Synthese und Struktur von viralen Regulatorproteinen · Synthese und Struktur von viralen...

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Synthese und Struktur

von viralen Regulatorproteinen

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von

Diplom-Chemiker René Röder

geboren am 11.05.1979 in Berlin

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Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen

Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 27. 04. 2010

Vorsitzender der

Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Hirsch

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Ulrich Schubert

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Für meine Familie

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Inhaltsverzeichnis

Seite

1 Zusammenfassung............................................................................................................. 6

2 Summary............................................................................................................................ 8

3 Einleitung ......................................................................................................................... 10

3.1 Peptidsynthese – gegenwärtiger Stand....................................................................... 11

3.2 Die Methode der „Native Chemical Ligation“ als Weg zur effizienten Synthese von

langen Peptiden .......................................................................................................... 13

3.3 Die Aspartimidbildung als Nebenreaktion bei der Peptidsynthese und deren

Verhinderung durch die Backbone Amidschutzgruppen Hmb und Dmb .................. 20

3.4 Die Backbone Amidschutzgruppe Dcpm in der Peptidsynthese................................ 25

3.5 NMR Untersuchungen von Peptiden ......................................................................... 26

4 Zielstellung....................................................................................................................... 29

5 Experimenteller Teil ....................................................................................................... 31

5.1 Material und Methoden.............................................................................................. 31

5.2 Peptidsynthesen.......................................................................................................... 33

5.2.1 Herstellung der Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV) ...................................... 33

5.2.2 Herstellung des Humanen Immundefizienzvirus Peptids Vpr mit klassischer

SPPS und mit NCL sowie dessen anschließende N-terminale Biotinylierung ... 41

5.2.3 Herstellung der Influenza A Virus PB1-F2 Peptide PR8, SF2, BF2(Y42 C) und

BF2(S47 C) von verschiedenen Stämmen ....................................................... 52

5.3 Ausgewählte Dcpm geschützte Aminosäuren............................................................ 58

5.3.1 Herstellung des Dicyclopropylmethanimin-Hydrochlorid.................................. 59

5.3.2 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der entsprechenden Benzylester

geschützten Dicyclopropyl-Ketiminaddukte....................................................... 61

5.3.3 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Benzylester geschützten (Dcpm)-

Aminosäuren aus den entsprechenden Ketiminen .............................................. 63

5.3.4 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der freien (Dcpm)-Aminosäuren .......... 65

5.3.5 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)-

Aminosäuren in Lösung...................................................................................... 70

5.3.6 Alternativer Syntheseweg für die Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)-

Aminosäuren an der festen Phase ....................................................................... 77

5.3.7 Herstellung von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH an der festen Phase ........... 81

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6 Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................. 88

6.1 Anwendungsmöglichkeiten der NCL zur Synthese der viralen Regulatorproteine ... 88

6.1.1 Die Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV) ......................................................... 88

6.1.2 Das HIV Peptid Vpr und die verschiedenen Influenza A Virus PB1-F2 Peptide

PR8, SF2 und BF2 .............................................................................................. 88

6.2 Strukturuntersuchungen mittels 1H NMR vom Peptid SF2 ....................................... 90

6.2.1 Bestimmung der Struktur des mittleren Fragments SF2(30-70)....................... 100

6.2.2 Bestimmung der Struktur des C-Terminus SF2(50-90).................................... 104

6.2.3 Zusammenfassung der Strukturelemente für das full-length Peptid SF2(1-90) 108

6.3 Die Anwendung von Dcpm geschützten Aminosäuren in der Peptidsynthese ........ 111

6.3.1 Stabilitätsuntersuchungen für den Einsatz bei der Peptidkupplung am Beispiel

von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH................................................................................ 111

6.3.2 Fmoc-OAt als neues Reagenz zur Einführung der Fmoc Schutzgruppe .......... 112

6.3.3 NMR Untersuchungen zum Abspaltungsprozess der Dcpm-Gruppe am Beispiel

von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH................................................................................ 114

6.3.4 Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH für die

Anwendung in der Peptidsynthese.................................................................... 119

6.3.5 Einfluss der Seitenketten auf das cis/trans-Verhältnis der Peptidbindung beim

neuen Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH............................. 123

7 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen............................................................... 125

8 Literaturverzeichnis...................................................................................................... 129

9 Danksagung ................................................................................................................... 137

10 Curiculum Vitae ............................................................................................................ 138

11 Publikationen................................................................................................................. 139

12 Eidesstattliche Erklärung............................................................................................. 140

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1 Zusammenfassung

Ein Schwerpunkt dieser Arbeit war die Synthese von langen viralen regulatorischen Peptiden

sowie von Fragmenten dieser Peptide. Neben der Synthese standen dabei die Optimierung von

bekannten Synthesestrategien und die Anwendung von neuen Konzepten, wie beispielsweise

die „Native Chemical Ligation“ (NCL), bei den im Rahmen dieser Arbeit erstmalig

synthetisch hergestellten Peptiden im Vordergrund. So wurden vom Influenza A Virus (IAV)

Protein PB1-F2 zwei humane H1N1 Varianten synthetisiert. Ein PB1-F2 Peptid entstammt

einem Isolat vom Mount Sinai [1], im Weiteren bezeichnet als PR8. Das zweite humane PB1-

F2 Peptid entstammt der „Spanischen Grippe“ [2], im Weiteren bezeichnet als SF2. Eine

weitere aviäre H5N1 Variante [3] des PB1-F2 Peptids, bezeichnet als BF2, wurde als

Vertreter der „Vogelgrippe“ synthetisiert. Vom Humanen Immundefizienzvirus Typ-1 wurden

zum einen das Gag Protein p6 [4] synthetisiert. Von diesem Peptid wurden zur Herstellung

von verschiedenen p6-Mutanten (Ser14,25,40 Asn) die Peptidkupplungen bei höheren

Temperaturen unter Verwendung eines Mikrowellensyntheseautomaten (Liberty, Firma

CEM) durchgeführt. Eine von Khurana et al. [5] modifizierte p6 Sequenz (in dieser Arbeit als

p6_neu bezeichnet) wurde für Vergleichsstudien synthetisiert, die von Patricia Klingler in der

Gruppe von Prof. Dr. U. Schubert (Universität Erlangen-Nürnberg) durchgeführt wurden. Ein

weiteres Gag Peptid p9 mit einer Länge von 51 Aminosäuren vom Equine Infectious Anemia

Virus wurde mittels step-by-step Methode erstmalig synthetisch hergestellt [6,7]. Im Rahmen

der vorliegenden Arbeit wurde ebenfalls das HIV-1 Protein Vpr mit einer Kettenlänge von 96

Aminosäuren synthetisch hergestellt, wobei hier die bekannte Synthese [8] durch die

Verwendung von Pseudoprolinen optimiert wurde. Dieses Peptid wurde im Rahmen dieser

Arbeit erstmalig durch die Methode der „Native Chemical Ligation“ erfolgreich synthetisiert.

Neben der Synthese dieser Peptide wurde im Rahmen der Arbeit von einem ausgewählten

Peptid, dem PB1-F2 Peptid der „Spanischen Grippe“, genannt SF2, die Struktur in Lösung

unter hydrophoben Bedingungen (TFE:Wasser, 1:1) berechnet. Dazu wurden von den

überlappenden Fragmenten SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90) 1H NMR

spektroskopische Untersuchungen durchgeführt und die erhaltenen quantitativen und

qualitativen NOE-Signale für die weitere Berechnung verwendet. Diese für das Peptid SF2

erhaltenen Strukturinformationen wurden anschließend mit der von Bruns et al. für das PB1-

F2 Peptid PR8 publizierten Struktur verglichen [9].

Zur Vermeidung von Schwierigkeiten bei der Synthese von langen Peptiden, hervorgerufen

durch die Aggregation der wachsenden Peptidkette infolge von

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Wasserstoffbrückenbindungen, werden im Allgemeinen „Backbone“ geschützte

Aminosäurebausteine eingesetzt. Die am häufigsten in der Literatur eingesetzten Bausteine

enthalten dabei die 2-Hydroxy-4-methoxybenzyl (Hmb) [10,11,12] bzw. deren

Weiterentwicklung die 2,4-Dimethoxybenzyl (Dmb) Schutzgruppe [12,13]. Auf Grund der

relativ stark sauren Bedingungen zur Abspaltung der Hmb und Dmb-Gruppe und der

Erkenntnis, dass bei der Verwendung der Hmb-Gruppe an deren freien Hydroxylfunktion

ungewünschte Nebenreaktionen auftreten können, wurde nach einer neuen Schutzgruppe für

die Peptidbindung des Peptidrückgrates gesucht. Als besonders geeignet erwies sich die von

Carpino für den Schutz der Amidfunktion von Glutamin und Asparagin sowie als

Carboxylschutzgruppe entwickelte Dicyclopropylmethyl (Dcpm) Gruppe [14]. Im Rahmen

dieser Arbeit wurden zu diesem Zweck die drei Dcpm geschützten Aminosäuren Glycin,

Alanin und Leucin synthetisiert und für die Peptidsynthese eingesetzt. Die Einführung der

Fmoc-Gruppe erwies sich auf Grund der Säurelabilität der eingeführten Dcpm-Gruppe als

schwierig. Zur Verbesserung der Ausbeute wurde nach einem alternativen Syntheseweg für

die Synthese der Fmoc geschützten (Dcpm)-Aminosäuren in Lösung [15] unter Verwendung

anderer Methoden zur Einführung der Fmoc-Gruppe an der festen Phase gesucht. Als

günstigste Methode stellte sich die Umsetzung unter neutralen Bedingungen mit einem in

unserer Arbeitsgruppe (Henklein et al.) entwickelten Einführungsreagenz Fmoc-OAt heraus.

Von Vorteil erwies sich, dass kein HCl während der Reaktion generiert wird, wie es im

Gegensatz zur Umsetzung mit Fmoc-Cl der Fall ist.

Neben der Vermeidung von Strukturproblemen durch die Hmb- und Dmb-Gruppe wird die

Verwendung dieser Gruppen als Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH bzw.

Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH zur Verhinderung der Aspartimid-Bildung während der

Synthese von Peptiden mit dem Sequenzmotiv Asp-Gly beschrieben [16,17,18]. Wegen den

bereits erwähnten Nachteilen der Hmb-Gruppe schien es daher interessant, die zuvor bereits

als „Backbone“ Schutzgruppe mit Erfolg eingesetzte Dcpm-Gruppe in einen derartigen

Dipeptidbaustein zu integrieren. Zu diesem Zweck wurde der Synthesebaustein Fmoc-

Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH entwickelt und bei der Synthese von Peptiden erfolgreich getestet

[19]. Ein Vorteil der Dcpm-Gruppe besteht darin, dass während der Abspaltung mit TFA

keine Nebenreaktionen mit dem zu synthetisierenden Peptid auftreten. Es konnte auch keine

Bildung von eventuell störenden Kationen beobachtet werden. Außerdem sind die

entstehenden Produkte aus der Abspaltung der Dcpm-Gruppe entweder flüchtig oder leicht

abtrennbar.

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2 Summary

A main topic was the synthesis of long viral regulation Peptids and fragments thereof. Besides

these syntheses the optimisation of known synthetic strategies and the usage of new concepts

like the “Native Chemical Ligation” (NCL) was our focus of research for the Peptids made

within the framework of this dissertation for the first time. From the Influenza A Virus (IAV)

protein PB1-F2 two different human H1N1 strains were synthesized; one from the Mount

Sinai [1], named as PR8, and the second from the 1918/19 “Spanish flu” [2], named as SF2.

Additionally one avian H5N1 strain [3], named as BF2, was synthesized. From the human

immunodeficiency virus typ 1 the Gag protein p6 was synthesized [4]. For the synthesis of

various mutants (Ser Asn) of the p6 protein the coupling reactions were also carried out at

higher temperatures by using a microwave assisted automated Peptids synthesizer (Liberty,

company CEM). A recently by Khurana et al. described modified sequence (named as

p6_neu) [5], was synthsized for comparable experiments done by Patricia Klinger in the

group of Prof. Dr. U. Schubert (university of Erlangen-Nürnberg).

One additional 51 amino acids long Gag protein p9 from the Equine Infectious Anemia Virus

was synthesized for the first time via the “step-by-step” method [6,7]. In the content of this

dissertation the HIV-1 regulatory protein Vpr with a length of 96 amino acids was synthesized

by using pseudoprolines to optimise the known strategy [8]. Besides for the synthesis of the

Vpr protein we used successfully the strategy of the „Native Chemical Ligation“for the first

time.

Besides the syntheses of all these Peptids, the structure of the PB1-F2 IAV peptide from the

“Spanish flu”, named SF2, was calculated under hydrophobic conditions (TFE:water 1:1). For

this 1H NMR analysis was done of the three overlapping fragments SF2(1-40), SF2(30-70)

und SF2(50-90) and the quantitative and qualitative NOE signals received from the spectra

were taken for the further calculation. The obtained results for the structure of the SF2 peptide

were then compared with known structure of the PB1-F2 IAV peptide PR8 published recently

by Bruns et al. [9].

The protection of the “Backbone” amide position of presynthesized amino acid building

blocks is normally done to overcome or to prevent problems during the synthesis of long

Peptids like the aggregation of the growing peptide chain caused by hydrogen bonds between

them. The mostly cited building blocks in the literature contain the 2-Hydroxy-4-

methoxybenzyl (Hmb) [10,11,12] or their improvement the 2,4-Dimethoxybenzyl (Dmb)

protecting group [12,13]. Because of the strong acidic conditions for deblocking the Hmb-

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and Dmb-group and the fact that by using the Hmb group side reactions could occur with their

free hydroxyl group we searched for a new protecting group for the backbone amide position

in Peptids. As the most promising group we found the Dicyclopropylmethyl (Dcpm)

protecting group, which was originally developed by Carpino for the protection of the amide

function of glutamine and asparagine and as a general protection for the carboxyl function

[14]. In the content of this work the three Dcpm protected amino acids glycine, alanine and

leucine were synthesized and used for the peptide synthesis. The introduction of the Fmoc

group via Fmoc-Cl analogue to the work of Carpino was difficult because of the acid

sensitivity of the introduced Dcpm group. To increase the yield an alternative strategy was the

aim of research for the synthesis of the Fmoc protected Dcpm-amino acids in solution [15] by

using other methods for the introduction of the Fmoc group on the solid support. The best

method was the reaction under neutral conditions with the new reagent Fmoc-OAt developed

in our group (Henklein et al.). It was advantageous that no HCl gas was generated during the

reaction compared the the conditions by using Fmoc-Cl.

Besides the prevention of structure problems by using the Hmb and Dmb group both groups

were also used as the dipeptide building block Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH or Fmoc-

Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH to prevent the aspartimide side reaction in the synthesis of Peptids

containing the Asp-Gly motiv [16,17,18]. Because of the mentioned disadvantages of the

Hmb group it was interesting to incorporate the Dcpm group, which was used successfully as

backbone protecting group, in such a dipeptide building block. For that purpose the new

dipeptide building block Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH was developed and tested

successful in peptide synthesis [19]. One advantage of the Dcpm group is that during the

cleavage with TFA no side reactions with the desired peptide occur and also no creation of

maybe violating cations were observed. Besides the products of the deblocking process of the

Dcpm group are either volatile or easy to remove.

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3 Einleitung

Peptide beeinflussen beispielsweise bei Vertebraten durch Wechselwirkung mit ihren

entsprechenden Rezeptoren die Kommunikation zwischen den Zellen und sind an der

Regulierung von Stoffwechsel, Reproduktion oder Immunabwehr beteiligt. Durch die

wachsende Kenntnis über die Wirkungsweise von bioaktiven Peptiden ist das Interesse an

dieser Stoffklasse vor allem in der Pharmazeutischen Industrie stark gestiegen. Die

Gewinnung von ausreichenden Mengen an Material dieser hochwirksamen Peptide aus

natürlichen Quellen ist oftmals problematisch, da diese in sehr geringen Konzentrationen

zwischen 10-12 bis 10-15 mol pro mg Frischmasse vorkommen können [20]. Der Einsatz von

verschiedensten Extraktionsverfahren zur Anreicherung und Gewinnung der Peptide aus

natürlichem Ausgangsmaterial stellt außerdem ein Risiko dar, weil das Material z.B. mit

pathogenen Keimen kontaminiert sein kann. Dies erhöht den Aufwand der Isolation des

gewünschten Peptids erheblich und erschwert die Gewinnung reiner Produkte. Bei der

Herstellung von Medikamenten, die auf isolierten Peptiden aus tierischen Quellen basieren,

können außerdem Unverträglichkeiten bei Patienten mit geschwächtem Immunsystem

auftreten, wenn mögliche Allergien von Menschen gegen bestimmte Tiere existieren.

Beruhend auf diesen Erkenntnissen hat man schon früh versucht, diese Peptidwirkstoffe auf

synthetische Weise zu gewinnen (z.B. Insulin, Somatostatin, Oxytocin, GnRH). Bei der

klassischen Peptidsynthese in Lösung erfolgt hierbei der Einsatz von verschieden orthogonal

geschützten Aminosäuren. Das heißt, dass beispielsweise für die Synthese eines beliebigen

Dipeptids Xxx1-Xxx2 die eine Aminosäure an ihrer α-Aminofunktion geschützt vorliegen

muss (z.B. Fmoc-NH-Xxx1-OH) und die andere Aminosäure muss an ihrer Carboxylfunktion

eine Schutzgruppe tragen (z.B. H2N-Xxx2-OtBu), so dass nur eine Reaktion zum

gewünschten Dipeptid Xxx1-Xxx2 möglich ist. Der Vorteil dieser beiden Schutzgruppen

beruht darauf, dass die Fmoc-Gruppe im alkalischen Milieu und die tBu-Gruppe im sauren

Umfeld abgespalten werden kann. Solche sogenannten orthogonalen Schutzgruppen liegen

dann vor, wenn jede Schutzgruppe für sich unter Bedingungen abgespalten werden kann, bei

denen die jeweils andere Schutzgruppe innert ist. Für die Synthese von relativ kleinen

Peptiden ist diese Verfahrensweise der schrittweisen Anknüpfung der nächsten Aminosäure in

Lösung grundlegend möglich. Durch die Notwendigkeit der Isolierung und Aufreinigung

jeder einzelnen Zwischenstufe während einer solchen Synthese ist diese Vorgehensweise

jedoch sehr zeitintensiv und mühselig. Dennoch gelang es auf diesem Weg biologisch aktive

Peptide wie beispielsweise das Neuropeptid Oxytocin, ein Nonapeptid mit einer

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Disulfidbrücke zwischen dem Cys-1 und dem Cys-6 in seiner Sequenz (Abbildung 1), zu

synthetisieren [20,21].

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Aminosäuresequenz von Oxytocin [20,21]

Neben Oxytocin gelang auch die Chemosynthese von weiteren pharmakologisch bedeutenden

Peptiden wie GnRH, dem synthetischen Analogon des Neurohormons Gonadotropin-

Releasing-Hormon, das zur Absenkung des Testosteronspiegels eingesetzt wird [22], oder

auch Cholecystokinin, ein Peptidhormon das die Wirkungsweise des Darms, die

Gallenblasenkontraktion und das Sättigungsgefühl steuert [23]. Mit der Einführung der

Festphasenpeptidsynthese (SPPS) [24] wurde es möglich, eine Vielzahl an Peptiden und

anderen Wirkstoffen in relativ kurzen Zeiträumen zu synthetisieren. Mit dem Einsatz von

Syntheseautomaten und neuen wirksameren Kopplungsreagenzien werden dabei Zykluszeiten

für die einzelnen Kupplungsreaktionen von ca. 30 min realisiert. Die Anfangs existierenden

Schwierigkeiten zur Reinigung der anfallenden Peptidgemische konnten durch

Weiterentwicklungen der analytischen Methoden z.B. der präparativen HPLC überwunden

werden. Der Einsatz von neuen Säulenmaterialien wie z.B. C4-, C8-, C18-, Amino-, CN-,

Phenyl- oder Silica-Material [25] und die Anwendung von erhöhten Temperaturen zur

Reinigung der Peptidgemische stellten wichtige Fortschritte dar. Neue Techniken wie die

UPLC ermöglichen es dabei, mit noch geringeren Probenmengen auszukommen und

gleichzeitig die Analysenzeiten zu verringern.

3.1 Peptidsynthese – gegenwärtiger Stand

Die Synthese von langen Peptiden mit mehr als 50 Aminosäuren stellt nach wie vor eine

Herausforderung an den Synthesechemiker dar. Ein Grund für dieses Problem ist dabei vor

allem die Ausbildung von sekundären Strukturelementen (z.B. β-Faltblatt [26]),

hervorgerufen durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Wasserstoffatomen des

Peptidrückgrats und den Aminosäureseitenketten. Durch diese zwischenmolekularen

Wechselwirkungen kann es zur Aggregation der Peptidketten kommen [27], wodurch die N-

terminale Aminogruppe für die weiteren Kupplungen abgeschirmt wird. Dadurch kommt es

H2N-Cys-Tyr-Ile-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-CONH2

S S

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zur unvollständigen Acylierung durch die nachfolgende Aminosäure. Die Anwendung von

reaktiveren Kondensationsreagenzien wie z.B. HATU oder die Verwendung von

Aminosäurechloriden und -fluoriden verbessert die Umsatzraten. Ein Weg zur Vermeidung

dieser Probleme ist der Einsatz von Pseudoprolinen während der Synthese [28,29], die durch

ihre strukturbrechenden Eigenschaften, ebenso wie Prolin selbst [30], die

Seitenkettenaggregation der stetig wachsenden Peptidkette verhindern können [28,29]. Die

Pseudoproline stellen cyclische Oxazolidine von Serin bzw. Threonin dar, die mit der jeweils

nachfolgenden benötigten Aminosäure verknüpft sind. Die fünfgliedrigen Pseudoproline

werden bei der Abspaltung des synthetisierten Peptids mit 95% TFA geöffnet, so dass sich die

ursprüngliche Sequenz mit den Aminosäuren Serin bzw. Threonin ausgebildet (Abbildung 2).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Ringöffnung der fünfgliedrigen Oxazolidine durch TFA [27]

Die Verwendung von niedrig beladenen Harzen für die Festphasenpeptidsynthese und die

Wahl von polaren aprotischen Lösungsmitteln (z.B. DMF oder NMP) für die Reaktion helfen

ebenso bei der Umgehung der beschriebenen Syntheseprobleme.

Für die erfolgreiche Synthese von Peptiden ist es notwendig, dass die Ausbeuten der

einzelnen Kupplungsreaktionen annähernd quantitativ verlaufen. Bei der linearen Methode

können beispielsweise Fehlsequenzen durch unvollständige Kupplungsreaktionen auftreten,

die dann die Reinigung des Zielpeptids behindern, da sie durch ihr ähnliches Verhalten meist

sehr schwer abzutrennen sind.

Im Gegensatz zur klassischen Methode der linearen Kettenverlängerung [31,32] ist es durch

Kondensation von geschützten Peptidfragmenten möglich, die Anzahl der einzelnen

Kupplungsreaktionen während der Synthese von langen Peptiden zu verringern. Durch die

separate Synthese dieser geschützten Peptidfragmente ist es möglich, diese aufzureinigen, so

dass bei der finalen Kupplung zum gewünschten Peptid relativ wenige Nebenprodukte

anfallen. Ein wesentlicher Nachteil dieser Methode ist die begrenzte Löslichkeit geschützter

Peptidfragmente und die erhöhte Racemisierungsgefahr.

NH

N

O

X

O

RH3C

H3C

O X = H, CH3

TFANH

HN

O

O

R

X OH

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3.2 Die Methode der „Native Chemical Ligation“ als Weg zur effizienten Synthese von

langen Peptiden

Trotz der Verwendung all dieser Hilfsmittel stellt die Länge des zu synthetisierenden Peptids

nach wie vor eine große Herausforderung dar. Statistisch gesehen nimmt mit zunehmender

Peptidkettenlänge auch die Wahrscheinlichkeit zu, dass Fehlsequenzen durch die

unvollständige Kupplung der einzelnen Aminosäuren auftreten. Um die Ausbeute und auch

die Reinheit des erhaltenen Rohproduktes zu erhöhen, ist es deshalb sinnvoll, solche Peptide

mit einer Länge von mehr als 50 bis 60 Aminosäuren durch die Kondensation von mehreren

kleineren ungeschützten Segmenten aufzubauen [27,33]. Eine Möglichkeit, um dies zu

erreichen, ist die von Kent und Dawson eingeführte Methode der „Native Chemical Ligation“

(NCL) [34,Review 35]. Es handelt sich hierbei um eine chemoselektive Kupplung zweier

ungeschützter Peptide, wobei das eine Fragment einen C-terminalen α-Thiolester und das

andere Fragment N-terminal einen Cysteinrest aufweist. Bei dieser Reaktion, die bereits von

Wieland et al. beschrieben wurde [36], erfolgt im ersten Schritt eine Thiolesterübertragung

von der Thiolgruppe der Seitenkette des Cysteins des C-terminalen Fragments auf das

Carboxylkohlenstoffatom des α-Thiolesters des N-terminalen Fragments. Im nächsten Schritt

folgt eine spontane intramolekulare S N Acylverschiebung über einen fünfgliedrigen

Übergangszustand, die sehr schnell abläuft im Vergleich zur Thiolesterübertragung und damit

das Gleichgewicht zu Gunsten der sich neu ausgebildeten Amidbindung verschiebt. Diese

resultierende Amidbindung stellt dann die neue Peptidrückgratbindung des Peptids an der

Ligationstelle dar [37,38,Review 39] (Abbildung 3).

Eine alternative Methode wurde von Tam et al. beschrieben, bei der das eine Fragment als

Thiolcarbonsäure vorliegt und das andere Fragment ein N-terminales α-Brom-Alanin

aufweist. Durch die Reaktion der beiden Fragmente über eine Thioalkylierung erfolgt die

Bildung eines intramolekularen α-Thiolester, gefolgt von der gleichen spontanen

intramolekularen S N Acylverschiebung wie bei der NCL [40,41].

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Abbildung 3: Schematische Darstellung des Mechanismus der NCL über eine spontane S N

Acylverschiebung [34,37]

Eine große Einschränkung für den universellen Einsatz der NCL in der Peptidsynthese ist,

dass in der Sequenz des zu synthetisierenden Peptids ein Cysteinrest an geeigneter Stelle

vorhanden sein muss. Erste Entwicklungen, um das Anwendungsgebiet der NCL von Xxx-

Cys Sequenzmotiven auf Xxx-Gly und Gly-Xxx zu erweitern, wurden von Canne et al.

beschrieben, wobei die Hilfsgruppen Nα(ethanthiol) bzw. Nα(oxyethanthiol) am N-Terminus

des mittels SPPS synthetisierten C-terminalen Fragments angeknüpft wurden [42]. Durch

diese Alkylthiol-Hilfsgruppen (Auxiliare) war es möglich zwei Peptidfragmente durch NCL

miteinander zu verknüpfen. Das Nα(oxyethanthiol)-Auxiliar ist ein säurestabiler Baustein, der

nach erfolgter NCL durch Zink reduktiv in saurem Milieu vom fertigen Peptid abgespalten

werden kann. Diese Reaktion verläuft jedoch mit sehr viel langsameren Reaktionszeiten, als

die NCL ohne Verwendung von Auxiliaren mit dem Sequenzmotiv Xxx-Cys, wie

Ligationszeiten der α-Thiolester aller 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren mit Cystein

zeigten [43]. Die Verwendung von Nα(ethanthiol) hingegen wies bessere Umsatzzeiten auf.

Jedoch war es hier nicht möglich, die Thiol-Hilfsgruppe nach der NCL wieder leicht

abzuspalten [42]. Eine Weiterentwicklung auf diesem Gebiet stellen die von Botti et al.

beschriebenen substituierten Nα-(1-phenyl-2-mercaptoethyl) Verbindungen dar, die nach

erfolgter NCL Reaktion durch TFA wieder leicht abgespalten werden können [44] (Abbildung

4).

HN

R'SR

O

H2N

HS

H2O; pH 7

NH O

S

H2NO

R'

HN

R'NH

OHS

OCys

N-terminaler Thiolester C-terminales Cys-Peptid

N-terminales Peptid C-terminales Peptid

neu gebildete Peptidbindung

O

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Abbildung 4: Schematische Darstellung der allgemeinen Synthese der Nα-(1-phenyl-2-mercaptoethyl) Thiol-

Hilfsgruppe und deren Anknüpfung an das C-terminale Peptidfragment nach Botti et al. [44]

Bei der Verwendung der Thiol-Hilfsgruppen (Auxiliare) erfolgt im ersten Schritt eine

Thiolesterübertragung auf den α-Thiolester des N-terminalen Fragments, so dass sich die zu

verknüpfenden Fragmente annähern. Im zweiten Schritt folgt dann die spontane S N

Acylverschiebung zur Ausbildung der Peptidbindung [38] (Abbildung 5).

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Einsatz von Thiol-Hilfsgruppen (Auxiliar) bei der NCL über

eine spontane S N Acylverschiebung und anschließender Abspaltung der Thiol-Hilfsgruppe

[38]

Die von Offer et al. beschriebene Tmb Gruppe (4,5,6-Trimethoxy-2-mercaptobenzyl) [45],

die eine Weiterentwicklung der Dmmb Thiol-Hilfsgruppe (4,5-Dimethoxy-2-mercaptobenzyl)

[46] darstellt, ist eine aromatische Thiol-Hilfsgruppe vom 2-Mercaptobenzyl System [47].

HN

R1

SR

O

ONH

H2O; pH 7 NH O

S AuxR1

HN

R1

NH

O R2

O

N-terminaler Thiolester C-terminales Cys-Peptid

N-terminales Peptid C-terminales Peptid

neu gebildete Peptidbindung

R2

AuxSH

abspaltbare Thiol-Hilfsgruppe

HN

R2

O

NH

O

NR1Aux

HS

O

R2

-Aux

H3CO

ORBr

CH3

SH

DIEA

DMF

H3CO

ORS

CH3

1) H2N-O-CH2CO2H

2) Reduktion

H3CO

NH2

SR'

R 1)

2) saure Abspaltung/Entschützungz.B. mit TFA

BrO

geschütztesPeptid

H3CO

HN

SH

RO

Peptid

R = H oder R = OCH3R' = para-Methylbenzyl

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Durch die gezielte Auswahl der Substituenten des aromatischen Ringsystems lässt sich die

Elektronendichte und folglich auch die Säureempfindlichkeit der gesamten Thiol-Hilfsgruppe

erhöhen, wodurch eine bessere Umsatzrate während der NCL Reaktion erreicht wird. Die

Tmb Gruppe lässt sich anschließend durch TFA sehr leicht wieder abspalten. Werden diese

Thiol-Hilfsgruppen bei NCL Reaktionen eingesetzt, die nicht das Sequenzmotiv Xxx-Gly

oder Gly-Xxx aufweisen, dann ist nicht mehr die Thiolesterübertragung der eigentliche

geschwindigkeitsbestimmende Schritt, sondern die Hydrolyse des α-Thiolesters tritt in den

Vordergrund [38]. Wu et al. kombinierten die beiden Methoden der auf Cystein basierenden

NCL und der cysteinfreien NCL bei der Synthese eines komplexen Glycopeptids in

eindrucksvoller Weise [48]. Bei der cysteinfreien NCL wurde bei dem Sequenzmotiv Gly-Gln

die Tmb Thiol-Hilfsgruppe eingesetzt. Durch die sauren Bedingungen während der

Abspaltung mit TFA wurde eine N S Acylverschiebung initiiert, gefolgt von der

irreversiblen Protonierung der resultierenden benzylischen Amingruppe. Die Folge war, dass

die eingesetzte Tmb Gruppe nicht mehr abgespalten werden konnte. Durch eine vorherige

Methylierung der freien Thiolfunktion der Tmb Gruppe mit para-

Nitrobenzensulfonsäuremethylester konnte die Nebenreaktion der N S Acylverschiebung

verhindert werden [38,48] (Abbildung 6). Auch wenn die Anwendung von solchen Thiol-

Hilfsgruppen bei der Anwendung von Ligationsreaktionen bisher wenig verbreitet ist, so

könnte diese Art der Maskierung der Thiolfunktion mit der Tmb Gruppe für deren Einsatz

von Vorteil sein. Um die für die NCL nötige freie Thiolfunktion vom Cysteinrest bzw. von

den Thiol-Hilfsgruppen vor der Oxidation zu disulfidverbrückten Dimeren zu schützen, wurde

von Burns et al. die Verwendung von TCEP als reduktives Phosphin beschrieben [49].

Abbildung 6: Schematische Darstellung des Einsatz von para-Nitrobenzensulfonsäuremethylester bei der

Abspaltung der Tmb Thiol-Hilfsgruppe unter sauren Bedingungen bei der Synthese eines

Glycopetids von Wu et al. [38,48]

OCH3

OCH3H3CO

SH N

O

O

R H

OCH3

OCH3H3CO

S NH2

O

RO

NO2

H3CO2S

OCH3

OCH3H3CO

SCH3 N

O

O

R NH

O

O

R

- 17 -

Die Oxidation der Thiolfunktionen und die Hydrolyse des α-Thiolesters können durch den

Zusatz von aromatischen Thiolen, wie z.B. (4-Carboxylmethyl)thiophenol [38], verringert

werden [50]. Dabei erfolgt eine in situ Generierung der Arylthiolester aus den eingesetzten

Alkylthiolestern. Diese können durch SPPS z.B. unter Verwendung des „backbone amide

linker“ [51] oder des „safety catch linker“ [52] erhalten werden. Beim „backbone amide

linker“ ist die C-terminale Aminosäure über das α-Stickstoffatom am Harz verankert und nach

der SPPS des Peptids mittels der Fmoc/tert-Butyl Strategie wird der α-Thiolesters vor der

Abspaltung mit TFA generiert [Review 53,54,55]. Beim „safety catch linker“ handelt es sich

um einen N-acylsulfonamidlinker [56,Review 53], der im Anschluss an die Peptidsynthese

durch Diazomethan oder Iodacetonitril am Stickstoff alkyliert und somit aktiviert wird. Durch

die Abspaltung vom Harz mit nucleophilen Thiolen werden dann die α-Thiolester gebildet

[57,58]. Eine alternative Strategie, wie sie auch im Rahmen dieser Arbeit angewendet wurde,

besteht darin, die Synthese des Peptids an einem säureempfindlichen 2-Chlortrityl Harz

durchzuführen, danach das Peptid geschützt mit intakten Seitenkettenschutzgruppen

abzuspalten und anschließend den Arylthiolester in Lösung am C-Terminus zu generieren

[59,60]. Die Seitenkettenschutzgruppen werden dann mit TFA abgespalten und der α-

Thiolester mittels RP-HPLC gereinigt. Die unterschiedlichen Reaktionsgeschwindigkeiten

während der NCL bei der Verwendung von Alkyl- oder Arylthiolestern wurden von Bang et

al. [61] unter kinetisch kontrollierten Bedingungen untersucht. Die Reaktivitätsunterschiede

wurden dabei auf die unterschiedlichen pKs-Werte der Thiolkomponenten des jeweiligen α-

Thiolesters zurückgeführt (pKs(Benzolthiol) = 6.6; pKs(2-Mercaptoethansulfonsäure) = 9.2)

[38,61]. Daran ist zu erkennen, dass die Arylthiole als stärkere Säuren die besseren

Abgangsgruppen im Gegensatz zur den Alkylthiolen während der Thiolesterübertragung

darstellen. Sie werden leichter abgespalten, wodurch sich die höheren

Reaktionsgeschwindigkeiten ergeben.

Eine Erweiterung der Anwendung für die NCL wurde durch den Austausch von Cystein für

Alanin in Peptiden, die normalerweise kein Cystein in ihrer Sequenz enthalten erreicht. Nach

erfolgter Ligation wird hier das zwischendurch eingeführte Cystein wieder in die Alanin

„wild typ“ Sequenz durch katalytische Hydrierung mit Raney-Nickel oder mit diversen

Palladiumkatalysatoren transformiert [62]. Die Verwendung von 10% Pd/Al2O3 in 6 M

Guanidiniumhydrochlorid-Lösung zeigte in diesem Fall sowohl bei der Synthese von linearen

als auch cyclischen Peptiden die besten Resultate und ist zusätzlich relativ einfach in der

Handhabung im Gegensatz zu Raney-Nickel, das im Allgemeinen vor jeder Anwendung

immer frisch hergestellt werden sollte [62]. Mit Hilfe dieser Methode kann die NCL auch auf

- 18 -

die Anwendung für das Sequenzmotiv Xxx-Ala ausgedehnt werden. Das Konzept, für die

Ligation auch andere Aminosäurebausteine einzusetzen und diese dann anschließend zu

modifizieren, wurde von Tam et al. [63] durch den Einsatz von Homocystein und

anschließender Methylierung der Thiolfunktion mit para-Nitrobenzol-sulfonsäure-methylester

zum Methionin gezeigt. Mit Hilfe dieser Methode ist auch der Zugang zu Peptiden mit dem

Sequenzmotiv Xxx-Met vorbereitet worden.

Durch die Modifizierung von verschiedenen Aminosäurebausteinen mit der benötigten

Thiolfunktion kann das Anwendungsgebiet der NCL auf weitere Sequenzmotive ausgedehnt

werden. Von Crich et al. [64] wurde gezeigt, dass durch die Integration der benötigten

Thiolfunktion auch andere Aminosäuren als Bausteine für die N-terminale Aminosäure des C-

terminalen Fragments bei der NCL Reaktion fungieren können. Nach Verseifung mit LiOH

des Nα-Boc-threo-β-hydroxy-L-phenylalaninmethylester, der aus L-Phenylalanin erhalten

wurde [65,66], erhielt Crich et al. [64] Nα-Boc-threo-β-hydroxy-L-phenylalanin als

modifizierte Aminosäure, die er anschließend bei der Synthese des C-terminalen Fragments

eingesetzt hat. Die Thiolfunktion der erythro-Thiolphenylalaninverbindung wurde

zwischenzeitlich mit Ethyldisulfid und meta-Chlorperbenzoesäure als Disulfid geschützt [67],

um die Ausbildung von Dimeren zu verhindern (Abbildung 7).

Abbildung 7: Schematische Darstellung der Synthese der modifizierten Phenylalaninverbindung mit

geschützter Thiolfunktion gemäß Crich et al. [64]

Bei der eigentlichen Ligation in Gegenwart vom Natriumsalz der 2-Mercaptoethansulfonsäure

(MESNa) und TCEP*HCl zur Reduktion der Disulfidbindungen zur freien Thiolfuktion [49]

wurden auch hier die reaktiveren Arylthiolester des N-terminalen Fragments eingesetzt. Die

abschließende Entschwefelung der im Ligationsprodukt resultierenden Thiolfunktion wurde

in diesem Fall durch die Umsetzung mit Nickelborid erreicht, welches in situ durch die

Reduktion von Nickelchlorid mit Natriumborhydrid erzeugt wurde [68]. Die Autoren konnten

HO

HN CO2CH3

BocH

1)MsCl, Et3N, DCM2)AcSH, DBU, DMF3)1N NaOH, DBU, DMF

HS

HN CO2CH3

BocH

Et3N, DCM

S

HN CO2CH3

BocH

EtS

THF

LiOH

S

HN CO2H

BocH

EtS

EtS-SEt, mCPBA

- 19 -

zeigen, dass diese Variante der Entschwefelung auch in Gegenwart vom Methionin und Acm

geschütztem Cystein ohne Nebenreaktionen durchführbar ist [64]. Außerdem konnten die

Autoren auch die analogen mit der Thiolfunktion modifizierten Verbindungen von Histidin,

Tyrosin und Tryptophan herstellen [65,66]. Durch die Herstellung dieser Verbindungen war

es möglich, dass neben dem Sequenzmotiv Xxx-Phe ebenfalls die Motive Xxx-His, Xxx-Tyr

und Xxx-Trp mit dem beschriebenen Prinzip eine Anwendung in der NCL finden sollten [64].

Andere orthogonale Ligationsmethoden, die nicht auf dem Prinzip der NCL beruhen, wurden

bereits für die Aminosäuren Tryptophan [69] und Histidin [70] beschrieben.

Eine interessante Weiterentwicklung der NCL ist die Möglichkeit der Durchführung an der

festen Phase (SPCL), woraus sich eine einfachere Handhabung des am polymeren Träger

gebundenen Ligationsprodukts ergibt [71]. Die schrittweise Durchführung von mehreren

Ligationen hintereinander und der Kombination mit anderen Ligationstechniken wie

beispielsweise der Oxaprolin- [72] und Thiaprolin-Ligation [73] erweitern das

Anwendungsgebiet der NCL auf die so genannte Tandemligation [74,75]. Dadurch können

auch an einem Trägermolekül verzweigte Peptide erhalten werden [76]. Die Verwendung von

sekundär geschützten Thiol-Hilfsgruppen wie beispielsweise durch die Acm Gruppe

zusätzlich geschützte Dmmb Thiol-Hilfsgruppe am N-Terminus des bei der NCL eingesetzten

α-Thiolester ist es möglich, durch Entschützen der Thiolfunktion der Dmmb Gruppe eine

zusätzliche NCL Reaktion als Tandemligation mit einem weiteren α-Thiolester durchzuführen

[77].

Zusätzlich zu der Verwendung der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren werden auch

modifizierte Aminosäuren wie Selenocystein [78] und Selenohomocystein [79] als Bausteine

in Peptide durch die Anwendung der NCL integriert.

Bei der „Expressed Protein Ligation“ (EPL) werden die Vorteile der Molekularbiologie mit

denen der chemischen Peptidsynsthese kombiniert. Hierbei werden die mit rekombinanten

Methoden erhaltenen α-Thiolester mit durch SPPS synthetisierte am N-Terminus ein Cystein

enthaltenen Peptiden unter den Bedingungen der NCL miteinander verknüpft

[80,81,82,Review 83]. Eine Übersicht über die Verbreitung der NCL bei der Anwendung in

der Peptidsynthese wurde kürzlich von Haase et al. beschrieben [84].

- 20 -

3.3 Die Aspartimidbildung als Nebenreaktion bei der Peptidsynthese und deren

Verhinderung durch die Backbone Amidschutzgruppen Hmb und Dmb

Bei der SPPS mittels Fmoc/tert-Butyl Strategie von Peptiden, die in ihrer Aminosäuresequenz

die Kombination Asp-Gly bzw. Asn-Gly enthalten, ist es möglich, dass als Nebenreaktion

Aspartimidbildung [27,85,86,87,88,89] auftreten kann. Bei der von Henklein et al. [90]

beschriebenen Synthese des PB1-F2 Peptids PR8 (A/Puerto Rico/8/1934) [1] konnte diese

Nebenreaktion beobachtet werden. Neben dem Vorhandensein des erwähnten Sequenzmotivs

hat auch die Sekundärstruktur des entsprechenden Peptids einen Einfluss auf das Ausmaß der

Aspartimidbildung, je nachdem wie leicht sich der fünfgliedrige Übergangszustand ausbilden

kann (Abbildung 8).

Abbildung 8: Schematische Darstellung der Aspartimidbildung als Nebenreaktion bei der Peptidsynthese

[27]

Ein Nachteil dieser ungewünschten Reaktion ist, dass nach dem Einbau der „Asp-Gly oder

Asn-Gly Einheit“, bei jeder weiteren Kupplung einer nachfolgenden Aminosäure die Fmoc-

Gruppe durch 20 %ige Piperidinlösung in DMF abgespalten wird. Durch das eingesetzte

Piperidin besteht die Möglichkeit, dass sich zum einen weiteres Aspartimid bildet. Und zum

anderen können sich aus dem entstandenen Aspartimid α- und β-Piperidide ausbilden. Diese

Nebenprodukte weisen eine Massendifferenz von +67 Da auf. Als weiterer Nachteil muss

angesehen werden, dass nach der Bildung des fünfgliedrigen cyclischen Imides, dieses sich

wieder öffnen kann, wobei sowohl das gewünschte α-Peptid resultiert und auch das

entsprechende β-Peptid gebildet werden kann. Die Bildung des cyclischen Imids erfolgt dabei

HN

X

O

NH

OX = OtBu, NH2

N

O

ONH

NH

OH

HN

OH

O

NH

O

OH

NH

O

NH

O

β-aspartyl Peptidrichtiges Peptid;α-aspartyl Peptid

HN

O

N

NH

O

O

NH

O

NH

N

β-Piperidid α-Piperidid

α

β

α

β α

β

- 21 -

durch den nucleophilen Angriff des Stickstoffatoms vom Glycin an das β-

Carboxylkohlenstoffatom der Ester- oder Amidseitenkettenfunktion von der geschützten

Fmoc-Aminosäure Asparaginsäure oder auch Asparagin, welche im nächsten Cyclus an die

Peptidkette gekuppelt wird. Da die Möglichkeiten zur Bildung der erwähnten Nebenprodukte

bei jedem weiteren Reaktionscyclus vorliegen, sinkt die Ausbeute des gewünschten Peptids in

erheblichem Maße. Eine sehr effektive Methode zur Verhinderung dieser Nebenreaktion

besteht in der temporären Maskierung des Stickstoffatoms der Peptidbindung mit der 2-

Hydroxy-4-methoxybenzyl-Amidschutzgruppe (Hmb) [10,11,12,91]. Durch die Verwendung

der Hmb-Gruppe wird neben der Verhinderung der Aspartimidbildung auch die Ausbildung

von Sekundärstrukturen der wachsenden Peptidkette am Harz während der Synthese

verhindert [92]. Die dadurch erreichte Unterdrückung der Aggregation der Peptidketten am

Harz während der Synthese ermöglicht die Synthese von Peptiden, die allgemein als

„Difficult Sequences“ bezeichnet werden [93]. Als eindruckvolles Beispiel sind dafür in der

Litertur beispielsweise die Synthesen der „Jung-Redemann“-Sequenz [94], das Alzheimer

Amyloid Peptid Aβ(1-42) [95,96] oder die Teilsequenz des Acyl Carrier Proteins ACP(65-74)

[97] beschrieben worden. Das Decapeptid ACP(65-74) gilt gegenwärtig als „Testsequenz“ für

die Leistungsfähigkeit der Anwendung von z.B. neuen Kupplungsmethoden [98], neuen

Additiven [99], neuen Harzen [100] und auch die Anwendung von neuen Amidschutzgruppen

für das Peptidrückgrat [10].

Bei der Entwicklung der Hmb-Gruppe durch Quibell und Johnson [27] wurden anfangs nur

methoxy-substituierte Arylreste als Amidschutzgruppe verwendet, wodurch die Acylierung

des Stickstoffatoms bei der Kupplung der folgenden Aminosäure nur sehr schlecht ablief und

nicht mehr quantitativ erfolgte. Durch die Einführung der 2-Hydroxylfunktion am Arylrest

wurde die Acylierung durch die nächste Aminosäure erleichtert. Der Grund liegt darin, dass

sich durch eine intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung mit dem freien Elektronenpaar

des Stickstoffatoms eine tautomere Grenzstruktur ausbildet, bei der die O-H-Bindung der

Hydroxyfunktion leicht destabilisiert wird (Abbildung 9). Bei dieser Grenzstruktur verläuft

die Acylierung mit Hilfe der sehr reaktiven Pentafluorphenylester der entsprechenden

Aminosäure schneller, als es ohne diesen elektronenziehenden Einfluss der Fall wäre. Als

abschließender Schritt erfolgt dann ein intramolekularer O N Acyltransfer, wodurch die

Amid-Peptidbindung gebildet und gleichzeitig die 2-Hydroxylfunktion regeneriert wird

(Abbildung 9).

- 22 -

Abbildung 9: Schematische Darstellung der Kupplung der nächsten Aminosäure über eine tautomere

Grenzstruktur der Hmb-Gruppe mit anschließendem O N Acyltransfer [27]

Die freie Hydroxylfunktion der Hmb-Gruppe kann bei der SPPS von biotinylierten Peptiden

während der Biotinylierung am N-Terminus des am Harz verankerten Peptids in Gegenwart

von DIEA ebenfalls durch Biotin acyliert werden [101]. Diese biotinylierte Hmb-Gruppe

verbleibt nach der anschließenden Abspaltung des Peptids mit TFA am Peptid, wohingegen

alle anderen Standardschutzgruppen (siehe Kapitel Material und Methoden) unter diesen

Bedingungen abgespalten werden. Dieser Effekt lässt sich zum einem durch den stark

gestiegenen sterischen Anspruch der durch Biotin acylierten Hmb-Gruppe erklären, wodurch

eine Abschirmung gegen die angreifende TFA resultiert (Abbildung 11). Zum anderen wird

ein stark elektronenziehender Substituent an Stelle der Hydroxylfunktion eingeführt, wodurch

ebenfalls die Abspaltbarkeit durch TFA herabgesetzt wird [102]. Den Effekt der Umkehr der

Säurelabilität in eine Säurestabilität der Hmb-Gruppe gegenüber TFA wurde bereits von

Quibell et al. [103] und Johnson et al. [104] beschrieben. Mit Hilfe der Acetylierung der

freien Hydroxylfunktion vom Hmb geschützten Glycin mit Ac2O in Gegenwart von DIEA

konnte er die Abspaltung der nunmehr 2-Acetoxy-4-methoxybenzyl Gruppe (AcHmb) von

Glycin durch TFA verhindern. Durch die anschließende Umsetzung des AcHmb geschützten

Peptids mit 20 % Piperidin in DMF (oder 5 % Hydrazin in DMF), den standardmäßigen

Bedingungen zur Abspaltung der Fmoc-Gruppe, wurde die Acetylgruppe wieder abgespalten

und so die säurelabile Hmb-Gruppe regeneriert [103] (Abbildung 10). Der Einbau der

O

H2N

R1

O

ON

Fmoc

F

F

F

F

FR2

OHN

R1O

N

R2

Fmoc

H3CO OFmoc

H3CO O

Fmoc

20% Piperidin/DMF

OHN

R1O

NH

R2

H3CO

OH

OHN

R1O

N

R2

H3CO

OHH

HN

OFmoc

R3

Aktivester

O

OHN

R1O

HN

R2

H3CO

O

OHN

R3

FmocOHN

R1O

N

R2

H3CO

O

O

NH

R3

Fmoc

OH

- 23 -

AcHmb-Gruppe während der SPPS verbesserte die Löslichkeit nach der Abspaltung vom

Harz von ansonsten sehr schwer löslichen Peptiden wie des Amyloid Peptids Aβ(1-42)

erheblich, wodurch die anschließende Reinigung mittels RP-HPLC sehr vereinfacht wurde

[105]. Diese starke Verbesserung der Löslichkeit von Peptiden durch den Einbau der AcHmb-

Gruppe konnte auch auf ansonsten vollständig geschützte Peptide übertragen werden, was

Quibell et al. [106,107] eindrucksvoll zeigen konnten.

Abbildung 10: Schematische Darstellung der reversiblen Modifizierung der Hmb-Gruppe durch Ac2O gemäß

Quibell et al. [103]

Abbildung 11: Schematische Darstellung der Acylierung der Hmb-Gruppe während der Biotinmarkierung des

Peptids und anschließender Abspaltung des Peptids vom Harz mit TFA

Eine Weiterentwicklung der Hmb-Gruppe stellt die 2,4-Dimethoxybenzyl Gruppe (Dmb)

[12,13,108] dar, die ebenso wie die Hmb-Gruppe die Ausbildung von geordneten β-

Falttblattstrukturen während der SPPS verhindert. Mit der Verwendung der Dmb-Gruppe als

NH

O

O

HN

O

OtBu

NH Biotinylierung

NH

OHN

O

OtBuO

NH

Asp(OtBu)

Gly(Hmb)

Asp(OtBu)

Gly(Hmb)+Biotin

TFA

NH

O

O

HN

OH

NH

Asp

Gly

OH

H3CO H3COO

O

S

HN NH

OO

O

O

O

N

Gly(Hmb)

Ac2O, DIEAN

Gly(AcHmb)

20% Pieridin/DMF

H3CO OH OH3CO CH3

O

O O

- 24 -

H3C

H3C

O

OHN

H3CCH3

Dmab

NCH3

MIM

O

OS

EDOTn

Backbone Amidschutzgruppe für die Aminosäure Glycin ist eine Acylierung nicht möglich

[109]. Durch die Einführung einer dritten Methoxygruppe kommt man zu der 2,4,6-

Trimethoxybenzyl Gruppe (Tmob) [110,111], bei welcher auf Grund des noch größeren

sterischen Anspruches die Kupplung der nächstfolgenden Aminosäure sehr erschwert wird.

Für die Abspaltung der drei als Backbone Amidschutzgruppe eingesetzten Hmb, Dmb und

Tmob Gruppe werden relativ harsche Bedingungen wie lange Reaktionszeiten in TFA

[102,112] benötigt, was für die Synthese von empfindlichen Peptiden ein Nachteil sein kann.

Beispielsweisen könnten Nebenreaktionen bei längeren Reaktionszeiten in den Vordergrund

treten, wodurch die Ausbeute des gewünschten Peptids verringert wird. Bei der Abspaltung

verbleibt außerdem ein intaktes Molekül in Form eines Benzylkations in der Abspaltlösung.

Auch wenn bei der Abspaltung Silane wie Triisopropylsilan (TIPS) als Scavanger zugegeben

werden [113,114], die diese reaktiven Kationen abfangen sollen, so verbleibt immer ein

gewisses Restrisiko, dass diese Kationen an anderer Stelle mit dem synthetisierten Peptid eine

kovalente Bindung eingehen und dann nicht mehr entfernt werden können.

Zur Verhinderung der Aspartimidbildung wurden kürzlich auch andere Schutzgruppen für die

Seitenkettenfunktion der Asparaginsäure wie beispielsweise die 4-{N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-

dioxocyclohexyliden)-3-methylbutyl]amino}benzyl Gruppe (Dmab) [115] oder die neuen

Backbone Schutzgruppen 3,4-Ethylendioxy-2-thenyl (EDOTn) und 1-Methyl-3-indolylmethyl

(MIM) [112] beschrieben (Abbildung 12).

Abbildung 12: Die zur Verhinderung der Aspartimidbildung eingesetzten Backbone Amidschutzgruppen

Dmab [115]; EDOTn und MIM [112]

Die Verwendung einer Schutzgruppe, die unter den Bedingungen der SPPS stabil ist und sich

während der Abspaltung in unreaktive Moleküle zersetzt, wie die von Carpino et al. [14,15]

eingeführte Dicyclopropylmethyl Gruppe (Dcpm), stellt in diesem Fall eine sehr viel

elegantere Lösung des Problems dar.

- 25 -

3.4 Die Backbone Amidschutzgruppe Dcpm in der Peptidsynthese

Die Dicyclopropylmethyl (Dcpm) und die Dimethylcyclopropyl (Dmcp) Schutzgruppen

wurden ursprünglich sowohl als Amidseitenkettenschutz für Asparagin und Glutamin, als

auch als Carboxylschutzgruppe am C-Terminus von Peptiden entwickelt [14]. Für die

Darstellung von Dcpm geschützten Aminosäuren in der SPPS mittels der Fmoc/tert-Butyl

Strategie entwickelten Carpino et al. [15] ein fünfstufiges Synthesekonzept. Im ersten Schritt

wird dabei ausgehend vom Dicyclopropylketon das entsprechende Iminhydrochlorid,

katalysiert durch TiCl4, zuerst durch die Einleitung von gasförmigem Ammoniak und

anschließend durch Chlorwasserstoffeinleitung generiert [116,117]. Als nächstes folgt dann

die Kondensation mit der jeweiligen Benzylester geschützten Aminosäure gefolgt von der

Reduktion mit NaCNBH3 zur N-Dcpm und O-Benzylester geschützten Aminosäure. Durch

katalytische Hydrierung mit Wasserstoff über Pd/C gefolgt von der Acylierung durch Fmoc-

Cl wird die entsprechende Fmoc-(Dcpm)-Aminosäure erhalten (Abbildung 13).

Abbildung 13: Schematische Darstellung des Synthesekonzepts gemäß Carpino et al. für Fmoc-(Dcpm)

geschützte Aminosäuren [15]

Im Gegensatz zu den bekannten Backbone Amidschutzgruppen Hmb und Dmb, bei denen

relativ stark saure Bedingungen für deren Abspaltung vom Peptid nötig sind [102,112], ist es

möglich, die Dcpm-Gruppe unter sehr schwach sauren Bedingungen vom gewünschten Peptid

abzuspalten. So konnte durch NMR-Untersuchungen gezeigt werden, dass bereits

Konzentrationen von z. B. 5 % TFA in Chloroform für die Abspaltreaktion ausreichend sind

[19,101].

O 1) NH3, TiCl42) HCl

NH2Cl

O

OH2N

RO

ON

R

NaCNBH3O

OHN

R

H2

Pd/C

O

OHHN

R

Fmoc-ClO

OH

N

R

Fmoc

- 26 -

3.5 NMR Untersuchungen von Peptiden

Um Strukturinformationen über Peptide in Lösung zu erhalten, können Untersuchungen mit

Hilfe von CD- und auch NMR Spektroskopie durchgeführt werden. Ziel dieser

Untersuchungen ist, ein Strukturmodell des entsprechenden Peptids zu erhalten und somit

einen möglichen Einblick in dessen biologische Wirkungsweise zu gewinnen.

Bei der Probenvorbereitung ist es dabei sehr wichtig, dass man so gut wie möglich versucht,

die physiologische Umgebung des zu untersuchenden Peptids bei den Messbedingungen zu

simulieren. Bei 1H NMR Untersuchungen von Peptiden weisen die eindimensionalen

Spektren eine sehr starke Überlappung der Signale auf, was eine eindeutige Zuordnung

meistens nicht möglich macht. Durch zweidimensionale 1H NMR Untersuchungen kann eine

Art „Entzerrung“ der Spektren in dem Sinn erreicht werden, dass die Überlappung der

Resonanzsignale der Protonen aufgehoben wird. Bei der PFT-Methode (Puls-Fourier-

Transform) der NMR Spektroskopie wird der Abfall der transversalen Magnetisierung (FID,

free induction decay) als Signal gemessen. Dabei ist das Empfängersignal eine Funktion der

Detektionszeit t2. Erfolgt eine Variation der Evolutionszeit t1, die zwischen dem ersten

Impuls und der Datenaufnahme liegt, so ist das Empfängersignal eine Funktion von t1 und t2.

Die anschließende Fourier-Transformation beinhaltet dann ebenfalls zwei Frequenzvariablen

F1 und F2, was die Grundlage der zweidimensionalen NMR Spektroskopie darstellt [118]. Es

wird bei den zweidimensionalen NMR Spektren im Allgemeinen zwischen den J-aufgelösten

(J-resoveld) und den korrelierten (correlated) 2D Spektren unterschieden [118]. Die

homonuklearen J-aufgelösten 2D Experimente enthalten nach einem primären 90°-Impuls

eine Evolutionszeit t1, in derren Mitte ein weiterer 180°-Impuls liegt. Nach jeden Impulspaar

nimmt t1 um einen konstanten Betrag zu. Während der Evolutionszeit t1 wird nur die skalare

Kopplung entwickelt, so dass die F1-Information ausschließlich Kopplungen enthält. Die F2-

Information hingegen enthält das gesamte Spektrum. Nach entsprechender mathematischer

Umformung (Fourier-Transformation) enthält man dann ein Konturdiagramm, in dem die

Spinmuster von oben betrachtet werden (in Abbildung 14 für ein Dublett und ein Triplett

veranschaulicht). Eine Projektion auf die F2-Achse liefert dann ein vollständig entkoppeltes 1H NMR Spektrum, wo jede Resonanz als Singulett widergegeben ist. Mit dieser Methode ist

die Zuordnung von stark überlappenden Multipletts möglich. Ein Nachteil besteht aber in der

relativ langen Messzeit und dem Auftreten von Signalartefakten bei stark gekoppelten

Spinnsystemen. Eine größere Bedeutung haben die korrelierten zweidimensionalen NMR

Spektren.

- 27 -

+10Hz

F2

δ2 δ1

F1

-10Hz

0Hz

δH

δH

δ2 δ3 F1 δ1

δ3

δ2

δ1

F2

Abbildung 14: Schematisches Konturdiagramm eines J-aufgelösten 2D 1H NMR Spektrum für ein Dublett

und ein Triplett mit Projektionen auf die F1- und F2-Achse [118]

Die korrelierten 2D NMR Spektren enthalten in beiden Frequenzachsen (F1 und F2) die

chemischen Verschiebungen. Es gibt hierbei verschiedene Verfahren wie beispielsweise

COSY, TOCSY, NOESY etc., die alle eine unterschiedliche Pulssequenz und graphische

Darstellungen aufweisen. Es werden mit diesen Methoden homonukleare 1H Shift-

Korrelationen erhalten, die die 1H-1H-Kopplungen eines Moleküls widergeben.

Abbildung 15: Schematisches Konturdiagramm eines 1H korrelierten zweidimensionalen NMR Spektrums

eines Drei-Spin-Systems mit zwei Kopplungen [118]

In Abbildung 15 ist als Beispiel ein 1H korreliertes 2D Spektrum eines Drei-Spin-Systems

dargestellt. Das normale 1D 1H NMR Spektrum liegt im Konturdiagramm auf der Diagonale.

Die ausgefüllten schwarzen Kreise stellen Kreuzungspunkte (cross-peaks) dar. In diesem Fall

koppelt δ3 mit δ1 und mit δ2. Die leeren Kreise symbolisieren dagegen, dass zwischen δ1 und

- 28 -

δ2 keine Kopplung vorliegt. Bei den COSY und TOCSY Experimenten werden dabei

Korrelationen (cross peaks) zwischen den Protonen beobachtet, die auf der Konektivität über

die chemischen Bindungen (skalare Kopplungen) beruhen. Im NOESY Spektrum hingegen

zeigen die Kreuzsignale (cross peaks) die räumliche Nachbarschaft der Kerne an, und sind auf

deren dipolaren Wechselwirkungen begründet. Diese NOE-Signale können bis zu einer

Entfernung von ca. 5Å nachgewiesen werden [118,119,120,121]. Mit Hilfe der

zweidimensionalen NMR Experimenten (COSY, TOCSY, NOESY) lassen sich die

Spinsysteme der einzelnen Aminosäuren zuordnen [119,120,121].

Die anschließenden Berechnungen zur Moleküldynamik und Energieminimierung mit Hilfe

der erhaltenen NOE-Daten sollen dann ein möglichst repräsentatives Ergebnis des

untersuchten Peptids in Lösung liefern.

- 29 -

4 Zielstellung

Das vorangige Ziel dieser Arbeit bestand darin, relativ lange virale Regulatorpeptide bzw.

Proteine synthetisch herzustellen. Diese synthetischen Peptide sollten anschließend für

biologische Experimente im Arbeitskreis von Prof. Dr. U. Schubert an der Universität

Erlangen-Nürnberg und für Untersuchungen zur Strukturbestimmung in Lösung in der

Arbeitsgruppe von Dr. V. Wray am Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in

Braunschweig eingesetzt werden. Es wurden Peptide mit einer Länge von bis zu 96

Aminosäuren resultierend vom Humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) synthetisiert,

aber auch schwerpunktmäßig Influenza A Virus (IAV) Peptide von drei verschiedenen

Stämmen (humane und aviäre). Bei den IAV Peptiden handelte es sich um verschiedene

Peptide, die alle zu der Gruppe der PB1-F2 Peptide mit einer Länge von bis zu 90

Aminosäuren gehören.

Bei der Synthese von Peptiden mit einer Länge von mehr als 50 Aminosäuren stellen die

Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Peptidketten, wie beispielsweise die Ausbildung

von Wasserstoffbrückenbindungen, am polymeren Träger ein gravierendes Problem dar.

Durch die damit verbundene Aggregation der Peptidketten wird das so genannte reaktive

Zentrum für die Kupplung der nächsten folgenden Aminosäure sehr stark abgeschirmt.

Dadurch wird ein Angriff der als Aktivester vorliegenden Aminosäure entweder sehr stark

behindert oder sogar ganz unterbunden. Im Gegensatz zu der klassischen kontinuierlichen

Methode der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) sollte im Rahmen dieser Arbeit die

konvergente Methode der „Native Chemical Ligation“ (NCL) auf die Synthese von viralen

Regulatorproteinen mit einer Länge von bis zu 96 Aminosäuren (Synthese von Vpr)

angewendet werden. Bei diesem Konzept werden Fragmente des eigentlich zu

synthetisierenden Peptids, die auf Grund ihrer kürzeren Aminosäuresequenz mit Hilfe der

SPPS leichter zu erhalten sind, zum fertigen „full-length“ Peptid kondensiert. Darüber hinaus

sollten die gewonnenen Erkenntnisse (Synthese von PR8) dann auch auf die Gewinnung von

bisher nicht synthetisierten Peptiden (Synthese von SF2 und Mutanten von BF2) angewendet

werden.

Um die Aggregation von Peptidketten während der Synthese am Harz zu verhindern, war es

das Ziel, die Amidfunktion von Glycin mit der Dicyclopropylmethyl (Dcpm) Gruppe zu

schützen und anschließend für die Synthese eines Modellpeptids einzusetzen. Die urspünglich

von Carpino et al. [14] als Carboxylschutzgruppe und als Schutzgruppe für die

Amidseitenkettenfunktionen von Glutamin und Asparagin entwickelte Dcpm Schutzgruppe

- 30 -

sollte in der vorliegenden Arbeit für die Maskierung des Stickstoffatoms von Glycin im

Peptidrückgrat verwendet werden. Mit Hinblick auf die in der Literatur bekannte

Nebenreaktion der Aspartimidbildung bei Peptiden war es ein Ziel, durch die Entwicklung

eines neuen Synthesebausteins die Anwendung von Dcpm geschütztem Glycin als Dipeptid

Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH zu vereinfachen. Durch die Verwendung des

Dipeptidbausteins wird das Risiko einer unvollständigen Acylierung durch Asparaginsäure

während der nächsten Kupplung minimiert. Die bei diesem neuen Dipeptidbaustein integrierte

Dcpm-Gruppe kann unter sehr milden leicht sauren Bedingungen nach erfolgreicher

Peptidsynthese problemlos mit abgespalten werden. Die Entwicklung des Dipeptids Fmoc-

Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH stellt eine Alternative dar, zu den kommerziell erhältlichen Hmb

und Dmb Derivaten Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH und Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH

(Novabiochem, Merck Biosciences und NeoMPS), für deren Abspaltung drastischere

Abspaltbedingungen, das heißt längere Reaktionszeiten in stark saurem Milieu, nötig sind.

Um den sterischen Einfluss der Seitenkettenfunktion der Aminosäure auf die Dcpm-Gruppe

zu untersuchen, wurden neben Glycin auch Alanin und Leucin mit dieser neuen Backbone-

Schutzgruppe modifiziert und mittels NMR Spektroskopie analysiert.

- 31 -

5 Experimenteller Teil

5.1 Material und Methoden

Die verwendeten Lösungsmittel von technischer Qualität wurden vor der Benutzung

destilliert. Für die Reaktionen verwendete Lösungsmittel wurden durch Destillation wie folgt

getrocknet: DCM über Calciumhydrid, Benzol und Toluol über Natrium / Benzophenon.

Die SPPS wurden entweder bei Raumtemperatur mit einem automatischen Peptidsynthesizer

ABI 433A mit UV-Detektor von Applied Biosystems oder bei höheren Temperaturen mit dem

Mikrowellen Peptidsynthesizer Liberty von CEM durchgeführt. Die Synthesen erfolgten

jeweils im 0.1 mmol Maßstab unter Verwendung der Fmoc/tert-Butyl Strategie. Die

folgenden Schutzgruppen für die Seitenketten der entsprechenden Aminosäuren wurden

während der automatischen Synthesen verwendet: 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydro-

benzofurane-5-sulfonyl (Arg), tert-butyloxycarbonyl (Trp, Lys), tert-butyl ether (Thr, Ser,

Tyr), tert-butyl ester (Asp, Glu), und trityl (Asn, Cys, Gln, His). Lösungsmittel, die für die

Peptidsynthese eingesetzt wurden, waren von der Qualität „peptide synthesis grade“.

Die Schmelzpunkte wurden mit einem Schmelzpunktbestimmer von Apotec mit einer offenen

Glaskapillare ermittelt und sind unkorrigiert.

Die Reinigung der Peptide erfolgte auf einem Shimadzu LC8 System. Deren analytische

Kontrolle mittels RP-HPLC wurde mit einem Shimadzu LC10 System durchgeführt. Für die

Reinigung mittels HPLC wurden Lösungsmittel der Qualtität „HPLC grade“ verwendet.

Die eindimensionalen NMR Spektren wurden entweder mit einem Bruker DPX 300 mit

Autosampler bei 300 MHz für 1H und 75 MHz für 13C, mit einem Bruker AV 400 mit

Autosampler bei 400 MHz für 1H und 100 MHz für 13C oder mit einem Bruker AV 600 bei

600 MHz für 1H und 150 MHz für 13C gemessen. Die Messung der zweidimensionalen

homonuclearen 1H NMR Spektren (TOCSY und NOESY) der synthetisierten Peptide erfolgte

mit einem Bruker Avance Gerät bei 600 MHz ausgestattet mit einem UltraShield Plus

Magneten und einem dreifachen Resonanzcryoprobenkopf (1H/13C/15N) mit

Gradienteneinheit. Für die Messungen der Peptide SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90)

wurden diese in 50%igem wässrigem TFE-d2 bei einem pH-Wert von ca. 3 gelöst. Die

Peptidlösungen hatten eine Konzentration von 1.4, 1.6 bzw 1.1 mmol. Die Messungen

erfolgten bei einer Temperatur von 300 K. Die Spektren wurden mit Mischzeiten von 110 ms

beim TOCSY und 250 ms beim NOESY jeweils ohne Rotation aufgenommen. Die

Datenaufnahme, Prozessierung und die Spektrenanalyse erfolgten mittels einer Standard

- 32 -

Bruker Software. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm angegeben und beziehen sich

auf das restliche Protonensignal des jeweiligen Lösungsmittels bzw. auf das interne

Methylensignal bei 3.95 ppm bei den Spektren in 50%igem TFE-d2. Die Identifizierung der

eindeutigen Spinsysteme der jeweiligen Aminosäuren und deren sequentielle Zuordnung

erfolgte in Anlehnung an die Vorgehensweise von Wüthrich [121]. Die für die

Peptidstrukturberechnungen benötigten Abstände zwischen den Protonen wurden durch die

Umwandlung der entsprechenden NOE-Signale mit dem Bruker Programm AURELIA

bestimmt, wobei nur eindeutige NOE-Signale für diese Analyse berücksichtigt wurden [122].

Dabei wurde der Abstand der Amidprotonen in den Seitenketten der Aminosäuren Gln oder

Asn auf 0.19 nm kalibriert. Die Peptidstrukturen wurden auf einer Octane Workstation von

Silicon Graphics berechnet unter Verwendung des Programms CNS 1.0 mit den

Standardparametern für CNS [123]. Die Bestimmung der jeweiligen Kernstrukturen erfolgte

mit den Programmen LSQMAN und MOLEMAN2 von Uppsala Software Factory [124,125].

Die graphische Darstellung der Strukturen wurde mit dem Programm PYMOL durchgeführt

[126]. Die oben beschriebenen Verfahren zur Strukturaufklärung von Peptiden in Lösung

wurden bereits in Arbeiten von Bruns et al. [9,127] und Fossen et al. [128] erfolgreich

angewendet und beschrieben.

Matrix assisted laser desorption ionization mass spectra (MALDI-MS) wurden aufgenommen

an einem Voyager-DE PRO BioSpectrometry Workstation von Applied Biosystems. Die

Peptidproben wurden in 50%igem wässrigem Acetonitril gelöst. Als Matrix wurde α-Cyano-

4-hydroxyzimtsäure verwendet. Positive ion electrospray ionization mass spectra (ESI-MS)

wurden mit einem Micromass Q-Tof-2 Massenspektrometer gemessen. Die Proteinproben

wurden in 70%igem wässrigem Methanol gelöst und in die Electrospraykammer mit einer

Nadelspannung von 0.9 kV bei einer Flussrate 40 nl/min injiziert.

Hochaufgelöste Massenspektren (HR-MS) wurden mit einer LCT Premier XE UPLC-Anlage

von Waters mit einer ACQUITY ACR UI HSST3 Säule (100 x 2.1 mm, 1.8 µm) bei einer

Säulentemperature von 35 °C gemessen bei einem Gradienten von 5 % Acetonitril / 95 %

Wasser auf 95 % Acetonitril / 5 % Wasser in 10.5 min bei einer Flussrate von 0.6 ml/min.

- 33 -

5.2 Peptidsynthesen

Bei den regulatorischen Viruspeptiden, die im Rahmen dieser Arbeit zum Teil erstmalig

synthetisch hergestellt wurden, handelt es sich zum einen um Peptide des Humanen

Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) [4,5,8], wie Vpr und p6. Zum anderen wurden drei

verschiedene PB1-F2 Peptide von humanen und aviären Influenza A Virus Stämmen [1]

synthetisiert, sowie das p9 Peptid vom Virus der infektiösen Anämie der Einhufer (EIAV)

[6,7].

5.2.1 Herstellung der Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV)

Das HIV Gag Peptid p6 (HIV-1NL4-3) mit einer Länge von 52 Aminosäuren und auch das

EIAV Gag Peptid p9 (Isolat EIAWYOMING) mit einer Länge von 51 Aminosäuren wurden

mittels klassischer step-by-step Methode am Trägerharz synthetisiert.

Abbildung 16: Aminosäuresequenz der Peptide p6(1-52) (A): (Die unterstrichenen Aminosäuren markieren

die Positionen, wo zur Syntheseoptimierung Pseudoproline bzw. für Thr-22 die sterisch

anspruchsvollere Trt-Seitenkettenschutzgruppe eingesetzt wurden.); und p9(1-51) (B): (Die

unterstrichenen Aminosäuren markieren die Position, wo zur Syntheseoptimierung

Pseudoprolin verwendet wurde.)

Synthese von p9 (EIAV)

Für die Synthese wurden 300 mg TentaGel S Trt-Glu(tBu)-Fmoc Harz (Beladung 0.17

mmol/g, Rapp Polymere) verwendet. Zur Erhöhung der Syntheseeffizienz wurden nach der

Kupplung der 4. Aminosäure Ser-48 Doppelkupplungen durchgeführt und HATU als

Kupplungsreagenz verwendet. Die Abspaltung der temporären Fmoc Schutzgruppe erfolgte

während der gesamten Synthese mit 20 % Piperidin in DMF. Zur Verringerung der

1 10 20 30 40 50

LQSRPEPTAP-PE FRFGEE-T TPSQKQEP-IDKELYPL -LRSLFGSDPS-SQES T AS

P6

1 10 20 30 40 50

PIQQKSQHN VVQETPQTQ-NLYPDLSEIK-KEYNVKEKDQ-VEDLNLDSLW-EK-S

P9

A

B

- 34 -

Interaktionen zwischen den Peptidketten und deren Aggregation am Harz während der

Synthese wurde Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH an der Position Lys-10/Ser-11 eingesetzt

(Abbildung 16). Die Abspaltung des so synthetisierten Peptids erfolgte mit TFA : Wasser :

TIPS (95:3:2, v/v/v) für 1.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der Abspaltlösung

am Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die Zugaben von eiskaltem Et2O

ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v)

lyophilisiert.

Ausbeute Rohprodukt:

173 mg (28.57 µmol, 56 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 52 %

Die Reinigung von jeweils ca. 35 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem

Gradienten von 35 % B auf 65 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA;

B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm)

bei einer Flussrate von 10 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm.

Ausbeute nach Reinigung mittels RP-HPLC:

6.7 mg (1.11 µmol, 20 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)

Abbildung 17: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid p9(1-

51) (B): Gradient: 10% B 100% B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml

TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125

x 4.6 mm, 5 µm)

Rt [min]

0 5 10 15 20 25

A Rt = 19.342 minp9(1-51)

Rt [min]

0 5 10 15 20 25

B Rt = 19.393 minp9(1-51)

- 35 -

MALDI-MS: berechnet: 6055.72 Da gefunden: 6056.46 Da (M+)

3027.54 Da (M2+)

Abbildung 18: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid p9(1-51)

Synthese von p6 (HIV)

Für die Synthese wurden 300 mg TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc Harz (Beladung

0.20 mmol/g, Rapp Polymere), verwendet. Zur Erhöhung der Syntheseeffizienz wurden nach

der Kupplung der 8. Aminosäure Phenylalanin Doppelkupplungen durchgeführt. Als

Kondensationsreagenz wurde HBTU verwendet. Die Abspaltung der Fmoc Schutzgruppe

erfolgte während der Synthese mit 20 % Piperidin in DMF. Zur Verringerung der

Interaktionen zwischen den Peptidketten und deren Aggregation am Harz während der

Synthese wurden die Pseudoproline Fmoc-Glu(OtBu)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH an der Position

Glu-13/Ser-14 und Fmoc-Ala-Ser(ΨMe,Mepro)-OH an Position Ala-39/Ser-40 eingesetzt.

Weiterhin wurden in dem Sequenzmotiv Thr-21/Thr-22/Thr-23 die Doppelkupplungen in

folgender Weise modifiziert. Für Thr-21 wurde als Seitenkettenschutzgruppe die tert-Butyl

Gruppe verwendet. Bei Thr-22 wurde für die erste Kupplung die sterisch anspruchsvollere

Trityl Gruppe eingesetzt, wobei nur von einem Reaktionsumsatz von ca. 80 % ausgegangen

werden kann. Durch den Einsatz der größeren Trityl Schutzgruppe soll die Ausbildung von

Sekundärstrukturen und die Interaktion der Peptidketten untereinander verhindert werden, um

so die Reinheit und Ausbeute des Rohproduktes zu erhöhen. Im zweiten Reaktionsschritt

wurde dann erneut die kleinere tert-Butyl Gruppe als Seitenkettenschutz für Thr-22

eingesetzt, um eine vollständige Kupplung an der Position Thr-22 zu erreichen. Die Kupplung

von Thr-23 wurde dann wieder als Doppelkupplung mit der standardmäßig verwendeten tert-

Butyl Seitenkettenschutzgruppe für Threonin durchgeführt. Die Abspaltung des Peptids vom

Harz erfolgte mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach

dem Einengen der Abspaltlösung am Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die

999.0 2399.4 3799.8 5200.2 6600.6 8001.0Mass (m/z)

4.2E+4

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 6055.9, 42496]

6056.46

6093.753027.54

- 36 -

Zugabe von eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure :

MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.



Die Reinigung mittels RP-HPLC erfolgte bei einem Gradienten von 39 % B auf 64 % B in

50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit

einer Agilent C-18 Säule (250 x 30.0 mm, 10 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer

Wellenlänge von λ = 220 nm.



Abbildung 19: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid p6(1-

52) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml

TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Zorbax

300SB_C18 (150 x 4.6 mm, 5 µm)

Rt [min]

0 5 10 15 20 25 30

A Rt = 21.270 minp6(1-52)

Rt [min]

0 5 10 15 20 25 30

B Rt = 21.246 minp6(1-52)

- 37 -


2905.97 Da (M2+)

Abbildung 20: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid p6(1-52)

Synthese der Mutanten p6(1-52; S14 N), p6(1-52; S25 N), p6(1-52; S40 N) und p6(1-

52; S14, S25, S40 N)

Neben der Synthese des Wildtyps vom Peptid p6(1-52) wurden unter Verwendung des

Mikrowellen-Peptidsyntheseautomaten Liberty von CEM die in Tabelle 1 angegebenen

Mutanten des full-length p6(1-52) Peptids synthetisiert. Mit Hilfe dieser Mutanten, in denen

die Aminosäure Serin durch Asparagin an den Positionen 14, 25 und 40 ausgetauscht wurden,

erfolgten dann im Arbeitskreis von Prof. Dr. U. Schubert (Universität Erlangen-Nürnberg,

Institut für Molekulare und Klinische Virologie) Untersuchungen zur Phosphorylierung des

Peptids p6(1-52).

Peptid Ausbeute an Rohpeptid Reinheit vom

Rohpeptid laut HPLC

Ausbeute nach HPLC-Reinigung#

p6(1-52; S14 N) 70 mg, 12.0 µmol, 24 % 24 % 3.1 mg, 0.53 µmol, 4.4 %



p6(1-52; S14,S25,S40 N) 77 mg, 13.0 µmol, 26 % 37 % 1.3 mg, 0.22 µmol, 1.7 %

Tabelle 1: Synthetisierte Mutanten (Ser Asn) vom Peptid p6(1-52), #Die prozentualen Angaben sind auf die

jeweils erhaltene Menge an Rohpeptid bezogen.

Die Synthesen der p6-Mutanten wurden jeweils an einem TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc Harz

(250 mg, Beladung 0.20 mmol/g, Rapp Polymere) durchgeführt. Die Abspaltung der Fmoc-

Gruppe erfolgte während der Synthese mit 20 % Piperidin in DMF, wobei für 210 Sekunden

1999.0 2999.4 3999.8 5000.2 6000.6 7001.0Mass (m/z)

2.8E+4

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 5810.7, 28001]

5811.21

5792.122905.97 5768.00

- 38 -

bei einer maximalen Temperatur von 70 °C Mikrowellen mit einer Leistung von 35 W

eingestrahlt wurden. Zur Erhöhung der Effizienz wurden alle Aminosäurekupplungen als

Doppelkupplungen durchgeführt. Als Kondensationsreagenz wurde HBTU verwendet. Die

Kupplungsreaktionen wurden erst für 120 Sekunden bei Raumtemperatur und dann für 240

Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 70 °C unter Mikrowelleneinstrahlung mit

einer Leistung von 35 W durchgeführt. Die Abspaltung der Peptide vom Harz erfolgte mit

TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der

Abspaltlösung am Rotationsverdampfer wurden die Rohprodukte durch die Zugaben von

eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1,

v/v) lyophilisiert. Die Reinigung mittels RP-HPLC erfolgte dabei analog zur Vorgehensweise

wie sie bei der Synthese von p6(1-52) zuvor beschrieben wurde.

Synthese von p6_neu (HIV)

Die Synthese des Gag Peptids p6_neu(1-52) erfolgte an einem TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc

Harz (350 mg, Beladung 0.20 mmol/g, Rapp Polymere) unter Verwendung des Mikrowellen-

Syntheseautomaten Liberty. Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe wurde mit 20 % Piperidin in

DMF durchgeführt, wobei für 210 Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 50 °C

Mikrowellen mit einer Leistung von 35 W eingestrahlt wurden. Zur Erhöhung der Effizienz

wurden alle Aminosäuren durch Doppelkupplungen verknüpft. Als Kondensationsreagenz

wurde HBTU verwendet. Die Kupplungsreaktionen wurden erst für 120 Sekunden bei

Raumtemperatur und dann für 240 Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 50 °C

unter Mikrowelleneinstrahlung mit einer Leistung von 25 W durchgeführt. Eine Ausnahme

bildet die Anknüpfung der Aminosäure Arginin. Arginin wurde erst für 25 Minuten bei

Raumtemperatur und anschließend für 300 Sekunden unter Mikrowellenstrahlung bei einer

maximalen Temperatur von 50 °C und einer Leistung von 25 W gekoppelt.

Abbildung 21: Aminosäuresequenz vom Peptid p6_neu(1-52)

1 10 2 0 30 40 50- - - - -SQSRPEPTAPPA ESFRFGEEIT PTPSQKQEPK DKELYPPLAS LRSLFGNDPS

P6_neu

- 39 -

Im Gegensatz zu den Synthesen der p6-Mutanten wurde hier die Temperatur für die

Kupplungsreaktionen und für die Abspaltung der Fmoc-Gruppe auf maximal 50 °C reduziert,

wodurch eine höhere Ausbeute des Rohpeptids im Verhältnis zur eingesetzten Harzmenge

erzielt werden konnte. Wahrscheinlich erfolgte bei Temperaturen oberhalb von 50 °C ein

partieller Verlust des Linkers am Harz, da bei allen Synthesen der p6-Mutanten und bei der

Synthese von p6_neu(1-52) das gleiche TentaGel S Trt-Gln(Trt)-Fmoc Harz verwendet

wurde.



Die Reinigung von 25 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem Gradienten von

37 % B für 5 min isokratisch dann von 37 % B auf 62 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN +

500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C-18

Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer Wellenlänge von

λ = 220 nm.



Abbildung 22: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid

p6_neu(1-52) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O

+ 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Zorbax

300SB_C18 (150 x 4.6 mm, 5 µm)

Rt [min]

0 5 10 15 20 25 30

A Rt = 20.754 minp6_neu(1-52)

Rt [min]

0 5 10 15 20 25 30

B Rt = 20.849 minp6_neu(1-52)

- 40 -


2877.54 Da (M2+)

Abbildung 23: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid p6_neu(1-52)

499.0 1799.4 3099.8 4400.2 5700.6 7001.0Mass (m/z)

2165.1

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 5752.9, 2165]

5753.02

5776.555852.96

2877.54563.73

- 41 -

5.2.2 Herstellung des Humanen Immundefizienzvirus Peptids Vpr mit klassischer

SPPS und mit NCL sowie dessen anschließende N-terminale Biotinylierung

Beim regulatorischen HIV Peptid Vpr (HIV-1NL4-3) handelt es sich um ein Peptid mit einer

Kettenlänge von 96 Aminosäuren. Die klassische Synthese mittels SPPS, wie sie Henklein et

al. beschrieben haben [8], wurde durch die Verwendung eines neuartigen auf

Polyethylenglycol (PEG) basierenden Aminomethyl-Harzes H-Ser(OtBu)-HMPB (260 mg,

Beladung 0.21 mmol/g, ChemMatrix) und durch den Einsatz von Pseudoprolinen optimiert.

Dieses neue Harz, im Weiteren als CM-Harz bezeichnet, weist bessere Quelleigenschaften in

vielen gängigen organischen Lösungsmitteln auf, als es bei herkömmlichen PS-Harzen der

Fall ist [129].

Um die Effizienz der Synthese zu erhöhen wurden nach der Kupplung der 5. Aminosäure

Glycin Doppelkupplungen durchgeführt. Als Kupplungsreagenz wurde HBTU verwendet. Die

Fmoc Schutzgruppe wurde mit 20 % Piperidin in DMF abgespalten. Zur Verhinderung der

Aggregation der sich stetig verlängernden Peptidkette während der Synthese wurden die

Pseudoprolin-Bausteine Fmoc-Trp(Boc)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für Trp-18/Thr-19, Fmoc-

Lys(Boc)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH für Lys-27/Ser-28, Fmoc-Asp(OtBu)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für

Asp-52/Thr-53 und Fmoc-Val-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für Val-83/Thr-84 eingesetzt (Abbildung

24). Die Abspaltung des fertigen Peptids erfolgte mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für

3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der Abspaltlösung am Rotationsverdampfer

wurde das Rohprodukt durch die Zugaben von eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und

anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.

Abbildung 24: Aminosäuresequenz der Peptids Vpr(1-96): (Die unterstrichenen Aminosäuren markieren die

Positionen, an denen der Einsatz von Pseudoprolinen zur Syntheseoptimierung erfolgte.)



1 10 20 30 40 50

60 70 80 90 96MEQAPEDQGP-QREPYNE L-ELLEEL EA-VRHFPRIWLH-NLGQHIYETY- G WAGVEAI-IRILQQLLFI-HFRIGCRHSR-IG RQRRAR-NGASRS

WT KS

DT VT

Vpr

- 42 -


Gradienten von 61 % B für 5 min isokratisch dann von 61 % B auf 91 % B in 50 min (A:

2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Zorbax

300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer



2.8 mg (0.246 µmol, 4.6 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)

Abbildung 25: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid Vpr(1-

96) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml

TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125

x 4.6 mm, 5 µm)


5685.14 Da (M2+)

3124.54 Da (Fragment)

Abbildung 26: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid Vpr(1-96)

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 34.042 minVpr(1-96)

A

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 34.176 minVpr(1-96)

B

1000.0 3400.6 5801.2 8201.8 10602.4 13003.0Mass (m/z)

266

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 3124.4, 266]

3124.545685.14

11375.33

11365.95

11405.541084.531109.61 3665.39 5639.97 11492.28

1326.23 3202.70 5596.594488.70

- 43 -

Biotinylierung am N-Terminus

Für biologische Untersuchungen im Arbeitskreis von Prof. Dr. U. Schubert (Universität

Erlangen-Nürnberg, Institut für Molekulare und Klinische Virologie) wurde am N-Terminus

von Vpr(1-96) Biotin angeknüpft. Dafür wurde ein Teil des Harzes vor der Endabspaltung

abgenommen. Das Harz mit dem verankerten Peptid Vpr(1-96) wurde dazu in 4 ml DMF

gequollen und anschließend wurden 67 mg (10 eq, 0.273 mmol) Biotin, 104 mg (10 eq, 0.273

mmol) HATU und 92 µl (20 eq, 0.546 mmol, 70.6 mg, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA zugegeben

und die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach gründlichem

Waschen des Harzes mit DCM und DMF erfolgte die Abspaltung des biotinylierten Peptids

Vpr(1-96) mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem

Einengen der Abspaltlösung am Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die

Zugaben von eiskaltem Et2O ausgefällt, gewaschen und abgesaugt. Anschließend wurde aus

10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.




Gradienten von 61 % B für 5 min isokratisch dann von 61 % B auf 91 % B in 50 min (A:





5.1 mg (0.439 µmol, 8.5 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)

- 44 -

Abbildung 27: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohpeptid (A) und vom gereinigten Peptid Vpr(1-

96)+Biotin (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O +

5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18

(125 x 4.6 mm, 5 µm)


5803.20 Da (M2+)

3873.12 Da (M3+)

Abbildung 28: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten N-terminal biotinyliertem Peptid Vpr(1-96)+Biotin

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 34.155 minVpr(1-96)+Biotin

B

Rt [min]

0 10 20 30 40

A Rt = 34.228 minVpr(1-96)+Biotin

999 3599 6199 8799 11399 13999Mass (m/z)

1305

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 5802.5, 1305]

5803.205811.75

5823.8211609.095782.753873.1211598.485871.37

1116.64 3881.922217.75 5722.993917.252707.24 5568.25

- 45 -

Synthese mittels Native Chemical Ligation (NCL)

Um die Synthese des Peptids Vpr(1-96) zu vereinfachen wurde die Methode der „Native

Chemical Ligation“ (NCL) angewandt [34]. Die für die klassische NCL Reaktion nötige

Aminosäure Cystein ist in der Sequenz von Vpr(1-96) an Position 76 vorhanden. Die

Unterteilung des Gesamtpeptids Vpr(1-96) in zwei Fragmente sollte zur Verbesserung der

Synthese und der Erhöhung der Gesamtausbeute beitragen. Die Reduzierung der Länge des

N-Terminus immerhin um 20 Aminosäuren, sollte eine Vereinfachung für die Synthese dieses

Fragments erwarten lassen. Die Synthese des N-Terminus Vpr(1-75) wurde an einem 2-

Chlortrityl Harz durchgeführt, welches zuvor mit der ersten Aminosäure Glycin beladen

wurde. Dazu wurden 1 g des 2-Chlortritylchlorid Harzes (CBL Patras Griechenland) in 3 ml

DCM 5 min gequollen und anschließend mit 178.4 mg (0.6 mmol) Fmoc-Gly-OH versetzt

und 90 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Harz gründlich mit

DMF und DCM gewaschen und die freien Reaktionsstellen am Harz durch die Zugabe von

MeOH : DIEA (9:1, v/v) 15 min lang „gecappt“. Die Fmoc-Gruppe wurde anschließend mit

20 % Piperidin in DMF abgespalten und durch UV-Spektroskopie der Abspaltlösung bei

λ = 301 nm die Absorption und daraus die Harzbeladung bestimmt. Die Beladung betrug in

diesem Fall 0.217 mmol/g. Für die Synthese des N-Terminus Vpr(1-75) wurden 250 mg des

beschriebenen Gly-2-Cl-Trt Harzes und HBTU als Kupplungsreagenz verwendet. Zur

Verhinderung der Aggregation der sich stetig verlängernden Peptidkette wurden, wie auch

schon bei der „step-by-step“ Synthese des gesamten Peptids Vpr(1-96), Fmoc-Trp(Boc)-

Thr(ΨMe,Mepro)-OH für Trp-18/Thr-19 und Fmoc-Lys(Boc)-Ser(ΨMe,Mepro)-OH für Lys-

27/Ser-28 eingesetzt. Als Variation wurde jedoch Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für

Glu-48/Thr-49 an Stelle von Asp-52/Thr-53 verwendet (Abbildung 29).

- 46 -

Abbildung 29: Aminosäuresequenz der Peptids Vpr(1-96); (A) Die unterstrichenen Aminosäuren markieren

die Positionen, wo der Einsatz von Pseudoprolinen zur Syntheseoptimierung erfolgte. (B)

Schematische Darstellung der beiden Fragmente für die NCL Reaktion zum Vpr(1-96)

Zur Vereinfachung wurde Met-1 bei der Synthese des α-Thiolesters von Vpr(1-75) als Boc-

geschützte Aminosäure eingesetzt. Nach beendeter SPPS wurde das Peptid Vpr(1-75) unter

milden Bedingungen vom sehr säurelabilen 2-Cl-Trt Harz mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1,

v/v/v) 2 h bei Raumtemperatur abgespalten, so dass alle Seitenkettenschutzgruppen noch am

Peptid vorhanden waren. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz von n-Heptan am

Rotationsverdampfer entfernt. Durch Zugabe von eiskaltem Et2O wurde das Rohprodukt

ausgefällt und anschließend aus Wasser : MeCN (1:1, v/v) lyophilisiert.

Für die Darstellung des α-Thiolester vom N-Terminus wurden 100 mg vom vollständig

geschützten Rohpeptid in 5 ml trocknem DCM zuerst mit 4 µl (3 eq, 21 µmol, ρ =

0.806 g/cm3) DIC dann mit 3 mg (3 eq, 21 µmol) HOBt*H2O und anschließend mit 17.5 mg

(15 eq, 0.105 mmol) para-Acetamidothiophenol versetzt [59]. Die Reaktionsmischung wurde

dann bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Anschließend wurde die Lösung am

Rotationsverdampfer eingeengt und die verbliebenen Schutzgruppen wurden mit TFA :

Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung

wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und das Rohprodukt durch die Zugaben von

eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1,

v/v) lyophilisiert.



1 10 20 30 40 50

60 70 80 90 96MEQAPEDQGP-QREPYNE L-ELLEEL EA-VRHFPRIWLH-NLGQHIY Y- GDTWAGVEAI-IRILQQLLFI-HFRIGCRHSR-IGVTRQRRAR-NGASRS

WT KS ET

Vpr

Vpr(1-75) Vpr(76-96)M1 G75 C 76 S 96

A

B

- 47 -

Die Reinigung von jeweils 28 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei 74 % B

isokratisch für 5 min und dann durch einen Gradienten von 74 % B auf 99 % B in 50 min (A:





7.0 mg (0.7674 µmol, 8 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)

Abbildung 30: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten α-Thiolester

des Peptids Vpr(1-75) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45min (A: 2000 ml MeCN +

500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:

Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)


4559.13 Da (M2+)

Abbildung 31: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten α-Thiolester des Peptids Vpr(1-75)

Rt [min]

0 10 20 30 40

A Rt = 38.923 minVpr(1-75)_Thiolester

Rt [min]

0 10 20 30 40

B Rt = 38.981 minVpr(1-75)_Thiolester

1999.0 3999.4 5999.8 8000.2 10000.6 12001.0Mass (m/z)

576

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 4558.8, 576]

4559.13

9117.47

2241.84

2376.18

2147.822782.75 4488.59

2816.23 4006.76

- 48 -

Die Synthese des für die NCL erforderlichen C-terminalen Peptid Vpr(76-96) wurde auf dem

Liberty-System von CEM durchgeführt. Die Kupplungen erfolgten erst für 120 Sekunden bei

Raumtemperatur und anschließend für 240 Sekunden unter Mikrowelleneinstrahlung bei einer

Leistung von 25 W und einer maximalen Reaktionstemperatur von 50 °C. Eine Ausnahme

bildete in dieser Sequenz die Aminosäure Arginin, die mit diesen Einstellungen nicht

ausreichend genug gekuppelt werden konnte. Aus diesem Grund erfolgte die Kupplung von

Arginin erst 25 Minuten bei Raumtemperatur und dann für 300 Sekunden unter

Mikrowelleneinstrahlung mit einer Leistung von 25 W und einer maximalen

Reaktionstemperatur von 50 °C. Die Temperatur wurde nicht über 50 °C erhöht, weil es bei

einigen Harzen zu Komplikationen mit dem entsprechenden Linker am Harz kommen kann.

Bei der Verwendung von TCP Harzen (PepChem, Tübingen) wurde der Trityllinker

beispielsweise abgespalten und das Harz verfärbte sich rot bei Temperaturen oberhalb von

50 °C, so dass keine weiteren Aminosäuren an dieses Harz gekuppelt werden konnten. Die

Synthese des C-Terminus Vpr(76-96) wurde an 300 mg TentaGel S Trt-Ser(tBu)-Fmoc Harz

(Beladung 0.23 mmol/g, Rapp Polymere) mit HBTU als Kupplungsreagenz durchgeführt. Die

Abspaltung der temporären Fmoc-Gruppe erfolgte mit 20 % Piperidin in DMF, wobei für 210

Sekunden bei einer maximalen Temperatur von 50 °C Mikrowellen mit einer Leistung von 35

W eingestrahlt wurden. Nach der Kupplung von Aminosäure Asn-91 wurden für die

nachfolgenden Aminosäuren Doppelkupplungen durchgeführt, um die Effizienz der Synthese

zu erhöhen. Die Abspaltung des fertigen Peptids erfolgte mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2,

v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur. Nach dem Einengen der Abspaltlösung am

Rotationsverdampfer wurde das Rohprodukt durch die Zugaben von eiskaltem Et2O

ausgefällt, abgesaugt und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v)

lyophilisiert.



Die Reinigung von 140 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei 17 % B isokratisch für

5 min und dann mittels eines Gradienten von 17 % B auf 42 % B in 50 min (A: 2000 ml

MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Kromasil C18

Säule (250 x 40 mm, 10 µm) bei einer Flussrate von 50 ml/min und einer Wellenlänge von

λ = 220 nm.

- 49 -


62.5 mg (25.79 µmol, 45 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)

Abbildung 32: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten C-Terminus

Vpr(76-96) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O +


(125 x 4.6 mm, 5 µm)


1211.97 Da (M2+)

Abbildung 33: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten C-Terminus Vpr(76-96)

Für die Ligation vom α-Thiolester des N-Terminus Vpr(1-75) mit dem C-Terminus Vpr(76-

96) wurden von beiden Fragmenten separat jeweils 7 mg in 0.5 ml einer 6 M

Guanidinhydrochlorid Lösung gelöst, wobei das Verhältnis vom α-Thiolester (0.76742 µmol)

zu C-Terminus (2.888 µmol) 1 zu 3.7 betrug. Um ein vollständiges Abreagieren des 75

Aminosäuren langen α-Thiolester zu gewährleisten, wurde bei der Ligation nicht mit

äquimolaren Mengen beider Fragmente gearbeitet, sondern ein großer Überschuss des

kürzeren und damit leichter zu synthetisierenden C-Terminus eingesetzt. Dadurch wurde das

Rt [min]

0 2 4 6 8 10 12 14

Rt = 9.632 minVpr(76-96)

A

Rt [min]

0 2 4 6 8 10 12 14

Rt = 9.642 minVpr(76-96)

B

499.0 1399.4 2299.8 3200.2 4100.6 5001.0Mass (m/z)

6587

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 2423.0, 6587]

2422.82

2445.171211.97 2485.27

660.05 1182.90 2540.14

- 50 -

Gleichgewicht der Ligationsreaktion weiter in Richtung des „full-length“ Peptid Vpr(1-96)

verschoben. Nachdem sich beide Peptide gelöst hatten, wurden die Lösungen vereint und eine

katalytische Menge von ca. 1 mg (3.49 µmol) von TCEP*HCl zugegeben, um die Oxidation

des Cystein und die Bildung von unerwünschten Dimeren zu verhindern [49]. Anschließend

wurde der pH-Wert der Reaktionslösung mit 0.1 M NaHCO3-Lösung auf 7 eingestellt, um

eine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit für die Ligation zu erreichen. Der

Reaktionsverlauf wurde dann mittels RP-HPLC kontrolliert (Abbildung 34 A). Trotz der

Zugabe von TCEP*HCl zeigte sich bereits nach 60 min Reaktionszeit eine Verdopplung der

Peaks von beiden Edukten, was zum einen auf die Oxidation des Cystein vom C-Terminus

Vpr(76-96) und die Bildung von unerwünschten Dimeren schließen lässt. Und zum anderen

wahrscheinlich der Zerfall (Hydrolyse) oder Oxidation des α-Thiolester von Vpr(1-75) erfolgt

ist. Nach 120 min Reaktionszeit konnte fast kein HPLC Signal vom α-Thiolester Vpr(1-75)

mehr detektiert werden, so dass der Reaktionsansatz mittels RP-HPLC gereinigt wurde. Die

Reinigung des Ligationsproduktes Vpr(1-96) erfolgte nach Zentrifugieren des

Reaktionsansatzes bei 61 % B isokratisch für 5 min und dann mittels eines Gradienten von 61

% B auf 91 % B in 50 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN

+ 5 ml TFA) mit einer Zorbax 300SB_C18 Säule (250 x 21.2 mm, 7 µm) bei einer Flussrate

von 15 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm.


0.4 mg (0.03516 µmol, 4.6 % bezogen auf die eingesetzte Menge an α-Thiolester Vpr(1-75))

Abbildung 34: Analytische HPLC Chromatogramme von der Reaktionskontrolle der NCL Reaktion (A) und

vom Peptid Vpr(1-96) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45min (A: 2000 ml MeCN + 500

ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule:


Rt [min]

0 10 20 30 40

start

60min

120min

Vpr(1-75)_Thiolester

Vpr(76-96)_C-Terminus

Vpr(1-96)A

Rt [min]

0 10 20 30 40

B Rt =34.082 minVpr(1-96)

- 51 -


5692.09 Da (M2+)

3790.40 Da (M3+)

Abbildung 35: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid Vpr(1-96)

In beiden Fällen, das heißt sowohl mittels der Methode der „step-by-step SPPS“ als auch mit

Hilfe der NCL konnte das „full-length“ Peptid Vpr(1-96) hergestellt werden. Die analytischen

Daten wie die Retentionszeit der analytischen RP-HPLC als auch die MALDI-MS Ergebnisse

stimmen überein.

499.0 2999.2 5499.4 7999.6 10499.8 13000.0Mass (m/z)

95.0

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 5692.1, 95]

5692.09

515.7411384.02501.97

5712.65624.213790.40978.91 5769.38

- 52 -

1 10 2 0 3 0 4 0

KQIVYWKQ-WLSLRNPILV-FL RVLKRW-RLFSKHEKT

MGQEQDTPWI-LSTGHISTQK-RQ QQTPKL-EHRNSTRLMG-HCQ

MNQVV-MP

DG KT 50 60 70 80 87

PR8

A

B PR8(1-41) PR8(42-87)M1 H41 C 42 E 87

5.2.3 Herstellung der Influenza A Virus PB1-F2 Peptide PR8, SF2, BF2(Y42 C) und

BF2(S47 C) von verschiedenen Stämmen

Das PB1-F2 Peptid des Influenza A Virus wurde als elftes Protein identifiziert, das durch die

8 RNA Gensegmente des Virus kodiert ist. Das PB1-F2 Peptid PR8(1-87) wurde als erstes

dieser neuen PB1-F2 Peptide von Chen et al. beim H1N1 Influenza A Virus vom Mount Sinai

(A/Puerto Rico/8/1934) gefunden [1]. Es konnte gezeigt werden, dass eine synthetische

Version des Peptids PR8(1-87) bei der Exposition von humanen Monozyten Apoptosis bei

den Zellen ausgelöst hat. Für weitere Untersuchungen der Eigenschaften von PR8(1-87)

wurde die Synthese in Anlehnung an die von Henklein et al. [90] beschriebene

Vorgehensweise durchgeführt. Für die Untersuchung der Eigenschaften von PB1-F2 Peptiden

von anderen Influenza A Virus Stämmen/Isolaten wurden die Peptide SF2(1-90) von der

„Spanischen Grippe“ und BF2(1-90) als ein Vertreter der „Vogelgrippe“ synthetisiert [130].

Die Darstellung des 87 Aminosäuren langen Peptids PR8(1-87) erfolgte hierbei wiederum

unter Anwendung der Ligation des α-Thiolester des N-Terminus PR8(1-41) mit dem C-

Terminus PR8(42-87).

Abbildung 36: Aminosäuresequenz der Peptids PR8(1-87); (A) Die unterstrichenen Aminosäuren markieren

die Positionen, an denen der Einsatz von Pseudoprolinen zur Syntheseoptimierung erfolgte. Für

Asp-23/Gly-24 wurde Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH eingesetzt. (B) Schematische

Darstellung der beiden Fragmente für die NCL Reaktion zum PR8(1-87)

Die Synthese des N-Terminus PR8(1-41) erfolgte mit HBTU als Kupplungsreagenz an einem

2-Chlortrityl Harz, welches mit der ersten Aminosäure Histidin bereits beladen war (350 mg,

Beladung 0.67 mmol/g, Iris Biotech). Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe erfolgte mit 20 %

Piperidin in DMF. Zur Vermeidung der Aspartimidbildung wurde Fmoc-Asp(OtBu)-

(Hmb)Gly-OH für die Positionen Asp-23/Gly-24 eingesetzt. Um die Effizienz der Synthese

- 53 -

zu erhöhen, wurden nach der Kupplung der Aminosäure Leu-38 Doppelkupplungen

durchgeführt. Für die Kupplung der letzten Aminosäure Met-1 bei der Synthese von PR8(1-

41) wurde Boc-geschütztes Methionin eingesetzt. Anschließend wurde das vollständig

geschützte Peptid PR8(1-41) mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1, v/v/v) für 2 h bei

Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz von n-Heptan am

Rotationsverdampfer entfernt. Durch Zugabe von eiskaltem Et2O wurde das Rohprodukt

ausgefällt und anschließend aus Wasser : MeCN (1:1, v/v) lyophilisiert.

Für die Darstellung des α-Thiolester vom N-Terminus wurden 690 mg von dem vollständig

geschützten Rohpeptid in 5 ml trocknem DCM zuerst mit 35.7 µl (3 eq, 0.228 mmol,

ρ = 0.806 g/cm3) DIC und anschließend mit 190.6 mg (15 eq, 1.14 mmol) para-

Acetamidothiophenol versetzt [59]. Die Reaktionsmischung wurde dann bei Raumtemperatur

über Nacht geschüttelt. Anschließend wurde die Lösung am Rotationsverdampfer eingeengt

und die verbliebenen Schutzgruppen wurden mit TFA : Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5

h bei Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung wurde am Rotationsverdampfer

eingeengt und das Rohprodukt durch die Zugabe von eiskaltem Et2O ausgefällt, abgesaugt

und anschließend aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.


355 mg (0.07278 mmol, 32 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 18 %

Die Reinigung von jeweils 40 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC erfolgte bei einem





93.0 mg (0.0191 mmol, 26 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)

- 54 -

Abbildung 37: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten α-Thiolester

PR8(1-41) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O +


(125 x 4.6 mm, 5 µm)

MALDI-MS: berechnet: 4878 Da gefunden: 4877.55 Da (M+)

Abbildung 38: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten α-Thiolester PR8(1-41)

Die Synthese des C-Terminus PR8(42-87) wurde mit HBTU als Kupplungsreagenz an einem

TentaGel S Trt-Glu(tBu)-Fmoc Harz durchgeführt (300 mg, Beladung 0.18 mmol/g, Rapp

Polymere). Die Abspaltung der Fmoc-Gruppe erfolgte mit 20 % Piperidin in DMF. Zur

Verhinderung der Seitenkettenaggregation der wachsenden Peptidkette am Harz, wurde

Fmoc-Lys(Boc)-Thr(ΨMe,Mepro)-OH für die Positionen Lys-44/Thr-45 sowie für Lys-73/Thr-

74 eingesetzt. Nach beendeter Synthese am Harz wurde das Peptid PR8(42-87) mit TFA :

Wasser : TIPS (95:3:2, v/v/v) für 3.5 h bei Raumtemperatur abgespalten. Die Abspaltlösung

wurde anschließend am Rotationsverdampfer eingeengt und das Rohpeptid durch Zugabe von

eiskaltem Et2O ausgefällt und aus 10 %iger Essigsäure : MeCN (3:1, v/v) lyophilisiert.

Rt [min]

0 5 10 15 20 25

A Rt = 17.110 minPR8(1-41)_Thiolester

Rt [min]

0 5 10 15 20 25

B Rt = 17.319 minPR8(1-41)_Thiolester

500.0 1800.2 3100.4 4400.6 5700.8 7001.0Mass (m/z)

0

5998.0

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 4877.1, 5998]

4877.55

4867.374845.144826.19518.29 2146.761169.28

- 55 -


206 mg (0.0357 mmol, 63 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 39 %






68.0 mg (0.0117 mmol, 33 % bezogen auf die gesamte Menge an erhaltenem Rohprodukt)

Abbildung 39: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm,

5 µm) (A) und vom gereinigten C-Terminus PR8(42-87); Säule: Zorbax C18 (120 x 4.6 mm, 5

µm) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml

TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm


Abbildung 40: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten C-Terminus PR8(42-87)

Rt [min]

0 10 20 30 40

A Rt = 27.654 minPR8(42-87)

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 25.652 minPR8(42-87)

B

499.0 1799.4 3099.8 4400.2 5700.6 7001.0Mass (m/z)

1.2E+4

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 5771.2, 12032]

5771.90

2826.02

5789.383095.111216.49 3665.93 5916.184608.59713.18 2900.70

- 56 -

Für die Ligation zum Gesamtpeptid PR8(1-87) wurden vom α-Thiolester des N-Terminus

PR8(1-41) 18.8 mg (3.854 µmol) und vom C-Terminus PR8(42-87) 22.2 mg (3.847 µmol)

jeweils separat in 0.5 ml einer 6 M Guanidinhydrochlorid Lösung gelöst. Das Verhältnis der

beiden Fragmente zueinander betrug dabei in etwa 1:1. Nachdem sich beide Peptide gelöst

hatten, wurden die Lösungen vereint und 3 mg (10.47 µmol) TCEP*HCl zugegeben, um die

Oxidation des Cystein und die Bildung von unerwünschten Dimeren zu verhindern [49].

Anschließend wurde der pH-Wert der Reaktionslösung mit 0.1 M NaHCO3-Lösung auf 7

eingestellt, um eine ausreichende Reaktionsgeschwindigkeit für die Ligation zu erreichen. Der

Reaktionsverlauf wurde dann mittels RP-HPLC kontrolliert (Abbildung 41 A). Nach 45 min

Reaktionszeit konnte fast kein HPLC Signal vom α-Thiolester PR8(1-41) mehr detektiert

werden, so dass der Reaktionsansatz mittels RP-HPLC gereinigt wurde. Die Reinigung des

Ligationsproduktes PR8(1-87) erfolgte nach Zentrifugieren des Reaktionsansatzes durch

präparative HPLC bei einem Gradienten von 40 % B auf 60 % B in 50 min (A: 2000 ml

MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA) mit einer Agilent Prep C-

18 Säule (250 x 30.0 mm, 10 µm) bei einer Flussrate von 15 ml/min und einer Wellenlänge

von λ = 220 nm.


14.9 mg (2.58 µmol, 67 % bezogen auf die eingesetzte Menge an α-Thiolester PR8(1-41))

Abbildung 41: Analytische HPLC Chromatogramme von der Reaktionskontrolle der NCL Reaktion (A) und

vom Peptid PR8(1-87) (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +



Rt [min]

0 10 20 30 40

start

45min

PR8(1-41)_Thiolester

PR8(1-87)

PR8(42-87)_C-Terminus

A

Rt [min]

0 10 20 30 40

B Rt = 24.979 minPR8 (1-87)

- 57 -


5260.36 Da (M2+)

Abbildung 42: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Peptid PR8(1-87)

Die Synthese der Peptide SF2(1-90), BF2(1-90; Y42 C) und BF2(1-90; S47 C)

einschließlich der entsprechenden Fragmente SF2(1-40), SF2(30-70), SF2(50-90) sowie

BF2(1-40), BF2(30-70) und BF2(50-90) konnte bereits im Journal of Peptide Science [130]

publiziert werden, so dass an dieser Stelle auf eine ausführliche Darstellung verzichtet wird.

2000.0 4000.2 6000.4 8000.6 10000.8 12001.0Mass (m/z)

2483.0

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 10488.4, 2483]

10488.37

10472.96

10455.53

10525.5010545.83

5260.362743.74

- 58 -

5.3 Ausgewählte Dcpm geschützte Aminosäuren

Wie bereits im Kapitel 3.4 erläutert wurde, erfolgte die Synthese der Dcpm geschützten

Aminosäuren Glycin, Alanin und Leucin über eine fünfstufige Synthese, deren einzelne

Zwischenstufen in den folgenden Unterkapiteln näher beschrieben sind. Zur Untersuchung

des sterischen Einflusses der Seitenkette der Aminosäuren auf die Acylierungsreaktion bei der

Einführung der Fmoc-Gruppe wurde als neue Verbindung Fmoc-(Dcpm)Leu-OH

synthetisiert. Die beiden anderen Verbindungen Fmoc-(Dcpm)Gly-OH und Fmoc-

(Dcpm)Ala-OH wurden in Anlehnung an die Protokolle von Carpino et al. [15] synthetisiert.

Auf der Basis der geschützten Aminosäure Fmoc-(Dcpm)Gly-OH wurde dann ein neuer

Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH hergestellt (Abbildung 43), der in der

Synthese von Peptiden mit dem Sequenzmotiv Asp-Gly zur Verhinderung der

Aspartimidbildung eingesetzt wurde.

Abbildung 43: Übersicht der drei synthetisierten Fmoc-(Dcpm)-Aminosäuren und des neuen Dipeptidbaustein

Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH ausgehend von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH

O

OHNFmoc

Fmoc-(Dcpm)Gly-OH

O

OHN

CH3

Fmoc

Fmoc-(Dcpm)Ala-OH Fmoc-(Dcpm)Leu-OH

O

OHNFmoc

CH3

H3C

Fmoc-Asp(OtBu)-OH

NO

OHO

HN

OO

CH3

H3C CH3

O

O

Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH

- 59 -

5.3.1 Herstellung des Dicyclopropylmethanimin-Hydrochlorid

In 1500 ml wasserfreiem Benzol wurden bei -5 °C 50 ml TiCl4 (0.5 eq,

0.454 mol, 85.8 g, ρ = 1.72 g/cm3) vorgelegt. Anschließend wurden

100 ml Dicyclopropylketon (0.908 mol, ρ = 0.977 g/cm3) so zugetropft,

dass die Temperatur nicht über 0 °C anstieg. Anschließend wurde in die

gelbe Reaktionslösung gasförmiges NH3 eingeleitet, welches zuvor zum Trocknen über KOH

Plättchen geleitet wurde. Die Einleitung erfolgte für mindestens 2 h, wobei sich die Lösung

langsam bräunlich verfärbte. Die Temperatur stieg während der NH3-Einleitung nicht über

20 °C an. Die Reaktionslösung wurde dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dabei

löste sich das am TiO2 adsorbierte Imin (gelbes Öl), und der ausgefallene Niederschlag

entfärbte sich etwas. Dann wurde das Benzol am Rotationsverdampfer entfernt und der

Rückstand wurde in 1300 ml Chloroform aufgenommen und anschließend die Lösung mit

einer G3- Fritte über Celite 545 filtriert, um das TiO2 abzutrennen. Das Chloroform wurde am

Rotationsverdampfer entfernt und das erhaltene gelbe Öl des Dicyclopropylimin wurde in

500 ml trockenem Toluol gelöst und die Reaktionslösung mit einem Eisbad auf 0 °C gekühlt.

Anschließend wurde Chlorwasserstoffgas durch die Lösung geleitet, welches aus

NaCl/HCl/H2SO4 generiert und über konz. H2SO4 getrocknet wurde. Die HCl-Einleitung

erfolgte für mindestens 2 h. Die Reaktionslösung wurde über Nacht gerührt und dabei

langsam auf Raumtemperatur erwärmt. Anschließend wurde das Toluol am

Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 1000 ml Chloroform aufgenommen. Die

Lösung wurde über eine G3-Fritte filtriert, um das entstandene NH4Cl abzutrennen. Das

Chloroform wurde dann am Rotationsverdampfer entfernt und der erhaltene Feststoff des

Hydrochlorids mit Et2O gewaschen.

Ausbeute: 24.4 g (0.1675 mol, 19 %), weißer Feststoff

mp = 127 – 128 °C (Lit. 125 – 127 °C [116,117])

1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 11.87 (br s, 2H, NH2), 1.95-1.87 (m, 2H, CH), 1.65-

1.50 (m, 4H, CH2), 1.44-1.28 (m, 4H, CH2).

13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 200.0 (C1), 15.8 (C2/C2’), 13.8 (C3/C3’+C4/C4’).

NH2 Cl

123

4

2' 3'

4'

- 60 -

EA (%) berechnet: C: 57.73 H: 8.31 N: 9.62 Cl: 24.34

gefunden: C: 57.03 H: 8.16 N: 9.60 Cl: 24.28

Die spektroskopischen Daten stimmen mit den von Carpino beschriebenen Daten überein

[15].

Abbildung 44: 1H NMR Spektrum von Dicyclopropylmethanimin–Hydrochlorid in CDCl3 bei 298 K

Abbildung 45: 13C NMR Spektrum (oben) und DEPT(unten) von Dicyclopropylmethanimin–Hydrochlorid in

CDCl3 bei 298 K

ppm (t1)0.05.010.015.0

2.004.054.04

1.94

ppm (t1)1.502.00

2.00

4.05

4.04

ppm (t1)050100150200250

200.

036

77.5

3677

.112

76.6

88

15.8

83

13.8

15

- 61 -

5.3.2 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der entsprechenden Benzylester

geschützten Dicyclopropyl-Ketiminaddukte

In 200 ml trockenem DCM wurden 5 g (0.03434 mol) des Ketiminhydrochlorids gelöst.

Anschließend wurden 1 eq (0.03434 mol) des Aminosäure-O-Benzylester * para-tosylat und

4.8 ml Et3N (1 eq, 0.03434 mol, 3.475 g, ρ = 0.977 g/cm3) zugegeben. Die Reaktionslösung

wurde dann bei Raumtemperatur 48 h gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Lösung

am Rotationsverdampfer eingeengt und mit 200 ml Et2O versetzt. Der ausgefallene weiße

Niederschlag wurde abfiltriert und nochmals mit Et2O gewaschen. Der Ether wurde dann am

Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt

wurde ohne weitere Reinigung für die nächsten Stufen eingesetzt.

Glycin-Dicyclopropylketimin-Benzylester

Ausbeute: 7.6 g (0.0295 mol, 86 %), gelbliches Öl

1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.34 (m, 5H, Harom.), 5.17 (s, 2H, CH2), 4.33 (s, 2H,

CH2), 1.68-1.59 (m, 1H, CH), 1.19-1.12 (m, 1H, CH), 0.99-0.94 (m, 2H, CH2), 0.87-0.81 (m,

4H, CH2), 0.65-0.59 (m, 2H, CH2).

13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 177.0/170.9 (C1/C3), 135.9 (C8), 128.4-128.1 (5C,

Carom.), 66.3/52.2 (C2/C7), 13.2/12.7 (C4/C4’), 7.6/6.1 (C5/C5’/C6/C6’).


[15].

NO1

2

3

4

5

6

4'

5'6'

78

9

10

11

O

- 62 -

Alanin-Dicyclopropylketimin-Benzylester

Ausbeute: 8.3 g (0.0306 mol, 90 %), gelbliches Öl

1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.35-7.28 (m, 5H, Harom.), 5.15 (s, 2H, CH2), 4.58-

4.52 (q, 1H, CH, J = 6.77 Hz), 1.78-1.69 (m, 1H, CH), 1.42-1.40 (d, 1H, J = 7.05 Hz), 1.16-

1.09 (m, 1H, CH), 0.97-0.93 (m, 2H, CH2), 0.89-0.74 (m, 4H, CH2), 0.64-0.54 (m, 2H, CH2).


Carom.), 66.1/57.0 (C2/C7), 19.0 (C12), 12.9/12.4 (C4/C4’), 7.8/7.3/6.15/6.13

(C5/C5’/C6/C6’).


[15].

Leucin-Dicyclopropylketimin-Benzylester

Ausbeute: 9.94 g (0.0317 mol, 93%), gelbliches Öl

1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.35-7.31 (m, 5H, Harom.), 5.26-5.09 (m, 2H, CH2),

4.56-4.48 (m, 1H, CH), 1.83-1.74 (m, 3H, CH und CH2), 1.65-1.52 (m, 1H,), 1.16-1.09 (m,

1H, CH), 0.97-0.92 (m, 5H, CH3 und CH2), 0.87-0.74 (m, 7H, CH3 und CH2), 0.63-0.57 (m,

2H, CH2).


Carom.), 66.0/60.2 (C2/C7), 42.7 (C12), 24.7/23.1/21.8 (C13/C14/C14’), 13.2/13.3 (C4/C4’),

7.7/7.5/6.1/6.0 (C5/C5’/C6/C6’).

NO1

23

4

5

6

4'

5'6'

78

9

10

11CH3

12

O

NO1

23

4

5

6

4'

5'6'

78

910

11

O

H3C

CH312 13

14

14'

- 63 -

5.3.3 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Benzylester geschützten (Dcpm)-

Aminosäuren aus den entsprechenden Ketiminen

Es wurden 3 g (11.06 mmol) des jeweiligen Ketimins der Aminosäure in 50 ml des

Lösungsmittelgemisches 10 % AcOH in Methanol (5 ml AcOH/45 ml MeOH) gelöst.

Anschließend wurden 765 mg (1.1 eq, 12.17 mmol) 95 %iges NaCNBH3 zugegeben und die

Reaktionslösung bei Raumtemperatur für 45 Minuten gerührt. Anschließend wurde das

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand in 60 ml Wasser

aufgenommen. Dann wurde die Reaktionsmischung durch Zugabe von NaHCO3 auf pH 7.5

gebracht, bis keine Gasentwicklung mehr zu beobachten war. Die wässrige Phase wurde mit

DCM (2 x je 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4

getrocknet und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde ohne weitere

Reinigung für die nächsten Stufen eingesetzt.

(Dcpm)Glycin-Benzylester

Ausbeute: 2.58 g (9.95 mmol, 90 %), gelbliches Öl

1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.34 (s, 5H, Harom.), 5.14 (s, 2H, CH2), 3.70-3.60 (m,

2H, CH2), 3.24 (br s, 1H, NH), 1.18-1.12 (m, 1H, CH), 0.90-0.78 (m, 2H, CH), 0.51-0.42 (m,

4H, CH2), 0.28-0.08 (m, 4H, CH2).

13C NMR (75 MHz, CDCl3, δ in ppm): 172.1 (C1), 135.5 (C8), 128.6-128.3 (5C, Carom.), 66.9

(C3), 66.6 (C7), 48.1 (C2), 15.6 (C4/C4’), 3.2/1.8 (C5/C5’/C6/C6’).


[15].

HN

O12

3

4

5

6

4'

5'6'

78

9

10

11

O

- 64 -

(Dcpm)Alanin-Benzylester


1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.31 (s, 5H, Harom.), 5.14-5.04 (m, 2H, CH2), 3.85-

3.78 (m, 1H, CH), 2.07 (br s, 1H, NH), 1.29 (d, 3H, CH3, J = 7.08 Hz), 0.88-0.70 (m, 3H,

CH), 0.51-0.30 (m, 4H, CH2), 0.15-0.06 (m, 4H, CH2).


(C7), 66.0 (C3), 53.8 (C2), 19.8 (C12), 17.3/15.2 (C4/C4’), 4.0/3.3/2.1/0.3 (C5/C5’/C6/C6’).


[15].

(Dcpm)Leucin-Benzylester


1H NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 7.33 (s, 5H, Harom.), 5.09 (s, 2H, CH2), 3.75 (t, 1H,

CH, J = 7.35 Hz), 1.96 (br s, 1H, NH), 1.80-1.71 (m, 1H, CH), 1.47.1.42 (t, 2H, CH2, J = 7.46

Hz), 1.05-0.81 (m, 8H, CH3/CH), 0.77-0.71 (m, 1H, CH), 0.52-0.30 (m, 4H, CH2), 0.14-0.01

(m, 4H, CH2).


(C7), 57.0 (C2), 43.2 (C12), 24.8 (C13), 22.6/22.2 (C14/C14’), 17.4/15.3 (C4/C4’),

4.0/3.5/2.1/0.1 (C5/C5’/C6/C6’).

HN

O12

3

4

5

6

4'

5'6'

78

910

11CH312

O

HN

O12

3

4

5

6

4'

5'6'

78

910

11

O

H3C

CH312 13

14

14'

- 65 -

5.3.4 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der freien (Dcpm)-Aminosäuren

In einem Schlenkkolben mit Septum wurden in 50 ml absolutem Ethanol 11.3 mmol der

entsprechenden (Dcpm)Benzylester-Aminosäure gelöst und 0.565 mmol (5 %) von 10 %igen

Palladium auf Aktivkohle als Katalysator dazugegeben. Mit Hilfe eines Luftballons mit

Kanüle wurde der Kolben zweimal mit Wasserstoff so gespült, dass beim zweiten

Spülvorgang das H2-Gas durch die Flüssigkeit geleitet wurde. Danach wurde die

Reaktionsmischung unter Wasserstoffatmosphäre für mindestens 3.5 h bei Raumtemperatur

gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Reaktionslösung filtriert und das Lösungsmittel

im Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde aus MeOH:Et2O umkristallisiert und mit Et2O

gewaschen.

(Dcpm)Glycin-OH

Ausbeute: 2.7 g (16 mmol, 60 %), weißer Feststoff

mp = 218 - 220 °C

1H NMR (300 MHz, D2O, δ in ppm): 3.80-3.72 (m, 2H, CH2), 3.64-3.57 (m, 1H, NH), 2.14-

2.07 (t, 1H, CH, J = 9.51 Hz), 1.10-1.00 (m, 2H, CH), 0.75-0.64 (m, 4H, CH2), 0.48-0.41 (m,

4H, CH2).

13C NMR (75 MHz, D2O, δ in ppm): 171.64 (C1), 67,3 (C3), 46.2 (C2), 11.5 (C4/C4’),

3.0/2.4 (C5/C5’/C6/C6’).


[15].

HN

O

OH12

3

4

5

6

4'

5'6'

- 66 -

Abbildung 46: 1H NMR Spektrum von (Dcpm)Gly-OH in D2O bei 298 K

Abbildung 47: 13C NMR Spektrum (oben) und DEPT (unten) von (Dcpm)Gly-OH in D2O bei 298 K

ppm (t1)0.05.010.015.0

2.06

1.00

2.04

4.144.23

ppm (t1)1.02.03.04.05.0

2.06

1.00

2.04

4.144.23

ppm (t1)050100150200250

171.

633

67.3

92

46.2

13

11.5

70

3.08

52.

427

- 67 -

(Dcpm)Alanin-OH

Ausbeute: 1.72 g (9.4 mmol, 58 %), weißer Feststoff

mp = 246-248 °C unter Zersetzung

1H NMR (300 MHz, D2O, δ in ppm): 4.08-4.01 (m, 1H, CH), 3.76-3.70 (m, 1H, NH), 2.00-

1.94 (t, 1H, CH, J = 9.63 Hz), 1.45 (d, 3H, CH3, J = 7.38 Hz), 1.07-0.93 (m, 2H, CH), 0.71-

0.56 (m, 4H, CH2), 0.42-0.29 (m, 4H, CH2).

13C NMR (75 MHz, D2O, δ in ppm): 175.1 (C1), 67.2 (C3), 54.9 (C2), 16.0 (C7), 12.7/11.1

(C4/C4’), 3.9/3.3/2.7/1.4 (C5/C5’/C6/C6’).


[15].

Abbildung 48: 1H NMR Spektrum von (Dcpm)Ala-OH in D2O bei 298 K

HN

OH12

3

4

5

6

4'

5'6'

CH37

O

ppm (t1)0.05.010.015.0

1.00

1.03

3.202.154.244.13

ppm (t1)0.501.001.502.002.503.003.504.00

1.00

1.03

3.20

2.15

4.24

4.13

- 68 -

Abbildung 49: 13C NMR Spektrum (oben) und DEPT (unten) von (Dcpm)Ala-OH in D2O bei 298 K

(Dcpm)Leucin-OH

Ausbeute: 1.64 g (7.3 mmol, 50 %), weißer Feststoff

mp = 212 - 213 °C

1H NMR (300 MHz, D2O, δ in ppm): 3.96 (t, 1H, CH, J = 7.35 Hz), 3.66-3.59 (m, 1H, NH),

1.97-1.91 (t, 1H, CH, J = 7.46 Hz), 1.77-1.61 (m, 3H, CH2/CH), 1.15-1.10 (m, 2H; CH), 0.99-

0.92 (m, 6H, CH3), 0.76-0.65 (m, 4H, CH2), ), 0.47-0.39 (m, 4H, CH2).

13C NMR (75 MHz, D2O, δ in ppm): 174.6 (C1), 67.9/58.6 (C2/C3), 39.9 (C7), 24.4 (C8),

21.5/21.4 (C9/C9’), 12.6/11.0 (C4/C4’), 4.0/3.8/2.6/1.4 (C5/C5’/C6/C6’).

HN

OH12

3

4

5

6

4'

5'6'

O

H3C

CH37 8

9

9'

ppm (t1)050100150200250

175.

147

67.2

90

54.9

76

16.0

8812

.721

11.1

42

3.93

83.

346

2.76

11.

463

- 69 -

Abbildung 50: 1H NMR Spektrum von (Dcpm)Leu-OH in D2O bei 298 K

Abbildung 51: 13C NMR Spektrum (oben) und DEPT (unten) von (Dcpm)Leu-OH in D2O bei 298 K

ppm (t1)0.05.010.015.0

1.00

1.033.24

2.316.494.084.03

ppm (t1)0.501.001.502.002.503.003.504.00

1.00

1.03

3.24

2.316.49

4.08

4.03

ppm (t1)050100150200250

174.

621

67.9

65

58.6

75

39.9

75

24.4

8121

.598

21.4

0912

.692

11.0

304.

031

3.89

22.

696

1.40

2

- 70 -

5.3.5 Allgemeine Vorschrift zur Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)-

Aminosäuren in Lösung

In 40 ml frisch destilliertem trockenem DCM wurden unter Schlenk-Bedingungen 13.1 mmol

der jeweiligen Dcpm-Aminosäure suspendiert. Dann wurden mit Hilfe einer Spritze 4.14 ml

(2.5 eq, 32.74 mmol, 3.56 g, ρ = 0.859 g/cm3) Trimethylsilylchlorid zugegeben und die

Reaktionsmischung ca. 4 h unter Rückfluss erwärmt. Dann wurde die Reaktionslösung mit

einem Eisbad auf 0 °C abgekühlt und anschließend unter Schlenk-Bedingungen erst 5.57 ml

(2.5 eq, 32.74 mmol, 4.23 g, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA und dann 4.07 g (1.2 eq, 15.72 mmol)

Fmoc-Cl gelöst in 10 ml DCM zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann noch 1 h bei

0 °C gerührt und anschließend langsam über Nacht auf Raumtemperatur erwärmt. Nach

beendeter Reaktion wurde das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der

Rückstand mit 100 ml Et2O versetzt und anschließend über Nacht im Kühlschrank stehen

gelassen. Es fiel das Hydrochlorid von DIPEA als ein weißer Feststoff aus, welcher über eine

G4-Fritte abgesaugt und gründlich mit Et2O gewaschen wurde. Die Et2O-Phase wurde

anschließend am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand, ein gelbliches Öl, mit

100 ml einer 10 %igen K2CO3-Lösung versetzt und dann mit ca. 150 ml 5 %iger

Zitronensäure angesäuert, wobei ein pH-Wert von 5 eingestellt wurde. Die milchig trübe

wässrige Phase wurde dreimal mit jeweils 120 ml Essigester extrahiert. Die vereinten

organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel am

Rotationsverdampfer entfernt. Das Rohprodukt wurde anschließend im Hochvakuum

getrocknet, wobei ein gelblicher Feststoff als Rohprodukt erhalten wurde. Eine grobe

Vorreinigung des Rohproduktes erfolgte durch Flash-Chromatographie an Silicalgel, wobei

erst mit DCM als Laufmittel alle Verunreinigungen von der Säule gespült wurden.

Anschließend erfolgte durch die Umstellung des Laufmittels auf MeOH das Eluieren des

Produkts von der Säule. Durch erneutes Lösen des Produktes in DCM und anschließendem

Filtrieren der Lösung wurde eventuell durch MeOH gelöstes Silicagel abgetrennt. Das DCM

wurde am Rotationsverdampfer entfernt und das vorgereinigte Produkt im Hochvakuum

getrocknet. Anschließend wurde das erhaltene Rohprodukt mittels RP-HPLC unter

Verwendung eines 0.025 M Ammoniumacetatpuffer ohne Zusatz von TFA gereinigt.

- 71 -

Fmoc-(Dcpm)Glycin-OH


3.8 g (9.72 mmol, 75 %), gelblicher Feststoff, Reinheit

laut RP-HPLC 60 %

Die Reinigung von ca. 150 mg Rohprodukt mittels RP-

HPLC wurde mit einem Gradienten von 25 % B für

5 min isokratisch dann von 25 % B auf 95 % B in 40 min (A: 0.025 M Ammoniumacetat in

H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule (250 x 40 mm, 15-

20 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm

durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert, um alle Reste

vom Ammoniumacetat zu entfernen.


59.7 mg (0.153 mmol, 40 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)

mp = 120-122 °C (weißer Feststoff)

Abbildung 51: Analytische HPLC Chromatogramme vom Rohprodukt (A) und vom gereinigten Produkt

Fmoc-(Dcpm)Gly-OH (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +




[15].

N

O OHO

O

H3

H1

H5

H4H2

6

7

8

9

1011

12

13

1415

16

17

13'14'

15'

16'

Ring1

Ring2

Rt [min]

0 10 20 30 40

A Rt = 29.350 minFmoc-(Dcpm)Gly-OH

Rt = 21.788 minFmoc-Gly-OH

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 29.212 minFmoc-(Dcpm)Gly-OHB

- 72 -

1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm) Atom trans cis Atom trans cis

1 0.13 0.33 10 4.57 4.41 2 -0.32 0.33 11 4.16 4.17 3 0.42 0.53 12 - - 4 -0.06 0.33 13 / 13’ 7.47 7.54 5 0.65 0.80 14 / 14’ 7.28 7.28 6 2.12 3.12 15 / 15’ 7.36 7.34 7 3.92 4.00 16 / 16’ 7.71 7.71 8 - - 17 / 17’ - - 9 - -

13C NMR (100 MHz, CDCl3, δ in ppm) Atom trans cis Atom trans cis

1 2.1 2.1 10 67.1 67.5 2 2.1 2.1 11 47.1 47.3 3 5.1 4.6 12 143.8 144.0 4 5.1 4.6 13 / 13’ 124.4 125.0 5 13.4 13.1 14 / 14’ 127.2 127.0 6 65.9 64.1 15 / 15’ 127.7 127.6 7 45.7 44.3 16 / 16’ 119.9 119.9 8 173.8 174.9 17 / 17’ 141.4 141.3 9 157.0 157.0

Tabelle 2: Zuordnung der 1H und 13C NMR Signale von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH

Abbildung 53: 1H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH in CDCl3

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

1.78

1.82

1.88

2.93

1.91

1.11

1.92

1.16

1.00

0.61

1.03

1.77

2.56

2.74

1.75

1.02

2.64

Current Data ParametersNAME fmoc-gly-dcpm-ct-cdcl3EXPNO 10PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20070925Time 14.45INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBO BB-PULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 32DS 2SWH 8223.685 HzFIDRES 0.125483 HzAQ 3.9846387 secRG 228.1DW 60.800 usecDE 6.00 usecTE 296.3 KD1 1.00000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 14.00 usecPL1 -1.00 dBSFO1 400.1324710 MHz

F2 - Processing parametersSI 32768SF 400.1300180 MHzWDW EMSSB 0LB 0.20 HzGB 0PC 1.00

Fmoc-Gly-Dcpm in CDCl3 bei 298 K 400 MHzcis / tans 35% / 65%cis Signale lassen sich leicht zuordnenfür cis und trans sind die 3-Ringe jeweils äquivalent, d.h.ein 3-Ring für cis und ein 3-Ring für trans im Spektrum

trans-H6

cis-H6

- 73 -

Fmoc-(Dcpm)Alanin-OH


4.1 g (10.11 mmol, 77 %), gelblicher Feststoff,

Reinheit laut HPLC 45 %

Die Reinigung von ca. 150 mg Rohprodukt mittels RP-

HPLC wurde mit einem Gradienten von 20 % B für

5 min isokratisch dann von 20 % B auf 100 % B in 40 min (A: 0.025 M Ammoniumacetat in

H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule (250 x 40 mm, 15-

20 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von λ = 220 nm

durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert, um alle Reste

vom Ammoniumacetat zu entfernen.


55.3 mg (0.136 mmol, 37 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)



Fmoc-(Dcpm)Ala-OH (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +




[15].

Rt [min]

0 10 20 30 40

A Rt = 30.762 minFmoc-(Dcpm)Ala-OH

Rt = 23.176 minFmoc-Ala-OH

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 30.627 minFmoc-(Dcpm)Ala-OH

B

N

O OHO

O

H3

H1

H5

H4H2

6

78

9

1011

12

13

1415

16

17

13'14'

15'

16'CH318

Ring1

Ring2

- 74 -


Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 1 0.16 / 0.10 0.33 / 0.31 10 4.65 / 4.59 4.65 / 4.59 2 -0.44 / -0.43 0.23 / 0.35 11 4.16 4.15 3 0.44 / 0.44 0.58 / 0.51 12 - - 4 -0.12 / -0.12 0.34 / 0.34 13 / 13’ 7.48 / 7.47 7.58 / 7.57 5 0.72 / 0.64 0.84 / 0.72 14 / 14’ 7.30 / 7.30 7.29 / 7.29 6 1.89 3.02 15 / 15’ 7.38 / 7.38 7.36 / 7.36 7 3.94 3.94 16 / 16’ 7.72 / 7.72 7.72 / 7.72 8 - - 17 / 17’ - - 9 - - 18 1.52 1.21

13C NMR (150 MHz, CDCl3, δ in ppm) Atom trans cis Atom trans cis

Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 1 2.2 / 2.0 2.1 / 2.1 10 66.7 66.7 2 2.2 / 2.0 2.0 / 2.1 11 46.9 47.2 3 5.4 / 5.3 4.3 / 4.3 12 143.4 / 143.4 143.4 / 143.4 4 5.4 / 5.3 4.3 / 4.3 13 / 13’ 124.3 / 124.3 124.7 / 124.8 5 13.6 / 13.4 13.2 / 13.2 14 / 14’ 127.3 / 127.1 127.0 / 127.1 6 67.2 65.0 15 / 15’ 127.8 / 127.7 127.4 / 127.5 7 53.9 51.1 16 / 16’ 119.9 / 119.8 119.7 / 119.7 8 174.4 175.5 17 / 17’ 141.2 / 141.2 141.1 / 141.1 9 156.3 155.9 18 15.6 16.2

Tabelle 3: Zuordnung der 1H und 13C NMR Signale von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH

Abbildung 55: 1H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH in CDCl3

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

1.93

1.92

2.02

0.39

1.48

2.34

1.30

1.28

0.37

1.09

3.00

1.04

0.36

1.31

1.31

1.54

0.97

2.50

2.53

1.90

0.64

2.46

Current Data ParametersNAME we_rralaEXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20070928Time 15.47INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBI 1H/PULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 32DS 2SWH 7183.908 HzFIDRES 0.109618 HzAQ 4.5614252 secRG 362DW 69.600 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KD1 1.00000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 14.50 usecPL1 2.00 dBSFO1 600.0324212 MHz


Fmoc-Ala-Dcpm-OH in CDCl3 bei 298 K 600 MHzcis / trans 25 % / 75 %cis-Signale lassen sich zuordnenbei cis und trans sind die 3-Ringe jeweils nicht äquivalent

trans-H6

cis-H6

- 75 -

Fmoc-(Dcpm)Leucin-OH


5.1 g (11.4 mmol, 87 %), gelblicher Feststoff,

Reinheit laut HPLC 16 %

Die Reinigung von ca. 150 mg Rohprodukt

mittels RP-HPLC wurde mit einem Gradienten

von 25 % B für 10 min isokratisch dann von 25 % B auf 95 % B in 35 min (A: 0.025 M

Ammoniumacetat in H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule

(250 x 40 mm, 15-20 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von

λ = 220 nm durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert,

um alle Reste vom Ammoniumacetat zu entfernen.


24 mg (0.054 mmol, 16 % bezogen auf die zur Reinigung eingesetzte Menge Rohprodukt)



Fmoc-(Dcpm)Leu-OH (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN +



Rt [min]

0 10 20 30 40

A Rt = 35.170 minFmoc-(Dcpm)Leu-OH

Rt = 28.382 minFmoc-Leu-OH

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 35.019 minFmoc-(Dcpm)Leu-OH

B

N

O OHO

O

H3

H1

H5

H4H2

6

78

9

1011

12

13

1415

16

17

13'14'

15'

16'

18CH3

CH3

1920

Ring1

Ring2

- 76 -


Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 1 0.15 / 0.04 n.z. 11 4.16 n.z. 2 -0.63 / -0.50 n.z. 12 - - 3 0.44 / 0.44 n.z. 13 / 13’ 7.49 / 7.46 7.57 / 7.57 4 -0.19 / -0.19 n.z. 14 / 14’ 7.32 / 7.31 n.z. 5 0.75 / 0.63 n.z. 15 / 15’ 7.40 / 7.39 n.z. 6 1.72 / 1.72 2.97 16 / 16’ 7.73 / 7.72 n.z. 7 3.86 3.78 17 / 17’ - - 8 - - 18 2.16 / 1.49 n.z. 9 - - 19 1.58 n.z.

10 4.74 / 4.64 n.z. 20 0.89 / 0.88 n.z. 13C NMR (150 MHz, CDCl3, δ in ppm)

Atom trans cis Atom trans cis Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2

1 2.3 4.1 11 47.1 47.4 2 2.1 4.1 12 143.2 / 143.2 n.z. 3 5.5 5.9 13 / 13’ 124.2 / 124.1 124.8 / 124.7 4 5.4 5.9 14 / 14’ 127.2 / 127.1 126.9 / 126.9 5 13.8 / 13.4 13.5 / n.z. 15 / 15’ 127.8 / 127.7 127.4 / 127.4 6 68.0 65.5 16 / 16’ 119.8 / 119.8 n.z. 7 58.0 54.6 17 / 17’ 141.3 / 141.3 n.z. 8 174.0 n.z. 18 39.1 41.0 9 157.0 156.5 19 25.0 25.6

10 66.8 66.6 20 21.9 / 23.1 22.0 / n.z. Tabelle 4: Zuordnung der 1H und 13C NMR Signale von Fmoc-(Dcpm)Leu-OH

Abbildung 57: 1H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Leu-OH in CDCl3

8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm

1.00

1.01

2.00

1.01

1.05

2.02

1.08

1.54

5.91

1.39

1.63

1.15

0.99

1.00

1.03

1.08

1.03

2.10

2.08

1.97

2.03

Current Data ParametersNAME we_rrleuEXPNO 1PROCNO 1

F2 - Acquisition ParametersDate_ 20070926Time 12.44INSTRUM spectPROBHD 5 mm PABBI 1H/PULPROG zg30TD 65536SOLVENT CDCl3NS 32DS 2SWH 7183.908 HzFIDRES 0.109618 HzAQ 4.5614252 secRG 362DW 69.600 usecDE 6.00 usecTE 298.0 KD1 1.00000000 secTD0 1

======== CHANNEL f1 ========NUC1 1HP1 14.50 usecPL1 2.00 dBSFO1 600.0324212 MHz


Fmoc-Leu-Dcpm-OH in CDCl3 bei 298K 600 MHzcis/trans 5% zu 95 %cis-Signale dementsprechend kaum zuordbarbeide 3-Ringe sind magnetisch nicht äquivalent

cis-H6

trans-H6

- 77 -

5.3.6 Alternativer Syntheseweg für die Herstellung der Fmoc geschützten (Dcpm)-

Aminosäuren an der festen Phase

Bei der Synthese in Lösung der Fmoc geschützten (Dcpm)-Aminosäuren konnte zwar die

gewünschte Verbindung erhalten werden, aber bei allen drei Beispielen trat als Nebenreaktion

die Eliminierung der bereits vorhandenen Dcpm-Gruppe auf. Dabei konnte ein

Zusammenhang zwischen dem zunehmenden sterischen Anspruch der Seitenkette der

jeweiligen Aminosäure und dem Anteil der gewünschten Fmoc-(Dcpm)-Aminosäure im

Rohprodukt festgestellt werden. Da der Verlust der bereits integrierten Dcpm Schutzgruppe

ein nicht hinnehmbarer Nachteil der beschriebenen Strategie für die Synthese in Lösung mit

vorheriger Silylierung am Stickstoffatom mit TMSCl war, wurde nach einem alternativen

Syntheseweg für die Darstellung der Fmoc-(Dcpm)-Aminosäuren an der festen Phase gesucht.

Dabei wurde die freie Dcpm geschützte Aminosäure (0.3 mmol) an 0.5 g eines 2-

Chlortritylchlorid Harzes (CBL Patras, Griechenland) verankert. Die Einführung der Fmoc

Schutzgruppe erfolgte dann mit Hilfe von Fmoc-OAt (2 eq, 0.6 mmol) [131] und der Zugabe

von DIPEA (2 eq, 0.6 mmol, ρ = 0.76 g/cm3). Die Reaktion wurde in 5 ml eines

Lösungsmittelgemischs von DMF : DCM (3:2, v/v) durchgeführt, da sich die freie (Dcpm)-

Aminosäure nicht in reinem DCM gelöst hat. Durch die Verwendung von DCM zeigte das

verwendete 2-Chlortrityl Harz ein besseres Quelleverhalten, weshalb dieses

Lösungsmittelgemisch verwendet wurde. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei

Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Harz gründlich mit DMF und DCM

gewaschen und das Rohprodukt geschützt mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1, v/v/v) für 2 h bei

Raumtemperatur vom Harz abgespalten. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz von n-Heptan

am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt anschließend aus Wasser : MeCN (1:1,

v/v) lyophilisiert.

Fmoc-(Dcpm)Glycin-OH


62.7 mg (0.160 mmol, 54 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 92 %

- 78 -

MALDI-MS: berechnet: 391.46 Da gefunden: 414.42 Da (+23, Natriumaddukt)

325.42, 379.35 Da (von Matrix CHCA)

Abbildung 58: Analytisches HPLC Chromatogramm (A): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A:

2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min;

λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm) und MALDI-MS (B) vom

Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)Gly-OH mit Fmoc-OAt an der festen Phase

Fmoc-(Dcpm)Alanin-OH


52.4 mg (0.1292 mmol, 43 %), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 83 %


325.51, 379.45 Da (von Matrix CHCA)

656.61 (Verunreinigung)




Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)-Ala-OH mit Fmoc-OAt an der festen Phase

Rt [min]0 10 20 30 40

A Rt = 28.566 minFmoc-(Dcpm)Gly-OH

299.0 399.4 499.8 600.2 700.6 801.0Mass (m/z)

3.5E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 379.3, 34848]

379.35325.42

414.42

326.43 415.33471.46

381.33336.37 429.48

B

Rt [min]0 10 20 30 40

A Rt = 30.045 minFmoc-(Dcpm)Ala-OH

Rt = 22.393 minFmoc-Ala-OH

299.0 399.2 499.4 599.6 699.8 800.0Mass (m/z)

3.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 428.6, 36417]

428.55325.51

379.45429.56 656.61

326.53 445.46657.61334.47 380.44 499.68430.56

B

- 79 -

Bei der analogen Reaktionsführung mit Fmoc-OSu als Reagenz zu Einführung der Fmoc

Schutzgruppe konnte am Beispiel für (Dcpm)-Alanin keine Umsetzung zum gewünschten

Produkt Fmoc-(Dcpm)Ala-OH festgestellt werden. Es wurden hierbei wiederum 0.5 g des 2-

Chlortritylchlorid Harzes (CBL Patras, Griecheland) eingesetzt und daran die freie Dcpm

geschützte Aminosäure (Dcpm)Ala-OH in DMF als Lösungsmittel verankert. Nach dem

Waschen des Harzes wurden in DMF : DCM (3:2, v/v) als Lösungmittelgemsich Fmoc-OSu

(2 eq, 0.6 mmol) und DIPEA (2eq, 0.6 mmol, ρ = 0.76 g/cm3) zur Reaktionsmischung

dazugegeben und über Nacht geschüttelt. Anschließend wurde das Harz gründlich mit DMF

und DCM gewaschen und das Rohprodukt geschützt mit DCM : TFE : AcOH (3:1:1, v/v/v)

für 2 h bei Raumtemperatur vom Harz abgespalten. Die Abspaltlösung wurde unter Zusatz

von n-Heptan am Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt anschließend aus Wasser

: MeCN (1:1, v/v) lyophilisiert.

Im Rohprodukt konnte die gewünschte geschützte Aminosäure Fmoc-(Dcpm)Ala-OH nicht

nachgewiesen werden (Abbildung 60 A). Lediglich das Molekül ohne die Dcpm-Gruppe war

mittels analytischer RP-HPLC und durch den Vergleich mit einer Referenzverbindung

(sauberes kommerzielles Fmoc-Ala-OH wurde analysiert) zu detektieren gewesen. Die

Verbindung Fmoc-Ala-OH wurde mittels Referenzverbindung durch analytische RP-HPLC

identifiziert, weil auf Grund der geringen Masse von 311.33 Da mittels MALDI-MS und

CHCA als Matrix die Verbindung massenspektroskopisch auf diesem Weg nicht detektiert

werden konnte. Obwohl in diesem Versuch kein HCl während der Reaktion generiert wird,

konnte die Abspaltung der Dcpm-Gruppe nicht verhindert werden. Das Reaganz Fmoc-OSu

scheint außerdem nicht reaktiv genug zu sein, um die Fmoc-Gruppe an die sekundäre

Aminfuktion kovalent zu binden. Die Aminfuktion von Alanin ist durch die Dcpm-Gruppe

und die Methylgruppe der Seitenkettenfuktion sterisch zu sehr abgeschirmt.

- 80 -

MALDI-MS: berechnet: 405.49 Da gefunden: 325.93, 379.87 Da (von Matrix CHCA)

445.90, 657.23, 672.56 (Verunreinigung)




Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)Ala-OH mit Fmoc-OSu an der festen Phase

Fmoc-(Dcpm)Leucin-OH


63 mg (0.1409 mmol, 47%), weißer Feststoff, Reinheit laut RP-HPLC 23%

MALDI-MS: berechnet: 447.57 Da gefunden: 495.58 Da (+46, 2 Natrium)

533.69 Da (+85, 2 Natrium + 1 Kalium)

579.66 Da (+131, 4 Natrium + 1 Kalium)

379.39 Da (von Matrix CHCA)




Rohprodukt bei der Umsetzung von (Dcpm)Leu-OH mit Fmoc-OAt an der festen Phase

Rt [min]0 10 20 30 40

ARt = 27.582 minFmoc-Leu-OH

Rt = 33.803 minFmoc-(Dcpm)Leu-OH

350.0 440.2 530.4 620.6 710.8 801.0Mass (m/z)

7906.1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1=>BC[BP = 533.7, 7906]

533.69

579.66495.58

534.68580.67379.39 496.60

B

Rt [min]0 10 20 30 40

Rt = 22.392 minFmoc-Ala-OHA

299.0 399.2 499.4 599.6 699.8 800.0Mass (m/z)

2437.0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 212.9, 5315]

325.93

379.87

657.23327.04

445.90323.62 672.56

B

- 81 -

5.3.7 Herstellung von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH an der festen Phase

Es wurden 500 mg 2-Chlortritylchlorid Harz

(CBL Patras, Griechenland, mesh 100-200) mit 5

ml DMF versetzt. Dann wurden 362.3 µl (2 eq,

2.13 mmol, 275.3 mg, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA

und anschließend 180 mg (1.065 mmol)

(Dcpm)Gly-OH dazugegeben. Die

Reaktionsmischung wurde dann bei

Raumtemperatur für 1.5 h geschüttelt. Nach der

Reaktion wurde das Harz gründlich mit DCM

und DMF gewaschen und anschließend mit 10 ml einer Lösung von MeOH : DIPEA (9:1) für

15 min gecappt. Nach erneutem Waschen des Harzes mit DCM und DMF wurde ein Kaiser-

Test durchgeführt [132], welcher als positives Ergebnis eine schwache Blaufärbung lieferte

und somit auf das Vorhandensein von freien Aminogruppen schließen ließ. Auch wenn beim

klassischen Kaisertest nur primäre Aminofunktionen detektiert werden [132], konnte durch

den Vergleich mit einer Blindprobe eine Farbänderung beim Harz mit dem verankerten

(Dcpm)Gly-OH festgestellt werden. Die am Harz verankerte Aminosäure (Dcpm)Gly-OH

wurde im nächsten Schritt mit der Fmoc geschützten Aminosäure Fmoc-Asp(OtBu)-OH

gekoppelt. Dazu wurde das Harz mit 10 ml DMF versetzt und dann 1.23 g (3 eq, 3 mmol)

Fmoc-Asp(OtBu)-OH dann 1.1 g (3 eq, 3 mmol) HATU und anschließend 1.02 ml (6 eq, 6

mmol, 775.5 mg, ρ = 0.76 g/cm3) DIPEA dazugegeben. Die Reaktionsmischung wurde dann

bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Um das vollständig geschützte Produkt vom

Harz abzuspalten, wurde das Harz mit einer Lösung von DCM : TFE : AcOH (3:1:1, 6 ml : 2

ml : 2 ml) versetzt und für 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wurde anschließend

über eine G3 Fritte abgesaugt und nochmals mit DCM gewaschen. Die erhaltene Lösung

wurde anschließend am Rotationsverdampfer unter Zusatz von n-Heptan eingeengt. Das

Rohprodukt wurde dann durch Zugabe von eiskaltem Et2O ausgefällt und anschließend aus

Wasser : Acetonitril (1:1) lyophilisiert.

Ausbeute:

Rohprodukt 93.5 mg (0.1664 mmol, 16 %), gelblicher Feststoff, Reinheit laut HPLC 72 %

O

HN

O

O

N

O

OCH3

CH3

CH3

OH

O

H5

H3

H1

H2

H4

Ring1

Ring2

67 8

9

10

1112 13 14

15

16

1718

19

20

2122

2324

19'

20'

21'22'

23'24'

- 82 -

Die Reinigung von 30 mg Rohprodukt mittels RP-HPLC wurde bei 20 % B für 5 min

isokratisch dann mittels eines Gradienten von 20 % B auf 90 % B in 45 min (A: 0.025 M

Ammoniumacetat in H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN) mit einer VYDAC C18 Säule

(250 x 40 mm, 15-20 µm) bei einer Flussrate von 20 ml/min und einer Wellenlänge von λ =

220 nm durchgeführt. Das gereinigte Produkt wurde anschließend zweimal lyophilisiert, um

alle Reste vom Ammoniumacetat zu entfernen.



weißer Feststoff

HR-MS: berechnet: 562.27 g/mol gefunden für Negativ-Mode: 561.26 g/mol gefunden für Positiv-Mode: 563.27 g/mol

- 83 -


Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH (B): Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml

MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA; B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min;

λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x 4.6 mm, 5 µm)

Abbildung 63: 1H NMR Spektrum von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH in CD3CN bei 298 K

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

1.92

4.33

4.28

2.16

3.16

1.14

3.18

1.09

19.9

0

1.97

2.05

1.05

0.89

2.38

0.92

2.12

5.25

0.93

1.21

0.83

1.00

4.29

4.18

4.24

4.06

Fmoc-Asp(OtBu)-Gly(Dcpm)-OH 7mg CH3CN 298K

trans-H6

cis-H6

Rt [min]

0 10 20 30 40

Rt = 31,730 minB

Rt [min]

0 10 20 30 40

A Rt = 32.213 min

- 84 -

1H NMR (600 MHz, CD3CN, δ in ppm) Atom trans cis Atom trans cis

Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 1 0.42 / 0.26 0.26 13 - - 2 0.38 / 0.23 0.14 14 1.38 1.38 3 0.58 / 0.52 0.49 15 6.27 6.15 4 0.44 /0.35 0.34 Fmoc-Bereich für cis / trans gleich 5 1.01 / 0.95 0.89 16 - - 6 2.96 3.34 17 4.33 / 4.28 4.33 / 4.28

Gly 18 4.20 4.20 7 4.03 / 4.01 4.36 / 4.13 19 - - 8 - - 20 7.63 7.63

Asp(OtBu) 21 7.31 7.31 9 - - 22 7.40 7.40

10 4.79 4.72 23 7.81 7.81 11 2.65 / 2.40 2.61 / 2.44 24 - - 12 - -

13C NMR (150 MHz, CD3CN, δ in ppm) Atom trans cis Atom trans cis

Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 Ring1 / Ring2 1 2.6 2.5 13 81.4 81.4 2 2.6 2.5 14 27.9 27.9 3 4.6 5.3 15 - - 4 4.6 5.3 Fmoc-Bereich für cis / trans gleich 5 14.2 / 14.0 13.4 16 156.3 156.3 6 65.4 63.3 17 67.5 67.5

Gly 18 47.8 47.8 7 45.7 46.6 19 / 19’ 144.8 144.8 8 171.4 172.9 20 / 20’ 126.0 126.0

Asp(OtBu) 21 / 21’ 128.0 128.0 9 171.2 172.1 22 / 22’ 128.6 128.6

10 48.9 49.8 23 / 23’ 120.8 120.8 11 39.5 39.6 24 / 24’ 141.9 141.9 12 170.5 170.6

Tabelle 5: Zuordnung der 1H und 13C NMR Signale von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH

- 85 -


602.04 Da (+39, Kaliumaddukt)

Abbildung 64: MALDI-MS Spektrum vom gereinigten Produkt Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH

Abbildung 65: UPLC Chromatogramm vom gereinigten Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH.

399.0 479.4 559.8 640.2 720.6 801.0Mass (m/z)

1.2E+4

0102030405060708090

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 601.7, 11725]

602.04

586.10

530.29441.79624.21443.73 659.26401.78 568.47

- 86 -

Abbildung 66: ESI-MS Spektrum im Negative-Mode von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH.

- 87 -

Abbildung 67: ESI-MS Spektrum im Positive-Mode von Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH.

- 88 -

6 Ergebnisse und Diskussion

6.1 Anwendungsmöglichkeiten der NCL zur Synthese der viralen Regulatorproteine

6.1.1 Die Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV)

Da in beiden Sequenzen der Gag Peptide p6 (HIV) und p9 (EIAV) kein Cystein vorhanden

ist, war es nicht möglich, die klassische Ligationsmethode der NCL anzuwenden, ohne

entweder eine Aminosäure auszutauschen bzw. ein zusätzliches Cystein zu integrieren. Beide

Peptide wurden aus diesem Grund mittels der „step-by-step“ Methode synthetisiert.

Mit dem erhaltenen „full-length“ Peptid p9(1-51) wurden von Dr. Alok Sharma und Dr.

Victor Wray weitergehende NMR Untersuchungen zur Strukturaufklärung des Peptids in

Lösung im Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung Braunschweig durchgeführt [133].

Diese Ergebnisse wurden mit den bereits aus der Literatur bekannten Strukturdaten vom

Peptid p6(1-52) [128] verglichen.

6.1.2 Das HIV Peptid Vpr und die verschiedenen Influenza A Virus PB1-F2 Peptide

PR8, SF2 und BF2

Mit Hilfe der NCL Methode ist es möglich, sehr viel längere Peptide einfacher zu

synthetisieren, als es mit der klassischen SPPS Methode der Kettenverlängerung der Fall ist.

Ein sehr gutes Beispiel für diesen Fall stellt das HIV Peptid Vpr(1-96) dar. Dieses Peptid

wurde auf beiden Synthesewegen, der klassischen stetigen Verlängerung der Peptidkette um

die jeweils folgende Aminosäure und mit Hilfe der Ligationsmethode der NCL, hergestellt.

Dadurch ist der Vergleich beider Synthesestrategien am gleichen Peptid möglich. Das für die

Ligation benötigte Cystein kommt in der natürlichen Sequenz von Vpr(1-96) an Position 76

vor. Der ebenfalls benötigte α-Thiolester des N-terminalen Fragments weist damit eine Länge

von 75 Aminosäuren auf. Mit dieser Kettenlänge stößt man an die Grenzen der

Ligationsmethode. Wie erwartet, stellte in diesem Fall die Synthese des α-Thiolester Vpr(1-

75) und dessen anschließende Reinigung mittels RP-HPLC das größte Problem dar. Die

Produktausbeute für dieses Fragment nach der Reinigung fiel mit nur 8 % sehr gering aus. Bei

der anschließenden Ligation zum „full-length“ Vpr(1-96) konnten jedoch 0.4 mg des

gewünschten Peptids erhalten werden. Trotz dieser geringen Menge an Material war durch die

Tatsache, dass für die Ligation bereits gereinigte Fragmente eingesetzt wurden, die

- 89 -

anschließende Reinigung des „full-length“ Peptids Vpr(1-96) mittels RP-HPLC einfacher im

Vergleich zur Reinigung des erhalten Rohpeptids aus der klassischen „step-by-step“ Synthese.

Die Synthese der beiden Influenza A Viruspeptide PR8(1-87) und SF2(1-90) erfolgte

ebenfalls unter Anwendung der „nativen chemischen Ligation“ (NCL). In beiden Peptiden

kommt ein Cystein in der Aminosäuresequenz an Position 42 vor. Durch die einfachere

Synthese der entsprechenden Fragmente für den N- und C-Terminus und die anschließende

Ligation dieser Fragmente konnte von beiden Peptiden ausreichend Material für weitere

biochemische Experimente und zur Strukturaufklärung mittels NMR Untersuchungen erhalten

werden. Bei dem Peptid BF2(1-90) kommt in der natürlichen Sequenz kein Cystein vor, so

dass das Wildtyp Peptid auf diesem Weg nur schwer erhalten werden kann. Auf Grund der

Tatsache, dass es sich beim BF2(1-90) ebenfalls um ein aus der Gruppe der Influenza A Virus

PB1-F2 Peptide stammendes Peptid handelt und bei ca. 30 % aller natürlich vorkommenden

Sequenzen dieser Peptide an Position 42 ein Cystein vorkommt, wie es auch bei PR8(1-87)

und SF2(1-90) der Fall ist, wurde die Mutation BF2(1-90, Y42 C) vorgenommen, um das

„full-length“ Peptid BF2 zu erhalten. Um den möglichen Einfluss der in der ersten Mutante

BF2(1-90, Y42 C) ausgetauschten Aminosäure Tyrosin auf das biologische Verhalten des

Peptids BF2 untersuchen zu können, wurde eine zweite Mutante BF2(1-90, S47 C)

synthetisiert. Hierbei erfolgte der Austausch der Aminosäure Serin gegen Cystein, um eine

möglichst geringe Änderung des sterischen Anspruchs der Seitenkette an dieser Position des

Peptids BF2 auszuüben. Beide Aminosäuren unterscheiden sich lediglich durch ihre

funktionelle Gruppe in der Seitenkette (Hydroxylgruppe beim Serin und Thiolgruppe beim

Cystein), so dass der sterische Einfluss durch das etwas größere Schwefelatom bei diesem

Aminosäureaustausch relativ klein sein sollte.

Es lässt sich abschließend festhalten, dass bei längeren Peptiden, die in Ihrer

Aminosäuresequenz ein Cystein an einer geeigneten Position enthalten, die Methode der

„nativen chemischen Ligation“ (NCL) eine wesentliche Vereinfachung der Synthese darstellt.

- 90 -

6.2 Strukturuntersuchungen mittels 1H NMR vom Peptid SF2

Zur Aufklärung der Struktur des PB1-F2 Peptids vom Influenza A Virus H1N1-Isolat der

„Spanischen Grippe“ von 1918, genannt SF2, wurden ein- und zweidimensionale (NOESY,

TOCSY) 1H NMR Spektren von den Fragmenten SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90)

aufgenommen und ausgewertet. Um die Strukturbestimmung mittels NMR Untersuchungen

zu vereinfachen, wurden die Spektren von diesen drei Fragmenten aufgenommen und

ausgewertet. Die Spektren von Peptiden mit einer Länge von jeweils 40 Aminosäuren sind

sehr viel leichter zu interpretieren, als es für NMR Spektren vom „full-length“ Peptid SF2(1-

90) der Fall wäre. Da die Peptide SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90) als überlappende

Fragmente synthetisiert wurden, kann angenommen werden, dass durch den Mittelwert der

Signale in den überlappenden Bereichen SF2(30-40) und SF2(50-70) die chemischen

Verschiebungen des „full-length“ Peptids SF2(1-90) wiedergegeben werden. Die 1H NMR

Messungen für die Peptide SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90) wurden in 50 %

wässrigem TFE-d2 als Lösungsmittel gemessen. TFE ist zum einen dafür bekannt, dass es die

hydrophoben Bedingungen, wie sie für Membranpeptide in physiologischer Umgebung

existieren, sehr gut imitiert. Andererseits wird TFE auch dafür verwendet, um die

hydrophoben Bedingungen zu simulieren, die durch die Wechselwirkung mit hydrophoben

Peptiden von anderen Proteinen auftreten. Durch TFE werden zusätzlich die intermolekularen

Wechselwirkungen der Peptide untereinander wie z.B. Oligomerisierung unterdrückt [134].

Für eine detaillierte Analyse der zweidimensionalen 1H NMR Spektren ist es notwendig, dass

die Spinsysteme aller Aminosäuren von den drei Fragmenten SF2(1-40), SF2(30-70) und

SF2(50-90) zugeordnet werden (siehe Tabelle 6, 7 und 8). Aus der chemischen Verschiebung

der α-Protonen lassen sich qualitative Informationen, wie die Art und die Position, von

eventuell vorhandenen sekundären Strukturmerkmalen des jeweiligen Peptids in der

gemessenen Lösung/Probe ableiten. Eine Verlagerung der chemischen Verschiebung der α-

Protonen zu höherem Feld (upfield shift) relativ zu den Werten für eine ungeordnete

Knäuelstruktur (random coil) [121] bei vier benachbarten Aminosäuren ist ein Anzeichen für

ein lokales α-helixartiges Strukturelement. Hingegen ist die Verlagerung zu tieferem Feld

(downfield shift) bei drei benachbarten Aminosäuren ein Hinweis auf ein lokales β-Faltblatt

[135]. Die graphischen Darstellungen der Differenz der chemischen Verschiebung der α-

Protonen für die drei Fragmente SF2(1-40), SF2(30-70) und SF2(50-90) sind in Abbildung 68

bis 70 wiedergegeben. Für die Darstellung des „full-length“ Peptids mix_SF2(1-90) wurden

die Werte von den drei Fragmenten zusammengefasst und in den überlappenden Bereichen

- 91 -

Leu-30 bis Asp-40 und Val-50 bis Val-70 wurden die Durchschnittswerte der chemischen

Verschiebungen der α-Protonen verwendet (Abbildung 71). Aus den graphischen

Darstellungen lässt sich folgende Vorhersage über das Vorhandensein von sekundären

Strukturelementen gewinnen.

Im N-terminalen Bereich des Peptids SF2(1-90) sind zwei kurze relativ schwache α-helikale

Bereiche von Trp-9 bis Thr-13, mit einer Länge von 5 Aminosäuren, und von Ile-16 bis Arg-

21, mit einer Länge von 6 Aminosäuren, zu erwarten. Diese Strukturvorhersage ist mit den

Angaben, wie sie für das PB1-F2 Peptid PR8 beschrieben worden sind [9], identisch. Dies

resultiert daher, dass sich die Aminosäuresequenzen der beiden Peptide PR8 und SF2 in

diesen Bereichen exakt gleichen. Die Werte für die Differenz der chemischen Verschiebungen

der α-Protonen ∆δHα liegen in diesen Bereichen nur sehr knapp unterhalb des Grenzwertes

von -0.1 ppm, so dass hier eine relativ schwach ausgeprägte α-Helix zu erwarten ist. Im

Gegensatz dazu gibt es im C-teminalen Bereich des Peptids SF2(1-90) zwei Bereiche von

Lys-52 bis Arg-65, mit einer Länge von 13 Aminosäuren, und von Val-70 bis His-86, mit

einer Länge von 16 Aminosäuren, in denen zwei sehr stark ausgeprägte α-Helices zu erwarten

sind. In diesen Bereichen der Peptidsequenz von SF2(1-90) wird der Grenzwert von -0.1 ppm

für das Vorhandensein von α-helikalen Strukturelementen von fast allen Aminosäuren sehr

deutlich unterschritten, wodurch sich die stärkere Ausprägung der beiden zu erwartenden α-

Helices erklären lässt.

- 92 -

SF2(1-40) [δ in ppm] Sequenz HN Hα Hβ Hγ Hδ Hε Hζ Hη

M1 4.225 1.930 2.235 1.930 G 8.702 4.079 Q 8.423 4.412 2.185 / 2.037 2.404 7.488 - 7.315 /

6.975 - 6.661

E 8.500 4.330 2.168 / 2.092 2.523 Q5 8.464 4.386 2.196 / 2.094 2.415 7.488 - 7.315 /

6.975 - 6.661

D 8.287 4.911 3.009 / 2.961 T 7.940 4.275 4.144 1.253 P 4.352 2.338/1.881 2.098 / 2.013 3.758 W 7.598 4.456 3.419 7.251 9.836 / 7.560 7.483 / 7.141 7.238 I10 7.742 3.712 1.899 1.312 / 1.083 /

0.912 0.895

L 8.056 4.226 1.821 1.758 0.894 / 0.848 S 8.076 4.333 4.045 / 3.972 T 8.002 4.071 4.125 1.082 G 8.296 3.918

H15 8.198 4.583 3.405 / 3.325 7.301 8.538 I 8.216 3.960 1.942 1.680 / 1.234 /

0.973 0.896

S 8.293 4.330 4.049 / 3.987 T 7.956 4.159 4.345 1.277 Q 8.073 4.163 2.189 / 2.132 2.402 7.488 - 7.315 /

6.975 - 6.661

K20 8.273 4.221 1.930 1.570 1.757 3.020 7.614 R 8.046 4.263 1.973 / 1.801 1.688 3.249 7.230 n.z. E 8.285 4.329 2.229 / 2.142 2.583 / 2.509 D 8.377 4.715 2.962 G 8.236 4.026

Q25 8.067 4.391 2.205 / 2.102 2.435 7.488 - 7.315 / 6.975 - 6.661

Q 8.274 4.474 2.231 / 2.083 2.449 7.488 - 7.315 / 6.975 - 6.661

T 7.969 4.561 4.309 1.309 P 4.453 2.359 / 2.119 2.040 / 1.930 3.861 / 3.742 R 8.005 4.310 1.908/1.770 1.696 3.255 7.225 n.z.

- 93 -

Sequenz HN Hα Hβ Hγ Hδ Hε Hζ Hη L30 7.924 4.354 1.742 1.656 0.970 / 0.920

E 8.101 4.307 2.059 / 1.998 2.444 H 8.321 4.666 3.332 / 3.228 7.328 8.586 H 8.480 4.710 3.363 / 3.255 7.350 8.600 N 8.563 4.693 2.903 / 2.853 7.551 / 6.815

S35 8.324 4.545 4.026 / 3.938 T 8.078 4.366 4.320 1.270 R 8.112 4.363 1.930 / 1.837 1.697 3.243 7.206 n.z. L 7.963 4.331 1.706 1.654 0.969 / 0.920 M 8.012 4.476 2.190 / 2.080 2.637 / 2.572 2.190

D40 8.083 4.746 2.925 / 2.889 Tabelle 6: Zuordnung der 1H NMR Signale des Peptids SF2(1-40)


L30 4.053 1.585 1.498 1.073 / 0.951 E 8.618 4.423 2.050 / 1.992 2.436 H 8.596 4.710 3.316 / 3.205 7.328 8.591 H 8.607 4.776 3.271 / 3.182 7.334 8.601 N 8.646 4.825 2.902 / 2.847 7.577 / 6.866

S35 8.431 4.572 4.052 / 3.954 T 8.194 4.350 4.346 1.311 R 8.213 4.282 1.932/1.885 1.778/1.707 3.257 7.251 n.z. L 7.924 4.294 1.734 1.690 0.969 / 0.926 M 8.094 4.374 2.180 2.681 / 2.596 2.180

D40 8.282 4.605 2.950 / 2.890 H 8.304 4.600 3.502 / 3.354 7.328 8.591 C 8.392 4.351 3.089 / 3.019 Q 8.490 4.222 2.179 2.499 / 2.435 7.289 / 6.647 K 8.197 4.285 1.910 / 1.733 1.590 1.491 3.096 7.639

T45 7.885 4.253 4.310 1.237 M 8.260 4.435 2.152 2.672 / 2.611 2.152 N 8.205 4.629 2.853 7.461 / 6.708 Q 8.078 4.335 2.188 2.470 / 2.428 7.366 / 6.658 V 7.887 4.108 2.227 1.035 / 0.976

- 94 -

Sequenz HN Hα Hβ Hγ Hδ Hε Hζ Hη V50 7.852 4.147 2.176 1.011 / 0.980 M 8.117 4.779 2.138 2.683 / 2.612 2.138 P 4.400 2.403 2.062 / 1.967 3.898 / 3.667 K 7.858 4.055 1.930 / 1.748 1.492 1.588 3.021 7.629 Q 8.364 4.126 2.223 / 2.140 2.398 / 2.333 6.934 / 6.576

I55 7.714 4.026 2.081 1.705 / 1.326 / 1.051

0.942

V 7.663 3.687 2.177 1.073 / 0.950 Y 7.990 4.286 3.090 / 2.160 6.835 6.515 W 8.299 4.649 3.502 / 3.354 7.277 9.660 / 7.596 7.435 / 6.641 7.093 K 8.640 4.004 2.063 / 1.978 1.512 1.860 / 1.705 3.004 7.617

Q60 8.337 4.053 2.307 / 2.111 2.517 / 2.307 6.847 / 6.473 W 8.519 4.180 3.502 / 3.106 7.029 9.642 / 7.596 7.458 / 7.088 7.218 L 8.679 3.911 1.851 1.523 0.932 / 0.864 S 7.918 4.261 4.047 / 3.971 L 7.538 4.249 1.707 1.514 0.867

R65 7.527 4.243 1.762 / 1.569 1.387 2.768 / 2.707 6.808 n.z. S 7.722 4.753 3.889 P 4.550 2.297 / 2.020 2.057 3.791 T 7.857 4.743 4.248 1.271 P 4.490 2.306 / 1.988 2.070 / 2.028 3.821 / 3.742

V70 7.654 4.163 2.111 1.014 / 0.982 Tabelle 7: Zuordnung der 1H NMR Signale des Peptids SF2(30-70)


V50 3.908 2.227 1.059 M 8.524 5.041 2.204 / 2.046 2.671 2.204 P 4.406 2.440 / 2.209 2.098 / 2.043 4.014 / 3.825 K 8.227 4.004 1.841 / 1.735 1.469 1.524 2.96 - 3.01 Q 8.333 4.092 2.246 / 2.063 2.428 / 2.299 7.166 / 6.648

I55 7.372 4.032 2.133 1.662 / 1.318 / 1.066

0.930

V 7.670 3.657 2.156 1.052 / 0.951 Y 8.021 4.277 3.104 6.876 6.545

- 95 -

Sequenz HN Hα Hβ Hγ Hδ Hε Hζ Hη W 8.251 4.649 3.507 7.257 9.603 / 7.588 7.438 / 6.634 7.087 K 8.662 3.986 2.072 / 1.971 1.508 1.724 2.960 - 3.010 7.585 - 7.65

Q60 8.359 4.048 2.315 / 2.120 2.533 6.820 / 6.463 W 8.572 4.131 3.510 / 3.100 7.020 9.663 / 7.587 7.458 / 7.091 7.218 L 8.723 3.864 1.841 / 1.771 1.490 0.911 / 0.827 S 7.979 4.223 4.092 / 3.982 L 7.626 4.251 1.801 1.725 0.867

R65 7.516 4.236 1.777 / 1.515 1.352 2.696 / 2.602 6.760 n.z. S 7.590 4.691 3.892 P 4.582 2.263 2.063 / 1.995 3.831 T 8.076 4.694 4.401 1.345 P 4.401 2.440 / 2.209 2.098 / 2.043 4.014 / 3.825

V70 7.510 3.856 2.099 1.074 / 1.003 S 8.123 4.280 4.087 / 4.032 L 7.945 4.225 1.760 1.715 0.931 K 8.108 3.968 2.277 / 1.991 1.890 1.937 2.96 - 3.01 7.585 - 7.65 T 8.046 3.982 4.340 1.345

R75 7.659 4.081 2.120 / 2.031 1.961 / 1.739 3.225 7.190 n.z. V 8.083 3.690 2.235 1.088 / 0.918 L 8.233 4.276 1.942 1.857 0.965 / 0.924 K 8.233 4.048 2.041 / 1.982 1.471 1.730 2.960 7.585 - 7.65 R 7.983 4.093 2.083 / 2.034 1.782 / 1.653 3.188 / 3.127 7.154 n.z.

W80 8.612 4.537 3.566 / 3.466 7.198 9.683 / 7.644 7.470 / 7.054 7.206 R 8.651 3.839 2.074 / 1.999 1.896 / 1.737 3.220 / 3.180 7.205 n.z. L 8.038 4.155 1.826 / 1.710 1.573 0.917 / 0.868 F 8.436 4.426 3.188 7.229 7.301 7.272 S 8.205 4.083 3.735 / 3.471

K85 7.664 4.181 1.867 1.427 1.667 2.960 - 3.010 7.585 - 7.65 H 8.050 4.433 3.157 / 3.067 7.122 8.386 E 8.072 4.268 1.980 / 1.871 2.264 W 7.967 4.771 3.383 / 3.308 7.227 9.815 / 7.649 7.418 / 7.140 7.193 T 7.675 4.436 4.274 1.169

S90 7.907 4.456 3.981 / 3.922 Tabelle 8: Zuordnung der 1H NMR Signale des Peptids SF2(50-90)

- 96 -

SF2(1-40)

Sequenz

0 5 10 15 20 25 30 35 40

∆δ H

α [p

pm]

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

* *

Abbildung 68: Hα-shift Plot des Peptids SF2(1-40); Die Sterne markieren die Positionen der in der Sequenz

enthaltenen Proline.

SF2(30-70)

Sequenz

30 35 40 45 50 55 60 65 70

∆δ H

α [p

pm]

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

* * *



- 97 -

SF2(50-90)

Sequenz

50 55 60 65 70 75 80 85 90

∆δ H

α [p

pm]

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

* * *



mix_SF2(1-90)

Sequenz

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

∆δ H

α [p

pm]

-0,6

-0,5

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

* * * * *

Abbildung 71: Hα-shift Plot von mix_SF2(1-90) als theoretisches „full-length“ Peptid; Die Sterne markieren

die Positionen der in der Sequenz enthaltenen Proline.

- 98 -

1 10 2 0 3 0 40

KQIVYWKQ-WLSLR V-SLKTRVLKRW-RLFSKH

MGQEQDTPWI-LSTGHISTQK-REDGQQTPRL-EHHNSTRLMD-HCQKT

MNQVV-MP SPTP EWTS 50 6 0 70 80 90

SF2M1

α 1

W9 T 13

α 2

I16 R 21

α 3

R37 V 50

α4

K52 R 65

α5

V70 H 86 S 90

A

B

1 10 2 0 3 0 40

KQIVYWKQ-WLSLRNPILV-FLKTRVLKRW-RLFSKHE

MGQEQDTPWI-LSTGHISTQK-RQDGQQTPKL-EHRNSTRLMG-HCQKT

MNQVV-MP 50 6 0 70 80 8 7

PR8M1

α 1

W9 T 13

α 2

I16 K 20

α3

K53 S 84 E 87

A

B

Im Bereich von Arg-37 bis Val-50 zeigt sich, dass ein Großteil der Verschiebungswerte der

Aminosäuren relativ knapp um den Grenzwert von -0.1 ppm gruppiert ist. Möglicherweise

liegt hier ebenfalls ein sehr schwach ausgeprägter α-helicaler Bereich des Peptids SF2(1-90)

vor. Ebenfalls auffällig ist, dass die Differenzwerte der chemischen Verschiebung der α-

Protonen ∆δHα von den Aminosäuren Thr-27, Met-51, Ser-66 und Thr-68 sehr deutlich

oberhalb des Grenzwertes von +0.1 ppm liegen. Hierbei handelt es sich um das Phänomen,

dass alle diese Aminosäuren direkt vor der Aminosäure Prolin in der Sequenz des Peptids

SF2(1-90) vorkommen. Prolin bewirkt, dass bei der in der Sequenz vorangegangenen

Aminosäure in Richtung N-Terminus ein Sprung der chemischen Verschiebung von +0.28 ±

0.1 ppm und ein etwas kleinerer Sprung von +0.08 ± 0.03 ppm für die Aminosäure zwei

Positionen vor dem entsprechenden Prolin in der Sequenz auftritt [9,127]. Eine graphische

Zusammenfassung der zu erwartenden sekundären Strukturelemente sowie die Sequenz für

das Peptid SF2(1-90) ist in Abbildung 72 wiedergeben.

Abbildung 72: Schematische Darstellung der erwarteten sekundären Strukturelemente des Peptids SF2(1-90)

(A), Aminosäuresequenz des Peptids SF2(1-90) (B)

Abbildung 73: Schematische Darstellung der Sekundärstruktur des Peptids PR8(1-87) gemäß der Angaben in

der Literatur von Bruns et al. [9] (A) Aminosäuresequenz des Peptids PR8(1-87) (B)

- 99 -

Für die weitere Untersuchung erfolgte die Zuordnung der NOE-Signale aus den NOESY

Spektren vom mittleren Fragment SF2(30-70) und vom C-Terminus SF2(50-90) des PB1-F2

Peptids SF2(1-90). Auf Grund der Ergebnisse der Hα-shift Plot’s ist zu erwarten, dass sich die

beiden zu vergleichenden PB1-F2 Peptide PR8 und SF2 in ihren N-Termini nicht sehr

unterscheiden, da in diesem Bereich eine sehr große Ähnlichkeit ihrer Aminosäuresequenzen

vorliegt (Abbildung 73). Die Berechnung der Strukturen von SF2(30-70) und SF2(50-90)

erfolgte in Anlehnung an das Standardprotokoll von Brunger et al. [123]. Mit Hilfe der

quantitativen NOE-Signale ist es möglich, eine genauere Struktur des jeweiligen Peptids zu

berechnen. Aus der Stärke der NOE-Signale der Protonen aus den Seitenketten der

Aminosäuren lassen sich die räumlichen Abstände dieser Protonen bzw. Seitenketten

zueinander bestimmen. Die Bestimmung der Interprotonenabstände liefert ein genaueres

Strukturmodell des Peptids in Lösung, als es durch den Vergleich der chemischen

Verschiebungen der α-Protonen der einzelnen Aminosäuren des Peptid (Hα-shift Plot’s) mit

den tabellarischen Werten für Aminosäuren in einer ungeordneten Struktur (random coil)

[121] erhalten werden kann. Für SF2(1-40), den N-Terminus des Peptids, wurden keine

Strukturberechnungen durchgeführt, weil zum einen im NOESY Spektrum dieses Peptids

nicht ausreichend eindeutig zuzuordnende NOE-Signale zu finden waren. Und zum anderen

zeigt SF2(1-40) in seinem Hα-shift Plot eine große Ähnlichkeit zum bereits literaturbekannten

Peptid PR8(1-40) [9].

- 100 -

Aminosäureposition

30 35 40 45 50 55 60 65 70

Anz

ahl d

er N

OE

-Sig

nale

0

5

10

15

20

25

30intraresidual (i) sequential (i-i+1) medium range (i-i+2,3,4)

6.2.1 Bestimmung der Struktur des mittleren Fragments SF2(30-70)

Für die Berechnungen zur Moleküldynamik und Energieminimierung wurden insgesamt 388

quantitative NOE-Signale benutzt, wovon 153 intraresiduale, 143 sequentielle und 92 medium

range Signale vorlagen (Abbildung 74). Der Abstand der Amidprotonen untereinander in den

Seitenketten von Glutamin oder Asparagin wurde auf 0.19 nm kalibriert und diente somit als

Bezugsgröße für die weiteren Signale. Nach Korrekturen für Pseudoatome gemäß den

Angaben von Wüthrich [121] wurden diese Signale direkt als Interprotonenabstände

verwendet. Es wurden anschließend 100 verschiedene Strukturen für das Peptid SF2(30-70)

berechnet und davon die 20 Strukturen, welche alle keine Störungen größer als 0.2 Å

aufwiesen, mit der niedrigsten Gesamtenergie Etotal für die weitere Fittinganalyse ausgewählt

(Tabelle 9).

Abbildung 74: Schematische Darstellung der Verteilung der Anzahl der NOE-Signale auf die entsprechende

Aminosäureposition für das Peptid SF2(30-70)

- 101 -

Anzahl der verwendeten Interprotonabstände (NOE’s)

Gesamt 388

Intraresidual (|i-j| = 0) 153

Sequentiell (|i-j| = 1) 143

Medium Range (2 ≤ |i-j| ≤ 4) 92

Anzahl der NOE Störungen ≥ 0.2 Å 0

Durchschnittliche Energien [kJ/mol]

Etotal 303.171

ENOE 81.661

Evan der Waals 76.381

Ebond + Eangle + Eimpropers 145.130

r.m.s.d. – Werte für die H-Atome des Peptidrückgrates [Å]

Fitting-Region M1 von Met 39 bis Asn 47 0.135

Fitting-Region M2 von Gln 54 bis Leu 62 0.025

Ramachandran Plot für Struktur mit niedrigster Etotal

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in äußerst günstigen Regionen 41.7

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in zusätzlich erlaubten Regionen 50.0

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in großzügig erlaubten Regionen 5.6

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in verbotenen Regionen 2.7

Tabelle 9: Statistische Auswertung für die ausgewählten 20 finalen Strukturen von SF2(30-70)

Durch die Anwendung der „Methode der aufeinander folgenden Segmente“ bzw. “Methode

eines gleitenden Filters“ (consecutive segment approach) [136] können die Bereiche mit

ausgeprägten Strukturelementen visualisiert werden. Bei dieser Methode werden für kurze

Segmente mit einer Länge von zwei, drei, vier und fünf Aminosäuren die durchschnittlichen

quadratischen Unterschiede (r.m.s. differences) der Peptidrückgratprotonen (backbone)

systematisch paarweise miteinander verglichen. Dabei werden die kurzen Segmente von z.B.

einer Länge von 2 Aminosäuren den sequentiellen NOE-Signalen (i-i+1) und die längeren

Segmente von z.B. einer Länge von 5 Aminosäuren den medium range NOE-Signalen (i-

i+2,3,4) zugeordnet. Anschließend werden für jedes Intervall der ausgewählten 20 Strukturen

die mittleren quadratischen Abweichungen/Standardabweichungen (r.m.s. deviations) für die

Abstände der Peptidrückgratprotonen zueinander bestimmt. Dieser r.m.s.d.-Wert ist ein Maß

für den Abstand zwischen analogen Atomen im Raum in verschiedenen Molekülen, in diesem

Fall in den 20 verschiedenen Konformationen bzw. Strukturen für das jeweilige untersuchte

Peptidfragment. Diese erhaltenen Standardabweichungen (r.m.s.d.-Werte) werden dann gegen

- 102 -

die entsprechende Aminosäure des Peptids aufgetragen. Diese Analysenmethode ermöglicht

eine objektive Wiedererkennung von stabilen sekundären Strukturelementen bei den

ausgewählten 20 finalen Strukturen mit der geringsten Gesamtenergie Etotal. Je geringer der

jeweilige r.m.s.d.-Wert (Standardabweichung) ist, desto mehr gleichen sich die einzelnen

Konformationen der 20 ausgewählten Strukturen für den entsprechenden Bereich. Die

Bereiche, in denen der Wert der Standardabweichung (r.m.s.d.-Wert) kleiner als 0.2 Å ist,

werden als Fitting-Regionen für die Anlagerung der 20 ausgewählten Strukturen an eine

zuvor bestimmte Kernstruktur benutzt (Abbildung 75).

Abbildung 75: Darstellung der r.m.s.d.-Werte für die 1H Atome des Peptidrückgrats für Segmente mit einer

Länge von 2 bis 5 Aminosäuren für das Peptid SF2(30-70)

Die erwähnte Kernstruktur (central structure) wird mit Hilfe der Programme LSQMAN und

MOLEMAN2 ermittelt. Es handelt sich bei der Kernstruktur um diejenige Struktur, welche

von allen 20 ausgewählten Strukturen die geringste Abweichung vom berechneten

arithmetischen Mittel von eben diesen 20 Strukturen liegt. Diese Struktur zeigt von allen 20

Strukturen den niedrigsten r.m.s.d.-Wert auf und stellt eine Art Grundkörper dar, an den sich

durch die Anlagerung (anfitten) der anderen 19 verbleibenden Strukturen die graphischen

Darstellungen der Superposition für jede einzelne Fitting-Region ergeben (Abbildung 76 und

77).

Aminosäureposition

30 35 40 45 50 55 60 65 70

Stan

dard

abw

eich

ung

(r.m

.s. d

evia

tion)

[Å]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Fitting Region M1 Fitting Region M2

- 103 -

L30

V70

Fitting-Region M1 (M39-N47)

Fitting-Region M2 (E54-L62)

Abbildung 76: Superposition von den 20 ausgesuchten finalen Strukturen nach der Anlagerung der

Rückgratatome für die Fitting-Region M1 (Met-39 bis Asn-47) dargestellt für den Bereich von

Arg-37 bis Val-50 für das Peptid SF2(30-70)


Rückgratatome für die Fitting-Region M2 (Glu-54 bis Leu-62) dargestellt für den Bereich von

Lys-52 bis Arg-65 für das Peptid SF2(30-70)

Abbildung 78: Struktur mit der niedrigsten Gesamtenergie Etotal des Peptids SF2(30-70)

R37 V50

R65 K52

- 104 -

In der graphischen Darstellung der energetisch günstigsten Struktur für das mittlere Fragment

SF2(30-70) in Lösung ist zu erkennen, dass die Bereiche, die als Fitting-Regionen (M1 und

M2) ausgewählt wurden, einen α-helikalen Charakter zeigen (Abbildung 78). Beide Fitting-

Regionen haben einen Abstand von 6 Aminosäuren Länge zueinander. Im Bereich der Fitting-

Region M1 sind jedoch die einzelnen Windungen weiter auseinander gezogen, als es im

Bereich von M2 der Fall ist. Dies in ein Anzeichen dafür, dass im Bereich von M1 keine

wirklich klassische α-Helix vorliegt, sondern es sich hier nur um einen leicht strukturierten

Bereich des Peptids SF2(30-70) mit α-helikalen Charakter handelt. Für die Fitting-Region M2

sind hingegen deutlich drei Windungen einer klassischen α-Helix zu erkennen. Die

beschriebenen Unterschiede zeigen sich ebenfalls in den Darstellungen der Superposition von

beiden Fitting-Regionen M1 und M2 (Abbildung 76 und 77). Durch die Untersuchung des C-

Terminus SF2(50-90) sollte sich der Charakter der α-Helix für den Bereich M2 bestätigen,

weil es sich hier um den überlappenden Bereich der beiden Fragmente SF2(30-70) und

SF2(50-90) handelt. In den Abbildungen der Superposition von allen 20 Strukturen zeigt sich

außerdem eine Art Auffächern der einzelnen Strukturen an den jeweiligen Enden der

ermittelten Fitting-Regionen. Dieses Auffächern ist ein Anzeichen dafür, dass sich die

Aminosäuren außerhalb der Fitting-Regionen in einem Abschnitt des Peptids SF2(30-70) mit

ungeordneter Struktur (random coil) befinden.

6.2.2 Bestimmung der Struktur des C-Terminus SF2(50-90)

Es wurden für die Berechnungen zur Moleküldynamik und Energieminimierung insgesamt

438 eindeutig zugeordnete Interprotonabstände verwendet, wovon 211 intraresiduale, 140

sequentielle und 87 medium range Signale vorlagen (Abbildung 79 und Tabelle 10). Die

Berechnungen zu den Strukturelementen für den C-Terminus SF2(50-90) erfolgten nach dem

gleichen Schema, wie sie für das mittlere Fragment SF2(30-70) durchgeführt wurden. Bei der

Ermittlung der r.m.s.d.-Werte (Standardabweichung der Abstände der 1H Atome des

Peptidrückgrats) für den C-Terminus des Peptids SF2(1-90) kommt besonders dem

überlappendem Bereich der beiden Fragmente SF2(30-70) und SF2(50-90) große Bedeutung

zu (Abbildung 80). Beim Vergleich der Fitting-Regionen M2 und C1 fällt auf, dass die

Fitting-Region C1 um 3 Aminosäuren in Richtung N-Terminus länger ist. Dieses Phänomen

lässt sich dadurch erklären, dass bei dem Fragment SF2(50-90) die Fitting-Region C1 sehr

weit am Ende der Peptidkette zu finden ist und somit sehr flexibel ist.

- 105 -


Aminosäureposition für das Peptid SF2(50-90)


Gesamt 438




Anzahl der NOE Störungen ≥ 0.2 Å 0

Durchschnittliche Energien [kJ/mol]

Etotal 285.878

ENOE 77.153

Evan der Waals 74.324

Ebond + Eangle + Eimpropers 134.401

r.m.s.d. – Werte für die H-Atome des Peptidrückgrates [Å]

Fitting-Region C1 Met 51 – Ser 63 0.265

Fitting-Region C2 Leu 72 – Phe 83 0.074

Ramachandran Plot für Struktur mit niedrigster Etotal

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in äußerst günstigen Regionen 52.8

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in zusätzlich erlaubten Regionen 38.9

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in großzügig erlaubten Regionen 8.3

% Aminosäuren mit Φ,Ψ in verbotenen Regionen 0

Tabelle 10: Statistische Auswertung für die ausgewählten 20 finalen Strukturen von SF2(50-90)

Aminosäureposition

50 55 60 65 70 75 80 85 90

Anz

ahl d

er N

OE

-Sig

nale

0

5

10

15

20

25


- 106 -

Der gleiche Sequenzbereich im mittleren Fragment SF2(30-70) ist hingegen weiter in der

Mitte der Peptidkette zu finden, so dass davon ausgegangen werden kann, dass erst ab der

Aminosäure Gln-54 eine α-Helix vorliegt.

Abbildung 80: Darstellung der r.m.s.d.-Werte für die 1H Atome des Peptidrückgrates für Segmente mit einer

Länge von 2 bis 5 Aminosäuren für das Peptid SF2(50-90)


Rückgratatome für die Fitting-Region C1 (Met-51 bis Ser-63) dargestellt für den Bereich von

Val-50 bis Arg-65 für das Peptid SF2(50-90)

V50 R65

Aminosäureposition

50 55 60 65 70 75 80 85 90

Stan

dard

abw

eich

ung

(r.m

.s. d

evia

tion)

[Å]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Fitting Region C1 Fitting Region C2

- 107 -


Rückgratatome für die Fitting-Region C2 (Leu-72 bis Phe-83) dargestellt für den Bereich von

Val-70 bis Lys-85 für das Peptid SF2(50-90)

Abbildung 83: Struktur mit der niedrigsten Gesamtenergie Etotal des Peptids SF2(50-90)

V70 K85

S90 V50

Fitting-Region C1 (M51-S63)

Fitting-Region C2 (L72-F83)

- 108 -

Bei der Betrachtung der graphischen Darstellungen der Superposition der 20 Strukturen für

die Fitting-Region C1 ist sehr gut zu erkennen, dass die α-Helix erst ab der Position Gln-54

vorliegt (Abbildung 81). Im Bereich von Met-51 bis Gln-54 ist keine Windung einer α-Helix

dargestellt, sondern hier zeigt die Peptidkette eine gestreckte Struktur auf, die auf die hohe

Flexibilität am Ende der Peptidkette zurückzuführen ist. In der Darstellung der Superposition

der 20 Strukturen für die Fitting-Region C2 (Abbildung 82) wie auch in der Abbildung

derjenigen Struktur mit der geringsten Energie Etotal von SF2(50-90) (Abbildung 83) sind die

vier einzelnen Windungen der vorliegenden zweiten α-Helix im Bereich von Leu-72 bis Phe-

83 sehr deutlich erkennbar. Wie es schon bei den beiden Superpositiondarstellungen des

mittleren Fragments SF2(30-70) der Fall gewesen ist, so spreizen sich auch beim C-Terminus

die Enden der beiden Fitting-Regionen C1 und C2 auf, weil sich dort strukturell ungeordnete

Bereiche des Peptids befinden.

6.2.3 Zusammenfassung der Strukturelemente für das full-length Peptid SF2(1-90)

Um weitere Informationen über das Verhalten des C-Terminus des kompletten Peptids SF2(1-

90) zu bekommen, wurden die Ergebnisse für die beiden Fragmente SF2(30-70) und SF2(50-

90) zusammengefasst. Dazu wurden die NOE-Signale von Leu-30 bis Trp-58 von dem Peptid

SF2(30-70) und die NOE-Signale von Lys-59 bis Ser-90 des Peptids SF2(50-90) verwendet

(Abbildung 84). Dabei handelte es sich um insgesamt 605 Interprotonabstände, von denen

268 intraresiduale, 205 sequentielle und 132 medium range Signale vorlagen (Tabelle 11).


Aminosäureposition für das „theoretische“ Peptid mix_SF2M(30-58)&SF2C(59-90)

Aminosäureposition

30 40 50 60 70 80 90

Anz

ahl d

er N

OE

-Sig

nale

0

5

10

15

20

25


- 109 -


Gesamt 605




Tabelle 11: Statistische Auswertung für das „theoretische“ Peptid mix_SF2M(30-58)&SF2C(59-90)

Abbildung 85: Darstellung der r.m.s.d.-Werte für die 1H Atome des Peptidrückgrates für Segmente mit einer

Länge von 2 bis 5 Aminosäuren für das „theoretische“ Peptid mix_SF2M(30-58)&SF2C(59-

90)

In der Auftragung der r.m.s.d.-Werte für das theoretische Peptid mix_SF2M(30-

58)&SF2C(59-90) werden die Bereiche, die entweder nur einen α-helikalen Charakter

aufweisen (Fitting-Region F1) oder aber eine klassische α-Helix enthalten (Fitting-Regionen

F2 und F3) dargestellt (Abbildung 85). Nach den Ergebnissen der Berechnungen für die

Strukturen für das mittlere Fragment SF2(30-70) und den C-Terminus SF2(50-90) lässt sich

ein leicht verändertes Schema für die Struktur des kompletten Peptids SF2(1-90) erstellen

(Abbildung 86). Die Bereiche, in denen nach der Auswertung der Hα-shift Plot’s sekundäre

Strukturelemente erwartet wurden, müssen leicht in ihrer Länge gekürzt werden. Nach den

Hα-shift Plot’s ist eine größere Ausdehnung von ca. 2 Aminosäuren Länge in jede Richtung

der drei Bereiche α3, α4 und α5 erwartet worden. Auf Grund der ermittelten r.m.s.d.-Werte

(Standardabweichung der Abstände der Peptidrückgratprotonen) für beide Peptidfragmente

Aminosäureposition

30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90

Stan

dard

abw

eich

ung

(r.m

.s. d

evia

tion)

[Å]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Fitting Region F1 Fitting Region F2 Fitting Region F3

- 110 -

SF2(30-70) und SF2(50-90), mit denen die Übereinstimmung dieser Bereiche (Fitting-

Regionen) für alle 20 finalen Strukturen des jeweiligen Fragments überprüft wird, mussten

die Längen für die Bereiche α3, α4 und α5 entsprechend korrigiert werden. Ein sehr großer

Unterschied zwischen den beiden Peptiden PR8(1-87) und SF2(1-90) besteht darin, dass die

α-Helix des C-Terminus im Peptid SF2(1-90) in zwei separate α-Helices unterbrochen ist und

eine Lücke von 9 Aminosäuren Länge aufweist im Gegensatz zum Peptid PR8(1-87), bei dem

eine kontinuierliche α-Helix vorliegt [9]. Dieser Unterschied beruht auf dem Vorhandensein

von zwei Prolinen an den Positionen Pro-67 und Pro-69 beim Peptid SF2(1-90), die sehr dicht

beieinander liegen und somit die α-Helix unterbrechen. Durch diese Unterbrechung der α-

Helix wird dem Peptid SF2(1-90) ein erhöhtes Maß an Flexibilität im Bereich um diese

beiden Proline gewährt. Beim Peptid PR8(1-87) hingegen reicht das Vorhandensein von nur

einem Prolin an Position Pro-67 für diese Unterbrechung der α-Helix nicht aus. Für das Peptid

PR8(1-87) liegt somit eine etwas mehr fixierte Struktur im Bereich des C-Terminus vor. Für

den N-Terminus SF2(1-40), von dem keine Strukturberechnungen durchgeführt wurden,

wurden die Ergebnisse von Bruns et al. [9] für den N-Terminus des Peptids PR8(1-40)

übernommen, weil beide Peptide SF2 und PR8 im Bereich des N-Terminus von Position Met-

1 bis Arg-21 eine exakt identische Aminosäuresequenz aufweisen. Auf Grund dieser

Sequenzgleichheit ist ein gleiches Strukturverhalten der beiden N-terminalen Fragmente

PR8(1-40) und SF2(1-40) zu erwarten, das in die schematische Darstellung der einzelnen

Bereiche, die sekundäre Strukturelemente enthalten integriert wurde (Abbildung 86).

Abbildung 86: Schematische Darstellung der berechneten sekundären Strukturelemente des Peptids SF2(1-90)

SF2M1

α1

W9 T1 3

α2

I16K20

α3

M39 N4 7

α 4

Q54 S6 3

α 5

L72 F8 3 S9 0

- 111 -

6.3 Die Anwendung von Dcpm geschützten Aminosäuren in der Peptidsynthese

Bei den beiden PB1-F2 Peptiden PR8(1-87) und SF2(1-90) liegt in deren

Aminosäuresequenzen eine so genannte „Asp-Gly Einheit“ im N-Terminus an Position Asp-

23 und Gly-24 vor. Auf Grund dieser Reihenfolge in der Aminosäuresequenz der beiden

Peptide PR8(1-87) und SF2(1-90), wird während der chemischen Synthese als Nebenreaktion

Aspartimidbildung begünstigt [27]. Diese Nebenreaktion wurde von Henklein et al. [90] auch

bei der Synthese des Peptids PR8(1-87) beobachtet und durch die Verwendung des bei

kommerziell erhältlichen Dipeptidbausteins Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH (Novabiochem,

Merck Biosciences und NeoMPS) verhindert.

6.3.1 Stabilitätsuntersuchungen für den Einsatz bei der Peptidkupplung am Beispiel

von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH

Für die Verwendung von Dcpm geschützten Aminosäuren bei der Peptidsynthese wurden

Stabilitätsuntersuchungen unter leicht sauren Bedingungen, wie sie bei der Kupplung von

Aminosäuren vorliegen können, am Beispiel von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH durchgeführt. Dazu

wurden 5.2 mg (12.824 µmol) Fmoc-(Dcpm)Ala-OH in 1 ml DMF gelöst und anschließend

17 mg (10 eq, 128.4 µmol) HOBt*H2O zugegeben und die Reaktionslösung dann bei

Raumtemperatur geschüttelt. Die Reaktionsverlaufskontrollen wurden mittels analytischer

RP-HPLC Untersuchungen durchgeführt und zeigten, dass die Verbindung in DMF als

Lösungsmittel in Gegenwart von HOBt über einen Zeitraum von bis zu 2.5 h keine Anzeichen

für einen Verlust der Dcpm-Gruppe aufwies. Außer den angegebenen Reagenzien konnten

mittels RP-HPLC keine weiteren Zersetzungsprodukte im Reaktionsansatz gefunden werden

(Abbildung 87).

- 112 -

Abbildung 87: Analytisches HPLC Chromatogramm von Fmoc-(Dcpm)Ala-OH und HOBt in DMF nach

2.5 h: Gradient: 10 % B 100 % B in 45 min (A: 2000 ml MeCN + 500 ml H2O + 5 ml TFA;

B: 2500 ml MeCN + 5 ml TFA); Fluss: 1 ml/min; λ = 220 nm; Säule: Nucleosil C18 (125 x

4.6 mm, 5 µm)

6.3.2 Fmoc-OAt als neues Reagenz zur Einführung der Fmoc Schutzgruppe

Für die Synthese der drei Modellverbindungen Fmoc-(Dcpm)Gly-OH, Fmoc-(Dcpm)Ala-OH

und Fmoc-(Dcpm)Leu-OH war die Einführung der Fmoc-Gruppe in Lösung problematisch.

Auf Grund des sterischen Anspruchs der bereits vorhandenen Dcpm-Gruppe im Molekül war

eine direkte Einführung der Fmoc-Gruppe mit Fmoc-Cl unter Schotten-Baumann-

Bedingungen mit DIPEA als Base nicht erfolgreich gewesen. Die bei diesen Bedingungen

normalerweise durchgeführte saure Aufarbeitung durch die Zugabe von verdünnter Salzsäure

(0.1 M) zum Ausfällen der Aminosäure stellt für die sehr säureempfindliche Dcpm-Gruppe

ein erhebliches Problem dar. Bei der Reaktion über vorherige Silylierung am sekundären

Stickstoff der Aminosäure mit TMSCl und anschließender Einführung der Fmoc-Gruppe

durch eine Acylierung mit Fmoc-Cl unter Schlenk-Bedingungen gemäß den Protokollen von

Carpino et al. [15] war es möglich, die drei gewünschten orthogonal geschützten

Modellverbindungen herzustellen. Trotz der Zugabe von DIPEA, welche das entstehende HCl

bei der Verwendung von Fmoc-Cl abfangen sollte, und der Verwendung von nur 5%iger

Zitronensäure zur Generierung der freien Carboxylgruppe bei einem pH-Wert von 5, konnte

nicht verhindert werden, dass die Dcpm-Gruppe zu einem erheblichen Anteil abgespalten

wurde. Aus diesem Grund wurde nach einem alternativen Syntheseweg zur Herstellung der

Fmoc geschützten (Dcpm)-Aminosäuren gesucht. Um das Risiko auszuschließen, durch das

entstehende HCl die Dcpm-Gruppe abzuspalten, auch wenn es durch die Base DIPEA

Rt [min]

0 10 20 30 40

DMF

HOBt

Rt = 30.029 minFmoc-(Dcpm)Ala-OH

2.5h

- 113 -

abgefangen werden sollte, wurde für die Einführung der Fmoc-Gruppe als neues Reagenz

Fmoc-OAt verwendet [131] (Abbildung 88).

Abbildung 88: Verwendetes Fmoc-OAt als neues Reagenz zur Einführung der Fmoc-Gruppe [131]

Zur Einführung der Fmoc-Gruppe bei den Dcpm geschützten Aminosäuren Glycin, Alanin

und Leucin wurde die Synthesestrategie in Lösung auf eine Reaktionsführung an der festen

Phase durch Verankerung der entsprechenden freien (Dcpm)-Aminosäure an ein 2-Chlortrityl

Harz übertragen. Die Synthese am Harz erlaubt den Einsatz von größeren Überschüssen der

Reagenzien sowie deren einfache Abtrennung nach der Reaktion durch Waschen des Harzes.

Durch milde Abspaltung des Rohproduktes von dem sehr säureempfindlichen 2-Chlortrityl

Harz sollte kein Verlust der Dcpm-Gruppe auftreten. Eine Übersicht der Produktverteilungen

von der Synthese in Lösung mit Fmoc-Cl und vorheriger Silylierung durch TMSCl sowie der

Synthese an der festen Phase mit Fmoc-OAt ist in Tabelle 12 dargestellt.

Synthese mit Fmoc-Cl in Lösung

Synthese mit Fmoc-OAt am Harz

Fmoc-(Dcpm)Gly-OH 60 % 92 % Fmoc-Gly-OH 13 % 0 %

Fmoc-(Dcpm)Ala-OH 45 % 83 % Fmoc-Ala-OH 36 % 9 %

Fmoc-(Dcpm)Leu-OH 16 % 23 % Fmoc-Leu-OH 28 % 25 %

Tabelle 12: Produktverteilung der Modellverbindungen bei der Einführung der Fmoc-Gruppe in Lösung und

an der festen Phase; bestimmt mittels analytischer RP-HPLC

Beim Vergleich der Reinheit der Rohprodukte ist zu erkennen, dass bei der Synthese am Harz

unter Verwendung von Fmoc-OAt als Reagenz zur Einführung der Fmoc-Gruppe deutlich

bessere Resultate erzielt werden konnten. Bei allen drei Modellverbindungen konnte der

Anteil des gewünschten Produkts mit den beiden orthogonalen Schutzgruppen Fmoc und

Dcpm im Molekül deutlich erhöht werden. Im Fall von Glycin war es möglich bei der

N NN

N

OO

O

- 114 -

Verwendung von Fmoc-OAt am Harz den Verlust der Dcpm-Gruppe vollständig zu

unterdrücken. Im Gegensatz dazu ist im Fall von Leucin auch bei der Verwendung von Fmoc-

OAt die Abspaltung der Dcpm-Gruppe nicht zu verhindern gewesen. In beiden Fällen ist der

Anteil am gewünschten Produkt Fmoc-(Dcpm)Leu-OH geringer als der des Nebenproduktes

Fmoc-Leu-OH. Diese Tatsachen lassen sich durch den sterischen Anspruch der Seitenkette

von Leucin sowie der Dcpm-Gruppe erklären. Beide Substituenten, am sekundären Stickstoff

der Aminosäure und am α-Kohlenstoffatom, behindern die Einführung der Fmoc-Gruppe in

erheblichem Maße, woraus die angegebene Verteilung der beiden Verbindungen im

jeweiligen Rohprodukt resultiert. Betrachtet man bei allen drei Modellverbindungen die

Summe der prozentualen Anteile in der Produktverteilung fällt auf, dass mit zunehmendem

sterischen Anspruch der Aminosäureseitenkette der Anteil an Fmoc-(Dcpm)-Aminosäure und

Fmoc-Aminosäure abnimmt. Durch die Verwendung von Fmoc-OAt an Stelle von Fmoc-Cl

konnte bei den Modellverbindungen in allen Fällen eine Verbesserung der Produktausbeute

und Reinheit erzielt werden. Der Wechsel der Synthesestrategie von der Reaktionsführung in

Lösung mit vorheriger Silylierung gemäß Carpino et al. [15] zur Synthese am Harz ist

ebenfalls von Vorteil. Die Verankerung der Dcpm geschützten Aminosäuren über die

Carboxylgruppe am Harz erleichterte die Isolierung der gewünschten Fmoc und Dcpm

geschützten Aminosäuren sehr, da somit kein Ausfällen durch Ansäuern der Reaktionslösung

nötig war. Die feste Phase wurde als eine Art Schutzgruppe für die Carboxylfunktion benutzt.

6.3.3 NMR Untersuchungen zum Abspaltungsprozess der Dcpm-Gruppe am Beispiel

von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH

Zur Untersuchung der Abspaltung der Dcpm-Gruppe wurden NMR Untersuchungen am

Beispiel von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH durchgeführt. Die Abspaltung der Dcpm-Gruppe erfolgte

bereits unter sehr schwach sauren Reaktionsbedingungen von 5 % TFA in Chloroform

(CDCl3). Die Reaktion wurde sowohl mit Triisopropylsilan (TIPS) als auch ohne Zusatz

dieses Scavangers untersucht.

Nach ca. 24 h Reaktionszeit in CDCl3 mit Zusatz von 5 % TFA konnten im 1H NMR

Spektrum (Abbildung 90) die in Abbildung 89 dargestellten Verbindungen als

Reaktionsprodukte aus der Abspaltung der Dcpm-Gruppe identifiziert werden. Dabei entfällt

ein Großteil der Protonensignale auf die Verbindungen 1(E) und 2(Z), die beide im Verhältnis

von 1(E):2(Z) 88:12 vorliegen (Tabelle 13). Neben diesen beiden Verbindungen, die die E-

- 115 -

8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 ppm

Fmoc+NH

O H H

1 2

3

4

5

6

7

O

7, 8

1, 2

3, 4 5

6

9, 10

11, 12

1, 2

3, 4 5

6OH

Fmoc-Gly-OH

O

H

H

13

4

5

6

27

CF3CO CF3CO

bzw. Z-Form der gleichen Verbindung darstellen, konnten noch zwei weitere Moleküle 3 und

4 identifiziert werden.

Abbildung 89: Entstandene Produkte und deren prozentuale Verteilung nach der Dcpm Abspaltung von Fmoc-

(Dcpm)Gly-OH nach 24 h mit 5 % TFA in CDCl3 bei 298 K

Abbildung 90: 1H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 24 h mit 5 % TFA in CDCl3 bei 298 K

H

H

O

O

F3C 1

2

3

4

5

6

7

1(E)

HH

O

O

F3C

1 2

4

5

6

7

2(Z)

3

79% 10%

O

1,2

3,45

67,8

9,10

11,12

34%

OH

1,2

3,456

47%

H

H

HO 1

2

3

4

5

6

7

6(E)

HH

HO

1 2

4

5

6

7

7(Z)

3

<1% <1%

- 116 -

1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm) 13C NMR (100 MHz, CDCl3, δ in ppm) Atom Verbindung 1(E) Verbindung 2(Z) Atom Verbindung 1(E) Verbindung 2(Z)

1 0.32 0.33 1 6.4 6.9 2 0.68 0.75 2 6.4 6.9 3 1.35 1.51 3 13.9 9.6 4 5.08 4.89 4 138.5 138.2 5 5.41 5.22 5 120.8 120.5 6 2.41 2.62 6 31.3 26.6 7 4.31 4.35 7 67.6 67.6

Atom Verbindung 3 Verbindung 4 Atom Verbindung 3 Verbindung 4 1 0.22 0.33 1 1.8 n.z. 2 0.49 0.61 2 1.8 n.z. 3 0.32 0.49 3 3.5 n.z. 4 0.53 0.67 4 3.5 n.z. 5 0.90 1.09 5 14.6 14.7 6 3.36 4.41 6 85.6 84.0 7 1.78 / 7 30.9 / 8 2.07 / 8 30.9 / 9 1.88 / 9 25.5 /

10 1.88 / 10 25.5 / 11 3.88 / 11 67.8 / 12 3.99 / 12 67.8 /

Tabelle 13: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Produkte nach der Abspaltung der Dcpm-Gruppe

von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 24 h mit 5 % TFA in CDCl3 bei 298 K.

Neben den Ester der Trifluoressigsäure 1(E) und 2(Z) sind auch die analogen Verbindungen

als Alkohole 6(E) und 7(Z) entstanden. Allerdings liegt der gemeinsame Anteil von 6(E) und

7(Z) bei unter 1 % im Verhältnis zu den anderen Reaktionsprodukten, wie an dem

Signalmuster bei 3.6 ppm zu erkennen ist. Diese beiden Tripletts sind im 1H NMR Spektrum

mit Silanzusatz deutlich stärker ausgeprägt, so dass die Zuordnung der chemischen

Verschiebungen auch nur in diesem Fall vorgenommen werden konnte.

Bei der analogen Reaktionsführung von 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz von

Triisopropylsilan, welches normalerweise als Scavanger bei der Abspaltung von Peptiden

vom Harz verwendet wird, konnten die in Abbildung 91 dargestellten fünf Verbindungen, als

Reaktionsprodukte im 1H NMR Spektrum (Abbildung 92) identifiziert werden. Neben dem

durch Hybridabstraktion vom Silan entstandenem Dicyclopropylmethan 5 sind wieder die

Verbindungen 1(E) und 2(Z) als Ester der Trifluoressigsäure sowie deren analoge

Verbindungen als Alkohol 6(E) und 7(Z) als Reaktionsprodukte entstanden (Tabelle 14).

- 117 -

Abbildung 91: Entstandene Produkte und deren prozentuale Verteilung nach der Dcpm Abspaltung von Fmoc-

(Dcpm)Gly-OH nach 2 h mit 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz von Silan (TIPS) bei 298 K

Aus der abgespaltenen Dcpm Schutzgruppe entsteht zu ca. 66 % unter Zusatz von TIPS als

Hauptprodukt durch Hybridabstraktion das Dicyclopropylmethan 5. Bei den anderen

identifizieren Molekülen handelt es sich sowohl um die Ester der Trifluoressigsäure 1(E) und

2(Z) auch um die entsprechenden Alkohole 6(E) und 7(Z). Das Verhältnis von Ester zu

Alkohol liegt in dem Fall bei ca. 70 : 30. Das Verhältnis von der E-Form zur Z-Form liegt bei

ca. 90 : 10 zu Gunsten der stabileren E-Form. Die Alkohole 6(E) und 7(Z) entstehen auch bei

der Reaktionsführung ohne Silanzusatz (TIPS). Wegen der Überlagerung der sehr eng

beieinander liegenden Signalsätze ist es nicht möglich, diese Verbindungen im 1H NMR

Spektrum eindeutig zu identifizieren. Die Reaktionszeit unter Einwirkung von Silan wurde

hierbei nur auf 2 h begrenzt, da im Allgemeinen diese Zeitspanne für die Abspaltung von

Peptiden ausreichend ist. Mit Ausnahme von Verbindung 5 entstammen die übrigen

Verbindungen 1(E), 2(Z), 3, 4, 6(E) und 7(Z) aus der Ringöffnung von einem der beiden

Cyclopropylringe in der Dcpm-Gruppe bzw. aus der weiteren Umwandlung der entstehenden

Komponenten.

H

H

O

O

F3C 1

2

3

4

5

6

7

1(E)

HH

O

O

F3C

1 2

4

5

6

7

2(Z)

3

21%

2%

H

H

HO 1

2

3

4

5

6

7

6(E)

HH

HO

1 2

4

5

6

7

7(Z)

3

10%

1%H H

1

23

4

566%

- 118 -

7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

Fmoc+NH

O

H

H

13

4

5

6

27

3, 4

Fmoc-Gly-OH

1, 2

5

6 H H

CF3CO

H

H

H

13

4

5

6

27

O H H

1 2

3

4 5

6

7CF3CO

H H H

1 2

3

4 5

6

7

(iPr)

3SiH

(iPr)

3SiH

(iCH

3CH

) 3Si+

(iCH

3CH

) 3Si+

Abbildung 92: 1H NMR Spektrum von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 2 h mit 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz

von Silan (TIPS) bei 298 K

1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm)

Atom Verbindung 1(E) Verbindung 2(Z) Verbindung 5 Verbindung 6(E) Verbindung 7(Z) 1 0.33 0.33 0.03 n.z. n.z. 2 0.68 0.75 0.40 n.z. n.z. 3 1.35 1.51 0.76 n.z. n.z. 4 5.08 4.91 1.13 5.08 4.91 5 5.41 5.24 / 5.48 5.30 6 2.41 2.62 / 2.41 2.41 7 4.33 4.38 / 3.49 3.55

Tabelle 14: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Produkte nach der Abspaltung der Dcpm-Gruppe

von Fmoc-(Dcpm)Gly-OH nach 2 h mit 5 % TFA in CDCl3 unter Zusatz von Silan (TIPS) bei

298 K.

Alle entstandenen Produkte aus der Abspaltung der Dcpm-Gruppe reagieren nicht mit dem

eigentlichen Syntheseziel, dem Peptid. Durch die durchgeführte Ausfällung des Peptids mit

eiskaltem Diethylether lassen sich die Reaktionsprodukte der Abspaltung der Dcpm-Gruppe

auch leicht vom Peptid abtrennen.

- 119 -

6.

4.

3.

2.

1.

pp 8. 8. 7. 7. 6.

Val 7

NH

cis

Asp

13tr

ans

Asp

13

Ile 6

NH

cis

Ar g

15

cis

Hm

b 5

Biotin_2-CH27

Biotin_1-CH21

Arg

1 N

H

tran

s H

mb

5

6.3.4 Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH für die Anwendung

in der Peptidsynthese

Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH wurde entwickelt, um zum

einen ein Werkzeug zur Verhinderung der Aspartimidbildung zu haben. Zum anderen wird

durch die Verwendung des Dipeptids das Risiko einer unvollständigen Kupplung der

folgenden Aminosäure verhindert, wenn diese Kupplung erst während der SPPS erfolgt.

Asparaginsäure konnte außerdem gut an das verankerte (Dcpm)Gly-OH gekoppelt werden.

Beim Versuch einen Fmoc-Ala-(Dcpm)Ala-OH Dipeptidbaustein durch eine analoge

Reaktionsführung zu erhalten, ist die Kupplung nicht gelungen. Durch den Einbau der

Backbone Dcpm Schutzgruppe wird auch die Kettenaggregation während der Peptidsynthese

verringert. Diese Ergebnisse wurden bereits teilweise auf dem 20. Amerikanischen

Peptidsymposium vorgestellt [101,137] und sind im Journal of Peptide Science [19]

ausführlicher beschrieben, so dass an dieser Stelle auf eine ausführlichere Darstellung

verzichtet und nur ein kurzer Überblick gegeben wird.

Abbildung 93: NOESY Spektrum (600 MHz) vom Modellpeptid Mon1 in DMSO-d6 bei 298 K; Biotin_1 ist

N-terminal gebunden und Biotin_2 ist an der Hmb-Gruppe verankert.

Die Nebenreaktion der Acylierung durch Biotin der Hydroxylfunktion der Hmb-Gruppe des

Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH wurde bei der Synthese des Modellpeptids

Mon1 (Sequenz: Biotin-RQYRLIVHNGYCDGRSERNL-COOH) und dessen anschließende

1D und 2D NMR spektroskopische Untersuchung gefunden. In Abbildung 93 ist dazu das

NOESY Spektrum mit den hervorgehobenen Crosspeaks dargestellt.

- 120 -

Abbildung 94: Darstellung der mit Biotin_2 acylierten Hmb-Gruppe im Modellpeptid Mon1

Abbildung 95: Darstellung vom N-terminal gebundenen Biotin_1 im Modellpeptid Mon1

Biotin_2 (an der Hmb-Gruppe) Biotin_1 (N-terminal)

Proton cis [ppm] trans [ppm] Biotin_1-Arg1 1 4.44 4.45 2.14 2 4.06 4.36 1.50 3 7.10 7.35 1.30 4 6.75 6.84 1.60 / 1.46 5 6.65 6.72 3.07 6 3.72 3.74 4.11 7 2.54 2.54 6.41 8 1.63 1.63 6.39 9 1.41 1.41 4.30

10 1.64 / 1.49 1.64 / 1.49 2.79 / 2.56 11 3.12 3.12 / 12 4.16 4.16 / 13 6.45 6.45 / 14 6.45 6.45 / 15 4.32 4.32 / 16 2.82 / 2.58 2.82 / 2.58 /

Tabelle 15: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Hmb-Gruppe mit dem verankerten Biotin_2 und

vom N-terminal gebundenen Biotin_1

Biotin_1-RQYRLIVHNGYCRSERNL-CO2HN

H

HO2C

O

N

O

OCH3

O

O

S

HNNH

O

1,23

4

56

7

8

9

1011

12

1314

15

16

RQYRLIVHNGYCDG(Hmb)RSERNL-CO2H

S

HNNH

O

1

2

3

45

6

78

9

10

Biotin

O

- 121 -

Aminosäure NH [ppm] Hα [ppm] Hβ [ppm] andere H, Hγ,Hδ,Hε [ppm]

Arg1 8.02 4.21 1.63 / 1.63 γ 1.46; δ 3.06; NH 7.50 Gln2 7.96 4.14 1.83 / 1.65 γCH2 2.07 / 2.07; δNH2 7.29 / 6.84 Tyr3 7.95 4.41 2.85 / 2.66 2,6H 6.99; 3,5H 6.61 Arg4 8.13 4.29 1.66/ 1.66 γ 1.48; δ 3.05; NH 7.50 Leu5 7.93 4.34 1.41 γCH 1.58: δCH3 0.82 / 0.85 Ile6 7.90 4.17 1.69 γCH2 1.03 / 1.39; γCH3 0.73; δCH3 0.77 Val7 7.78 4.11 1.91 γCH3 0.78 His8 8.17 4.61 3.03 / 2.93 2H 8.91

4H 7.30 Asn9 8.17 4.50 2.52 / 2.44 γNH2 7.43 / 6.97 Gly10 8.19 3.68 / 3.59

cis-Bereich Tyr11 8.03 4.45 2.89 / 2.67 2,6H 7.02; 3,5H 6.62 Cys12 8.13 4.38 2.73 / 2.66 Asp13 8.49 4.88 2.76 / 2.51 Gly14 - 4.31 / 3.82 Arg15 8.24 4.41 1.65 /1.65 γ 1.46; δ n.z.; NH n.z. Ser16 8.19 4.33 3.62 / 3.57

trans-Bereich Tyr11 8.01 4.45 2.89 / 2.67 2,6H 7.02

3,5H 6.62 Cys12 8.12 4.34 2.65 / 2.65 Asp13 8.59 5.10 2.81 / 2.41 Gly14 - 3.69 / 3.60 Arg15 8.04 4.37 1.63 / 1.63 γ 1.46; δ n.z.; NH n.z. Ser16 8.08 4.30 3.59 / 3.59 Glu17 8.12 4.26 1.94 / 1.94 γCH 2.25 /2.25 Arg18 7.95 4.25 1.64 / 1.64 γ 1.49; δ 3.05; NH 7.45 Asn19 8.11 4.54 2.53 / 2.40 γNH2 7.36 / 6.93 Leu20 7.95 4.15 1.49 γCH 1.62; δCH3 0.87 / 0.82

Tabelle 16: Zuordnung der chemischen Verschiebungen der Aminosäuren des ModellPeptids Mon1

- 122 -

Bei der Zuordnung der chemischen Verschiebungen der einzelnen Aminosäuren des

Modellpeptids Mon1 (Tabelle 16) zeigt sich, dass zwischen den Aminosäuren Asp-13 und

(Hmb)Gly-14 eine stark ausgeprägte cis/trans-Isomerie der Peptidbindung vorliegt. Dies ist

aus der Verdopplung aller Signale für die Aminosäuren innerhalb dieses Bereichs und auch

der Signale der Hmb Schutzgruppe mit dem daran verankerten Biotin_2 zu erkennen (Tabelle

15). Im Gegensatz dazu ist solch eine Signalverdopplung bei den Verschiebungen für das N-

terminal gebundene Biotin_1 nicht zu erkennen.

Als Folge dieser Acylierung lässt sich die Hmb Schutzgruppe anschließend nicht mehr mit

TFA abspalten, so dass als Hauptprodukt ein Peptid mit einer Massendifferenz von zusätzlich

362 Da erhalten wird. Bei Verwendung der Dcpm geschützten Aminosäure Glycin, sowohl

als einzelne Aminosäure als auch integriert im Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-

(Dcpm)Gly-OH, konnte diese Nebenreaktion während der Biotinylierung verhindert werden.

Das gewünschte nur am N-Terminus mit Biotin markierte Peptid konnte unter diesen

Bedingungen als Produkt erhalten werden.

Die bereits beschriebene Säurelabilität der Dcpm-Gruppe beeinträchtigte die Aufreinigung

unter Standardbedingungen mit Eluenten, die Trifluoressigsäure als Zusatz enthalten.

Während des Lyophilisierens des gereinigten Produktes kam es zur teilweisen Abspaltung der

Dcpm-Gruppe durch die Aufkonzentration der TFA im Lyophilisat. Deshalb führten wir die

Aufreinigung des Dipeptidbausteins und auch der drei Dcpm geschützten Aminosäuren

Glycin, Alanin und Leucin unter Verwendung eines 0.025 M Ammoniumacetat-Puffer an

Stelle der normalerweise verwendeten 0.2 % TFA als Zusatz der Eluenten durch (A: 0.025 M

Ammoniumacetat in H2O : MeCN 1000 ml : 350 ml; B: MeCN). Es wurde ein

Ammoniumacetat-Puffer-System auch deshalb gewählt, da es durch wiederholtes

Lyophilisieren vollständig entfernt werden kann.

Der neue Synthesebaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH stellt eine gute Alternative zu

den käuflichen Dipeptiden Fmoc-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH und Fmoc-Asp(OtBu)-

(Dmb)Gly-OH (Novabiochem, Merck Biosciences und NeoMPS) dar. Auch wenn durch die

Verwendung der Dmb an Stelle der Hmb-Gruppe die Problematik der ungewollten

Acylierung der Seitenkettenschutzgruppe verhindert wird, so sind für die Abspaltung der

Dmb-Gruppe dennoch sehr viel harschere Bedingungen wie beispielsweise die Verwendung

von starken Säuren und längeren Reaktionszeiten nötig [112]. Hier lässt sich Fmoc-

Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH vorteilhaft einsetzen, da zur Abspaltung der Dcpm Gruppierung

vergleichsweise milde Bedingungen erforderlich sind. Es konnte am Beispiel von Fmoc-

(Dcpm)Gly-OH gezeigt werden, dass sich die Dcpm-Gruppe bereits unter sehr schwach

- 123 -

sauren Bedingungen von beispielsweise 5 % TFA in Chloroform abspalten lässt, was durch

NMR Messungen bestätigt werden konnte [19,101]. Der Zerfall der Dcpm-Gruppe unter

diesen Bedingungen zu weitgehend unreaktiven Molekülen stellt einen weiteren Vorteil der

Dcpm-Gruppe dar. Es wird eine Kontamination des synthetisierten Peptids während der

Abspaltung vom Harz mit Resten dieser Schutzgruppe vermieden. Abschließend lässt sich

feststellen, dass der neue Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH bei der

Synthese von Peptiden, welche das Sequenzmotiv Asp-Gly enthalten, ein wirkungsvolles

Werkzeug darstellt [137]. Dieser Dipeptidbaustein vermeidet die Aspartimidbildung und

umgeht Nebenreaktionen, wie ungewünschte Acylierung der phenolischen OH-Gruppe, die

beim Einsatz der Hmb-Gruppe auftreten können.

6.3.5 Einfluss der Seitenketten auf das cis/trans-Verhältnis der Peptidbindung beim neuen Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH

In den NMR Spektren (1H NMR Abbildung 63, 2D NMR siehe Supporting Information von

[19]) des neuen Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH sind zwei komplette

Signalsätze für alle Protonen zu finden (Tabelle 5). Diese beruhen auf der cis/trans-Isomerie

der Peptidbindung. Das Verhältnis zwischen dem thermodynamisch stabileren trans-Isomer

und dem cis-Isomer liegt gemessen bei 298 K in CDCl3 als Lösungsmittel bei 65:35. Neben

dem sterischen Einfluss der Schutzgruppen beeinflussen auch die Aminosäureseitenketten das

Verhältnis zwischen cis- und trans-Isomer, wie bei den drei Dcpm geschützten Aminosäuren

Glycin, Alanin und Leucin beobachtet werden konnte [19]. In Tabelle 17 sind die

Verhältnisse der Isomere der drei Aminosäuren sowie die Verteilung bei zwei verschiedenen

Lösungsmitteln für den neuen Dipeptidbaustein Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH

wiedergegeben. Hierbei ist auch zu erkennen, dass die cis/trans-Isomerie unter anderem vom

gewählten Lösungsmittel abhängig ist.

- 124 -

Verbindung Trans cis Lösungsmittel Fmoc-(Dcpm)Gly-OH 65 % 35 % CDCl3 Fmoc-(Dcpm)Ala-OH 75 % 25 % CDCl3 Fmoc-(Dcpm)Leu-OH 95 % 5 % CDCl3

Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH 65 % 35 % CDCl3 Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH 55 % 45 % CD3CN

Tabelle 17: Verhältnisse der cis- und trans-Konformere beruhend auf der gehinderten Rotation um das tertiäre

Stickstoffatom der Amin bzw. Amidfunktion; bestimmt mittels 1H NMR Spektroskopie [19]

Abbildung 96: Schematische Darstellung des cis- 8 und trans-Isomer 9 des neuen Dipeptidbaustein Fmoc-

Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH

Die äquivalenten Protonen der beiden Cyclopropylringe vom cis-Isomer 8 zeigen identische

chemische Verschiebungen im Gegensatz zu den Cyclopropylringen des trans-Isomer 9

(Tabelle 5 und 18; Abbildung 96). Hier wird die Möglichkeit zur freien Rotation der Dcpm-

Gruppe durch die geschützte Seitenkette der Asparaginsäure behindert. Durch

Temperaturerhöhung konnte ein „Shiften“ der chemischen Verschiebungen für beide Isomere

beobachtet werden. Jedoch wurde bei Messungen bis zu 70 °C der Koaleszenzpunkt nicht

erreicht, an dem nur noch ein kompletter Signalsatz für das thermodynamisch stabilste Isomer

zu erkennen wäre. In Tabelle 18 ist abschließend der Einfluss der Aminosäureseitenketten auf

die Signalsätze der Cyclopropylringe der Dcpm-Gruppe zusammengefasst.

Verbindung Signalsätze für

Cyclopropylringe beim trans-Isomer

Signalsätze für Cyclopropylringe beim

cis-Isomer Fmoc-(Dcpm)Gly-OH verschieden gleich Fmoc-(Dcpm)Ala-OH verschieden verschieden Fmoc-(Dcpm)Leu-OH verschieden n.z. (Anteil unter 5 %)

Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH verschieden gleich

Tabelle 18: Übersicht zur chemischen Verschiebung der beiden Cyclopropylringe der Dcpm geschützten

Verbindungen zum Einfluss der Aminosäureseitenketten auf die cis/trans-Isomerie

N

O

OH

8

O O

HN

O

O

CH3H3C

H3C

O

N

9

O

HN

OO

CH3

H3C CH3

O

OOH

O

- 125 -

7 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

Ac - Acetyl

Acm - Acetamidomethyl

AcHmb - 2-Acetoxy-4-methoxybenzyl

Ac2O - Essigsäureanhydrid

AcOH - Essigsäure

ACP - Acyl Carrier Protein

Boc - tert-Butyloxycarbonyl

br s - breites Singulett

Bu - Butyl

BSA - N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid

Cbz - Carbobenzyloxy

CD - Circularer Dichroismus

CHCA - α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure

d - Dublett

Da - Dalton

DBU - 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en

DCM - Dichlormethan

Dcpm - Dicylcopropylmethyl

DEPT - Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DIC / DIPCDI - Diisopropylcarbodiimid

DIEA / DIPEA - Diisopropylethylamin

Dmab - 4-{N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)-3-

methylbutyl]amino}benzyl

Dmb - 2,4-Dimethoxybenzyl

Dmmb - 4,5-Dimethoxy-2-mercaptobenzyl

E - Energie in kJ/mol

EA - Elementaranalyse

EDOTn - 3,4-Ethylendioxy-2-thenyl

EIAV - Equine Infectious Anemia Virus (Virus der infektiösen Anämie der

Einhufer)

EPL - Expressed Protein Ligation

eq - Äquivalent

- 126 -

ESI - Electrospray Ionization

Et - Ethyl

Et2O - Diethylether

Fmoc - 9-Fluorenylmethoxycarbonyl

h - Stunde

HATU - N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-

N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxid

HBTU - N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-

methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxid

H2O - Wasser

HIV - Humanes Immundefizienzvirus

Hmb - 2-Hydroxy-4-methoxybenzyl

HMPB - 4-(4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy)butyryl

HOBt - 1-Hydroxybenzotriazol

Hrsg - Herausgeber

Hz - Hertz

IAV - Influenza A Virus

iPr - Isopropyl

J - Kopplungskonstante in Hz

m - Multiplett

M - molar [mol*l-1]

MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization

mCPBA - meta-Chlorperbenzoesäure

Me - Methyl

MeCN - Acetonitril

MESNa - Natriumsalz der 2-Mercaptoethansulfonsäure

MIM - 1-Methyl-3-indolylmethyl

min - Minute

mp - Schmelzpunkt

MS - Massenspektroskopie

MsCl - Methansulfonsäurechlorid (CH3SO2Cl)

NCL - Native Chemical Ligation

NMP - N-Methylpyrrolidon

NMR - Nuclear Magnetic Resonance

- 127 -

NOESY - Nuclear Overhauser and Exchange Spectroscopy

n.z. - nicht zugeordnet

OAt - O-(7-azabenzotriazol-1-yl)

OSu - N-hydroxysuccinimide

OtBu - tert-Butylester

PEG - Polyethylenglycol

PFT - Puls-Fourier-Transform

ppm - parts per million

PS - Polystyrol

q - Quartett

Reagent K - 82.5 % TFA + 5 % Phenol + 5 % H2O + 5 % Thioanisol + 2.5 %

Ethandithiol

r.m.s. - root mean square:

r.m.s. deviation (mittlere quadratische Abweichung /

Standardabweichung)

r.m.s. differences (mittlere quadratische Unterschiede)

RP-HPLC - Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography

RT - Raumtemperatur

Rt - Retentionszeit

SPPS - Solid Phase Peptide Synthesis (Festphasenpeptidsynthese)

SPCL - Solid Phase Chemical Ligation (NCL an der festen Phase)

s - Singulett

t - Triplett

T - Temperatur

tBu - tert-Butyl

TCEP - Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin

tert - tertiär

TFA - Trifluoressigsäure

TFE - Trifluorethanol

THF - Tetrahydrofuran

TIPS - Triisopropylsilan

Tmb - 4,5,6,-Trimethoxy-2-mercaptobenzyl

Tmob - 2,4,6-Trimethoxybenzyl

TMSCl - Trimethylsilylchlorid

- 128 -

TOCSY - Total Correlation Spectroscopy

Trt - Trityl (Triphenylmethyl)

UPLC - Ultra Performance Liquid Chromatography

UV - Ultraviolett

v/v - Volumenverhältnisse zueinander

W - Watt

Xxx - Abkürzung für eine beliebige Aminosäure im Dreibuchstabencode

Å - Angström (1Å = 10-10 m)

δ - chemische Verschiebung in ppm

ρ - Dichte in g*cm-3

Die chiralen Aminosäuren wurden in Anlehnung an die Empfehlungen der IUPAC-IUB

Kommission der Biochemischen Nomenklatur bezeichnet [138]. Die Aminosäuren wurden

dabei durch den Ein- bzw. Dreibuchstabencode abgekürzt und sofern nicht anders angegeben

beziehen sich die Angaben jeweils auf das L-Isomer.

- 129 -

8 Literaturverzeichnis

[1.] Chen W., Calvo P.A., Malide D., Gibbs J., Schubert U., Bacik I., Basta S., O’Neill

R., Schickli J., Palese P., Henklein P., Bennink J.R., Yewdell J.W. Nat. Med.

2001, 7, 1306-1312.

[2.] Reid A.H., Fanning T.G., Hultin J.V., Taubenberger J.K. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 1999, 96, 1651-1656.

[3.] Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P., Zhang L., Liu Z., Webster R.G.,

Yu K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 10452-10457.

[4.] Adachi A., Gendelman H.E., Koenig S., Folks T., Willey R., Rabson A., Martin

M.A. J. Virol. 1986, 59, 284-291.

[5.] Khurana S., Needham J., Park S., Mathieson B., Busch M.P., Nemo G., Nyambi

P., Zolla-Pazner S., Laal S., Mulenga J., Chomba E., Hunter E., Allen S., McIntyre

J., Hewlett I., Lee S., Tang S., Cowan E., Beyrer C., Altfeld M., Yu X.G.,

Tounkara A., Koita O., Kamali A., Nguyen N., Graham B.S., Todd D., Mugenyi

P., Anzala O., Sanders E., Ketter N., Fast P., Golding H. J. Acquir. Immune Defic.

Syndr. 2006, 43, 304-312.

[6.] Stephens R.M., Casey J.W., Rice N.R. Science 1986, 231, 589-594.

[7.] Chen C., Li F. Montelaro R.C. J. Virol. 2001, 75, 9762-9770.

[8.] Henklein P., Bruns K., Sherman M.P., Tessmer U., Licha K., Kopp J., de Noronha

C.M.C., Greene W.C., Wray V., Schubert U. J. Biol. Chem. 2000, 275, 32016-

32026.

[9.] Bruns K., Studtrucker N., Sharma A., Fossen T., Mitzner D., Eissmann A.,

Tessmer U., Röder R., Henklein P., Wray V., Schubert U. J. Biol. Chem. 2007,

282, 353-363.

[10.] Johnson T., Quibell M., Owen D., Sheppard R.C. J. Chem. Soc. Chem. Commun.

1993, 4, 369-372.

[11.] Quibell M., Owen D., Packman L.C., Johnson T. J. Chem. Soc. Chem. Commun.

1994, 20, 2343-2344.

[12.] Johnson T., Quibell M., Sheppard R.C. J. Pept. Sci. 1995, 1, 11-25.

[13.] Zahariev S., Guarnaccia C., Zanuttin F., Pintar A., Esposito G., Maravić G., Krust

B., Hovanessian A.G., Pongor S. J. Pept. Sci. 2005, 11, 17-28.

- 130 -

[14.] Carpino L.A., Chao H.G., Ghassemi S., Mansour E.M.E., Riemer C., Warrass R.,

Sadat-Aalaee D., Truran G.A., Imazumi H., El-Faham A., Ionescu D., Ismail M.,

Kowaleski T.L., Han C.H., Wenschuh H., Beyermann M., Bienert M., Shroff H.,

Albericio F., Triolo S.A., Sole N.A., Kates S.A. J. Org. Chem. 1995, 60, 7718-

7719.

[15.] Carpino L.A., Nasr K., Abdel-Maksoud A.A., El-Faham A., Ionescu D., Henklein

P., Wenschuh H., Beyermann M., Krause E., Bienert M., Org. Lett. 2009, 11,

3718-3721.

[16.] Merck Biosciences, Novabiochem Innovations 1/03 im Internet

http://www.merckbiosciences.co.uk/html/NBC/home.html

[17.] Merck Biosciences, Novabiochem Letters 03/05 im Internet


[18.] Merck Biosciences, Novabiochem Letters 01/07 im Internet


[19.] Röder R., Henklein P., Weißhoff H., Mügge C., Pätzel M., Schubert U., Carpino

L.A., Henklein P. Journal of Peptide Science, 2010, 16, 65-70.

[20.] Jakubke H.-D. Peptide – Chemie und Biologie. 1996, Spektrum Akademischer

Verlag. Berlin. (und dort zitierte Literatur)

[21.] Kosfeld M., Heinrichs M., Zak P.J., Fischbacher U., Fehr E. Nature Letters 2005,

435, 673-676.

[22.] Beranova M., Oliveira L.M.B., Bédécarrats G.Y., Schipani E., Vallejo M.,

Ammini A.C., Quintos J.B., Hall J.E., Martin K.A., Hayes F.J., Pitteloud N.,

Kaiser U.B., Crowley Jr. W.F., Seminara S.B. The Journal of Clinical

Endocrinology & Metabolism 2001, 86, 1580-1588.

[23.] Takahashi Y., Kato K., Hayashizaki Y., Wakabayashi T., Ohtsuka E., Matsuki S.,

Ikehara M., Matsubara K. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 1931-1935.

[24.] Merrifield R.B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154.

[25.] Lindsay S. Einführung in die HPLC. 1996, Verlag Vieweg.

Braunschweig/Wiesbaden.

Und siehe Hersteller im Internet unter http://www.alphachrom.com

[26.] Pillai V.N.R. und Mutter M. Acc. Chem. Res. 1981, 14, 122-130.

[27.] Sewald N. und Jakubke H.-D. Peptids: Chemistry and Biology. 2002, Wiley-VCH

Verlag GmbH. Weinheim. (und dort zitierte Literatur)

[28.] Haack T. und Mutter M. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 1589-1592.

- 131 -

[29.] Wöhr T., Wahl F., Nefzi A., Rohweder B., Sato T., Sun X., Mutter M. J. Am.

Chem. Soc. 1996, 118, 9218-9227.

[30.] Toniolo C., Borona G.M., Mutter M., Pillai V.N.R. Makromol. Chem. 1981, 182,

2007-2014.

[31.] Atherton E. und Sheppard R.C. Solid Phase Peptide Synthesis – A Practical

Approach. 1989, Oxford University Press. Oxford. (und dort zitierte Literatur)

[32.] Chan W.C. und White P.D. Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis – A Practical

Approach. 2000, Oxford University Press. New York (und dort zitierte Literatur)

[33.] Schölzer M. und Kent S.B.H. Science 1992, 256, 221-225.

[34.] Dawson P.E., Muir T.W., Clark-Lewis I., Kent S.B.H. Science 1994, 266, 776-

779.

[35.] Dawson P.E. und Kent S.B.H. Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 923-960.

[36.] Wieland T., Bokelmann E., Bauer L., Lang H.U., Lau H. Liebigs Annalen der

Chemie 1953, 583, 129-149.

[37.] Johnson E.C.B. und Kent S.B.H. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 6640-6646.

[38.] Macmillan D. Angew. Chem. 2006, 118, 7830-7834.

[39.] David R., Richter M.P.O., Beck-Sickinger A.G. Eur. J. Biochem. 2004, 271, 663-

677.

[40.] Tam J.P., Lu Y.A., Liu C.F., Shao J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92, 12485-

12489.

[41.] Tam J.P., Xu J., Eom K.D. Biopolymers (Peptide Science) 2001, 60, 194-205.

[42.] Canne L.E., Bark S.J., Kent S.B.H. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 5891-5896.

[43.] Hackeng T.M., Griffin J.H., Dawson P.E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96,

10068-10073.

[44.] Botti P., Carrasco M.R., Kent S.B.H. Tetrahedron Lett. 2001, 42, 1831-1833.

[45.] Offer J., Boddy C.N.C., Dawson P.E. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 4642-4646.

[46.] Kawakami T., Akaji K., Aimoto S. Org. Lett. 2001, 3, 1403-1405.

[47.] Offer J. und Dawson P.E., Org. Lett. 2000, 2, 23-26.

[48.] Wu B., Chen J., Warren J.D., Chen G., Hua Z., Danishefsky S.J. Angew. Chem.

2006, 118, 4222-4231.

[49.] Burns J.A., Butler J.C., Moran J., Whitesides G.M. J. Org. Chem. 1991, 56, 2648-

2650.

[50.] Dawson P.E., Churchill M., Ghadiri M.R., Kent S.B.H. J. Am. Chem. Soc. 1997,

119, 4325-4329.

- 132 -

[51.] Alsina J., Yokum T.S., Albericio F., Barany G. J. Org. Chem. 1999, 64, 8761-

8769.

[52.] Backes B.J., Virgilio A.A., Ellman J.A. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 3055-3056.

[53.] James I.W. Tetrahedron 1999, 55, 4855-4946.

[54.] Jensen K.J., Alsina J., Songster M.F., Vágner J., Albericio F., Barany G. J. Am.

Chem. Soc. 1998, 120, 5441-5452.

[55.] Alsina J., Jensen K.J., Albericio F., Barany G. Chem. Eur. J. 1999, 5, 2787-2795.

[56.] Kenner G.W., McDermott J.R., Sheppard R.C. J. Chem. Soc. Chem. Commun.

1971, 12, 636-637.

[57.] Shin Y., Winans K.A., Backers B.J., Kent S.B.H., Ellman J.A., Bertozzi C.R. J.

Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11684-11689.

[58.] Ingenito R., Bianchi E., Fattori D., Pessi A. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11369-

11374.

[59.] von Eggelkraut-Gottanka R, Klose A, Beck-Sickinger A.G., Beyermann M.

Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3551-3554.

[60.] Futaki S., Sogowa K., Maruyama J., Asahara T., Niwa M. Tetrahedron Lett. 1997,

38, 6237-6240.

[61.] Bang D., Pentelute B.L., Gates Z.P., Kent S.B.H. Org. Lett. 2006, 8, 1049-1052.

[62.] Yan L.Z. und Dawson P.E. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 526-533.

[63.] Tam J.P. und Yu Q. Biopolymers (Peptide Science) 1998, 46, 319-327.

[64.] Crich D. und Banerjee A. J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 10064-10065.

[65.] Easton C.J., Hutton C.A., Roselt P.D., Tiekink E.R.T. Tetrahedron 1994, 50,

7327-7340.

[66.] Crich D. und Banerjee A. J. Org. Chem. 2006, 71, 7106-7109.

[67.] Furukawa N., Morishita T., Akasaka T., Oae S. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2

1980, 432-440.

[68.] Back T.G., Baron D.L., Yang K. J. Org. Chem. 1993, 58, 2407-2413.

[69.] Li X., Zhang L., Hall S.E., Tam J.P. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 4069-4073.

[70.] Zhang L. und Tam J.P. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 3-6.

[71.] Canne L.E., Botti P., Simon R.J., Chen Y., Dennis A.E., Kent S.B.H. J. Am. Chem.

Soc. 1999, 121, 8720-8727.

[72.] Tam J.P. und Miao Z. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 9013-9022.

[73.] Liu C.-F., Rao C., Tam J.P. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 307-312.

[74.] Tam J.P., Yu Q., Lu Y.-A. Biologicals 2001, 29, 189-196.

- 133 -

[75.] Miao Z. und Tam J.P. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 4253-4260.

[76.] Eom K.D., Miao Z., Yang J.-L., Tam J.P. J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 73-82.

[77.] Spetzler J.C., Hoeg-Jensen T. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 4700-4704.

[78.] Hondal R.J., Nilsson B.L., Raines R.T. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 5140-5141.

[79.] Roelfes G., Hilvert D. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 2275-2277.

[80.] Muir T.W., Sondhi D., Cole P.A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 6705-6710.

[81.] Hofmann R.M. und Muir T.W. Curr. Opin. Biotechnol. 2002, 13, 297-303.

[82.] Severinov K. und Muir T.W. J. Biol. Chem. 1998, 273, 16205-16209.

[83.] Muir T.W. Annu. Rev. Biochem. 2003, 72, 249-289.

[84.] Haase C. und Seitz O. Angew. Chem. 2008, 120, 1575-1579.

[85.] Lauer J.L., Fields C.G., Fields G.B. Lett. Pept. Sci. 1994, 1, 197-205.

[86.] Mergeler M., Dick F., Sax B., Weiler P., Vorherr T. J. Pept. Sci. 2003, 9, 36-46.

[87.] Mergeler M., Dick F., Sax B., Stähelin C., Vorherr T. J. Pept. Sci. 2003, 9, 518-

526.

[88.] Mergeler M. und Dick F. J. Pept. Sci. 2005, 11, 650-657.

[89.] Dölling R., Beyermann M., Haenel J., Kernchen F., Krause E., Franke P., Brudel

M., Bienert M. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994, 7, 853-854.

[90.] Heinklein P., Bruns K., Nimtz M., Wray V., Tessmer U., Schubert U. J. Pept. Sci.

2005, 11, 481-490.

[91.] Packman L.C. Tetrahedron Lett. 1995; 36, 7523-7526.

[92.] Sampson W.R., Patsiouras H., Ede N.J. J. Pept. Sci. 1999, 5, 403-409.

[93.] Kent S.B.H. Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 957-989.

[94.] Redemann T., Jung G. Peptids 1996 Proceedings of the 24th European Peptide

Symposium; Hrsg.: Ramage R., Epton R. Mayflower Scientific Ltd. UK 1998, 749.

[95.] Milton S.C.F., Milton R.C.D., Kates S.A., Glabe C. Lett. Peptide Sci. 1999, 6,

151-156.

[96.] Sohma Y., Yoshiya T., Tanguchi A., Kimura T., Havashi Y., Kiso Y. Biopolymers

(Peptide Science) 2007, 88, 253-262.

[97.] Hancock W.S., Prescott D.J., Vagelos P.R., Marshall C.R. J. Org. Chem. 1973, 38,

774-781.

[98.] Kent S.B.H. Proceedings of the 9th American Peptide Symposium; Hrsg.: Deber

C.M., Hruby V.J., Kopple K.D. Pierce Chemical Co. Rockford IL 1985, 407.

[99.] Hyde C., Johnson T., Sheppard R.C. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1992, 21,

1573-1575.

- 134 -

[100.] Meldal M. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 3077-3080.

[101.] Henklein P., Röder R., Weißhoff H., Henklein P., Carpino L.A. Poster Nr. 489 bei

20th American Peptidsymposium Montreal, Kanada 2007 „The Dcpm protecting

group is a useful alternative to the Hmb residue” Biopolymers (Peptide Science)

2007, 88, 636. und Proceedings of the 20th American Peptidsymposium Montreal,

Kanada Adv. Exp. Med. Biol. 2009, 611, 247-248.

[102.] Weygand F., Steglich W., Bjarnason J., Akhtar R., Khan M. Tetrahedron Lett.

1966, 29, 3482-3487.

[103.] Quibell M., Turnell W.G., Johnson T. Tetrahedron Lett. 1994, 35, 2237-2238.

[104.] Johnson T., Packman L.C., Hyde C.B., Owen D., Quibell M. J. Chem. Soc., Perkin

Trans. 1 1996, 719-727.

[105.] Quibell M., Turnell W.G., Johnson T. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1995, 2019-

2024.

[106.] Quibell M. Packman L.C., Johnson T. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 11656-11668.

[107.] Quibell M. Packman L.C., Johnson T. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1996, 1227-

1234.

[108.] Zahariev S., Guarnaccia C., Pongor C.I., Quaroni L., Čemažar M., Pongor S.

Tetrahedron Lett. 2006; 47, 4121-4124.

[109.] Merck Biosciences, Novabiochem Innovations 1/08 im Internet


[110.] Clausen N., Goldammer C., Jauch K., Bayer E. Hrsg: Kaumaya P.T.P. und Hodges

R.S. Peptids: Chemistry, Structure and Biology, Mayflower Scientific Ltd.

Kingswinford UK 1996, 71-72.

[111.] Munson M.C., Carcia-Echeverria C., Albericio F. Barany G. J. Org. Chem. 1992,

57, 3013-3018.

[112.] Isidro-Llobet A, Just-Baringo X, Álvarez M, Albericio F. Biopolymers 2008, 90,

444-449.

[113.] Pearson D.A., Blanchette M., Baker M.L., Guindon C.A. Tetrahedron Lett. 1989,

30, 2739-2742.

[114.] Mehta A., Jaouhari R., Benson T.J., Douglas K.T. Tetrahedron Lett. 1992, 33,

5441-5444.

[115.] Ruczyński J., Lewandowska B., Mucha P., Rekowski P. J. Pept. Sci. 2008, 14,

335-341.

- 135 -

[116.] Kurono M., Kondo Y., Matsumoto Y., Sawai K., United States Patent, Date of

Patent 5th May 1992, Patent Number 5, 110, 945.

[117.] Kurono et al. Chem. Abstr. 1992, 117, 111466.

[118.] Messe M., Meier H., Zeh B. Spektroskopische Methoden in der organischen

Chemie 5. Auflage 1995 Georg Thieme Verlag Stuttgart. (und dort zitierte

Literatur)

[119.] Braun S., Kalinowski H.-O., Berger S. 100 and More Basic NMR Experiments – A

Practical Course. 1996 VCH Weinheim. (und dort zitierte Literatur)

[120.] Bruns K. unveröffentlichte Ergebnisse

[121.] Wüthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. 1986, John Wiley & Sons, Inc.

New York. (und dort zitierte Literatur)

[122.] Neidig K.P., Kalbitzer H.R. J. Magn. Reson. 1990, 88, 155-160.

[123.] Brunger A.T., Adams P.D., Clore G.M., DeLano W.L., Gros P., Grosse-Kunstleve

R.W., Jiang J.S., Kuszewski J., Nilges M., Pannu N.S., Read R.J., Rice L.M.,

Simonson T., Warren G.L. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 1998, 54,

905-921.

[124.] Turner und Summers, 1999, Uppsala Software Factory im Internet

http://xray.bmc.uu.se/usf/

[125.] Kleywegt G.J. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 1996, 52, 842-857.

[126.] DeLano W.L. 2002, The PyMOL Molecular Graphics System im Internet

http://www.pymol.org

[127.] Bruns K., Fossen T., Wray V., Henklein P., Tessmer U., Schubert U. J. Biol.

Chem. 2003, 278, 43188-43201.

[128.] Fossen T., Wray V., Bruns K., Rachmat J., Henklein P., Tessmer U., Maczurek A.,

Klinger P., Schubert U. J. Biol. Chem. 2005, 280, 42515-42527.

[129.] García-Martín F., Quintanar-Audelo M., García-Ramos Y., Cruz L.J., Gravel C.,

Furic R., Côté S., Tulla-Puche J., Albericio F. J. Comb. Chem. 2006, 8, 213-220.

[130.] Röder R., Bruns K., Sharma A., Eissmann A., Hahn F., Studtrucker N., Fossen T.,

Wray V., Henklein P., Schubert U. J. Pept. Sci. 2008, 14, 954-962.

[131.] Henklein P. et al. unveröffentlichte Ergebnisse

[132.] Kaiser E., Colescott R.L., Bossinger C.D., Cook P.I. Analyt. Biochem. 1970, 34,

595-598.

[133.] Sharma A., Bruns K., Röder R., Henklein P., Votteler J., Wray V. and Schubert U.

Solution structure of the Equine Infectious Anemia Virus p9 protein: a

- 136 -

rationalization of its different ALIX binding requirements compared to the

analogous HIV-p6 protein. BMC Structural Biology. 2009, 9:74.

[134.] Buck M. Q. Rev. Biophys. 1998, 31, 297-355.

[135.] Wishart D.S., Sykes B.D., Richards F.M. Biochemistry 1992, 31, 1647-1651.

[136.] Blankfeldt W., Nokihara K., Naruse S., Lessel U., Schomburg D., Wray V.

Biochemistry 1996, 35, 5955-5962.

[137.] Röder R., Weißhoff H., Henklein P., Carpino L.A., Henklein P. Poster bei 17th

Peptids, Chemistry & Biology of, Gordon Research Conferences Ventura, USA

2008 „Fmoc-Asp(OtBu)-(Dcpm)Gly-OH a new building block for peptide

synthesis“.

[138.] IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) Eur. J.

Biochem. 1984, 138, 9-37.

- 137 -

9 Danksagung

Besonders bedanken möchte ich mich bei Dr. Peter Henklein dafür, dass ich einen Großteil

meiner Dissertationszeit in seinem Labor im Institut für Biochemie der Charité

Universitätsmedizin-Berlin arbeiten durfte, sowie für die zahlreichen konstruktiven

Diskussionen bei Fachproblemen und die sehr gute Betreuung. Ebenfalls möchte ich mich bei

Barbara Brecht-Jachan, Prisca Kunert, Manuela Dierenfeld und Dr. Petra Henklein für die

sehr gute Zusammenarbeit im Labor und die stete Hilfsbereitschaft bedanken.

Ich möchte mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Ulrich Schubert für die Aufnahme in

seinen Arbeitskreis, die spannende und interessante Themenstellung und die sehr gute

Betreuung bedanken. Außerdem bedanke ich mich bei allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe

von Prof. Schubert in der Virologie der Universität Erlangen-Nürnberg.

Ebenfalls möchte ich mich bei Prof. Dr. Andreas Hirsch für die Übernahme des

Erstgutachtens für meine Arbeit bedanken.

Mein Dank gilt auch Dr. Victor Wray vom Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung in

Braunschweig für die vielen hilfreichen Ratschläge bei Fachproblemen sowie Karsten Bruns

und Dr. Alok Sharma für die tatkräftige Unterstützung bei der Auswertung der

zweidimensionalen NMR-Spektren der Peptide und der anschließenden Berechnung der

Peptidstrukturen.

Ebenso bedanke ich mich bei Prof. Dr. Stefan Hecht für die Möglichkeit zur Durchführung

von diversen chemischen Synthesearbeiten in seinem Labor im Institut für Organische

Chemie der Humboldt Universität zu Berlin und Dr. Michael Pätzel für seine Unterstützung

vor Ort während dieser Zeit und Dr. Joachim Leistner für die UPLC und HR-MS Messungen.

Ich bedanke mich auch bei Dr. Hardy Weißhoff vom Institut für Chemie der Humboldt

Universität zu Berlin für die hilfreichen Diskussionen und die Unterstützung bei der

Auswertung der NMR-Spektren der Dcpm-Aminosäurebausteine.

Mein ganz besonderer Dank gebührt meiner Frau Sandra und meiner Familie, die mich immer

gefördert und in jeder erdenklichen Art unterstützt haben. Die Geburt meiner Tochter

Séraphie Joelie während meiner Dissertationszeit war dabei eine Bereicherung meines Lebens

in besonderem Maße. Meinen Eltern möchte nochmals für ihre Hilfe und Aufmunterung

danken, ohne die diese Arbeit niemals möglich gewesen wäre.

- 138 -

10 Curiculum Vitae

Name: Röder

Vorname: René

Geburtsdatum: 11. Mai 1979

Geburtsort: Berlin – Lichtenberg

Familienstand: verheiratet

Kinder: eine Tochter

09/1985 bis 08/1991 Grundschule in Berlin – Prenzlauer Berg

09/1991 bis 07/1995 Heinrich-Schliemann-Oberschule (Gymnasium) in Berlin

08/1995 bis 06/1998 Alexander-von-Humboldt-Oberschule (Gymnasium) in Berlin

07/1998 bis 04/1999 Grundwehrdienst; 2. Kompanie des Panzergrenadierbatallion 72 in

Hamburg – Harburg

10/1999 bis 10/2005 Studium der Chemie an der Technischen Universität Berlin

Diplomarbeit in Organsicher Chemie unter Betreuung von Prof. Dr.

Karola Rück-Braun

Titel: „Darstellung von Heterocyclen ausgehend von Nitronen“

Note der Diplomarbeit: sehr gut (1,0)

seit 11/2005 Promotion unter Betreuung von Prof. Dr. Ulrich Schubert an der

Universität Erlangen-Nürnberg in Zusammenarbeit mit Dr. Peter

Henklein vom Institut für Biochemie von der Charité

Universitätsmedizin-Berlin und Dr. Victor Wray vom Helmholtz-

Zentrum für Infektionsforschung in Braunschweig

- 139 -

11 Publikationen

1. Karsten Bruns, Nicole Studtrucker, Alok Sharma, Torgils Fossen, David Mitzner,

André Eissmann, Uwe Tessmer, René Röder, Peter Henklein, Victor Wray and Ulrich

Schubert. Structural Characterization and Oligomerization of PB1-F2, a Proapoptotic

Influenza A Virus Protein. Journal of Biological Chemistry, 2007, 282, 353-363.

2. René Röder, Karsten Bruns, Alok Sharma, André Eissmann, Friedrich Hahn, Nicole

Studtrucker, Torgils Fossen, Victor Wray, Peter Henklein, and Ulrich Schubert.

Synthesis of full-length PB1-F2 influenza A virus proteins from “Spanish flu” and

“bird flu”. Journal of Peptide Science, 2008, 14, 954-962.

3. Petra Henklein, René Röder, Hardy Weißhoff, Peter Henklein and Louis A. Carpino.

The Dcpm protecting group is a useful alternative to the Hmb residue. Advances in

Experimental Medicine and Biology, 2009, 611, 247-248.

4. Alok Sharma, Karsten Bruns, René Röder, Peter Henklein, Jörg Votteler, Victor Wray

and Ulrich Schubert. Solution structure of the Equine Infectious Anemia Virus p9

protein: a rationalization of its different ALIX binding requirements compared to the

analogous HIV-p6 protein. BMC Structural Biology, 2009, 9: 74.

5. René Röder, Petra Henklein, Hardy Weißhoff, Clemens Mügge, Michael Pätzel,

Ulrich Schubert, Louis A. Carpino and Peter Henklein. On the use of N-

dicyclopropylmethyl aspartyl-glycine synthone for backbone amide protection.

Journal of Peptide Science, 2010, 16, 65-70.

- 140 -

12 Eidesstattliche Erklärung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom November 2005 bis Dezember 2008. im

Institut für Biochemie der Charité Universitätsmedizin-Berlin, im Institut für Organische

Chemie der Humboldt Universität zu Berlin und am Helmholtz-Zentrum für

Infektionsforschung in Braunschweig angefertigt.

Hiermit erkläre ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und nur

unter Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel angefertigt habe.

Weder diese noch eine andere Arbeit wurde von mir an einer anderen Universität oder

Hochschule zum Zwecke der Einleitung eines Promotionsverfahrens vorgelegt.

René Röder

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