Kinetik eines Photorezeptor-Proteins

(Kurzanleitung)

UNIVERSITAT REGENSBURG

Institut fur Physikalische

und Theoretische Chemie

Prof. Dr. B. Dick

VERTIEFUNGS-PRAKTIKUM PHYSIKALISCHE CHEMIE

Inhaltsverzeichnis

1 Grundlagen 2

2 Messverfahren, Apparatur und Datenanalyse 6

2.1 Singularwertzerlegung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.2 Globaler Fit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3 Aufgabenstellung 12

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1 Grundlagen

Fast alle Organismen reagieren auf Licht oder benutzen Licht fur ihren Stoffwechsel. Da-

bei wird eine Folge von chemischen Reaktionen durch Absorption von Licht ausgelost.

Die chemischen Reaktionen werden in der Regel durch Proteine katalysiert, die aber

selber nur Licht im UV-Bereich (λ < 350 nm) absorbieren. Damit Organismen auch

sichtbares oder infrarotes Licht verarbeiten konnen, mussen die Proteine mit lichtabsor-

bierenden Molekulen (Chromophoren) verbunden sein. Diese absorbieren nicht nur das

Licht, sondern losen durch eine primare Photoreaktion auch die chemische Reaktions-

kette aus.

Nach der biologischen Funktion kann man die verschiedenen photochemischen Reakti-

onssysteme in folgende Klassen einteilen:

• Photosynthese: Grune Pflanzen absorbieren Licht uber den Chromophor Chloro-

phyll. Die Lichtenergie wird durch Energietransfer (Forstertransfer) an das Reak-

tionszentrum weitergegeben. Dort findet als Primarreaktion eine Ladungstrennung

statt. Am Ende der Reaktionskette ist ein Teil der absorbierten Lichtenergie als

chemische Energie (ATP) gespeichert. Einige Purpurbakterien haben ein alterna-

tives Verfahren entwickelt, das Retinal als Chromophor verwendet. Dieses erleidet

nach Lichtabsorption eine cis/trans Isomerisierung. Dadurch wird im Protein ein

Proton von einer Seite der Membran auf die andere gepumpt. Der so gebildete Pro-

tonengradient treibt ein weiteres Enzym an, das ADP und ATP herstellt. Letztlich

wird auch hier die Lichtenergie in chemische Energie umgewandelt und gespeichert.

• Photorezeptoren: Diese versetzen die Organismen in die Lage, Informationen

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uber ihre Umgebung zu gewinnen und darauf zu reagieren. Der bekannteste Vor-

gang dieser Art ist der Sehvorgang. Die Proteine sind die Rhodopsine, der Chromo-

phor ist Retinal, und die photochemische Primarreaktion ist eine cis/trans Isomeri-

sierung. Es gibt aber noch viele andere Lichtsensor-Proteine mit unterschiedlichen

Funktionen. So konnen Pflanzen ihre Blatter zum Licht wenden (Phototropismus),

sie wachsen zum Licht hin. Keimlinge wachsen zunachst steil nach oben, sobald sie

aber ans Licht kommen, schaltet die Pflanze um auf das Wachstum von Blattern.

Die Chloroplasten in den Blattern breiten sich bei schwachem Licht nebeneinander

aus, um so moglichst viel Licht fur die Photosynthese einzufangen. Bei intensivem

Licht stapeln sie sich aber hintereinander, um sich vor zu hoher Intensitat zu

schutzen. Grunalgen fliehen vor intensivem blauen Licht, sammeln sich aber bei

rotem Licht. Diese und noch viele andere Funktionen werden durch Lichtsensoren

gesteuert.

• Sonstige: Eine Klasse von Enzymen, die Photolyasen, kann lichtinduzierte DNA-

Schaden reparieren. Fur diese Funktion nutzt das Protein die Energie von blauen

Lichtquanten.

In diesem Experiment wird ein Rezeptor untersucht, der in der Grunalge Chlamydomo-

nas Reinhardtii vorkommt. Er ist fur blaues Licht empfindlich. Der Rezeptor enthalt

drei Proteindomanen: Zwei werden als LOV (Light, Oxygen, Voltage) bezeichnet (sie-

he Abbildung 1.1). Ahnliche Domanen kommen in vielen anderen Sensorproteinen vor.

Die dritte Domane ist eine Kinase (siehe Abbildung 1.1). Sie ubertragt nach Aktivie-

rung des Rezeptors einen Phosphatrest auf eine andere Stelle des Proteins. Durch diese

Phosphorylierung wird die Signalkette ausgelost.

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PHOT

LOV1 LOV2 Jα Ser/Thr-KinaseH3N+

COO−

Abb. 1.1: Schematische Darstellung der Proteinstrukturen des PHOT aus Chlamydomonas

Reinhardtii. Die lichtsensiblen LOV-Domanen, die beide FMN binden, sind ge-

kennzeichnet. Die Serin/Threonin-Kinasedomane ist in cyan gezeigt.

Der Chromophor in der LOV-Domane ist ein Flavin-Mononukleotid (FMN). Dieses hat

eine Absorptionsbande mit Maximum bei 447 nm. Durch Absorption von blauem Licht

geht das FMN zunachst in den angeregten Singulettzustand uber. Ein Teil fallt un-

ter Aussendung von Fluoreszenz oder auch strahlungslos in den Grundzustand zuruck,

ein anderer Teil geht durch Intersystem Crossing (ISC) in den Triplettzustand uber.

Dieser bildet mit einem Cysteinrest in der gegenuber liegenden Proteinkette (siehe Ab-

bildung 1.2) ein labiles Addukt.

Abb. 1.2: Struktur der LOV1-Domane mit FMN als Chromophor.

Der genaue Mechanismus dieser Adduktbildung ist noch Gegenstand der Forschung.

Das Addukt, das eine Absorptionsbande bei 390 nm zeigt, kehrt anschliessend auf ei-

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ner Zeitskala von mehreren Minuten in den Dunkelzustand zuruck. In Abbildung 1.3

ist bisher bekannte Photozyklus der LOV1-Domane schematisch dargestellt. Im Prak-

tikumsversuch soll diese Dunkelreaktion nach einem kurzen Lichtimpuls zeitlich und

spektral verfolgt werden.

Abb. 1.3: Photozyklus der LOV1-Domane.

2 Messverfahren, Apparatur und

Datenanalyse

Nach Anregung durch ein Lichtquant durchlauft jedes Rezeptorprotein seinen Photozy-

klus. Fuhrt man die Anregung mit einem kurzen Lichtpuls durch, sind die Photozyklen

aller Proteinmolekule in der Probe synchronisiert. Die Konzentration eines jeden In-

termediates k ist dann eine Funktion Ck(t) der Zeit. Jedes Intermediat hat zudem ein

eigenes charakteristisches Absorptionsspektrum Sk(λ). Das gesamte Absorptionsspek-

trum der Probe ist dann zu jedem Zeitpunkt durch die Summe der Absorptionsspektren

der Intermediate, gewichtet mit ihrer Konzentration, gegeben:

A(t, λ) =K∑k

Ck(t)Sk(λ) (2.1)

Hierbei ist K die Anzahl der Intermediate. Die Absorption ist also sowohl zeit- als auch

wellenlangenabhangig. Die Apparatur soll diese transiente Absorption sowohl zeitlich

als auch spektral aufgelost messen. Hierzu wird ein Spektrograph mit Diodenzeile ver-

wendet, der in einer Zeit von 100 ms jeweils ein ganzes Spektrum aufnehmen kann. Die

Probe wird mit einer intensiven LED (Light Emitting Diode) angeregt, die bei einer Wel-

lenlange von ca. 460 nm emittiert und eine Leistung von ca. 1 Watt erreicht. Ein Puls

von etwa 0,5 s Dauer reicht aus, um die Probe fast vollstandig in den Signalzustand zu

bringen. Anschließend werden bei vorprogrammierten Zeiten Absorptionsspektren auf-

genommen. Zu Beginn wahlt man kurze Zeitabstande, spater großere. So erhalt man

am Anfang fur die Verfolgung der schnellen Prozesse eine hohere Zeitauflosung, ohne

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die Datenmenge ausufern zu lassen. Die Apparatur ist in Abbildung 2.1 schematisch

dargestellt.

Abb. 2.1: Schematischer Aufbau der Apparatur:

Strahlungsquelle mit Halogen-Lampe (HL), Deuterium-Lampe (DL), einer Linse

(L1) zur Fokussierung von DL sowie gleichzeitigem Umlenken von HL, zwei Spie-

geln (S1 und S2) zur Strahlenbundelung und zwei Blendenverschlussen.

Probenraum mit thermostatisierbarer Kuvettenhalterung (KH, T = -20 ℃- 60 ℃),

in die senkrecht zum Abfragestrahlengang (probe) zwei gegenuberliegende LEDs

zur moglichen Photoanregung eingebaut sind. Die Kuvettenhalterung kann bei Mes-

sungen bei tieferen Temperaturen als Raumtemperatur mit N2 geflutet werden, so

dass ein Beschlagen der Kuvettenwande sowie der Quarzfenster vermieden werden

kann.

Spektrographsystem mit Eintrittslinse (L2), MCS-Modul mit holografischem

Gitter und Diodenzeilen-Empfanger (DZ).

Steuereinheit ist ein PC mit installierter AJ-UVVIS-Software.

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Die Messwerte entsprechen diskreten Werten der Zeit (tj, j = 1 . . . N) und der Wel-

lenlange (λl, l = 1 . . .M). Sie konnen in einer Matrix A mit den Matrixelementen Ajl

zusammengefasst werden:

Ajl = A(tj, λl) =K∑k

Ck(t)Sk(λ) =K∑k

CjkSlk (2.2)

Dies kann als Matrixgleichung in der Form

A =∑

k

ckstk = CS (2.3)

geschrieben werden kann. Die Daten fur das Konzentrationsprofil der Komponente k

bilden dabei den Spaltenvektor ck, die Daten fur das entsprechende Spektrum den Zei-

lenvektor stk (der hochgestellte Index t steht fur ’transponiert’). Die Matrix C wird von

den einzelnen Konzentrationszeitprofilen gebildet,

C = (c1, c2, . . . , cM) (2.4)

die Matrix S entsprechend aus dem Spektrum dieser Komponenten.

Leider lasst sich fur K > 1 die Matrix A nicht wieder eindeutig in die Matrizen C

und S zerlegen, wie man leicht einsehen kann. Definiert man namlich zwei alternative

Konzentrations- und Spektrenmatrizen durch:

C = CM (2.5)

S = M−1S, (2.6)

wobei M eine invertierbare quadratische Matrix der Dimension K ist, dann gilt

CS = CMM−1S = CS = A (2.7)

Anderseits enthalt die Matrix A ein Vielfaches der Information, die man fur die Bestim-

mung der Spektren und Kinetiken einiger weniger Spezies (K �M,N) benotigt. Daher

sollte man moglichst die gesamte Matrix fur die Datenanalyse nutzen. Zwei Strategien

hierzu sollen kurz beschrieben werden.

2.1. SINGULARWERTZERLEGUNG 9

2.1 Singularwertzerlegung

Jede rechteckige N×M Matrix A mit N ≤M kann eindeutig in folgender Weise zerlegt

werden:

A = UWVt (2.8)

Dabei ist U eine N ×M Matrix, W und V sind quadratische M ×M Matrizen, Vt ist

die transponierte Matrix von V, und W ist diagonal mit Diagonalelementen Wk ≥ 0.

Wir nehmen im Folgenden an, dass diese Diagonalelemente nach absteigender Große

sortiert sind, d.h. Wk ≥ Wk+1. Die Spalten der Matrizen U und V sind orthogonal und

normiert:

UtU = VtV = 1 (2.9)

Da V quadratisch ist, gilt auch

VVt = 1 (2.10)

Eine analoge Beziehung fur U gilt aber nur fur N = M . Gleichung 2.8 kann man auch

folgendermaßen schreiben:

A =M∑k

ukWkvtk (2.11)

Dabei ist uk die k-te Spalte von U und vk die k-te Spalte von V. Diese Gleichung hat

große Ahnlichkeit mit Gleichung 2.2. In der Tat bilden die Vektoren uk eine Basis fur

die Darstellung der ck, entsprechend sind die vk eine Basis fur die Darstellung der sk.

Wenn man eine nach Gleichung 2.2 berechnete Matrix A nach Gleichung 2.11 zerlegt,

stellt man fest, dass genau K der Gewichtungsfaktoren Wk von Null verschieden sind,

d.h.

W1 ≥ W2 ≥ . . . ≥ WK (2.12)

WK+1 = WK+2 = . . . = WM = 0 (2.13)

Man kann die Summe in Gleichung 2.11 also auf die ersten K Terme beschranken. Die

Zahl der von Null verschiedenen Gewichtungsfaktoren ist dann gleich der Zahl der Spe-

zies, die zur Absorption beitragen. Wenn die Matrix der Meßwerte Rauschen enthalt,

2.2. GLOBALER FIT 10

gilt Gleichung 2.13 nicht mehr exakt. Man kann nun die Daten mit den ersten L Kom-

ponenten rekonstruieren:

A(L) =L∑k

ukWkvtk (2.14)

und dann die Standardabweichung zu den tatsachlichen Daten bestimmen:

σ(L) =∣∣∣∣A−A(L)

∣∣∣∣ (2.15)

Tragt man σ(L) gegen L auf, so kann man leicht die Nummer der ersten Komponente

bestimmen, die zu keiner merklichen Verbesserung mehr fuhrt. So erhalt man einen

Schatzwert fur K. Die Matrix A(K) stellt dann eine auf K Komponenten reduzierte

Datenmatrix dar, aus der also das Rauschen quasi herausprojiziert wurde.

Hat man so die Zahl der Komponenten bestimmt, kann man versuchen, mit Hilfe von

Nebenbedingungen die Spektren der Komponenten und deren Zeitprofile zu bestimmen.

Fur zwei Komponenten gilt z.B. st1

st2

=

x11 x12

x21 x22

× vt

1

vt2

(2.16)

Kennt man z.B. das Spektrum der Komponente 1, dann kann man daraus die beiden Ma-

trixelemente x1j = st1vj bestimmen. Ein isosbestischer Punkt legt einen weiteren Wert

von x fest. Gibt es schließlich eine Wellenlange, bei der nur die zweite Komponente ab-

sorbiert, kann man auch den vierten Koeffizienten bestimmen. Damit hat man nicht nur

das zweite Spektrum, sondern, uber die Inverse der Matrix X, auch die entsprechenden

Zeitprofile:

(c1, c2) = (W1u1,W2u2)×X−1 (2.17)

2.2 Globaler Fit

Wahrend die oben beschriebene Methode die Datenmatrix - im Rahmen der angenom-

men Zahl von Komponenten - exakt in Spektren und Zeitprofile zerlegt, analysiert ein

globaler Fit die Daten unter der Annahme eines bestimmten Modells. Meist nimmt man

2.2. GLOBALER FIT 11

an, dass sich die Zeitprofile als Linearkombination sogenannter ’primitiver’ Funktionen

Fi(t) schreiben lassen:

Ck(t) =∑

i

Fi(t)Yik (2.18)

Oder, in der kompakten Matrixschreibweise,

C = FY (2.19)

Dem entspricht ein Modell fur die Datenmatrix

D = FYSt = FBt (2.20)

Die quadratische Abweichung dieser Modellmatrix von der tatsachlichen Datenmatirx

ist

χ2 =∣∣∣∣A− FBt

∣∣∣∣2 (2.21)

Es gibt effiziente Computeralgorithmen, die dieses ’linear least squares’ Problem fur vor-

gegebene Matrizen A und F nach B auflosen. In der Regel hangen die Funktionen Fi

noch von nichtlinearen Parametern ab (z.B. Abklingzeiten). Dann ist das bereits hin-

sichtlich B optimierte χ2 noch eine nichtlineare Funktion dieser Parameter und kann

mit einer ’nonlinear least squares’ Methode (z.B. Levenberg-Marquard) optimiert wer-

den. Als Ergebnis erhalt man die optimierten Werte fur die nichtlinearen Parameter und

die optimale Matrix B. Da die Zeitprofile Linearkombinationen der Spalten der Matrix

F sind (siehe Gleichung2.19), sind die entsprechenden Spektren Linearkombinationen

der Spalten der Matrix B. Die Information uber das kinetische Modell steckt dabei in

der Matrix Y. Es gilt

St = Y−1Bt (2.22)

Da die Matrix Y in Gleichung 2.21 nicht vorkommt, ist die Qualitat des Fits unabhangig

davon. Die Interpretation der Ergebnisse erfordert aber eine Wahl fur die Matrix Y. Hier-

bei gibt es in der Regel mehrere Moglichkeiten, zwischen denen aus den Daten allein nicht

entschieden werden kann. Dies ist Ausdruck der Tatsache, dass eine kinetische Messung

einen Mechanismus (also die Matrix Y) nicht beweisen sondern hochstens widerlegen

kann.

3 Aufgabenstellung

Die thermische Ruckreaktion vom Signalzustand (Addukt) zur Dunkelform einer LOV-

Domane soll durch Messung der transienten Absorption verfolgt werden. Dabei soll ein

externer Parameter (Temperatur, pH-Wert, Ionenstarke, Konzentration eines Reagenzes)

variiert werden. Die Proteinlosung wird vom Assistenten vorbereitet. Nach Einweisung

in die Bedienung der Apparatur wird zunachst ein kurzer Testlauf durchgefuhrt, um die

korrekte Eingabe der Parameter fur die Apparatur zu uberprufen. Dann wird die eigent-

liche Messung gestartet. Diese kann bis zu 90 Minuten dauern. In dieser Zeit kann ein

Gelchromatogramm der Probe aufgenommen werden, um die Reinheit zu uberprufen.

Die Auswertung der Daten erfolgt mit Programmen, die am Lehrstuhl entwickelt wur-

den. Diese fassen zunachst die Einzelspektren in eine Datenmatrix zusammen. Dann

wird durch Singularwertzerlegung die Zahl der Spezies bestimmt, die zum Photozyklus

beitragen. In der Regel sind dies nur zwei, namlich der Signalzustand und der Dunkelzu-

stand. Dann erhalt man aus der Zerlegung auch das Spektrum des Signalzustandes und

dessen zeitabhangige Konzentration. Letztere kann mit den Fitroutinen des Programms

ORIGIN analysiert werden. Testen Sie eine Uberlagerung von bis zu drei Exponential-

funktionen.

Alternativ kann mit einem anderen Programm direkt ein Fit an die komplette Daten-

matrix mit mehreren Exponentialfunktionen durchgefuhrt werden. Diese Globalanalyse

kann auch verwendet werden, wenn mehr als zwei Komponenten zu den Spektren bei-

tragen. In diesem Fall liefert sie auch die Spektren der einzelnen Komponenten.

Wenn Messungen bei mehreren Temperaturen durchgefuhrt werden, sollen die Geschwin-

digkeitskonstanten nach dem Modell von Arrhenius analysiert und nach Moglichkeit

12

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Aktivierungsenergien bestimmt werden.