Das Sommerekzem des Pferdes: Untersuchungen zu ... · PDF fileNomenklatur der Allergene ........

Aus der Arbeitsgruppe Immunologie und dem Institut für Virologie

der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Das Sommerekzem des Pferdes:

Untersuchungen zu potentiellen Allergenen aus

Culicoides nubeculosus

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.) durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Kathrin Friederike Annika Langner

aus Bremen

Hannover 2005

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr., Dr.h.c. Wolfgang Leibold

Apl.-Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr., Dr.h.c. Wolfgang Leibold

2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Astrid M. Tenter

Tag der mündlichen Prüfung: 30.05.2005

Die Arbeit wurde freundlicherweise unterstützt von der Graduiertenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Karl-Enigk-Stiftung.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Zielsetzung .............................................................................................. 11

2 Literaturübersicht ............................................................................................................ 13

2.1 Allergie ....................................................................................................................................13

2.1.1 Allergene .............................................................................................................. 13

2.1.1. Nomenklatur der Allergene .............................................................................. 13

2.1.1.2 Charakteristika von Allergenen – Was macht eine Substanz zum Allergen? .. 15

2.1.1.3 Kreuzreaktivitäten von Allergenen ................................................................. 16

2.1.2 Mechanismen der Typ-I-Allergie ......................................................................... 18

2.1.2.1 Der Erstkontakt mit Allergenen: Produktion sensibilisierender Antikörper ... 18

2.1.2.2 Die Folgekontakte mit Allergenen: Ausbildung der allergischen Reaktion ... 19

2.1.3 Die Bedeutung der Immunglobulin-Isotypen für die Typ-I-Allergie ................... 20

2.1.4 Die spezifische Immuntherapie (SIT) .................................................................. 23

2.2 Das Sommerekzem des Pferdes .............................................................................................25

2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie, Klinik und Pathogenese des Sommerekzems ............ 25

2.2.2 Diagnostische Ansätze zum Sommerekzem ......................................................... 28

2.2.3 Therapeutische Ansätze zum Sommerekzem ....................................................... 30

2.3 Untersuchungen zu Allergenen aus haematophagen Insekten ...........................................31

2.3.1 Allergene des Katzenflohs (Ctenocephalides felis) .............................................. 31

2.3.2 Allergene der Stechmücke (Aedes aegypti) .......................................................... 32

2.3.3 Allergene der Raubwanze (Triatoma protracta) .................................................. 33

2.4 Culicoides spp. .........................................................................................................................33

2.4.1 Biologie von Culicoides spp. ................................................................................ 33

2.4.2 Untersuchungen zu Culicoides spp. vor dem Hintergrund ihrer Bedeutung als Vektoren von Pathogenen .................................................................................... 35

2.4.3 Untersuchungen zu Culicoides spp. vor dem Hintergrund der Allergie .............. 37

3 Geräte, Material und Methoden ..................................................................................... 40

3.1 Geräte ......................................................................................................................................40

3.2 Material ...................................................................................................................................41

3.2.1 Laborbedarf .......................................................................................................... 41

3.2.2 Reagenzien ........................................................................................................... 43

3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien ................................................................... 46

3.2.4 Culicoides nubeculosus ........................................................................................ 47

3.2.5 Herkunft von Vollblut und Seren ......................................................................... 47

3.2.6 Puffer und Lösungen ............................................................................................ 48

3.3 Methoden .................................................................................................................................58

3.3.1 Präparation von Culicoides nubeculosus .............................................................. 58

3.3.1.1 Extraktion löslicher Komponenten aus Culicoides nubeculosus .................... 58

3.3.1.2 Biotinylierung der Proteine des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus ..................................................................................................... 58

3.3.2 Bestimmung des Proteingehalts ........................................................................... 59

3.3.3 Affinitätschromatographie .................................................................................... 59

3.3.2.1 Affinitätschromatographie zur Reinigung von Immunglobulinen aus Pferdeseren ...................................................................................................... 60

3.3.2.2 Affinitätschromatographie zur Isolierung von Komponenten aus Culicoides nubeculosus ..................................................................................................... 61

3.3.4 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ................................................... 62

3.3.5 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) .............. 63

3.3.6 Zweidimensionale Gelelektrophorese .................................................................. 64

3.3.7 Coomassie-Blau-Färbung nach Sambrook ........................................................... 65

3.3.8 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick .................................................... 66

3.3.9 Western Blotting ................................................................................................... 66

3.3.10 Immunoblotting ................................................................................................... 67

3.3.11 Funktioneller In-Vitro-Test (FIT) ....................................................................... 68

3.3.11.1 Histaminfreisetzung ...................................................................................... 68

3.3.11.2 Radio-Immuno-Assay (RIA) .......................................................................... 70

3.3.12 Immunpräzipitation ............................................................................................. 71

3.3.13 Ultrafiltration ....................................................................................................... 72

3.3.14 Gelfiltrationschromatographie ............................................................................ 72

3.3.15 Ionenaustauscherchromatographie ...................................................................... 73

3.3.16 Reversed-Phase-Chromatographie ...................................................................... 74

3.3.17 Massenspektrometrie ........................................................................................... 75

3.3.17.1 Vorbereitung der Proteine für die Massenspektrometrie .............................. 75

3.3.17.2 Electrospray Ionization Time-of-flight Tandem Mass-spectrometry (ESI/TOF- MS-MS) ...................................................................................... 75

3.3.17.3 Auswertung der Massenspektren .................................................................. 76

3.3.18 Recherche nach homologen Proteinen ................................................................ 77

3.3.19 Evaluierung von Chromatogrammen .................................................................. 78

3.3.20 Bestimmung der Molmasse von Proteinen über den Rf-Wert ............................ 78

4 Ergebnisse ......................................................................................................................... 80

4.1 Eigenschaften des Ganzkörperextraktes aus Culicoides nubeculosus ...............................80

4.1.1 Reaktivität des Extrakts mit equinen Blutzellen im FIT ...................................... 80

4.1.2 Einfluss verschiedener Parameter auf die Reaktivität im FIT .............................. 81

4.1.3 Nachweis biotinylierter Proteine im Immunoblot ................................................ 84

4.2 Reinigung von Immunglobulinen aus Pferdeseren .............................................................84

4.2.1 Überprüfung des Reinigungserfolges in der SDS-PAGE ..................................... 85

4.2.2 Qualitative Bestimmung der Immunglobulin-Isotypen ........................................ 86

4.3 Reaktivität equiner Serum-Immunglobuline mit Komponenten aus Culicoides nubeculosus .............................................................................................................................89

4.3.1 Untersuchung der Antikörperbindung an Komponenten aus Culicoides nubeculosus im Immunoblot ................................................................................ 89

4.3.2 Untersuchung der Antikörperbindung an Komponenten aus Culicoides nubeculosus in der Immunpräzipitation ............................................................... 90

4.3.3 Untersuchung von Komponenten aus Culicoides nubeculosus, die mittels Affinitätschromatographie isoliert wurden .......................................................... 92

4.4 Isolierung potentieller Allergene aus Culicoides nubeculosus ............................................95

4.4.1 Etablierung des ersten Reinigungsschritts ............................................................ 95

4.4.1.1 Gelfiltrationschromatographie ........................................................................ 95

4.4.1.2 Ionenaustauscherchromatographie .................................................................. 97

4.4.1.3 Bestimmung von Kandidatenallergenen ....................................................... 100

4.4.2 Etablierung des zweiten Reinigungsschritts ....................................................... 102

4.4.2.1 Zweistufige Reinigung über einen starken Kationenaustauscher und einen starken Anionenaustauscher .......................................................................... 102

4.4.2.2 Elution der Culicoides-Proteine im Stufengradienten von einem starken Kationenaustauscher ...................................................................................... 103

4.4.2.3 Elution der Culicoides-Proteine im linearen Gradienten von einem starken Kationenaustauscher ...................................................................................... 104

4.4.2.4 Vergleich der Methoden und Nachweis der Kandidatenallergene ................ 107

4.4.3 Isolierung der Kandidatenallergene .................................................................... 110

4.4.3.1 Isolierung des 45 kD-Proteins mittels Reversed-Phase Chromatographie ... 110

4.4.3.2 Isolierung des 15 kD-Proteins mittels Ultrafiltration .................................... 111

4.4.3.3 Isolierung des 15 kD-Proteins mittels Gelfiltrationschromatographie .......... 113

4.4.3.4 Isolierung des 15 kD-Proteins mittels Reversed-Phase Chromatographie ... 114

4.5 Biochemische Charakterisierung der isolierten Komponenten aus Culicoides nubeculosus ..........................................................................................................................115

4.5.1 Biochemische Charakterisierung des 45 kD-Proteins ........................................ 116

4.5.2.1 Bestimmung der Molmasse und des isoelektrischen Punktes ..................... 116

4.5.2.2 Bestimmung der Peptidsequenzen .............................................................. 117

4.5.2 Biochemische Charakterisierung des 15 kD-Proteins ........................................ 120

4.6.1.1 Bestimmung der Molmasse und des isoelektrischen Punktes ..................... 120

4.6.1.2 Bestimmung von Peptidsequenzen .............................................................. 121

4.6.1.3 Identifizierung des 15 kD-Proteins anhand von Sequenzidentitäten .......... 122

4.6 Funktionelle Charakterisierung der isolierten Komponenten aus Culicoides nubeculosus ...........................................................................................................................123

4.6.1 Funktionelle Charakterisierung des 45 kD-Proteins .......................................... 123

4.6.1.1 Bindung der Citratsynthase durch equine Serum-Antikörper im Immunoblot ................................................................................................... 123

4.6.1.2 Reaktivität der Citratsynthase mit Effektorzellen der Allergie im FIT ......... 124

4.6.2 Funktionelle Charakterisierung des 15 kD-Proteins .......................................... 124

4.6.2.1 Bindung des Cytochrom C durch equine Serum-Antikörper im Immunoblot ................................................................................................... 124

4.6.2.2 Reaktivität des Cytochrom C mit Effektorzellen der Allergie im FIT .......... 125

4.6.2.3 Kreuzreaktivität mit bovinem Cytochrom C ................................................. 126

5 Diskussion ........................................................................................................................ 128

5.1 Untersuchung des Ganzkörperextraktes aus Culicoides nubeculosus .............................128

5.2 Untersuchungen zu definierten Komponenten aus Culicoides nubeculosus ...................138

6 Zusammenfassung .......................................................................................................... 148

7 Summary ......................................................................................................................... 151

8 Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 153

Glossar und Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen und Termini technici

µ mikro (x10–6)

AA/BA Acrylamid/Bisacrylamid

Abb. Abbildung

A. dest. Aqua destillata

A. tridest. Aqua tridestillata

APS Ammoniumpersulfat

ATP Adenosintriphosphat

B-Zellen B-Lymphozyten

BCA bicinchoninic acid

BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

Bq Becquerel

BSA Bovines Serumalbumin

bspw. beispielsweise

bzw. beziehungsweise

C. Culicoides

°C Grad Celsius

ca. circa

CCD cross-reactive carbohydrate determinant

CD Cluster of Differentiation

cDNA complementary deoxyribonucleic acid

CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat

cm Zentimeter

cpm counts per minute

Cut-off Ausschluss-Molmassen bei der Ultrafiltration

C-terminal carboxyterminales Ende eines Peptids/Proteins

D Durchlauf

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA desoxyribonucleic acid

DTT 1,4-Dithiothreitol

Ekzemer am Sommerekzem erkranktes Pferd/erkrankte Pferde

E Eluat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

ESI/TOF-MS-MS Electrospray Ionization Time-of-flight Tandem Mass-spectrometry

eV Elektronenvolt

Fa. Firma

Fc fragment cristalline

FcεR Fcε-Rezeptor

FcγR Fcγ-Rezeptor

FIT funktioneller In-vitro-Test für Typ-I-Allergien

FPLC Fast Pressure Liquid Chromatography

g Gramm

GFC Gelfiltrationschromatographie

GKE Ganzkörperextrakt

ggf. gegebenenfalls

h hora

HEPES N-(2-Hydroxyethyl) piperazin-N´(2 -ethansulfonsäure)

H + L schwere (heavy) und leichte (light) Immunglobulinketten

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

i. d. R. in der Regel

IEX Ionenaustauscherchromatographie

IgE Immunglobulin E

IgG Immunglobulin G

IgM Immunglobulin M

IL Interleukin

INF Interferon

IP Immunpräzipitation

IPG immobilisierter pH-Gradient

IUIS International Union of Immunological Societies

kD Kilodalton (10³ Dalton)

l Liter

Mr relative Molmasse in kD

M mol/l

max. maximal

MHC major histocompatibility complex

min Minute

ml Milliliter

mol Stoffmenge

mRNA messenger ribonucleic acid

m/z Massen-Ladungsverhältnis

n nano (x10-9)

NBT 2,2`-Di-p-nitrophenyl-5,5`-diphenyl-3,3`-ditetrazoliumchlorid

NCBI National Institute for Biotechnology Information

Nichtekzemer nicht am Sommerekzem erkranktes Pferd/erkrankte Pferde

N-terminal aminoterminales Ende eines Peptids/Proteins

OD optische Dichte

PBS phosphate-buffered saline

PEG Polyethylenglycol

pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Konzentration

pI point isoelectric

Pipes Piperazin N,N’bis(2-ethansulfon)säure

PVDF Polyvinylidendifluorid

r rekombinant

Rf-Wert Retentionsfaktor zur Berechnung von Molmassen

RIA Radio-Immuno-Assay

RNA ribonucleic acid

RPC Reversed-Phase-Chromatographie

rpm rotation per minute

s. siehe

s. u. siehe unten

SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

SIT Spezifische Immuntherapie

sog. sogenannte, -er, -es

spp. species

SPT Skin Prick Test

Tab. Tabelle

TCR T cell receptor

TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin

TFA Trifluoressigsäure

TH1-/TH2-Zellen Subpopulation von T-Zellen

TMB Tetramethylbenzidin

TNF Tumornekrosefaktor

T-Zellen T-Lymphozyten

u. a. unter anderem

UV ultraviolett

V Volt

vgl. vergleiche

Vh Voltstunden

well Vertiefung einer Mikrotiterplatte

WHO World Health Organization

x g multipliziert mit der Erdbeschleunigung (9,81 m/s2)

z. B. zum Beispiel

Einleitung und Zielsetzung

1 Einleitung und Zielsetzung

Allergien zählen mit steigender Inzidenz zu den häufigsten Krankheitsbildern beim Menschen

und bei den Haustieren – und stellen gleichzeitig eine der kausal am wenigsten therapierbaren

pathologischen Erscheinungen dar. Entscheidend für die unzureichenden Behandlungs-

möglichkeiten ist die lückenhafte Kenntnis über die Ursache und Entstehung von Allergien.

So ist zwar bekannt, dass jeder Allergie primär eine physiologische Immunreaktion zugrunde

liegt. Ungeklärt ist jedoch, warum bei einigen Menschen und Tieren dieser Mechanismus

gegen bestimmte Substanzen überschießend ausgeführt wird, so dass die betroffenen

Individuen erkranken. Weiterhin ist zwar in vielen Fällen die Quelle der Allergene

identifiziert (Katzenhaare, Medikamente, Birkenpollen, Hausstaub u. a.). Welche definierten

Komponenten aus diesen Quellen jedoch für die inadäquate Reaktion des Immunsystems

verantwortlich sind, ist für einen Großteil der Allergien noch nicht bekannt.

Die weitaus häufigste Form unter der Vielzahl der allergischen Erkrankungen ist die Typ-I-

Allergie (Hypersensibilitätsreaktion oder Überempfindlichkeit vom Soforttyp), zu der auch

das Sommerekzem des Pferdes gehört. Diese Allergieform ist gekennzeichnet durch die

Produktion sensibilisierender Antikörper, vorrangig des Isotyps E (IgE), die überwiegend auf

den Oberflächen von Mastzellen im Gewebe und basophilen Granulozyten im Blut gebunden

werden. Bei allen Folgekontakten mit den Allergenen vermitteln die zellgebundenen

Antikörper in Abhängigkeit vom Eintrittsweg der Komponenten in den Körper vielfältige

Reaktionen, die von einer lokalen Entzündung bis zum systemischen anaphylaktischen

Schock reichen können.

Das Krankheitsbild des Sommerekzems des Pferdes entspricht einer lokalen allergischen

Dermatitis. Verantwortlich für die Ausprägung dieser Allergie sind in erster Linie die

haematophagen weiblichen Insekten der Gattung Culicoides (Gnitzen), die während ihrer

Blutmahlzeit Speichelbestandteile in die Haut des Pferdes injizieren. Bei sensibilisierten

Tieren lösen diese Komponenten eine allergische Reaktion aus, die mit starkem Juckreiz

einhergeht und durch Scheuern der betroffenen Hautareale zu einer Dermatitis führt. Eine

kausale Therapie der Erkrankung gibt es bisher nicht, Behandlungsversuche beschränken sich

auf die Linderung der Symptome und sind oftmals unzureichend.

11

Einen Erfolg versprechenden Ansatz zur Entwicklung einer spezifischen Therapie sowie zur

Erforschung der Mechanismen von Typ-I-Allergien stellt die Isolierung und

Charakterisierung von definierten allergen wirksamen Komponenten dar. Für einen Großteil

der Bienen- und Wespenarten, deren Stiche beim Menschen zu schweren allergischen

Reaktionen bis zum anaphylaktischen Schock führen können, sind die relevanten Allergene

nahezu vollständig identifiziert und stehen nach rekombinanter Expression als standardisierte

reine Proteine zur Verfügung. Mit Hilfe dieser Allergene gelang es, eine zuverlässige

spezifische Immuntherapie (SIT) zu entwickeln sowie bestimmte Mechanismen der Typ-I-

Allergie beim Menschen (beteiligte Antikörperisotypen, Effektorzellen u. a.) gezielt zu

untersuchen.

Im Gegensatz dazu fehlt bezüglich des Sommerekzems des Pferdes jegliche Kenntnis über die

allergieauslösenden Komponenten aus den Gnitzen. Diagnostik, Therapieversuche sowie

Grundlagenforschung werden bislang mit Extrakten aus Culicoides durchgeführt, deren

Anzahl unterschiedlicher Allergene nicht bekannt ist und deren Allergenkonzentration

jeglicher Standardisierung entbehrt.

In dieser Arbeit sollte daher durch die Untersuchung der Komponenten eines

Ganzkörperextrakts aus der Gnitzenspezies Culicoides nubeculosus ein Überblick über die

biochemischen und funktionellen Eigenschaften der allergen wirksamen Komponenten

erhalten werden. Weiterhin sollte anhand dieser Informationen ein geeigneter Reinigungsweg

für potentielle Allergene aus den Insekten etabliert und eine Charakterisierung der isolierten

Komponenten hinsichtlich ihrer Bedeutung für das Sommerekzem vorgenommen werden.

12

Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Allergie

2.1.1 Allergene

Allergene sind Substanzen, die beim sensibilisierten Individuum eine inadäquate,

überschießende Reaktion des Immunsystems auslösen, deren Wirkung von milder Dermatitis

bis hin zum anaphylaktischen Schock reichen kann (HUBY et al. 2000). Die Bandbreite der

Allergene beinhaltet u. a. Proteine, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Lipide, verschiedene

Wirkstoffe aus Arzneimitteln und Metallionen. Die relevanten Allergene für die Typ-I-

Allergie, zu der auch das Sommerekzem des Pferdes gehört, finden sich überwiegend in den

Substanzklassen der Proteine und Glykoproteine (AALBERSE 2000).

2.1.1.1 Nomenklatur der Allergene

Bislang sind die Primärstrukturen von etwa 200 allergen wirksamen Proteinen und

Glykoproteinen bekannt und größtenteils in einer via Internet zugänglichen Datenbank der

Weltgesundheitsorganisation (World Health Organization, WHO) und der Internationalen

Union Immunologischer Gesellschaften (International Union of Immunological Societies,

IUIS) zusammengestellt (WHO/IUIS allergen list: http://www.allergen.org; s. Tab. 1). Die

Bezeichnung der Allergene erfolgt nach den Empfehlungen des Subkomitees für die

Allergennomenklatur der WHO und der IUIS (KING et al. 1994). Für die Benennung ist der

taxonomische Name der Pflanzen- oder Tierart maßgeblich, aus der das jeweilige Allergen

stammt. Die ersten drei (bei Doppelbelegung vier) Buchstaben beschreiben die Gattung, der

vierte (oder fünfte) Buchstabe kennzeichnet die Art. Die nachgestellte arabische Ziffer gibt

die Reihenfolge der Identifizierung an. Sofern bekannt, wird zusätzlich die biologische

Funktion des Allergens beschrieben. Vervollständigt wird die Liste durch die Molmasse und

den Verweis auf die zugehörige Sequenz (Aminosäuresequenz, ggf. Nukleotidsequenz).

Weiterhin sind in der Datenbank sog. Isoallergene aufgeführt. Diese Proteine sind innerhalb

einer Spezies auftretende Isoformen von Allergenen, deren Aminosäuresequenzen eine

Identität von mindestens 67 % zu den entsprechenden Allergenen aufweisen. Das

13

Literaturübersicht

Vorkommen der Isoallergene beruht auf dem Polymorphismus der Allergen codierenden

Gene oder auf posttranslationalen Modifikationen.

Tab. 1 Auszug aus der Allergen-Datenbank der WHO/IUIS: Nomenklatur einiger Allergene aus haematophagen Insekten

Spezies Allergen biologische Funktion

Aedes aegypti 1 Aed a 1 Apyrase

Aed a 2 unbekannt

Ctenocephalides felis 2 Cte f 1 unbekannt

Cte f 2 unbekannt

Cte f 3 unbekannt

Triatoma protracta 3 Tria p 1 Prokalin

1 Stechmücke, 2 Katzenfloh; 3 Raubwanze Der überwiegende Teil aller bisher identifizierten allergen wirksamen Proteine und Glykoproteine ist in einer Datenbank der Weltgesundheitsorganisation (WHO) und der Internationalen Union Immunologischer Gesellschaften (IUIS) zusammengefasst. Diese Tabelle gibt einen Überblick über die aufgeführten Allergene haematophager Insekten (mittlere Spalte), die jeweils mit ihrer Quelle (linke Spalte) und ihrer Funktion (rechte Spalte) aufgeführt sind. Nicht dargestellt sind die Molmassen der Allergene sowie die Verweise auf die Sequenzen, die die Originalliste vervollständigen.

Ein Großteil der in der Liste aufgeführten Spezies enthält mehrere Allergie auslösende

Komponenten, die sich hinsichtlich ihrer Relevanz für die sensibilisierten Individuen

unterscheiden (KING & SPANGFORD 2000). Um die Bedeutung des einzelnen Allergens für

das Krankheitsgeschehen zu beurteilen, wird das Vorhandensein von allergenspezifischen

Antikörpern des Isotyps E, die bei der Überempfindlichkeit vom Soforttyp eine zentrale Rolle

spielen (vgl. 2.1.2), im Serum der betroffenen Individuen bestimmt (LOWENSTEIN 1978;

KING et al. 1994). Besitzen mehr als 50 % der untersuchten Allergiker IgE gegen ein

bestimmtes Allergen, so wird es als Hauptallergen bezeichnet. Ist allergenspezifisches IgE bei

weniger als 50 % der Probanden nachweisbar, handelt es sich um ein Nebenallergen. Diese

Definition ist nicht zuletzt aufgrund der teilweise unzureichenden Korrelation der

Serumprävalenz von allergenspezifischem IgE zur Ausprägung klinischer Symptomatik

umstritten, jedoch bislang nicht neu festgelegt worden (AALBERSE 2000).

14

Literaturübersicht

2.1.1.2 Charakteristika von Allergenen – Was macht eine Substanz zum Allergen?

Durch Vergleich verschiedener Allergene auf biochemischer und/oder funktioneller Ebene

wurde versucht, charakteristische Merkmale dieser Proteine zu bestimmen. Eine

allgemeingültige Klassifizierung gelang nicht, jedoch konnten einige Charakteristika

festgestellt werden, die häufig auf Proteine zutreffen, die für Typ-I-Allergien verantwortlich

sind (HUBY et al. 2000).

Die Mehrzahl der bekannten Allergene besitzt Molmassen, die zwischen 10 und 70 kD liegen

(LEHRER et al. 1996; PUC 2003). Bei kleineren Proteinen sinkt die Allergenität. Dies

begründet sich darin, dass das Allergen zur Induktion der allergischen Reaktion von

mindestens zwei Antikörpern gebunden werden muss (Kreuzvernetzung). Aus sterischen

Gründen sind bei kleinen Proteinen die Bindungsmöglichkeiten für Antikörper eingeschränkt,

so dass die Kreuzvernetzung erschwert wird (AALBERSE 2000). Zudem verfügen kleine

Proteine über eine weniger komplexe dreidimensionale Struktur und aufgrund dessen über

eine geringere Anzahl potentiell allergen wirksamer Epitope. Proteine mit einer Molmasse

über 70 kD können dagegen die Schleimhautbarrieren von Atmungs- und Verdauungstrakt

schlecht überwinden, sofern sie nicht durch direkte Applikation (Stich) in den Organismus

gelangen (LEHRER et al. 1996).

Ein Großteil der Allergene ist hydrophil (JANEWAY et al. 2002). Dies ermöglicht bei

Allergenen, die an eine feste Phase (z. B. Pollen, Milbenkot) gekoppelt sind, die Dissoziation

vom Partikel auf der feuchten Schleimhautoberfläche sowie den Transport durch die

Schleimhaut. Zudem wird die Verteilungskinetik (aktiver und passiver Transport,

Verteilungsvolumen) der Allergene im Organismus begünstigt.

Zahlreiche Allergene weisen ein hohes Maß an Stabilität auf (JANEWAY et al. 2002). Diese

Stabilität beinhaltet die Unempfindlichkeit gegenüber Austrocknung, Erhitzung, pH-Wert-

Schwankungen, Verdauungsenzymen u. a. und führt dazu, dass die Allergene in

unveränderter Form auf die Zellen des Immunsystems im sensibilisierten Individuum treffen.

Ein großer Teil der Allergene ist stark glykosiliert (HUBY et al. 2000). Für solche Proteine ist

die Aufnahme in Antigen präsentierende Zellen erleichtert, da eine Bindung der

Kohlenhydratreste der Allergene an zuckerspezifische Rezeptoren (z. B. den Makrophagen-

Mannoserezeptor) erfolgt. Die Aufnahme in diese Zellen stellt die Voraussetzung für die

Induktion der spezifischen Immunantwort gegen das Allergen dar (vgl. 2.1.2).

15

Literaturübersicht

Viele Allergene sind enzymatisch aktiv (HUBY et al. 2000; JANEWAY et al. 2002). Weisen

sie eine proteolytische Aktivität auf, können sie zum einen durch Zersetzung von Gewebe ihr

Verteilungsvolumen erhöhen (ROBINSON et al. 1990). Zum anderen konnte gezeigt werden,

dass allergen wirksame Proteasen, u. a. die Cystein-Protease Der p 1 aus der Hausstaubmilbe

Dermatophagoides pteronyssinus, bestimmte Oberflächenmoleküle wie den niedrigaffinen

IgE-Rezeptor CD 23 auf B-Lymphozyten und Monozyten spalten. Durch Zerstörung dieses

Moleküls, das in seiner zellständigen Form die Synthese von IgE reguliert, wird eine

überschießende IgE-Produktion induziert (DUDLER et al. 1995; HEWITT et al. 1995;

SCHULZ et al. 1995). Andere enzymatisch aktive Allergene, u. a. die in Bienen- und

Wespengift enthaltene Phospholipase A2 sowie einige Proteasen, sind direkt in der Lage, in

Abwesenheit von allergenspezifischem IgE Effektorzellen der Typ-I-Allergie (Mastzellen,

basophile Granulozyten) zu stimulieren und damit allergoide Reaktionen auszulösen

(MACHADO et al. 1996). Der Weg der Zellaktivierung ist bisher nicht bekannt. Unabhängig

von der Art ihrer Funktion sind enzymatisch aktive Allergene häufig auch außerhalb ihrer

natürlichen Lokalisation stabil und weisen eine komplexe Struktur auf - zwei Faktoren, die

beide im Zusammenhang mit der allergenen Wirksamkeit von Proteinen diskutiert werden

(AALBERSE 2000; BUFE 1998; HUBY et al. 2000).

2.1.1.3 Kreuzreaktivitäten von Allergenen

Etwa 80 % der bekannten Lebensmittelallergien treten im Zusammenhang mit einer

allergischen Reaktion gegen verschiedene Pollen auf (ERIKSSON et al. 1982; CABALLERO

& MARTIN-ESTEBAN 1998). Die klinische Ausprägung der Lebensmittelallergie entwickelt

sich dabei meist erst nach einer primären Sensibilisierung gegen Pollen und beruht in vielen

Fällen auf einer Kreuzreaktivität des pollenspezifischen IgE mit Bestandteilen der

Lebensmittel. Einige Komponenten aus Lebensmitteln, z. B. das Protein Mal d 1 des Apfels,

sind ihrerseits nicht in der Lage, die Produktion von spezifischem IgE zu induzieren

(AALBERSE 2000). Die dennoch bereits beim Erstkontakt mit dem Lebensmittel

beobachteten allergischen Symptome werden durch die Reaktion mit bereits präformiertem

IgE gegen Pollenallergene, das im Fall des genannten Apfelproteins gegen das Allergen

Bet v 1 aus Birkenpollen gebildet wurde, verursacht. Des weiteren werden für die enge

Relation von Lebensmittel- und Pollenallergien verschiedene Kohlenhydratstrukturen (sog.

cross-reactive carbohydrate determinants, CCDs) verantwortlich gemacht (VAN REE 1999).

16

Literaturübersicht

Die CCDs sind in nahezu allen groben Präparationen von Allergenen enthalten und führten

verschiedentlich zu falsch positiven Reaktionen im ELISA (VAN DER VEEN et al. 1997;

MARI et al. 1999). Im Intrakutantest wurde dagegen keine Reaktivität beobachtet, da eine

Kreuzvernetzung von zellständigem IgE durch CCDs möglicherweise mangels ausreichender

Epitopzahl nicht möglich ist.

Auch im Bereich der Insektenallergien sind Kreuzreaktivitäten weit verbreitet. So konnten bei

Menschen mit einer Hypersensitivität gegen Moskitostiche allergische Reaktionen gegen

Moskitospezies festgestellt werden, mit denen die betroffenen Personen zuvor noch nie in

Kontakt gekommen waren (PENG & SIMONS 1997). Ähnliche Beobachtungen wurden beim

Sommerekzem des Pferdes gemacht. In verschiedenen Studien reagierten betroffene Pferde

nicht nur auf die heimischen Gnitzenspezies sondern ebenfalls auf exotische Arten

(ANDERSON et al. 1993; KAUL 1998). Kreuzreaktivitäten, die weite taxonomische Grenzen

überschreiten, konnten bei der Allergie gegen inhalativ aufgenommene Komponenten von

Zuckmücken (Chironomidae) nachgewiesen werden. Kreuzreagierende Allergene fanden sich

in diesem Zusammenhang in Milben, Motten, Fliegen sowie in verschiedenen Muschel- und

Garnelenarten (ERIKSSON et al. 1989; GARLINDO et al. 1999).

Die biochemischen Grundlagen für die Kreuzreaktivität von Allergenen wurden anhand

isolierter und charakterisierter allergen wirksamer Proteine untersucht. Als Ursache wurden

strukturelle Gemeinsamkeiten der Proteine hinsichtlich ihrer Primärstruktur

(Aminosäuresequenz) und Tertiärstruktur (dreidimensionale Faltung) festgestellt

(AALBERSE 2000). Die Primärstruktur kreuzreagierender Proteine besitzt meist eine

Homologie von mindestens 70 %, unter 50 % Homologie ist Kreuzreaktivität selten.

Weiterhin weisen alle kreuzreagierenden Allergene die gleiche Tertiärstruktur auf, die im

Wesentlichen durch die Aminosäuresequenz bedingt wird.

Bei der Milbenallergie des Menschen, die durch eingeatmete Komponenten verschiedener

Milbenspezies und deren Exkrementen ausgelöst wird, konnte festgestellt werden, dass der

Anteil ähnlicher Allergenstrukturen hinsichtlich Primär- und Tertiärstruktur mit

zunehmendem Verwandtschaftsgrad der Arten steigt (VAN HAGE-HAMSTEN &

JOHANSSON 1998). So zeigen die Proteine verschiedener Spezies der Hausstaubmilben eine

starke Kreuzreaktivität (ARLIAN et al. 1987). Dagegen ist die Kreuzreaktivität der

Komponenten von Hausstaubmilben zu den taxonomisch weiter entfernten Vorratsmilben

17

Literaturübersicht

schwächer ausgeprägt (VAN HAGE-HAMSTEN & JOHANSSON 1998). Dass

Kreuzreaktivität bis hin zur Autoreaktivität bei phylogenetisch konservierten Strukturen auch

unabhängig des Verwandtschaftsgrads von Spezies auftritt, wurde bei Untersuchungen zu

verschiedenen Pollen- und Schimmelpilzallergien des Menschen festgestellt (VALENTA et

al. 1992; CRAMERI et al. 1996). Beispiele für solche Allergene sind das Protein Profilin,

eine Komponente des Zytoskeletts, sowie die Mangan-Superoxid-Dismutase. Beide Proteine

zählen zu den Hauptallergenen aus Birken- und verschiedenen Gräserpollen bzw. aus

Aspergillus fumigatus. Die humanen homologen Proteine bewirkten beim Pollen bzw.

Schimmelpilz sensibilisierten Menschen nach intrakutaner Verabreichung eine starke

Hautreaktion, ebenso konnte spezifisches IgE gegen beide Proteine nachgewiesen werden.

2.1.2 Mechanismen der Typ-I-Allergie

Anhand der zugrunde liegenden Immunmechanismen wurden die Allergien in vier

verschiedene Typen eingeteilt, von denen die Typen I bis III Antikörper vermittelten

Reaktionen entsprechen, der Typ IV dagegen auf einer antikörperunabhängigen,

zellvermittelten Reaktion basiert (COOMBS & GELL 1968).

Das Sommerekzem des Pferdes zählt zu den Typ I allergischen Reaktionen (FADOK &

GREINER 1990; KAUL 1998). Die physiologische Bedeutung dieses Mechanismus liegt in

der Auslösung und Kontrolle von Entzündungsreaktionen durch Mastzellen und basophile

Granulozyten, die der Abwehr parasitärer Infektionserreger, vorrangig von Endoparasiten,

dienen (JANEWAY et al. 2002). Erforderlich für diese Allergieform ist die Produktion sog.

sensibilisierender Antikörper beim Erstkontakt mit dem Allergen. Diese Antikörper, in erster

Linie dem Isotyp E zugehörig, binden an Rezeptoren auf der Oberfläche von Mastzellen im

Gewebe und basophilen Granulozyten im Blut. Bei den nachfolgenden Allergenkontakten

kommt es zu einer Kreuzvernetzung der membranständigen Immunglobuline durch die

Allergene, die in einer Freisetzung verschiedener Mediatoren, u. a. von Histamin, resultiert.

2.1.2.1 Der Erstkontakt mit Allergenen: Produktion sensibilisierender Antikörper

Die Produktion der sensibilisierenden Antikörper durch B-Lymphozyten (B-Zellen) ist von

verschiedenen Vorraussetzungen abhängig. Das Allergen muss von Antigen präsentierenden

Zellen (Makrophagen, dendritische Zellen, B-Zellen) aufgenommen, prozessiert und an

18

Literaturübersicht

MHC II (major histocompatibility complex class 2) präsentiert werden. Das in kurzen

Segmenten präsentierte Allergen wird durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) allergenspezifischer,

naiver T-Lymphozyten (T-Zellen) gebunden und induziert deren Differenzierung zu sog.

TH2-Zellen. Die reifen TH2-Zellen binden ihrerseits über den TCR allergenspezifische B-

Zellen, welche nach Aufnahme des Allergens die relevanten Epitope an MHC II präsentieren.

Durch die Sekretion verschiedener Zytokine, insbesondere von Interleukin 4 und 13 (IL-4 &

IL-13), sowie durch die zusätzliche Bindung der B-Zellen über costimulatorische

Oberflächenmoleküle bewirken die TH2-Zellen einen Klassenwechsel der B-Zellen zur IgE-

Produktion (MAGGIE et al. 1988; O`ROURKE et al. 1997; BACHARIER et al. 1998). Die

Besonderheit des IgE besteht darin, dass es über den Fc-Teil ohne vorangegangene

Antigenbindung an den hochaffinen Fcε-Rezeptor I (FcεRI) binden kann, der konstitutiv auf

der Oberfläche von Mastzellen und basophilen Granulozyten exprimiert wird und auch auf

aktivierten eosinophilen Granulozyten nachgewiesen wurde (JANEWAY et al. 2002).

Warum manche Proteine in der Lage sind, die Differenzierung naiver T-Zellen zu TH2-Zellen

und damit den ersten Schritt zur Produktion sensibilisierender Antikörper zu induzieren, ist

bislang nicht vollständig geklärt. Als einer der entscheidenden Faktoren wird die geringe

Dichte angesehen, mit der Allergene an den MHC II-Molekülen präsentiert werden (HUBY et

al. 2000). Zurückzuführen ist dies zum einen auf die niedrige Dosis, in der Allergene in den

Körper gelangen. Die berechnete Aufnahme von Pollenallergenen beträgt pro Person für das

gesamte Jahr nicht mehr als etwa 1 µg. Ein Moskito appliziert mit einem Stich ca. 200 ng

Gesamtprotein, das sich aus ~ 30 verschiedenen Proteinen zusammensetzt (PENG &

SIMONS 2004). Zum anderen besitzen viele allergene Peptide eine strukturell bedingte

niedrige Affinität zu MHC II (MURRAY et al 1994). Die aus diesen Faktoren resultierende

geringe Anzahl von MHC II-/Peptidkomplexen auf der Oberfläche von Antigen

präsentierenden Zellen induziert bei Bindung des TCR lediglich schwache stimulatorische

Signale, die eine Differenzierung der naiven T-Zellen zu TH2-Zellen bewirken (TAO et al.

1997).

2.1.2.2 Die Folgekontakte mit Allergenen: Ausbildung der allergischen Reaktion

Sowohl im Gewebe (Mastzellen) als auch im Blut (basophile Granulozyten) befinden sich

nach dem Erstkontakt Effektorzellen, die mit sensibilisierenden Antikörpern beladen sind. Im

19

Literaturübersicht

Zuge weiterer Allergenexpositionen werden die Allergene über diese membranständigen

Antikörper direkt gebunden. In Abhängigkeit von der Dichte der Antikörper auf den Zellen

führt die Bindung des Allergens zur Kreuzvernetzung der Antikörper und damit zu einer

Aktivierung der Mastzellen und basophilen Granulozyten. Die Zellen setzen zum einen

präformierte Mediatoren frei, zum anderen synthetisieren sie verschiedene Mediatoren neu.

Zu den präformierten Mediatoren, die eine Sofortreaktion der Typ-I-Allergie (innerhalb

weniger Minuten) auslösen, gehören das in den Granula der Zellen gespeicherte Histamin,

verschiedene Proteasen (Tryptase, Chymase) und Gerinnungshemmer (Heparin,

Chondroitinsulfat) sowie chemotaktische Faktoren (Eosinophilen chemotaktischer Faktor,

Neutrophilen chemotaktischer Faktor). Zu den neu gebildeten Mediatoren, die die

Spätreaktion einleiten (nach etwa 30 min) zählen im wesentlichen Leukotriene und

Prostaglandine. Durch die genannten Mediatoren wird eine Entzündungsreaktion eingeleitet

und aufrechterhalten, die zum klinischen Erscheinungsbild der Typ-I-Allergie führt.

Neben Mediatoren produzieren die aktivierten Mastzellen und basophilen Granulozyten auch

IL-4, präsentieren das internalisierte Allergen an MHC II und exprimieren costimulatorische

Moleküle, so dass sie unabhängig von TH2-Zellen einen Klassenwechsel von B-Zellen zur

IgE-Produktion induzieren können (YANAGIHARA et al. 1998).

Auch in Abwesenheit von Allergenen bleibt der Zustand der Sensibilisierung eines

Individuums, das Vorhandensein allergenspezifischer Antikörper auf Mastzellen und

basophilen Granulozyten, über mehrere Jahre erhalten (GEIBEN 2003). Als Ursache wird

zum einen die hohe Affinität des IgE zum FcεRI diskutiert, die einer sehr niedrigen

Dissoziationskonstante von 1-3 x 10 -10 mol/l folgt (JANEWAY et al. 2002). Zum anderen

deutet die Aufrechterhaltung der Sensibilisierung möglicherweise auf langlebige Plasmazellen

hin, deren allergenspezifische Antikörper stets einen Teil der FcεRI auf neu gebildeten

Mastzellen und basophilen Granulozyten einnehmen (GEIBEN 2003).

2.1.3 Die Bedeutung der Immunglobulin-Isotypen für die Typ-I-Allergie

Im Zusammenhang mit der Typ-I-Allergie werden Immunglobuline sowohl hinsichtlich

sensibilisierender als auch inhibitorischer oder protektiver Wirkung diskutiert. Die Rolle, die

ein bestimmter Immunglobulin-Isotyp im allergischen Geschehen letztendlich spielt, hängt

ganz entscheidend von dem Vorhandensein und der Funktion der entsprechenden Fc-

20

Literaturübersicht

Rezeptoren (inhibierend oder aktivierend) auf den Effektorzellen (Mastzellen, basophile

Granulozyten) ab (JANEWAY et al. 2002).

Immunglobuline des Isotyps E spielen eine zentrale Rolle als sensibilisierende Antikörper bei

der Typ-I-Allergie des Menschen und Pferdes sowie bei der experimentellen Hypersensitivität

der Maus. IgE mit Spezifität für zahlreiche definierte Allergene konnte im Serum von

Allergikern nachgewiesen werden. Dabei wurde in einigen Ansätzen gezeigt, dass die

Produktion des allergenspezifischen IgE nur auf allergiekranke Individuen begrenzt ist

(KASAIAN et al. 1995). Andere Untersuchungen dagegen belegen, dass auch gesunde

Patienten IgE mit Spezifität für definierte Allergene produzieren (MIMURA et al. 2004). Der

allergenspezifische IgE-Titer dieser Individuen liegt jedoch in den meisten Fällen unter dem

der Allergiker, so dass anhand der Höhe der entsprechenden IgE-Spiegel eine Unterscheidung

von Atopikern und gesunden Individuen vorgenommen werden kann. Erkenntnisse über die

Serum-Prävalenz von allergenspezifischem IgE beim Pferd liegen nicht vor.

Sowohl im humanen als auch im murinen System ist auf Mastzellen und auf basophilen

Granulozyten konstitutiv der hochaffine, aktivierende FcεRI exprimiert, der freies IgE über

den Fc-Teil bindet und die Zellen damit für bestimmte Allergene sensibilisiert (JANEWAY et

al. 2002). Durch Kreuzvernetzung der FcεRI gebundenen Antikörper wird die

Zusammenlagerung der Rezeptoren induziert und damit eine Aktivierung und Degranulation

der Zellen bewirkt. Auch für das Pferd gelang der Nachweis dieses Rezeptors auf den

genannten Zelltypen (MCALEESE & MILLER 2003). Zusätzlich konnte in vitro und in vivo

gezeigt werden, dass IgE-Antikörper in freier Form an Mastzellen und basophile

Granulozyten binden und durch ihre Kreuzvernetzung eine Histaminfreisetzung ausgelöst

werden kann (WAGNER et al. 2002).

Für die verschiedenen IgG-Isotypen ist weder bei Mensch und Maus noch beim Pferd

schlüssig nachgewiesen, welchem Isotyp eine sensibilisierende oder eine inhibitorische

Wirkung im Rahmen der Typ-I-Allergie zugeordnet werden kann. Im Serum allergischer

Menschen konnte IgG1, 2 und 4 mit Spezifität für definierte Allergene bestimmt werden

(TIIKKAINEN & KLOCKARS 1990; GEHLHAR et al. 1999). Bei gesunden Individuen

wurde bislang überwiegend das Vorkommen von allergenspezifischem IgG4 nachgewiesen,

die übrigen Isotypen kamen weniger häufig vor (PORTENGEN et al. 2004; STERN et al.

21

Literaturübersicht

2004). Im Gegensatz zum Serum-IgE-Gehalt mit Spezifität für definierte Allergene, der in

den meisten Fällen bei klinisch erkrankten Personen deutlich höher ist als bei gesunden

Individuen, sind die Angaben bezüglich der Korrelation der IgG-Titer mit der klinischen

Ausprägung der Allergie sehr widersprüchlich. Zum einen konnte gezeigt werden, dass zwar

die Serum-Titer der IgG-Isotypen in Abhängigkeit von der Stärke der Allergenexposition

steigen, jedoch keine Korrelation zur klinischen Symptomatik besteht (TIIKKAINEN &

KLOCKARS 1990; GARCIA-ROBAINA et al. 1997). Zum anderen weisen Menschen mit

starker klinischer Symptomatik einer Allergie signifikant erhöhte allergenspezifische IgG4-

Titer gegenüber den schwach oder nicht betroffenen Individuen auf (PORTENGEN et al.

1999; STERN et al. 2004). Eine konträre Sichtweise bezüglich der Bedeutung der IgG-

Isotypen verdeutlichen die im Zusammenhang mit der spezifischen Immuntherapie (SIT)

erhaltenen Daten. Ein Verschwinden der klinischen Symptome unter der Therapie ging mit

einem Anstieg von IgG1 und IgG4 einher (OHASHI et al. 1997; FLICKER et al. 2002) bzw.

konnte mit dem Verhältnis von IgG4 zu IgG1 korreliert werden (GEHLHAR et al. 1999).

Für das Pferd, das im Gegensatz zu anderen Spezies über sieben verschiedene IgG-Isotypen

verfügt (WAGNER et al. 2004), ist die Bedeutung der einzelnen Isotypen für die Allergie

noch nicht geklärt. Zudem ist unklar, inwiefern die entsprechenden Isotypen von Mensch und

Pferd hinsichtlich ihrer Funktion gleichgesetzt werden können. Vergleiche der

korrespondierenden Isotypen der beiden Spezies lassen vermuten, dass eine Gleichsetzung

nicht ohne Einschränkungen vorgenommen werden kann (WEGE 2004).

Die Bindung von IgG erfolgt bei Mensch und Maus über die Rezeptoren FcγRI, FcγRIIB1

und FcγRIIB2 sowie über FcγRIII, die auf Mastzellen exprimiert werden (DAERON et al.

1995; OKAYAMA et al. 2000). Sowohl über die Kreuzvernetzung der FcγRI als auch FcγRIII

konnte eine Degranulation der Zellen ausgelöst werden (KATZ et al. 1992; RAVETCH &

CLYNES 1998; TKACZYK et al. 2002 & 2004). Hingegen resultierte die Bindung von

Immunkomplexen an den FcγRIIB1 und FcγRIIB2 sowie die Kreuzvernetzung dieser

Rezeptoren mit dem aktivierenden FcεRI in einer Inaktivierung der Zellen (BATARD et al.

1996; ZHANG et al. 2004). An den FcγRIIB1 und FcγRIIB2 können mit hoher Affinität

Antikörper des Isotyps G1 binden, mit geringer Affinität auch IgG4. Allerdings steigt für

immunkomplexiertes IgG4 (IgG4, das z. B. an ein Allergen gebunden hat) die

Bindungsaffinität an den Rezeptor erheblich.

22

Literaturübersicht

Auch auf der Oberfläche von Granulozyten des Pferdes wird die Existenz des FcγRIIB1,

FcγRIIB2 und FcγRIII vermutet (AGGARWAL & HOLMES 2000). Welche Funktion diese

Rezeptoren einnehmen und welche Isotypen daran binden, ist noch nicht bekannt. Eine

Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten des Pferdes gelang durch die Inkubation

mit einem Antikörper mit Spezifität für schwere Ketten von equinem IgG sowie für equine

leichte Ketten (GEIBEN 2003; ROHWER 2004). Es konnte gezeigt werden, dass bei einigen

Pferden nur durch diesen Antikörper, nicht aber durch einen IgE-spezifischen Antikörper,

eine Histaminfreisetzung ausgelöst werden konnte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass

beim Pferd möglicherweise eine Sensibilisierung auch über Antikörper des Isotyps G erfolgen

kann. Eine Bestimmung des sensibilisierenden IgG-Isotyps gelang nicht. Durch

Kreuzvernetzung von IgG1, 4 und 5, die an noch unbekannten Rezeptoren auf den basophilen

Granulozyten binden, konnte eine Inhibition der Zellen bei Einwirkung eines gleichzeitigen

aktivierenden Stimulus (Culicoides nubeculosus-Extrakt) induziert werden (ROHWER 2004).

2.1.4 Die spezifische Immuntherapie (SIT)

Allergien vom Typ I sind unter kausalen Aspekten bislang nur durch die SIT, auch als Hypo-

oder Desensibilisierung bezeichnet, heilbar (ROSS et al. 2000). Die SIT beruht auf dem

Prinzip, die überschießende Immunantwort gegen Allergene derart zu modulieren, dass

allergische Symptome beim betroffenen Individuum in abgemilderter Form auftreten oder

vollständig verschwinden (GEHLHAR et al. 1999). Erfolgreich war die Anwendung der SIT

für die Allergie gegen Pollen, Hausstaubmilben sowie gegen Bienen- und Wespengift

(EBNER 1999).

In Abhängigkeit von der Allergieform und der verfügbaren Allergene kommen

unterschiedliche Ansätze der SIT zum Einsatz. Ihnen allen gemeinsam ist das Prinzip, dass

die applizierte Allergendosis die Menge des natürlichen Eintrags deutlich überschreitet. Die

bekannteste Form ist die Langzeit-SIT, deren Gesamtdauer sich nach der Verbesserung der

klinischen Symptome richtet und die unter Umständen über mehrere Jahre andauert. Für die

Allergie gegen Bienen- und Wespengift ist zudem die erfolgreiche Anwendung kürzerer

Therapien beschrieben (BIRNBAUM et al. 1993). Die Applikation der Allergene erfolgt

mehrheitlich als subkutane Injektion, jedoch sind auch orale, nasale oder sublinguale

Verabreichungen möglich (SABBAH et al. 1994; ANDRI et al. 1995). Die besten Erfolge

23

Literaturübersicht

erzielte die SIT mit definierten, rekombinanten Allergenen (WESTRITSCHNIG et al. 2002).

Zum einen war die Dosis des Allergens exakt determinierbar, zum anderen konnten

unerwünschte Sensibilisierungen gegen bislang nichtallergene Komponenten ausgeschlossen

werden. Einen weiteren Vorteil bot die Möglichkeit, bei Polyallergikern (bspw. Individuen

mit einer gleichzeitigen Sensibilisierung gegen mehrere Pollenarten) gemeinsame Allergene

verschiedener Quellen zu bestimmen und somit durch die gezielte Desensibilisierung mit

diesen Komponenten die Allergie zu therapieren. Bei der Anwendung von groben Extrakten

in der SIT lag die Heilungsrate deutlich niedriger, vereinzelt wurde eine Verschlechterung der

Symptomatik beobachtet.

Die immunologischen Grundlagen der SIT sind bislang sowohl auf der zellulären Ebene als

auch auf der Ebene der Antikörper weitgehend unverstanden, auch wenn mehrere

Erklärungsmodelle vorliegen.

Für die Produktion von IgE, dem zentralen sensibilisierenden Antikörper-Isotyp der Typ-I-

Allergie, ist die Synthese von IL-4 notwendig (vgl. 2.1.2.1). Es konnte gezeigt werden, dass

die Konzentration des IL-4 mit zunehmender Dauer der SIT signifikant sinkt (SECRIST et al.

1993). Gleichzeitig wurde ein Anstieg der Zytokine IL-12 und Interferon γ (INF-γ)

beobachtet, die eine Induktion von TH 1- Zellen bewirken und die Bildung von TH2-Zellen

sowie eine vorrangige Antikörperproduktion unterdrücken (DURHAM et al. 1996; HAMID et

al. 1997). Somit wurde konstatiert, dass durch die SIT eine Immundeviation von einer

vormals TH2-geprägten Antwort zu einer vornehmlichen TH1-Reaktion bewirkt wird. Jedoch

bleibt dieses Modell die Erklärung schuldig, warum trotz deutlicher Reduktion der TH2-

Zellen die Serum-IgE-Spiegel nahezu unbeeinflusst von der SIT blieben (EBNER et al. 1999).

Neben den genannten Zytokinen konnte ein Anstieg von IL-10 und Tumornekrosefaktor ß

(TNF-ß) unter der SIT bestimmt werden (AKDIS & BLASER 1999; JUTEL et al. 2003). Für

beide Zytokine ist bekannt, dass sie eine Anergie von T-Zellen hervorrufen, die auch im Zuge

der SIT nachgewiesen werden konnte (SCHMIDT-WEBER & BLASER 2002). Die T-Zellen,

die diese Zytokine produzieren, lassen sich weder der TH1- noch der TH2-Antwort zuordnen.

Sie werden als regulatorische T-Zellen bezeichnet und treten auch unabhängig von

allergischen Erkrankungen bei der Induktion von Toleranzen auf (MOTTET et al. 2003).

Durch den Nachweis solcher T-Zellen wurde deutlich, dass weniger die Ausbildung einer

TH1- oder TH2-Antwort als vielmehr das Verhältnis von T-Effektorzellen (TH1- und TH2-

24

Literaturübersicht

Zellen) zu regulatorischen T-Zellen das Verschwinden der klinischen Symptomatik unter der

SIT erklären kann (SCHMIDT-WEBER & BLASER 2004).

Andere Modelle favorisieren dagegen als Begründung des Therapieerfolgs die Produktion

protektiver Antikörper durch die SIT. Es konnte gezeigt werden, dass der Anstieg der

Antikörper-Spiegel von IgG1 und 4 durch die SIT mit einer deutlichen Verbesserung der

allergischen Symptomatik einherging (OHASHI et al. 1997; GEHLHAR et al. 1999). Als

ursächlich für die klinischen Befunde wurde die Bildung von Immunkomplexen aus Allergen

und IgG angesehen, die an hemmende Rezeptoren (FcγRIIB) auf den Effektorzellen binden

und damit eine Aktivierung der Zellen unterbinden (vgl. 2.1.3).

2.2 Das Sommerekzem des Pferdes

Das Sommerekzem des Pferdes ist eine saisonal auftretende allergische Dermatitis. Erstmalig

wurde die Erkrankung – jedoch ohne Berücksichtigung der allergischen Genese - im Jahr

1840 von französischen Pferdehaltern beschrieben (UNKEL 1985). Mittlerweile ist das

Krankheitsbild des Sommerekzems nahezu weltweit bekannt: als Queensland itch in

Australien als allergic urticaria in Israel, als Kasen in Japan, als sweet itch, summer eczema

oder insect bite hypersensivity im englischsprachigen Raum, als ardeurs in Frankreich und als

dermite estivale recidivante in spanisch-sprachigen Ländern.

2.2.1 Epidemiologie, Ätiologie, Klinik und Pathogenese des Sommerekzems

Die vom Sommerekzem betroffenen Pferderassen umfassen Araber, englische Vollblüter,

Islandpferde, deutsche Warm- und Kaltblüter, Quarter Horses sowie verschiedene

Ponyrassen. Je nach untersuchter Pferdepopulation schwankt die Erkrankungshäufigkeit

zwischen 11 und 70 % (HALLDORSDOTTIR & LARSEN 1991; LITTLEWOOD et al.

1998; RÜSBÜLDT 2001). In Deutschland zählt das Islandpferd zu den stärker betroffenen

Rassen. Besonders hohe Prävalenzen von bis zu 70 % wurden bei Islandpferden beobachtet,

die aus Island exportiert wurden (RÜSBÜLDT 2001).

Das Alter, in dem die klinische Symptomatik des Sommerekzems zum ersten Mal in

Erscheinung tritt, liegt beim Islandpferd bei über 94 % der untersuchten Pferde zwischen vier

25

Literaturübersicht

und fünf Jahren (UNKEL 1985; HALLDORSDOTTIR & LARSEN 1991). Ein frühes

Eintrittsalter von vier Jahren wird vorwiegend bei den aus Island exportierten Pferden

berichtet. Jüngere Tiere zeigen in der Regel keine Anzeichen der Erkrankung. Bei einigen

Fohlen und Jährlingen konnte jedoch nachgewiesen werden, dass ihre basophilen

Granulozyten als Effektorzellen der Typ-I-Allergie bereits gegen Blut saugende Insekten, die

Auslöser des Sommerekzems, sensibilisiert waren (KOBELT 2001).

Ein Einfluss von Geschlecht, Farbe oder Größe auf die Ausprägung des Sommerekzems

konnte ausgeschlossen werden (HALLDORSDOTTIR & LARSEN 1991). Auch für eine

Korrelation der Allergie mit den Blutplasmaspiegeln von Zink und Kupfer wurden keine

Hinweise gefunden (STARK et al. 2001).

Die Vererblichkeit des Sommerekzems scheint multifaktoriell zu sein und erfolgt mit einer

sehr geringen Heritabilität von etwa 10 % (UNKEL 1985; MARTI et al. 1992). Allerdings

wurde in einigen Warmblutlinien in der Schweiz eine Assoziation zwischen Ausprägung

sowie Vererbung des Sommerekzems mit bestimmten Typen von MHC II-Molekülen

festgestellt (LAZARY et al. 1994).

Durch intrakutane Applikation von Extrakten verschiedener stechender Insekten bei

erkrankten Pferden und/oder durch In-vitro-Testssysteme konnten in erster Linie die Blut

saugenden weiblichen Mücken der Gattung Culicoides als Auslöser des Sommerekzems

identifiziert werden (QUINN et al. 1983; HECK 1991). Von den regional zum Teil erheblich

variierenden Culicoides spp. wurde die Beteiligung zahlreicher Arten an der Ausprägung der

Erkrankung nachgewiesen (vgl. Tab. 2). Daraufhin wurde postuliert, dass die für das

Sommerekzem verantwortlichen Allergene in nahezu jeder Gnitzenspezies vorhanden sind

und identische Reaktionen bei der Mehrzahl der betroffenen Pferde hervorrufen (MARTI et

al. 1999). Neben den Gnitzen wurden auch unter Verwendung von Extrakten anderer

haematophager Insekten, u. a. der Gattungen Stomoxys, Tabanus und Simulium, positive

Reaktionen im Intrakutan- oder In-vitro-Test bei erkrankten Pferden beobachtet, so dass eine

Beteiligung dieser Insekten am Sommerekzem vermutet wird (BAKER & QUINN 1978;

HECK 1991; MARTI et al. 1999). Allerdings liegen aus Regionen, in denen Culicoides spp.

nicht heimisch sind, wohl aber eine oder mehrere der weiteren genannten Gattungen (u. a. auf

Island, verschiedenen Nordseeinseln, in Küsten- und Berggebieten) keine Berichte über das

Auftreten des Sommerekzems in der Pferdepopulation vor.

26

Literaturübersicht

Das klinische Bild des Sommerekzems lässt sich in verschiedene Stadien unterteilen

(RÜSBÜLDT 2001): Im ersten Stadium erscheinen stecknadelkopf- bis zu drei Zentimeter

große Umfangsvermehrungen der Haut, die einen starken Juckreiz hervorrufen. Durch

Scheuern der betroffenen Stellen entwickelt sich das zweite Stadium des Ekzems, das

gekennzeichnet ist durch Alopezie (Verlust von Deck- und Langhaar) und Exkoriationen.

Letztere manifestieren sich zunächst in oberflächlichen Hautabschürfungen, später auch in

Kutis durchtrennenden Verletzungen. An dieses Stadium können sich sekundäre Infektionen

oder Ulzerationen anschließen. Infolge der permanenten Reizung tritt zudem eine

Proliferation der Kutis auf, die zur Hautverdickung (Pachydermie) mit Faltenbildung führt.

Mit nachlassender Allergenexposition kommt es in der Regel zur Abheilung der Läsionen.

Die häufigsten Lokalisationen des Sommerekzems sind die Mähne, der Schweifansatz und die

dorsale und ventrale Mittellinie (s. Abb. 1). Je nach Stärke der Ausprägung der Allergie führt

die Erkrankung zur erheblichen Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Tiere sowie zur

eingeschränkten Nutzung der Pferde in Freizeit- und Turniersport.

(a) (b)

Abb. 1 (a, b) Klinische Ausprägung des Sommerekzems Die typischen Symptome des Sommerekzems äußern sich in lokaler Alopezie, offenen Wunden und Krustenbildung sowie einer Zunahme der Hautdicke mit nachfolgender Faltenbildung. Zu den häufigsten Lokalisationen der Veränderungen zählen die Mähne (a), die Schweifrübe (b) sowie die dorsale (a, b) und ventrale Mittellinie. Die Pfeile kennzeichnen die Allergie bedingten Läsionen bei einem am Sommerekzem erkrankten Pferd im Hochsommer (Juli 2003).

Verschiedene Versuchsansätze zeigen, dass der dem Sommerekzem zugrunde liegende

Pathomechanismus primär eine Hypersensibilisierungsreaktion vom Soforttyp (Typ-I-

27

Literaturübersicht

Allergie) ist. Dies ergibt sich zum einen aus Beobachtungen der klinischen Symptome, die

sich beim überwiegenden Teil der intradermal mit Culicoides-Extrakten behandelten Pferde

innerhalb einer halben Stunde einstellten (FADOK & GREINER 1990). Zum anderen zeigten

histopathologische Untersuchungen der Hautveränderungen deutlich erhöhte Zahlen an

Mastzellen und eosinophilen Granulozyten sowie lokale Ödeme (KUROTAKI et al. 1994).

Funktionelle In-vitro-Tests erbrachten, dass basophile Granulozyten aus dem Blut betroffener

Pferde bei Kontakt mit Culicoides-Komponenten Histamin und weitere Mediatoren

(vgl. 2.1.2.2) freisetzen, ein Vorgang, der das Vorhandensein und die Bindung

sensibilisierender, für Typ-I-Allergien spezifischer Immunglobuline an diese Zellen

voraussetzt (BRUENNLEIN 2001; KAUL 1998; MARTI et al. 1999).

2.2.2 Diagnostische Ansätze zum Sommerekzem

Zur Diagnostik des Sommerekzems und weiterer Typ I-allergischer Erkrankungen des Pferdes

stehen verschiedene Testsysteme zur Verfügung, deren Aussagekraft und Zuverlässigkeit

jedoch umstritten ist.

Ein Ansatz beruht auf dem Nachweis der Bindung von Serum-IgE an Präparationen

verschiedener Insekten und Pflanzen im Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

(KALINA et al. 2003). Die Diagnose stützt sich darauf, dass allergische Pferde höhere IgE-

Titer gegen die Komponenten der Extrakte besitzen als die gesunden Kontrollpferde.

Die Diagnostik Typ I-allergischer Erkrankungen auf der Basis des allergenspezifischen

Serum-IgE-Titers wird jedoch in der Humanmedizin zunehmend als unzureichend angesehen

(AALBERSE 2000). Dies beruht darauf, dass häufig keine Korrelation zwischen klinischer

Ausprägung der Allergie und Höhe des Serum-IgE-Spiegels besteht (GEHLHAR et al. 1999;

STERN et al. 2004) und teilweise trotz deutlicher Symptomatik kein allergenspezifisches IgE

im Serum nachweisbar ist (NIEDERBERGER et al. 2001). Weiterhin konnte gezeigt werden,

dass die Höhe des allergenspezifischen IgE-Spiegels abhängig von der Intensität der

Allergenexposition ist und dass auch bei nicht-allergischen Individuen IgE in stark

variierenden Konzentrationen im Serum präsent sein kann (MIMURA et al. 2004). Bei der

Verwendung von groben Allergenpräparationen kann zudem nicht ausgeschlossen werden,

dass Kreuzreaktivitäten mit den nichtallergenen Bestandteilen auftreten, die zu falsch

positiven Ergebnissen führen können. Schlussendlich ist zu beachten, dass die Halbwertszeit

28

Literaturübersicht

von IgE im Serum mit zweieinhalb Tagen relativ gering ist, so dass die Zeit, die zwischen

Entnahme der Serumprobe und Untersuchung im ELISA vergeht, entscheidenden Einfluss

auf die Ergebnisse haben kann (HIRANO et al. 1983).

Inwieweit sich diese, aus der Humanmedizin erhaltenen Erkenntnisse auf das Pferd

übertragen lassen, ist noch unklar. Die Anzahl der allergischen Pferde, deren IgE keine

Reaktivität im ELISA zeigte oder diejenigen Pferde, die trotz des Fehlens klinischer

Symptome auf eine breite Palette von Allergenpräparationen reagierten, deuten jedoch darauf

hin, dass auch die equinen Serum-IgE-Spiegel nur unzureichend Aufschluss über die

tatsächliche Ausprägung des Sommerekzems und weiterer Allergien geben können.

Neben der Allergiediagnostik anhand der Serum-Immunglobulin-Spiegel stehen mit dem

Intrakutantest (Skin Prick Test, SPT) und dem funktionellen In-vitro-Test

(HALLDORSDOTTIR et al. 1989; ANDERSON et al. 1993; KAUL 1998; MARTI et al.

1999; KOLM-STARK & WAGNER 2002) zwei Methoden zur Verfügung, die die

Allergiebereitschaft auf der Ebene der Effektorzellen (Mastzellen, basophile Granulozyten)

nachweisen. Beim SPT wird durch die intrakutane Verabreichung von Allergenpräparationen

die Sensibilisierung der lokalen Mastzellen untersucht. Die Reaktivität der Zellen wird

anhand der Zunahme der Hautdicke im Vergleich zur Negativkontrolle bestimmt. Im In-vitro-

Test werden die Blutzellen der Pferde mit verschiedenen Allergenextrakten inkubiert. Die

Aktivierung, vornehmlich der basophilen Granulozyten, wird anhand der Messung

spezifischer Mediatoren (z. B. Histamin, Sulfoleukotriene) vorgenommen.

Obwohl beide Testsysteme im Gegensatz zum ELISA die Reaktionsbereitschaft des

Individuums auf die Allergenpräparationen erfassen, korrelieren die Ergebnisse nicht immer

mit der Klinik. Es konnte an 81 Islandpferden in Österreich gezeigt werden, dass ein positiver

SPT mit Culicoides sonorensis (variipennis) nicht nur bei den ekzemkranken Pferden auftrat,

sondern auch bei vielen gesunden Kontrolltieren (KOLM-STARK & WAGNER 2002). Im

In-vitro-Test wurden für einen Teil der klinisch gesunden Pferde Histaminfreisetzungen aus

den Blutzellen auf Extrakte aus Culicoides nubeculosus wie auch weiterer haematophager

Insekten gemessen (GEIBEN 2003). Klinisch gesunde und am Sommerekzem erkrankte

Pferde zeigten im Intrakutantest wie auch im In-vitro-Test zudem häufig Reaktionen mit

Extrakten aus der nicht haemotophagen Eintagsfliege und der ebenfalls nicht Blut saugenden,

in Nordamerika heimischen Feuerameise (GEIBEN 2003; MORRIS & LINDBORG 2003).

29

Literaturübersicht

Die häufige, nicht vorhandene Korrelation von Testergebnissen und Klinik kann in erster

Linie auf die fehlende Standardisierung des Allergengehalts, die noch unbekannte Anzahl der

verschiedenen Allergene in den verwendeten Extrakten sowie die Kreuzreaktivität einzelner

Komponenten zurückgeführt werden. Zusammenfassend ist somit unter Verwendung grober

Allergenpräparationen weder der Intrakutantest noch der In-vitro-Test für eine zuverlässige

Diagnostik des Sommerekzems geeignet.

2.2.3 Therapeutische Ansätze zum Sommerekzem

Eine kausale Therapie des Sommerekzems existiert bisher nicht. Versuche zur

Hyposensibilisierung allergischer Pferde wurden bislang mit Ganzkörperextrakten aus

Culicoides spp. durchgeführt (ANDERSON et al. 1996). Nach zweijähriger Therapie im

wöchentlichen Rhythmus bei zehn Pferden mit Sommerekzem konnte bei drei Pferden ein

vollständiges Verschwinden der klinischen Symptomatik beobachtet werden, bei weiteren

fünf Pferden traten die Läsionen in abgeschwächter Form auf. Prinzipiell ist neben dem

partiellen Erfolg der Therapie jedoch zu beachten, dass die Verwendung grober

Allergenpräparationen grundsätzlich das Risiko birgt, dass Immunreaktionen, insbesondere

gegen nichtallergene Bestandteile der Extrakte, ausgelöst werden können.

Erfolgreiche therapeutische Ansätze beschränken sich bislang auf die symptomatische

Behandlung des Ekzems durch die Gabe von entzündungshemmenden Kortikosteroiden, die

jedoch aufgrund massiver Nebenwirkungen (Hufrehe, erhöhte Anfälligkeit für

Infektionskrankheiten verschiedenster Genesen u. a.) nicht für eine Langzeittherapie geeignet

sind (FREY & LOESCHER 2001). Von Tierärzten wie Patientenbesitzern verwendete

alternative Methoden in Form von Homöopathika, Eigenblutbehandlungen, Bioresonanz oder

biologisch aktiven Peptiden zeigten keine zuverlässige und dauerhafte Verminderung der

Allergiebereitschaft (RÜSBÜLDT 2001). Ebenso konnte kein dauerhafter und zuverlässiger

Einfluss der weit verbreiteten Therapien mit Ökozon, Allergostop® I (Gegensensibilisierung

nach Theurer), Baypamun N® (Immunmodulator) oder Insol®Dermatophyton

(Hautpilzvakkzine) auf das Sommerekzem nachgewiesen werden (BRUENNLEIN 2001).

So liegt der Behandlungsschwerpunkt derzeit in der für Pferd und Besitzer aufwändigen,

belastenden und nicht immer zuverlässigen Vermeidung der Allergenexposition durch

30

Literaturübersicht

Auftragen von Repellents, Anlegen von Ekzemerdecken, Aufstallen oder Transport des Tiers

in die mückenfreien Berg- oder Küstenregionen (RÜSBÜLDT 2001).

2.3 Untersuchungen zu Allergenen aus haematophagen Insekten

Die Anzahl der bislang identifizierten Allergene aus haematophagen Insekten ist gering. Es

sind drei Allergene aus dem Katzenfloh Ctenocephalides felis bekannt, dessen Stiche bei

Hunden und Katzen eine allergische Dermatitis verursachen können (MCDERMOTT et al.

2000). Weiterhin sind vier Allergene aus dem Moskito Aedes aegypti identifiziert

(vgl. Tab. 1: Aed a 3 und Aed a 4 sind bislang nicht in die Allergen-Datenbank aufgenommen

worden), deren allergische Wirkung beim Menschen von lokaler Dermatitis bis zum

anaphylaktischen Schock reicht (PENG & SIMONS 2004). Zudem wurde ein Allergen aus

der Raubwanze Triatoma protracta isoliert, deren Bisse bei allergischen Menschen zu

schweren anaphylaktischen Reaktionen führen können (PADDOCK et al. 2001).

2.3.1 Allergene des Katzenflohs (Ctenocephalides felis)

Erste Ansätze zur Identifizierung der Allergene aus dem Katzenfloh erfolgten über

Ganzkörperextrakte der Flöhe. Im Immunoblot wurde untersucht, welche Komponenten durch

IgE und IgG aus dem Serum flohallergischer Hunde und negativer Kontrolltiere gebunden

wurden (MCKEON & OPDEBEECK 1994). Für beide Gruppen konnte festgestellt werden,

dass eine Vielzahl verschiedener Komponenten von den Antikörpern erkannt wurde. Es

konnte anhand der detektierten Proteine weder ein Rückschluss auf potentielle Allergene des

Katzenflohs gezogen werden noch war es möglich, anhand der Antikörperbindung zwischen

Allergikern und Nichtallergikern zu differenzieren.

Um die Zahl nicht allergen wirksamer Komponenten einzuschränken, wurde in einem

weiteren Ansatz ein löslicher Extrakt aus den präparierten Speicheldrüsen der Flöhe

hergestellt (LEE et al. 1999). Die Komponenten des Extrakts wurden über

Gelfiltrationschromatographie nach ihrer Molmasse aufgetrennt und die einzelnen Fraktionen

an flohallergischen Hunden im Intrakutantest untersucht. Die häufigsten positiven Reaktionen

wurden für Proteine der Molmassen zwischen 8 und 12 kD sowie für ca. 40 kD gefunden. Die

Identifizierung der relevanten Allergene erfolgte nicht.

31

Literaturübersicht

Die Isolierung des ersten Allergens aus dem Katzenfloh (Cte f 1) gelang durch die

Fraktionierung von Flohspeichel über die Reversed-Phase-Chromatographie (FRANK et al.

1996; MCDERMOTT et al. 2000). Es wurde ein Protein mit einer Molmasse von 18 kD

isoliert, dass durch IgE gebunden wurde und eine starke biologische Aktivität im

Intrakutantest bei Hunden mit Flohallergie zeigte. Das aminoterminale Ende des 18 kD-

Protein wurde sequenziert (MCDERMOTT et al. 2000). Mit entsprechenden Primern wurden

die zugehörige komplementäre Desoxyribonukleinsäuren (cDNA) aus einer Genbank von

Ctenocephalides felis isoliert und in Insektenzellen kloniert. Das rekombinante Protein zeigte

wie das native Allergen eine positive Reaktion im Intrakutantest und wurde durch IgE aus

dem Serum flohallergischer Hunde gebunden. Die biologische Funktion des Allergens im

Katzenfloh ist bislang nicht bekannt. Neben dem Cte f 1 sind in der Allergen-Datenbank

(vgl. Tab. 1) zwei weitere Allergene aus dem Katzenfloh eingetragen.

2.3.2 Allergene der Stechmücke (Aedes aegypti)

Im Speichel von Aedes aegypti konnten etwa 20 verschiedene Proteine in der

Gelelektrophorese nachgewiesen werden (RACIOPPI & SPIELMAN 1987). Im Immunoblot

wurden mit dem Serum moskitoallergischer Personen acht IgE-bindende Proteine aus dem

Speichel bestimmt (PENG & SIMONS 1998). In weiteren Moskitospezies der Gattungen

Aedes und Culex konnten je nach Spezies zwischen drei und sechzehn IgE-bindende Proteine

im Speichel oder in Extrakten der Speicheldrüsen gefunden werden, die teilweise bei allen

Spezies vorkamen, andernteils speziesspezifisch waren.

Mittlerweile sind vier der Allergene aus Aedes aegypti (Aed a 1 - 4) in rekombinanter Form

erhältlich. Die Isolierung der Allergene Aed a 1, 2 und 4 erfolgte aus dem Speichel oder aus

Speicheldrüsenextrakten der Mücken auf der Proteinebene. So wurde das Allergen Aed a 1

durch die Kombination von Ionenaustauscherchromatographie und Reversed-Phase-

Chromatographie isoliert (CHAMPAGNE et al. 1995). Die zugehörige cDNA wurde aus

einer cDNA-Genbank aus Speicheldrüsen weiblicher Moskitos der Spezies Aedes aegypti

isoliert. Das Allergen Aed a 3 wurde direkt aus der Genbank durch die Untersuchung der

Klone mit dem Serum einer mit Aedes-Speichel immunisierten Maus erhalten (XU et al.

1998). Zur rekombinanten Expression wurden die für die Allergene kodierenden cDNA`s in

Insektenzellen kloniert. Die bislang näher untersuchten rekombinanten Allergene r Aed a 1, 2

32

Literaturübersicht

und 3 zeigten sowohl im In-vitro-Test als auch in vivo im Intrakutantest eine biologische

Aktivität bei allergischen Probanden (PENG & SIMONS 2004). Die meisten Patienten

reagierten auf r Aed a 1, die wenigsten auf r Aed a 2. Eine Reaktion nichtallergischer

Individuen wurde nicht beobachtet. Zudem wurden alle vier rekombinanten Allergene durch

IgE und auch IgG1 und 4 aus dem Serum allergischer Patienten gebunden (PENG et al. 1998

& 2001). Die biologische Identität der Allergene konnte für Aed a 1, 2 und 4 bestimmt

werden. Das Protein Aed a 1 ist eine Apyrase. Die funktionelle Bedeutung dieses Enzyms im

Moskitospeichel liegt in der Verhinderung der Thrombozytenaggregation durch Spaltung von

Adenosintriphosphat (ATP). Das Protein Aed a 2 gehört zur Familie der sog. D7-Proteine.

Die Funktion dieser Proteine ist bislang ungeklärt, ihr Vorkommen beschränkt sich auf die

Speicheldrüsen der weiblichen Blut saugenden Insekten. Das Protein Aed a 4 ist eine α-

Glukosidase. Dieses Enzym dient dem Verdau von Kohlenhydraten bei der Aufnahme von

Pflanzensäften. Es kommt bei vielen haematophagen Insektenspezies in den Speicheldrüsen

der männlichen und der weiblichen Tiere vor (PENG & SIMONS 2004).

2.3.3 Allergene der Raubwanze (Triatoma protracta)

Eines der Hauptallergene aus der Raubwanze Triatoma protracta wurde durch die

Kombination aus Kationenaustauscherchromatographie und Reversed-Phase-

Chromatographie isoliert und sequenziert (PADDOCK et al. 2001). Aus den präparierten

Speicheldrüsen der Wanze wurde die zugehörige mRNA isoliert, in cDNA umgeschrieben

und in Hefen kloniert. Das rekombinante Protein wurde von nicht näher charakterisierten

Antikörpern eines allergischen Patienten gebunden, eine Überprüfung der biologischen

Aktivität wurde nicht durchgeführt. Für die biologische Funktion des Allergens, das zur

Familie der Lipocaline gehört, wird eine antihaemostatische Wirkung angenommen.

2.4 Culicoides spp.

2.4.1 Biologie von Culicoides spp.

In der Systematik der Arthropoda (Gliederfüßer) gehört die Gattung Culicoides zur Familie

der Ceratopogonidae (Gnitzen) und der Ordnung der Dipterida (Zweiflügler) (ROMMEL et

33

Literaturübersicht

al. 2000). Zur Gattung Culicoides zählen über 1000 verschiedene Arten sowie zahlreiche

Unterarten, die weltweit verbreitet sind und von der Subarktis bis in die Tropen auftreten. Nur

in wenigen Ländern wie z. B. Island sind Culicoides spp. nicht vorhanden. Die Bezeichnung

der Gattung variiert zwischen den Kontinenten: Im Allgemeinen werden die Insekten im

englischsprachigen Raum als midges oder biting midges bezeichnet, in Amerika werden

Culicoides spp. teilweise als no see-ums (aufgrund der Größe) oder punkies (aufgrund der bei

den meisten Arten gefleckten Flügel) benannt. In Australien ist diese Gattung unter dem

Namen sandflies bekannt (BRAVERMAN 1994).

Abb. 2 Culicoides nubeculosus beim Stechakt (Photo mit freundlicher Genehmigung von Dr. Philip Mellor, Institute for Animal Health, Pirbright, Großbritannien)

Culicoides nubeculosus ist die in Deutschland vorherrschende Gnitzen-Spezies und wird auch in weiteren Ländern Europas angetroffen. Die Art gehört mit etwa 3 mm Körperlänge zu den größeren Vertretern ihrer Gattung. Als anautogene Spezies müssen die weiblichen Insekten bereits für die Ablage des ersten Eipaketes Blut aufnehmen. Die Hauptwirte von Culicoides nubeculosus stellen Pferde und Rinder dar.

Adulte Insekten der Gattung Culicoides haben eine Größe von 1,5-4 mm. Die Vermehrung

erfolgt ausschließlich in der warmen Jahreszeit. Über insgesamt vier Larvenstadien und eine

Mumienpuppe vollzieht sich die Entwicklung zu den Imagines. In Abhängigkeit von der

Spezies und den klimatischen Bedingungen dauert ein Entwicklungszyklus 23 Tage. Für die

Entwicklung der Larven wird ein Feuchtbiotop benötigt. Culicoides spp. sind ortsgebunden,

34

Literaturübersicht

sie legen in der Regel nur wenige hundert Meter an Flugstrecken zurück, können aber bei

geeigneten Windverhältnissen über viele Kilometer verbreitet werden.

Die weiblichen Tiere benötigen für die Eiablage Blut, das sie je nach Art von einem mehr

oder weniger begrenzten Wirtsspektrum von Säugetieren und Vögeln aufnehmen. In

Abhängigkeit von der Culicoides spp. variieren neben den Wirten auch die bevorzugten

Einstichslokalisationen am Tier (BRAVERMAN 1988). Der Stechakt erfolgt meistens in der

Dämmerung oder während der Nacht. Die männlichen Tiere ernähren sich ausschließlich von

Pflanzensäften. Die unterschiedlichen Anforderungen an die weiblichen und männlichen

Speicheldrüsen spiegeln sich in einem deutlichen Geschlechtsdimorphismus dieser Organe

wider (PEREZ DE LEON et al. 1994). Weibliche Speicheldrüsen bestehen aus einem

untergliederten Hauptteil einer Größe von 0,5 mm sowie vier akzessorischen Speicheldrüsen

kleineren Umfangs. Es gilt als wahrscheinlich, dass die Haupt- und akzessorischen

Speicheldrüsen für die Produktion unterschiedlicher Speichelkomponenten zuständig sind.

Welche Komponenten in welchem Teil der Drüsen produziert werden, ist nicht bekannt.

Männliche Speicheldrüsen bestehen im Gegensatz zu den weiblichen Drüsen lediglich aus

einem wenig untergliederten Hauptteil, der eine Größe von 0,17 mm aufweist.

2.4.2 Untersuchungen zu Culicoides spp. vor dem Hintergrund ihrer Bedeutung als Vektoren von Pathogenen

Culicoides spp. sind häufige Vektoren für zahlreiche Krankheitserreger. So gelten Culicoides

sonorensis (ehemals variipennis) in Nordamerika sowie Culicoides imicola in Afrika, im

mittleren Osten und in Südeuropa als wichtigste Überträger des Virus der Blauzungen-

Krankheit, die bei Rindern (subklinischer Verlauf) und Schafen zu erheblichen

wirtschaftlichen Schäden führt (GERRY et al. 2001; CETRE-SOSSAH et al. 2004). Neben

weiteren viralen Erkrankungen (Afrikanische Pferdepest, Bovine ephemeral fever, Akabane)

werden auch verschiedene Parasiten (Onchocerca spp., Leukozytozoon caulleryi,

Haemoproteus nettionis) übertragen (BRAVERMAN 1994; YERUHAM et al. 2002;

MELLOR & HAMBLIN 2004).

Aufgrund der Bedeutung der Gnitzen als Vektor galt der Zusammensetzung des Speichels im

Hinblick auf die Verbreitung der Krankheitserreger ein großes Interesse. Zur

Charakterisierung der enthaltenen Proteine wurde ein Extrakt aus den Speicheldrüsen von

35

Literaturübersicht

Culicoides sonorensis hinsichtlich des Vorkommens antihaemostatischer Komponenten

untersucht (PEREZ DE LEON et al. 1996, 1997 & 1998). Es gelang der Nachweis einer

Apyrase, einem Enzym, das die Aggregetion von Blutplättchen durch die Spaltung von

Adenosintriphosphat (ATP) verhindert. Dieses Enzym, das bei vielen bislang untersuchten

haematophagen Insekten nachgewiesen werden konnte, fand sich sowohl in den

Speicheldrüsenextrakten weiblicher Culicoides als auch in geringerer Konzentration bei den

männlichen Tieren. Durch Auftrennung der Komponenten des Extrakts in der

Gelfiltrationschromatographie wurde die höchste Apyrase-Aktivität in einer Fraktion

festgestellt, die Proteine einer Molmasse von etwa 35 kD enthielt. Des weiteren wurden

Hinweise auf das Vorkommen eines Proteins gefunden, dass die katalytische Aktivität des

Gerinnungsfaktors Xa inhibierte. Dem Protein konnte eine geschätzte Molmasse von 28 kD

zugeordnet werden. Zusätzlich wurde die vasodilatatorische Aktivität der

Speicheldrüsenextrakte untersucht. Eine Vasodilatation wurde nur in den Extrakten

nachgewiesen, die von nicht gefütterten weiblichen Mücken präpariert wurden. Nach der

Fütterung war eine entsprechende Aktivität nicht mehr feststellbar. Die höchsten Werte

ergaben sich für eine Fraktion mit Proteinen der Molmasse von etwa 22 kD. Eine weitere

Charakterisierung der beschriebenen Speichelkomponenten erfolgte nicht.

Ebenfalls aufgrund der Bedeutung von Culicoides spp. als Vektoren wurden Protein

vermittelte Resistenzen der Insekten untersucht. Es gelang die Isolierung eines

Hitzeschockproteins aus Culicoides sonorensis, das den Insekten eine Anpassung an kältere

Temperaturen ermöglicht (ABDALLAH et al. 2000a). Weiterhin wurde eine Glutathion S-

Transferase dieser Gnitzenspezies isoliert und sequenziert, deren Aktivität in Zusammenhang

mit Resistenzen gegen Insektizide gebracht wird (ABDALLAH et al. 2000b).

Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit den phylogenetischen Unterschieden der

Cytochrom C-Oxidase (Untereinheit 1 und 2) bei den zehn verschiedenen Unterarten von

Culicoides imicola in Südafrika (LINTON et al. 2002). Als vornehmlicher Überträger des

Virus der Blauzungenkrankheit gilt Culicoides bolitinos. Um eine zuverlässige Methode zur

Abgrenzung dieser Unterart von den übrigen unabhängig vom Entwicklungsstadium (Larve,

Puppe, Imago) zu etablieren und somit das Risiko einer Virusverbreitung in bestimmten

Regionen abschätzen zu können, wurden die Aminosäure- und Nukleotidsequenzen der

Cytochrom C-Oxidase analysiert.

36

Literaturübersicht

2.4.3 Untersuchungen zu Culicoides spp. vor dem Hintergrund der Allergie

Die Stiche vieler verschiedener Culicoides spp. rufen allergische Reaktionen bei Säugetieren

hervor. Das Spektrum der betroffenen Wirte umfasst dabei neben Pferden auch Esel, Schafe

und Rinder (YERUHAM et al. 1993) sowie den Menschen (SMITH et al. 1982). Im

Gegensatz zu der üblichen Reaktion auf Stiche von Culicoides spp., die gekennzeichnet ist

durch moderate Rötung, Schwellung und Schmerzhaftigkeit an der Einstichstelle, verursacht

die allergische Reaktion eine massive Dermatitis. Im Zuge dieser Reaktion treten starker

Juckreiz, Zunahme der Hautdicke mit Faltenbildung, offene Wunden und bei Tieren

Fellverlust auf.

Am häufigsten sind Pferde von allergischen Erkrankungen gegen Culicoides spp. betroffen.

Erste Hinweise auf eine Beteiligung der Gnitzen an der Allergie ergaben sich aus der

Koinzidenz der Einstichlokalisationen der Insekten und der Verteilung der Läsionen auf den

Pferden (MCCAIG 1973). Durch Intrakutantests oder In-vitro-Tests mit Ganzkörperextrakten

der Insekten konnte die Allergie auslösende Wirkung zahlreicher Culicoides spp. belegt

werden (s. Tab. 2).

Tab. 2 Culicoides-Spezies, die allergische Reaktionen beim Pferd verursachen

Spezies Referenz

C. chiopterus, C. obsoletus, C. impunctatus HALLDORSDOTTIR et al. 1989

C. obsoletus, C. cockerellii, C. imicola, C. biguttatus, C. sonorensis (ehemals C. variipennis)

ANDERSON et al. 1993

C. pulicaris MORROW et al. 1986

C. nubeculosus, C. sonorensis KAUL 1998

C. insignis, C. stellifer, C. niger, C. akchua, C. scanloni, C. lahillei, C. pusillus, C. edeni

GREINER et al. 1990

Verschiedene Culicoides spp. wurden in Intrakutantests und/oder in In-vitro-Testsystemen an Pferden mit Sommerekzem untersucht. Die in der Tabelle aufgeführten Spezies repräsentieren Spezies, die eine positive Reaktion bei allergischen Pferden hervorriefen und somit als Induktoren des Sommerekzems angesehen werden können.

37

Literaturübersicht

Als primäre Allergenquelle aus Culicoides spp. wird der Speichel weiblicher Gnitzen

angesehen, dessen Komponenten beim Stechakt in die Pferde gelangen. Es konnte allerdings

im In-vitro-Test gezeigt werden, dass auch durch Ganzkörperextrakte aus männlichen Tieren

und aus Larven von Culicoides nubeculosus, die noch keine ausdifferenzierten

Speicheldrüsen besitzen, eine Aktivierung allergischer Effektorzellen induziert wird (MARTI

et al. 1999; ALTHAUS et al. 2004). In immunhistologischen Untersuchungen an Culicoides

spp. mit Serum-Immunglobulinen von Pferden wurde deutlich, dass sich die stärkste

Konzentration IgE und IgG detektierter Komponenten in den Speicheldrüsen der Gnitzen

befand (WILSON et al. 2001). Diese Beobachtung wurde sowohl bei der Untersuchung mit

Antikörpern aus Seren ekzemkranker als auch gesunder Pferde erhoben. Für beide Gruppen

wurde zudem festgestellt, dass Antikörper bindende Komponenten auch im gangliösen

Nervensystem, im Auge und im Zytoplasma von Zellen im hinteren Abdomen nachweisbar

waren. Aus diesen Ergebnissen wurde gefolgert, dass die allergen wirksamen Komponenten

aus den Insekten nicht ausschließlich im Speichel der weiblichen Tiere lokalisiert sind.

Versuche zur Identifizierung der relevanten Allergene aus den Gnitzen wurden einerseits

durch Fraktionierung von Ganzkörperextrakten aus Culicoides spp. und Untersuchung der

einzelnen Fraktionen im Intrakutantest (MORROW et al. 1986) vorgenommen. Die

Fraktionierungen erfolgten sowohl nach den Molmassen der im Extrakt enthaltenen Proteine

als auch nach den isoelektrischen Punkten der Komponenten. Im Intrakutantest konnte gezeigt

werden, dass reaktive Proteine in nahezu allen getesteten Fraktionen vorhanden waren.

Anhand der Ergebnisse wurde geschlussfolgert, dass mehrere Allergene oder verschiedene

Isoformen eines Allergens, die hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften differieren, am

Sommerekzem des Pferdes beteiligt sind.

Andererseits wurde wiederholt versucht, potentielle Allergene aus Culicoides spp. anhand der

Bindung durch equine Serum-Antikörper zu identifizieren (UNGAR-WARON et al. 1990;

WILSON et al. 2001; ALTHAUS et al. 2004). Im ELISA wurden nach der Molmasse

getrennte Fraktionen der Gnitzen mit Seren ekzemkranker Pferde und gesunder Kontrolltiere

untersucht und die Bindung von IgE und IgG an die Fraktionen bestimmt. Beide Isotypen

banden an Komponenten aus allen isolierten Fraktionen, so dass eine nähere Bestimmung

potentieller Allergene anhand der Antikörperbindung nicht möglich war (UNGAR-WARON

et al. 1990).

38

Literaturübersicht

Im Immunoblot konnte gezeigt werden, dass durch IgE wie auch durch IgG-Isotypen eine

Vielzahl von Proteinen des Ganzkörperextrakts gebunden wurde (WILSON et al. 2001;

ALTHAUS et al. 2004). Bei der Untersuchung mit IgG waren die Banden so zahlreich, dass

eine Differenzierung einzelner Proteine nicht möglich war (ALTHAUS et al. 2004). Ebenso

waren keine deutlichen Unterschiede in der Antikörperbindung zwischen ekzemkranken und

gesunden Pferden zu erkennen, vornehmlich bedingt durch eine interindividuelle Variation

der detektierten Proteine (WILSON et al. 2001). Als Ursache für die mit dieser Methode

erfolglose Identifizierung potentieller Allergene wurden Kreuzreaktivitäten der verwendeten

Antikörper diskutiert. Indirekt bestätigt wurde diese Theorie dadurch, dass auch Pferde aus

Island, die nie in Kontakt mit Culicoides spp. gekommen waren, Antikörper gegen

Bestandteile der Gnitzen aufwiesen.

Um eine weitere Charakterisierung der Immunglobulin gebundenen Komponenten aus

Culicoides zu ermöglichen, wurde eine cDNA-Expressions-Genbank von Culicoides

nubeculosus hergestellt (ALTHAUS et al. 2004). Eine Untersuchung der Genbank mit dem

gesamten Serum resultierte in starken Hintergrundfärbungen. Aus diesem Grunde wurden die

Antikörper, vornehmlich des Isotyps E, die für die Arbeit mit der Genbank verwendet werden

sollten, zunächst über den Immunoblot mit einem Ganzkörperextrakt der Gnitzen

affinitätsgereinigt. Es wurden insgesamt vier Banden mit Molmassen von 36, 40, 45 und

47 kD erhalten, die von den Immunglobulinen erkannt wurden. Die vier Antikörperfraktionen

wurden vom Blot eluiert und nacheinander zur Untersuchung der Genbank verwendet.

Lediglich die Immunglobuline, die im Immunoblot das 36 kD-Protein detektierten,

identifizierten einen Bakterienklon, dessen cDNA für ein ribosomales Protein kodierte. Das

rekombinant hergestellte Protein (r Cul n 1) wurde zwar im ELISA durch IgE und IgG

ekzemkranker und auch gesunder Pferde gebunden, im In-vitro-Test ließ sich jedoch keine

Reaktivität mit den Blutzellen ekzemkranker Pferde nachweisen.

Zusammenfassend wird deutlich, dass durch die geschilderten Ansätze weder die Isolierung

allergen wirksamer Komponenten aus Culicoides spp. gelang, noch konkrete Hinweise auf

potentielle Allergene erhalten wurden.

39

Geräte, Material und Methoden

3 Geräte, Material und Methoden

3.1 Geräte

Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage, Typ RO 50/14SMB Typ I

(Wasser- und Regenerierstation, Hamburg/Barsbüttel)

Aqua tridest. Aufbereitungsanlage SG Reinstwasser System Typ SG-RS90-4 UF

(Wasser- und Regenerierstation, Hamburg/Barsbüttel)

Autoklav Typ GE 406 (Fa. Getinge AB, Getinge, Schweden)

Blotkammer, halbtrocken (Fa. BioRad, München)

Bunsenbrenner mit automatischer Zündung (Fa. Wartewig, Göttingen)

Chemielumineszenz-Gerät (Fa. BioRad, München)

Eismaschine Typ UBE 30-10 (Fa. Ziegra, Isernhagen)

Elektrophoresekammer und Zubehör (Fa. BioRad Laboratories, München)

ELISA-Platten Photometer MR 5000 (Fa. Dynatech, Denkendorf)

ELISA-Platten Waschgerät (Fa. Dynatech, Denkendorf)

FPLC-Anlage (Liquid Chromatography Controller 500) und Zubehör

(Fa. Amersham Bioscience, Freiburg)

Gamma-Counter (LKB Wallac 1272 Clinigamma)

(Fa. Wallac 0y, Turku, Finnland)

HPLC-Anlage (Spectra System P 2000) und Zubehör

(Fa. Thermo Seperation Products, Dreieich)

HPLC-Anlage und Zubehör (Fa. Shimadzu, Duisburg)

Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor

(Fa. Heraeus, Osterode)

Laborwaage L310 (Fa. Sartorius, Göttingen)

Magnetrührer mit Heizplatte, Modell IKAMG RH

(Fa. Jahnke und Kunkel, Staufen)

Massenspektrometer (Quadrupole time-of-flight mass spectrometer, QTOF2) und Zubehör

(Fa. Micromass, Manchester, United Kingdom)

Mikrowelle (Fa. Quelle, Hannover)

40


PH-Meter Typ 27 (Fa. Knick, Berlin)

Pipetten, einstellbar von 1-20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 100-1000 µl

(Fa. Abimed, Langenfeld)

Pipettierhilfe „accu-jet®“ (Fa. Brand, Wertheim)

Protean IEF Cell für die isoelektrische Fokussierung mit Zubehör

(Fa. BioRad Laboratories, München)

Reinwerkbank „LaminAir“ HL 2448 (Fa. Heraeus, Hanau)

Schüttelinkubator RS 90-4 UF (Fa. SG, Barsbüttel)

Speedvac mit Kühlfalle und Pumpe (Fa. Bachofen, Reutlingen)

Thermoblock Modell DB-3 (Fa. Thermo-DUX, Wertheim)

Tischzentrifuge Eppendorf 5402 (Fa. Eppendorf, Hamburg)

Überkopfschüttler (Fa. ASID, Bonz & Sohn, Unterschleißheim)

Wärmeschrank (Fa. Heraeus, Hanau)

3.2 Material

3.2.1 Laborbedarf

BioSil-SEC 125-5, Gelfiltrationschromatographie

(Nr. 125-0060, Fa. BioRad Laboratories, München)

Combitips, 1,25 ml (Nr. 0030048.407, Fa. Eppendorf, Hamburg)

Combitips, 2,5 ml (Nr. 0030069.447, Fa. Eppendorf, Hamburg)

Combitips, 5 ml (Nr. 0030 069.455, Fa. Eppendorf, Hamburg)

cyanbromid-aktivierte Sepharose (Nr. 17-0981-01, Fa. Amersham Bioscience, Freiburg)

Dialyseschläuche Spectra/Por, Ausschluss-Molmasse 10 kD

(Nr. E 869.1, Fa. Roth, Karlsruhe)

Einmalfilter, 0,2 µm (Nr. AX 0558-3, Fa. Renner, Darmstadt)

Einmalpipetten, 10 ml (Nr. 13017, Fa. Renner, Darmstadt)

Filterpapier GB001 (Nr. 426392, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel)

41


Filterpapier GB003 (Nr. 426892, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel)

Frischhaltefolie Einzelhandel

Glaskapillaren, goldbeschichtet (Nr. 2754-23, Fa. Protana, Odense, Dänemark)

Ionenaustauscher-Kit (Nr. 17-6001-01, Fa. Amersham Bioscience, Freiburg)

IPG-Streifen, isoelektrische Fokussierung (Nr. 163-2005, Fa. BioRad Laboratories, München)

Kapillarspitzen (200 µl) (Nr. 729016, Fa. Biozym, Hess.Oldendorf)

Klebefolie für ELISA-Platten (Nr. 3095 Fa. Corning Inc. NY, USA)

Mikrotiterplatte Nunc-Immuno-Plate, ELISA (Nr.363-401, Fa. Nunc, Wiesbaden)

Pasteurpipetten (Nr. 747720, Fa. Brand, Wertheim)

PD 10-Säulen (Nr. 17-0851-01, Fa. Amersham Bioscience, Freiburg)

Protein G-Sepharose (Nr. 17-0618-02, Fa. Amersham Bioscience, Freiburg)

Pipettenspitzen, blau und gelb (Nr.70/762002, Fa. Sarstedt, Nürnberg)

Reaktionsgefäß (0,5 ml) (Nr. 0030 121.023, Fa. Eppendorf, Hamburg)

Reaktionsgefäß (1,5 ml) (Nr. 616 201, Fa. Greiner, Frickenhausen)

Reversed Phase Säule (ET 250/8/4 Nucleosil 300-5 C18)

(Nr. 721668.40, Fa. Macherey-Nagel, Düren)

Röhrchen (5ml) (Nr. 2008, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg)

RS-Röhrchen (RIA), 5 ml (Nr. 115101, Fa. Greiner, Frickenhausen)

Superose 12 10/30, Gelfiltrationschromatographie

(Nr. 17-0538-01, Fa. Amersham bioscience, Freiburg)

Transfermembran, Immobilon P, Polyvinylidendifluorid (PVDF)

(Nr. IPVH 00010, Fa. Millipore, Eschborn)

Ultrafree 0,5 MWCO 5 kD (Nr. 01VS50038, Fa. Millipore, Eschborn)

Vivaspin 20 MWCO 3, 10, 30, 100 kD (Nr.VS2001, Fa. Vivascience, Hannover)

Zentrifugenröhrchen (15 ml) (Nr. 25315-15, Fa. Corning Costar, Bodenheim)

42


Zentrifugenröhrchen (50 ml) (Nr. 25335-50, Fa. Corning Costar, Bodenheim)

Zip-Tip P 10 (Nr. ZTC18S096, Fa. Millipore, Eschborn)

3.2.2 Reagenzien

2-Mercaptoethanol (ME) (Nr. 8683, Fa. Baker, Griesheim)

2,2`-Di-p-nitrophenyl-5,5`-diphenyl-3,3`-ditetrazoliumchlorid, Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT)

(Nr. 06428, Fa. Biomol, Hamburg)

3,3`,5,5`-Tetramethylbenzidine (TMB) (Nr. T-2885, Fa. Sigma, Deisenhofen)

3`,3`,5`,5`-Tetrabromophenolsulfophtalin Natriumsalz (Bromphenolblau)

(Nr. 15375, Fa. Serva, Heidelberg)

5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, p-Toluidinsalz (BCIP)

(Nr. B 8503, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Acetonitril (Nr. 9017, Fa. J.T. Baker, Griesheim)

Acrylamid/Bisacrylamid 30:0,8 (AA/BA) (Nr. 1820-101, Fa. Pharamcia, Freiburg)

Agarose (Nr. 155100-027, Fa. GibcoBRL, Eggenstein)

Ameisensäure (Nr. F 0507, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3) (Nr. A 6141, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Ammoniumpersulfat (APS) (Nr. A 7460, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Bicinchoninicacid (BCA)-Assay, Kit zur Bestimmung der Proteinkonzentration

(Nr. 23225, Fa. Perbio Science, Bonn)

Bovines Serumalbumin (BSA) (Nr. A 4378, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Calciumchlorid (CaCl2 x 2 H2O) (Nr. C 3881, Fa. Sigma, Deisenhofen)

3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS)

(Nr. C 5070, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Chemielumineszenz-Kit ECLTM Western Blotting Detection Reagents

(Nr. RPN 2135, Fa. Amersham Bioscience, Freiburg)

Citronensäure (x 1 H2O) (Nr. C 7129, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Coomassie Brilliant Blau (Nr. 17524, Fa. Serva, Heidelberg)

Bovines Cytochrom C aus dem Herzmuskel (Nr. C 2037, Fa. Sigma, Deisenhofen)

43


Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) (Nr. S-0876, Sigma, Deisenhofen)

Dimethylformamid (DMF) (Nr. D 4551, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Dimethylsulfoxid (DMSO) (Nr. D 5879, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Dithiothreitol (DTT) (Nr. 5545, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Endoprotease Endo Lys C (Nr. 11047825001, Fa. Roche, Mannheim)

Ethanol (Nr. 8229, Fa. J.T. Baker, Griesheim)

Essigsäure (99-100%) (Nr. 6052, Fa. J.T. Baker, Griesheim)

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) (Nr. ED2SS, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Formaldehyd 37% (Nr. 49794.1, Fa. Roth, Karlsruhe)

Gelatine (Nr. 4308 Fa. Roth, Karlsruhe)

Glutaraldehyd 25% (Nr. 529388, Fa. Merck, Hohenbrunn)

Glycerin (Nr. G 7757, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Glycin, kristallin (Nr. G 7126, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Guanidin (Hydrochlorid) (Nr. G 4505, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Harnstoff (Nr. U 0631, Fa. Sigma, Deisenhofen)

N-(2-Hydroxyethyl) piperazin-N´(2 -ethansulfonsäure) (HEPES)

(Nr. H 7523, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Histamin, freie Base (Nr. H 7125, Fa. Sigma Deisenhofen)

India Ink Einzelhandel

Iodacetamid (Nr. I 1149, Fa. Sigma Deisenhofen) 125Jod-Histamin-Tracer, < 130 kBq, 1 Flasche Lyophilisat gelöst in 5,5 ml A. dest.

(Sonderfertigung, Fa. LDN, Nordhorn)

Isopropanol, 2-Propanol (Nr. 8119, Fa. J.T. Baker, Griesheim)

Kaliumchlorid (KCl) (Nr. P 4504, Fa. Sigma, Deisenhofen)

L-Histidin (Nr. H 8776, Fa. Sigma Deisenhofen)

Magnesiumchlorid (MgCl2 x H2O) (Nr. M 0250, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Methanol (Nr. 8046, Fa. J.T. Baker, Griesheim)

Mineralöl (Nr. M 2163, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Molmassenstandard, Wide Range Marker (Nr. LC 5677, Fa. Invitrogen, Karlsruhe)

Molmassenstandard, Gelfiltration (Nr. 151-1901, Fa. BioRad, München)

44


N, N, N, N`-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

(Nr. T 8133, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Natriumacetat (Na-Acetat) (Nr. S 2889, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Natriumazid (NaN3) (Nr. 6688, Fa. Merck, Darmstadt)

Natriumcarbonat (Na2CO3) (Nr. S 2127, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Natriumchlorid (NaCl) (Nr. 9265.2, Fa. Roth, Karlsruhe)

Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4 x 2 H2O)

(Nr. 04269, Fa. Riedel-DeHaen, Hohenheim)

Natrium(Sodium)dodecylsulfat (SDS) (Nr. L-4390, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Natriumhydrogencarbonat (NaHCO2) (Nr. 63295, Fa. Merck, Darmstadt)

Natriumhydroxid (NaOH) (Nr. 55881, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Natriumthiosulfat (Nr. S 1648, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (Nr. L-182-10, Fa. Biochrom, Berlin)

Piperazin N,N’bis(2-ethansulfon)säure (Pipes)

(Nr. P 6757, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Polyethylenglycol 8000 (PEG) (Nr. 783641, Fa. Böhringer, Mannheim)

Salzsäure (HCl, 37%) (Nr. 6159, Fa. J.T. Baker, Griesheim)

Schwefelsäure 96 % (H2SO4) (Nr. 9316, Fa. Roth, Karlsruhe)

Silbernitrat (AgNO3) (Nr. 31639, Fa. Riedel-de Haen)

Streptavidin, Alkalische Phosphatase gekoppelt (Streptavidin-AP)

(Nr. S 2890, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Tetramethylbenzidine (TMB) (Nr. T 2885, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Trifluoressigsäure (TFA) (Nr. 28903, Fa. Perbio Science, Bonn)

1,2-Bis(dimethylamino)ethan (TEMED) (Nr. T 9281, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Trizma Base (Tris) (Nr. T 8524, Fa. Sigma, Deisenhofen)

T-Octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100)

(Nr. X 100, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Tween 20 (Nr. P 1379, Fa. Sigma, Deisenhofen)

Wasserstoffperoxid (H2O2) 30% (Nr. 21676-3, Fa. Sigma, Deisenhofen)

45


3.2.3 Antikörper und Nachweisreagenzien

Unkonjugierte monoklonale Antikörper

1. monoklonale Antikörper gegen equines IgE

(WAGNER et al. 2002)

2. monoklonaler Antikörper gegen equines IgG1

freundlicherweise zur Verfügung gestellt von P. Lunn (LUNN et al. 1998)





Unkonjugierte polyklonale Antikörper

1. affinitätschromatographisch gereinigte Ziegenantikörper gegen Pferde IgG (H+L)

(2,4 mg/ml)

Nr. 108-005-003, Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., USA

2. Eselantikörper gegen Ziegen IgG

(Konzentration nicht bestimmt)

Nr. 3AD497, Scantibodies, Schweden

3. Nativserum mit Ziegenantikörper gegen acyliertes Histamin


Arbeitsgruppe Immunologie, Tierärztliche Hochschule Hannover

4. Ziegenserum


Arbeitsgruppe Immunologie, Tierärztliche Hochschule Hannover

5. Ziegenantikörper gegen Cytochrom C von Rind, Maus, Hund, Kaninchen und Schwein

(0,5 mg/ml)

Nr. 234 (231), Fa. Dako A/S, Dänemark

46


Konjugierte polyklonale Antikörper

1. affinitätschromatographisch gereinigte Ziegenantikörper gegen Maus IgG (H+L)

alkalische Phosphatase gekoppelt (600 µg/ml)

Nr. 115-055-062, Fa. Dianova, Hamburg

2. affinitätschromatographisch gereinigte Ziegenantikörper gegen Maus IgG +

IgM (H+L); Peroxidase gekoppelt (Px)

Nr. 115-035-044, Fa. Dianova, Hamburg

3. affinitätschromatographisch gereinigte Ziegenantikörper gegen Kaninchen IgG (H+L);

Peroxidase gekoppelt (Px)

Nr. 050 (101), Fa. Dako A/S, Dänemark

3.2.4 Culicoides nubeculosus

Es wurden 6 g Gnitzen der Spezies Culicoides nubeculosus im tiefgefrorenen Zustand von der

Firma Greer Laboratories, USA, bezogen, die für die vorliegenden Untersuchungen

verwendet wurden. Bei den Insekten handelt es sich um einen Laborstamm. Es wurden

männliche und weibliche Tiere erhalten, deren Anteile an der Gesamtmenge nicht bestimmt

wurden.

Für vergleichende Untersuchungen (s. 4.1.1) wurde von der selben Firma ein lyophilisierter

Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus bezogen, der routinemäßig zur Diagnostik des

Sommerekzems in der Arbeitsgruppe Immunologie eingesetzt wird. Vor der Verwendung

wurde das Lyophilisat in A. dest. gelöst und die Lösung über eine PD 10-Säule (s. 3.2.1)

gereinigt.

3.2.5 Herkunft von Vollblut und Seren

Für die Histaminfreisetzung standen Vollblutproben von einer Herde mit 26 Islandpferden zur

Verfügung.

Zur Reinigung der equinen Serum-Immunglobuline und für den Immunoblot waren einmal

monatlich Seren der selben Pferden verfügbar.

47


Tab. 3 Auflistung der Islandpferde, die in die vorliegenden Untersuchungen eingingen

Nr. Geschlecht Geburtsjahr Klinisches SE

1 Stute 1992 positiv










22 Stute 1993 negativ




29 Hengst 2000 negativ

In der Tabelle sind die Pferde aus der Herde aufgeführt, deren Vollblut und/oder Serum in den vorliegenden Untersuchungen eingesetzt wurde. Die Spalten enthalten die Versuchsnummer des Tieres (Nr.), das Geschlecht, das Geburtsjahr und den klinischen Allergiestatus (Sommerekzem (SE) positiv oder negativ). Das Pferd Nr. 2 schied am 10. November 2003 nach einem Unfall aus dem Versuch aus.

3.2.6 Puffer und Lösungen

Alle aufgeführten Substanzen (s. 3.2.2) wurden – sofern nicht anders angegeben – in A. dest.

gelöst. Weiterhin wurden alle Puffer und Lösungen nach der Herstellung bei 4 ° C gelagert,

Ausnahmen sind entsprechend gekennzeichnet.

Reagenzien für die Extraktion löslicher Komponenten aus Culicoides nubeculosus

Extraktionspuffer

NH4HCO3 10 mM

Der Puffer wurde vor der Verwendung frisch angesetzt.

48


Reagenzien für die Biotinylierung

Kopplungspuffer, pH-Wert 8,6

NaHCO3 100 mM


Biotinlösung

NHS-Biotin 5 % (w/v)

Das Biotin wurde in einer Konzentration von 50 mg/ml in DMSO gelöst und bei einer Temperatur von – 20 °C gelagert. Aus der Stocklösung wurde die Biotinylierungslösung vor der Verwendung frisch angesetzt, als Lösungsmittel wurde der Kopplungspuffer verwendet.

Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH-Wert 7,4

NaCl 137 mM

KCl 2,7 mM

Na2HPO4 8,1 mM

KH2PO4 1,12 mM

Reagenzien für die Affinitätschromatographie

a) Puffer zur Elution der Affinitätssäulen

Eluierungspuffer, pH-Wert 3,0 und 2,0

Glycin 0,1 M

Eluierungspuffer, pH-Wert 3,5

HEPES 0,02 M

NaCl 0,75 M

Neutralisierungspuffer, pH-Wert 7,0

Tris 1 M

Neutralisierungspuffer, pH-Wert 11,7

Na2CO3 1 M

49


b) Puffer zur Kopplung der cyanbromid-aktivierten Sepharose

Kopplungspuffer, pH-Wert 8,8

NaHCO3 0,1 M

NaCl 0,5 M

Der Kopplungspuffer wurde vor der Verwendung frisch angesetzt.

Quellungspuffer

HCl 50 mM

Absättigungspuffer, pH-Wert 8,0

Tris 0,1 M

Waschpuffer I, pH-Wert 4,0

Na-Acetat 0,1 M

NaCl 0,5 M

Waschpuffer II, pH-Wert 8,0

Tris 0,1 M

NaCl 0,5 M

Reagenzien für den Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Beschichtungspuffer (A-Puffer), pH-Wert 9,6

Na2CO3 5 mM

NaHCO3 35 mM

Wasch- und Verdünnungspuffer (B-Puffer), pH-Wert 7,2

NaH2PO4 xH2O 2,5 mM

Na2HPO4 7,5 mM

NaCl 145 mM

Tween 20 0,1 %

Der Puffer wurde als 10-fach konzentrierte Stocklösung angesetzt und vor der Verwendung auf die Gebrauchskonzentration verdünnt.

50


Substratpuffer (C-Puffer), pH-Wert 5,0

Zitronensäure 33,3 mM

Na2HPO4 66,7 mM

Substratlösung

TMB in DMSO (0,15 %-ige Lösung) 15 mM

H2O2 5 mM

Die Lagerung des TMB erfolgte bei einer Temperatur von -20° C. Die Substanzen wurden unmittelbar vor der Verwendung im C-Puffer gelöst. Reagenzien für die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und die Immunpräzipitation (IP)

Trenngelpuffer (4x konzentriert), pH-Wert 8.8

Tris 1,5 M

SDS 0,4 % (w/v)

Sammelgelpuffer (4x konzentriert), pH-Wert 6.8

Tris 1,5 M

SDS 0,4 % (w/v)

SDS-Probenpuffer (2x konzentriert), pH-Wert 6.8

Tris 125 mM

SDS 4 % (w/v)

Glycerin 20 % (w/v)

Bromphenolblau 0,002 % (w/v)

Die Lagerung des Puffers erfolgte bei Raumtemperatur. Für einen nicht-reduzierenden

Gellauf wurden der mit SDS-Probenpuffer versetzten Probe 10% A. dest. zugesetzt, für einen

reduzierenden Lauf 10% 2-Mercaptoethanol.

Ammoniumpersulfat (APS)-Lösung

APS 10 % (w/v)

Die Lösung wurde vor Gebrauch jeweils frisch angesetzt.

51


SDS-Elektrodenpuffer, pH-Wert 8,3

Tris 25 mM

Na2HPO4 0,19 M

SDS 0,1 % (w/v)

Der Puffer wurde bei Raumtemperatur gelagert.

Gelzusammensetzung für die diskontinuierliche SDS-PAGE

Trenngel Sammelgel

Stärke des Gels 7,5 % 15 % 5 % AA/BA 2,44 ml 4,88 ml 0,83 ml Trenngelpuffer 2,5 ml 2,5 ml --- Sammelgelpuffer --- --- 1,25 ml A. dest. 5,02 ml 2,51 ml 2,87 ml APS-Lösung (10 %) 30 µl 30 µl 50 µl TEMED 10 µl 10 µl 5 µl Gelvolumen 10 ml 10 ml 5 ml Reagenzien für die zweidimensionale Gelelektrophorese

Rehydratisierungspuffer

Harnstoff 8 M

DTT 10 mM

CHAPS 1 % (w/v)

Bromphenolblau 0,75 % (w/v)

Der Harnstoff, das DTT und das CHAPS wurden in A. dest. gelöst und bei einer Temperatur

von -20 °C gelagert. Das Bromphenolblau wurde erst unmittelbar vor der Anwendung

zugegeben.

Äquilibrierungspuffer I

Harnstoff 6 M

Glyzerin 30 % (w/v)

SDS in 0,05 M Tris/HCl (pH-Wert 8,8) 2 % (v/v)

DTT 1 % (w/v)

Iodacetamid 0,26 M

52


Äquilibrierungspuffer II

Harnstoff 6 M

Glyzerin 30 % (w/v)

SDS in 0,05 M Tris/HCl (pH-Wert 8,8) 2 % (v/v)

Iodacetamid 0,26 M

Beide Äquilibrierungspuffer wurden vor Gebrauch frisch angesetzt.

Agaroselösung

Agarose 1 % (w/v)

Die Agarose wurde unter Hitzezufuhr in A. dest. gelöst.

Reagenzien für die Coomassie-Brilliant-Blau-Färbung

Coomassie-Brilliant-Blau-Färbelösung

Coomassie Briallant Blue 0,1 % (w/v)

Methanol 42 % (v/v)

Essigsäure 16 % (v/v)

Coomassie-Entfärbelösung

Methanol 30 % (v/v)


Sowohl die Färbe- als auch die Entfärberlösung wurden bei Raumtemperatur gelagert.

Reagenzien für die Silberfärbung

Fixierlösung I: entspricht der Coomassie-Entfärbelösung

Fixierlösung II

Ethanol 30 % (v/v)

Na-Acetat 0,5 M

Glutaraldehyd 0,5 % (w/v)

Natriumthiosulfat 0,2 % (v/v)

Mit Ausnahme des Glutaraldehyds, das kurz vor der Anwendung frisch zugesetzt wurde,

wurden alle Komponenten in A. dest. gelöst und bei Raumtemperatur gelagert.

53


Färbelösung

Silbernitrat 0,1 % (w/v)

Formaldehyd 0,01 % (v/v)

Das Silbernitrat wurde bei einer Temperatur von 4 °C als vierfach konzentrierte

Stammlösung gelagert. Unmittelbar vor der Verwendung wurde die Stammlösung im

Verhältnis 1:4 mit A. dest. verdünnt und das Formaldehyd zugefügt.

Entfärbelösung

Natriumcarbonat 2,5 % (w/v)

Formaldehyd 0,01 % (v/v)

Das Formaldehyd wurde unmittelbar vor der Verwendung zugesetzt.

Stopplösung

Na-EDTA 0,05 M

Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gelagert.

Reagenzien für das Western Blotting

Transferpuffer, pH-Wert 8,3

Tris 25 mM

Glycin 150 mM

Methanol 20 % (v/v)


Reagenzien für den Immunoblot

PBS / Tween-Waschpuffer

Tween 0,02 % (v/v)


Blockreagenz

Gelatine 1 % (w/v)

Die Lösung wurde vor Verwendung frisch angesetzt. Als Lösungsmittel wurde PBS/Tween-Waschpuffer verwendet. Die Gelatine wurde unter Rühren und Wärmezufuhr gelöst.

54


India Ink-Färbelösung


India Ink 0,1 % (v/v)

Die Lösung wurde vor jeder Färbung frisch hergestellt.

Substratlösung für die Alkalische Phosphatase (AP)

Tris-Acetat-Pufferlösung, pH 9,6; 0,15 M 25 ml

A. dest. 25 ml

MgCl2 200 µl

NBT (50 mg/ml in 70 % DMSO) 125 µl

BCIP (100 mg/ml in 100 % DMSO) 50 µl

Die Stammlösungen von NBT und BCIP wurden in DMF gelöst und bei einer Temperatur

von -20 °C gelagert. Die fertige Substratlösung wurde unmittelbar vor Gebrauch hergestellt. Reagenzien für den funktionellen In-vitro-Test (FIT)

a) Puffer

Pipes A, pH-Wert 7,2

NaCl 110 mM

KCl 5 mM

Pipes 25 mM

NaOH 40 mM

Pipes B, pH-Wert 7,4

NaCl 110 mM

KCl 5 mM

Pipes 25 mM

NaOH 40 mM

CaCl2 2 mM

MgCl2 2 mM

Tris-Puffer, pH-Wert 8,5

Tris 0,5 M

Tween 20 0,02 % (v/v)

55


b) Gebrauchslösungen

Histaminstandards

Die Reihe von Histamin-Standards enthielt Histamin in 0,1 N HCl in den

Endkonzentrationen 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng /ml, 3 ng/ml, 1 ng/ml oder 0,3 ng/ml. Das

Histamin wurde in 0,1 N HCl gelöst. Der Standard wurde in Aliquots bei einer Temperatur

von -20 °C gelagert.

NHS-Biotin und Acylierungsreagenz

Das NHS-Biotin wurde in einer Konzentration von 50 mg/ml in DMSO angesetzt und in

Aliquots zu 1 ml bei -20° C gelagert. Das NHS-Biotin wurde unmittelbar vor Gebrauch 1:25

mit Pipes A verdünnt.

c) Nachweisreagenzien

Reagenz zum Nachweis von Acylhistamin

Ziege-anti-Acylhistamin Serum (1 : 100 000 in PBS)

1 % (v/v)

Ziegenserum 1 % (v/v)

Natriumazid (10 %-ig) 0,2 % (v/v)

Als Lösungsmittel wurde PBS verwendet.

Präzipitationsserum

PEG 10 % (w/v)

Esel-anti-Ziege-Serum 1 % (v/v)

Triton X-100 (25 %-ig in PBS) 0,4 % (v/v)

Natriumazid (10 %-ig) 0,4 % (v/v)

Als Lösungsmittel wurde PBS verwendet.

Reagenzien für die Gelfiltrationschromatographie (GFC)

Tris-Puffer, pH-Wert 6,8

Tris 20 mM

CHAPS 1 mM


56


Reagenzien für die Ionenaustauscherchromatographie (IEX)

pH-Wert Puffer (50 mM) pKa-Wert Austauschertyp

4, 5 und 6 Na-Acetat 4,8 Kationenaustauscher

7 HEPES 7,2 Kationenaustauscher

8 HEPES 7,6 Kationenaustauscher

pH-Wert Puffer (20 mM) pKa-Wert Austauschertyp

5 Piperazin 5,7 Anionenaustauscher

6 L-Histidin 6,15 Anionenaustauscher

7, 8 und 9 Tris 8,1 Anionenaustauscher

Alle Puffer wurden zum einen ohne Zusatz von NaCl, zum anderen mit 1 M NaCl hergestellt.

Alle Puffer enthielten 1 mM CHAPS und wurden direkt vor der Verwendung hergestellt. Reagenzien für die Reversed-Phase-Chromatographie (RPC)

TFA-Puffer

TFA 0,1 % (v/v)

Der Puffer wurde bei Raumtemperatur gelagert.

Reagenzien für die Vorbereitung der Proteine zur Massenspektrometrie

Puffer für den Endo Lys C-Verdau, pH-Wert 8,5

Tris 1 M

Puffer zum Kalibrieren und Waschen des Zip-Tips

Ameisensäure 0,5 % (v/v)

Puffer zum Kalibrieren und zur Elution des Zip-Tips

Acetonitril 50 % (v/v)

Ameisensäure 0,5 % (v/v)

Alle Puffer für die Vorbereitung der Proteine für die Massenspektrometrie wurden bei

Raumtemperatur gelagert.

57


3.3 Methoden

3.3.1 Präparation von Culicoides nubeculosus

3.3.1.1 Extraktion löslicher Komponenten aus Culicoides nubeculosus

Als Ausgangsmaterial für alle Isolierungs- und Charakterisierungsansätze potentieller

Allergene wurde ein Ganzkörperextrakt (GKE) aus Culicoides nubeculosus hergestellt. Zur

Solubilisierung der löslichen Komponenten wurden 6 g tiefgefrorene Gnitzen (s. 3.2.4) mittels

Mörser und Pistill zerkleinert. Je Gramm Insektenmaterial wurden 10 ml Extraktionspuffer

(s. 3.2.6) hinzugefügt. Die Suspension wurde in ein Röhrchen überführt und über Nacht bei

4 °C im Überkopfschüttler (s. 3.1) moderat geschwenkt. Anschließend wurden die unlöslichen

Bestandteile durch Zentrifugation bei 4000 x g und 4 °C bei einer Dauer von 20 min

abgetrennt und der Überstand sterilfiltriert. Mit PD 10-Säulen (s. 3.2.1) wurden Salze und

Histamin aus dem GKE entfernt. Die Säulen wurden mit 25 ml A. dest. gewaschen, mit

jeweils 2,5 ml Extrakt beladen und mit 3,5 ml A. dest. eluiert. Nach erfolgter Reinigung

wurde die Proteinkonzentration des GKE bestimmt (s. 3.3.2). Der Extrakt wurde nach

Überprüfung der Reaktivität im FIT (s. 3.3.11) bis zur weiteren Verwendung in Aliquots bei

einer Temperatur von -80 °C tiefgefroren.

3.3.1.2 Biotinylierung der Proteine des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus

Kovalent mit NHS-Biotin (s. 3.2.2) markierte Proteine aus Culicoides nubeculosus wurden

genutzt, um mit hoher Sensitivität auch geringe Mengen (zweistelliger Nanogrammbereich)

der Gnitzen-Komponenten nachweisen zu können. Die optimale Biotinmenge von 12 µg

NHS-Biotin pro ml Gesamtprotein für die Markierung des Ganzkörperextrakts ergab sich aus

dem Verhältnis der Nachweisempfindlichkeit (Detektion im Immunoblot) und Erhalt der

biologischen Funktion (Bindung durch Antikörper) der Proteine (Daten nicht gezeigt). Der

GKE wurde zunächst über Nacht gegen den Kopplungspuffer (s. 3.2.6) dialysiert. Im zweiten

Schritt erfolgte die Kopplung mit NHS-Biotin (gelöst in DMSO, s. 3.2.6) für 2 h unter

Lichtausschluß im Überkopfschüttler. Abschließend wurde nicht gebundenes Biotin durch

Dialyse gegen PBS (s. 3.2.6) entfernt. Der biotinylierte Extrakt wurde nach Kontrolle des

Biotinylierungserfolges im Immunoblot (s. 3.3.10) in der Immunpräzipitation (s. 3.3.12)

verwendet.

58


3.3.2 Bestimmung des Proteingehalts

Zur Bestimmung der Proteinkonzentrationen wurde ein BCA-Kit (Nachweisbereich 200 µg

bis 2000 µg) angewandt (s. 3.2.2).

Das Prinzip der Proteinbestimmung beruht auf der Biuret-Reaktion. Im alkalischen Milieu

werden zweiwertige Kupferionen in Gegenwart von Proteinen unter Komplexbildung zu

einwertigen Kupferionen reduziert, die ihrerseits unter Bildung eines violetten Farbstoffs von

bicinconinic acid (BCA) komplexiert werden.

Die Proben wurden in Doppelansätzen in einer Verdünnungsreihe mit PBS (in

Zweierschritten bis 1:64) getestet. Als Referenz wurde mit einer Standard-Verdünnungsreihe

eines Proteins bekannter Konzentration (bovines Serumalbumin, s. 3.2.2) in gleicher Weise

verfahren. Von jeder Verdünnungsstufe wurden 50 µl zu 200 µl der vorgefertigten BCA-

Lösung in eine Mikrotiterplatte (s. 3.2.1) pipettiert und mit 10 µl der Probe für 30 min bzw.

60 min bei 37 °C inkubiert. Die Messung des Farbumschlags erfolgte im ELISA Platten-

Photometer (s. 3.1) bei einer Wellenlänge von 562 nm. Mit den Proteinen des Standards

wurde auf logarithmischem Papier eine Eichgerade erstellt, in der Proteinkonzentration in

mg/ml (X-Achse) und Höhe der gemessenen Extinktion in OD (Y-Achse) korreliert wurden.

Den gemessenen Extinktionen der Probe (Mittelwerte der Doppelansätze) konnten anhand der

Gerade die Proteinkonzentrationen zugeordnet werden.

3.3.3 Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie als Methode zur Reinigung von Komponenten aus

Substanzgemischen wurde zur Isolierung von Immunglobulinen der Isotypen G und E aus

Pferdeseren sowie zur Isolierung von Proteinen aus Culicoides nubeculosus angewandt.

Das Prinzip der Affinitätschromatographie basiert auf der nicht-kovalenten Bindung der zu

reinigenden Komponenten durch Matrix gekoppelte Liganden (z. B. Antikörper, Protein G),

die durch Absenken des pH-Wertes und/oder Erhöhung der Salzkonzentration wieder gelöst

werden kann.

Für alle Affinitätschromatographien wurden mit den Matrizes Säulen präpariert, die bei 10 °C

in einer computergesteuerten FPLC-Anlage (s. 3.1) beladen, gewaschen, eluiert und

regeneriert wurden. Die Proteingehalte der Flüssigkeiten wurden nach Passieren der Säulen

mit einem UV-Meter bei Wellenlängen von 260 und 280 nm überprüft und als

59


Chromatogramm mit der Software FPLC-Director™ dargestellt. Alle Chromatographien

erfolgten nach dem gleichen Grundschema. Zunächst wurden die Säulen mit dem Beladungs-

und Waschpuffer gewaschen, um die Basislinie im UV-Meter einzustellen. Danach wurde die

Beladung der Säulen durchgeführt, gefolgt von einem Waschgang zum Entfernen der

ungebundenen Komponenten, der mit Erreichen der Basislinie endete. Durch einen

Elutionspuffer wurden die gebundenen Komponenten von den Säulen eluiert. Nach erneutem

Erreichen der Basislinie wurden die Säulen abschließend mit dem Beladungs- bzw.

Waschpuffer regeneriert. Die für jede Affinitätschromatographie speziellen Bedingungen

hinsichtlich Volumina und Fließgeschwindigkeiten wurden in Vorversuchen ermittelt.

3.3.2.1 Affinitätschromatographie zur Reinigung von Immunglobulinen aus Pferdeseren

Kombinierte Reinigung von IgG1 und IgG4

Für die Reinigung von IgG1 und 4 aus dem Serum wurde Protein G gekoppelte Sepharose

(s. 3.2.2) verwendet, mit der eine Säule des Volumens von 10 ml hergestellt wurde. Pro

Reinigungsgang wurden 10 ml Serum auf die Säule gegeben, die zuvor sterilfiltriert und im

Verhältnis 1:25 mit PBS verdünnt wurden. Der Durchlauf der Protein G-Säule mit den

ungebundenen Komponenten wurde gesammelt und zur Reinigung von IgE genutzt (s. u.).

Die von Protein G gebundenen Immunglobuline wurden mit 30 ml Elutionspuffer (pH 3,0;

s. 3.2.6) von der Säule gelöst und in 15 ml Neutralisierungspuffer (pH 7,0; s. 3.2.6)

aufgefangen. Der Reinigungserfolg wurde in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) überprüft, die in den

Eluaten enthaltenen Isotypen im ELISA (s. 3.3.4) bestimmt. Die Protein G-Säule wurde nach

jedem Durchgang mit 50 ml Elutionspuffer pH 2,0 und nachfolgend 20 ml PBS gespült.

Trennung von IgG1 und IgG4

Für die Trennung von IgG1 und 4 wurde zunächst eine IgG4-Affinitätssäule hergestellt, durch

die IgG4 spezifisch gebunden wurde und von der Säule eluiert werden konnte, während das

IgG1 im Säulendurchlauf erschien. Gereinigte monoklonale Antikörper mit Spezifität für

equines IgG4 (s. 3.2.3) wurden nach Herstellerangaben kovalent an cyanbromidaktivierte

Sepharose (s. 3.2.2) gebunden. Analog zur Protein G-Sepharose wurde mit der gekoppelten

Sepharose eine Säule von 10 ml Volumen (s. 3.2.1) vorbereitet. Die fertige Säule wurde mit

dem im Verhältnis 1:50 mit PBS verdünnten Eluat der Protein G-Säule beschickt. Die Elution

60


erfolgte wie für das IgG beschrieben. Das Eluat und der Durchlauf wurden durch

Ultrafiltration (s. 3.3.13) mit Konzentratoren einer Ausschluß-Molmasse (Cut-Off) von

100 kD (s. 3.2.1) eingeengt und nach Untersuchung im BCA (s. 3.3.2) auf eine Konzentration

von 2 bzw. 1 mg/ml eingestellt. Die Kontrolle des Reinigungserfolges wurde wie für das

Eluat der Protein G-Säule beschrieben durchgeführt. Bis zur weiteren Verwendung im

Immunoblot (3.3.10), in der Immunpräzipitation (3.3.12) und in der

Affinitätschromatographie (3.3.2.2) wurden die Konzentrate bei einer Temperatur von -20 °C

gelagert. Die Säule wurde nach jedem Durchgang mit 50 ml Elutionspuffer pH 3,0 und

nachfolgend mit 20 ml PBS gespült.

Reinigung von IgE

Für die Reinigung von IgE wurde unter den gleichen Konditionen wie für die Trennung von

IgG1 und 4 beschrieben eine IgE-Affinitätssäule aus monoklonalen Antikörpern mit Spezifität

für equines IgE hergestellt (s. 3.2.3). Die Beladung der Säule erfolgte mit dem IgG1- und

IgG4-depletierten Durchlauf der Protein G-Säule. Die Elutionsparameter entsprachen dem für

die Reinigung von IgG geschilderten Vorgehen. Das Eluat wurde über Ultrafiltration auf ein

Volumen von 1 ml je gereinigtem Serum konzentriert. Die Untersuchung und Lagerung des

Konzentrats sowie die Regeneration der Affinitätssäule erfolgten analog dem beschriebenen

Vorgehen für die IgG1- und IgG4-Konzentrate bzw. für die IgG4-Affinitätssäule.

3.3.2.2 Affinitätschromatographie zur Isolierung von Komponenten aus Culicoides

nubeculosus

Für die Isolierung von Culicoides-Komponenten wurden Matrizes aus cyanbromidaktivierter

Sepharose (s. 3.2.1) benutzt, an die die unter 3.3.2.1 gereinigten equinen Immunglobuline

nach Anleitung des Herstellers gekoppelt wurden. Es wurden sechs verschiedene Matrizes

hergestellt, die jeweils ein Volumen von 5 ml besaßen und mit 7,5 mg Antikörper gekoppelt

wurden. Für die Kopplung wurden gereinigtes IgE (Matrix I), IgG1 (Matrix II) und IgG4

(Matrix III) aus dem Serum von zehn am Sommerekzem erkrankten Pferden sowie gereinigtes

IgE (Matrix III), IgG1 (Matrix IV) und IgG4 (Matrix III) aus dem Serum von fünf gesunden

Kontrollpferden verwendet. Mit den fertigen Matrizes wurden Säulen befüllt. Die Beladung

der Säulen erfolgte mit dem GKE aus Culicoides nubeculosus (jeweils 8 mg Gesamtprotein),

der bei einer Temperatur von 4 °C für 2 h auf den Säulen belassen wurde. Die Elution erfolgte

61


als Kombination aus pH-Wert-Absenkung und Erhöhung der Salzkonzentration (s. 3.2.6)

durchgeführt. Das Eluat wurde mit Neutralisierungspuffer (pH 11,7, s. 3.2.6) versetzt, durch

Ultrafiltration mit Konzentratoren eines Cut-Off von 3 kD eingeengt und mehrfach mit Pipes

B (s. 3.2.6) gewaschen. Anschließend wurde die Reaktivität der Eluate im FIT (s. 3.3.11)

überprüft.

3.3.4 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Die in der Affinitätschromatographie (s. 3.3.2.1) gewonnenen Eluate der Protein G-, IgG4-

und IgE-Affinitätssäule sowie das native Serum und die Durchläufe der letzteren beiden

Säulen wurden im ELISA hinsichtlich der enthaltenen Isotypen charakterisiert.

Die Technik des hier angewandten ELISA-Systems beruht darauf, dass alle in den Fraktionen

enthaltenen equinen Immunglobuline initial über einen Fänger-Antikörper gebunden und

damit angereichert werden. Anschließend werden aus der Mischung der angereicherten

Immunglobuline einzelne Isotypen durch Isotyp spezifische Antikörper gebunden. Der

Nachweis dieser Bindung und damit des Vorkommens des jeweiligen Isotyps in der Fraktion

erfolgt durch Enzym gekoppelte Detektionsantikörper und Substrat, die einen messbaren

Farbumschlag induzieren.

Zur Beschichtung der Flachboden-Mikrotiterplatten (3.2.1) wurde ein polyklonaler

Antikörper mit Spezifität für die schweren Ketten equiner IgG-Isotypen und die leichten

Ketten aller equinen Isotypen (s. 3.2.3) verwendet. In Vorversuchen war festgestellt worden,

dass dieser Antikörper neben IgG auch alle anderen equinen Immungloblin-Isotypen über die

leichten Ketten bindet. Der Antikörper wurde in einer Konzentration von 4 µg/ml im

Beschichtungspuffer (s. 3.2.6) und einem Volumen von 100 µl je Vertiefung eingesetzt und

die Platte bei einer Temperatur von 4 °C über Nacht inkubiert.

Vor der weiteren Verwendung wurde die Platte für 30 min bei Raumtemperatur auf einem

Mikrotiterplattenschüttler (s. 3.1) bei 500 rpm inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen mit

Waschpuffer (s. 3.2.6) im Waschgerät für ELISA-Platten (s. 3.1) wurden das native Serum,

die Eluate und die Durchläufe in verschiedenen Verdünnungsstufen auf die Platte verbracht.

Für den Nachweis des in hohen Konzentrationen im Serum enthaltenen IgG1 und IgG4

wurden die sechs Fraktionen in den Verdünnungsstufen 1:104 bis 1:106 aufgetragen; für den

Nachweis der geringer konzentrierten Antikörper der Isotypen IgG5 und IgE wurden

62


Verdünnungen von 1:103 bis 1:105 gewählt (jeweils in Zehnerschritten). Die Verdünnung

erfolgte mit dem Waschpuffer. Die Platte wurde für 1 h auf dem Schüttler bei

Raumtemperatur inkubiert.

Nach erneutem Waschen wurden Isotyp spezifische, murine monoklonale Antikörper für

equines IgG1, IgG4, IgG5 und IgE (als Zellkulturüberstände, s. 3.2.3) in den

Verdünnungsstufen 1:40 (anti IgG1 und anti IgG4), 1:20 (anti IgG5) und 1:10 (anti IgE)

zugegeben. Je Vertiefung wurden 50 µl pipettiert, die Platte wurde für 1 h auf dem Schüttler

bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach erneutem Waschen mit Waschpuffer wurde ein polyklonaler Peroxidase (Px)

gekoppelter Detektionsantikörper mit Spezifität für schwere und leichte Ketten von murinem

IgG und IgM (s. 3.2.3) in einer 1:105 Verdünnung mit Waschpuffer und einem Volumen von

50 µl je well dazugegeben. Nach einstündiger Inkubation auf dem Schüttler und

abschließendem Waschen wurden jeweils 50 µl Substratlösung (s. 3.2.6) zupipettiert und die

Platte für 20 min bei Lichtausschluß inkubiert. Gestoppt wurde die Reaktion mit jeweils 50 µl

Schwefelsäure (s. 3.2.2). Die Farbreaktion wurde anschließend im ELISA- Plattenphotometer

(s. 3.1) bei einer Absorption von 450 nm und 630 nm gemessen.

Zur Überprüfung unspezifischer Bindungen wurde der Detektionsantikörper direkt mit dem

Beschichtungsantikörper inkubiert. Zur Überprüfung der Bindung des Detektionsantikörpers

an die equinen Immunglobuline wurden Serum, Eluate und Durchläufe ohne die Isotyp

spezifischen Antikörper inkubiert.

3.3.5 Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

In der SDS-PAGE wurden anhand der nachweisbaren Proteinbanden die Anzahl, die

Molmassen und die Reinheit der aus den equinen Seren sowie aus den Gnitzen gereinigten

Komponenten bestimmt. Zudem stellte sie den ersten Schritt für den spezifischen

Proteinnachweis im Immunoblot (s. 3.3.10) dar.

Das Prinzip dieser Methode beruht auf der Trennung von Proteinen nach ihrer Molmasse im

elektrischen Feld in einer Polyacrylamidmatrix, die von Proteinen kleiner Größe schneller

durchwandert werden kann als von größeren Proteinen. Durch Zusatz des anionischen

Detergenz Sodiumdodecylsulfat (SDS; s. 3.2.2) und ggf. des Reduktionsmittels

63


Mercaptoethanol (s. 3.2.2; Spaltung von Disulfidbrücken) in Kombination mit Erhitzung wird

vor der Trennung allen in der Probe enthaltenen Proteinen eine einheitlich negative Ladung

verliehen und ihre dreidimensionalen Strukturen aufgelöst.

Die Trennung erfolgte in einer vertikalen Elektrophoresekammer (s. 3.1) bei einer konstanten

Spannung von 200 V. Das Trenngel hatte eine Dicke von 1 mm und wurde in Abhängigkeit

der aufgetragenen Proben in unterschiedlicher Porengröße hergestellt. Für die nicht

reduzierten Immunglobuline aus dem Serum wurde ein 7,5 %-iges Gel verwendet, für die

Proteine aus Culicoides nubeculosus kamen 15 %-ige Gele zum Einsatz. Zur Vorbereitung

der Proteine wurden 15 µl Probe mit 15 µl Probenpuffer (s. 3.2.6) und ggf. 3 µl

Mercaptoethanol versetzt, für 10 min im Heizblock (s. 3.1) bei einer Temperatur von 100 °C

erhitzt und anschließend bei 10 000 x g kurz zentrifugiert. Für den Probenauftrag wurde ein

Sammelgel (diskontinuierliche SDS-PAGE, LAEMMLI 1970) mit zehn Taschen vorbereitet.

Von jedem Ansatz wurden 30 µl in eine Tasche pipettiert. Zur Beurteilung der Molmasse

wurde ein Standard von Proteinen bekannter Größe (s. 3.2.2) aufgetrennt. Anschließend

wurden die Proteine entweder in der Coomassie Blau-Färbung (s. 3.3.7), in der Silberfärbung

(s. 3.3.8) oder mit Hilfe des Immunoblotting-Verfahrens (s. 3.3.10) sichtbar gemacht.

3.3.6 Zweidimensionale Gelelektrophorese

Die zweidimensionale Gelelektrophorese wurde angewandt, um den isoelektrischen Punkt

und die Molmasse der isolierten Proteine aus Culicoides nubeculosus zu bestimmen sowie

ihre Reinheit zu überprüfen.

Die Methode basiert darauf, Proteine nach zwei voneinander unabhängigen Parametern, ihrer

Ladung und ihrer Molmasse, zu trennen. Der erste Schritt beinhaltet eine isoelektrische

Fokussierung in einem immobilisierten pH-Gradienten (IPG), in dem die Proteine bis zu dem

pH-Wert wandern, wo ihr isoelektrischer Punkt liegt. An die isoelektrische Fokussierung

schließt sich eine Trennung nach der Molmasse in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) an.

Die isoelektrische Fokussierung erfolgte in einem Fokussiergerät (s. 3.1) auf sieben

Zentimeter langen IPG-Streifen (s. 3.2.2) mit einem pH-Gradienten von 7,0 bis 10,0. Der

Streifen wurde zunächst einige Minuten bei Raumtemperatur aufgetaut und dann zum Quellen

des trockenen IPG-Gels für 12 h in eine Mischung aus Rehydratisierungslösung (s. 3.2.6) und

Probe eingelegt. Der Anteil der Probe betrug 30 bis 50 µl und wurde mit der

64


Reydratisierungslösung auf ein Endvolumen von 125 µl aufgefüllt. Um ein Verdunsten der

Lösung während der Inkubation zu verhindern, wurden Streifen und Lösung mit Mineralöl

(s. 3.2.2) überschichtet. Nach Beendigung der Rehydratisierung wurde das Mineralöl entfernt

und der Streifen in die Elektrophoresezelle verbracht. Unter den Streifen auf die Elektroden

wurde jeweils ein feuchtes Filterpapier gelegt, um eine Salzkristallisation zu vermeiden. Der

Streifen wurde während der Fokussierung erneut mit Mineralöl überschichtet, um ein

Austrocknen zu verhindern. Die Fokussierung erfolgte nach folgendem Programm:

Phase Dauer Voltzahl

1 1 h 200 V

2 0,5 h 500 V

3 0,5 h 1 000 V

4 bis zum Erreichen von 10 000 Vh

4 000 V

Nach dem Abschluss der isoelektrischen Fokussierung wurde der Streifen aus der Zelle

entnommen und bis zur weiteren Verwendung bei einer Temperatur von -20 °C gelagert.

Vor der Verwendung in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) wurde der Streifen nacheinander in zwei

Äquilibrierungslösungen (s. 3.2.6) für jeweils 10 min geschwenkt. Danach wurde er auf das

Trenngel der zweiten Dimension gelegt und mit flüssiger Agarose (s. 3.2.6) überschichtet. An

einer Seite des Streifens wurde zuvor ein Filterpapier platziert, das mit einem

Molmassenstandard (s. 3.2.2) getränkt wurde. Die Elektrophorese erfolgte nach den unter

3.3.5 beschriebenen Punkten.

3.3.7 Coomassie-Blau-Färbung nach Sambrook

Zur unspezifischen Färbung aller im Gel befindlichen Proteine wurden die SDS-Gele nach der

Elektrophorese aus den Kammern entnommen und für 30 min in Coomassie-Brilliant-Blau-

Färbelösung (s. 3.2.6) geschwenkt (SAMBROOK et al. 1989). Mit dieser Färbung konnten

Proteinkonzentrationen bis in den einstelligen Mikrogrammbereich nachgewiesen werden.

Zum Entfärben des Hintergrundes wurde das Gel in A. dest. zwei Mal für 6 min in der

65


Mikrowelle erhitzt und ggf. in Coomassie-Entfärber (s. 3.2.6) weiter entfärbt, bis sich die

Banden deutlich vom Hintergrund abhoben. Das SDS-Gel wurde anschließend eingescannt.

3.3.8 Silberfärbung nach Heukeshoven und Dernick

Die Silberfärbung wurde ebenfalls zur unspezifischen Färbung der im Gel aufgetrennten

Proteine genutzt; durch sie konnten jedoch Proteinkonzentrationen bis zu 1 ng/ml

nachgewiesen werden (HEUKESHOVEN & DERNICK 1988). Das aus der

Elektrophoresekammer entnommene Gel wurde zunächst für jeweils 30 min in zwei

unterschiedliche Fixierlösungen (s. 3.2.6) gelegt. Durch dreimaliges Waschen mit A. tridest.

wurden die Reste der Lösungen entfernt. Für 15 min wurde das Gel in die Färbelösung

(s. 3.2.6) verbracht und anschließend in die Entwicklerlösung (s. 3.2.6) überführt. Nach

Erscheinen deutlicher Banden nach etwa 5 bis 10 min wurde die Farbentwicklung durch

Dekantieren der Entwicklerlösung und Zugabe der Stopplösung (s. 3.2.6) unterbunden. War

das Gel vor der Silberfärbung bereits mit Coomassie Brilliant Blue-Färbelösung sowie

Entfärber behandelt, entfiel die Fixation des Gels.

3.3.9 Western Blotting

Um die getrennten Proteine aus dem SDS-Gel im Immunoblot (s. 3.3.10) genauer

charakterisieren zu können, wurden die Proteine aus dem Gel vorab auf eine PVDF-

Blotmembran (s. 3.2.1) im Western Blot übertragen. Der Proteintransfer erfolgte in einer

feuchten Blotkammer (s. 3.1) im elektrischen Feld (Semidry-Blotting, KHYSE-ANDERSEN

1984). Die im trockenen Zustand hydrophobe PVDF-Membran wurde für 10 min in Methanol

getränkt und anschließend in den Transferpuffer (s. 3.2.6) eingelegt. Das Gel wurde im

Transferpuffer luftblasenfrei auf die Membran verbracht. Als leitendes Material wurden an

jeder Elektrode drei Puffer getränkte, dicke Filterpapiere (s. 3.2.1) positioniert. Zwischen die

Filterpapiere wurden Gel und Membran gelegt, wobei sich das Gel auf der Seite der Kathode

befand. Das Blotting erfolgte für 30 min bei einer Spannung von 10 V.

66


3.3.10 Immunoblotting

Der Immunoblot wurde zum Nachweis biotinylierter Culicoides-Komponten sowie zur

Überprüfung der Reaktivität equiner Serum-Immunglobuline mit Gnitzen-Proteinen

angewandt. Zudem wurde er für Untersuchungen zur Kreuzreaktivität der Serum-Antikörper

mit bovinem Cytochrom C eingesetzt.

Das Prinzip der Methode beruht darauf, dass die mittels SDS-PAGE und Western Blot

vorbereiteten Proteine analog zum ELISA (s. 3.3.4) direkt oder nach ein oder mehreren

Zwischenschritten durch Enzym gekoppelte Reagenzien (z. B. Antikörper, Streptavidin)

anhand der Substratreaktion nachgewiesen werden. Als zusätzliche Information im Gegensatz

zum ELISA kann Rückschluss auf die Molmassen der detektierten Proteine gezogen werden.

Der Nachweis der biotinylierten Proteine des Ganzkörperextraktes aus Culicoides

nubeculosus erfolgte durch Inkubation mit Enzym gekoppeltem Streptavidin (Streptavidin-

AP; s. 3.2.2). Das Streptavidin-AP wurde im Verhältnis 1: 5000 mit Waschpuffer (s. 3.2.6)

verdünnt.

Für den Nachweis der isolierten Proteine aus Culicoides nubeculosus wurden folgende, mit

Waschpuffer verdünnte Antikörper in der angeführten Reihenfolge verwendet:

a) Antikörper aus Pferdeseren:

Eingesetzt wurden über Affinitätschromatographie gereinigtes IgG1 und 4 und IgE (s. 3.3.2.1)

in Konzentrationen von 50 µg/ml. Für den Nachweis der IgG5-Bindung wurde der Durchlauf

der IgE-Affinitätssäulen im Verhältnis 1:2 verdünnt.

b) monoklonale, Isotyp spezifische Antikörper für equines IgG1, 4, 5 und IgE (s. 3.2.3)

Die Antikörper wurden als Zellkulturüberstände in Verdünnungen von 1:2 eingesetzt.

c) Ziege anti Maus IgG (H+L) Antikörper, Alkalische Phosphatase (AP) gekoppelt (s. 3.2.3)

oder Ziege anti Maus IgG (H+L) Antikörper, Peroxidase (Px) gekoppelt (s. 3.2.3)

Die Nachweisantikörper wurden in einer Verdünnung von 1:5000 verwendet.

Für den Nachweis des bovinen Cytochrom C (s. 3.2.2) wurden folgende, mit Waschpuffer

verdünnte Antikörper eingesetzt:

a) polyklonale Ziegenantikörper mit Spezifität für Cytochrom C von Hund, Schwein,

Kaninchen, Rind und Maus (s. 3.2.3)

Die Antikörper wurden im Verhältnis 1:10 verdünnt.

67


b) Ziege anti Kaninchen IgG (H+L) Antikörper, Peroxidase (Px) gekoppelt (s. 3.2.3)

Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:5000 eingesetzt.

Vor der Inkubation mit den Nachweisreagenzien wurde die aus dem Western Blot erhaltene

Membran zur Absättigung freier Bindungsstellen für 20 min in einer Blocklösung (s. 3.2.6)

geschwenkt und danach mit dem Waschpuffer gespült. Anschließend wurde die Membran auf

eine Glasplatte gelegt, mit einem Antikörper-Lösung getränkten dünnen Filterpapier (s. 3.2.1)

überschichtet und mit einer zweiten Glasplatte abgedeckt. Die Inkubationszeit für alle

Antikörper betrug 1 h bei Raumtemperatur. Zwischen den Inkubationsschritten wurde die

Membran drei Mal für jeweils 10 min unter moderatem Schwenken in Waschpuffer

gewaschen. Die Bindung des Enzym gekoppelten Nachweisantikörpers wurde durch 20-

minütige Inkubation in Substratlösung (s. 3.2.6) unter Lichtausschluß nachgewiesen. Die

Reaktion wurde nach der Entwicklung sichtbarer Banden durch Dekantieren der

Substratlösung sowie durch die Zugabe von Methanol (s. 3.2.2) gestoppt. Um ein Entfärben

der Membran zu verhindern, wurde sie abschließend mit A. dest. gespült. Die Bindung des

Px-gekoppelten Detektionsantikörpers wurde durch eine dreiminütige Inkubation mit

Substratlösung (s. 3.2.2) und nachfolgender Chemiluminiszenz (s. 3.1) sichtbar gemacht. Die

Belichtungszeit betrug bis zu 5 min. Um scharfe Banden zu erhalten, wurde die Iris während

der Belichtung nicht vollständig geöffnet.

Zur Detektion der Proteine des Standards (s. 3.2.2) wurde eine Tuschefärbung angewandt

(HANCOCK & TSANG 1983). Dazu wurde das Membranstück, auf das die Markerproteine

im Western Blot übertragen wurden, abgeschnitten und unter leichtem Schwenken in einer

Färbelösung (s. 3.2.6) belassen, bis deutliche Proteinbanden sichtbar wurden.

3.3.11 Funktioneller In-vitro-Test (FIT)

Der FIT (KAUL 1998) wurde angewandt, um die allergene Wirkung des präparierten

Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus sowie der daraus isolierten Komponenten auf

equine Blutzellen zu überprüfen.

3.3.11.1 Histaminfreisetzung

Durch Waschen der Vollblutproben mit PBS (s. 3.2.6) vor der eigentlichen

Histaminfreisetzung wurden Serumkomponenten weitgehend entfernt. Die Blutproben

68


wurden dazu mit dem fünffachen Volumen PBS versetzt, suspendiert und bei 400 x g und

10 °C für 10 min ohne Bremse zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde abgehoben und

verworfen, die Zellen erneut auf dem beschriebenen Wege gewaschen. Nach Abheben des

letzten Überstandes und Resuspension der Zellen im Ausgangsvolumen der Blutprobe wurden

verschiedene Ansätze hergestellt:

a) Spontan-Freisetzung:

Zu 250 µl Zellsuspension wurden 250 µl Freisetzungspuffer Pipes B (s. 3.2.6) zugesetzt. Die

spontane Freisetzung diente als Kontrolle dafür, wie viel Histamin von den Zellen als Folge

der mechanischen Behandlung oder aufgrund einer Vorschädigung freigesetzt wurde.

b) Koch-Freisetzung:

200 µl Zellsuspension wurden mit 800 µl Pipes B versetzt und für 10 min im Wasserbad

gekocht. Mit der Koch-Freisetzung wurde die in den Zellen enthaltene Histaminmenge

bestimmt, die durch Hitze bedingte Zerstörung der Zellen freigesetzt werden konnte.

c) Standard-Allergen-Freisetzung

250 µl Zellsuspension wurden 250 µl eines in Pipes B gelösten GKE aus Culicoides

nubeculosus (s. 3.2.5) zugesetzt. Die Präparation kam in den Endkonzentrationen 15 µg/ml,

5 µg/ml, 0,5 µg/ml sowie 0,05 µg/ml Gesamtprotein zum Einsatz. Dieser Ansatz diente als

Kontrolle für eine Sensibilisierung auf die Gnitzen.

d) Untersuchung des selbst hergestellten GKE

Die Untersuchung des selbst hergestellten GKE (s. 3.3.1.1) erfolgte analog zur Standard-

Allergen-Freisetzung.

e) Untersuchung isolierter Fraktionen aus dem GKE

Nicht konzentrierte Fraktionen wurden im Verhältnis 1:10 mit Pipes B verdünnt und zu

250 µl Zellsuspension gegeben. Konzentrierte Fraktionen wurden 1:25 bis 1:50 mit Pipes B

verdünnt und mit 250 µl Zellsuspension inkubiert. Fraktionen aus der Reversed-Phase-

Chromatographie wurden zunächst vollständig in der Speedvac (s. 3.1) eingeengt (jeweils 100

bis 200 µl pro Ansatz) und nachfolgend in 250 µl des Pipes B aufgenommen.

Alle Ansätze wurden gemischt und mit Ausnahme der Koch-Freisetzung für 60 min bei einer

Temperatur von 37 °C im Wärmeschrank inkubiert. Um die Reaktion zu stoppen, wurden die

Ansätze danach für 20 min auf Eis gestellt und anschließend zur Gewinnung zellfreier

Überstände bei 700 x g und 4 °C für 10 min ohne Bremse zentrifugiert. Die Überstände

69


wurden abgenommen und bei einer Temperatur von -20 °C bis zur Weiterverarbeitung in

aufbewahrt.

3.3.11.2 Radio-Immuno-Assay (RIA)

Der Histamingehalt der im FIT gewonnenen Überstände wurde im RIA bestimmt. Das

Testprinzip beruht auf einer Kompetition des Probenhistamins mit einem radioaktiv

markierten Histamin (Jod125-Histamin-Tracer, s. 3.2.2), die um eine limitierte Anzahl von

Antikörper-Bindungsstellen konkurrieren.

Für den RIA wurden folgende Doppelansätze in Polystyrolröhrchen (s. 3.2.1) hergestellt:

Histamin-Standards je 50 µl Standardlösung in 0,1 N HCl (s. 3.2.6)

+ 50 µl Pipes B

histaminfreie Probe (B0) 50 µl 0,1 N HCl + 50 µl Pipes B

Probe für nichtspezifische Bindung (NSB) 50 µl 0,1 N HCl + 50 µl Pipes B

Freisetzungs-Überstände 100 µl Überstand

Zu allen Ansätzen wurden jeweils 50 µl Tris-Puffer (s. 3.2.6) sowie 50 µl Acylierungsreagenz

(NHS-Biotin, s. 3.2.6) gegeben. Die Ansätze wurden für 30 min bei Raumtemperatur

inkubiert.

Zu jeder Probe und in zwei weitere Röhrchen (Tracer-Kontrolle) wurden 50 µl 125Jod-

Histamin-Tracer pipettiert, ein durch Iodierung acyliertes, radioaktiv markiertes Histamin.

Danach wurde zu jedem Ansatz, außer zur Tracer-Kontrolle und zur NSB-Probe, 50 µl Ziege-

anti-Acylhistamin Serum (s. 3.2.3) gegeben. Die Proben wurden gemischt und bei 4 °C für

15-16 h inkubiert. In dieser Zeit konkurrierten das Tracer-Histamin und das acylierte

Probenhistamin um die limitierte Anzahl der Antikörper-Bindungsstellen (Kompetition), bis

sich ein dynamisches Gleichgewicht von Antigen-Antikörperkomplexen nach dem

Massenwirkungsgesetz eingestellt hatte.

Jeder Probe mit Ausnahme der Tracer-Kontrolle wurde 1 ml Präzipitationsserum (s. 3.2.6)

zugesetzt. Die Proben wurden für 15 min bei 4 °C inkubiert, anschließend bei 1500 x g für

15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und die Überstände abgegossen. Durch die

Antikörper des Präzipitationsserums wurden die Antigen-Antikörperkomplexe präzipitiert.

70


Die Radioaktivität der Proben wurde im Gamma-Counter (s. 3.1) gemessen und die

Ergebnisse als Zählimpulse pro Minute (counts per minute, cpm) angegeben. Aufgrund der

Kompetition verhielt sich dabei die Höhe der Radioaktivität umgekehrt proportional zur

Histaminkonzentration der Probe.

Die Umrechnung in Prozentwerte erfolgte über mehrere Stufen: Von den Doppelansätzen

wurden die Mittelwerte berechnet und davon der Mittelwert der NSB-Probe abgezogen.

Anschließend wurden alle Probenwerte in Prozent zum B0-Wert ausgedrückt (B/B0%-Wert).

Mit den B/B0%-Werten der Histamin-Standardlösungen und den zugehörigen

Histaminkonzentrationen wurde eine Standardkurve erstellt, anhand derer die B/B0%-Werte

der Proben in die Histaminkonzentration umgerechnet wurden. Der Histamingehalt der

Maximalfreisetzung jedes Tieres wurde gleich 100 % gesetzt. Die Histamingehalte der

weiteren Proben dieses Pferdes wurden dann in Prozent von der Maximalfreisetzung

ausgedrückt. Zur Auswertung wurden nur solche Proben herangezogen, deren Spontan-

freisetzung unter 6 % der Maximalfreisetzung betrug. Erreichte der Histamingehalt eines

Allergen-Ansatzes mindestens 10 % der Maximalfreisetzung, galt dieser Ansatz als positiv.

3.3.12 Immunpräzipitation (IP)

Mit der IP wurden von Matrix gekoppelten equinen Serum-Immunglobulinen Proteine aus

dem biotinylierten Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus isoliert.

Das Prinzip der IP entspricht dem der Affinitätschromatographie (vgl. 3.3.2). Im Gegensatz

zur Chromatographie, durch die Komponenten in einer Form gereinigt werden, die

verschiedene weiterführende Untersuchungen ermöglicht, ist die weitere Analyse der in der IP

isolierten Proteine auf die SDS-PAGE (s. 3.3.5) und den Immunoblot (s. 3.3.10) beschränkt.

Es wurden jeweils 100 µl der in 3.3.2.2 hergestellten Matrizes, bestehend aus IgG1, 4 und IgE

von Pferden mit und ohne Sommerekzem an cyanbromidaktivierter Sepharose, verwendet.

Alle sechs Matrizes wurden für 2 h bei Raumtemperatur im Überkopfschüttler (s. 3.1) mit

jeweils 500 µl biotinyliertem Ganzkörperextrakt (s. 3.3.1.2) inkubiert. Nach Ende der

Inkubationszeit wurde jede Matrix zur Entfernung der ungebundenen Komponenten 5 x mit

1 ml Waschpuffer (s. 3.2.6) gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde die Sepharose bei

2000 x g für 2 min ohne Bremse zentrifugiert und der Überstand verworfen. Abschließend

wurde jede Matrix zum Ablösen der gebundenen Bestandteile mit 180 µl Probenpuffer

71


(s. 3.2.5) und 20 µl Mercaptoethanol (s. 3.2.2) versetzt und für 5 min bei 100 °C im Heizblock

(s. 3.1) erhitzt. Nach erneuter Zentrifugation wurde der Überstand gewonnen, in der Speedvac

(s. 3.1) auf ein Volumen von etwa 30 µl eingeengt und in einem 15 %-igen SDS-Gel

aufgetrennt. Nach dem Transfer auf eine Membran im Western Blot (s. 3.3.9) wurden die

Proteine durch Inkubation mit Streptavidin-AP (s. 3.2.2) und Substrat (s. 3.2.6) im

Immunoblot sichtbar gemacht.

3.3.13 Ultrafiltration

Die Ultrafiltration wurde zur Konzentration von Proben einerseits und zur Trennung von

Proteinen unterschiedlicher Molmassen andererseits verwendet.

Für diese Technik werden Filtereinheiten mit verschiedenen Ausschluss-Molmassen genutzt

(Cut-Off, s. 3.2.1). Proteine größer des Cut-Off werden in der oberen Kammer der

Filtereinheit konzentriert, kleinere Proteine finden sich im Durchlauf in der unteren Kammer

wieder. Die Trennung erfolgt unter Ausnutzung der Zentrifugalkraft bei 2000 x g. Die

Zentrifugationsdauer variiert mit der Proteinkonzentration und dem gewünschten Grad der

Konzentration. Bei vollständiger Beschickung der Filtereinheit (Volumen beim verwendeten

Modell: 20 ml) kann maximal eine 200-fache Konzentration der Probe (Volumen: 200 µl)

erreicht werden.

Für die Konzentration der Serum-Antikörper wurden Filtereinheiten eines Cut-Off von

100 kD verwendet. Die Konzentration der Proteine aus Culicoides nubeculosus wurde

ausschließlich mit Filtereinheiten eines Cut-Off von 3 kD durchgeführt. Bei der Anwendung

der Ultrafiltration zur Abtrennung von Proteinen bestimmter Molmassen wurde eine

Kombination von Filtern mit verschiedenen Cut-Off-Grenzen eingesetzt (s. 4.4.3.2).

3.3.14 Gelfiltrationschromatographie (GFC)

Die GFC wurde zur Reinigung von potentiellen Allergene aus Culicoides nubeculosus

eingesetzt.

Das Prinzip dieser Methode basiert auf einer Trennung der in einem Proteingemisch

vorhandenen Komponenten nach der Molmasse. Die Matrix einer Gelfiltrationssäule besteht

aus Poren unterschiedlicher Größe. Je kleiner das Protein ist, durch desto mehr Kanäle kann

es wandern und desto länger ist seine Retentionszeit. Damit werden größere Proteine früher

72


von der Säule eluiert als kleine Moleküle. Im Gegensatz zur Ionenaustauscher-

chromatographie trat im Zuge der GFC eine erhebliche Verdünnung der Proteine ein, die eine

nachfolgende Konzentration in der Speedvac (s. 3.1) oder über Ultrafiltration (s. 3.3.13)

erforderte.

Für die Reinigung potentieller Allergene aus den Gnitzen standen zwei unterschiedliche

Gelfiltrationssäulen zur Verfügung (s. Tab. 4). Der Betrieb der Säulen erfolgte in

Abhängigkeit von der Säule in einer computergesteuerten FPLC- oder HPLC-Anlage (s. 3.1).

Beide Säulen wurden vorab mit einem Molmassenstandard (equines IgG1/4: komplettes

Molekül, schwere und leichte Kette oder kommerziell erhältlicher Standard, s. 3.2.2) beladen,

um zu bestimmen, zu welchem Zeitpunkt Proteine definierter Molmasse von der Säule eluiert

wurden. Die Fliessgeschwindigkeit des Laufpuffers (s. 3.2.6) betrug für BioSil 125-Säule

0,6 ml/min, für die Superose 12-Säule 0,25 ml/min.

Tab. 4 Verwendete Gelfiltrationssäulen

Säule maximale Trennleistung Ladekapazität

BioSil-SEC 125-5 für HPLC < 20 kD max. 1,5 mg

Superose 12 30/100 für FPLC

> 20 kD max. 10 mg

Für die Gelfiltrationschromatographie wurden zwei Säulen verwendet, die sich hinsichtlich ihres bevorzugten Trennbereichs (mittlere Spalte) und ihrer Ladekapazität unterschieden. Für den Betrieb der Säulen waren unterschiedliche Druckverhältnisse (HPLC/FPLC) notwendig.

3.3.15 Ionenaustauscherchromatographie (IEX)

Die IEX wurde zur Reinigung und Anreicherung potentieller Allergene aus dem

Ganzkörperextrakt von Culicoides nubeculosus verwendet.

Das Prinzip der IEX beruht auf der reversiblen Bindung geladener löslicher Substanzen (hier:

Proteine) an eine gegensätzlich geladene Matrix. Durch Erhöhung der Ionenstärke im

Elutionspuffer (i. d. R. durch NaCl) kann diese Bindung wieder gelöst werden. Dabei werden

zunächst die schwach geladenen Proteine, mit zunehmender NaCl-Konzentration auch die

stärker geladenen Moleküle eluiert. Da das einzelne Protein aufgrund der Art und Dichte der

Ladung und der Verteilung der geladenen Gruppen auf seiner Oberfläche bei einer definierten

Kochsalzkonzentration eluiert wird, wird eine Anreicherung dieses Proteins bei gleichzeitiger

73


Abtrennung von Proteinen anderer Ladungsstärken erreicht. Durch Kationenaustauscher

werden positiv geladene Proteine, über den Anionenaustauscher negativ geladene Proteine

gebunden. In Abhängigkeit des pH-Wertes variiert die Ladung der Proteine, bei pH-Werten

< 7 nimmt die Zahl der positiven Ladungen durch Protonierung zu, bei pH-Werten > 7 steigt

die negative Ladung durch Abgabe von Protonen.

Für die Isolierung von Culicoides-Proteinen wurden zwei verschiedene Säulen getestet

(s. Tab. 5). Beide Säulen wurden mit einer FPLC-Anlage (s. 3.1) betrieben. Da über die

potentiellen Allergene aus Culicoides nubeculosus keinerlei biochemische Daten

(Molmassen, isoelektrischer Punkt) verfügbar waren, mussten neben der Auswahl des

Ionenaustauschers die zu verwendenden Puffer- (s. 3.2.6) und Elutionsbedingungen

(Ausnahme: vom Hersteller geforderte Flussrate von 1 ml/min) zur Isolierung der

Zielproteine zunächst etabliert werden.

Tab. 5 Verwendete Ionenaustauschersäulen

Säule Typ funktionelle Gruppe Ladekapazität SP Sepharose Fast Flow

starker Kationenaustauscher

Sulfopropylgruppe max. 70 mg

Q Sepharose Fast Flow

starker Anionenaustauscher

quartenäre Ammoniumgruppe

max. 120 mg

Für die Ionenaustauscherchromatographie wurden ein starker Kationen- und ein starker Anionenaustauscher verwendet. Die Tabelle gibt Aufschluss über die Bezeichnung der Säulen (linke Spalte) sowie über ihre funktionellen Gruppen und Ladekapazitäten an Protein.

3.3.16 Reversed-Phase-Chromatographie (RPC)

Die RPC wurde ebenfalls zur Reinigung und Anreicherung potentieller Allergene aus

Culicoides nubeculosus genutzt.

Über hydrophobe Wechselwirkungen werden bei dieser Chromatographie Proteine an die

Säulenmatrix aus unpolaren Gruppen reversibel gebunden. Durch Erhöhung der Polarität des

Elutionspuffers wird diese Bindung wieder gelöst, so dass sich zunächst die wenig

hydrophoben, mit steigender Polarität auch die stärker hydrophoben Moleküle von der Säule

lösen. Da ähnlich der IEX der Punkt der Elution für jedes Protein sehr eng umrissen ist, lassen

sich Komponenten unterschiedlicher Polarität mit der RPC voneinander trennen. Das einzelne

Protein wird dabei gleichzeitig angereichert.

74


Die RPC wurde in einer HPLC-Anlage (s. 3.1) durchgeführt. Für die Reinigung der Proteine

aus Culicoides nubeculosus wurde eine C 18-Säule (s. 3.2.1) verwendet. Die Beladung und

das Waschen erfolgten mit Trifluoressigsäure (TFA) 0,1 % (s. 3.2.6). Für die Elution der

gebundenen Proteine wurde die Konzentration des polaren Lösungsmittels Acetonitril

(s. 3.2.2) über verschiedene Volumina auf 100 % erhöht. Die Fliessgeschwindigkeit der

Puffer betrug 1 ml/min, es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt.

3.3.17 Massenspektrometrie

Zur Bestimmung von Peptidsequenzen wurden die isolierten Proteine einer

massenspektrometrischen Analyse unterzogen. Zur Vorbereitung für die Massenspektrometrie

wurden die Proteine durch den Verdau mit Proteasen in einzelne Peptide gespalten.

3.3.17.1 Vorbereitung der Proteine für die Massenspektrometrie

Der Verdau der aus Culicoides nubeculosus isolierten Proteine wurde mit der Endoprotease

Endo Lys-C (aus Lysobacter enzymogenes, s. 3.2.2) durchgeführt. Die Spaltstellen des

Enzyms lagen jeweils am C-terminalen Ende von Lysin. Zur Optimierung der pH-

Bedingungen für die Protease wurde die Probe mit dem Verdaupuffer (s. 3.2.6) verdünnt. Das

Enzym wurde in einer Menge von 10 % des zu verdauenden Proteins (mg/mg) zur Probe

gegeben. Entsprechend der Herstellerangaben wurde der Ansatz für 6 h bei 37 °C inkubiert.

Der Erfolg des Verdaus wurde durch Kontrolle einer Probe vor Zugabe der Protease und nach

Ablauf der 6 h in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) und Silberfärbung (s. 3.3.8) überprüft.

Bei vollständigem Verdau wurden die erhaltenen Peptide über eine Mikro-Reversed-Phase-

Säule (Zip-Tip, s. 3.2.1) entsalzt. Die Säulen wurden entsprechend der Herstelleranleitung

kalibriert, mit der verdauten Probe beladen, gewaschen und eluiert (s. 3.2.6). Bis zur weiteren

Analyse wurden die Peptide bei einer Temperatur von -20 °C aufbewahrt.

3.3.17.2 Electrospray Ionization Time-of-flight Tandem-Massenspektrometrie (ESI/TOF- MS-MS)

Zur Sequenzierung einzelner, durch den Verdau der Culicoides-Komponenten erhaltener

Peptide wurde die ESI/TOF-MS-MS-Technik angewandt.

Durch das Anlegen einer Hochspannung werden die in Lösung vorliegenden Peptide in einer

75


Metall beschichteten Glaskapillare ionisiert und die Ionen in die Gasphase freigesetzt. Nach

Einsaugen in das Hochvakuum des Massenspektrometers erfolgt die Auftrennung der Ionen

auf einer definierten Flugstrecke. Anhand der Messung der Flugzeit bis zum Auftreffen auf

einen Detektor wird die Masse der Ionen [als Massen-Ladungsverhältnis (m/z)] berechnet.

Für die Sequenzierung werden ionisierte Peptide bestimmter m/z aus dem Gesamtspektrum

herausgefiltert und in einer Kollisionzelle unter niedriger kinetischer Energie durch Gas

fragmentiert. Die entstandenen Fragmente werden auf einer zweiten Flugstrecke aufgetrennt

und ihre Massen berechnet.

Die Analyse der Culicoides-Peptide erfolgte in einem Quadrupole time-of-flight (QTOF2)

mass spectrometer (s. 3.1). Die Ionisierung der Proben (Volumen: 3 µl) wurde in Gold

beschichteten Nanokapillaren aus Glas (s. 3.2.1) mit einer Spannung von 1000 V

durchgeführt. Für die Fragmentierung ausgewählter Peptide wurde Argon verwendet, die

kinetische Energie in der Kollisionszelle betrug – 35 eV.

3.3.17.3 Auswertung der Massenspektren

Durch Computer gestützte Analyse der erhaltenen Massenspektren wurden die

Aminosäuresequenzen der fragmentierten Peptide bestimmt.

Die im Zuge der Gaskollision entstandenen Fragment-Ionen eines Peptids werden

entsprechend ihres m/z-Quotienten angeordnet (s. Abb. 3, durchgezogene, senkrechte Linien).

Die Differenz der Quotienten zweier konsekutiver Fragmente (gekennzeichnet durch

gepunktete oder gestrichelte senkrechte Linien) entspricht der Masse einer bestimmten

Aminosäure an dieser Stelle der Sequenz (Buchstabenreihen oberhalb des Spektrums). Eine

Einschränkung ist bei den Aminosäuren Leucin und Isoleucin gegeben, die aufgrund

identischer m/z-Quotienten nicht diskriminiert werden können.

Die Fragmentionen werden entsprechend des Verbleibs der Ladung nach Spaltung der

Peptidbindung unterschieden. Verbleibt die Ladung am N-terminalen Ende des Fragments,

entstehen Ionen vom B-Typ (b), ein Verbleib am C-terminalen Ende resultiert in der Bildung

von Y-Typ-Ionen (y). Eine Bestimmung der Aminosäuresequenz kann sowohl anhand der

konsekutiven Ionen des B-Typs wie auch des Y-Typs erfolgen.

Für die Sequenzierung der Peptide aus Culicoides nubeculosus wurde die carboxyterminale

Fragmentationsserie (Y-Typ) genutzt und durch die aminoterminalen Ionen (B-Typ) bestätigt.

Die Analyse wurde mit der Software Maximum Entropy 3 (s. 3.1) durchgeführt.

76


Dargestellt ist der Auszug aus einem Massenspektrum eines fiktiven Peptids nach Fragmentierung. Die entstandenen Fragment-Ionen (durchgezogene, senk-rechte Linien) sind nach aufsteigendem Massen-Ladungsverhältnis (m/z) ange-ordnet (X-Achse). Die relative Häufigkeit der Fragmente zeigt die Höhe der Linien an. Der Typ der Fragment-Ionen ist durch die Kleinbuchstaben b oder y gekenn-zeichnet, die nachgestellte Ziffer gibt die Anzahl der Aminosäuren an, aus denen sich das Fragment zusammensetzt. Die Abstände zwischen konsekutiven Fragment-Ionen der B- oder Y-Serie (senkrechte gepunktete bzw. gestrichelte Linien) entsprechen den m/z-Quotienten der Aminosäuren an dieser Position (obere Buchstabenreihen).

Abb. 3 Schematische Darstellung eines Massenspektrums

3.3.18 Recherche nach homologen Proteinen

Anhand der in der Massenspektrometrie bestimmten Peptidsequenzen wurden die isolierten

Proteine aus Culicoides nubeculosus identifiziert. Es wurde die Suchmaschine BLAST (Basic

Local Alignment Search Tool) des NCBI (National Institute for Biotechnology Information)

für die Recherche genutzt. Die Peptidsequenzen wurden in das Menü Search for short, nearly

exact matches eingegeben und mit den Einträgen der via Internet zugänglichen

Proteindatenbanken verglichen. Die erhaltenen, zu den eingegebenen Sequenzen passenden

Proteine wurden anhand der Größe ihrer Identitäten (identische Aminosäuren an den

entsprechenden Positionen in %) bewertet. Neben diesem Parameter wurde überprüft, ob sich

alle sequenzierten Peptide eines Culicoides-Proteins in dem Pendant der Datenbank wieder

fanden. Je höher die Identität und je höher die Zahl der sequenzierten Peptide, die sich dem

Datenbank-Protein zuordnen ließen, desto größer war die Wahrscheinlichkeit, dass es sich um

homologe Proteine handelte.

77


3.3.19 Evaluierung von Chromatogrammen

Die chromatographische Trennung der Culicoides-Komponenten wurde über UV-Messung

(280 / 260 nm in der FPLC-, 210 nm in der HPLC-Anlage) verfolgt. Die gemessenen

Absorptionen (angegeben als optische Dichte (OD) oder Millivolt (mV)) wurden als

Chromatogramm dargestellt. Durch Computer gestützte Integration der

Chromatogrammfläche konnten sowohl die Gesamtfläche als auch die Flächen einzelner,

fraktionsbezogener Extinktionen (Peaks) anteilig der Gesamtfläche bestimmt werden

(s. Abb. 4). Damit konnte eine Aussage über die prozentuale Verteilung der Menge der

Gnitzen-Komponenten nach der chromatographischen Trennung getroffen werden. Je höher

die Prozentzahl, desto größer war die Menge der in der Fraktion enthaltenen Komponenten.

Abb. 4 Schematische Darstellung der Komponentenmenge über Flächenintegration Anhand des Chromatogramms konnte die Komponentenmenge in den Fraktionen grob berechnet werden. Über Integration der im Chromatogramm angezeigten Flächen (A) wurde der Anteil der gesuchten Flächen A1 und A2 (= Menge der Komponenten in den Fraktionen) an der Gesamtfläche A1 + A2 (= Gesamtmenge aller im aufgetragenen Extrakt enthaltenen Komponenten) bestimmt. Die Integration der Chromatogrammflächen erfolgte Computer gestützt. Die Anteil der gesuchten Fläche wurde in Prozentwerte umgerechnet.

3.3.20 Bestimmung der Molmasse von Proteinen über den Rf-Wert

Die exakte Bestimmung der Molmasse von Proteinen, die in der SDS-PAGE (s. 3.3.5)

getrennt wurden, wurde über die Berechnung des Retentionsfaktor (Rf-Wert) vorgenommen.

Da die Trennung der Proteine in der SDS-PAGE nicht linear erfolgt, ist eine direkte Aussage

78


über die Molmasse eines unbekannten Proteins anhand des Vergleichs mit Standardproteinen

bekannter Größe (s. 3.2.2) häufig ungenau. Durch die Bestimmung des Rf-Wertes, der die

relative Mobilität von Proteinen beschreibt, wurde dagegen ein linearer Zusammenhang zum

Logarithmus der Molmasse hergestellt. Der Rf-Wert ergibt sich als Quotient aus der

Laufstrecke des Proteins zur Laufstrecke des Bromphenolblau (Farbstoff, der die Lauffront

markiert; s. 3.2.2).

Rf-Wert = Laufstrecke Proteine (cm) / Laufstrecke Lauffront (cm)

Die Rf-Werte der Standardproteine (X-Achse) werden auf halblogarithmischem Papier

entsprechend ihrer Molmasse (Y-Achse) aufgetragen und als Eichgerade verbunden

(s. Abb. 4). Die Rf-Werte der zu untersuchenden Proteine werden in die Eichgerade integriert

und die zugehörigen Molmassen abgelesen.

Abb. 5 Bestimmung der Molmasse über den Retentionsfaktor (Rf-Wert) Anhand des Rf-Wertes kann die Molmasse eines unbekannten Proteins exakt bestimmt werden. Die eingezeichnete Eichgerade ist aus den Rf-Werten (X-Achse) von Standardproteinen (s. 3.2.2) erstellt worden, die sich linear zum Logarithmus der Molmasse verhalten (Y-Achse). Mit Hilfe des Rf-Wertes des unbekannten Proteins kann auf der Geraden die Molmasse des Proteins abgelesen werden.

79

Ergebnisse

4 Ergebnisse

Im Zuge dieser Arbeit sollten allergen wirksame Komponenten aus Culicoides nubeculosus

untersucht werden. Zunächst wurden die dazu notwendigen Vorarbeiten durchgeführt, die die

Herstellung eines Ganzkörperextrakts aus den Gnitzen sowie die Reinigung von

Immunglobulinen aus Pferdeseren beinhalteten. Weiterhin wurde die Reaktion der gereinigten

Immunglobuline mit Culicoides-Komponenten überprüft. Nachfolgend wurden potentielle

Allergene der Gnitzen durch Fraktionierung des Ganzkörperextrakts isoliert und abschließend

einer biochemischen und funktionellen Charakterisierung unterzogen.

4.1 Eigenschaften des Ganzkörperextraktes aus Culicoides nubeculosus

Um ausreichende Mengen Ausgangsmaterial für die folgenden Untersuchungen

bereitzustellen, wurden die löslichen Komponenten aus 6 g tiefgefrorenen Gnitzen eines

Laborstamms von Culicoides nubeculosus (s. 3.2.4) extrahiert (s. 3.3.1). Es wurden 60 ml

eines wässrigen Ganzkörperextrakts (GKE) gewonnen, dessen im BCA (s. 3.3.2) bestimmte

Proteinkonzentration 3,2 mg/ml betrug. Der GKE wurde im Folgenden hinsichtlich seiner

Reaktivität und der Beeinflussung seiner Reaktivität durch verschiedene Zusätze und

Manipulationen im funktionellen In-vitro-Test (FIT, s. 3.3.11) untersucht. Weiterhin wurde

ein Teil des GKE für folgende Untersuchungen einer Biotinylierung (s. 3.3.1.2) unterzogen.

4.1.1 Reaktivität des Extrakts mit equinen Blutzellen im FIT

Die Reaktivität des Extraktes wurde im FIT überprüft, als positive Kontrolle diente ein

kommerziell erhältlicher GKE (s. 3.2.4). Beide Extrakte wurden zweimalig in

Konzentrationen von 15 µg, 5 µg, 0,5 µg und 0,05 µg pro Ansatz mit den Blutzellen von fünf

am Sommerekzem erkrankten Pferden und zwei ekzemfreien Kontrolltieren im FIT überprüft

(s. Abb. 6). Die fünf allergischen Pferde reagierten mit einer Histaminfreisetzung oberhalb der

10 %-Grenze auf die ersten drei Verdünnungsstufen beider Extrakte. Die Histaminfreisetzung

in der dritten Verdünnungsstufe (0,5 µg) war für die eigene Präparation bei allen untersuchten

80

Ergebnisse

ekzemkranken Pferden deutlich höher als für den kommerziellen GKE. Die ekzemfreien

Kontrollpferde reagierten auf keinen der beiden Extrakte (nicht dargestellt).

Abb. 6 Vergleich von kommerziell erhältlichem und präpariertem Ganzkörperextrakt im FIT

Es wurden vergleichend ein kommerziell erhältlicher Extrakt (GKE 1; s. 3.2.4) von Culicoides nubeculosus und der eigene Extrakt (GKE 2; s. 3.3.1) bei fünf Pferden mit und zwei Pferden ohne Sommerekzem im FIT (s. 3.3.11) in den Konzentrationsstufen 15 µg, 5 µg, 0,5 µg und 0,05 µg pro Ansatz getestet. Die Histaminfreisetzungen (in % des maximal freisetzbaren Histamingehalts der Zellen, dargestellt auf der Y-Achse) als Mittelwerte der Doppelansätze pro Pferd sind beispielhaft für zwei der getesteten ekzemkranken Pferde (#4 und #7) dargestellt.

4.1.2 Einfluss verschiedener Parameter auf die Reaktivität im FIT

Im Zuge der weiteren Untersuchungen wurde der GKE aus Culicoides nubeculosus mit

Substanzen versetzt bzw. verschiedenen Manipulationen unterzogen, deren Auswirkungen auf

die Proteine und damit auch auf den FIT nicht bekannt waren. Zu diesem Zweck wurde

getestet, ob sich die Histaminfreisetzung durch den behandelten Extrakt im Vergleich zur

unbehandelten Präparation veränderte (s. Tab. 6). Der GKE wurde in den Konzentrationen

5 µg und 0,5 µg pro Ansatz verwendet. Des weiteren wurde überprüft, ob die Substanzen

selber eine Histaminfreisetzung aus den Zellen induzierten. Die Untersuchungen wurden mit

den Blutzellen zweier am Sommerekzem erkrankter Pferde durchgeführt.

81

Ergebnisse

In der Affinitätschromatographie (s. 3.3.2.2) wurden die gebundenen Proteine durch die

Verringerung des pH-Wertes im Laufpuffer eluiert. Um die pH-Toleranzbereiche der

Gnitzenproteine zu überprüfen, wurde der GKE mit Freisetzungspuffer (s. 3.2.6) der pH-

Werte 2,5 bis 5,0 (Schritte in 0,5 pH-Einheiten) versetzt, 5 min inkubiert und nach Zugabe

des Neutralisierungspuffers (s. 3.2.6, Einstellung des pH-Wertes auf 7,0) im FIT eingesetzt.

Die Histaminfreisetzung war im Vergleich zum unbehandelten GKE bei pH 5,0 und 4,5

unverändert, bei pH 4,0 und 3,5 schwach vermindert (bis 10 %) und bei pH-Werten unter 3,0

stark vermindert (> 10 %).

In der Ionenaustauscher- (s. 3.3.14) und Gelfiltrationschromatographie (s. 3.3.15) wurden zur

besseren Solubilisierung der im GKE enthaltenen Proteine das Detergenz CHAPS

(zwitterionisches Detergenz, s. 3.2.2) zugesetzt. Es wurde die zur Solubilisierung übliche

Konzentration von 1 mM eingesetzt. Zusätzlich wurden eine darüber und eine darunter

liegende Konzentrationsstufe untersucht. Es konnte in den Konzentrationen von 1 mM und

2 mM eine geringe Steigerung (bis 10 %) der Histaminfreisetzung bestimmt werden. Die

Zellen wurden durch die Detergenzien nicht aktiviert.

In der Ionenaustauscher- und teilweise in der Affinitätschromatographie wurde für die Elution

gebundener Komponenten ein Salzgradient benötigt. Der Einfluss des Salzes wurde durch

Zusatz von NaCl-Lösung der Molaritäten von 0,25 M, 0,5 M, 0,75 M und 1 M zum

Gnitzenextrakt untersucht. Bei Zugabe der Lösung von 1 M konnte eine geringe

Verminderung der Histaminfreisetzung (bis 10 %) festgestellt werden.

Weiterhin wurde der Einfluss der für die Ionenaustauscherchromatographie benötigten Puffer

verschiedener pH-Werte überprüft (s. 3.2.6). Mit Ausnahme des Natriumacetatpuffers

(pH 4,0), der die Histaminfreisetzung durch Culicoides leicht verminderte (bis 10 %), zeigten

sich keinerlei Veränderungen im Vergleich zum Kontrollansatz.

Die Reversed-Phase-Chromatographie (s. 3.3.16) beinhaltete die Elution gebundener

Komponenten durch Acetonitril (s. 3.2.2) und Trifluoressigsäure (TFA 0,1 %; s. 3.2.6) sowie

das anschließende Eindampfen der Proben in der gekühlten Speedvac (s. 3.1). Das alleinige

Eindampfen der Proben zeigte keinen Einfluss auf die Histaminfreisetzung. Dagegen bewirkte

der Zusatz von Acetonitril oder TFA 0,1 % alleine wie auch in Kombination (nach

Eindampfen der Probe, Aufnahme der getrockneten Proteine in den Freisetzungspuffer und

ggf. Korrektur des pH-Wertes) eine geringgradige Verminderung (bis 10 %) der

Histaminfreisetzung.

82

Ergebnisse

Tab. 6: Einfluss verschiedener Parameter auf die Reaktivität des Ganzkörperextrakts im funktionellen In-vitro-Test

pH-Wert Kationenaustauscher

Reaktivität GKE Reaktivität GKE

pH 2,5 ↓↓ Na-Acetat pH 4,0 ↓

pH 3,0 ↓↓ Na-Acetat pH 5,0 -

pH 3,5 ↓ Na-Citrat pH 6,0 -

pH 4,0 ↓ HEPES pH 7,0 -

pH 4,5 - HEPES pH 8,0 -

pH 5,0 -

Detergenzien Anionenaustauscher


CHAPS 0,5 mM - Piperazin pH 5,0 -

CHAPS 1 mM ↑ L-Histidin pH 6,0 -

CHAPS 2 mM ↑ Tris pH 7,0 -

Tris pH 8,0 -

Tris pH 9,0 -

Natriumchlorid Reversed Phase Chromatographie


0,25 M - Speedvac -

0,5 M - TFA 0,1 % ↓

0,75 M - Acetonitril ↓

1 M ↓ TFA + Acetonitril ↓

Der Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus (s. 3.3.1) wurde im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen mit unterschiedlichen Reagenzien behandelt und Manipulationen unterzogen, deren Einflüsse auf den Extrakt vorab im FIT (s. 3.3.11) überprüft wurden. Dargestellt sind die Auswirkungen der Behandlungen auf den GKE im Vergleich zum Parallelansatz mit dem nativen GKE. Abwärtsgerichtete Pfeile zeigen eine Reduktion der freigesetzten Histaminmenge bis 10 % (↓) oder über 10 % (↓↓) an, aufwärts gerichtete Pfeile beschreiben eine Steigerung der Histaminfreisetzung bis zu 10 %. Waagerechte Striche (-) symbolisieren keine Veränderung der Reaktivität des GKE. Eine direkte Aktivierung der Blutzellen durch die untersuchten Reagenzien wurde nicht festgestellt (nicht dargestellt).

83

Ergebnisse

4.1.3 Nachweis biotinylierter Proteine im Immunoblot

Ein Teil des GKE aus Culicoides nubeculosus (5 mg) wurde für die Immunpräzipitation

(s. 3.3.12) biotinyliert (s. 3.3.1.2). Nach Auftrennung der biotinylierten Proteine in der SDS-

PAGE (s. 3.3.5) und Transfer auf eine Membran (s. 3.3.9) wurde der Erfolg der Kopplung im

Immunoblot (s. 3.3.10) mit Enzym markiertem Streptavidin (Streptavidin-AP) und Substrat

überprüft (s. Abb. 7). Es konnten sowohl mit als auch ohne Zusatz von Reduktionsmitteln

Proteine mit Molmassen von < 15 bis 200 kD nachgewiesen werden.

Abb. 7 Nachweis biotinylierter Proteine aus Culicoides nubeculosus im Immunoblot Die Biotinylierung (s. 3.3.1) der Proteine des Ganzkörperextrakts aus den Gnitzen diente als Vorbereitung für den Nachweis von Komponenten der Gnitzen in der Immunpräzipitation (s. 3.3.12). Zur Überprüfung des Biotinylierungserfolgs wurde der Extrakt in der 15 %-igen SDS-PAGE (s. 3.3.5) aufgetrennt, im Western Blot (s. 3.3.9) auf eine Membran transferiert und mit Streptavidin-AP und Substrat im Immunoblot (s. 3.3.10) angefärbt. Spur 1 zeigt die nicht reduzierte, Spur 2 die reduzierte Präparation. Die Molmassen wurden anhand eines mitgelaufenen Standards (s. 3.2.2) ermittelt.

4.2 Reinigung von Immunglobulinen aus Pferdeseren

Die equinen Serum-Immunglobuline wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität mit Komponenten

des GKE aus Culicoides nubeculosus überprüft.

Im Serum liegen die einzelnen Antikörper-Isotypen in unterschiedlich hohen Konzentrationen

vor. Die Verwendung des nativen Serums birgt entsprechend die Gefahr, dass eine

Kompetition von Antikörpern gleicher Spezifität aber unterschiedlichen Isotyps um die

Bindung der Culicoides-Komponenten eintritt, bei der eine Detektion durch geringer

konzentrierte Isotypen ggf. nicht erfasst würde. Ebenso können Immunglobuline des

84

Ergebnisse

Isotyps M durch unspezifische Bindung Gnitzenproteine maskieren. Daher wurden IgG1 und

4 sowie IgE, die hinweislich bzw. nachweislich an der equinen Typ-I-Allergie beteiligt sind,

für weitere Untersuchungen aus Pferdeseren gereinigt. Für die Isolierung weiterer IgG-

Isotypen waren die entsprechenden Reagenzien nicht oder in nicht ausreichender Menge

vorhanden. Zur Reinigung der Immunglobuline wurden Seren von zehn Pferden mit und fünf

Pferden ohne Sommerekzem (s. 3.2.5) verwendet, die im Frühsommer des Jahres 2003

entnommen wurden. Zu diesem Zeitpunkt zeigten die ekzemkranken Pferde eine deutliche

Sensibilisierung gegen Culicoides nubeculosus im FIT und teilweise Symptome des

Sommerekzems. Die Nichtekzemer waren weder sensibilisiert noch war eine klinische

Ausprägung der Allergie vorhanden. Zur Isolierung von IgG1/4 (Mischfraktion beider

Isotypen) wurde eine Protein G-Säule verwendet; IgE wurde nachfolgend aus dem IgG-

depletierten Serum über eine IgE-Affinitätssäule gereinigt (s. 3.3.2.1). Die Mischfraktion

wurde zusätzlich zur Trennung von IgG1 und 4 über eine IgG4-Affinitätssäule gegeben. Eluat

und Durchlauf wurden auf eine Proteinkonzentration von 2 bzw. 1 mg/ml eingestellt. Das

native Serum, die durch die jeweilige Säule gebundenen Proteine sowie die Durchläufe der

IgE- und IgG4-Affinitätssäule wurden in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) hinsichtlich der Reinheit

der Proteine und im ELISA (s. 3.3.4) hinsichtlich der enthaltenen Isotypen überprüft.

4.2.1 Überprüfung des Reinigungserfolges in der SDS-PAGE

In der SDS-PAGE (s. 3.3.5) wurde die Reinheit der affinitätschromatographisch isolierten

Antikörper anhand der Molmasse und der Anzahl der Proteinbanden überprüft. Neben den

Antikörperfraktionen wurden die nativen Seren und die Durchläufe der IgE-Affinitätssäule

untersucht. Die Seren wurden im Verhältnis 1:500 verdünnt, alle übrigen Fraktionen im

Verhältnis 1:5. Die Trennung der Proteine erfolgte unter nicht reduzierenden Bedingungen,

zum Nachweis wurde die Coomassie-Färbung (s. 3.3.7) angewandt (s. Abb. 8).

Es konnte gezeigt werden, dass mit der Protein G-Säule im Vergleich zum nativen Serum eine

starke Anreicherung einer Bande im Bereich von etwa 160 kD gelang, die der Molmasse

equiner IgG-Isotypen entspricht. Im Durchlauf der IgG4-Affinitätssäule wurde eine Bande

oberhalb von 160 kD (entspricht der Masse von IgG1) und im Eluat eine Bande knapp

unterhalb 160 kD (entspricht der Masse von IgG4) erhalten. Im Eluat der IgE-Affinitätssäule

wurde eine starke Anreicherung einer Bande von knapp oberhalb 200 kD erreicht, die mit der

85

Ergebnisse

Molmasse des equinen IgE übereinstimmt. Die übrigen Serumbestandteile, u. a. Albumin,

erschienen im Durchlauf dieser Säule. Die aus dem Serum der 15 Pferde (mit und ohne Som-

merekzem) gereinigten Proteine erzeugten in der SDS-PAGE vergleichbare Bandenmuster.

Abb. 8 Untersuchung der Reinheit der Antikörper-Fraktionen in der SDS-PAGE Anhand der Molmasse und der Anzahl der Proteinbanden wurde in der 7,5 %-igen SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen (s. 3.3.5) nach Coomassie-Färbung (s. 3.3.6) die Reinheit der equinen Serum-Immunglobuline nach Affinitätschromatographie (s. 3.3.2.1) beurteilt. Dargestellt sind beispielhaft an einem Pferd (#12) die Proteine des nativen Serums (Spur 1; Verdünnung 1:500), des Eluats der Protein G-Säule (Spur 2; 1:10), der konzentrierte Durchlauf (Spur 3; 1:5) und das konzentrierte Eluat der IgG4-Affinitätssäule (Spur 4; 1:10) sowie das konzentrierte Eluat (Spur 5; 1:5) und der Durchlauf der IgE-Affinitätssäule (Spur 6; 1:500). Die Pfeile markieren die gereinigten Immunglobuline. Die Bestimmung der Molmassen erfolgte anhand eines Standards (s. 3.2.2).

4.2.2 Qualitative Bestimmung der Immunglobulin-Isotypen

Zum spezifischen Nachweis der Isotypen, die in den Eluaten und Durchläufen der einzelnen

Säulen enthalten waren, wurde ein Isotyp-ELISA (s. 3.3.4) eingesetzt. Um Aussagen über

eine Anreicherung bzw. Depletion bestimmter Isotypen treffen zu können, wurde zudem das

native Serum im ELISA untersucht. Für den Nachweis der im Serum höher konzentrierten

Isotypen IgG1 und IgG4 wurden für alle Fraktionen Verdünnungen von 1:104 bis 1:106

gewählt, für die in geringeren Mengen vorkommenden Isotypen IgG5 und IgE wurden in

Verdünnungsstufen von 1:103 bis 1:105 eingesetzt (jeweils in Zehnerschritten) (s.Abb. 9).

Im Ausgangsserum (a) ließen sich alle untersuchten Isotypen mit Ausnahme von IgE

nachweisen. In der über Protein G isolierten Fraktion (b) wurden vorwiegend IgG1 und IgG4

detektiert. Der IgG1-Nachweis war über alle drei, der IgG4-Nachweis über die ersten beiden

86

Ergebnisse

Verdünnungsstufen möglich, so dass diese Isotypen im Vergleich zum Serum angereichert

wurden. IgG5 und IgE wurden nicht an die Säule gebunden. Mit der IgE-Affinitätssäule (c)

wurde eine Anreicherung von IgE erreicht; ein Nachweis war in allen drei Verdünnungsstufen

möglich. Im Durchlauf der Säulen (d) konnte lediglich IgG5 nachgewiesen werden.

Abb. 9 (a-d) Verteilung der Immunglobulin-Isotypen im ELISA vor und nach Reinigung über eine Protein G- und IgE-Affinitätssäule

Durch die Affinitätschromatographie mit einer Protein G- bzw. IgE-Affinitätssäule (s. 3.3.2.1) wurden IgG und IgE aus Pferdeseren angereichert und gereinigt. In der Grafik sind die im nativen Serum (a), im Durchlauf (d) und in den von den Säulen isolierten Antikörperfraktionen IgG1/4 (b) und IgE (c) enthaltenen Immunglobulin-Isotypen dargestellt. Die Bestimmung der Isotypen erfolgte im ELISA durch monoklonale Isotyp spezifische Antikörper, einen Enzym gekoppelten Detektionsantikörper und Substrat (s. 3.3.4). Für die im Serum höher konzentrierten Isotypen IgG1 und IgG4 wurden stärkere Verdünnungen der Fraktionen gewählt, für die in geringeren Mengen vorkommenden Isotypen IgG5 und IgE wurden schwächere Verdünnungsstufen benutzt. Die dargestellten Werte stellen die Mittelwerte aller getesteten Pferde dar, die Standardabweichungen sind eingezeichnet.

87

Ergebnisse

Die mit der IgG4-Affinitätssäule aus den IgG1/4-Mischfraktionen erhaltenen Eluate und

Durchläufe wurden nach Einstellung auf eine Proteinkonzentration von 2 bzw. 1 mg/ml in den

Verdünnungstufen 1:104 bis 1:106 im ELISA untersucht (s. Abb. 10). Es wurde festgestellt,

dass die an die Säule gebundene Fraktion in allen Verdünnungsstufen deutlich nachweisbares

IgG4 enthielt. Im Säulendurchlauf konnte IgG1 in allen Verdünnungen detektiert werden.

Abb. 10 Verteilung der Immunglobuline vom Isotyp G1 und G4 im ELISA nach Reinigung über eine IgG4-Affinitätssäule

Die in der mittels Protein G-Säule gewonnenen Mischfraktion enthaltenen Isotypen IgG1 und IgG4 wurden durch Affinitätschromatographie mit einer IgG4-Affinitätssäule voneinander getrennt (s. 3.3.2.1). In drei Verdünnungsstufen wurden die von der Säule gebundenen sowie die im Durchlauf erhaltenen konzentrierten Fraktionen (2 bzw. 1 mg/ml) hinsichtlich des enthaltenen IgG1 und IgG4 untersucht. Der Nachweis erfolgte durch monoklonale Isotyp spezifische Antikörper sowie einen Enzym gekoppelten Detektionsantikörper und Substrat im ELISA (s. 3.3.4). Die dargestellten Werte wurden als Mittelwerte der getesteten Pferde berechnet, die Standardabweichung ist eingezeichnet.

Eine Bindung der zur Detektion eingesetzten monoklonalen Isotyp spezifischen Antikörper

sowie des Enzym gekoppelten Nachweisantikörpers an die Beschichtung wurde durch

entsprechende Kontrollen ausgeschlossen. Ebenso erfolgte keine Bindung des Enzym

gekoppelten Detektionsantikörpers an die equinen Immunglobuline. Die Immunglobuline

wurden aus gleichen Volumina von Seren ekzemkranker und gesunder Pferde unter

identischen Bedingungen isoliert. Es konnten im ELISA zwar individuelle Unterschiede, nicht

jedoch Unterschiede zwischen den beiden Gruppen (Ekzemer und Nichtekzemer) hinsichtlich

der Höhe der OD für einzelne Antikörper-Isotypen in den Fraktionen festgestellt werden.

88

Ergebnisse

4.3 Reaktivität equiner Serum-Immunglobuline mit Komponenten aus Culicoides nubeculosus

Basierend auf der Tatsache, dass die Typ-I-Allergie durch Antikörper vermittelt wird, wurde

untersucht, ob und welche Immunglobulin-Isotypen an Komponenten des Ganzkörperextrakts

aus Culicoides nubeculosus binden und ob sich Unterschiede in der Antikörperbindung

zwischen ekzemkranken und gesunden Pferden erkennen lassen. Zusätzlich wurde

festgestellt, ob es sich bei den durch die Serum-Immunglobuline detektierten Komponenten

um potentielle Allergene handelt.

Zur Bestimmung der bindenden Antikörper-Isotypen wurden der Immunoblot (s. 3.3.10) und

die Immunpräzipitation (s. 3.3.12) angewandt. In der Affinitätschromatographie (s. 3.3.2.2)

wurden die von den Immunglobulinen gebundenen Proteine in einer Form isoliert, in der sie

im funktionellen In-vitro-Test (FIT; s. 3.3.11) hinsichtlich ihrer Reaktivität mit equinen

basophilen Granulozyten und damit einer potentiellen allergenen Wirkung untersucht werden

konnten.

4.3.1 Untersuchung der Antikörperbindung an Komponenten aus Culicoides nubeculosus im Immunoblot

Im Immunoblot (s. 3.3.10) wurde überprüft, welche Immunglobulin-Isotypen aus dem Serum

von ekzemkranken Pferden und gesunden Kontrolltieren an Komponenten aus Culicoides

nubeculosus binden (s. Abb. 11). Der Ganzkörperextrakt der Gnitzen (s. 3.1) wurde in der

SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt (10 µg je Spur) und auf

eine Membran transferiert (s. 3.3.9). Zur Untersuchung der Bindung von IgG1, IgG4 und IgE

wurden die affinitätschromatographisch gereinigten Antikörper verwendet (s. 4.2). Da eine

spezifische Reinigung von IgG5 nicht möglich war, erfolgte der Nachweis der Detektion von

Culicoides-Komponenten durch diesen Isotyp durch Inkubation der Blotstreifen mit dem

Durchlauf der IgE-Affinitätssäule (s. Abb. 9d). Insgesamt wurde die Bindung der Serum-

Immunglobuline von zehn Pferden mit Sommerekzem und fünf nichtallergischen Tieren

untersucht.

Bei allen getesteten Pferde, unabhängig von der Ausprägung des Sommerekzems, konnten

Serum-Antikörper der Isotypen IgE, IgG1, IgG4 und IgG5 nachgewiesen werden, die mehrere

Komponenten aus Culicoides nubeculosus detektierten. Die Molmassenbereiche der

89

Ergebnisse

gebundenen Proteine zeigten eine breite Streuung von < 15 kD bis > 200 kD, der

überwiegende Anteil der gebundenen Proteine konzentrierte sich jedoch auf Molmassen von

15 bis 55 kD. Die farbliche Intensität und die Abgrenzbarkeit der Banden variierte stark, ein

Großteil war lediglich schwach gefärbt und kaum differenzierbar. Zudem trat eine teilweise

nicht unerhebliche Hintergrundfärbung der Membran auf. Somit war es weder möglich, einem

einzelnen Isotyp die Bindung von Culicoides-Proteinen bestimmter Molmassen zuzuordnen

noch Unterschiede zwischen ekzemkranken und gesunden Pferden anhand der gebundenen

Komponenten aufzuzeigen.

Abb. 11 Nachweis einzelner Immunglobulin-Isotypen im Immunoblot, die Komponenten aus Culicoides nubeculosus binden

Im Immunoblot (s. 3.3.10) wurde untersucht, welche Immunglobulin-Isotypen ekzemkranker und gesunder Pferde Komponenten aus dem Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus binden. Dargestellt sind exemplarisch für ein am Sommerekzem erkranktes Pferd (#4) die Bindung von IgE (Spur 1), IgG1 (Spur 2), IgG4 (Spur 3) und IgG5 (Spur 4). Die Trennung der Proteine des Ganzkörperextrakts erfolgte in einer 15 %-igen SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter reduzierenden Bedingungen. Nach Transfer auf eine Membran (s. 3.3.9) wurden die Gnitzenproteine mit den affinitätsgereinigten Immunglobulinen (Spur 1-3) bzw. mit dem Durchlauf der IgE-Affinitätssäule (Spur 4) inkubiert. Die Bindung der Immunglobuline wurde über monoklonale, Isotyp spezifische Antikörper, einen Enzym gekoppelten Detektionsantikörper und Substrat nachgewiesen. Die Molmassen wurden anhand eines Standards (3.2.2) bestimmt.

4.3.2 Untersuchung der Antikörperbindung an Komponenten aus Culicoides nubeculosus in der Immunpräzipitation

Im Immunoblot (s. 3.3.10) waren die Culicoides-Proteine den denaturierenden Konditionen

der SDS-PAGE unterworfen und zusätzlich auf einer Membran fixiert. In der

90

Ergebnisse

Immunpräzipition (s. 3.3.12) wurde dagegen der flüssige Ganzkörperextrakt aus Culicoides

nubeculosus Matrix gekoppelten Antikörpern angeboten, so dass die erkannten Gnitzen-

Komponenten selektiv angereichert wurden. Entsprechende Matrizes wurden durch kovalente

Bindung des affinitätschromatographisch gereinigten IgG1, IgG4 und IgE an

Sepharosekügelchen hergestellt (s. 3.3.2.2). Es wurden zwei Matrizes für jeden Isotyp

präpariert; jeweils eine Matrix wurde mit den zusammengeführten Serum-Immunglobulinen

der zehn Pferde mit Sommerekzem gekoppelt, an die zweite Matrix wurden die gepoolten

Antikörper der gesunden Kontrolltiere gebunden. Die Zusammenführung der Immunglobuline

mehrerer Pferde wurde vorgenommen, um eine Übersicht der gebundenen Culicoides-

Komponenten durch bestimmte Isotypen zu erlangen. Auf eine Immunpräzipitation mit IgG5

musste aufgrund fehlender Reinigungsmöglichkeiten für diesen Antikörper verzichtet werden.

Die insgesamt sechs Matrizes wurden mit dem biotinylierten Ganzkörperextrakt (s. Abb. 7)

der Gnitzen inkubiert. Die gebundenen Proteine wurden durch Erhitzen im SDS-Probenpuffer

von den Antikörpern gelöst, in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen getrennt,

auf eine Membran transferiert und im Immunoblot anhand der Biotinmarkierung

nachgewiesen (s. Abb. 12).

Durch die Isotypen G1, G4 und E wurden unabhängig vom Allergiestatus der Spenderpferde

mehrere Proteine aus dem Ganzkörperextrakt der Gnitzen präzipitiert. Im Vergleich zum

Immunoblot ohne vorangegangene Immunpräzipitation (s. Abb. 11) waren die Banden

überwiegend gut differenzierbar. Mit dem IgG1 der ekzemkranken Pferde wurden sechs

eindeutige Banden erhalten, deren Molmassen sich über einen Bereich von ca. 17 bis 70 kD

verteilten. Durch das IgG1 der Nichtekzemer wurden sieben Banden von 25 bis 70 kD

erhalten. Vier Banden mit Molmassen von 15 bis 40 kD wurden durch das IgG4 der

ekzemkranken Pferde präzipitiert, sieben Banden von etwa 15 bis 45 kD fanden sich beim

Einsatz des IgG4 der gesunden Kontrolltiere. Mit dem IgE der Pferde mit Sommerekzem

wurden neun differenzierbare Banden mit Molmassen von etwa 15 und 60 kD erhalten. Durch

das IgE von Pferden ohne Sommerekzem konnten vier Proteine von 15 bis 45 kD bestimmt

werden.

Wie bereits für den Immunoblot ohne vorausgegangene Immunpräzipitation beobachtet,

besaß die Mehrzahl der in diesem Ansatz detektierten Proteine Molmassen von 15 bis 55 kD.

Das Muster der präzipitierten Proteine unterschied sich dabei sowohl in Abhängigkeit vom

verwendeten Isotyp als auch von der Herkunft der Immunglobuline (Ekzemer/Nichtekzmer).

91

Ergebnisse

Ein Teil der erhaltenen Banden wies ähnliche oder gleiche Molmassen auf, der Großteil

variierte dagegen sehr deutlich. Die Bereiche, in denen mit allen eingesetzten Matrizes

unabhängig vom gekoppelten Isotyp oder Allergiestatus der Spendertiere am häufigsten

Gnitzenproteine präzipitiert wurden, konzentrierten sich auf Molmassen von etwa 15, 30 und

45 kD.

Als Kontrollansatz wurde mit bovinem Serumalbumin gekoppelte Sepharose mit dem

biotinylierten Extrakt inkubiert. Es konnten eine mäßig starke Hintergrundfärbung, jedoch

keine eindeutigen Proteinbanden nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 12 Nachweis einzelner Immunglobulin-Isotypen in der Immunpräzipitation, die Komponenten aus Culicoides nubeculosus binden

Mit der Immunpräzipitation (s. 3.3.12) wurde die Bindung der Serum-Immunglobuline an die Culicoides-Komponenten optimiert. Das affinitätsgereinigte IgG1, IgG4 und IgE (s. 4.2) von Pferden mit und ohne Sommerekzem wurde an eine Matrix gekoppelt (s. 3.3.2.2) und mit dem biotinylierten Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus (s. 3.3.1.2) inkubiert. Die gebundenen Gnitzenproteine wurden gelöst, in der 15 %-gen reduzierenden SDS-PAGE (s. 3.3.4) aufgetrennt und auf eine Membran transferiert (s. 3.3.9). Der Nachweis erfolgte durch Inkubation mit Streptavidin-AP und Substrat im Immunoblot (s. 3.3.10). Die Pfeile markieren die Proteine, die durch IgG1, IgG4 und IgE von Pferden mit (SE+) und ohne Sommerekzem (SE-) präzipitiert wurden. Die Molmassenbestimmung wurde anhand eines Standards (s. 3.2) durchgeführt.

4.3.3 Untersuchung von Komponenten aus Culicoides nubeculosus, die mittels Affinitätschromatographie isoliert wurden

Um festzustellen, ob die im Immunoblot und in der Immunpräzipitation von den equinen

Serum-Immunglobulinen detektierten Proteine (s. Abb. 11 & 12) aus Culicoides nubeculosus

92

Ergebnisse

eine sensibilisierende Wirkung aufweisen, wurde eine Affinitätschromatographie

durchgeführt (s. 3.3.2.2). Mit dieser Methode war es möglich, die Reaktivität der Gnitzen-

Komponenten mit basophilen Granulozyten der Pferde im FIT zu untersuchen. Zudem sollten

durch die Affinitätschromatographie größere Proteinmengen als in der Immunpräzipitation

isoliert werden, um eine Voraussetzung für die weitere Charakterisierung einzelner Proteine

zu schaffen.

Die Affinitätssäulen wurden mit den gleichen Matrizes (IgG1, IgG4 und IgE) präpariert wie

für die Immunpräzipitation beschrieben (s. 4.3.2). Zur Beladung der Säulen wurde der nicht

biotinylierte Ganzkörperextrakt der Gnitzen (s. 3.3.1). verwendet. Die von den Säulen

eluierten Proteine wurden nach Neutralisation und Konzentration durch Ultrafiltration

(s. 3.3.13) mit den Blutzellen von sieben ekzemkranken Pferden und zwei Pferden ohne

Sommerekzem im FIT getestet.

Aus den Blutzellen von fünf der sieben allergischen Pferde konnte eine Histaminfreisetzung

mit dem Eluat induziert werden, das mit der IgE-gekoppelten Säule der ekzemkranken Tiere

isoliert wurde (s. Abb. 13a). Bei zweien dieser Pferde wurde eine schwache

Histaminfreisetzung aus den Blutzellen mit dem Eluat der IgE-gekoppelten Säule der

Nichtekzemer festgestellt. Die Eluate der IgG4-Säule der Ekzemer ergaben bei vier der sieben

untersuchten allergischen Pferde positive Ergebnisse im FIT (s. Abb. 13c), das Eluat der

IgG4-Säule der Nichtekzemer aktivierte die Blutzellen der Testpferde dagegen nicht. Für

keines der beiden über IgG1 gewonnenen Eluate konnte ein positiver FIT beobachtet werden

(s. Abb. 13b). Die gesunden Kontrollpferde reagierten auf keine der sechs isolierten

Fraktionen.

Für eine weitere Charakterisierung der isolierten Gnitzen-Komponenten wurden die

konzentrierten Eluate in der SDS-PAGE (s. 3.3.4) unter reduzierenden Bedingungen

aufgetrennt und die enthaltenen Proteine in der Silberfärbung (s. 3.3.8) dargestellt. Die Menge

an Protein reichte jedoch nicht aus, um auswertbare Ergebnisse zu erhalten. Im Zuge der

Elution der Säulen trat zudem eine Denaturierung der gekoppelten Immunglobuline auf, so

dass die Matrizes nach ein bis zwei Elutionsgängen unbrauchbar wurden. Dadurch war die

Aufreinigung der notwendigen größeren Menge an Culicoides-Proteinen für weitere

Untersuchungen nicht möglich.

93

Ergebnisse

Abb. 13 (a-c) Reaktivität der mittels Serum-Immunglobulinen isolierten Gnitzenproteine im FIT

Im funktionellen In-vitro-Test (FIT; s. 3.3.11) wurde untersucht, ob die Komponenten aus Culicoides nubeculosus, die über die Affinitätschromatographie mit gereinigten Serum-Immunglobulinen (s. 3.3.2.2) isoliert wurden, eine Histaminfreisetzung aus equinen Blutzellen auslösen. Dargestellt sind die Ergebnisse (in % der maximalen Histaminfreisetzung der Zellen, Y-Achse) für sieben Pferde mit und zwei Pferde ohne Sommerekzem (SE). Eingesetzt wurden die Eluate von Säulen, an die IgE (a) von Pferden mit (IgE (SE+)-Säule) und ohne SE (IgE (SE-)-Säule) gebunden war sowie von IgG-gekoppelten Säulen (b & c) von Pferden mit (IgG1 bzw. IgG4 (SE+)-Säule) und ohne SE (IgG1 bzw. IgG4 (SE-)-Säule). Die Prozentzahlen stellen die Mittelwerte der Histaminfreisetzungen dar.

94

Ergebnisse

4.4 Isolierung potentieller Allergene aus Culicoides nubeculosus

Über die Allergene aus Culicoides spp. sind keinerlei biochemische Daten verfügbar

(s. 2.3.3), so dass für die Isolierung zunächst ein Reinigungsprotokoll etabliert werden

musste. Dazu wurde der Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus (s. 3.3.1) mit

verschiedenen säulenchromatographischen Verfahren (s. 3.3.14 bis 3.3.16) sowie mittels

Ultrafiltration (s. 3.3.13) fraktioniert. Zur Bewertung des Reinigungserfolgs wurden die

jeweils erhaltenen Fraktionen hinsichtlich verschiedener Parameter untersucht. Beurteilt

wurden die Reaktivität im FIT (s. 3.3.11) sowie die Relation der FIT-Reaktivität zu der in den

Fraktionen enthaltenen Proteinmenge (s. 3.3.19). Weiterhin wurde die Anzahl der Proteine

unterschiedlicher Molmassen in der SDS-PAGE (s. 3.3.4) nach Silberfärbung (s. 3.3.8)

bestimmt. Schlussendlich wurde die Reaktivität der isolierten Proteine mit IgE aus dem

Serum ekzemkranker Pferde, das nach den Ergebnissen aus 4.3.3 sensibilisierende Gnitzen-

Komponenten binden kann, im Immunoblot untersucht (s. 3.3.11).

4.4.1 Etablierung des ersten Reinigungsschritts

Ziel des ersten Reinigungsschrittes war es, aus der Gesamtproteinmenge von Culicoides

nubeculosus Kandidatenallergene zu bestimmen. Der Ganzkörperextrakt aus den Gnitzen

wurde auf verschiedene Gelfiltrations- (s. 3.3.14) und Ionenaustauschersäulen (s. 3.3.15)

geladen und eluiert. Für die erhaltenen Fraktionen wurde der Quotient aus Höhe der

Histaminfreisetzung im FIT und Chromatogrammfläche (als Parameter für die enthaltene

Proteinmenge) berechnet. Die Fraktion mit dem höchsten Quotienten, gleichbedeutend mit

einer starken Reaktivität durch eine geringe Proteinkonzentration, wurde zur Bestimmung von

Kandidatenallergenen in der SDS-PAGE und im Immunoblot genutzt.

4.4.1.1 Gelfiltrationschromatographie

Es wurden eine BioSil 125- und eine Superose 12-Säule (s. 3.2.1), zur Fraktionierung der

Gnitzen-Komponenten verwendet. Beide Säulen wurden vorab mit einem Molmassenstandard

(kommerzieller Marker, s. 3.2.2 oder equines IgG1/4) kalibriert und nachfolgend mit jeweils

100 µg Gesamtprotein des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus beladen. Die

Eluate wurden in Fraktionen von 0,5 ml gesammelt, deren Reaktivität im FIT mit Blutzellen

zweier ekzemkranker Pferde untersucht wurde. Aufeinanderfolgende Fraktionen

95

Ergebnisse

vergleichbarer Reaktivität wurden zusammengeführt und erneut im FIT gemessen. Die

Histaminfreisetzung jeder Sammelfraktion wurde als Anteil der Gesamthistaminfreisetzung

aller erhaltenen Fraktionen unter Verwendung der Mittelwerte der beiden Pferde berechnet.

Die zugehörigen Chromatogrammflächen wurden integriert und anteilig der Gesamtfläche

berechnet (s. 3.3.19). Die Molmassen der in den Fraktionen enthaltenen Proteine wurden

anhand des Standards bestimmt (s. Abb. 14).

Abb. 14 Chromatogramm der Gelfiltrationschromatographie mit Maxima der Histaminfreisetzung und zugehörigen Flächen

Zur Ermittlung einer Ausgangsfraktion für die Bestimmung von Kandidatenallergenen wurden die Komponenten des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus in der Gelfiltrationschromato-graphie (s. 3.3.15) mit einer BioSil 125-Säule (a) und einer Superose 12-Säule (b) (s. 3.2.1) getrennt. Dargestellt ist der jeweilige Ausschnitt des Chromatogramms, in dem die Trennung der Proteine stattfindet. Die vertikalen schwarzen Linien markieren die Molmassen [ermittelt anhand eines Standards (kommerzieller Marker, s. 3.2.2 oder equines IgG1/4: komplettes Immunglobulin, schwere und leichte Ketten]. Die grauen Felder unterhalb der Kurven zeigen die zusammengefassten Fraktionen der höchsten Histaminfreisetzungen im FIT (s. 3.3.11) an (H; Mittelwerte der Freisetzungen zweier ekzemkranker Pferde anteilig des Mittelwerts der Gesamthistaminfreisetzung). Die zugehörigen Chromatogrammflächen (A) wurden anteilig der Gesamtfläche dargestellt.

Die Blutzellen beider Testpferde zeigten im FIT die höchste Reaktivität mit Proteinen der

Molmassenbereiche zwischen 44 und 158 kD (29 %) und < 17 kD (62 %; BioSil 125-Säule)

bzw. zwischen 55 und 160 kD (37 %) und um sowie < 25 kD (46 %; Superose 12-Säule).

Durch die in den weiteren Fraktionen enthaltenen Proteine konnten z. T. ebenfalls

Histaminfreisetzungen aus den Zellen induziert werden, die anteilige Histaminmenge lag

jedoch deutlich unter den genannten Werten. Die zwischen 44 und 158 kD bzw. 55 und

160 kD gelegene Sammelfraktion umfasste zwei bzw. drei Einzelfraktionen und entsprach

einer anteiligen Chromatogrammfläche von 16 % bzw. 21 %. Die Sammelfraktion des

96

Ergebnisse

niedermolekularen Bereichs setzte sich aus fünf bzw. sechs Einzelfraktionen zusammen, die

einen Anteil von 19 % der Gesamtchromatogrammfläche stellte. Die zur Vergleichbarkeit der

vier Sammelfraktionen berechneten Quotienten aus Histaminfreisetzung und Chromato-

grammfläche besaßen Werte zwischen 1,5 und 2,4 (s. Abb. 15).

Abb. 15 Quotienten aus Histaminfreisetzungen und Chromatogrammflächen für die Gelfiltrationschromatographie

Um die in der Gelfiltrationschromatographie (s. 3.3.14) erhaltenen Fraktionen hinsichtlich ihrer Eignung als Ausgangsfraktion für die Bestimmung von Kandidatenallergenen zu charakterisieren, wurden die Quotienten aus Histaminfreisetzung (%) im FIT (s. 3.3.11) und Chromatogrammfläche (%) berechnet (s. 3.3.19). Die Höhe des Quotienten ist auf der Y-Achse aufgetragen. Die Molmassenangaben kennzeichnen die jeweilige Fraktion.

4.4.1.2 Ionenaustauscherchromatographie

Als Alternative zu den Gelfiltrationssäulen wurden für den ersten Reinigungsschritt ein

starker Kationen- und Anionenaustauscher (s. 3.2.1) getestet. Beide Säulen wurden bei

verschiedenen pH-Werten mit jeweils 50 µg Gesamtprotein des Ganzkörperextrakts aus

Culicoides nubeculosus beladen und bei einer NaCl-Konzentration von 1 M eluiert. Die

ungebundenen Proteine (Durchlauf) und das Eluat wurden im FIT mit den Blutzellen zweier

ekzemkranker Pferde getestet. Die Histaminfreisetzungen durch Durchlauf und Eluat wurden

anteilig der Summe der beiden Freisetzungen unter Verwendung der Mittelwerte beider

Pferde bestimmt. Die Flächen von Durchlauf- und Elutionspeak wurden anhand des

Chromatogramms integriert und anteilig der Gesamtfläche berechnet (s. Abb. 16).

97

Ergebnisse

Abb. 16 (a,b) Histaminfreisetzungen und Chromatogrammflächen unter Verwendung der Ionenaustauscherchromatographie

Zur Bestimmung einer Ausgangsfraktion, die hinsichtlich enthaltener Kandidatenallergenen weiteren Untersuchungen unterzogen werden sollte, wurden ein Kationen- (a) und ein Anionenaustauscher (b) (s. 3.3.14) bei unterschiedlichen pH-Werten mit dem Ganzkörperextrakt aus Culicoides nubeculosus beladen und eluiert. Eluat (E) und Durchlauf (D) jedes Ansatzes wurden im FIT (s. 3.3.11) an drei Pferden mit Sommerekzem getestet und die Histaminfreisetzungen als Mittelwerte der drei Pferde anteilig der mittleren Gesamtfreisetzung bestimmt (H). Die zugehörige Chromatogrammfläche wurde anteilig der Gesamtfläche dargestellt (A).

98

Ergebnisse

Die Chromatogramme zeigen, dass der überwiegende Teil der Proteine aus Culicoides

nubeculosus basischer Natur sein muss, da bei neutralem pH-Wert wie auch bei schwach

sauren pH-Werten der größte Teil der Proteine an den Anionenaustauscher gebunden hatte.

Eine Bindung an den Kationenaustauscher gelang nur im sauren Bereich, wo die Proteine in

zunehmend protonierter Form vorlagen. Die Bewertung des Reinigungserfolgs erfolgte

anhand des Quotienten der Histaminfreisetzung im FIT im Vergleich zur

Chromatogrammfläche (s. Abb. 17). Für die Mehrzahl der Ansätze ergaben sich Quotienten

zwischen 0,7 und 1,7. Dagegen wurde für das Eluat des Kationenaustauschers (pH 6,0) bei

einer Histaminfreisetzung von 36 % und einer Chromatogrammfläche von 2,5 % ein Quotient

von 11,6 erhalten. Der Durchlauf des Anionenaustauschers bei pH 9,0 ergab bei einer

Histaminfreisetzung von 35 % und einer Chromatogrammfläche von 8 % einen Quotienten

von 4,25.

Abb. 17 Quotienten aus Histaminfreisetzungen und Chromatogrammflächen für die Ionenaustauscherchromatographie

Zur Bewertung ihrer Eignung als Ausgangsfraktion für die Bestimmung von Kandidatenallergenen wurden für die mit dem starken Kationen- und Anionenaustauscher bei verschiedenen pH-Werten (s. 3.3.14) erhaltenen Fraktionen der Quotient aus Histaminfreisetzung (%) im FIT (s. 3.3.11) und Chromatogrammfläche (%) berechnet (s. 3.3.19). Die Höhe des Quotienten ist auf der Y-Achse aufgetragen. Ausgenommen wurden die Fraktionen, die keine Histaminfreisetzung bzw. keine messbare Chromatogrammfläche aufwiesen.

99

Ergebnisse

4.4.1.3 Bestimmung von Kandidatenallergenen

Durch den Vergleich der errechneten Quotienten wurde festgestellt, dass das bei einem pH-

Wert von 6,0 vom starken Kationenaustauscher gewonnene Eluat hinsichtlich der Korrelation

von Reaktivität zur Proteinkonzentration die optimale Ausgangsfraktion für die Bestimmung

von Kandidatenallergenen darstellt. Es wurden insgesamt 10 mg Gesamtprotein des

Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus auf diesem Wege fraktioniert und

weitergehend untersucht. Hierzu wurde die Reaktivität der isolierten Fraktion mit den

Blutzellen von acht weiteren ekzemkranken Pferden im FIT (s. 3.3.11) überprüft, um

festzustellen, ob die bei den zwei bereits untersuchten Pferden (#4 und # 12) gemessenen

Histaminfreisetzungen maßgeblich für die Mehrzahl der am Sommerekzem erkrankten Pferde

waren. Als negative Kontrolle erfolgte zudem eine Inkubation der Fraktion mit den Zellen

zweier gesunder Pferde. Alle ekzemkranken Tiere zeigten eine Histaminfreisetzung mit der

eluierten Fraktion (s. Abb. 18), bei den Kontrolltieren wurde keine Reaktivität beobachtet.

Abb. 18 Histaminfreisetzungen der mittels Kationenaustauscherchromatographie isolierten Fraktion im funktionellen In-vitro-Test (FIT)

Die mit dem Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von 6,0 und einer NaCl-Konzentration von 1 M gewonnene Fraktion wurde hinsichtlich ihrer Reaktivität im FIT (s. 3.3.11) mit den Blutzellen von zehn Pferden mit Sommerekzem (SE) und zwei gesunden Kontrollpferden (nicht gezeigt) untersucht. Dargestellt sind die Histaminfreisetzungen in % der maximal aus den Blutzellen freisetzbaren Histaminmenge (Y-Achse). Die Skalierung der Y-Achse beginnt mit der 10 %- Marke, ab der der Test als positiv gewertet wird.

100

Ergebnisse

Weiterhin wurde die Anzahl und Größe der im Eluat enthaltenen Proteine in der unter

reduzierenden Bedingungen durchgeführten SDS-PAGE (s. 3.3.5) nach Silberfärbung

(s. 3.3.8) bestimmt. Im Immunoblot (s. 3.3.10) wurde zusätzlich mit affinitätsgereinigtem IgE

zweier ekzemkranker Pferde nach möglichen Kandidatenproteinen für die weiteren

Reinigungsschritte gesucht. Die Fraktion wurde zur Vorbereitung für die SDS-PAGE und den

Immunoblot mittels Ultrafiltration (s. 3.3.13) um den Faktor 50 konzentriert und entsalzt. Die

Ausschlussgrenze der Filtrationseinheiten betrug 3 kD. In der Silberfärbung wurden Proteine

mit Molmassen von < 15 kD bis 200 kD gefunden (s. Abb. 19, Spur 1). Die genaue Anzahl

konnte aufgrund der Überlagerung und schlechten Abgrenzung der Proteinbanden nicht

bestimmt werden. Im Immunoblot konnte gezeigt werden, dass aus der Masse der Proteine

zwei unterschiedliche Banden von Immunglobulinen des Isotyps E der zwei Testpferde

deutlich gebunden wurden (Spur 2). Anhand eines Markers konnten den Banden ungefähre

Molmassen von 15 kD und 45 kD zugeordnet werden. Weitere, schwach gefärbte Banden bei

ca. 60, 40 und 36 kD wurden durch das IgE eines Pferdes detektiert (im dargestellten Blot

nicht erkennbar).

Abb. 19 SDS-PAGE und Immunoblot chromatographie isol

der mittels Kationenaustauscher-ierten Fraktion

%-ig erblick über

einem p von 1 M isolierten Fraktion enthalten waren. Im

In der 15 en SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter reduzierenden Bedingungen wurde ein Übdie Anzahl und die Molmassen der Proteine gewonnen, die in der mit dem Kationenaustauscher bei

H-Wert von 6 und einer NaCl-KonzentrationImmunoblot (s. 3.3.10) wurde untersucht, ob Proteine dieser Fraktion durch affinitätsgereinigtes IgE ekzemkranker Pferde gebunden wurden. Vor Verwendung in der SDS-PAGE wurde die Fraktion durch Ultrafiltration (s. 3.3.13) konzentriert und entsalzt. Auf Spur 1 ist das Gel nach Silberfärbung (s. 3.3.8) dargestellt, Spur 2 zeigt beispielhaft einen Immunoblot mit IgE von einem Pferd mit Sommerekzem. Die Molmassen wurden anhand eines Standards (s. 3.2.2) bestimmt.

101

Ergebnisse

4.4.2 Etablierung des zweiten Reinigungsschritts

Im ersten Reinigungsschritt konnten durch einen starken Kationenaustauscher bei einem pH-

datenallergene mit Molmassen

altenen Proteine mit einer gegensätzlich geladenen Matrix

en Eluaten der Säule, jedoch nicht

Wert von 6 und einer NaCl-Konzentration von 1 M zwei Kandi

von etwa 45 kD und 15 kD angereichert werden, die vom Serum-IgE ekzemkranker Pferde

gebunden wurden (s. Abb. 19). Die Gesamtfraktion löste eine Histaminfreisetzung aus den

Blutzellen aller getesteten, am Sommerekzem erkrankten Pferde aus (s. Abb. 18). Ausgehend

von diesen Ergebnissen war das Ziel des zweiten Reinigungsschritts, eine Methode zu

entwickeln, in der das 45 kD-Protein und das 15 kD-Protein voneinander getrennt wurden und

eine Anreicherung des jeweiligen Proteins erfolgte. Für die Reinigung wurden erneut

Ionenaustauschersäulen verwendet, die unter variierenden Bedingungen beladen und eluiert

wurden. Die erhaltenen Fraktionen wurden im FIT (s. 3.3.11), in der SDS-PAGE (s. 3.3.5)

sowie im Immunoblot (s. 3.3.10) überprüft.

4.4.2.1 Zweistufige Reinigung über einen starken Kationenaustauscher und einen

starken Anionenaustauscher

Über den Anionenaustauscher sollte versucht werden, die vom Kationenaustauscher bei

pH 6,0 und 1 M Kochsalz erh

weiter zu trennen. Die mit dem Kationenaustauscher gewonnene Fraktion wurde über

Ultrafiltration mit Filtern eines Ausschlusses von 3 kD eingeengt und entsalzt (s. 3.3.13).

Anschließend wurden die Proteine bei pH-Werten von 5,0 bis 9,0 (in Schritten von jeweils

einer pH-Einheit) auf eine starke Anionenaustauschersäule geladen und mit einer NaCl-

Konzentration von 1 M eluiert. Sowohl Durchlauf als auch Eluat des Anionenaustauschers

wurden im FIT mit Blutzellen zweier ekzemkranker Pferde untersucht sowie nach

Konzentration und Entsalzen in der SDS-PAGE überprüft.

In den Chromatogrammen der fünf pH-Stufen wurde eine messbare Fläche nur für die Eluate

erhalten (nicht dargestellt). Eine FIT-Reaktivität konnte in d

in den Durchläufen nachgewiesen werden (s. Tab. 7). In der SDS-PAGE wurde nach

Silberfärbung gezeigt, dass sich sowohl das 45 kD- als auch 15 kD-Protein sowie die übrigen

Komponenten der aufgetragenen Fraktion im Eluat befanden (nicht dargestellt). Damit wurde

deutlich, dass nicht nur der Großteil der Culicoides-Proteine basischer Natur ist (s. Abb. 16b),

sondern auch die beiden Kandidatenallergene.

102

Ergebnisse

Tab. 7 Verteilung der Histaminfreisetzung bei Verwendung eines Anionenaustauschers als zweiten Reinigungsschritt

pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0 pH 9,0

Durchlauf 9 % 4 % 5 % 2 % 8 %

Eluat 1 M 35 % 39 % 23 % 44 % 31 %

Durch einen starken Anionenaustauscher (s. 3.3.14) sollte eine weitere Auftrennun it dem Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von 6 un NaCl-Ko tion von haltenen F 4.4. sucht we Dazu wurde das Eluat des Kationenaustauschers über Ultrafiltration (s. 3.3.13) konzentriert und entsalzt, auf einen starken Anionenaustauscher geladen und

ng der Proteine durch eine modifizierte Elution der

Kationenaustauschersäule bei pH 6,0 vorgenommen. Die bisher einstufige Elution der Säule

g der md einer nzentra 1 M er

raktion (s. 1) ver rden.

bei verschiedenen pH-Werten mit 1 M NaCl eluiert. Die Histaminfreisetzungen von Durchlauf und Eluat wurden mit Blutzellen von zwei ekzemkranken Pferden im FIT (s. 3.3.11) untersucht. Die Prozentzahlen stellen Mittelwerte Histaminfreisetzungen der getesteten Pferde dar.

4.4.2.2 Elution der Culicoides-Proteine im Stufengradienten von einem starken

Kationenaustauscher

Alternativ zur Reinigung über eine Kombination zweier unterschiedlicher Ionenaustauscher

wurde eine Trennu

mit 1 M NaCl wurde durch eine mehrstufige Erhöhung der Ionenstärke des Puffers ersetzt, die

eine Lösung der gebundenen Proteine in Abhängigkeit von ihrer Ladungsstärke ermöglichte.

Nach Beladung der Säule mit jeweils 100 µg Gesamtprotein des Ganzkörperextrakts aus

Culicoides nubeculosus wurde die NaCl-Konzentration des Elutionspuffers (s. 3.2.6)

stufenweise von 0 M auf 0,5 M erhöht (Volumen: 10 ml pro Stufe). Abschließend erfolgte

eine Elution mit 10 ml 1 M NaCl. Die in den jeweiligen Stufen eluierten Fraktionen wurden

auf ihre Reaktivität mit Blutzellen von zwei Pferden mit Sommerekzem im FIT getestet.

Zusätzlich wurden die in den Fraktionen enthaltenen Proteine nach Konzentration und

Entsalzung mittels Ultrafiltration in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen

getrennt. In der Silberfärbung wurde untersucht, ob eine Trennung der beiden

Kandidatenproteine von 45 und 15 kD gelungen war. Begonnen wurde mit einem

Zweistufengradient. Ausgehend von den erhaltenen Histaminfreisetzungen sowie den

Proteinverteilungen in den Fraktionen wurde jeweils der neue Gradient entwickelt. Die beste

Trennung gelang mit einem Fünfstufengradienten der Kochsalzkonzentrationen 31 mM;

62,5 mM; 125 mM; 187,5 mM und 500 mM (s. Tab. 8). Die Zielproteine fanden sich hier in

103

Ergebnisse

angereicherter Form in den Stufen 62,5 mM (45 kD-Protein) sowie 187,5 mM (15 kD-

Protein). Bei 125 mM waren schwächere Banden beider Zielproteine zu erkennen. Alle drei

genannten Fraktionen zeigten eine Histaminfreisetzung im FIT, die für die Mischfraktion am

höchsten, für die Fraktion des 15 kD-Proteins am niedrigsten war. Eine weitere Verkleinerung

der Stufen erbrachte hinsichtlich der Trennung der Proteine keine wesentliche Verbesserung

(nicht dargestellt). Bei keinem der untersuchten Gradienten konnte in der Abschlussfraktion

von 1 M NaCl eine Reaktivität im FIT gezeigt oder ein Proteinnachweis in der SDS-PAGE

erbracht werden. Neben den FIT-positiven Fraktionen, die das 15 kD- oder 45 kD-Protein

enthielten, konnte für die Fraktion von 31 mM im Fünfstufengradienten eine deutliche

Histaminfreisetzung festgestellt werden. Diese Fraktion, die keines der beiden Zielproteine

enthielt, wurde im Zuge dieser Arbeit nicht weiter untersucht.

Tab. 8 Verteilung der Zielproteine und Histaminfreisetzungen bei Elution des Kationenaustauschers im Stufengradienten

31 mM 62,5 mM 125 mM 187,5 mM 250 mM 500 mM

2 Stufen 44 % 7 %

3 Stufen 53 % 29 % 10 %

4 Stufen 43 % 64 % 27 % 8 %

5 Stufen 48 % 54 % 58 % 34 % 0 %

Durch Elution des starken Kat engradienten4.4.1 als Gesamdie Reaktivität im FIT (s. 3.3.11) mit den Blutzellen von zwei Pferden mit Sommerekzem untersucht

Kationenaustauscher

Mit der Elution im linearen Gradienten sollte eine im Vergleich zum Stufengradienten feinere

Auftrennung der Proteine durch die fließende Erhöhung der Ionenstärke erreicht werden. Die

ionenaustauschCulicoides

ers mit untersc-Proteine voneinand

hiedlichen Stuer getrennt. Von jeder Stufe wurde

f wurden die in tfraktion eluierten

(Prozentzahlen entsprechen den Mittelwerten der zwei getesteten Tiere). Des weiteren wurde das Vorkommen des 15 kD- bzw. 45 kD-Proteins in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (s. 3.3.5) nach Silberfärbung (s. 3.3.8) untersucht. Fraktionen, die neben weiteren Proteinen nur das 15 kD-Protein enthielten, sind hellgrau unterlegt, solche, in denen das 45 kD-Protein angereichert wurde, sind schwarz unterlegt. Eine dunkelgraue Unterlegung kennzeichnet Fraktionen, die beide Proteine enthalten. Die nicht unterlegten Felder (mit Prozentangaben) zeigen an, dass keines der beiden Kandidatenproteine in der Fraktion nachweisbar war.

4.4.2.3 Elution der Culicoides-Proteine im linearen Gradienten von einem starken

104

Ergebnisse

Ergebnisse des Stufengradienten zeigten, dass beide Kandidatenproteine bei niedrigen NaCl-

Konzentrationen vom Kationenaustauscher eluiert wurden. Entsprechend wurden lineare

Gradienten von 0 mM bis 250 mM NaCl gewählt. Die Säule wurde mit 100 µg Gesamtprotein

ie Elution entsprechender Fraktionen bei vergleichbaren NaCl-

des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus beladen. Die Elution erfolgte zum einen

im steilen Gradienten, bei dem sich die Ionenstärke des Elutionspuffers über ein Volumen von

20 ml auf 250 mM erhöhte. Zum anderen wurde ein flacher Gradient mit einem Volumen von

50 ml für die Elution genutzt. Abschließend wurde die Säule bei beiden Gradienten mit 1 M

NaCl eluiert. Es wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt, deren Reaktivität im FIT mit den

Blutzellen von zwei am Sommerekzem erkrankten Pferden untersucht wurde. Zusätzlich

wurden die in den Fraktionen enthaltenen Proteine nach Konzentration in der Speedvac

(s. 3.1) in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und mittels

Silberfärbung dargestellt.

Mit beiden Gradienten ließen sich das 45 kD- und das 15 kD-Protein voneinander trennen

(s. Abb. 20). Fraktionen, die neben weiteren Proteinen lediglich eines der beiden

Kandidatenproteine enthielten, wurden im steilen Gradienten bei etwa 50 mM NaCl (45 kD-

Protein) und 150 mM NaCl (15 kD-Protein) von der Säule eluiert (jeweils eine Fraktion). Im

flachen Gradienten erfolgte d

Konzentrationen. Es wurden drei Fraktionen mit dem 45 kD-Protein und vier Fraktionen mit

dem 15 kD-Protein erhalten. Der Großteil der getesteten Fraktionen, der zwischen 50 und

150 mM eluiert wurde, enthielt jedoch - neben weiteren Komponenten - beide

Kandidatenproteine. Alle Fraktionen, die das 45 kD- oder 15 kD-Protein enthielten,

induzierten eine Histaminfreisetzung im FIT aus. Die stärksten Freisetzungen wurden für die

Mischfraktionen der beiden Kandidatenproteine gemessen. Fraktionen, in denen bezüglich der

Kandidatenproteine nur das 45 kD-Protein nachweisbar war, zeigten analog zum

Stufengradienten durchschnittlich höhere FIT-Ergebnisse als Fraktionen, die das 15 kD-

Protein enthielten. Bei beiden Gradienten konnten zudem bei sehr niedrigen NaCl-Molaritäten

Fraktionen gewonnen werden, die keines der Kandidatenproteine enthielten, jedoch eine

Histaminfreisetzung im FIT auslösten. Die entsprechenden Fraktionen wurden nicht weiter

analysiert. Bei der Elution oberhalb einer Ionenstärke von 250 mM war keine FIT-Reaktivität

mehr nachweisbar. In der SDS-PAGE nach Silberfärbung ließen sich nur wenige Proteine

darstellen. Die Erhöhung der Ionenstärke über größere Volumina als 50 ml verbesserten die

Ergebnisse der Trennung nicht (nicht dargestellt).

105

Ergebnisse

Abb. 20 (a,b) Verteilung der Zielproteine und Histaminfreisetzungen bei Elution des Kationenaustauschers im linearen Gradienten

Die Elution des starken Kationenaustauschers (s. 3.3.14) bei einem pH-Wert von 6,0 mit einem steilen (a) sowie flachen (b) linearen Gradienten wurde zur Trennung der beiden Kandidatenproteine von 45 kD und 15 kD angewandt. Die Verteilung der Proteine wurde in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter reduzierenden Bedingungen nach Silberfärbung (s. 3.3.8) untersucht. Das Vorkommen eines oder beider Proteine in der jeweiligen Fraktion ist in den Grafiken durch entsprechende Färbung r eingezeichneten Messpunkte dargestellt. Die Fraktionen wurden hinsichtlich ihrer Reaktivität im FIT (s. 3.3.11) mit den Blutzellen von zwei Pferden mit Sommerekzem überprüft. Die gemessenen Histaminfreisetzungen wurden anteilig der maximal aus den Zellen freisetzbaren Histaminmenge berechnet (linke Y-Achse) und entsprechen den Mittelwerten der zwei untersuchten Tiere. Die Gerade kennzeichnet die Ionenstärke des Elutionspuffers (rechte Y-Achse).

de

106

Ergebnisse

4.4.2.4 Vergleich der Methoden und Nachweis der Kandidatenallergene

Ziel des zweiten Reinigungsschrittes stellten die Trennung sowie die Anreicherung der beiden

Kandidatenallergene von 45 kD und 15 kD dar. Die Kombination von zwei gegensätzlich

geladenen Ionenaustauschersäulen (s. 4.4.2.1) erbrachte keine Trennung der Proteine, die alle

an die Anionenaustauschersäule banden. Eine weitere Fraktionierung der Proteine mit dieser

Säule wäre daher nur über eine Elution im Gradienten möglich gewesen. Der Säulenwechsel

ging zudem mit einem erheblichen Verlust von Culicoides-Komponenten durch das

Konzentrieren und Entsalzen einher. Die Elution des Kationenaustauschers bei pH 6,0 im

n eine partielle

Trennung und Anreicherung der beiden Kandidatenproteine. Zudem gingen diese Ansätze

vier- und fünfstufigen wie auch im linearen Gradienten erbrachte dagege

vom Ganzkörperextrakt der Gnitzen aus, so dass kein Materialverlust durch einen

Säulenwechsel entstand. Beim Vergleich der beiden linearen Gradienten war die Anzahl der

Fraktionen beim flachen Gradienten größer, in denen entweder das 45 kD- oder 15 kD-Protein

enthalten waren. Allerdings überwogen die Fraktionen, in denen beide Proteine vorhanden

waren. Die Elution im Stufengradienten erbrachte ebenfalls eine Mischfraktion. Die anhand

der Bandenstärke im Gel geschätzte Menge zeigte jedoch, dass der größte Teil der 45 kD- und

15 kD-Proteine voneinander getrennt wurde. Durch den Fünfstufengradienten wurde im

Gegensatz zum vierstufigen Gradienten zusätzlich ein Teil anderer Proteine aus der Fraktion

des 45 kD-Proteins entfernt. Somit wurde eine Elution über fünf Stufen zur Reinigung der

Kandidatenallergene gewählt, bei der das 45 kD-Protein nach Elution mit 62,5 mM und das

15 kD-Protein nach Elution mit 187,5 mM NaCl erhalten wurden. Zusätzlich stand nach

Elution mit 125 mM eine Fraktion zur Verfügung, in der beide Proteine vorhanden waren.

Insgesamt wurden 20 mg Gesamtprotein des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus

über den Fünfstufengradienten gereinigt und die genannten drei Fraktionen weitergehend

untersucht.

Im FIT (s. 3.3.11) wurde überprüft, ob bei weiteren, am Sommerekzem erkrankten Pferden

eine vergleichbare Reaktion der Blutzellen auf die eluierten Fraktionen beobachtet werden

konnte wie bei den beiden Testpferden. Als Negativkontrolle wurden zudem zwei gesunde

Tiere untersucht. Die Eluate wurden im Verhältnis 1:10 mit dem Freisetzungspuffer (s. 3.2.6)

verdünnt. Die Fraktion des 45 kD-Proteins induzierte bei acht von neun am Sommerekzem

erkrankten Tieren eine Histaminfreisetzung aus den Blutzellen, die Fraktion des 15 kD-

107

Ergebnisse

Proteins bei sechs von neun Pferden (s. Abb. 21). Zellen aller untersuchten ekzemkranken

Pferde lieferten positive FIT-Ergebnisse mit der Mischfraktion erhoben. Die höchsten

Histaminfreisetzungen wurden mit der Mischfraktion gemessen, die niedrigsten mit der

Fraktion des 15 kD-Proteins. Bei den Blutzellen der gesunden Kontrolltiere induzierten die

drei Eluate keine Histaminfreisetzung.

Abb. 21 Untersuchung der Histaminfreisetzungen dreier im Stufengradienten aus Culicoides nubeculosus erhaltenen Fraktionen im FIT

Durch die Elution des starken Kationenaustauschers (s. 3.3.14) im Fünfstufengradienten bei einem pH-Wert von 6,0 wurden drei Fraktionen isoliert, die die Kandidatenallergene von 45 kD und 15 kD enthielten. Alle drei Fraktionen wurden im FIT (s. 3.3.11) mit den Blutzellen von neun Pferden mit Sommerekzem sowie von zwei Kontrolltieren (nicht gezeigt) untersucht. Dargestellt sind die Histaminfreisetzungen in % der maximal aus den Blutzellen freisetzbaren Histaminmenge (Y-Achse). Die Skalierung der Y-Achse beginnt mit der 10 %- Marke, ab der der Test als positiv gewertet wird.

Um eine Strategie für die nächsten Reinigungsschritte zu entwickeln, wurde in der SDS-

PAGE (s. 3.3.5) nach Silberfärbung (s. 3.3.8) überprüft, wie viele Proteine neben den

Kandidatenallergenen in den Fraktionen enthalten waren. Um einen Hinweis zu erhalten, ob

deutliche Anreicherung des jeweiligen Zielproteins sowie eine Reduktion der übrigen

die in den isolierten Fraktionen nachgewiesenen 45 kD- und 15 kD-Proteine den im ersten

Reinigungsschritt (s. 4.4.1.3) detektierten Proteinen entsprachen, wurde ein Immunoblot

(s. 3.3.10) mit affinitätsgereinigtem IgE von zwei Pferden mit Sommerekzem durchgeführt.

Die drei Fraktionen wurden hierzu durch Ultrazentrifugation (s. 3.3.13) konzentriert und

entsalzt. In der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen war bei allen Fraktionen eine

108

Ergebnisse

Proteine im Vergleich zum Gesamteluat bei 1 M (vgl. Abb. 19) zu erkennen (s. Abb. 22a). In

der Fraktion des 45 kD-Proteins waren einige weitere Proteine ober- und unterhalb von 45 kD

zu erkennen (Spur 1). Das 15 kD-Protein schien die kleinste sichtbare Komponente in der

entsprechenden Fraktion zu sein (Spur 3). Sowohl die 45 kD- als auch die 15 kD-Bande

waren in der Mischfraktion schwächer als in den anderen beiden Fraktionen ausgeprägt,

zusätzlich waren weitere Banden von 30 kD bis knapp 200 kD erkennbar (Spur 2). Im

Immunoblot wurde gezeigt, dass das 45 kD- wie auch das 15 kD-Protein durch IgE aller

untersuchten Pferde gebunden wurden (s. Abb. 22b). In der Fraktion des 45 kD-Proteins

waren mit dem IgE eines der beiden Pferde zwei weitere, schwächer gefärbte Banden

oberhalb und unterhalb von 45 kD nachweisbar. In der Mischfraktion war mit dem IgE beider

Pferde eine weitere, ebenfalls schwach ausgeprägte Bande oberhalb der 45 kD-Proteins zu

erkennen.

Abb. 22 (a,b) SDS-PAGE und Immunoblot der im Stufengradienten erhaltenen Fraktionen aus Culicoides nubeculosus

Die Fraktionen mit 62,5 mM (Spur 1), 125 mM (Spur 2) und 187,5 mM NaCl (Spur 3), die durch Elution im Fünfstufengradienten vom Kationenaustauscher gewonnen wurden, wurden zur Bestimmung der Anzahl und Größe der enthaltenen Proteine in der SDS-PAGE (s. 3.3.4; 15 %-ig, reduzierende Bedingungen) getrennt und in der Silberfärbung (s. 3.3.8) dargestellt (a). Des weiteren wurde im Immunoblot (s. 3.3.10) die Reaktivität der in den Fraktionen enthaltenen Proteine mit Serum-IgE von Pferden mit Sommerekzem überprüft. Das Ergebnis ist beispielhaft dargestellt für ein Pferd (b). Die Pfeile markieren die Kandidatenproteine in den einzelnen Fraktionen, Doppelpfeile die zusätzlich zum 45 kD- und 15 kD-Protein im Immunoblot detektierten Proteine. Die Molmassen wurden anhand eines Standards (s. 3.2.2) bestimmt. Die Fraktionen wurden vor Verwendung in der SDS-PAGE bzw. im Immunoblot durch Ultrafiltration (s. 3.3.13) konzentriert und entsalzt.

109

Ergebnisse

4.4.3 Isolierung der Kandidatenallergene

Im dritten Reinigungsschritt wurden das vorgereinigte und angereicherte 45 kD- bzw. 15 kD-

Protein von den übrigen Proteinen der jeweiligen Fraktion isoliert. Die Reinigung des 45 kD-

Proteins erfolgte aus der Fraktion, die bei einer NaCl-Konzentration von 62,5 mM im

Fünfstufengradienten vom starken Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von 6,0 eluiert

wurde (vgl. Abb. 22a, Spur 1). Das 15 kD-Protein wurde aus der Fraktion isoliert, die bei

einer Ionenstärke von 187,5 mM von dieser Säule gewonnen wurde (Spur 3). Für die

abschließende Reinigung der beiden Kandidatenallergene wurden aus 30 mg Gesamtprotein

ngen der beiden Fraktionen hergestellt.

Zur Reinigung des 45 kD- und 15 kD-Proteins aus diesen Fraktionen wurden unterschiedliche

nicht

3.3.13)

wurde die Gesamtfraktion auf eine C18-Säule (s. 3.2.2) aufgetragen und mit verschiedenen

des Ganzkörperextrakts der Gnitzen ausreichende Me

chromatographische Verfahren (s. 3.3.14 bis 3.3.16) sowie die Ultrafiltration (s. 3.3.13)

angewandt. Die Kontrolle des Reinigungserfolges erfolgte in der SDS-PAGE (s. 3.3.5).

4.4.3.1 Isolierung des 45 kD-Proteins mittels Reversed-Phase-Chromatographie

Die Untersuchung der Fraktion des 45 kD-Proteins in der SDS-PAGE erbrachte, dass mehrere

Proteine, teilweise im Molmassenbereich von 45 kD, in der Fraktion vorhanden waren. Um

eine effektive Abtrennung dieser Komponenten zu erreichen, wurde als Reinigungsmethode

die Reversed-Phase-Chromatographie (s. 3.3.16) angewandt, die Proteine nach ihrer Polarität

fraktioniert. In Vorversuchen wurde festgestellt, dass die Reaktivität der Gesamtfraktion des

45 kD-Proteins im FIT (s. 3.3.11) durch den Zusatz der für die Chromatographie

erforderlichen Reagenzien Trifluoressigsäure (TFA; 0,1 %-ig) und Acetonitril (s. 3.2.2)

beeinträchtigt wurde. Nach Konzentration und Entsalzen durch Ultrafiltration (s.

Gradienten eluiert (Daten nicht dargestellt). Fraktionen, die eine messbare UV-Absorption

zeigten, wurden in der Speedvac (s. 3.1) eingeengt und nachfolgend in der SDS-PAGE

untersucht.

Die Reinigung des 45 kD-Proteins gelang mit einem Gradienten, der über 140 min bei einem

Fluss von 1 ml/min von 30 % auf 100 % Acetonitril anstieg (s. Abb. 23). Die Elution des

Kandidatenproteins erfolgte bei hoher Polarität bei einer Konzentration von ca. 74 %

Acetonitril (Fraktion 106 bis 110). Die übrigen Proteine der Fraktion wurden größtenteils bei

niedrigeren Polaritäten eluiert, nur ein kleiner Teil folgte nach dem 45 kD-Protein. Proteine

110

Ergebnisse

< 100 kD banden nicht an die Säule und erschienen bereits im Durchlauf bei 100 % TFA

(0,1 %) (nicht dargestellt).

(a) (b)

Abb. 23 (a,b) Isolierung des 45 kD-Proteins mittels Reversed-Phase-Chromatographie und Überprüfung des Reinigungserfolgs in der SDS-PAGE

Die Fraktion des 45 kD-Proteins, die vom Kationenaustauscher eluiert wurde (vgl. Abb. 21a, Spur 1), wurde zur Reinigung des Kandidatenallergens mit der Reversed-Phase-Chromatographie (s. 3.3.16) über eine C18-Säule (s. 3.2.2) weiter fraktioniert. In der linken Abbildung (a) ist das Chromatogramm der Reinigung dargestellt. Die Y1-Achse zeigt die Höhe der Absorption im UV-Meter (Wellenlänge 230 nm) umgerechnet in Volt als Indikator der Proteinmenge, die Y2-Achse beschreibt die Acetonitrilkonzentration (in %) des Gradienten (gestrichelte Linie). Auf der X-Achse sind die mit der Zeit (in min) des Säulenlaufs identischen Fraktionsnummern angegeben (Fluss: 1 ml/min; Fraktionsgröße: 1 ml). Abbildung b zeigt gepoolte, in der Speedvac (s. 3.1) eingeengte Fraktionen, in denen nach Trennung in der 15%-igen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (s. 3.3.5) und Silberfärbung (s. 3.3.8) Proteine nachgewiesen werden konnten. Die Zahlen kennzeichnen die Fraktionsnummern. Die Molmassen der Proteine wurden anhand eines Standards (s. 3.2.2) geschätzt. Der Elutionspeak des 45 kD-Proteins im Chromatogramm sowie das gereinigte Protein im Gel sind durch einen Kreis gekennzeichnet.

4.4.3.2 Isolierung des 15 kD-Proteins mittels Ultrafiltration

Im Gegensatz zum 45 kD-Protein, in dessen Fraktion Proteine ähnlicher Molmassen enthalten

waren, stellte das 15 kD-Protein die kleinste, in der Silberfärbung nachweisbare Komponente

seiner Fraktion dar (vgl. Abb. 22a, Spur 3). Das nächstgrößere, detektierbare Protein besaß

eine Molmasse von etwa 36 kD, die übrigen Komponenten hatte noch höhere Molmassen.

111

Ergebnisse

Somit eigneten sich zur Reinigung des Proteins Verfahren, die auf der Trennung von

Komponenten nach ihrer Molmasse basieren. Um große Mengen des Proteins für die

Überprüfung der potentiellen allergenen Wirkung im FIT (s. 3.3.11) zu isolieren, wurde eine

Ultrafiltration (s. 3.3.13) mit Filtern unterschiedlicher Ausschluss-Molmassen (Cut-Off)

it einem Filter des Cut-Offs

(s. 3.2.1) durchgeführt. Zunächst wurde die Ausgangsfraktion m

von 50 kD auf das kleinste, mit den Filtern erreichbare Volumen von 200 µl eingeengt. Das

Konzentrat wurde entnommen, der Durchlauf des Filters erneut eingefüllt und konzentriert.

Insgesamt wurde dieser Vorgang dreifach wiederholt. Der Durchlauf des dritten Durchgangs

wurde in einen Filter des Cut-Offs von 30 kD gefüllt und wie oben beschrieben behandelt.

Schlussendlich wurde der dritte Durchlauf des 30 kD-Filters mit einem Filter des Cut-Offs

von 3 kD konzentriert. Der Reinigungserfolg wurde in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) kontrolliert.

Unter reduzierenden Bedingungen wurden die Konzentrate im Gel aufgetragen und die

enthaltenen Proteine in der Silberfärbung (s. 3.3.8) dargestellt (s. Abb. 24).

In den Konzentraten des 50 und 30 kD-Filters befanden sich die höhermolekularen Proteine

(Spur 1 und 2). Im Konzentrat des 3 kD-Filters war lediglich eine in der Silberfärbung

sichtbare Bande mit einer Molmasse von 15 kD zu erkennen (Spur 3).

Abb. 24 Kontrolle der Reinheit des 15 kD-Proteins in der SDS-PAGE nach Ultrafiltration

Durch die Kombination von Filtern verschiedener Ausschluss-Molmassen (s. 3.2.1) wurde das 15 kD-Protein aus der Fraktion von 187,5 mM des Kationenaustauschers (s. 4.4.2.4) gereinigt. Die Konzentrate der verschiedenen Filter wurden in der 15 %-igen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen aufgetrennt (s. 3.3.5) und die enthaltenen Komponenten mittels Silberfärbung (s. 3.3.8) sichtbar gemacht. Dargestellt sind die Proteine, die in den Konzentraten der Filter mit einer Ausschluß-Molmasse von 50 kD (Spur 1), 30 kD (Spur 2) und 3 kD (Spur 3) enthalten waren. Die Molmassen wurden anhand eines Größenstandards bestimmt (s. 3.2.2).

112

Ergebnisse

4.4.3.3 Isolierung des 15 kD-Proteins mittels Gelfiltrationschromatographie

Neben der Ultrafiltration wurde eine Reinigung des 15 kD-Proteins mittels Gelfiltrations-

chromatographie (s. 3.3.15) durchgeführt, durch die die Proteine ebenfalls in Abhängigkeit

von ihrer Größe getrennt wurden. Die dazu eingesetzte BioSil 125-Säule mit einer maximalen

Trennleistung < 20 kD war der Ultrafiltration an Genauigkeit und Reproduzierbarkeit

überlegen, war jedoch nur mit geringen Volumina zu beladen (max. 20 µl). Daher wurden mit

der Säule lediglich kleine Mengen des 15 kD-Proteins zur Untersuchung im FIT (s. 3.3.11)

und im Immunoblot (s. 3.3.10) gereinigt, die als Vergleich und Kontrolle der Ergebnisse nach

Ultrafiltration dienten. Vor der Reinigung des Kandidatenproteins wurde die Säule mit

assenstandard beladen, um den

auscher

11 bis 22),

deutlich isoliert davon folgte das 15 kD-Protein (Fraktion 28 & 29).

equinem Myoglobin (s. 3.2.2; M: 17,6 kD) als Molm

Elutionspunkt des 15 kD-Proteins abschätzen zu können. Die vom Kationenaust

erhaltene Ausgangsfraktion wurde vor dem Auftrag auf die BioSil-Säule durch Ultrafiltration

konzentriert und entsalzt (s. 3.3.13). Die von der Gelfiltrationssäule eluierten Fraktionen

wurden in der Speedvac (s. 3.1) eingeengt, anschließend in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter

reduzierenden Bedingungen aufgetrennt und die Komponenten in der Silberfärbung (s. 3.3.8)

sichtbar gemacht (s. Abb. 25).

Zunächst wurden die hochmolekularen Proteine von der Säule eluiert (Fraktion

(a) (b)

113

Ergebnisse

Abb. 25 (a,b) Isolierungraphie und Überprüfung des Reinigungserfolgs in der SDS-PAGE

Durch die Gelfiltrationschromatographie (s. 3.3.15) wurde das 15 kD-Protein NaCl vom Kationenaustauscher eluierten Fraktion (vgl. Abb. 21

g des 15 kD-Proteins mittels Gelfiltrationschromato-

aus der bei 187,5 mM a, Spur 3) isoliert. Im

ma gramm (a) sind die für die einzelnen Fraktionen (X-Achse, Fraktionsgröße: 0,5 ml) essenen Absorptionen in mV (Y-Achse, Wellenlänge UV-Lampe: 210 nm) dargestellt. Die kursiv

gedruckten Ziffern geben die Zeit des Säulenlaufs an (Fluss: 0,6 ml/min). Der senkrechte Strich kennzeichnet den Elutionspunkt des equinen Myoglobins (s. 3.2.2), das als Molmassenstandard verwendet wurde. Fraktionen, denen eine messbare Chromatogrammfläche zugeordnet werden konnte, wurden in der Speedvac (s. 3.1) eingeengt und in der 15 %-igen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (s. 3.3.5) getrennt. Die Proteine wurden durch nachfolgende Silberfärbung (s. 3.3.8) sichtbar gemacht (b). Die Zahlen kennzeichnen die Fraktionsnummern. Die Molmassen wurden anhand eines Größenstandards (s. 3.2.2) bestimmt.

4.4.3.3 Isolierung des 15 kD-Proteins mittels Reversed-Phase-Chromatographie

Um die notwendigen Mengen Protein für die biochemische Charakterisierung

[Massenspektrometrie (s. 3.3.17) und zweidimensionale Gelelektrophorese (s. 3.3.6)] zu

erhalten, wurde die Reversed-Phase-Chromatographie (s. 3.3.16) angewandt. Mit dieser

Methode konnten große Mengen des 15 kD-Proteins gereinigt und gleichzeitig angereichert

werden. In Vorversuchen war festgestellt worden, dass die Ausgangsfraktion von 187,5 mM

NaCl keine Beeinträchtigung der Reaktivität im FIT durch die für die Chromatographie

3.2.2)

Einen optimalen Gradienten für die Isolierung des 15 kD-Proteins stellte eine Erhöhung der

ei einer

Chro togem

verwendeten Reagenzien Trifluoressigsäure (TFA; 0,1 %-ig) und Acetonitril (s.

erkennen ließ. Zur Trennung wurde eine C18-Säule (s. 3.2.2) benutzt, auf die die durch

Ultrafiltration konzentrierte und entsalzte Ausgangsfraktion aufgetragen wurde. Um eine

vollständige Reinigung des 15 kD-Proteins zu erreichen, wurden zur Elution der Säule

verschiedene Gradienten untersucht (Daten nicht gezeigt). Eluierte Fraktionen wurden in der

Speedvac (s. 3.1) eingedampft und in der SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter reduzierenden

Bedingungen aufgetrennt. Der Nachweis der enthaltenen Proteine erfolgte in der

Silberfärbung (s. 3.3.8).

Acetonitrilkonzentration über eine Zeitspanne von 90 min von 30 % auf 60 % b

Fliessgeschwindigkeit des Puffers von 1 ml/min dar (s. Abb. 26). Es wurde gezeigt, dass bei

mittlerer Polarität (etwa 45 % Acetonitril) das 15 kD-Protein von der Säule eluiert wurde

(Fraktion 53 bis 55). Teilweise mit dem Kandidatenallergen folgten Proteine der Molmassen

um 35 kD (Fraktion 54 & 55). Höhermolekularen Proteine wurden erst bei der abschließenden

Elution mit Acetonitrilkonzentrationen > 60 % von der Säule gelöst (Fraktion 110).

114

Ergebnisse

(a) (b)

Abb. 26 (a,b) Isolierung des 15 kD-Proteins mittels Reversed-Phase-Chromatographie und Überprüfung des Reinigungserfolgs in der SDS-PAGE

In der Reversed-Phase-Chromatographie (s. 3.3.16) wurde das 15 kD-Protein aus der Fraktion, die bei 187,5 mM NaCl vom Kationenaustauscher eluiert wurde (vgl. Abb. 21a, Spur 1) von den übrigen

and ilen der Fraktion isoliert. Im Chromatogramm ung (a) ist auf der Y1-Achse ist die im UV-Meter bei 230 nm gemessene Absorption umgerechnet in Volt angegeben. Der verwendete Gradient (gestrichelte Linie) zeigt die jeweilige Konzentration von Acetonitril (in %, Y2-Achse). Die Fraktionsnummern bzw. die Zeit der Reinigung sind auf der X-Achse dargestellt (Fluss: 1 ml/min; Fraktionsgröße: 1 ml). Ausgewählte Fraktionen wurden in der 15 %-igen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (s. 3.3.5) getrennt, die enthaltenen Proteine wurden durch Silberfärbung (s. 3.3.8) sichtbar gemacht (b). Die Zahlen bezeichnen die Fraktionsnummer, die Molmassen wurden anhand eines Größenstandards (s. 3.2.2) bestimmt. Der Elutionspeak des 15 kD-Proteins im Chromatogramm sowie das Protein im Gel sind durch einen Kreis gekennzeichnet.

4.5 Biochemische Charakterisierung der isolierten Komponenten aus Culicoides nubeculosus

Durch die biochemische Charakterisierung sollten grundlegende Parameter der Proteine

bestimmt werden. Dazu zählte die exakte Berechnung der Molmasse über den Rf-Wert

(s. 3.3.20) sowie die Bestimmung des isoelektrischen Punkts in der zweidimensionalen

Gelelektrophorese (s. 3.3.6). Anhand der empfindlichen Silberfärbung (s. 3.3.8) des Gel

konnte zudem festgestellt werden, ob weitere Proteine in der Fraktion enthalten waren. Zur

Bestimmung der Identität der Proteine wurde ein Verdau mit anschließender Sequenzierung

Best te der Reinig

s

115

Ergebnisse

einzelner Peptide (s. 3.3.18) und Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit bereits bekannt

zen aus Internet-Datenbanken (s. 3.3.17) durchgeführt.

en

Sequen

musste (vgl. 4.4.1.2 & 4.4.2.1). Daher wurde für die erste Dimension ein Streifen mit einem

Dim DS-Gel unter reduzierenden Bedingungen, der

Proteinnachweis in der Silberfärbung. Fü Reversed-

4.5.1 Biochemische Charakterisierung des 45 kD-Proteins

4.5.2.1 Bestimmung der Molmasse und des isoelektrischen Punktes

Aufgrund der Hinweise, die bei der Reinigung mit dem Ionenaustauscher erhalten wurden,

war davon auszugehen, dass es sich bei dem 45 kD-Protein um ein basisches Protein handeln

pH-Gradienten von pH 7 bis pH 10 (s. 3.2.2) gewählt. Die Trennung in der zweiten

ension erfolgte in einem 15 %-igen S

r die Untersuchung wurden die in der

Phase-Chromatographie erhaltenen, gepoolten Fraktionen Nr. 106 bis 110 verwendet

(vgl. Abb. 22b), die vor dem Gelauftrag in der Speedvac (s. 3.1) eingeengt wurden.

Es zeigte sich ein Proteinspot im pH-Bereich von ca. 9,4 und einer berechneten Molmasse

(s. 3.3.19) von etwa 46,5 kD (s. Abb. 27). Weitere Proteine waren nicht nachweisbar.

Abb. 27 Zweidimensionale Gelelektrophorese des gereinigten 45 kD-Proteins In der zweidimensionalen Gelelektrophorese (s. 3.3.6) wurden die exakte Molmasse und der isoelektrische Punkt des 45 kD-Proteins bestimmt, das über die Reversed-Phase-Chromatographie (s. 4.4.3.1) gereinigt worden war. Die erste Dimension (Trennung nach dem isoelektrischen Punkt) wurde mit einem Streifen einer pH-Spanne von 7 bis 10 (s. 3.2.1) durchgeführt, die zweite Dimension (Trennung nach der Molmasse) erfolgte in der 15 %-igen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (s. 3.3.5). Das Protein wurde in der Silberfärbung sichtbar gemacht (s. 3.3.8). Die Zuordnung der pH-Bereiche wurde anhand der Streifenlänge vorgenommen, die Molmasse wurde anhand eines mitgelaufenen Größenstandards (s. 3.2.2) über den Rf-Wert berechnet (s. 3.3.20).

116

Ergebnisse

4.5.2.2 Bestimmung der Peptidsequenzen

Das gereinigte 45 kD-Protein (vgl. Abb. 23b, Fraktionen 106 - 110) wurde mit der

Endoprotease Endo Lys-C verdaut (s. 3.3.17.1). Die Fraktionen wurden vor dem Verdau in

der Speedvac eingeengt. Jeweils eine Probe wurde vor der Zugabe des Enzyms und nach

Ende der Inkubationszeit des Verdaus in der SDS-PAGE (reduzierende Bedingungen) und

Silberfärbung untersucht. Es wurde ein vollständiges Verschwinden der Proteinbande bei

45 kD nach Anwendung des Enzyms festgestellt (s. Abb. 28).

Abb. 28 Kontrolle des Verdaus des gereinigten 45 kD-Proteins Für die massenspektrometrische Analyse wurde das 45 kD-Protein mit der Endoprotease Endo Lys-C

e in der 15 %-igen SDS-PAGE unter reduzierenden kontrolliert. In Spur 1 ist die unverdaute Probe

Tab. 9 Sequenzen der analysierten Peptide des 45 kD-Proteins

verdaut (s. 3.3.17.1). Der Erfolg des Verdaus wurdBedingungen (s. 3.3.5) und Silberfärbung (s. 3.3.8) aufgetragen, Spur 2 zeigt die Probe nach dem Verdau. Die bei etwa 30 kD sichtbare Bande ist lt. Herstellerangaben Bestandteil der Endoprotease.

Die aus dem Endo LysC-Verdau des 45 kD-Protein erhaltenen Peptide wurden in der ESI-

MS/MS-Analyse (s. 3.3.17.2 & 3) anhand ihrer unterschiedlichen Massen-Ladungs-

verhältnissen (m/z) voneinander getrennt. Von drei ausgewählten Peptiden mit m/z von 1261,

963 und 484 wurden im Folgenden die Sequenzen bestimmt (s. Tab. 9 & Abb. 29).

Peptid 1 YWEYVYEDSMDLLAK

Peptid 2 PLPEGLFWLLITGDVPTK

Peptid 3 PPLLTELGK

117

Ergebnisse

Abb

. 29

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118

Ergebnisse

4.5.2.3 Identifizierung des 45 kD-Proteins anhand von Seque

ur Identifizierung des Proteins wurden die erhaltenen Sequenzen sic

(BLAST) eingegeben, durch die in den via Internet

zugänglichen Datenbanken nach ähnlichen bzw. identisch

. 3.3.18). Als Suchoptionen wurde die Option „Search for short, nearly exact matches“

ewählt. Alle drei sequenzierten Peptide aus des 45 kD-Pro

em Protein Citratsynthase zugeordnet werden (s. Abb.

it der Citratsynthase aus

2 zeigten ebenfalls hohe Identitäten zu Drosophila melanogaster u

nzidentitäten

in die Suchmaschine Ba

Sequenzen gesucht wurden

konnten mit hoher Identität

& Tab. 10). Die meisten

heles gambiae. Peptid 1 und

nd dem Rind (Bos taurus).

Z

Local Alignment Search Tool

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30

Anop

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Übereinstimmungen ergaben sich m

Abb. 30 Auszug aus der Trefferliste der Sequenzrecherchchmaschine BLAST (s. 3.3.18) wurden zahlreiche

equenzierten Peptiden des 45 kD-Proteins hohe Identitäten aufw n Peptids 2). Dargestellt ist jeweils die eingegebene Sequenz (Q) i

equenz der jeweiligen Spezies. Die Identität des bekannten Proteins ist entweder durch Referenznummer oder Namen angegeben. Die eingegebene e

roteinen zum einen hinsichtlich der Länge des passenden Abschnitt anderen wird die Übereinstimmung der innerhalb dieses Sequenzabsch

erechnet (Identities). Die jeweils variierenden Aminosäuren zwischen der gesuchten und den bekannten Sequenzen, durch + gekennzeichnet, sind in dieser Dars n

e Seqiesem V

Sequ

tellu

Über die Sus

uenzen gefunden, die zu den (hier beschrieben anhand desergleich zur bereits bekannten

nz wird mit den bekanntens verglichen (Positives). Zumnittes gelegenen Aminosäuren

g grau unterlegt.

S

P

b

119

Ergebnisse

Tab. 10 Sequenzidentitäten zu den Peptidsequenzen des 45 kD-Proteins

Spezies Identität

Peptid 1 Anopheles gambiae

Drosophila melanogaster

Bos taurus

93 %

93 %

80 %



Bos taurus

94 %

88 %

82 %

Peptid 3 Anopheles gambiae 88 %

4.5.2 Biochemische Charakterisierung des 15 kD-Proteins

4.6.1.1 Bestimmung der Molmasse und des isoelektrischen Punktes

Die Bestimmung der Molmasse und des isoelektrischen Punktes erfolgte in der

zweidimensionalen Gelelektrophorese (s. 3.3.6). Da auch bei dem 15 kD-Protein anhand der

Ergebnisse aus der Ionenaustauscherchromatographie davon ausgegangen werden konnte,

dass es sich um ein basisches Protein handelt (vgl. 4.4.1.2 & 4.4.2.1), wurde die isoelektrische

Fokussierung (erste Dimension) mit einem Streifen des pH-Bereichs 7 bis 10 (s. 3.2.1)

durchgeführt. In der zweiten Dimension wurde eine 15 %-ige SDS-PAGE unter

reduzierenden Bedingungen angewendet (s. 3.3.5). Der Nachweis der Proteine im Gel erfolgte

durch Silberfärbung (s. 3.3.8). Für die Untersuchung in der Gelelektrophorese wurde das

mittels Reversed-Phase-Chromatographie gereinigte Protein verwendet (vgl. Abb. 26b,

ktion in der Speedvac (s. 3.1) Fraktion 53). Vor dem Gelauftrag wurde die entsprechende Fra

konzentriert.

Es zeigte sich ein Proteinspot, der einem pH-Bereich von etwa 9,3 zugeordnet werden konnte

(s. Abb. 31). Die Molmasse des Proteins wurde anhand des Rf-Wert (s. 3.3.19) mit 14,6 kD

berechnet. Da lediglich ein einzelner Spot im Gel zu erkennen war, konnte ausgeschlossen

werden, dass weitere, in der Silberfärbung nachweisbare Proteine mit anderen isoelektrischen

Punkten und/oder Molmassen in der Fraktion enthalten waren.

120

Ergebnisse

Abb. 31 Zweidimensionale Gelelektrophorese des gereinigten 15 kD-Proteins In der zweidimensionalen Gelelektrophorese (s. 3.3.6) wurden die exakte Molmasse und der isoelek-trische Punkt des 15 kD-Proteins bestimmt, das über die Reversed-Phase-Chromatographie (s. 4.4.4.3) gereinigt worden war. Die erste Dimension wurde mit einem Streifen der pH-Spanne von 7 bis 10

er pH-Bereich wurde anhand der Streifenlänge zugeordnet, die Molmasse wurde über den Rf-Wert berechnet (s. 3.3.19).

durchgeführt, die zweite Dimension erfolgte in der 15 %-igen SDS-PAGE (reduzierende Bedingun-gen; s. 3.3.5), die Sichtbarmachung des Proteins in der Silberfärbung (s. 3.3.8). D

4.6.1.2 Bestimmung von Peptidsequenzen

Analog zum 45 kD-Protein wurde das über Reversed-Phase-Chromatographie (s. 4.4.3.3)

gereinigte 15 kD-Protein mit der Endoprotease Endo Lys-C verdaut (s. 3.3.17.1). Der Erfolg

des Verdaus wurde in der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen kontrolliert. In der

Silberfärbung konnte gezeigt werden, dass nach Inkubation mit dem Enzym die in der

Ausgangsprobe sichtbare Proteinbande bei 15 kD nicht mehr nachweisbar war (s. Abb. 32).

Abb. 32 Kontrolle des Verdaus des gereinigten 15 kD-Protein

Für die massenspektrometrische Analyse wurde das 15 kD-Protein mit der Endoprotease Endo Lys-C verdaut (s. 3.3.17.1). Der Erfolg des Verdaus wurde in der 15 %-igen SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (s. 3.3.5) nach Silberfärbung (s. 3.3.8) kontrolliert. In der

Enzyms aufgetragen, Spur 2 zeigt die Probe nach dem Verdau. Die bei etwa 30 kD sichtbare Bande ist lt. Herstellerangaben Bestandteil der Endoprotease.

s

Spur 1 wurde Probe vor dem Zusatz des

121

Ergebnisse

Die aus dem Endo LysC-Verdau des 15 kD-Protein erhaltenen Peptide wurden in der ESI-

MS/MS-Analyse (s. 3.3.17.2 & 3) anhand ihrer unterschiedlichen Massen-Ladungs-

verhältnisse (m/z) voneinander getrennt. Von drei ausgewählten Peptiden mit m/z von 1034,

765 und 636 wurden im Folgenden die Sequenzen bestimmt (s. Tab. 11).

Tab. 11 Sequenzen der analysierten Peptide des 15 kD-Proteins

Peptid 1 TGQAAGFSYSEANVK

Peptid 2 ALTWNDDTLFEYLENPK

Peptid 3 VGPNLNGLFGRK

4.6.1.3 Identifizierung des 15 kD-Proteins anhand von Sequenzidentitäten

Wie für das 45 kD-Protein beschrieben, wurden die erhaltenen Sequenzen der Peptide des

15 kD-Proteins zur Suche nach bekannten Proteinen verwendet (s. 3.3.18). Alle drei Peptide

konnten mit hoher Übereinstimmung dem Protein Cytochrom C zugeordnet werden

(s. Tab. 12). Die höchsten Identitäten ergaben sich für Cytochrom C aus Anopheles gambiae.

Ebenfalls hohe Übereinstimmung fanden sich für Peptid 1 und 2 mit dem Cytochrom C-2 aus

Drosophila melanogaster. Hohe Identitäten konnten auch für das Rind (Bos taurus) und das

Pferd (Equus caballus) festgestellt werden. Peptid 3 zeigte sowohl mit den Insekten als auch

mit Rind und Pferd hohe Identitäten.

Tab. 12 Sequenzidentitäten zu den Peptidsequenzen des 15 kD-Proteins

Spezies Identität



Bos taurus, Equus caballus

84 %

76 %

73 %

Peptid 2 Anopheles gambiae & Drosophila melanogaster

Bos taurus

Equus caballus

93%

76 %

69 %

Peptid 3 Anopheles gambiae, Drosophila melanogaster, Equus caballus, Bos taurus

91 %

122

Ergebnisse

4.6 Funktionelle Charakterisierung der isolierten Komponenten aus Culicoides nubeculosus

In der funktionellen Charakterisierung wurden die potentiellen allergenen Eigenschaften der

isolierten Citratsynthase und des Cytochrom C aus Culicoides nubeculosus untersucht. Dazu

unglobulin-Isotypen aus

d ekzemkranker und gesunder Pferd reagierten. Für die

Bestimm

Serum-Antikörper (s. 4.2) von zehn Pferden mit und fünf Pferden ohne Sommerekzem

verwendet. Zum Nachweis der Bindung der Kom

und IgG4-depletierte Serum der selben Tiere benutzt. Die Gnitzenproteine wurden in einer

bereitet und

4.6.1.1 Bindung der Citratsynthase durch equine Serum-Antikörper im Imm

I en, dass die Citratsynthase durch Serum-

Antikörper der Isotypen E und G4 aller ekzemkranken Pferde gebunden wurde (s. Tab. 13).

Tiere ohne So gend eine alleinige Detektion durch IgG4, zwei der

Seren von fünf nichtallergischen Pferde enthielt

erkannte. Die Inkubation mit dem affinitätsangereicherten IgG1 aus Seren von sechs der zehn

untersuchten Sommerekzem und von drei der fünf gesunden Kontrolltiere

resultierte in einer Bindung des Culicoides-Proteins. Die Detektion der Citratsynthase durch

I te erek

wurde im Immunoblot (s. 3.3.10) überprüft, ob und mit welchen Imm

em Serum e die gereinigten Proteine

ung der Detektion durch IgE, IgG1 und IgG4 wurden die affinitätsgereinigten

ponenten durch IgG5 wurde das IgE-, IgG1-

15%-igen SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter reduzierenden Bedingungen vor

nachfolgend auf eine Membran transferiert (s. 3.3.7). Neben der Reaktivität mit den equinen

Serum-Immunglobulinen wurde das Vermögen der isolierten Komponenten zur Aktivierung

allergischer Effektorzellen (basophile Granulozyten) im FIT (s. 3.3.11) überprüft. Vor der

Verwendung im Immunoblot und im FIT wurden die isolierten Proteine mit Ausnahme des

über Ultrafiltration gereinigten Cytochrom C (s. 4.4.3.2) in der Speedvac eingeengt (s. 3.1).

Für das Cytochrom C wurden die genannten Untersuchungen vergleichend mit dem aus den

Gnitzen isolierten und dem homologen Protein des Rindes (s. 3.2.2) durchgeführt.

4.6.1 Funktionelle Charakterisierung des 45 kD-Proteins

unoblot

m Immunoblot konnte nachgewiesen werd

mmerekzem zeigten überwie

en jedoch auch IgE, dass die Citratsynthase

Pferde mit

gG5 erfolg mit Antikörpern von vier Tieren mit und zwei Pferden ohne Somm zem.

123

Ergebnisse

Tab. 13 Detektion der Citratsynthase durch equine Immunglobuline

IgE IgG1 IgG4 IgG5

Pferde mit SE 10/10 6/10 10/10 4/10

Pferde ohne SE 2/5 3/5 5/5 2/5

Im Immunoblot (s. 3.3.10) wurde bestimmt, welche Immunglobulin-Isotypen mit der Citratsynthase reagierten. Die Bestimmung der Bindung von IgE, IgG1 und IgG4 wurden mit den affinitätsgereinigten Antikörpern durchgeführt (s. 4.2). Für die Bindung von IgG5 wurde IgE-, IgG1- und IgG4-depletiertes Serum verwendet. Der Nachweis der Bindung erfolgte über monoklonale Antikörper gegen equines IgE, IgG1, IgG4 und IgG5 sowie einen AP-gekoppelten Detektionsantikörper (s. 3.3.10). Die Zahl der Reagenten (x) ist im Verhältnis zur Gesamtzahl der getesteten Ekzemer bzw. Nichtekzemer (y) aufgeführt (x/y).

4.6.1.2 Reaktivität der Citratsynthase mit Effektorzellen der Allergie im FIT

Die über die Reversed-Phase-Chromatographie gereinigte Citratsynthase (vgl. Abb. 23b,

Fraktionen 106 bis 110) wurde mit den Blutzellen von sechs am Sommerekzem erkrankten

Pferden und zwei gesunden Kontrollpferden im FIT (s. 3.3.11) getestet. Durch die Fraktionen

konnte bei keinem der Tiere eine Histaminfreisetzung aus den Zellen induziert werden.

Dagegen konnte mit den Blutzellen aller getesteten ekzemkranken Pferden eine deutliche

Histaminfreisetzung bei Inkubation mit weiteren Fraktionen der Reversed-Phase-Säule

nachgewiesen werden (s. Abb. 23b, Fraktionen 14 bis 24).

4.6.2 Funktionelle Charakterisierung des 15 kD-Proteins

4.6.2.1 Bindung des Cytochrom C durch equine Serum-Antikörper im Immunoblot

In Vorversuchen wurde festgestellt, dass das auf allen drei Wegen isolierte Cytochrom C

(s. 4.4.4) von Serum-Immunglobulinen des Pferdes gebunden wurde (Daten nicht gezeigt).

Für die vergleichende Charakterisierung wurde das mittels Ultrafiltration gereinigte

Cytochrom C (s. 4.4.3.1) verwendet. Wie die Citratsynthase wurde das Cytochrom C durch

Serum-IgE und -IgG4 aller ekzemkranken Pferde gebunden (s. Tab. 14). Ebenso detektierten

Antikörper des Isotyps G4 aller Nichtekzemer das Gnitzenprotein, bei zwei Tieren ließ sich

auch bindendes IgE nachweisen. Affinitätsgereinigtes IgG1 aus dem Serum von fünf Pferden

mit Sommerekzem und zwei Pferden ohne Allergie reagierten ebenfalls mit dem Protein.

124

Ergebnisse

IgG5, das an das Cytochrom C band, konnte im Serum von vier ekzemkranken Pferden und

einem gesunden Kontrolltier nachgewiesen werden.

Tab. 14 Detektion des Cytochrom C durch equine Immunglobuline

IgE IgG1 IgG4 IgG5

Pferde mit SE 10/10 5/10 10/10 4/10

Pferde ohne SE 2/5 2/5 5/5 1/5

Im Immunoblot (s. 3.3.10) wurde bestimmt, welche Immunglobulin-Isotypen an das Cytochrom C binden. Für die Bindung von IgE, IgG1 und IgG4 wurden die aus dem Serum gereinigten IgE- und IgG-Fraktionen (s. 4.2) benutzt. Für die Bindung von IgG5 wurde IgE-, IgG1- und IgG4-depletiertes Serum verwendet. Der Nachweis der Bindung erfolgte über monoklonale Antikörper gegen equines

kzemer (y)

aufgeführt (x/y).

ar der FIT negativ (s. Abb. 33).

Zusätzlich wurden die Konzentrate des 50 kD- und 30 kD-Filters sowie die Durchläufe des

sechs Pferde mit

Sommerekzem reagierten auf die ersten beiden Durchläufe mit einer Histaminfreisetzung aus

des

Fraktionen erfolgte in den vorliegenden Untersuchungen nicht.

IgE, IgG1, IgG4 und IgG5 sowie einen AP-gekoppelten Detektionsantikörper (s. 3.3.10). Die Zahl derReagenten (x) ist im Verhältnis zur Gesamtzahl der getesteten Ekzemer bzw. Nichte

4.6.2.2 Reaktivität des Cytochrom C mit Effektorzellen der Allergie im FIT

Zur Überprüfung der allergenen Wirkung wurde das über die Ultrafiltration gereinigte

Cytochrom C (vgl. Abb. 24, Spur 3) mit den Blutzellen von neun Pferden mit und zwei

Pferden ohne Sommerekzem zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (August 2003 und

September 2003) im FIT (s. 3.3.11) getestet. Die Zellen von sechs der allergischen Pferde

zeigten eine Histaminfreisetzung, bei den übrigen Tieren w

50 kD-, 30 kD- und 3 kD-Filters im FIT untersucht. Die genannten

den Zellen. Bei drei Pferden (#4, #7 und #9) wurde ein positiver FIT beim Einsatz

Konzentrats aus dem 50 kD-Filter (vgl. Abb. 24, Spur 1) im FIT beobachtet. Dieses

Konzentrat wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter untersucht.

Zur Absicherung der Ergebnisse der Ultrafiltration wurde im Mai 2004 das in der

Gelfiltrationschromatographie gereinigte Cytochrom C (vgl. Abb. 25b, Fraktion 28/29) mit

den Blutzellen von vier am Sommerekzem erkrankten Pferden im FIT eingesetzt. Die Zellen

dreier Pferde zeigten eine Histaminfreisetzung, ein Pferd (#9) reagierte nicht auf das Protein.

Für dieses Pferd konnte jedoch eine Reaktivität bei weiteren, in der Gelfiltration gewonnenen

Fraktionen (vgl. Abb. 25, Fraktionen 11-16) festgestellt werden. Eine weitere Analyse dieser

125

Ergebnisse

Zusätzlich wurde das über die Reversed-Phase-Chromatographie isolierte Cytochrom C

(vgl. Abb. 26b, Fraktion 53) mit den Blutzellen von drei Pferden mit Sommerekzem im

September 2004 im FIT untersucht. Alle Pferde zeigten eine Histaminfreisetzung.

chend der in 3.3.10.1

g schilderten Art den ellen zugese ine exakte sung der tzten

P ionen e aufgrund der geringen Prob en nicht. A d der

S in der S-PAGE wurd schätzt, dass die Proteinmengen zwischen

500 ng und 1 µg pro Ansatz betrugen. Es kann daher nicht davon ausgegangen werden, dass

Das durch die drei Reinigungsverfahren isolierte Protein wurde entspre

e Blutz tzt. E Erfas eingese

roteinkonzentrat rfolgte enmeng nhan

tärke der Banden SD e ge

die dargestellten Histaminfreisetzungen auf äquivalenten Mengen des Cytochrom C beruhen.

Abb. 33 Reaktivität des Cytochrom C im FIT Im FIT (s. 3.3.11) wurde die Reaktivität des Cytochrom C mit equinen Blutzellen untersucht. Das mit der Ultrafiltration gewonnene Cytochrom C (vgl. Abb. 22, Spur 3) wurde mit den Blutzellen von neun Pferden mit Sommerekzem im FIT zu zwei Zeitpunkten (August 2003 & September 2003) durchgeführt. Die angegebenen Prozentwerte stellen die Mittelwerte der Histaminfreisetzungen beiderZeitpunkte dar. Das in der Gelfiltrationschromatographie (vgl. Abb. 23b, FCytochrom C wurde mit den Blutzellen von vier Pferden mit Sommerekzem (#1, #4, #8, #9), das durch die Reversed-Phase-Chromatographie isolierte Cytochrom C (vgl. Abb. 26b, Fraktion 53) wurde mit den Blutzellen dreier ekzemkranker Pferde (#1, #4, #8) untersucht. Alle Histaminfreisetzungen sind dargestellt als % der maximal aus den Zellen freisetzbaren Histaminmenge (Y-Achse).

4.6.2.3 Kreuzreaktivität mit bovinem Cytochrom C

Da es sich bei dem Cytochrom C um eine im Tier- und Pflanzenreich weit verbreitete und

konservierte Struktur handelt, wurde untersucht, ob die Im

raktion 26/27) gewonnene

munglobuline des Pferdes

126

Ergebnisse

möglicherweise weitere, speziesfremde Cytochrome detektieren. Im Immunoblot (s. 3.3.9)

wurde bovines Cytochrom C (s. 3.2.2, jeweils 10 µg pro Spur) mit IgG1, 4, 5 und IgE aus

dem Serum von zwei Pferden mit Sommerekzem inkubiert. Im Gegenzug wurd

Culicoides nubeculosus isolierte Cytochrom C (s. 4.4.3.2) mit Antikörpern inkubiert, die

gegen Cytochrom C verschiedener Säugetierspezies (Hund, Schwein, Maus, Kaninchen,

Rind) gerichtet waren (s. 3.2.3). Zusätzlich wurde untersucht, ob diese Antikörper das bovine

Cytochrom C erkannten. Die Antikörper mit Spezifität für verschiedene Säuger-Cytochrome

erkannten das bovine Cytochrom C (s. Abb. 34, Spur 1), nicht jedoch das homologe Protein

aus den Gnitzen (Spur 2). Keiner der untersuchten equinen Immunglobulin-Isotypen zeigte

e das aus

eine Bindung an das bovine Cytochrom C (Spur 3 – 5).

Abb. 34 Untersuchung der Kreuzreaktivität im Immunoblot

licher Kreuzreaktivitäten überprüft, ob tochrom C (s. 3.2.2) reagierten.

(s. 3.3.11) untersucht. Das Protein wurde in Konzentrationen von 50 µg bis 0,005 µg

ferden mit Sommerekzem sowie von

drei gesunden Kontrollpferden inkubiert. Bei keinem der untersuchten Pferde konnte eine

Im Immunoblot (s. 3.3.9) wurde zur Untersuchung möggereinigte, equine Serum-Immunglobuline (s. 4.2) mit bovinem CyEbenso wurde untersucht, ob Antikörper mit Spezifität für Säugetier-Cytochrom C (s. 3.2.3) das aus Culicoides nubeculosus isolierte und das bovine Cytochrom C banden. Das jeweilige Cytochrom C wurde in der 15 %-igen SDS-PAGE (s. 3.3.5) unter reduzierenden Bedingungen aufgetragen und auf eine Membran transferiert (s. 3.3.7). Spur 1 zeigt das bovine, Spur 2 das aus den Gnitzen isolierte Protein nach Inkubation mit den Antikörpern gegen Säuger-Cytochrom C. Spur 3-6 zeigt die Reaktion von equinem IgG1, 4, 5 und IgE mit dem bovinen Cytochrom C.

Des weiteren wurde die Reaktivität des bovinen Cytochrom mit equinen Blutzellen im FIT

(Verdünnung in Zehnerstufen) mit den Zellen von neun P

Histaminfreisetzung oberhalb der 10%-Grenze nachgewiesen werden.

127

Diskussion

5 Diskussion

Das Sommerekzem des Pferdes ist eine saisonale, allergische Dermatitis, die durch Stiche

haematophager Insektenspezies, insbesondere der Gattung Culicoides (Gnitzen) zugehörig,

verursacht wird. Aufgrund zahlreicher Defizite in der Diagnostik und Therapie der

Erkrankung einerseits und hinsichtlich der unzureichend untersuchten Mechanismen der

equinen Typ I Allergie andererseits ist eine Identifizierung der allergen wirksamen

Komponenten aus den Gnitzen zwingend notwendig. Vor diesem Hintergrund sollten in der

vorliegenden Arbeit biochemische und funktionelle Eigenschaften der Allergene aus

Culicoides nubeculosus durch die Untersuchung der Komponenten eines Ganzkörperextraktes

sowie definierter Komponenten bestimmt werden.

5.1 Untersuchung von Komponenten eines Ganzkörperextraktes aus Culicoides nubeculosus

Über die biochemischen und funktionellen Eigenschaften der Allergene aus Culicoides

nubeculosus ist bislang nichts bekannt. Durch die Untersuchung des Ganzkörperextrakts

(GKE) der Gnitzen sollten erste Erkenntnisse über die sensibilisierenden Komponenten

it ihre Isolierung erleichtern.

zur Verfügung, die in der

als auch

enen Isotypen um die

gewonnen werden und dam

Mit dem funktionellen In-vitro-Test (FIT) stand eine Methode

Arbeitsgruppe Immunologie zum Nachweis equiner Typ-I-Allergien auf der Ebene der

Effektorzellen entwickelt wurde (KAUL 1998). Das Prinzip des Tests beruht darauf, dass

allergen wirksame Stoffe auf der Oberfläche der basophilen Granulozyten gebundene

sensibilisierende Antikörper entsprechender Spezifität kreuzvernetzen und dadurch die Zellen

aktivieren. Durch die quantitative Erfassung des im Zuge der Zellaktivierung freigesetzten

spezifischen Mediators Histamin kann sowohl die Allergiebereitschaft eines Pferdes

die allergene Potenz von Stoffen bestimmt werden.

Zur Untersuchung der Reaktivität des GKE mit equinen Serum-Immunglobulinen in

Abhängigkeit vom Isotyp und vom Allergiestatus des Pferdes wurden der Immunoblot und

die Immunpräzipitation angewandt. Um zu gewährleisten, dass äquivalente Mengen jedes

Isotyps eingesetzt wurden und um eine Kompetition der verschied

128

Diskussion

Culicoides-Proteine zu unterbinden, wurden die Immunglobuline E, G1 und 4 über

Affinitätschromatographie aus dem Serum von zehn Pferden mit und fünf Pferden ohne

Sommerekzem gereinigt. Zur Überprüfung der Reaktivität mit IgG5 wurde das um IgE, IgG1

ides nubeculosus mit den Effektorzellen

der Allergie

deutli

Pferde erfolgte dagegen nicht (s. 4.1.1).

st ein Teil der Allergene aus den

und IgG4 depletierte Serum der selben Tiere genutzt.

Um einen Hinweis zu erhalten, ob im Serum Immunglobuline mit Spezifität für potentielle

Allergene vorhanden sind, wurden Affinitätschromatographien mit den Isotypen E, G1 und

G4 aus dem Serum von Pferden mit und ohne Sommerekzem durchgeführt. Die durch die

Antikörper detektierten Gnitzen-Komponenten wurden nachfolgend hinsichtlich ihrer

Reaktivität mit equinen basophilen Granulozyten von ekzemkranken und gesunden Pferden

im FIT untersucht.

Reaktivität des Ganzkörperextrakts aus Culico

Bei Zusatz des GKE aus den Gnitzen zu Blutzellen von Pferden mit Sommerekzem wurden

che Histaminfreisetzungen im FIT gemessen, eine Aktivierung der Zellen gesunder

Zur Präparation des GKE aus Culicoides nubeculosus wurde ein wässriger Puffer verwendet,

so dass die Reaktivität im FIT auf die wasserlöslichen Komponenten der Insekten

zurückzuführen ist. Damit wird deutlich, dass zuminde

Gnitzen hydrophile Eigenschaften besitzen muss.

Ähnliche Beobachtungen wurden bei zahlreichen Allergenextrakten aus verschiedenen

Insekten, u. a. aus dem Silberfisch, der Feuerameise, der Küchenschabe und dem Katzenfloh,

gemacht (NORDVALL et al. 1988; HELM et al. 1994; LEE et al. 1999; BARLETTA et al.

2002). Auch hier ist ein Großteil der enthaltenen Allergene hydrophil, so dass die auf Basis

wässriger Lösungen hergestellten Extrakte deutlich Reaktivität in vitro und in vivo zeigten.

Die Variation des pH-Wertes von 4,5 bis 9,0, der Zusatz von Kochsalz bis zu einer

Konzentration von 0,75 M sowie das Trocknen der Komponenten in der gekühlten Speedvac

beeinflussten die Reaktivität des GKE aus den Gnitzen nicht (s. 4.1.2). PH-Werte < 4,5,

Salzkonzentrationen > 0,75 M sowie der Zusatz stark polarer Substanzen bewirkten eine

Minderung der Histaminfreisetzung im Vergleich zum nicht behandelten Extrakt.

129

Diskussion

Die vollständig oder teilweise erhaltene Reaktivität des GKE nach Zusatz denaturierender

Substanzen oder nach Trocknung lässt den Schluss zu, dass ein Teil der Culicoides-Allergene

stabil ist.

Eine hohe Beständigkeit gegenüber äußeren Einflüssen

beschrieben. So verlieren Allergene aus der Küchenschabe erst nach Kochen in 4 N

Essigsäure vollständig ihr Vermögen zur Aktivierung basophiler Granulozyten (TWAROG et

al. 1977). Das Protein Der f 1 aus der Hausstaubmilbe behält in Wohnräumen unabhängig der

umgebenden Temperatur und der Luftfeuchte über Jahrzehnte seine allergene Wirkung bei

(SIDENIUS et al. 2002). Für das Allergen Cte f 1 aus dem Katzenfloh konnte gezeigt werden,

dass es auch nach de

ist auch für weitere Insektenallergene

r Behandlung mit Acetonitril und Trifluoressigsäure (0,1 %) sowie nach

dem Lyophilisieren im Intrakutantest allergische Reaktionen auslöst (MCDERMOTT et al.

Beim Zusatz des Detergenz CHAPS zum GKE aus Culicoides nubeculosus konnte eine

Die zentrale Wirkung von Detergenzien beruht darauf, die Löslichkeit von Substanzen durch

e

rweise der

Substanzklasse der Proteine angehört.

2000).

leichte Steigerung der Histaminfreisetzung beobachtet werden, ohne dass eine direkte

Zellaktivierung durch die Substanz ausgelöst wurde (s. 4.1.2).

Maskierung unpolarer Gruppen zu erhöhen. Von den Culicoides-Komponenten im

verwendeten wässrigen Extrakt, die hinsichtlich ihrer Substanzklasse als Allergene betrachtet

werden können (Kohlenhydrate, Proteine), besitzen die Proteine durch die verschiedenen

Seitenketten ihrer Aminosäuren unpolare Anteile. In wässrigen Lösungen können Protein

daher - bedingt durch hydrophobe Kräfte - Micellen bilden (BERG et al. 2001). Mehrere

Moleküle lagern sich derart zusammen, dass ihre unpolaren Gruppen im Inneren zum Liegen

kommen und die polaren Reste den Kontakt zu den Wassermolekülen herstellen. Durch

Detergenzien werden Proteinmoleküle aus den Micellen gelöst, indem sich die Seifen an die

unpolaren Gruppen anlagern. Da eine direkte Aktivierung der Blutzellen durch CHAPS

ausgeschlossen werden konnte, liegt die wahrscheinliche Erklärung für die erhöhte

Reaktivität des GKE aus Culicoides nubeculosus im FIT nach Detergenzzusatz in einer

Verbesserung der Löslichkeit der allergen wirksamen Komponenten und damit ihrer Fähigkeit

zur Kreuzvernetzung des Rezeptor gebundenen IgE. Damit geben diese Ergebnisse einen

Hinweis darauf, dass ein Teil der Allergene aus den Gnitzen mögliche

130

Diskussion

Detergenzien werden häufig zur Solubilisierung von Proteinen, insbesondere bei der

Extraktion aus dem Gewebe, angewendet (BAJO et al. 2003, YAO & LI 2003). Auch der

Einsatz zur

TOVEY et al. 2001). Es konnte gezeigt werden, dass sich der im ELISA messbare Gehalt an

den hydrophilen Allergenen Fel d 1 (Hauskatze) und Der p 1 (Hausstaubmilbe) signifikant

erhöhte, wenn zur Extraktion Puffer mit Detergenzienzusatz verwendet wurden.

Reaktivität des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus mit equinen Serum-

Immunglobulinen

Im Immunoblot konnte gezeigt werden, dass IgE sowie IgG1, 4 und 5 von Pferden mit und

ohne Sommerekzem vorrangig ein Spektrum von Culicoides-Proteinen im Molmassenbereich

von 15 k

Verbesserung der Löslichkeit von Allergenen ist beschrieben (HIRD et al. 2000;

D bis 55 kD erkannten (s. 4.3.1). Die erhaltenen Banden hoben sich überwiegend nur

er zunächst angereichert

wurden, wurden deutlich abgrenzbare Banden insbesondere zwischen 15 kD und 55 kD

s Serum-IgE und -IgG4 (PORTENGEN et al. 1999).

schwach vom Hintergrund ab, so dass eine Auswertung nicht möglich war.

In der Immunpräzipitation, in der die Gnitzen-Komponenten durch die Matrix gebundenen

Antikörper (IgE, IgG1 oder IgG4) der Ekzemer oder Nichtekzem

erhalten (s. 4.3.2). In Abhängigkeit vom Allergiestatus der Pferde und vom Isotyp variierte

das Bandenmuster der präzipitierten Proteine. Es fanden sich jedoch einige Banden gleicher

oder ähnlicher Molmassen, die von den Antikörpern der Ekzemer und auch der Nichtekzemer

detektiert wurden. Des weiteren wiesen bei der Betrachtung verschiedener Isotypen einzelne

präzipitierte Proteine vergleichbare Massen auf.

Die Bindung der Antikörper kann damit erklärt werden, dass es sich zumindest bei einem Teil

der detektierten Komponenten um Allergene aus Culicoides nubeculosus handelt, die durch

spezifische Antikörper aus dem Serum der Pferde mit Sommerekzem gebunden wurden. An

der Allergendetektion sind möglicherweise verschiedene Isotypen beteiligt, gegen einen Teil

der Allergene besitzen eventuell auch Pferde ohne Sommerekzem Serum-Immunglobuline.

In der Humanmedizin konnte anhand definierter Allergene das Vorhandensein von

spezifischem IgE im Serum von Allergikern nachgewiesen werden (JANEWAY et al. 2002).

Mit IgG1, IgG2 und IgG4 konnten zudem drei der vier humanen IgG-Isotypen detektiert

werden, die eine Allergenspezifität aufweisen (GEHLHAR et al. 1999). Gesunde Menschen

besitzen vorwiegend allergenspezifische

131

Diskussion

Beim Pferd konnte dagegen aufgrund fehlender definierter Allergene bislang keine eindeutige

Aussage über die Serumprävalenz von Immunglobulinen mit entsprechender Spezifität

getroffen werden. Im Immunoblot mit Extrakten aus Culicoides spp. wurde festgestellt, dass

IgE und IgG aus dem Serum von Pferden mit und ohne Sommerekzem verschiedene Proteine

aus den Gnitzen detektierten (WILSON et al. 2001; ALTHAUS et al. 2004). Die im Blot

erhaltenen Banden waren insbesondere beim Nachweis der IgG bindenden Proteine sehr

zahlreich und kaum differenzierbar (ALTHAUS et al. 2004). Weiterhin wurde in der

den mit Sommerekzem Komponenten der Gnitzen detektiert wurden

Serum um den Faktor 105

bzw. 103 geringer (JANEWAY et al. 2002; WAGNER et al. 2002). Beim Menschen konnte

e

Immunhistochemie an Schnitten aus Culicoides spp. gezeigt, dass durch IgE sowie durch IgG

aus dem Serum von Pfer

(WILSON et al. 2001). Die stärkste Bindungsintensität der Antikörper fand sich im Bereich

der Speicheldrüsen der Insekten, wo die Hauptlokalisation der Allergene vermutet wird. Bei

den nichtallergischen Pferden konnte ausschließlich IgG bestimmt werden, das an

Komponenten aus Culicoides spp. band.

Eine derartig klare Trennung von Pferden mit und ohne Sommerekzem anhand der bindenden

Isotypen an Culicoides-Komponenten konnte in den vorliegenden Untersuchungen nicht

gezeigt werden. Es konnten bei beiden Pferdegruppen Antikörper aller untersuchten Isotypen

bestimmt werden, die Gnitzen-Komponenten detektierten.

Möglicherweise liegt der Grund für den erfolgreichen Nachweis von IgE gegen Culicoides-

Proteine beim Nichtekzemer in der Verwendung des angereicherten und gereinigten IgE. Die

Konzentration des Gesamt-IgE ist beim Menschen wie beim Pferd mit durchschnittlich

50 ng/ml bzw. ~ 100 µg/ml im Vergleich zu anderen Isotypen im

zudem gezeigt werden, dass die Konzentration des allergenspezifischen IgE im Serum

gesunder Individuen niedriger ist als bei Allergikern (MIMURA et al. 2004; PENG &

SIMONS 2004). Damit wird deutlich, dass eine starke Anreicherung des IgE die

Nachweismöglichkeiten der allergenspezifischen Antikörper dieses Isotyps entscheidend

verbessern kann. Ebenso ist denkbar, dass bezüglich der Konzentration stärker vertreten

Immunglobulin-Isotypen erfolgreich um die Bindung an die Proteine kompetieren. Die

meisten Allergene induzieren keine alleinige IgE-Antwort. Vielmehr können beim Menschen

IgE, IgG1, 2 und 4 nebeneinander mit Spezifität für ein bestimmtes Allergen nachgewiesen

werden, deren Serum-Titer stark variieren (GEHLHAR et al. 1999; STERN et al. 2004).

WILSON et al. konnten in der Immunhistochemie zeigen, dass die Mehrzahl der Culicoides-

132

Diskussion

bindenden Antikörper, insbesondere diejenigen, die an die Speicheldrüsen banden, beim

ekzemkranken Pferd IgG-Isotypen zugehörig waren (WILSON et al. 2001). In eigenen

Untersuchungen wurde deutlich, dass verschiedene Isotypen Gnitzenproteine gleicher

Molmassen detektierten. Daher ist es denkbar, dass andere Isotypen als IgE, die ebenfalls

Culicoides-Komponenten binden, beim Nichtallergiker in höheren Konzentrationen vorliegen.

Ein erfolgreicher Nachweis von IgE bei diesen Tieren ist somit eventuell erst nach Trennung

dieses Antikörpers von den übrigen Isotypen möglich.

Neben der möglichen Erklärung, dass es sich um spezifisch gebundene Komponenten aus

Culicoides nubeculosus handelt, muss in Betracht gezogen werden, dass für die Bindung

kreuzreagierende Antikörper verantwortlich sein können, deren Produktion unabhängig von

den Gnitzen-Komponenten ist.

Als kreuzreaktive Antikörper kommen insbesonde

Proteine anderer haematophager Insekten gebildet wurden. Im Zusammenhang mit der

Moskito-Allergie des Menschen konnte eine entsprechende Kreuzreaktivität nachgewiesen

werden (PENG & SIMONS 1997). Die Antikörper der Isotypen E, G1 und G4, die aus dem

Serum Moskito allergischer Personen aus Manitoba, Kanada, isoliert

nur die Speichelproteine der heimischen Spezies Aedes vexans, sondern auch die homologen

Proteine aus den in der Region nicht vorkommenden Arten wie Aedes aegypti und Culex

quinquefaciatus, mit denen die Probanden nie in Berührung gekommen waren. Am

Sommerekzem des Pferdes sind neben Culicoides spp. weitere blutsaugende Insekten

(Culicidae, Tabanidae, Simuliidae) beteiligt (FADOK & GREINER 1990; MARTI et al.

1999; GEIBEN 2003). Hinweise auf kreuzreagierende Antikörper fanden sich in

Untersuchungen von Culicoides-Präparationen in der Immunhistochemie und im Immunoblot

mit Seren von Pferden aus Island, die nie in Kontakt mit den Gnitzen gekommen waren

(WILSON et al. 2001; ALTHAUS et al. 2004). Im Serum dieser Pferde konnte IgG

nachgewiesen werden, das an verschiedene Gnitzenproteine band. Als Ursache wurde

vermutet, dass die eigentliche Spezifität der Antikörper gegen Komponenten aus isländischen

Stechinsekten (Culicidae, Tabanidae, Simuliidae) gerichtet ist.

Die weiteren in Frage kommenden Quellen kreuzreaktiver Antikörper variieren mit dem

jeweiligen Isotyp. IgE besitzt neben seiner Bedeutung für die Typ-I-Allergie eine

physiologische Funktion bei der Abwehr von Endoparasiten, insbesondere bei der

re solche in Frage, die gegen homologe

wurden, banden nicht

133

Diskussion

Bekämpfung gastrointestinaler Helminthen. Das Pferd ist Wirt zahlreicher Endoparasiten

[kleine Strongyliden (Cyathostominae u. a.), Magendasseln (Larven von Gasterophilus

intestinales), selten: große Strongyliden (Strongylus edentatus, S. vulgaris, S. equinus)]

(ROMMEL et al. 2000). Bei den Pferden, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden,

konnte im ELISA ein hoher Serum-IgE-Titer gegen Komponenten aus kleinen Strongyliden

nachgewiesen werden (HESELHAUS 2005). Verschiedene Helminthen induzieren im Zuge

ihrer Überlebensstrategie zudem die Produktion großer Mengen von sog. polyklonalen IgE

(MAIZELS et al. 1993; LYNCH et al. 1993; PRITCHARD 1993). Diese Antikörper sind im

ope, die Wahrscheinlichkeit, dass es durch

Immunglobuline unterschiedlicher Isotypen an Komponenten der Gnitzen binden. Es wurde

Gegensatz zum spezifischen IgE gegen eine sehr breite Anzahl von Endoparasiten-

Komponenten gerichtet, binden sie jedoch mit geringerer Affinität. Auf der Oberfläche von

Effektorzellen (Mastzellen, basophile Granulozyten) gebundenes polyklonales IgE erniedrigt,

insbesondere durch die hohe Anzahl der Zielepit

Parasitenproteine kreuzvernetzt wird und die Zellen aktiviert werden. Auch beim Pferd

wurden Hinweise auf das Vorkommen von polyklonalem IgE gefunden

(HESELHAUS 2005).

Für das Pferd ist erst seit kurzer Zeit bekannt, dass es über sieben unterschiedliche IgG-

Isotypen verfügt (WAGNER et al. 2004). Soweit geeignete Nachweisreagenzien existent sind,

wurde das Auftreten einiger Isotypen im Serum nach Antigenexposition ansatzweise geklärt.

Es konnten spezifisches IgG1 und IgG4 nach Infektionen (equines Herpesvirus 4, equines

Influenzavirus, Rhodococcus equi) sowie nach Impfungen nachgewiesen werden (LUNN et

al. 1999; HOOPER-MCGREVY et al. 2002, MIZUKOSHI et al. 2002). IgG(T), das sich aus

IgG3 und IgG5 zusammensetzt, tritt vor allem im Zusammenhang mit endoparasitären

Infektionen auf (u. a. der Klasse der Cyathostominae) (DOWDALL et al. 2002 & 2004). Im

Serum der Pferde, die für diese Arbeit untersucht wurden, fanden sich Antikörper der

Isotypen G1, 4 und 5, die Komponenten aus kleinen Strongyliden detektierten (HESELHAUS

2005).

Reaktivität affinitätschromatographisch isolierter Komponenten aus Culicoides

nubeculosus mit equinen Effektorzellen

Bislang konnte gezeigt werden, dass der Ganzkörperextrakt (GKE) aus Culicoides

nubeculosus eine Aktivierung der basophilen Granulozyten bewirkt und dass equine Serum-

134

Diskussion

jedoch nicht nachgewiesen, ob die von den Antikörpern gebundenen Proteine für die Reaktion

mit den Effektorzellen verantwortlich sind.

Um diesen Zusammenhang zu klären, wurde eine Affinitätschromatographie mit Matrizes

durchgeführt, an die das jeweils gepoolte Serum-IgE, -IgG1 und -IgG4 von Pferden mit oder

ohne Sommerekzem kovalent gebunden wurde. Nach Beschickung der Matrizes mit dem

GKE aus den Gnitzen wurden die gebundenen Proteine eluiert und im FIT untersucht. Mit

dem Serum-IgE und -IgG4 der ekzemkranken Pferde konnten Komponenten isoliert werden,

die eine Histaminfreisetzung im FIT bei fünf bzw. vier von sieben Tieren mit Sommerekzem

auslösten (4.3.3). Mit dem IgE aus dem Serum von Nichtekzemern gelang die Isolierung von

Proteinen, die bei zwei von sieben Pferden eine Histaminfreisetzung bewirkten. Mit dem

IgG1 aller Tiere sowie mit dem IgG4 der gesunden Kontrollpferde konnten keine

Komponenten isoliert werden, die eine Histaminfreisetzung induzierten.

Als ursächlich für die FIT-Reaktivität der durch IgE und IgG4 isolierten Komponenten kann

postuliert werden, dass es sich zum

Culicoides nubeculosus handelt, für die sensibilisierende Antikörper auf den basophilen

Granulozyten der ekzemkranken Pferde vorhanden sind. Damit wird ebenfalls deutlich, dass

IgE und IgG4 mit Spezifität für potentielle Allergene aus Culicoides nubeculosus im

Pferdeserum prävalent sein können.

Eine Induktion verschiedener Isotypen derselben Spezifität, insbesondere von IgE und IgG4,

ist im Zusammenhang mit der Typ-I-Allergie mehrfach beschrieben (AALBERSE 2000;

STERN et al. 2004; PENG & SIMONS 2004). Untersuchungen in vitro bieten eine Erklärung

für die zugrunde liegenden Mechanismen des parallelen Auftretens dieser beiden Isotypen. Es

konnte gezeigt werden, dass eine IgG4 geprägte B-Zelle in einem kurzen Zeitraum ihrer

Existenz einen weiteren Klassenwechsel zur IgE-Produktion vollziehen kann, so dass IgE

synthetisierende Plasm

indest bei einem Teil um potentielle Allergene aus

azellen entstehen (VERCELLI 2000). Außerhalb dieses Zeitfensters

entwickeln sich aus den IgG4 geprägten B-Zellen IgG4 produzierende Plasmazellen oder

beim Pferd möglich.

Die nicht vorhandene bzw. geringere Reaktivität der Culicoides-Komponenten, die durch das

Gedächtniszellen. Ein solcher Klassenwechsel von IgG4 zu IgE wäre aufgrund der

Anordnung der entsprechenden Gene auch

IgG4 bzw. IgE der ekzemfreien Pferde aus dem GKE isoliert wurden, kann möglicherweise

darauf beruhen, dass der Serum-Gehalt der allergenspezifischen Antikörper bei diesen Tieren

135

Diskussion

sehr gering ist. In der Humanmedizin konnten bei Nichtallergikern im Vergleich zu

allergischen Personen häufig signifikant n

Spezifität für definierte Allergene nachgewiesen werden (PORTENGEN et al. 1999;

MIMURA et al. 2004; STERN et al. 2004). Denkbar ist ebenfalls, dass die

allergenspezifischen Antikörper der hier untersuchten ekzemfreien Pferde eine geringere

Affinität zu ihren Zielproteinen besitzen, so dass mit diesen Antikörpern weniger oder kein

Allergen aus dem GKE der Gnitzen isoliert wurde. Insbesondere für humanes IgG1 und IgG4

konnte nachgewiesen werden, dass die Affinitäten der Immunglobuline in Abhängigkeit vom

Allergen wie auch vom Allergiestatus des jeweiligen Individuums erheblich variieren können

(BOLUDA et al. 1996). Ob und welche Unterschiede in den Spiegeln und Affinitäten

allergenspezifischer Serum-Immunglobuline beim Pferd bestehen, ist bislang ungeklärt.

Eine weitere Erklärung für die Histaminfreisetzung aus den basophile

iedrigere Spiegel von IgE und/oder IgG4 mit

n Granulozyten, die

durch die mittels IgE und IgG4 isolierten Culicoides-Komponenten induziert wurde, basiert

elminthen (kleine Strongyliden,

r

auf kreuzreagierenden, sensibilisierenden Antikörpern.

Aus der Humanmedizin ist bekannt, dass eine Kreuzreaktivität nicht nur auf der Ebene der

Serum-Immunglobuline lokalisiert ist, sondern auch die Antikörper auf den Effektorzellen

betrifft (s. 2.1.1.3; AALBERSE 2000). Die Kreuzreaktivitäten traten sowohl zwischen nah

verwandten Spezies als auch zwischen taxonomisch weit entfernten Arten auf. Beim Pferd

wurde eine Sensibilisierung im FIT gegen verschiedene H

Parascaris equorum) festgestellt (MARTI et al. 1999; HESELHAUS 2005). Zudem konnte

bei vielen Pferden eine Histaminfreisetzung aus basophilen Granulozyten im FIT auf

verschiedene Gräser- und Baumpollen, Moskitos, Wadenstecher, Pferdebremsen, Ameisen

oder verschiedene Fliegen nachgewiesen werden (BRUENNLEIN 2001; GEIBEN 2003).

Somit wäre denkbar, dass die originär gegen andere Strukturen produzierten Antikörper die

Komponenten aus Culicoides nubeculosus binden und eine Degranulation der Effektorzellen

auslösen. Ein entsprechender Nachweis von Kreuzreaktivität beim Pferd gelang im FIT für

die in Nord- und Südamerika heimische Gnitzenart Culicoides sonorensis, mit der die

untersuchten europäischen Pferde nie in Kontakt gekommen waren (KAUL 1998).

Ein mehrfach in der Literatur beschriebenes Phänomen einer direkten, Antikörpe

unabhängigen Aktivierung der basophilen Granulozyten (MACHADO et al. 1996) kann für

die isolierten Komponenten ausgeschlossen werden, da nicht bei allen untersuchten Tieren

eine Histaminfreisetzung aus den Zellen induziert werden konnte.

136

Diskussion

Die nicht erfolgte Histaminfreisetzung durch die mittels IgG1 isolierten Komponenten aus

Culicoides nubeculosus kann auf einem nicht ausreichend hohen Spiegel an

allergenspezifischen Antikörpern dieses Isotyps oder an einer niedrigen Affinität dieser

Antikörper zu ihrem Zielprotein beruhen (s. S. 138).

Weiterhin ist denkbar, dass mit der equinen Typ-I-Allergie assoziierte Allergene keine

Produktion von spezifischem IgG1 induzieren. Typ I-Allergene wie auch extrazelluläre

Pathogene bedingen einen Shift des Immunsystems zu einer Antikörper dominierten

Immunantwort. Diese Antwort wird nach den vermittelnden TH2-Zellen

(CD4+ Lymphozyten) auch als TH2-Reaktion bezeichnet. Intrazelluläre Erreger bewirken

dagegen neben der Induktion einer Antikörperproduktion eine vorwiegend zellulär basierte

Immunantwort (Aktivierung von Makrophagen u. a.), eine sog. TH1-Reaktion. B

Menschen und im Mausmodell reflektieren die Isotypen der antigenspezifischen

Immunglobuline den jeweilige vorherrschenden Reaktionstyp. Beim Pferd trat IgG1 als

protektiver Antikörper bei verschiedenen intrazellulä

Herpesvirus 4, equines Influenzavirus, Rhodococcus equi), so dass im Hinblick darauf

vorgeschlagen wurde, diesen Isotypen als Indikator einer TH1-Antwort anzusehen

(HOOPER-MCGREVY et al. 2002). Sollte sich diese Klassifizierung bestätigen, ist es

unwahrscheinlich, dass IgG1 als dominanter Isotyp bei einer TH2-Antwort wie dem

Sommerekzem in Erscheinung tritt.

Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass ein Teil der Allergene aus Culicoides

nubeculosus hydrophil und stabil gegenüber äußeren Einflüssen ist und mit hoher

Wahrscheinlichkeit zur Substanzklasse der Proteine gehört. Damit kann eine Vielzahl

proteinbiochemischer Methoden zur Isolierung und Charakterisierung der Allergene zur

Anwendung kommen.

Die Antikörper-Isotypen E, G1, G4 und G5 aus Seren von Pferden mit und ohne

Sommerekzem binden an Komponenten aus dem GKE der Gnitzen. Eine Aktivierung

basophiler Granulozyten zur Histaminfreisetzung erfolgte jedoch ausschließlich

Komponenten, die mit dem IgE ekzemkranker und gesunder Pferde sowie mit dem IgG4 von

Pferden mit Sommerekzem erhalten wurden. Damit wird deutlich, dass die

Antikörperbindung nur in Kombination mit einer funktionellen Untersuchung eine adäquate

Beurteilung der allergenen Wirksamkeit der zu isolierenden Proteine aus dem

eim

ren Infektionserregern auf (equines

durch die

GKE erlaubt.

137

Diskussion

5.2 Untersuchungen zu definierten Komponenten aus Culicoides nubeculosus

Im Folgenden wurden durch verschiedene flüs

definierte Komponenten aus dem GKE aus Culicoides nubeculosus isoliert. Vorversuche zur

Etablierung eines geeigneten Reinigungsweges der Komponenten erbrachten weitere

Hinweise auf die biochemischen Eigenschaften der potentiellen Allergene aus den Gnitzen.

Die Fraktionierung der Proteine nach ihrer Größe in der Gelfiltrationschromatographie ergab,

dass die Proteine der stärksten FIT-Reaktivität Molmassen zwischen 44 und 160 kD sowie

< 25 kD aufweisen (s. 4.4.1.1). Weiterhin konnte in der Ionenaustauscherchromatographie

festgestellt werden, dass es sich bei einem Teil der potentiellen Allergene der Gnitzen um

basische Proteine handeln muss (s. 4.4.1.2). Durch die Kombination eines starken

Kationenaustauschers mit einer Größentrennung (Gelfiltrationschromatographie oder

Ultrafiltration) oder der Reversed-Phase-Chromatographie wurden zwei Proteine aus dem

GKE aus Culicoides nubeculosus isoliert (s. 4.4.3). Die Ergebnisse der zweidimensionalen

Gelelektrophorese und Silberfärbung zeigten, dass es sich um reine Proteine handelt

(s. 4.5.1.1 & 4.5.2.1). Ein Protein wurde in der massenspektrometrischen Analyse als

Citratsynthase, das zweite Protein als Cytochrom C identifiziert (s. 4.5.1.2 & 4.5.2.2).

Die Citratsynthase ist als Enzym d

sigkeitschromatographische Verfahren

es Zitronensäurezyklus in der mitochondralen Matrix

zyme der Atmungskette an der inneren Membran der Mitochondrien

lokalisiert und katalysiert die Synthese von Citrat und Coenzym A aus Oxalacetat und Acetyl-

Coenzym A. Das Enzym besteht aus zwei identischen Untereinheiten, die bei allen

untersuchten Lebewesen eine Molmasse zwischen 45 und 50 kD aufweisen und isoelektrische

Punkte zwischen 8 und 10 besitzen (BERG et al. 2003).

Cytochrome sind als En

lokalisiert und wirken als Oxidoreduktasen bei der Elektronenübertragung. Sie setzen sich aus

einem Proteinanteil, der die Unterscheidung der einzelnen Cytochrome erlaubt, und einer

Häm-Gruppe mit zentralem Eisenatom zusammen. Die Molmassen des Cytochrom C

variieren bei den bisher untersuchten Spezies zwischen 12 und 20 kD, der isoelektrische

Punkt liegt zwischen 9 und 11 (BORSARI et al. 2000; BERG et al. 2003).

Die Bedeutung der Citratsynthase und des Cytochrom C als potentielle Allergene wurde unter

biochemischen und funktionellen Gesichtspunkten analysiert.

138

Diskussion

In der biochemischen Charakterisierung sollte festgestellt werden, inwieweit die beiden

ine aufgrund ihrer Struktur und hinsichtlich ihrer Eintragswege ins Pferd als Allergene Prote

aus Culicoides nubeculosus relevant sein können.

ültigen

Charakteristika für Allergene darstellen, jedoch häufig bei solchen angetroffen werden

stark konserviert sind (s. 4.5.1.3 &

der nur wenige

Effektorzellen im Körper, die eine Spezifität für Epitope dieser Proteine aufweisen.

n, dass trotz einer Identität von

Im Zuge der funktionellen Charakterisierung wurde die Reaktivität der Citratsynthase und des

Cytochrom C aus den Gnitzen mit gereinigten equinen Serum-Immunglobulinen von zehn

Pferden mit und fünf Pferden ohne Sommerekzem überprüft. Zudem wurde das Vermögen

der beiden Proteine zur Aktivierung equiner basophiler Granulozyten als Effektorzellen der

Typ-I-Allergie bei neun ekzemkranken Pferden und fünf gesunden Tieren untersucht.

Die Bedeutung der Citratsynthase und des Cytochrom C für das Sommerekzem des

Pferdes unter biochemischen Aspekten

Die Citratsynthase und das Cytochrom C besitzen mit 46,5 bzw. 14,6 kD Molmassen, die

zwischen 10 und 70 kD liegen. Zudem erwiesen sich die beiden Proteine gegenüber den

angewandten Manipulationen während der Reinigung als stabil (u. a. gegenüber der

reduzierenden Wirkung des Acetonitrils bei der Reversed-Phase-Chromatographie). Zudem

sind beide Proteine Enzyme.

Damit zeigen die beiden Proteine Merkmale, die zwar keine allgemeing

(s. 2.1.1.2; LEHRER et al. 1996; HUBY et al. 2000; JANEWAY et al. 2002).

Auf der anderen Seite wurde anhand der hohen Identität einzelner Peptide zu den homologen

Proteinen aus anderen Spezies deutlich, dass die Citratsynthase und das Cytochrom C

Strukturen repräsentieren, die im Tier- und Pflanzenreich

4.5.2.3).

Eine allergene Wirksamkeit von konservierten Strukturen ist selten (DEPPE 2002). Als

Ursache kann angenommen werden, dass die Identität dieser Proteine zwischen den einzelnen

Spezies so hoch ist, dass spezifische T- und B-Lymphozyten im Zuge der

Toleranzentwicklung ausselektiert wurden. Somit existieren keine o

Konservierte Komponenten werden jedoch in einigen Fällen als potente Allergene

beschrieben. Untersuchungen zum Albumin des Hundes belege

139

Diskussion

etwa 83 % zum humanen Albumin starke allergische Reaktionen bei sensibilisierten Personen

hervorgerufen werden können (PÓMES 2002). Weitere Beispiele für konservierte Allergene

sind das pflanzliche Profilin sowie die Mang

fumigatus, deren humane Äquivalente eine so hohe Identität aufweisen, dass sie durch die

Pollen bzw. Schimmelpilz spezifischen Antikörper gebunden werden (VALENTA et al. 1992;

CRAMERI et al. 1996).

Für das Cytochrom C aus Culicoides nubeculosus konnte jedoch trotz der hohen Identität der

Sequenzen zu den homologen Proteinen des Rindes keine Kreuzreaktivität mit dem b

an-Superoxid-Dismutase aus Aspergillus

ovinen

Protein nachgewiesen werden (s. 4.6.2.3).

dem Katzenfloh (Ctenocephalides felis) isoliert wurden, waren typische Speichelproteine

In den Speichel der Gnitzen gelangen die beiden Proteine vermutlich nur im Zusammenhang

ewebe der Ratte nachgewiesen (SOLTYS et al. 2001). Welche Rolle das

Cytochrom C in seiner sezernierten Form spielt, ist unklar. Dagegen lassen diese Hinweise

für den

Allergene, die bisher aus Blut saugenden Insekten wie der Stechmücke (Aedes aegypti) und

(MCDERMOTT et al. 2000; PENG & SIMONS 2004). Auch beim Pferd wird als

Haupteintragsweg für die Allergene der Speichel angenommen (MARTI et al. 1999;

ALTHAUS et al. 2004). Bei der Citratsynthase und dem Cytochrom C handelt es sich um

intrazelluläre Proteine, die in den Mitochondrien lokalisiert sind.

mit dem Absterben von Zellen der Speicheldrüsen. Für das Cytochrom C zeigen allerdings

neuere Untersuchungen, dass die ursprüngliche Annahme einer rein mitochondralen

Lokalisation dieses Enzyms revidiert werden muss. Cytochrom C kann aus den

Mitochondrien ins Cytosol freigesetzt werden und über die Aktivierung von Kaspasen den

programmierten Zelltod (Apoptose) einleiten (REED 1997; KROEMER et al. 1998). Zum

anderen wurde Cytochrom C in hohen Konzentrationen in sekretorischen Granula im

Pankreasg

den Schluss zu, dass möglicherweise auch bei Culicoides nubeculosus ein

extramitochondrales Vorkommen von Cytochrom C zu höheren Konzentrationen im Speichel

führen kann als bisher angenommen.

Neben der häufig beschriebenen Annahme, dass sensibilisierende Komponenten aus

Culicoides mit dem Speichel ins Pferd gelangen, wurde eine weitere Theorie

Allergeneintrag aufgestellt (WILSON et al. 2001). Bei günstigen Witterungsbedingungen

können mehrere hundert Gnitzen auf einem Pferd gefunden werden. Scheuert sich das Pferd

140

Diskussion

aufgrund des Juckreizes, kommt es zur Quetschung der Insekten und zur Zerstörung ihrer

Zellen. Über offene Hautwunden können nun neben Speichelproteinen auch andere

Komponenten aus den Gnitzen in das Pferd gelangen und allergische Reaktionen verursachen.

Indirekt gestützt wird diese Hypothese durch Untersuchungen, bei denen in der

Immunhistochemie von Culicoides spp. IgE-bindenden Proteine auch außerhalb der

Speicheldrüsen nachgew

Proteinen nicht um solche handelt, die Homologe der Speichelproteine sind oder die durch

kreuzreagierendes IgE gebunden werden, müssen sie auf anderem Wege als über den Speichel

der Gnitzen ins Pferd gelangt sein.

iesen wurden (WILSON et al. 2001). Sofern es sich bei diesen

Ein Hinweis darauf, dass ein Eintrag von Insektenprotein über offene Wunden beim Pferd

„Eintrittspforte“ für niedriger konzentrierte und/oder

möglich ist, gibt die im FIT festgestellte Sensibilisierung ekzemkranker aber auch gesunder

Tiere gegen Hausfliegen (GEIBEN 2003). Die Fliegen lassen sich in großer Zahl zur

Aufnahme der Sekrete auf Wunden jeglicher Art nieder, so dass Komponenten aus den

Insekten in das Pferd gelangen und eine Immunreaktion auslösen können. Allerdings darf

auch hier eine Kreuzreaktivität als mögliche Erklärung für die beobachtete Reaktivität des

GKE aus den Fliegen nicht ausgeschlossen werden.

Unabhängig vom Eintragsweg der Citratsynthase und des Cytochrom C ist die Menge der

beiden Proteine, die in die Pferde gelangt, vermutlich deutlich geringer als die beim Stich

applizierte Menge der typischen Speichelproteine.

Es ist jedoch mehrfach beschrieben, dass sich auch niedrig konzentrierte und/oder wenig

immunogene Komponenten im Zusammenhang mit der sog. Polysensibilisierung zu

wirksamen Allergenen entwickeln können (SILVESTRI et al. 1999; WU et al. 2001). Am

Mausmodell konnte auf der T-Zellebene gezeigt werden, dass bei Mäusen, die mit einem

Hauptallergen der Hausstaubmilbe (Der p 2) immunisiert wurden, bei permanenter

Allergenexposition auch niedriger konzentrierte oder schwächer allergen wirksame Peptide

des Der p 2 die T-Zellen aktivierten (WU et al. 2001). Als Erklärung hierfür wird angeführt,

dass die Hauptallergene eine Art

schwächere Komponenten darstellen. Auf welchen Mechanismen dieses Prinzip beruht, ist

noch ungeklärt. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Pferde schon seit mehreren

Jahren am Sommerekzem leiden, wäre denkbar, dass analog des geschilderten Modells eine

141

Diskussion

Sensibilisierung auch gegen die Citratsynthase und das Cytochrom C im Laufe der Zeit

erfolgt ist.

Die Bedeutung der Citratsynthase und des Cytochrom C für das Sommerekzem des

Pferdes unter funktionellen Aspekten

Sowohl die Citratsynthase als auch das Cytochrom C wurden im Immunoblot durch IgE

gebunden, das aus dem Serum von Pferden mit klinischer Ausprägung des Sommerekzems

isoliert wurde (s. 4.6.1.1 & 4.6.2.1). Im Serum eines Teils der Pferde ohne Sommerekzem

wurde ebenfalls IgE nachgewiesen,

das IgG4 aus dem Serum aller untersuchten Pferde mit den beiden Proteinen. Bei jeweils

einem Teil der ekzemkranken und gesunden Tiere konnte IgG1 und IgG5 im Serum

nachgewiesen werden, das die isolierten Gnitzenproteine detektierte.

Im FIT induzierte die Citratsynthase keine Histaminfreisetzung aus den Blutzellen der

untersuchten Pferde (s. 4.6.1.2). Dagegen ergaben erst im letzten Reinigungsschritt von dem

Enzym abgetrennte, nicht weiter analysierte Komponenten positive FIT-Resultate (s. 4.4.4).

Das Cytochrom C aktivierte bei der Mehrzahl

das die beiden Komponenten detektierte. Zudem reagierte

der Pferde mit Sommerekzem die

ase im FIT liegt es nahe, dass es sich bei

Klon aus einer cDNA-Expressionsgenbank. Das rekombinante Protein wurde durch IgE und

Effektorzellen zur Histaminfreisetzung (s. 4.6.2.2). Bei Pferden ohne Sommerekzem konnte

keine Freisetzung durch dieses Protein festgestellt werden.

Aufgrund der fehlenden Reaktivität der Citratsynth

diesem Enzym nicht um ein Allergen aus Culicoides nubeculosus handelt. Die Bindung der

Serum-Immunglobuline ist daher möglicherweise auf Kreuzreaktivität zurückzuführen.

Für die Citratsynthase ist bislang keine sensibilisierende Wirkung bekannt. Antikörper gegen

dieses Enzym wurden nur im Zusammenhang mit Autoantikörpern gegen mitochondrale

Strukturen bei kongenitaler Leberzirrhose nachgewiesen (MELEGH et al. 1998). Für die

Citratsynthase konnte dabei im Gegensatz zu weiteren mitochondralen Bestandteilen nur eine

schwache immunogene Wirkung festgestellt werden.

Eine Antikörperbindung durch IgE, jedoch keine sensibilisierende Wirkung des isolierten

Proteins wurde auch für Komponenten aus Culicoides nubeculosus beschrieben (ALTHAUS

et al. 2004). Im Immunoblot wurde durch IgE eines ekzemkranken Pferdes ein ribosomales

Protein aus einem GKE detektiert. Ebenso banden diese Antikörper an den entsprechenden

142

Diskussion

IgG von Pferden mit und ohne Sommerekzem detektiert. Allergische Pferde zeigten einen im

Vergleich zu den gesunden Tieren leicht erhöhten Titer der bindenden Antikörper. Das im In-

vitro-Test eingesetzte rekombinante Protein zeigte dagegen keinerlei allergene Wirksamkeit.

ität im FIT mehrere mögliche Erklärungen.

wöchiger, signifikanter

Rezeptor

FcγRIIB gebunden haben (DAERON et al. 1995; BATARD et al. 1996; OKAYAMA et al.

aben,

se im FIT auf eine nicht ausreichende

Sollte es sich bei der Citratsynthase dennoch um ein Allergen aus Culicoides nubeculosus

handeln, ergeben sich für die fehlende Reaktiv

So könnte eine zu geringe Besatzdichte der basophilen Granulozyten mit spezifischen,

sensibilisierenden Antikörpern eine Kreuzvernetzung und Aktivierung der Zellen durch die

Citratsynthase verhindern. Da die Serum-Immunglobuline um die Rezeptoren auf den

Effektorzellen konkurrieren, dominieren die im Serum stärker vertretenen Spezifitäten auch

den Besatz der Zellen. Beim Pferd konnte dies nach einer massiven Anflutung parasitären

Antigens durch Entwurmung veranschaulicht werden (HESELHAUS 2005). Parallel zum

Anstieg wurmspezifischer Antikörper im Serum erfolgte ein mehr

Einbruch der vor der Entwurmung starken Sensibilisierung gegen Culicoides - ein Hinweis

auf eine Veränderung des Antikörperbesatzes der basophilen Granulozyten.

Weiterhin kann die fehlende Reaktivität der Citratsynthase im FIT möglicherweise durch eine

Bindung an inhibierende Antikörper auf der Oberfläche der basophilen Granulozyten erklärt

werden (s. 2.1.3). Beim Menschen kann eine Hemmung der Effektorzellen über die Bindung

an IgG1, seltener an IgG4, ausgelöst werden, die ihrerseits an den inhibierenden

2000). Weiterhin wurde gezeigt, dass bei einer Kreuzvernetzung eines aktivierenden

Rezeptors (FcεRI) mit dem FcγRIIB ebenfalls eine Degranulation der Zellen verhindert

werden kann (DAERON 1997; ZHANG et al. 2004). Untersuchungen beim Pferd erg

dass durch Kreuzvernetzung von IgG1, 4 und 5, die an noch unbekannte Rezeptoren auf den

basophilen Granulozyten gebunden haben, eine Inhibition der Zellen bei Einwirkung eines

gleichzeitigen aktivierenden Stimulus (Culicoides nubeculosus) induziert werden kann

(ROHWER 2004).

Ebenso kann die fehlende Reaktivität der Citratsyntha

Anzahl von Allergie relevanten Epitopen (Antikörper bindende Strukturen) auf dem Enzym

zurückzuführen sein. Damit ein Allergen eine Kreuzvernetzung der Immunglobuline auf den

Effektorzellen induzieren kann, muss es mindestens zwei Epitope besitzen (HUBY et al.

2000). Die meisten hinsichtlich ihrer Struktur charakterisierten Allergene sind multivalent

und weisen wie das Erdnuss-Allergen Ara h 1 bis zu 23 Epitope auf (SHIN et al. 1998). Als

143

Diskussion

besonders potente Induktoren einer IgE-Antwort gelten Allergene mit sog. repetitiven

Epitopen (Tandem Amino Acid Repeats) zu denen u. a. die Hauptallergene der Küchenschabe

gehören (POMÉS et al. 1998).

Das isolierte Cytochrom C ist als ein potentielles Allergen aus Culicoides nubeculosus

betrachten, für das sensibilisierende Antikörper auf den basophilen Granulozyten von Pferden

mit Sommerekzem und spezifische Immunglobuline im Serum von Pferden mit und ohne

Sommerekzem vorhanden sind. Da das Enzym bei > 50 % der untersuchten ekzemkranken

Pferde eine sensibilisierende Wirkung im FIT zeigt, ist es als Hauptallergen zu bezeichnen.

Beurteilt wurde in diesem Fall aufgrund der konträren Ergebnisse von Immunoblot und FIT

für die Citratsynthase nicht die Prävalenz von allergenspezifischem Serum-IgE

(LOWENSTEIN 1978), sondern die Reaktivität des isolierten Proteins mit den Effektorzellen

der Allergie.

Im Gegensatz zur Citratsynthase ist für das Cytochrom C eine starke immunogene

erwiesen. Bereits 1979 wurde die proliferationsfördernde Wirkung von Cytochrom C sowie

von zahlreichen Peptiden des Cytochrom C auf T-Lymphocyten gezeigt (CORRADIN &

CHILLER 1979). Inzwischen existieren synthetische Peptide u. a. aus Pferdeherz-, Tauben-

und Thunfisch-Cytochrom C sowie Cytochrom C spezifische T-Zellhybridome, die in

Kombination zur gezielten Aktivierung von Zellen eingesetzt werden können (CROFT &

SWAIN 1995; HAYASHI et al. 2002).

Neben der immunogenen Wirkung ist Cytochrom C auch als Allergen mehrfach beschrieben:

Erstmalig wurde es bekannt als sensibilisierende Komponente aus den Pollen der Ambrosie

(Ambrosia artemisiifolia), die als Auslöser allergischer Rhinitis, Konjunktivitis und des

allergischen Asthmas (Pollinosis) des Menschen bekannt ist (GOODFRIEND et al. 1979).

Aus den Pollen verschiedenen Gräsersorten [Wiesenrispengras (Poa pratensis), Weidelgras

(Lolium perenne)] isoliertes Cyto

pollenallergischen Menschen aus (EKRAMODOULLAH et al. 1981, 1982 & 1984).

Untersuchungen zum Nachweis spezifischer Serum-Immunglobuline erbrachten, dass das im

Serum von Pollenallergikern vorhandene IgE sowohl das komplette Cytochrom C detektierte

wie auch verschiedene, aus dem Enzym erhaltene Peptide. Auch aus den Pollen einiger

Baumarten (Plantago lanceolata, Echium plantagineum) wurde Cytochrom C isoliert, dass

durch IgE aus dem Serum pollenallergischer Menschen gebunden wurde (MATTHEWS et al.

zu

Wirkung

chrom C löste eine deutliche Intrakutanreaktion bei

144

Diskussion

1998). Beim Pferd, das zum Teil erhebliche Sensibilisierungen auf verschiedene

Pollenextrakte erkennen lässt (GEIBEN 2003), wurde eine allergene Wirksamkeit des

Cytochrom C bislang nicht nachgewiesen.

unde auf die Floh-Komponenten nicht korrelieren (GREENE et al. 1993;

ktive Antikörper zwar das denaturierte (positiver

Antikörper im Serum nachgewiesen werden. Die FIT-Ergebnisse für das Cytochrom C

Die funktionelle Charakterisierung des Cytochrom C mit Serum-Immunglobulinen im

Immunoblot zeigte, dass dieses potentielle Allergen durch ein vergleichbares Spektrum von

Antikörper-Isotypen detektiert wird wie die mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht allergen

wirksame Citratsynthase.

Es wurde bereits unabhängig von den vorliegenden Untersuchungen festgestellt, dass auch

nicht allergene Proteine aus Culicoides nubeculosus durch Serum-IgE und -IgG gebunden

werden (ALTHAUS et al. 2004). Auch bei Untersuchungen zu den Allergenen des

Katzenflohs wurde deutlich, dass die Ergebnisse des Imunoblots mit der Reaktivität

allergischer H

MCKEON & OPDEBEECK 1994). Die Erklärung für diesen Sachverhalt kann in der dem

Immunoblot vorangehenden SDS-PAGE liegen, in der Proteine stark denaturierenden

Bedingungen unterzogen werden (LAEMMLI et al. 1970). Es konnte zwar belegt werden,

dass nach Entfernen dieser Einflüsse im eigentlichen Immunoblot viele Proteine eine

Rückfaltung vollziehen, jedoch gelingt dies nicht in allen Fällen (TOVEY et al. 1987;

AALBERSE 2000). Möglicherweise wird die Struktur der Citratsynthase durch die SDS-

PAGE derart verändert, dass kreuzrea

Nachweis im Immunoblot), jedoch nicht das native Protein (negatives FIT-Resultat) binden

können.

Weiterhin konnte im Zuge der funktionellen Charakterisierung gezeigt werden, dass das

Cytochrom C durch die Serum-Immunglobuline von einem Großteil der untersuchten Pferden

mit und ohne Sommerekzem gebunden wird. In der Affinitätschromatographie (s. 4.3.3)

konnten aber nur mit IgE und IgG4 Komponenten aus Culicoides nubeculosus isoliert

werden, die eine Histaminfreisetzung im FIT lediglich bei einem Teil der ekzemkranken

Pferde induzierten.

Die Ursache liegt wahrscheinlich im Verhältnis von spezifischen Antikörpern zu ihrem

Zielprotein. Das isolierte Cytochrom C wurde den Immunglobulinen im Immunoblot in hoher

Konzentration (ca. 50 ng) angeboten. Damit konnten auch geringe Mengen spezifischer

145

Diskussion

wurden durch eine Proteinmenge ab etwa 500 ng pro Ansatz erhalten. Wenn die Zahl der

Serum-Antikörper mit Spezifität für das Enzym also gering war, konnte zwar ihr Nachweis

erfolgen. Es konnte jedoch keine affinitätschromatographische Isolierung des Cytochrom C in

einer Menge gelingen, die für eine positive Reaktion im FIT ausreichte.

.

kann die im FIT beobachtete Histaminfreisetzung auch durch kreuzreagierende

Antikörper, u. a. gegen Endoparasiten, andere haematophage Insekten oder Gräser- und

onslage des allergischen Individuums (Besatz der Effektorzellen mit

Einige Fraktionen, die im Rahmen der Reinigung des Cytochrom C und der Citratsynthase

gewonnen wurden, erwiesen sich im FIT als potente Aktivatoren der basophilen Granulozyten

von ekzemkranken Pferden

Aus vielen haematophagen Insekten, u. a. dem Katzenfloh und verschiedenen Moskito-

Spezies, konnten mehrere relevante Allergene isoliert werden. So lassen Untersuchungen des

Speichels der Moskito-Spezies Aedes aegypti vermuten, dass nahezu alle ca. 30 enthaltenen

Proteine allergen wirksam sind (PENG & SIMONS 2004). Auch für Culicoides spp. wird

angenommen, dass verschiedene Allergene für die Ausprägung des Sommerekzems

verantwortlich sind (WILSON et al. 2001). Ein deutlicher Hinweis, dass tatsächlich mehr als

ein Allergen beteiligt ist, konnte durch die Isolierung des Cytochrom C erbracht werden. So

reagierte zwar die Mehrheit der getesteten ekzemkranken Pferde mit einer

Histaminfreisetzung auf das Enzym, ein Teil jedoch nicht. Dagegen zeigten alle untersuchten

Pferde mit Sommerekzem eine deutliche Reaktivität im FIT beim Einsatz des GKE aus

Culicoides nubeculosus.

Sollte es sich bei dem Cytochrom C nicht um ein Allergen aus Culicoides nubeculosus

handeln,

Baumpollen vermittelt sein (vgl. S. 135, Absatz 2 & 3).

Zudem muss in Betracht gezogen werden, dass Fremdproteine für die beobachtete

Histaminfreisetzung verantwortlich sein können, die sich neben dem Cytochrom C in der

jeweiligen Fraktion befanden. Die Allergenkonzentrationen, die benötigt werden, um eine

Degranulation von Mastzellen und basophilen Granulozyten auszulösen, unterliegen der

individuellen Reakti

sensibilisierenden Antikörpern) und sind abhängig von der Art und Anzahl der eingesetzten

Allergene (Anzahl der Epitope, die durch die Antikörper kreuzvernetzt werden können)

(HUBY et al. 2000). Unter bestimmten Bedingungen können sensibilisierende Komponenten

bereits Mengen von < 1 ng eine Degranulation der basophilen Granulozyten auslösen

146

Diskussion

(HESELHAUS 2005). Es ist also theoretisch möglich, dass in den eingesetzten Fraktionen

des Cytochrom C weitere Komponenten enthalten waren, die in der ein- oder

zweidimensionalen Gelelektrophorese nach Silberfärbung nicht nachweisbar waren, jedoch

die Histaminfreisetzung im FIT induzierten.

Zusammenfassend handelt es sich bei der Citratsynthase wahrscheinlich nicht um ein

Allergen aus Culicoides nubeculosus. Ein Eintrag in das Pferd ist zwar möglich, und im

Immunoblot erfolgte eine B

Rahmen der equinen Typ-I-Allergie nachgewiesen ist. Als entscheidendes Kriterium muss

jedoch die fehlende Reaktivität des Enzyms mit den Effektorzellen der Allergie im FIT

gewertet werden.

Für das Cytochrom C kann dagegen von einer allergenen Wirksamkeit ausgegangen werden.

Es kann nicht nur auf verschiedenen Wegen ins Pferd gelangen und wird von Serum-IgE

gebunden, sondern induziert zudem bei der Mehrzahl der untersuchten Pferde mit

Sommerekzem eine Histaminfreisetzung aus den basophilen Granulozyten im FIT.

Um einen abschließenden Beweis für die allergene Wirksamkeit des Cytochrom C führen zu

können, ist eine rekombinante Expression und nachfolgende Charakterisierung des Proteins

notwendig. Die Vorausse

indung durch Serum-IgE, dessen sensibilisierende Funktion im

tzungen dafür wurden mit der umfangreichen Information über 41 %

der Aminosäuresequenz des Proteins geschaffen. Bei Bestätigung seiner allergenen

Wirksamkeit stünden mit dem rekombinanten Cytochrom C entsprechend große Mengen des

Proteins in konstanter Reinheit zur Verfügung, die für Diagnostikzwecke wie auch für

funktionelle Untersuchungen zur equinen Typ-I-Allergie genutzt werden können.

147

Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Das Sommerekzem des Pferdes:

Untersuchungen zu potentiellen Allergenen aus Culicoides nubeculosus

kten bestimmt werden, die in erster Linie der Gattung Culicoides (Gnitzen)

angehören.

mit dem

ioneller In-

vitro-Test (FIT) angewandt. Im FIT wird die Aktivierung sensibilisierter basophiler

Antigenstimulation anhand der Histaminfreisetzung erfasst. Es konnte festgestellt werden,

indest ein Teil der Allergene aus Culicoides nubeculosus hydrophil ist, über ein

hohes Maß an Stabilität verfügt und zur Substanzklasse der Proteine gehört. Die höchste

Reaktivität im FIT wurde durch Proteine der Molmassen zwischen 44 und 158 kD sowie

< 17 kD erzielt. Ein Großteil der Allergene ist basischer Natur.

2. Reaktivität von equinen Serum-Immunglobulinen und basophilen Granulozyten mit den

Komponenten des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus

Affinitätsgereinigtes IgE, IgG1 und IgG4 aus dem Serum von Pferden mit und ohne

Kathrin F. A. Langner

Das Sommerekzem stellt weltweit eine der häufigsten Typ-I-Allergien des Pferdes dar. Die

betroffenen Tiere entwickeln eine schwere Dermatitis, die sich vornehmlich an Mähne,

Widerrist und Schweifrübe manifestiert. Als Auslöser der Erkrankung konnten verschiedene

haematophage Inse

Die verantwortlichen Allergene aus den Gnitzen sind unbekannt, so dass eine Klärung der

grundlegenden regulativen Mechanismen des Sommerekzems und damit die Entwicklung

geeigneter diagnostischer und therapeutischer Maßnahmen bislang nicht erfolgreich war. In

dieser Arbeit sollten potentielle Allergene aus der in Deutschland am häufigsten

Sommerekzem assoziierten Gnitzenspezies Culicoides nubeculosus identifiziert und

charakterisiert werden.

Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

1. Bestimmung biochemischer Eigenschaften von Allergenen im Ganzkörperextrakt aus

Culicoides nubeculosus

Zum Nachweis der allergenen Potenz der Gnitzen-Komponenten wurde ein funkt

Granulozyten (neben Mastzellen die Haupteffektorzellen der Typ-I-Allergie) nach

dass zum

148

Zusammenfassung

Sommerekzem wurde zur Immunpräzipitation von Culicoides-Komponenten eingesetzt. Die

genannten Isotypen detektierten vorrangig Gnitzenproteine mit relativen Molmassen (Mr)

zwischen 15 kD und 55 kD. Das Bandenmuster der Komponenten variierte sowohl in

Abhängigkeit vom Isotyp al erde. Die equinen Immun-

globuline nten die

von den Antikörpern gebundenen G her Form isoliert und nachfolgend

nglobulinen reagierten ausschließlich die basophilen Granulozyten der

aphieschritt die erhaltenen Fraktionen im FIT und im Immunoblot

urden in der zweidimensionalen Gelelektrophorese und

Kombination eines starken Kationenaustauschers mit der Reversed-

icht auf das Enzym. Dagegen

e die beiden isolierten

s auch vom Allergiestatus der Pf

wurden weiterhin zur Affinitätschromatographie verwendet. Dadurch kon

nitzenproteine in löslic

im FIT hinsichtlich ihrer Reaktivität mit equinen basophilen Granulozyten untersucht werden.

FIT-positive Komponenten wurden sowohl durch das IgE ekzemkranker und gesunder Pferde

als auch durch das IgG4 der allergischen Tiere erhalten. Die Mengen der gewonnenen

Proteine reichten jedoch für weiterführende Untersuchungen nicht aus. Im Gegensatz zu den

Serum-Immu

ekzemkranken Pferde, nicht aber der gesunden Kontrolltiere, mit den Komponenten des

Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus bei der Untersuchung im FIT.

3. Isolierung potentieller Allergene des Ganzkörperextrakts aus Culicoides nubeculosus

Der Extrakt wurde durch flüssigkeitschromatographische Verfahren fraktioniert, bis einzelne

Proteine vorlagen. Um eine gezielte Reinigung potentieller Allergene zu erreichen, wurden

nach jedem Chromatogr

überprüft. Die gereinigten Proteine w

in der Massenspektrometrie hinsichtlich ausgewählter biochemischer Parameter

charakterisiert. Durch die

Phase-Chromatographie konnten zwei Kandidatenallergene isoliert werden, die als

Citratsynthase (Mr 46,5 kD; isoelektrischer Punkt (pI) 9,3) und Cytochrom C (Mr 14,6 kD;

pI 9,1) identifiziert wurden.

4. Funktionelle Eigenschaften der isolierten Proteine aus Culicoides nubeculosus

Die Citratsynthase induzierte im FIT keine Histaminfreisetzung aus den equinen basophilen

Granulozyten. Für das Cytochrom C konnte dagegen bei der Mehrzahl der untersuchten

allergischen Pferde eine Histaminfreisetzung aus den Zellen nachgewiesen werden. Die

basophilen Granulozyten der gesunden Kontrolltiere reagierten n

konnten im Immunoblot Antikörper der Isotypen E, G1, G4 und G5 im Serum von Pferden

mit und auch ohne Sommerekzem nachgewiesen werden, welch

Proteine detektierten.

149

Zusammenfassung

Schlussfolgernd ist für die Citratsynthase eine Beteiligung an dem durch Culicoides

nubeculosus verursachten allergischen Geschehen des Sommerekzems unwahrscheinlich. Im

Gegensatz dazu kann das Cytochrom C als ein potentielles Allergen aus den Gnitzen

angesehen werden. Für einen abschließenden Beweis der allergenen Wirksamkeit des Enzyms

ist eine rekombinante Expression mit nachfolgender Charakterisierung notwendig. Durch den

Vergleich der funktionellen Eigenschaften der beiden isolierten Proteine wurde deutlich, dass

beim Pferd die Bindung durch Serum-Immunglobuline alleine keine zuverlässige Aussage

über die allergene Potenz einer Komponente erlaubt. Neben dem Cytochrom C ist noch

mindestens ein weiteres Allergen an der Ausprägung des Sommerekzems beteiligt, da bei

allen getesteten ekzemkranken Pferden positive FIT-Resultate mit dem Ganzkörperextrakt aus

Culicoides nubeculosus erzielt wurden, jedoch nur bei einem Teil der Tiere mit dem

Cytochrom C.

150

Summary

7 Summary

Summer eczema of horses:

Studies on potential allergens from Culicoides nubeculous

Kathrin F. A. Langner

Summer eczema is one of the most frequent type I allergies in horses worldwide. Affected

animals suffer from severe dermatitis located primarily in the mane, withers and base of the

tail which leads to serious discomfort. Various hematophagous insects, in particular biting

midges of the genus Culicoides, are dominating causes of the disease.

The lack of knowledge about responsible allergenic components of midges hampers the

elucidation of essential regulatory mechanisms of this type I allergy and, thus, the

evelopment of suitable diagnostic and therapeutic regimes. This study describes attempts to

identify and characterize potential allergens of Culicoides nubeculosus, the major cause of

ummer eczema in Germany.

plished:

1. Biochemical characteristics of allergens in a whole body extract of Culicoides nubeculosus

as used to monitor allergenic components. The FIT

uantifies histamine selectively released from sensitized basophils (besides mast cells the

major effector cells in type I allergy) upon triggering with antigen. It was found that at least

ome of the relevant allergens are hydrophilic proteins and are remarkably stable to

egradation. Maximal FIT-activity was seen for proteins with relative molecular masses (Mr)

between 44 and 158 kDa and below 17 kDa. The majority of allergens were alkaline.

2. Reactivity of equine serum antibodies and basophils with components in a whole body

xtract of Culicoides nubeculosus

ffinity purified IgE, IgG1 and IgG4 from horses with and without summer eczema were

used for immunoprecipitation of components from Culicoides nubeculosus. Predominantly

proteins between 15 and 55 kDa came down. Their binding pattern varied depending on the

isotype and the allergy status of the serum donating horse. The different antibody isotypes

were further used for isolation of soluble components from whole body extract by means of

affinity chromatography. Isolated components were subsequently tested in the FIT. FIT

d

s

The following results were accom

A functional in-vitro-test (FIT) w

q

s

d

e

A

151

Summary

positive fractions were separated with IgE from diseased as well as from healthy horses and

with IgG4 from allergic animals. However, not enough material could be isolated for more

elaborate characterization of these components. In contrast to serum antibodies, exclusively

basophils from horses with clin a but not from healthy horses

recognized com

3. Isolation of potential allergens from a whole body extract of Culicoides nubeculosus

atures of the purified

ted proteins of Culicoides nubeculosus

amine release from basophils of any of the horses

tested in the FIT. Cytochrome c triggered histamine release by basophils of the majority of

sequent

functional characterization, are required to substantiate the allergenic potential. Comparison

allergenic potency of components. The fact that not every

ical signs of summer eczem

ponents in the whole body extract by means of the FIT.

Whole body extract of midges was fractionated by different liquid chromatography

procedures. In order to select potential allergens, peak fractions from each chromatography

step were monitored by FIT and by immunoblotting. Two dimensional gel electrophoresis and

mass-spectrometry were applied to determine some biochemical fe

proteins. Combining a strong cation exchange and a reversed-phase column revealed two

highly purified proteins subsequently identified as citrate synthase (Mr 45 kDa; isoelectric

point (pI) 9,3) and cytochrome c (Mr 15 kDa; pI 9,1).

4. Functional properties of isola

Citrate synthase was unable to induce hist

allergic horses tested. Cells from healthy animals failed to react with the enzyme. In contrast,

immunoblotting revealed that citrate synthase and cytochrome c were recognized by IgE,

IgG1, IgG4 and IgG5 serum antibodies from horses with and without summer eczema.

In conclusion, citrate synthase does not seem to be involved in summer eczema caused by

Culicoides nubeculosus. Cytochrome C, however, may be one potential allergen of these

midges. Further experiments, including recombinant expression of the protein and sub

of the functional properties of these two proteins documented that in the horse antibody

binding alone is not a criterion for

horse reacting positively with the whole body extract of Culicoides nubeculosus was FIT

positive with cytochrome c indicates that more than one allergen must be involved in the

induction of summer eczema.

152

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In

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Tagungsbeiträge und Veröffentlichungen

Erste Ergebnisse dieser Arbeit sind vorab veröffentlicht worden:

D

oides nubeculosus relevant to

21. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Parasitologie, Würzburg, 17. – 20.03.2004 38): 66

S. SCHLOTE, J. HESELHAUS, W. LEIBOLD (2004)

LANGNER, K.F.A., I. GREISER-WILKE, S. SCHLOTE, J. HESELHAUS, W. LEIBOL(2004) Isolation and initial characterization of a protein from Culicsummer eczema in horses.

In: Int. J. Med. Microbiol. 293 (Supplement

LANGNER, K.F.A., I. GREISER-WILKE,

Isolation and initial characterization of a major allergen from Culicoides nubeculosus relevant to summer eczema in horses. 7th International Veterinary Immunology Symposium, Quebec City, Canada, 25. – 30.07.2004

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Das Sommerekzem des Pferdes:

Untersuchungen zu potentiellen Allergenen aus Culicoides nubeculosus“ selbstständig

ut

le zur Verfügung gestellt.

- Die Materialien und Geräte für einen Teil der flüssigkeitschromatographischen Verfahren

Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und von Herrn Dr. Stephan Schlote

fügung gestellt. Desweiteren wurden die Materialien zur

Braunschweig zur Verfügung gestellt.

Die massenspektrometrischen Analysen wurden von Herrn Dr. Manfred Nimtz aus der

GbF Braunschweig, durchgeführt.

Diese Arbeit wurde in der Arbeitsgruppe Immunologie und im Institut für Virologie der

tiftung Tierärztliche Hochschule Hannover mit einem Stipendium der Graduiertenförderung

der Tierärztlichen Hochschule Hannover (07/02 – 06/03) und der Karl-Enigk-Stiftung (07/03

06/04) durchgeführt.

ie Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen

Zweck zur Beurteilung eingereicht.

h versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der

Wahrheit entsprechend gemacht habe.

F. A. Langner Hannover, 01.03.2005

verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

- Die Materialien und Geräte wurden von der Arbeitsgruppe Immunologie und dem Instit

für Virologie der Stiftung Tierärztliche Hochschu

wurden freundlicherweise von der Abteilung für Chemische Analytik und Endokrinologie

der

persönlich sowie von der Gesellschaft für biotechnologische Forschung (GbF) in

Braunschweig, zur Ver

Vorbereitung der Gnitzenproteine für die Massenspektrometrie von der GbF

-

S

–

D

Ic

Kathrin

Danksagung

Herrn Prof. Dr. Wolfgang Leibold danke ich für die Überlassung des Themas und die

Bereitstellung eines Arbeitsplatzes. Ferner danke ich ihm dafür, dass er mir die Freiheit

gewährt und das Vertrauen geschenkt hat, dieses Projekt selbständig zu bearbeiten.

beitsplatzes und

für ihren unermüdlichen Einsatz bei der Organisation von Material und Geräten, um die

Durchführung dieses P

kom

Problem

mit ihr viel Freude bereitet.

Her

End

die

dan enutzung seiner Geräte, auch nach seinem Schritt

d

Herrn Dr. Harald S. Conradt und Frau Susanne Pohl von der Gesellschaft für

mtz aus der GbF Braunschweig danke ich für die

massenspektrometrische Analyse der Proteine und seine geduldigen Erläuterungen zu dieser

Ein großer Dank gilt Frau Sonja Kordex, Frau Silke Schöneberg und Herrn Udo Rabe aus der

temporärer materieller Engpässe einen reibungslosen

Ablauf der Versuche ermöglichten.

ich bei Frau Dr. Frauke Regina Busse und Frau Ester Barthels aus

e bei

technischen Fragen.

Frau Prof. Dr. Irene Greiser-Wilke danke ich für die Bereitstellung eines Ar

rojekts zu ermöglichen. Ganz herzlich möchte ich mich für ihre

petente fachliche Beratung und ihre stete Bereitschaft zur Lösung kleinerer und größerer

e bedanken. Trotz oder gerade aufgrund ihrer direkten Art hat die Zusammenarbeit

rn Dr. Stephan Schlote, ehemals Zentrumsabteilung für Chemische Analytik und

okrinologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, möchte ich meinen Dank für

Einweisung in die flüssigkeitschromatographischen Verfahren aussprechen. Weiterhin

ke ich ihm für die jederzeit gewährte B

in ie Selbständigkeit.

biotechnologische Forschung in Braunschweig (GbF) gilt mein Dank für ihre Unterstützung

bei der Reinigung von Proteinen mittels HPLC-Technologie, der Vorbereitung der Proteine

für die Massenspektrometrie und ihre Diskussionsbeiträge.

Herrn Dr. Manfred Ni

Methode.

Arbeitsgruppe Immunologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, die stets mit

Rat und Tat zur Seite standen und trotz

Weiterhin bedanke ich m

dem Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, für ihre Hilf

Allen derzeitigen und ehemaligen Mitdoktoranden der Arbeitsgruppe Immunologie -

insbesondere Frau Julia Heselhaus, Frau Patricia Traub und Frau Dr. Anja Kathrin Wege -

Bei der Graduiertenförderung der Tierärztlichen Hochschule Hannover bedanke ich mich für

– und ohne sie wäre ich mit Sicherheit nicht so

weit gekommen. Für ihre Unterstützung in jeglicher Form möchte ich mich von ganzem

spreche ich meinen Dank für ihre Hilfsbereitschaft und für die angenehme Arbeitsatmosphäre

aus.

die finanzielle Förderung im ersten Jahr der Dissertation sowie bei der Karl-Enigk-Stiftung

für das Stipendium in der Folgezeit. Der Karl-Enigk-Stiftung und der Gesellschaft der

Freunde der Tierärztlichen Hochschule Hannover danke ich zudem für die finanzielle

Unterstützung bei der Teilnahme an Kongressen.

Schlussendlich ist die Familie das höchste Gut

Herzen bedanken.

„Wer höher steigt, wird weiter sehen.“

(Reinhard Karl)

Das Sommerekzem des Pferdes: Untersuchungen zu ... · PDF fileNomenklatur der Allergene ........

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