Kurze Originalmitteilungen

(Institut fur Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena. der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin,

Direktor: Prof. Dr. med. H. KNOLL)

Eignung von Esterase-Mustern als taxonomisches Kriterium bei Actinomyceten

JUTTA MEYER

(Eingegangen am 23. 6.1969)

Der Gedanke, die Gelelektrophorese als analytische Methode in der mikrobiolo- gischen Taxonomic anzuwcnden, ist, wie die zahlreiche Literatur des letzten Jahrzehntes zeigt, nicht neu. Folgende Gattungen wurden auf ihre Protein- und/ oder Esterase-Muster und deren mogliche Brauchbarkeit als taxonomisches Kriterium untersucht : Streptococcus ( LUND 1965), Mycobacterium (CANW u. WILLOX 1965, CANN et al. 1966, NAKAYAMA u. TAKEYA 1967), Corynebacterium (ROBINSON 1966), Microbacterium (ROBINSON 1966), Streptomyces (GOTTLIEB u. HEPDEN 1966), Bacillus (BAILLIE u. NORRIS 1963, BAILLIE u. WALKER 1968), Mycoplasma (RAZIN 1968), Pusarium (HALL 1967) u. a. Alle Autoren kommen zu dem SehluB, dalS die Gelelektrophorese in den gepriiften Gattungen taxono- misch brauchbare Ergebnisse liefert.

Bei kritischer Beurteilung der Arbeiten kann man sich dieser Meinung nicht in allen Fallen anschlieBen, besonders da die gezeigten Zymogramme bzw. Elektro- phorese-Diagramme z. T. eine solche SchluBfolgerung nicht stiitzen. Sie zwingen vie1 eher zum Zweifel an der taxonomischen Brauchbarkeit, wenn z. B. die man- gelnde Reproduzierbarkeit von Protein-Mustern nicht nur beim Vergleich meh- rercr StBmme einerArt, sondern auch bei einund demselben Stamm in hintcr- einanderfolgenden Versuchen sichtbar wird.

Zicl der vorliegenden Untersuchungen war zu priifen; ob im Bereich der Actinomycetales Enzym-Muster nachgewiesen werden konnen, die gattungs- differenzierend sind. Dabei wurde der Elektrophorese von Esterasen an Poly- acrylamid der Vorzug gegeben, da sie methodische Vorteile durch die einfachr Gel-Herstellung, Reproduzierbarkeit der PorengroBe, Transparenz und Stabili- t a t der Gele bietet. Nach BAILLIE u. WALKER (1968) ist aul3erdem der Esterase- Nachweis im Vergleich zur Protein-Elektrophorese wesentlich empfindlichrr.

Es wurden Actinomyceten-Extrakte von 32 Stammen getestet, die zugleich Vertreter von 12 verschiedenen Actinomycetales-Gattungen darstellen: Streptomyces albus ATCC 3004’), S. griseus NCIB 8232, 8. olivaceus NCIB 8238, 8. virido- chromogenes ATCC 3356, S. hirsutus ISP 5095, 8. fradiae ATCC 10745, Streptoverticillium cinnarnoneum ATCC 11874, S. biverticillaturn INA 11 189, 8. spec. IMET 756, Chainia poonensis RIA 563, Actinopycnidium caeruleum RIA 729, A ctinosporangium violaceum RIA 655, - ~ ~ . . ~~

l) Herkunft der Stamme vgl. PRAUSER und FALTA 1968. 45 Zcitschrift f . Allg. hlikrobinlogie, Bd. 9, H. 6

652 JVTTA JIEYER

Nicroellobosporia flaeea IMRU 3857, ,If. ciolaceo IJIET 188, Nocardia jirrcinica ATCC 3318, S. asteroides ATCC 3308, X. corallinu ATCC 4273, N . opaca ATCC 4276, S. polychromogeikes CBS, S. calcnren SCIB 8863, S. petroleophila P. HIRSCH Stamm-Sr. 102, S. furbnfa-Gruppe I X E T 7006. nocardioforme St.amme lMET 7801 und

Actinorncrdura spec. RG 1091. A . spec. RC: 1136, ~4ctinonzndurn-Gruppe IMET 486-28 und

Nycobacteriuvz srneginatis IMET SG 346, ,If. ueium IMET B 116, Prornicronzonospora citrea RIA 562, Micromonosporn fuscu RIA 472.

Die Anzucht der Stamme erfolgte in Schuttelkultnren (20 m1/100 ml Kolbchen) auf dem Dextrose-Pepton-Medium 79 (PRAESER u. FALTA 1968). Inkubation je nach Wachstums- intensitat 48 Std. bis max. 10 Tage. Die Sribmerskulturen wurden mit Formalin abgetotet, zentrifugiert und der Jlycelriickstand 3mal mit aqua dest. gewaschen. Fiir die Herstellung des zellfreien Extmktes wurde das Jiycel mit einer geeigneten llIenge Ballotini vermischt und im Vibrationshomogenisator (Akadeniie-IYerkstatten, Berlin) homogenisiert. Ballotini und Zelltriinimer wurden bei niedriger Umdrehungszahl/niin abzent,rifugiert. Reinigung der Rohextrakte erfolgte durch Zentrifugieren in der V,%C 40 bei 20000 U/min (= 40000 g) und anschlieRender Lyophilisation. Fiir die Elektrophorese nurden 20 mg des lyophil ge- trockneten Extraktes in l nil aqua dest. gelost und jeweils 0,2 ml der Probelosung auf das Gel aufgetragen. Die Durchfuhrung der Elektrophorese erfoigte nach dem ,,Disc-Prinzip" von ORYSTEIN 11. DAVIS (modif. nach REICH 1966) in Glasrohrchen (10 cm lang, 0,5-0,6 cm 0) mit 7qbigem Trenngel. Bnch beendeter Polymerisation wurde 0,2 nil Probelosung auf-

getragen und niit 40ohiger Saccharoselosung uberschichtet, um ein Verdiinnen der Probe- losung durch den Elektrodenpuffer zu vermeiden. Elektrophorese-Bedingungen: 90 min/ 160 V/12 mA; 90 min/l75 V/14 niA; 90 min/l80 V/l5 mA; 90 min/l9O V/15 m a .

652-48,

IMET 485-7,

Xach Beendigung der Elektrophorese wurden die Gel-Saulen fur die Darstel- lung der Esterasen mit Farbstofflosung ubcrflutet. Der Nachweis erfolg-t nach dem Prinzip der Azofarbstoffmethode : Bei Einsatz eines eatsprechenden Sub- strates (z. B. Chloressigsaureest~er von Saphtholderivaten) spaltet das nachzu- weisende Enzym bei bestimmter Teniperatur- und pH-Einstellung den Ester in einen Kaphtholring und Essigsaure. Der Inkubationslosung wird gleichzeitig ein Diazoniumsalz (fast blue salt B oder BB) zugesetzt, das mit dem freigesetzten Xaphthol untcr Bildung eines wasserunloslichen Azofarbstoffes reagiert. Nach 10 min bis max. 2 h bilden sich, entsprcchend der Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen Esterasen, einzelne oder nielirerc dunkelrote bis rotbraune Banden.

Zusamniensetzung des Gels, des Puffers und der Farbstofflosirng: 1. derylamid-Stanimlos~ing : 20:O g Acrylamid, 0,75 g Bis-Rlethglacryiamid, ad 100 ml

aqua dest. 2. Tris-Glycin-Puffer (nach DATIS. konz.) : 6.0 g Tris-(oxymethy1)-aminomethan, 28,s g

Glycin. ad 1000 tnl aqua dest., pH 8.3-8.5. Dieser sogenannte ,,konz. DAVIS-Puffer" wird fiir die Fiillung der Elektrodenkamiiiern 1 : 10 verdiinnt.

3. Trenngel 7 O A : 0 3 nil konz. DAvrs-Puffer, 1.2 nil aqua dest., 2,0 ml dcrylamid-Stamm- lijsung. 5 p1 Tenied (= Tetramethyl~th\.lenrliamin)~ 4.0 ml Ammoniumpersulfatlosung (0.14 g (SH,),S,O,, ad 100 ml aqiia dest.).

4. Substrat-Farbstoff-Losung: 50 nil Tris-maleat-Poffer 0,l 31, pH 6,4, 2.0 nil 10/ba-Saph- thyl-acetat in 50(jo Aceton, 50 nig ..Fast blue salt'. B oder BB.

Die A-lbl). 1-4 z e p n enie =\nsn ah1 tlcr iuitersuchtcn Stamme und dcren Estciasc-JLuster

Zunnchst niulJ festgestellt 15 riden. tlaR w i e Gattungsspczifitkt der Banden iiicht I orliept ITeItieter einer Chttung 1ial)en unterscliiedliche Muster hinsicht- lich drr Zahl der Bancleii und der \~-anclerungsgesclla indigkcit F u r eine Art- spezifitat der Estcrasen gibt es \\ ie Abb 3 Lint14 zeigen, gewisse Anhaltspunkte ;

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Abb. 4. a) 90 min/175 V/l

Schalterstellmlg A4; c) 90 min/175

Esterase-Muster bei Actinomyceten 655

jedoch reichen diese bei der geringen Zahl von getesteten Stammen und Artcn nicht aus, um die Anwcndung der Methode als taxonomisches Kriterium zu enipfehlen. Bei Parallelversuchen mit gleichen Gel- und Probenchargen sind z. T. erheblichc Abweichungen im Enzym-Muster crkennbar. So rufen geringe Schwankungen in den elektrophoretischen Versuchsbedingungen bei gleichen Ausgangswerten offensichtlich nicht nur eine veranderte Wanderungsgcschwin- digkcit, sondern auch eine verandcrte Trennschiirfe hervor. Zieht man auBer- dem in Hetracht, daB das Enzym, da es gereinigt bzw. angereichert wcrdcn mu13, durch die Lyophilisation einen erheblichen Aktivitatsverlust erleiden kann, ergibt sich cine weitere Qucllc fur Schwankungen im Enzym-Muster. Weiter- hin haben, \vie CANN et al. (1966) zeigen, auch die Art der Vorkultur, das Alter der Organismcn sowie die Priiparation des Extraktes EinfluB auf die spezifi- sche Ausbildung des Enzym-Musters. Allc gcnannten Faktoren setzen der An- wendung dcr Elektrophorese von Esterasen als Routine-Met,hode - das muBte sie als taxonomisches Hilfsmittcl in gewissem Grade sein - enge Grenzen.

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