INAUGURAL-DISSERTATION - elib.tiho-hannover.de · Gerade die IVP humaner Blastozysten und der...

Aus dem Institut für Reproduktionsmedizin

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Charakterisierung der porcinen Zona pellucida

und ihrer Veränderungen während der In-vitro-Maturation

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin

der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Silja Ebeling

aus Hannover

Hannover 2002

Wissenschaftliche Betreuung:

Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen

1. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Dr. med. habil. Edda Töpfer-Petersen 2. Gutachter/in: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Bernd Otto Tag der mündlichen Prüfung: 04. Juni 2002

You hold a candle in your heart You shine the light on hidden parts You make the whole world wanna dance You‘ve bought yourself a secound chance

(Garbage, beautifulgarbage)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS······························································································ 7

A EINLEITUNG······················································································································ 11

B LITERATURÜBERSICHT································································································· 14

1. Vorbemerkungen·········································································································· 14

2. Das Spermium·············································································································· 17

2.1. Aufbau und Entwicklung···································································································17

2.2. Epididymale Reifung und Einfluss des Seminalplasmas·················································· 19

2.3. Spermienveränderungen im weiblichen Genitale····························································· 20

3. Die Oozyte····················································································································22

3.1. Entwicklung und Aufbau···································································································22

3.2. Maturation der Oozyte in vivo···························································································24

4. Gameteninteraktion······································································································ 26

5. Die Zona pellucida······································································································· 28

5.1. Aufbau und Entwicklung···································································································29

5.2. Oligosaccharidstrukturen···································································································31

5.3. Spermien-Zona pellucida-Interaktionen············································································37

5.4. Die Zona pellucida nach der Befruchtung·········································································41

5.5. Antikörper gegen Zona pellucida als Immunokontrazeptiva············································ 43

C MATERIAL UND METHODEN························································································ 44

1. Isolierung der Zona pellucida················································································· 44

1.1. Massenaufarbeitung···········································································································44

1.2. Gewinnung von Zonae pellucidae aus frischen Ovarien···················································45

1.3. In-vitro-Maturation der Oozyten······················································································· 47

1.4. Überprüfung des Kernreifungsstatus·················································································47

2. Elektrophoretische Auftrennungen·········································································48

2.1. Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der ZP·····································48

2.2. Zweidimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der ZP·································· 50

3. Immuno- und lektinologische Analyse der ZP Glykoproteine am Proteinblot·············································································································· 52

3.1. Chemilumineszenzverfahren····························································································· 52

3.2. Immunologische Identifizierung der Glykoproteine der ZP··············································54

3.3. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP·········································· 55

Inhaltsverzeichnis_____________________________________________________________

4. Rasterelektronenmikroskopie················································································· 57

5. Funktioneller Vergleich von ZP ungereifter und in vitro gereifter Oozyten··········58

5.1. Aufbereitung der Spermien································································································58

5.2. Spermatologische Untersuchungen····················································································59

5.3. Induktion der Akrosomreaktion durch die Zona pellucida················································61

5.4. Statistische Auswertung·····································································································62

D ERGEBNISSE····················································································································· 64

1. Gewinnung der Oozyten und Isolierung der Zonae pellucidae······························ 64

2. SDS-Gelelektrophorese·························································································· 65

2.1. 1D-PAGE der Glykoproteine der Zona pellucida······························································65

2.2. 2D-PAGE der Glykoproteine der Zona pellucida······························································67

3. Immunologische Charakterisierung der ZP Proteine············································· 69

4. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP······························· 71

5. Rasterelektronenmikroskopische Studien······························································ 78

6. Die Fähigkeit der ZP zur Induktion der Akrosomreaktion in Abhängigkeit vom Reifungsstatus der Oozyte ····················································································· 80

E DISKUSSION······················································································································ 92

1. Verhalten der porcinen ZP in der PAGE································································ 92

2. Charakterisierung der ZP durch Antikörper und Lektine·······································96

3. Ultrastrukturelle Untersuchung der ZP································································ 102

4. Funktioneller Vergleich von ungereifter und gereifter ZP··································· 104

5. Unterschiede zwischen der ZP von in vitro und in vivo gereiften Oozyten········ 108

6. Abschlussbetrachtung und Ausblick···································································· 109

F ZUSAMMENFASSUNG··································································································· 111

G SUMMARY······················································································································· 113

H LITERATURVERZEICHNIS··························································································· 115

J ANHANG···························································································································· 136

1. Rezeptverzeichnis·································································································136

2. Tabellen zur Auswertung der funktionellen Bindungstests··································139

3. Multifaktorielle Varianzanalyse··········································································· 142

K DANKSAGUNG················································································································144

Abkürzungsverzeichnis


Abb. Abbildung aggl. agglutinin (Lektin) AK Antikörper APS Ammoniumpersulfat AQN Protein der porcinen Spermadhäsine; A, Q und N stehen für die ersten drei Aminosäuren des N-Terminus Aqua bidest. Aqua bidestillata Asn203 Asparagin an der 203. Stelle ATP Adenosintriphosphat AWN Protein der porcinen Spermadhäsine; A, W und N stehen für die ersten drei Aminosäuren des N-Terminus BSA Bovine Serum Albumin (Rinderserumalbumin) bZP bovine Zona pellucida bzw. beziehungsweise °C Grad Celcius ca. circa Ca2+ Kalziumionen cAMP cyclic adenosin monophosphate cm Zentimeter CO2 Kohlenstoffdioxid conj. conjugiert Da Dalton db-cAMP dibutyryl-cAMP DNA desoxyribonucleotide acid, Desoxyribonukleinsäure 1D-Membran PVDF-Membran mit transferierten Proteinen nach 1D-PAGE 2D-Membran PVDF-Membran mit transferierten Proteinen nach 2D-PAGE 1D-PAGE eindimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese 2D-PAGE zweidimensionale Polyacrylamidgelektrophorese DTT Dithiothreitol EM Elektronenmikroskop et al. et alii (und andere) etc. et cetera (und so weiter) evtl. eventuell g Gramm FITC Fluoreszeinisothiocyanat GalTase Galaktosyltransferase GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung GV Germinalvesicle GVBD Germinalvesicle Breakdown h hour (Stunde) hCG human Chorionic Gonadotropin Hepes N-(2-hydroxyethyl)piperazin-N’-2-ethan

Abkürzungsverzeichnis________________________________________________________

HPLC High Pressure Liquid Chromatography HRPO horse radish peroxidase (Meerrettichperoxidase) hZP humane Zona pellucida ICSI intrazytoplasmatische Spermieninjektion IP isoelektrischer Punkt IPG immobilisierter pH-Gradient IVF In-vitro-Fertilisation IVM In-vitro-Maturation IVP In-vitro-Produktion kDa Kilodalton kg Kilogramm KOK Kumulus-Oozyten-Komplex l Liter LM Lichtmikroskop LMW Low Molecular Weight LPC Lyso-Phosphatidylcholin M Molar M II Metaphase II mA/cm2 Milliampere pro Quadratzentimeter mg Milligramm min Minute ml Milliliter mM Millimolar mm Millimeter mmHg Millimeter Quecksilbersäule mod. modifiziert mZP murine Zona pellucida NaCl Natriumchlorid NCSU North-Carolina-State-University neg. negativ ng Nanogramm N-Glykan/glykosidisch Protein mit Zuckerkette, welche über eine NH2-Gruppe einer

Aminosäure mit diesem verknüpft ist NH2-Gruppe Aminogruppe nm Nanometer Nr. Nummer OD Optische Dichte OH-Gruppe Hydroxylgruppe O-Glykan/glykosidisch Protein mit Zuckerkette, welche über eine OH-Gruppe einer

Aminosäure mit diesem verknüpft ist p Probabilität, Irrtumswahrscheinlichkeit PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PBS Phosphat-Buffered-Saline (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) pH pondus Hydrogenii, Wasserstoffionenkonzentration PI Propidiumjodid pI pH-Wert am isoelektrischen Punkt PMSG Pregnant Mare’s Serum Gonotropin


pos. positiv PSP porcine Seminalplasmaproteine PVA Polyvinylalkohol PVDF Polyvinylidene Difluoride PVM perivitelline Matrix pZP porcine Zona pellucida REM Rasterelektronenmikroskop s. siehe SDS Sodium-Dodecyl-Sulfate Standardabw. Standardabweichung sec Sekunde SUZI subzonale Insemination Tab. Tabelle TBS Tris-Buffered-Saline (Trisgepufferte Kochsalzlösung) TEMED N,N,N’N’-Tetramethylethylendiamin TG-Sperma Tiefgefriersperma Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan u. und u.a. unter anderem µg Mikrogramm µl Mikroliter µm Mikrometer V Volt vgl. vergleiche v/v volume/volume (Volumen/Volumen) vWW van der Waal’sche Wechselwirkungen w/v weight/volume (Gewicht/Volumen) xg x-fache der Erdbeschleunigung z.B. zum Beispiel ZBP Zona pellucida bindende Proteine ZP Zona pellucida Einbuchstaben- und Dreibuchstabencode der angesprochenen Aminosäuren A Ala Alanin P Pro Prolin C Cys Cystein Q Gln Glutamin D Asp Asparaginsäure R Arg Arginin E Glu Glutaminsäure S Ser Serin G Gly Glycin T Thr Threonin I Ile Isoleucin V Val Valin K Lys Lysin W Trp Tryptophan L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin N Asn Asparagin

Abkürzungsverzeichnis________________________________________________________

Erläuterungen zu den Zuckerstrukturen Fuc Fukose

Gal Galaktose

GalNAc N-Acetylgalaktosamin

Glc Glukose

GlcNAc N-Acetylglukosamin

Man Mannose

Neu Neuramin- oder Sialsäure

NeuNAc, NANA N-Acetylneuramin- oder N-Acetylsialsäure

Manα Mannose in α-Stellung verknüpft (gilt auch für andere Zucker)

Manβ Mannose in β-Stellung verknüpft (gilt auch für andere Zucker)

(1-4) zwei Monozucker sind über ihre Kohlenstoffatome C1 und C4

verknüpft, gilt auch für andere Zahlenkombinationen

Lektine AAA Anguilla anguilla agglutinin

ACA Amaranthus caudatus agglutinin

Con A Concanavalin A agglutinin

DSA Datura stramonium agglutinin

ECA Erythrina cristagalli agglutinin

GS I Griffonia simplicifolia agglutinin I

Jacalin Artocarpus integrifolia agglutinin

MAA II Maackia amurensis agglutinin II

PNA Peanut agglutinin

RCA I Ricinus communis agglutinin I

SNA Sambucus nigra agglutinin

Die Begriffe Spermium und Spermatozoon werden synonym verwendet,

ebenso die Bezeichnungen Eizelle und Oozyte.

A Einleitung

11

A Einleitung

Im Laufe der letzten Jahre haben die assistierenden und In-vitro-Produktionstechniken (IVP)

im Bereich der Fortpflanzung immer mehr an Bedeutung gewonnen. Gerade die IVP humaner

Blastozysten und der kommerzielle Transfer boviner mittels IVF (In-vitro-Fertilisation)

erzeugten Blastoysten (BOUSQUET et al. 1999) werden schon routinemäßig angewendet.

Beim Schwein hingegen sind die Methoden auf Laborebene gut entwickelt (PRATHER u.

DAY 1998), aber zur Zeit nicht als praxisrelevant zu betrachten.

Als Ursachen der geringen Befruchtungsraten der IPV sind u.a. Polyspermie und übermäßiges

Zona hardening zu nennen. Ein weiterer Aspekt ist die In-vitro-Reifung der Eizellen im

Vorfeld der eigentlichen IVF. Die Oozyte wird als gereift angesprochen, wenn sie sich im

überprüfbaren Kernstatus der Metaphase II befindet. Von der Kernreifung sind jedoch noch

die zytoplasmatische Reifung und die Reifungsprozesse an der Zona pellucida abzugrenzen.

Die beiden zuletzt genannten Veränderungen sind schwerer zu erfassen, scheinen aber eine

funktionelle Bedeutung zu besitzen. Um Ansatzpunkte für Verbesserungen der

Fertilisationsraten der IPV zu erreichen, bietet sich eine genauere Untersuchung der die

Oozyte umgebenden Zona pellucida (ZP) an.

Die erste Kontaktaufnahme zwischen Spermium und Eizelle, Bindung und

Gametenerkennung finden an der ZP statt. Sie induziert die Akrosomreaktion der

kapazitierten Spermien und ist am Polyspermieblock beteiligt. Die Polyspermie ist ein

Problem der IVP, welches als insuffizienter Zonablock zwischen Spermium und Oozyte

anzusehen ist (KOUBA et al. 2000). Weiterhin schützt die ZP die Eizelle und die Blastocyste

vor äußeren Einflüssen.

Aufgrund der Bedeutung der ZP für die Befruchtung wurden Hemizonabindungsassays

(BURKMAN et al. 1988) etabliert, um die Qualität und Eignung von Spermien für bestimmte

Oozyten testen zu können.

Ein weiteres Forschungsgebiet ist die Entwicklung von immunologischen Kontrazeptiva

(KIRKPATRICK et al. 1996), die gegen bestimmte Antigene der ZP gerichtet sind.

A Einleitung_________________________________________________________________

12

Die Bindung und Signalübertragung des Spermatozoons an die ZP wird über

oberflächenassozierte Proteine der Spermien und die Zuckerseitenketten der ZP vermittelt.

Bei der Maus sind die Strukturen weitestgehend aufgeklärt, bei den höheren Säugetieren

jedoch noch nicht. Die fehlende Schichtung in der räumlichen Struktur (TALBOT u. DI

CARLANTONIO 1984) und die alleinige Synthese der ZP durch die Eizelle bei der murinen

ZP (BLEIL u. WASSARMAN 1980b) stehen den Variationen in der morphologischen

Architektur (VANROOSE et al. 2000) und der zusätzlichen Beteiligung von Granulosazellen

(SINOWATZ et al. 2001) an der ZP Synthese bei höheren Säugern gegenüber. Dies spricht

für auch genauso große Unterschiede in der Kohlenhydratstruktur und der dreidimensionalen

Architektur der Zona pellucida.

Gerade das Schwein eignet sich gut als Modelltier für biochemische Analysen, da über das

Schlachthofmaterial relativ große Mengen von Eizellen zur Verfügung stehen und homologe

Gensequenzen (HARRIS et al. 1994) mit denen der ZP z.B. von Rind und Mensch

nachgewiesen worden sind. Viele Strukturen wurden bereits über die Lektinhistochemie und

durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie mit anschließender Aminosäuren- und

Zuckeranalyse untersucht.

Nur bei der Maus ist ebenfalls schon aufgeklärt, wie die drei Glykoproteine der ZP strukturell

zu einander angeordnet (WASSARMAN u. MORTILLO 1991) und welches ihre einzelnen

Aufgaben sind (WASSARMAN 1988). Bei den höheren Haussäugetieren und beim

Menschen stehen genauere Erkenntnisse, beispielsweise welches ZP Protein nun für welche

Bindung an das Spermium verantwortlich ist, noch aus.

A Einleitung

13

In der vorliegenden Arbeit sollten nun mögliche Veränderungen der Zona pellucida während

der In-vitro-Maturation näher untersucht werden. Um Veränderungen aufzeigen zu können,

mussten zunächst Charakterisierungen der ZP ungereifter Oozyten vorgenommen werden.

Dazu wurden die Proteine durch eine zweidimensionale SDS-Polyacrylamid-

Gelelektrophorese nach isoelektrischen Punkt und relativen Molekulargewicht aufgetrennt.

Nach Transfer auf PVDF-Membranen erfolgte eine Analyse der Kohlenhydratstrukturen.

Diese wurde mit Lektinen durchgeführt, die an definierte Zuckerstrukturen binden. Mittels

Antikörpern wurden die einzelnen Glykoproteine der ZP charakterisiert. Im Anschluss an die

lektinologischen und immunologischen Untersuchungen der ZP Glykoproteine von

ungereiften Eizellen sollten sich entsprechende Analysen von Glykoproteinen der ZP in vitro

gereifter Eizellen anschließen. So ist es möglich, Umstrukturierungen bezüglich des

isoelektrischen Verhaltens und/oder der Kohlenhydratstrukturen der ZP während der In-vitro-

Reifung auf die Spur zu kommen.

Neben der biochemischen Untersuchung sollten auch Analysen zur Verteilung der

exponierten Kohlenhydrate über die die Oberfläche der ZP angefertigt werden. Dies geschah

mittels rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der ZP von intakten Eizellen, nachdem

diese mit goldgekoppelten Lektinen und einer Silverenhancement-Technik behandelt worden

waren.

Damit die funktionelle Bedeutung eventueller Veränderungen gezeigt werden kann, sollte

zum Abschluss ein Spermatozoen-Zona pellucida-Bindungstest folgen. Als Untersuchungs-

parameter wurde die Fähigkeit der Zona pellucida zur Induktion der Akrosomreaktion von

kapazitierten Spermien gewählt. Ein diesbezüglicher Vergleich von ungereifter und gereifter

ZP sollte nähere Erkenntnisse über die Modifikationen der Zona pellucida während der

Reifung liefern.

Diese Untersuchungen sollten einen Beitrag leisten zur biochemischen, morphologischen und

funktionellen Charakterisierung der ZP und ihrer Reifungsprozesse, um so ein besseres

Verständnis der physiologischen Befruchtungsvorgänge und Ansätze zur weiteren Forschung

zwecks Optimierung von Biotechniken zu ermöglichen.

B Literaturübersicht___________________________________________________________

14

B Literaturübersicht

1. Vorbemerkungen Um eine erfolgreiche Befruchtung zu gewährleisten, müssen beide Gameten

Entwicklungsprozesse und Aktivierungsstufen durchlaufen. Die Spermatozoen unterliegen

nach ihrer Bildung im Hoden bestimmten Reifungsvorgängen und einer Versetzung in einen

Ruhezustand der eigentlich schon befruchtungskompetenten Spermien durch das

Nebenhodensekret und das Seminalplasma. Nach der Ejakulation werden sie im weiblichen

Genitaltrakt durch Barrieren selektiert und durch Sequenzen von Aktivierungsstufen

reaktiviert. Erst kapazitierte Spermien sind in der Lage, eine Eizelle zu befruchten.

Die Eizelle ihrerseits muss durch die Wiederaufnahme der Meiose nach Arretierung in der

Prophase I im Sexualzyklus das fertile Stadium der Metaphase II erreichen. Neben dieser

Kernreifung laufen auch Maturationsveränderungen an der Zona pellucida, den Zellorganellen

und dem Zytoplasma ab (PRATHER u. DAY 1998). Diese sind sehr schwer zu definieren und

noch nicht sehr weit erforscht.

Diese physiologischen Konditionierungen müssen nun entsprechend der jeweiligen

künstlichen Manipulationen auf dem Weg zu einer befruchteten Eizelle berücksichtigt

werden. Bei der künstlichen Insemination ist also ein Verdünnungsmedium und eventuelle

Lagerungsbedingungen für das Ejakulat so zu wählen, dass die Spermien zwar ernährt

werden, aber keine übermäßige Aktivierung mit Energieverlusten entsteht. Weiterhin ist es

von Bedeutung, dass durch die Verdünnungsmedien keine größeren Veränderungen des

weiblichen Genitalsekretes hervorgerufen werden, sei es durch Milieuveränderungen oder

übermäßige Induktion von Entzündungsreaktionen auf Fremdantigene. Eine zentrale Rolle bei

der Samenkonservierung spielt die Erhaltung der Membranintegrität. Bei größeren Schäden

stirbt die Zelle ab, aber auch kleine Veränderungen können für die Kontaktaufnahme mit dem

Eileiterepithel und der Eizelle erhebliche Einschränkungen mit sich bringen. Dies kommt

gerade bei der Verwendung von Tiefgefriersperma zum Tragen. So wurden spezielle

Einfriermedien und Programme entwickelt, um einen bestmöglichen Schutz der

Plasmamembran zu gewährleisten. Bei aktuellen Forschungen zum Einsatz von


15

flowzytometrisch gesexten Spermien hat sich die Bedeutung der Zusammensetzung der

Plasmamembran gezeigt, da durch Anlegen eines elektrischen Feldes die Membranstrukturen

der Spermatozoen so verändert werden, dass eine Erkennung durch die Oozyte und die

Auslösung erforderlicher Mechanismen zur Induktion des Zonablocks kaum noch stattfinden

(RATH et al. 1999).

Der Einsatz von Frischsamen in der künstlichen Besamung ist inzwischen bei

Warmblutpferden und Schweinen zur Routine geworden. Gleiches gilt für Tiefgefriersamen in

der Rinderzucht.

Bei Befruchtung außerhalb des weiblichen Genitaltraktes, also in vitro, muss neben der

Spermaaufbereitung noch die Vorbereitung der Eizelle berücksichtigt werden. Für den

Kontakt mit den Spermien müssen die Oozyten gereift sein und sich im Metaphase II

Kernstatus befinden. Dies ist zum einen durch eine Superovulation beim weiblichen Spender

durch Hormoneinsatz und anschließender operativer Gewinnung von Eizellen aus

sprungreifen Follikeln zu erzielen. Eine andere Möglichkeit ist, unreife Eizellen, sei es mittels

invasiver Methoden oder einer Gewinnung nach der Schlachtung, in vitro zu reifen (In-vitro-

Maturation, IVM).

Bei der In-vitro-Produktion (IVP) stehen nun verschiedene Verfahrensweisen zur Verfügung.

Für die In-vitro-Fertilisation (IVF) müssen die Spermien in künstlichen Medien kapzitiert

werden und es folgt eine Koinkubation mit der gereiften Eizelle. Weiterhin gibt es

mikroassistierte Fertilisationstechniken wie die Zona-Öffnung (Zona drilling), die subzonale

Injektion (SUZI) von Spermien und die intrazytoplasmatische Injektion (ICSI) (CATT 1996).

Die Verfahren wurden an Labortieren erprobt, dann in der Humanmedizin zur Therapie bei

andrologischer Sub- und Infertilität eingesetzt und anschließend auf die Haussäugetiere

übertragen (IRITANI 1991). Bei den Nutztieren steht weniger eine therapeutische Absicht im

Vordergrund, vielmehr spielen züchterische und genetische Einsatzmöglichkeiten, wie z.B.

die Anwendung von gesextem Sperma (RATH et al. 1996), eine Rolle. Auch für die

Arterhaltung, wenn nur wenige Tiere mit schlechter Samenqualität zur Verfügung stehen,

kommt ICSI zum Einsatz (z.B. Katzen: POPPE et al. 1997).

Für das Zona drilling und SUZI sind Grenzen gesetzt, weil für diese Verfahren die

Spermienpopulation nur begrenzt Schädigungen aufweisen darf. Bevor die Spermien

erfolgreich in Kontakt mit der Eizelle gebracht werden können, müssen sie erst kapazitiert


16

und akrosomreagiert vorliegen. Eine künstliche Auslösung dieser beiden Prozesse ist jedoch

bei intakten Spermien möglich. Bei ICSI müssen die Spermien weder kapazitiert noch

akrosomreagiert sein (PAYNE 1995), da durch die Injektion eines einzelnen Spermiums die

natürliche Penetration umgangen wird und ein Signal an die Zona pellucida für den

Polyspermieblock nicht von Nöten ist. Der Erfolg von ICSI in der Humanmedizin zeigt sich

daran, dass laut der Ergebnisse der Datenerhebung des Deutschen IVF-Registers 1996 die

ICSI-Behandlungen (16.233) die Anzahl der IVF-Behandlungen (14.494) überschritten hatten

(FELBERBAUM u. DAHNKE 1997).

Wie dieser Überblick zeigt, sind die Nachahmungen oder Umgehungen der physiologischen

Reifungsvorgänge sowohl für Spermien als auch für Oocyten für die Fertilisation essentiell.

Es kann zwar durch sehr spezielle Techniken (ICSI) Kapazitation und Akrosomreaktion

umgangen werden, jedoch eine gereifte Eizelle bleibt Grundvoraussetzung. Daher sind die

Veränderungen der Eizelle während der IVM Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Die Zona

pellucida, als erste Kontaktstelle zwischen Oocyte und Spermium, stellt dabei das

Untersuchungsobjekt dar.

Im folgenden werden nun die angesprochenen Entwicklungsprozesse von Spermium und

Oocyte näher erläutert. Es folgen detailliertere Angaben zur Zona pellucida.


17

2. Das Spermium

2.1. Aufbau und Entwicklung

Das Spermatozoon setzt sich aus Kopf, Hals und Schwanz, welcher in Mittel-, Haupt- und

Endstück unterteilt wird, zusammen (SETCHEL 1982). Die Gesamtlänge des Spermiums

beträgt 50 bis 70 µm. Der Spermienkopf wird fast vollständig vom Zellkern eingenommen,

welcher das Erbmaterial in Form von hochgradig kondensiertem Chromatin enthält (MONESI

1976). Der Zellkern wird von einer inneren und äußeren Kernmembran umgeben, an die sich

in den vorderen zwei Dritteln die Kopfkappe, das Akrosom, anschließt. Die akrosomale

Matrix wird ebenfalls durch eine innere und äußere Membran begrenzt (EDDY u. O’BRIAN

1994). Das Akrosom entsteht aus Vesikeln des Golgikomplexes und enthält hydrolytische

Enzyme u.a. Hyaluronidase, Neuraminidase und Akrosin, welche die Penetration der ZP

ermöglichen (YANAGIMACHI 1994).

Im Spermienhals, ein bewegliches Gelenkstück zwischen Kopf und Schwanz, befinden sich

das proximale Zentriol und der Rest des distalen. Das proximale Zentriol wird nach der

Befruchtung für die erste Zellteilung benötigt, da der Eizelle ein eigenes Zentriol fehlt. Der

Schwanz besitzt eine für Geißeln typisches Mikrotubulussystem mit einer 9+2

Fibrillenstruktur. Im Mittelstück wird in den Mitochondrien die Menge ATP produziert, die

für die Beweglichkeit von Nöten ist, so dass Geschwindigkeiten bis 4 mm/min erreicht

werden können (SAYONSKI u. SMOLLICH 1990).

Bei einem ausgereiften Spermium ist die Plasmamembran, welche das ganze Spermatozoon

umhüllt, für die Kontaktaufnahme der Zelle mit ihrer Umwelt verantwortlich. Sie besteht aus

einer Phospholipiddoppelschicht, in der verschiedene Proteine eingebaut sind. Die die

Membran völlig durchziehenden Tunnelproteine bilden Poren und Kanäle. Des Weiteren

existieren wasserunlösliche integrale Proteine, die nur in einer Lipidschicht eingelagert sind,

und lösliche Proteine, die sich peripher an der Membranaußenfläche befinden (ALBERTS et

al. 1990).

Während der Reifung im Nebenhoden, der Ejakulation, den Kapazitationsvorgängen und der

Akrosomreaktion finden zahlreiche Umbauvorgänge an der Plasmamembran des

Spermatozoons statt, die für die jeweiligen Funktionen eine Grundvoraussetzung darstellen


18

(TÖPFER-PETERSEN et al. 1996). An der Plasmamembran gibt es verschiedene Areale, die

sich entsprechend ihrer Aufgabe spezifisch zusammensetzen (GADELLA et al. 1994). Das

Apikalsegment der Kopfkappe ist an der Akrosomreaktion beteiligt, daher haben einige über

der akrosomalen Region liegende Glykoproteine die Aufgabe, die Plasmamembran zu

stabilisieren und so eine vorzeitige Akrosomreaktion zu verhindern.

Andere Proteine sind für die Interaktionen zwischen Spermium und Zona pellucida bzw.

Eizelle zuständig. So fusionieren während der Akrosomreaktion nur der apikale und

periakrosomale Teil der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran. Im

Gegensatz dazu leitet die Plasmamembran über dem Äquatorialsegment die Fusion des

Spermiums mit der Zellmembran der Eizelle ein (DRIESCH et al. 1991). Mit der

Plasmamembran des Schwanzes scheinen Moleküle in Verbindung zu stehen, die an der

Bewegungsaktivität beteiligt sind. Eine verfrühte Hyperaktivierung könnte so durch die

Absorption und Integration von bestimmten Glykoproteinen vermieden werden.

Die Reifung der diploiden Stammzellen im Hoden zu morphologisch ausdifferenzierten

haploiden Spermatozoen bezeichnet man als Spermatogenese. Im Gegensatz zur Oogenese,

die bereits in der Embryonalphase ihre Anfänge hat, beginnt die Spermatogenese erst mit der

Geschlechtsreife und dauert beim Eber ca. 34 Tage (SCHNORR 1989).

Die Spermatogenese besteht aus drei Phasen:

1. die mitotischen Teilungen und Differenzierungen der diploiden Spermatogonien ,

2. die meiotischen Reifeteilungen der tetraploiden Spermatozyten und

3. die Entwicklung der haploiden Spermatiden zu Spermatozoen (Spermiogenese).

Die wesentlichen Schritte der Spermiogenese, die weitreichende morphologische und

funktionelle Umbauprozesse mit sich bringt, sind die Fusion der Golgi-Vesikel zur

Akrosomvakuole und Bildung des Akrosoms, die Kondensation des Chromatins und die

damit verbundene speziesspezifische Formung des Spermienkopfes und die Entwicklung der

Geißel (WUTTKE 1990). Gegen Ende der Reifungsphase wird das überschüssige Zytoplasma

abgeschnürt und von Sertolizellen im Hoden phagozytiert. Erst im Nebenhoden wird der

kleine Teil, der als Zytoplasmatröpfchen in der Halsregion bestehen bleibt, abgebaut.


19

2.2. Epididymale Reifung und Einfluss des Seminalplasmas

Im männlichem Geschlechtstrakt schließt sich an die Spermatogenese im Hoden die

posttestikuläre Spermienreifung bzw. –modifikation an, da die Spermien trotz

abgeschlossener morphologischer Entwicklung noch nicht befruchtungsfähig sind. Die

Spermien erlangen während ihrer Passage durch den Nebenhoden durch den Erwerb einer

gerichtete Vorwärtsbeweglichkeit und der Fähigkeit, an die Zona pellucida zu binden, ihre

Fertilität (KIRCHHOFF u. IVELL 1995). Dies dauert beim Säuger 10-15 Tage (HAFEZ

1987), wobei die Spermatozoen je nach Spezies ihre Befruchtungskompetenz in

unterschiedlichen Nebenhodenabschnitten erreichen. Obwohl beim Eber die Spermien erst im

Nebenhodenschwanz voll befruchtungsfähig werden, können sie bereits mit ihrem im

Nebenhodenkopf erreichten Status in vitro eine Eizelle befruchten (COOPER 1996).

Die biochemischen Umbauprozesse der Spermienplasmamembran während der

Nebenhodenreifung bestehen u.a. aus Lokalisationsänderungen einiger Membranproteine,

Glykosylierung von Proteinen und Lipiden, sowie Maskierung, Entfernung und teilweiser

Einlagerung von Peptidstrukturen aus Proteinen, die im Nebenhoden sezerniert werden

(OVERSTREET 1983; DACHEUX et al. 1989). Im Nebenhoden wird auch Cholesterin

synthetisiert, dass in die Plasmamembran des Spermiums eingebaut wird (SEKI et al. 1992)

und so eine Membranstabilisierung bewirkt, die vor mechanischen Schädigungen schützt. Die

negative Ladung der Spermienoberfläche wird durch den Einbau von Sialoglykoproteinen,

Steroidsulfaten und Sulfoglycerolipiden verstärkt (TULSIANI 1993). Durch die erhöhte

Abstoßung aufgrund gleichgerichteter Ladung wird die laterale Beweglichkeit der

Makromoleküle in den Membranen reduziert und die Membran so stabilisiert. Durch den

Kontakt mit dem Seminalplasma während der Ejakulation werden die Spermien durch

bestimmte Inhaltsstoffe vor Schädigungen, Umwelteinflüssen und frühzeitiger Kapazitation

geschützt (SHIVAIJI 1990).

Das Seminalplasma setzt sich beim Eber aus Sekreten der Samenblase, der Prostata und der

Bulbourethraldrüse zusammen. Es besteht aus vielerlei Komponenten, u.a. die Peptidhormone

LH, FSH und Prolaktin, Enzyme wie Glykosidasen, Glykosyltransferasen, Phosphatasen, den

biogenen Amine Spermin und Carnitin, Proteaseinhibitoren, Monosaccharide (Fruktose und

Glukose), sowie Östrogenen und Prostaglandinen (MANN u. LUTWACK-MANN 1981).

Den Hauptanteil bilden Spermadhäsine, die vorwiegend als Dekapazitationsfaktoren wirken


20

(TÖPFER-PETERSEN et al. 1994). Durch die erwähnten Inhaltsstoffe wird den prinzipiell

befruchtungskompetenten Spermien ihre Befruchtungsfähigkeit vorläufig entzogen. Die

Versetzung in diesen Ruhestatus verhindert Energieverluste, verfrühte Umbauprozesse und

unspezifische Bindungen bis kurz vor Erreichen der Eizellen im weiblichen Eileiter und

vergrößert die Chance auf eine erfolgreiche Befruchtung.

2.3. Spermienveränderungen im weiblichen Genitale

Mit Eintritt in den weiblichen Genitaltrakt nach der Ejakulation müssen die Spermien

verschiedene Barrieren überwinden. Es existieren mechanische (Falten, Krypten, Cilien),

physikochemische (Vaginalsekret, Zervixmucus) und immunologische Abwehrvorgänge als

Selektionsstufen (HUNTER 1988). Bei den Scheidenbesamern (z.B. Rind, Kaninchen, Affe

und Mensch) gilt als erste Hürde der Gebärmuttermund mit dem Zervixschleim, welche die

Spermien überwinden, in dem sie durch Micellenkomplexe des Zervikalmucus in die Krypten

der Schleimhaut geleitet werden. Dort entsteht so ein erstes Spermienreservoir. Das Schwein

zählt zu den Arten (wie Pferd und Hund) mit uteriner Samenportionierung, bei denen die

Passage durch die uterotubale Verbindung die erste Barriere darstellt. Die Schleimhautfalten

in diesem Bereich, welche während des Östrus ödematisieren, verhindern den Eintritt von

Seminalplasma und Uterusekret in den Eileiter und reduzieren den Anteil der Spermien, der

bis in den Isthmus des Eileiters vordringt (HUNTER 1995). Der caudale Teil des Isthmus

stellt für beide angesprochenen Besamungstypen ein funktionelles Spermienreservoir dar, in

dem in einem bestimmten Zeitfenster die Vitalität der Spermien geschützt wird. An

Spermatozoen, die sich im Lumen befinden, laufen die Alterungsprozesse in beschleunigter

Form ab.

Wichtig für das Überleben und die Kapazitation der Spermien ist eine Bindung zwischen dem

apikalen Teil des Spermienkopfes und dem Eileiterepithel (SUAREZ et al. 1991). Dieser

Kontakt wird wahrscheinlich durch Kohlenhydrate des Oviduktepithels und

kohlenhydratbindenden Proteinen des Spermatozoons, entsprechend einer Lektin-Zucker-

Bindung, hergestellt (SUAREZ 1998). Die Tatsache, dass Kohlenhydrate diese Bindung

hemmen können (WAGNER et al. 2002), spricht für einen solch vermittelten Kontakt. Es ist


21

von großer Bedeutung, dass die Spermien in dem präovulatorischen Zeitraum nicht weiter den

Eileiter hinauf wandern, da sie sonst die ovulierte Eizelle nicht mehr befruchten können

(HUNTER 1995).

Für eine erfolgreiche Befruchtung müssen die Spermatozoon ihre Befruchtungsfähigkeit

wieder erlangen, in dem sie verschiedene Kapazitationsprozesse durchlaufen. Ein Spermium

gilt als kapazitiert, wenn bei seinem intakten Akrosom durch die Zona pellucida, die

Akrosomreaktion induziert werden kann (KOPF u. GERTON 1991). Die ersten Schritte der

Kapazitation bestehen aus der Entfernung der oberflächenassozierten Inhaltsstoffe aus dem

Seminalplasma von den Spermien. Dies geschieht je nach Samendeponierung in der Zervix

oder erst im Bereich der uterotubalen Verbindung (YANAGIMACHI 1994). Der Anteil der

Spermien, der eine Bindung mit dem Eileiterepithel im Bereich des caudalen Isthmus

eingehen kann, durchläuft weitere Schritte der Kapazitation. Kapazitierte Spermien weisen

eine reduzierte Bindungsfähigkeit zum Oviduktepithel auf (FAZELI et al. 1999) und

kennzeichnen sich durch sichtbare hyperaktive Geißelbewegungen, mit denen sie aktiv zum

Ort der Befruchtung, der Ampulla, gelangen (SMITH 1998).

Die biochemischen Veränderungen von Membrankomponenten und intrazellulären

Ionenkonzentrationen (BEDFORD u. HOYKINS 1990), die Hyperaktivität und Ablösung von

dem Oviduktepithel zur Folge haben, sind von einer sehr komplexen Natur. Im wesentlichen

werden die durch die Komponenten des Nebenhodensekretes und des Seminalplasmas

hervorgerufenen Veränderungen rückgängig gemacht. Hydrolasen des weiblichen

Genitalsekretes bewirken eine Entfernung von Sialsäuren und Sulfatresten aus der

Spermienplasmamembran, so dass die negative Oberflächenladung wieder abnimmt

(LANGLAIS et al. 1981). Durch diese Vorgänge und die Entfernung von Cholesterin aus der

Plasmamembran wird diese durchlässiger und es kommt zu einem zweiphasigen

Kalziumeinstrom. Der zweite, stärkere Influx ist für die Auslösung der Akrosomreaktion

verantwortlich (FRASER 1995) und der erste scheint mit der Kapazitation verbunden zu sein.

So bewirkt die Aktivierung einer Ca2+-abhängigen Adenylatzyklase über weitere

Enzymaktivierungskaskaden Tyrosinphosphorylierung. Dies konnte an einer Reihe von

Proteinen des Spermatozoons bei der Maus (VISCONTI et al. 1997), beim Eber und Bullen

(TÖPFER-PETERSEN et al. 1996) nachgewiesen werden. Weitere Forschungsergebnisse zur

genaueren Bedeutung stehen noch aus.


22

3. Die Oocyte

3.1. Entwicklung und Aufbau

Die Entwicklung der Eizellen beginnt schon im weiblichen Fetus mit der Einwanderung der

Urkeimzellen in die Gonadenanlagen und anschließender Differenzierung über

Primordialkeimzellen zu Oogonien. Diese vermehren sich mitotisch und werden mit dem

Eintritt in die Prophase der ersten meiotischen Reifeteilung als primäre Oozyten bezeichnet.

Es folgt nach Rekombination homologer Chromosome (LEIBFRIED-RUTLEDGE et al.

1989) eine Arretierung der Eizellen in der Prophase I (Diplotän). Dieser Block wird unter In-

vivo-Bedingungen mit dem Eintritt in die Geschlechtsreife durch den präovulatorischen

Gonadotropinimpuls wieder aufgehoben (BUCCIONE et al 1990) und die Meiose fortgesetzt

(sekundäre Oozyte). Allerdings nur wenige der arretierten Oozyten gelangen wirklich zur

Ovulation, viele verfallen einer Atresie. Während der beschriebenen meiotischen Pause ruht

aber nicht die ganze Entwicklung der Oozyte. Es finden vielmehr hohe Syntheseleistungen

und eine 200fache Vergrößerung ihres Volumens statt (MOOR et al. 1990). Erst durch diese

Wachstumsphase erhält die Oozyte die Fähigkeit, die Meiose wieder aufzunehmen.

Die ablaufenden Prozesse zwischen Wiederaufnahme und erneuter Arretierung im

Kernstadium der Metaphase II ist die eigentliche Eizellreifung, auch Maturation genannt. Der

Abschluss der zweiten Reifeteilung erfolgt erst nach der Aktivierung durch das Spermium

oder einem entsprechenden Stimulus.

In dem Zeitraum bis zur Aktivierung im Geschlechtszyklus bilden die primären Oozyten mit

dem sie einschichtig und flach umgebenden Follikelepithel die Primordialfollikel. Mit der

Aktivierung wird er als Primärfollikel bezeichnet. Es folgt eine mitotische Proliferation des

umgebenden Follikelepithels mit der Folge, dass dieses mehrschichtig wird

(Sekundärfollikel). Die Follikelzellen, welche die Eizelle unmittelbar umgeben, produzieren

Fortsätze und an der Oberfläche der Eizelle entwickeln sich Mikrovilli. Zwischen der Oozyte

und den Follikelzellen beginnt die Bildung der Zona pellucida. Der Follikel wird zum

Tertiärfollikel, wenn die Follikelzellen beginnen, Flüssigkeit (Liquor follikuli) in den

Interzellularraum auszuscheiden. Dadurch wird die Eizelle an den Rand des Follikels


23

gedrängt und der Cumulus oophoros entsteht. Die innerste Schicht, die Corona radiata,

entsendet durch die Zona pellucida Zellfortsätze in das Ooplasma (ALBERTINI u. RIDER

1994). Die Kumuluszelllen sind sowohl unter einander als auch mit den wandständigen

Granulosazellen über Gap junctions verbunden. So wird ein Austausch von Metaboliten und

Signalen von der Follikelperipherie bis in das Innerste der Eizelle gewährleistet (MOTTA et

al. 1994).

Abb. 1: Tertiärfollikel mit Eizelle, Follikelhöhle und Theca follicularis Färbung Hämatoxylin-Eosin, 120fache Vergrößerung (nach LIEBICH 1993)

Corona radiata

Ooplasma

Follikelhöhle

Kern

Zona pellucida

Theca follicularis externa

Theca follicularis interna

Follikelhöhle

Follikelepithelzellen

Corona radiata

Cumulus oophorus


24

3.2. Maturation der Oozyte in vivo

Die Maturation der Oozyte ist in Kernreifung, zytoplasmatische Reifung und strukturelle

Veränderungen untergliedert. Noch im Fetus tritt die DNA der Oozyte in die Prophase I ein

und wird nach Durchlaufen der Stadien Leptotän, Zygotän und Pachytän im Diplotän arretiert.

Dieser Ruhestatus wird als Diktyotän bezeichnet und wird bis zur Induktion der Reifung

beibehalten (LEIBFRIED-RUTLEDGE et al. 1989). Während der Wachstumsphase

vergrößert sich der Nukleus so, dass er als Keimbläschen bzw. Germinalvesikel (GV)

bezeichnet wird. Als Germinalvesikle Breakdown (GVBD) wird von MOTLIK und FULKA

(1976) der gesamte Kernreifungsprozess von der Auslösung der Reifung bis zum Beginn der

Metaphase I bezeichnet und sie unterteilten den Vorgang in sechs Stadien, die

lichtmikroskopisch zu unterscheiden sind:

GV I:

Der Zellkern und der Nukleolus sind deutlich zu erkennen. Das Chromatin ist ring- oder

hufeisenförmig um das Kernkörperchen verdichtet.

GV II:

Zellkern und Nukleolus sind erhalten und im Bereich der Kernmembran sind einige orcein-

positive Strukturen, Chromozentren, nachzuweisen.

GV III:

Nukleolus und Zellkern sind noch intakt und das Chromatin liegt in einzelnen Clustern oder

fädigen Strukturen vor.

GV IV:

Der Nukleolus ist bei einem erhaltenen Zellkern nicht mehr zu erkennen. Das Chromatin stellt

sich in der Orceinfärbung als irreguläres Netzwerk oder einzelne Bivalente dar.

Frühe Diakinese:

Die Membran des Zellkerns ist nicht mehr zu sehen. In der Region des ehemaligen Zellkerns

befinden sich nun die Bivalente.

Späte Diakinese:

Die Chromosomen sind kondensiert und als individuelle Teile darstellbar.


25

Nach dem GVBD schließen sich die Stadien Metaphase I, Anaphase I, Telophase I und die

Metaphase II an, in der es zu einem erneuten Block kommt.

Metaphase I:

Der Zellkern existiert nicht mehr und die Chromosomen sind bei maximaler Kondensation in

einem Cluster angeordnet.

Anaphase I:

Die Chromosomen befinden sich in der Äquatorialebene und eine Spindel ist zu erkennen.

Telophase I:

Die meiotische Spindel ist nun deutlich zu sehen und Chromosomen weichen in zwei

Gruppen auseinander.

Metaphase II:

Die Chromosomen sind auf zwei Cluster verteilt und ein Polkörper ist zu finden.

Die zytoplasmatische Reifung ist von der Kernreifung abzugrenzen, beide Prozesse treten

jedoch in Wechselwirkung (EPPIG 1996). Eine befriedigende Befruchtungs- und embryonale

Entwicklungskompetenz wird keines Falls nur durch eine erfolgreich abgelaufene

Kernreifung garantiert (LAURINCIK et al. 1994). So konnte CRAN 1985 nachweisen, dass

in vivo gereifte porcine Eizellen eine Umstrukturierung der Zellorganellen aufzeigen. Die

Mitochondrien beispielsweise verteilen sich aus ihrer Gruppierung am Rande der Eizelle

gleichmäßig im gesamten Ooplasma. Die kortikale Granula verdoppelt sich in ihrer Menge

und ordnet sich in einem ca. 4 µm breiten Bereich unterhalb der Plasmamembran an. Die

Verfügbarkeit der Granula in dieser Lokalisation korreliert mit dem Vermögen der Eizelle

zum Polyspermieblock (DUCIBELLA 1996).


26

4. Gameteninteraktion

Die ersten Schritte der Gameteninteraktionen finden zwischen Spermium und Zona pellucida

statt. Es werden folgende Stufen der Annäherung des Spermatozoons an die Eizelle

unterschieden (WASSARMAN 1990):

1. Attachement: lockere, nicht speziesspezifische Kontaktaufnahme des

Spermiums mit der ZP

2. primäre Bindung: Bindung von akrosomintakten, kapazitierten Spermien an die ZP

3. sekundäre Bindung: Bindung von akrosomreagierten Spermien an die ZP

4. Penetration: akrosomreagierte Spermien wandern durch die ZP.

Diese Prozesse werden über Protein-Kohlenhydrat-Erkennungsmechanismen vermittelt

(MILLER u. AX 1990). Oberflächenassozierte Spermienproteine binden speziesspezifisch an

Kohlenhydrate der Zona pellucida und als Folge wird die Akrosomreaktion induziert

(MEIZEL 1985).

Akrosomreaktion:

Als Akrosomreaktion wird der exocytische Prozess beschrieben, durch den der akrosomale

Inhalt mit seinen lytischen Enzymen (u.a. Akrosin) freigesetzt wird. Dies geschieht durch die

Verschmelzung der äußeren akrosomalen Membran mit der darüber liegenden

Plasmamembran (siehe Abb. 2). Für die Befruchtung ist dieser Vorgang essentiell, da erst

eine partielle Hydrolyse der ZP dem Spermium die Penetration ermöglicht. Unterschiedliche

Signalübertragungssysteme werden kaskadenartig aktiviert und als Hauptresultat entsteht ein

massiver Kalziuminflux in das Zellinnere der Spermien (FRASER 1993). Durch die Bindung

von Kalzium an Calmodulin erfolgen Phosphorylierungen verschiedener Membranproteine.


27

Abb. 2: Schematischer Ablauf der Akrosomreaktion beim Säugetier (nach YANAGIMACHI 1994), AM: akrosomale Membran; PM: Plasmamembran

Mit der In-vitro-Induktion der Akrosomreaktion kann ein funktioneller Teilaspekt von

Spermienpopulationen untersucht werden; sind die Spermien kapazitiert und sind sie in der

Lage, auf den entsprechenden Reiz mit der Akrosomreaktion zu reagieren. Die Induktion der

Akrosomreaktion ist möglich mit Lyso-Phosphatidylcholin (LPC) und Glukosaminoglykanen

z.B. Heparin, Hyaluronsäure und Chondroitinsulfat (KOPF u. GERTON 1991; VARNER et

al. 1993).

Die anschließende sekundäre Bindung ist für die Verbindung der akrosomreagierten Spermien

mit der ZP-Matrix verantwortlich. Sowohl durch die bei der Akrosomreaktion freigesetzten

Enzyme als auch durch den eigenen motorischen Antrieb penetriert das Spermium die Zona

pellucida. Das Spermium lagert sich nun tangential mit der ganzen Fläche seines Kopfes an

die Plasmamembran der Eizelle an. Im seitlichen Bereich des Spermatozoons sind viele

Proteine lokalisiert, die an der Fusion der Spermienmembran mit den Mikrovilli der

Eizellmembran beteiligt sind. Nach der Verschmelzung der Plasmamembranen wird erst der

Spermienkopf und dann das ganze Spermium in die Eizelle aufgenommen. Dabei entsteht der

sogenannte Empfängnishügel (impregnation cone), da sich die Eizelle für die

phagozytoseähnliche Inkorporation des Spermiums vorwölbt.


28

Im Gegensatz zur Bindung an die ZP ist die Fusion von Eizelle und Spermatozoon nicht

speziesselektiv. Dieser Umstand wurde bei der Entwicklung von heterologen IVF-Tests

genutzt. So kann die Fertilität von humanen Spermien mit Hamsteroocyten überprüft werden

(ROGERS 1988), welches von großem Vorteil ist, da die Bereitstellung von humanen

Eizellen aus ethischer Sicht sehr problematisch ist.

Nach Eintritt des Spermiums in die Eizelle wird diese aktiviert, die Meiose vollendet und die

kortikale Reaktion ausgelöst. Dabei werden die proteolytischen Enzyme der kortikalen

Granula von der Eizelle in den perivitellinen Spaltraum abgegeben. Die Enzyme sind nun in

der Lage, die Zellmembranproteine der Oocyte so zu verändern, dass diese nicht mehr von

den Spermien erkannt werden können. Weiterhin bewirken diese Enzyme eine partielle

Proteolyse der ZP Glykoproteine, so dass dort kein weiteres Erkennen, Binden und

Vordringen von Spermien möglich ist. Diese Reaktion wird als Zona-Reaktion angesprochen.

Eine weitere Umstrukturierung der Eizellmembran für die Verhinderung der Polyspermie

erfolgt durch eine Depolarisationswelle, die unmittelbar nach der Verschmelzung der

Gameten über die Plasmamembran der Oocyte hinweg läuft.

5. Die Zona pellucida

Die Zona pellucida (Glashaut) ist eine extrazelluläre Matrix, welche die Oocyte gelartig

umgibt. Sie bildet sich in ihrer Struktur während der Follikulogenese aus und bleibt auch noch

nach der Befruchtung der Eizelle eine gewisse Zeit zum Schutz der entstandenen Blastozyste

bestehen. Die weiteren Aufgaben bestehen aus der speziesspezifischen Bindung von

kapazitierten Spermien und nachfolgender Induktion der Akrosomreaktion mit anschließender

Penetration des Spermiums durch die ZP. Weiterhin trägt die ZP durch ihre im Anschluss an

die Befruchtung entstehenden Modifikationen zum Polyspermieblock mit bei (DUNBAR u.

WOLGEMUTH 1984).


29

5.1. Aufbau und Entwicklung

Die azelluläre ZP zeigt in ihrer Dicke größere Unterschiede im Vergleich von niederen und

höher entwickelten Tieren. So beträgt ihre durchschnittliche Breite bei der Maus 5 µm, 13-16

µm bei Mensch und Schwein (DUNBAR u. WOLGEMUTH 1984; DUNBAR et al. 1991)

und beim Rind 27µm (DUNBAR et al. 1994). Die Schweineeizelle besitzt mit der ZP einen

Durchmesser von ca. 100 bis 150 µm und ist annähernd rund. Der Proteingehalt beträgt je

nach Reifungszustand 15-30 ng/ZP (TÖFER-PETERSEN, persönliche Mitteilung). Die

Proteine sind durch nicht-kovalente Bindungen in einem feinverküpften Netzwerk angeordnet

(WASSARMAN 1988). Mittels Elektronenmikroskopie ist zu erkennen, dass die ZP eine

zweischichtige Struktur aufweist. Die äußere Schicht besitzt größere Löcher, gleich einem

Schweizer Käse, und der innere Bereich ist von amorpher Struktur. An Hand von

Untersuchungen der bovinen ZP konnte gezeigt werden, dass nach der Befruchtung der

Oozyte die ZP dünner wird und die Lochstrukturen verschwinden (SUZUKI et al 1994).

Die ZP der Säugetiere besteht aus drei Glykoproteinen, die posttranslationalen

Umbauprozessen wie Glykosylierung und Sulfatierung unterliegen, so dass eine gewisse

Heterogenität entsteht (WASSARMAN, 1988).

Die Nomenklatur der ZP-Glykoproteine ist teilweise recht missverständlich. Die Maus war

die erste untersuchte Spezies, bei der die einzelnen Proteine mittels Gelelektrophorese isoliert

werden konnten. Die drei erhaltenen Proteine wurden einfach nach absteigendem

Molekulargewicht mit ZP1 (200 kDa), ZP2 (120 kDa) und ZP3 (83 kDa) bezeichnet (BLEIL

u. WASSARMAN 1980a). Bei den ersten biochemischen Analysen der porcinen ZP konnten

unter reduzierenden Konditionen bei der Elektrophorese (PAGE) vier Komponenten mit

einem Molekulargewicht von 90, 65, 55, 25 kDa isoliert werden. Werden allerdings nicht

reduzierende Bedingungen gewählt, so erscheinen nur eine 90 und eine 55 kDa Bande

(HEDRIK u. WARDRIP 1980; SACCO et al. 1981).

In weiteren Untersuchungen von HEDRICK und WARDRIP konnte 1987 gezeigt werden,

dass sich das porcine ZP1 (pZP1), die 90 kDa Bande der nicht reduzierenden PAGE, unter

Reduktion durch Spaltung von Disulfidbrücken in die 65 kDa und 25 kDa Komponenten der

reduzierenden PAGE auftrennt. Durch eine isoelektrische Fokussierung konnten HEDRICK

und WARDRIP (1980) den Proteinanteil, welcher der breiten 55 kDa Bande der nicht

reduzierenden PAGE entsprach, in einen sauren Anteil pZP3α und einen basischen pZP3β


30

auftrennen. Später konnte nachgewiesen werden, dass es sich dabei nicht um zwei

Proteinketten, sondern um zwei verschiedene Proteine handelt (TÖPFER-PETERSEN et al.

1993). Eine einheitliche speziesübergreifende Nomenklatur wurde durch die Identifizierung

der kodierenden Gene für die einzelnen Glykoproteine ermöglicht (HARRIS et al. 1994). Die

Bezeichnungen der ZPA-, ZPB- und ZPC-Genfamilien wurden etabliert. Die Einstufung

wurde nach der Anzahl der Basenpaare vorgenommen, und zwar stellt dabei ZPA das größte

und ZPC das kleinste Gen dar.

Tab. 1: Nomenklatur der Proteine der Zona pellucida

ZPA

ZPB

ZPC Maus

mZP2

mZP1

mZP3

Mensch

hZP2

hZP1

hZP3

Schwein

pZP1 (pZP2)

pZP3α (pZP1)

pZP3β (pZP3)

Bei jeder der drei Proteinfamilien konnte gezeigt werden, dass zu 50-98 % Homologien auf

der Ebene der Nukleinsäure bestehen (EPIFANO u. DEAN 1994, MCLESKEY et al. 1998).

Die strukturelle Bedeutung der einzelnen Glykoproteine ist bisher nur bei der Maus geklärt.

Nach WASSARMAN und MORTILLO (1991) sind dort jeweils ZPA und ZPC zu

Heterodimeren zusammengelagert. Diese Einheiten bilden lange Filamente, welche durch das

ZPB an diversen Stellen verbunden werden.

Die ZP ist während der Follikulogenese ab dem Stadium des Sekundärfollikels zwischen

Oolemn und den Granulosazellen nachweisbar (LEE u. DUNBAR 1993). Über den

Syntheseort der ZP bestanden kontroverse Meinungen. Kern der Auseinandersetzungen war

die Beteiligung der Granulosazellen neben der Oozyte und bei welcher Tierart welche

Systeme vorherrschen. Bei der Maus wurde nachgewiesen, dass die ZP nur in der Eizelle

selbst synthetisiert wird (WASSARMAN u. KINLOCH 1992; EPIFANO et al. 1995). Bei

anderen Arten (Kaninchen, Schwein, Rind, Marmoseten und Mensch) konnte mRNA


31

und/oder Protein der ZP in den Granulosazellen nachgewiesen werden. GROOTENHUIS et

al. (1996) konnte mittels Antikörpern gegen ZPC ZP Proteine in Granulosazellen markieren.

Mittels in situ Hybridisierung konnten KÖLLE et al. (1996 u. 1998) pZPB und bZPC in einer

Entwicklungsstufenabhängigkeit in den Granulosazellen von Sekundärfollikeln nachweisen.

Dabei ist die bovine Oocyte während der gesamten Follikologenese in die ZP Synthese

involviert, wenn auch bei den Tertiärfollikeln am meisten ZPC im Zytoplasma der Corona

radiata Zellen nachgewiesen werden konnte.

Beim Schwein hingegen wird im Stadium des Tertiärfollikels die ZP nicht mehr von der

Eizelle selbst synthetisiert. ZP bzw. die entsprechenden Transskripte konnten dann nur noch

in den Granulosazellen detektiert werden. Untersuchungen an fetalen Ovarien haben gezeigt,

dass Zona pellucida Proteine schon während der pränatalen Entwicklung von Follikelzellen

synthetisiert werden. In bovinen Feten konnte ZPC bei Primordial- und Primärfollikeln in der

Eizelle selbst und bei Sekundär- und Tertiärfollikeln zusätzlich noch in den Follikelzellen

nachgewiesen werden (TOTZAUER et al. 1998).

5.2. Oligosacchridstrukturen der ZP

Der wichtigste Informationsträger der Zellen ist die Desoxyribonukleinsäure (DNA). Die

Erbinformationen werden durch ihre Nukloetidsequenz kodiert, abgelesen, in Proteine

übersetzt und durch diese werden dann die folgenden biologischen Prozesse induziert.

Eine weitere Struktur, die als Informationsträger fungiert und immer mehr in das Interesse

verschiedener Forschungen rückt, sind die Kohlenhydrate (GABIUS et al. 1988; HURTLEY

et al. 2001). Die Zuckerketten sind an Proteine und Lipide gebunden, so dass Glykokonjugate

(Glykoproteine, Glykolipide, Proteoglykane) entstehen. Die Bildung der Polypeptidketten der

Proteine wird genetisch durch den DNA-Code terminiert. Die Glykosylierung wird jedoch

durch ein hochspezifisches Enzymsystem, es existiert für jeden Zucker und jede

Verknüpfungsmöglichkeit ein spezielles Enzym, gesteuert und unterliegt so nur indirekt einer

genetischen Kontrolle.


32

Zwischen den Kohlenhydraten gibt es viel mehr Verbindungsformen und –möglichkeiten als

zwischen Aminosäuren und somit auch ein größeres Potential zur Übertragung von

Informationen. Werden zwei Aminosäuren verknüpft, so gibt es nur eine Möglichkeit. Bei

zwei Zuckern hingegen können aufgrund der vielfältigen möglichen Bindungsformen, α- oder

β-Verknüpfung und verschiedene Konformationsmöglichkeiten (Wannen- oder Sesselform),

bis zu 16 isoforme Strukturen entstehen (KOBATA 1992). Weiterhin bestehen zwei

Möglichkeiten, die Zuckerkette an ein Proteingerüst zu binden. Bei der O-Glykosylierung

werden die Kohlenhydrate an die OH-Gruppen der Aminosäuren Serin oder Threonin und

sehr selten auch an Hydroxylysin geheftet. Die zweite Form der Anheftung ist die N-

Glykosylierung über die Aminogruppe (NH2) der Aminosäure Asparagin. Nicht jedes

Asparagin ist jedoch eine potentielle Glykosylierungsstelle, vielmehr sind sogenannte

Signalsequenzen von Nöten. Die Signalsequenz besteht aus einer Asparagin-X-Serin oder

Asparagin-X-Threonin Abfolge, in der X für jede Aminosäure exklusive Prolin steht.

Die Informationen, welche die Glykokonjugate festlegen, können durch geeignete Rezeptoren

abgelesen werden (GABIUS u. GABIUS 1992). In den Zellmembranen kommen

Glykoproteine vor, deren Zuckerketten weit in den interstiellen Raum hinausragen, und sind

somit hervorragend für die interzelluläre Kommunikation geeignet. Sie agieren als

Oberflächenrezeptoren und übertragen die extrazellulären Signale in das Zellinnere.

Lektine Lektine sind Glykoproteine, die zunächst aus Pflanzen, in letzter Zeit aber auch aus tierischen

Organismen, isoliert wurden, und gehören zur Klasse der zuckerbindenden Proteine. Sie

zeichnen sich durch ihr substratspezifisches Verhalten gegenüber Kohlenhydraten

(SCHUMACHER et al. 1990)und durch das Fehlen einer enzymatischen Aktivität aus und

weisen auch keine Homologien zu Antikörpern auf (GABIUS u. GABIUS 1992).

Die ersten Berichte über Lektine erschienen schon 1888 von STILLMARK. Er fand heraus,

dass der giftige Inhaltsstoff Ricin des Wunderbaumes Erythrozyten agglutiniert. Seitdem sind

viele Arbeiten mit und über Lektine entstanden. Paul Ehrlich beispielsweise benutzte die

Lektine um die Jahrhundertwende bei seinen Immunisierungsversuchen. Bei diesen

Forschungen war die Zuckerspezifität eher nebensächlich, da toxische Lektine hier als

hochwirksame Antigene zur Produktion von Antikörpern eingesetzt wurden. Die Fähigkeit


33

zur Hämagglutination rückte erst später wieder in den Blickpunkt des wissenschaftlichen

Interesses. Lektine können z.B. die einzelnen menschlichen Blutgruppen unterscheiden, in

dem sie die unterschiedlichen Blutgruppenantigene anhand einzelner endständiger

Zuckerreste erkennen (GABIUS et al. 1988). Das „auswählende“ Verhalten der Lektine

veranlasste BOYD u. SHAPLEIGH 1954, ihnen den Namen Lektine zu geben (nach

lateinisch legere → auswählen).

Die Bindungsfähigkeit der Lektine wird durch verschiedene Faktoren beeinflusst. Sie ist

abhängig von der Tertiärstruktur des Rezeptors, der Lage der umliegenden Zuckerstrukturen

sowie von den Liganden des C3- und C4-Atoms des zu bindenden Zuckermoleküls. Lektine

weisen zwei oder bis zu 18 Zuckerbindungsstellen pro Molekül auf, wobei die

Bindungsaktivität durch das Vorhandensein von Schwermetallionen und dem pH-Wert

beeinflusst wird (LEATHEM 1986).

Neben der weitverbreiteten Anwendung von Lektinen in der Histologie und Biochemie

kommen die Lektine auch in der diagnostischen Medizin zur Anwendung. Zu erwähnen sind

die Diagnosen von entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn, Colitis ulcrosa) und

verschiedener Speicherkrankheiten. Weiterhin werden Lektine zur Identifizierung von

speziellen Zellpopulationen und zur Erkennung von metastasierenden Mammakarzinomen

verwendet (SCHUMACHER et al. 1990).

Zur Analyse der Kohlenhydratstrukturen der Zona pellucida wurden zunächst Lektine

eingesetzt, da sie wie beschrieben mit hoher Spezifität ähnlich einem Schlüssel-Schloss-

Prinzip an bestimmte Zuckerstrukturen binden. Verschiedene Autoren haben die ZP von

unterschiedlichen Spezies mit Hilfe von Lektinen untersucht (AVILES et al. 1994;

MAYMON et al. 1994). So konnte mittels Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass die

ZP in Schichten organisiert ist, in denen definierte Zuckerstrukturen eine bestimmte

räumliche Verteilung aufweisen (SHALGI et al. 1991). In der murinen ZP befinden sich die

GalNAc-β(1-4)-Gal-Strukturen vorwiegend in der inneren Region (AVILES et al. 1999).

Eine umfangreiche Studie an verschiedenen Arten wurde 1994 von SKUTELSKY et al.

durchgeführt. Die Lektinbindungsmuster weisen eine speziesbezogene Spezifität auf. Bei den

Nagetieren konnten in strukturellen Untersuchungen mit Lektinen nur α-Galaktose und/oder

β-N-Acetylgalaktosamin nachgewiesen werden. Bei der ZP von humanen, caninen, felinen


34

und porcinen Eizellen markierten die entsprechenden Lektine keine Zuckerstrukturen.

Allgemein ist zu sagen, dass die Unterschiedlichkeit der Lektinbindungsmuster mit

wachsender phylogenetischer Distanz sich ebenfalls vergrößert (SHALGI u. RAZ 1997).

Neben diesen Unterschieden bestehen aber auch Gemeinsamkeiten. Bestimmte Zuckerreste,

wie Mannose und N-Acetylglukosamine, sind bei allen untersuchten Spezies nachzuweisen,

und zwar meistens in der Core-Region von N-glykosidisch gebundenen Kohlenhydraten

(GEYER u. GEYER 1998).

Neben der Lektinologie wurden in den letzten Jahren die Kohlenhydrate der ZP mit Hilfe

neuer Analysemöglichkeiten direkt untersucht. Die Zusammensetzung der Oligosaccharide

der porcinen ZP (NOGUCHI u. NAKANO 1992; HOKKE et al. 1994; NAKANO u.

YONEZAWA 2001), der murinen ZPA und ZPC Proteine (NOGUCHI u. NAKANO 1993;

NAGDAS et. al. 1994) sowie der unfraktionierten bovinen ZP (KATSUMA et al. 1996) sind

bereits veröffentlicht worden.

Soweit untersucht, besitzen alle ZP Glykoproteine sowohl N-glykosidisch als auch O-

glykosidisch gebundene Seitenketten. N-glykosidisch verknüpfte Zuckerketten weisen im

Allgemeinen eine höhere Komplexität und mehr Verzweigungen als O-glykosidisch

verknüpfte Zuckerketten auf. Es werden mannosereiche (High-Mannose) Zuckerketten von

komplexen unterschieden und die Mischformen als Hybridtyp bezeichnet. Diese Ketten

kommen in di-, tri- und tetraantennärer Form vor.

Das ZPA des Schweins weist sechs potentielle N-Glykosylierungsstellen auf, die Anzahl der

O-Glykosylierungen ist hingegen nicht bekannt. ZPB und ZPC besitzen jeweils drei N-

glykosidisch verknüpfte und drei bzw. bei ZPC sechs O-glykosidisch verknüpfte

Zuckerketten (YUREWICZ et al. 1991).

Die N-gebundenen Glykane der ZP bei Schwein, Rind und Maus besitzen die gleiche

Grundstruktur. Sie gehören zum fukosylierten Komplex-Typ und sind verlängert mit

unverzweigten N-Acetyllaktosamineinheiten. Bei sauren Glykanen sitzen am nicht

reduzierten Ende Sialsäure- und/oder Sulfatreste an der C-6 Position der N-

Acetylglukosamine der sich wiederholenden Laktosamineinheiten. Zusätzlich wurden beim

Schwein auch Sulfatreste bei sich nicht wiederholenden Einheiten und an der C-3 Position der

N-Acetylglukosaminreste am reduzierten Ende gefunden (MORI et al. 1998).


35

Das Verhältnis der di-, tri- und tetraantennären Ketten und der Grad der Sulfatierung und

Sialylierung ist bei den einzelnen Arten zum Teil recht unterschiedlich. Die Glykoproteine der

ZP von Maus und Rind bestehen aus sauren tri- und tetraantennären Ketten, die hauptsächlich

Sialylreste tragen und nur wenig sulfatiert sind. Die Acidität der N-gebundenen sauren

Zuckerketten beim Schwein hingegen wird vornehmlich durch das Vorhandensein von

Sulfatresten hervorgerufen.

Die Struktur der neutralen N-Glykane gestaltet sich bei den angesprochenen Arten in

unterschiedlicher Weise. Die Hauptstruktur der N-glykosidisch gebundenen neutralen

Oligosaccharide bei der ZP des Rindes ist der High-Mannose-Typ, während beim Schwein

unter den N-Glykanen die diantennären fukosylierten Glykane mit N-Acetyllaktosamin-

Ketten vorherrschen.

Der Anteil der neutralen N-glykosylierten Zuckerketten an der Gesamtheit aller

Kohlenhydrate der ZP beträgt bei Rind und Schwein circa 25% und bei der Maus hingegen

weniger als 5%.

Ausgehend von einem Gal-β(1-3)-GalNAc Disaccharidkern besitzt die sulfatierte

Polylaktosamingrundstruktur (β(2-3)-Verknüpfung) der O-glykosidisch verknüpften Zucker

der porcinen ZP die gleiche Anordnung wie die N-glykosidisch verknüpften Zucker (HOKKE

et al. 1993). Die Sialsäurereste können an das nicht reduzierte Ende der Zuckerkette und/oder

an den proximalen N-Acetylgalaktosaminrest des Kerndisaccharides gebunden sein. Das nicht

reduzierte Ende der Kohlenhydratkette endet mit neutralen Strukturen mit β-Galaktose- und

β-N-Acetylglukosaminresten oder auch zu einem geringen Anteil mit α-Galaktose- und β-N-

Acetylgalaktosaminresten (TÖPFER-PETERSEN 1999).

Mittels Oligosaccharid-Analyse von den N-Glykanen der porcinen ZP konnte gezeigt werden,

dass an Asn203, Asn220 und Asn333 von ZPB neutrale diantennäre Zuckerketten N-

glykosidisch konjugiert sind. An Asn220 sind zusätzlich noch tri- und tetraantennäre Ketten

lokalisiert, welche sich bei ZPC an Asn271 befinden. An alle drei Glykosylierungsstellen des

ZPC (Asn124, Asn146 und Asn271) sind auch wieder diantennäre Zuckerketten N-

glykosidisch gebunden. Von den drei O-Glykosylierungsstellen des ZPB sind Ser293 und

Thr303 bekannt. Die Lokalisationen Thr155, Thr161 und Thr162 des pZPC sind drei der

potentiellen sechs O-Glykosylierungsstellen (NAKANO u. YONEZAWA 2001).


36

A O-glykosidische Zuckerkette Gal(β1-4)GlcNAc(β1-3)Gal(β1-3)GalNAc Beispiel für eine Zuckerstruktur bei einem O-Glykan der pZP B Diantennäre Struktur eines komplexen Zuckers Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-6) Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2)Man(α1-3) dominierende neutrale Oligosaccharidstruktur der N-Glykane der pZP C Triantennäre Struktur eines komplexen Zuckers Gal(β1-4)GlcNAc(β1-6)Man(α1-6) Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc Gal(β1-4)GlcNAc(β1-4) Man(α1-3) Gal(β1-4)GlcNAc(β1-2) Beispiel für eine triantennären Zuckerkette eines N-Glykans der pZPB, welches neben den tetraantennären in der Lage ist, die Bindung zwischen Spermatozoon und Eizelle zu inhibieren (KUDO et al. 1998). D Mannosereicher Zucker Man(α1-6) Man(α1-6) Man(α1-3) Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc Man(α1-3) Dominierende Struktur eines neutralen N-Glykans des „High-Mannose“-Typs, welches sich beim Rind durch inhibierende Wirkung(en) auf die Spermatozoon-Eizell-Bindung und die IVF auszeichnet (NAKANO u. YONEZAWA 1998). Abb. 3: Schematische Darstellung von porcinen und bovinen biologisch aktiven Glykanen der ZP (nach TÖPFER-PETERSEN 1999) Gal = Galaktose; Man = Mannose; Fuc = Fukose; GlcNAc = N-Acetylglukosamin


37

5.3. Spermien-Zona pellucida-Interaktionen

Zuckerstrukturen der ZP bei der Gameteninteraktion Zahlreiche Untersuchungen belegen, dass die Oligosaccharidstrukturen der ZP bei der

Gameteninteraktion eine maßgebliche Rolle spielen. Die genauen Prozesse sind jedoch noch

sehr unzureichend erklärbar. Nur bei wenigen Arten ist bisher bekannt, welches Glykoprotein

für die Spermienbindung zuständig ist. Bei der Maus und beim Hamster wird ZPC sowohl die

Fähigkeit zur Erkennung des Spermiums als auch zur Induktion der Akrosomreaktion

zugeordnet. Die Bindungsaktivität der ZP von Schwein und Kaninchen ist hingegen am ZPB

lokalisiert (HEDRICK 1996; PRASAD et al. 1998). Zur Komplettierung der

Speziesunterschiede ist anzumerken, dass bei Xenopus laevis (Krallenfrosch) der

Spermienrezeptor (gp69/64) am ZPA liegt (TIAN et al. 1999). Beim Menschen wird wie bei

der Maus ZPC die Rezeptoraktivität zugewiesen. Es fehlen jedoch die direkten Beweise für

eine Bindungslokalisation, da bisher nur die Fähigkeit zur Induktion der Akrosomreaktion

beim rekombinanten hZPC nachgewiesen werden konnte (BREWIS et al. 1996) und nicht die

Bindungsfähigkeit direkt.

Sowohl bei der Maus als auch beim Schwein wurde die Spermienrezeptoraktivität

hauptsächlich einer bestimmten Klasse von O-glykosidisch gebundenen Zuckern zugeordnet

(FLORMAN u. WASSARMAN 1985; YUREWICZ et al. 1991). Im Gegensatz dazu

postulieren in neuerer Zeit andere Autoren die Beteiligung von neutralen N-glykosidisch

gebundenen Zuckern an der Gametenbindung (TÖPFER-PETERSEN et al. 1995; NAKANO

u. YONEZAWA 2001). Bei beiden angesprochenen Arten scheint ein Zusammenspiel von

diversen biologisch aktiven Oligosacchariden für eine ausreichend starke Bindung von Nöten

zu sein. Bei der Maus kann die Rezeptoraktivität einer Region im C-terminalen 28kDa Peptid

von mZPC zugeordnet werden (WASSARMAN u. LITSCHER 2001). JOHNSTON et al.

(1998) entwickelten bei der Maus ein komplexes Modell der Spermienerkennung. Demnach

besitzen die Spermien Bindungsstellen, die eine hohe Affinität für α3-fukosylierte

Oligosaccharide und eine niedrigere Affinität für α3-galaktosylhaltige und β-galaktosehaltige

Strukturen zeigen. Der Grad der Sialylierung und Sulfatierung scheint keinen Effekt auf die

Bioaktivität auszuüben (SHUR 1998).


38

YUREWICZ et al. konnten 1992 zeigen, dass die Poly-N-Acetyllaktosamineinheiten

anscheinend keine Rolle bei der Spermienbindung im porcinen Organismus spielen. Nach

einer Trypsinspaltung von isoliertem pZPB und pZPC wies nur der Anteil der O-Glykane von

pZPB noch eine Rezeptoraktivität auf. Bei den O-Glykanen von pZPC ist dies nicht der Fall,

so dass von einem unterschiedlichen O-Glykolysierungsmuster ausgegangen werden kann.

Im Gegensatz dazu konnte in aktuellen Ergebnissen gezeigt werden, dass die neutralen N-

glykosidisch verknüpften Oligasaccharide vom porcinen ZPB/ZPC-Komplex eine

Bindungsaffinität für Spermien besitzen (YONEZAWA et al. 1999; NAKANO u.

YONEZAWA 2001). Bei all diesen Zuckerketten vom komplexen Typ wird den tri-und

tetraantennären Ketten eine größere Bindungsaktivität als den diantennären Ketten

zugesprochen. Eine dominierende Rolle scheinen dabei die Zuckerstrukturen, die an Asn220

in der N-terminalen Region von endo-β-Galaktosidase gespaltenen ZPB geknüpft sind,

einzunehmen. Den Strukturen von ZPC wird eine unterstützende Funktion zugeordnet.

Bei anderen Spezien werden interessanter Weise andere Kohlenhydrate als Spermienrezeptor

angesprochen. Beim Rind konnte gezeigt werden, dass isoliertes bZPB mit seinen

hauptsächlich neutralen N-Glykanen des High-Mannose-Typs in der Lage ist, die Spermien-

Eizell-Bindung und die In-vitro-Fertilisation zu hemmen. Weiterhin konnte gezeigt werden,

dass die Bindungskapazität nach der Befruchtung herabgesetzt ist, ein Indiz also für

Veränderungen der ZP in Struktur und/oder Konformation während der Fertilisation

(NAKANO et al. 1996; NAKANO u. YONEZAWA 1998).

Die Bindung von humanen Spermien an hZP kann durch diverse Zucker (Fukose, Mannose,

Galaktose und N-Acetylglukosaminreste) gehemmt werden (MIRANDA et al. 1997).

Weiterhin zählen auch komplexe Glykokonjugate mit selektinartigen Liganden, wie Sialyl-

Lewis und fukosylierte und sialylierte GalNAc-β(1-4)-GlcNAc (LacdiNAc)-Antennen der N-

Glykane, zu den Inhibitoren. OEHNINGER et al. (2001) kommen daher zu der Erkenntnis,

dass beim Menschen die Gametenerkennung und –bindung über einen selektinähnlichen

Mechanismus vermittelt wird.

Alle diese Daten zeigen, dass es sich bei der Spermienerkennung und der Bindung an die ZP

um ein sehr komplexes und spezifisches System handelt. Homologen ZP Proteinen können

keineswegs die gleichen Funktionen zu geordnet werden. Die Gameteninteraktion scheint ein

Ergebnis kooperierender multimerer Rezeptorsysteme darzustellen (SHUR 1998).


39

ZP bindende Proteine der Spermien Diverse Zona pellucida bindende Proteine (ZBP) der Spermienmembran sind zur Zeit schon

bekannt, aber von nur wenigen ist auch die Struktur und ihre biochemische Wirkungsweise

detailliert erforscht. Bei den ZBP handelt es sich um kohlenhydratbindende Enzyme oder

lektinähnliche Proteine, die jeweils spezifische Bindungsstellen für die ZP und ihre

Zuckerstrukturen aufweisen.

Die β(1-4)-Galaktosyltransferase (GalTase) der Maus ist in die anfängliche Bindung des

Spermiums an die ZP involviert. Sie hat nachweislich einen Anteil an der Aktivierung der G-

Proteine der Spermatozoenmembran, welche Phosphorylierung und Induktion der

Akrosomreaktion zur Folge hat. Allerdings sind GalTase defiziente Mäuse trotzdem ohne

große Einschränkungen befruchtungsfähig. Dies untermauert die Vermutung, dass die

GalTase die Gametenbindung in einem speziesspezifischen System von mehreren Rezeptoren

lediglich unterstützt (TÖFPER-PETERSEN et al. 1995; SHUR 1998). Es erfolgt dabei eine

nicht katalytische Bindung der GalTase an die N-Acetylgalaktosaminreste des mZPC

(MILLER et al. 1992). Das murine sp56 ist im Gegensatz zum integralen Membranprotein

GalTase ein peripheres Membranprotein der Spermien. Es erkennt die O-glykosidischen

Zuckerketten des ZPC, welche für die Spermienrezeptoraktivität des ZPC unabdingbar sind

(BLEIL u. WASSARMAN 1988). So kann auch dem sp56 eine Beteiligung an der primären

Spermien-ZP-Bindung zugesprochen werden (CHENG et al. 1994).

Das sp17 des Kaninchens bindet über einen Kohlenhydrat-Sulfat-Erkennungsmechanismus an

die ZP und es kann wahrscheinlich einer Untergruppe der Lektine, die spezifisch an Galaktose

binden, zugeordnet werden (ABDULLAH et al. 1991; RICHARDSON et al. 1994).

Ein weiteres Protein der Spermienmembran, das an der Interaktion mit der ZP beteiligt ist, ist

das PH-20. Es handelt sich hierbei um ein Glykoprotein testikulärer Abstammung, das über

einen GPI-Anker an die Spermatozoenmembran gekoppelt ist. Mittels spezifischer Antikörper

gegen PH-20 konnte die Kontaktaufnahme des PH-20 an die ZP gehemmt werden und somit

die Bedeutung für den Bindungsvorgang nachgewiesen werden (PRIMAKOFF et al. 1988).

Weiterhin besitzt das angesprochene Protein auch eine Hyaluronidaseaktivität (HUNNICUTT

et al. 1996). PH-20 wurde beim Meerschwein (PRIMAKOFF et al. 1997) und weiterhin beim

Affen und Menschen (LIN et al. 1993) nachgewiesen.


40

Beim Schwein sind bereits diverse spermienassozierte Proteine, die an die ZP binden,

bekannt. Es handelt sich dabei um P47, Zonadhäsin, Spermadhäsine und Pro/Akrosin. P47 ist

ein peripheres Spermienmembranprotein, das auch im testikulären Gewebe von Schwein,

Rind, Maus, Mensch und Pferd (ENSSLIN et al. 1998; TÖPFER-PETERSEN u. GENTZEL

persönliche Mitteilung) mit einer Sequenzhomologie von 60-100% lokalisiert werden konnte.

Das porcine Zonadhäsin bindet speziesspezifisch an homologe ZP. Ob die Bindung über die

Zuckerstrukturen der ZP oder direkt mit dem Polypeptidcore abläuft, wird noch diskutiert.

Vermutlich erfolgt die Erkennung über heparinbindende speziesspezifische Sequenzen der

Zonadhäsine von sulfatierten Oligosaccharidstrukturen der ZP (TÖPFER-PETERSEN 1999).

Bei der Gruppe der Spermadhäsine handelt es sich um eine Gruppe von Komponenten des

Seminalplasmas, die in die Spermienmembran eingebaut werden. Es werden beim Eber

AWN, AQN, die Buchstaben stehen für die drei ersten Aminosäuren der N-terminalen

Sequenz, und das Porcine Seminal Plasma Protein (PSP) unterschieden (CALVETE et al.

1994; SOLIS et al. 1997). Proteine der Spermadhäsinfamilie konnten auch beim Hengst

(REINERT et al. 1996) und Bullen (WEMPE et al. 1992) nachgewiesen werden. Die

Bindungsfähigkeit der Spermadhäsine erstreckt sich über verschiedene Stoffe. Sie binden an

Serinproteaseinhibitoren (SANZ et al. 1992), O-Phosphorylethanolamin (DOSTALOVA et al.

1995b) und sulfatierte Glukosaminoglykane z.B. Heparin (CALVETE et al. 1996b). Da die

Spermadhäsine auch mit sehr hoher Affinität an Zuckerstrukturen binden, werden sie auch als

Lektine tituliert. Die Zuckerstrukturen Gal-β(1-3)-GalNAc und Gal-β(1-4)GlcNAc der O- und

N-glykosidisch verknüpften Oligosaccharide werden von AWN (DOSTALOWA et al. 1995b)

und AQN-1 und AQN-3 (CAVELTE et al. 1996a) erkannt. PSP-II hingegen weist eine hohe,

von divalenten Kationen (z.B. Ca2+) abhängige Bindungsaffinität für Mannose-6-Phosphat

auf.

Das Pro/Akrosin fungiert als Penetrationsenzym (TÖPFER-PETERSEN et al. 1990). Es liegt

bei intakten Spermien als die inaktive Vorstufe Proakrosin vor. Die Interaktion mit der ZP im

Rahmen der sekundären Bindung an die ZP nach der Akrosomreaktion bewirkt die

Umwandlung in das enzymatisch aktive Akrosin, welches dem Spermium die Penetration

durch die ZP erleichtert. Der Kontakt mit der ZP wird durch einen Polysulfat-


41

Erkennungsmechanismus vermittelt. Die basischen Aminosäuren des Pro/Akrosins agieren

dabei mit den laktosaminhaltigen N- und O-gebundenen Kohlenhydratstrukturen der ZP.

5.4. Die Zona pellucida nach der Befruchtung

Nach der Verschmelzung beider Gameten und ihrer Vorkerne bekommt die Zona pellucida

neue Aufgaben und unterliegt einer Umstrukturierung. Sie verhindert Aggregationen von

mehreren Blastomeren und zu frühe Kontaktaufnahme mit dem Eileiterepithel bzw. dem

Endometrium der Gebärmutter. Weiterhin schützt die Zona den Keimling vor mechanischen,

toxischen und mikrobiologischen Einflüssen bis zum Schlupf des Trophoblasten aus der ZP

mit anschließender Einnistung in die Gebärmutterschleimhaut (HERRLE u. BEIER 2000).

Nicht nur die ZP bildet eine Schutzhülle, auch die nach Freisetzung der kortikalen Granula

entstehende perivitelline Matrix (PVM) übernimmt Schutzfunktionen und scheint auch beim

Polyspermieblock beteiligt zu sein (DANDEKAR u. TALBOT 1995). Es ist bekannt, dass die

ZP von der ungereiften Eizelle bis zur Zygote in ihrer Zusammensetzung Veränderungen

erfährt (HEDRICK et al. 1987). Die Veränderungen werden u.a. durch den Kontakt zur

freigesetzten Granula der Eizelle und dem Eileitersekret hervorgerufen.

Die Granulasekrete bewirken eine Härtung (hardening) der Zona, die für den

Polyspermieblock, den Schutz der Blastocyste und den Transport durch den Eileiter von

Nöten ist. Mit der Härtung wird die ZP auch dünner, so dass der Schlupf des Embryos

erleichtert wird. Für den Aufbruch der ZP werden zum einen der Druck der Blastozyste selbst

und lytische Enzyme verantwortlich gemacht (SCHIEWE et al. 1995). Die Enzyme stammen

aus der Zygote und/oder dem Uterussekret.

Ein übermäßiges Zona hardening wurde bei der In-vitro-Kultur beobachtet, welches beim

Schlüpfen der Blastozyste aus der ZP im Uterus mit Problemen verbunden ist (DE VOS u.

VAN STEIRTEGHEM 2000). Zur Umgehung dieses Hindernisses wurden spezielle

mikroassistierende Methoden, und zwar mechanische, chemische und lasergesteuerte,

entwickelt. Zunächst wurden Schlupflöcher in die ZP gesetzt (Drilling) wie COHEN et al.

1989 beschreiben. Um einen besseren Schutz des Embryos zu gewährleisten, befassen sich


42

neuere Untersuchungen mit einer partiellen Ausdünnung der ZP (GORDON u. DAPUNT

1993).

Neben dem mechanischen Schutz durch das Hardening selektiert die ZP auch die Stoffe, die

bis zum Embryo vordringen können. Die Selektion scheint nicht nur über eine

Größenbegrenzung der Moleküle abzulaufen. Bei vielen Arten konnte gezeigt werden, dass

die ZP permeabel ist für Moleküle von einer Größe wie Immunglobuline ( z.B. GUILLOMOT

u. BETTERIGE 1984), beim Schwein hingegen scheint dies nicht der Fall zu sein

(STROBAND u. VAN DER LENDE 1990). Es wurde auch beobachtet, dass große Viren,

Bakterien, Pilze und einige Toxine die ZP nicht passieren können (EAGLESOME et al. 1980;

FLEMING et al. 1987). TURNER und HOROBIN (1997) konnten zeigen, dass der

physikochemische Charakter eines Moleküls über dessen Verbleib außerhalb, innerhalb oder

durch die ZP entscheidet.

Tab. 2: Beziehungen zwischen Moleküleigenschaften und der Zona pellucida

Moleküleigenschaften (vWW: van der Waal’sche-

Wechselwirkungen)

Abstoßung durch ZP

Anreicherung

innerhalb der ZP

Erreichen

des Embryos durch ZP

schwache vWW, stark hydrophil

vorhanden

nicht vorhanden

nicht vorhanden

starke vWW,

hydrophil

nicht vorhanden

vorhanden

nicht vorhanden

starke vWW,

lipophil

nicht vorhanden

vorhanden

vorhanden

schwache vWW,

lipophil/schwach hydrophil

nicht vorhanden

nicht vorhanden

vorhanden

Durch diese Selektion werden Signalstoffe von dem Mutterorganismus und von dem Embryo

akkumuliert und modifiziert. Die Zona pellucida wirkt also ähnlich einer Mailbox (HERRLE

u. BEIER 2000).


43

5.5. Antikörper gegen Zona pellucida als Immunokontrazeptiva

Es stellte sich bei einer Reihe von immunologischen Versuchen heraus, dass die ZP eine

starke Immunogenität besitzt. Ziel ist es nun eine Vakzine zu entwickeln, die reversibel nur

die normale Spermien-Zona pellucida-Bindung verhindert, aber keine Auswirkungen auf den

ovariellen Zyklus mit sich bringt. Es wurden Antikörper gegen verschiedene Epitope,

hauptsächlich von ZPC, auf ihre empfängnisverhütenden Eigenschaften getestet. Meist

wurden gute Kontrazeptionsraten erzielt, allerdings mit teilweise erheblichen unerwünschten

Nebenwirkungen, wie Eierstockentzündungen (HERRLE u. BEIER 2000). Es konnten zwar

auch durch gezieltere Auswahl der Antigenregion die unerwünschten Nebenwirkungen

minimiert werden, dies ging aber bei den Versuchen mit Primaten mit einer reduzierten

Kontrazeptivität einher.

Außerhalb der Primaten wurde vor allem heterologe ZP eingesetzt. Solubilisierte porcine

Zona pellucida als aktive Immunisierung wurde bei 27 Arten mit einer 90%igen Sicherheit,

gegebener Reversibilität und ohne Nebenwirkungen eingesetzt (KIRKPATRICK et al. 1996).

Einem breiten Einsatz zur Vermehrungskontrollen in den Wildtierpopulationen stehen noch

einige Probleme gegenüber. Einerseits sind für die Erstellung der heterologen Vakzine die

homologen Genabschnitte bei vielen Arten ein großer Vorteil, anderseits verhindern sie aber

auch den Einsatz von Impfungen mittels Fressköder (entsprechend der Tollwutimpfung für

Füchse in Deutschland). Fast jedes Tier würde durch den Fraß der Köder steril werden. Also

bleibt nur noch die gezielte Impfung und Markierung jedes einzelnen Tieres, welches

natürlich mit größeren Kosten und Aufwänden verbunden ist.

In neuerer Zeit wurden Versuche mit gentechnisch veränderten Mäusen durchgeführt.

Murines ZPC wurde durch humanes ZPC ersetzt und nach Verabreichung von Antikörpern

gegen hZP3 konnte eine langanhaltende, reversible Kontrazeption erreicht werden

(GREENHOUSE et al. 1999). Die Maus stellt somit ein gutes Testsystem für die Entwicklung

einer humanen Vakzine dar.

C Material und Methoden______________________________________________________

44

C Material und Methoden

1. Isolierung der Zona pellucida

1.1. Massenaufarbeitung

Zur Gewinnung der Zona pellucida im großen Rahmen wurde folgende Aufarbeitung

modifiziert nach DUNBAR et al. (1980) angewendet:

Ovarien von peripubertären Jungsauen wurden am Band eines Schlachthofes in gekühlte

Oozytenpufferlösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) gesammelt und bei – 20°C

eingefroren.

Am Vortag der eigentlichen Aufarbeitung wurden ca. 1,5 kg Ovarien über Nacht im

Kühlschrank in 1-2 Litern Oozytenpuffer aufgetaut.

Am nächsten Tag wurden Ovarien mit Gelbkörpern, Zysten etc. aussortiert und

Bindegewebsreste abpräpariert. Dann wurden die Ovarien mit einem Fleischwolf

(Körnungsdurchmesser 5mm; Scharfen) zerkleinert und mit kühlschrankkaltem

Oozytenpuffer versetzt (1/3 Ovarien zu 2/3 Puffer) und eine Stunde im Kühlschrank mittels

Magnetrührer gerührt.

Die anschließenden Filtrationsschritte fanden alle auf ständig eisgekühlten Gefäßen statt.

Die durchmischte Ovariensuspension filtert man über Nylonnetze mit abnehmender

Porengröße, und zwar 8mal mit 2000 µm, 3mal mit 1000 µm, 3mal mit 600 µm und 6mal mit

200 µm (Mondurnetze; Josef Hepfinger, München).

Es wurde stets der Durchfluss gesammelt, wobei die zerkleinerten Gewebereste, welche auf

den Netzen liegen blieben, während der ersten vier Filtrationsschritte nochmals je 10 Minuten

lang bei 4°C gerührt wurden.

Als abschließenden Schritt wurde ein Netz mit einer Porengröße von 80 µm verwendet. Hier

wurden nun die Rückstände, die sich beim zweimaligem Durchspülen auf dem Netz

gesammelt hatten, mit Puffer abgespült. Die aufgefangene Suspension lagert man über Nacht

im Kühlschrank, währenddessen die Oozyten, aber auch ein großer Teil des Zelldetritus, zu

Boden sinken.


45

Am nächsten Morgen wurde der Überstand mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt.

Über eine Percoll-Dichtezentrifugation wurden Eizellen und Zelldetritus aus der

verbleibenden Suspension getrennt. Dafür wurden 50 ml Zentrifugengläser (Schott Duran®;

Carl Roth GmbH & Co., Karlsruhe) mit 5 ml 40%iger Percolllösung und je 10 ml 20%iger

und 10%iger Percolllösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) beschickt. Den Abschluss

bildeten 10 ml der ungereinigten Oozytensuspension. Nach erfolgter Zentrifugation (20 min.

bei 1900 xg; Megafuge 2.0 R, Heraeus, Hanau) wurden die Eizellen aus der 10%igen Percoll-

Schicht mittels Pipette abgesammelt.

Diese Suspension wurde durch ein 42,5 µm Netz filtriert und die auf dem Netz liegenden

Oozyten mit Aqua bidest. abgespült.

In fünf Tropfen von je 5 µl wurden die Oozyten und Zonae pellucidae unter einem

Stereomikroskop (Zeiss 4750 03, Jena) gezählt und der Durchschnittswert ermittelt. Anhand

dieser Zahl wurde eine Schätzung der Gesamtanzahl an Oozyten und Zonae in der

vorliegenden Suspension ermittelt.

Diese wurde anschließend durch einen Hub (Stroke) in einem 2 ml Potter (B. Braum AG,

Melsungen) homogenisiert, erneut durch ein 42,5 µm Netz filtriert, dieses mit Aqua bidest.

abgespült und die Flüssigkeit in 1,5 ml Eppendorfgefäße (Eppendorf, Sarstedt) überführt. Es

folgte eine Zentrifugation der Gefäße (für 15 min bei 4500 xg), der Überstand wurde

verworfen und die Zonae pellucidae nach und nach durch Resuspension in einem Gefäß

vereinig. Die weitere Lagerung erfolgte bei –20°C.

1.2. Gewinnung von Zonae pellucidae aus frischen Ovarien

Auf einem Schlachthof wurden am Versuchstag Ovarien von peripubertären Jungsauen in ein

auf 30°C angewärmtes Thermosgefäß gesammelt. Der Transport zum Labor erfolgte

innerhalb von ca. einer Stunde. Dort wurden die Ovarien sofort mit physiologischer

Kochsalzlösung (39°C) gespült. Anschließend wurden Follikel mit einem Durchmesser von 2-

5 mm und heller, durchsichtiger Oberfläche mit einer Aspirationsnadel (18-gauge; Mikrolance

3, Dickinson) punktiert. Die Nadel war über ein Schlauchsystem und einem Adapter mit

einem sterilen Auffanggefäß verbunden (50 ml Zentrifugenröhrchen, Greiner GmbH,


46

Frickenhausen), welches mit einer Unterdruckpumpe (20 mmHg) gekoppelt war. Die

Follikelflüssigkeit in dem Auffanggefäß mit den Kumulus-Oozyten-Komplexen (KOK)

wurde nach der Punktion mit Spülmedium (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) auf ca. 50 ml

aufgefüllt und zur Sedimentation stehen gelassen. Nach 10 min wurde der Überstand

abgegossen und das Sediment wieder mit Spülmedium gewaschen. Nach weiteren 10 min

wurden nach Abgießen des Überstandes drei ml des Sedimentes in einer Petrischale

(Durchmesser 94 mm) mit 10 ml PBS (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) verdünnt.

Unter einem Stereomikroskop (20-50fache Vergrößerung) wurden die KOK nach

morphologischen Kriterien beurteilt und klassifiziert. Die Einteilung wurde nach den von

LEIBFRIED und FIRST (1979) aufgestellten Kriterien hinsichtlich der Integrität der Zona

pelllucida, der Zahl der Kumuluszellschichten, der strukturellen Homogenität und der

einheitlichen Färbung des Zytoplamas vorgenommen. Für die Versuche wurden KOK

ausgewählt, die mindestens drei kompakte Kumuluszellagen und keine expandierte

Kumulusschicht besaßen. Die ausselektierten KOK wurden zweimal im Spülmedium

gewaschen und in einer kleinen Petrischale (35 mm) gesammelt.

Wurden ungereifte Zonae pellucidae benötigt, so wurden die KOK zur Denudierung durch

mehrmaliges Aufziehen und Ausspülen mit einer ausgezogenen Mikropipette mechanisch von

den Kumuluszellen befreit. Zur Isolierung der Zona pellucida wurde die Eizelle erneut mittels

einer Mikropipette, deren Durchmesser ca. ein Drittel kleiner als der einer Oozyte sein sollte,

aufgezogen und ausgespült, so dass die Eizelle und die Zona pellucida durch den

mechanischen Defekt, der durch die Scherkräfte entsteht, von einander getrennt wurden.

Die Zona pellucida konnte nun für weitere Versuche verwendet werden oder wurde in Aqua

bidest. bei -20°C eingefroren. Alternativ konnten auch die denudierten Eizellen in einer

hyperosmolaren Salzlösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) bei 4°C bis zu drei Monaten

gelagert werden.

Am Versuchsvortag wurden sie dann in PBS/2% PVA gewaschen, die Zona pellucida

mechanisch isoliert und in PBS/2% PVA im Kühlschrank bis zum nächsten Tag aufbewahrt.


47

1.3. In-vitro-Maturation der Oozyten

Die wie unter 1.2. beschrieben selektierten KOK wurden in äquilibrierten Maturationsmedium

(s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) dreimal gewaschen. Die Reifung erfolgte in five well

dishes (Embryokulturschale mit fünf Vertiefungen; Minitüb, Tiefenbach) mit je 500 µl

Maturationsmedium in den Vertiefungen. Zur Äquilibrierung wurden die Schalen einige

Stunden vor Gebrauch bei 38,5 °C und 5% CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Luft in einem

Inkubator (Nuaire NU 2700 E, Zapf Instrumente, Sarstedt) einige Stunden vorinkubiert.

Es wurden jeweils 50 KOK in eine Vertiefung verbracht und zur Supplementierung Hormone

(PMSG/hCG) und db-cAMP hinzugegeben. Die Reifung erfolgte bei 38,5°C und 5% CO2

über 44-46 Stunden. Nach den ersten 24 Stunden wurden die KOK in Maturationsmedium

ohne Supplementierung umgesetzt.

Nach Ende der Reifungszeit wurden die KOK aus dem Maturationsmedium entnommen und

in einem Spülmedium (PBS/2% PVA) mehrmals gewaschen. Durch mehrmaliges Pipettieren

mit einer 100 µl Eppendorf-Pipette wurde eine grobe Ablösung der Kumuluszellen erreicht.

Die Eizellen konnten nun in einer hyperosmolaren Salzlösung bei 4°C gelagert werden oder

sie wurden mittels ausgezogener Mikropipette feindenudiert und die Zonae pellucidae isoliert.

Diese konnten bei Bedarf bei –20°C eingefroren werden.

1.4. Überprüfung des Kernreifungsstatus

Die Darstellung des Meiosestadiums erfolgte modifiziert nach HANCOCK (1958). Die

denudierten Eizellen, jeweils Stichproben des entsprechenden Eizellpools, wurden in 0,7 %ige

Kaliumchloridlösung für fünf Minuten inkubiert. Die Eizellen wurden nun in einem ca. 50 µl

großen Tropfen der Kaliumchloridlösung auf Deckgläschen mittig platziert. In die Ecken gibt

man als Abstandshalter „Paraffin-Vaseline-Füßchen“ (9 Teile Vaseline u. 1 Teil Paraffin). Ein

fettfreier Objektträger wurde nun so an den Tropfen mit den Eizellen herangeführt, so dass

sich dieser am Objektträger „fängt“ und dann der Objektträger mit dem anhaftenden Deckglas

umgedreht.


48

Die Fixation der Eizellen erfolgte für mindestens 24 Stunden in einer frisch angesetzten

Lösung aus einem Teil Essig und drei Teilen Ethanol. Anschließend legt man das Präparat für

30 min in reinen Alkohol. Zur Färbung wurde ein Tropfen 2%iger Orceinlösung neben das

Deckglas gegeben, welcher durch die Kapillarkraft unter das Deckglas gezogen wurde. Nach

dem gleichen System wurde nach zwei Minuten mit 25%iger Essigsäure überschüssiger

Farbstoff abgewaschen. Der Fluss der Säure wurde durch ein saugfähiges Tuch am

gegenüberliegendem Rand des Deckglases verstärkt. Die Beurteilung des Kernstatus erfolgte

mit einem Phasenkontrastmikroskop (Zeiss 1697, Jena) bei 200-400-facher Vergrößerung.

2. Elektrophoretische Auftrennungen

2.1. Eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelelektrophorese der ZP

Für die Gelelektrophorese musste zunächst eine Probenaufarbeitung erfolgen. Die in Aqua

bidest., pH 8,0 eingestellt mit Natronlauge, vorliegenden Zonae pellucidae (ZP) wurden in

einem Heizblock für zwei Stunden bei 72°C solubilisiert. Anschließend zentrifugiert man das

Gemisch für 10 min bei 15.000 xg scharf ab, um nicht gelöste Anteile abzutrennen.

Der Überstand konnte für die Analysen verwendet werden.

Die Proteinkonzentration wurde bei einer nicht genau definierten Anzahl an Zonae pellucidae,

beispielsweise wenn sie durch die Massenaufarbeitung gewonnen wurden, mittels Messung

der Optischen Dichte (OD) ermittelt und dafür die Extinktion bei einer Wellenlänge von 280

nm bestimmt.

Nach folgender Formel wurde dann die Kozentration der ZP-Lösung bestimmt:

gemessene OD bei 280 nm Konzentration der ZP-Lösung = ____________________________________ 1,17 (1 mg/ml ZP ≈ 1,17 OD)


49

Die eindimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophrese (1D-PAGE) wurde in

modifizierter Form mit der nach LAEMMLI (1970) beschriebenen Methode durchgeführt.

Hierbei wurden die Proteine gemäß ihrer Netto-Ladung, Größe und Gestalt durch das Anlegen

eines elektrischen Feldes getrennt. Durch die Einstellung der Porengröße des sehr stark

vernetzte Polyacrylamidgels, welches als trennende Matrix fungiert, kann die

Wanderungsstrecke eine optimale Trennung der Proteine in einem bestimmten

Molekulargewichtsbereich ermöglichen. Anhand eines mitlaufenden Standards können die

Molekulargewichte neuer, unbekannter Proteine ermittelt werden.

Es wurden selbsthergestellte, 0,75 mm starke, 10%ige (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) und

6 x 8,3 cm große Polyacrylamidgele verwendet. Diese wurden nach Polymerisierung mit

einem 4,5%igem Sammelgel überschichtet, in dem durch den Einsatz eines

Kunststoffkammes jeweils zehn Taschen zur Probenaufnahme ausgeformt wurden.

Die Proben zur Analyse wurden im Verhältnis 1:2 mit Laemmli-Auftragspuffer (s.

Rezeptverzeichnis in J Anhang) verdünnt, fünf Minuten bei 95°C erhitzt und eine Minute bei

13.000 xg zentrifugiert. Ebenso wurde mit dem Standard LMW (Low Molecular Weight

Proteinstandard, 161-0304; BioRad, München) verfahren. Sollten im Anschluss an die 1D-

PAGE die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert werden, so wurde ein biotinylierter

LMW Standard (161-0306; BioRad, München) verwendet.

Die Trennung der Proteinproben erfolgte in einer Elektrophoresekammer (Mini-Protean II;

BioRad, München), welche mit Laufpuffer (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) gefüllt wurde.

Während der Passage der Proben des Sammelgeles (Marker: Bromphenolblau) startet man

den Elektrophoreselauf mit 100 V, im Trenngel wird auf 200 V erhöht. Der Lauf wurde mit

dem Auslaufen des Frontmarkers am unteren Rand beendet.

Die aufgetrennten Polypeptide wurden nun für weitere Analysen auf eine PVDF-

Blotmembran transferiert oder wurden direkt auf dem Gel angefärbt Coomassie-Färbung

detektiert.

Dazu wurden die Gele für ca. 30 min bei Raumtemperatur in der Färbelösung (0,25%

Coomassie Brilliant Blue R (Nr. 35051; Serva, Heidelberg); 40% Methanol; 10% Eisessig)

leicht geschwenkt. Zur Entfärbung des Hintergrundes wurden die Gele unter leichtem

Schütteln in einer Entfärbelösung (20% Methanol; 10% Eisessig), welche mehrmals


50

gewechselt wurde, gewaschen. Das Gel wurde zwischen zwei Cellophanseiten (Gel Drying

Film; Promega, Madison) getrocknet.

Anhand der 1D-PAGE wurden die Zona pellucida-Proben auf ihre Reinheit überprüft und die

molekularen Massen ihrer Polypeptide ermittelt.

2.2. Zweidimensionale SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der ZP

Bei der zweidimensionalen SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE) werden die

Proteine nicht nur nach der molekularen Masse, sondern auch nach ihrem isoelektrischen

Punkt aufgetrennt. Die beiden Auftrennungskriterien stehen im Gel senkrecht zueinander, so

dass ein zweidimensionales Trennungsbild entsteht. In einem Gel mit linearem pH-Gradienten

wandern die geladenen Substanzen nach Anlegung einer elektrischen Spannung an eine

Position, die ihrem isoelektrischen Punkt entspricht. Der isoelektrische Punkt (IP) ist der pH-

Wert einer Lösung, bei dem die Dissoziation der basischen und sauren Gruppen eines

amphoteren Stoffes gleich stark und folglich die Summe der Ladungen gleich Null ist.

Die isoelektrische Fokussierung (IEF) der ersten Dimension wurde mittels des Multiphor II

Systems (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) durchgeführt. Dazu wurden

immobilisierte pH-Gradienten-Gele (IPG) mit einem linearen pH-Gradienten von pH 3 bis pH

10 mit einer Länge von 7 cm (Immobiline DryStrips; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala,

Schweden) verwendet.

Die zu untersuchende Zona pellucida-Probe wurde nach der Solubilisierung im SpeedVacPlus

(Sc 110 A; Servant, Incorporated, New York, USA) auf 15 µl eingeengt, welche anschließend

mit Rehydrationslösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) auf 125 µl aufgefüllt wurde.

Diese Lösung gibt man in einem der Länge des IPG-Strips entsprechenden IPGphor Strip

Holder (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden). Der aufgetaute IPG-Strip wurde

vorsichtig aufgelegt und mit ca. 250 µl Mineralöl überschichtet.

Die Fokussierung wurde bei 20°C durchgeführt und nach einem ausgearbeitetem Programm

(15 h Rehydration bei 50 V, 1 h bei 150 V, 1 h bei 500 V, 1 h bei 1000 V und in der letzten

Stufe bei 4000 V bis zum Erreichen von 20.000 Vh) gestartet.


51

Am Tag nach der Fokussierung (Dauer ca. 24 h) ist es möglich, die Streifen mit den

fokussierten Proteinen bei –80°C einzufrieren. Bei den beschriebenen Versuchen wurde

jedoch darauf verzichtet und die zweite Dimension gleich angeschlossen.

Für die zweite Dimension, die PAGE, muss der IPG-Strip erst in einer Lösung bei

Raumtemperatur unter Schütteln äquilibriert werden. Für die ersten 15 Minuten gibt man

DTT und für die nächsten 15 Minuten Jodacetamid zu der Äquilibrierlösung (s.

Rezeptverzeichnis in J Anhang). Um eine Reduktion und die damit verbundene Aufspaltung

von Proteinen zu vermeiden, wurde nach einigen Versuchen auf den Zusatz von DTT

verzichtet.

Die Gele und die Vorbereitung des Proteinstandards für die 2D-PAGE entsprachen denen der

1D-PAGE, lediglich wurde für die Formung der Taschen ein anderer Kunststoffkamm

verwendet, so dass eine Tasche für den Standard und eine sieben cm lange Tasche für den

IPG-Strip geschaffen wurde. Der äquilibrierte Gelstreifen wurde mittels Laemmli-

Auftragspuffer so in die Geltasche eingeschoben, dass die Anode (pH 3) an der Seite mit den

Molekulargewichtsstandardproteinen positioniert wurde. Der Streifen wurde abschließend mit

erhitzter flüssigen 0,3%igen Agarose überschichtet.

Der Elektrophoreselauf wurde mit 100 V gestartet und mit Erreichen der Front des Trenngels

auf 200 V erhöht.

Die doppelt aufgetrennten Proteine wurden entweder auf eine Blotmembran übertragen, oder

mit einer Silberfärbung, welche sensitiver als die Coomassie-Färbung ist, angefärbt.

Bei der Silberfärbung wurde eine modifizierte Methode nach HEUKESHOVEN (1988)

angewendet. Zunächst wurden die Gele über Nacht in 12,5% Trichloressigsäure fixiert.

Anschließend wurden sie viermal für 10 Minuten mit Aqua bidest. auf einer Schüttelbank

gewaschen und für 60 Minuten in der Inkubationslösung (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang)

geschwenkt. Nach erneuter Waschung (6 x 10 min in Aqua bidest.) schloss sich der

30minütige Färbevorgang (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) an. Die Gele wurden nun nach

kurzem Schwenken in Aqua bidest. in der Entwicklerlösung (s. Rezeptverzeichnis in J

Anhang) bis zum gewünschten Ergebnis (sec-min) gefärbt. Die Farbreaktion wurde durch

eine Stopplösung (0,05 M Glycin) beendet. Nach 5-10 min konnten die Gele in Wasser

gelagert und anschließend getrocknet werden.


52

3. Immuno- und lektinologische Analyse der ZP Glykoproteine am Proteinblot

3.1. Chemilumineszenzverfahren

Nachweise von Proteinen mittels Antikörpern und von Kohlenhydratstrukturen durch Lektine

sind sehr empfindliche Verfahren in der Biochemie, die eine Charakterisierung von sehr

geringen Glykoproteinmengen erlauben.

Für die gewählte Versuchsanordnung mussten die Proteine von einem Gel nach

elektrophoretischer Auftrennung auf eine Membran durch ein Blotting-Verfahren transferiert

werden.

Die vorliegenden Versuche wurden nach der von TOWBIN et al. (1979) beschriebenen

Methode durchgeführt. In einem Semidry-Apparatus (Biometra, Göttingen) wurde unter

Wasserkühlung (1 l/min) auf PVDF-Membranen (Nr. 1722026; Boeringer Mannheim,

Mannheim) geblottet. Die 6 x 8,3 cm große Membran wurde vor ihrer Verwendung für 30 sec

in 100% Methanol geschwenkt, kurz in Aqua bidest. gewaschen und für 2-3 min in

Blottingpuffer (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang) äquilibriert.

Das Blotten erfolgte in einem Sandwichverfahren. Dieses „Sandwich“ bestand dabei von

unten nach oben aus drei Lagen in Blottingpuffer getränktem Blotpapier (GB 003;

Schleicher&Schell, Dassel), der Membran, dem Gel und erneut drei Lagen getränktem

Blotpapier. Nach der Positionierung dieses „Sandwiches“ zwischen den beiden mit

Blottingpuffer angefeuchteten Graphitplatten des Semidry-Apparatus wurde bei konstantem

Strom (1mA/cm2) für zwei Stunden bei Raumtemperatur geblottet.

Der Bloterfolg wurde durch eine Anfärbung mit Ponceau Rot (s. Rezeptverzeichnis in J

Anhang) für fünf min und anschließender Entfärbung mit Aqua bidest. überprüft. Es handelt

sich dabei um eine reversible Färbung, die die weiteren Reaktionen nicht beeinflusst.

Für die immunologischen und die lektinologischen Untersuchungen wurden die Membranen

über Nacht in TBS/ Tween 1% (v/v) bei 4°C blockiert, um unspezifische Bindungen zu

verhindern.

Am nächsten Tag wurden die Membranen mit Antikörpern bzw. biotinylierten Lektinen

inkubiert (siehe 3.2 u. 3.3.) und die Reaktionen mittels einem Peroxidase-Chemilumineszenz-

Verfahren detektiert.


53

Nach der Inkubation mit horse radish-peroxidase (HRPO) gekoppelten Reagenzien wurden

die Membranen in eine durchsichtige Plastikfolie mit 3 ml working solution des

Chemilumineszenz-Substrates (Super Signal West Pico; Pierce über KMF Laborchemie, St.

Augustin-Buisdorf) eingeschweißt und für fünf Minuten leicht geschwenkt. Danach wurde

das Substrat aus der Folie ausgestrichen und diese erneut zugeschweißt. Die Membran wurde

mit Klebefilm in einer Röntgenkassette befestigt.

In einer Dunkelkammer mit röntgenfilmgeeigneter Lichtquelle (Lampenfilter 6BX-2 Safe

Light; Kodak GmbH, Stuttgart) wurde ein Röntgenfilm (XAR-5; Kodak GmbH, Stuttgart)

belichtet, in dem er auf die Membran platziert wurde. Je nach Reaktionsintensität reichten im

Durchschnitt 10-30 sec für die Belichtungszeit aus. Der Film wurde ca. 30 sec im

Entwicklungsbad (G 150; Agfa Deutschland, Köln) geschwenkt, kurz in einem Stoppbad

(Aqua bidest. mit einem Spritzer Essig) gewaschen, mindestens eine Minute im Fixierbad (G

350; Agfa Deutschland, Köln) fixiert und schließlich für fünf Minuten gewässert. Die

Trocknung des Röntgenfilmes wurde hängend und lichtgeschützt vorgenommen.

Die Vorteile der Chemilumineszenz sind, dass man ein hochempfindliches Detektionssystem

hat und durch veränderbare Belichtungszeiten unterschiedlich intensive Bilder von einer

Membran erhält. Ferner kann man die Membran für andere Analysen weiter verwenden. Dazu

wurde die Membran nach der Chemilumineszenz aus der Folie genommen und zweimal in

TBS/Tween 1% (v/v) gewaschen und in 3 M Kaliumthiocyanatlösung (Merck, Darmstadt)

zum „Abstrippen“ gegeben. Dies dauert bei Antikörpern 1-2 Tage, bei Lektinen erreicht man

in diesem Zeitraum eine Reduktion/Eliminierung möglicher unspezifischer

Hintergrundbindungen. Ein vollständiges „Abstrippen“ der Lektine ist nur bei einigen

schwach bindenden nach ca. 5-7 Tagen möglich. Zur Kontrolle des „Striperfolges“ wurden

die Membranen wieder gewaschen und blockiert. Anschließend folgte eine Inkubation mit

Peroxidase gekoppeltem Streptavidin oder Peroxidase gekoppeltem Zweitantikörper. Die

Chemilumineszenz wurde dann erneut wie beschrieben durchgeführt. Der biotinylierte

Standard bietet dabei eine gute Systemkontrolle, da Streptavidin an das Biotin bindet.


54

3.2. Immunologische Identifizierung der Glykoproteine der ZP

Zur Charakterisierung der einzelnen Glykoproteine der Zona pellucida nach der Auftrennung

durch die 1D- und 2D-PAGE wurden unterschiedliche Antikörper gegen die einzelnen

Glykoproteine bzw. deren Sequenzausschnitte verwendet.

Zum Einsatz kamen zwei verschiedene polyklonale Antikörper, die gegen ZPB (pZP3α) und

ZPC (pZP3β) gerichtet sind. Diese Antikörper werden hier im weiteren AK ZPB und AK

ZPC genannt.

TÖPFER-PETERSEN et al. (1993) erhielten diese Antikörper, indem nach Solubilisierung,

Auftrennung über HPLC-Chromatographie und Endo-β-Galactosidase-Spaltung porcines ZPB

und ZPC isoliert werden konnten. Mit diesen beiden Proteinanteilen wurden Hühner

immunisiert und aus den Eiern wurden die gebildeten Antikörper gewonnen.

Von Frau Prof. Dr. Elvira Hinsch, Zentrum für Dermatologie und Andrologie der Justus-

Liebig-Universität Gießen, wurden freundlicher Weise Antikörper, die gegen synthetische

Peptidsequenzen der Zona pellucida gerichtet sind, zur Verfügung gestellt. Es handelt sich

dabei um Sequenzen, die homolog in verschiedenen Säugetieren vorhanden sind (vgl.

HARRIS et al. 1994). Die Antiseren wurden in Kaninchen hergestellt und werden hier als AK

ZPA-20 (gegen Peptidsequenz D-P-N-I-K-L-V-L-D-D-C-W-A-T-S in ZPA) und AK ZPC-5a

(gegen P-I-E-C-R-Y-P-R-Q-G-N-V-S-S in ZPC) bezeichnet.

Die immunologischen Versuche wurden mit auf PVDF-Membranen transferierten Proteinen

von ungereiften und gereiften Zonae pellucidae sowohl nach 1D-PAGE, als auch nach 2D-

PAGE Auftrennung durchgeführt.

Nach Blockierung der Membranen mit TBS/Tween 1% über Nacht bei 4°C wurden die

Membranen eine Stunde mit den Antikörpern (Verdünnungsstufen siehe Tab. 3) inkubiert. In

Folge des dreimaligen Waschens mit TBS/Tween 1% für jeweils 10 min wurden die

Membranen mit dem entsprechenden Zweitantikörper, der HRPO-gekoppelt war, für eine

weitere Stunde inkubiert. Anschließend wurde wieder 3 x 10 min gewaschen.

Zur Markierung des biotinylierten Molekulargewichtsstandards wurde die Membran noch mit

HRPO-Streptavidin behandelt.

Die folgenden Waschprozesse und die Entwicklung per Chemilumineszenz entsprachen der

schon beschriebenen Vorgehensweise (siehe 3.1.).


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Tab. 3: Verwendete Antikörper

Erstantikörper

Verdünnung in

TBS/Tween 1% (v/v)

Zweitantikörper

Verdünnung in

TBS/Tween 1% (v/v)

AK ZPB

1 : 3.000 HRPO-AntiChicken (Dianova, Hamburg)

1 : 10.000

AK ZPC

1 : 10.000

HRPO-AntiChicken (Dianova, Hamburg)

1 : 10.000

AK ZPA-20

1 : 50

HRPO-AntiRabbit (Dianova, Hamburg)

1 : 5.000

AK ZPC-5a

1 : 100

HRPO-AntiRabbit (Dianova, Hamburg)

1 : 5.000

Zum Nachweis der Spezifität wurden auch Versuche mit den entsprechenden Präimmunseren

statt der Antiseren durchgeführt.

3.3. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP

Die lektinologischen Untersuchungen der Glykoproteine der Zona pellucida wurden sowohl

an 1D-PAGE- als auch an 2D-PAGE-Membranen durchgeführt. Dabei wurden zum einem

ungereifte (GV I) und zum anderen in-vitro-gereifte (Metaphase II) Zonae pellucidae

verwendet.

Nach der Blockierung der Membranen in TBS/Tween 1% über Nacht bei 4°C wurden die

Membranen mit biotinylierten Lektine (Vektor über Alexis Deutschland, Grünberg), 5µg/ml

in TBS/Tween 1%, unter leichtem Schwenken für 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur

inkubiert. Dann wurden sie 3 x 10 min lang in TBS/Tween 1% (v/v) kräftig gewaschen, um

die überschüssigen Lektinanteile zu entfernen. Anschließend wurde die Membran mit HRPO-

Streptavidin (Horse radish peroxidase conj. Streptavidin; Dianova, Hamburg), 1:20.000

verdünnt in TBS/Tween 1%, für 30 Minuten inkubiert und 6 x 5 min gewaschen. Dann wurde

die beschriebene Chemilumineszenz durchgeführt.


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Tab. 4: Nomenklatur und Spezifität der verwendeten Lektine (aggl. → agglutinin)

Gruppe

Lektin

Abk.

Spezifität I Gluc/Man

Concanavalin A aggl. Con A α-D-Man; α-D-GlcNAc

Datura stramonium aggl. DSA [Gal-β(1-4)-GlcNAc]N II GlcNAc Ricinus communis aggl. I RCA I Gal-β(1-4)-GlcNAc

Griffonia simplicifolia aggl. I GS I α-D-Gal, α-D-GalNAc

Peanut aggl. PNA Gal-β(1-3)-GalNAc; α/β-Gal

Erythrina cristagalli aggl. ECA α/β-Gal; α/β-GalNAc; Gal-β(1-4)-GlcNAc

III GalNAc/ Gal

Artocarpus integrifolia Aggl. Jacalin Gal-β(1-3)-GalNAc

IV L-Fuc

Anguilla Anguilla aggl. AAA Fuc-α(1-6)-GlcNAc

Maackia amurensis aggl. II MAA II NeuNAc-α(2-3)-Gal

Amaranthus caudatus aggl. ACA NeuNAc-α(2-3/6)-Gal-β(1-3)-GalNAc

V Neuramin- säure Sambucus nigra aggl. SNA NeuNAc-α(2-6)-Gal;

NeuNAc-α(2-6)-GalNAc

Zur Kontrolle der Spezifität der Lektinbindungen wurden in weiteren Versuchen den Lektinen

gemäß einer kompetitiven Hemmung die entsprechenden Zucker während des ersten

Inkubationsschritts mit der Membran zugesetzt.

Tab. 5: Lektine mit den verwendeten Hemmzuckern und ihrer eingesetzten Konzentration

Lektin

Hemmzucker

Konzentration Con A α-Methylmannopyranosid 0,5 M GS I; PNA; Jacalin Galaktose 0,5 M ECA; RCA I; ACA Laktose 0,5 M DSA Chitotriose 0,2 M AAA α-L-Fukose 0,5 M SNA; MAA II Sialyllaktose 0,2 M


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4. Rasterelektronenmikroskopie

Darstellung von Lektinen an Oozyten mittels Silverenhancement in der REM Zur Analyse der räumlichen Verteilung der oberflächlichen Kohlenhydratstrukturen der Zona

pellucida Glykoproteine ist es möglich, intakte Oozyten mit Lektinen zu beladen.

Die ultramorphologische Darstellung der Zona pellucida mit gebundenen Lektinen wurde

mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) ermöglicht, mit der sich Objekte mit großer

Tiefenschärfe (Plastizität) darstellen lassen. Diese Versuche wurden im Zentrum für

Anatomie der Georg-August-Universität Göttingen in Kooperation mit Herrn Dr. P. Schwartz

und Herrn Prof. Dr. H. W. Michelmann (Zentrum für Frauenheilkunde) durchgeführt.

Die Technik entsprach einer modifizierten Methode nach SCHWARTZ et. al. (1996).

Um die gebundenen Lektine in der REM sichtbar machen zu können, verwendete man eine

Silverenhancement-Methode. Die Silverenhancement-Technik beruht darauf, dass eine

Silberlösung kleine Goldpartikel (Durchmesser 10 nm) auf etwa 250 nm „wachsen“ lassen

kann. Diese Partikelgröße lässt sich dann im REM gut auswerten.

Die Eizellen für die REM wurden nach Grobdenudierung mit einer 100 µl Eppendorfpipette

in hyperosmalarer Salzlösung bei 4°C gelagert. Zum Einsatz kamen ungereifte Oozyten, die

wie unter 1.2. beschrieben gewonnen worden waren.

Die in hyperosmolarer Salzlösung gelagerten Oozyten wurden in PBS gewaschen und für

zwei Stunden in 2,25 % Glutaraldehyd/0,1 M Cacodylatpuffer fixiert. Anschließend wurden

sie zweimal für 10 min mit PBS gewaschen und mit biotinylierten Lektinen (Konz. 10µg/ml)

für zwei Stunden inkubiert. Es folgte ein erneuter zweimaliger Waschvorgang mit PBS für je

10 Minuten und eine weitere Inkubation für anderthalb Stunden mit goldgekoppeltem

Streptavidin (Goldpartikelgröße 10nm; Plano W. Plannet GmbH, Wetzlar). Nachdem die

Eizellen mehrmals gewaschen worden waren, wurden sie in einer Silberlösung (LM/EM

Silver Enhancing Kit; Plano W. Planet GmbH, Wetzlar) für 35 Minuten kultiviert. Nach

erneutem Waschen wurden die Eizellen auf Glasplättchen aufgesetzt, in einer Alkoholreihe

dehydriert und in einem Polaron-Trockner (Polaron, Waterford, England) getrocknet. Für die

Analyse mit einem Rasterelektronenmikroskop (DSM 960 Zeiss, Oberkochen) wurden die


58

Präparate auf einem Aluminiumträger befestigt und mit Gold/Pallladium bedampft (Cool

sputter coater SC510; Fisions Instruments, England).

Die folgende REM-Analyse der Verteilung der Partikel wurde per Foto dokumentiert.

Zum Einsatz kamen die Lektine AAA und Con A. Die Spezifität der Bindungen wurden mit

Hemmversuchen in Parallelansätzen mit den entsprechenden Zuckern (AAA → α-L-Fukose;

Con A → α-Methylmannopyranosid) überprüft. Die Oozyten wurden dazu in der jeweiligen

Zuckerlösung (0,2 M) für 30 Minuten vorinkubiert. Der Lektinlösung und dem Waschpuffer

wurden gleichermaßen ebenfalls der Hemmzucker (0,5 M) zugesetzt.

5. Funktioneller Vergleich von ZP ungereifter und in vitro gereifter Oozyten

Zur Untersuchung des funktionellen Einflusses des Reifungsgrades der Zona pellucida wurde

ein Spermien-ZP-Bindungstest entwickelt. Mit diesem Assay konnte die Fähigkeit der ZP, die

Akrosomreaktion zu induzieren, beurteilt werden. Als Spermienpopulationen wurden

ejakuliertes Frischsperma und kryokonserviertes Nebenhodensperma einer Charge verwendet.

5.1. Aufbereitung der Spermien

Frischsperma:

Es wurde die spermienreiche Phase eines Institutsebers gewonnen und Volumen, Aussehen,

Dichte, Motilität, Morphologie, Vitalität und Akrosomstatus bestimmt. Zur Selektion der

motilen Spermien und Entfernung des größten Teils an Seminalplasma wurde ein Swim-up

durchgeführt. Dazu wurden acht Zentrifugenröhrchen (20ml mit rundem Boden; Sarstedt,

Niembrecht) mit 10 ml vorgewärmten Androhep-Puffer (s. Rezeptverzeichnis in J Anhang)

mit je einem ml der spermienreichen Phase unterschichtet und für 45 Minuten bei 37°C in

einem Wasserbad (Typ 1012, Gesellschaft für Labortechnik, Burwedel) inkubiert. Nach dem

Swim-up wurde die motile Spermienfraktion aus dem oberen Drittel der Röhrchen

entnommen und zur Konzentration zentrifugiert (5 min bei 550 xg; Megafuge 2.0 R, Haraeus,


59

Hanau). Das Spermienpellet wurde mit modifizierter Tyrodelösung (s. Rezeptverzeichnis in J

Anhang) aufgeschwemmt. Mittels Zählkammer nach Thoma wurde die Dichte auf 107

Spermien pro ml eingestellt.

Tiefgefriersperma:

Als Tiefgefrier-(TG)-Sperma wurden freundlicher Weise 0,25 ml Pailletten (Minitüb GmbH,

Landshut) mit je 50 Millionen Nebenhodenspermien von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. D. Rath

(Forschungsanstalt für Landwirtschaft, Mariensee) zur Verfügung gestellt. Die in flüssigem

Stickstoff gelagerten Pailletten wurden für 30 sec in einem 37°C warmen Wasserbad

aufgetaut. Zur Entfernung des TG-Verdünners wurde jeweils der Inhalt von zwei Pailletten in

10 ml Androhep-Puffer bei 550 xg für fünf Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in

modifizierter Tyrodelösung resuspendiert und die Dichte ebenfalls auf 107/ml eingestellt.

5.2. Spermatologische Untersuchung

Die Frischsamenproben wurden nach Gewinnung untersucht auf Aussehen, Motilität, Dichte,

Morphologie, Vitalität und Akrosomstatus. Nach der Resuspendierung, Dichteeinstellung und

folgender 15minütigen Äquilibrierung im Brutschrank (Nuaire US Autoflow; Zapf,

Langenhagen) bei 38,5°C und 5% CO2 wurden die Spermien erneut auf Motilität und Vitalität

untersucht und der akrosomale Status bestimmt. Die Untersuchungen des TG-Spermas

erfolgten analog.

Die primären Analysen (alle Punkte bis auf Vitalität und Akrosomstatus) wurden mit einem

Phasenkontrastmikroskop (Zeiss 1697, Jena) durchgeführt. Die verwendeten Deckgläser,

Objektträger und Pasteurpipetten wurden auf einem Heiztisch (Minitüb GmbH, Landshut) bei

38°C vorgewärmt. Ebenso war die Wärmeplatte des Mikroskops angewärmt.

- Makroskopische Beurteilung

Die Ejakulate wurden nach ihrer Farbe (grau bis weiß) und ihrer augenscheinlichen Dichte

(wässrig-molkig, molkig-milchig, und milchig-rahmig) eingestuft.

- Motilitätsbestimmung

Im nativen Ejakulat und in den Inkubationsmedien wurde der Prozentsatz der motilen

Spermien geschätzt. Als motil galten sowohl die vorwärts- als auch die ortsbeweglichen


60

Spermien. Jeweils ein 5 µl Tropfen wurde unter dem Mikroskop bei 160facher Vergrößerung

beurteilt.

- Dichtebestimmung

Die Bestimmung erfolgte mittels einer Zählkammer nach Thoma. In 10 ml 0,9%iger NaCl-

Lösung wurden 25 µl (natives Ejakulat) bzw. 50 µl Spermasuspension verdünnt. Die

Spermien in der Kammer wurden ausgezählt und die Dichte der Ursprungssuspension

errechnet.

- Morphologie

Für die Bestimmung der abweichenden Spermienformen wurden 50 µl Spermiensuspension in

300 µl Formolzitrat-Lösung (37%ige Formaldehydlösung u. 29%ige Natriumzitratlösung im

Verhältnis 1:24) fixiert. Die Beurteilung der morphologischen Abweichungen erfolgte bei

1000facher Vergrößerung (mit Ölimmersion) nach den von KRAUSE (1966) aufgestellten

Kriterien.

-Vitalität

Die Impermeabilität der intakten Zellmembran für den Fluoreszenzfarbstoff Propidiumjodid

(PI) erlaubt eine Unterscheidung der lebenden und toten Spermien. Die Zellen mit

beschädigter Kopfmembran (zu meist tote) stellen sich bei Betrachtung durch einen 560 nm

Filter leuchtend rot dar. Membranintakte Spermien weisen keine Fluoreszenz auf.

Der Farbstoff Propidiumjodid (Sigma Aldrich, Deisenhoffen) wurde vorbereitend in Aqua

bidest. mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml gelöst und in 1 ml Aliquoten bei –18°C in

Dunkelheit gelagert (HARRISON u. WICKERS 1990). Kurz vor Gebrauch wurde die Lösung

aufgetaut und im Dunklen gehalten. Für die PI-Färbung wurde die jeweilige

Spermiensuspension 50:1 mit der aufgetauten Färbelösung versetzt und fünf Minuten bei

Raumtemperatur unter Lichtausschluss inkubiert. Die Auswertung mit einer Zählung von

mindestens 100 Spermien erfolgte unter einem Fluoreszenzmikroskop (Axiovert; Zeiss, Jena)

mit dem entsprechenden Filtereinsatz.

- Bestimmung des akrosomalen Status

Für den Nachweis der Akrosomreaktion wurde das Lektin Peanut agglutinin (PNA), welches

an den Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) gekoppelt war, eingesetzt

(CROSS u. MEIZEL 1989). Im Gegensatz zu den humanen Spermatozoen, bei denen die

Zielstruktur von PNA die äußere akrosomale Membran ist, bindet PNA beim Eber an die


61

Glykoproteine in der akrosomalen Matrix, wenn die äußere Membran permeabel ist. In

diesem Fall leuchtet der akrosomale Inhalt grün-gelb bei der Betrachtung durch einen Filter

mit einem Exzitationsmaximum bei 365 nm.

PNA-FITC (Vektor über Alexis Deutschland, Grünberg) wurde in einer Konzentration von 10

µg/ml in 1 ml Portionen bei –20°C eingefroren und am Versuchstag unter Lichtausschluss

aufgetaut. Zu 9 Teilen Spermiensusspension wurde 1 Teil Lektinlösung gegeben

(Endkonzentration 1 µg/ml). Nach fünfminütiger Inkubation bei Raumtemperatur erfolgte die

Auszählung unter dem Fluoreszenzmikroskop.

Die PI-Anfärbung wurde gleichzeitig mit der PNA-FITC-Anfärbung in der jeweils selben

Suspension durchgeführt.

5.3. Induktion der Akrosomreaktion durch die Zona pellucida

Um die funktionellen Unterschiede der einzelnen Reifungsstadien der Zona pellucida zu

untersuchen, wurde ein Spermatozoon-Zona pellucida-Bindungstest durchgeführt, der den

Verlauf des akrosomalen Zustandes der gebundenen Spermien darzustellen erlaubt.

Die in hyperosmolarer Salzlösung gelagerten Oozyten wurden nach mehrfachem Waschen

durch PBS/PVA 2% Tropfen mit einer dünn ausgezogenen Pipette eröffnet und die Zonae

pellucidae isoliert. Diese wurden dann bis zum Versuchsanfang in PBS/PVA 2% gelagert.

Die folgenden Versuche wurden vergleichend mit Oozyten im GV I und Metaphase II

Stadium durchgeführt.

Die zwei Populationen von Spermien (Frischsperma u. TG-Sperma) wurden wie beschrieben

aufbereitet und untersucht. Nach Einstellung der Dichte auf 107 Mio/ml in modifizieter

Tyrodelösung wurden die Spermien für 15 Minuten im Brutschrank (38,5°C, 5%CO2)

äquilibriert.

Genauso wurde mit den Zonae pellucidae verfahren, nachdem 30 Stück in eine der vier

Abteilungen einer Gewebekulturschale (Greiner GmbH, Frickenhausen) in je 50 µl

modifizierter Tyrodelösung platziert worden waren.

Nun wurden zu den Zonae pellucidae in die entsprechende Abteilung 5 µl der

Spermiensuspension gegeben (ca. 50.000 Spermien) und im Brutschrank koinkubiert. Nach 1


62

Minute wurden alle Zonae pellucidae mehrmals in PBS/PVA 2% gewaschen und 10 Zonae

zur Fixation entnommen. Weitere 10 wurden jeweils für 10 und 20 min ab Beginn weiter

koinkubiert, dann jeweils wieder gewaschen und fixiert. Parallel zu diesen Zeitpunkten

wurden die Spermien, die zur Kontrolle ohne Zona pellucida weiter im Brutschrank inkubiert

wurden, auf Motilität, Vitalität und Akrosomreaktion untersucht.

Die Zona pellucida wurde mit den gebundenen Spermien für 10 Minuten in 2,5 %

Glutardialdehyd fixiert. Nach kurzem Waschen in 0,1 M Glycinlösung wurden die einzelnen

Zonae pellucidae nochmals fünfmal durch PBS/PVA 2% Tropfen gewaschen. Zum Anfärben

der gebundenen Spermien wurden die ZP in 50 µl PBS/PVA 2% mit PI- und PNA-FITC-

Färbelösung entsprechend der Spermienanfärbung gesetzt. Diese wurden dann für fünf

Minuten im Dunklen bei Raumtemperatur inkubiert.

Die PI-Anfärbung dient hier als reine Zählfärbung (vgl. FLESCH et al. 2001), da die äußere

Spermienmembran in jedem Fall durch die Fixierung beschädigt wurde.

Nach Färbung der koinkubierten Zonae pellucidae wurden diese auf Poly-L-Lysin

beschichtete Objektträger gesetzt. Die gebundenen Spermien wurden nun unter einem

Fluoreszenzmikroskop bei 400facher und 1000facher (mit Ölimmersion) Vergrößerung

ausgewertet. Es wurde die Gesamtanzahl der gebundenen Spermien, die PI-positiven

Spermien, die PNA- und PI-positiven Spermien, die Menge der isolierten abgelösten

Akrosome und die der PI positiven Spermien mit abgelöstem Akrosom bestimmt.

Die Dokumentation erfolgte mittels einer angeschlossenen Fotoeinrichtung.

5.4. Statistische Auswertung

Zum Vergleich der ungereiften und der gereiften Zona pellucida in ihrer Wirkung auf die

jeweiligen Spermienpopulationen wurde eine statistische Auswertung vorgenommen.

Mit Hilfe der deskriptiven Statistik wurden jeweils für die Zonae pelucidae mit gleichem

Reifungsstatus, Beobachtungszeitpunkt und Spermienart dieselben Parameter erfasst.

Mit der zur Verfügung stehenden Prozedur MEANS des Statikstik-Paketes SAS® (Statistical

Analysis System Institute Ltd, Version 6.02) wurden Mittelwerte, Standardabweichung,

Minimum und Maximum berechnet.


63

Mit Hilfe der multifaktoriellen Varianzanalyse wurden die Werte der PNA-FITC positiven

Spermien an der ZP im Rahmen der GLM(General Linear Models)-Prozedur in Abhängigkeit

von Reifungsstatus der ZP, Zeitpunkt, Spermienpopulation und der jeweiligen

Wechselwirkungen dieser Faktoren untereinander untersucht.

Das zugrundeliegende Modell wird folgender Maßen beschrieben (GOGOLOK et al. 1992;

SCHUEMER et al. 1992):

Yijkl = µ + αi + βj + γk + αβij + αγik + βγjk + αβγijk + εijkl wobei

Yijk der Messwert der abhängigen Variablen Y für die l-te Beobachtung unter der Stufe j, i bzw. k von dem jeweiligen Einflussfaktor ist,

µ der Gesamtmittelwert ist,

αi, βj, γk die Mittelwerte für die Effekte von Einflussfaktoren A, B und C sind,

αβij, αγik, βγjk, αβγijk die Wechselwirkungseffekte für die jeweilige Stufe von A, B und C sind und

εijkl ein Fehler ist.

Aufgrund der sich bei der dreifaktoriellen Varianzanalyse ergebenen signifikanten Einflüsse

wurde zur Bestimmung einzelner Zusammenhänge die Parameter dieser Analysenform

weiterführend untersucht. Es wurden nach Reifungsstadium der ZP, Spermienpopulation und

Beobachtungszeitpunkt Gruppen gebildet und diese entsprechend dem erläuterten Modell in

einer zwei- bzw. einfaktoriellen Varianzanalyse beschrieben.

Für eine optimierte Darstellung des Zeiteinflusses wurde die Steigung der Geraden ermittelt,

die in einem Zeitdiagramm mit den PNA-FITC positiven Werten entsteht. Für die

Beschreibung der Geraden wurde folgende Formel angewendet:

y = ax + b mit a = Steigung; b = y-Achsenabschnitt;

x = Wert der x-Achse; y= Wert der y-Achse

Die Wahrscheinlichkeitswerte p≤0,001 wurden als statistisch hoch signifikant, die Werte

p≤0,05 als statistisch signifikant und die Werte p≤0,1 als statistisch auffallend betrachtet.

D Ergebnisse________________________________________________________________

64

D Ergebnisse

1. Gewinnung der Oozyten und Isolierung der Zonae pellucidae

Mit der beschriebenen Methode der Massenaufarbeitung zur Isolierung der Zonae pellucidae

(ZP) war es möglich, eine für weiterführende biochemische Analysen benötigte Menge an ZP

Glykoproteinen im mg-Bereich zu gewinnen. Durch die Zerkleinerung mit dem Fleischwolf

wurden sehr viele Follikel auch im Inneren des Ovars aufgebrochen, so dass eine große

Anzahl an Oozyten isoliert werden konnte. Große Anteile des anfallenden Zelldetritus wurden

von der Oozytensuspension bereits durch die Filtrationsschritte separiert, die Percoll-

Dichtezentrifugation sorgte für die weitere Aufreinigung. Die Eizellen sammelten sich in der

10%igen Percoll-Lösungsschicht und der Detritus in den darunterliegenden, höher

konzentrierteren Schichten. Nach der Homogenisierung mit anschließender Filtration erhielt

man eine lichtmikroskopisch saubere Suspension an einzelnen ZP. Aus 300 Ovarien konnten

ca. 150.000 ZP gewonnen werden, dies entspricht 2,25 mg (bei 1 ZP = 15 ng).

Im Gegensatz dazu ließen sich pro Ovar bei der Follikelpunktion um die 20 Eizellen isolieren.

Die Überprüfung des Kernreifestatus ergab, dass sich nach der Isolierung der Oozyten aus den

Ovarien frisch geschlachteter Sauen so gut wie alle Eizellen im GV I Stadium (siehe

Abbildung 4a) befanden. Analog sah es bei der Oozyten der eingefrorenen Ovarien für die

Massenaufarbeitung aus.

Bei der stichprobenartigen Überprüfung des Kernstatus der gereiften Oozyten durch die

Orceinfärbung befanden sich im Durchschnitt 79,5 % im Metaphase II Stadium (siehe

Abbildung 4b) mit Polkörper. Dieser konnte auch im Stereomikroskop ohne Anfärbung

identifiziert werden.

D Ergebnisse

65

a Eizelle im GV I Kernstadium

Der Zellkern und der Nukleolus sind deutlich zu erkennen, das Chromatin ist hufeisenförmig um das Kernkörperchen verdichtet. ( Kernmembran)

b Eizelle im M II Kernstadium

Die Chromosomem sind auf zwei Cluster verteilt und es ist ein Polkörper zu finden. ( Polkörper)

Abb. 4: Orceinanfärbungen von Eizellen zur Beurteilung des Reifungsstadiums

2. SDS-Gelelektrophorese

2.1. 1D-PAGE der Glykoproteine der Zona pellucida

Die eindimensionale Gelelektrophorese der ZP diente vor allem der Überprüfung der Reinheit

der einzelnen ZP Isolierungen. Weiterhin wurden alle späteren Schritte der

zweidimensionalen Gelelektrophorese zunächst in der 1D-PAGE bzw. dem nachfolgenden

Transfer auf PVDF-Membranen mit anschließender Chemilumineszenz ausgetestet.

a

b

D Ergebnisse________________________________________________________________

66

Die für die elektrophoretische Auftrennung erforderliche Solubilisation der Zonae pellucidae

wurde im Lichtmikroskop überprüft. Die kreisförmige Struktur der ZP war dabei nicht mehr

zu erkennen, sehr vereinzelt zeigten sich kleinere Fäden. Die Hitzesolubilisation in Aqua dest.

pH 8,0 bei 72°C ist eine der einfachsten und am häufigsten verwendeten Methoden. Es

besteht u.a. auch die Möglichkeit, die ZP durch 5 mM Phosphorsäure bei pH 2,5 oder mit 5

mM Ammoniumbicarbonat bei pH 8,2 jeweils bei 72 °C zu lösen.

In der Coomassieanfärbung der 1D-PAGE der ZP Glykoproteine unter nicht reduzierenden

Bedingungen zeigten sich zwei Banden. Die obere Bande bei 90 kDa stellt ZPA und die

untere großflächige Bande (Molekulargewichtsbereich 45-60 kDa) das Gemisch von ZPB und

ZPC dar. Diese Breite wird durch den hohen Glykosylierungsgrad hervorgerufen.

Geltasche Nr.: 1 2 3 4 5 6

Abb. 5: 1D-PAGE ungereifter ZP; Coomassie Blue Färbung (Die Geltaschen enthalten folgende Mengen an ZP: Nr. 1 u. 5: ca. 4 µg, Nr. 2 u. 6: ca. 2,7 µg, Nr. 3: ca. 8 µg, Nr. 4: ca. 5,3 µg; es wurde ein 10%iges Trenngel verwendet; weist auf die schwache Bande der 90 kDa Komponente hin, diese wurde hier durch β-Merkaptoethanol reduzierend gespalten)

relatives Molekulargewicht:

97,4 kDa ► (Phosphorylase b)

66,2 kDa ► (Serumalbumin)

45,0 kDa ► (Ovalbumin)

◄ ZPA

◄ ZPB/ ZPC

D Ergebnisse

67

2.2. 2D-PAGE der Glykoproteine der Zona pellicida

Die bisher veröffentlichten zweidimensionalen Gelelektrophoresen der nativen ZP wurden

zumeist unter reduzierenden Bedingungen erstellt. Diese Bedingungen ergeben sich stets

durch die Verwendung von DTT in der Äquilibrierlösung des Gelstrips vor der zweiten

Dimension. Dies hat u.a. zur Folge, dass ZPA durch Aufspaltung von Disulfidbrücken in

mehrere Bereiche separiert wird. So wird die ohnehin schon gegenüber dem ZPB/ZPC-

Bereich geringe Proteinmenge des 90 kDa Anteils noch gestreut, welches Probleme bei der

Detektion mit sich bringen kann. Vor allem wird aber die native Struktur der ZP, die

eigentlich Gegenstand der Untersuchung war, stark verändert. Daher wurden die Versuche

hauptsächlich unter nicht reduzierenden Konditionen durchgeführt und während die

reduzierenden Ansätze nur zum Vergleich dienten.

Die zweidimensionale Elektrophorese wurde mit Zonae pellucidae von ungereiften

(Kernstadium GV I) und in vitro gereiften (Kernstadium M II) Oozyten durchgeführt, um

mögliche Veränderungen des isolelektrischen Verhaltens der ZP Glykoproteine während

dieser Entwicklung darzustellen. Der dem isoelektrischen Punkt entsprechende pH-Wert wird

im folgenden als pI-Wert bezeichnet.

Die 2D-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (mit DTT) der ungereiften ZP wies folgende

Glykoproteinverteilung auf: ZPA war partiell gespalten und nahm die Bereiche pI 4,7-6,4 bei

110-90 kDa und pI 4,6-7,0 bei 90-65 kDa ein. Die große Bande von ZPB/ZPC erstreckte sich

von pI 3,0-7,2 bei 70-50 kDa (s. Abb. 6a).

Bei der 2D-PAGE von Glykoproteinen ungereifter Zona pellucida unter nicht reduzierenden

Bedingungen (ohne DTT) waren nur zwei klar abgrenzbare Spotbereiche zu erkennen. ZPA

erstreckte sich über pI 3,9-6,7 bei 120-95 kDa und ZPB/ZPC über pI 3,0-7,8 bei 60-45 kDa (s.

Abb. 6b). Neben der ungespaltenen Darstellung des Glykoproteins ZPA fiel die Ausdehnung

der ZPB/ZPC Spotbande in den alkalischeren Bereich um 0,8 pI-Einheiten auf. Der Bereich

der 90 kDa Komponente war im Vergleich zu den 90 und 65 kDa Anteilen von ZPA in der

reduzierenden 2D-PAGE jedoch um 0,3 pI-Einheiten in Richtung Anode verschoben.

Es bleibt zu erwähnen, dass keine Unterschiede in den angesprochenen 2D-PAGE-Analysen

zwischen ZP Proteinen aus frischen punktierten Ovarien und ZP Proteinen aus aufgetauten

und per Fleischwolf zerkleinerten Ovarien zu beobachten waren.

D Ergebnisse________________________________________________________________

68

pI 3 4 5 6 7 8 pI 3 4 5 6 7 8 b 2D-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen

ZPA ist nicht gespalten. Abb. 6: 2D-PAGE der Glykoproteine ungereifter ZP, Silberfärbung (jeweils 6,0 µg ZP und 10%iges Trenngel)

Bei der 2D-PAGE mit ZP gereifter Oozyten (Kernstadium M II) wurde nur einzelnd isolierte

ZP verwendet. Alle Versuche wurden ohne Reduktionsmittel durchgeführt, da die

Materialmenge limitiert war. Die Spotbanden von ZPA erstreckten sich von pI 4,3-5,9 bei ca.

115-90 kDa und der Bereich von ZPB/ZPC von pI 3,0-6,5 bei ca. 60-50 kDa. Im Vergleich

zur entsprechenden Auftrennung der ungereiften ZP zeigte die 2D-PAGE der gereiften ZP in

der Silberfärbung für ZPA eine Verschiebung von 0,8 pI-Einheiten und für ZPB/ZPC von 1,3

pI-Einheiten in Richtung Anode und somit eine Zunahme der Acidität.

ZPA

ZPA

ZPB/ZPC

ZPB/ZPC

97,4

66,2

45,0

31,0

97,4

66,2

45,0

31,0

a 2D-PAGE unter reduzierenden Bedingungen

ZPA ist gespalten.

kDa

kDa

a

b

D Ergebnisse

69

Für das eingesetzte Fokussierungssystem (Multiphor II; Amersham Pharmacia Biotech,

Uppsala, Schweden) standen leider keine immobilisierten pH-Gradienten-Gele mit einem

niedrigeren pH-Wert als 3,0 zur Verfügung. Für eine genauere Analyse des sauren Bereichs

von ZPB/ZPC wäre dies sinnvoll gewesen.

3. Immunologische Charakterisierung der ZP Proteine

Zur eindeutigen Identifizierung der ZP Glykoproteine wurden diese nach der

elektrophoretischen Auftrennung auf PVDF-Membranen transferiert. Im Western Blot mit

definierten Antikörpern gegen die einzelnen drei Proteine der ZP sollten diese näher

analysiert werden. Es kamen dabei sowohl polyklonale Antikörper als auch monospezifische

Peptidantikörper zum Einsatz. Die Unterscheidung der Bereiche von ZPA und ZPB/ZPC war

bereits in der Gelanfärbung offensichtlich. Die große Bande von ZPB/ZPC sollte jedoch auch

ihren einzelnen Bestandteilen zu geordnet werden können. Die Markierungen der Antikörper

wurden durch ein Chemilumineszenzverfahren entwickelt. Die Kontrolle der Spezifität wurde

durch den Einsatz von entsprechenden Präimmunseren überprüft.

Bei durch 1D-PAGE aufgetrennten Glykoproteinen der ZP konnte die 90 kDa Bande mit dem

AK ZPA-20 als ZPA identifiziert werden. Die anderen drei verwendeten Antikörper (AK

ZPB; AK ZPC; AK ZPC-5a) zeigten alle die gleiche Markierung über die gesamte 45-60 kDa

Bande. Eine Unterscheidung von ZPB und ZPC war nicht möglich, sowohl bei ungereiften als

auch bei gereiften Zonae pellucidae.

AK ZPA-20 markierte bei den Membranen mit Proteine nach 2D-PAGE Auftrennung das

ZPA zugeordnete Bandenmuster analog der entsprechenden Silberfärbung oberhalb des

breiten dominanten Bereichs von ZPB/ZPC. Dies galt sowohl für den Ansatz unter

reduzierenden Bedingungen als auch für den unter nicht reduzierenden Konditionen.

Die Unterscheidung von ZPB und ZPC innerhalb der zweidimensional aufgetrennten ZP

Proteine war wie bei der 1D-PAGE Auftrennung ebenfalls nicht eindeutig möglich, da sich

die Areale zum größten Teil überlappten (vgl. Abb. 7). Allerdings erhielt man schon zwei

D Ergebnisse________________________________________________________________

70

97,4

66,2

45,0

kDa

unterschiedliche Signalmuster, so dass eine Tendenz beschrieben werden kann. Diese galt für

alle drei untersuchten ZP Gruppen, die ungereifte nicht reduzierte ZP, die ungereifte

reduzierte ZP und die gereifte nicht reduzierte ZP. AK ZPC und AK ZPC-5a markierten

vornehmlich verstärkt im sauren pI-Bereich und AK ZPB gleichmäßig über die gesamte

Breite der Proteinbande um die 55 kDa. Die Signale von AK ZPC/AK ZPC-5a endeten

auslaufend ca. 1,0-1,5 pI Einheiten vor dem Ende der Proteinsspots auf Seiten der Kathode

verglichen mit der jeweiligen Silberfärbung.

Allgemein ist zu sagen, dass die reale Verteilung der einzelnen Proteinanteile wahrscheinlich

etwas weiter in den basischen pI-Bereich hineinreichten. Dort wird die Proteinkonzentration

im Vergleich zum sauren Abschnitt wesentlich geringer, so dass eine sichtbare Detektion auch

nicht mehr durch verlängerte Belichtungszeiten erfolgen konnte. Der durch den AK ZPB

markierte Bereich endete bis zu 0,5 pI-Einheiten vor dem basischen Ende der entsprechenden

Silberfärbung.

Die Chemilumineszenz mit den Präimmunseren statt der Antiseren wies keine Signale auf.

Die beschriebenen Spotbanden sind folglich als spezifisch anzusehen.

AK ZPB AK ZPC

pI 3 4 5 6 7 8 pI 3 4 5 6 7 8

Abb. 7: Chemilumineszenz ungereifter nicht reduzierter ZP mit Antikörpern (bei AK ZPB war Belichtungszeit verlängert, daher Standard intensiver und noch schwache Signale zu erkennen, bei AK ZPC ergaben längere Belichtungszeiten keine weiteren Signale)

kDa

66,2

97,4

45,0

D Ergebnisse

71

4. Lektinologische Analyse der Kohlenhydratstrukturen der ZP

Alternativ zur immunologischen Charakterisierung wurden die durch die Elektrophorese

aufgetrennten ZP Proteine mit Lektinen untersucht. Mittels Lektinen konnten definierte

Kohlenhydratstrukturen der ZP näher analysiert werden. Zur Detektion kam ein

Biotin/Streptavidin-System zum Einsatz und die Visualisierung erfolgte wiederum durch das

Verfahren der Chemilumineszenz.

Alle Lektine wurden zunächst an Membranen mit Proteinen ungereifter ZP nach

eindimensionaler elektrophoretischer Auftrennung (1D-Membranen) getestet. Nach einem

positivem Signal in der Chemilumineszenz wurden die jeweiligen Lektine auch in der

Analyse von zweidimensional elektrophoretisch separierten Proteinen (2D-Membranen)

eingesetzt.

Die Spezifität der Lektinbindung wurde durch den Zusatz von Zuckern überprüft. Gemäß

einer kompetitiven Hemmung wurden in Parallelansätzen während des Inkubationsschritts der

Lektinlösung der jeweilige Bindungshemmzucker (Lektine mit Hemmzuckern siehe Tabelle 5

unter 3.2. in C Material und Methoden) zugesetzt. Wurden die Zucker in einer Konzentration

von 0,2 M bei einer Lektinkonzentration von 5 µg/ml verwendet, so konnte eine deutliche

Signalreduktion erzielt werden. Beim Einsatz einer 0,5 M Zuckerlösung wurde in der

Chemilumineszenz keine Markierung der ZP Proteine durch die Lektine mehr nachgewiesen.

Die eingesetzten biotinylierten Standardproteine diente neben der Bestimmung des relativen

Molekulargewichtes der ZP Glykoproteine zur Kontrolle eines korrekten

Entwicklungssystems.

In Tabelle 6 sind die eingesetzten Lektine und die von ihnen markierten Bereiche der ZP

Glykoproteine von ungereiften Eizellen auf dem Röntgenfilm dargestellt. Die ZP Erkennung

wurde unterteilt nach Markierungen im Bereich des höher molekularen ZPA und des

großflächigeren ZPB/ZPC Gebietes. Die Versuche mit 2D-PAGE Auftrennung der ZP

wurden sowohl unter reduzierenden Bedingungen als auch unter nicht reduzierenden

Bedingungen durchgeführt. Für den jeweiligen Versuchsansatz ergaben sich keine

Unterschiede; es wurden in beiden Fällen die gleichen Muster analog der Silberfärbung

D Ergebnisse________________________________________________________________

72

erkannt. Entsprechend verhielten sich auch die Signale der 1D-Membranen. In der

Besprechung der einzelne Muster wurde sich daher auf die der 2D-Membranen konzentriert.

Tab. 6: Ergebnisse der Chemilumineszenz zur Analyse der ungereiften ZP auf 1D- und 2D-Membranen mit Lektinen (— = kein Signal; + = geringes Signal; + + = mittleres Signal; + + + = starkes Signal)

Signal im ZP Bereich

Gruppe

Lektin

Spezifität ZPA ZPB/ZPC

I Gluc/Man Con A α-D-Man; α-D-GlcNAc + + + (+)

DSA [Gal-β(1-4)-GlcNAc]N + + + + + + II

GlcNAc RCA I Gal-β(1-4)-GlcNAc + + + + +

GS I α-D-Gal, α-D-GalNAc — —

PNA Gal-β(1-3)-GalNAc; α/β-Gal — —

ECA α/β-Gal; α/β-GalNAc; Gal-β(1-4)-GlcNAc

+ + +

+ + +

III

GalNAc/ Gal

Jacalin Gal-β(1-3)-GalNAc + + + + +

IV L-Fuc AAA Fuc-α(1-6)-GlcNAc + + + + + +

MAA II NeuNAc-α(2-3)-Gal + + + +

ACA NeuNAc-α(2-3/6)-Gal-β(1-3)-GalNAc + + + +

V Neuramin- säure SNA NeuNAc-α(2-6)-Gal;

NeuNAc-α(2-6)-GalNAc

+

+

Die Beurteilung der angegebenen Signalstärke erfolgte durch einen Vergleich der

Schwärzungen auf den Röntgenfilmen innerhalb der Versuche in Intensität und

Flächenausmaß.

D Ergebnisse

73

Die Lektinbindungsmuster auf den erstellten Röntgenfilmen waren grob in vier Typen zu

unterteilen (vgl. Abb. 8):

Typ I (ohne Signal)

Die Lektine GS I und PNA zeigten weder auf 1D-Membranen noch auf 2D-Membranen ein

Signal. Sie binden beide spezifisch an terminale Galaktose, die folglich durch diese nicht

nachgewiesen werden konnte.

Typ II (Signal nur im ZPA Bereich)

Dieses Muster war nur bei Con A zu finden, welches vornehmliche α-D-Mannose erkennt und

schwächer an α-D-GlcNAc bindet. Bei allen beschriebenen Versuchsanordnungen, 1D- oder

2D-Membran, reduzierend oder nicht reduzierend, wurde von diesem Lektin nur der jeweilige

ZPA Bereich erkannt, und zwar deutlich. Minimale Signale waren jedoch beim Lektinblot der

nicht reduzierten 2D-Membran auch im ZPB/ZPC Bereich zu sehen (s. Abb. 8a+b).

Typ III (mittlere Signale bei ZPA und ZPB/ZPC)

Zu diesem Typ wurden die Lektine SNA, ACA und MAA II gezählt. Sie gehören alle zur

Gruppe der Lektine , die Sialsäure in bestimmten Verknüpfungen erkennen. SNA und MAA II

markieren diese Strukturen in N-Glykanen und ACA komplexe sialsäurehaltige Bereiche in O-

Glykanen.

Bei SNA war auffällig, dass gerade zum sauren Bereich hin die Signale in beiden

Proteinbereichen der ZP immer schwächer werden (s. Abb. 8d), obwohl die

Glykoproteinkonzentration zur Anode größer wird. Dort haben die Lektine mit dem

Signalmuster vom Typ IV und ACA ihre stärkste Markierung.

MAA II rief im Vergleich zum SNA stärkere Markierungen hervor. Sie umfassten beide

Proteinbereiche, wiesen aber ähnlich dem SNA gerade am basischen Ende beider Spotbanden

(ZPA und ZPB/ZPC) den intensivsten Signalbereich auf. Dies wurde bei reduzierten 2D-

Membranen (s. Abb. 8c) mit aufgespaltenem ZPA und nicht reduzierten 2D-Membranen mit

einheitlichem ZPA Bereich deutlich.

ACA markierte zwar beide Spotbanden komplett (s. Abb. 8e), jedoch insgesamt schwächer als

die Lektine mit Typ IV, so dass längere Belichtungszeiten (ca. 2-4fache) von Nöten waren.

D Ergebnisse________________________________________________________________

74

Abb. 8: Chemilumineszenz von 2D-Membranen mit ungereifter ZP und Lektinen (Banden der Molekulargewichtsstandardproteine auf den jeweils linken Seiten von oben nach unten: 97,4 kDa, 66,2 kDa und 45,0 kDa; red. = reduziert; Signalm. = Signalmuster) a : Con A; red. ZP; Signalm. Typ II b : Con A; nicht red. ZP; Signalm. Typ II c : MAA II; red. ZP; Signalm. Typ III d : SNA; nicht red. ZP; Signalm. Typ III e . ACA; nicht red. ZP; Signalm. Typ III f : AAA; nicht red. ZP; Signalm. Typ IV

a b

c d

e f

pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7

pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7

pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7

D Ergebnisse

75

Typ IV (starke Signale bei ZPA und ZPB/ZPC)

AAA, DSA, ECA, RCA I und Jacalin bewirkten sehr ähnliche starke Signale in beiden

Spotbanden. Die Markierungen waren gleichmäßig stark über die Breiten der jeweiligen

Banden verteilt (vgl. Abb. 8f). Im sauren Bereich waren die Signale dichter entsprechend der

Proteinverteilung in der Silberfärbung. AAA, spezifisch für Fuc-α(1-6)-GlcNAc, war das

Lektin mit den stärksten Signalen.

In der Silberfärbung der 2D-PAGE war ein auffälliger Shift der pI-Bereiche zur Anode im

Vergleich zwischen ungereifter und gereifter ZP zu beobachten. Es finden folglich

Veränderungen an der ZP während der In-vitro-Reifung auf biochemischer Ebene statt. Daher

wurde auch die ZP von gereiften Oozyten mittels Lektinen untersucht. Es wurden nur einige

der bei den ungereiften ZP eingesetzten Lektine verwendet, da die Materialbeschaffung mit

einem großem Aufwand verbunden war. Die Oozyten mussten gereift werden und zur

Vermeidung von unnötigen Materialverlusten wurde jede ZP einzeln isoliert und auf den

Einsatz von Siebtechniken verzichtet. Die einzelnen Lektine untereinander wiesen auch in

ihren Detektionsmustern auf den Röntgenfilmen meistens eine sehr ähnliche Verteilung auf.

Es wurde fast immer der gesamte Proteinbereich der entsprechenden Coomassie Blue-(1D)

oder Silberfärbung (2D) markiert.

Bei der Analyse der gereiften ZP der Eizellen im M II Stadium wurden also vornehmlich

Lektine mit unterschiedlichen Mustern eingesetzt. Die 2D-PAGE wurden mit den gereiften

Eizellen für die Chemilumineszenz nur unter nicht reduzierenden Konditionen durchgeführt.

So wird die Aufspaltung der Disulfidbrücken des ZPA umgangen und die Proteinmenge des

ZPA auf einen kleineren Bereich konzentriert. Daher konnte auch trotz geringer

Glykoproteinmengen (120 ZP ~ 1,8 µg pro Membran) der Zuckeranteil des ZPA mittels

beschriebener lektinologische Analyse dargestellt werden. Als Ausnahme wurde nur für die

Untersuchung mit Con A auch ein 2D-Ansatzt mit DTT (reduzierend) durchgeführt, da die

selektive Erkennung von Kohlenhydratstrukturen im ZPA Bereich durch das Con A eine

Untersuchung unter Aufspaltung der 90 kDa Komponente von ZPA interessant machte.

Die Ergebnisse der lektinologischen Untersuchungen der gereiften ZP sind in Tabelle 7

zusammengefasst.

D Ergebnisse________________________________________________________________

76

Tab. 7: Ergebnisse der Chemilumineszenz zur Analyse der gereiften ZP mittels Lektinen (— = kein Signal; + = geringes Signal; + + = mittleres Signal; + + + = starkes Signal; 2D red. = Auftrennung der ZP Proteine vor Transfer aus Membran durch 2D-PAGE unter reduzierenden Bedingungen; ohne Angabe = nicht reduzierende Bedingungen)

Signal im Bereich der ZP

Gruppe

Lektin

Spezifität

Art der PAGE ZPA ZPB/ZPC

1D + + + —

2D + + + —

I

Gluc/Man

Con A α-D-Man; α-D-GlcNAc

2D red. + + —

1D + + + + + + DSA [Gal-β(1-4)-GlcNAc]N

2D + + + + + +

II

GlcNAc

RCA I Gal-β(1-4)-GlcNAc 2D + + + + +

III

GalNAc/Gal

ECA α/β-Gal; α/β-GalNAc;

Gal-β(1-4)-GlcNAc

2D

+ + +

+ + +

IV L-Fuc AAA Fuc-α(1-6)-GlcNAc 2D + + + + + +

1D + + + V Neuramin-säure

SNA NeuNAc-α(2-6)-Gal;

NeuNAc-α(2-6)-GalNAc 2D + + +

Die bei gereiften ZP eingesetzten Lektine führten jeweils zu den gleichen Signalmustern wie

diese bei ungereiften ZP. Bei Con A war dies folglich Typ II, bei SNA Typ III und bei AAA,

ECA, RCA-I und DSA Typ IV (vgl. Abb. 9). Allerdings verliefen die Markierungen der

Spotbanden entsprechend der Silberfärbung der gereiften ZP nicht so weit in den basischen

pI-Bereich wie die bei den 2D-Membranen der ungereiften Eizellen. Über dies hinaus war der

pI-Shift, wenn man nur die lektinologische Untersuchung betrachtet, noch größer als der in

der Silberfärbung. Dort betrug der Unterschied etwas über eine pI-Einheit und bei der

Analyse mit Lektinen ca. 2 pI-Einheiten (z.B. AAA: vgl. Abb. 8f mit Abb. 9a2). Diese

Vergrößerung der Differenz beruht darauf, dass bei den 2D-Membranen mit ZP von M II

Oozyten selbst die Lektine mit Signalmuster Typ IV nicht mehr den kompletten Bereich von

ZPB/ZPC bis zum basischen Ende entsprechend der Silberfärbung sichtbar markierten, auch

nicht bei erhöhten Konzentrationen und verlängerten Belichtungszeiten.

D Ergebnisse

77

Abb. 9: Chemilumineszenz von 1D- und 2D-Membranen mit gereifter ZP und Lektinen (alle PAGE unter nicht reduzierenden Konditionen; die Banden der Molekulargewichts-standardproteine auf der jeweiligen linken Seite der Bilder entsprechen von oben nach unten einem relativen Molekulargewicht von 97,4 kDa, 66,2 kDa und 45,0 kDa) a1 u. a2: ein und dieselbe 2D-Membran mit 120 ZP,

erst mit Con A (a1), Signalmuster Typ II, und nach „Strippen“ mit AAA (a2), Signalmuster Typ IV, inkubiert

b1, b2 u. b3: b1 = Standardproteine; b2 u. b3 ein und dieselbe Proteinspur auf derselben 1D-Membran mit 30 ZP, erst mit Con A (b2), Signalmuster Typ II, und nach „Strippen“ mit AAA (b3), Signalmuster Typ IV, inkubiert

c: 2D-Membran (265 ZP) mit DSA, Signalmuster Typ IV

a1 a2

c b3 b2 b1

pI 3 4 5 6 7 pI 3 4 5 6 7

pI 3 4 5 6 7

D Ergebnisse________________________________________________________________

78

5. Rasterelektronenmikroskopische Studien

In der Rasterelektronenmikroskopie (REM) sollte die räumliche Verteilung der Lektine und

somit der entsprechenden Kohlenhydratstrukturen über die Oberfläche der intakten ZP an

ganzen Eizellen dargestellt werden. Die fixierten Eizellen wurden dazu mit biotinylierten

Lektinen inkubiert, an die anschließend goldgekoppeltes Streptavidin band. Danach folgte

eine Behandlung in einer Silberlösung, welche die Goldpartikel von 10 nm auf ca. 250 nm

wachsen ließ. Abschließend wurden die Präparate für die REM-Analyse dehydriert und

getrocknet.

Es kamen die Lektine AAA und Con A an ungereiften Eizellen zum Einsatz. Das

fukosebindende AAA wurde als Übersichtsmarkierung gewählt, da es bei der lektinologischen

Untersuchung im Western Blot die stärksten und großflächigsten Signale aufwies. Die

Untersuchungen mit Con A sind insoweit besonders interessant, da dieses mannosebindende

Lektin im Lektinblot im Vergleich zu den anderen verwendeten ein ganz spezielles

Bindungsmuster besaß. Als einziges rief es nur Signale im ZPA Bereich hervor und der große

ZPB/ZPC Bereich blieb ohne Markierung. So kann man unter Umständen durch diese

Versuchsanordnung neben der Kohlenhydratverteilung auch Rückschlüsse über die

Zuordnung der einzelnen Proteine zu einander gewinnen.

In den REM Aufnahmen war die typische Struktur der ZP zu erkennen. An der Oberfläche

war eine netzgitterartige Struktur mit Löchern von ca. 3-5 µm Durchmesser zu sehen. In deren

Tiefe befanden sich kleine Poren, welche von Ebene zu Ebene nach innen immer kleiner

wurden (vgl. Abb. 10 b u. d).

Auf den Bildern mit AAA war die ZP mit Partikeln voll beladen (Abb. 10 a). Die dichte

Lagerung war sowohl an der Oberfläche als auch in der Tiefe der Löcher und Poren

vorhanden, deren Größe noch sterisch eine Partikelanheftung erlaubte. Die Spezifität dieser

Bindungen wurde durch die komplette Hemmung mit 0,5 M α-L-Fukoselösung untermauert.

Bei den Versuchen mit Con A waren insgesamt viel weniger Partikel auf der ZP zu sehen

(Abb. 10 c). Sie waren eher isoliert und nicht dicht an dicht gepackt. Auffällig war, dass sie

zumeist nur an den oberflächlichen Gitterstrukturen und nur vereinzelt in sehr großen Poren

D Ergebnisse

79

zu finden waren. Mit einer 0,5 M α-Methylmannopyranosidlösung wurde zwar keine

komplette Hemmung der Con A-Bindung erreicht, aber eine sehr deutliche Reduktion.

Die Ergebnisse der REM-Analyse zeigten, dass die Kohlenhydratstrukturen der ZP an der

Außenseite viel Fukose und weniger Mannose enthalten. Diese Verteilung entsprach den

Mengenverhältnissen im Lektinblot.

Abb. 10: REM-Analyse ungereifter Eizellen mit AAA, Con A und jeweiliger Hemmung (5000fache Vergrößerung) a : AAA; b : AAA/0,5 α-L-Fukose; c : Con A; d : Con A/0,5 M α-Methylmannopyranosid

c d c

a b

D Ergebnisse________________________________________________________________

80

6. Die Fähigkeit der ZP zur Induktion der Akrosomreaktion in Abhängigkeit vom Reifungsstatus der Oozyte Nach den vorangegangenen Untersuchungen sollte nun der Einfluss der beobachteten

Veränderungen der Zona pellucida während der In-vitro-Reifung in funktioneller Hinsicht

untersucht werden. Eine Aufgabe der ZP unter physiologischen In-vivo-Bedingungen ist es,

die Akrosomreaktion des gebundenen (first binding) Spermiums zu induzieren. Daher wurde

diese Funktion unter In-vitro-Bedingungen vergleichend zwischen isolierter ZP von Oozyten

im GV I und M II Stadium untersucht. Dazu wurden ejakulierte Frischspermien bzw.

kryokonservierte epididymale Spermien (TG-Sperma) nach 15minütiger Vorkapazitation mit

den ZP für eine Minute koinkubiert und dann der ungebundene Anteil entfernt. Die

Auswertung der Anzahl der gebundenen Spermien erfolgte nach einer, zehn und zwanzig

Minuten. In Akrosomreaktion befindliche Spermien stellten sich als PNA-FITC-positiv dar (s.

Abb. 11). Schon der optische Vergleich der Bilder innerhalb eines Reifungsstadiums zu den

verschiedenen Beobachtungszeitpunkten lässt eine Zunahme der sich in Akrosomreaktion

befindlichen Spermatozoen erkennen (s. Abb. 12).

Abb. 11: Spermienanfärbung mit PI und PNA-FITC 1.: isoliertes Spermium der Suspension, in Akrosomreaktion befindlich 2.: Spermien an der ZP, fixiert und somit permeabilisiert für PI auch wenn Akrosom intakt ( ) a : Fluoreszenzlicht; b: Hellfeld; a u. b : 1000fache Vergrößerung, Ölimmersion

1.b

2.b

1.a

2.a

D Ergebnisse

81

Abb. 12: Spermien, gebunden an ZP, in Propidiumjodid (PI) und PNA-FITC Anfärbung

Die Bilder wurden von ZP ungereifter Oozyten mit ejakulierten Frischspermien angefertigt, aufgrund der Fixation sind die Membranen aller Spermien durchlässig für PI. a : Beobachtungszeitpunkt 1min

b : Beobachtungszeitpunkt 10 min

c : Beobachtungszeitpunkt 20 min

a b

c

D Ergebnisse________________________________________________________________

82

Die deskriptive Statistik der erhobenen Parameter, sowohl an der ZP als auch bei den

Spermien in der Kontrollsuspension ohne ZP, sind unter 2. in J Anhang tabellarisch

aufgelistet. Die Werte des untersuchten nativen Frischspermas und der Kontrollsuspension

von Frisch- und TG-Sperma befanden sich in physiologischer Norm, so dass die beurteilten

Spermienfraktionen zum Versuchseinsatz kommen konnten. Der erhöhte Anteil der

Plasmatropfen (ca. 25 %) bei den epididymalen TG-Spermien ist auf die noch nicht

abgeschlossene Abschnürung dieses Tropfens im Nebenhoden zurückzuführen (vgl. 2.1.

Aufbau u. Entwicklung des Spermiums unter B Literaturübersicht).

Die folgende Analyse bezieht sich vornehmlich auf die erhobenen Werte für den Anteil der

PNA-FITC positiven Spermien als Maß der Akrosomreaktion. Die Auswertung der

beschreibenden Statistik dieses Beobachtungsparameters sind in Tabelle 8 aufgeführt.

Tab. 8: Deskriptive Statistik der PNA-FITC positiven an ZP gebundenen Spermien a. ejakulierte Frischspermien

Kernstatus der Oozyte

Zeitpunkt

(min)

Anzahl der ZP

Mittelwert

(%)

Standard- abw. (%)

Minimum

(%)

Maximum

(%) 1

27

22,6

7,69

10,9

42,1

10

28

34,2

12,2

11,1

54,5

GV I

20

26

46,5

16,0

25,5

100 1

19

20,2

6,40

5,00

34,0

10

22

42,2

15,1

20,0

83,3

M II

20

20

42,3

9,17

24,7

58,3

D Ergebnisse

83

b. epididymale TG-Spermien

Kernstatus der Oozyte

Zeitpunkt

(min)

Anzahl der ZP

Mittelwert

(%)

Standard- abw. (%)

Minimum

(%)

Maximum

(%) 1

25

36,2

11,8

20,0

66,7

10

25

36,7

10,5

15,3

70,0

GV I

20

23

38,4

13,1

6,67

69,2 1

18

36,6

20,1

13,0

64,6

10

18

45,1

10,5

22,2

62,5

M II

20

20

47,7

11,1

28,9

66,7

Die Ausgangswerte der PNA-FITC positiven Spermien beim Zeitpunkt von 1 min bewegten

sich sowohl bei ungereifter und gereifter ZP innerhalb derselben Spermienpopulationen

jeweils im gleichen Wertebereich. Der höhere Ausgangswert der aufgetauten Spermien war

u.a. durch die aufgrund der Ein- und Auftauprozesse hervorgerufene geringere Stabilität der

Spermatozoenmembran zu begründen.

Bei den Versuchen mit Frischsperma fällt auf, dass sich die Mittelwerte des Anteils der

akrosomreagierenden Spermien 20 min nach Versuchsbeginn bei den ZP unterschiedlichen

Reifungsgrades wieder in etwa angleichen. Auffällig ist die Entwicklung dazwischen zum

Beobachtungszeitpunkt von 10 min. Der Anteil der akrosomreagierenden Spermien bei der

ZP ungereifter Eizellen verläuft über die gesamte beobachtete Zeitspanne von 20 min

annähernd linear. Bei den gereiften Eizellen hingegen wird schon nach 10 min so gut wie der

Endwert bei 20 min erreicht.

Betrachtet man die Auswertung für die Versuche mit den aufgetauten Nebenhodenspermien,

so ist diese schnellere Zunahme des Anteils der PNA-FITC positiven Spermatozoen bei der

ZP in M II im Vergleich zur ZP im GV I zur Zeit von 10 min noch rasanter. Bemerkenswert

ist die geringe Induktion der Akrosomreaktion durch die ungereifte ZP. Der Endwert bei 20

min ist sowohl im Vergleich zu dem bei der GV I-ZP mit Frischsperma als auch bei der M II-

ZP mit ebenfalls aufgetautem Sperma deutlich niedriger (ca. 9 Prozentpunkte).

D Ergebnisse________________________________________________________________

84

a. Verwendung von ejakuliertem Frischsperma

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 10 20

Zeitpunkt (min)

Ant

eil d

er P

NA

-FIT

C p

os. S

perm

ien

(%)

GV I

M II

b. Verwendung von kryokonserviertem Nebenhodensperma

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

1 10 20

Zeitpunkt (min)

Ant

eil d

er P

NA

-FIT

C p

os. S

perm

ien

(%)

GV I

M II

Abb. 13: Darstellung des Anteils der in Akrosomreaktion befindlichen Spermien, die an die ZP gebunden sind, in Abhängigkeit vom Beobachtungszeitpunkt

Zur Untersuchung der Einwirkungen der einzelnen Parameter zum Anteil der

akrosomreagierenden Spermien wurde eine multifaktorielle Varianzanalyse durchgeführt. Es

wurde zwischen drei-, zwei- und einfaktorieller Analyse unterschieden.

Alle erhobenen Wahrscheinlichkeitswerte (p, für die gilt: p≤0,001 = statistisch hoch

signifikant; p≤0,05 = statistisch signifikant; p≤0,1 = statistisch auffallend) und das

Bestimmheitsmaß (R2) sind unter 2. in J Anhang aufgeführt.

D Ergebnisse

85

Dreifaktorielle Varinazanalyse:

Die verwendeten Spermienpopulationen, der Reifungsstatus der ZP und der Zeitpunkt hatten

einen statistisch signifikanten Einfluss auf den Anteil der PNA-FITC positiven Spermien. Das

gleiche galt für die Wechselwirkungen der Parameter Reifungsstatus mit Zeitpunkt und

Spermienpopulation mit Zeitpunkt. Die Kombination von Spermienpopulation und

Reifungszustand der ZP und die Dreifachwechselwirkung von Spermienpopulation,

Reifungszustand und Zeitpunkt hatten jedoch keinen statistisch signifikanten Einfluss.

Zweifaktorielle Varianzanalyse:

Hierbei wurden die Versuche aufgrund der nachgewiesenen Einflüsse und Wechselwirkungen

in der dreifaktoriellen Analyse nach Spermienpopulation getrennt ausgewertet.

Innerhalb der Gruppe mit den ejakulierten Frischspermien stieg der Anteil der

akrosomreagierenden Spermien mit der Zeit statistisch hoch signifikant an und die

Wechselwirkung von Reifungsstatus der ZP mit dem Beobachtugnszeitpunkt war statistisch

signifikant. Der Anteil der PNA-FITC positiven Spermien bei der ZP von GV I Eizellen

unterschied sich nicht statistisch signifikant von dem bei der ZP von M II Eizellen.

Bei der Gruppe, in der TG-Sperma eingesetzt wurde, hingegen hatte der Reifungsstatus der

eingesetzten ZP einen statistisch signifikanten Einfluss auf die Induktion der

Akrosomreaktion. Der Zeiteinfluss wurde als statistisch auffallend eingestuft und die

Wechselwirkungen zwischen Reifungsstatus und Zeit spielten hier keine statistisch

signifikante Rolle.

Ebenfalls mit der zweifaktoriellen Varianzanalyse wurden Gruppen untersucht, die nach dem

Reifungsstatus der ZP eingeteilt worden waren.

Die Werte der PNA-FITC positiven Spermatozoen unterschieden sich bei der ungereiften ZP

statistisch nicht signifikant nach der verwendeten Spermienart. Einen statistisch hoch

signifikanten Einfluss wiesen aber sowohl der Beobachtungszeitpunkt als auch die

Wechselwirkungen von diesem mit der Spermienpopulation auf.

Innerhalb der Gruppe der gereiften ZP von Oozyten im M II Stadium erhöhte die Nutzung

von TG-Sperma den Anteil der akrosomreagierenden Spermien statistisch hoch signifikant.

Gleiches galt für den zeitlichen Verlauf. Den Wechselwirkungen von Spermienpopulation und

Zeitpunkt kam eine statistisch auffällige Rolle zu (0,05<p≤0,1).

D Ergebnisse________________________________________________________________

86

Einfaktorielle Varianzanalyse:

Aufgrund der sich ergebenen Abhängigkeiten und Wechselwirkungen der drei- und

zweifaktoriellen Varianzanalyse wurden noch diverse einfaktorielle Analysen erstellt. So

konnten die Zusammenhänge einzelner Parameter genau beschrieben werden. Für die Bildung

einer Untersuchungsgruppe wurden zwei Variablen fest geschrieben und der Einfluss einer

dritten innerhalb dieser Gruppe auf die Induktion der Akrosomreaktion untersucht.

Bei der Verwendung von Frischsperma hatte der Reifungsstatus nur zum Zeitpunkt von 10

min einen statistisch signifikanten Einfluss auf den Anteil der PNA-FITC positiven

gebundenen Spermien.

Betrachtet man hingegen die Verhältnisse beim Einsatz des TG-Spermas, so wurde die

Induktion der Akrosomreaktion durch die gereifte ZP gegenüber der ungereiften sowohl beim

Beobachtungszeitpunkt von 10 min als auch bei 20 min statistisch signifikant verstärkt.

Neben dem Einfluss des Reifungsstadiums der ZP wurde auch die Abhängigkeit vom

Zeitfaktor überprüft.

Der Zeitfaktor hatte beim Gebrauch von Frischsperma mit ungereifter ZP und auch mit

gereifter ZP einen statistisch hoch signifikanten Einfluss auf den Anteil der PNA-FITC

positiven Spermien. Bei Zona pellucida von GV I Oozyten unter Einsatz von aufgetauten

Nebenhodenspermien war dies nicht der Fall, aber bei der gleichen Spermienpopulation mit

Verwendung von gereifter ZP war eine statistische Auffälligkeit nachzuweisen.

Zur Kontrolle des Einwirkens der ZP wurden zu denselben Zeitpunkten wie die Spermien an

der ZP Spermien in Suspension untersucht (alle Angaben siehe unter 2. in J Anhang). Der

Anteil der PNA-FITC positiven Spermien in Suspension unterschied sich statistisch hoch

signifikant von dem der an die ZP gebundenen. Die Zona pellucida hatte folglich in dem

beschriebenen Versuchsaufbau die Fähigkeit zur Induktion der Akrosomreaktion.

Im Vordergrund dieser Untersuchung stand vor allem die Charakterisierung des Einflusses

des Reifungsgrades der ZP auf die Spermatozoen bezüglich der Induktion der

Akrosomreaktion. Aus der bisherigen Darstellung der statistischen Ergebnisse wird deutlich,

dass die größte Unterscheidung im Zeitabschnitt von einer Minute gegenüber zehn Minuten

D Ergebnisse

87

vorlag. Zur konkreteren Auswertung wurde daher in Modellen die Steigung der Geraden

durch die entsprechenden Grafikpunkte bei 1min, 10 min und 20 min ermittelt

(siehe Abb.14).

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

1 10 20

Zeitpunkt (min)

Ant

eil P

NA

-FIT

C p

os. S

perm

ien

an Z

P

(%)

GV I; ejak. Frischsp.

M II; ejak. Frischsp.

GV I; aufget. Nh-Sp.

M II; aufget. Nh-Sp.

Abb. 14: Darstellung von Geraden durch die ermittelten Diagrammpunkte des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien in Abhängigkeit vom Beobachtungszeitpunkt (ejak. Frischsp.= ejakulierte Frischspermien; aufget. Nh-Sp.= aufgetaute Nebenhodenspermien)

Die Gerade verlief bei der Verwendung von ungereifter ZP und ejakulierten Frischspermien

annähernd linear mit einer Steigung von 1,26. Bei der gleichen Zonaart mit kryokonservierten

Nebenhodenspermien ist anzumerken, dass die Zeit keinen statistisch signifikanten Einfluss

besaß und somit die Steigung auch sehr gering (0,12) war.

In der grafischen Darstellung des Versuchsansatzes mit gereifter ZP fiel der zweiphasige

Verlauf mit unterschiedlicher Steigung auf. Dieser Effekt war beim ejakuliertem

Frischsperma besonders ausgeprägt. Für beide Grafen wurden also die Steigung der Geraden

durch die Grafikpunkte bei 1 min bis 10 min und 10 min bis 20 min getrennt berechnet. Bei

den ejakulierten Frischspermien ergab sich im ersten Zeitabschnitt eine Steigung von 2,44, im

D Ergebnisse________________________________________________________________

88

zweiten von 0,01 (keine statistisch signifikante Unterscheidung des Zeiteinflusses von 10 min

gegenüber 20 min) und für den ganzen Grafen 1,13. Nach 10 Minuten war bereits eine Art

Sättigung erreicht. Der beschriebene biphasische Verlauf war unter Verwendung von

kryokonserviertem Nebenhodensperma schwächer ausgeprägt. Die Steigung beläuft sich für

den Bereich von 1 min bis 10 min auf 0,94, für den Bereich von 10 min bis 20 min auf 0,29

und insgesamt auf 0,58.

Die Steigung ist als Maß für die Geschwindigkeit der Induktion der Akrosomreaktion

anzusehen. Diese war unter Verwendung von ejakuliertem Frischsperma innerhalb der ersten

10 Minuten bei den Versuchen mit gereifter ZP ca. doppelt so groß gegenüber denen mit

ungereifter ZP. Bei Einsatz von aufgetauten epididymalen Spermien war die

Anfangsgeschwindigkeit gegenüber von Frischsperma bei gereifter ZP geringer als die Hälfte.

Dennoch war der Anstieg des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien auch beim TG-

Sperma in den ersten 10 Minuten wesentlich stärker bei der gereiften ZP als bei der

ungereiften. Dies war vor allem durch die nur minimale Erhöhung des akrosomreagierenden

Anteils der Nebenhodenspermien an der ungereiften ZP begründet.

Zum besseren Vergleich des Einflusses der beiden verwendeten Spermienpopulationen

mussten zunächst beider Ausgangswerte in Suspension betrachtet werden. Schon dort lagen

Spermien vor, die PNA-FITC positiv reagierten. Dies war als sogenannte spontane

Akrosomreaktion, ein Zeichen des Zellverfalls, zu werten. Es war allerdings anzunehmen,

dass die Spermien, die in der kurzen Koinkubationszeit von 1 min an die ZP binden, aus der

vitalen akrosomintakten Teilmenge der Gesamtsuspension stammten. Der Anteil der PNA-

FITC positiven Spermien zu Beginn des Bindungsversuches in Suspension betrugt beim

Frischsperma ca. 8 % und beim TG-Sperma ca. 25 %. Die Ausgangswerte wurden jeweils

aufgrund des möglichen Einflusses der ursprünglichen Spermiensuspension von denen an der

ZP ausgezählten und prozentual dargestellten Werten abgezogen (siehe Abb.15).

Es ergaben sich dabei für alle Versuchsansätze ähnliche Ausgangswerte der PNA-FITC

positiven Spermien an der ZP. Die Reaktionskinetiken blieben unverändert, da die

Darstellungen in Abbildung 15 im Vergleich zu Abbildung 14 nur um die jeweiligen

Ausgangswerte in der Suspension in Richtung x-Achse verschoben wurden.

D Ergebnisse

89

Die statistisch signifikanten Einflüsse, die in den beschriebenen Varianzanalysen ermittelt

wurden, blieben fast unverändert. Es änderte sich lediglich das Einwirken der Spermien. In

der zweifaktoriellen Varianzanalyse innerhalb der Gruppe der ungereiften ZP waren die

Durchschnittswerte der PNA-FITC positiven Spermien der aufgetauten Nebenhodenspermien

im Vergleich zum Frischsperma jetzt statistisch signifikant niedriger.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

1 10 20

Zeitpunkt (min)

Ant

eil P

NA

-FIT

C p

os. S

perm

ien

an Z

P

(%)

GV I; ejak. Frischsp.




Abb.15: Darstellung von Geraden durch die ermittelten Diagrammpunkte des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien in Abhängigkeit vom Beobachtungszeitpunkt nach Abzug der Ausgangswerte der jeweiligen Spermiensuspension (ejak. Frischsp.= ejakulierte Frischspermien; aufget. Nh-Sp.= aufgetaute Nebenhodenspermien)

Die bisher beschriebenen Ansätze waren vor allem geeignet, die unterschiedlichen Einflüsse

des Reifungsgrades der ZP herauszuarbeiten. Durch die ähnlichen Werte beim Zeitpunkt von

einer Minute wurde belegt, dass der Reifungsgrad der ZP die Selektion der Spermien aus der

Suspension nicht beeinflusst. Spermienpopulation abhängige Einwirkungen waren innerhalb

einer Beobachtungsgruppe mit gleichen verwendeten Spermien bei ungereifter und gereifter

ZP einheitlich. Für Aussagen über die Induktion der Akrosomreaktion durch die jeweilige ZP

musste auch die Entwicklung des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien in der

Kontrollsuspension berücksichtig werden.

D Ergebnisse________________________________________________________________

90

Unter der Annahme, dass alle sich in der Suspension befindlichen Spermien die gleiche

Chance hatten, in der Koinkubationszeit von einer Minute an die ZP zu binden, wurden

folgendermaßen Daten erhoben. Von den jeweiligen Prozentwerten der PNA-FITC positiven

Spermien, die an die ZP gebunden hatten, wurden die entsprechenden Werte der Spermien in

der Kontrollsuspension zum selben Zeitpunkt abgezogen. Man erhielt so einen Wert, der als

Maß der Induktion der Akrosomreaktion durch die ZP angesprochen werden konnte.

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

1 10 20

Zeitpunkt (min)

Ant

eil d

er P

NA

-FIT

C p

osit

iven

Sp

erm

ien

an d

er Z

P (

%)

GV I;ejak. Frischsp.




Abb. 16: Induktion der Akrosomreaktion durch die ZP; Differenzen des Anteils der PNA-FITC positiven Spermien an der ZP und in Kontrollsuspension in Abhängigkeit von der Zeit (ejak. Frischsp.= ejakulierte Frischspermien; aufget. Nh-Sp.= aufgetaute Nebenhodenspermien)

Aus der Abbildung 16 im Vergleich zu den Abbildungen 14 und 15 war zu entnehmen, dass

der große Einfluss der gereiften ZP innerhalb der ersten 10 Minuten auf die Induktion der

Akrosomreaktion bei den ejakulierten Frischspermien durch die Differenzbildung mit den

Kontrollwerten noch verstärkt wurde. Der schwächere Einfluss der ungereiften ZP auf die

Frischspermien war jedoch noch stärker ausgeprägt als der der gereiften ZP auf die

aufgetauten Nebenhodenspermien. Beim epididymalen TG-Sperma fiel wieder der

biphasische Verlauf des Grafen bei gereifter ZP auf. Im Zeitabschnitt von 1 min zu 10 min

D Ergebnisse

91

wurde durch die gereifte ZP die Akrosomreaktion wesentlich stärker induziert als in den

folgenden 10 Minuten. Die Fähigkeit der ungereiften ZP, bei den gebundenen

Nebenhodenspermien gegenüber denen in der Kontrollsuspension die Akrosomreaktion

hervorzurufen, wurde mit fortschreitender Zeit immer geringer. Zum Zeitpunkt von 20 min

war kein Unterschied mehr festzustellen.

Weitere bei der Auswertung der an die ZP gebundenen Spermien erhobene Parameter waren

der Anteil der Spermien mit abgelöstem Akrosom und der der isolierten Kopfkappen (genaue

Werte siehe unter 2. in J Anhang).

Spermien mit abgelöstem Akrosom wurden relativ selten beobachtet. Unabhängig von der

Spermienpopulation und dem Reifestatus der ZP wurden bei einer Minute etwa 1,5 %, bei 10

Minuten ca. 2,4 % und bei 20 Minuten ca. 3,0 % Spermien ohne Kopfkappe beobachtet. Fast

alle der PNA-FITC negativen Spermien besaßen also noch ihr Akrosom.

Die vom Spermatozoon isolierten PNA-FITC positiven Kappen wurden vergleichsweise in

einem höheren Maße gefunden. Sie sind also nicht als abgelöste Akrosome noch an die ZP

gebundener Spermien zu betrachten. Sie konnten auch nicht vermehrt in der Nähe von den

wenigen Spermien ohne Kopfkappe lokalisiert werden. In der Spermiensuspension wurden

allerdings keine isolierten Kappen gefunden, so dass diese als Reste ehemals gebundener,

durch die Waschvorgänge abgelöster Spermien anzusehen sind. Relevant für die

Versuchsauswertung war, dass keine Unterschiede zwischen dem Einsatz von ungereiften und

gereifter ZP hinsichtlich des Anteils an abgelösten Akrosomen bestand.

Bei ejakuliertem Sperma bewegten sich die Werte für die isolierten Kappen an der ZP in etwa

von 5 % zum Zeitpunkt von einer Minute über ca. 15 % bei 10 min bis ca. 20 % bei 20 min.

Der Einsatz von aufgetautem Nebenhodensperma rief Daten von ca. 18 % bei 1 min, 22 % bei

10 min und 30 % bei 20 min hervor.

E Diskussion________________________________________________________________

92

E Diskussion

1. Verhalten der porcinen Zona pellucida in der PAGE

Die biochemische Analyse der ZP begann mit der Auftrennung der Glykoproteine mittels

Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE). In der eindimensionalen PAGE (1D-PAGE) wurde

eine Bande um ca. 90 kDa und eine breite, nicht scharf begrenzte Bande mit einem relativen

Molekulargewicht von 45-60 kDa ermittelt. Diese Ergebnisse stimmen mit denen von

YUREWICZ et al. (1983) in etwa überein. Diese Arbeitsgruppe erhielt zwei Banden mit 77-

97 kDa und 46-70 kDa. Die höher molekulare Bande entspricht ZPA und die andere dem

Gemisch von ZPB/ZPC. Durch den hohen Glykosylierungsgrad der einzelnen Proteine

erstreckt sich diese Bande über einen großen Molekulargewichtsbereich. Diese Heterogenität

wird durch posttranslationale Strukturierungsprozesse, wie dem Einbau von Kohlenhydrat-

strukturen, Sulfatierung und Sialylierung, hervorgerufen. Bei ZPA beträgt der Proteinanteil

ca. 85 % und bei ZPB/ZPC ca. 78 % des Gesamtgewichtes der jeweiligen Glykoproteine

(HEDRIK u. WARDRIP 1986).

Analog zu den entsprechenden Literaturstellen wurden keine Unterschiede in den PAGE von

ZP von Eizellen aus frischen oder tiefgefrorenen Oozyten beobachtet (DUNBAR et al. 1980;

HEDRIK u. WARDRIP 1986). Die Gewinnungsart der ZP, entweder Punktion einzelner

Follikel oder Massenaufarbeitung mit Siebtechnik, hatte ebenfalls keinen erkennbaren

Einfluss auf die PAGE.

Die meisten beschriebenen 2D-PAGE der porcinen ZP Glykoproteine wurden unter

reduzierenden Bedingungen durchgeführt. DUNBAR und RAYNOR (1980) hielten die

Reduktion für das Erreichen der Dissoziation der einzelnen Makromoleküle für notwendig.

Die zweidimensionale Auftrennung zeigte so stets vier Spotbanden bei ca. 90, 65, 55 und 25

kDa. Es wurde nachgewiesen, dass die 65 kDa und 25 kDa Anteile Fragmente der 90 kDa

Komponente von ZPA sind und nur durch die Spaltung von Disulfidbrücken entstehen

(HEDRIK u. WADRIP 1987). Es existiert im porcinen ZPA eine vorgegebene Spaltstelle

zwischen Ala168 und Asp169. In ovariellen Oozyten erfolgt eine partielle Aufspaltung des

E Diskussion

93

Zweikettenmoleküls durch Reduktion der Disulfidbrücken in einen 65 kDa und einen 25 kDa

Anteil (s. Abb. 17). Eine vollständige Spaltung dieser Prozessierungsstelle erfolgt erst nach

der Befruchtung der Oozyte.

Abb. 17: Proteolytisches Processing porcinen ZPA (Schema) ZP2 = 90 kDa, ZP1 = 65 kDa und ZP4 = 25 kDa Komponente von ZPA

Für die vorliegenden Arbeit sollten die Proteine der ZP so wenig wie möglich durch die

Aufarbeitung für die PAGE verändert werden. Es wurde daher sowohl auf Reduktion als auch

auf Enzymbehandlungen verzichtet, da im anschließenden Lektinblot die exponierten

Zuckerstrukturen analysiert werden sollten. In der 2D-PAGE wurde die ZP entsprechend der

1D-PAGE in zwei separierte Spotbanden aufgetrennt. Diese verliefen ca. von 120-95 kDa bei

pI 3,9-6,7 und von 60-55 kDa bei pI 3,0-7,8 (vgl. HEDRIK u. WARDRIP 1986: 2 Banden bei

101-73 kDa u. 73-46 kDa). Es wurden 10%ige Trenngele verwendet, da sich die

Bandenbereiche unter nicht reduzierenden Bedingungen so am besten darstellen ließen. Diese

wurden auch für die reduzierenden Ansätze verwendet, die zum Vergleich angefertigt wurden.

Nach Reduktion konnten so jedoch nur drei, nämlich die 90, 65 und 55 kDa Anteile der ZP

Proteine dargestellt werden. Das 25 kDa Fragment von ZPA war nur bei höher

Ala168 Asp169

ZP4 ZP1

ZP4 ZP1

Verbindung des Zweikettenmoleküls (ZP2) durch Disuldfidbrücken

potentielle Spaltstelle

E Diskussion________________________________________________________________

94

konzentrierteren Gelen zu finden. Zum besseren Vergleich wurde in der vorliegenden Arbeit

die elektrophoretische Auftrennung gewählt, mit der sich die nicht reduzierte Form der ZP

Proteine am optimalsten darstellen ließ. Das 25 kDa Fragment besteht auch nur aus 4 % des

Proteinanteils der Zona pellucida (HEDRIK u. WARDRIP 1986).

Interessant bei der 2D-PAGE war der Vergleich von ungereifter und gereifter ZP. Während

der Reifung, sowohl in vivo als auch in vitro, unterliegt die Oozyte bestimmten

Veränderungen. Am eindeutigsten ist die Veränderung des Kernstatus darzustellen. Mit

diversen Färbetechniken können die Chromatinstrukturen im Kern sichtbar und die

Entwicklung vom Germinalvesikel I Stadium zur Metaphase II dargestellt werden. Das

abgeschürte Polkörperchen in Metaphase II ist auch ohne Anfärbung mit einem Mikroskop

auszumachen. Diese Untersuchungen gehören zur Routine bei der Beurteilung des

Reifungsstatus bei Eizellen.

Während des Reifungsprozesses finden jedoch auch noch weitere Veränderungen an der

Oozyte statt, die durchaus entscheidende Rollen bei der weiteren Entwicklung der Zygote

spielen können. Die Mitochondrien sind in der M II nicht mehr in Gruppen am Rand

angeordnet, sondern gleichmäßig über das gesamte Ooplasma verteilt (CRAN 1985). In den

Randbereichen hingegen verdoppelt sich die kortikale Granula, deren Verfügbarkeit mit dem

Vermögen der Oozyte zur Ausbildung des Polyspermieblocks korreliert (DUCIBELLA

1996).

Untersuchungen zur Veränderung der Zona pellucida wurden zumeist vergleichend von ZP

ungereifter Eizellen und ZP von bereits befruchteten Eizellen, nicht im Vergleich zu

Metaphase II Stadien, durchgeführt. HATANAKA et al. (1992) untersuchten bei Schweinen

die ZP von in vitro gereiften M II Stadien und von fertilisierten Oozyten. Sie stellten fest, dass

die benötigte Zeit zur Solubilisation der ZP von M II Oozyten 30-40% kürzer war. Die

verlängerte Zeit bei der ZP von befruchteten Oozyten begründeten sie mit den Veränderungen

im Rahmen des Zona hardenings, induziert durch die Befruchtung. In der 2D-PAGE Analyse

konnten sie eine deutliche Verringerung der Menge an ZPA bei den ZP Proteinen von

befruchteten Eizellen aufzeigen, wohingegen Veränderungen bei den anderen Proteinfamilien

kaum zu beobachten waren. Sie machten dafür die durch Exozytose im Rahmen des

Polyspermieblocks freigesetzten Enzyme der kortikalen Granula verantwortlich. Weitere

E Diskussion

95

Veränderungen der ZP nach der Befruchtung in vivo sind die Einlagerungen von

Glykoproteinen aus dem Eileiter (HEDRIK et al. 1987).

Die Veränderungen nach der Befruchtung sind also vor allem durch geänderte

Funktionen/Aufgaben (Polyspermieblock, Schutz der Zygote) und Ortswechsel (in vivo:

Wanderung vom Eileiter in den Uterus) bedingt.

In der vorliegenden Arbeit sollten jedoch nun die Verhältnisse bis kurz vor der Befruchtung

untersucht werden. Erstmalig konnte ein Shift der Spotbanden in den sauren pI-Bereich beim

Vergleich der ZP von GV I Stadien und der ZP von in vitro gereiften M II Stadien aufgezeigt

werden. Es findet folglich eine Veränderung während der Reifung auf biochemischer Ebene

statt. Die Zunahme der sauren Anteile der ZP Glykoproteine kann durch diverse

Umbauprozesse hervorgerufen werden. Möglich wären Sulfatierungen, Sialylierungen und

veränderte Kohlenhydratstrukturen. Weiterhin sind auch Veränderungen innerhalb der

Polypeptidkette nicht vollständig auszuschließen.

Die Veränderungen des Proteinmusters der ZP Glykoproteine während der In-vitro-Reifung

können nicht als erste Stufe zu den bereits bekannten Modifikationen der ZP Proteine von

porcinen befruchteten Eizellen aufgefasst werden. Die Studien von HATANAKA et al. (1992)

zeigten, dass unter reduzierenden Konditionen bei der ZP von IVF Oozyten die 90 kDa

Spotbande (ein Teil von ZPA) nicht mehr in der 2D-PAGE zu identifizieren ist. Während der

Befruchtung unterliegt ZPA der vollständigen Spaltung der Disulfidbrücken im Rahmen des

Proteinprocessing (vgl. Abb. 17). Weitere Veränderungen der ZPA Anteile von befruchteten

Oozyten werden vermutlich durch Enzyme bewirkt, die im Verlauf der Fertilization

freigesetzt werden. PRASAD et al. (2000) beschreiben zu diesem Thema, dass sich die

morphologische Erscheinung im Lichtmikroskop von trypsin-behandelter ZP nicht von dem

der unbehandelten ZP unterscheidet. In der 2D-PAGE ist hingegen eine partielle Proteolyse

des 90 kDa Anteils und eine vollständige Proteolyse der 65 kDa und 25 kDa Anteile von ZPA

zu erkennen.

Bei den Untersuchungen von HATANAKA et al. (1992) wiesen die pI-Bereiche der

Glykoproteine im Gegensatz zu den von uns durchgeführten Versuchen (s. 2.2. 2D-PAGE der

Glykoproteine der Zona pellucida unter D Ergebnisse) von GV I über M II bis zu den

befruchteten Stadien keine Veränderungen auf. Eine mögliche Ursache dafür ist in der

Reduktion der Proteine zu suchen.

E Diskussion________________________________________________________________

96

2. Charakterisierung der ZP durch Antikörper und Lektine

Durch die immunologische Untersuchung der einzelnen Glykoproteine der ZP im Western

Blot nach zweidimensionaler Auftrennung konnte die Zuordnung der Spotbanden zu den

einzelnen Glykoproteinen bestätigt werden. ZPA, welches sich vom relativen

Molekulargewicht her mit um 90 kDa deutlich von dem Bereich um 55 kDa von ZPB/ZPC

abhebt, wurde von dem entsprechenden Antikörper als solches erkannt. Eine genaue

Abgrenzung des Bereiches von ZPB zu dem von ZPC war nicht möglich, da eine große

Überlappung vorlag. Diese ist als reale Überschneidung zu werten und weniger als

Kreuzreaktivitäten der Antikörper. Analog der Ergebnisse von BLASE und Mitarbeitern

(1998) konnten jedoch Unterscheidungstendenzen bezüglich des pI-Bereiches festgestellt

werden. ZPB erstreckt sich bis zum basischen Ende des Proteinbereiches und das ZPC

konzentriert sich mehr in den sauren pI-Bereichen. BLASE et al. (1998) weisen ZPB im

Vergleich zu ZPC eine etwas höhere Molekulargewichtsregion zu. Diese Ergebnisse konnten

nicht nachvollzogen werden. Dieser Unterschied könnte darauf zurückzuführen sein, dass

unsere entsprechenden Versuche unter nicht reduzierenden Bedingungen und nicht mit

Reduktionsmittel durchführt wurden. Der Einsatz von Reduktionsmittel bewirkt nicht nur eine

Aufspaltung von ZPA, sondern sicherlich auch einige noch nicht näher beschriebene

Veränderungen innerhalb von ZPB/ZPC.

In den vergangenen Jahren mehrten sich die Erkenntnisse über die Bedeutung der

Kohlenhydratstrukturen bei der Vermittlung von bestimmten Signalen und Prozessen im

lebenden Organismus. Auf dem Gebiet der Forschungen um die Zona pellucida kamen

Lektine als Erkennungsmarker von bestimmten Kohlenhydratstrukturen schon vielfältig zum

Einsatz. Es kann mit Lektinen zum einem gezielt nach vermuteten Strukturen gesucht werden,

zum anderen aber auch durch den Einsatz von verschiedenen Lektinen sich ein Überblick über

beteiligte Oligosaccharide verschafft werden. Die Zona pellucida wurde in vielen Studien oft

vor einer Inkubation mit Lektinen mit Glykosidasen behandelt aufgrund einer möglichen

Maskierung von definerten Zuckerstrukturen durch terminale Kohlenhydrate und/oder

Säurereste. Dies ist sinnvoll bei der Aufklärung der Gesamtheit aller in der ZP

vorkommenden Strukturen. Beispielsweise können mittels Neuraminidase Sialsäurereste

E Diskussion

97

abgespalten werden. Eine Desulfatierung und Deacetylierung sind ebenfalls möglich. Zur

Auftrennung von ZPB und ZPC wird oft Endo-β-Galaktosidase eingesetzt, die durch

Abspaltung von Laktosamineinheiten zur Verringerung der Heterogenität der Glykoproteine

beiträgt und so die Separierung der beiden Proteine ermöglicht. Da die

Kohlenhydratstrukturen der porcinen ZP (besonders von ZPB u. ZPC, zur Übersicht siehe

NAKANO u. YONEZAWA 2001) weitestgehend bekannt sind, war es nicht das Ziel dieser

Arbeit, durch die lektinologische Analysen bestimmte Oligosaccharide der ZP nachzuweisen.

Es sollten vielmehr durch möglichst wenige Manipulationen der Glykoproteine die für

Lektine freizugänglichen Kohlenhydrate und mögliche Veränderungen durch die IVM

dargestellt werden. Deshalb wurden die Versuche unter nicht reduzierenden Bedingungen und

ohne Modifizierungen, wie z.B. durch Enzymspaltungen, durchgeführt.

Folgende Zuckerstrukturen der nativen mittels 2D-PAGE aufgetrennten ZP Glykoproteine

konnten im Lektinblot ermittelt werden:

Das Lektin Con A detektiert Mannose (und/oder N-Acetylglukosamin), die typisch für das

Trimannosyl-Core der N-Glykane ist (vgl. Abb. 18). Zu beachten ist weiterhin, dass Con A

die Strukturen von diantennären Glykoproteinen, nicht aber von tri- und tetraantennären

erkennt, da beim Schwein keine Zuckerverknüpfungen vom „High-Mannose“-Typ vorhanden

sind. Auffällig war, dass stark positive Con A Signale auf den ZPA Bereich beschränkt

waren. Dies galt gleichermaßen für ungereifte und gereifte ZP. Das Vorhandensein von

mannosehaltigen, diantennären Kohlenhydratketten ist zwar auch für ZPB und ZPC belegt

(NAKANO u. YONEZAWA 2001), diese scheinen aber maskiert oder in einem zu geringen

Anteil vorzuliegen. Die Glykoproteinstrukturen von ZPA sind im Vergleich zu denen von

ZPB und ZPC weniger untersucht. Mittels N-terminaler Sequenzierung konnte in unsere

Arbeitsgruppe für über Con A Affinitätschromatographie isolierte diantennäre N-Glykane

eine dominante Glykosylierungsstelle im porcinen ZPA an Asn268 gefunden werden

(EKHLASI-HUNDRIESER et al., unveröffentlicht).

Bei den anderen eingesetzten Lektinen konnten keine Unterschiede innerhalb der einzelnen

Glykoproteine beobachtet werden. Mit AAA (vgl. Abb. 18) konnte der für die porcine ZP

typische hohe Fukosylierungsgrad dargestellt werden. ECA detektierte die Strukturen N-

Acetylgalaktosamin, N-Acetyllaktosamin oder terminale Galaktose innerhalb neutraler N-

E Diskussion________________________________________________________________

98

glykosidisch gebundener Ketten. Im Gegensatz zu HOKKE und Mitarbeitern (1993), die in

porciner ZP nur (2-3)-verknüpfte Sialsäure fanden, konnte hier neben dieser Struktur mit

MAA II auch (2-6)-verknüpfte Sialsäure mit SNA nachgewiesen werden. Auffällig war, dass

beide Lektine, obwohl sie relativ saure Strukturen erkennen, im Bereich der Anode eher

schwache Signale besaßen und ihr Signalmaximun mehr in der Mitte des

Spotbandenbereiches der Glykoproteine lag. Jacalin und ACA erkennen beide Strukturen, die

typischer Weise in O-Glykanen vorliegen (α-D-Gal-β(1-3)-GalNAc), wobei Jacalin die

neutrale und ACA die saure sialylierte Form markiert (vgl. Abb. 18). Weitere positive Signale

konnten mit DSA für repetierende N-Acetyllaktosamineinheiten nachgewiesen werden.

Die an terminale Galaktose bindenden Lektine PNA (β-D-Gal) und GS I (α-D-Gal) riefen

keine Markierungssignale hervor. Dies stimmt mit den Ergebnissen andere Arbeitsgruppen

überein. PARILLO et al. (2001) erhielten in der Histochemie von ZP von Wildschweinen bei

PNA (β-D-Gal) erst ein Signal nach Einsatz von Neuraminidase und α–D-Gal konnte nur

nach Desulfatierung nachgewiesen werden. Auch SKUTELSKY et al. (1994) erhielten bei

feliner, caniner und porciner ZP, jeweils ohne enzymatische oder chemische Vorbehandlung,

bei der Anwendung von PNA und GS I keine positive Detektion. Allerdings bei der ZP von

niederen Tieren wie Maus, Ratte und Hamster ließ sich mit PNA β-D-Gal auch an der ZP im

nativen Zustand nachweisen. Dies belegt, dass Sulfatierung und Sialylierung der ZP zu den

höher entwickelten Tieren hin zunimmt. Bei der Maus ist bekannt, dass die terminale

Galaktose als Erkennungsmerkmal für die Spermatozoen-Zona pellucida Bindung eine

wichtige Rolle spielt (BLEIL u. WASSARMAN 1988). Diese ist nach den

Lektinbindungsstudien auch gut zugänglich. Da dies u.a. bei der porcinen ZP nicht der Fall

ist, spricht dies für differenziertere Bindungsvorgänge.

E Diskussion

99

N-Glykane:

NeuAcα(2-3)Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2) Manα(1-6) Fucα(1-6)

Manβ(1-4)GlcNAcβ(1-4)GlcNAc-Asn NeuAcα(2-6)Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2) Manα(1-3)

O-Glykane:

-Ser/Thr -Ser/Thr

Abb. 18: Lektine und die von ihnen erkannten Kohlenhydratstrukturen ( )

Abgesehen von der vermehrten Acidität zeigten die Lektinmuster im Vergleich von ZP von

ungereiften und gereiften Oozyten keine Veränderungen. Die pI-Verschiebung stellte sich in

der lektinologischen Analyse allerdings mit einer Differenz von ca. zwei pI-Einheiten zu dem

in der Gelanfärbung mit Silberreagenz von ca. einer pI-Einheit noch ausgeprägter dar.

NeuAcα(2-3/6)Galβ(1-3)GalNAc Galβ(1-3)GalNAc

Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-6) Manα(1-6) Fucα(1-6) Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2)

Manβ(1-4)GlcNAcβ(1-4)GlcNAc - Asn Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-2)

Manα(1-3)

[Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-3)]N-Galβ(1-4)GlcNAcβ(1-4)

MAA II Con A

SNA

DSA

AAA

ACA Jacalin

6 HSO4

potentielle Sulfatierungsstelle am C-6-Atom von N-Acetylglukosamin

E Diskussion________________________________________________________________

100

Bei der Interpretation von Lektinbindungsstudien muss einiges beachtet werden. Es besteht

immer die Möglichkeit, dass bestimmte Strukturen nicht erkannt werden, da Oligosaccharide

sehr komplexe Verbindungen sind. Das Bindungsverhalten der Lektine ist so

substratspezifisch entsprechend dem von Enzymen. Es erfolgt aber eine Bindung über

Wasserstoffbrücken und hydrophobe Wechselwirkungen wie bei einer Antigen-Antikörper-

Reaktion. Neben diesen molekularen Wechselwirkungen kann die Tertiärform der

Molekülketten und die Anwesenheit von maskierenden Strukturen das Bindungsverhalten von

Lektinen erheblich beeinflussen.

Daher werden oft Lektine, die gleiche oder ähnliche Kohlenhydrate erkennen, parallel

eingesetzt, um falsch negative Ergebnisse möglichst zu vermeiden. So wurden von vielen

Autoren als α-L-Fukose erkennendes Lektin UEA I (Ulex europaeus I) verwendet, welches in

der Histochemie keine Strukturen innerhalb der ZP zu markieren scheint (z.B. SKUTELSKY

et al. 1994; TREDE 1995). Bei den in dieser Arbeit beschriebenen Versuchen wurde statt

UEA I das Lektin AAA eingesetzt, welches auch den durch moderne Zuckeranalysemethoden

nachgewiesenen hohen Anteil an Fukose in der ZP des Schweins erkennen konnte.

Maskierungen von Sacchariden in der ZP sind z.B. durch andere Kohlenhydrate, Sulfate und

Sialsäurereste möglich. Es handelt sich bei letzteren beiden um negativ geladene Strukturen,

die u.a. für den sauren Charakter der ZP in der isoelektrischen Fokussierung verantwortlich

gemacht werden können. Aufgrund dieser Acidität wären eine vermehrte Sialylierung

und/oder Sulfatierung der Zona pellucida während der In-vitro-Maturation eine mögliche

Ursache für den nachgewiesenen pI-Shift in der 2D-PAGE.

Bedeutung von Sialylierung und Sulfatierung der ZP Studien bei diversen Tierarten haben gezeigt, dass die ZP reich an Sialsäureresten ist

(AVILES et al. 1994; PARILLO et al. 1996). Die negative Sialsäure ist aufgrund ihrer

Ladung in Bindungen und Transporte von positiv geladenen Teilchen involviert. Diese

spielen eine Rolle bei der Hydratation der ZP. Zusätzlich tragen die Sialsäurereste dazu bei,

dass dem Spermium die Penetration durch die ZP ermöglicht wird. Auf die Spermienbindung

an die Zona pellucida scheint die Sialsäure einen differenzierten Einfluss zu besitzten. Bei der

humanen ZP konnte gezeigt werden, dass die chemische Modifikation der terminalen

Sialsäurereste eine deutliche Reduktion der Spermienbindungskapazität der ZP hervorruft

E Diskussion

101

(OZGUR et al. 1998). Die Behandlung der ZP mit Neuraminidase bewirkt allerdings einen

signifikanten Anstieg der Anzahl der an die ZP gebundenen Spermatozoen. Diese Ergebnisse

lassen die Koexistenz von durch Sialsäure vermittelten Bindungen und durch Sialsäurereste

maskierten Bindungsstellen vermuten.

Die Sialylierungen über α(2-3)-Verknüpfungen sind relativ starr, aber in Verbindung mit den

besser frei drehbaren α(2-6)-Verknüpfungen erhält die ZP einen vikös-elastischen Charakter

(PARILLO u. VERINI-SUPPLIZI 2001). Mit dem Lektin SNA konnte in der vorliegenden

Arbeit der geringe, aber eindeutig vorhandene Anteil der α(2-6)-Verbindungen nachgewiesen

werden.

Sialsäurereste spielen folglich eine bedeutende Rolle bei den Befruchtungsvorgängen. Die

erbrachten lektinologischen Untersuchungen weisen jedoch nicht auf eine vermehrte

Sialylierung durch die IVM hin. Die Intensität des Bindungsmusters von SNA bei gereifter

ZP war nicht gesteigert im Vergleich zur ungereiften ZP.

Sulfate sind ebenfalls negativ geladene Strukturen, die zum sauren Charakter der ZP mit

beitragen. Sulfatierte Oligosaccharide konnten bereits bei den Glykoproteinen der porcinen

ZP nachgewiesen werden (MORI et al. 1998; PARILLO et al. 2000). Es ist bekannt, dass die

Sulfatierung bei der Bioaktivität von Glykoproteinen eine Rolle spielt, jedoch inwieweit sie

für die Prozesse innerhalb der Befruchtungsvorgänge relevant ist, muss noch diskutiert

werden. So führen Antikörper gegen sulfatierte Glykoproteine der ZP zur Immuno-

kontrazeption (PATERSON et al. 1996). JONES (1991) konnte zeigen, dass Oligosaccharide

mit Sulfatresten Proacrosin binden und mit als sekundäre Rezeptoren innerhalb der

Spermatozoon-Oozyten-Bindung agieren.

Mit der möglichen wichtigen funktionellen Rolle der Sulfatierung und Sialylierung befassten

sich in Studien LIU et al. (1997). Dabei wurde gezeigt, dass die Acidität von mZPC u.a. von

der Verknüpfung mit Sialsäureresten abhängt. Der pI-Wert stieg nach der Behandlung mit

Neuraminidase von ca. 4,7 auf ca. 6,0. Weiterhin wurde unter In-vitro-Bedingungen die

Fähigkeit von partiell deglykosylierten, desulfatierten oder desialylierten ZPC, Spermien zu

binden und die Akrosomreaktion zu induzieren, geprüft. Allerdings schienen Sulfatierung,

Sialylierung und der Grad der Glykosylierung bei der Bioaktivität von murinen ZPC keine

Rolle zu spielen. Inwieweit diese Erkenntnisse über den anscheinend fehlenden Einfluss von

Sulfatresten und Sialinsäureresten von der Maus auf höher entwickelte Tiere, wie dem

E Diskussion________________________________________________________________

102

Schwein, übertragen werden können, ist fraglich. Wie schon beschrieben, ist zum einen der

Aufbau der ZP bei Nagetieren wesentlich einfacher und zum anderen wird bei der Maus die

Spermienbindung O-Glykanen des ZPC zugesprochen.

Bei der porcinen ZP sind N-Glykane von ZPB mit Unterstützung der N-Glykane von ZPC in

die primäre Spermienbindung involviert. Während bei der Maus die Sialylierung ausgeprägter

ist (NOGUCHI u. NAKANO 1993), ist der Sulfatanteil der porcinen ZP besonders hoch

(NOGUCHI u. NAKANO 1992). Eine mögliche Sulfatierungstelle ist die Verknüpfung an der

C-6 Position von N-Acetylglukosamin innerhalb einer Laktosamineinheit (s. Abb. 18). N-

Acetyllaktosamineinheiten konnten hier durch das Lektin DSA nachgewiesen werden. Die

Laktosamineinheiten kommen innerhalb der N-Glykane oft in unverzweigter sich mehrfach

wiederholender Form vor, welches eine ausgeprägte Sulfatierung bewirken kann. Zusätzlich

wurden beim Schwein auch Sulfatreste an sich nicht repetierenden Einheiten und an der C-3

Position der N-Acetylglukosaminreste am reduzierten Ende gefunden (MORI et al. 1998).

3. Ultrastrukturelle Untersuchung der Zona pellucida

Mit der Rasterelektronenmikroskopie der intakten Eizellen mit AAA und Con A konnte eine

Mengenverteilung der exponierten Kohlenhydratstrukturen entsprechend der lektinologischen

Analysen der auf PVDF-Membranen transferierten ZP Glykoproteine dargestellt werden. Die

Markierung mit AAA zeigte sich fast flächendeckend und bestätigte somit wieder den hohen

Fukosylierungsgrad der porcinen ZP. Die Kügelchen mit Con A waren mehr isoliert über die

Oberfläche verteilt und weniger in den sich zentripedal verkleinernden Poren zu finden. Die

Zuckerstrukturen α-D-Mannose und α-D-GlcNAc, die vorliegend in diantennären Ketten von

Con A erkannt werden, sind an der Oberfläche der ZP folglich gut zugänglich. Die Muster

von Con A positiven Strukturen wurden an der humanen ZP von MICHELMANN und

Mitarbeitern (2001) untersucht. In dieser Studie konnten Verteilungen der Con A beladenen

Mikrobeads analog zur Spermienverteilung dargestellt werden. Statt der Goldkopplung mit

Silverenhancement, die die Goldpartikel auf ca. 250 nm wachsen lässt, wurden von ihm mit

Con A beladene Microbeads verwendet. Deren Größe belief sich auf ca. 2,8 µm und entsprach

E Diskussion

103

somit eher der Spermienkopfgröße, so dass die Microbeads als eine Art künstliches Spermium

Bindungsstellen markierten. Für ein solches Vorhaben sicherlich gut geeignet sind die

Microbeads allerdings zu groß für Untersuchungen, die sich mehr auf die Zuckerpräsentation

im allgemeinen und nicht auf die Spermienverteilung beziehen. Aufgrund des größeren

Durchmessers ist eine Markierung innerhalb der Poren der ZP nur schwer möglich.

Zur Zeit laufen noch Versuche mit gereiften Oozyten. Morphologisch bestehen bei der

unbehandelten ZP im REM zwischen ungereifter und gereifter ZP keine Unterschiede

(SCHWARTZ, persönliche Mitteilung). Die Wandlung des gitterartigen Netzwerkes der ZP

ungereifter Eizellen zu einer glatten und kompakteren Struktur konnte erst nach der

Fertilisation dargestellt werden. VANROOSE et al. (2000) wiesen dies für bovine ZP und

FUNAHASHI et al. (2001) für porcine ZP nach. Letztere konnten auch zeigen, dass sich der

Grad der fibrillären Aggregation von der ZP von in vivo erzeugten Zygoten von der ZP von in

vitro erzeugten Zygoten unterscheidet. Das In-vivo-Produkt stellt sich kompakter dar.

Veränderungen der ZP innerhalb der IVM konnten mit normaler REM nicht dargestellt

werden. Die lektinologischen Analysen der mittels 2D-PAGE separierten ZP Glykoproteine

zeigten keine Unterschiede zwischen GV I und M II Stadien bei den Lektinmustern. Nur der

pI-Shift, der auch in der Proteinanfärbung zusehen war, stellte eine Veränderung dar. Aus

diesem Grund sind auch für die Lektinverteilungen über die ZP intakter Eizellen vergleichend

zwischen ungereiften und gereiften kaum Unterschiede zu erwarten. In einer

elektronenmikroskopischen Auswertung goldgekoppelter Lektine in der Zytochemie von

muriner ZP konnte gezeigt werden, dass Veränderungen im Muster der Lektinmarkierungen

nach der Befruchtung auftreten (AVILES et al. 1997). Die Markierungen durch MAA II, PNA

und AAA waren nach der Fertilisation schwächer und die durch RCA I stärker. Diese

Untersuchung gibt Hinweise auf Veränderungen der exponierten Kohlenhydratstrukturen im

Rahmen von Befruchtung und Zona hardening. Bezüglich möglicher Veränderungen während

der Reifung der Oozyte wurden keine Angaben erhoben.

E Diskussion________________________________________________________________

104

4. Funktioneller Vergleich von ungereifter und gereifter ZP

Die lektinologischen Untersuchungen der Glykoproteine der ZP haben noch keine eindeutigen

Erklärungen für den pI-Shift in Richtung Anode nach der IVM gebracht. Es wurden auch

keine zusätzlichen Hinweise für weitere Veränderungen während der Reifung gefunden. Aus

diesem Grund wurde eine funktionelle Untersuchung angeschlossen, um die These über

Veränderungen der ZP während der In-vitro-Reifung zu untermauern. Die Fähigkeit der ZP,

die Akrosomreaktion bei kapazitierten Spermien auszulösen, wurde dazu als

Untersuchungsparameter eingesetzt. Isolierte ZP wurde mit kapazitierten Spermien inkubiert

und der Anteil der in Akrosomreaktion befindlichen Spermien ausgewertet. Parallel dazu

wurde der Prozentsatz der akrosomreagierenden Spermien einer Kontrollsuspension

bestimmt. Dieser Anteil wurde dann von dem im Bindungstest ermittelten subtrahiert und so

erhielt man den Wert, der für die Induktion durch die ZP steht.

Die Fähigkeit der ZP, die Akrosomreaktion zu induzieren, wurde schon vielfältig in

Untersuchungen als Hilfsmittel herangezogen. Beispielsweise kann so der Erhalt der

Funktionalität von gelagerten Eizellen überprüft werden. Weiterhin konnte gezeigt werden,

dass es möglich ist, die Akrosomreaktion einer bovinen Spermienpopulation durch ein

synthetisches Peptid analog zu einer ZPC-Sequenz zu induzieren (HINSCH 1998).

Mit dem in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Spermien-ZP-Bindungstest konnte gezeigt

werden, dass die Induzierbarkeit der Akrosomreaktion durch die ZP abhängig vom

Reifungsstatus der Oozyten ist. Dieser Unterschied kommt bei dem gewählten

Beobachtungszeitraum von zwanzig Minuten besonders innerhalb der ersten zehn Minuten

zum Ausdruck. Der Anteil der akrosomreagierenden Spermien, welche an die ZP gebunden

hatten, war beim Vergleich der ZP verschiedenen Reifungsgrades zu Anfang und Ende des

Versuches in etwa gleich. Die Übereinstimmung am Anfang weist darauf hin, dass die

Reifungsstadien die Spermien der Populationen nicht unterschiedlich selektieren. Der

Unterschied besteht darin, dass die Entwicklung sowohl bei den Frischspermien als auch bei

den epididymalen TG-Spermien bei der ZP in M II zwischen einer und zehn Minuten

wesentlich schneller abläuft. Besonders ausgeprägt ist dies beim Einsatz der ejakulierten

Frischspermien. Innerhalb der ersten zehn Minuten wird bei diesen durch die gereifte ZP die

E Diskussion

105

Akrosomreaktion ca. doppelt so schnell induziert wie bei der ungereiften ZP. Nach zehn

Minuten hat der Anteil der PNA-FITC positiven Spermien schon fast seinen Endwert erreicht.

Um genauere Aussagen über die Funktionalität der ZP im Hinblick auf die Induktion der

Akrosomreaktion machen zu können, muss noch die sogenannte spontane Akrosomreaktion

berücksichtigt werden. YANAGIMACHI (1994) weist darauf hin, dass sich die wahre

Akrosomreaktion, die bei lebenden, motilen Zellen stattfindet, von dem degenerativ an toten

Zellen stattfindenden Vorgang zu unterscheiden ist. Unter der spontanen Akrosomreaktion

versteht man Spermien, die ohne Einfluss von ZP oder bestimmten Substanzen (z.B. Lyso-

Phosphatidylcholin, Heparin, Hyaluronsäure etc.) eine Auflösung der äußeren Membranen

aufweisen. Die durch Agonisten induzierte Akrosomreaktion findet mit größter Effizienz an

ZP derselben Spezies innerhalb weniger Minuten nach Erreichen des Kapazitationszustandes

statt (YANAGIMACHI 1994). Die spontane Akrosomreaktion verläuft hingegen eher

langsam. Ein Ansatzpunkt zur Unterscheidung dieser beiden Arten einer Akrosomreaktion ist,

parallel zur Akrosomreaktion eine Vitalfärbung der Spermien einzusetzen.

Dies war aber in den hier beschriebenen Bindungstests nicht möglich. Die aufgrund des

zügigen Ablaufs der ZP-induzierten Akrosomreaktion gewählten Beobachtungszeitpunkte von

einer, zehn und zwanzig Minuten machten eine Konservierung des Spermienstatus nötig, da

in den Zwischenzeiten die ZP mit den gebundenen Spermien nicht ausgewertet werden

konnte. Durch die Fixierung (mit 2,5% Glutardialdehyd) kommen die Spermatozoen in einen

avitalen Zustand, der sich in einer Propidiumjodid positiven Anfärbung darstellt. Diese

Anfärbung konnte folglich innerhalb der Bindungstests nur als reine Zählfärbung eingesetzt

werden (vgl. FLESCH et al. 2001). Die parallel untersuchte Spermienkontrollsuspension ohne

ZP wurde nicht fixiert. Bei den gleichzeitig durchgeführten Färbungen mit Propidiumjodid

und PNA-FITC wurden als Zeichen der spontanen Akrosomreaktion nur Spermien

beobachtet, die, wenn sie PNA-FITC positiv waren, auch durch Propidiumjodid markiert

wurden. Allerdings ist es auch schwierig, eine induzierte Akrosomreaktion (z.B. durch Lyso-

Phosphatidylcholin) in Suspension nachzuweisen, da flowzytometrische Untersuchungen

zeigten, dass der Zeitraum von der Induzierung der Akrosomreaktion bis zum Zelluntergang

sehr kurz ist (ASCHWORTH et al. 1995). Eine Erfassung ist daher nur im

E Diskussion________________________________________________________________

106

flowzytometrischen Diagramm und nicht in der Beurteilung von Spermienpräparaten aus

Suspensionen möglich.

Zur Vermeidung von Bindungen avitaler Spermien und Spermienaggregationen an die ZP

wurde mit einer Minute eine sehr kurze Koinkubationszeit gewählt. Es ist davon auszugehen,

dass daher nur kapazitierte, akrosomintakte Spermatozoen an die jeweilige ZP gebunden

haben. Trotzdem wurde in einem Rechenmodell bei allen drei Beboachtungszeitpunkten der

Ausgangswert bei einer Minute der in spontaner Akrosomreaktion befindlichen Spermien

innerhalb der Kontrollsuspension von dem Wert der PNA-FITC positiven gebundenen

Spermien abgezogen. Um auch die Möglichkeit zu berücksichtigen, dass eben doch der

gleiche Anteil der Spermien an der ZP, wie der in der Suspension, degenerativen Prozessen

unterliegt, wurde noch eine weitere Rechnung aufgestellt. Den Anteilen der

akrosomreagierenden Spermien an der ZP wurde der zu jedem Zeitpunkt entsprechende

Anteil in der Kontrollsuspension abgezogen. Welches Modell nun den Tatsachen entsprechen

mag, ist für den dargestellten Einfluss gereifter ZP nicht von größerer Bedeutung. Eine

beschleunigte Akrosomreaktion an der gereiften ZP innerhalb der ersten zehn Minuten war in

jedem Berechnungsmodell zu beobachten.

Somit konnte mit den Studien zur Induktion der Akrosomreaktion neben dem pI-Shift ein

weiterer Hinweis für Veränderungen der Zona pellucida während der IVM erbracht werden.

Ansatzpunkte zur Erklärung der beschleunigten Induktion der Akrosomreaktion durch die

Zona pellucida in vitro gereifter Oozyten

Für Aussagen über die Art der funktionellen Veränderungen der Zona pellucida während der

In-vitro-Reifung muss die Vermittlung der Spermienbindung an die ZP betrachtet werden.

Am besten untersucht sind dabei die Vorgänge bei der Maus. ZPC wurde als primärer

Spermienrezeptor identifiziert (BLEIL u. WASSARMAN 1980b) und α-Galaktosereste am

nicht reduzierten Ende von O-glykosidischen Kohlenhydraten als Spermienrezeptoren

proklamiert (BLEIL u. WASSARMAN 1988). In den folgenden Jahren wurden noch weitere

Zucker der O-Glykane der ZPC auf ihre Interaktionen mit murinen Spermien untersucht.

NIXON et al. (2001) beschreiben so, dass mindestens vier unterschiedliche

E Diskussion

107

Monosaccharidreste an der primären Spermienbindung beteiligt sind, nämlich α-Galaktose, β-

N-Acetylglukosamin, Fucose und Mannose. Weiterhin bestehen Hinweise, dass auch bei der

Maus Strukturen der N-glykosidischen Kohlenhydrate an der Gametenerkennung beteiligt

sein können (YAMAGATA 1985), wie es beim Schwein der Fall ist (NAKANO u.

YONEZAWA 2001).

Zunächst wurde im porcinen Organismus den O-Glykanen von ZPB eine Rezeptoraktivität

zugesprochen (YUREWICZ et al. 1992). In neueren Untersuchungen (NAKANO u.

YONEZAWA 2001) konnte jedoch gezeigt werden, dass die neutralen N-Glykane des

gesamten ZPB/ZPC Komplexes eine Bindungsaffinität für Spermatozoen besitzen. Innerhalb

der Kohlenhydratketten vom komplexem Typ wird den tri- und tetraantennären Ketten eine

größere Bindungsaffinität als den diantennären Ketten attestiert. Dominierend scheinen dabei

die Saccharide zu sein, die mit Asn220 in der N-terminalen Region von endo-β-

Galaktosidase-gespaltenen ZPB verknüpft sind. Den Strukturen von ZPC kommt eher eine

unterstützende Funktion zu.

Die beschriebenen Kohlenhydratketten sind für die primäre Bindung des Spermiums an die

Zona pellucida zuständig. Eventuell finden an der ZP während des Reifungsprozesses

Veränderungen statt, welche die Interaktion der Gameten optimiert. Die lektinologischen

Analysen wiesen keine Unterschiede in der Verteilung der untersuchten Zuckerstrukturen auf.

Eine für die Spermien günstigere Präsentation der Rezeptoren auf der Oberfläche der intakten

ZP wäre denkbar. Allerdings spricht die ähnliche Ausgangslage des Spermienstatus bei

ungereifter und gereifter ZP zum Zeitpunkt von einer Minute im Bindungstest nicht unbedingt

für eine veränderte Rezeptorpräsentation.

Es muss folglich der weitere Schritt, nämlich die Induktion der Akrosomreaktion und die

dafür verantwortlichen Strukturen betrachtet werden.

Bei der Maus ist dafür wiederum ZPC verantwortlich (WASSARMAN u. LITSCHER 2001).

Durch die Verbindung von β(1-4)-Galaktosyltransferasen (GalT) auf der Spermienmembran

durch ZPC wird ein pertussistoxin-sensitives G-Protein aktiviert. Dieses ist direkt mit der

entsprechenden GalT-Domäne im Zytoplasma verbunden, welche die Akrosomreaktion

auslöst (GONG et al. 1995). NIXON und Mitarbeiter (2001) sehen in Polymeren von N-

Acetylglukosamin (GlcNAc) die für die Klusterbildung der GalT verantwortliche Struktur.

Bei anderen Tierarten, eventuell auch zusätzlich bei der Maus, scheint die Peptidstruktur vom

E Diskussion________________________________________________________________

108

Glykoprotein ZPC für die Auslösung der Akrosomreaktion bedeutender zu sein als die

Kohlenhydratstruktur. Der Nachweis der Induzierbarkeit der Akrosomreaktion durch

synthetische Peptide basierend auf einer Aminosäurensequenz von ZPC bei bovinen

Spermatozoen untermauert diese Vermutung (HINSCH 1998).

Für das Schwein fehlen noch genauere Angaben über die Auslösung der Akrosomreaktion.

Die vorliegenden Ergebnisse weisen darauf hin, dass innerhalb der ZP während der IVM

Vorgänge ablaufen, die das Vermittlungs- und Aktivierungssystem zur Induktion der

Akrosomreaktion so konditioniert, dass diese Prozesse schneller und effektiver ablaufen

können.

5. Unterschiede zwischen der ZP von in vitro und in vivo gereiften Oozyten

Bei den in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnissen ist zu berücksichtigen, dass in den Versuchen

die Eizellen unter In-vitro-Bedingungen gereift wurden. Bei Rückschlüssen über Verhältnisse

in vivo ist zu beachten, dass sich die Zonae pellucidae von in vivo gereiften Oozyten von

denen der in Kultur gereiften Oozyten unterscheiden.

Beim Vergleich von IVM Oozyten gewonnen aus Schlachtmaterial mit ovulierten, in vivo

gereiften Oozyten, die am zweiten Tag des Östrus der Sauen aus deren Eileitern gespült

worden waren, wiesen die jeweiligen ZP Unterschiede auf (WANG et al. 1998). Die Dicke

der ZP ovulierter Eizellen (17,9 ± 2,4 µm) war statistisch hoch signifikant (p < 0,001) erhöht

im Vergleich zu der ZP von in vitro gereiften (14,9 ± 2,1 µm). Weiterhin ließ sich die ZP der

IVM Oozyten mit 0,1%iger Pronase innerhalb von 2-2,5 Minuten auflösen, welches mit der

ZP der aus dem Ovidukt gespülten Eizellen innerhalb von zwei Stunden nicht gelang. Als

mögliche Ursache postulieren die Autoren die Einlagerungen von Sekretionsprodukten des

Eileiterepithels in die ZP. Dazu passen die Beobachtungen von DUBY und Mitarbeitern

(1997), dass der Kontakt von boviner ZP mit Eileitern von Rindern oder Schafen die ZP vor

Pronaseverdauung schützt. Die Einlagerung von weiteren Glykoproteinen kann auch als

Ursache für eine veränderte Lektinbindungsaktivität möglich sein. In den angesprochenen

Versuchen von WANG und Mitarbeitern (1998) wies die ZP ovulierter Oozyten eine

E Diskussion

109

intensive PNA Markierung auf. Bei der ZP von IVM Oozyten wurden keine Signale

beobachtet. Diese Untersuchungen wurden mit intakten, fixierten Eizellen und FITC

konjugiertem PNA durchgeführt. Zur weiteren Klärung des Einflusses von

Sekretionsprodukten des Oviduktes wäre die vergleichende Untersuchung der ZP von in vivo

gereiften und aus Follikeln punktierten Eizellen sinnvoll.

Aufgrund der geschilderten Verhältnisse ist es anzunehmen, dass der hier nachgewiesene pI-

Shift der Glykoproteine der ZP von GV I Stadien zu denen der ZP von IVM M II Stadien in

der 2D-PAGE unter in vivo Bedingungen noch größer sein könnte. Innerhalb der Säugetiere

unterliegt die Eizelle von der GV I Phase über die Reifung und der Ovulation bis kurz vor

dem Kontakt mit dem Spermium noch dem Weg durch Abschnitte des Ovidukts. Die unter

den geschilderten Bedingungen nachgewiesenen Veränderungen, wie pI-Shift und

beschleunigte Induktion der Akrosomreaktion bei der ZP von IVM Oozyten, könnten in vivo

noch durch weitere Umgestaltungen ergänzt bzw. verstärkt sein.

6. Abschlussbetrachtung und Ausblick

Die Erforschungen molekularer Vorgänge innerhalb dieser Arbeit gehören zum Bereich der

Grundlagenforschung. Diese sind auf dem Gebiet der Gameteninteraktionen notwendig, um

physiologische Prozesse besser zu verstehen. Erst dann sind Eingriffe zur Behebung von

physiologischen Fehlleistungen und Optimierungen von In-vitro-Systemen möglich.

Es konnte gezeigt werden, dass bei der In-vitro-Maturation bereits Veränderungen an der ZP

ablaufen. Diese treten in Erscheinung als vermehrte Acidität der Glykoproteine innerhalb der

isoelektrischen Fokussierung. Weiterhin ist die ZP von gereiften Oozyten in der Lage, die

Akrosomreaktion an homologen Spermien schneller zu induzieren als die der ungereiften. In

der lektinologischen Analyse konnten keine Hinweise erhoben werden, dass der pI-Shift

durch veränderte Kohlenhydratstrukturen oder vermehrte Sialylierung hervor gerufen wird.

In anschließenden Versuchen sollte daher besonders der Grad der Sulfatierung der ZP von

Oozyten unterschiedlichen Reifungstatus im Vordergrund stehen. Vergleichende

Untersuchungen von nativer und desulfatierter ZP, sowohl ungereifter als auch gereifter

E Diskussion________________________________________________________________

110

Oozyten, sollten durchgeführt werden. Analysen mittels 2D-PAGE und funktionelle

Bindungstest zur Induktion der Akrosomreaktion könnten dazu beitragen, die Rolle der

Sulfatreste bezüglich der ZP-Reifung und der Gameteninteraktionen aufzuklären. Aufgrund

der beschriebenen Unterschiede zwischen der ZP von in vitro und in vivo gereiften Oozyten

wären auch Untersuchungen zu diesen Differenzen interessant. Die in vivo gereiften Oozyten

lassen sich wiederum nochmals unterteilen, nämlich in aus antralen Follikeln aspirierten und

aus Eileitern gespülten Oozyten.

In dieser Arbeit wird die Komplexität und enorme Vielfalt bezüglich der Fertilitätsvorgänge

deutlich. Es kommt stets auf das Zusammenspiel unterschiedlichster Faktoren an, die bei den

einzelnen Tierarten auch recht unterschiedlich sein können. Dennoch ist das Schwein als

Modelltier mit Hinblick auf die Humanmedizin von großer Bedeutung. Es steht dem

Menschen entwicklungsgeschichtlich näher als z.B. die Maus, welche auch bezogen auf die

Morphologie der ZP größere Differenzen zur humanen ZP als die porcine ZP aufweist. Die

geschilderten Studien und deren weiterführende Untersuchungen am Modelltier Schwein sind

sinnvoll, um Methoden zu etablieren und Tendenzen zu erfassen, die dann auf den Menschen

übertragen werden können. Dort besteht ein großer Bedarf daran, Antworten auf bisher

ungeklärte Infertilitäten, Optimierungsansätzen von In-vitro-Techniken und neue

Möglichkeiten zur Kontrazeption zu erhalten.

F Zusammenfassung

111

F Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit war es, die porcine Zona pellucida (ZP) näher zu charakterisieren, mit

besonderem Blick auf mögliche biochemische und funktionelle Veränderungen während der

In-vitro-Maturation.

Als Untersuchungsmaterial standen Ovarien zahlreicher frisch geschlachteter Jungsauen zur

Verfügung. Nach der Gewinnung der Oozyten wurde entweder die ZP direkt isoliert oder die

Oozyten wurden zunächst einer In-vitro-Maturation unterzogen.

Die drei Glykoproteine der porcinen Zona pellucida wurden mittels ein- und

zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophrose (1D- u. 2D-PAGE) aufgetrennt. Es folgte

eine immunologische und lektinologische Analyse der durch die PAGE separierten

Glykoproteine der ZP. Diese Studien wurden sowohl mit ZP ungereifter als auch gereifter

Oozyten durchgeführt. Weiterhin wurde ebenfalls mittels Lektinen die Verteilung der

Kohlenhydratketten über die Oberfläche der ZP in rasterelektronenmikroskopischen

Aufnahmen von intakten Oozyten untersucht.

Zur Klärung funktioneller Aspekte innerhalb der Veränderungen der ZP während der In-vitro-

Maturation wurde ein Spermien-ZP-Bindungstest entwickelt. Mit diesem konnte die

Induzierbarkeit der Akrosomreaktion vergleichend von ZP ungereifter und gereifter Oozyten

untersucht werden. Der akrosomale Status der Spermien wurde mit dem Lektin PNA, das an

einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt war, ermittelt. Für die Bindungstests wurden

Frischejakulate eines institutseigenen Ebers und kryokonservierte Nebenhodenspermien einer

Charge verwendet.

Folgende Ergebnisse wurden erzielt:

In der 2D-PAGE wurde bei der ZP von gereiften Oozyten im Vergleich zur Auftrennung von

ungereiften ein pI-Shift von ca. einer pI-Einheit festgestellt. Diese Zunahme der Acidität stellt

sich mit einer Differenz von ca. zwei pI-Einheiten innerhalb der lektinologischen Analyse

noch deutlicher dar.

F Zusammenfassung__________________________________________________________

112

Im Lektinblot konnte gezeigt werden, dass mannosehaltige Strukturen innerhalb von

diantennären Seitenketten ausgeprägt im Glykoprotein ZPA vorliegen und bei ZPB/ZPC

durch Con A nicht erkannt werden.

Mit SNA, MAA II und ACA wurde unterschiedlich verknüpfte Sialsäure nachgewiesen.

Durch das Lektin AAA konnte der für das Schwein typische hohe Fukosylierungsgrad der ZP

nachvollzogen werden.

Ein negatives Ergebnis in der lektinologischen Untersuchung erhielt man nur für den

Nachweis von terminaler Galaktose (PNA u. GS I).

Das ermittelte Lektinbindungsverhalten wies keine Unterschiede bei ungereifter und gereifter

ZP auf.

Innerhalb der rasterelektronenmikroskopischen Analysen konnte das Mengenverhältnis von

Con A und AAA positiven Strukturen aus dem Lektinblot bestätigt werden.

Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die ZP während der In-vitro-Maturation

Prozessen unterliegt, die eine Funktionsänderung hervorrufen.

Die In-vitro-Reifung bewirkte statistisch signifikant eine beschleunigte Induktion der

Akrosomreaktion durch die ZP. Dies wurde für die ersten zehn Minuten nach der Bindung der

Spermien an die ZP gezeigt. Nach weiteren zehn Minuten erfolgte eine Angleichung an die

Verhältnisse bei der ungereiften ZP.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die ZP schon während der Maturation und nicht erst nach der

Fertilisation nachweisbaren Veränderungen unterliegt. Bezüglich des pI-Shifts konnten keine

Hinweise erhoben werden, dass dieser durch veränderte Kohlenhydratstrukturen oder eine

vermehrte Sialylierung bewirkt wird. Die erhöhte Acidität der ZP Glykoproteine von gereiften

Oozyten könnte durch eine gesteigerte Sulfatierung hervorgerufen werden. Dies ist in

weiterführenden Untersuchungen abzuklären. Weiterhin muss überprüft werden, inwiefern

sich diese Ergebnisse vom In-vitro-Modell auf die Verhältnisse in vivo übertragen lassen und

ob dort noch umfangreichere Veränderungen auftreten.

G Summary

113

G Summary

Silja Ebeling:

Characterization of the porcine zona pellucida and the changes during in vitro maturation.

The aim of this study was to characterize the porcine zona pellucida (ZP) with a special view

of potential biochemical and functional changes during in vitro maturation.

Ovaries from many freshly slaughtered young sows were available as research-material. After

winning the oocytes either the ZP was isolated directly or first the oocytes were subjected to

in vitro maturation.

The three glycoproteins of the porcine zona pellucida were divided by one- and

twodimensional polyacrylamid-gelelectrophoresis (1D- and 2D-PAGE). An immunologic and

lectinologic analysis of the separated ZP glycoproteins was followed. This studies were

carried out as well with ZP of immatured as with matured oocytes. Further the distribution of

carbohydrates chains over the ZP surface was investigated by lectins in a scanning electron

microscopy assay with entire oocytes.

A spermatozoa-ZP-binding test was developed to find out functional aspects within the

changes of ZP during in vitro maturation. Using this test it was possible to investigate

comparatively the inducing of acrosome reaction by ZP from immatured and matured oocytes.

The acrosome status was determined with lectin PNA, which was conjugated with a

fluorescence dye. For the binding tests fresh ejakulated spermatozoa of an institute own boar

and kryoconserved epididymal spermatozoa of one population were used.

Following results were achieved: A pI-shift of about one pI unit was found out in comparsion from separated ZP proteins of

immatured to matured oocytes by 2D-PAGE. This increased acidic was expressed with a

more distinct difference of about two pI units within the lectionologic analysis.

G Summary_________________________________________________________________

114

The lectinblot with Con A has shown, that structures including mannose in diantennary chains

exist in glycoprotein ZPA and were not recognized in ZPB/ZPC.

Using SNA, MAA II and ACA differently connected sialic acid was proved.

The typical high fucosed degree of pig ZP was shown by the lectin AAA.

In the lectinologic examination a negativ result was got only for terminal galactose (PNA and

GS I).

Within scanning electron microscopy analysis the quantitative distribution of Con A to AAA

positive structures was confirmed with the results of the lectinblot.

Further it could be shown, that the ZP undergoes proceedings during in vitro maturation,

which caused an altered function.

Maturation results in a statistical significantly accelerated induction of acrosome reaction by

ZP. This was shown for the first ten minutes after sperm binding at the ZP. After further ten

minutes there was following an adjustment on the relations of the matured ZP.

This results showed, that the ZP already undergoes demonstrable changes during maturation

not only after fertilization. No information were found relating to the pI-shift, that it was

caused by changed carbohydrate structures or multiply sialylation. The increased acidic of ZP

glycoproteins from matured oocytes could be produced by an additional sulfation. This case

has to be cleared by continued examinations. Further it must be checked in what way the

results of an in vitro model could be transfer on in vivo relations and if there would be found

more extensive alterations.

H Literaturverzeichnis

115


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Eigene Veröffentlichung: EBELING, S., P. SCHWARTZ, H.W. MICHELMANN, M. EKHLASI-HUNDRIESER, A.M. PETRUNKINA u. E. TÖPFER-PETERSEN (2002): Characterization of the porcine zona pellucida during in vitro maturation. in: 35th Annual Meeting on Physiology and Pathology of Reproduction, 27th Veterinary-Human Medical Communal Meeting, Leipzig, 2002 Dt. Veterinärmed. Ges., Gießen

J Anhang___________________________________________________________________

136

J Anhang

1. Rezeptverzeichnis

Alle Chemikalien stammen von Merck, Darmstadt, soweit nicht anders angegeben. Pufferlösungen: PBS (Phosphat buffered saline): 154 mM NaCl; 9,1 mM Na2HPO4; 2,71 mM KH2PO4; pH-Wert 7,4

TBS (Tris buffered saline): 50 mM Tris; 150 mM NaCl; pH-Wert 7,5 Physiologische Kochsalzlösung:

0,9% NaCl (154 mM) Oozytenpuffer: 10 mM Na2HPO4; 125 mM NaCl; 3 mM Na3-Citrat x 2 H2O; 2 mM EDTA; 10 mM NaH2PO4 pH-Wert 7,0-7,4 Hyperosmolare Salzlösung: 1,5 M MgCl2 x 6 H2O; 40 mM Hepes; 0,1% Dextran pH-Wert 7,0-7,4 Percoll-Lösungen: a. Stammlösung 90% Original-Percoll-Lösung (Sigma Diagnostics, Taufkirchen) 10% physiolog. Kochsalzlsg

b. 40% Percoll-Lsg 40% Stammlsg 60% physiolog. Kochsalzlsg

c. 20% Percoll-Lsg 20% Stammlsg 80% physiolog. Kochsalzlsg

d. 10% Percoll-Lsg 10% Stammlsg 90% physiolog. Kochsalzlsg

J Anhang

137

Spül- und Waschmedium für Oozyten bzw. Zonae pellucidae (PBS/PVA):

PBS/ 2% PVA (w/v)

Maturationsmedium NCSU 37 (PETTERS u. WELLS 1993):

1,7 mM CaCl2 x 2 H2O; 0,6 mM Cystein; 10 ng/ml EGF; 5,6 mM Glucose; 1,0 mM Glutamin; 10% immature Follikelflüssigkeit; 5,0% Insulin; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO4 x 6 H2O; 108,7 mM NaCl; 25,1 mM NaHCO3; 100 IE/l Penicillin G; 12 mM Sorbitol; 50 mg/l Streptomycin

für die ersten 24 h zusätzliche Supplementierung von: 1,0 mM db-cAMP; 10 IE/l hCG; 10 IE/l PMSG

Polyacrylamidgele:

10% Trenngel: 30% Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe): 3,3 ml 1,5 M Tris/HCl pH 8,8: 2,5 ml 10 ml 10% SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe): 100 µl Aqua bidest.: 4,0 ml TEMED (Serva, Heidelberg): 4 µl 40% Ammoniumpersulfat (Serva, Heidelberg):100 µl

4,5% Sammelgel: 30% Acrylamidlösung (Roth, Karlsruhe): 0,5 ml 1,0 M Tris/HCl pH 6,8: 0,38 ml 3 ml 10% SDS Ultrapure (Roth, Karlsruhe): 30 µl Aqua bidest.: 2,1 ml TEMED (Serva, Heidelberg): 3 µl 40% Ammoniumpersulfat (Serva, Heidelberg): 30 µl

TEMED und Ammoniumpersulfat werden jeweils erst nach 5minütigem Entlüften im Ultraschallbad hinzugefügt.

Laemmli-Auftragspuffer (nach LAEMMLI 1970):

50 mM Tris pH 6,8; 2% SDS (w/v); 10% Glycerin;1 Spatelspitze Bromphenolblau

Elektrodenlauf-Puffer:

25 mM Tris; 192 mM Glycin; 0,1% SDS (w/v)

J Anhang___________________________________________________________________

138

Isoelektrische Fokussierung: Rehydrationslsg: 9 M Harnstoff; 2% CHAPS; 0,5% IPG Puffer Äquilibrierlsg a: 6 M Harnstoff; 2% SDS (w/v); 2,5 ml 0,5 M Tris/HCl pH 6,8 30% Glycerin (w/v) Äquilibrierlsg I: a + 65 mM DTT (Dithiothreitol; AppliChem, Darmstadt) Äquilibrierlsg II: a + 0,24 M Jodacetamid (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) Silberfärbung (mod. nach HEUKESHOVEN 1988): Fixierlsg: 12,5% Trichloressigsäure

Inkubationslsg:17,01 g Natriumacetat-3-hydrat; 5 ml Glutaraldehyd 25%; 1,24 g Natriumthiosulfat-5-hydrat ad 250 ml Aqua bidest.

Färbelsg: 0,5 g AgNO3; 0,05% Formaldehyd ad 500 ml

Entwickler: 12,5 g Na2CO3; 0,01% Formaldehyd ad 500 ml, pH 11,5

Stopplsg: 0,05 M Glycin (3,75 g/l)

Blottingpuffer:

0,039 M Glycin; 0,048 M Tris; 0,0375% SDS (w/v); 20% Methanol (v/v)

Ponceaufärbelösung:

0,5% Ponceau Rot (Roth, Karlsruhe) in 1% Essigsäure

TBS/ Tween:

TBS, 1% Tween (v/v)

Androhep-Puffer:

20 mM Hepes pH 7,4; 1,5 mM CaCl2 ; 1 mM MgCl2 ; 95 mM NaCl; 1 mM K2HPO4; 5 mM Glucose; 60 mM Saccharose; 5 mM Natriumpyruvat; 0,5% BSA

Tyrodemedium, mod. (Zusammensetzung nach HARRISON 1993):

96,0 mM NaCl; 3,1 mM KCl; 2,0 mM CaCl2 ; 0,4 mM MgSO4 x 6 H2O; 0,3 mM Na2PO4; 5,0 mM Glucose; 21,6 mM Na-lactat; 1,0 mM Na-pyruvat; 15,0 mM NaHCO3 ; 20,0 mM Hepes; 0,3% BSA; 0,001% Phenolrot; pH 7,4

J Anhang

139

2. Tabellen zur Auswertung der funktionellen Bindungstests

Tab. 9: Parameter der an die ZP gebundenen Spermien

a. ejakulierte Frischspermien an Zona pellucida verschiedenen Reifungsgrades

Parameter Mittelwert (%)

Standard- abw.

Minimum

Maximum

1 min 51,9 27,7 8,00 93,0

10 min 42,6 26,5 9,00 117

Anzahl der an ZP gebundenen Spermien 20 min 44,3 24,1 7,00 89,0

1 min 1,46 2,01 0,00 7,69

10 min 2,24 2,89 0,00 11,1

Spermien an ZP mit abgelöster Kappe (%) 20 min 2,83 2,94 0,00 12,5

1 min 6,45 10,2 0,00 52,6

10 min 20,6 24,9 3,85 122

isolierte PNA-FITC pos. Kappen an ZP (%) 20 min 31,3 49,5 6,74 214

1 min 22,6 7,69 10,9 42,1

10 min 34,2 12,2 11,1 54,5

Spermien an ungereifter ZP von Oozyten im Kernstadium GV I

PNA-FITC pos. Spermien an ZP (%) 20 min 46,5 16,0 25,5 100

1 min 47,7 23,3 9,00 98,0

10 min 41,2 18,8 12,0 81,0

Anzahl der an ZP gebundenen Spermien 20 min 45,7 21,0 6,00 79,0

1 min 2,16 2,84 0,00 11,1

10 min 2,69 2,93 0,00 8,70

Spermien an ZP mit abgelöster Kappe (%) 20 min 2,68 1,96 0,00 7,14

1 min 3,27 2,63 0,00 8,51

10 min 16,5 11,6 2,94 50,0

isolierte PNA-FITC pos. Kappen an ZP (%) 20 min 11,4 6,00 0,00 25,5

1 min 20,2 6,40 5,00 34,0

10 min 42,2 15,1 20,0 83,3

Spermien an gereifter ZP von Oozyten im Kernstadium M II

PNA-FITC pos. Spermien an ZP (%) 20 min 42,3 9,17 24,7 58,3

J Anhang___________________________________________________________________

140

b. aufgetaute Nebenhodenspermien an Zona pellucida unterschiedlichen Reifungsgrades

Parameter

Mittelwert (%)

Standard- abw.

Minimum

Maximum

1 min 23,3 9,28 9,00 49,0

10 min 53,3 46,3 6,00 152

Anzahl der an ZP gebundenen Spermien 20 min 56,6 59,7 13,0 213

1 min 1,04 1,60 0,00 4,17

10 min 2,29 2,79 0,00 10,0

Spermien an ZP mit abgelöstem Kappe (%) 20 min 2,99 3,01 0,00 11,5

1 min 18,2 16,7 0,00 50,0

10 min 23,8 19,3 0,00 100

Isolierte PNA-FITC pos. Kappen an ZP (%) 20 min 27,0 16,0 4,76 61,5

1 min 36,2 11,8 20,0 66,7

10 min 36,7 10,5 15,3 70,0

Spermien an ungereifter ZP von Oozyten im Kernstadium GV I


1 min 17,3 6,50 7,00 32,0

10 min 44,7 53,1 8,00 180

Anzahl der an ZP gebundenen Spermien 20 min 44,1 56,5 7,00 176

1 min 1,21 2,05 0,00 5,26

10 min 2,65 3,37 0,00 9,52

Spermien an ZP mit abgelöstem Kappe (%) 20 min 8,74 15,4 0,00 70,6

1 min 19,0 23,0 0,00 85,7

10 min 19,3 17,6 0,00 61,9

Isolierte PNA-FITC pos. Kappen an ZP (%) 20 min 60,7 81,6 0,00 70,6

1 min 36,6 20,1 13,0 64,6

10 min 45,1 10,5 22,2 62,5

Spermien an gereifter ZP von Oozyten im Kernstadium M II


J Anhang

141

Tab. 10: Parameter der Spermien in der Kontrollsuspension ohne ZP

a. ejakulierte Frischspermien Variable Mittelwert (%) Standardabw. Minimum Maximum

5,04 0,64 4,00 6,00 patholog. Abweichungen (%)

davon Plasmatropfen (%) 1.43 0,84 1,00 3,00

1 min 80,9 2,79 75,0 85,0

10 min 66,4 4,88 60,0 70,0

Motilität (vorwärts- u. orts- beweglich in %) 20 min 62,5 5,87 55,0 70,0

1 min 9,07 5,14 3,00 16,0

10 min 16,8 5,33 11,0 26,0

PI pos. (%) ; PNA-FITC neg. (%)

20 min 19,7 3,97 14,0 28,0

1 min 7,78 3,02 4,00 13,0

10 min 13,3 3,09 8,00 17,0

PNA-FITC pos. (%) 20 min 18,8 3,01 15,0 24,0

b. aufgetaute Nebenhodenspermien Variable Mittelwert (%) Standardabw. Minimum Maximum

36,8 1,89 35,0 40,0 patholog. Abweichungen (%)

davon Plasmatropfen (%) 25,4 1,91 22,0 27,0

1 min 64,4 3,38 60,0 70,0

10 min 54,7 3,62 50,0 60,0

Motilität (vorwärts- u. orts- beweglich in %) 20 min 49,5 3,59 45,0 55,0

1 min 11,8 5,22 7,00 21,0

10 min 10,7 1,68 8,00 12,0

PI pos. (%) ; PNA-FITC neg. (%)

20 min 11,2 2,52 8,00 15,0

1 min 25,2 2,88 22,0 29,0

10 min 32,1 1,62 30,0 34,0

PNA-FITC pos. (%) 20 min 38,9 1,61 37,0 41,0

J Anhang___________________________________________________________________

142

3. Multifaktorielle Varianzanalyse

Erläuterungen zur multifaktoriellen Varianzanalyse der Einflüsse auf den Anteil der PNA-

FITC positiven Spermien:

p entspricht der Irrtumswahrscheinlichkeit und R² dem Bestimmungsmaß

(p mit p≤0,001 = statistisch hoch signifikant = **; p≤0,05 = statistisch signifikant = *; p≤0,1 = statistisch auffallend = (*))

Dreifaktorielle Varianzanalyse

Korrelation von Spermienpopulation, Reifungsstatus der ZP und Beobachtungszeitpunkt

Signifikanz des Modells: 0,0001; R² = 0,31

Einfluss der einzelnen Parameter:

Spermienpopulation p=0,001** Reifungsstatus der ZP p=0,021* Zeitpunkt p=0,0001** Reifungsstatus x Zeitpunkt p=0,106 Spermienpopulation x Zeitpunkt p=0,038* Spermienpopulation x Reifungsstatus x Zeitpunkt p=0,177

Zweifaktorielle Varianzanalyse

Korrelation von Reifungsstatus und Beobachtungszeitpunkt bei einheitlicher

Spermienpopulation

Signifikanz des Modells bei a. ejakuliertes Frischsperma: 0,0001**; R² = 0,42 b. aufgetautem TG-Sperma: 0,0134*; R² = 0,11


Reifungsstatus der ZP a. p=0,583 b. p=0,008* Zeitpunkt a. p=0,0001** b. p=0,094(*)

Reifungsstatus x Zeitpunkt a. p=0,028* b. p=0,226

J Anhang

143

Korrelation von Spermienpopulation und Beobachtungszeitpunkt bei einheitlichem Reifungsstatus der Zona pellucida

Signifikanz des Modells bei a. ungereifter ZP: 0,0001**; R² = 0,27 b. gereifter ZP: 0,0001**; R² = 0,34


Spermienpopulation a. p=0,152 b. p=0,001** Zeitpunkt a. p=0,0001** b. p=0,0001** Spermienpopulation x Zeitpunkt a. p=0,0001** b. p=0,056(*)

Einfaktorielle Varianzanalyse

einheitliche Parameter in der Beobachtungsgruppe

Einflussparameter auf PNA-FITC pos. Anteil

p

R²

Zeitpunkt 1 min 0,273 0,027

Zeitpunkt 10 min 0,044* 0,082

ejakulierte

Frischspermien Zeitpunkt 20 min

Reifungsstatus

der ZP 0,301 0,024

Zeitpunkt 1 min 0,944 0,0001

Zeitpunkt 10 min 0,013* 0,14

kryokonservierte

Nebenhodenspermien Zeitpunkt 20 min

Reifungsstatus der ZP

0,017* 0,13

Frischspermien 0,0001** 0,39 ungereifte ZP Nebenhodenspermien

Zeitpunkt 0,796 0,0064

Frischspermien 0,0001** 0,47 gereifte ZP Nebenhodenspermien

Zeitpunkt 0,573 0,10

K Danksagung_______________________________________________________________

144

K Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich hiermit herzlichst bei Frau Prof. Dr. Dr. Edda Töpfer-

Petersen für die Überlassung des interessanten Themas, die freundliche Aufnahme im Institut

für Reproduktionsmedizin, die persönliche Betreuung und die motivierende Unterstützung bei

der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.

Mein besonderer Dank geht an Frau Dr. Anna M. Petrunkina für ihr freundliches Engagement

und die tatkräftige Unterstützung bei der statistischen Auswertung der entsprechenden

Versuchsteile.

Herrn Prof. Dr. D. Rath danke ich für die Aufnahme in seiner Arbeitsgruppe innerhalb des

Institutes für Tierzucht und Tierverhalten der FAL Mariensee für die Erstellung der in vitro

gereiften Oozyten. Stellvertretend für alle seine Mitarbeiter danke ich Antje Frenzel und Dr.

Sabine Probst für die freundliche und entgegenkommende Hilfeleistung.

Herrn Dr. P. Schwartz und Herrn Prof. Dr. H. W. Michelmann (Georg-August-Universität

Göttingen) sei für die Kooperation bei der REM-Analyse herzlich gedankt.

Bei allen Mitarbeitern des Institutes für Reproduktionsmedizin, insbesondere aus dem Werk

II, möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit und die stete Bereitschaft, viele kleine und

große Fragen auch zwischendurch zu beantworten, bedanken.

Mein persönlicher und sehr herzlicher Dank gilt den Mitarbeitern meiner Arbeitsgruppe für

die große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit.

Dank Christiane Hettel, Dr. Mahnaz Ekhlasi-Hundrieser, Bianca Oldendorf und Christine

Kochel und meinen Mitdoktoranden Dr. Andrea Wagner, Bettina Thomas und Katrin Gohr

konnte ich stets in einer sehr angenehmen Atmosphäre arbeiten. Die mir entgegengebrachte

Freundlichkeit über die reine Zusammenarbeit hinaus und die unterhaltsamen zusammen

verbrachten Stunden werde ich nicht vergessen.

_______________________________________________________________K Danksagung

145

Ein großes Dankeschön geht an Edith Podhajsky und Monika Gümmer für ihre allzeit

vorhandene Hilfsbereitschaft und tatkräftige Unterstützung bei der Zonaisolierung und allen

Fragen rund um die Eizelle.

Den Doktoranden des Schweinelabors danke ich für die jederzeit gewährte Hilfe bei der

Gewinnung der Eberejakulate. Hier sei auch Sven für seine konstante und qualitativ

hochwertige Mitarbeit gedankt.

Ganz herzlich bedanke ich mich bei meiner Familie für die finanzielle Ermöglichung von

Studium und Promotion.

Weiterhin danke ich für das Korrekturlesen diverser von mir verfasster Schriftstücke.

Er sieht die Störche fliegen, sieht sich selbst in ihrem Reigen, frei und schwerelos, durch die eigne Kunst, ins Sonnenlicht aufsteigen!

Du kannst fliegen, ja, Du kannst! Laß den Wind von vorne weh’n, breite die Flügel, Du wirst seh’n: Du kannst fliegen, ja, Du kannst!

(R. Mey, Leuchtfeuer)

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