Zeitschrif~ fiir die gesarnte experimerltelte Medizin 139,438--445 (1965)

Aus der Abteilung ffir Nedizinische Physik an der Universit~ts-Hautklinik Giel]en (Leiger: Prof. Dr. R. HEt~RsIa~ ~)

Eine Methode zur flammenspektrophotometrischen Serum-Rubidium-Bestimmung*

Von

WALTER LANO

(Eingegangen am 11. Mai 1965)

Beim Menschen sell das Element Rubidium in Spuren unter 0,0016% bis herauf zu 0,006% weiter verbreitet sein als Mangan und fast ebenso allgemein wie Kupfer auftreten; es kommt besonders in Mn-armen Ge- weben und am meisten im Herzen und in gestreiften Muskeln vor 1. LVNDEGARDK U. BERaSWRAND 6 fanden flammenspektrometrisch in der mensehliehen Leber bis zu 15,4 mg Rb je Ki logramm Frisehgewieht. Es ist bekannt, dab das Spurenelement Rb (ebenso wie Cs) das Element Ka- lium funktionell vertreten kann 1. Rubidium wird im Gehirn teils in Spu- ten, teils in gr613eren Mengen his zu 2 - -4 rag-% gefunden 9. Radioaktives Rubidium (S6Rb) wird naeh ZIPSE]~ u. F~EED~ERC 11 yon t l i rntumoren starker autgenommen als von normalem ttirngewebe. Weitere Angaben der Rubidiumgehalte in organisehen Substanzen finder man bei SHELDO~ u. RAM~-GE 9.

F/Jr routinemi~gige Rubidiumbest immungen erseheint die Flammen- Spektr~lanalyse wegen ihrer Empfindliehkeit, Sehnelligkeit und Einfaeh- heir bei den Alkalielementen besonders aussiehtsreieh. So ist es nieht verwunderlieh, dab bereits im Jahre 1934 LU~D~GAt~D~ U. BERGSTRA~D a U.a. Rubidiumanalysen in groger St/iekzahl in versehiedenen biologi- sehen Materialien durehgeffihrt haben. Der Vorteil der damals angewand- ten Flammenspektrographie (mit Photoplat te!) bestand darin, dab mehrere Elemente gleiehzeitig best immt werden konnten; der Naehteil gegenfiber modernen photoelektrisehen Melt- und Auswerteverfahren be- stand in dem gr6Beren Zeit- und Apparateaufwand. Wit haben deshalb mit den inzwisehen verffigbaren modernen photoelektrisehen Hilfsmit- teln eine flammenspektrophotometrisehe Methode ffir Rubidiumanalysen ausgearbeitet. Die routinems Serum-Rubidium-Analyse dfirfte im klinisehen Labor die h6ehsten Anforderungen an das Rb-t/estimmungs- verfahren stellen, da naeh I-II~SBEgO U. LA~G a in normalem Serum der t~ubidiumgehMt nut 50--200 y-~ betrs Die im folgenden angegebene

* Unterstfitzt aus Mitteln der Deutschen Forsehungsgemeinsehaft.

Flammenspektrophotometrische Serum-Rubidium-Bestimmung 439

Serummethode ist mit geringffigigen Abgnderungen - - wie etwa vor- herige Veraschung der Proben - - auch fiir Rubidiumanalysen in 0r- ganen oder anderen KSrperfliissigkeiten geeignet. Wegen der hSheren gb -Konzen t r a t i onen in den Organen kann dann eine wesentliche Ver- besserung der Best immungsgenauigkei t gegeniiber der unten mitge- teilten Serummethode erzielt werden.

Meltanordnung Die Meftanordnung ist die gleiche, die bereits 5 ffir die Serum-Lithium-

Bes t immung beschrieben wurde. Deshalb sol1 hier nur kurz zusammen- gefaBt werden: Die Anregung der Rb-Emission erfolgt mit einer turbu- lenten Wasserstoff-Pre$1uft-Flamme. Die StrahIung wird mit dem Glas- pr i smenmonochromator , ,Uvispec" der Fa. Hilger u. Wat t s spektral zer- legt und f/illt auf den l~CA-Photomultiplier 1 P28. Der Pho tos t rom wird mit dem RShrenelektrometer 610A der Fa. Kei thley nachvers tgrk t und yore Linienschreiber ,,Mierograph B D 2 " der Fa. Kipp & Zonen regi- striert. Eine einfaehe Zusatzeinriehtung gestat te t die Registrierung fiber die Wellenlgnge. Die Mel~parameter sind:

Preftluftdruek 0,7 kp/cm 2 (Beckman-Brenner mit welter Capillare, Bestell- 1Nr. 4090),

Wasserstoffdruck 250 mm WS, Abst~nd Brennerspitze yon der optischen Achse 5,5 cm, Spaltbreite 0,1 mm, VC'el]enlgnge der t~b-Analysentinie 780,02 nm, Spektrale Bandbreite 16/~, Diimpfung mit 2 #F-Kondensator parallel dem Eingang des R6hrenelektro-

meters~ l~egistrierpapiervorschub 1800 mm/Std, Registriergeschwindigkeit 0,15 nm/sec. Ein ausgesuchter Photomultiplier der Type 1 P 28 wurde beziiglich seines Signal-

zu-R~usch-Verhgltnisses und damit der unteren Nachweisgrenze fiir die Rb-Be- stimmung mit folgenden Strahlungsempfgngern verglichen: 1 P 21,931 A, 7102 und Cudmiumselenid-Photowiderstand. Von den gepriiften Exemplaren lieferten die Strahlungsempfgnger 1P28 und 1P21 die besten Ergebnisse. Fiir die l~ubidium- bestimmung mit der Linie 780,0 nm sind beide Strahlungsempfgnger gleichwertig. iDa uber der SEV 1 P28 im kurzwelligeren Spektralbereich (fiir andere 1V[el~zwecke) empfindlicher ist als der 1 P21, verwenden wit fiir die Rb-Bestimmung gleichfalls den 1 P28, so daft ffir Messungen im nahen ultravioletten Spek~ralbereich ein Aus- wechseln der Strahlungsempfgnger nicht erforderlich ist.

Probenvorbereitung Probe A: 3 ml Serum ~- 9 ml entsalztes Wasser (s. u.); Probe B : 3 ml Serum ~- 9 ml wgSrige l~ubidiuml6sung, Konzent ra t ion

0,1 ~tg Rb/ml. Herstel lung der wgSrigen l~ubidiumlSsung: Aus der StammlSsung

(1,415 g RbC1 p.a. ; mit entsalztem Wasser (s. u.) auf 1000 ml aufgeffillt)

440 W~LTEn L~G:

wird eine ZwischenlSsung der Konzentrat ion 1 #g Rb/ml dureh Verdfin- hen 1 : 1000 hergestellt und dutch noehmalige Naehverdfinnung 1 : 10 mit entsalztem Wasser die w/~Brige gubidiuml6snng ffir die Zumisehung (Konzentration 0,1 jug t~b/ml) hergestellt. Die LSsungen werden in Poly- /ithylenflasehen angesetzt und aufbewahrt .

Das in einer Ionenaustauschers/iule (Serva Wasser-Reiniger Wl~-12) entsalzte Leitungswasser (Leitfghigkeit <0,01 #S) wird in einer Quarzapparatur nachdestil- lier~. Die Priifung auf etwaige I~ubidiumverunreinigungen wird flammenphoto. metriseh mit der beschriebenen Meganordnnng durchgefiihrt. Dazu wird die Sioalt- breite des Monoehromators auf 0,3 mm erh6ht und der 2/~F-Kondensator dureh einen l0/~F-Kondensator ersetzt. Bei Registrierung an stark verdfinnten tlb- LSsungen fiber die Analysenlinie 780,0 nm sind 0,05 r Rb/ml gerade noeh naeh- weisbar. Der Rubidiumgehalt des verwendeten entsalzten und naehdestillierten Wassers liegt unterhalb dieser Naehweisgrenze.

Messung

Die elektrisehe Empfindlichkeit der MeBanordnung wird w~hrend des Zerstiiubens einer ws gubidiuml6sung (1,0/~g Rb/ml, s. o.) ein- geregelt. Die Proben A und B werden dutch Registrieren fiber die Ana- lysenlinie 780,0 nm gemessen. Nach jeder Serumprobe wird zur I~eini- gung der Zerst/iubercapillare knrzzeitig entsalztes Wasser zerst/inbt. Beide Proben A und B werden zur Kontrolle ein zweites Mal gemessen.

Auswertung

Aus den gegistrierstreifen wird nach Abzug des Untergrundes die PeakhShe (Linienintensit/~t) in bekannter WeiseS, 7 ermittelt. Die ge- suchte Serum-Rubidium-Konzentrat ion folgt aus

V z h c s ~ e Z V s "h z - h

c z Zumisehkonzentration der w/~grigen RubidiumlSsung (0,1 #g/ml); Vs Volumen der Serumproben A bzw. B (3 ml); V z Volumen der Verdfinnungsl6sung, also entsalztes Wasser ffir

Probe A und w~Brige Rb-L6sung ffir Probe B (9 ml) ; h PeakhShe der Probe A auf dem t~egistrierstreifen in Millimeter; h z PeakhShe der Probe B auf dem Registrierstreifen in Millimeter.

Nach Einsetzen der Zahlenwerte in die Gleiehung wird

h es = 0,30 hz-z--h r Rb/ml .

Verlauf der Eiehkurve

Die vorstehende Gleichung gilt nm" unter der Voraussetzung, dab die Konzentrat ion der AnalysenlSsung direkt proportional der gemessenen Peakh6he ist und die Eichkurve - - in linearem MaBstab aufgetragen - -

Flammenspektrophotometrisehe Serum-t{ubidium-Bestimmung 441

soll eine Gerade durch den Nullpunkt sein. Den Eichkurvenverlauf haben wir in dem Konzentrationsintervall von 0,1--100 #g Rb/ml und insbe- sondere von 0,05--1,0 #g Rb/ml untersueht. In dem zuletzt genannten, hier allein interessierenden Intervall ist keine Abweichung yon der Li- nearit/~t festzustellen. Das bei der Serum-Lithium-Analyse 5 bereits aus- ffihrlich beschriebene Verfahren der Zumischung haben wir auch bier bei den Rubidium-Analysen angewandt: Vier verschiedene, bekannte Ru- bidiumzusatzkonzentrationen zum Mischserum zugegeben zeigten ein- deutig eine lineare Eiehkurve.

Andere Autoren s beobaehteten eine Kriimmung der Eichkurve infolge teil- weiser Ionisation des Elementes Rubidium; diese Kriimmung versehwand bei Zu- gaben eines anderen Alkalielementes zum Probengut. Dabei ist allerdings zu be- achten, dab die genannten Autoren Flammen hSherer Temperatur verwendeten (Acetylen-Sauerstoff 3140~ w//hrend die yon uns verwendete Wasserstoff-Preg- luft-Flamme nur eine 3/faximaltemperatur yon 2100~ mit wesentlieh geringeren Ionisationsst6rungen aufweist. Hinzu kommt, dab wir in einem verhgltnismgBig kiihlen Teil der Flamme 5 em oberhalb der Brennerspitze messen. Aus diesen Griin- den und wegen des hohen Na- nnd K-Gehaltes im Serum tritt hier bei Rb kein meg- barer IonisationseinfluB in Erscheinung.

Untersuchung etwaiger Sti~reinfliisse

Es ist bekannt~,4,s, I~ dab bei flammenspektrophotometrischen Ana- lysen die Intensit~t der Rb-Resonanzlinie 780,0 nm durch die Alkalien Natrium und Kalium angehoben wird und durch versehiedene Anionen (z. B. Chlor oder Phosphat) gesenkt wird.

Bei der angegebenen Methode der Serum-Rubidium-Analyse ist die Verwendung einer BlindlSsung nieht erforderlich, da fiber die Analysen- linie registriert und bei der Auswertung naeh tier Basislinienmethode der Untergrund eliminiert wird. Aus dem gMehen Grunde haben etwaige Xnderungen des Untergrundes yon einer Probe zur anderen keinen Ein- flug auf die I~ubidiumanalyse. Als Eichl6sung wird eine 1:4 verdfinnte Serumprobe verwendet, welehe bis auf einen geringen (und bekannten) Zusatzgehalt an Rubidium v61hg identiseh mit tier eigentlichen Analysen- probe ist. Wenn also die Rubidiumintensit/it dutch stSrende Partner um einen gewissen Faktor angehoben oder gesenkt wird, so hebt sich die- ser Faktor bei der anschliegenden Quotientenbildung aus der obigen Glei- chung heraus. Von diesem Vorteil der Zumischteehnik 2 hubert z. B. auch R~zX5 u. DVOl~XK s bei der flammenspektrophotometrisehen Rubidium- analyse in Glimmer erfolgreieh Gebraueh gemacht.

Die Priifung tier angegebenen Methode auf etwaige St6reinfliisse dutch variable Anionen- und Kationenkonzengrationen im Serum haben wir ghnlich wie fiir Li- thium 5 durchgefiihrt (s. Tabelle 1). Die verhgltnism/iBig niedrige Rb-Zumischung zu allen Serum-Proben (s. u.) wurde nut zu dem Zweck vorgenommen, den Gesamt- rubidiumgehalt der Proben etwas anzuheben und somit genauere Megergebnisse zu erhalten. Die variierten Zusatzkonzentrationen der Elemente Na, K, Ca und Mg

442 WALTEI~ LANG :

entsprechen in etwa ihren maximalen Schwankungen innerhalb des physiologisehen Bereichs bei 1 : 4 verdfinntem Serum. (Wenn man die Zumischkonzentrationen auf unverdfinntes Serum beziehen will, sind die Tabellenwerte mit dem Faktor 4 zu multiplizieren.) Auch diese Messungen wurden s~mtlich durch Registrieren fiber die Analysenlinie 780 nm ausgeffihrt.

Ergebnis: S~mtliche LSsungen liefern innerhalb der Mel3genauigkeit die gleichs l~b-Linienintensit~t. Bei der angegebenen Methods der Serum-Rubidiumbestim- mung tritt also keine StSrung durch wechselnde Konzentrationen der wichtigsten Kationen im Serum auf.

Tabelle 1. Prii/ung der flammenspektrophotometrischen Rubidiumbestimmung au/ StSreinfliisse dutch Kationen. Konzentra~ionen verschiedener Elemente, welche 1:4 verdfinntem Mischserum zugesetzt wurden, um etwaige StSreinflfisse auf die Rb-

Bestimmung zu ermitteln (Konzentrationsangaben in #g/ml)

zusatzelement P r ~ - fung

a u f R b l~g

N a

K

Ca

Mg

0,25 0,25

0,25 0,25

0,25 0,25

0,25 0,25

Na K Ca

50 - - - - 100 - - - -

- - 5 0 - -

- - 1 0 0 - -

- - - - 2 5

- - 5 0 m

5 10

Dieses Ergebnis steht in t_~bereinstimmung mit ~essungen yon t~EZ~.6 u. DvO~XK s. Die genannten Autoren stellen sine Anhebung der Rb-Emission mit stei- genden Natrium- und/oder K-Zugaben fest. Aber schon bei Zusgtzen der beiden Alk~lien bis 100/~g/ml wird deutlich, dab dieser Effekt einem Grenzwert zustrebt. Bei den im Serum - - tro~z der Verdiinnung 1 : 4 - - vorliegenden hohen N~trium- und Kaliumkonzentrationen bleiben deshalb Schwankungen der untersuchten Ele- mente in ihrer Auswirkung auf l~ubidium innerhalb der Grenzen der Mel3genauig- keit.

Bei der f l ammenspek t ropho tomet r i schen R u b i d i u m b e s t i m m u n g in

Anwesenhe i t yon Chlorid a n d Sulfat in der ProbenlSsung haben t~EZX5

u. Dvo~XK s e i n e Depression der Rubidiumintensi t&t beobachtet . Ein

solcher StSreinflu$ auf die Serum-Rubid ium-Analyse wurde mi t den hier

benu tz t en MeBparametern und mi t t~egistrieren fiber die Linie nicht fest-

gestellt . Zur zus/itzlichen und genaueren Prfifung auf einen e~waigen St5reinfluB der Anionen haben wir wie bei der Serum-Li th ium-Analyse 5

die Mel~bedingungen mi t Modellseren so gew~hlt, dab jede Einzelmessung mit e inem re la t iven Fehler yon h6chstens ~= 2 ~o behaf te t ist. Mit natfir-

l ichen Scren ist einc solche Bes t immungsgenauigke i t nicht erzielbar (s. u.).

Zur Herstellung der Proben sind wir yon jeweils 2,5 ml einer wal~rigen L6sung ausgegangen, welche au6er Rb noch C1 als Chlorid, Pals Phosphat bzw. S als Sulfat in bekannten Mengen enthielt (s. Tabelle 2). Diese LSsung wurde mit 1VIerck-Haupt- eichlSsung Nr. 9976 auf 50 ml aufgeffillt und anschliel~end mit entsalztem Wasser 1 : 4 verdfinnt.

Flammenspektrophotometrisehe Serum-Rubidium-BestimInung 443

0bgle ieh die hier ve rwende ten Zusa t zkonzen t r a t i onen der verschie- denen Anionen z. T. wei t fiber den physiologisehen Sehwankungsbere ieh im Serum hinausreichen, konn te bei der Regis t r ie rung fiber die Linie

Tabelle 2. Prii/ung der flammenspektrophoto- metrischen Rubidiumbestimmung au/ StSr- einfli~sse dutch Anionen. Konzentrationen verschiedener Elemente (in #g/ml), welche 1 : 4 verdSnntem Modellserum zugesetzt wur- den, um etwMge St6reinflfisse auf die Rb-

Bestimmung fes~zustellen

Prfi- f u n g auf

C1

P

R b

1

1

1

0,5 0,5 0,5

1

1

1

0,5 0,5 0,5

Zusatzelement C1 P

i00 2OO

100 200

- - 10 - - 20

- - 10 2O

s

m

m

m

m

Tabelle 3. Rubidiumbestimmung mit veraschten Serumproben. Zum Vergleich die AnMysenergebnisse mit 1:4 verdiinnten, nicht ver- aschten und nicht enteiweigten Serumproben. Konzentrationen in

#g I~b/ml

Nr. der Se- Sermn r u m p r o b e 1:~ ve ra sch t

ve rdf inn t (Mnffelofen)

1

2 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

0,25 0,15 0,24 0,21 0,27 0,36 0,16 0,14 0,17 0,30 0,23 0,25 0,14 0,22

0,21 0,13 0,24 0,19 0,27 0,38 0,21 0,14 0,12 0,27 0,20 0,18 0,18 0,24

S 1 m 1 10 keine Xnderung entspreehen- 1 20 der I~ub id iumkonzen t ra t ionen 0,5 __ fiber die Bes t immungsgenauig- 0,5 10 kei t yon : J :2% hinaus fest- 0,5 20 gestel l t werden. D a m i t is t

s ichergestel l t , dag bei dem an- gegebenen MeB- und Auswer t eve r fah ren ffir die Se rum-Rub id ium-Ana lyse die var iab le Anionen- u n d K a t i o n e n k o n z e n t r a t i o n im Serum ohne Be- deu tung ist.

U m einen evtl . Einf lug des Serumeiweiges auf die Rub id iuma na ly se zu untersuehen, haben wir Einzelseren in der gleiehen Weise wie bei L i t h ium im Muffelofen bei 500~ veraseh t und naeh der Methode der Zumiseh- t eehn ik gemessen. Die Ergebnisse s ind in Tabel le 3 zusammengeste] l t .

Ahnl ieh wie bei der L i t h i u m b e s t i m m u n g s ind aueh hier die Meg- ergebnisse mi t 1 :4 ve rdf inn tem Serum als zuverl/~ssiger zu bewer ten als diejenigen mi t den verasehten Serumproben . Sofern f iberhaupt eine Be- einflussung der R u b i d i u m b e s t i m m u n g dureh Eiweig auf t r i t t , so l iegt diese sieherl ieh innerha lb der Bes t immungsgenauigke i t .

444 WALTEI~ LANG :

Konzentrationsbereich yon 52 Einzelseren

Im Gegensatz zum Serum-Lithium-Gehalt zeigen die Serum-Ru- bidium-Konzentrationen in 52 untersuchten Einze]seren eine kleinere

Tabelle 4. Konzentrationsverteilung des Serum-Rubidiums in 52 Einzel-

seren

KIassenbreite /xg Rb/ml

0,05--0,09 0,10--0,14 0,15--0,19 0,20--0,24 0,25--0,29 0,30--0,34 0,35--0,39 0,40---0,69 0,70~0,75

* Auf- bzw. abgerundet.

H~ufigkeit absolut relativ (%)*

3 5,8 10 19,2 10 19,2 16 30,8 5 9,6 5 9,6 1 1,9 0 0,0 1 1,9

Tabelle 5. Wiederholung der Serum- Rubidium-Analyse an 12 Seren naeh einem Zeitraum yon 3 bis

Tagen, Konzentrationen in #g Rb/ml

Nr. der Serum- probe

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36

Bestirmnung nach 3 bis

am 1. Tag ~ Tagen

0,24 0,33 0,21 0,14 0,27 0,27 0,36 0,40 0,16 0,18 0,14 0,14 0,17 0,15 0,30 0,34 0,23 0,34 0,25 0,24 0,14 0,19 0,22 0,22

Eine einfaehe

Sehwankungsbreite. Der Mi~elwert liegt bei 0,217/zg Rb/ml. Die niedrigste gemessene Konzentration betritgt 0,08 #g l~b/ml und die h6ehste gemessene Konzentration erreicht der Wert 0,70 #g Rb/ml. Der in der Literatur s angegebene Bereieh f/ir normales Serum (50--200 y-%) liegt also wesentlich h6her (vgl. Tabelle 4).

Reproduzierbarkeit und Bestimmungsgenauigkeit

Zur Prfifung der ]~eproduzierbarkeit haben wir bei insgesamt 12 Serumproben die l~ubidiumanalyse nach einem Zeit- raum yon 3 bis 4 Tagen wiederholt (Ta- belle 5). Obgleieh in einem Falle (Probe Nr. 25) bei der Wiederholung der Meg- wert um 37% h6her liegt, ist diese Ab- weichung noch klein im Verh~ltnis zum rel~tiv groBen Sehwankungsbereieh des Serum-Rubidiums, der bis zum Faktor 3 (300 % !) gehen kann. Der relative Fehler sowie die mittlere Standardabweichung (vgl. ~) bei 20 hintereinander ausge- fiihrten Analysen an Mischserum be- tr~gt • bzw. • 11,5%.

Herrn Prof. Dr. R. H ~ . ~ A ~ danke ich fiir die kritische Durchsicht des Manuskriptes sowie wertvolle Verbesserungsvorschl~ge. Frau B. GUTSC~E leistete uns mit der selb- st~ndigen Durchfiihrung der experimentellen Arbeiten wertvo]le Itilfe, woffir ihr auch hier gedankt sei.

Zusammenfassung und schnelle flammenspektrophotometrische Analysen-

methode ftir die routinemaBige Serum-Rubidium-Bestimmung mit 1:4 verdiinntem Serum wird angegeben. Als mittlere Konzentration bei 52 untersuchten Einzelseren wurden 0,217/zg Rb/ml gefunden. Der relative Fehler der Bestimmung yon Mischserum betr~gt bei 20 Messungen •

Flammenspektrophotometrische Serum-Rubidiu m-Bestimmung 445

Summary

A simple and fast flame spec t rophotomet r ic analyt ica l me thod is

described for rout ine serum rub id ium determinat ions in 1:4 di luted

serum. The average concentra t ion of 52 sera amoun ted to 0,217 #g Rb/ml .

The re la t ive error of 20 pooled sera de terminat ions was found to be

~: 2,6~ . Literatur

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Dipl.-Phys. W. LAsO, 63 Giel~en, Gaffkystral3e 14, Abteilung fiir Medizinische Physik an der Universitgts-Hautklinik