Einführung in Zellanalyse und Zellsortierung · Modul-Seminar: Moderne molekulare und...

Einführung in Zellanalyse und

Zellsortierung Modul-Seminar: Moderne molekulare und Hochdurchsatz-Technologien in der medizinischen

Grundlagenforschung, Master-Studiengang MBT

Johann Volzke, MSc. Biochemie

Universitätsmedizin Rostock

Zellanalyse

Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor 2


Zellsortierung



Durchflusszytometrie


• Automatisierte Messung von Zelleneigenschaften in

einem kontinuierlichen Probenstrom

• Zyto = Zelle / -metrie = „das Maß betreffend“

• Relative Beurteilung von Größe und Granularität

- Vorwärtsstreulicht (FSC)

- Seitwärtsstreulicht (SSC)

• Immunfluoreszenz

- (monoklonale) Antikörper + Fluorochrom spezifische Färbung

- zahlreiche Kombinationen von Ab und fluoreszierenden Farbstoffen

- „Panel-Design“: Zusammenstellung von Abs und Fluorochromen


Probenvorbereitung


• Zellhaltige Probe

- Vollblut (antikoaguliert)

- Organe: Aggregate entfernen, Zellen

sieben/suspendieren

• Zellzählung (optional)

• Färbung

- Oberflächenmoleküle (CD, Rezeptoren, …)

- intrazelluläre Moleküle (DNA, Proteine) nach

Fixierung/Permeabilisierung


Aufbau


• Strömungstechnik (Fluidics)

- Probe durch Leitungen befördern (Druck)

- Vereinzelung in Flusszelle durch hydrodynamische

Fokussierung


Fluidics


• Zellen müssen einzeln

untersucht werden!

• Hydrodynamische

Fokussierung

- Zellen fließen nacheinander

durch Flusszelle

- Zellen werden nacheinander

„untersucht“

• Mantelflüssigkeit nicht mit

Probenkern mischbar

(Viskosität,

Fließgeschwindigkeit)

Probe

Mantelfl. Küvette


Aufbau




- Vereinzelung in Flusszelle durch hydrodynamische

Fokussierung

• optische Messeinheit (Optics)

- Anregung zur Fluoreszenz (LASER: Anregungs-Strahlung)

- Fokussierung, Weiterleitung und Registrierung von Streuung und

Emission

- Umwandlung der Signale in elektrischen Strom


Optics


• markierte Zellen werden

angestrahlt (--- --- ---)

- Streuung des anregenden

Lichts

- Anregung (versch.

Wellenlängen) und

Fluoreszenz

• Detektor: Photoeffekt

erzeugt Elektronen

LASER

„Sensing“-Region


Registrierung von FSC und SSC


• Registrierung von

gestreutem Licht einer

Wellenlänge

• SEV: „aus einem

mach viele“

FSC

SSC

Detektor

Detektor

„Abgedunkelt“

e-

e- e-

e-

e- e-

e- e- e- e- e- e- e- e- e-

e-

SEV


Registrierung von Fluoreszenz

Vorlesung: Klinische Immunologie, MBT Bachelor

11

• Fluoreszenz

- viele Wellenlängen

- gleichzeitige Registrierung

- werden durch Spiegel gefiltert (lassen bestimmte

Wellenlängen-Bereiche passieren)

- Licht gelangt erst danach zum Detektor

Fluoreszenz

Detektor e- e- e- e- e- e- e- e- e-

Filter



Zellen

FSC



SSC und Emmision


Strahlenfiltertypen


longpass bandpass shortpass

520

LP

520

SP 530/60

BP

400 450 500 550 650 750


Aufbau




- Vereinzelung in Flusszelle durch hydrodynamische Fokussierung

• optische Messeinheit (Optics)

- Anregung zur Fluoreszenz (LASER: Anregungs-Strahlung)

- Registrierung und Lenkung der Streuung und Emission

- Umwandlung der Signale in elektrischen Strom

• Elektronik (Electronics)

- Weiterleitung des elektrischen Stroms

- Verstärkung des elektr. Stroms und Umwandlung in

Spannungsimpulse

- Konvertierung in digitale Werte Auswertung


Electronics


Photonen Detektor + SEV elektr. Strom

e- e-

e- e- e- e- e- AMP Daten

Verstärkung + Spannungsimpuls

Photokathode (-)

Anode (+) Primärelektron Sekundärelektronen

Detektorspannung ↑: Anzahl Sekundärelektronen↑


Electronics


Photonen Detektor + SEV elektr. Strom

e- e-

e- e- e- e- e- AMP Daten

Verstärkung + Spannungsimpuls

Zeit

V V V V V

Fluoreszenz


Spannungsimpuls


• Signal wird stärker wenn (je Detektor)

- Zelle größer (FSC)

- Zelle granulärer (SSC)

- Zelle mit mehr gebundenen Ab (Fluoreszenz)

- Zelle mit erhöhter Fluoreszenz durch weitere Farbstoffe (z.B.

Interkalatoren)

• Dubletten: Aggregation führt zu unerwünscht erhöhten Signalen

(Zeit-Komponente und damit Fläche werden größer)

t1 < t2


Leukozytenanalyse


Trümmer

Lymphozyten

Monozyten

Granulozyten

Leukozyten

Signalhöhe oder -fläche = Intensität

Dotplot

• Morphologie sehr ähnlich: Grobe (relative)

Unterscheidung in Größe und Granularität


CD Moleküle


• Leukozyten und Subpopulationen: Färbung von

spezifischen Oberflächenmolekülen

CD45 Leukozyten

CD3 T-Zellen

CD4 T-Helferzellen

CD8 Zytotoxische T-Zellen

CD19 oder CD45R (B220) B-Zellen

CD16 und CD56 NK-Zellen

CD14 Monozyten

… …


Histogramm


• Leukozyten und Subpopulationen: Färbung von

spezifischen Oberflächenmolekülen

CD3- CD3+

T

CD45 CD3

CD3 Ab + Fluorochrom

Histogramm

MFI


Hierarchisches Gating im Dotplot


• Beispiel: Analyse von T-Zellen in Vollblutprobe

- Anteil der T-Zellen (CD3+) an Lymphozyten?

- Anteil der T-Helferzellen (CD4+) an T-Zellen?

„parent gate“ ≙ 100 %

der Messereignisse (Events)

CD3+ CD3-

„child gates“ ≙ Anteile am

parent gate*

25 %* 75 %*

neues „parent gate“

65 %

35 %


Hierarchisches Gating


• Beispiel: Analyse von B-(CD19+) und NK-(CD16/56+)

Zellen aus Vollblutprobe

- Anteil von B-Zellen und NK-Zellen an Lymphozyten?

15 %

5 %

80 %

versch. Emissions- Wellenlängen


Reinheitsanalyse


• B-Zellen aus Milz isoliert (Reinheit? )

- „Verunreinigung“ durch T-Zellen?

95 %

3 %

Zellen


Analyse von Apoptose


• lebende Zellen: Asymmetrie

von Lipiden

- katalysiert durch

Flippase und Floppase

• Caspase: Aktiviert Scramblase

• Scramblase hebt Assymetrie

auf

• Phospatidylserin zeigt bei

Apoptose in den

Extrazellulärraum

• PS wird durch Annexin

gebunden

Extrazellulär

Intrazellulär

polarer Phospholipidrest

Phosphatidylserin

Caspase-Aktivierung und Apoptose

Annexin

Fluorochrom


Analyse von Apoptose und Zelltod


• Kombination mit DNA-

Interkalatoren

- Propidiumiodid (PI) / 7-AAD

• Unterscheidung von bereits

gestorbenen Zellen

(Membranintegrität)

• Lebende Zellen: FITC− PI−

• Apoptose: FITC+ PI−

• Tot: FITC+ PI+

• DNA-Fragmente: FITC− PI+

PI / 7-AAD

DNA

Annexin-FITC FITC

PI


Multiplex-Analyse


• Prinzip des Sandwich-ELISA

• Gleichzeitge Quantifizierung von bis zu 30 Antigenen in einer Probe

• z.B. Zytokine

2

1

1

unterschiedlich

fluoreszierende Beads

Analyten (Zytokine)

Zytokin-spezifische AK

Detektions-Ab

Analyse


Multiplex-Analyse


Beadpopulation 1

- gleiche Größe

- 6 sub-Populationen mit

unterschiedlicher

Autofluoreszenz und

Zytokin-Reaktivität

Beadpopulation 2

- gleiche Größe

- 7 sub-Populationen mit

unterschiedlicher

Autofluoreszenz und

Zytokin-Reaktivität

Signal von Nachweis-Ab

Bead

Fluoreszenz

SSC

FSC


Aspekte der Planung von Zellanalysen


• Komponenten von Zellanalysen können auf unerwünschte Weise

Messungen beeinflussen

- Zellen: Autofluoreszenz (z.B. NAPDH) und Aggregation

(Dubletten)

- Antikörper: unspezifische Bindung (z.B. über Fc)

- Farbstoffe: Überlagerung von Emissionsspektren

• „Design“ der Analyse: geeignete Kontrollen wählen und

Durchflusszytometer einstellen


Betrachtung von Populationen

ist immer relativ!

Detektor-Spannungen in beiden Kanälen anpassen

Autofluoreszenz


• Biologische Kontrolle: Vorab-Messung von ungefärbten Zellen

- Detektorspannung (Beschleunigung der Elektronen im SEV) am

Messgerät einstellen

- scheinbar positive Signale in „negativen“ Bereich schieben (empirisch)

Ausnutzung des dynamisches Bereichs

+ - + -


Dublettenausschluss


• Nicoletti-Assay: Anfärbung

von DNA nach Fixierung

und Permeabilisierung von

Zellen (Zellzyklusanalyse)

• Dubletten führen zu

unsinnig vielen „Peaks“

- zwei Zellen haben mehr

DNA als eine

• Dubletten-Ausschluss

- Plot von Signalbreite

gegen Signalfläche

(Interkalator-Emission)

- Gating der Einzelzellen

PI


Unspezifische Antikörperbindung


• Bindung über Fc?

• Probenvorbereitung

- „Fc-Block“ Blockieren FcR

- Verwendung von k/o Zellen

als Negativ-Kontrolle

• Isotyp-Kontrolle

- Antikörper mit gleichem Isotyp

(leichte/schwere Kette) und

Fluorochrom

- keine Spezifität für Antigene

in der Probe



Spektrale Überlappung

• Verwendung von vielen Farbstoffen in einer

Probe: Überlappung der Emissionsspektren

möglich

PE-Cy7 strahlt in den Detektor-Kanal von PE (ca. 570 nm) rein

ThermoFischer Fluorescence SpectraViewer


Spektrale Überlappung und Kompensation


• Verwendung von Kontrollen: Zellprobe nur mit einem

Farbstoff inkubiert

• betroffenen Kanal / betroffene Kanäle betrachten

• Abschätzen der Überlappung und Subtraktion:

Kompensation

Zellen + Ab(PE-Cy7) kompensiert Zweifachfärbung


Kompensation


Zweifachfärbung

PE Kanal: (PE + PE-Cy7 Überlappung) - (PE-Cy7 Überlappung) =

korrigiertes Signal für PE

=> Doppelt positive Populationen auswertbar

• Verwendung von Kontrollen: Zellprobe nur mit einem

Farbstoff inkubiert

• betroffenen Kanal / betroffene Kanäle betrachten

• Abschätzen der Überlappung und Subtraktion:

Kompensation


Fluorescence Minus One (FMO)


• bei Verwendung eines „multi-color“ panels

• Abschätzen inwiefern einzelne Fluorochrome in andere Kanale strahlen

• unvermeidbar auf Grund logarithmischer Darstellung und spektraler

Überlappung

PE

FITC

0

102

103

104

105

0 102 103 104 105

PE

FITC

0

102

103

104

105

0 102 103 104 105

PE

FITC

0

102

103

104

105

0 102 103 104 105

ungefärbte Kontrolle FMO Kontrolle Vollständig gefärbt

FITC --- CD45RO CD45RO

PE --- --- CD45RA

Cy55PE --- CD4 CD4

ungefärbt Grenze ungefärbt Grenze ungefärbt Grenze

FMO Grenze

Falsch positiv

FMO Grenze

FITC+

PE−

FITC−

PE+


Zellsortierung


• Isolation gewünschter Zellpopulationen

• Depletion unerwünschter Zellpopulationen

• Aufreinigung

• Wahl der Methode: Reinheit, Ausbeute, Stress auf Zellen

und Art der Downstream-Anwendungen (z.B. Zellkultur)


Durchflusszytometrische Zellsortierung


• Datenabhängige Zellsortierung

• Zielzellen markiert (Ab +

Fluorochrom)

• Tröpfchenbildung am Ende

einer Düse

• Tropfen werden je nach Signal

positiv bzw. negativ elektrisch

geladen

• Sortierung erfolgt über elektr.

geladene Ablenkplatten

• hohe Reinheit aber hoher

Stress für Zellen (EM-Felder,

Fragmentierung nach

Tröpfchenbildung) und

Aktivierung von Zellen

möglich (z.B. T-Zellen)

„Sensing“

„Drop- Delay“

Tropfen mit Zelle


Magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS®)


• magnetisch markierte Zellen

werden retardiert

• waschen der Säule

• Elution durch Schwerkraft

oder Druck (autoMACS)

• schonend für Zellen (geringer

Stress) hohe Ausbeute

Magnetische Markierung

magnetisches Objekt (bead)

Ab

Magnetische Sortierung Elution der markierten Zellen

N

S

ferromagnetisches Säulenmaterial

„Negativfraktion“

N

S

„Positivfraktion“


Zellsortierung nach Größenausschluss


• künstlich vergrößerte Zellen

bleiben auf Zellsieb zurück

• waschen!

• Ablösen der Zielzellen von

beads (chemisch vermittelt)

• „schonende“ Prozedur

Markierung und Vergrößerung

Ab

bead (d = 30 - 70 µm)

Sortierung nach Größe

„Negativfraktion“

Gewinnung der Zielzellen

„Positivfraktion“

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