JUL - 492 - ZO Junl1967

KERNFORSCHUNGSANLAGE JCJLICH DES LANDES N 0 R DR HE 1 N ·WESTFALEN • E. V.

Arbeitsgruppe Institut für Zoologie

Lebendbeobachtungen und

elektronenmikroskopische Untersuchungen

der Neuentstehung von Mitochondrien

in gezüchteten Hühnerherzzellen

von

Ernst &Yendt und Dieter ...§.._chäfer

Als Manuskript gedruckt

Berichte der Kernfo rsch u n 91a n 1 a g e Jülich - Nr. 492

Arbeitsgruppe Institut für Zoologie Jül - 492 - ZO

Dole.: Animal Cells - Electron Microscopy Mitochondria - Development

OK: 591.81 : 537.533.35 576.311.347: 576.1

Zu beziehen durch: ZENTRALBIBLIOTHEK der Kernforschungsanlage JOlich, Jülich, Bundesrepublik Deutschland

Lebendbeobachtungen und

elektronenmikroskopische Untersuchungen

der Neuentstehung von Mitochondrien

in gezüchteten Hühnerherzzellen

von

ErnsthY'endt und Dieter _ichäfer

- 1 -

Einleitung

Die Mitochondrien haben als Reaktionsorte der Energiegewinnung

für das Leben der Zelle eine zentrale Bedeutung (9). Die An­

zahl der in der lebenden Zelle vorhandenen Mitochondrien paßt

sich dem Energiebedarf der jeweilig herrschenden Stoffwechsel­

situation an (13). Daher werden in der Interphasezelle immer

wieder neue Mitochondrien gebildet, wenn durch eine Steigerung

des Stoffwechsels der Energieverbrauch wächst oder wenn geal­

terte Mitochondrien ersetzt werden müssen. Auch die aus einer

Mitose hervorgegangenen jungen Zellen, auf die sich die Mito­

chondrien der Mutterzelle rein zufallsmäßig verteilen (6),

müssen ihr Chondriom komplettieren (4), um ihren Energiehaus­

halt decken zu können.

Die Frage, auf welchem Wege die tierische Zelle ihr Chondriom

vermehrt oder ergänzt, hat die Cytologen seit langem beschäf­

tigt und zu unterschiedlichen, manchmal auch widersprüchlichen

Ergebnissen geführt. Eine Zusammenfassung einschlägiger Lite­

ratur findet sich bei Wohlfarth-Bottermann (36). Nach Wohl­

farth-Bottermann (36) kann die Vermehrung der Mitochondrien

auf zwei grundsätzlich verschiedene Weisen erfolgen, nämlich

1. durch Fragmentierung aus ihresgleichen und 2. aus anders­

artigen Zellstrukturen, d. h. durch Entstehung de novo. Wäh­

rend die Vermehrung des Chondrioms über den Weg der Teilung

schon vorhandener Mitochondrien durch Versuchsergebnisse bei

Ciliaten (36) überzeugend belegt werden konnte, bestehen hin­

sichtlich der Neubildung aus andersartigen Vorstufen noch er­

hebliche Ungewißheiten, da bisher keine Übereinstimmung dar­

über erzielt werden konnte, welche Zellstrukturen als Bil­

dungsorganelle der Mitochondrien anzusehen sind.

Der Versuch, die de novo-Entstehung der Mitochondrien allein

mit Hilfe elektronenoptischer Methoden morphologisch zu ana­

lysieren, stößt insofern auf Schwierigkeiten, als die normale

Neubildungsrate der Mitochondrien so gering ist, daß im Dünn­

schnittpräparat nur wenige Entwicklungsstadien angetroffen

werden. Darüber hinaus ist die Zusammenstellung der elektronen­

optischen Zustandsbilder dieser Einzelstadien zu einer lücken-

- 2 -

losen Gesamtdarstellung des Entwicklungsprozesses ohne phasen­

kontrastmikroskopischen Vergleich mit den Verhältnissen in

der lebenden Zelle recht problematisch. Für Untersuchungen

über die Neuentstehung von Mitochondrien ist es daher sinn­

voll, nach wirksamen Mitteln zu suchen, mit deren Hilfe sich

die Normalrate der Mitochondrienbildung spürbar erhöhen läßto

Hierzu ist aus Arbeiten von Hirsch (11) und Wendt (33) schon

bekannt, daß Zellen, die mit subletalen Dosen von Röntgen­

strahlen behandelt wurden, ihre Mitochondrien im Laufe eini­

ger Stunden weitgehend einschmelzen, während gleichzeitig jun­

ge Mitochondrien in großer Anzahl neu gebildet werden.

In der vorliegenden Arbeit berichten wir von Versuchen an ge­

züchteten Hühnerherzmyoblasten, bei denen wir das Chondriom

durch verträgliche Röntgenbestrahlungen abgebaut haben, um so

eine verstärkte Neubildung von Mitochondrien zu erzwingen.

Diesen Regenerationsprozess haben wir zunächst in seinen ein­

zelnen Phasen bei der lebenden Zelle beobachtet. Die dabei er­

hobenen Befunde konnten dann als Richtschnur für die nachfol­

gende elektronenmikroskopische Analyse dieses Vorganges ver­

wendet werden. Eine weitere wertvolle Hilfe f'ür die elektronen­

optischen Untersuchungen ergab sich aus der Verwendung von

Glutaraldehyd als Fixierungsmittel, weil so eine sichere Ab­

grenzung der Mitochondrienvorstufen von andersartigen Zell­

strukturen möglich wurde.

Material und Methoden

a. Lichtmikroskopie und Bestrahlungstechnik

Herzexplantate 8tägiger Leghornembryonen wurden zunächst 8 Ta­

ge lang in Rollertubes vorgezüchtet und dann als Deckglaskul­

turen auf' Maximowkammern umgesetzt. Nach 2 weiteren Kulturta­

gen konnten wir die gut entwickelten Deckglaskulturen zur Be­

strahlung und Lebendbeobachtung auf planparallele Beobachtungs­

kammern übertragen. Das Kulturmedium bestand aus der synthe­

tischen Nährf'lüssigkeit nTCM" der Behringwerke, das mit 5 % Embryonalextrakt von Btägigen Leghornembryonen und J % mensch-

- 3 -

lichem Nabelschnurserum versetzt war. Die phasenkontrastmikro­

skopischen Lebendbeobachtungen wurden mit einem Ortholux-Mikro­

skop durchgeführt, das in einen Hüllthermostaten (37°) einge­

baut war. Als Bestrahlungsgerät diente eine mit Beryllium­

fenster (Eigenfilterwert 1,6 mm Be) ausgerüstete Spektralana­

lysenröhre. Die Bestrahlungen erfolgten bei 40 kV durch ein

o,6 mm dickes Aluminiumfilter und einer Dosisleistung von

600 R/min. Dabei wurden die Kulturen durch das Deckglas der

geschlossenen Kammer hindurch bestrahlt. Der Objektabstand be­

trug 25 cm. Zur Dosismessung diente eine Weichstrahlkammer.

Für Vitalfärbungen verwendeten wir polychromes Methylenblau,

das im Verhältnis 1 : 20000 mit physiologischer Lösung nach

Pannet und Compton verdünnt wurde.

b. Elektronenmikroskopische Präparation

Zur elektronenmikroskopischen Untersuchung wurden die Hühner­

herzmyoblasten 2 1/2 Tage lang in Polypropylen-Petrischalen

bei 37° C gezüchtet und bei der gleichen Temperatur bestrahlt.

Die Fixierung der gezüchteten Zellen erfolgte nach der durch

Weissenfels (30) modifizierten Methode von Gordon, Miller und

Bensch (8) mit 2 % Glutaraldehyd + 0,5 % CaC12 in 0,05 M

Cacodylatpuffer, pH 7,4, 1/4 Std bei 4° C. Nach dem Auswaschen

des Glutaraldehyds mit 6,5 % Sucrose in 0,05 M Cacodylatpuffer­

lösung bei pH 7,4 wurde das Untersuchungsmaterial osmiert und

im 70 %igen Alkohol der Entwässerungsreihe mit 1 % Phosphor­

wolframsäure und 1 % Uranylacetat 3 Std nachkontrastiert. Die

gesamte Präparation erfolgte in Kunststoffpetrischalen, die

nach der Polymerisation ohne Beschädigung des Objektes leicht

vom Vestopalblock entfernt werden konnten.

Zur Herstellung der Dünnschnitte dienten Mikrotome der Fa.

LKB. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden mit dem

Zeiss EM 9 auf 6,5 x 9 cm Agepe-Film hergestellt. Für die Aus­

wertung lagen 1200 Mikrofotos vor.

Für beratende Hilfe danken wir Herrn Prof. Dr. R. Danneel und

Herrn Prof. Dr. N. Weissenfels, für technische Unterstützung

Frau B. Zarbock, Frl. I. Spieckermann und Frl. I. Rosocha.

- 4 -

Ergebnisse

a. Lichtmikroskopische Befunde

1.) Die Mitochondrien der unbestrahlten Myoblastenzelle

Im lebenden Hühnerherzmyoblasten lassen sich die Mitochondrien

mit dem Phasenkontrastmikroskop gut beobachten. Ihre Zahl

wechselt je nach dem Alter und dem Zustand der Zelle zwischen

50 und 80 Stück. Obschon ihre Gestalt in mannigfacher Weise

variiert, lassen sich drei Grundtypen unterscheiden, nämlich

Faden-, Keulen- und Kugelmitochondrien. Daneben treten noch

stabförmige, verzweigte, perlschnurartige und in anderer Weise

unregelmäßig geformte Mitochondrien auf, die aber alle als

vorübergehende Abwandlungen des Fadentyps anzusehen sind. Die

bis zu 10 f langen und 0,5 - 1 p dicken Fadenmitochondrien

übertreffen die übrigen Formen bei weitem an Größe. Die Länge

der Keulenmitochondrien, die aus einem kugeligen Anfangsab­

schnitt (Durchmesser 0,3 - 1 p) und einem dünneren fädigen

Schwanzteil bestehen, beträgt höchstens 4 f • Der Durchmesser

der Kugelmitochondrien schwankt zwischen 0,3 und 1 P• Viel­

fach liegt die Größe der Keulen- und Kugelmitochondrien auch

noch unter den hier angegebenen Meßwerten, d. h. also an der

Grenze des Auflösungsvermögens des Lichtmikroskops. Daß es

sich auch bei diesen winzigen Partikeln um Mitochondrien han­

delt, kann man aber bei längerer Lebendbeobachtung eindeutig

erkennen, da diese Strukturen allmählich kräftiger werden und

die Gestalt von Fadenmitochondrien annehmen. Ferner lassen

sie sich mit verschiedenen Vitalfarbstoffen in der für Mito­

chondrien charakteristischen Weise anfärben.

2.) Die Mitochondrien der bestrahlten Zelle

Der Einfluß ionisierender Strahlen auf die Mitochondrien tie­

rischer Zellen ist schon mehrfach untersucht worden. Bei licht­

mikroskopischen Beobachtungen an lebenden und fixierten Zellen

verschiedener Herkunft ließ sich feststellen, daß starke Strah­

lendosen Deformationen, Fragmentationen und eine Teilauflösung

des Chondrioms zur Folge haben (11, 16, 25, 20, 33). Eine Br-

- 5 -

weiterung dieser Ergebnisse brachten elektronenoptische Unter­

suchungen bestrahlter Zellen, wonach sich die Innenstrukturen

der Mitochondrien auch schon nach der Einwirkung relativ ge­

ringer Strahlendosen verändern und sogar völlig auflösen (7, 3, 26, 19, 35, 27, 23).

Bei unseren eigenen Versuchen an Htihnerherzmyoblasten in Ge­

webekulturen konnten wir nach Bestrahlungen mit Röntgendosen

von 200 - 1500 R an den lichtmikroskopisch erfaßbaren Struk­

turen der Mitochondrien noch keine signifikanten Veränderungen

feststellen. Erst nach stärkeren Bestrahlungen mit 2000 bis

3000 R, einem Dosisbereich, der jedoch noch unter der Letali­

tätsgrenze liegt (32, 33), ließen sich bei der phasenkontrast­

mikroskopischen Lebendbeobachtung mit Sicherheit Veränderungen

des Chondrioms erkennen.

Dabei kommt es nach einer auf die Bestrahlung folgenden 4-bis 5stündigen Latenzzeit, während der die Mitochondrien sich

ganz normal verhalten, zunächst zu einer merklichen Einschrän­

kung ihrer Bewegungsaktivität. Gleichzeitig bringen die Mito­

chondrien vielfach seitliche Verzweigungen und Verästelungen

hervor, von denen sich bald mehr oder weniger große Teilstücke

ablösen. Ferner kann man sehen, wie die Mitochondrien sich an

einer oder an mehreren Stellen aufblähen, wobei sie ein ballon­

artiges Aussehen erhalten. Zugleich ziehen sie sich allmählich

aus den Zellausläufern zurück und suchen die zentralen Zellbe­

zirke auf. In der Regel umlagern sie dann 6 - 7 Stunden nach

der Bestrahlung das Zentroplasma und den Zellkern. Hier zertei­

len sie sich meist in etwa 3 bis 4 p lange Bruchstücke, die

alsbald in ihrer mittleren Region beträchtlich anschwellen,wo­

bei die Enden dieser Fragmente aber ihre ursprüngliche Dicke

von etwa 1 p beibehalten. Auf diese Weise verarmen die distalen

Zellregionen mehr und mehr an normalen Mitochondrien. An ihrer

Stelle erscheinen in dem für die weitere Beobachtung frei ge­

wordenen Cytoplasma zahlreiche Kugelmitochondrien von 0,3 bis

0,5 f Durchmesser, die im Phasenkontrastmikroskop ein dunkel­

graues Aussehen haben. In Anlehnung an die Arbeiten von Weissen­

fels (29) bezeichnen wir diese Kügelchen als Promitochondrien.

Die weitere Lebendbeobachtung zeigte auch, daß sich aus die-

- 6 -

sen Partikeln dünne fädige Anhänge entwickeln, wodurch sie ein

keulenförmiges Aussehen erhalten. Diese Keulenmitochondrien

wachsen schließlich im Verlauf einiger Stunden zu Fadenmito­

chondrien normaler Größe heran.

Die Phasenkontrastaufnahmen der Abb. 1 a - d sollen dies ver­

anschaulichen. Bild 1a zeigt den Ausläufer eines Hühnerherz­

myoblasten in Gewebekultur, der 6 Stunden zuvor mit 2400 R be­

strahlt wurde. Man sieht hier einige durch Strahlenwirkung

pathologisch veränderte Mitochondrien (M), die stark verdickt

sind und seitliche Verzweigungen ausgebildet haben. Über das

weitere Schicksal dieser degenerierenden Mitochondrien geben

die in einstündigem Abstand aufgenommenen Zustandsbilder b -

d Auskunft; wie man sieht, zerfallen die Mitochondrien in mehre­

re Teilstücke, die kernwärts abwandern.

In der Peripherie und im Mittelteil der Zelle erkennt man auf

den Photographien b - d deutlich kleine, kontrastreiche Kügel­

chen (PM1 ) sowie blassere fädige, teilweise keulenförmige Ge­

bilde unterschiedlicher Größe (PM2 ). Bei den ersteren handelt

es sich, wie die fortlaufende Lebendbeobachtung eindeutig be­

wies, um kugelige Promitochondrien und bei den letzteren um

die aus diesen hervorgehenden jungen Mitochondrien in verschie­

denen Entwicklungszuständen. Diese Bilder zeigen also, daß in

den bestrahlten Myoblastenzellen nicht nur Mitochondrien abge­

baut werden, sondern auch, daß diese anschließend sehr rasch

durch neue ersetzt werden können.

Dieser Vorgang wird noch deutlicher, wenn man die lebenden

Zellen nach der Bestrahlung mit polychromem Methylenblau vital

anfärbt und im Hellfeldmikroskop untersucht. Polychromes

Methylenblau besteht aus verschiedenen Farbstoffkomponenten

(10), von denen das Tetramethylthionin die erwachsenen Mito­

chondrien blau färbt (14, 31), während das Trimethylthionin

die kugeligen Promitochondrien rot tingiert.

Ein entsprechendes färberisches Verhalten zeigen auch die

Mitochondrien bzw. ihre Vorstufen in den bestrahlten Myo­

blastenzellen. Wir konnten immer wieder feststellen, daß sich

die rundlichen Promitochondrien sowie die kugeligen Anfangs­

abschnitte der keulenförmigen Mitochondrien, aus denen sich

- 7 -

die jungen Mitochondrien entwickeln, deutlich rot färbten.

Die fädigen Anhänge der Keulenstadien sowie die jungen und

die ausgewachsenen Mitochondrien nahmen dagegen stets eine

kräftige blaue Färbung an.

b. Elektronenmikroskopische Befunde

Eingehende methodologische Untersuchungen haben schon früher

ergeben, daß gezüchtete Hühnerherzmyoblasten sich mit Glutar­

aldehyd (8) nahezu optimal fixieren lassen. Die gute Struktur­

erhaltung der mit Glutaraldehyd fixierten Zellen ist schon bei

der lichtmikroskopischen Kontrolle erkennbar (JO) und wirkt

sich ganz besonders vorteilhaft im Bereich der Feinstrukturen

aus. So läßt sich das endoplasmatische Retikulum (ER in Abb. Z) aufgrund seiner dichten Füllung klar erkennen, und sogar seine

vesikulären Anteile können von den fast leer erscheinenden

Golgi-Vakuolen (GV in Abb. 2) eindeutig unterschieden werden.

Das gleiche gilt für die Knospen des endoplasmatischen Retiku­

lums (j PM in Abb. Ja und Jb, PM in Abb. Je), die in be~trahl­

ten (2400 R) Hühnerherzmyoblasten häufig vorkommen und die­

selben Strukturmerkmale aufweisen wie die von Weissenfels (29)

und Danneel (5) beschriebenen Promitochondrien.

Die ausgezeichnete Fixierungsleistung des Glutaraldehyds hat

uns bewogen, das Problem der de novo-Entstehung von Mitochon­

drien bei Hühnerherzmyoblasten im Anschluß an unsere Lebend­

beobachtungen noch einmal elektronenmikroskopisch zu überprü­

fen.

Nach Glutaraldehyd-Fixierung haben die ER-Knospen (j PM in

Abb. Ja und Jb) eine wesentlich dichtere Füllung als das endo­

plasmatische Retikulum selbst und lassen sich daher gut von

den Retikularschläuchen abgrenzen (Doppelpfeil in Abb. Jb).

Während diese Knospen des ER, die wir schon als Promitochon­

drien bezeichnen können, noch im Verband mit dem Retikular­

system stehen, wird bereits die innere der beiden Mitochon­

drienhüllmembranen sichtbar (Pfeil in Abb. Jb), von der aus

später die Cristae mitochondriales in den Innenraum vorstoßen

(Pfeilmarkierungen in Abb. Je). Von diesem Zeitpunkt an sind

- 8 -

die kontrastreichen Abkömmlinge des Retikularsystems mit

Sicherheit als Promitochondrien identifizierbar.

Es muß aber auch mit der Möglichkeit gerechnet werden, daß die

in den Abb. Ja, b und c erkennbaren Entwicklungsvorgänge erst

nach der Ablösung der Knospen vom ER ablaufen. So erkennt man

in Abb. Jd und Je junge Promitochondrien (PM) ohne nachweis­

bare Verbindung mit dem Retikularsystem. Die Pfeilmarkierungen

bei diesen Aufnahmen weisen wieder auf Cristae hin.

Die Entwicklung der kugel- bis eiförmigen Promitochondrien von

ca O,J p Durchmesser zu normalen Fadenmitochondrien von 5 -10 p Länge verläuft so, wie schon die lichtmikroskopischen

Untersuchungen ergeben haben. Im Elektronenmikroskop sieht man

auch die keulenartigen Übergangsf'ormen sehr deutlich (Abb. Je

und Jf). Sie weisen zwei verschiedene Abschnitte auf, nämlich

einen membranfreien, grundsubstanzhaltigen Bereich (G) und einen

mit Cristae (Cr) angefüllten Teil. Viele Anzeichen sprechen da­

für, daß das Längenwachstum dieser Promitochondrien immer in

den mit Cristae besetzten Abschnitten erf'olgt. Hierbei dürfte

die Grundsubstanz teilweise zur Bildung der Cristae verwendet

werden.

In Übereinstimmung mit den Lebendbeobachtungen läßt sich also

aus den elektronenoptischen Bildern entnehmen, daß die Hühner­

herzmyoblasten 8 Stunden nach der Bestrahlung mit 2400 R schon

wieder über funktionstüchtige Mitochondrien verfügen. Von die­

sem Zeitpunkt an kann das Chondriom der Zellen wahrscheinlich

auch wieder durch Fragmentierung von Mitochondrien vervollstän­

digt werden. Hierauf deutet jedenfalls die Einschnürung (Pfeil­

markierung) des großen Mitochondriums in Abb. Jg hin.

- 9 -

Diskussion der Ergebnisse

Über die Entstehung und Vermehrung der Mitochondrien wurden in

den letzten Jahren zahlreiche, einander oft widersprechende An­

sichten geäußert, wie aus den zusammenfassenden Darstellungen

von Seelbach (28) und Wohlfarth-Bottermann (J6) hervorgeht.

Nach den elektronenmikroskopischen Untersuchungen von Wohlfarth­

Bot termann (J6) können die Mitochondrien unter normalen Bedin­

gungen aus ihresgleichen entstehen, also durch Teilung oder

Fragmentierung bereits vorhandener Mitochondrien. Hierfür spre­

chen auch die Lebendbeobachtungen an subletal bestrahlten und

unbestrahlten Zellen (Diskussionsbeitrag Weissenfels, J6). Wird

jedoch das Chondriom der Hühnerherzmyoblasten durch eine Be­

strahlung mit 2400 R geschädigt, dann greifen diese Zellen weit­

gehend, vielleicht sogar ausschließlich, auf die Möglichkeit

zurück, Mitochondrien über Promitochondrien aus dem ER de novo

zu bilden.

In Übereinstimmung mit unseren Befunden nehmen auch Robertson

(21) und Andre (1) an, daß Mitochondrien vom endoplasmatischen

Retikulum aus neu entstehen können. Untersuchungen an Hefe­

zellen (15) und regenerierenden Leberzellen (2) haben eben­

falls gezeigt, daß hier die neuen Mitochondrien dem Retikular­

system entstammen. Den Mechanismus der lokalen ER-Differen­

zierung zur Mitochondrien-Vorstufe kennen diese Autoren ebenso­

wenig wie wir.

Wie Weissenfels (29) und Wendt (JJ) bereits beobachtet haben,

treten in unbestrahlten Hühnerherzmyoblasten ebenfalls Pro­

mitochondrien und keulenförmige Mitochondrienvorstufen auf.

Auch in unseren elektronenmikroskopischen Bildern von unbe­

strahl ten Hühnerherzmyoblasten fanden wir regelmäßig Promito­

chondrien, wenngleich in relativ geringer Anzahl. Die morpho­

logischen Befunde stimmen mit den Beobachtungen an bestrahlten

Zellen überein. Die Mitochondrienneubildung verläuft also bei

bestrahlten und unbestrahlten gezüchteten Hühnerherzmyoblasten

grundsätzlich gleich; die Intensität der de novo-Entstehung

richtet sich dabei aber natürlich nach den Erfordernissen der

Zelle.

- 10 -

Der hohe Bedarf an funktionstüchtigen Mitochondrien in tei­

lungsaktiven und in strahlengeschädigten Zellen ist verständ­

lich, weil sowohl die normalen Synthesevorgänge als auch die

Regenerationsprozesse der Zelle außerordentlich energiezehrend

sind. Unter diesem Gesichtspunkt beurteilt auch~ (2) die

Notwendigkeit einer Mitochondrienneubildung nach Hepatektomie

bei Mäusen. Unsere eigenen und die hier angeführten Ergebnisse

anderer Autoren liefern aber noch keine Hinweise auf eine

etwaige Beteiligung von spezifischer Mitochondrien-DNS (17,

18) an der Entstehung und Entwicklung dieser Zellorganelle.

Vergleicht man die Wirkung von zwei verschieden hohen sub­

letalen Röntgendosen auf die Mitochondrien gezüchteter Hühner­

herzmuskelzellen, so ergibt sich zunächst ein etwas überra­

schendes Ergebnis. Nach einer Bestrahlung mit 1200 R (23) fin­

det man erst 12 - 15 Std später wieder normale Mitochondrien,

während nach der Einwirkung von 2400 R schon 8 - 12 Stunden

später funktionstüchtige Mitochondrien in den Zellen nachge­

wiesen werden können. Die Erklärung hierfür ergibt sich aber

aus der Tatsache, daß die Mitochondrien bei der kleineren

Dosis nur reversibel geschädigt werden und nur Schwellungen

in begrenzten Bereichen aufweisen, die alsbald wieder behoben

werden. Nach der Bestrahlung mit 2400 R sind aber die meisten

Mitochondrien irreversibel geschädigt, so daß neue Mitochon­

drien aus Vorstufen gebildet werden müssen, damit die Zellen

nicht zugrunde gehen. Dieser Prozeß läuft merkwürdigerweise

in kürzerer Zeit ab als die Behebung der Schäden an den mit

1200 R bestrahlten Mitochondrien.

- 11 -

Zusarnmenfassunß_

An bestrahlten und unbestrahlten Hühnerherzmyoblasten in vitro

wurde die Mitochondrienneubildung licht- und elektronenmikro­

skopisch untersucht.

Die phasenkontrastmikroskopische Lebendbeobachtung erbrachte,

daß die Zellen 6 - 7 Std nach einer Röntgenbestrahlung mit

2400 R merklich an funktionstüchtigen Mitochondrien verari:ien,

dann aber zunehmend kugelige Promitochondrien neu bilden, aus

denen sich Mitochondrien von normaler Größe entwickeln.

Die elektronenmikroskopischen Ergebnisse lassen sich anhand

des Schemas in Abb. 4 wie folgt zusammenfassen:

Das endoplasmatische Retikulum erzeugt Knospen, die als junge

Promitochondrien (a) bezeichnet werden ~issen. Während sie noch

am Retikularsystem festsitzen (b 1 ) oder erst nach ihrer Los­

lösung vom endoplasmatischen Retikulum (b2 ) beginnen sie mit

der Ausbildung der inneren Hüllmembran. Später lassen die ku­

geligen Promitochondrien in einem begrenzten Bereich die ersten

Cri stae mi t'ocllondriales erkennen ( c) und strecken sich gleich­

zeitig in die Länge (d). Dabei entstehen Keulenformen (e), deren

kugelförmiger Teil mit einer Grundsubstanz angefüllt ist und

offenbar das Material für die weitere Cristae-Bildung liefert,

die mit dem Auswachsen des Mitochondrienschlauches einhergeht. ,, Die Promitochondrien gehen also in den fertigen Mitochondrien

( f) auf.

Summary

In irradiated and unirradiated chicken heart myoblasts culti­

vated in vitro, the formation of mitochondria was studied by

means of phase contrast and electron microscopy.

By phase contrast observations of' the living object it was

found, that 6 to 7 hours af'ter irradiation with 24Gü tl, the

number of functionally active mitochondria decreased; sub­

sequently there appeared in the cytoplasm numerous smnll

spherical pre-mitocltondria which soon increased in nurnber ancl

develop into mitochondria of normal size and structure.

- 12 -

The results with the electron microscope are illustrated in

the diagram (Plate 4). · t' 1 produces buds which must be considered The endoplasmic re icu um

as young pre-mitochondria (a). While they are still attached to

the reticular system (b1

) or after detaching from the endo­

plasmic reticulum (b2

) they begin to establish an interior

membrane. Later on, in limited areas, the spherical pre-mito­

chondria show the typical arrangement of cristae mitochondriales

(c) and simultanously they increase in length (d). Therewith the

pre-mitochondria assume a club-shaped form (e) the spherical

portion of which is filled with a dense ground-substance. This

ground-substance obviously produces the material for the further

formation of cristae mitochondriales which accompanies the out­

growth of the mitochondrial tube. Thus the pre-mitochondria

transform into the definitive mitochondria (f).

Resume

Nous avons irradie des myoblasts de poulet en condition de

culture pour eclaircir la regeneration des mitochondries

d~fectueuses.

L'observation des cellules vivantes en contraste de phase a

demontre que les cellules irradiees par 2400 r de rayons X

s'appauvrissent tout d'abord en mitochondries, mais forment

ensuite par creation nouvelle des pro-mitochondries spheriques

qui plus tard se transforment en mitochondries de taille normale.

Les observations en microscopie ~lectronique peuvent itre

resumees ä l'aide de la figure 4. Le reticulum endoplasmique

des cellules irradiees produit d'abord des boutons qu'on peut

dejä designer comme des jeunes pro-mitochondries (a). Celles-ci

commencent immediatement ou apres leur separation de l'ergasto­

plasme (b 1 , b 2 ) ä former des cr~tes mitochondriales (c} et puis

ä s'allonger. Le bout gonfle des jeunes mitochondries (e) con­

tient evidemment le materiel necessaire pour completer les

cr~tes qui en outre s 1 augmentent pendant l'acroissement des

mitochondries.

Ainsi les mitochondries d~truites par irradiation sublethale

sont recr~es aussit~t en rapport avec le r~ticulum endoplas­

mique.

- 1 J -

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J\bb. 1 Degeneration und Neubildung von Mitochondrien in

einer mit 2400 R bestrahlten Zelle. Aufnahmeabstand 1 Stun­

de. M = geschädigte Mitochondrien: PM1= Promitochondrien:

PM2

= junge Mitochondrien; PMJ = aus Promitochondrien neu

gebildete Mitochondrien. Lebendaufnahmen, Phasenkontrast,

Vergr.: 2000 x

J\.bb. 2 Elektronenmikroskopisches Ausschnittsbild eines be­

strahlten Hübnerherzmyoblaaten (2400 R). Schnitt durch die

kernnahe Golgi-Zone. Bei guter Erhaltung des Grundcytoplasmas

heben sich die leer erscheinenden Golgi-Vakuolen (GV) deut­

lich von dem angefüllten endoplasmatischen Retikulum (ER)

ab. K =Kern. Vergr.: 50 000: 1

J\bb. 3 ~ Cytoplasmaausschnitte von 2400 R bestrahlten

Hühne1herzmyoblasten.

a Ausscbnittsbild mit Cieternen des endoplasmatischen

Retikulums (ER) und einem jungen Promitochondrium (j PM)

mit dunkler Füllung.

b Kontrastreiche Knospe des ER. Der Doppelpfeil weist aur

die Verbindungsstelle der Knospe mit dem ER hin, die Pfeil­

markierungen auf die entstehende innere Mitochondrienmembran.

c Differenzierung der mitochondrialen Xnnenstrukturen (Preile).

d Promitochondrien ohne sichtbare Verbindung zum ER. Rechts

noch undifferenziert, Mitte Ausbildung der Innenstrukturen

(Pfeilmarkierungen)

e Sehr junges Keulenstadium zu Beginn des Längenwachstums.

G = Grundsubstanz, Cr = Cristae.

f Späteres Keulenstadium.

g Fertiges Mitochondrium mit seitlicher Verzweigung.

Vergr.: 50 000: 1