This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Ober die Isolierung eines Metamorphose-Hormons der Insekten in kristallisierter Form

V o n A D O L F B U T E N A N D T u n d P E T E R K A R L S O N

Aus dem Max-Plandc-Institut für Biochemie, Tübingen (Z. Naturforschg. 9 b,389—391 [1954]; eingegangen am 8. Mai 1954)

Aus Seidenspinner-Puppen wurde durdi Methanolextraktion und Anreicherung in Bezug auf das im Test am abgeschnürten Abdomen von Calliphora-Larven wirksame Prinzip ein kristalli-sierter einheitlicher Stoff vom Schmp. 235—237° erhalten, der im Calliphora-Test mit 0,0075 y wirksam ist. Wie Versuche an Saturniiden-Puppen (C. M. W i l l i a m s ) zeigten, handelt es sidi um das Hormon der Prothorakaldrüsen.

Im Rahmen unserer Untersuchungen über Insekten-wirkstoffe 2 haben wir im Jahre 1943 Versuche

in Angriff genommen, die die Anreicherung und Reindarstellung der Metamorphosehormone zum Ziele haben. Es gelang nun, eines dieser Hormone in kristallisierter Form zu erhalten und durch einige chemische, physikalische und physiologische Daten zu charakterisieren.

T e s t m e t h o d e

Als physiologische Auswertungsmethode benutz-ten wir bei der Anreicherung des Wirkstoffs den von uns modifizierten3 Test an Calliphora-Maden nach B e c k e r und P l a g g e 4 : Kurz vor der Ver-puppung stehende Calliphora-Larven werden im vorderen Drittel mit einem Baumwollfaden abge-schnürt. Nur diejenigen, die nach 24 Stdn. „Halb-puparien" gebildet haben, d. h. sich nur am Vorder-teil verpuppten, werden für den Versuch verwen-det. Das verpuppte Vorderteil wird abgetrennt, und durch die Schnittstelle werden genau 0,01 ml einer wässerigen Lösung der zu prüfenden Substanz in das isolierte Abdomen injiziert. Als positive hormo-nale Reaktion gilt die Puparisierung (Braunfärbung und Verhärtung der Kutikula) der überlebenden Hinterstücke innerhalb von 24—30 Stdn. nach der Injektion. Die Berechnung des Prozentsatzes der ver-

1 A. B u t e n a n d t , Angew. Chem. 61, 262 [1949]; A. B u t e n a n d t , W. W e i d e l u. H. S c h l o ß b e r g e r , Z. Naturforschg. 4 b, 242 [1949].

2 A. B u t e n a n d t , P. K a r l s o n u. G . H a n n e s , Biol. Zbl. 65, 41 [1946].

3 P. K a r l s o n u. G. H a n s e r , Z. Naturforschg. 7 b, 80 [1952].

* E . B e c k e r u.E. P l a g g e , Biol. Zbl. 59, 326 [1939]. 5 P. K a r l s o n u. G. H a n s e r , Z. Naturforschg. 8b, 91

[1953].

puppten Testabdomina geschah in der früher5 an-gegebenen Weise; abweichend davon definieren wir heute als Calliphora-Einheit ( = C.E.) diejenige Sub-stanzmenge, die an 5 0 — 7 0 % der Versuchstiere eine Verpuppung auslöst6. Der Test hat sich in über 2000 Versuchsserien als gut reproduzierbar und sehr zuverlässig erwiesen.

A u s g a n s m a t e r i a l

Zur Gewinnung wirksamer Extrakte haben wir anfangs nach dem Vorgang von B e c k e r 7 Puppen der Schmeißfliege Calliphora erythrocephala Meig. verwendet. Später (seit 1947) haben wir fast aus-schließlich Puppen des Seidenspinners, Bombyx mori L., aufgearbeitet, da diese leichter zu beschaf-fen sind. Aus deutschen Zuchten des Sommers 1953 standen uns erstmalig größere Mengen, etwa 500 kg frischer Bombyx-Puppen (fast ausschließlich $$) zur Verfügung 8.

M e t h o d e d e r A u f a r b e i t u n g

Die in Methanol konservierten 500 kg Puppen wurden unter 50 Atm. Drude abgepreßt, der Preß-saft (etwa 6501) unter vermindertem Druck auf 30 l konzentriert und mehrfach mit Butanol ausgerührt. Der Butanolauszug wurde mit 1-proz. Schwefelsäure, 10-proz. Sodalösung und 5-proz. Essigsäure gewa-

6 Ausführlidie Beschreibung und Diskussion der Test-methode bei P. K a r 1 s o n, Habilitationsschrift Tübingen 1953.

7 E . B e c k e r , Biol. Zbl. 61, 360 [1941]. 8 Für ihre Unterstützung bei der Beschaffung der

Bombyx-Kokons danken wir Herrn Regiemngsrat Dr. M. C r e t s c h m a r , Bundesforschungsanstalt für Klein-tierzucht, Celle, und Herrn E. P o e r s c h k e , Arbeitsge-meinschaft der Seidenbauer, Celle.

sehen und eingedampft9 . Das hinterbliebene rot-braune Öl (79 g) wurde in reinem Butanol gelöst, über die 10-fache Menge Aluminiumoxyd (Aktivi-tät V nach B r o c k m a n n 10) filtriert, das Butanol-filtrat zu Trockne gebracht, in Wasser aufgenommen

Abb. 1. Gegenstromverteilung des Hormons (einmal um-kristallisiertes Präparat) im System Cyclohexan(6)-Butanol-(4)/Wasser(10) bei 19° C. Volumenverhältnis 2/3, n 30, Fraktion 27—30 einphasig entzogen, o o experimentell gefundene Verteilungskurve, x x theoretische Kurve

für K = 1,28 \

-m^u

Abb. 2. UV-Spektrum des Hormons in Äthanol (ausgezo-gen) und in Wasser (gestrichelt). Auf der Ordinate ist der

Absorptionskoeffizient a = ~ • log ° aufgetragen.

und mit Äther und Essigester ausgeschüttelt. Die wässerige Phase wurde eingedampft und hinterließ

9 Diese Operationen wurden auf Grund unserer Labo-ratoriumserfahrungen unter unserer Aufsicht im Werk der Deutschen Hoffmann - La Roche Gesellschaft, Grenzadi, durchgeführt. Der Deutschen Hoffmann - La Rodie Ge-sellschaft, insbesondere Herrn Direktor Dr. S a e n g e r , sei auch an dieser Stelle herzlich für ihre unentbehrliche Hilfe gedankt.

10 H. B r o c k m a n n u. H . S c h o d d e r . Ber.dtsch. ehem. Ges. 74, 73 [1942],

1,15 g eines rotbraunen Öls, das die Calliphora-Ein-heit in etwa 0,5 y enthielt.

Durch sorgfältig geleitete Chromatographie an Aluminiumoxyd der Aktivität IV nach B r o c k -m a n n 1 0 unter Verwendung von Essigester-Butanol (3 : 1)- und Essigester-Methanol (3 : 1)-Gemischen ge-lang es, daraus 167 mg einer hochwirksamen Frak-tion (1 C.E. = 0,1 y) abzutrennen, aus der durch An-reiben mit Essigester und wenig Methanol ein wirk-sames Kristallisat gewonnen werden konnte. Es wur-den 35 mg dieses Rohkristallisates aus 500 kg Frisch-puppen erhalten, nach einmaligem Umkristallisieren aus Essigester-Methanol verblieben 25 mg.

Zur Prüfung auf die Identität des kristallisierten Materials mit der aktiven Substanz wurde mit 10 mg eine Gegenstromverteilung im System Butanol (4 Tie.) — Cyclohexan (6 Teile)/ Wasser (10 Teile) durchge-führt (Abb. 1), die die erwartete Aktivitäts Vertei-lung aufwies. Der Verteilungskoeffizient beträgt 1,28 (bei 19° C); das aus der Verteilung wiedergewon-nene, aus Methanol-Essigester und Methanol-Aceton umkristallisierte Material enthält die Calliphora-Ein-heit in 0 ,0075 y (im Test mit 0,005 y 41%, mit 0,0075 y 6 9 % , mit 0,01 y 80% Verpuppung).

C h a r a k t e r i s i e r u n g d e r S u b s t a n z

Das reine Hormon kristallisiert aus Essigester oder Wasser in seidigen, verfilzten Nadeln (Abb. 3), die unter dem K o f i e r sehen Heizmikroskop beim raschen Erhitzen bei 161—162° eine Umwandlung (Kristall-wasserverlust?) zeigen, dabei teilweise schmelzen und rekristallisieren, um bei 235—237° endgültig zu schmelzen. — Die Substanz ist optisch aktiv, [a]p = + 58,5° ± 2°, [et] 52J6° = 82,3° ± 2° (7,00 mg in 2 ml Äthanol). Das UV-Spektrum (s.Abb. 2) weist ein ausgeprägtes Maximum bei 244 mp (in Äthanol) bzw. 249 mp (in Wasser) auf. In alkalischer Lösung findet rasche Zersetzung der Substanz unter Veränderung des Spektrums statt. — Das IR-Absorptionsspektrum zeigt eine scharfe Bande bei 6,12 p.

Zu unserer Überraschung ist das Hormon — im Gegensatz zu seinen früher n > 1 2 isolierten Begleit-stoffen — stickstofffrei. Die aus Wasser erhaltenen Kristalle erleiden beim Trocknen eine Gewichtsab-nahme von 1 0 , 2 % (wahrsdieinlich Kristallwasserver-

* Berechnet nach P. K a r l son u. E. H e c k e r , Z. Na-turforsdrg. 5 b, 237 [1950], unter Berücksichtigung des Volumenverhältnisses 2/3.

11 A. B u t e n a n d t , P . K a r l s on u. W. Z i l l i g , Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 288, 125 [1951].

12 A. B u t e n a n d t , P . K a r l s o n u. W . Z i l l i g , Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 288. 279 [1951].

lust). Aus der Elementaranalyse der getrockneten Substanz (Gef. C 69,58, H 9,62, O 21 ,17%) berechnet sich ein Atomverhältnis von C4,4117.30!. Eine Mol.-Gew.-Bestimmung konnte wegen der Schwerlöslich-keit der Substanz in Campher nicht durchgeführt werden.

Der hier beschriebene Stoff ist unseres Wissens das erste Hormon des Insektenreiches, das in reiner Form isoliert wurde. Aus biologischen Versuchen über die hormonale Steuerung der Insektenmetamor-phose 13 ist bekannt, daß drei Hormondrüsen daran beteiligt sind: Das Gehirn mit seinen neurosekreto-rischen Zellen, die Prothorakaldrüse und die Corpora allata. Jeder Häutungsschritt wird eingeleitet von einem adenotropen Hormon des Gehirns, das auf die Prothorakaldrüse wirkt und diese zur Ausschüttung eines zweiten Hormons veranlaßt. Das Hormon der Prothorakaldrüse löst die Häutung aus und lenkt sie in imaginäle Richtung, wenn nicht gleichzeitig das Hormon der Corpora allata zur Wirkung kommt und der Häutung larvalen Charakter aufprägt (vgl. das Schema bei K a r l s o n und H a n s e r 5 ) . Die Ein-ordnung des von uns isolierten Stoffes in diese Zu-sammenhänge war möglich durch das Entgegenkom-men von Prof. C a r r o l l M. W i l l i a m s , der ihn an seinen Versuchsobjekten ausgewertet hat. Nadi seinen Ergebnissen 14 vermag das hier besdiriebene Hormon an Puppen der Saturniiden Samia icalkeri

13 Zusammenfassungen: V. B. W i g g l e s w o r t h , Bull. Biol. Suppl. 33, 174 [1949]; H. P i e p h o , Verh. dtsch. zool. Ges. 1951, 62; C . M . W i l l i a m s , Harvey Lectures 47,126 [1952]; vgl. auch V. B. W i g gl es w o r t h, J. exper. Biol. 29, 620 [1952]; C . M . W i l l i a m s , Biol. Bull. 103, 120 [1952].

14 Unveröffentlichte Privatmitteilung.

(Cynthia) und Platysamia cecropia, die sich in der Diapause befinden, die Imaginalentwicklung einzu-leiten; er ist wirksam sowohl an Puppen, denen das Gehirn exstirpiert wurde, als auch am isolierten Puppenabdomen, das keine endokrinen Drüsen mehr enthält. Die in diesem Test benötigte Dosis beträgt

Vergr. etwa 300-fach.

nadi bisherigen Ergebnissen etwa 12,5 y pro Tier. Da die Weiterentwicklung des isolierten Abdomens als spezifische Reaktion auf die Wirkung der Pro-thorakaldrüse anzusehen ist, muß der von uns iso-lierte Stoff das Hormon der Prothorakaldrüse sein.

Fräulein I n g e b o r g B r a c h m a n n danken wir für die gewissenhafte Ausführung der Tierversuche und für technische Hilfe; der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e -m e i n s c h a f t haben wir für eine großzügige Sachbei-hilfe zur Beschaffung des Ausgangsmaterials zu danken.

Über die Oxydationsreaktion der Gärung V o n O T T O W A R B U R G , H E L M U T K L O T Z S C H u n d K A R L F R I E D G A W E H N

Aus dem Max-Planck-Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem (Z. Naturforschg. 9 b, 391 393 [1954]; eingegangen am 5. Mai 1954)

In wässerigen Phosphatlösungen, bei neutraler Reaktion, ohne Protein, oxydiert Pyridin-nucleotid Glycerinaldehyd.

I.

1925 fanden wir \ daß Glycerinaldehyd, der in neutraler wässeriger Lösung nicht wesentlich autoxydabel ist, bei Zusatz von Phosphat durch

i F. W i n d , Biochem. Z. 159, 58 [1925],

molekularen Sauerstoff zu Glykolsäure oxydiert wird. M e y e r h o f und L o h m a n n 2 fügten 1934 die Beobachtung hinzu, daß sich der phosphorylierte Glycerinaldehyd ( F i s c h e r - Ester) entsprechend

2 O. M e y e r h o f u. K. L o h m a n n , Biochem. Z. 271, 89 [1934],