Ruhr-Universität BochumProf. Dr. med. Stephan Schneider

Dienstort: St. Vinzenz-Hospital in Köln-NippesAbteilung Innere Medizin II Endokrinologie und Diabetologie

Entwicklung und Analyse eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels auf Basis der Phage-Display-Technologie

Inaugural-Dissertationzur

Erlangung des Doktorgrades der Medizineiner

Hohen Medizinischen Fakultätder Ruhr-Universität Bochum

Vorgelegt vonGeorg Dennis Ziegler

Aus Mannheim2013

Dekan: Prof. Dr. med. K. ÜberlaReferent: Prof. Dr. med. S. SchneiderKorreferent: Prof. Dr. rer. nat. Katrin Marcus

Tag der Mündlichen Prüfung: 06.11.2014

Abstract

Ziegler

Georg Dennis

Entwicklung und Analyse eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels auf Basis der Phage-

Display-Technologie

Problem: Mit der Möglichkeit die aktive BZM (β-Zell-Masse) in vivo über den Verlauf

der Erkrankung des Diabetes darzustellen, wird erhofft, dass neue Kenntnisse über die

Pathogenese des Diabetes erlangt werden können. Trotz hoher Sensitivität von

radiologischen Methoden scheitert die Darstellung von β-Zellen des Pankreas in vivo

bisher am Fehlen eines geeigneten Kontrastmittels. Aufgrund der Tatsache, dass das

Massenverhältnis der β- zu nicht β-Zellen sehr ungünstig ist, sind sehr hohe

Anforderungen an das Kontrastmittel zu stellen.

Methode: Eine auf Phagen basierende Single-Chain-Antikörper (SCA) -Bibliothek wurde

in Ratten in vivo und an einer β-Zelllinie in vitro selektiert. Mit Hilfe der selektierten

Phagenklone wurden inselspezifische SCA hergestellt. Diese SCA wurden dann in vitro

charakterisiert.

Ergebnis: Es konnten zwei SCA (SCAB1 und SCAB7) aus dem in vivo Ansatz isoliert

werden. Nur einer davon ist bis dahin unbekannt gewesen (SCAB7), der SCAB1 ist bereits

in der Literatur beschrieben. Der SCAB7 bindet in vivo an den β-Zellen des Pankreas wie

immunhistochemische Färbungen zeigen. Der SCAB7 zeigt auch ein deutliches

Hintergrundsignal im exokrinen Pankreas, aber kein Bindung an extrapankreatisch

gelegenen Organen und Geweben.

Des Weiteren wurde der SCAB5 von S. Überberg (2009a, 2010b) charakterisiert. Dieser

zeigte, dass seine Bindungsspezifität gegenüber der INS-1- und Beta TC6-Zelllinie ein

450-faches größer ist als zu der AR42J-Zelllinie. Außerdem konnte mittels

Radioaktivitätsversuchen und Aufnahmen mittels konfokalem Lasermikroskop gezeigt

werden, dass der SCAB5 aktiv internalisiert wird.

Diskussion: Mit Hilfe der Phage-Display-Methode lassen sich β-Zell-spezifische

Antikörper entwickeln. Ein neuer SCA konnte dadurch entwickelt werden. In dieser Arbeit

war es außerdem möglich, die bisherigen Ergebnisse des SCAB1 zu bestätigen und anhand

des SCAB5 eine Internalisierung nachzuweisen. Dadurch scheint es, dass der SCAB5 nur

an gesunden β-Zellen bindet. Die weiterführende Untersuchung des SCAB5 auf Toxizität

und Elimination aus dem pankreatischen Gewebe steht noch offen.

1

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung...........................................................................................................................7

1.1 Diabetes mellitus..............................................................................................................7

1.2 Pankreasaufbau und –funktion.....................................................................................8

1.3 Bisherige Versuche der non-invasive BZM-Bestimmung in vivo.............................10

1.3.1 Anforderung an ein β-Zell-Kontrastmittel ..........................................................10

1.3.2 Evaluierte β-Zell-spezifische Kontrastmittel ......................................................11

1.4 Phage-Display-Technologie.......................................................................................11

1.4.1 M13-Phagen........................................................................................................12

1.5 Antikörper ..................................................................................................................13

1.5.1 Antikörper Phage-Display ..................................................................................15

1.6 Humane SCA-Bibliothek I (Tomlinsen)....................................................................16

1.6.1 Selektionsverfahren ............................................................................................16

1.7 Bestimmung der CDR (Kabat, et al., 1991)...............................................................17

2. Zielsetzung.......................................................................................................................19

3. Material und Methoden....................................................................................................20

3.1 Material ......................................................................................................................20

3.1.1 Chemikalien ........................................................................................................20

3.1.2 Antibiotika ..........................................................................................................21

3.1.3 Zellkultur-Medien und Zusätze ..........................................................................21

3.1.4 Verbrauchsmaterialien ........................................................................................22

3.1.5 Bakterien.............................................................................................................22

3.1.6 Zelllinien .............................................................................................................22

3.1.7 Antikörper ...........................................................................................................22

3.1.8 Oligonukleotide ..................................................................................................23

3.1.9 Reagenzsysteme..................................................................................................23

3.1.10 Größenstandard und Enzyme............................................................................23

3.1.11 Radioaktivität....................................................................................................23

3.1.12 Medien und Lösungen für Arbeiten mit der Tomlinson-Bibliothek.................24

3.1.13 Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese ........................................................25

3.1.14 Puffer für die Histologie ...................................................................................25

3.1.15 Puffer und Lösungen für den Westernblot........................................................25

3.1.16 Geräte................................................................................................................26

2

3.2 Methoden ...................................................................................................................28

3.2.1 Zellkultur ............................................................................................................28

3.2.1.1 Kultivierung von eukaryonten Zellen ..............................................................28

3.2.1.2 Kryokonservierung ..........................................................................................28

3.2.1.3 Auftauen von eukaryonten Zellen....................................................................28

3.2.1.4 Passagieren von Zellen ....................................................................................29

3.2.3 Molekularbiologischen Methoden ......................................................................29

3.2.3.1 Analytische Plasmidisolierung ........................................................................29

3.2.3.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase-chain-reaction) ...................29

3.2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................30

3.2.3.4 DNA-Extraktion nach Agarose-Gelelektrophorese .........................................30

3.2.3.5 DNA-Aufreinigung und -Konzentrierung .......................................................30

3.2.3.6 Konzentrationsbestimmung der DNA .............................................................31

3.2.3.7 Sequenzierung..................................................................................................31

3.2.4 Insel-spezifischer-Phagenklon (ISPC) Herstellung ............................................31

3.2.4.1 Herstellung und Titern des M13-Helferphagenstocks .....................................31

3.2.4.2 Amplifizieren und Titern der gewünschten Phagen ........................................32

3.2.5 Proteinbiochemische Methoden..........................................................................33

3.2.5.1 Herstellung von löslichen Antikörperfragmenten (SCA) ................................33

3.2.5.2 Präparation und Aufreinigung von SCA aus Bakterien...................................34

3.2.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford ..................................................................34

3.2.5.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ...................................35

3.2.5.4.1 SCA-Aufreinigungsnachweis mittels Coomassie-Brilliantblau Färbung .....35

3.2.5.4.2 Westernblot ...................................................................................................36

3.2.6 Charakterisierung der ISPC und SCA ................................................................36

3.2.6.1 Zellbasierter Bindungsassay ............................................................................36

3.2.6.2 Immunhistochemische Färbungen an Paraffin-Schnitten ................................37

3.2.6.3 Chloramin-T Methode .....................................................................................38

3.2.6.4 In vitro Analysen des Bindungsverhaltens vom SCA .....................................38

3.2.6.4.1 Charakterisierung der SCA mittels konfokalem Lasermikroskop ................38

3.2.6.4.2 In vitro Radioaktivitäts-Bindungsassay ........................................................39

4. Ergebnisse ........................................................................................................................40

4.1 Bestimmung β-Zell-spezifischer SCA aus der Phage-Display-Technologie.............40

4.2 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des ISPC.................................................42

3

4.3 SCA-Herstellung........................................................................................................42

4.4 In vivo Bestimmung der β-Zell-Spezifität der ISPC .................................................43

4.5 In vivo Bestimmung der Spezifität des SCAB7 ........................................................45

4.6 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des SCA .................................................46

4.7 Charakterisierung des Bindeverhaltens des SCAB5 mittels konfokalem

Lasermikroskop .......................................................................................................47

5. Diskussion........................................................................................................................49

5.1 Hintergrund zur humanen BZM-Darstellung ............................................................49

5.2 Antikörper als β-Zell-spezifischer Marker ................................................................50

5.3 Entwicklung β-Zell-spezifischer SCA.......................................................................51

5.4 Bestimmung der β-Zell-Spezifität in vitro und in vivo..............................................52

5.5 Bindungsverhalten von markierten SCA in vitro ......................................................54

5.6 Ausblick .....................................................................................................................56

6. Literaturverzeichnis .........................................................................................................59

Danksagung .............................................................................................................................

Lebenslauf................................................................................................................................

4

Abkürzungsverzeichnis

A.dest. Aqua destillatum

BRASIL Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands

BZM β-Zell-Masse

CAR cell associated radioactivity (Zell assoziierte Radioaktivität)

CDR complimentary determining regions

DAPI 4’,6-diamdino-2-phenylindole, dihydrochloride

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DPP4 Dipeptidyl Peptidase-4

GLP-1 Glukagon-Like-Peptide-1

IMAC immobilized metal ion affinity chromatography (immobilisierte Metall-

Ionen-Affinitätschromatographie)

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

ISPC isle specific phage-clone (Insel-spezifischer Phagenklon)

OD optische Dichte

PCR polymerase chain reaction (Polymerase Ketten Reaktion)

PEG Polyethylene glycol 6000

PET Positronen-Emissions-Tomographie

pfu/ml plaque forming unit/ml

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

RPMI Roswell Park Memorial Institute

SCA Single-Chain-Antibody

SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Natriumdodecylsulfat)

U/min Umdrehung pro Minute

VMAT2 Vesicular Monoamin Transporter 2

[11C]DTBZ Dihydroterabenazin

5

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien ...........................................................28

Tabelle 2: Zusammensetzung von Sammel- und Trenn-Gel ...............................................35

6

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Schematischer Aufbau des humanen Pankreas mit benachbarten Strukturen .9

Abbildung 2: Schematische Darstellung einer Langerhans´schen Insel..............................10

Abbildung 3: Schematische Darstellung eines M13-Bakteriophagen .................................13

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Antikörpers ................................................14

Abbildung 5: Vektorkarte von pIT2 ....................................................................................16

Abbildung 6: Schematische Darstellung des Phage-Display Screenings ............................17

Abbildung 7: Sequenzen des ISPC1 und ISPC8..................................................................41

Abbildung 8: In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität ....................................................42

Abbildung 9: SCA-Aufreinigung aus HB2151 Bakterien und Westernblot........................43

Abbildung 10: In vivo Lokalisation der ISPC .....................................................................44

Abbildung 11: In vivo Lokalisation des SCAB7 im Pankreas ............................................45

Abbildung 12: In vivo Lokalisation des SCAB7 in den Kontrollorganen...........................46

Abbildung 13: in vitro Bindungsverhalten von [125I]-markiertem SCAB5 für endokrine

und exokrine Zelllinien ................................................................................................47

Abbildung 14: Bindeanalyse mittels konfokalem Lasermikroskops ...................................48

7

1. Einleitung

Für die Entstehung des Typ-1-Diabetes spielen autoimmun bedingte Prozesse beim Verlust

der Insulin produzierenden β-Zellen eine zentrale Rolle. Auch beim Typ-2-Diabetes

kommt es im weiteren Erkrankungsverlauf zur Verminderung der β-Zellen. Hierbei scheint

es aber, durch eine erhöhte Apoptoserate bedingt zu sein (Butler, et al., 2003, Weir, et al.,

1990). Daraus folgernd ist es ersichtlich, dass alle Typ-1-Diabetiker und viele Typ-2-

Diabetiker bei Fortschreiten der Krankheit eine Insulintherapie benötigen. Bis jetzt ist es

noch nicht gelungen, diesen Zellverlust dauerhaft aufzuhalten (Schneider, 2008). In

Tierversuchen konnten Hinweise gefunden werden, dass gewisse Antidiabetika z.B. DPP4-

Hemmer (Dipeptidyl Peptidase-4), GLP-1 Analoga (Glukagon-Like Peptide-1) etc. die

Reduktion der β-Zell-Masse (BZM) verhindern (Meier, 2008, Mu, et al., 2006, Stoffers, et

al., 2000). Die Komplexität der pathophysiologischen Mechanismen hat dazu geführt, dass

die Notwendigkeit besteht, die BZM beim Menschen nicht-invasiv in vivo zu bestimmen.

Um die Wirkung dieser Therapien auf die menschlichen β-Zellen untersuchen zu können,

sowie weitere Erkenntnisse über die BZM, β-Zellfunktion und Glukosestoffwechsel zu

erlangen, wäre eine nicht-invasiv Methode von Nutzen. Doch steht leider bis jetzt ein

solches Verfahren nicht zur Verfügung (Schneider, 2008).

Um eine adäquate Auflösung zur Bestimmung der BZM des Menschen zu erreichen, ist

ein hoch sensitives Verfahren notwendig. Dafür bietet sich die Radionukleid-Bildgebung

an, da ihre Sensitivität im Pikomol-Bereich liegt (Cassidy and Radda, 2005). Bis jetzt fehlt

für eine radiologische Aufnahme, um exokrinem von endokrinem Anteil abgrenzen zu

können, ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel.

1.1 Diabetes mellitus

Der Diabetes mellitus (kurz Diabetes) ist eine der häufigsten Zivilisationskrankheiten in

den Industrienationen und eine weitere Zunahme wird erwartet. Im Jahr 2000 waren ca.

171 Millionen Menschen an Diabetes erkrankt, welches ca. 2,8 % der Weltbevölkerung

über alle Altersgruppen entspricht. Im Jahr 2011 waren es schon ca. 8,3% der

Weltbevölkerung (366 Millionen Menschen) und für das Jahr 2030 wird ein

Bevölkerungswachstum auf ca. 9,9 % erwartet. Dies entsprächen ca. 552 Millionen

(Whiting, et al., 2011, Wild, et al., 2004). Mit der Außnahme von Afrika können im Jahr

8

2011 ca. 10% der Todesfälle in der Altersgruppe zwischen 20-79 Jahren auf den Diabetes

zurückgeführt werden (IDF, 2013). Der Diabetes basiert auf einer chronischen

Hyperglykämie, die durch einen Fehler in der Insulinsekretion, Insulinwirkung oder aber

sogar durch eine Kombination von beiden bedingt ist. Der Diabetes wird aufgrund von

unterschiedlicher Ursache und Verlauf in verschiedene Gruppen unterteilt. Eine

Klassifikation wurde erstmals 1997 von der American Diabetes Association nach Ursache

und nicht nach Art der Behandlung eingeführt. Es wird vorwiegend zwischen Typ-1 und

Typ-2-Diabetes unterschieden (Kerner, 2011, Mehnert, 1999).

Der Typ-1-Diabetes ist der seltenere und liegt in ca. 5-7% der Fälle vor (Wild, et al., 2004).

Als Ursache wird von einer Autoimmunreaktion ausgegangen, die zum Untergang der β-

Zellen führt. Diese Reaktion beginnt meist schon im Kindesalter und mündet in einem

Totalausfall der Insulinproduktion (Weir, et al., 1990). Aufgrund der fehlenden

Insulinproduktion besteht die einzige Therapiemöglichkeit in einer lebenslangen exogenen

Zufuhr von Insulin.

Der viel häufigere Typ-2 Diabetes liegt in ca. 85 % der Fälle vor (Wild, et al., 2004).

Hierbei wird angenommen, dass es durch verschiedene Mechanismen zu einem Verlust der

β-Zellfunktion kommt und darauf folgend zu einem schleichenden Untergang der BZM,

der bis jetzt noch nicht vollständig verstanden wurde (Butler, et al., 2003, Marchetti, et al.,

2004). In den Leitlinien der Deutsche Diabetes Gesellschaft wird hierfür ein

Therapieschema empfohlen, in dem zunächst eine Ernährungs- und Bewegungstherapie

versucht wird. Ist keine adäquate Reduktion des Blutglukosespiegels zu erreichen, wird

eine medikamentöse Therapie eingeleitet. Wenn dies ebenfalls nicht ausreichen sollte,

wird zusätzlich mit einer Insulintherapie begonnen (Matthaei, et al., 2009).

1.2 Pankreasaufbau und –funktion

Das Pankreas ist eine sekundär retroperitoneal liegendes Organ. Es liegt s-förmig im

Oberbauch. Es ist ca.14-18 cm lang und ca 60-100 Gramm schwer. Es wird unterteilt in

Caput, Corpus und Cauda (vgl. Abb. 1). Das Caput pancreaticus wird hufeisenförmig vom

Duodenum umgeben, während die Cauda bis zur Milz hinreicht. Histologisch besteht das

Pankreas aus einem exokrinen und einem endokrinen Teil. Im exokrinen Teil werden

verschiedene Enzyme produziert. Dazu gehören amylolytische, lipolytische, proteolytische

Enzyme, die alle eine Verdauungsfunktion haben. Diese werden über einen ca. 2 mm

9

großen Ausführungsgang, Ductus pancreaticus, sezerniert. Dieser mündet zusammen mit

dem Ductus choledochus über die Papilla Vateri im Duodenum (Welsch, 2006).

Abbildung 1: Schematischer Aufbau des humanen Pankreas mit benachbarten Strukturen

Das Pankreas wird in drei Teile, Caput, Corpus und Schwanz unterteilt (modifiziert nach Steffens, 2013).

Der endokrine Anteil besteht aus den Langerhans-Inseln. Sie machen ca. 1-3 % des

Pankreas aus und kommen hauptsächlich im Cauda-Bereich vor. Die Hauptaufgabe der

Langerhans-Inseln ist die Regulation des Blutglukosespiegels mit Hilfe der Hormone

Insulin und Glukagon.

Die Langerhans-Inseln sind ca. 100-200 µm groß und bestehen aus etwa 2000-3000

endokrin-aktiven unterschiedlichen Zelltypen (vgl. Abb. 2). Es werden dabei vier Typen

unterschieden. Die Glukagon produzierenden α-Zellen, die zu ca. 20 % vorzufinden sind

und eher am Rand angelagert sind. Des Weiteren die Insulin produzierenden β-Zellen, die

ca. 70 % der Insel umfassen, sowie die ca. 10 % δ-zellen, die für die Produktion von

Somatostatin verantwortlich sind. Der vierte Typ sind die γ-Zellen, die das pankreatische

Polypeptid (PP) produzieren, welche nur 1-2 % ausmachen (Weir, et al., 1990, Welsch,

2006).

10

Abbildung 2: Schematische Darstellung einer Langerhans´schen Insel

Die Langerhans´schen Insel setzt sich aus vier Zelltypen zusammen, wobei die Insulin produzierenden β-Zellen die Mehrzahl und den Kern der Insel bilden. Am Rand liegen die Glukagon produzierenden α-Zellen,Somatostatin produzierende δ-Zellen und die Pankreatisches Polypeptid produzierenden γ-Zellen(modifiziert nach Mansouri, 2006).

Insulin und Glukagon sind Gegenspieler innerhalb des Glukosestoffwechsels. Insulin senkt

den Blutglukosespiegel, indem es die Aufnahme und Verwertung von Glukose in Muskel-,

Fett- und Leberzellen steigert. Ebenso beeinflusst es den Aufbau von Proteinen und wirkt

wachstumsfördernd. Glukagon wirkt antagonistisch zum Insulin. Es erhöht den

Blutglukosespiegel durch Förderung des Glykogenabbaus, aber es steigert auch die

Insulinsekretion (Welsch, 2006).

1.3 Bisherige Versuche der non-invasive BZM-Bestimmung in vivo

1.3.1 Anforderung an ein β-Zell-Kontrastmittel

Die β-Zellen sind diffus verteilt und machen nur ca. 1-3 % der Gesamtmasse des Pankreas

aus (Welsch, 2006). Im Verlauf des Diabetes nimmt ihre Masse noch weiter ab. Außerdem

unterscheiden sich die β-Zellen vom exokrinen Gewebe nur wenig anhand der Dichte oder

Echogenität (Schneider, 2008). Daher ist es von immenser Wichtigkeit, dass ein

Kontrastmittel entwickelt wird, das spezifisch genug ist, um die β-Zellen darzustellen. In

einer Arbeit von Sweet et al. (2004b) wurde berechnet, dass ein Kontrastmittel mindestens

eine Spezifität von 100:1 β-Zellen zu nicht-β-Zellen haben muss, um in vivo ein

entsprechendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erreichen. In einer weiteren Arbeit

veranschlagten die Autoren das Verhältnis auf 1000:1, damit das Kontrastmittel klinisch

einsetzbar wird (Sweet, et al., 2004a). Für die klinische Einsetzbarkeit wurden in einer

Übersichtsarbeit von Schneider (2008) weitere Eigenschaften definiert. Das Kontrastmittel

11

muss eine hohe Bindungsaffinität vorweisen, die gekoppelt ist mit vielen Bindungsstellen

pro Zelle. Zusätzlich ist es wichtig, dass eine schnelle Elimination aus dem Gefäßsystem,

alternativ sogar eine Internalisierung von der β-Zelle erreicht werden kann. Als weitere

Ziele wurden beschrieben, dass das Kontrastmittel proportional zur BZM bindet und es

keine Toxizität besitzt.

1.3.2 Evaluierte β-Zell-spezifische Kontrastmittel

Bis jetzt gab es schon viele Versuche ein spezifisches Kontrastmittel zu entwickeln, doch

bis jetzt konnte keins die oben genannten Bedingungen erfüllen (Malaisse, 2001, Moore, et

al., 2001, Schirrmacher, et al., 2002, Schneider, 2008, Sweet, et al., 2004aa, Sweet, et al.,

2004bb, Wangler, et al., 2004a, Wangler, et al., 2004b). Am vielversprechendsten war ein

PET-Kontrastmittel [11C]DTBZ (Dihydroterabenazin), das den Vesicular Monoamin

Transporter 2 (VMAT2) auf den β-Zellen erkannte (Simpson, et al., 2006, Souza, et al.,

2006). Leider haben danach veröffentlichte Daten gezeigt, dass DTBZ kein geeignetes

Kontrastmittel ist, um die menschliche BZM zu bestimmen. Es konnte kein Unterschied

bei der Aufnahme vom [11C]DTBZ in das Pankreas von Typ-1-Diabetikern und gesunden

Kontrollen festgestellt werden (Liu, et al., 2007). Da nur wenig über die

Oberflächenstrukturen der β-Zellen bekannt ist, gestaltet sich die Entwicklung von neuen

spezifischen Kontrastmitteln schwierig. Mittels der Phage-Display-Technologie soll diese

Problematik umgangen werden.

1.4 Phage-Display-Technologie

Eine weit verbreitete Technik, um Polypeptid-Binder gegen Target-Zellen zu selektieren,

auch ohne spezielle Kenntnisse der Oberflächenstrukturen, ist die Phage-Display-

Technologie. Damit ist es möglich, diese unbekannten Polypeptide zu identifizieren und

dann im Weiteren zu charakterisieren (Amstutz, et al., 2001, de Wildt, et al., 2000). In der

Phage-Display-Technologie werden am häufigsten filamentöse Phagen als Vektoren

genutzt. Dafür werden DNA-Sequenzen für verschiedene Proteine in den Phagen kloniert,

damit sie mit einem Phagen eigenen Oberflächenprotein fusionieren und exprimiert

werden (O'Brien and Aitken, 2002). Nach Selektions- und Amplifikationsrunden kann auf

Grund der Phenotyp-Genotyp-Kopplung die DNA-Sequenz aus Bakterien ermittelt werden.

12

1990 wurde erstmals durch McCafferty gezeigt, dass durch die Fusion von variablen

Antikörper-Genen mit dem Phagen-Hüllprotein-Gen diese Antikörper auf der Oberfläche

der filamentösen Phagen exprimiert wurden (McCafferty, et al., 1990). Aber auch andere

Proteine wie Enzyme können auf Phagen exprimiert werden. Dafür wird dann

entsprechend die Gensequenz vom Enzym mit dem Hüllprotein fusioniert (O'Brien and

Aitken, 2002).

Durch die Entwicklung des Phagmid-Vektors ist die Selektion von rekombinanten

Proteinen erst möglich geworden. Dieser Vektor erlaubt es, dass Plasmid- und Phagen-

Merkmale kombiniert werden. Dieses aus beiden Teilen bestehende Phagmid enthält zwei

Replikationsursprünge, jeweils eins vom Bakterium und eins vom Phagen, ein Phagen-

Verpackungssignal und für die Selektion notwendige Antibiotika Resistenzen. Alle

anderen Phagen-Gene fehlen dem Phagmid. Daher ist es zur Vermehrung auf

Helferphagen angewiesen (z.B. M13-Phagen). Bei der Replikation wird aber nur das

Phagmid vermehrt (Hoogenboom, et al., 1991).

1.4.1 M13-Phagen

M13-Phagen sind E.coli spezifische filamentöse Bakteriophagen und gehören zu den Ff-

Phagen (F-Pili, filamentös). Sie sind ca. 10 µm lang und ihr Durchmesser ist ca. 7 nm.

Diese Phagen bestehen aus einer zirkulären Einzelstrang-DNA, die von einer Proteinhülle

umgeben ist, die einen flexiblen Protein-Zylinder bilden (vgl. Abb. 3). Der Zylinder

besteht aus ungefähr 2800 identischen Molekülen (gp8). An den jeweiligen Enden bilden

ca. je 5 Moleküle die Kappen des Zylinders. Auf der einen Seite bilden gp7 und gp9 und

auf der Anderen gp3 und gp6 die Kappe (Ploss and Kuhn, 2010, Sachdev S, 2001, Stopar,

et al., 2003).

13

Abbildung 3: Schematische Darstellung eines M13-Bakteriophagen

Dargestellt sind die verschiedenen Hüllproteine und die zirkuläre, einzelsträngige DNA des M13 Phagen(modifiziert nach Ploss and Kuhn, 2010).

M13 Phagen können sich nur in E.coli vermehren, da der für die Infektion erforderliche F-

Pilus nur bei diesen Bakterien vorhanden ist. Eine weitere Besonderheit ist, dass die M13-

Phagen nicht zur Lyse der Wirtszelle führen. Das bedeutet, dass einmal infizierte Zellen

konstant neue Virionen produzieren (Marvin and Hohn, 1969, Russel, 1991).

1.5 Antikörper

Antikörper, international auch Immunglobuline genannt, gehören der Klasse der Globine

an. Sie bestehen aus zwei Peptidketten, einerseits aus der schweren Kette (H für heavy)

und andererseits aus der leichten Kette (L für light). Die schwere Kette ist ca. 50 kDa und

die leichte ca. 25 kDa groß. Die Antikörper bestehen aus jeweils zwei identischen leichten

und zwei schweren Ketten. Diese Ketten sind über Disulfidbrücken miteinander verbunden.

Jeweils eine leichte und eine schwere Kette bilden eine Antigen-Bindungs-Domäne. Dieser

Aufbau verleiht dem Antikörper eine Y-förmige Struktur (vgl. Abb. 4).

14

Abbildung 4: Schematische Darstellung eines Antikörpers

a) IgG Antikörper mit CDRs (complimentary determining regions),Fab-Fragment(variabler Teil), Fc-Fragment(kristaliner Teil), VH (variable schwere Kette) und VL(variable leichte Kette). b-e) verschiedenemolekularbiologisch herstellbare Antikörperformate (modifiziert nach Barbas, et al., 2001).

15

Nun kann der Antikörper in verschiedene Fragmente aufgeteilt werden. Der Fc-Teil (F=

Fragment, c= crystaline) besteht aus den carboxyterminalen Abschnitten beider schweren

Ketten. Der Fab-Teil (ab= antigenbinding) besteht entsprechend aus dem aminoterminalen

Abschnitt der schweren Ketten und zusätzlich der kompletten leichten Ketten. Jedes Fab

hat eine Antigenbindungstelle. Diese Stellen sind besonders Variabel und stehen

schleifenförmig aus der Struktur heraus und werden complimentary determining regions

(CDR) genannt (Janeway, et al., 2012).

Der Antikörper kann durch verschiede Enzyme in seine Bestandteile gespalten werden.

Durch molekularbiologische Methoden können vollständige IgGs oder Fragmente davon

künstlich hergestellt werden. Dazu gehören Fab2-Fragmente, Fab-Fragmente, Fv-Fragmente

(Fragment Variabel) und die Single-chain-Antibody (SCA) Fragmente (vgl. Abb. 4). Bei

den SCA handelt sich ausschließlich um die variablen Bereiche der schweren (VH) und

leichten Kette (VL), die durch einen synthetischen Abstandshalter verbunden sind. Der

große Vorteil von SCA-Fragmenten in einer Bibliothek beruht auf ihrer geringen Größe.

Durch die geringe Größe sind sie genetisch stabiler und somit leichter in Bakterien zu

exprimieren. Dennoch besteht die Gefahr, dass sich Dimere bilden. Durch Vergrößerung

des Abstandshalters kann die Bildung von Dimeren reduziert werden (Holliger, et al., 1993,

Janeway, et al., 2012).

1.5.1 Antikörper Phage-Display

Beim Antikörper Phage-Display werden Antikörperfragment-Bibliotheken verwendet. Die

Fab oder SCA-Fragmente werden auf der Oberfläche von den Phagen exprimiert (Griffiths,

et al., 1994, Hoogenboom and Winter, 1992, Nissim, et al., 1994). In dieser Arbeit wurde

eine humane SCA- Bibliothek (von Tomlinsen) verwendet, um mit Hilfe der Phage-

Display-Technologie ein β-Zell-spezifischen SCA-Fragment zu finden. Dazu wurden die

SCA-Fragmente in M13-Phagen kodiert.

16

1.6 Humane SCA-Bibliothek I (Tomlinsen)

Die verwendete Bibliothek stammt von Tomlinsen und besteht aus 1,47 x 108

verschiedenen Klonen von humanen SCA-Fragmenten, die auf der Oberfläche von M13-

Phagen exprimiert werden. Die SCA wurden in einen Ampicillin resistenten Phagmid-

Vektor pIT2 kloniert, der zusätzlich ein Myc-Tag und His-Tag besitzt (siehe Abb.5)

Die Artenvielfalt der Bibliothek basiert hauptsächlich auf den variierten Bereichen der

schweren und leichten Ketten: H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97,

H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 and L96

(http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf)

Abbildung 5: Vektorkarte von pIT2

Das klonierte SCA-Gen liegt zwischen den Schnittstellen NcoI und NotI. Es wird von einer SignalsequenzpelB und einem Myc-Tag flankiert. Ein lacZ Promotor (lac promotor) und eine Ribosomen Bindestelle (RBS)sind vorgeschaltet. Ein amber-Stopcodon trennt das Myc-tag vom gp3 Phagenhüllprotein-Gen. Zusätzlichsind Replikationsursprüunge für E.coli (coliE1 ori) und M13-Phagen (M13 ori) vorhanden sowie eineAmpicillinresistenz (amp)(modifiziert nach http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).

1.6.1 Selektionsverfahren

Über die Jahre wurden verschiedene Selektionsmethoden entwickelt. Zunächst wurden die

Bibliotheken mit Antigen beschichteten Immuno-Röhrchen selektiert (Hoogenboom and

Winter, 1992, Marks, et al., 1991, McCafferty, et al., 1990, Nissim, et al., 1994, Winter, et

al., 1994). Später wurden weitere Selektionsmethoden entwickelt. Eine beruht auf dem

17

Panning der Bibliothek in vitro an Zelllinien, eine andere auf intravenöse Injektion in ein

Lebewesen in vivo (de Kruif, et al., 1995, Siegel, et al., 1997). Es werden immer mehrere

Selektionsrunden gefahren, um eine höhere Spezifität zu erlangen. Dafür werden nach

jeder Runde alle nicht bindenden Phagen entnommen und die, die an dem gewünschten

Molekül oder Zelle binden, werden wieder amplifiziert und dann einer weiteren

Selektionsrunde zugeführt. Normalerweise sind fünf Selektionsrunden nötig, um eine

entsprechend hohe Spezifität zu erhalten. Nach der Selektion werden die gefundenen

Phagenklone per Sequenzanalyse ausgewertet.

Abbildung 6: Schematische Darstellung des Phage-Display Screenings

Schematische Darstellung des Screenings für die in dieser Arbeit untersuchten Phagenklone.Die Phagen-Bibliothek wird in vivo dem Versuchstier (Ratte) injiziert, anschließend werden die gebundenPhagen isoliert und amplifiziert. Diese Selektionsrunde wird fünf-mal wiederholt und anschließendsequenziert und analysiert (modifiziert nach O'Brien and Aitken, 2002).

1.7 Bestimmung der CDR (Kabat, et al., 1991)

Die beiden Ketten der Antikörper haben einen konstanten Fc-Teil und einen variablen Fab-

Teil. Der variable Teil (VH und VL) weisen drei Bereiche auf, die die besonders hohe

Variabilität bedingen. Kabat schrieb 1970, dass diese hypervariablen Bereiche die Stellen

sind, die die Antigene binden. Des Weiteren wird die Spezifität der Antikörper durch die

Aminosäurereste an diesen Stellen, auch CDR genannt, bestimmt. Für die Bestimmung der

CDRs nach Kabat et al. (1991) gelten folgende Regeln:

Die CDR-L1 beginnt nach 24. Aminosäure. Sie ist 11-17 Aminosäuren lang.

Die CDR-L2 ist 7 Aminosäuren lang und beginnt 15 Aminosäuren nach der CDR-L1.

18

Die CDR-L3 ist 9-15 Aminosäuren lang und fängt 31 Aminosäuren nach Ende der CDR-

L2 an.

Die CDR-H1 startet nach ca. 30 Aminosäuren und ist 5-7 Aminosäuren lang.

Die CDR-H2 fängt 14 Aminosäuren nach dem Ende von CDR-H1 an, sie ist 16-19

Aminosäuren lang.

Die CDR H3 beginnt 29-32 Aminosäuren nach dem Ende von CDR-H2 und ist 8-19

Aminosäuren lang.

19

2. Zielsetzung

Im Rahmen dieser Arbeit soll ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel entwickelt werden.

Hierfür wurde sich der SCA-Technologie zugewendet. Da aber über die

Oberflächenstruktur der β-Zellen wenig bekannt ist, wird die Phage-Display-Technologie

verwendet, um die SCAs zu entwickeln. Im Weiteren sollen die entwickelten SCAs näher

charakterisiert werden:

1. In vitro Evaluation der SCA auf Spezifität (endokrin vs. exokrin), Bindungsaffinität und

Bindungsstelle.

2. In vivo Evaluation der SCA auf Spezifität (endokrin vs. exokrin) und Affinität zu extra-

pankreatischen Organen.

20

3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien

Aceton Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Agar ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Albumin (Fraktion V) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Chloramin-T Trihydrat ACROS (Geel, Belgien)

Chloroform Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Coomassie® Brilliantblau R-250 ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

DAPI (4’,6-diamdino-2-phenylindole,

dihydrochloride) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Dimethylsulfoxid (DMSO) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Essigsäure Sigma (München, Deutschland)

Ethidiumbromid Lösung Sigma (München, Deutschland)

D(+)-Glukose wasserfrei ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Glycerin 87% ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Hefeextrakt ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Imidazol ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Isopopyl β-D-thiogalactopyranosid(IPTG) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Methanol Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Natriumchlorid ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Natriummetabisulfit Lancaster (Morecambe, England)

Nickel(II)-chlorid-Hexahydrat ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

PBS(1x) PAA (Pasching, Österreich)

Phenylmethylsulfonylfluorid(PMSF) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Polyethylenglycol 6000 (PEG) ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Roti®-Load 1 Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Trypton ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Xylol Roth (Karlsruhe, Deutschland)

21

Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat

(mono-basisch) NaH2PO4 ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

di-Natriumhydrogenphosphat

(di-basisch) Na2HPO4 ApliChem (Darmstadt, Deutschland)

Alle hier nicht genannten Chemikalien wurden von den Firmen ApliChem (Darmstadt,

Deutschland), Sigma (Münschen, Deutschland) und Roth (Karlsruhe, Deutschland)

bezogen.

3.1.2 Antibiotika

Ampicillin (ApliChem; Darmstadt, Deutschland)

Stammlösung: 100 mg/ml

Gebrauchslösung: 100 µg/ml

Kanamycin (Sigma; Münschen, Deutschland)

Stammlösung: 30 mg/ml

Gebrauchslösung: 50 µg/ml

Penicillin/Streptomycin (PAA; Paschingen, Österreich)

Stammlösung: 100x

Gebrauchslösung 1x

3.1.3 Zellkultur-Medien und Zusätze

Die in der Arbeit verwendeten Medien und Zusätze wie FCS, L-Glutamin 200 mM (100x),

MEM Vitamine, PBS, essentielle Aminosäuren und Trypsin EDTA wurden von der Firma

PAA (Paschingen, Österreich) bezogen.

22

3.1.4 Verbrauchsmaterialien

Die in der Arbeit verwendeten Plastikwaren wie Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße und

Zellkulturflaschen wurden von der Firma Peske (Aindling-Arnhofen, Deutschland)

bezogen.

3.1.5 Bakterien

E.coli TG1

K12.(lac-proAB) supE thi hsdD5/F’ traD36proA+B lacIq lacZ .M15

E.coli HB2151

K12 ara .(lac-proAB) thi/F’ proA+B lacIq lacZ .M15

3.1.6 Zelllinien

INS-1 (Hr. C.B. Wollheim; Genf, Schweiz)

AR42J (ATCC; Manassas, USA)

Beta-TC-6 (ATCC; Manassas, USA)

3.1.7 Antikörper

Anti-Myc (monoklonal Maus; Cell Signaling/New England Biolab, Frankfurt, Deutschland)

Anti-Insulin (polyklonal Meerschweinchen; Dako, Golstrup, Dänemark)

Anti-Glukagon (monoklonal Maus; Affinity BioReagents, Golden, USA)

Biotinylierter anti-Maus IgG (Linearis, Wertheim, Deutschland)

Cy™3-konjugierter Ziege-anti-Meerschweinchen (Jackson Immunoresearch Laberatories,

Suffolk, UK)

Cy™2-konjugiertes Streptavidin (Jackson Immunoresearch Laberatories, Suffolk, UK)

DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) (Invitrogen; Karslruhe,

Deutschland)

23

3.1.8 Oligonukleotide

Die Synthese der verwendeten Oligonukleotide (Primer) wurde bei der Firma Metabion

(Martinsried, Deutschland) in Auftrag gegeben.

Für die Tomlinson Bibliothek I wurde mit folgenden Primern gearbeitet:

PCR (Polymerase Ketten-Reaktion)-Primer für die Selektion:

pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CA

LMB3 CAG GAA ACA GCT ATG AC

Sequenzierprimer:

pHEN seq CTA TGC GGC CCC ATT CA

3.1.9 Reagenzsysteme

GenElute™ Agarose Spin Column (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)

Pierce®BCA™ Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, USA)

Pierce®ECL Western Blotting Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, USA)

ProPur™ IMAC (Nunc/Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Deutschland)

QIAquick® PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland)

QIAprep® Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland)

Slide-A-Lyzer® Dialyse Cassette 10,000 MWCO (Pierce Biotechnology, Rockford, USA)

3.1.10 Größenstandard und Enzyme

Die in dieser Arbeit verwendete 1 kb DNA-Marker bzw. Protein-Marker (Page-ruler)

wurden von der Firma Fermentas (St. Leon Rot, Deutschland) und die taq-Polymerase von

Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.

3.1.11 Radioaktivität

125Iod (Hartmann Analytic, Braunschweig, Deutschland)

24

3.1.12 Medien und Lösungen für Arbeiten mit der Tomlinson-Bibliothek

Zum Ansetzen aller Medien und Lösungen wurde, soweit nicht anders angegeben,

demineralisiertes Wasser aus der Reinstwasseranlage Milli-Q Plus der Firma Millipore

verwendet. Danach wurden sie autoklaviert und, wenn nicht anders angegeben, bei

Raumtemperatur gelagert.

H-Top Agar 16 g/l Tryptone

10 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

7 g/l Bacto-Agar

PEG/NaCl 20 % PEG

2,5 M NaCl

Trypsin 50 mM Tris HCl, pH 7,4

1 mM CaCl2

bei -20°C lagern

TY(2x) 16 g/l Tryptone

10 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

2x TY (1%Glukose) 16 g/l Tryptone

10 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

1 % Glukose

2xTY (0,1% Glukose) 16 g/l Tryptone

10 g/l Hefeextrakt

5 g/l NaCl

0,1 % Glukose

25

TYE 10 g/l Tryptone

5 g/l Hefeextrakt

8 g/l NaCl

15 g/l Bacto-Agar

TYE (1% Glukose) 10 g/l Tryptone

5 g/l Hefeextrakt

8 g/l NaCl

15 g/l Bacto-Agar

1 % Glukose

3.1.13 Puffer für die Agarose-Gelelektrophorese

TAE 50x 242 g/l Tris-Base

57,1 ml/l Eisessig

3.1.14 Puffer für die Histologie

Antigen Unmasking Solution (Vector Laboratories, Burlinghame, USA)

Aurion BSA-c (Aurion, Wageningen, Niederlande)

Fluorescent Mounting Medium (Dako, Golstrup, Dänemark)

3.1.15 Puffer und Lösungen für den Westernblot

Zum Ansetzen aller Medien und Lösungen wurde, soweit nicht anders angegeben,

demineralisiertes Wasser aus der Reinstwasseranlage Milli-Q Plus der Firma Millipore

verwendet.

Annonden-Puffer (10x); pH 8,9 242,2 g/l Tris-Base

26

Coomassie 1 Gramm Comassie Blau

450 ml Methanol

450 ml A. Dest.

100 ml Eisessig

Entfärber 100 ml Methanol

100 ml Eisessig

800 ml A.dest. (Aqua destillatum)

Kathoden-Puffer 10 g/l SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

121,1 g/l Tris-Base

179,2 g/l Tricin

NTBPF 4,45 g/l NaCl

6,1 g/l Na Pyrophosphat

4,2 g/l NaF

1 g/l Na-Methylhydroxybenzoat

PBS-T PBS

0,1 % Tween 20

Transfer-Puffer (10x) 58 g/l Tris-Base

29,3 g/l Glycine

4,0 g/l SDS

3.1.16 Geräte

Analysewaage BL600 (Sartotius)

Biophotometer (Eppendorf)

Blot-Gel-Kammer (Hoefer Scientific Instruments)

CASY 1 cell counter (Innovatis)

CO2 Inkubator (Heraeus)

Dampfsterilisator Varioklav (Thermo Scientific)

Einbettautomat Reichert Lynx (Leica)

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Eismaschine (Ziegra)

Elektrophorese Power Supply B6 (Biometra)

Feinwaage RC210D (Sartorius)

Gelelektrophoresekammer (EASY-CAST™)

Magnetrührer (IKA®Works, Inc)

Mastercycler Gradient (Eppendorf)

Mikroskope

ZEISS Axioplan Mikroskop (Zeiss)

ZEISS Axiovert 25 (Zeiss)

ZEISS LSM 510 Laser Module, Axiovert 100M (Zeiss)

Minishaker (IKA®Works, Inc.)

Pipettierhilfe Pipetus® (Hirschmann)

Reinstwasseraufbereitungssystem MilliQ Plus (Millipore)

Schüttelapparat/Inkubator 1000 (Heidolph)

Sterilbank (Heraeus)

Thermocycler (Labtech)

Wasserbad (Köttermann)

Westernblot-Apparatur Semi Phor™ (Hoefer Scientific Instruments)

Gamma-Zähler (Packard Instrument Company)

Zentrifugen

Biofuge (Heraus)

GR2022 (Jouan)

Alle hier nicht aufgeführten Geräte entsprechen dem allgemeinen Laborstandard.

28

3.2 Methoden

3.2.1 Zellkultur

3.2.1.1 Kultivierung von eukaryonten Zellen

Die Zelllinien werden bei 37°C und 5 % CO2-Gehalt im Brutschrank kultiviert. Die INS-1-

Linie wird in RPMI-Kulturmedium (Roswell Park Memorial Institute) und die AR42J- und

TC6-Linie in DMEM-Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium) mit

entsprechenden Zusätzen kultiviert (vgl. Tabelle 1).

Tabelle 1: Zusammensetzung der Zellkulturmedien

Zusätze DMEM high glucose RPMI

Fetal Calf Serum AR42J 10% / TC615% 10%

Penecillin/Streptomycin √ √

MEM-Vitamine √ √

3.2.1.2 Kryokonservierung

Wenn die Zelllinien länger gelagert werden sollen, können sie im flüssigen Stickstoff

aufbewahrt werden. Hierzu werden die in einer Zellkulturflasche gezüchteten Zellen mit

3 ml Trypsin EDTA abtrypsiniert, in 10 ml Medium aufgenommen und für 5 min bei 1300

g zentrifugiert. Das Pellet wird in 10 % DMSO-haltigem Medium resuspendiert und dann

in flüssigem Stickstoff eingefroren.

3.2.1.3 Auftauen von eukaryonten Zellen

Die tiefgefrorenen Zellen werden für 30-60 Sekunden im Wasserbad bei 37°C aufgetaut

und im entsprechenden Kulturmedium aufgenommen. Um das Zelltoxische DMSO zu

entfernen, werden die Zellen kurz abzentrifugiert und in frischem Kulturmedium

resuspendiert, um sie dann in eine neue Zellkulturflasche anzuziehen.

29

3.2.1.4 Passagieren von Zellen

Alle 2-5 Tage müssen die Zellen bei einer Konfluenz von ca. 80 % passagiert werden.

Dazu wird das Kulturmedium aus der Kulturflasche genommen, die Zellen mit PBS

gespült und mit 3 ml Trypsin EDTA abtrypsiniert. Dann werden die Zellen in 10 ml

Kulturmedium aufgenommen und abzentrifugiert. Das Pellet wird in 10 ml Medium

resuspendiert und 1 ml davon wird in eine neue Kulturflasche gegeben und mit 25 ml

Medium aufgefüllt. Wenn die Zellen für Experimente geerntet werden, wird das Pellet in

50 ml Kulturmedium über Nacht bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert.

3.2.3 Molekularbiologischen Methoden

3.2.3.1 Analytische Plasmidisolierung

Die analytische Plasmidisolierung wurde mit dem QIAprep®Spin Miniprep-Kit von

Qiagen durchgeführt. Dafür wird eine unter Selektionsdruck angezogene Übernachtkultur

benötigt. Die folgenden Schritte werden nach den Herstellerangaben durchgeführt.

3.2.3.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR, polymerase-chain-reaction)

Bei der PCR handelt es sich um ein Verfahren zum Vervielfältigen eines DNA-Stückes.

Der Bereich der DNA wird mit Hilfe von zwei synthetischen Oligonukleotidprimern

bestimmt.

Für die Vervielfältigung der SCA-DNA wurde das folgende PCR-Programm genutzt:

1. Denaturierung 94°C 4:00 min

2. Denaturierung 94°C 0:45 min

3. Annealing 55°C 0:30 min

4. Extending 72°C 2:00 min

30

30 Wiederholungen der Schritte 2.-4.

5. Extending 72°C 4:00 min

Zur Analyse wird eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt (vgl. 3.2.3.3.).

3.2.3.3 Agarose-Gelelektrophorese

Die vervielfältigten DNA-Stücke werden nun nach ihrer Größe elektrophoretisch

aufgetrennt. Dazu wird 0,7 % Agarose in 1x TAE-Puffer aufgekocht und mit 10 %

Ethidiumbromid versetzt. Die Mischung wird zum Erstarren in eine Gelkammer mit

Kamm für die Probetaschen gegeben. Wenn das Gel erstarrt ist, wird es mit 1x TAE-Puffer

übergossen bis es vollständig bedeckt ist. Zum Auftragen der Proben werden sie mit 20 %

Ladepuffer versetzt. Als Größenstandard dienen 2,5 µl von der 1 kb DNA-Ladder. Die

Phorese wird mit einer Spannung von 90-110 Volt durchgeführt. Danach wird die DNA

mithilfe von UV-Licht (λ=302nm) sichtbar gemacht.

3.2.3.4 DNA-Extraktion nach Agarose-Gelelektrophorese

Zur DNA-Extraktion wird das GenElute™ Agaose-Kit von der Firma Sigma verwendet.

Dafür wird die gesuchte Bande aus dem Gel geschnitten und in ein Eppendorf-

Reaktionsgefäß gegeben. Die restlichen Schritte werden nach Herstellerangaben

durchgeführt.

3.2.3.5 DNA-Aufreinigung und -Konzentrierung

Zum Aufreinigen und Konzentrieren der aus 3.2.3.4 gewonnenen DNA wird das PCR-

Purification Kit von Qiagen verwendet. Es wurde nach Herstellerangaben verfahren. Zum

Eluieren der DNA wurde 30 µl A.dest. verwendet.

31

3.2.3.6 Konzentrationsbestimmung der DNA

Für die Bestimmung der Konzentration der DNA wird eine 1% Lösung aus der

vorhandenen DNA hergestellt und in einer Quarzküvette gegeben. Zum Messen wird die

Absorption der Lösung bei der Wellenlänge von 260 nm gemessen.

Es gilt: OD260 (Optische Dichte)= 50 µg/ml dsDNA

Um die Reinheit zu messen, wird zusätzlich noch mal bei 280 nm gemessen und der

Quotient A260/A280 ausgerechnet. Ist der Quotient zwischen 1,7-2,0, so ist die DNA rein

genug fürs weitere Arbeiten.

3.2.3.7 Sequenzierung

Die Firma GENterprise, in Mainz, hat die Sequenzierung durchgeführt. Die Analyse wurde

mit dem Programm FinchTv gemacht. Der Abgleich der ermittelten Peptidsequenz wurde

mittels BLAST (basic local assigment search tool) vom NCBI (National Center of

Biotechnology Information) durchgeführt.

3.2.4 Insel-spezifischer-Phagenklon (ISPC) Herstellung

Die durch verschiedene Selektionsrunden gefundenen Phagenklone wurden amplifiziert

und sequenziert um sie dann auf ihre Charakteristika zu untersuchen. Dazu wurden bereits

infizierte Bakterienkulturen der entsprechenden Klone verwendet.

3.2.4.1 Herstellung und Titern des M13-Helferphagenstocks

TG1-Bakterien werden in 5 ml 2x TY bei 37°C und 160 U/min (Umdrehung pro Minute)

bis zu einer OD600 von 0,4 inkubiert. Von dieser Bakterienkultur werden je 200 µl mit je

10 µl einer 100x seriellen Verdünnung des vorhanden M13-Helferphagenstocks infiziert

und anschließend in einem 37°C warmen Wasserbad inkubiert. Dieses Gemisch wird nun

mit ca. 42°C warmem H-Top Agar vermischt und auf eine TYE-Agarplatte gegeben.

Sobald der Agar erstarrt ist, werden die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert. Nun werden

5 ml frische TG1 Bakterien der OD600 von 0,4 mit einem gepickten Plaque infiziert und für

32

2 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Mit dieser Kultur wird nun 500 ml 2xTY in einem

1 L Kolben beimpft und für 1 h bei 37°C und 200 U/min inkubiert. Darauf gibt man

Kanamycin bis zu einer Konzentration von 50 µg/ml hinzu, dann wird der Ansatz über

Nacht bei 37°C und 200 U/min inkubiert.

Die Übernachtkultur wird bei 10.800 g, 4°C für 15 min zentrifugiert. 400 ml des

phagenhaltigen Überstandes werden abgenommen und mit 100 ml PEG/NaCl vermischt,

um sie dann für 1 h auf Eis zu inkubieren. Nach einer weiteren Zentrifugation für 30 min

wird das Pellet in 8 ml PBS resuspendiert und dann mit 2 ml PEG/NaCl gut vermischt.

Nun für 20 min auf Eis stellen und dann für 30 min bei 3.300 g und 4°C zentrifugieren.

Das Pellet wird nun in 5 ml PBS resuspendiert und dann für 10 min bei 11.600 g und 4°C

zentrifugiert. Der phagenhaltige Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß gegeben und

kann nun für bis zu vier Wochen bei 4°C gelagert werden. Sollte er länger gelagert werden,

wird das PBS mit 15% Glycerin versetzt und dann können die Phagen bei -80°C

eingefroren werden.

Zum Titern der Phagen werden 45 µl mit 5 µl Trypsin-Lösung gemischt und im 37°C

warmen Wasserbad für 30 min inkubiert. 1 µl der mit Trypsin behandelten Phagen werden

mit 1 ml PBS versetzt und fünf 100x serielle Verdünnungen in 1 ml PBS angefertigt. Von

jeder Verdünnung werden 50 µl mit 1 ml TG1 Bakterien der OD600 0,4 gemischt. Dieses

Gemisch wird mit 3 ml geschmolzenen ca. 42°C warmen H-Top Agar vermischt und dann

auf eine TYE-Platte gegeben. Nach Erstarren des Agars werden die Platten bei 37°C über

Nacht inkubiert. Genauso wird mit nicht Trypsin behandelten Phagen vorgegangen. Die

mit Trypsin behandelten Phagen sollten einen 105-108 pfu/ml geringeren Titer haben als

die unbehandelten. Insgesamt sollte der Titer der Helferphagen mindestens 1012 pfu/ml

betragen.

3.2.4.2 Amplifizieren und Titern der gewünschten Phagen

Der gewünschte Phagenklon wird von der Agarplatte gepickt und mit 20 ml TY-Medium,

das 100µg/ml Ampicillin und 1% Glukose enthält, beimpft. Nun werden die Bakterien auf

eine OD600 von 0,4 inkubiert bei 37°C und 160 U/min geschwenkt. 10 ml dieser Kultur

werden nun mit 5x1010 Helferphagen versetzt und für 30 min im 37°C warmen Wasserbad

inkubiert. Danach wird die Kultur für 10 min bei 3.000 g und 4°C zentrifugiert. Der

Überstand wird verworfen und das Pellet in 50 ml 2x TY mit 100 µg/ml Ampicillin, 50

33

µg/ml Kanamycin und 0,1 % Glukose resuspendiert und in einem 200 ml

Erlenmeyerkolben bei 30°C und 200 U/min schwenkend über Nacht inkubiert. Nun wird

die Übernachtkultur für 15 min bei 4°C und 3.300 g zentrifugiert. 40 ml des Überstandes

werden mit 10 ml PEG/NaCl vermischt und 1h auf Eis inkubiert. Darauf wird wieder

zentrifugiert für 30 min bei 4°C und 3.300 g. Der Überstand wird verworfen und das Pellet

in 2 ml PBS resuspendiert und dann für 10 min bei 4°C und 11.600 g zentrifugiert. Im

Überstand sind nun die Phagen enthalten und sie können wie die Helferphagen für ca. vier

Wochen bei 4°C gelagert werden. Für eine längere Lagerung bei -80°C wird 15 %

Glycerin beigefügt.

Für die Titerbestimmung werden 1 µl der Phagen in 100 µl PBS aufgenommen und davon

ausgehend fünf 100x serielle Verdünnungen angefertigt. 900 µl TG1-Bakterien der OD600

0,4 werden zu jeder Verdünnung gegeben und dann für 30 min im 37°C warmen

Wasserbad inkubiert. Nun werden jeweils 10 µl der Verdünnungen auf eine TYE-

Agarplatte mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 % Glukose ausplattiert und über Nacht bei

37°C inkubiert. Die amplifizierten Phagen sollten 1012-1013 pfu/ml betragen.

3.2.5 Proteinbiochemische Methoden

3.2.5.1 Herstellung von löslichen Antikörperfragmenten (SCA)

Für die Herstellung werden 200 µl der exponentiell wachsenden HB2151 Bakterien der

OD600 0,4 benötigt. Sie werden mit 10 µl der Phagen infiziert und dann für 30 min im

37°C warmen Wasserbad inkubiert. Es werden je 50 µl einer Verdünnungsreihe der

infizierten Bakterien auf eine TYE-Agarplatte mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 % Glukose

ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. 10 ml TY mit 1 % Glukose und 100 µg/ml

Ampicillin werden mit einer Bakterienkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C und 200

U/min schwenkend inkubiert. 2 l TY-Medium, welches 100 µg/ml Ampicillin und 0,1 %

Glukose enthält, werden mit den Bakterien beimpft und bis zu einer OD600 von 0,6 bei

37°C und 200 U/min schwenkend inkubiert. Nun wird zur Induzierung der

Proteinproduktion 1 mM IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalacropyranosid) hinzugegeben und

dann für weitere 4 h bei 30°C und 200 U/min schwenkend weiter inkubiert. Danach

werden die Bakterien mittels Zentrifugation mit 6.000 g 15 min bei 4°C sedimentiert. Der

34

Überstand wird verworfen und das Pellet zur weiteren Präparation und Aufreinigung der

SCA verwendet.

3.2.5.2 Präparation und Aufreinigung von SCA aus Bakterien

Das Bakterienpellet das unter 3.2.5.1 hergestellt wurde, wird mit 5 ml PBS incl. 1 mM

PMSF resuspendiert und 1 h auf Eis inkubiert. Alle 5 min wird die Suspension für ca. 20 s

gevortext. Anschließend wird die Suspension für 1 h bei 11.600 g und 4°C zentrifugiert

und der Überstand einmal mit 0,45 µm und danach mit 0,22 µm Filtern filtriert.

Zur Aufreinigung nutzt man die sechs Histidinreste des SCA am N-Terminus. Damit

lassen sie sich über eine immobilisierte Metallionen Affinitätschromatographie (IMAC)

aufreinigen. Dabei bilden die Histidin-Reste Komplexe mit den Ni2+ Ionen. Die

Komplexbildung kann später mit einem Überschuss an Imidazol aufgelöst werden.

Die mit Nickel beladenen Säulchen werden mit PBS equilibriert bevor die SCA-

Suspension auf das Säulchen gegeben wird. Nachdem die SCA nun gebunden haben wird

sechsmal mit PBS gewaschen, um die ungebundenen Proteine zu entfernen. Um die SCA

zu eluieren, wird 80 mM Imidazol verwendet. Die aufgereinigten SCA werden daraufhin

über Nacht in PBS bei 4°C dialysiert und danach lyophilisiert. Für die Proteinbestimmung

nach Bradford (vgl. 3.2.5.3) werden die SCA rehydriert. Um die Reinheit der SCA zu

bestimmen, werden ein SDS-Gel mit anschließender Coomassie-Färbung(vgl. 3.2.5.4.1)

und ein Westernblot(vgl. 3.2.5.4.2) durchgeführt.

Die aufgereinigten und lyophilisierten SCA wurden bei 4°C bis zu vier Monaten und in

A.dest. rehydrierte bei 4°C bis zu vier Wochen gelagert.

3.2.5.3 Proteinbestimmung nach Bradford

Für die Bestimmung der Proteinkonzentration der aufgereinigten, dialysierten und

konzentrierten SCA nach Bradford (Bradford, 1976) wird das BCA Assay von Pierce

benutzt. Diese Bestimmungsart basiert auf der Verschiebung des Absorbtionsspektrum von

Coomassie Blau von 465 nm nach 595 nm bei Bindung an Proteine. Es wurde nach

Herstellerangaben verfahren. Die Extinktion wurde bei 595 nm gegen den Leerwert (PBS)

gemessen. Als Eichkurve diente Rinderalbumin in PBS verdünnt.

35

3.2.5.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

Die aufgereinigten und lyophilisierten SCA werden in einem 12 %igem SDS-Gel

elektrophoretisch aufgetragen, um die Reinheit zu prüfen. Das Trenngel wird nach Tabelle

2 in einem Becherglas angesetzt. Nach Zugabe des APS wird die Lösung schnell zwischen

die Glasplatten gegossen, damit sie auspolymerisieren kann. Danach wird das Sammelgel

hergestellt und ebenfalls nach Zugabe des APS auf das Trenngel zwischen die Glasplatten

gegeben. Bevor das Sammelgel auspolymerisiert ist, wird ein Kamm zum Auftragen der

Proben eingehängt. Sobald das komplette Gel auspolymerisiert ist, wird die Kammer in die

Elektrophorese-Apparatur eingespannt und der Kamm entfernt, um die Proben auftragen

zu können. Dafür werden 40 µl einer Probe mit 20 µl Roti® Load 1 vermischt und das

Gemisch für sieben Minuten und 30 Sekunden auf 99°C erhitzt. Nun kann die aufgekochte

Probe zusammen mit dem Protein-Molekulargewichtsmarker auf das Gel gegeben werden.

Die Elektrophorese wird für 2-3 h bei einer Spannung von 50 Volt ausgeführt.

Tabelle 2: Zusammensetzung von Sammel- und Trenn-Gel

Zusatz Sammel-Gel 12% Trenn-Gel

A.dest 6,25 ml 5,3 ml

Gel-Puffer

(ohne Glycerol) 2,5 ml 6,7 ml

30% Acrylamide 1,25 ml 8 ml

Phenol rot 2 Tropfen 1 Tropfen

TEMED 40 µl 50 µl

10% APS 60µl 70 µl

3.2.5.4.1 SCA-Aufreinigungsnachweis mittels Coomassie-Brilliantblau Färbung

Nach der Elektrophorese wird das Gel 2 h in Coomassie-Brilliantblau-Färbelösung gefärbt

und anschließend über Nacht im Entfärber entfärbt. Am nächsten Morgen kann das Gel

ausgewertet und gescannt werden.

36

3.2.5.4.2 Westernblot

Zum Nachweis, dass sich es bei der Bande des Gels auch um den gesuchten SCA handelt,

wurde ein Westernblot durchgeführt. Das Gel wird nach der Elektrophorese (vgl. 3.2.5.4)

erstmal 1 h im Transferpuffer equilibriert. Danach werden vier Whatmann-Filterpapiere

auf die Größe des Gels zugeschnitten und zusammen mit einer Nitrocellulosemembran mit

dem Transferpuffer getränkt. Nun wird der Blot wie folgt luftblasenfrei zusammengebaut.

Auf die Kathode der Blot-Apparatur werden zwei Whatmann-Filterpapier gelegt, darauf

kommen das SDS-Gel, die Nitrocellulosemembran und oben wieder 2 Whatmann-

Filterpapiere. Die Annode verschließt den Blot oben. Das Blotting findet bei 10 Volt für 5

h statt. Die Membran wird nach dem Blotting in A.dest. gespült und dann 1 h in NTBPF

geblockt. Der erste Antikörper anti-myc wird im Verhältnis 1:200 mit NTBPF verdünnt

und die Nitrocellulosemembran wird damit über Nacht bei 4°C schwenkend inkubiert.

Nach einmaligem Spülen mit A.dest. werden drei weitere Male mit PBS-T gespült.

Anschließend wird der zweite Antikörper anti-Maus, der 1:20 mit NTBPF verdünnt ist, für

1 h bei Raumtemperatur mit der Membran inkubiert. Nun wird die Membran dreimal mit

PBS-T gespült und danach das Pierce®ECL Western Blotting Substrate nach

Herstellerangaben auf die Membran gegeben und der Blot ausgewertet.

3.2.6 Charakterisierung der ISPC und SCA

3.2.6.1 Zellbasierter Bindungsassay

Die BRASIL-Methode (Biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands) von

Giordano et al. (2001) wird genutzt, um die Bindungsaffinität der ISPC zu evaluieren.

Hierfür werden INS-1- und AR42J-Zellen 12 h vor dem Versuch mit Tryspin/EDTA

abtrypsiniert, in entsprechendem Kulturmedium aufgenommen und 5 min bei 1.300 g

abzentrifugiert. Das Pellet wird im entsprechenden Kulturmedium resuspendiert und in ein

50 ml Rektionsgefäß überführt, damit es nicht anwächst. Nun werden die Zellen bei 37°C

und 5 % CO2 kultiviert. Von den Zelllinien werden für den Versuch je 106 Zellen mit 109

pfu/ml des ISPC für 4 h auf Eis unter leichtem Schwenken inkubiert. Die Phagen-Zell-

Suspension wird auf eine organische Phase gegeben. Sie besteht aus n-dodecan und

bromododecan im Verhältnis 1:90,8 (d=1,017 g/ml). Nun wird für 10 s bei 12.000 g

zentrifugiert und danach in flüssigen Stickstoff eingefroren. Das Zellpellet mit den

37

gebunden Phagen wird abgeschnitten und in 1 ml TG1-Bakterien der OD600 0,4

amplifiziert. Dieses Gemisch wird auf 100 µg/ml Ampicillin und 1 % Glukose enthaltende

TYE-Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

3.2.6.2 Immunhistochemische Färbungen an Paraffin-Schnitten

Für die paraffinierten Gewebeschnitte wurden einer Ratte 100 µg SCA oder ISPC

intravenös injiziert. Nach 2 h wurde das Tier getötet und die Organe (Pankreas, Leber, etc.)

für die Schnitte entnommen. Die Tierversuche wurden von der Betreuerin mit meiner

Assistenz durchgeführt. Diese Gewebeschnitte werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Nun

werden die Gewebeschnitte mit einer absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert. Dazu

wird zuerst zweimal 10 min in Xylol inkubiert. Danach jeweils einmal 5 min in 100 %

EtOH, 96 % EtOH, 80 % EtOH, 70 % EtOH und zum Schluss noch mal 5 min mit A.dest.

inkubieren. Anschließend werden die Schnitte für 10 min in Antigen Unmasking Solution

aufgekocht. Nachdem die Schnitte 45 min bei Raumtemperatur abgekühlt sind, werden sie

in A.dest. und PBS gespült. Um unspezifische Bindungen zu blockieren, wird darauf 2 h

bei Raumtemperatur mit 2 % BSA in PBS inkubiert. Die Antikörper werden in PBS mit

2 % BSA verdünnt.

Die Gewebeschnitte werden mit dem Primärantikörper anti-myc (1:200) bei 4°C über

Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS-Puffer

wird für 1 h bei Raumtemperatur mit dem Antikörper anti-Maus (1:200) inkubiert.

Anschließend wird wieder zweimal mit PBS-Puffer gewaschen und dann für 1 h bei

Raumtemperatur mit Cy2-konjugiertem-Straptavidin (1:100) inkubiert. Für die

Doppelfärbung werden die Schnitte noch zwei weitere Male mit PBS-Puffer gewaschen

und entsprechend mit Anti-Insulin (1:800) oder Anti-Glukagon (1:200) für 30 min bei

37°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend werden die Schnitte wieder mit

PBS-Puffer gespült, um darauf mit den entsprechenden Sekundärantkörpern, Cy3-Anti-Pig

(1:800, Anti-Insulin) und Cy3-anti-Maus (1:200, Anti-Glukagon) für 30 min beim

Raumtemperatur zu inkubieren. Am Ende erfolgt die Kerngegenfärbung, indem wiederum

zweimal mit PBS-Puffer gewaschen wird und dann für 30 min bei Raumtemperatur mit

DAPI inkubiert wird. Nun werden die Gewebeschnitte nach dem Waschen mit PBS-Puffer

mit Fluoreszence-Mounting-Medium eingedeckelt und unter einem Zeiss Axioplan

Mikroskop analysiert.

38

3.2.6.3 Chloramin-T Methode

Mittels der Chloramin-T Methode (DeNardo, et al., 1986) werden die SCA radioaktiv

markiert. Dafür werden 100 µg SCA mit 1/10 Volumen 0,2 M Natrium Phosphat Puffer

mit pH 7,4 und 125I im Verhältnis 1:1 (mg Protein:mCi) gemischt. Durch Zugabe von 1/10

Volumen 1 mg/ml Chloramin-T wird die Reaktion gestartet und bei Raumtemperatur für 1

min inkubiert. Die Reaktion wird durch Hinzugeben von 1/10 Volumen 1 mg/ml

Natriummetabisulfit gestoppt. Die Suspension wird auf eine mit PBS equilibrierte

NAP™10 Säule gegeben. In 250 µl Schritten wird der radioaktiv markierte SCA eluiert.

Im Gammazähler werden die gesammelten Fraktionen gemessen und die SCA-haltige

Fraktion wird darauf zur Proteinbestimmung in den BCA (vgl. 3.2.5.3) gegeben.

3.2.6.4 In vitro Analysen des Bindungsverhaltens vom SCA

Die im folgenden beschriebenen Methoden sind Teil der Veröffentlichung „In vitro phage

display in a rat beta cell line: a simple approach for the generation of a single-chain

antibody targeting a novel beta cell-specific epitope“ (Ueberberg, S., D. Ziegler, et. al.,

Diabetologia, Band 53, Ausgabe 7, Seite 1384-1394). Die Durchführung der Methoden

erfolgte überwiegend selbstständig sowie die Auswertung unter Hilfestellung der

wissenschaftlichen Mitarbeiter.

3.2.6.4.1 Charakterisierung der SCA mittels konfokalem Lasermikroskop

INS-1- und AR42J-Zellen werden auf Kulturschalen mit den entsprechenden Medien für

48 h bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Auf die Zellen werden 100 µl Medium ohne FCS

mit 2 µg/ml SCA gegeben und 10 min bei entweder 4°C oder 37°C inkubiert.

Anschließend werden die Kulturschalen mit PBS gewaschen und mit eisgekühlten 4 %

Formaldehyd 15 min fixiert. Drauf werden die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 für 10 min

permeabilisiert und ein anti-myc fluoreszenzmarkierter Sekundärantikörper (2µg/ml,

AlexaFluor 488 konjugiert) zugefügt. Am Ende werden die Zellen in Assistenz einer

wissenschaftlichen Mitarbeiterin mit einen konfokalem Lasermikroskop ausgewertet.

39

3.2.6.4.2 In vitro Radioaktivitäts-Bindungsassay

Für den Versuch werden je 106 Zellen der Zelllinien INS-1, AR42J und TC-6 benötigt. Sie

werden in 200 µl ihrer entsprechenden Kulturmedien für 30 min bei 37°C und 5 % CO2 in

Kulturschalen inkubiert. Anschließend werden 5 µg der radioaktiv markierten SCA für

5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h oder 2 h mit den Zellen inkubiert. Durch Zentrifugation

für 10 s bei 12.000 g durch eine organische Phase (n-dodecan:bromododecan, 1:90,8 ,

d=1,017 g/ml) werden die gebundenen SCA von den ungebundenen SCA getrennt. Danach

wird das Zellpellet in flüssigen Stickstoff eingefroren und das gefrorene Pellet wird

abgetrennt. Von diesem wird mithilfe des Gamma-Zählers die Zell-assoziierte-

Radioaktivität (CAR) gemessen. Um die Retention der SCA zu messen wird ähnlich

verfahren. Dazu wird nach 10 minütiger Inkubation mit dem radioaktiv markierten SCA

die Zellen zweimal mit PBS gespült. Danach wird mit strahlungsfreiem Medium

entsprechend weiter inkubiert und durch die Ölschicht zentrifugiert. Die CAR der SCA

wird auf das spezifische mittlere Zellvolumen normiert, das mit dem CASY ermittelt

wurde, und in cpm/Zelle angegeben wird. Um Hintergrundrauschen rauszufiltern, wird ein

Versuch mit hoher Konzentration von unmarkierten SCA gemacht und der Wert von

jedem Datenpunkt abgezogen.

40

4. Ergebnisse

4.1 Bestimmung β-Zell-spezifischer SCA aus der Phage-Display-Technologie

Es wurden 20 Phagenklone, die in einem in vivo Ansatz mit Hilfe der Phage-Display-

Technologie generiert wurden, sequenziert, um nach unbekannten β-Zell-spezifischen

Phagenklonen zu suchen. Dabei wurden zwei verschiedene ISPCs gefunden. Sie werden in

Anlehnung an die Arbeit von S. Ueberberg (2009a) ISPC1 und ISPC8 genannt. ISPC1

wurde dabei in 70% der Phagenklone und ISPC8 in 30% der Klone entdeckt. Die

Sequenzauswertung wurde nach Kabat et al.(1991) durchgeführt. Mit Hilfe der Kabat-

Regeln unter 1.7 wurden die einzelnen CDR-Bereiche abgeleitet. In Abbildung 7 werden

die ausgewerteten Sequenzen dargestellt, die aus einer schweren Kette (blau) und einer

leichten Kette (grün) bestehen, die mit einem Linker verbunden sind. Die Variabilität der

ISPC liegt in den CDRs, der schweren (CDR-H1-CDR-H3) und leichten Ketten (CDR-L1-

CDRL3), die in der Abbildung 7a mit einem schwarzen Rahmen hervorgehoben werden.

Die hier gefundenen ISPCs und die aus der Arbeit von S.Ueberberg (2009a) unterscheiden

sich nur in den CDR-H2, CDR-H3, CDR-L2 und CDR-L3.

Die Sequenz vom ISPC1 ist mit der aus der Arbeit von S.Ueberberg (2009a) identisch. Die

Sequenz des ISPC8 wurde mittels BLAST (basic local alignment search tool) des NCBI

(National Center for Biotechnology Information) abgeglichen. Es wurde keine

Übereinstimmung mit bekannten Proteinsequenzen gefunden.

41

Abbildung 7: Sequenzen des ISPC1 und ISPC8

a) Aminosäuresequenzen der schweren (blau) und leichten (grün) Ketten der ISPC. Die CDRs sind mit einemschwarzen Rahmen markiert, die variablen Aminosäuren sind mit X. b) Aminosäurenvergleiche der CDRsder schweren Kette mit den variablen Aminosäuren (rot). c) Aminosäurevergleich der CDRs der leichtenKette mit den variabelen Aminosäuren (rot) (modifiziert nach Ueberberg, et al., 2009a).

42

4.2 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des ISPC

Mittels eines zellbasierten Bindungsassay (Giordano, et al., 2001) wurde der IPSC8 auf

seine β-Zell-Spezifität untersucht. Dabei wurde das unterschiedliche Bindungsverhalten zu

einer exokrinen Pankreas-Zelllinie der Ratte (AR42J Zellen) mit einer β-Zelllinie der Ratte

(INS-1 Zellen) verglichen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 8 dargestellt. Das

Bindungsverhältnis zwischen INS-1 zu AR42J beträgt 1:1,55.

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000

INS-1

AR42J

gebundene Phagen/ 10^6 Zellen

Abbildung 8: In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität

Bindungsspezifität des ISPC8 ist gegenüber der INS-1-Zelllinie um das 1,5-fache höher als gegenüber derAR42J-Zelllinie.

4.3 SCA-Herstellung

Für die Herstellung der SCA wurden mit dem entsprechenden ISPC infizierte HB2151

Bakterien lysiert. Denn die hergestellten SCA befinden sich im inneren der Bakterie. Die

SCA werden mittels Nickel-Säule, aufgrund ihres His-Tag, von Fremdproteinen

aufgereinigt. Abbildung 9 zeigt beispielhaft den so aufgereinigten SCAB7 (β-Zell-

spezifischer SCA) mit der erwarteten Bande bei ca. 31 kDa. Der SCA konnte anhand des

His-Tag durch einen Westernblot nachgewiesen werden (vgl. Abb. 9b).

43

a) b)

Abbildung 9: SCA-Aufreinigung aus HB2151 Bakterien und Westernblot

a) 10% SDS-Gel nach Comassie-Färbung: Die SCA-Aufreinigung zeigt die erwartete Bande bei ca. 31 kDa.Spur 1:Marker (M); Spur 2: Probe vor Säule (P); Spur 3: Probe nach Säule (PS); Spur 4-9: Waschschritte 1-6(W1-W6); Spur 10: Eluat (E).b) Westernblot mit anti-His-Tag: Die erwartete Bande liegt bei ca. 31 kDa, Spur 1: Marker (M); Spur 2: Eluat(E).

4.4 In vivo Bestimmung der β-Zell-Spezifität der ISPC

Um in vivo die Lokalisation der ISPC zu untersuchen, wurden die ISPC einer nicht

diabetischen Ratte intravenös injiziert. Nach zwei Stunden Zirkulation wurde das Tier

getötet und das Pankreas entnommen. Das Pankreas wurde in Formalin fixiert und in

Paraffin eingebettet. Anhand immunhistochemischer Methoden konnte die Lokalisation

der ISPC innerhalb der Insel sowie das Bindeverhalten zum exokrinen Pankreas bestimmt

werden.

ISPC1 und ISPC8 zeigen bei der Bakteriophagen-Insulin-Doppelfärbung eine klare

Überlagerung der Färbungen (vgl. Abb. 10), während in der Bakteriophagen-Glukagon-

Doppelfärbung keine Überlagerung zu sehen ist (vgl. Abb. 10).

Beide ISPC sind damit β-Zell-spezifisch, wobei zwischen diesen ISPC Unterschiede zu

erkennen sind. Beim ISPC8 ist im exokrinen Gewebe ein erhöhtes Hintergrundrauschen zu

sehen. Dies deutet im Vergleich zum ISPC1 auf eine nicht so hohe Spezifität hin.

Nebenbei zeigt sich bei beiden ISPC eine Akkumulation im Zytoplasma. Der

Kontrollphage zeigt keine Affinität zu endokrinem oder exokrinem Gewebe (vgl. Abb.10).

44

Abbildung 10: In vivo Lokalisation der ISPC

Immunhistochemische Färbungen an Pankreasgewebeschnitten der Ratte mit ISPC1, ISPC8 und einemKontrollphagen. Färbungen der Phagen (grün), anti-Insulin (rot) , anti-Glukagon (rot) und KerngegenfärbungDAPI (blau). Anhand der Überlagerung der Phagen-Insulin-Doppelfärbung konnte gezeigt werden, dassbeide ISPC β-Zell-spezifisch sind. Der Kontrollphage zeigte keinerlei Bindung (Vergrößerung 40x).

45

4.5 In vivo Bestimmung der Spezifität des SCAB7

Um zu bestätigen, dass die SCA auch unabhängig von den ISPC ihre Spezifität in vivo

beibehalten, wurde exemplarisch der SCAB7 der Ratte intravenös injiziert. Nach zwei

Stunden Zirkulation wurde das Pankreas sowie Kontrollorgane entnommen. Entsprechend

der Ergebnisse des ISPC8 zeigt der SCAB7 eine selektive Bindung mit den β-Zellen und

eine Ablagerung des SCAs im exokrinen Pankreasgewebe. Ebenso ist eine Anreicherung

im Zytoplasma zu sehen, die wieder für eine Internalisierung spricht (vgl. Abb.11).

Abbildung 11: In vivo Lokalisation des SCAB7 im Pankreas

Der SCAB7 wurde mittels anti-myc (grün), Insulin mit anti-insulin (rot), Glukagon mit anti-Glukagon (rot)detektiert und die Kerngegenfärbung mit DAPI (blau) durchgeführt (10x Vergrößerung).

Eine wichtige Vorrausetzung für ein selektives Targeting ist es, dass es keine Bindungen

an anderen Organen gibt. Dafür wurden verschiedene Kontrollorgane (Herz, Leber, Lunge,

Milz und Niere) untersucht (vgl. Abb. 12).

46

Abbildung 12: In vivo Lokalisation des SCAB7 in den Kontrollorganen

Gewebeschnitte der verschiedenen Kontrollorgane mit immunhistochemischer Färbung des SCAB7 und demKontrollphagen. Bei allen Organen wurden entsprechend der SCA mittels anti-myc (grün) und derKontrollphage mit anti-Bakteriophage (grün) markiert. Die Kerngegenfärbung erfolgte mittels DAPI (blau)(40xVergrößerung).

Die Untersuchung hat gezeigt, dass es zu keiner spezifischen Bindung des SCAB7 an den

Kontrollorganen kommt. Nur im retikulohistiozytäres System, vor allem in der Milz, sind

ein wenig SCAs und Kontrollphagen zu finden. Dabei scheint es sich, um eine

unspezifische Clearance des SCA zu handeln. Dafür spricht, dass der SCAB7 und der

Kontrollphage das gleiche Aufnahmemuster besitzen.

4.6 In vitro Bestimmung der β-Zell-Spezifität des SCA

Aufgrund der schlechten Spezifität des SCAB7 und ISPC8 für β-Zellen im in vitro und in

vivo Ansatz wurde mit einem Antikörper (SCAB5) weitergearbeitet, der eine höhere β-

Zell-Spezifität hat (Ueberberg, et al., 2010b). Um das Bindungsverhalten des SCAB5 zu

bestimmen, wurde der [125I]-markierte SCAB5 einer in vitro Analyse zugeführt. Dazu

wurde die Affinität des SCAB5 an INS-1, beta-TC6 und AR42J-Zellinien untersucht. Es

zeigte sich für den SCAB5, dass es gegenüber der INS-1-Zelllinie zu einer raschen

Bindung kommt (t1/2=6min), wobei kein Auswaschen des SCAB5 möglich erscheint. Dies

deutet auf die Internalisierung des SCAB5 hin (vgl. Abb. 13a). Des Weiteren war die

Bindungsspezifität des SCAB5 gegenüber INS-1- und beta TC6-Zellen um 450-faches

größer als zu AR42J-Zellen (vgl. Abb. 13b).

47

Abbildung 13: in vitro Bindungsverhalten von [125I]-markiertem SCAB5 für endokrine und exokrineZelllinien

a) Bindung des SCAB5 an INS-1 Zellen über die Zeit: Rasche Bindung (t1/2=6 min) des SCAB5 an INS-1-Zellen (schwarze Kreise), aber keine Ausswaschung (weiße Kreise) konnte gefunden werden.b) Bindungsverhalten des SCAB5 an endokrine und exokrine Zellen: Hohe Bindungsaffinität des SCAB5 anINS-1-Zellen (schwarzer Balken) und beta-TC6-Zellen (grauer Balken) konnte festgestellt werden, währendfast keine Bindung mit den AR42J-Zellen (schraffierter Balken) erfasst wurde (*** p<0,001 gegen AR42JZellen) (Ueberberg, et al., 2010b).

4.7 Charakterisierung des Bindeverhaltens des SCAB5 mittelskonfokalem Lasermikroskop

Für die weitere Untersuchung des SCAB5 auf die Frage hin, ob der Antikörper

internalisiert wird, wurden INS-1- und AR42J-Zellen mit dem SCAB5 bei 4°C oder 37°C

inkubiert. Nach Fixierung der Zellen konnte der SCAB5 mittels fluoreszierender

Sekundärantikörper sichtbar gemacht werden. Dadurch konnte die rasche Bindung des

SCAB5 an die β-Zelloberfläche und auch die Internalisierung gezeigt werden (vgl. Abb.

14). Die Kontrollversuche ohne Primärantikörper und mit den AR42J-Zellen waren negativ.

Die Internalisierung ist nur bei aktiven Zellen vorhanden, dies spricht für einen aktiven

Transport des SCAB5 in die Zelle.

48

Abbildung 14: Bindeanalyse mittels konfokalem Lasermikroskops

Die INS-1-Zellen wurden entweder bei 4°C oder 37°C mit dem SCAB5 inkubiert. Es zeigte sich, dass bei4°C der SCAB5 auf der Zelloberfläche verteilt war und bei 37°C eine Internalisierung zu erkennen. DieKontrollen ohne Antikörper oder mit der AR42J-Zelllinie waren negativ (modifiziert nach Ueberberg, et al.,2010b).

49

5. Diskussion

Es sollten SCA, die spezifisch gegen Oberflächenproteine der β-Zellen sind, charakterisiert

und evaluiert werden. Dabei war das Ziel, dass diese SCA später für eine in vivo

Evaluation der BZM genutzt werden können, also eine hohe Spezifität für die β-Zellen

aufweisen mit einem geringen Bindungsverhältnis zu dem umliegenden Gewebe und den

anderen Organen.

5.1 Hintergrund zur humanen BZM-Darstellung

Bis heute ist es nicht möglich, eine einzelne Langerhans-Insel oder β-Zelle beim Menschen

nicht invasiv in vivo darzustellen (Schneider, 2008). Daneben besteht das Problem, dass

die Langerhans-Inseln diffus im gesamten Pankreas verteilt sind und ihr Anteil nur 1-2 %

ausmacht. Außerdem nimmt der Anteil im Verlauf der Diabeteserkrankung weiterhin ab.

Zusätzlich gibt es kaum einen Unterschied in Echogenität oder Dichte gegenüber dem

exokrinen Pankreas (Schneider, 2008). Dadurch ist eine Vorraussetzung, um die Inseln

nicht invasiv messen zu können, das Entwickeln eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels.

Um ein potentielles Kontrastmittel auf seine Spezifität hin zu testen, entwickelten Sweet et

al. (2004b) einen systematischen Screening-Assay, mit dem eine in vitro Untersuchung auf

die Spezifität des Kontrastmittels möglich ist. Des Weiteren stellten sie fest, dass die

Spezifität eines Kontrastmittels mindestens 100:1 β-Zellen gegenüber nicht β-Zellen sein

muss, um das Massenverhältnis zu überwinden (Sweet, et al., 2004b). In einer weiteren

Berechnung stellte sich heraus, dass das Verhältnis sogar 1000:1 sein muss, um in vivo

überhaupt ein genügend hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erreichen (Sweet, et al.,

2004b). Durch diese Berechnung ist anzunehmen, dass ein Kontrastmittel mit der

Spezifität von 50 oder kleiner klinisch nicht erfolgreich angewendet werden kann. Dabei

ist aber zu bedenken, dass es sich bei den Angaben nicht um absolute Zahlen handelt,

sondern vielmehr um einen Richtwert. Deswegen ist es durchaus sinnvoll, schon

Kontrastmittel mit einer Spezifität von z.B. größer 100 zu untersuchen. Neben der

Spezifität des Kontrastmittels gibt es noch weitere Aspekte, die berücksichtigt werden

sollten. Diese Aspekte wurden von Schneider (2008) näher beschrieben.

Bei den bisherigen Versuchen ein Kontrastmittel zu entwickeln, war das Target meist ein

Oberflächen-Protein oder -Rezeptor der β-Zelle, teilweise sogar intrazelluläre Proteine

50

oder Vesikel (z.B. Oberflächen Ganglioside, VMAT2, GLUT2,…). Diese Moleküle

werden zur in vivo Testung radioaktiv markiert, daher kommt es von den ungebundenen

Molekülen, z.B. dem noch intravasal verbliebenen Teilen, zur Überlagerung. Es wurde

berechnet, dass ein ungebundenes Signal solange das eigentliche Signal überlagert bis es

ca. 200-mal schwächer ist als die gebundene Markierung (Sweet, et al., 2004a). Damit

dieser Überlagerungseffekt kein Problem darstellt, sollte ein potentielles Kontrastmittel

eine hohe Affinität als auch eine hohe Target-Dichte pro Zelle besitzen. Alternativ kann

auch eine lange Retentionszeit oder eine Internalisierung in der β-Zelle ausreichen. Am

besten wäre es, wenn das Kontrastmittel neben dem Bindungsverhalten mit einer schnellen

Ausscheidung aus dem Körper gekoppelt wäre (Hampe, et al., 2005).

Mittels des Kontrastmittels soll es möglich werden, die BZM zu bestimmen. Um dies zu

erreichen, muss seine Signalstärke mit der BZM korellieren. Guiot et al. (2007) stellten ein

Kontrastmittel vor der am Sulfonylharnstoffrezeptor 1 bindet. Es konnte gezeigt werden,

dass er mit den Insulingranula assoziiert ist. Dazu wurde in einem in vitro Versuch gezeigt,

dass die Markierung an den β-Zellen nach der Degranulation deutlich abnahm. Dies

scheint darauf zu deuten, dass dieses Kontrastmittel eher mit den Insulinvorräten korreliert

als mit der BZM. Es ist davon auszugehen, dass andere Moleküle, die dasselbe Ziel

besitzen oder mit den Insulingranula assoziiert sind, ähnliche Resultate liefern werden. Das

muss aber noch bestätigt werden. Neben den bisher genannten Eigenschaften ist es

natürlich wichtig, dass ein Kontrastmittel nicht nur auf tierischen β-Zellen exprimiert wird,

sondern auch auf humanen Zellen. Ebenso sollte das Kontrastmittel weder für die β-Zelle

an sich noch für den restlichen Organismus toxisch sein (Schneider, 2008).

5.2 Antikörper als β-Zell-spezifischer Marker

Antikörper wurden bis jetzt für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben entwickelt (Zheng,

et al., 2006), z.B. zum spezifischen Transport von Chemotherapeutika (Dubowchik and

Walker, 1999) oder zum Abfangen von Molekülen, die für den Tumorwachstum essentiell

sind (Ferrara, et al., 2005). Derzeitig sind ca. 17816 Substanzen und ca. 2025 verschiedene

Targets bekannt (Zhu, et al., 2012) und ihre Anzahl nimmt weiterhin zu. Deswegen ist

durchaus anzunehmen, dass ein hoch spezifischer Antikörper gegen die Oberfläche der β-

Zellen entwickelt werden kann und dieser sich für die nicht-invasive BZM-Darstellung

eignet. Ein paar Arbeitsgruppen haben schon daran gearbeitet, darunter auch Moore et al.

(2001). Sie untersuchten einen [111In]-IC2-Antikörper, der an einem bis dato unbekannten

51

Oberflächenprotein der β-Zelle der Maus gebunden hatte. In weiteren ex vivo Versuchen

konnten sie eine gute Korrelation von BZM und Antikörper-Akkumulation feststellen.

Leider musste festgestellt werden, dass das große Molekulargewicht des IC2-Antikörpers,

welches ein Antikörper des IgM-Typs ist, zu einer sehr langen Verweildauer im

Organismus führte. Das große Molekulargewicht sorgte für eine geringe Ausscheidung und

dadurch zu einer Halbwertszeit von mehreren Tagen. Dies führte zu einem schlechten

Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Eine weitere Arbeitsgruppe um Ladriere et al. (2001)

untersuchte den [125I]R2D6-Antikörper, der gegen ein Gangliosid der β-Zelle gerichtet war.

Leider wurde in vitro und in vivo Untersuchungen kein Unterschied im Rahmen der

Aufnahme in die β-Zellen von nicht diabetischen und diabetischen Ratten festgestellt.

Einen weiteren potenziellen β-Zell-Antikörper stellte Hampe et al. (2005) vor. Dabei

handelte es sich um einen IgM-Antikörper und das Fab-Fragment, die in vitro Screening-

Tests näher untersucht wurden. Dabei stellte sich heraus, dass die Spezifität des

Antikörpers zu gering war.

Durch diese Veröffentlichungen ist erkennbar, dass ein zu großes Molekulargewicht eines

monoklonalen Antikörpers die Halbwertszeit im Körper signifikant erhöht und es somit

äußerst schwierig macht das Hintergrundrauschen weit genug zu reduzieren, um eine

Aufnahme mit möglichst geringer Überlagerung und entspechender Schärfe zu generieren.

Große Moleküle besitzen die Tendenz, unspezifische Bindungen einzugehen, und sie

neigen zu sehr langen Zirkulationszeiten im Organismus. Durch das Entfernen des Fc-Teils

ist es möglich, diesen Effekt zu reduzieren. (Hampe, et al., 2005, Ladriere, et al., 2001).

Deshalb ist das Targeting der β-Zellen mittels Antikörpertechnologie weiterhin ein viel

versprechender Ansatz. Nur muss neben der Spezifität für das Target auch das Molekül

möglichst klein sein, um unnötiges Hintergrundrauschen zu vermeiden.

Da die Antikörper trotz der Probleme am vielversprechensten sind und mit möglichst

kleinen Molekülen gearbeitet werden sollte, bietet es sich an, einen SCA zu verwenden.

Damit ist es möglich, die Spezifität eines kompletten Antikörpers zu nutzen und trotzdem

ein möglichst geringes Molekulargewicht zu wahren.

5.3 Entwicklung β-Zell-spezifischer SCA

Die Entwicklung eines β-Zell-spezifischen Kontrastmittels wurde erschwert durch die

Tatsache, dass nur sehr wenig über die Oberflächenmarker der β-Zellen bekannt ist (Samli,

et al., 2005). Eine Möglichkeit dieses Problem bei der Entwicklung eines SCA zu umgehen,

52

ist das Nutzen der Phage-Display-Technologie. Sie ist eine Methode, um Peptide oder

Antikörper zu isolieren, die auf der Zelloberfläche binden, ohne dass ein

Oberflächenprotein vorher bekannt sein muss. Mit dieser Technik wurden schon

erfolgreich Peptide isoliert, die über das Gefäßsystem ganz spezielle Organe erreicht haben

unter anderem das Pankreas. (Pasqualini and Ruoslahti, 1996, Rajotte, et al., 1998, Trepel,

et al., 2002). Selbst für Langerhans-Inseln wurden schon mit dieser Technologie mittels in

vitro Panning spezifische Phagen isoliert (Samli, et al., 2005). Deshalb erscheint es

wahrscheinlich, dass mittels der Phage-Display-Technologie ein monoklonaler Antikörper

entwickelt werden kann, der eine entsprechend hohe β-Zell-Spezifität hat. Das Problem mit

der langen Verweildauer im Körper, dass durch das hohe Molekulargewicht bedingt ist,

wird durch den Einsatz einer SCA-Bibliothek umgangen. Der Einsatz von SCA-

Bibliotheken war zur Generierung von Insel spezifischen Phagen in vitro an Zell-Linien

der β- und α-Zellen und in vivo in Ratten schon erfolgreich. Sie zeigten eine signifikante

Anreicherung auf den Inseln (Ueberberg and Schneider, 2010a). Ebenso konnte bewiesen

werden, dass mit SCA die langen Zirkulationszeiten von bis zu Tagen nicht mehr auftreten.

Die Halbwertszeit betrug nur 22,7 oder 19,2 min für die SCA (Ueberberg, et al., 2009a).

Es wurde im Rahmen dieser Arbeit nun mit Hilfe der Phage-Display-Technologie nach

weiteren SCA gesucht um diese näher zu untersuchen und auf ihre β-Zell-Spezifität zu

testen. Oder bereits bekannte Klone, die bereits auf ihre Spezifität untersucht wurden,

weiter zu evaluieren. Es konnte ein Klon entdeckt werden, der bei einem Vergleich der

Peptidsequenz mit Hilfe des BLASTs (basic local alignment search tool) des NCBI

(National Center for Biotechnology Information) keine Übereinstimmung mit bereits

bekannten Proteinen lieferte Ein weiterer SCA wurde im in vivo Ansatz entdeckt, welcher

bereits durch Überberg (2009a) beschrieben wurde.

5.4 Bestimmung der β-Zell-Spezifität in vitro und in vivo

Ziel dieser Arbeit ist es, ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel zu finden. Mittels in vivo

Selektion in Ratten wurden zwei ISPC gefunden. Die beiden gefundenen Klone wurden

näher untersucht. Dazu wurde mittels Zell basiertem Bindungsassay das Bindeverhalten

der beiden SCA analysiert. Dabei wurden die beiden ISPC mit INS-1- und AR42J-Zellen

inkubiert und dann durch eine organische Phase zentrifugiert (Giordano, et al., 2001).

Dabei stellte sich heraus, dass der ISPC8 nur eine geringe β-Zell-Spezifität und der ISPC1

eine relative hohe erreicht. Die Ergebnisse sind mit denen von Ueberberg (2010a)

53

vergleichbar. Dies gab den ersten Hinweis, dass es sich um β-Zell-spezifische Phagenklone

handelte. Um dieses Ergebnis auch in vivo zu bestätigen, wurden die ISPC Ratten

intravenös injiziert, anschließend die Organe entnommen und immunhistochemisch

analysiert. In den histologischen Bildern bestätigte sich die Affinität beider ISPC zu den β-

Zellen. Während der ISPC1 keine weitere Bindung weder zu den Kontrollorganen noch

zum exokrinen Gewebe des Pankreas zeigte, entsprechend den Ergebnissen Ueberbergs

(2009a), konnte beim ISPC8 eine deutliche Aufnahme des ISPC8 in den exokrinen Zellen

festgestellt werden. In der Histologie hatten sich somit die Ergebnisse des Bindungsassay

bestätigt. Der Klon mit der geringen Spezifität zeigte entsprechend im exokrinen Gewebe

Anreicherungen, während der andere dort keine Aufnahme zeigte und nur in den β-Zellen

bindet. Des Weiteren zeigten beide Klone Anzeichen für eine Internalisierung. Da die

Ergebnisse mit denen Ueberbergs (2009a) korrelierten, wurde mit dem ISPC1 nicht

weitergearbeitet und der ISPC8 wurde näher untersucht. Um zu überprüfen ob der SCAB7

auch losgelöst vom Phagenanteil die gleiche Spezifität erreicht, ähnlich wie der ISPC1

(Ueberberg, et al., 2009a), wurde der SCA aufgereinigt und wie mit den ISPC den nicht

diabetischen Ratten intravenös injiziert. Es bestätigten sich die vorherigen Ergebnisse, dass

der SCAB7 spezifisch ist für die β-Zelle mit Anzeichen einer Internalisierung. Zusätzlich

zeigte sich nur eine leichte Ansammlung des SCAB7 im retikulohistozytären System der

extrapankreatischen Organe. Dies entsprach am ehesten der unspezifischen Clearance der

SCA, da auch die Kontrollen ein ähnliches Muster zeigten. Es zeigte sich auch hier wieder

eine niedrige Spezifität des SCAB7 auf β-Zellen. Denn neben der Bindung an den β-Zellen

war auch eine Anreicherung im exokrinen Pankreasgewebe zu sehen. Diese Ergebnisse

führen dazu, dass der SCAB7 für weitere Untersuchungen wahrscheinlich nicht in Frage

kommt, da der SCAB7 keine entsprechende Spezifität hat, die vorausgesetzt wurde (Sweet,

et al., 2004a, Sweet, et al., 2004b). Der SCAB1 hingegen ist durch seine große Spezifität

und geringe Bindung zu den restlichen Organen durchaus ein geeigneter Kandidat für ein

Kontrastmittel (Ueberberg, et al., 2009a). Weitere Untersuchungen sind hier durchaus von

Nöten.

Da der SCAB7 für weitere Analysen nicht geeignet ist, wurde entschieden, dass sich der

Erforschung eines weiteren SCA zugewandt werden sollte. Es wurde sich für den SCAB5

entschieden, denn er hat in Versuchen eine größere Spezifität gezeigt als der SCAB1

(Ueberberg, et al., 2010b). Aus diesem Grund sollte dieser Antikörper näher charakterisiert

werden. Der SCAB5 stammt aus einem in vitro Versuchsansatz. Die dafür verwendete

Bibliothek Tommlinson I wurde erst mit AR42J-Zellen inkubiert, damit die Klone

54

rausgefiltert werden können, die am exokrinen Pankreas binden. Erst darauf folgend wurde

mittels der INS-1-Zelllinie geschwenkt, um einen Klon zu bekommen, der gegen die β-

Zellen gerichtet ist. Im Gegensatz dazu stammen der SCAB7 und der SCAB1 aus einem in

vivo Ansatz, in dem die gleiche Bibliothek einer Ratte gespritzt wurde und der Pankreas

entnommen wurde, um die bindenden Phagenklone aufreinigen zu können. Aus dem

Pankreas werden die Langerhans-Inseln herauspräperiert, um an die spezifischen Phagen

zu gelangen. Da es aber leider keine Möglichkeit gibt, einzelne β-Zellen zu isolieren und

somit die β-Zell bindenden Phagen direkt zu ernten, kann es passieren, dass kein β-Zell-

spezifischer Klon, sondern ein α- oder δ-spezifische Variante dabei ist. Bei einer

Langerhans-Insel handelt es sich aber zum Großteil aus β-Zellen, daher ist es mit diesem

Versuchsaufbau am wahrscheinlichsten, einen β-Zell-spezifischen Klon zu generieren.

5.5 Bindungsverhalten von markierten SCA in vitro

Der entwickelte SCAB5 wurde mittels in vitro Versuch generiert. Er zeigte in einem

zellbasierten Bindungsassay eine 450-fach höhere Bindung an β-Zell-Linien als an einer

Zelllinien des exokrinen Pankreas. Dabei ist der SCAB5 älteren Liganden deutlich

überlegen (Hampe, et al., 2005, Sweet, et al., 2004b) und ist an der errechneten Spezifität

vergleichbar mit dem SCAB1 der einen Wert von ca. 500:1 hat (Ueberberg and Schneider,

2010a). Die Bindung des SCAB5 wird aber durch die Präinkubation mit SCAB1, SCAB2,

SCAB3 und SCAB4 nicht inhibiert. Dies spricht mindestens für eine separate

Bindungstasche innerhalb des gleichen Oberflächen-Antigen, wenn nicht sogar für ein

ganz anderes Oberflächen-Antigen.

Der SCAB5 überschreitet den in der Literatur angegebenen Schwellenwert (Sweet, et al.,

2004b), um als Kontrastmittel ein ausreichend hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu

erreichen. Dadurch ist der SCAB5 zu einem Kandidaten für weitere Untersuchungen

geworden. Bei diesen Tests wurde eine rasante Bindung des SCAB5 an INS-1-Zellen

festgestellt. Sie beträgt t1/2=6 min, außerdem konnte keine Auswaschung festgestellt

werden, was auf eine Internalisierung deutet. Verglichen mit dem SCAB1, der ebenfalls

eine schnelle Bindung hat (t1/2=8min) (Ueberberg, et al., 2009a), ist der SCAB5 nur

geringfügig schneller. Dies hat aber für die weitere Forschung kaum Relevanz. Um die

Aufnahme des SCAB5 in INS-1-Zellen nachzuweisen, wurde die INS-1-Zellen einmal bei

4°C und 37°C mit den SCAB5 inkubiert. Damit konnte gezeigt werden, dass bei aktiven

Zellen (37°C Ansatz) der SCAB5 sich im Zytoplasma ablagert, während bei den inaktiven

55

Zellen (4°C Ansatz) sich die Antikörper gleichmäßig auf der Zelloberfläche verteilten.

Dadurch konnte zusätzlich beweisen werden, dass der SCAB5 an der β-Zell-Linie bindet

und, dass der Antikörper aktiv von den Zellen aufgenommen wird. Daraufhin konnte

mittels Inkubation von radioaktiv markierten SCAB5 und INS-1-Zellen gezeigt werden,

dass mehr als 630.000 SCA pro β-Zelle internalisiert werden (Ueberberg, et al., 2010b).

Dies entspricht also ungefähr der selben Größenordnung wie der SCAB1 (Ueberberg, et al.,

2009a). Da es sich um eine aktive Internalisierung des SCAB5 handelt, kann davon

ausgegangen werden, dass nur noch lebende und wahrscheinlich gesunde β-Zellen die SCA

aufnehmen. Dementsprechend kann die Markierung durch den SCAB5 gleichgesetzt

werden mit der BZM. Des Weiteren konnte mittels Färbungen des pankreatischen

Gewebes von Ratten und Menschen gezeigt werden, dass das Epitop in Geweben

unterschiedlichen Ursprungs vorkommt (Ueberberg, et al., 2010b). Deshalb ist davon

auszugehen, dass die Ergebnisse, die durch Versuche an Ratten erlangt wurden, zumindest

teilweise auf menschliches Gewebe übertragbar sind.

Eine Grundvorrausetzung für die weitere Erforschung der Funktion der β-Zellen

insbesondere des Menschen ist es, dass das Kontrastmittel in Tierversuchen das gleiche

Verhalten aufzeigt wie an menschlichen Geweben. Dies scheint hier, der Fall zu sein.

Weitere Untersuchungen sind dennoch notwendig, um diese Eigenschaft bestätigen zu

können. Ein weiterer entscheidender Punkt, ob ein Ligand sich für ein β-Zell-spezifisches

Kontrastmittel eignet, ist seine Korrelation zur BZM. Mittels Infrarotaufnahmen von

markierten SCAB5 konnte gezeigt werden, dass die Zunahme der Signalintensität nur

abhängig ist von der BZM (Ueberberg, et al., 2010b). Damit erfüllt der SCAB5 einen Teil

der Vorgaben, die von Schneider (2008) beschrieben wurden, um als β-Zell-spezifisches

Kontrastmittel zu gelten.

Der SCAB5 ist zwar im Rahmen der Bindungsspezifität einem vollständigen Antikörper

oder seinem Fragmenten unterlegen (Hampe, et al., 2005), jedoch zeichnet er sich

insbesondere durch seine schnelle Bindung an den β-Zellen und seine Korrelation zur

BZM aus (Ueberberg, et al., 2010b). Die Spezifität mag zwar geringer sein, doch ist sie

immer noch ausreichend hoch, um als β-Zell-spezifisches Kontrastmittel in Betracht

gezogen werden zu können. Dadurch ist der SCAB5 weiterhin ein viel versprechender

Ligand für die nicht invasive Darstellung der BZM.

56

5.6 Ausblick

Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein SCA entwickelt, der eine gewisse Spezifität gegenüber

den β-Zellen des Pankreas zeigt. Leider erreichte sie nicht den notwendigen Schwellenwert

von 1:100 gegenüber dem exokrinen Gewebe, sodass dieser Klon nicht zu der Entwicklung

eines β-Zell-spezfischen Kontrastmittels genutzt werden kann. Aus diesem Grund wurde

sich einem weiteren vielversprechenderen Klon zugewendet. Dieser war schon als β-Zell-

spezifisch bekannt, aber wurde noch nicht näher untersucht. Leider konnte zu keinem der

beiden das Target bestimmt werden an dem es bindet. Damit kann nicht ausgeschlossen

werden, dass die SCA an schon bekannte Antigene binden und dabei nur eine andere

Tasche des Proteins zur Erkennung verwenden. Einige konnten ausgeschlossen werden,

dazu gehören Insulin, GAD-65, C-Peptid und IAPP (Ueberberg, et al., 2010b). Aber um

das Potential des SCAB5 besser abschätzen zu können, ist es notwendig, das Ziel Antigen

zu identifizieren. Weitere Möglichkeiten könnten sich durch die Identifizierung des

Antigens offenbaren. Daher sollte ein Ziel sein, es in der weiteren Forschung zu

identifizieren.

Ueberberg (2009b) konnte mit ihrem entdeckten Klon SCA1 deutlich machen, dass die

Entwicklung von spezifischen SCA mittels Phage-Display-Technologie durchaus Früchte

tragen kann. Ihr ist es sogar möglich gewesen, die BZM nicht invasiv in einer Ratte zu

bestimmen. Hierfür koppelte sie den SCA1 an 124Iod und detektierte den SCA dann mit

dem Positronen-Emmisions-Tomographen. Die Ergebnisse zeigten, dass ein deutlicher

Unterschied der Signalstärke im Pankreas von diabetischen und nicht diabetischen Ratten

erkennbar wurde (Ueberberg, 2009b). Damit wurde erstmals die BZM nicht-invasiv

sichtbar gemacht. Dies ist ein großer Schritt in der Diabetesforschung, denn durch die

nicht-invasive Darstellung der BZM werden neue Einblicke in die Pathogenese des

Diabetes möglich. Dadurch ergibt sich weiter die Möglichkeit, neue Therapien zu

entwickeln und bereits bestehende genauer evaluieren zu können.

Neben diesen viel versprechenden Ergebnissen sollte nicht unbeachtet bleiben, dass diese

Technologie doch sehr vom Zufall abhängig ist. Mittels der Phage-Display-Technologie ist

es möglich, auch ohne Kenntnis über die Oberflächenantigene einer Zelle Antikörper zu

entwickeln. Doch wird dadurch nicht garantiert, dass dabei immer ein hoch spezifischer

entdeckt wird. In einigen Fällen werden auch Klone selektiert, die nur eine geringe

Spezifität besitzen oder gegen ein allgemeines Antigen gerichtet sind, welches in mehreren

Zellen oder Organen vorkommt. Dadurch wird die Entwicklung neuer Antikörper mit Hilfe

57

dieser Technologie durchaus teuer, und ein Erfolg ist dabei nicht garantiert. Dazu kommt,

dass die Entwicklung der SCA auch sehr störanfällig ist. Die SCA haben sich im Rahmen

dieser Arbeit als sehr instabil erwiesen. Durch den Einsatz von verschiedenen Linker wäre

es vielleicht möglich, die Stabilität zu erhöhen. Einer anderen Arbeitsgruppe ist es

gelungen durch den Einsatz eines anderen Linkers die proteolytische Stabilität von einem

SCA zu erhöhen (Alfthan, et al., 1995). Es gibt eine große Menge an Möglichkeiten, die

Stabilität der SCA zu erhöhen. Dabei existieren zwei Herangehensweisen, die rationelle

und die evolutionäre. Welche von beiden nun besser ist, kann derzeitig nicht mit Sicherheit

geklärt werden. Während die eine schnell und günstig ist, bietet die andere die Möglichkeit,

neue und vielleicht noch bessere Methoden zu entdecken. Daher ist anzunehmen, dass

durch die Kombination beider Ansätze noch bessere Ergebnisse erzielt werden können

(Wörn and Plückthun, 2001). Da es so viele Möglichkeiten gibt und bis jetzt noch nicht

klar ist welche die bessere ist, sollte es vorrangig sein, einen Antikörper zu finden, der den

Kriterien Schneiders (2008) entspricht. Danach kann dieser immer noch weiter modifiziert

werden, um ihn stabiler zu machen und damit den praktischen Nutzen zu verbessern. Um

im Weiteren die Produktivität für die Antikörper zu erhöhen, könnten einerseits Bakterien

zur Sekretion der Antikörper umgezüchtet oder es könnte mittels Chaperonen eine bessere

Produktivität erreicht werden (Hayhurst and Harris, 1999). Es ist sicherlich ebenfalls

denkbar, dass mittels Zellkulturen die Antikörper hergestellt werden können. Dies hat

entsprechende Vor- und Nachteile (Hellwig, et al., 2004).

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Technologien, die in dieser Arbeit

verwendet wurden, durchaus geeignet sind, spezifische Marker zu entwickeln. Die Marker

können bei entsprechender Spezifität auch als Kontrastmittel eingesetzt werden. Das Ziel

für diese Arbeit war es ein β-Zell-spezifisches Kontrastmittel zu entwickeln, da es bis jetzt

nicht möglich ist, die BZM in vivo beim Menschen zu bestimmen und dadurch vieles über

die Pathogenese des Diabetes noch unbekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden nun

Marker entwickelt von denen sich herausstellte, dass nur einer den Anforderungen genügte.

Ueberberg (2009b, 2009a) hat gezeigt, dass es mit dem durch Phage-Display-Technologie

hergestellten SCA1 möglich ist, die BZM der Ratte mittels Positronen-Emissions-

Tomographen relativ darzustellen. Auch der SCAB5 konnte in den Versuchen zeigen, dass

er durch seine Eigenschaften als Kontrastmittel geeignet sein kann. Doch, ob es mit diesem

auch möglich ist, die BZM mittels radiologischen Methoden zu bestimmen, steht noch

offen. Ebenfalls ist die Frage auf die langfristige Reaktion des Organismus, die Elimination

aus dem pankreatischen Gewebe und evtl. Toxizität zu klären.

58

In wie weit durch dieses Kontrastmittel es nun möglich ist, die Pathogenese des Diabetes

genauer zu erkunden, und welche Methoden dazu am besten geeignet sind, ist Grund für

weiterführende Forschungen in diesem Gebiet.

59

6. Literaturverzeichnis

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Danksagung

Als erstes möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. S. Schneider bedanken, der

mir die Möglichkeit gab, an diesem äußerst interessanten Thema mitzuwirken sowie für

die schnellen Rückmeldungen und die fachliche Bewertung meiner Arbeit.

Zusätzlich gilt mein Dank auch Frau Dr. S. Ueberberg, die mit ihrer Betreuung und

Engagement einen großen Anteil am Zustandekommen dieser Dissertation hat. Ohne ihre

Anleitung und ihr ewig offenes Ohr für Fragen, wäre die Fertigstellung meiner Arbeit nicht

möglich gewesen.

Des Weiteren möchte ich allen Mitarbeitern des endokrinologischen Labors danken, für

den unermüdlichen Beistand bei jeglichen Fragen.

Außerdem will ich mich bei meiner Familie und Freunden bedanken, die mit viel Geduld,

Rat und Tat zur Seite standen.

Lebenslauf

Name: Georg Dennis Ziegler

Geburtsdatum: 05.06.1985

Geburtsort: Mannheim

Ausbildung

07/04 allgemeine Hochschulreife am Heinrich SigmundGymnasium Schriesheim, Baden-Württemberg

11/2011 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

10/2005–11/2011 Medizinstudium an der Ruhr-Universität-Bochum

09/2007 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung

Seit 02/12 Arzt in Weiterbildung für Ophthalmologie im St.-Johannes-Hospital Dortmund

PublikationenIn vitro phage display in a rat beta cell line: a simpleapproach for the generation of a single-chain antibodytargeting a novel beta cell-specific epitope. Diabetologia53(7): 1384-94.Ueberberg, S., D. Ziegler, W. Schechinger, J. W. Dietrich, S.Akinturk, H. H. Klein, and S. Schneider (2010).