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Kulturen für die Oberflächenreifung geschmierter Weichkäse

von W. Bockelmann1, P. Willems1, J. Rademaker2, W. Noordman3 und K.J. Heller1

1 Bundesforschungsanstalt für Ernährung und Lebensmittel, Institut für Mikrobiologie,Postfach 6069, D-24121 Kiel

2 NIZO Food Research B.V., Dept. Processing, Quality and Safety, P.O Box 20, 6710BA EDE, Niederlande

3 NIZO Food Research B.V., Dept. Flavour, Nutrition and Ingredients, P.O Box 20, 6710BA EDE, Niederlande

1. Einleitung

Geschmierte Weichkäse wie Limburger, Romadur und Weinkäse werden durch einekomplexe Schmiereflora bestehend aus typischen Hefen und Bakterien auf der Oberflä-che charakterisiert, die den Käse vor Austrocknung und Kontaminationen mit anderenMikroorganismen schützt (1). Die Zusammensetzung der Oberflächenflora wird überwie-gend durch eine zufällige, betriebsspezifische Flora der jeweiligen Käsereien bestimmt.Traditionell werden gereifte Weichkäse mit ausgebildeter Rotschmiere mit einem Sprüh-automaten vor jungen Käsen ohne entwickelte Schmiere behandelt. Durch Abtropfen vonFlüssigkeit beim Sprühen wird diese „Arbeitsschmiere“ durch Schmierebakterien ange-reichert, bevor diese auf junge Käse aufgesprüht wird. Dieses „Alt-Jung“ Verfahren istkostengünstig, jedoch kann es durch diesen Kreislauf bei Reifungsstörungen zur Verbrei-tung unerwünschter Mikroorganismen im gesamten Betrieb kommen (2, 3). Unerwünsch-te Mikroorganismen sind in erster Linie Listerien, aber auch Enterobakterien undEnterokokken mit übertragbaren Antibiotikaresistenzen müssen zukünftig in Betrachtgezogen werden (4, 5, 6, 7).

Zum jetzigen Zeitpunkt gibt es keine kommerziell erhältliche, funktionstüchtige Ober-flächen-Reifungskultur als hygienisch einwandfreie Alternative zum „Alt-Jung“ Verfah-ren. Im Allgemeinen werden bei geschmierten Weichkäsen nur kommerzielleBrevibacterium linens und Debaryomyces hansenii Kulturen eingesetzt. Angepasste,definierte Oberflächen-Reifungskulturen, die der Zusammensetzung der Oberflächen-flora von Schmierekäsen entsprechen, wären eine wichtige Hilfe, den steigendenhygienischen Ansprüchen neuer Verordnungen und Gesetze der Europäischen Unionauch in Zukunft zu entsprechen.

Das Ziel des zweijährigen Projektes gefördert durch das Bundesministerium für Wirt-schaft und Arbeit über den Forschungskreis der Ernährungsindustrie war die Entwicklungdefinierter Oberflächen-Reifungskulturen für geschmierte Weichkäse, um das „Alt-Jung“Verfahren überflüssig zu machen.

Kostenaspekte konnten im Rahmen des Projektes nur am Rande bearbeitet werden.Die Forderungen an die Kulturen waren:

1. schnelle Besiedlung der Käseoberfläche,

2. Ausbildung des typischen Geruchs, Geschmacks und Aussehens sowie

3. die Verhinderung von bakteriellen und pilzlichen Kontaminationen.

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Die Basis für das Projekt stellten Arbeiten zur Kulturenentwicklung für Tilsiter ähnlicheKäse dar (8, 9). Für letztere konnte gezeigt werden, dass eine definierte Oberflächen-kultur bestehend aus der Hefe D. hansenii, Staphylococcus equorum, B. linens,Corynebacterium casei und Microbacterium gubbeenense eine dem Alt-Jung Verfahrenvergleichbare Käsereifung ermöglichten (10).

2. Material und Methoden

2.1 Rotschmierekulturen

Alle eingesetzten Stämme stammten aus der Stammsammlung des Instituts fürMikrobiologie (Ausnahme: Arthrobacter sulfureus DSM 20167, DSMZ, Braunschweig).Sie waren ursprünglich von der Oberfläche von Rotschmierekäsen isoliert worden.Rotschmierekulturen wurden auf modifiziertem Plate-Count-Agar (11) und Hefen aufMalzextrakt-Agar (VWR, Darmstadt) kultiviert. Vor dem Einsatz als Kultur in der Käse-reifung wurden die Stämme so lange subkultiviert, bis sich sichtbares Wachstum aufentsprechendem Agar innerhalb von 24 h bei 25°C ergab. Zur Erzeugung einer Sprüh-lösung (Betriebskultur) wurden Flüssigkulturen in modifiziertem Plate-Count-Medium(11) oder Malzextraktbouillon für Hefen (VWR International) geschüttelt über Nacht bei25°C inkubiert. Nach Abzentrifugation der Zellen wurden diese doppelt (Bakterien) bzw.10fach konzentriert (Hefen) in Lagerungsmedium aufgenommen (Pepton aus Casein5 g/l, Glukose 5 g/l, Caseinhydrolysat 5 g/l, NaCl 20 g/l, pH 6,4). Vor dem Einsatz dieserFlüssigkulturen in der Sprühlösung wurde die Keimzahl bestimmt. Für die Sprühlösungder Käse (3 % NaCl in entionisiertem, sterilem Wasser) wurde eine Endkonzentration vonca. 107 KbE/ml für jeden Stamm eingestellt.

2.2 Mikrobiologische Analytik

Lebendkeimzahlen wurden für alle Schritte der Käseproduktion und Reifung bestimmt.Dabei wurden die Keimzahlen für die Kesselmilch, Molke, Salzbad und Sprühlösung aufMilliliter bezogen. Für die Bestimmung der Oberflächenflora wurde 1 cm2 Fläche nachein-ander mit 2 sterilen Wattetupfern abgerieben, die Angabe der Keimzahlen bezog sich hierauf cm2 (11).

Zum Ausplattieren der verschiedenen Oberflächen-Mikroorganismen wurden nachHoppe-Seyler et al. (11) folgende Medien verwendet: modifizierter Milchagar mit Delvocidfür Rotschmierebakterien und Staphylokokken, SK-Selektivagar für Staphylokokken,YGC-Agar für Hefen und Schimmel, Kanamycin-Äskulin-Agar für Enterokokken, VRBD-Agar für Enterobakterien und GSP-Agar für Pseudomonaden (kommerzielle Medien vonVWR-International, Darmstadt).

Die Identifizierung erfolgte zuerst über die Kolonie- und Zellmorphologie. Staphylokok-ken konnten mit guter Wahrscheinlichkeit mit ID 32 Staph (Bio Meriéux, Marcy l´Etoile,Frankreich) biochemisch identifiziert werden. Coryneforme Bakterien (Brevibacterium,Microbacterium, Arthrobacter, Corynebacterium) ließen sich mit API-Coryne (Bio Meriéux)nicht klassifizieren. Die Identifizierung ausgewählter Isolate erfolgte mit „AmplifiedRibosomal DNA Restriction Analysis“ (ARDRA) nach Hoppe-Seyler et al. (12, 13). DieARDRA Methodik für Brevibacterium und Corynebacterium Spezies ist noch nichtveröffentlicht. Ergebnisse wurden abgesichert durch partielle Sequenzierung der 16SrDNA (variable Regionen V1 bis V3, ca. 600 Basen) nach Amplifikation beschriebendurch Klijn et al. (14) und durch Homologievergleiche mit Sequenzen des im „Ribosomal

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Database Project II“ (15). Für neue, unbekannte Isolate (orange pigmentierte, beweglicheStäbchen) wurde ebenfalls eine Identifizierung über die Sequenzierung von 16S rDNASequenzen mit Datenbank Homologievergleich durchgeführt.

Die Identifizierung der Hefen erfolgte durch Beurteilung der Zell- und Koloniemorphologiesowie dem biochemischen Identifizierungssystem API 32C (BioMérieux).

2.3 Screening

Nach Bockelmann et al. (8) sind Schüttelkulturen auf Milchbasis geeignet zumScreening auf Wachstumsgeschwindigkeit, Entsäuerungseigenschaften und Aroma-entwicklung bei Hefen und Rotschmierebakterien. Das Milchflüssigmedium enthielt10 %ige tyndallisierte Magermilch, 3 % Caseinhydrolysat, 3 % NaCl und 10 mM CaCl2.Der pH Wert wurde mit Milchsäure auf pH 5,2 eingestellt. 100 ml Medium wurden miteiner Impföse täglich überimpfter, auf YGC Agar oder modifiziertem Milchagar gutwachsender Hefen bzw. Rotschmierebakterien angeimpft und bei 25°C für 2-5 Tage aufeinem Rundschüttler mit guter Durchmischung bebrütet. Für die pH Messungen undKeimzahlbestimmungen wurden Proben steril entnommen und extern gemessen.

2.4 Käseherstellung im Labormaßstab

Durch die Etablierung geeigneter Bedingungen für die Reifung geschmierter Schnitt-käse im Kleinstmaßstab (0.5-2 kg pro Charge) fand das Screening von Mischkulturen imWesentlichen in echter Käseumgebung statt (16). Die Performance einer Oberflächen-kultur konnte innerhalb einer Woche (geschlossene Bakterien/Hefeschicht) bakteriolo-gisch und nach 2 Wochen bereits über Sensorik (Geruch) ermittelt werden. Insgesamtwurden 33 Versuchskäsechargen in einem Zeitraum von 2 Jahren analysiert. Diedargestellten Ergebnisse entsprechen den letzten 2 Versuchsserien gereift mit je 4unterschiedlichen Oberflächenkulturen.

20 l pasteurisierte Milch mit einem Fettgehalt von 2,4 % und einem Eiweißgehalt von3,6 % wurde mit „Latto Inesto“ Kultur nach Herstellerangaben gesäuert (Danisco, Niebüll,Deutschland). Nach dem Einlaben mit „Labextrakt Premium 155“ (Firma Hundsbichler,Langkampfen, Österreich) bei 36°C wurde die Milch 20 min vorgereift. Die Dickungszeitlag bei ca. 40 min, die Gesamtkäsungszeit bei ca. 80 min. Mit einer Käseharfe wurde derBruch auf 15x15x15 mm geschnitten, zweimal gerührt und dann in rechteckige Formenabgefüllt (ca. 12 x 4 x 5 cm). Das Abtropfen/Pressen wurde bei 20-22°C über Nacht unter5-6maligem Wenden durchgeführt. Die Käse wurden für ca. 80 min in einem Badgesalzen (ca. 20 % NaCl). Dann wurde für 30 h bei 20°C und 95 % relativer Feuchte„gebeizt“ und für 12 Tage bei 13-14°C und 95-98 % relativer Feuchte gereift. An Kulturenwurden Geotrichum candidum in der Kesselmilch, Debaryomyces hansenii undStaphylococcus equorum im Salzbad und Rotschmierebakterien (Brevibacterium linens,Arthrobacter spp., Microbacterium gubbeenense, Corynebacterium casei und Halomonassp.) in der Sprühlösung eingesetzt. Die Konzentrationen sind im Ergebnisteil beschrie-ben. Die Käse wurden am 2., 4., 6., 8., und 11. Tag geschmiert (Maximalwerte) und am1., 4., und 8. Tag gewendet. Bei guter Schmiereentwicklung wurden die Käse nur 3 x mitKulturen geschmiert. Die Trockenmasse gereifter Käse lag zwischen 43,2 % und 45,7 %.

Die gleichzeitige Reifung mehrerer Chargen Käse wurde in separaten Einheitendurchgeführt (diverse, nicht luftdicht mit Deckel verschlossene Aquarien, eingestellt ineine Klimakammer mit entsprechender Temperatur und relativer Feuchte)(16).

280

2.5 Käseherstellung im Pilotmaßstab

Die Käseherstellung wurde mit einem Industriepartner aus dem FEI Projekt durchge-führt. Für Analysen wurden die Käseproben per Kurier nach Kiel verschickt und mit 1-2Tagen Verzögerung analysiert (siehe Tab. 6). Nach insgesamt 33 Käseproduktionen imLabormaßstab wurde eine sensorische Bewertung der letzten 4 Chargen gemeinsam mitdem Industriepartner durchgeführt und die Zusammensetzung der Rotschmierekultur fürdie Käseproduktion im Pilotmaßstab gemeinsam festgelegt.

M. gubbeenense 95292, A. nicotianae CA13, Halomonas sp. 99001, S. equorumStaph2 und G. candidum 6216 wurden wie oben beschrieben in entsprechend großerMenge für die Käsereifung produziert. Für den Versand wurden die Proben nach einemim Institut für Mikrobiologie etablierten Verfahren gefriergetrocknet (gewaschene Zellenin 5 % Laktose in A. dest.). B. linens BL19 und D. hansenii 6004 waren kommerzielleKulturen der Hersteller Rhodia Food (Dangé St. Romain, Frankreich) bzw. Danisco(Niebüll, Deutschland).

4.000 l Kesselmilch (für Limburger Käse mit 45 % Fett in der Trockenmasse) wurdenmit G.candidum (Endkonz. 5x102 KbE/ml) beimpft. Die daraus hergestellten Käselaibe(200 g) wurden in einem Salzbad von 2.000 l Volumen gesalzen, welches mit S.equorumund D. hansenii (Endkonz. 2x106 KbE/ml) beimpft worden war. Nach Inkubation in einemBeizraum wurden die Käse 4 x mit einer Suspension von Halomonas sp., A. nicotianae,M. gubbeenense und B. linens gesprüht. Die Konzentration je Stamm lag beim erstenSprühen bei 2,5x106 KbE/ml, bei den weiteren Sprühzyklen bei ca. 2,5x105 KbE/ml. DieKäse wurden während der Reifung mehrfach gewendet. Nach 15 Tagen Reifung wurdendie Käse verpackt und kühl gelagert.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1 Analyse der Oberflächen-Mikroflora kommerzieller Käse

Die auf modifiziertem Milchagar analysierten Oberflächen-Mikrofloren kommerziellerWeichkäse zeigten deutliche Unterschiede zu geschmierten Schnittkäsen (Tab. 1, 9, 17,18, 19, 20, 21). Insgesamt waren sehr hohe Keimzahlen der gelb pigmentierten Arthrobacteroder Microbacterium-Gattungen vorherrschend, bei einem Käsehersteller bis nahe100 %. Beigefarbene Corynebacterium-Spezies trugen mit 0-30 % zur Flora bei. GroßeUnterschiede ergaben sich auch für das Auftreten von B. linens mit 0-42 % der Oberflächen-mikroflora.

Zum Zeitpunkt der bakteriologischen Analyse dieser Weichkäse stand eine sichereund schnelle Routinemethode zur Identifizierung der coryneformen Bakterien noch nichtzur Verfügung. Die Auswahl der Bakterien zum Screening erfolgte im Wesentlichen nachZell- und Koloniemorphologie und orientierte sich an der Zusammensetzung der Ober-flächenflora der analysierten Käse. Während der Entwicklung der ARDRA für Rotschmiere-bakterien (12, 13; weitere Veröffentlichungen zur Identifizierung von Brevibakterien undCorynebakterien in Vorbereitung) wurden die eingesetzten Stämme und einzelne vonKäsen isolierte Bakterien mit ARDRA identifiziert und die Ergebnisse wenn notwendigdurch Sequenzierung der 16S rDNA und Homologievergleich mit Sequenzen des„Ribosomal Database Project II“ (15) abgesichert und mit Daten von Brennan et al. (22)verglichen. Dies führte zur Umbennung der Spezies Microbacterium barkeri zu M.gubbeenense. Mit den heutigen Erkenntnissen lassen sich auf modifiziertem Milchagarmit guter Wahrscheinlichkeit kleine orangefarbene Kolonien coryneformer Bakterien auf

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modifiziertem Milchagar der Spezies B. linens zuordnen. Für Weichkäse wurden Isolateaus gelblichen Kolonien meist der Spezies M. gubbeenense selten Arthrobacter nicotianaezugeordnet und beige-rötliche Kolonien der Spezies Corynebacterium casei. Alle Spezi-es sind auch typisch auch für geschmierte Schnittkäse (17, 23). Neue Ergebnisse weisenjedoch darauf hin, dass auch die für Schmierekäse neu beschriebene Spezies Arthrobactercasei orangefarbene Kolonien bildet und damit leicht mit B. linens verwechselt werdenkann (24). Über den prozentualen Anteil beider Spezies in der Mikroflora von Weichkäseliegen noch keine Untersuchungen vor.

Für eine Käserei ergab sich ein hoher Anteil (16-37% im Reifungsverlauf) an beweg-lichen, hellorange pigmentierten Stäbchen, die als Halomonas sp. identifiziert werdenkonnten (partielle Sequenzierung von ca. 600 Basen der 16S rDNA des Isolates 99001,Homologiewert ca. 94%). Ähnliche orangefarbene, bewegliche Bakterien wurden beiregelmäßigen Untersuchungen von Käsen des gleichen Herstellers über mehrere Jahrenachgewiesen, die damit wohl zur Käserei-typischen Oberflächenmikroflora gehören(Bockelmann, unveröffentlichte Ergebnisse). Kürzlich wurden auch ähnliche beweglicheBakterien aus Salzbädern von Schnittkäsereien mit der gleichen Methode als Halomonassp. klassifiziert (Rademaker, unveröffentlichte Ergebnisse).

Auf allen Käsen wurden die Hefen D. hansenii und G. candidum nachgewiesen.Rotschmiere-Staphylokokken (S. equorum) wurden nicht oder nur in sehr geringenKeimzahlen (<103 KbE/cm2) festgestellt. Als Verunreinigungen ergaben sich Entero-kokken, Pseudomonaden und Enterobakterien zwischen (103 -106 KbE/cm2). Schimmel-verunreinigungen wurden auf keinem Käse festgestellt.

3.2 Entsäuerung der Käseoberfläche

Die Entsäuerung der Käseoberfläche ist Voraussetzung für ein schnelles Wachstumvon Rotschmierebakterien und eine typische und sichere Käsereifung (17) Für dieAnalyse des Reifungsverlaufs wurden von Käsereien kommerzielle Käse verschiedenenAlters zur Verfügung gestellt (Tab. 1, Abb. 1). Im Unterschied zu geschmierten Schnitt-käsen zeigte die Entsäuerung der Weichkäse eine deutliche Verzögerung von bis zu fünfTagen (25). Erste Versuchskäse, die mit einer typischen Tilsiter Reifungskultur (ohne G.candidum in der Kesselmilch) geschmiert worden waren, zeigten die gleiche verzögerteEntsäuerung (Abb. 1) aber auch untypisches Aussehen und Aroma (Daten nicht gezeigt).

3.3 Screening von Hefen

Nach Ergebnissen von Wyder & Puhan (26) zeichneten sich kommerziell erhältliche D.hansenii Hefen im Vergleich zu natürlichen Isolaten durch schlechtere Entsäuerung aus.Stämme der für Weichkäse wichtigen Spezies D. hansenii und G. candidum wurdendeshalb auf ihre Entsäuerungseigenschaften im Milchschüttelmodell getestet (8). Dabeiergaben sich große stammspezifische Unterschiede (Abb. 2).

Für die Beurteilung von Aussehen und Aroma von Hefekulturen erwies sich dasWachstum der Hefen auf modifiziertem Milchagar und Malzextrakt Agar als geeignet. ImVergleich zu G. candidum erwiesen sich die getesteten D. hansenii Stämme als kaumaromatisch und optisch uninteressant. D. hansenii 6004 wurde als unproblematisch beider Kultivierung und Lagerung und als mit den besten Entsäuerungseigenschaftenausgestattet bestimmt.

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Tab. 1: Oberflächenmikroflora geschmierter Weichkäse (Grünkäse, Alter 1 Woche und 2Wochen) produziert von 3 deutschen Käsereien (A, B u. C). Die Gesamtbakterien-zahl wurde auf modifiziertem Milchagar, die Hefe- und Schimmelkeimzahl aufHefeextrakt-Glukose-Chloramphenicol Agar ermittelt. Als Selektivmedien wurdenSK Agar (Merck) für Staphylokokken, Kanamycin Äsculin Agar (Merck) fürEnterokokken und VRBD Agar (Merck) für Enterobakterien eingesetzt. Der ColiTiter wurde mit Laurylsulfat Bouillon ermittelt. Die Identifizierung der Hefenerfolgte morphologisch und mit ID 32C (Bio Mérieux). Die Identifizierung derRotschmierebakterien wurde mit der molekularen Identifizierungsmethode ARDRAan ausgewählten Isolaten vorgenommen und mit Hilfe der partiellen Sequenzierungder 16S rDNA abgesichert. Eine Keimzahlangabe „kleiner als“ bedeutet, dass dieKonzentrationen gegebenfalls auftretender Kontaminanten unterhalb der gering-sten gewählten Verdünnungsstufe lagen. Die Nachweisgrenze lag bei 102 KbE/mlbzw cm2.

Käserei A: A: A: A: B: B: C: C:

Salzbad Grünkäse 1 Woche 2 Wochen 1 Woche 2 Wochen 1 Woche 2 Wochen

Bakterien[KbE/cm2] bzw ml 4,5 x 102 3,9 x 102 8,2 x 107 1,8 x 108 9,0 x 107 2,4 x 108 1,6 x 108 1,2 x 109

Coryneformeweiß/gelb, groß, prt+ — 46 % 32 % 31 % — — 14 % 2 %

Coryneformebeige-rötlich 10 % 54 % 39 % 13 % — — 31 % 29 %

Coryneformegelb 86 % — 13 % 19 % 81 % > 99 % 19 % 11 %

Coryneformeorange 4 % — — — 19 % < 1 % 14 % 42 %

bewegliche Stäbchenhell-orange, groß — — 16 % 37 % — <0,1 % 22 % 16 %

Hefen[KbE/cm2] bzw. ml

Debaryomyces hansenii < 2,3 x 103 < 1,2 x 103 1,4x105 4,1x105 1,7 x 107 1,3 x 107 3,5x106 4,2x105

Geotrichum candidum 3,1 x 104 2,0 x 104 1,2x106 1,1x106 3,0 x 106 2,7 x 106 4,0x106 6,2x105

Kontaminanten[KbE/cm2] bzw. ml

Staphylokokken < 103 < 103 < 103 < 103 < 103 < 105 < 103 < 103

Enterokokken 5.0 x 102 1.3 x 102 1,0 x 102 7,4 x 103 4,1 x 102 3,3 x104 3,1 x 104 2,0 x 104

Pseudomonaden — 4.1 x 102 < 2,3 x 102 1,7 x 103 — 6,1 x 106 < 2,3 x 102 < 1,2 x 103

Enterobakterien — 2.1 x 102 < 1,0 x102 9,8 x102 — — 1,9 x 102 4,5 x 102

Coliforme (Titer) — 10-3 g pos 10-2 g pos. 10-3 g pos. 10-3 g pos. 10-4 g pos. 10-3 g pos 10-4 g pos

Schimmel — — — — — — — —

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Abb. 1: Entsäuerung der Käseoberfläche kommerzieller Weichkäse. Die Messungen erfolgtenmit einer flachen Oberflächen pH Elektrode. Für diesen ersten Versuchskäse kam einefür Tilsiter geeignete Oberflächenstarterkultur zum Einsatz, bestehend aus Debaryomyceshansenii 6004, Staphylococcus equorum Staph 2, Brevibacterium linens Br5, Micro-bacterium gubbeenense CA12, Arthrobacter nicotianae CA13 und Corynebacteriumcasei CA3 (Konzentration in der Schmiere 107 KbE/ml für jede Spezies).

Abb. 2: Entsäuerung des Milchmediums durch Wachstum von Hefereinkulturen (DH=Debaryomyces hansenii, GC= Geotrichum candidum)

Reifungszeit in Tagen

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Obe

rflä

chen

pH

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

Käserei AKäserei BKäserei CVersuchskäse

Zeit [h]

0 10 20 30 40 50

Med

ium

pH

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0DH 5674 DH 5691 DH 6004 DH 6084 DH 6075 GC 6201 GC 6202 GC 6203 GC 6204 GC 6205 GC 6206 GC 6207 GC 6215 GC 6216 GC 6217

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Die untersuchten G. candidum Stämme unterschieden sich stark in Aussehen undAroma. Alle besaßen ein mehr oder weniger ausgeprägtes schwefliges Aroma, das B.linens Kulturen vergleichbar war (27, 28). Auf Grund der Wachstumsraten, des Ausse-hens, des Geruchs und der Entsäuerungseigenschaften wurden die Stämme 6215 und6216 für Versuchskäse eingesetzt, von denen der Stamm 6216 im Verlauf der Versuchevom Aussehen und Aroma der Versuchskäse als deutlich besser bewertet wurde (Tab.2, siehe „Versuchskäsereifung Labormaßstab“).

Tab. 2: Eigenschaften der im Screening eingesetzten Geotrichum candidum-Stämme.

Stamm-Nummer 6201 6202 6203 6204 6205 6206 6207 6215 6216 6217

Kolonieform und beige, beige, zur rein weiß, weiß, beige, beige, beige- beige, weiß, weißlich-farbe (Oberseite) matt, Mitte weiß, haarig, faserig, Mitte in der weiß, haarig, Rand beige,

Mitte matt, samtig pudrig weiß Mitte fein krümelig beige, myzelartighaarig flauschig, glänzend, weiß haarig faserig,Rand haarig krümelig matt, puderig staubigfaserig pudrig faserig

Unterseite s.o. s.o. beige beige s.o. beige- hellbeige weiß beige s.o.faltig uneben

Randzone gefranst, leicht stark sehr fein granulär fransig, sehr fein wimpern- wimpern- glattwimpern- fransig fransig gefranst wimpern- gefranst förmig förmigförmig durch- förmig

scheinendbeige

Wachstums- 1,9 cm/3d 2,1 cm/3d 1,8 cm/3d 2,3 cm/3d 1,5 cm/3d 1,8 cm/3d 1,5 cm/3d 1,5 cm/3d 2,0 cm/3d 2,0 cm/3dgeschwindig- 5,2 cm/7d 5,8 cm/7d 5,1 cm/7d 5,5 cm/7d 4,1 cm/7d 4,7 cm/7d 4,3 cm/7d 4,1 cm/7d 4,7 cm/7d 4,9 cm/7dkeit

Geruch schweflig, kein anfaultes schweflig, kein alt, Alkohol alt, schweflig, keinalt, modrig Geruch nasses leichtes Geruch muffig moderig alkoholisch Geruch

Holz Muffeln säuerlich

Geruchsintensität 6 0 2 5 0 2 3 1 1 0

Geruchsintensität: 0: kein Geruch wahrnehmbar; 1: sehr schwach; 2: schwach; 3: deutlich; 4: stark; 5: mittelstark; 6: sehr stark

3.4 Screening von Rotschmierebakterien

Mehrere Stämme der Spezies B. linens, A. nicotianae, M. gubbeenense, C. casei undHalomonas sp. wurden auf Wachstumsraten sowie Aroma- und Farbentwicklung gete-stet. Die getesteten Rotschmierebakterien waren mehr oder weniger proteolytisch undkonnten in Milch-Schüttelkultur auch in Reinkultur wachsen (8). Zur Simulation der starkproteolytischen Umgebung der Käseoberfläche wurde jeweils das Wachstum einerKultur parallel mit Zusatz von 3 % Caseinhydrolysat untersucht. Besonderes Augenmerkwurde auf die gelb pigmentierten Spezies A. nicotianae und M. gubbeenense sowie aufB. linens gelegt. Die getesteten Stämme wuchsen alle mit und ohne Zusatz vonCaseinhydrolysat mit mehr oder weniger vergleichbaren Wachstumsraten (Abb. 3).Jedoch war der pH-Wert der Medien nach 5 Tagen Wachstum nur bei den starkproteolytischen B. linens Kulturen unabhängig von der Caseinhydrolysat-Zugabe. M.gubbeenense und A. nicotianae zeigten eine deutliche Alkalisierung der Milch nur bei derSimulation proteolytischer Bedingungen (Abb. 3). Für die Farbentwicklung bedeutetedies, dass die gelbe Farbe nur in Kulturen mit Zusatz von Caseinhydrolysat in Rotfarbtöneumschlug (Daten nicht gezeigt), was früheren Ergebnissen von Bockelmann et al. (29)entspricht, aber vom Mechanismus noch unverstanden ist. Der Rotfarbton war bei allenKulturen um so intensiver, je höher der pH-Wert war.

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Abb. 3: Wachstum und Entsäuerung des Milchflüssigmediums durch B. linens Br5, M.gubbeenense CA 12 und Arthrobacter nicotianae 95299

Zeit [Tage]0 1 2 3 4 5

Kei

mza

hl [K

bE]

106

107

108

109

1010

1011

Med

ium

pH

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

KbE - CaHy

pH - CaHy

KbE + CaHy pH + CaHy

Brevibacterium linens Br5

Microbacterium gubbeenense CA 12

Zeit [Tage]0 1 2 3 4 5

Kei

mza

hl [K

bE]

107

108

109

1010

1011

Med

ium

pH

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

KbE - CaHy

pH - CaHy

KbE + CaHy

pH + CaHy

Arthrobacter nicotianae 95299

Zeit [Tage]0 1 2 3 4 5 6

KbE

106

107

108

109

1010

1011

Med

ium

pH

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

9,0

KbE - CaHy

pH - CaHy

KbE + CaHy

pH + CaHy

286

Der hohe Oberflächen pH und der hohe proteolytische Index von Rotschmierekäsenweisen auf die Bedeutung der gelb-pigmentierten coryneformen Bakterien für dieFarbentwicklung (Orange) geschmierter Weichkäse hin. Da sich die Orangefärbung deranalysierten Käse (Tab. 1) trotz der großen Schwankungsbreite der B. linens Keimzahlennicht unterschied, scheint die Bedeutung von B. linens für die Käsefarbe damit eher in denproteolytischen Eigenschaften zu liegen als im direkten Beitrag der B. linens Pigmente zurFarbentwicklung, was auch für andere Käsesorten zutreffen dürfte (1).

Insgesamt ergaben die getesteten Arthrobacter und Microbacterium Stämme sehrähnliche aromatische Profile. Wie bereits in früheren Untersuchungen festgestellt,zeigten alle Isolate neben anderen aromatischen Bestandteilen eine mehr oder wenigerstarke urinartige Geruchsnote (9). B. linens Stämme entwickelten die typischen unange-nehmen Geruchsnoten mit einem hohen Anteil an Schwefelverbindungen (fischig,ammoniakalisch). Wie von Bockelmann et al. (8) beschrieben, war das flüchtige Aromavon Mischkulturen von Arthrobacter und Brevibacterium oder Microbacterium undBrevibacterium dem Rotschmierearoma deutlich ähnlicher als das der Reinkulturen.

Da nach Vorgabe von Industriepartnern eine Salzkonzentration von 10 % NaCl in derSchmierelösung eingestellt werden sollte, wurde die Salztoleranz der für die Käse-versuche eingesetzten Spezies untersucht (Tab. 3). Die höchste Salztoleranz zeigten einkommerzieller B. linens Stamm (BL19, Rhodia Food) und ein M. gubbeenense Stamm,der von Limburger Käse isoliert worden war. Trotz des Gattungsnamens Halomonas sp.war für den getesteten Stamm kein Wachstum auf modifiziertem Milchagar ab 7.5 % NaClmehr nachzuweisen. Die geringste Salztoleranz zeigte A. nicotianae. Dies deutet daraufhin, warum auf handelsüblichen geschmierten Weichkäsen bei den verwendeten hohenSalzkonzentrationen gelb-pigmentierte M. gubbeenense vorherrschen (Bockelmann,unveröffentlichte Ergebnisse). Beide Spezies waren in der Vergangenheit für Versuchs-käseproduktion eingesetzt worden, technologisch bedeutende Unterschiede konntenzwischen beiden Spezies nicht nachgewiesen werden (17).

Tab. 3: Salztoleranz von Rotschmierebakterien getestet durch visuelle Bestimmung desWachstums des Bakterienrasens auf modifiziertem Plate Count Medium(Bockelmann et al., 1997b): kein (o), leichtes (+), mittleres (++) und starkesWachstum (+++) bei der angegebenen Natriumchloridkonzentration.

Stamm 2,5 % 3,75 % 5,0 % 7,5 % 10 % 15 % 20 %

B. linens BL 19 ++ +++ ++ +++ ++ + o

M. gubbeenense 95292 ++ ++ ++ ++ + o o

Halomonas sp. 99001 +++ ++++ +++ o o o o

A. nicotianae CA13 + o o o o o o

kein (o), leichtes (+), mittleres (++) und starkes Wachstum (+++) bei der angegebenen NaCl Konzentration

3.5 Versuchskäsereifung (Labormaßstab)

Entwicklung von Hefen und Staphylokokken (Versuche 1-4)

Der Einsatz einer zweiten Hefe (G. candidum) in der Kesselmilch (analog demVorkommen dieser Spezies in den Betrieben der Projektpartner) und das Beimpfen desSalzbades mit der Hefe D. hansenii und S. equorum führte zu einer drastisch beschleu-nigten Entsäuerung der Käseoberfläche, sogar im Vergleich zu den analysierten kommer-

287

ziellen Käsen (Abb. 4). Die positive Wirkung hoher Konzentrationen von Hefen undStaphylokokken im Salzbad für die Schmiereentwicklung und Schimmelhemmung konn-te auch für Tilsiter Käse gezeigt werden (25). Hohe Konzentrationen dieser Mikroorganis-men im Salzbad scheinen in Weichkäsereien nicht vorzukommen, da die Salzbäderhäufig desinfiziert / filtriert werden müssen, um einem Überhandnehmen der Hefen(vermutlich D. hansenii) aus der Hausmikroflora vorzubeugen (persönliche Mitteilungeines Weichkäseherstellers). Da sich bei bisherigen Untersuchungen (Tilsiter ähnlicheVersuchskäse) kein erkennbarer Einfluss durch D. hansenii und S. equorum auf Ausse-hen und Aroma feststellbar war (17), wurden beide Spezies auch für die Weichkäse-reifung eingesetzt.

Im Unterschied zu geschmierten Schnittkäsen unterschied sich die Entsäuerungzwischen den geschmierten Versuchskäsen und den nicht geschmierten Kontrollkäsennicht. Der Grund könnten die in die Kesselmilch geimpften G. candidum Hefen sein, dievermutlich zusammen mit D. hansenii und S. equorum aus dem Salzbad die Entsäuerungder Käseoberfläche bewirken. Die Salzbadmikroflora allein (Hefen und Staphylokokken)führte bei Tilsiter Versuchskäsen zu keiner typischen Entsäuerung (25).

Abb. 4: Entsäuerung der Käseoberfläche von Versuchskäsen, geschmiert mit unterschiedlichkomplexen definierten Rotschmierekulturen (Konzentration ca. 106 KbE/ml für jedeneingesetzten Stamm). Schmiere 4 enthielt jeweils einen Stamm B. linens (orange) undM. gubbeenense (gelb); Schmiere 3 enthielt einen zusätzlichen B. linens Stamm(orange), Schmiere 2 zusätzlich Arthrobacter sp. (gelb) und Schmiere 1 zusätzlichHalomonas sp. (gelb-orange). Die Kontrolle wurde nicht geschmiert. Die Kesselmilchwurde für alle Käse mit G. candidum angeimpft (103 KbE/ml), das Salzbad mit D.hansenii (106 KbE/ml) und S. equorum (104 KbE/ml). Die Spezies Klassifizierung desActinomyces sp. Stammes, eingesetzt in Schmiere 1, war zum Zeitpunkt des Einsatzesin der Käsereifung noch nicht erfolgt. Der Stamm wurde später nicht mehr eingesetzt.

Reifungszeit [Tage]

0 2 4 6 8 10 12 14 16

pH K

äseo

berf

läch

e

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

Schmiere 1Schmiere 2Schmiere 3Schmiere 4Kontrolle (ungeschmiert)

288

Die Entwicklung der Hefe- und Staphylokokkenflora ist in Tab. 4 gezeigt. G. candidumin die Kesselmilch angeimpft, war im Käsebruch mit 4x103 KbE/g nachweisbar, dieOberflächenkeimzahlen von etwa 4x102 KbE/cm2 änderten sich durch die Salzbad-behandlung nicht. Die Keimzahlen stiegen nach dem Beizschritt um eine Zehnerpotenzan. Die Keimzahlen der ins Salzbad geimpften D. hansenii und S. equorum Kulturenwaren nach dem Beizschritt um zwei bzw eine Zehnerpotenz angestiegen. Die hoheStoffwechselaktivität zeigt, dass bereits vor dem Sprühen der Käse mit Rotschmiere-bakterien die Käsereifung beginnt, so dass die Kontrolle der Mikroflora über Kulturenein-satz bereits in diesem Prozessschritt beginnen sollte. Im gesamten Reifungsverlauf vondrei Wochen blieben bei allen eingesetzten Rotschmierekulturen die Hefekeimzahlen(beide Hefen) zwischen 106 und 108 KbE/cm2 (Daten nicht gezeigt). Die verschiedeneneingesetzten Rotschmierekulturen hatten weder einen fördernden oder hemmendenEinfluss auf die beiden Hefen.

Die natürlich in Käsereien vorkommenden S. equorum- Bakterien wurden bei der Hälfteeiner Versuchskäsecharge (4 Käse) durch S. xylosus, eine kommerziell erhältlicheSpezies, ersetzt. Es wurden keine Unterschiede hinsichtlich Entsäuerung, Aroma- oderFarbentwicklung bei der Reifung der Versuchskäse festgestellt (Daten nicht gezeigt). Inden folgenden Versuchen wurden jedoch immer S. equorum eingesetzt, weil es sichhierbei um eine natürlich in Käsereien vorkommende Spezies handelt.

Die Gegenwart von Corynebacterium Spezies war für die Reifung nicht notwendig. Einehohe Dosierung führte sogar zu untypischer Rotfärbung vor allem der Kanten derVersuchskäse. Es zeigte sich, dass auf modifiziertem Milchagar ausplattierte Bakterienaus roten Kantenbereichen einen hohen Anteil beige pigmentierter Corynebakterien undtypisch orange-farbene Bereiche einen entsprechend hohen Anteil gelb-pigmentierterMicrobacterium bzw. Arthrobacter Bakterien aufwiesen (Daten nicht gezeigt).

Tab. 4: Entwicklung von Hefe- und Staphylokokken Keimzahlen zu Beginn der Käse-reifung; die Keimzahlen (Kolonie bildende Einheiten) beziehen sich bei Kessel-milch, Molke und Salzbad (SB) auf Milliliter, bei Bruch auf Gramm und beiVersuchskäse auf Quadratzentimeter Oberfläche.

Kessel- Molke Bruch Salzbad Versuchs- Versuchs- Versuchs-milch käse käse käse

vor SB nach SB nach Beizen

Geotrichum candidum 4,3x103 0,3x103 3,9x103 4,0x102 3,0x102 3,8x103

Debaryomyces hansenii - - - 2,0x106 - 4,3x103 1,2x105

S. equorum - - - 1,0x104 - 2,0x102 1,0x103

Die Keimzahlen (Kolonie bildende EInheiten) beziehen sich bei Kesselmilch, Molke und Salzbad (SB) auf Milliliter, bei Bruch aufGramm und bei Versuchskäse auf Quadratzentimeter Oberfläche.

Entwicklung der Rotschmiereflora (Versuche 5-8)

Das in vorangegangenen Versuchskäseproduktionen als leicht untypisch bewerteteAussehen und Aroma konnte auf den eingesetzten G. candidum Stamm 6215 zurückge-führt werden. Bei den folgenden Käsechargen wurde der Stamm gegen den Stamm 6216ausgetauscht. Die Beimpfung der Kesselmilch und des Salzbades wurde von denVorversuchen unverändert übernommen. Die Schmierezusammensetzung ist der Tabel-le 5a zu entnehmen. Hierbei wurden wieder unterschiedliche Kombinationen der vorhan-

289

denen Rotschmiere-Bakterienspezies eingesetzt. Dabei wurde bei Charge 5 ausschließ-lich B. linens eingesetzt und bei Charge 8 kein B. linens. Die Chargen 6 und 7 erhieltenzusätzlich ungewöhnliche gelb-pigmentierte Arthrobacter rhombi und Arthrobactersulfureus, die nicht von Schmierekäsen isoliert worden waren. Ein Kontrollkäse wurde nurmit Salzwasser geschmiert. Die Bakterien-Konzentration in der Schmierelösung lagbei107 KbE/ml.

Die Entwicklung der Hefen G. candidum und D. hansenii war den vorangegangenenVersuchen vergleichbar. Anders als bei Schnittkäsen lag die Oberflächenkeimzahl derBakterien auf Weichkäsen generell niedriger, nach einer Woche nur bei ca. 107 KbE/cm2

(Tab. 5; Vergleich: Schnittkäse 109 KbE/cm2, 9). Dies lag nicht an mangelnder Entsäue-rung, da die Oberflächen pH-Werte nach einer Woche oberhalb von pH 7,5 lagen (Datennicht gezeigt). Der Grund für die niedrigeren Bakterienkeimzahlen dürfte an dem beiWeichkäsen deutlich höheren Anteil der Hefen in der Mikroorganismen-Oberflächenfloraliegen.

Es war auffällig, dass die Oberflächenkeimzahlen der Käse, die ausschließlich mit B.linens geschmiert wurden (Schmiere 5), fast eine Zehnerpotenz niedriger lagen. Auchnach 2 Wochen waren ausschließlich die Kolonietypen der eingesetzten Brevibakterienund Staphylokokken bei einer niedrigen Gesamtbakterienzahl festzustellen (Tab. 5).Über den gesamten Reifungsverlauf wurden ausschließlich die Kolonietypen auf modi-fiziertem Milchagar gefunden, die den eingesetzten Rotschmierebakterien glichen. AusArbeiten mit geschmierten Schnittkäsen ist bekannt, dass Rotschmierebakterien, die inhoher Konzentration auf die Oberfläche geimpft wurden, tatsächlich zu praktisch 100%auf der Oberfläche wachsen können, sich also gegen eine „Hausmikroflora“ durchsetzenkönnen (Nachweis mit Pulsfeld-Gelelektrophorese; Bockelmann et al., unveröffentlichteErgebnisse).

Nach zwei Wochen Reifung und weiteren zwei Wochen Lagerung verpackt bei 8°Cwaren zusätzlich zu den bekannten Kolonietypen der eingesetzten Bakterienstämme beizwei Versuchskäsen (Charge 5 + 8) gelb-orangefarbene Kolonien mit 30 % bzw. 60 % derGesamtbakterienzahlen nachzuweisen (Daten nicht gezeigt). Charge 5 wurde aus-schließlich mit B. linens geschmiert, in Charge 8 fehlte B. linens in der Schmiere. B. linensist bekannterweise ein wichtiger Bestandteil der Rotschmiere, wenn auch häufig nurniedrige Keimzahlen auf der Käseoberfläche erreicht werden. Für B. linens und M.gubbeenense sind synergistische Effekte beim Wachstum in Milchmedien beschrieben(9). Das Fehlen dieser essentiellen Komponenten führte also offensichtlich zu einemzufälligen Wachstum von gelb pigmentierten Bakterien aus der Labor-Hausmikroflora,vermutlich Arthrobacter oder Microbacterium Spezies.

Der Versuchskäse, der ohne B. linens produziert wurde, war flach im Geschmack(Charge 8), der Käse mit ausschließlich B. linens auf der Oberfläche hatte nicht nur dieam stärksten ausgeprägte Orangefärbung, sondern war auch von sehr intensivemGeschmack und Geruch. Das Aussehen war jedoch für alle vier Käsechargen ähnlich(Abb. 5). Die Käse wurden von Prüfern eines Projektpartners optisch und sensorischbewertet. Diese kamen zu dem Schluss, dass die Kulturen der Chargen 7 und 8 die bestenErgebnisse zeigten und deshalb weiter untersucht werden sollten.

290

Tab. 5: Käsereifung mit definierten Oberflächenkulturen unterschiedlich komplexer Zu-sammensetzung (a-c). Die eingesetzten Stämme unterschieden sich deutlich inZell- und Koloniemorphologie. Dies wurde zur Klassifizierung der OberflächenMikroflora (b. und c.) eingesetzt. Eine weitere biochemische oder molekulareIdentfizierung erfolgte nicht

Schmiere- Schmiere 5 Schmiere 6 Schmiere 7 Schmiere 8 Kontrollezusammen-setzung(a)

B. linens Br9 x

B. linens BL19 x x x

B. linens 95295 x

A. rhombi 95297 x x

M. gubbeenense95292 x x x

Halomonas sp.99001 x x x

A. sulfureusDSM 20167 x x

(b) Charge 5 Charge 6 Charge 7 Charge 8 KontrolleReifungszeit 1 Woche 1 Woche 1 Woche 1 Woche 1 Woche

Geotrichum

candidum 6216 6,0x106 9,0x106 9,0x106 7,2x106 1,2x107

Debaryomyces

hansenii 6004 5,5x105 2,9x106 5,5x106 2,4x106 2,7x106

Bakterien[KbE/cm2] 2,8x106 3,5x107 4,5x107 2,7x106 4,5x104

B. linens Br9 43,5 %

B. linens BL19 14,5 % 10,1 % 13,4 %

B. linens 95295 12,7 %

A. rhombi 95297 49,0 % 37,6 %

M. gubbeenense95292 34,6 % 16,7 % 3,8 %

Halomonas sp.99001 0,3 % 40,2 % 11,3 %

A. sulfureusDSM 20167 11,2 % 15,0 %

S. equorumStaph2 29,3 % 6,1 % 18,5 % 32,3 % 100 %

291

(c) Charge 5 Charge 6 Charge 7 Charge 8 KontrolleReifungszeit 2 Wochen 2 Wochen 2 Wochen 2 Wochen 2 Wochen

Geotrichumcandidum 6216 1,4x107 7,4x106 7,4x106 1,5x107 3,1x107

Debaryomyceshansenii 6004 1,8x107 4,4x106 8,2x106 7,2x106 4,1x107

Bakterien[KbE/cm2] 1,8x108 5,1x108 1,1x109 1,2x109 6,4x106

B. linens Br9 82,9 %

B. linens BL19 0,6 % 60,4 % 82,6 %

B. linens 95295 11,0 %

A. rhombi 95297 1,3 % 12,2 %

M. gubbeenense95292 29,2 % 0,1 % 0,1 %

Halomonas sp.99001 6,8 % 7,3 % 43,6 %

A. sulfureusDSM 20167 7,3 % 43,67 %

S. equorumStaph2 5,5 % 2,3 % 2,7 % 0,6 % 100 %

Abb. 5: Aussehen der Versuchskäse, gereift mit definierten Oberflächenkulturen im Labor-maßstab (Charge 5-8) und Pilotmaßstab (Charge 9).

Charge 5 (14 Tage) Charge 6 (14 Tage)

Charge 7 (14 Tage) Charge 8 (14 Tage)

Charge 9 (Tag 12) Charge 9 (am Packtag, Tag 17)

292

Versuchskäsereifung (Pilotmaßstab, Charge 9)

Aufgrund der positiven Versuche im Labormaßstab wurde eine Kultur, bestehend ausG. candidum 6216, S. equorum Staph2, Halomonas sp. 99001, A. nicotianae CA13 undM. gubbeenense CA12 angezüchtet und im Institut gefriergetrocknet. Die Mengen solltenausreichen, um einen Versuch mit 4.000 l Kesselmilch in einer Käserei durchzuführen.Die gefriergetrockneten Präparate wurden in ihrer Aktivität (Überlebensrate) bestimmtund entsprechende Portionen wurden für den Einsatz in der Käsereifung vorbereitet. DieKonzentration von G. candidum wurde für 4.000 l Kesselmilch eingestellt, S. equorumund D. hansenii wurden für 2.000 l Salzbad vorbereitet, die restlichen Rotschmiere-bakterien wurden für 4x300 l Schmierelösung eingestellt. Die Käse wurden im Reifungs-verlauf viermal geschmiert.

Die Entsäuerung der Käseoberfläche war normal, nach bereits vier Tagen war pH 7erreicht (Abb. 6). Die Entwicklung der Hefen verlief innerhalb weniger Tage auf über107 KbE/cm2, die Entwicklung der Rotschmiere war langsam, sie zeigte zu Beginn derReifung von Tag 4 bis 7 einen Abfall der Keimzahl und dann erst einen starken Anstiegauf 108 KbE/cm2 nach 10 Tagen (Tab. 6).

Abb. 6: Entsäuerung der Käseoberfläche der im Pilotmaßstab produzierten Versuchskäse. DieMessungen erfolgten an 3 verschiedenen Stellen der Käseoberfläche mit einer Oberflä-chen pH Elektrode

Reifungszeit [Tage]

0 2 4 6 8 10 12 14 16

pH K

äseo

berf

läch

e

4,5

5,0

5,5

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

8,5

293

Tab. 6: Oberflächenflora der Versuchkäse produziert im Pilotmaßstab. Die Zuordnung zu den angegebenen Stämmen erfolgte nach Zell- undKoloniemorphologie von Bakterien gewachsen auf modifiziertem Milchagar; n.d. = nicht detektiert wegen zu starker Verdünnung beiKeimzahlbestimmungen; — = Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze (10 KbE/cm2)

Charge 4000 l Salzbad OF vor SB nach Beizen n. 1.Schmieren n. 2. Schmieren n. 3. Schmieren am Packtag(1d + 2d) (1d + 2d) (3d + 2d) (4d + 1d) (7d + 2d) (10d + 3d) (15d + 2d)KbE/ml KbE/cm² KbE/cm² KbE/cm² KbE/cm² KbE/cm² KbE/cm²

Hefen auf YGC 3.8x106 2.4x103 2.7x107 7.7x106 4.7x107 4.0x107 5.5x107

D. hansenii 3.8x106 2.2x107 5.2x106 5.6x106 8.2x106 7.8x105

G. candidum 2.4x103 5.3x106 2.5x106 4.2x107 3.2x107 5.5x107

Bakterien auf mMA 2.7x107 n.d. 3.1x103 n.d. 1.5x106 1.4x108 4.2x108

S. equorum Staph 2 2.7x107 3.1x103 2.5x104 5.2x105 1.5x105

M. gubbeenense 95292 3.0x105 1.5x107 6.3x106

A.nicotianae CA13 1.2x106 3.6x107 1.3x108

Halomonas sp. 99001 7.2x103 7.0x107 1.0x108

B.linens BL19 4.2x103 2.1x104 —

andere Coryneforme 1.8x108

Pseudomonaden (GSP) — — — — — — —

Enterokokken (KAA) — — — — — — 2.8x104

Enterobakterien (VRBD) — — — — — — 1.7x104

Schimmel (YGC) — — — — — — —

n.d.= nicht detektiert wegen zu starker Verdünnung bei Keimzahlbestimmungen; --= Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze (102 KbE/cm2)

294

Die Probleme mit langsamer Rotschmiereentwicklung, die sich auch in einer langsa-men Farbentwicklung widerspiegeln (siehe Fotos in Abb. 5), wurden vermutlich durch dieGefriertrocknung der Kulturen verursacht, die zwar eine hohe Überlebensrate gewährlei-stete, jedoch vermutlich zu einer zu geringen Aktivität der Kulturen nach Resuspendierenvor dem Einsatz im Sprühautomaten führte. Jedoch wird die Eignung der eingesetztenMischkulturen für die Käsereifung durch die Ergebnisse bestätigt, da sich hohe Keim-zahlen und eine typische Farbe und Aroma entwickelten.

Die Käse wiesen bis zum Packtag keine Verunreinigungen mit Enterokokken undEnterobakterien auf. Die erste Probe, die nach dem Packtag analysiert wurde, zeigte einedeutliche Verunreinigung mit diesen Kontaminanten (Tab. 6), die somit während desVerpackens auf die Käseoberfläche gelangt waren. Dazu kam auch eine deutlich höhereHeterogenität der Rotschmiereflora, beurteilt nach den auf modifiziertem Milchagargewachsenen Kolonien und mikroskopischem Bild („andere“ Coryneforme in Tab. 6). DerGrund lag in den nicht speziell für den Käseversuch gereinigten Bändern zum Transportder Käse zur Verpackung. Auf diese Weise erhielten die Versuchskäse zusätzlich dienormale Rotschmiereflora der Käserei. Insgesamt entwickelten sich die Käse, wenn auchlangsam, normal und hatten ein ansprechendes Äußeres und wurden auch sensorischpositiv bewertet. Dieser Versuch zeigt, dass Enterokokken und Enterobakterien auch inGegenwart einer ausgebildeten Rotschmiereflora wachsen können. Jedoch zeigte derVersuch auch, dass es möglich ist, unter Praxisbedingungen kontaminationsfreie Rot-schmiereweichkäse zu reifen.

4. Schlussfolgerungen und zukünftige Arbeiten

Die Untersuchungen zeigen, dass es möglich ist, geschmierte Weichkäse mit definier-ten Hefe- und Rotschmierekulturen ohne einen „Alt-Jung“ Schritt zu reifen. ErsteAnsatzpunkte für eine Optimierung stellt die Kontrolle der Hefe der Kesselmilch und derSalzbadmikroflora dar. Vor einer weitergehenden Optimierung der Rotschmierekulturensollte das Vorhandensein von Arthrobacter casei in der orangefarbenen „B. linens“Fraktion und das Vorkommen bzw. die Häufigkeit von M. gubbeenense, A. nicotianaesowie Microbacterium lacticum in der Fraktion der gelben coryneformen Bakterien geprüftwerden. Entsprechende Methoden (ARDRA) für eine sichere und schnelle Identifizierungeiner großen Zahl von Rotschmierebakterien stehen dafür inzwischen zur Verfügung.und sollen im 2. Halbjahr 2004 in einer größeren Untersuchung deutscher geschmierterWeichkäse eingesetzt werden.

Danksagungen

Dieses Vorhaben wurde aus Mitteln der industriellen Gemeinschaftsforschung (Bun-desministerium für Wirtschaft und Arbeit / AiF) über den Forschungskreis der Ernährungs-industrie (FEI) gefördert. Projekt Nr. AiF-FV 12780 N.

Wir danken Frau Vera Meiners für ausgezeichnete technische Assistenz bei denmikrobiologischen Analysen, Herrn Dr. Günter Engel und Herrn Niels Rösch für die HefeIdentifizierung und Hilfe beim Hefescreening sowie Herrn Norbert Johannsen vom Institutfür Chemie und Technologie der Milch für die Unterstützung bei der Produktion derWeichkäse im Labormaßstab.

Wir danken den Projektpartnern im FEI Projekt für konstruktive Zusammenarbeit, diedie Praxisnähe der Projektarbeiten sicherstellte (alphabetisch): Danisco Cultor NiebüllGmbH, Niebüll; Goldsteig Käsereien Bayernwald GmbH, Cham; J. Bauer KG, Wasser-burg; Käserei Champignon Hofmeister GmbH & Co KG, Lauben; Mang Käsewerk GmbH& Co. KG Kammlach.

295

5. Literatur(1) Bockelmann, W.: Smear-Ripened Cheeses. in: Encyclopedia of dairy sciences, Eds. Roginski,

H., Fuquay, J.W. & Fox, P.F., 391-401 (2002)(2) Hahn, G., Hammer, P.: Listerien-freie Käse - höhere Sicherheit für den Verbraucher. Dtsch.

Milchwirtsch. 33, 1120-1125 (1990)(3) Rudolf, M., Scherer, S. : High incidence of Listeria monocytogenes in European red smear

cheese”, International Journal of Food Microbiology 63 (1-2), 91-98 (2001)(4) Burri, S.: Microbiology of Gram-positive microflora of the surface of typical Swiss cheeses.

Dissertation. Swiss federal institute of technology, Zurich (1999)5) Gianotti, S. M.: Microbiology and biochemistry of the Enterobacteriaceae flora of the surface of

typical Swiss cheeses, ETH Zurich (1999)(6) Teuber, M.: Spread of antibiotic resistance with food-borne pathogens, Cell.Mol.Life Sci., vol.

56, pp. 755-763 (1999)(7) Teuber, M., Perreten, V.: Role of milk and meat products as vehicles for antibiotic-resistant

bacteria. Acta Vet.Scand. 75-87 (2000)(8) Bockelmann W., Hoppe-Seyler T., Krusch U., Hoffmann W., Heller K. J.:The microflora of Tilsit

cheese. part 2. Development of a surface smear starter culture. Nahrung 41 (4) 213-218 (1997)(9) Bockelmann W., Krusch U., Engel G., Klijn N., Smit G., Heller K. J.: The microflora of Tilsit

cheese. Part 1. Variability of the smear flora. Nahrung 41 208-212 (1997)(10) Bockelmann, W.: Development of defined surface starter cultures for the ripening of smear

cheeses. International Dairy Journal 12 (2-3) 123-131 (2002)(11) Hoppe-Seyler T., Jaeger B., Bockelmann W., Heller K. J.: Quantification and identification of

microorganisms from the surface of smear cheeses. Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsbe-richte 52 (4) 294-305 (2000)

(12) Hoppe-Seyler, T., Jaeger, B., Bockelmann, W., Noordman, W. H., Geis, A., Heller, K. J.:Identification and Differentiation of species and strains of Arthrobacter and Microbacteriumbarkeri isolated from smear cheeses with Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis(ARDRA) and Pulsed Field Gel electrophoresis (PFGE); Systematic and Applied Microbiology26, 438-444 (2003)

(13) Hoppe-Seyler, T., Jaeger, B., Bockelmann, W., Noordman, W., Geis, A., Heller, K.J.: MolecularIdentification and differentiation of Staphylococcus species and strains of cheese origin;Systematic and Applied Microbiology, 27, 211-218 (2004)

(14) Klijn, N., A. H. Weerkamp, de Vos, W.M.: Identification of mesophilic lactic acid bacteria byusing polymerase chain reaction-amplified variable regions of 16S rRNA and specific DNAprobes. Appl Environ Microbiol. 57 (11):3390-3393 (1991)

(15) Cole, J.R., Chai, B., Marsh, T.L., Farris, R.J., Wang, Q., Kulam, S.A., Chandra, S., McGarrell,D.M., Schmidt, T.M., Garrity, G.M., Tiedje, J.M.: The Ribosomal Database Project (RDP-II):previewing a new autoaligner that allows regular updates and the new prokaryotic taxonomy.Nucleic Acids Res. 31, 1, 442-443 (2003)

(16) Bockelmann, W., Hoppe-Seyler, T., Jaeger, B., Heller, K.J.: Small scale cheese ripening ofbacterial smear cheeses. Milchwissenschaft 55 (??) 621-624 (2000)

(17) Bockelmann, W.: Development of defined surface starter cultures for the ripening of smearcheeses, in: Maximising quality, Eds. Smit, G. & Dodds, F., Woodhead Publishing Ltd.,Cambridge, GB, 470-49 (2003)

(18) Bockelmann W., Hoppe-Seyler T.: The surface flora of bacterial smear-ripened cheeses fromcow´s and goat´s milk. International Dairy Journal 0, 1-8 (2001)

(19) Brennan, N. M., Ward, A. C., Beresford, T. P., Fox, P. F., Goodfellow, M., Cogan, T. M.:Biodiversity of the bacterial flora on the surface of a smear cheese. Appl. Environ. Microbiol. 68,820-830 (2002)

(20) Eliskases-Lechner, F., Ginzinger, W.: The bacterial flora of surface-ripened cheeses withspecial regard to coryneforms, Lait, 75, (6), 571-583 (1995)

(21) Eliskases-Lechner, F., Ginzinger, W.: “The yeast flora of surface-ripened cheeses”, Milch-wissenschaft 50 (8), 458-462 (1995)

(22) Brennan, N. M., Brown, R., Goodfellow, M., Ward, A. C., Beresford, T. P., Vancanneyt, M.,Cogan, T. M., Fox, P. F.: Microbacterium gubbeenense sp. nov., from the surface of a smear-ripened cheese. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 1969-1976 (2001)

296

(23) Bockelmann, W.: Kulturenentwicklung geschmierter Käse. DMZ, Lebensmittelindustrie undMilchwirtschaft 3 93-98 (2002)

(24) Wenning, M. & Scherer, S.: Schnelle Populationsanalyse von Reifungskonsortien mit FTIR-Mikrospektroskopie; Milchkonferenz Osnabrück 2003, Tagungsband, Minireport M3 (2003)

(25) Jaeger B., Hoppe-Seyler T., Bockelmann W., Heller K. J.: The influence of the brine microfloraon the ripening of smear cheeses. Milchwissenschaft 57 (11/12) 645-648 (2002)

(26) Wyder, M.-T., Puhan, Z.: Investigation of the yeast flora in smear ripened cheeses, Milch-wissenschaft 54 (6), 330-333 (1999)

(27) Berger, C., Khan, J.A., Molimard, P., Martin N., Spinnler H. E. : Production of sulfur flavors byten strains of Geotrichum candidum. Appl.Environ.Microbiol 65 (12) 5510-5514 (1999)

(28) Spinnler H. E., Berger C., Lapadatescu C., Bonnarme P.: Production of sulfur compounds byseveral yeasts of technological interest for cheese ripening. International Dairy Journal 11 (4-7) 245-252 (2001)

(29) Bockelmann, W., Fuehr, C., Martin, D., Heller , K.J.: Color development by Red-Smear surfacebacteria. Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsberichte 49 (4) 285-292 (1997)

6. Zusammenfassung

Bockelmann, W., Willems, P., Rademaker, J., Noordman, W., Heller, K.J.: Kulturen fürdie Oberflächenreifung geschmierter Weichkäse. Kieler Milchwirtschaftliche For-schungsberichte 55 (4) 277-299 (2003)

26 Mikrobiologie (Weichkäse, Rotschmiere, definierte Kultur, „Alt-Jung“ Verfahren)

Die analysierten Oberflächen-Mikrofloren kommerzieller Weichkäse zeigten deutlicheUnterschiede zu geschmierten Schnittkäsen. Die höchsten Keimzahlen ergaben sich fürgelb pigmentierte Microbacterium gubbeenense und zu einem geringeren Anteil fürArthrobacter nicotianae. Beige-rötlich pigmentierte Corynebacterium casei trugen mit10-30 % zur Flora bei. Brevibacterium linens war in sehr niedrigen Anteilen in derOberflächenflora vorhanden. Für eine Käserei ergab sich ein typischer hoher Anteil(35 %) an beweglichen, hellorange pigmentierten Stäbchen, die als Halomonas sp.identifiziert wurden. Auf allen Weichkäsen wurden die Hefen Debaryomyces hanseniiund Geotrichum candidum nachgewiesen. Die für Schnittkäse typischen Staphylokokken(S. equorum) wurden nicht nachgewiesen. Als Verunreinigungen ergaben sichEnterokokken, Pseudomonaden und Enterobakterien. Fremdschimmel wurden auf keinemKäse festgestellt.

Das Screening auf geeignete Stämme zeigte die große Bedeutung von D. hansenii fürdie Entsäuerung der Oberfläche (=Schmiereentwicklung) und von G. candidum für dasAussehen (weiße Bereiche) und Aroma, das dem von B. linens ähnelte. Isolierte Stämmeder häufigen Microbacterium und Arthrobacter Spezies ergaben insgesamt sehr ähnlichearomatische Profile (mehr oder weniger starke urinartige Geruchsnoten). Diese Bakterien-gruppen zeigten in Flüssigkultur gelben Kulturüberstand, aber in Abhängigkeit vom Gradder Proteolyse und pH Wert auch rote Farbe. In Mischkultur mit Brevibakterien, Coryne-bakterien und Geotrichum candidum entwickelten Mikrobakterien ein für Rotschmiere-käse typischeres flüchtiges Aroma, dominiert von geruchsintensiven Schwefel-komponenten. Von den getesteten Spezies erwiesen sich die für Weichkäse wichtigenB. linens und M. gubbeenense als sehr salztolerant. Halomonas sp. zeigte eine geringereSalztoleranz bis ca. 5 % NaCl.

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Die Reifung von Versuchskäsen war entscheidend abhängig vom Vorhandensein vonD. hansenii und G. candidum. Verschiedene Microbacterium und Arthrobacter Speziesund B. linens Stämme änderten Aussehen und Aroma der Käse kaum. Der Einsatz vonS. equorum im Salzbad analog den Verhältnissen bei geschmierten Schnittkäsen führteim Vergleich zu alt-jung geschmierten Schnittkäsen zu einer deutlich schnellerenEntsäuerung der Oberfläche in den ersten 7 Reifungstagen. Ein Einfluss dieser Speziesauf das Aroma wurde nicht beobachtet, ein möglicher positiver Einfluss auf die Färbungder Käse ergibt sich durch die orangefarbenen Pigmente von S. equorum. Die Gegenwartvon Corynebacterium Spezies war für die Reifung nicht notwendig. Eine hohe Dosierungführte sogar zu untypischer Rotfärbung vor allem der Kanten der Versuchskäse. Es zeigtesich, dass rote Bereiche einen hohen Anteil von C. casei und typisch orange-farbeneBereiche einen entsprechend hohen Anteil gelb-pigmentierter Microbacterium bzw.Arthrobacter Bakterien aufwiesen.

Ein Test in der Praxis wurde mit 4.000 l Kesselmilch durchgeführt. Mit gefrier-getrockneten G. candidum, S. equorum, Halomonas sp., A. nicotianae und M. gubbeenensePräparationen wurden Limburger Käse im Reifungsverlauf viermal geschmiert. DieEntsäuerung der Käseoberfläche die Entwicklung der Hefen war normal, die Entwicklungder Rotschmierebakterien und der typischen Oberflächenfarbe war langsamer als imLaborversuch. Grund war vermutlich die nicht optimale Gefriertrocknung der Kulturen imLabor. Die Käse wiesen bis zum Packtag keine messbaren Verunreinigungen mitPseudomonaden, Enterokokken und Enterobakterien auf.

Summary

Bockelmann, W., Willems, P., Rademaker, J., Noordman, W., Heller, K.J.: Cultures forsurface ripening of smeared soft cheese. Kieler Milchwirtschaftliche Forschungsbe-richte 55 (4) 277-299 (2003)

26 Microbiology (Soft cheese, red smear, defined culture, “old-young” procedure)

The surface microflora of smear soft cheeses showed distinct differences to semi-soft(Tilsit-type) cheeses. Highest cell counts were found for the yellow pigmented coryneformMicrobacterium gubbeenense. A low proportion of yellow pigmented coryneformArthrobacter nicotianae was also detected. Cream coloured Corynebacterium caseicomprised 10-30 % of the total bacterial surface flora. Brevibacterium linens was foundin variable but low cell counts in the surface microflora. For one cheese factory orangepigmented motile rods (Halomonas sp.) were typical. On all cheeses analysed,Debaryomyces hansenii and Geotrichum candidum were the predominant yeast species.Staphylococcus equorum typical for semi-soft cheeses was not detected. All cheesesshowed bacterial contamination with enterococci and enterobacteria in variable degree.Mould contamination was not detected on any of the soft cheeses analysed.

The screening for surface microorganisms showed that D. hansenii was essential fordeacidification of the cheese surface and G. candidum was important for appearance andaroma development, which was similar to that of B. linens. Isolated strains of the abundantMicrobacterium and Arthrobacter species showed similar aromatic profiles (urine-like) inliquid milk model systems where these bacteria showed yellow culture supernatants.Depending on degree of proteolysis and pH, these yellow strains could also liberate redpigments. In cultures mixed with brevibacteria, corynebacteria and Geotrichum candidum,

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microbacteria and Arthrobacter developed a typical smear cheese aroma dominated byaromatic sulfur components. Of all species tested the important B. linens und M.gubbeenense species showed the highest degrees of salt tolerance whereas A. nicotianaestrains showed the lowest.

For typical ripening D. hansenii (in cheese brines or smear) and G. candidum (in thecheese milk) were essential. The use of different Microbacterium and Arthrobacterspecies and B. linens strains had only a minor effect on appearance and aroma ofcheeses. The use of S. equorum in cheese brines together with D. hansenii led to a fasterdeacidification of the cheese surface during the first 7 days as compared to typically old-young smeared soft cheeses. A contribution to aroma development was not observed forS. equorum, however, due to the orange pigments a contribution to the development ofthe orange appearance of the soft cheese can be assumed. The presence ofCorynebacterium species was not essential for typical ripening. Instead, the reddiscolouration observed at the edges of the cheeses could be related to a high percentageof C. casei. Orange areas showed higher cell counts of yellow microbacteria or Arthrobacter.

A selected defined surface culture was used on pilot scale (4.000 l cheese milk). Usinglyophilised G. candidum, S. equorum, Halomonas sp., A. nicotianae and M. gubbeenensepreparations, Limburg cheeses were smeared 4 times during ripening. Development ofyeast cell counts was normal, growth of smear bacteria as well as colour- and aromadevelopment was typical but slower than on lab scale.

Résumé

Bockelmann, W., Willems, P., Rademaker, J., Noordman, W., Heller, K.J.: Culturespour la maturation de la croûte des fromages à pâte molle, enduit de morge KielerMilchwirtschaftliche Forschungsberichte 55 (3) 277-299 (2003).

26 Microbiologie (fromage à pâte molle, morge rouge, culture définie, méthode „old-young“ )

En analysant les microflores des croûtes de fromages à pâte molle, on a pu constaterde grandes différences avec les fromages à pâte semi-dure, enduit de morge. Les teneursbactériennes les plus élevées ont été relevées pour Microbacterium gubbeenense àpigments jaunes. Pour Arthrobacter nicotianae, elles étaient moins importantes.Corynebacterium casei à pigments beige-rougeâtre ont contribué avec 10-30% à la flore.Brevibacterium linens n’était que très faiblement représenté sur la flore de la croûte. Dansune fromagerie, on a constaté la présence typique élevée (35%) de bâtonnets mobilesà pigments orange clair, identifiés comme Halomonas sp.. Les levures Debaryomyceshansenii et Geotrichum candidum ont été identifiées sur tous les fromages à pâte molle.Des staphylocoques (S. equorum) typiques pour le fromage à pâte semi-dure n’ont pasété détectées. Tous les fromages ont été contaminés par des entérocoques, pseudo-monades et entérobactéries. Des moisissures étrangères n’ont pas été identifiées sur lesfromages.

Le screening à la recherche de souches appropriées a souligné l’importance de D.hansenii pour la désacidification de la croûte (=formation de morge) et de G. candidumpour l’apparence (zones blanches) et l’arôme, comparable à celui de B. linens. Dessouches isolées des espèces fréquentes Microbacterium et Arthrobacter ont montré desprofiles aromatiques très comparables (odeur d’urine). En culture liquide, ces groupes debactéries avaient des excédents de culture jaunes, mais également rouges selon le degré

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de protéolyse et la valeur pH. Dans des cultures mixtes à brévibactéries, corynebactérieset Geotrichum candidum des nitrobactéries ont développé un arôme volatile typique pourle fromage enduit de morge rouge, dominé par des composantes sulfuriques trèsintensives. De toutes les espèces analysées, B. linens et M. gubbeenense, très importantespour le fromage à pâte molle, ont montré une grande tolérance envers le sel tandis quela tolérance de Halomonas sp. était moins grande, jusqu’à environ 5% de NaCl. Lamaturation de fromages d’essai dépendait avant tout de l’occurrence de D. hansenii etG. candidum.

Des espèces différentes de Microbacterium et d’Arthrobacter ainsi que les souches B.linens ont eu un effet minimal sur l’apparence et l’arôme des fromages. L’utilisation de S.equorum dans le bain de saumure ensemble avec D. hansenii a mené à une désacidificationnettement plus rapide de la croûte pendant les 7 premiers jours de maturation encomparaison avec les fromages à pâte molle „old-young“. Un effet de cette espèce surl’arôme n’a pas été constaté. Il est probable qu’un effet sur la coloration du fromagerésulte des pigments orange de S. equorum. La présence de l’espèce corynebacteriumn’était pas nécessaire pour la maturation. Un haut dosage menait même à une colorationrouge atypique avant tout sur les bords du fromage d’essai. Il s’est avéré que des zonesrouges ont une teneur élevée en C. casei et que des zones typiquement orange ont uneteneur élevée en Microbacterium à pigments jaunes, voir en bactéries Arthrobacter .

Dans la pratique, un essai a été réalisé avec 4.000l de lait de fromagerie. En utilisantdes préparations lyophilisées G. candidum, S. equorum, Halomonas sp., A. nicotianae etM. gubbeenense des fromages Limburger ont été enduits de morge à quatre reprisespendant la maturation. La désacidification de la croûte ainsi que le développement deslevures étaient normales tandis que la formation des bactéries de morge rouge et de lacouleur typique de la croûte était plus lente que lors de l’essai au laboratoire. La raisonen était probablement une lyophilisation non-optimale des cultures au laboratoire.Jusqu’à leur emballage les fromages n’étaient pas contaminés par des pseudo monades,dés entérocoques et des entérobactéries.