Eidgenössisches Volkswirtschaftsdepartement EVD Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux ALP...

Eidgenössisches Volkswirtschaftsdepartement EVDForschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux ALP

VTEC in Rohmilchkäse | Interlab-Kongress, München – 05.06.08J. Hummerjohann

VTEC in Rohmilchkäse – was nun?

5. Juni 2008Jörg Hummerjohann, Dr. sc.nat.

2 VTEC in Rohmilchkäse | Interlab-Kongress, München – 05.06.08J. Hummerjohann

Ausgangslage

• 2 Chargenrückrufe in D wegen VTEC in Schweizer Halbhartkäse (Schnittkäse) aus Rohmilch innerhalb 6 Monaten

• Keine Krankheitsfälle bekannt• „Normale“ E. coli nicht nachweisbar • Kein VTEC-Kriterium in EU VO 2078/2005• 2 Einträge im EU-Schnellwarnsystem RASFF

• 40 t Ware (inkl. Hartkäse) blockiert bei Grenzkontrollen nach Österreich


Inhalt

• VTEC: Einführung zu den Keimen, ihrer Pathogenität & ihrem Vorkommen in Lebensmitteln

• Diverse VTEC-Nachweis-Methoden

• Lebensmittelrechl. Beurteilungen und Differenzen im europäischen Vollzug

• Konsequenzen für Rohmilchkäse-Produktion

• Aktivitäten der Forschungsanstalt ALP


Wichtige Referenzen

• CRL VTEC: www.iss.it/vtec/index.php• EFSA Journal (2007) 579, 1-61 Monitoring of VTEC and identification of human pathogenic VTEC

types: Scientific opinion of the panel on biological hazards

• Kaper et al. (2004), Nature Rev. 2:123-140 • Karch et al. (2005), IJMM 295, 405-418• Bülte & Goll (2006): Escherichia coli und

Shigellen, Behr‘s Verlag, Hamburg


Pathogene E. coli: Begriffsverwirrung

STEC

VTEC

EPEC

EHEC

ETEC

DAEC

MNEC

UPEC

EAEC

O157:H7O26:H11

O136:H16

EIEC

stx1- & stx2+

eae-Gen


Verotoxin-bildende E. coli (VTEC = STEC)

+ Toxin

VT1 = Shiga-like toxin (Stx1) & VT2 (Stx2) aus: Caprioli (2006)

Verozellen-Kultur


EHEC sind eine spezielle Untergruppe der VTEC/STEC

Aus: Caprioli, CRL VTEC (2006)


EHEC binden durch Intimin/Tir an Darmepithelzellen und setzen Stx frei

Aus : www.bms.ed.ac.uk/


Eigenschaften von E. coli O157:H7- Prototyp der EHEC-

• hochpathogen; verursacht Ausbrüche seit 1982

• jährliche Inzidenz aller EHEC-Erkrankungen: ca. 1.4/100000 Einw. [Salmonella: 82/100000; RKI 2006]

• infektöse Dosis <100 Keime

• resistent gegenüber Säure und Einfrieren

• Glucuronidase-negativ (negativ auf TBX-Agar!)

• Spiking-Experimente: überlebt in streichfähiger Rohwurst und in Rohmilchkäse (Stiebing, 2000; Reitsma, 1996)

• Achtung: Punkte gelten nicht automatisch für alle VTEC


Aus: Caprioli (2006)


Gene für Intimin, Rezeptor und Sekretionssystem sind auf der LEE-Pathogenitätsinsel lokalisiert



Verlauf EHEC-Erkrankung

Aus : Gyles (2007) und RKI (2008)

Inkubationszeit: 2-10 Tage

• Mehrzahl: wässriger Durchfall• 10-20%: HC*• 5-10%: HUS* oder TTP*• Letalität HUS: 2%

•Auch Symptomlosigkeit!

*HC = hämorrhagische Colitis HUS = hämolytisch-urämisches SyndromTTP = thrombotisch-trombocytopenische Purpura


Verteilung v. VTEC O157 und non-O157 in EU

Aus EFSA (2007)


Symptome bei O157- und non-0157 Fällen & „Rangliste“ der Serotypen bei HUS


Einteilung in Seropathotypen nach Karmali:Basis für Risikobeurteilung durch EFSA und für CEN-Norm „Detection of VTEC in food“

O157 u.a. : es gibt auch nicht-toxigene IsolateO26: H11 (stx1+ & eae+) => oft nur milder DurchfallO26: H11 (stx2+ & eae+) => oft HUSO91:H21 => Obwohl eae-negativ HC/HUS möglich

=> Nie Serotypisierung ohne stx- und eae-Bestimmung


Einteilung in Seropathotypen: Suche nach dem einen (?) „magic predictive marker“

• alternative Einteilung nach stx2-Varianten (Scheutz & Strockbine, 2005; Friedrich, 2002) => Serotypen-unabhängig

• Screening nach neuen Pathogenitätsfaktoren,mittels Genomics z.B. Karmali (2003),Coombes (2008)

Seropathotypen-Konzept (EFSA, 2007):

„wertvoll“ „noch zu verfeinern“„Zurzeit nicht möglich, humanpathogene VTEC vollständig zu definieren“


VTEC: Reservoire & Transmissionsrouten

Aus: Gyles (2007)

• Auf Farmen und in Schlachthöfen wimmelt es von diversen VTEC in Faeces,in Umgebungsproben, auf Schlachtkörpern

• Rinder scheiden VTEC symptomlos aus

• Bis ca. 40% der Rinderkotproben positiv; O157 in CH nicht dominant

(Bülte & Goll, 2006; Fremaux et al. 2006)


Beispiele für VTEC-Ausbrüche

Oktober 2007 (www.ecoliblog.com):• 30 Personen erkrankt in 8 US-Bundesstaaten, 0 Tote• Rückruf von 9000 t gefrorenen, rohen Hamburgern• Fabrik geschlossen (81 Pers. entlassen)

Land Vektor Serotyp D/HC HUS/TTP Tote Ref. USA Hamburger O157:H7 25 0 0 Riley, 1983 CDN Badewasser (See) O157:H7 37 3 0 Bruce, 2003 USA Kontakt mit Rindern O157:H7 51 8 0 CDC, 2001 CDN Pflegeheim; person-to-

person; Sandwiches O157:H7 73 12 17 Carter, 1987

AUS Mettwurst O111:H- k.A. 23 1 CDC, 1995 JPN Schulmahlzeiten:

Sprossen O157:H7 6561 101 2 WHO, 1996

DE Mortadella; Teewurst SF O157:H7 k.A. 45/28 7/3 RKI, 1996 Ammon, 1999

SCO Past. Milch O157 >100 9 0 Upton, 1994 DE Rohmilch (Ferienlager) O80:H-; O145 59 1 0 RKI, 2008


VTEC-Ausbrüche durch Rohmilchkäse

• seltener als bei Fleischprodukten• klassische EHEC dominieren• Käsetyp & Umstände leider oft unklar• Tendenz: Frisch/Weichkäse

Land Käse Serotyp D/HC HUS/TTP Tote Ref. CDN Gouda O157:H7 13 2 0 Honish, 2005 SCO „farm cheese“ O157 22 1 0 Rampling

1996 FRA Frischkäse

(Ziegenmilch) O103 ? 4 0 Decludt, 1995

FRA Ziegen/Kuhmilchkäse ? (VT2) ? 4 0 Deschenes, 1996

FRA Frischkäse (Ziegenmilch)

O157 3 2 0 Espie, 2006

FRA Camembert O26 6 ? 0 Mercer, 2005 DE Rohmilchkäse ? 3 (Enter.) 0 0 Bockemühl,

1995


Fallkontrollstudie sporadischer VTEC-Erkrankungen in D: Werber et al. 2007

• 202 Fälle (Median: 2.5 J.); 5 Fälle mit HUS (3x O157); 85% VTEC non-O157 • Risikofaktoren für Kinder < 3 J.:

• Kontakt zu Wiederkäuern, wichtigster Faktor (OR=9.3)• Spielen im Sandkasten (OR = 2.6)• Konsum von Rohmilch (OR = 6.9; einziges „Lebensmittel“)

• Risikofaktoren für Kinder zwischen 3 und 9 J.• Spielen im Sandkasten (OR = 9.0)• „Privates“ Baden in Seen, Planschbecken etc (OR = 3.8)

• Risikofaktoren für Personen >10 J.• Konsum von Lammfleisch (OR = 14.1)• Konsum streichfähiger Rohwürste (OR = 3.2)

Schlussfolgerungen: • Direkte Übertragung durch Lebensmittel spielt für Kinder <3 J. (grösstes Risiko für VTEC-Infektion und HUS) eine geringe Rolle • Grosses Potenzial für Prävention (Händewaschen, kontr. Tierkontakt, Lm etc.)


Epidem. Daten zu EHEC in CH, 1996 -2006:

Beobachtungen (Baumgartner & Schmid, 2008):• Auslandsreise (62.7% der Fälle mit bekanntem Aufenthaltsort)• Wohnen in ländlicher Umgebung• Fäkal-kontaminiertes Trinkwasser• 24 HUS-Fälle im Sommer 2003: Badegewässer etc.• HUS durch ungenügend erhitztes Fleisch & Genuss von Rohmilch

Empfehlungen zur Prävention: • Keine Rohmilch trinken (Rohmilch gilt in CH als nicht genussfertig)• Regeln zum Umgang mit rohem Fleisch beachten• gute individuelle Hygiene, bes. auf Auslandsreisen• Personen mit Durchfall dürfen keine Lebensmittel zubereiten


Bestimmung von VTEC in Lebensmitteln (D)

25g Lm & Anreicherung & Ausplattierung

stx-PCR

Koloniehybridisierung

Isolat: biochem. Bestätigung Kein Isolat

+ -

• nach: § 64 LFGB, L 07.18-1:2002 für Hackfleisch & Umgebungsproben• auch: § 64 LFGB, L 00.00-92:2006 (DIN 10118:2004) für alle Lebensmittel, mit Toxinnachweis & Immunoblot

Vorteil: detektiert Virulenzfaktoren unabhängig vom SerotypNachteile: z.T. sehr niedrige Isolationsraten; Gene ≠ ToxineAchtung: Toxinnachweis mit induzierten Kolonien und nicht direkt im Käse wie bei SET

+

„VTEC nicht nachweisbar“„VTEC nachweisbar“


VTEC-Nachweis in Milch und Milchprodukten

• i.d.R. seltener als bei Fleischprodukten• Stephan, 2007: nur Seropathotypen C-E, keine eae+ - Stämme, v.a. Produkte aus Hofverarbeitung & Alpkäsereien, aber auch aus Gewerbe

Land Produkt Anzahl O157 (%) VTEC (%) Ref. DE Rohmilch 127 0.8 3.9 Klie, 1997 DE Rohmilch-Weichkäse 72 0 2.8 Teufel, 1998 DE Rohmilchkäse 267 0 0.7 Bülte, 2001 FR Rohmilch 205 *4.8 (EHEC) *21% Perelle, 2007 FR Rohmilchkäse 1039 0 1.7 Vernozy-Rozand,

2005 CH Rohmilch 110 0 *6.4 Svoboda, 1999 CH Rohmilchkäse 405 0 1.2 Stephan, 2007

* PCR-Nachweis ohne Keim-Isolierung


Differenzen zwischen VTEC-Isolaten aus Lebensmitteln und Patienten

• starke Heterogenität & versch. Serotypen in 1 Probe; häufig Zugehörigkeit zu den Seropathotypen C-E

• VTEC von HUS-Patienten (n=6) können auch mehr zytotoxisch als bovine Isolate von ident. Serotyp sein (Pradel et al, 2000)

• Nur 1.8% EHEC O26, O103, O157 in Lebensmittel, dagegen dominant in STEC-infizierten Patienten und eae-Gen in ca. 90% der HUS-Isolate (v.a. Kinder) und 5% der Lebensmittelisolate (Bülte & Goll, 2006; Beutin et al 2007)

• Ca. 50% der Isolate mit stx2/stx2d (davon 83% in Rindfleischproben) und Serotypen mit bekannten human-pathogenen Stämmen, zeigen Pathogenitätspotenzial auf, auch in Rohmilch (Beutin et al. 2007)

Bestätigt Werber et al (2007): Lebensmittelübertragung spielt für Kinder <3J eine begrenzte Rolle und (Rind-)Fleischprodukte sind am kritischsten


Differenzen zwischen VTEC-Isolaten aus Lebensmitteln und Patienten

Serogruppenzugehörigkeit & Virulenzaustattung zeigen Unterschiede zuhumanen EHEC-Stämmen, typische EHEC werden selten isoliert(Pradel et al. 2000; Bülte, 2001; Beutin et al 2007)

Hypothese (Bülte & Goll, 2006): „Auch wenn bislang nicht sicher bekannt ist, welche Eigenschaften einen VTEC- Stamm humanpathogen werden lassen, […] ist nur eine Subpopulation der VTEC als potenziell humanpathogen anzusehen“


VTEC-Methoden und Lebensmittelkontrolle (übrige EU)

Land Offizielle Lm-Kontrolle

Offizielle Methode Ausbruch durch Rohmilchkäse

Anmerkung

FI N J: stx-PCR k.A. IT N N N Monitoring für O157 SE N N J SP N N N Kontrollen bei Ausbruch (O157) UK J J: mod. O157-Norm J Rückrufkriterium: Isolat & stx+ &

Phage- & Serotyp FR N N J VTEC-Monitoring;

(afssa-Empfehlung: Perelle, 2007) IR N N ? CZ N N N O157 (ISO) ist Norm NE J J (stx-PCR & Isolat &

Serogruppe ) N Rückruf, falls O157 & stx+

Plan: Ausdehnung auf andere VTEC CH N N N Monitoring, Kontrollen bei Ausbruch DE J J J Auch Monitoring

Umfrage während CEN/TC275/WG6 „Food microbiology“Meeting in 7.-9.5.08, Helsinki


Differenzen zwischen VTEC-Methoden und Resultat-Interpretation: (1) Frankreich

Aus: Perelle et al, 2007 (afssa-Methode, nicht im Vollzug eingesetzt)


Differenzen zwischen VTEC-Methoden und Resultat-Interpretation: (2) Deutschland

25g Lm & Anreicherung & Ausplattierung

stx-PCR

Weitere Charakterisierung: RKI

Koloniehybridisierung

Isolat: biochem. Bestätigung Kein Isolat

Chargenrückzug

+ -

• nach: § 64 LFGB, L 07.18-1:2002 für Hackfleisch & Umgebungsproben• auch: § 64 LFGB, L 00.00-92:2006 (DIN 10118:2004) für alle Lebensmittel, mit Toxinnachweis & Immunoblot

„Potentieller EHEC“

Keine Beanstandung


Begründung & Ablaufschema Rückruf

„alle VTEC = potentielle EHEC “ (BgVV 2001)

Probe unsicher und geeignet, die Gesundheit zu schädigenArt. 14 Abs 1, 2a und 6 der VO (EG) Nr. 178/2002

Chargenrückzug => Möglichkeit zur Gegenanalyse falls ungenügend => Chargenrückruf

Eintrag in europ. Schnellwarnsystem (RASFF)


Beispiel Schnittkäse-Isolat, welches im April 08 zum Rückruf führte

• Serotyp: O136:H16 => Macht dieser Keim krank?• Pathogenitätsfaktoren:

stx1:-stx2:+ => stx2 kann mit HC/HUS assoziiert seineae: - => Kein klassischer EHECe-hly: -

Bovines Isolat, noch nie aus Patienten mit Durchfall oder HUS isoliert (Blanco et al, 2004; Midgley et al, 1999)

Seropathotyp 5 (bislang ohne Hinweis auf Humanpathogenität)


Entwurf: VTEC-Referenzmethode der EU

• CEN/WG6

• Projektleitung: S. Morabito (IT, CRL VTEC) und J. Boel (DK)

• Prinzip von Perelle et al (2007) übernommen, Änderungen:

• Anreicherung mit Novobiocin

• alles mit real-time PCR: (1) stx & eae; (2) Seropathotypen A & B

• offen für „neue EHEC“ (Beachtung der Populationsdynamik)


Entwurf: VTEC-Referenzmethode der EU

Mögliche Resultatangaben (ohne lebensmittlrechtl. Interpretation):

Verbindliche lebensmittlrechtliche Interpretation würde dann ineinem neuen mikrobiol. Kriterium der VO (EG) 2073 erscheinen.


Wichtige Aussagen von EU-Gremien zu VTEC: (1) SCVPH (2003)

• Verwirrende Terminologie zur Definition humanpathogener VTEC führt Interpretations-Schwierigkeiten bei Prüfberichten

• Nur ein kleiner Teil aller VTEC-Isolate aus Tieren, Lebensmitteln und Umwelt ist humanpathogen

• Analyse auf VTEC O157 führt wahrscheinlich nicht zu einer bedeutenden Verringerung des Risikos für den Verbraucher

• Mikrobiolog. Leitlinien zu Verringerung der Fäkalkontamination entlang Lebensmittelkette könnten dazu beitragen

• Lm-Kategorien: rohes Rindfleisch, Hackfleisch, Rindfleischerzeugnisse, Rohmilch und Rohmilcherzeugnisse, Frischerzeugnisse bzw. Rohkost (bes. Sprossen & nicht-past. Säfte)

Aus: Hatakka, 2006


Wichtige Aussagen von EU-Gremien zu VTEC: (2) EFSA (2006)

• Vollständige Definition humanpathogener VTEC z. Zt. nicht möglich

• Konzept „Seropathotypen“ wichtig für zukünftiges Risk Assessment; Konsensus der Definition suchen (CRL VTEC u.a.)

• Hauptvirulenzfaktoren : stx1, stx2, stx2c, eae (kein Konsens zu Charakt.)

• qualitative & quantitative VTEC-Standards sollten entwickelt werden

• „Gute Hygiene Praxis“ (Schlachthöfe & Lm-Produktion) ist effektivste Methode zur Veringerung dess VTEC-Gesundheitsrisikos. Indikatoren: Enterobacteriaceae & normale E. coli

• ausserdem: Anwendung effizienter validierter HACCP-Prozeduren

• Monitoring: starten mit O157, dann weitere wichtige Serogruppen


Massnahmen zu VTEC in der CH

„Runder Tisch“ bei ALP: Treffen von Gesundheitsbehörde, Kant. Vollzug, Käseexporteur, Käseproduzent, Milchwirtschaftl. Berater, Labor-Fachleute

• offenes Gesprächsklima

• VTEC als Krankheitserreger ist sehr ernst zu nehmen

• Epid. Impact in CH durch Rohmilchkäse z.Zt. nicht relevant

• vorerst keine Änderung der Mikr. Kriterien & Lm-Kontrolle

• bei Ausbruch nachweislich durch Rohmilchkäse: evtl. Revision

• VTEC-Monitoring beibehalten

• Betriebliche Massnahmen treffen


Massnahmen zu VTEC in der CH

• Sensibilisierung der Käseproduzenten eingeleitet

• Betriebs-Analysen • Produktspez. Analysen (Hhk A ≠ Hhk B)• Massnahmen getroffen

• Miteinbezug der Rohmilchproduzenten sehr wichtig

• Vollzug bedauert, dass die Tolerenzwerte für E. coli in Käse wegen neuer HyV (Anpassung an 2073/2005) nun fehlen:

• 1000 KBE/g in Halbhartkäse• 10 KBE/g in (Extra)Hartkäse


Halbhartkäse-Technologie führt zu keiner sicheren Abtötung von Pathogenen (bekannt)

Listeriamonocytogenes

0

1

2

3

4

5

6

7

Har

tkäs

e (

log

cfu

/ m

l, g

)

Hartkäse

Halbhartkäse

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Hal

bh

artk

äse

(lo

g c

fu /

ml,

g)

Milch Bruch Käse Käse Käse Käse Käsenach 1 d 7 d 30 d 60 d 90 d

Brennen

S. aureus

Staphylococcus aureus

E. coli

Salmonellen

Bachmann, 1995


Stufenkontrollen in 2 Halbhartkäse-herstellenden Betrieben auf E. coli

10

100

1000

10000

100000

1000000

Kessimilch Bruch vorAusrühren

Käse vor Salzbad KonsumreiferKäse

E.

coli

(K

BE

/g)

Betrieb A

Betrieb B

Betrieb C

Betrieb C:Daten fehlen

Wichtigkeit Kessimilchqualität & des Prozesshygiene-Monitorings


Was macht die Forschungsanstalt ALP bzgl. VTEC?

Sensibilisierung der Branche: Information an Verband der gewerblichen Käsereien über VTEC und vorbeugende Massnahmen gegen VTEC in der Käsefabrikation (E.Jakob):


Was macht die Forschungsanstalt ALP bzgl. VTEC?

• „Runden Tisch“ von Behörden & Praxis weiter pflegen

• Angebot VTEC-Analytik für Milchbranche:• z.Zt. VTEC-Schnellmethode Duopath (Merck)• Ziel: EU-Referenzmethode VTEC

• Durchführung Intensivmonitoring (E coli, VTEC, etc)

• Plan: Versuchskäse, Überleben von VTEC in Halbhartkäse• Labor Spiez (Armee; Biohazard-Problematik)• Vergleich VTEC-Isolate aus Käse & O157

• Beratung betroffener Betriebe & Weiterbildung Regionalberater

• Modellrechnungen (risk assessment)

• Symposium „Mikr. Qualität von Rohmilchkäse“ (www.safeconsortium.org)


Zusammenfassung und Ausblick

• Definition humanpathogener VTEC ist schwierig• Die Mehrzahl der Lebensmittel-Isolate gehören nicht zu den klassischen EHEC (Seropathotypen A & B), sondern zu den Seropathotypen C – E (nicht-humanpathogen über leichtem Durchfall bis HC/HUS)

Einfluss auf verwendete Methoden, Resultat-Interpretation und und lebensmittelrechtliche Beurteilung (bleibt schwierig)

mehr Forschung ist notwendig, um Pathogenitätsdifferenzen v.a. der Seropathotypen C-E zu erklären (Marker, Säureresistenz, etc)

Konzept der Seropathotypen von EFSA (2007) prinzipiell anerkannt und Basis für kommende EU-Referenzmethode für VTEC

Einheitlicher lebensmittelrechtlicher Vollzug auf Basis der kommenden CEN-Norm und eines noch zu definierenden mikrobiol. Kriteriums „VTEC“ wäre grundsätzlich möglich und ist erstrebenswert


Zusammenfassung und Ausblick

• Rohmilchkäse kann zu VTEC-Erkrankungen führen

• Der epidemiologische Impact dieser Kategorie spielt im Ggs. zu anderen Lebensmitteln (Rohmilch; Fleischprodukte) und anderen Übertragungsvehikelneine begrenzte Rolle (bes. für die HUS-anfälligen Kleinkinder)

• Milchlieferanten und Käseproduzenten müssen dennoch VTEC sehr ernst nehmen und sich kontinuierlich um eine hohe Qualität der Rohmilch und der Produktionsabläufe bemühen

• Die Forschungsanstalt ALP leistet ihre Beiträge dazu


Zum Schluss ein persönliches Statement

und

Eidgenössisches Volkswirtschaftsdepartement EVD Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux ALP...

Documents

Transcript of Eidgenössisches Volkswirtschaftsdepartement EVD Forschungsanstalt Agroscope Liebefeld-Posieux ALP...