Kraftspektroskopie an einzelnen Titin-Molekülen

AFM(Atomic Force Microscop)

• Erfinder Gerd Binning• Nobelpreis für das Rastertunnel Mikroskop• Funktion wie RTM nur Kraft statt Tunnelstrom als

Messgröße

Aufbau des AFM

• 3D Piezo Motor • Feder mit niedriger

Federkonstanten ca.0.1-1 N/m• Scharfe Messpitze• Feedback System zur

Bestimmung und Regulierung der Feder

Messspitze

• Die Spitze im ersten AFM war ein Diamantsplitter• Auch möglich sind Si3N4 Kristalle• Die Feder kann mit integrierter Spitze gebaut werden• Für elektrische oder magnetische Kräfte kann man feine

geätzte Drähte als Spitze verwenden

Feder

• Lithographisch hergestellt• Aus Silizium, SiliziumOxid oder SiliziumNitrid• ca. 100μm lang und 1μm dick• Ferdekonstanten 0.1-1 N/m• Resonanzfrequenzen 10-100 kHz

Verschiedenen Typen des AFM

• Raster Kraft Mikroskop• Es können verschiedene Kräfte gemessen werden und

damit– Atomare Kräfte– Magnetische Felder– Elektrische Felder– Van der Vaals

Betriebsmoden

• Contact-mode– Auflagekraft von typischerweise 10-7 bis 10-11

• Langreichweitige Kräfte– Abstand zur Probe 10-100 nm– Feder wird nahe der Resonanz in Schwingung versetzt– Der Kraft Gradient Fz/ z verändert die Resonanz Frequenz

Der Versuch

• Einzelmolekül Kraftspektroskopie an Titin• Matthias Rief, Mathias Gautel, Filipp Österhelt, Julio M.

Fernandez, Hermann E. Gaub• Ziele

– Untersuchung der mechanischen Eigenschaften des Muskelprotein Titin

– und damit besseres Verständnis über die Stabilität von Muskeln

Die Probe

• Frisch aufgedampfte Gold Oberfläche• titin Lösung 10 -100 μg/ml in Phosphat gepuffertem Salin

(PBS) bei pH 7,4• Nach 10 min abgespült mit PBS

Aufbau und Durchführung

• Die Spitze Si3N4 wird auf die Probe gepresst, und nach kurzem Warten wieder weggezogen

Konstante Geschwindigkeit

Immunoglobulin (Ig) Domänen

• Sägezahn Profil• Zähne haben abstand 22-28 nm• 150-300 pN je nach Geschwindigkeit• Vermutung:

– Die einzelnen Immunoglobulin Domänen entfalten sich nacheinander

• Eine vollständig Entfaltete Domäne ist 31 nm lang

Natürliches titin und Ig4 Ig8

• Um zu beweisen, das die Ig Domänen für die schrittweise Verlängerung verantwortlich sind wurde künstliches Titin hergestellt, das nur 4 bzw. 8 Ig Domänen enthält (Ig4 Ig8)

• Bei den Versuchen mit diesem Titin wurden immer nur maximal soviele Sägezähne aufgezeichnet wie Ig Domänen vorhanden waren.

Wormlike chain model

• Beschreibt die Kraft Dehnungs Kurve• F(x)=(kT/b)[0.25(1-x/L)-2-0.25+x/L]• Fitten des Mesergebnis eines Ig8 mit 7 Peaks, mit Hilfe

dieser Formel ergab:– Anfangslänge von 58 nm (fiten des 1. Peaks)– Verlängerung von 28 bis 29 nm beim fiten des nächsten Peaks

Reversibel

• Nach vollständiger Entspannung falten sich die Ig Domänen wieder zusammen

• Dieser Vorgang war sehr oft wiederholbar => reversibel

Andere Methoden zur Kraftspektroskopie

• Mit Hilfe eines Force clamp AFM sind folgende Methoden möglich– Konstante Kraft

• konstante Kraft zwischen 50 und 200 pN• Dauer zwischen 10 und 30 sec

– Kraft wächst linear mit der Zeit• ca. 100 pN/s

Konstante Kraft

Konstante Kraft

• Man sieht einen Stufenweisen Anstieg der Länge• Die meisten Stufen sind 22 nm • Es gibt auch Vielfache davon, mehrere Ereignisse die nicht

mehr zeitlich aufgelöst werden konnten

Zeitlich linear ansteigende Kraft

• Das entfalten spielt sich in wesentlich kürzerer Zeit ab

• aber sonst keine neuen Ergebnisse

Abhängigkeit der Kraft von zuggeschw.

• Komplexe Moleküle haben viele Konformationen• Potentialverlauf ist Abhängig von Zuggeschwindigkeit

Montecarlo Simulation

• Simulation eines thermischen Gleichgewichts• Annahme Ig-Domäne wird duch 6 H-Brücken gehalten• H-Brücken können brechen und rekombinieren• Zugkraft verteilt sich auf die bestehenden H-Brücken

• Nur möglich wenn sehr hohe Zuggeschwindigkeiten simuliert werden

Andere ähnliche Experimente

• Kraftspektroskopie an Biomolekülen• Auch andere Domänen können sich entfalten

– Immunoglobulin– Fibronectin type III– Cadherin– α-Helix (DNS)

• Entfaltung lösen Nervenimpulse aus