Projekt Spielzeugmuseum Antje Ernst, Leiterin des Spielzeugmuseums.
Prof. Dr. Antje von Schaewen - Universität Münster · 27.05.2016 1 Vorlesung „Zellbiologie...
Transcript of Prof. Dr. Antje von Schaewen - Universität Münster · 27.05.2016 1 Vorlesung „Zellbiologie...
27.05.2016
1
Vorlesung „Zellbiologie Physiologie und Genetik “
SoSe 2016
Wege des Kohlenstoffs 1
Prof. Dr. Antje von Schaewen
30.05. „Aufbau pflanzlicher Kohlenhydrate“
Pflanzliche Kohlenhydrate
� Transportzucker (Di- und Oligosaccharide)
� Glucose-Polymere
Stärke (Speicherkohlenhydrat)
Cellulose (Zellwandstruktur)
Callose (zelluläre Abdichtung)
� Komplexe Oligo- und Polysaccharide
Hemicellulosen (Linker zwischen Cellulose-fribrillen)
Pektine (Zellwandmatrix)
Glykane (Bestandteil glykosylierter Proteine)
27.05.2016
2
Alle Kohlenhydrate stammen aus dem Calvin-Zyklus
Primäre Produkte sind Triose-P, Stärke und Saccharose
Merke:
Stärke dient als lokaler Speicher,
ABER
Saccharose dem Ferntransport!
Triose-P
Translokator
Calvin
Zyklus
1. Lichtreaktionen
(Bildung von ATP, NADPH)
2. Dunkelreaktionen
(Bildung von Triose-P/Stärke)
3. Triose-P Transport in das Cytosol
(Bildung von Saccharose)
4. Export von Saccharose
Export
SaccharoseTransport-Kohlenhydrat
der Pflanzen
27.05.2016
3
Kranz-Anatomie
Woher stammt der Zucker
den wir kaufen und essen?
Rohrzucker
Würfelzucker (Saccharose)
Raffinade (gebleicht)
Zuckerrohr
Zuckerrohr ist eine bekannte C4-Pflanze aus der Familie
der Süßgräser. Bildquelle: © iStockphoto.com/ Amandaliza
27.05.2016
4
Saccharose (ein Disaccharid aus Glc und Fru) ist das
wichtigste pflanzliche Transport-Kohlenhydrat
Saccharose
ist ein „nicht-reduzierender“ Zucker
(reduzierende Enden → glykosidische Bindung)
Vorlesung E. Weis (modifiziert)
GlucoseFructose
α- und β-Stereo-Isomere von
D-Glucose, d.h. Stellung der
Hydroxylgruppe (-OH) am
anomeren C1-Atom
oci.uzh.chGleichgewicht zwischen zyklischer bzw. offener Form von Maltose
(Disaccharid aus Glucose, das bei Getreide-Vermalzung frei wird)
offen
(Aldose)
zirkulär
(Halbacetal)
„Sessel“-Darstellung
H2O anomeres
C-Atom
Reduzierende und nicht-reduzierende Zucker Reduzierende Zucker tragen freie Aldehyd- oder Ketogruppen und sind relativ reaktionsbereit
(besonders in Bindung mit Phosphat!)
Beispiele: Glucose, Galactose (= Aldosen), Fructose, Ribulose (= Ketosen).
Funktion: Speicherstoffe bzw. Stoffwechsel-Intermediate
(z.B. als Zuckerphosphate: im Calvin-Zyklus, in der Glykolyse, im oxidativen Pentosephosphatweg)
Nicht-reduzierende Zucker sind dagegen chemisch sehr stabil! Z.B. Zuckeralkohole (wie
Mannitol, Sorbitol) oder Di- bzw. Oligosaccharide mit Keto- bzw. Aldehyd-
gruppe in glykosidischer Bindung).
Vertreter: Saccharose und davon abgeleitete höherwertige Zucker (Saccharose + Gal1-3)
Funktion: „Transportzucker“, in Ausnahmefällen auch Speicherkohlenhydrate (in Vakuolen).
Reduzierende Zucker Nicht-reduzierende Zucker
CH2OH
D-Mannitol
CH2OH
Alkohol
27.05.2016
5
Saccharose-Synthese findet im Cytosol statt
Kohlenstoffbausteine werden aus dem Chloroplasten-Stroma abgezogen
Dort wird aus Triose-Phosphat
Hexose-Phosphat synthetisiert und als
Saccharose aus den „source“-Zellen
exportiert und über das Phloem zu
Verbrauchsorganen transportiert
(„sink“-Gewebe: Wurzeln, wachsende
junge Blätter, Blüten, Samen)
Pi Pi
Export
Triose-Phosphate werden im
Gegentausch mit Phosphat (Pi) aus
den Chloroplasten in das Cytosol
transloziert
TPTTPT
TPT: Triose-Phosphat/Pi-Translokator
Triose-Phosphat
Fructose-1,6-bis-Phosphat (FBP)
Pi
Saccharose-Synthese 1. Schritt: Bildung von Hexosen
exergonische
Reaktion
(irreversibel)
Triose-Phosphat
Fructose-6-Phosphat
Fru-1,6-bis-Phosphatase
(FBPase)
Aldolase
Vorlesung E. Weis (modifiziert)
Quasi Glykolyse rückwärts
⇒ Gluconeogenese
27.05.2016
6
Fructose-6-P
Fructose-1-P UDP-Glucose
Saccharose-P
Saccharose
UTP
PPi
UDP
Pi
Saccharose-Phosphat-
Synthase (SPS)
Glucose-6-P
Fructose-6-P
Saccharose-Synthese2. Schritt: Bildung von Saccharose (via SPS)
UDP-„aktivierte“ Glucose
exergonische
Reaktionen
(irreversibel)
Saccharose-
Synthase (SuSy)
Vorlesung E. Weis (modifiziert)
Fructose + UDP-
Glucose
Saccharose
Saccharose-Spaltung
Zwei Wege - Invertase und Susy
Saccharose-Synthase
(engl. sucrose synthase „Susy“)
Fructose +
Glucose
Hydrolytische Spaltung
(durch Invertase)
reversibel!irreversibel!
Vorlesung E. Weis (modifiziert)
UDPH2O
Cellulose
27.05.2016
7
StärkeSpeicher-Kohlenhydrat
der Pflanzen
α1�4-Bindung
α1�6-Bindung ⇒ Verzweigung!
Stärke - ein verzweigtes Polymer aus GlucoseDie α1�4 Ketten sind spiralig gewunden (vgl. gestreckte β1�4 Kette von Cellulose!)
27.05.2016
8
Stärke dient als Kohlenhydrat-Speicher
Stärkepolymere können viele Millionen Glucose-Einheiten enthalten
(in Form von Stärkekörnern)
In seiner verzweigten, hochpolymeren Form ist Stärke nicht mehr löslich
(� osmotisch inaktiv!)
MERKE: In dieser Bindung ist Glucose extrem stabil
Vorlesung E. Weis (modifiziert)
Chloroplast
mit transitorischer
Stärke
Amyloplast
mit vielen
Stärkekörnern
In Höheren Pflanzen wird Stärke in Plastiden
gebildet - über „aktivierte Glucose“
unverzweigte
Stärke
verzweigte
Stärke
Abb. aus: Buchanan et al., „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“; Amer. Soc. of Plant Physiol.
27.05.2016
9
Die AGPase-Reaktion ist prinzipiell reversibel
die angekoppelte exergone Pyrophosphatase-Reaktion treibt die Bildung
von ADP-Glucose und damit die gesamte Stärkesynthese an
AGPase
irreversibel!
Zusätzlich redox-reguliert über das
Ferredoxin/Thioredoxin-System
Elektronen werden zu Regulationszwecken
„abgezweigt“
Stroma
Beispiele
Fd FTR TRX target enzyme(s)
Lumen
Fd: Ferredoxin (Fd)
FTR: Fd/Trx-Reduktase
FNR: Fd/NADP-Reduktase
TRX: Thioredoxin (Trx,
verschiedene Isoformen)
27.05.2016
10
…und in der Nacht? Ohne den Licht-getriebenenen Elektronentransport werden Enzyme
des Calvin-Zyklus (= reduktiver Pentose-Phosphatweg) inaktiviert
PRK und GAPDH werden zusätzlich via CP12 komplexiert
CP12 N-terminal
peptide loop
C-terminal
peptide loop
Nach: Wedel et al. (1997) und Wedel & Soll (1998) PNAS USA
Fd/Trx
system
Evolutionär konserviert!
Auch in Moosen, Grünalgen und Cyanobakterien!
Platform
for enzyme
complex
formation
NADP(H)
NADPH-Bildung in der Nacht erfolgt durch den
Oxidativen Pentose-Phosphatweg (OPP)
• OPP und RPP teilen sich mehrere reversible Enzym-Reaktionen im Stroma
• G6PDH (OPP Startenzym) wird über das Fd/Trx-System gegenläufig reguliert
→ tags
→ nachts
↑an ↓aus
Vorteil dieser Regulation: Minimiert sinnlose Zyklen (NADPH↔NADP) und ATP-Verbrauch
27.05.2016
11
SH
SH
S
S
Redox-Wechsel
H2O1/2 O2
Light (Fd red→FTR)
2 e- + 2 H+
EE
Trxox
Trxred
Post-translationale Regulation von Enzymen
De-/Phosphorylierung
E
ATP ADP
H2OPi
Kinase
Phosphatase
E P
Ob ein Enzym (E) in seiner Aktivität durch diese posttranslationalen Regulationsmechanismen
positiv oder negativ beeinflusst wird, muss immer experimentell geklärt werden!
chloroplastidäre
G6PDH „aus“
(Scheibe & Anderson,
1981)
cytosolische
G6PDH „aktiviert“
(Dal Santo et al.,
2012)
Calvin-Zyklus
Enzyme „an“
(Crawford et al.,
1989)
Vorlesung E. Weis (modifiziert)
In Amyloplasten stammen die Hexosen aus
importiertem Glucose-6-Phosphat sowie
importiertem ATP
MERKE:
In Chloroplasten stammen die Hexosen zur
Stärkebildung aus dem Calvin-Zyklus
GPT
OPP NADPH
ATP/ADP
Translokator
27.05.2016
12
In Amyloplasten gespeicherte Stärke wird bei keimenden
Samen durch spezielle Enzyme mobilisiert
Nach der Quellung wird zunächst das Hormon Gibberellinsäure
(Gibberellic acid = GA3)
1) vom Embryo ausgeschüttet und induziert so die
2) Expression von α-Amylasen und Proteasen, aber
(in der Aleuronschicht)
3) β-Amylasen sind bereits im Samen vorhanden und
werden durch Protein-Prozessierung aktiv
⇒ Unser KURSVERSUCH mit Getreide-Koleoptilen
GA3
Abb. aus: Buchanan et al., „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“; Amer. Soc. of Plant Physiol.
Abbildungen aus W. Nultsch, „Allgemeine Botanik“, Thieme Verlag; Vorlesung E. Weis (modifiziert)
In Chloroplasten wird Stärke tagsüber aufgebaut und nachts abgebaut
⇒ „transitorische“ Stärke
In Amyloplasten dient sie der ⇒ langfristigen CHO-Speicherung
„sink“ Organe
(Metabolismus)
„source“-Zellen
„sink“ Organe
(Speicher)
NachtTag
In Chloroplasten „wachsen“ Stärkekörner
tagsüber und „schrumpfen“ nachts.
Die Produkte der Stärke-Mobilisierung
(Maltose und Glucose) können über einen
Facilitator (konzentrationsausgleichend)
in das Cytosol entlassen und dort nach
Aktivierung (Hexokinase, ATP) in die
Saccharose-Synthese eingeschleust
werden
27.05.2016
13
Zwei Wege der Stärke-Spaltung:
Hydrolyse oder PhosphorolyseHydrolyse durch α- und β-Amylasen
Energie bleibt erhalten
Energie geht verloren
Endoenzym
Exoenzym
Export-
+Saccharose-
Phosphat
Synthase (SPS)
In den Chloroplasten wird das Gleichgewicht zwischen Stärke- und
Saccharose-Synthese über den Phosphat-Translokator (TPT) eingestellt
TPT
27.05.2016
14
Regulation von Glykolyse und Gluconeogenese in Pflanzen
Saccharose
Triose-P
G6PF6PF2KP
ATP
+
Pi
PPi
F2,6P2
6PG
+
ADP
-
ATP
Pi PFK
-PFPFBP6PG
Pi
F1,6P2
Ru5P
CO2
3
2
NADPH
NADP
1
Triose-P
Glc/Mal
ATP
ADP
HK
ADP
3PGA
Cytosol
ChloroplastMitochondrium
Pi
HK: Hexokinase
SPS: Sucrose-P-Synthase
OPPP steps:
1 = G6PDH
2 = 6PGL
3 = 6PGDH
Fructose 2,6-bisphosphate (F2,6P2) and carbon partitioning in source leaves. Control of carbon fluxes in the Cytosol of source leaves.
In plant cells, the step to/from fructose-1,6-bis-phosphate (F1,6P2) can be catalyzed by 3 different enzymes: uni-directional PFK (Phospho-fructo-
kinase), unidirectional FBP (fructose-bis-phosphatase), or bi-directional PFP (fructose-6-phopshate 1-phospho-transferase). Only FBP and PFP
(but not of PFK) are influenced by F2,6P2 levels: FBP negatively and PFP positively (indicated by light blue minus and plus signs). F2,6P2 levels
are adjusted by bifunctional fructose 2,6-bisphosphate kinase/ phosphatase (F2KP). High levels favor glycolysis over gluconeogenesis. Conversion
of F2,6P2 is influenced by multiple effectors, amongst others OPPP intermediate 6-phosphogluconate (6PG). 6PG and pyrophosphate (Pi) dampen
F2,6P2 destruction and promote F2,6P2 formation (indicated by dark blue minus and plus signs). Scheme modified after Nielsen et al. (2004).
Stärke
PEP
Pi
TP
TX
PTXu5P
PP
TG
lcT
F2,6P2 als wichtige
Stellschraube im
Cytosol: Bei Zucker-
Rückstau hemmt das
Metabolit FBP
(Zuckerexport) und
aktiviert PFP
(Zuckerrückhalt).
Dies resultiert in
allosterischer
Aktivierung von
AGPase in
Chloroplasten
(Stärke-Synthese)
SPS
Pi
Photo-
synthese
CO2
CO2
Cellulose
Gerüst der pflanzlichen
Zellwand
27.05.2016
15
Cellulose bildet die Grundlage
der Zellwandstruktur
Vergleich:
Cellulose(gestreckt)
Stärke(spiralig)
27.05.2016
16
Richmond, Genome Biol 2000Richmond, Genome Biol 2000Richmond, Genome Biol 2000
Struktur der Cellulose-Synthase (Monomer)
UDP-Glc(Cytosol)
Kettenverlängerung
Cellulose-Synthase Rosettenkomplex
Mehrere Cellulose-Synthase-Untereinheiten bilden
jeweils einen Komplex mit Saccharose-Synthase
(SuSy) und lagern sich zu „Rosetten“ zusammen
(Rosettenkomplex).
Die Celluloseketten werden in den Apoplasten
(Zellwandraum) abgeschieden und bilden
parachristalline „Mikrofibrillen“ (durch H-Brücken).
Abb. Aus Buchanan et al., Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Vorlesung E. Weis (modifiziert)
Cellulose - ein unverzweigtes Glucose-Polymer
(β1�4 Verknüpfung)
Die Bildung von Cellulose erfordert
Bereitstellung von UDP-Glucose
Susy =
27.05.2016
17
Erinnerung:
Die Orientierung der peripheren
Mikrotubuli legt die Orientierung
der Cellulosefibrillen (Wandtextur)
und damit die Dehnungsrichtung
expandierender Zellen fest.
Cellulosetextur und Mikrotubuli
Callose
Zelluläres Dichtungsmaterial
27.05.2016
18
� Callose fungiert als Abdichtungsmaterial und dient der Verfestigung
von zellulären Strukturen
� Dies spielt eine wichtige Rolle bei:
- Zellteilung (Zellplatte)
- Wundreaktion
- Abwehr (nach Infektion)
- Verschluss (von Siebröhren u. Plasmodesmata)
Die Bildung von Callose-Ablagerungen kann sehr schnell, d.h. innerhalb
von Minuten, induziert werden (z.B. bei der Wundreaktion ≥ 30 min).
Callose - ein stark gewundenes Glucose-Polymer
(β1�3 Verknüpfung)
Vorlesung E. Weis (modifiziert)
Cellulose (β1�4 Glucan) ist gestreckt
und kann sich zu parakristallinen
Mikrofibrillen zusammenlagern
Callose (β1�3 Glucan, teilweise
1�6 verzweigt) ist eng helikal
gewunden und bildet Knäuel
Callose- und Cellulose-Bildung an der Plasmamembran erfolgt ähnlich
(siehe frühere VL-Folien), die Synthasen sind evolutionär verwandt)
Cellulose und Callose sind verwandte Strukturen
1 4
5
6
1 3
46
5
27.05.2016
19
• Callosebildung ist schnell
(ca. 1 h nach Verwundung)
• Verantwortliche Isoform:
GSL5 (= CalS12)
• Suppression von GSL5
mittels RNAi-Technik
(GSL5-RNAi)
� keine Callosebildung
Callose-Färbung mit Anilinblau
(sichtbar durch hellblaue Fluoreszenz der
Wundränder)
Jacobs et al. (2003)
Beispiel 1: Callose-Bildung nach Blatt-Verwundung
(Arabidopsis)
Callose-Ablagerungen an den Plasmodesmata von Schwammparenchym-Zellen
nach Infektion von Tabakblättern mit dem Pathogen Phytophthora nicotianae
Beispiel 2: Abwehr-induzierte Callose-Ablagerungen
(Plasmodesmata)
In situ-Callose-Nachweis (≥ 30 min) mittels Anilinblau-Fluoreszenz unter Confokalmikroskop (AG Weis)
Callose-Verschluss
der symplastischen
Zell-Verbindungen
⇒ Zuckerstau in
„source“-Zellen
(exportieren Zucker)
Abwehr
verbraucht
Energie!
27.05.2016
20
„Komplexe“ Oligosaccharide
� Festigungselemente (in der Zellwand)
� Erkennungsignale (Arabinogalaktan-Proteine)
� „Dekoration“ der Zelloberfläche (sekretierte Proteine)
Bildungsorte: ER & Golgi-Apparat (� 1. Vorlesung, A. von Schaewen)
„Komplex“ bedeutet:
Die Oligosaccharide setzen sich aus einer variablen Sequenz verschiedener
Zuckereinheiten zusammen (z.B. N-acetylglucosamin = GlcNac, Mannose,
Glucose, Xylose, Fucose, Galactose) und sind mehr oder weniger verzweigt.
MERKE:
Durch Variation in Kettenlänge, Verzweigung und Abfolge ergibt sich eine
schier unbegrenzte Variationsvielfalt!
Xyloglucan- (links) und Pektin- (rechts) Polysaccharide (Zellwandbestandteile)
Abb.: Buchanan et al., „Biochem. & Mol. Biol. of Plants“, Kap. 1 (American Society of Plant Physiologists, ASPP)
Synthese und Sekretion komplexer Oligosaccharide
27.05.2016
21
Kommunikation in der Zellwand (Apoplast)
AGP (Arabinogalaktan-Proteine, Proteoglykane)
Abb.: Buchanan et al., „Biochem. & Mol. Biol. of Plants“, Kap. 1 (American Society of Plant Physiologists, ASPP)