FORSCHUNG & ENTWICKLUNG

Automatisierte mikroskopische

tung zum Nachweis von Cryptosporidien

und Giardien in Wasserproben

Im Rahmen eines DVGW-Forschungsvorhabens wurde eine automatisierte mikroskopische

Auswertungsmethode für Cryptosporidien und Giardien entwickelt und erprobt.

S eit einigen Jahren werden zuneh­mend Wasserproben auf die parasi­

tischen Protozoen Cryptosporidien und Giardien untersucht. Diese Protozoen sind Erreger von Durchfallerkrankungen beim Menschen, und es wurden für bei­de Erreger mehrere Epidemien beschrie­ben, die auf kontaminiertes Trinkwasser zurückzuführen waren [1 J. Dies ist vor al­lem dadurch bedingt, dass die mit den Fäkalien befallener Wirtsorganismen aus­geschiedenen Cysten (bei Giardien) bzw. Oocysten (bei Cryptosporidien) als Dau­erstadien sehr resistent insbesondere ge­genüber den bei der Trinkwasseraufbe­reitung üblichen Desinfektionsverfahren sind. Eine Desinfektion alleine stellt daher auf Grund der hohen Resistenz der Cys­ten und Oocysten keine ausreichende Aufbereitung dar [1, 2J.

Die Cryptosporidien-Oocysten sind in der Regel rund und weisen einen Durchmes­ser von 4-6 IJm auf, während die Giar­dien-Cysten oval sind und der Längs­durchmesser etwa 14 IJm und der Quer­durchmesser etwa 10 IJm beträgt [1]. Der Nachweis dieser Oocysten und Cysten ist sehr zeit- und arbeitsaufwändig und erfordert die Verarbeitung sehr großer Probenvolumina, da diese Protozoen nur in recht geringen Konzentrationen (1 bis 10/100 I) in Wässern vorkommen. Übli­cherweise werden ca. 100 bis 500 Liter Wasser angereichert.

Nach einem Primäranreicherungsschritt über Filterkartuschen muss das ange­reicherte Sediment unter anderem durch Zentrifugationsschritte so gereinigt wer­den, dass möglichst nur die Partikel in der Größenklasse von 4-14 IJm erhalten werden. Die resultierende Peilet-Sus­pension wird über Membranfilter filtriert. Auf diesen erfolgt die Markierung durch spezifische fluoreszenzmarkierte Anti­körper. Die Antikörper werden spezifisch

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1: Beispiel für die oetektion von Konturpunkten

2: Konturpunkte nach Anwendung des Verdünnungsveffahrens

3: Verkettung der Konturpunkte

o'J 4: Empsenanpassung und Erkennung der ringförmigen Struktur

5: Beispiel für die effolgreiche oetektion eines Einzellers

Abb.: Oie fünf Schritte der Bildauswertung

an die Oberflächenstrukturen der Proto­zoen angelagert, sodass diese im Epi­fluoreszenzmikroskop durch eine typi­sche ringförmige, apfelgrüne Fluores­zenz erkennbar sind. Da normalerweise nur sehr wenige Einzeller pro Kubikme­ter Trinkwasser vorhanden sind, ist es erforderlich, das komplette Filter mikro­skopisch auszuwerten. Der Einsatz ei­nes statistischen Verfahrens durch Aus­wertung von Stichproben scheidet auf Grund der geringen Konzentration aus. Falls sehr viel Sediment bzw. Peiletvolu­men vorliegt, müssen unter Umständen mehrere Membranfilter von 25 Millimeter Durchmesser mikroskopisch auf die..., Partikel der entsprechenden Größe und Form mit der spezifischen Fluoreszenz durchsucht werden. Diese mikroskopi­sche Auswertung ist somit der zeitauf­wändigste Schritt (etwa zwei Stunden pro Filter), der außerdem nur von ge­schultem Personal durchgeführt werden kann.

Die Automatisierung der Auszählung kann durch die Anwendung von Flow-Cytome­tern oder Solidphase Laserscannern erfol­gen, die allerdings nur in medizinischen La­bors verbreitet sind und deren Anschaf­fung sehr teuer ist.

In den meisten Laboratorien, die diese Untersuchungen durchführen, wird des­halb die mikroskopische Auswertung vor­genommen. Die Personalkapazität eines Wasserlabors wird dadurch sehr stark belastet. Fast alle auszuwertenden Ge­sichtsfelder enthalten viele Fremdkörper und nur wenige die gesuchten Protozo­en, sodass die Konzentrationsfähigkeit eines menschlichen Betrachters nachlas­sen kann. Dieses Nachlassen der Aus­werteleistung birgt die Gefahr in sich,

~ dass Protozoen insbesondere nach län­~ gerer Tätigkeit in nicht vertretbarem Aus­8 maß übersehen werden.

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Zielstellung Das Ziel dieses Projektes war daher eine Automatisierung des mikroskopischen Auswerteverfahrens für Cryptosporidien und Giardien. Die Membranfilteroberflä­chen sollen dabei über ein Epifluores­zenzmikroskop in Verbindung mit einer empfindlichen Videokamera und einem PC-gesteuerten Kreuztisch vollständig untersucht und durch ein Bildanalysesys­tem die "verdächtigen" Befunde mit Lage und Aussehen gespeichert werden. Da­durch ist vom Fachpersonal nur eine Ve­rifizierung vorzunehmen, was eine deutli­che Zeit- und Kostenersparnis bedeutet und auch geringere Fehlermöglichkeiten beinhaltet.

Käufliche Bildanalyseverfahren können nur mit erheblichen Modifikationen bzw. einer völligen Neukonzeption eingesetzt werden. Deshalb wurde schließlich der Auftrag zur Erstellung der Software an die Firma Gevitec vergeben, die auf Bildaus­werteverfahren spezialisiert ist und die Er­arbeitung, Erprobung sowie Installation direkt im mikrobiologischen Labor des DVGW-Technologiezentrums Wasser (TZW) vornahm.

Im Rahmen des Projektes stand ein Epi­fluoreszenzmikroskop mit motorgetriebe­nen XY-Kreuztisch und Z-Antrieb ein­schließlich Schrittmotorsteuerung sowie eine Schwarz-Weiß-CCD-Kamera zur Verfügung. Ziel des Projektes war die Entwicklung eines Bildauswertungssys­tems bestehend aus einem Arbeitsplatz­rechner mit Bildeinzugskarte und einem Programmpaket, das möglichst vollauto­matisch die Auswertung der Membranfil­ter durchführt.

Implementiertes Auswertesystem Zunächst wurden die Schnittstellenpro­gramme entworfen und implementiert, so­dass sich der XY-Kreuztisch und der Z-An­trieb vom Arbeitsplatzrechner ansteuern ließen und die aktuelle Position abgefragt werden konnte. Anschließend wurden die Programme zur Bildaufnahme und Bildar­chivierung auf Festplatte installiert.

Auch die grafische Benutzeroberfläche wurde erstellt, die sowohl die Ansteue­

rung des Kreuztisches und Z-Antriebes als auch die Bilddarstellung und -abspei­cherung ermöglicht. Darüber hinaus ist dadurch auch der automatische Ablauf festzulegen.

Nachdem die Implementierung der Hard­waresteuerung des Mikroskops und des Kreuztisches abgeschlossen waren, konnte mit der Entwicklung der Software für die Bildauswertung begonnen wer­den. Hierzu wurden Proben mit angefärb­ten Cryptosporidien und Giardien mikros­kopisch analysiert und der Bildauswer­tung unterzogen.

Es gelang, ein leistungsfähiges Verfahren zur Bestimmung von Bereichen mit opti­maler Schärfe zu erstellen. Dabei hängt die hierfür benötigte Rechenzeit von der notwendigen Rauschunterdrückung ab.

Darüber hinaus gelang es, das Bildauswer­teverfahren zur Erkennung der Cryptospo­ridien und Giardien zu erstellen und zu im­plementieren. Die Erkennung beruht auf der Detektion der angefärbten Zellwand der Einzeller, die als ringförmige Struktur im Mikroskop sichtbar ist.

Der bei dem implementierten Bildauswer­tungsverfahren verfolgte Ansatz besteht darin, die mit fluoreszierendem Farbstoff markierte Zellwand der Einzeller zu de­tektieren. Dieser Ring ist ausreichend charakteristisch für die zu detektierenden Einzeller und kann daher als Schlüssel­merkmal herangezogen werden. Nach den Ergebnissen lassen sich die Zell­wandringe mit ausreichender Genauig­keit durch Ellipsen beschreiben, wobei je eine innere und äußere Ellipse an den Ring angepasst werden kann. Die Unter­scheidung zwischen Cryptosporidien und Giardien erfolgt über die unter­schiedlichen Halbmesser und die Dicke des Rings, da sich die beiden Gruppen deutlich in der Größe unterscheiden.

Die Bildauswertung erfolgt nach dem Bild­einzug in den Schritten - Detektion von Konturpunkten - Verdünnung der Kontur­punkte - Verkettung der Konturpunkte - Ellipsenanpassung - Erkennung ringför­miger Strukturen und - Zuordnung zu Ein­

zeller-Klassen. Die Ausführung der ver­schiedenen Algorithmen erfolgt hinterei­nander im Pipelinebetrieb. Um die äußere und innere Ellipse des Zellwandringes zu bestimmen, werden bei dem implemen­tierten Ansatz zuerst die Konturpunkte de­tektiert. Ein Bildpunkt (Pixel) wird dabei als Konturpunkt bezeichnet, wenn an seiner Position ein Hell-Dunkel-Übergang im Bild maximalen Kontrast besitzt. Die Abbil­dung verdeutlicht die nacheinander vorzu­nehmenden Schritte.

Anforderungen an die Implemen­tierung Als Probleme sind zwei Faktoren zu nen­nen: zum einen die reine Datenmenge, die abgespeichert werden muss und zum anderen der notwendige Zeitbedarf. Die für eine Tiefenebene anfallende Daten­menge berechnet sich wie folgt: Die Fil­teroberfläche beträgt 490 mm2 bei einem Durchmesser von 25 mm. Die Größe der zu detektierenden Einzeller (Cryptospori­dien) liegt bei ca. 4-6 fl.m. Für eine siche­re Detektion der charakteristischen Merk­male (Zellwand-Ring) wird eine Abbil­dungsgröße von ca. 30 Bildpunkten ge­fordert. Es ergibt sich eine Auflösung von 0,14 j.Lm pro Bildpunkt. Die Auflösung der eingesetzten Kamera beträgt 720 x 576 Bildpunkte. Das Gesichtsfeld der Ka­mera überdeckt dadurch 0,0079 mm2.

Bei einer vorgegebenen Überlappung der Gesichtsfelder von zehn Prozent werden ca. 70.000 Aufnahmen pro Tiefenebene benötigt.

Der Speicherbedarf für eine Aufnahme (8 Bit Grauwertauflösung) beträgt ca. 395 kByte. Für jede Tiefenebene benötigt man daher ca, 27 GByte Festplattenka­pazität. Festplatten mit 200 GByte Kapa­zität stehen zum heutigen Stand der Technik zur Verfügung, und es lassen sich bis zu drei Festplatten ohne Zusatz­aufwand in einen Arbeitsplatzrechner ein­bauen. In dieser Ausbaustufe lassen sich 22 Tiefenebenen abspeichern. Die Ka­mera liefert die Bildinformation mit 25 Bil­dern pro Sekunde. Für die Aufnahme ei­ner Tiefenebene werden ca. 47 Minuten benötigt. Bei der derzeit notwendigen Anzahl von 30 Tiefenebenen würde der Gesamtzeitbedarf bei 23,5 Stunden ~

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FORSCHUNG & ENTWICKLUNG

Tabelle 1: Derzeitiges und prinzipiell mögliches Auswertesystem im Vergleich zur manuellen Auswertung

Anzahl Zeitaufwand Speicherbedarf Tiefenebenen

Manuelle Auswertung

Implementierung mit vorhandener Hardware

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Implementierung mit verbesserter Hardware

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liegen. Hierfür wären 81 0 GByte erforder­lich, wobei man derzeit nur 3 x 200 GBy­te in einem Arbeitsplatzrechner verwalten kann.

Zur Reduzierung der Anzahl der Tiefen­ebenen wäre eine automatische Einstel­lung der aktuellen Schärfenebene erfor­derlich, die allerdings durch das starke Bildrauschen erschwert wird. Dies wie­derum hängt von der eingesetzten Ka­mera ab. Daneben wäre auch eine dyna­mische Anpassung der Anzahl der Tie­fenebenen denkbar, die allerdings eben­falls eine ausreichend empfindliche Kamera erforderte, die auch außerhalb der Schärfenebene das Fluoreszenz­leuchten eines Objektes detektiert.

Anforderungen an die Kamera Die Anforderungen an die Kamera sind generell der Dreh- und Angelpunkt für weitere Optimierungsmöglichkeiten. Die im Rahmen des Projektes implementier­ten Bildauswerteverfahren zur Detektion und Klassifikation von Einzellern wurden an zahlreichen Aufnahmen von verschie­denen Filterproben überprüft. Die Aufnah­men wurden dabei im stationären Zu­stand gewonnen, d.h. ohne Bewegung des Kreuztisches. Nach dem bisherigen Kenntnisstand lässt sich mit den Bildaus­werteverfahren eine sichere Detektion er­reichen, wenn die vom Sensor gelieferten Bilddaten ein ausreichendes Signal­Rausch-Verhältnis aufweisen. Dies wird von den getesteten CCD-Kameras im stationären Zustand erreicht. Die Qualität der Kamerabilder nimmt jedoch beim kontinuierlichen Abtasten der Filterober­fläche stark ab. Dafür sind die folgenden Ursachen ausschlaggebend:

• Die kamerainternen Regelkreise für die Anpassung des Verstärkungsfaktors funktionieren nicht mehr, da sich die im Vergleich zur Umgebung recht hellen Ob­jekte nur kurz im Blickfeld der Kamera befinden.

> 2 h (Personal)

23,5 h (Rechenzeit) 0,3 h (Personal) 810 GByte

~1,8 h (Rechenzeit) 0,3 h (Personal) 67 GByte 'ffi

a;

<3

• Bedingt durch das Zeilensprungverfah­ren bei Videokameras, bei dem die Sensorinformation in zwei verzahnten Halbbildern (gerade und ungerade Zei­lennummern) ausgelesen wird, treten an den vertikalen Konturen Störungen durch Ausfransen der Konturen auf.

Basierend auf den bisherigen Erfahrungen werden an eine für diese Anwendung ge­eignete Kamera die Forderungen hohe Auslesegeschwindigkeit, hohe Empfind­lichkeit, hohe Dynamik und geringes Bild­rauschen gestellt.

Fazit Mit dem derzeit am TZW implementierten System ist eine automatische Erkennung der Cryptosporidien und Giardien möglich. Um alle Tiefenebenen und die gesamte Fil­terfläche sicher abzudecken, war bei der eingesetzten Computertechnik noch ein sehr hoher Zeitbedarf erforderlich. Außer­dem wurden die Speicherkapazitätsgren­zen des eingesetzten Arbeitsplatzrechners erreicht, da die notwendige Speicherkapa­zität 810 GByte beträgt.

Allerdings zeigte sich im Betrieb mit be­wegter Kamera (bzw. bewegtem Filter), dass dadurch die Bildqualität so stark ab­nimmt, dass ein vollautomatisches Absu­chen der Filteroberfläche derzeit nicht möglich ist. Als weitere Entwicklung müsste daher eine hoch empfindliche und gleichzeitig hochdynamische Kame­ra eingesetzt werden. Solche sind zwar in Entwicklung, aber noch nicht kommer­ziell für diesen Einsatzzweck verfügbar. Eine Bildauswertung mit Echtzeit-Filte­rung (Bildeinzugskarte mit Vorverarbei­tungsfunktion) wäre prinzipiell verfügbar, müsste jedoch noch an das Gesamtsys­tem angepasst werden. Eine dynamische Tiefenschärfeanpassung müsste eben­falls noch erarbeitet werden.

Wären diese drei Randbedingungen in absehbarer Zeit zu lösen, ließe sich der

Gesamtzeitbedarf auf rund 1,8 Stunden und die Speicherkapazität auf 62 GByte verringern. Dementsprechend ist zur Weiterentwicklung dieses Verfahrens noch eine Optimierung der Hardware­komponenten erforderlich. Die Proble­matik der großen Datenmengen ist bei Automatisierungsverfahren insbesonde­re bei Echtzeitanforderungen in der Bild­auswertung nicht trivial und diese wird daher zumindest derzeit noch durch die Hardware begrenzt.

Ein Vergleich des prinzipiell Erreichbaren mit dem derzeit implementierten System ist in der Tabelle 1 zusammengestellt.

Durch Einsatz der elektronischen Bild­auswertung mit einer optimieren Hard­wareausstattung ließe sich demnach ei­ne Senkung des Personal- und Zeitauf­wandes für die Giardien- und Cryptospo­ridien-Analytik im Vergleich zur bisher eingesetzten manuellen Auswertung er­reichen. Darüber hinaus könnten Fehler bedingt durch das Nachlassen der Kon­zentrationsfähigkeit des Betrachters ver­mieden werden. Mittelfristig ist daher ei­ne Weiterverfolgung dieses Ansatzes durchaus sinnvoll, wobei jedoch zu­nächst die weitere Entwicklung in der Hardwaretechnologie abgewartet wer­den muss.

Literatur'

[IJ Wiedenmann, A: Cryptosporidien und Giardien. In: Schulze, E. (Hrsg.): Hygienisch mikrobiologi­sche Wasseruntersuchungen, 1996.

[2J Rödelsperger, M. u. Rohmann, U.: Möglichkeiten der Rohwasserbehandlung zur Inaktivierung von Cryptosporidien und Giardien sowie zur Biminati­on von Parasiten mit Rltrationsverfahren - Litera­turstudie - Veröffentlichungen aus dem 7Z\IY, Band 10,1999,

Autorin: Dr. Beate Hambsch DVGW-Technologiezentrum Wasser (TZW)

Karlsruher Straße 84 76139 Karlsruhe Tel.: 0721 9678-220

. Fax: 0721 9678-101

E-Mail: hambsch@tzw.de

Internet: www.tzw.de ­

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