Entwicklung von stammspezifischen PCR-Systemen mittels...

Entwicklung von stammspezifischen PCR-Systemen

mittels subtraktiver Hybridisierung

für verschiedene Stämme innerhalb der Milchsäurebakterien

Diplomarbeit

Ausgeführt am

Institut für Allgemeine Mikrobiologie

der Christian-Albrechts Universität zu Kiel

unter der Leitung von PD Dr. W. Hausner

vorgelegt von Christian Stelter

Kiel, im Februar 2003

Angenehm sind die erledigten Arbeiten.

Marcus Tullius Cicero

Inhaltsverzeichnis 5

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung................................................................................................................................. 9

1. Einleitung ......................................................................................................................................... 11

1.1 Starterkulturen in der Biotechnologie .................................................................................... 11

1.2 Taxonomie und Eigenschaften von Milchsäurebakterien ..................................................... 11

1.2.1 Lactococcus ......................................................................................................................... 12

1.2.2 Lactobacillus ....................................................................................................................... 13

1.3 Diagnostische Systeme .............................................................................................................. 14

1.4 Genomische Unterschiede ........................................................................................................ 15

1.5 Technische Entwicklung der Subtraktiven Hybridisierung ................................................. 16

1.6 Ablauf der „Suppression Subtractive Hybridization“ (SSH) ............................................... 18

1.7 Anwendungen von Genomsubtraktionen ............................................................................... 21

2. Material und Methoden .................................................................................................................. 23

2.1 Verwendete Bakterienstämme ................................................................................................. 23

2.2 Kultivierung der Mikroorganismen ........................................................................................ 23

2.3 DNA-Präparation...................................................................................................................... 24

2.4 „Suppression Subtractive Hybridization“ .............................................................................. 25

2.4.1 Oligonukleotide ................................................................................................................... 25

2.4.2 Vorbereitung der Driver- und Tester-DNA ......................................................................... 26

2.4.3 Subtraktive Hybridisierung.................................................................................................. 27

2.4.4 Auswertende Suppression- und Nested-PCR ...................................................................... 27

2.4.5 Effizienzkontrolle mittels Lambda-Phagen/Escherichia coli Hybridisierung..................... 28

2.5 Standard-Methoden zur Auswertung innerhalb der „Subtractive Suppression

Hybridization“ (SSH) ..................................................................................................................... 28

2.5.1 Klonierung von PCR-Fragmenten durch TA-Cloning......................................................... 28

2.5.2 Kolonie-Screening zur Identifikation gewünschter Fragmentgrößen.................................. 29

2.5.3 Präparation von Plasmid-DNA (Minipräparation) durch alkalische Lyse........................... 29

2.5.4 Blot-Analysen zur Identifikation stammspezifischer Sonden.............................................. 30

2.5.4.1 Herstellen eines DIG-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde........................... 30

2.5.4.2 Herstellen eines Biotin-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde........................ 30

2.5.4.3 Überprüfung der Markierungseffizienz der Sonde....................................................... 31

2.5.4.4 Southern-Blot ............................................................................................................... 31

2.5.4.5 Hybridisierung.............................................................................................................. 32

6 Inhaltsverzeichnis

2.5.4.6 Detektion ...................................................................................................................... 32

2.5.4.7 Dot-Blots auf ungeladener Nylon-Membran................................................................ 32

2.5.5 DNA-Sequenzierung und Erstellen stammspezifischer PCR-Systeme ............................... 33

2.5.6 Sequenzierung von Fragmenten aus Agarosegelen ohne Klonierung ................................. 34

2.6 Subtraktive Hybridisierung durch Immobilisierung............................................................. 35

2.7 Allgemeine Arbeitsschritte ....................................................................................................... 36

2.7.1 DNA-Sequenzierung............................................................................................................ 36

2.7.2 Polymerase-Chain-Reaction ................................................................................................ 37

2.7.3 Herstellen kompetenter Zellen mit der Calciumchlorid-Methode ....................................... 37

2.7.4 Glycerinkulturen.................................................................................................................. 37

2.7.5 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................................. 37

2.7.6 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mittels der Zentrifugier-Methode ..... 38

2.7.7 Reinigung von Nukleinsäuren durch Phenol/Chloroform-Extraktion ................................. 38

2.7.8 Ethanolfällung ..................................................................................................................... 38

2.7.9 Konzentrationsbestimmung der DNA mittels Absorptionsspektronomie ........................... 39

3. Ergebnisse ........................................................................................................................................ 41

3.1 Vorversuch zum Nachweis stammspezifischer Fragmente durch Modifizierung der

klassischen Subtraktionshybridisierung unter Verwendung von Restriktionskinetiken......... 41

3.2 Anreicherung von definierten Unterschieden zwischen Tester- und Driver-DNA ............. 42

3.3 Theoretische Restriktionsanalysen am Beispiel der Gattungen Lactococcus und

Lactobacillus .................................................................................................................................... 44

3.4 Identifizierung von genomischen Unterschieden innerhalb der Lactococcus-Stämme ...... 45

3.4.1 Anreicherung von potentiell stammspezifischen DNA-Fragmenten zur gegenseitigen

Differenzierung von Lactococcus St. 1526 und St. 1760 ............................................................. 45

3.4.2 Klonierung der angereicherten Fragmente .......................................................................... 46

3.4.3 Dot- und Southern-Blot-Analysen....................................................................................... 47

3.4.4 Sequenzierung und Analyse der für St.1526 und St.1760 spezifischen DNA-Fragmente .. 49

3.4.5 Erstellen von stammspezifischen PCR-Systemen ............................................................... 50

3.5 Identifizierung von genomischen Unterschieden innerhalb der Lactobacillus-Stämme..... 54

3.5.1 Anreicherung von stammspezifischen DNA-Fragmenten von Lactobacillus-Stämmen unter

Verwendung von 2 Driver-Stämmen............................................................................................ 54

3.5.2 Isolierung und Sequenzierung von Fragmenten aus Agarosegelen ohne Klonierung ......... 56

3.5.3 Auswertung der Fragmente über Klonierung und Dot-Blot Analysen ................................ 56

3.6 Versuche zur Parameteroptimierung innerhalb der Suppression Subtractive

Hybridization................................................................................................................................... 57

3.6.1 Optimierung des Waschpuffers ........................................................................................... 57

Inhaltsverzeichnis 7

3.6.2 Optimierung der Annealingtemperaturen in den auswertenden PCRs der SSH.................. 57

3.6.3 Versuch zur Effizienz des „Suppression Effects“................................................................ 58

3.6.4 Auswertung der SSH über eine Gradienten-PCR ................................................................ 59

3.6.5 PCR-Modifizierung zur Detektion geringster Template-Mengen ....................................... 61

3.6.6 Auswirkung der Tester-Konzentration auf die SSH ............................................................ 62

3.6.7 Versuch zum Ausschluss falsch-positiver Tester-Tester-Homohybride.............................. 64

4. Diskussion ........................................................................................................................................ 65

4.1 Eine kritische Analyse des Systems ......................................................................................... 65

4.1.1 Optimierung ausgewählter Parameter.................................................................................. 65

4.1.2 Modifikationen .................................................................................................................... 66

4.2 Bewertung der „Suppression Subtractive Hybridization“ als Grundlage zum Erstellen

stammspezifischer PCR-Systeme................................................................................................... 69

4.3 Diskussion der gefundenen genomischen Unterschiede ........................................................ 71

4.4 Ein Ausblick .............................................................................................................................. 72

4.4.1 Weiterentwicklung des Systems .......................................................................................... 72

4.4.2 Milchsäurebakterien in der Subtraktionshybridisierung...................................................... 73

4.5 Abschließende Betrachtung ..................................................................................................... 74

5. Literaturverzeichnis........................................................................................................................ 75

Anhang ................................................................................................................................................. 83

„Subtractive Hybridization“ mittels Immobilisierung der Subtractor-DNA............................ 83

Theoretische Restriktion ................................................................................................................ 84

Sequenzen ........................................................................................................................................ 86

Chemikalien..................................................................................................................................... 89

Verwendete Größenstandards ....................................................................................................... 90

Enzyme und andere Proteine ......................................................................................................... 90

Kulturmedien .................................................................................................................................. 91

Lösungen und Puffer ...................................................................................................................... 92

Abkürzungsverzeichnis....................................................................................................................... 93

Danksagung.......................................................................................................................................... 95

8 Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung 9

Zusammenfassung

Die Verwendung von Milchsäurebakterien in der milchverarbeitenden Industrie bedarf der

Notwendigkeit, die Reinheit und Zusammensetzung der verwendeten Kulturen innerhalb von

Fermentationsprozessen zu kontrollieren. Die mikrobielle Diagnostik bietet hierfür unterschiedliche

Techniken an. In dieser Arbeit wird das Verfahren der „Suppression Subtractive Hybridization“

dargestellt und als Basis dienen, um spezifisch einzelne Stämme von Milchsäurebakterien zu

identifizieren und näher zu charakterisieren.

Die Methodik beruht auf dem direkten Vergleich zweier Genome, eines zu untersuchenden und eines

nahe verwandten Stammes, mit Hilfe genomischer Subtraktion. Hierbei werden DNA-Fragmente

ermittelt, die in dem einen Stamm vorhanden und in dem anderen abwesend sind. Durch das

Schmelzen und Hybridisieren der DNA zweier Stämme können homologe Anteile ausgeschlossen und

stammspezifische Sequenzen isoliert werden. Mit dieser Technik kann auf die Sequenzierung

vollständiger Genome verzichtet werden, womit sich der zeitliche und finanzielle Aufwand für den

genotypischen Vergleich nahe verwandter Bakterien mit interessanten phänotypischen Unterschieden

reduziert. Auch wenn die Funktionen der unterschiedlichen Regionen unklar sind, können die

Nukleotidsequenzen als diagnostische Marker für auf DNA-basierende Detektion dienen. Hierin lag

das vorrangige Ziel dieser Arbeit.

Die Methode wurde anhand von zwei unterschiedlichen Stämmen aus der Gattung Lactococcus im

Labor etabliert und an weiteren Stämmen von Milchsäurebakterien erprobt. Die hierbei generierten

DNA-Fragmente wurden durch Blot-Analysen auf ihre Spezifität getestet, sequenziert sowie mit

Datenbank-Beständen verglichen. Neben dem Weg der Klonierung und einem Screening auf

Stammspezifität wurde die Möglichkeit erprobt, die erzeugten Fragmente direkt aus einem Agarosegel

heraus zu sequenzieren. Bei den verwendeten Milchsäurebakterien konnten stammspezifische DNA-

Fragmente ermittelt und zur Entwicklung von spezifischen PCR-Systemen verwendet werden.

Weiterhin wurde der Einsatz in einer Multiplex-PCR optimiert.

Das Verfahren hat sich als geeignet erwiesen, eine nähere Charakterisierung einzelner Stämme auf

genetischer Ebene durchzuführen. Die ermittelten Unterschiede konnten für diagnostische Zwecke

verwendet werden.

10 Zusammenfassung

1. Einleitung 11

1. Einleitung

1.1 Starterkulturen in der Biotechnologie

In beinahe allen menschlichen Kulturen dienen Mikroorganismen der Herstellung von

Nahrungsmitteln. Bereits vor ungefähr 8000 Jahren wurden im Zweistromland alkoholische Getränke

durch Gärungsprozesse hergestellt und Nomaden in Zentralasien betrieben zur gleichen Zeit

Milchwirtschaft mit Schafen und Ziegen. Sie stellten wahrscheinlich den ersten Käse her, ein aus

Sauermilch gewonnener Topfen.

Diese Prozesse dienten der Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln, doch die

wissenschaftliche Belegung dieser Vorgänge begann erst mit den Untersuchungen Louis Pasteurs in

der Mitte des 19. Jahrhunderts. Als eine klassische Organismengruppe der Biotechnologie sind die in

dieser Arbeit verwendeten Milchsäurebakterien zu betrachten. Milchsäurebakterien werden weltweit

empirisch oder zielbewußt als Starterbakterien in der Herstellung von Lebensmitteln eingesetzt. Die

Fermentation von Nahrungsmitteln umfasst Milchprodukte (Käse, Butter, Joghurt, Buttermilch),

fermentiertes Gemüse (Gurken, Oliven und Sauerkraut), Würste, Sauerteig und Silage (Daly et al.,

1996).

Das Interesse der Lebensmittelindustrie beruht auf der Fähigkeit der Milchsäurebakterien, vor allem

Laktose zu Milchsäure zu fermentieren. Die Vorteile liegen im säurebedingten Abfall des pH-Wertes

auf unter 4,6. Zum einen beeinflusst die Denaturierung des Milch-Caseins die Stabilität und

Konsistenz des Fermentationsproduktes positiv. Zum anderen wird das Wachstum potentiell

pathogener Bakterien inhibiert. Hinzu kommen aromatische Vorzüge durch das bei der Verwertung

des Milch-Citrats entstehende Diacetyl maßgeblich durch Vertreter der Leuconostoc-Gruppe.

Proteolytische Systeme zum Abbau des Milcheiweißes Casein tragen wesentlich zur Käsereifung bei,

wohingegen Exopolysaccharide (EPS) auf die Textur der Produkte Einfluss nehmen (Limsowtin et al.,

1996; Macura und Townsley, 1984).

1.2 Taxonomie und Eigenschaften von Milchsäurebakterien

Milchsäurebakterien werden in der Familie der Lactobacteriaceae zusammengefasst. Es sind

gram-positive, morphologisch uneinheitliche Bakteria (Stäbchen, Kokken, Streptokokken), die mit

wenigen Ausnahmen (Sporolactobacillus inulinus) weder die Fähigkeit zu Sporenbildung, noch zur

aktiven Fortbewegung besitzen. Phylogenetisch gehören sie zur Clostridium-Bacillus Gruppe und ihr

G+C-Gehalt liegt unterhalb von 50 mol% (Madigan et al, 2000, Stackebrandt et al., 1988).

Trotz variabler Morphologie sind sie physiologisch verhältnismäßig gut zu charakterisieren. Diese

chemoorganoheterotrophen Organismen sind grundsätzlich auf Kohlenhydrate angewiesen. Man

unterscheidet die homofermentativen Milchsäurebakterien, die zu mindestens 90% reines Laktat

12 1. Einleitung

bilden, von den heterofermentativen Milchsäurebakterien, die neben Laktat auch Acetat, Ethanol und

Kohlenstoffdioxid freisetzen (Teuber et al., 1991). Die Unterschiede werden durch das Vorhandensein

oder Fehlen des für die Glykolyse als Schlüsselenzyms dienenden Aldolase verursacht. Vertretern der

Familie Lactobacteriaceae fehlt die Fähigkeit der Porphyrinsynthese. Sie besitzen somit keine

Katalase, weshalb sie nicht zur Elektronentransportphosphorylierung befähigt und infolgedessen auf

Energiegewinnung durch Substratstufenphosphorylierung angewiesen sind. Alle Vertreter dieser

Gruppe sind aerotolerante Anaerobier. Bei Zugabe von Porphyrinen zu dem Nährboden können jedoch

Hämpigmente gebildet und möglicherweise sogar Atmungskettenphosphorylierung betrieben werden

(Schlegel, 1992).

Milchsäurebakterien sind mesophil bis thermophil und entsprechend ihrer Stoffwechselendprodukte

säuretolerant. Ihre natürlichen Standorte sind Milch, deren Erzeugungs- und Verarbeitungsstätten,

intakte und sich zersetzende Pflanzen sowie Darm und Schleimhäute von Mensch und Tier (Teuber et

al., 1991). Milchsäurebakterien besitzen einen hohen Bedarf an Supplinen in Form von Vitaminen,

Aminosäuren, Purinen und Pyrimidinen. Wahrscheinlich haben sie als Folge ihrer Spezialisierung auf

das Wachstum in Milch und anderen nährstoff- und supplinreichen Standorten eine begrenzte

Biosynthesefähigkeit zahlreicher Metabolite angenommen. Aufgrund dieser Auxotrophie erscheint das

Vorhandensein von proteolytischen Systemen und Transportsystemen für Peptide und Aminosäuren

verständlich. Hierdurch sind sie in der Lage hohe Wachstumsdichten zu erreichen, was eine

wesentliche Grundlage der industriellen Nutzung darstellt (Mayo, 1993). Im Gegensatz zu den meisten

anderen Mikroorganismen vermögen sie Laktose als Anpassung an den Säugetierdarm zu verwerten.

Die verschiedenen Gattungen der Milchsäurebakterien sind auf Grundlage ihrer Zellmorphologie,

DNA-Basenzusammensetzung und Art des Gärungsstoffwechsels definiert worden. Die

Milchsäurebakterien, die mit Nahrungsmitteln in Verbindung gebracht werden, beinhalten die

Gattungen Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus,

Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus and Weissella (Stiles et al., 1997).

Innerhalb der Arbeit wurden Vertreter der Gattungen Lactococcus und Lactobacillus verwendet. Diese

sollen im folgenden näher betrachtet werden.

1.2.1 Lactococcus

Von Joseph Lister wurde 1873 die erste bakterielle Reinkultur angelegt. Er nannte den Organismus

Bacillus lactis. Es handelte sich um ein Milchsäurebakterium, welches später in Lactococcus lactis

ssp. lactis umbenannt wurde. In den darauffolgenden Jahren wuchsen mit neuen Isolaten die

Bemühungen zur systematischen Einordnung dieser Stämme nach morphologischen und anderen

Merkmalen (Orla-Jensen, 1919; Lancefield, 1933).

1. Einleitung 13

Die ehemalige Gattung Streptococcus umfasst zahlreiche homofermentative Arten mit

unterschiedlichen Habitaten mit z.T. beträchtlicher Bedeutung für den Menschen. Neben industriell

relevanten sind hier ebenfalls pathogene Organismen u.a. der Erreger der Karies einzuordnen.

Die Anwendung von molekulargenetischen Techniken, insbesondere die Analyse der 16S-rRNA,

resultierte ab 1985 in Veränderungen ihrer bisherigen taxonomischen Klassifikation. Die Gattung

Streptococcus wurde in die drei Gattungen Enterococcus, Lactococcus und Streptococcus aufgeteilt

(Stiles et al., 1997) Die Einteilung differenzierte außerdem pathogene und nicht pathogene

Streptococcen.

Im Gegensatz zur Enterococcus-Gattung, hauptsächlich fäkalen Ursprungs (Enterococcus faecalis),

und Streptococcus, die mit den Pyogenes (Streptococcus pyogenes) sowie Viridansuntergruppe

(Streptococcus mutans) medizinische Bedeutung aufweisen, stehen die Lactococcen mit ihrem

Einfluss auf die Milchwirtschaft. Die Gattung Lactococcus umfasst die Arten L. garvieae, L. lactis, L.

piscium, L. plantarum und L. raffinolactis.

1.2.2 Lactobacillus

Lactobacillen sind normalerweise stäbchenförmig und variieren zwischen langen, schlanken und

kurzen, gekrümmten Stäbchen. Zweidrittel der Arten sind homofermentativ. Die Gattung wurde in

drei große Untergruppen eingeteilt, mit mehr als 70 bekannten Arten. Die Aufteilung geschah primär

nach den Gesichtspunkten der Fermentationsleistung (homo-/heterofermentativ) sowie der

Wachstumstemperatur (15°C oder 45°C) und Form der Stäbchen. So zeigt Lactobacillus acidophilus

ein Wachstum bei 45°C nicht jedoch bei 15°C, weist morphologisch eine langgestreckte Stäbchenform

auf, besitzt Glycerinteichonsäuren, ist aufgrund des Vorhandenseins von Aldolase homofermentativ

und bildet kein Gas aus Glucose. Lactobacillen sind normale Bewohner des Gastrointestinaltraktes

von Mensch und Tier und werden weithin als Auslöser einiger positiver Einflüsse wie die Stimulation

des Immunsystems in Hinblick auf Pathogene und der Instandhaltung einer gesunden Mikroflora des

Darmes angesehen. Unter diesen erscheint Lactobacillus gasseri als die hauptsächlich vertretene

Lactobacillus-Art, die den menschlichen Gastrointestinaltrakt besiedelt (Mitsuoka, 1992; Kullen et al.,

2000). Die Gattung Lactobacillus enthält Vertreter mit sehr unterschiedlichen DNA-

Basenzusammensetzungen und bildet daher keine homogene Gruppe (G+C-Gehalt: 33 - 55 mol%).

Die Bedeutung der Lactobacillen in der milchverarbeitenden Industrie erklärt sich durch die hohe

Säuretoleranz (bis pH 4). Hierdurch lässt sich neben einer selektiven Anreicherung auch ein Einsatz

im Endstadium der Milchsäuregärung ableiten, wenn andere Milchsäurebakterien bereits nicht mehr in

der Lage sind zu wachsen. Arten der Gattung Lactobacillus sind nur selten pathogen (Harty et al.,

1994).

14 1. Einleitung

1.3 Diagnostische Systeme

Aus den ehemals unkontrollierten Fermentationsprozessen in kleinem Maßstab haben sich die

Ansprüche an die verwendeten Starterkulturen und Bedingungen bis zur heutigen Zeit hin stark

gewandelt. Um die genetische Identität und Sicherheit spezifischer bakterieller Isolate zu

gewährleisten, sind art- und stammspezifische molekulare Techniken für genetische Fingerabdrücke

notwendig. Die Stabilität der Komposition von Starterkulturen ist von großem Interesse für den

Hersteller. Eine routinemäßige Verifikation ist eine der wichtigsten Aufgaben, um die Produkt- und

Prozesssicherheit in Form von hygienischen Risiken und somit auch wirtschaftlicher Effizienz zu

optimieren. Es wird daher eine schnelle und reproduzierbare Methode für die Identifikation von

einzelnen Stämmen benötigt.

Während die traditionelle taxonomische Einordnung von Milchsäurebakterien auf phänotypischen

Analysen beruht (Schleifer et al., 1987), begann mit der Analyse der 16S-rRNA, als Betrachtung eines

hochkonservierten Merkmalsträgers, die Erstellung eines phylogenetischen Stammbaums der

Prokaryoten in den Vordergrund zu treten. Hierbei musste festgestellt werden, dass die Verwendung

von auf 16S-rRNA basierenden Sonden bei Lactococcus lactis ssp. cremoris (Klijn et al., 1991,

Salama et al., 1991) eine Diskrepanz zwischen der phänotypischen und genotypischen Identifikation

einiger Stämme aufzeigte (Godon et al., 1992, Klijn et al., 1995).

Die Entwicklung der Polymerasenkettenreaktion in der Mitte der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts

(Mullis et al, 1986) brachte sehr schnell eine Reihe von Technologien hervor, die Möglichkeiten zur

schnellen auf DNA basierender Diagnostik boten. Ein Längenpolymorphismus des PCR-Fragmentes

(Beimfohr et al., 1997) aufbauend auf Primer komplementär zur Mosaikstruktur des Histidin-

Biosynthese-Operons (Delorme et al., 1994) erlaubte zum ersten Mal eine zuverlässige Identifikation

der Art. Stammspezifische Identifikationssysteme konnten jedoch nicht auf der Basis solcher Gene

entwickelt werden.

Die genetische Identifikation von einzelnen Bakterienstämmen erfolgte über Fingerprinting-Techniken

wie die Random Amplified Polymorphic DNA (Welsh et al., 1991; Power et al., 1996), die auch für

Lactococcen in Starterkulturen (Erlandson et al., 1997) oder zur Identifikation von potentiell

probiotischen Stämmen eingesetzt wurde (Roy et al., 2000, Kullen et al., 2000). Weiterhin fand die

Methode der Amplified Fragment Length Polymorphism Anwendung (Vos et al., 1995). Darüber

hinaus hat es die DNA-Sequenzierung ermöglicht, die Phylogenie in vielen schwierigen

taxonomischen Gruppen aufzuklären.

Ergänzt werden diese Techniken durch Detektionsverfahren spezieller Eigenschaften wie die Nisin-

Produktion durch DNA-Sonden (Meghrous et al., 1999). Vergleichend hierzu stehen die in der Regel

aufwendigeren und zudem weniger sensitiven Untersuchungen wie die Analyse von Proteinprofilen

über SDS-PAGE (Pot et al., 1994), die Zusammensetzung der Fettsäuren der Zellmembranen (Welch

et al., 1991) oder Agglutinationstests (Annuk et al., 2001).

1. Einleitung 15

1.4 Genomische Unterschiede

Innerhalb der mikrobiellen Diagnostik ist es von entscheidender Bedeutung nicht nur Gattungen und

Arten, sondern ebenfalls Stämme voneinander unterscheiden zu können. Es muss jedoch angemerkt

werden, dass es keine einheitliche Konvention gibt, die bestimmt, wie viel genomischer Homologie

notwendig ist, um zwei Mikroorganismen dem gleichen Taxon zuzuordnen. Jedoch gelten

Homologiewerte über 70% als Hinweis, dass zwei verschiedene Stämme zur gleichen Art gehören.

Werte von über 20 bis 30 Prozent gelten als Argument dafür, dass zwei Mikroorganismen

wahrscheinlich der gleichen Gattung angehören (Madigan et al., 2000). Vergleichende bakterielle

Genomanalysen haben gezeigt, dass sogar Isolate desselben Bakterienstammes signifikante

Unterschiede in ihrem Geninhalt und Stämme einer Art Unterschiede in ihrer Genkonstellation von bis

zu 20% aufweisen können (Boucher et al., 2001).

Um jedoch alle Übereinstimmungen zwischen zwei Stämmen eindeutig identifizieren zu können, muss

auf die Sequenzierung des gesamten Genoms des verwandten Stammes zurückgegriffen werden. Diese

Vorgehensweise hat sich in einigen Fällen als fruchtbar erwiesen, aber solche Projekte benötigen

substantielle Unterstützung. Zudem gibt es vorher nur ein geringes Wissen über die Natur oder die

Menge an Unterschieden, die letztendlich gefunden werden würden. Zum Beispiel belegte eine

Sequenzierung und der Vergleich der Genome von Escherichia coli K12, einem nicht-pathogenen

Stamm, und E. coli O157:H7 EDL-933, einem enterohemorrhagischen Stamm, die genetische

Grundlage für die unterschiedlichen Lebensweisen der beiden Stämme (Blattner et al., 1997, Perna et

al., 2001 und Hayashi et al., 2001).

Es wurden weiterhin zwei Stämme von Helicobacter pylori sequenziert, wobei wesentliche

Unterschiede festgestellt werden konnten (Alm et al., 1999 und Tomb et al., 1997). Diese Studien

zeigen die Bedeutung von Sequenzinformationen von mehr als nur einem Isolat nahe verwandter

Stämme. Unter Berücksichtigung der großen Anstrengungen für komplette Genomsequenzierungen,

stellt sich eine Methode zur gezielten Identifikation von Unterschieden als besonders vorteilhaft dar.

Üblicherweise besteht die dominante Quelle der genomischen Variation aus Insertionen oder

Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen (Perna et al., 2001, Lawrence et al., 1997). Solche

Unterschiede lassen sich identifizieren, wenn die kompletten Genome durch Hybridisierung

miteinander verglichen werden. Im Verfahren der Genomsubtraktion wird die DNA eines

Bakterienstammes von der eines zweiten abgezogen, um stammspezifische Sequenzen zu

identifizieren. Hierbei werden die Genome zweier Bakterienstämme miteinander vermischt. Nach dem

einleitenden Aufschmelzen der DNA bilden homologe Bereiche der beiden Genome Hybride aus,

während stammspezifische Sequenzen als Einzelstränge erhalten bleiben und isoliert werden können.

Die Methode der Genomsubtraktion wurde in der Mitte der 80er Jahre des 20. Jahrhunderts eingeführt

und kontinuierlich weiterentwickelt. Heute wird sie üblicherweise unter der Bezeichnung „Subtraktive

Hybridisierung“ dargestellt. Aufgrund der Komplexität der Technik soll im folgenden die Entwicklung

bis zum heutigen Tag dargestellt werden.

16 1. Einleitung

1.5 Technische Entwicklung der Subtraktiven Hybridisierung

Die Subtraktive Hybridisierung bezeichnet als Methodik des „Differentiellen Screenings“ ursprünglich

die Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen unter regulatorischen Prozessen wie

Zelldifferenzierung, Embryonalentwicklung oder Krebsentstehung. Es handelt es sich bei der

Subtraktionshybridisierung um eine Methode für die schnelle Isolierung verschieden distribuierter

Nukleinsäuren (differentiell exprimiert, differentiell präsent oder differentiell geordnet in zwei oder

mehr Quellen: verschiedene Zellen, Zellpopulationen oder Zelltypen, unterschiedliche Gewebe,

Erkrankungen oder Entwicklungsstadien). Neben der Analyse differentiell exprimierter Gene stellt die

vergleichende Genomanalyse einen wichtigen Anwendungsbereich dar: Den Vergleich von

verschiedenen Bakterienstämmen, die Analyse von Deletionsmutanten oder den Vergleich komplexer

Genome.

Es wurden zahlreiche Variationen der Subtraktiven Hybridisierung entwickelt. Die Grundlage sind in

allen Fällen Nukleinsäuren einer ersten Quelle (Tester), die spezifische Sequenzen enthalten (Target),

die durch den Vergleich mit Nukleinsäuren der zweiten Quelle (Driver) extrahiert werden sollen. Alle

Formen der Subtraktionshybridisierung beruhen auf dem Schmelzen und Hybridisieren von einer

Mischung aus Tester- und Driver-DNA-Fragmenten mit anschließender Amplifikation von Tester-

spezifischen (Target-) Sequenzen. Je nach verwendetem System können so bis zu 96% der

genomischen Unterschiede detektiert werden (Townsend et al., 1998 und Sawada et al., 1999).

Ursprünglich wurde die Subtraktive Hybridisierung (SH) zur Analyse gewebespezifischer

Genexpression entwickelt (Davis et al., 1984 und Hendrick et al., 1984). Die sich anschließende

methodische Weiterentwicklung betraf überwiegend die Entfernung der unerwünschten Hybride aus

den Hybridisierungsansätzen. DNA/RNA-Hybride wurden durch Hydroxyl-Apatit-Chromatographie

entfernt (Hendrick et al., 1984, Davis et al., 1984), wobei ein 1000facher Überschuss von Subtraktor-

DNA1 verwendet wurde. Durch die Unfähigkeit der Methode zwischen einzelsträngiger Proben und

Subtraktor-DNA diskriminieren zu können, wurden Markierungen in der Subtraktor-DNA, häufig

durch Biotinilierung, eingesetzt. Nach Reaktion mit Streptavidin konnte sie durch Cupric-

Iminodiaceticacid-Chromatographie (Welcher et al., 1986) oder durch Phenol/Chloroform-Extraktion

entfernt werden (Sive und St. John, 1988, Bjourson et al., 1992). Eine weitere Modifikation stellt hier

die Separation von markierten Subtraktor-Hybriden durch mit Streptavidin beschichtete

Magnetpartikel dar (Townsend et al., 1996, Wassill et al., 1998).

Neben Verfahren bei denen die Hybridisierung in Lösung ablief, wurden bereits früh Möglichkeiten

getestet die Subtraktor-DNA zu immobilisieren, wie an einer epoxy-aktivierten Cellulose-Matrix

(Bjourson und Cooper, 1988). Hier waren noch bis zu 5 Hybridisierungszyklen mit mehr als 100 1 In den Anfängen der „klassischen“ Subtraktiven Hybridisierung besitzen die eingesetzten Nukleinsäuren der beiden Quellen

eine andere Nomenklatur als in später entwickelten Systemen. Der Begriff Subtraktor wird als Synonym für Driver, Probe für

Tester verwendet. Für ein besseres Verständnis wird neben dieser Begriffstrennung auf weitere innerhalb der

Entwicklungsgeschichte eingeführte Bezeichnungen verzichtet.

1. Einleitung 17

Waschschritte notwendig, um spezifische Fragmente zu erhalten. Der Vorteil ist darin zu sehen, dass

auf eine Markierungsreaktion der Subtraktor-DNA verzichtet werden kann. Eine Weiterentwicklung

mit Immobilisierung in Mikroplatten (Zwirglmaier et al., 2001) reduzierte den Aufwand auf eine

einzige Hybridisierung.

Um eine Anreicherung der gewünschten Fragmente zu ermöglichen, wurde eine Ligation von

Adaptoren an die Fragmentpopulation eingeführt (Straus et al., 1990). Hierdurch konnte das

Ausgangsmaterial, bei Vorliegen nur geringer DNA-Mengen, vervielfacht werden. Weiterhin konnten

die nur in sehr geringen Mengen vorhandenen stammspezifischen Fragmente vor der Auswertung

amplifiziert werden. Nachteilig bei den bis zu diesem Zeitpunkt vorliegenden Entwicklungen war

jedoch die Notwendigkeit mehrfacher Hybridisierungsschritte, um Hintergrundsignale zu minimieren,

sowie die physikalische Entfernung von Driver-DNA-Hybriden (s. Anhang: Abbildung 1).

Die Entwicklung der Representational Difference Analysis benötigte diese Abtrennung nicht mehr

(Lisitsyn et al., 1993). Innerhalb der RDA wird Tester-DNA an ihrem 5’-Ende mit einem Adapter

versehen und mit einem Überschuss an Driver-DNA gemischt. Nach Hybridisierung werden die

einzelsträngigen Adaptoren über eine PCR-Reaktion aufgefüllt und amplifiziert. Hierbei besitzen

Hybride aus Tester- und Driver-DNA nur an einem Ende einen Adapter, wodurch sie ausschließlich

linear amplifiziert werden. Fragmente mit Adaptoren an beiden Enden werden exponentiel

amplifiziert. Dieses sind entweder Fragmente, die kein Homolog im Driver-Stamm besitzen, also

stammspezifisch sind, oder um Fragmente, die durch Rehybridisierung innerhalb des Tester-Stammes

entstanden sind. Um solche falsch-positiven Fragmente zu entfernen, werden die nun doppelsträngigen

Adaptoren durch Restriktion entfernt und durch neue einzelsträngige Adatoren ersetzt. Es erfolgt eine

neue Hybridisierungsrunde.

Die RDA löste jedoch nicht das Problem von großen Unterschieden in den Anteilen übermäßig

vorhandener mRNA-Spezies. Daher waren immer noch multiple Hybridisierungsrunden notwendig

(Hubank et al., 1994). Zu diesem Zeitpunkt waren das mRNA-Differential-Display (Liang et al., 1992)

und RNA-Fingerprinting durch Arbitrary-Primed-PCR (Welsh, Chada et al., 1992) schnellere

Methoden, um differentiell exprimierte Gene zu identifizieren. Beide dieser Methoden hatten jedoch

einen hohen Anteil an falsch-positiven Klonen (Bauer et al., 1994, Sompayrac et al., 1995), der durch

die Anfälligkeit auf hohe Kopienzahlen einiger mRNAs verursacht wurde (Bertioli et al., 1995).

Weiterhin waren sie ungeeignet für Versuche in denen nur wenige Unterschiede zu erwarten waren

(Sompayrac et al., 1995). Während bei der „klassischen“ Subtraktiven Hybridisierung nach einem

fünfstufigen Verfahren eine Anreicherung von 103 erreicht wird, bietet die RDA bereits nach 2 Stufen

eine Anreicherung um den Faktor 105 (Lisitsyn et al., 1993 und 1995).

Weitere Vereinfachungen wurden von Gurskaya (1996) und Diatchenko (1996) eingeführt, wobei die

Suppression PCR (US Patent # 5.565.340) unter Verwendung von „Inverted Terminal Repeats“

Verwendung fand (Siebert et al., 1995, Chenchik et al., 1996). Neben dem Verzicht auf die

physikalische Trennung der homologen DNA-Fragmente und mehrmalige Hybridisierungszyklen wird

18 1. Einleitung

durch das Einfügen eines weiteren Hybridisierungsschrittes der Überfluss einzelner Sequenzen

normalisiert.

Seit der Einführung vor einigen Jahren hat sich die SSH (Suppression Subtractive Hybridization) als

nützliches Werkzeug für differentielle Genexpression erwiesen (Diatchenko et al., 1996). Der Vorteil

der SSH besteht darin, dass sie keinen großen Umfang an speziellem Material benötigt, da die

Methode ausschließlich auf Hybridisierung mit anschließender PCR basiert. Zusätzlich zur Analyse

von differentiell exprimierten Genen wurde die SSH zur Studie von Unterschieden in bakteriellen

Genomen optimiert (Akopyants et al., 1998). Bei den meisten dieser Entwicklungen werden die Tester

und Driver-Fragmente durch Restriktionsendonukleasen erzeugt (Akopyants et al., 1998) im Vergleich

zur mechanischen Scherung durch z.B. Ultraschall (Ferreira et al., 1999).

Auf diesen Entwicklungen aufbauend wurde von der Firma Clontech ein Kit für cDNAs als auch für

genomische Subtraktion entwickelt (Clontech, 2001). Trotz der Vorzüge der SSH haben die SH

(Winstanley, 2002) als auch die RDA (Perrin et al., 1999) ihre Aktualität behalten.

Begleitet wurde die Entwicklung der aktuellen Systeme durch theoretische Analysen über die

Hybridisierungskinetiken (Sverdlov, 1993, Sverdlov et al., 1994, Milner et al., 1995, Ermolaeva et al.,

1996 und Cho et al., 1998) und kritische Analysen (Sverdlov et al., 1993, und Ermolaeva et al., 1996)

bis hin zu theoretischen und praktischen Limitationen innerhalb der SSH (Ji et al., 2002)

Neben computergestützten Simulationen über molekulare Prozesse bei Veränderung von Parametern

innerhalb von Hybridisierungsvorgängen („SUBTRACT“, Ermolaeva et al., 1995) wurde ebenfalls

Software entwickelt, die bei Vorhandensein genomischer Sequenzen eine theoretische Hybridisierung

mit Ausgabe genomischer Unterschiede erlaubt („FindTarget“, Chetouani et al., 2001).

1.6 Ablauf der „Suppression Subtractive Hybridization“ (SSH)

Die genomische DNA vom zu untersuchenden Stamm und einem Referenzstamm wird mit einer

Restriktionsendonuklease in eine Fragmentpopulation mit einer durchschnittlichen Größe von

ungefähr 0,5 kb hydrolysiert. Zwei verschiedene PCR-Adaptoren, die ausschließlich an dem 5’-Ende

der Ziel-DNA binden können (weil ihr eigenes 5’-Ende keine Phosphatgruppe aufweist), werden in

zwei verschiedenen Ansätzen jeweils an die Tester-DNA ligiert („pseudo-double-stranded“

Adaptoren). Die ligierte DNA wird mit einem Überschuss an Driver-DNA (ohne Adaptoren) gemischt

und denaturiert (Abbildung 1).

Während der folgenden Reannealing-Phase bilden Tester-Moleküle, die ebenfalls im Driver-Genom

vorhanden sind, Tester-Driver-Heterohybride, wodurch sie der Fraktion einzelsträngiger Moleküle

entzogen werden (C). In Hinblick auf die Hybridisierungskinetik zweiter Ordnung ist die Effektivität

der im Überschuss vorliegenden Moleküle sehr groß, was zu einer angenäherten Gleichstellung der

Konzentrationen der verschiedenen Typen von Molekülen führt (Driver-Pressing). Zielmoleküle

werden vom „Driver-Pressing“ nicht beeinflusst und verbleibende ss-Tester-Fragmente angereichert

1. Einleitung 19

(A). Da Zielmoleküle Homohybride durch Reassoziation bilden (B) und da Reassoziationprozesse

schneller für Zielmoleküle in hoher Kopienzahl als für seltene Sequenzen stattfinden, werden die

Konzentrationen der Zielmoleküle als ss-Tester angeglichen.

Nach der ersten Phase der Hybridisierung werden die beiden Ansätze miteinander vermischt, um

weitere Reassoziation stattfinden zu lassen. Es wird weitere Driver-DNA zugegeben (D), um

sämtliche Sequenzen der Tester-DNA zu binden, die sich ebenfalls im Driver-Genom befinden.

Verbleibende komplementäre Einzelstränge der Tester-DNA hybridisieren (E). Dieser Vorgang führt

zu der Ausbildung eines neuen Typus von Molekülen, die sich durch die asymmetrische Flankierung

von Adapter 1 an dem einen und Adapter 2 an dem anderen Ende definieren lassen. Die (pseudo-

double-stranded) Adaptersequenzen an ihren 3’-Enden werden aufgefüllt (double-stranded). Mittels

PCR wird Tester-DNA mit unterschiedlichen Adaptoren (E) exponentiell amplifiziert, während die

Amplifikation von Fragmenten mit identischen Adaptoren (B) durch PCR-Suppression (PS-Effekt)

unterdrückt wird. Die Bindung der PCR-Primer wird durch Ausbildung von Haarnadelschleifen (pan-

like structure) inhibiert (Abbildung 1, rechter Abschnitt). Bei der Bildung von DNA-Primer-Hybriden

wird bei Verwendung von Primern, die am äußeren Bereich der Inverted Terminal Repeats (ITR)

binden, durch die DNA-Synthese der Taq-Polymerase die Originalstruktur hergestellt. Auf diese

Weise wird die Überdauerung des Unterdrückungseffektes während der folgenden PCR-Zyklen

gewährleistet. In komplexen Mischungen erlaubt der PS-Effekt die präzise Amplifikation derjenigen

Moleküle, die von verschiedenen Adaptoren flankiert werden (E, asymmetrisch flankierte Moleküle).

Symmetrisch flankierte DNA-Fragmente (B) werden durch die Unterdrückung des Primerannealings

(Lukyanov et al., 1994, Gurskaya et al., 1996 und Diatchenko et al., 1996) im Verhältnis reduziert.

Tester-DNA mit einem Adaptor an nur einer Seite des Fragmentes (C) untersteht einer linearen jedoch

keiner exponentiellen Amplifikation. Auf diese Weise werden bevorzugt Sequenzen von Interesse

angereichert.

20 1. Einleitung

Ligation vonAdaptor 2

Tester DNA mit Adaptor 2Driver DNA (im Überschuss)

Erste Hybridisierungmit Denaturierung

Zweite Hybridisierung ohne Denaturierung

Tester-Tester Homohybride

Tester-Tester Heterohybride

Tester-Driver Heterohybride

ds-Driver

ss-Driver

ss-Tester

Auffüllen der Enden

Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation

Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation

Nested PCR

Tester DNA mit Adaptor 1

Ligation vonAdaptor 1

A A

C C

B B

D D

E

E

Tester DNADriver DNA

EnzymatischerVerdau

A

C

B

DAufschmelzen

“Haarnadel”-Schleife

Elongation

Primer-Annealing

Self-Annealing

erne

uter

PC

R-Z

yklu

s

Abk

ühlu

ng

erne

uter

PC

R-Z

yklu

s

Tester-TesterHomohybride

ITRITR

1. Einleitung 21

Abbildung 1: Generelles Prinzip der Suppression Subtractive Hybridization (modifiziert nach Akopyants et al., 1998): Die SSH beinhaltet als Wesentliches die folgenden Schritte: (1) Aufteilung der Tester DNA in zwei Ansätze und Ligation mit zwei

verschiedenen Adaptoren, (2) Hybridisierung mit einem Überschuss an Driver-DNA, (3) Amplifikation der Fragmente, die über

zwei verschiedene Adaptoren verfügen. Die SSH basiert auf der Unterdrückung der PCR durch lange „inverted terminal

repeats“, die an den Enden der Fragmente lokalisiert sind. Suppression Effekt durch Inverted Terminal Repeats: Nach der Initiation der PCR durch die Denaturierungsphase bilden die einzelsträngigen (ss) DNA-Fragmente flankiert von „Inverted

Terminal Repeats“ (ITR) durch self-annealing Haarnadelschleifen (pan-like structure) aus, wobei die Bindung der Primer an ihre

komplementären Bindungsstellen ausbleibt und die PCR unterdrückt wird.

1.7 Anwendungen von Genomsubtraktionen

Besonders häufig wurden vergleichende Genomanalysen bisher im medizinischen Bereich eingesetzt.

Beispiele zeigen die Identifikation von Virulenzgenen (DeShazer et al., 2001 und Tinsley et al., 1996),

serovarspezifischen Genen (Emmerth et al., 1999) oder neuartigen Restriktions-

Modifikationssystemen (Lin et al., 2001). Neben Antibiotikaresistenzen oder Oberflächenstrukturen

sind die PAIs „pathogenicity islands“ von besonderem Interesse. Mit diesen multigenen Segmenten,

spezifisch für virulente Stämme, kann die Natur von Erkrankungen näher bestimmt werden.

Doch auch wenn die Funktion der unterschiedlichen Regionen unklar ist, kann die Nukleotidsequenz

als diagnostischer Marker für auf DNA basierender Detektion dienen (Agron et al., 2001 und

Radnedge et al., 2001).

Starterkulturen, wie sie in der milchverarbeitenden Industrie eingesetzt werden, sind Mischungen

sorgfältig ausgesuchter Milchsäurebakterien. Sie werden der Milch zugesetzt, um die gewünschte

Fermentation auszuführen. Auf undefinierte Kulturen wird in der Produktion von Milchprodukten

weitestgehend verzichtet, um Variationen in Geschmack und Konsistenz zu vermeiden (Daly et al.,

1996). Die industrielle Bedeutung der Milchsäurebakterien bewirkt somit ein großes Interesse an der

Identifizierung von Stämmen, um eine gleichbleibende Produktstabilität zu gewährleisten und eine

großtechnische Anwendung zu ermöglichen. Innerhalb dieser Arbeit wurde die vorgestellte Methode

der „Suppression Subtractive Hybridization“ anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien

erprobt, um stammspezfische Sequenzabschnitte zu isolieren. Neben der näheren Charakterisierung

der Stämme stand die Entwicklung von stammspezifischen PCR-Systemen im Vordergrund.

22 1. Einleitung

2. Material und Methoden 23

2. Material und Methoden

2.1 Verwendete Bakterienstämme

Die in dieser Arbeit verwendeten Stämme von Lactococcus und von Lactobacillus acidophilus

(Tabelle 1) wurden von der Firma Danisco Cultor Niebüll GmbH2 zur Verfügung gestellt. Die

Lactococcus-Stämme lagen als Milchpulverkultur vor, während die übrigen Stämme in Flüssigmedien

bereitgestellt wurden. E. coli K12 wurde von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und

Zellkulturen bezogen.

Im Hinblick auf weitergehende Informationen wurde von der Danisco Cultor Niebüll GmbH

mitgeteilt, dass es sich beim Lactococcus Stamm 1760 um eine Nisin-bildende Kultur handelt. Alle

übrigen Kulturen der Gattung Lactococcus werden als Fermentationskulturen für die Herstellung von

Käse verwendet. Weiterhin sind die drei Stämme von Lactobacillus acidophilus eindeutig über AFLP

zu identifizieren.

Tabelle 1: Übersicht über die Herkunft und Eigenschaften der verwendeten Bakterienstämme

Bezeichnung Status/Eigenschaft Herkunft

Stamm 1760 Nisinbildung Danisco

Stamm 1526 Käseherstellung DaniscoStamm 1478 Käseherstellung Danisco

Stamm 1224 Käseherstellung DaniscoStamm 563 Käseherstellung Danisco

Stamm 676 unbekannt DaniscoStamm 770 unbekannt DaniscoStamm 771 unbekannt Danisco

E. coli K12 Laborstamm DSMZ

Lactococcus

Lactobacillus acidophilus

2.2 Kultivierung der Mikroorganismen

Die Wahl der Medien erfolgte nach Angaben der DSMZ3 (s. Anhang: Kulturmedien). Die Anzucht der

Lactococcen-Stämme erfolgte primär im Medium 92 (TRYPTICASE SOY YEAST EXTRACT

MEDIUM). Alternativ wurde das Medium 449 (M17 MEDIUM FOR LACTIC STREPTOCOCCI)

verwendet. Die Wachstumstemperatur betrug 30°C. Zur Anzucht der Lactobacillus acidophilus

Stämme wurde das Medium 11 (MRS MEDIUM) bei 37°C verwendet. E. coli K12 wurde in LB 2 Danisco Cultor Niebüll GmbH, Busch-Johannsen-Straße 1, D-25899 Niebüll, Tel. +49 4661 602-0, Fax + 49 4661 602-107, Wisby, Starter Cultures and Media 3 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany, www.DSMZ.de

http://www.dsmz.de/

24 2. Material und Methoden

(Luria-Bertoni) Medium bei einer Temperatur von 37°C herangezogen. Reinigungsausstriche erfolgten

bei allen Mikroorganismen auf Agarplatten desselben Mediums mit einem Agaranteil von 1,5%. Das

Medium und die herangezogenen Zellen wurden mikroskopisch auf Kontaminationen überprüft.

2.3 DNA-Präparation

Zur Entfernung von Fremd-DNA aus den Kulturmedien (Soja/Hefe) wurden die Zellen vor der DNA-

Isolierung gewaschen. Für diesen Vorgang wurde der Waschpuffer auf die verwendeten

Bakterienstämme kalibriert, um eine Zelllyse und somit den Verlust von DNA zu reduzieren.

(1 – Kalibrierung des Waschpuffers) Aliquots von 1 ml einer hochgewachsenen Kultur wurden auf

1,5 ml Caps verteilt. Durch Zentrifugieren mit 2.000 rpm für 5 min in einer Tischzentrifuge

(Eppendorf centrifuge 5415D) wurden die Zellen pelletiert. Der Überstand wurde abgenommen und

verworfen. Das Pellet wurde mit Waschpuffer unterschiedlicher Konzentrationen überschichtet und

resuspendiert (ROTAMIX RM1, ELMI). Nach erneutem Zentrifugieren wurde eine Probe des

Waschpuffers genommen und direkt zur Nukleinsäurebestimmung eingesetzt. Hierbei wurde das

Photometer jeweils mit Waschpuffer der verwendeten Konzentration kalibriert. Es folgte eine

mikroskopische Untersuchung der Zellen auf Unversehrtheit.

(2 – Waschen der Zellen) Die Zellen einer herangewachsenen Kultur wurden zweimal in 1 Vol.

eiskaltem TE+NaCl [10mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8.0] (Agron et al., 2002)

gewaschen. Alternativ wurden andere Puffer mit 150 mM NaCl wie 1x TBS [100 mM Tris-HCl / 0,9%

(w/v) (150 mM) NaCl / pH 7,5] verwendet. Die gewaschenen Zellen wurden in Mengen zu 0,1 g

Feuchtgewicht portioniert und bei –20°C gelagert.

(3 – Präparation genomischer DNA) Die Präparation der genomischen DNA erfolgte mit

Modifikationen nach der Anleitung „Miniprep of bacterial genomic DNA“ (current protocolls in

molecular biology, chapter 2.4.1) von Flamm et al. (1984) unter Anpassung an die Verwendung von

gram-positiven Bakterien. Je 100 ml der gesättigten Übernacht-Kultur wurden für 10 min bei 2.000

rpm bei 4°C zentrifugiert bis ein kompaktes Pellet erzielt wurde (Sorvall® RC-5B Refrigerated

Superspeed Centrifuge, Du Pont Instruments, Sorvall® GSA Rotor, Du Pont Instruments). Der

Überstand wurde verworfen und das Pellet zweimal gewaschen. Die Zellen wurden in TE-Puffer

resuspendiert, so dass 0,1 g Feuchtgewicht in einem Gesamtvolumen von 486 µl vorlagen. Die

Lagerung erfolgte bei –20°C (alle Zellen wurden vor der DNA-Präparation einem einmaligen

Gefrierzyklus ausgesetzt). Die DNA-Präparation erfolgte in 2 ml Eppendorf-Caps. Es wurden 69 µl

Lysozym/TE-Lösung (20 mg/ml; 118.200 E/mg) zu einer endgültigen Konzentration von 2,5 mg/ml

zugegeben und nach Durchmischung bei 37°C für 45 min inkubiert.

Das Zellmaterial wurde gevortext bis die Suspension zähflüssig war und nach mikroskopischer

Kontrolle des Zellaufschlusses 30 µl SDS (10%) und 15 µl Proteinase K (20 mg/ml) zur


Endkonzentration von 500 µg/ml Proteinase K und 0,5% SDS zugegeben. Der Ansatz wurde gemischt

und für 15 min bei 60 °C in einem Wasserbad inkubiert.

Nach Zugabe von 100 µl 5 M NaCl (auf eine Endkonzentration von 713 mM NaCl sowie einem

Volumen von 700 µl) und gründlichem Mischen wurden 80 µl CTAB/NaCl [10% (w/v) CTAB / 0,7 M

NaCl] hinzugefügt. Nach erneutem Mischen wurde der Ansatz für 10 min bei 65 °C inkubiert.

Es wurde ein Volumen (700 – 800 µl) Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben und durch

kräftiges Vortexen gemischt. Der Ansatz wurde bei maximaler Drehzahl für 5 min in einer

Tischzentrifuge (Eppendorf Zentrifuge 5415D) abzentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde ohne

Interphase in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Zur weiteren Reinigung der genomischen DNA

erfolgte eine Phenol-Extraktion. Die obere, wässrige Phase wurde in ein neues Gefäß überführt, der

Ansatz mit 0,6 Volumen kaltem Isopropanol versetzt, durch mehrmaliges Umkehren des

Reaktionsgefäßes gemischt und kurz zentrifugiert (1 min), um die präzipitierten Nukleinsäuren zu

pelletieren. Der Überstand wurde quantitativ entfernt und das Präzipitat wurde mit 1000 µl Ethanol

(70%, RT) versetzt, gemischt und für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das

Pellet luftgetrocknet (alternativ 3min vakuumgetrocknet). Das Pellet wurde in 200 µl TE-Puffer 10:0,1

gelöst.

Zur Hydrolyse der verbliebenden RNA wurde RNase A zu einer Endkonzentration von 0,4 mg/ml

zugegeben und für 45min bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Phenol/Chloroform-

Extraktion und eine photometrische Konzentrationsbestimmung. Die Qualität der isolierten DNA

wurde durch elektrophoretische Auftrennung auf einem 1%igen Agarosegel überprüft.

2.4 „Suppression Subtractive Hybridization“

Die „Suppression Subtractive Hybridization“ wurde mit Modifizierungen nach N. S. Akopyants et

al. (1998) durchgeführt.

2.4.1 Oligonukleotide

Die folgenden (HPSF gereinigt, MALDI dokumentierten) Oligonukleotide wurden für die

Subtraktionshybridisierung verwendet: Adaptor 1, 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC

GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3´ (44 nt); Adaptor 2, 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA

GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGA GGT-3´ (42 nt); P1x, 5´-CTA ATA CGA CTC ACT ATA

GGG C-3´ (22 nt) (Dieser P1x PCR-Primer bindet an die 5’-Bereiche von Adaptor 1 und 2); NP1, 5´-

TCG AGC GGC CGC CCG GGC AGG T-3´ (22 nt); NP2, 5´-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-

3´ (20 nt) (Die NP1 und NP2 nested PCR-Primer binden an die inneren 3’-Bereiche der Adaptoren 1

und 2). Die verwendeten Oligonukleotide wurden von der Firma Sigma-ARK (Darmstadt) sowie von

MWG-Biotech (Ebersberg) bezogen.


2.4.2 Vorbereitung der Driver- und Tester-DNA

(1 – Theoretische Analyse zur Restriktion)

Innerhalb der SSH werden Fragmentgrößen von durchschnittlich 500 bp benötigt (Akopyants et al.,

1998). Die Hydrolyse des Genoms sollte daher Fragmente in der Größe zwischen 100 bp und 2000 bp

produzieren (Clontech, 2001).

Zur Analyse der Genome in Hinblick auf potentiell verwendbare Restriktionsendonukleasen wurde

das Computerprogramm pDRAW324 1.0 revision 1.1.45 von Kjeld Olesen verwendet. Folgende

sequenzierte Genome wurden für die theoretischen Analysen eingesetzt: Die Genomsequenzen von

Lactococcus lactis subsp. lactis, Escherichia coli K12 und dem Bakteriophagen Lambda wurden von

NCBI5 bezogen. Die unvollständige Sequenz von Lactobacillus gasseri ATCC33323 stammte von

JGI6 (Tabelle 2).

(2 – Restriktionshydrolyse des Genoms) Zwanzig Mikrogramm der Tester- und Driver-DNA

wurden jeweils vollkommen mit 20 Units von RsaI (New England Biolabs) für 16 h in einem 125 µl

Reaktionsvolumen unter zeitgleichem Einsatz von RNase A (EK: 80 µg/ml) hydrolysiert. Der parallele

Einsatz von RNase dient der vollständigen Hydrolyse verbliebener Spuren von RNA, die die SSH

ansonsten beeinflussen könnte. Nach Hitzeinaktivierung des Enzyms (20 min bei 65°C),

Phenol/Chloroform Aufreinigung und Ethanolfällung wurde die DNA in TE resuspendiert. Die

angestrebte Konzentration betrug 600 ng/µl.

(3 – Adapterligation) In zwei getrennten Reaktionsansätzen (jeder in einem Gesamtvolumen von 10

µl) wurden der Tester-DNA (jeweils 120 ng) 2 µl der Adaptoren 1 oder 2 (2 µM Endkonzentration)

bei 16°C über Nacht anligiert. Hierfür wurde 1 µl T4 DNA Ligase (MBI Fermentas, 5U/µl) im Puffer

des Herstellers (mit 10% (v/v) 50% PEG 4000) verwendet. Nach der Ligation wurde 1 µl einer 0,2 M

EDTA-Lösung (pH 8.0) zugegeben und die Ligase für 15 min bei 65°C hitzeinaktiviert. Die Proben

wurden bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.

Tabelle 2: Übersicht zur Herkunft genomischer Sequenzen.

Bezeichnung RefSeq GenBank Bezug

Lactococcus lactis subsp. lactis NC_002662 AE005176 NCBIEscherichia coli K12 NC_000913 U00096 NCBI

Bacteriophage Lambda NC_001416 NCBILactobacillus gasseri ATCC33323 JGIunvollständig/unveröffentlicht

4 pDRAW32 1.0 revision 1.1.45; Kjeld Olesen / AcaClone Software; E-mail: [email protected]; Updated executables may be downloaded from: http://www.geocities.com/acaclone, http://home.get2net.dk/acaclone, http://mibi1.uni-

muenster.de/acaclone, http://medlem.tripodnet.nu/acaclone. 5 National Center for Biotechnology Information, http://www2.ncbi.nlm.nih.gov 6 These sequence data were produced by the US Department of Energy Joint Genome Institute http://www.jgi.doe.gov/, Mikrobielle Genomsequenzen: ftp://ftp.jgi-psf.org/pub/JGI_data/Microbial/

mailto:[email protected]://www.geocities.com/acaclonehttp://home.get2net.dk/acaclonehttp://mibi1.uni-muenster.de/acaclonehttp://mibi1.uni-muenster.de/acaclonehttp://medlem.tripodnet.nu/acaclonehttp://www2.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.jgi.doe.gov/ftp://ftp.jgi-psf.org/pub/JGI_data/Microbial/


2.4.3 Subtraktive Hybridisierung

Ein Mikroliter der Driver-DNA (600 ng) wurde zu 1 µl (12 ng) jeder der Adapter-ligierten Tester-

DNA (Verhältnis 50:1) gegeben. Ein Mikroliter des 5x Hybridisierungspuffers [2,5 M NaCl / 25 mM

Hepes / 1 mM EDTA / pH 8.3] wurde zu jedem Ansatz gegeben, das Volumen mit Wasser auf 5µl

aufgefüllt, mit 10 µl Mineralöl überschichtet und die DNA denaturiert (1,5 min, 98°C). Die

Hybridisierung erfolgte für 1,5 h bei 65°C. Nach dieser ersten Hybridisierung wurden die beiden

Proben (die erste mit Adaptor 1, die zweite mit Adaptor 2) kombiniert, bei Bedarf7 300 ng zusätzlicher

hitzedenaturierter Driver-DNA in 1x Hybridisierungspuffer im Volumen von 3 µl zugegeben, und die

Probe für weitere 14 h bei 65°C inkubiert. Es erfolgte keine zusätzliche Denaturierung. Der 10 – 13 µl

Ansatz wurde mit vorgewärmten (65°C) Dilutionspuffer [50 mM NaCl / 5 mM Hepes / 0,2 mM EDTA

/ pH 8.3] im Verhältnis von 1/10 bis 1/20 verdünnt und für weitere 20 min auf 65°C erhitzt. Nach

Abkühlung auf Eis erfolgte der sofortige Einsatz in die PCR (2.4.4 Auswertende Suppression- und

Nested-PCR). Die weitere Lagerung erfolgte bei –20°C.

2.4.4 Auswertende Suppression- und Nested-PCR

(1 – Suppression-PCR) Es wurden zwei sequenzielle PCRs durchgeführt. In der ersten PCR wurde 1

µl der verdünnten, genomischen DNA aus dem Hybridisierungsansatz als Template eingesetzt (0,2 U

Taq-Pol, 0,8 µM P1x, 100 µM dNTP, 1xPCRPuffer (1,5 mM Mg2+), 15 µl RV). Der mit Mineralöl

überschichtete Ansatz wurde auf 72°C erhitzt, die Polymerase als Hot-Start zugegeben, und für 5 min

bei 72°C inkubiert. Anschließend wurde das folgende PCR-Programm durchgeführt: (1) 72°C – 5 min,

(2) 94°C – 2 min, (3) 10x: 94°C – 30 sec, 56°C – 30 sec, 72°C – 1 min, (4) 15x: 94°C – 30 sec, 56°C –

30 sec, 72°C – 1 min + 10 sec je Zyklus, (5) 72°C – 7 min, (6) 4°C - ∞.

Nach Ablauf der PCR wurde das Reaktionsvolumen mit 15 µl eines PCR-Mastermixes (identische

Verhältnisse) auf 30 µl aufgefüllt und das PCR-Programm erneut, jedoch ohne beginnende Inkubation

bei 72°C, durchgeführt.

(2 – Nested-PCR) Die amplifizierten Produkte wurden auf Eis abgekühlt, zwanzigfach in TE-Puffer

(nach Abnahme von 8 µl zur späteren Analyse) verdünnt und jeweils 1 µl der verdünnten Probe in der

zweiten PCR eingesetzt. Als Primer wurden die Oligonukleotide NP1 und NP2 eingesetzt (identische

Bedingungen: 0,4 µM NP1, 0,4 µM NP2, 15 µl RV) und das folgende PCR-Programm durchgeführt:

(1) 94°C – 2 min, (2) 11x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1min 10 sec, (3) 72°C – 7 min, (4)

4°C - ∞.

Von den Produkten der ersten und zweiten PCR wurden jeweils ca. 7 µl auf einem 1,5%igen

Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Die zweite PCR wurde bei einem verwendbaren

7 Die Zugabe der zusätzlichen 300 ng Driver-DNA ist nicht dringend erforderlich. Bei einer zu hohen Anzahl falscher Signale

kann der Versuch mit zusätzlicher Driver-DNA wiederholt werden.


Hybridisierungsmuster im größeren Volumen wiederholt, um ausreichende DNA-Mengen für weitere

Versuche vorliegen zu haben. Hierfür wurde 1 µl des PCR-Produktes (Verdünnung 1/20) der Nested-

PCR als Template eingesetzt.

2.4.5 Effizienzkontrolle mittels Lambda-Phagen/Escherichia coli Hybridisierung

Es wurde RsaI hydrolysierte genomische DNA von E. coli K12 und Lambda in einem Verhältnis

gemischt, so dass die Lambda-DNA einen Anteil (gemäß ihrer Größe von 48502 bp) 1% des E. coli

Genoms (4.634.815 bp) ausmachte. Hierfür wurden 118,7 ng E. coli K12 (RsaI hydrolysiert) mit 1,3

ng Lambda DNA (RsaI hydrolysiert) versetzt und die Ligation der Linker durchgeführt. Es wurden die

Hybridisierungsansätze „(E. coli + Lambda) – E. coli“ sowie „(E. coli + Lambda) – (E. coli +

Lambda)“ nach beschriebenem Schema durchgeführt.

2.5 Standard-Methoden zur Auswertung innerhalb der „Subtractive Suppression

Hybridization“ (SSH)

2.5.1 Klonierung von PCR-Fragmenten durch TA-Cloning

(1 – Präparation des Vektors) Die Klonierungseffizienz wurde durch die Generierung für TA-

Cloning geeigneter Enden an dem EcoRV hydrolysierten Vektor (blunt-end) gesteigert.

Innerhalb der auswertenden PCRs und der abschließenden Inkubation bei 72°C für 7 min der Nested-

PCR wurde an das 3’-Ende der Fragmente ein zusätzliches templateunabhängiges A durch die Taq-

Polymerase angefügt. Durch das Anfügen eines einzelnen T an die Blunt-Ends des Vektors wurden

komplementäre Basenüberhänge geschaffen.

Es wurden 5 µg des Vektors pIC19H mit 30 U des RE EcoRV (MBI Fermentas) in einer 70 µl

Reaktion hydrolysiert. Einhundert ng der Restriktion wurden elektrophoretisch auf seine

Vollständigkeit überprüft. Nach Phenol/Chloroformextraktion und Ethanolfällung wurde die DNA in

25 µl TE-Puffer aufgenommen. Die T-Additions-Reaktion lief über 2 h bei 75°C (5 µg blunt-ended

Vektor-DNA, 1 mM dTTP, 5U Taq-Polymerase, 1x PCR-Reaktionspuffer, 3,5 mM Mg2+, 100 µl RV).

(2 – Ligation in den Vektor pIC19H8) Es wurden 160 ng Vektor pIC19H (EcoRV hydrolysiert; T

Addition) mit der dreifach molaren Menge an Insert (ungefähr 88 ng Fragmente der Nested-PCR mit

einer durchschnittlichen Länge von ~500 bp) in einem Reaktionsvolumen von 10 µl unter

Verwendung von 1 µl T4 DNA Ligase (MBI Fermentas, 5U/µl) im Puffer des Herstellers (mit 10%

(v/v) 50% PEG 4000) für 16 h bei RT ligiert.

8 pIC 19H: 2701 bp großer Klonierungsvektor mit der Multiple Cloning Site in dem lac Z-Gen unter Kontrolle des lac-Promotors, AmpR


(3 – Transformation in E. coli JM1099) Es wurden 100 µl kompetenter Zellen von E. coli JM109

mit der zu transformierenden DNA (10 µl Ligationsansatz bzw. 160 ng Plasmid-DNA) gemischt und

für 30 min auf Eis gestellt. Danach wurden die Bakterien für 2 min auf 42°C (Hitzeschock) gestellt, 1

ml LB-Medium dazugegeben und für 60 min bei 37°C inkubiert. Das Bakterienpellet wurde nach

Zentrifugieren bei 2.000 rpm für 2 min und Abnahme von 1 ml Überstand in den verbleibenden 100 µl

resuspendiert und auf einem selektiven Medium zum Blau/Weiß-Screening [0,1 mg/ml / 1 mM IPTG /

0,05 mg/ml X-Gal] ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

2.5.2 Kolonie-Screening zur Identifikation gewünschter Fragmentgrößen

In die PCR-Reaktionsgefäße wurden jeweils 15 µl eines PCR-Mastermix [0,2 U Taq-Pol, 0,4 µM

NP1, 0,4 µM NP2, 100 µM dNTP, 1x PCRPuffer (1,5 mM Mg2+), 15 µl RV] vorgelegt. Mit einer

sterilen Kristall-Pipettenspitze wurden Zellen aus einer Kolonie auf einen definierten Punkt einer

Agarplatte (Replikat) und anschließend weiter in ein PCR-Reaktionsgefäß mit PCR-Mastermix

übertragen [(1) 94°C – 2 min, (2) 25x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min 10 sec, (3) 72°C –

5 min, (4) 4°C – ∞]. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1,5%igen Agarosegel elektrophoretisch

aufgetrennt. Das Replikat wurde bei 37°C inkubiert. Die übertragenen Kolonien wurden innerhalb der

folgenden 6 bis 8 Stunden sichtbar und konnten am selben Tag weiter verwendet werden, um weitere

Reinigungsausstriche anzufertigen. Hiervon wurden Kulturen für Plasmid-Präparationen angelegt.

2.5.3 Präparation von Plasmid-DNA (Minipräparation) durch alkalische Lyse

Präparation von Plasmid-DNA durch alkalische Lyse wurde nach Birnboim und Doly (1979)

durchgeführt. Das Pellet von 1,5 ml Bakterienkultur wurde in 150 µl Lösung I [50mM Glucose / 25

mM Tris / 10 mM EDTA] (alternativ TE oder H2O) resuspendiert, 150 µl Lösung II [0,2 N NaOH /

1% (w/v) SDS] (haltbar bis max. 4 Wochen) zugegeben, gut gemischt und für 30 sec. inkubiert, bis die

Bakterien lysiert waren – erkennbar an der schleimigen Konsistenz der Lösung. Anschließend wurde

150 µl Lösung III [3M Kaliumacetat pH 5,2] [60 ml 5 M Kaliumacetat / 11,5 ml Essigsäure p.a. und

28,5 ml H2O] (alternativ 3 M Natriumacetat pH 4,8) zugegeben und nochmals gründlich gemischt.

Nachdem die Lösung wieder klar war, wurden zwei Tropfen Chloroform zugegeben, wodurch die

Kalium-SDS-Flocken besser pelletieren können, gemischt und für 2 bis 5 min bei Raumtemperatur

zentrifugiert. Der klare Überstand (ca. 400 µl) wurde in ein neues Gefäß überführt, 1 ml Ethanol

zugegeben, gemischt und für 10 bis 15 min bei 4°C bei 15000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde

getrocknet (SpeedVac concentrator, Savant / RVC 2-18, Christ) und in 50 bis 100 µl TE + 1 bis 2 µl 9 JM 109 e14-(mcrA-) recA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (rk- mk+) supE44 relA1 Δ(lac-proAB) (F´traD36 proAB lacIqZΔM15) (YANISCH-PERON et al., 1985)


RNase A (10 mg/ml) gelöst. Es folgte eine Inkubation für 30 min bei 37°C und eine anschließende

Phenol/Chloroform-Reinigung mit Alkoholfällung. Bei Verwendung in Sequenzierungsreaktionen

wurde die DNA abschließend in Wasser anstelle von TE aufgenommen. Alternativ wurde das High

Pure Plasmid Isolation Kit von Roche verwendet.

2.5.4 Blot-Analysen zur Identifikation stammspezifischer Sonden

2.5.4.1 Herstellen eines DIG-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde

Die Arbeiten mit DIG-11-dUTP wurden nach den Richtlinien des DIG Application Manuals von

Roche durchgeführt. Bei der Markierung mittels PCR wurde das DIG-dUTP im molaren Verhältnis

von 1:4 zum dTTP eingesetzt [10 pg Plasmid-DNA, 0,25 µM NP1, 0,25 µM NP2, 40 µM dNTP, 10

µM DIG-dUTP, 1x PCR-Puffer (1,5 mM Mg2+), 0,2 U Taq-Pol, 25 µl RV], [(1) 94°C – 2 min, (2) 10x:

94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min, (3) 15x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min + 10

sec je Zyklus, (4) 72°C – 7 min, (6) 4°C - ∞]. Zusätzlich wurde eine Kontroll-PCR ohne DIG-dUTP

durchgeführt. Beide Produkte wurden elektrophoretisch verglichen, um den Einbau des modifizierten

Nukleotids über das langsamere Laufverhalten bestätigen zu können. Die Aufreinigung des DIG-

markierten PCR-Produktes zum Entfernen nicht inkorporierter Nukleotide erfolgte durch Ethanol-

Fällung oder durch Aufreinigung mittels eines PCR-Purification-Kits (High Pure PCR Product

Purification Kit, Roche). Die Sonde wurde bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.

2.5.4.2 Herstellen eines Biotin-markierten PCR-Produktes als Sequenzsonde

Zur Erstellung von Biotin-markierten Sonden wurden folgende biotinilierte M13-Primer verwendet:

M13 F-Biotin* 5`- ACG ACG TTG TAA AAC GAC GGC CAG –3´, M13 Rev-Biotin * 5`- CAC

ACA GGA AAC AGC TAT GAC –3´ unter den Reaktionsbedingungen [1 ng Plasmid-DNA, 0,2 U

Taq-Pol, 0,4 µM M13F-Biotin, 0,4 µM M13Rev-Biotin, 100 µM dNTP, 1x PCRPuffer (1,5 mM

Mg2+), 25 µl RV] und dem PCR-Programm [(1) 94°C – 2 min, (2) 10x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec,

72°C – 1 min, (3) 15x: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min + 10 sec je Zyklus, (4) 72°C – 7

min, (6) 4°C - ∞]. Die Markierung mit biotinilierten Nested-Primern (NP1, NP2) verlief unter

identischen Bedingungen. Die Aufreingung erfolgte über ein PCR-Purification-Kit (High Pure PCR

Product Purification Kit, Roche). Die Sonde wurde bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt.


2.5.4.3 Überprüfung der Markierungseffizienz der Sonde

Von dem DIG-markierten PCR-Produkt wurden Verdünnungen von 1:10, 1:50, 1:100, 1:500, 1:1000,

1:5000 auf die Nylonmembran aufgetragen, getrocknet und UV-fixiert. Von einem markierten

Standard (Roche) wurde eine vergleichbare Verdünnungsreihe aufgetragen. Die erstellte Membran

wurde einem verkürzten Detektionsverfahren unterzogen: 2 min Blockierungslösung (20 ml) [1%

(w/v) blocking reagent in Puffer 1], 3 min Blockierungslösung mit Antikörpern gegen DIG (0,375 U

in 10 ml Blockierunglösung), 1 min Blockierungslösung (10 ml), 1 min Waschen in 10 ml Puffer 1

[100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5], 1 min Äquilibrieren in 10 ml Puffer 3 [100 mM

Tris/HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5], Zugabe von 2 ml Färbe-/Substratlösung

(BCIP/NBT). Der Ansatz wurde für 30 min dunkel inkubiert.

2.5.4.4 Southern-Blot

Southern-Blots wurden nach Angaben der Current Protocols in Molecular Biology durchgeführt

(Section IV, Unit 2.9A, Southern Blotting onto a nylon or nitrocellulose membrane with high-salt

buffer, basic protocol). Es wurden jeweils 5 µg der genomischen DNA von den zu kontrollierenden

Stämme in einem Volumen von 20 µl mit demjenigen Restriktionsenzym geschnitten, mit dem auch

die Fragmente für die Subtraktionshybridisierung erstellt wurden. Restriktionsenzyme wurden nach

den Instruktionen des Herstellers verwendet (10 U je 5 µg DNA). Die Hydrolyse erfolgte über Nacht.

Die Fragmente wurden mit 6fach AP versetzt und auf einem 1%igen Agarosegel elektrophoretisch

aufgetrennt. Nach der Videodokumentation folgte die Denaturierung der Nukleinsäuren. Das

Agarosegel wurde für 15 min in 100 ml 0,25 M HCl, für 30 min in 100 ml Denaturierungslösung [0,5

N NaOH / 1,5 M NaCl], und für 60 min in 100 ml Neutralisationslösung [0,5 M Tris/HCl / 3 M NaCl /

pH 7.5] geschwenkt, wobei nach 30 min der Puffer getauscht wurde. Die Nukleinsäuren im Gel

wurden durch Kapillar-Blot mit Hochsalzpuffer (20x SSC) auf eine Nitrocellulose-Membran

(OPTITRAN BA-S85, reinforced NC, Schleicher & Schuell) übertragen: Die Nitrocellulosemembran

wurde mit destilliertem Wasser angefeuchtet und für 10 min in 20x SSC belassen bevor sie auf die

Oberfläche des Agarosegels gelegt wurde. Der Transfer verlief über Nacht. Die DNA auf der

Membran wurde nach kurzem Spülen mit 2x SSC durch UV-Crosslinking fixiert. Hierfür wurde die

leicht feuchte Membran für 3 min mit UV-Licht (312 nm) bestrahlt (Typ W-IL-200-M, Bachhofer

GmbH, Reutlingen). Die Membran wurde anschließend direkt in der Hybridisierung eingesetzt oder

luftdicht bei 4°C aufbewahrt.


2.5.4.5 Hybridisierung

Sondenhybridisierungen wurden mit leichten Modifikationen nach Angaben des DIG Application

Manual for Filter Hybridization durchgeführt (Roche Molecular Biochemicals, 2000). Für die

Prähybridisierung wurde die Membran zusammen mit der Hybridisierungslösung (20 ml pro 100cm2

Membran) [1% (w/v) Blocking-Reagent in Puffer 1] in einem Plastikbeutel eingeschweißt. Die

Inkubation erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln zum Abdecken

unspezifischer Bindungsstellen. Die gereinigte Sonde (2 µl des PCR-Produktes / 1 ml

Hybridisierungslösung) wurde mit Wasser auf ein Volumen von 50 µl aufgefüllt und durch

10minütiges Aufkochen und anschließendem Abkühlen auf Eis denaturiert. Nach dem Entfernen der

Prähybridisierungslösung wurden 5 ml Hybridisierungslösung zusammen mit der denaturierten Sonde

im Plastikbeutel luftblasenfrei verschweißt und über Nacht bei 65°C inkubiert.

2.5.4.6 Detektion

Nach der Hybridisierung wurde die nicht gebundene DIG-markierte Sonde durch mehrmaliges

Waschen entfernt. Die Membran wurde zweimal mit je 200 ml 2x SSC mit 0,1% SDS für jeweils 5

min bei RT unter leichtem Schütteln gewaschen. Der Waschschritt wurde zweimal mit 0,5x SSC mit

0,1% SDS für jeweils 15 min bei 65°C wiederholt. Die Membran wurde für 1 min in 15 ml Puffer 1

[100mM Maleinsäure, 150 mM NaCl pH 7,5] mit 0,3% (v/v) Tween 20 äquilibriert. Unspezifische

Antikörperbindungen wurden durch Inkubation für 30 min in 15 ml 1xBlockierungslösung [1% (w/v)

Blocking-Reagent in Puffer 1] verhindert. 20 ml Blockierungslösung wurden mit 1 µl Antikörper (0,75

U) versetzt und für 30 min bei RT inkubiert. Die Membran wurde für 2 x 15 min in 100 ml Puffer 1

mit 0,3 % (v/v) Tween 20 bei RT gewaschen und für 5 min in 20 ml Puffer 3 [100 mM Tris/HCl, 100

mM NaCl, pH 9,5] inkubiert. Nach dem Abgießen des Puffers wurden 2 ml der Färbe-/Substratlösung

(BCIP/NBT) direkt auf die Membran pipettiert und anschließend die Petrischale dunkel gehalten und

nicht bewegt. Nach ungefähr 1 h war die Färbereaktion abgeschlossen.

2.5.4.7 Dot-Blots auf ungeladener Nylon-Membran

Die Dot-Blots wurden nach Maßgabe des Current Protocol in Molecular Biology erstellt (2.9.18.

Preparation and Analysis of DNA, Alternate Protocol, Manual Preparation of a DNA Dot Blot). Ein

Streifen einer ungeladenen Nylonmembran (QIABRANE, Nylon membrane, uncharged, QIAGEN)

wurde auf die gewünschte Größe zugeschnitten (ca. 1cm x 2,5cm). Mit einer umgekehrten

Kristallspitze (10µl) wurde durch festes Aufdrücken eine Markierung auf der Membran aufgebracht.

Die Membran wurde in Wasser angefeuchtet und für 10 min in 6x SSC untergetaucht.


Zu jeder DNA-Probe wurde ½ Volumen 20x SSC auf eine Endkonzentration von 6x SSC zugefügt.

Die DNA wurde bei 98°C für 10 min denaturiert und anschließend auf Eis abgekühlt. Die Membran

wurde bei Raumtemperatur angetrocknet, bis sie nur noch leicht angefeuchtet war. Jede Probe wurde

in einer Tischzentrifuge für 5 sec abzentrifugiert, die Probe in Aliquots von 1-1,5 µl auf die Membran

aufgebracht und durch eine beheizbare Unterlage getrocknet (ca. 50°C) (MR 2002, Heidolph). Durch

mehrmaliges Auftragen nach Trocknung der einzelnen Aliquots wurde die gewünschte DNA-Menge

(2 µg, RsaI hydrolysiert ) auf der Membran fixiert. Hierbei wurden insgesamt nicht mehr als 10 µl

aufgetragen. Die abschließende Trocknung der Membran geschah bei Raumtemperatur. Es folgte die

Denaturierung, Neutralisation und Immobilisierung der DNA. Die Membran wurde für 10 min auf

einem Stück Whatman 3MM Papier, das mit Denaturierungslösung [1,5 M NaCl / 0,5 M NaOH]

getränkt war, platziert und anschließend für 5 min auf ein Stück Whatman 3MM-Papier, getränkt mit

Neutralisationslösung [1M NaCl / 0,5 M Tris-HCl / pH 7.0], übertragen. Die Membran wurde auf ein

Stück trockenes Whatman 3MM-Papier gelegt und über mehrere Stunden getrocknet. Es folgte die

UV-Fixierung der trockenen Membran bei 256 nm für 23 sec. (160 Joule/m2) (UV-Lampe VL-6.MC,

VILBER LOURMAT). Bis zum Gebrauch wurde die Membran zwischen zwei Lagen Whatman 3MM

Papier bei RT gelagert. Die Sondenhybridisierung erfolgte wie für den Southern-Blot beschrieben. Die

Hybridisierung wurde für jede Sonde in einem 1,5 ml Cap durchgeführt, in dem die Nylon-Membran

platziert wurde.

2.5.5 DNA-Sequenzierung und Erstellen stammspezifischer PCR-Systeme

(1 – DNA-Sequenzierung von klonierten Fragmenten) Der Einsatz der DNA in die

Sequenzierreaktion erfolgte direkt aus der beschriebenen Plasmid-Präparation ohne weitere

Aufreinigung. Die Sequenzierung der Inserts wurde mit dem BigDye Terminators v1.1 Cycle

Sequencing Kit von Applied Biosystems System nach Angaben des Herstellers durchgeführt (s.

Abschnitt DNA-Sequenzierung). Als Sequenzierprimer wurden M13 F 5`- GCC AGG GTT TTC

CCA GTC ACG A –3´und M13 Rev 5`- GAG CGG ATA ACA ATT TCA CAC AGG –3´ genutzt.

(2 – Sequenzanalyse und Erstellen von fragmentabhängigen Primerpaaren) Das Alignment der

Forward und Reverse-Sequenzen wurde unter Verwendung des Programms BioEdit10 5.0.9, © 1997-

2001, von Tom Hall (1999) durchgeführt. Da methodenbedingt keine Aussage über den Plus/Minus-

Strang der Sequenz gemacht werden kann, wurden die Sequenzen der Forward-Sequenzierung als

Plus-Strang angegeben. Die ermittelten Sequenzen wurde über NCBI BLASTN11 2.2.3 (Altschul et al.

1997) mit den vorgegebenen Standardeinstellungen mit den Datenbankbeständen abgeglichen.

10 BioEdit 5.0.9, © 1997-2001, von Tom Hall, http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html 11 NCBI BLASTN , http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmlhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/


Stammspezifische Primerpaare wurden über den Oligo Explorer12 1.1.0 (© 2001-2002) von Teemu

Kuulasmaa erstellt.

(3 - stammspezifische PCR-Systeme) Die ermittelten Primer wurden in Konzentrationen von 0,4 µM

je Primer eingesetzt (0,2 U Taq-Pol, 0,4 µM P1, 0,4 µM P2, 100 µM dNTP, 1x PCR-Puffer (1,5 mM

Mg2+, ad 20 µl RV). Die Annealingtemperatur wurde für den Einsatz in einer Multiplex-PCR über

einen Gradienten getestet. In den stammspezifischen PCR-Systemen für die Lactococcus-Stämme

1526 und 1760 fanden die folgenden Primerpaare mit der Annealingtemperatur von 56°C

Verwendung:

Spezifisch für Stamm 1760: A2-17-15F: 5´- CCG GCT TGT TCT AAC TTT CC -3´ (20 nt), A2-17-

15R: 5´- CAA CCC CTG TTA TCT ATT GGA C -3´ (22 nt), (322 bp) und A5-17-15F: 5´- TGA GGT

ATT GTG GCA ACT GTT C -3´ (22 nt), A5-17-15R: 5´- GCC AAT GAA AGA CGG AAA AC -3´

(20 nt), (89 bp) sowie spezifisch für Stamm 1526: A22-15-17F: 5´- GGG TGC TTG ACC TTA CCA

G -3´ (19 nt), A22-15-17R: 5´- GGG AGC AAA AGA CGA TTA CC -3´ (20), (166 bp) und A23-15-

17F: 5´- CGC TTG AGC TCA TTA GTT CTT G -3´ (22 nt), A23-15-17R: 5´- GGG ACG GTG ATA

TTG ATT GG -3´ (20 nt), (271 bp).

In Multiplex-PCRs wurden die Primer entsprechend der Länge ihres PCR-Produktes im Verhältnis 2

zu 1 (kurz zu lang) mit einer maximalen Konzentration von 0,4 µM je Primer eingesetzt.

2.5.6 Sequenzierung von Fragmenten aus Agarosegelen ohne Klonierung

(1 – Isolierung, Amplifikation und Aufreinigung des Fragmentes aus einem Agarosegel) Die

Auftrennung des Hybridisierungsmusters der Nested-PCR erfolgte auf einem 1,5%igen Agarosegel.

Die Elektrophoreseanlage war durch mehrmaliges Spülen mit MilliQ-Wasser von Nukleinsäuren

weitestgehend befreit worden. Nach Ethidiumbromidfärbung und Visualisierung unter UV-Licht

wurde mit einer Kristallspitze eine Probe aus der zu analysierenden Bande entnommen und diente als

Template in einer folgenden Amplifikation. Als Primer wurden die Oligonukleotide NP1 und NP2

eingesetzt (2,5 U Taq-Pol, 0,4 µM NP1, 0,4 µM NP2, 100 µM dNTP, 1x PCR-Puffer (1,5 mM Mg2+),

200 µl RV, aufgeteilt auf 4 getrennte Reaktionsvolumina) und das folgende PCR-Programm

durchgeführt: (1) 94°C – 2 min, (2) 30X: 94°C – 30 sec, 65°C – 30 sec, 72°C – 1 min 30 sec, (3) 72°C

– 5 min, (4) 4°C – ∞. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1,5%igen Agarosegel aufgetrennt und die

Banden aus dem Gel eluiert (DNA Extraction Kit, Fermentas).

(2 – Sequenzierung des PCR-Produktes) Zur Sequenzierung des PCR-Produktes wurde das BigDye

Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kit von Applied Biosystems unter Verwendung der Primer NP1

(forward) und NP2 (reverse) der Nested-PCR genutzt (s. Abschnitt DNA-Sequenzierung). In die

Sequenzierung wurden 5 ng des isolierten Fragmentes als Template eingesetzt. 12 Oligo Analyzer 1.0.2 / Oligo Explorer 1.1.0, © 2000-2002; Teemu Kuulasmaa, M.Sc., University of Kuopio, P.O. Box 1627, 70211 Kuopio, FINLAND, [email protected], http://www.uku.fi/~kuulasma/OligoSoftware

mailto:[email protected]://www.uku.fi/~kuulasma/OligoSoftware


2.6 Subtraktive Hybridisierung durch Immobilisierung

Die Subtraktionshybridisierung mit Immobilisierung der Subtraktor-DNA wurde mit Modifikationen

nach Wassill et al. (1998) durchgeführt.

(1 – Verwendete Oligonukleotide für die Subtraktionshybridisierung) Die Oligonukleotide, die

zur Präparation der Linker benötigt wurden, wurden von Sigma-ARK bezogen: P1, 5´-AGG GGA

TAA CCA ATT CAC ACA CCA-3´ (24 nt), P2, 5´-P-TAT GGT GTG TGA ATT GGT TAT CCC

CT-3´ (26 nt), S1, 5´-CGC CAG GGA ACA CCC AGT CAC GAC-3´ (24 nt), S2 5´-P-TAG TCG

TGA CTG GGT GTT CCC TGG CG-3´ (26 nt).

(2 – Theoretische Analyse zur Restriktion) Die Analyse der Genome in Hinblick auf potentiell

verwendbare Restriktionsendonukleasen mit einem möglichst großen Erfassungsbereich wurde mit

dem Computerprogramm pDRAW32 1.0 revision 1.1.45 von Kjeld Olesen (s. o.) durchgeführt.

(3 – Restriktionskinetik) Es wurden 50 µg DNA mit 20 U (2µl) MseI (New England Biolabs) nach

Angaben des Herstellers in 125 µl Ansätzen unter zeitgleichem Einsatz von RNase A hydrolysiert

(EK: 80 µg/ml). Zu den Zeitpunkten 5, 10, 15, 30, 60 Minuten sowie über Nacht, wurde ein Aliquot

von 20 µl abgenommen, die Restriktion mit 2 µl 0,5 M EDTA gestoppt, und bis zur weiteren

Verwendung eingefroren. Die Aliquots wurden elektrophoretisch auf einem 1%igen Agarosegel

aufgetrennt, die Fragmente im Größenbereich zwischen 100 und 1000 bp ausgeschnitten und

elektrophoretisch aus dem Gel isoliert (S&S BIOTRAP, Schleicher & Schuell).

(4 – Hybridisierung der Linker für Subtraktor- und Probenstamm) Sechs µg der Oligonukleotide

P1/P2 und S1/S2 (2 µl 200 µM Oligo = ~3 µg) wurden in 40 µl [10 mM Tris/HCl, 50 mM NaCl, pH

8,0] gemischt, bei 98°C für 2 min denaturiert und von 70 °C auf 20°C abgekühlt, um doppelsträngige

Linker P und S zu bilden. Beide Linker tragen 5’-MseI kompatible Überhänge. Die Hybridisierung der

Oligonukleotide zur Linkerstruktur erfolgte in einem kontinuierlichen Temperaturgradienten durch die

natürliche Abkühlungskurve eines Wasserbades. Alternativ wurde die Hybridisierung in einem

Thermocycler durchgeführt. Hier wurde die Ausgangstemperatur von 70°C für 3 min beibehalten und

alle 5 min um 1°C bis auf 20°C abgesenkt.

(5 – Ligation der Linker an die Genomfragmente) Der Linker P (600 ng) wurde an die MseI

hydrolysierten Fragmente des Proben-Stammes (200 ng) sowie der Linker S an die MseI hydrolysierte

DNA des Subtraktor-Stammes ligiert. Der Ansatz wurde auf 37°C erhitzt und innerhalb von 15 min

auf 16°C abgekühlt, bevor Ligase zugegeben wurde. Die Ligation erfolgte mit 2 U T4 DNA Ligase

(MBI Fermentas) unter Zusatz von 20% (v/v) 50% PEG 4000 im Volumen von 30 µl bei 16°C über

Nacht. Die Inaktivierung der Ligase erfolgte bei 65°C für 15 min. Überschüssige Linker wurden

entfernt (High Pure PCR Product Purification Kit, Roche).

(6 – Amplifikation der Fragmente) Fünf ng der modifizierten Proben-DNA wurden als Template zur

PCR-Amplifikation mittels des Primer P1 eingesetzt (200 µM dNTP, 2 µM Primer (P1), 5 U Taq-

Polymerase, 1x PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2) 50 µl RV). [(1) 94°C – 2 min, (2) 10x: 94°C – 30 sec,

Entwicklung von stammspezifischen PCR-Systemen mittels...

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