Tierärztliche Hochschule Hannover Beurteilung von ......Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine...

Tierärztliche Hochschule Hannover

Beurteilung von Immunglobulin A und Tau-Protein

im kaninen Liquor cerebrospinalis als diagnostische Hilfsmittel

in der klinischen Neurologie

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

- Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Andrea Rörig

Remscheid

Hannover 2012

Wissenschaftliche Betreuung:

1. PD Dr. med. vet. Veronika Stein, PhD, Klinik für Kleintiere

2. Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold, Klinik für Kleintiere

1. Gutachter: PD Dr. med. vet. Veronika Stein, PhD

2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Marion Hewicker-Trautwein

Tag der mündlichen Prüfung: 5. November 2012

Meinen ElternMeinen ElternMeinen ElternMeinen Eltern

Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt: Rörig, A., Maiolini, A., Carlson, R., Tipold, A.:

Evaluierung eines „microsphere-based immunfluorescence assay“ zur Bestimmung von IgA im Liquor cerebrospinalis und Serum des Hundes 20. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Laboratoriumsdiagnostik“, Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, e.V. (DVG), Gießen, 03.02.-04.02.2012

Rörig, A., Carlson, R., Tipold, A., Stein, V.M.:

Cerebrospinal fluid tau protein as a prognostic biomarker for recovery in canine intervertebral disk disease 25th

Annual Symposium of the European Society (ESVN) and European College (ECVN) of Veterinary Neurology, “Epilepsy”

Ghent, Belgien, 14.09.-15.09.2012 Rörig, A., Carlson, R., Tipold, A.:

Evaluation of a microsphere-based immunofluorescence assay for the determination of immunoglobulin A concentrations in cerebrospinal fluid of dogs 25th

Annual Symposium of the European Society (ESVN) and European College (ECVN) of Veterinary Neurology, “Epilepsy”

Ghent, Belgien, 14.09.-15.09.2012

INHALTSVERZEICHNIS

1. EINLEITUNG UND LITERATURÜBERSICHT.................. .................................. 7

2. MATERIAL UND METHODEN.............................. ............................................ 15

2.1. IgA – Microsphere-based immunofluorescence assay ... ......................... 15

2.1.1. Patientenmaterial ....................................................................................... 15

2.1.2. Material ...................................................................................................... 17

2.1.3. Methode ..................................................................................................... 21

2.1.4. Statistische Auswertung - Methodenvergleich............................................ 28

2.2. Messung von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis .. ............................ 30

2.2.1. Patientenmaterial und Datenerhebung...................................................... 30

2.2.2. Liquorentnahme ......................................................................................... 33

2.2.3. Material ...................................................................................................... 34

2.2.4. Messung des Tau-Proteins ........................................................................ 36

2.2.5. Statistische Auswertung ............................................................................. 40

3. ERGEBNISSE................................................................................................... 41

3.1. Measurement of IgA in canine CSF using MIA......... ................................. 41

3.2. CSF Tau in dogs with IVDH.......................... ............................................... 43

4. ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ........................... ......................................... 67

5. ZUSAMMENFASSUNG .................................... ................................................ 78

6. SUMMARY........................................................................................................ 81

7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS.............................. ........................................... 83

8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS ................ ............................ 85

9. LITERATURVERZEICHNIS ............................... ............................................... 86

10. ANHANG............................................. ............................................................ 106

11. DANKSAGUNG ......................................... ..................................................... 122

Einleitung und Literaturübersicht

7

1. Einleitung und Literaturübersicht

Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine klare, farblose, zellarme Flüssigkeit, die das

zentrale Nervensystem (ZNS) umgibt, es schützt und versorgt. Des Weiteren dient

der Liquor dem Transport von neuroendokrinen Substanzen und Neurotransmittern

sowie der Aufrechthaltung eines gleichmäßigen intrakraniellen Drucks. Auch eine

exkretorische Funktion wird der Gehirnrückenmarksflüssigkeit zugesprochen

(TIPOLD 2003; DE LAHUNTA 2009). Der Großteil des Liquors wird von den Plexus

chorioidei in den Ventrikeln als Ultrafiltrat aus dem Blut gebildet. Die Produktionsrate

variiert je nach Spezies und wird für den Hund mit 0,047 ml/min angegeben (DE

LAHUNTA 2009).

Die Rückresorption des CSF in die Blutbahn erfolgt teils über arachnoidale Zotten,

teils über leptomeningeale Gefäße, aber hauptsächlich aus dem Subarachnoidal-

raum. Das gesamte Volumen des Liquor cerebrospinalis wird innerhalb eines Tages

3-5 mal produziert und resorbiert (JAGGY 2005; DE LAHUNTA 2009).

Die Liquorentnahme erfolgt unter Allgemeinanästhesie in der Regel subokzipital und

seltener lumbal, da hier die Gefahr einer iatrogenen Blutkontamination höher ist

(BAILEY u. HIGGINS 1985). Allerdings weisen lumbal gewonnene Proben bei der

Diagnose von kaudal der zerebellomedullären Zisterne gelegenen Läsionen eine

höhere Aussagekraft auf (THOMSON et al. 1989, 1990).

Pathologische Veränderungen im ZNS können die Zusammensetzung des Liquor

cerebrospinalis beeinflussen, so dass die Liquoranalyse ein wichtiger Bestandteil der

neurologischen Diagnostik ist. In der routinemäßigen Untersuchung wird neben

Aussehen (Farbe, Durchsichtigkeit oder Trübung), Protein-, Glukose- und Zellgehalt

auch das Differentialzellbild beurteilt. Die Liquoruntersuchung besitzt eine hohe

Sensitivität aber niedrige Spezifität für die Diagnose einer Erkrankung. Nicht jede

neurologische Erkrankung geht mit Veränderungen im Liquor einher (DI TERLIZZI u.

PLATT 2006). Trotzdem ist diese spezielle Untersuchung hilfreich, denn zusammen

mit Signalement, Anamnese, Blutuntersuchung und Klinik kann sie die Diagnostik

neurologischer Erkrankungen beim Hund effektiv unterstützen (TIPOLD et al. 1995;

ABATE et al. 1998).


8

In den letzten Jahrzehnten wurde das Spektrum der Liquoranalyse deutlich erweitert.

Mittels verschiedener Methoden können unter anderem Antikörper, Krankheits-

erreger, Proteine, Enzyme und Neurotransmitter im Liquor bestimmt und für die

Abklärung von Differentialdiagnosen interpretiert werden (TIPOLD et al. 1994;

OLBY et al. 1999; SCHATZBERG et al. 2003; LEVINE et al. 2006; KWON et al.

2010; LEVINE et al. 2010). So ist zum Beispiel die Messung des so genannten IgG-

Index hilfreich, denn dieser erlaubt die Unterscheidung einer entzündlichen oder

infektiösen Erkrankung des ZNS von anderen zentralnervösen Krankheiten

(TIBBLING et al. 1977).

Die parallele Messung von Immunglobulin A (IgA) in Serum und Liquor

cerebrospinalis ist ein wichtiges Hilfsmittel bei der Diagnose der steril-eitrigen

Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes (MAIOLINI et al. 2012). Diese entzündliche

Erkrankung des ZNS ist weit verbreitet und wird besonders bei jungen Hunden

diagnostiziert (TIPOLD 1995; CIZINAUSKAS et al. 2000). Eine exzessive

systemische und intrathekale IgA-Synthese, die sich in der gemeinsamen Erhöhung

von IgA in Serum und Liquor widerspiegelt, ist neben den typischen klinischen

Symptomen wie rezidivierendes Fieber, steife Kopf-Hals-Haltung und Schmerzhaftig-

keit in der Halswirbelsäule, charakteristisch (TIPOLD u. JAGGY 1994;

CIZINAUSKAS et al. 2000).

Immunglobulin A ist das wichtigste Immunglobulin der epithelialen Immunabwehr und

ist deshalb vor allem im Speichel, in der Tränenflüssigkeit sowie in den Sekreten des

Gastrointestinal-, des Respirations- und des Urogenitaltraktes vorzufinden (TIPOLD

et al. 1994; TIZARD 2009). Das kanine Immunglobulin A kann eine monomere oder

dimere Form annehmen (DAY u. PENHALE 1988; TIZARD 2009). Der normale

systemische IgA-Gehalt ist altersabhängig, wobei junge Hunde im Allgemeinen

niedrigere Serumwerte besitzen (GLICKMAN et al. 1988; SCHREIBER et al. 1992;

GINEL et al. 1993). Die in der veterinärmedizinischen Literatur angegebenen

Referenzwerte für den IgA-Gehalt im kaninen Serum sind uneinheitlich und

schwanken zwischen 10,9 µg/ml und 1790 µg/ml (REYNOLDS u. JOHNSON 1970;

HEDDLE u. ROWLEY 1975; FELSBURG et al. 1985; GLICKMAN et al. 1988;

SCHREIBER et al. 1992; TIPOLD et al. 1994; GRIOT-WENK et al. 1999).


9

Physiologischerweise wird im ZNS die humorale Immunantwort durch

Immunglobulin G dominiert (FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987). Bei

verschiedenen neurologischen Erkrankungen, vor allem bei Entzündungen und

Tumoren, konnte jedoch eine zusätzliche starke Beteiligung von IgA nachgewiesen

werden (BUDKA et al. 1985; FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987; TIPOLD

et al. 1994). Die genaue Funktion von IgA im ZNS ist bisher nicht bekannt (BUDKA

et al. 1985; TIPOLD et al. 1994). WOO et al. (1993) vermuten, dass intrathekales IgA

zum Schutz des ZNS Antigene neutralisiert und somit dem Erhalt der wichtigen

neuronalen Funktionen dient. Da aber unterschiedliche Erkrankungen des

Nervensystems mit einer Erhöhung der IgA-Konzentration einhergehen, ist zu

vermuten, dass die IgA-Synthese nicht antigenspezifisch erfolgt (BUDKA et al. 1985).

Der erhöhte IgA-Gehalt im ZNS ist auf eine intrathekale IgA-Synthese

zurückzuführen, denn aufgrund der dimeren Form erscheint das Passieren der Blut-

Hirnschranke unwahrscheinlich (WOO et al. 1993; TIPOLD et al. 1994;

TIZARD 2009). Die Messung von IgA im Liquor kann daher auch einen Hinweis auf

einen intrathekalen, primären oder sekundären Entzündungsprozess geben.

Zum Nachweis von Immunglobulin A wurde früher ein radial immunodiffusion assay

(RID) angewendet, welcher auch als Basis für den heute üblichen Enzyme-linked-

immunosorbent-assay (ELISA) diente (HEDDLE u. ROWLEY 1975; TIPOLD

et al. 1994). Da der ELISA einige Nachteile mit sich bringt - so können zum Beispiel

Einzelproben nur mit hohem zeitlichen Aufwand und Materialverbrauch analysiert

werden - bedarf es einer alternativen Messmethode.

Die Durchflusszytometrie ist ein seit langem etabliertes labordiagnostisches

Verfahren, mit dessen Hilfe verschiedene Eigenschaften von Zellen, wie Größe oder

Komplexität, gemessen werden kann. Das Prinzip der Durchflusszytometrie besteht

darin, dass die zu messenden Partikel in einem Flüssigkeitsstrom einzeln einen

Laserstrahl passieren. Die durch diese Teilchen verursachte Lichtstreuung wird

registriert. Zusätzlich können die Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern

markiert werden; dies ermöglicht eine weitere Sortierung der Partikel. Die an den

Detektoren gesammelten Signale werden in elektrische Signale umgewandelt,


10

digitalisiert und mittels geeigneter Softwareprogramme ausgewertet (JAROSZESKI

u. RADCLIFF 1999).

Schon seit längerer Zeit ist diese Methode in ihrer Anwendung jedoch nicht mehr

ausschließlich auf Zellen begrenzt, sondern kann für die Detektion jeglicher Art

von Partikeln, einschließlich Mikrosphären, genutzt werden (JAROSZESKI u.

RADCLIFF 1999). Mikrosphären, auch „Beads“ genannt, sind im Durchmesser 5-20

µm kleine sphärische Gebilde, welche analog zum ELISA als Festphase für

biochemische Nachweisreaktionen dienen können. Da die Stärke der

Fluoreszenzintensität proportional zur Menge des zu messenden Analyten ist,

können die Konzentrationen mittels mitgeführter Standardproben berechnet werden

(WILSON u. WOTHERSPOON 1988).

Verschiedene Autoren konnten eine gute Übereinstimmung zwischen den

Messergebnissen eines ELISA und eines “microsphere-based immunofluorescence

assay“ (MIA) feststellen, insbesondere ein niedriger Intraassay-Variationskoeffizient

und eine gute Linearität wurden beschrieben (MCHUGH et al. 1989; SYRJALA et al.

1991; KWITTKEN et al. 1994).

Humanes Immunglobulin G und E konnte mit Hilfe von Mikrosphären quantitativ

bestimmt werden (LISI et al. 1982; KWITTKEN et al. 1994).

In der Veterinärmedizin hat sich dieses moderne Messverfahren bisher wenig

etabliert. PAUL et al. (2005) nutzten die Technik zur Messung von Anti-Histon-

Antikörpern im Serum von Hunden mit Verdacht auf Systemischen Lupus

erythematodes, während BRESHEARS et al. (2010) die Detektion von

Matrixmetalloproteinasen in kaninen Kreuzband-Zellkulturen mittels multiplexer

Bead-Technologie beschreiben.

Die vorliegende Arbeit schildert die Entwicklung und Evaluierung eines „microsphere-

based immunofluorescence assay“ zur Bestimmung von Immunglobulin A in Serum

und Liquor cerebrospinalis des Hundes. Die beschriebene Entwicklungsarbeit soll die

Grundlage bilden, dieses neue Messverfahren zur Bestimmung verschiedener

Analyten im CSF einzusetzen.


11

In einer zweiten Studie wurde die Liquoranalyse eingesetzt, um die Prognosestellung

bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen zu ergänzen: in Zusammenhang mit einem

Bandscheibenvorfall wird der Liquor cerebrospinalis zur Abklärung von Differential-

diagnosen untersucht. Verschiedene Studien haben sich in den letzten Jahren auch

mit einem möglichen prognostischen Wert der Liquoruntersuchung bei

Bandscheibenvorfällen beschäftigt (THOMSON et al. 1989, 1990; OLBY et al. 1999;

WITSBERGER et al. 2009; SRUGO et al. 2011).

Bandscheibenvorfälle beim Hund sind eine häufig diagnostizierte neurologische

Erkrankung in der Tiermedizin (FLUEHMANN et al. 2006). Die klinischen

Erscheinungsformen sind vielfältig und reichen von Hyperästhesien bis hin zu

Lähmungen der Gliedmaßen (JAGGY 2005). Eine chirurgische Therapie bewirkt in

der Regel eine schnelle Behebung der schmerzhaften Zustände und gibt dem

dekomprimierten Rückenmark die Möglichkeit zur Regeneration (COATES 2000;

DEWEY 2008).

Die Auswirkung eines Bandscheibenvorfalls auf das Rückenmark wird von mehreren

Faktoren beeinflusst. Neben der Menge des vorgefallenen Materials spielen die

Geschwindigkeit des Vorfalls und die Dauer der Kompression eine wichtige Rolle

(KEARNEY et al. 1988; CARLSON et al. 2003).

Die Verletzung des Rückenmarks ist auf primäre und sekundäre Pathomechanismen

zurückzuführen. Die primären Schäden sind Folge der direkten mechanischen

Einwirkung auf das Nervengewebe, die sekundären Schäden entstehen aufgrund

verschiedener pathophysiologischer Reaktionen (ANDERSON u. HALL 1993;

DUMONT et al. 2001). Letztgenannte beinhalten unter anderem Ischämie, Hypoxie,

Elektrolytverschiebungen, das Auftreten freier Radikale, eine übermäßige

Freisetzung des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat und einen anaeroben

Stoffwechsel (ANDERSON u. HALL 1993; OLBY 1999; OLBY et al. 1999; DUMONT

et al. 2001; HAUSMANN 2003).

Das Nervengewebe ist demnach einer Vielzahl schädigender Einflüsse ausgesetzt,

welche schlussendlich zum Zelltod der Neuronen durch Nekrose oder Apoptose

führen (ANDERSON u. HALL 1993; CROWE et al. 1997; LIU et al. 1997; DUMONT

et al. 2001).


12

Die Schwere der Läsionen im Myelon wird mit Hilfe der Befunde der neurologischen

Untersuchung und der bildgebenden Diagnostik wie der Magnetresonanz-

tomographie (MRT) eingeschätzt. Bei plegischen Tieren ist die Frage nach der

Prognose jedoch nicht immer ausreichend zu beantworten. Bei Tieren, die keinen

Tiefenschmerz mehr aufweisen, besteht trotz der schwerwiegenden Schädigung eine

Erholungschance von 43 bis 75% (YOVICH et al. 1994; DUVAL et al. 1996; OLBY et

al. 2003; ITO et al. 2005; RUDDLE et al. 2006). Ein einfach zu bestimmender,

verlässlicher prognostischer Faktor wäre eine große Hilfe für die Bewertung der

Heilungschancen bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen.

In der Humanmedizin sind in den letzten Jahren verschiedene Biomarker zur

Beurteilung der Schwere von Rückenmarksschäden untersucht worden (BRISBY et

al. 1999; GUÉZ et al. 2003; KWON et al. 2010). Als weiterer potentieller

diagnostischer Marker könnte Tau-Protein dienen. Dieses Phosphoprotein ist

hauptsächlich in Nervenzellen und dort vor allem in den Axonen zu finden (BINDER

et al. 1985). Es unterstützt die Polymerisation von einzelnen Tubuli-Monomeren zu

Mikrotubuli, weshalb es in die Gruppe der „microtubule-associated proteins (MAP)“

eingeordnet wurde (WEINGARTEN et al. 1975; BINDER et al. 1985). Mikrotubuli

spielen eine wichtige Rolle in der Stabilisation der Zellform und in axonalen

Transportvorgängen (DRUBIN 1986; BUEE et al. 2000).

Die Kompression und Traumatisierung des Myelon bei Bandscheibenvorfällen

resultiert in Verlust von Neuronen und damit auch in der Freisetzung von

intrazellulären Proteinen in den das Rückenmark umgebenden Liquor

cerebrospinalis. Da Tau kein sekretorisches Protein ist, sind bei gesunden Menschen

und Tieren nur niedrige Tau-Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis zu erwarten,

während erhöhte Werte auf eine Schädigung von neuronalem Gewebe hinweisen

(MORI et al. 1995).

Humanes Tau-Protein besteht aus 352 bis 441 Aminosäuren und besitzt ein

Molekulargewicht von 45 bis 65 kDa. Diese Spannweiten in Größe und Gewicht sind

in den sechs verschiedenen Isoformen begründet. Diese Isoformen unterscheiden

sich in der Anzahl der Sequenzwiederholungen am carboxyterminalen Ende des


13

Proteins (drei oder vier) sowie in dem Vorhandsein von Inserts (kein Insert, ein Insert,

mehrere Inserts) am aminoterminalen Ende (GOEDERT et al. 1989a; GOEDERT et

al. 1989b).

Erhöhte Tau-Protein-Konzentrationen im CSF sind beim Menschen zuerst im

Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie der weithin bekannten

Alzheimer Erkrankung beschrieben worden (BLENNOW et al. 1995; ANDREASEN et

al. 1998). Bei dieser sogenannten Tauopathie steht besonders das abnormal

hyperphosphorylierte Tau-Protein im Interesse der Forschung (GRUNDKE-IQBAL et

al. 1986; BUEE et al. 2000).

Auch bei Patienten mit Multipler Sklerose, einer Erkrankung, die mit einer

Demyelinisierung einhergeht, sind hohe Tau-Protein-Werte im CSF zu finden und

diese stehen im Zusammenhang mit der Erkrankungsdauer (TERZI et al. 2007). Es

konnte gezeigt werden, dass auch hier abnormal phosphoryliertes Tau an der

Pathogenese beteiligt sein kann (ANDERSON et al. 2008).

In der tiermedizinischen Literatur ist bisher nur wenig über Tau-Protein berichtet

worden. Lediglich die Expression von Tau-Protein im Gehirn alter Hunde und Katzen,

sowie die Konzentration von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei Hunden mit

Enzephalitis wurden untersucht (HEAD et al. 2005; PUGLIESE et al. 2006; TANAKA

et al. 2011).

ZEMLAN et al. (1999) zeigten, dass erhöhte Tau-Protein-Werte im CSF von

Menschen mit Schädelhirntrauma vorkommen. Des Weiteren konnten KWON

et al. (2010) erhöhte Tau-Protein-Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis von

Menschen mit traumatisch bedingten Rückenmarksschäden nachweisen. In dieser

Studie wurde ebenso wie in der Studie von TANAKA et al. (2011) ein ELISA genutzt,

der das sogenannte „Total Tau“ also normales und phosphoryliertes Tau detektiert.

Aufgrund der oben genannten Informationen wurde die Hypothese aufgestellt, dass

die Tau-Protein-Konzentration im CSF mit der Schwere der Schädigung des

Rückenmarks bei Hunden mit Bandscheibenvorfall korreliert und somit eine Aussage

über die Schwere der Läsion sowie über die Prognose des einzelnen Patienten

erlaubt. Da bisher nicht bekannt ist, welche Form des Tau-Proteins bei Hunden mit


14

Bandscheibenvorfällen im CSF vorhanden sein könnte, wurde für die hier angeführte

Studie ebenfalls ein ELISA zur Messung von „Total Tau“ verwendet.

Die vorliegende Arbeit ist in zwei Abschnitte gegliedert: Das Ziel der ersten Studie

(Evaluation of a microsphere-based immunofluorescence assay for the determination

of immunoglobulin A concentrations in cerebrospinal fluid of dogs) war, einen

„microsphere-based immunofluorescence assay“ zu entwickeln, um ein geeignetes

Verfahren für die Untersuchung von CSF-Einzelproben zu erhalten, bei dem nur

geringe Mengen an Probenmaterial benötigt werden. Der entwickelte MIA sollte mit

einem etablierten ELISA verglichen werden.

In der zweiten Studie (Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of

spinal cord injury in canine intervertebral disk herniation) wurde der Schweregrad der

Schädigungen des Rückenmarks und der mögliche prognostische Wert der

Konzentrationen von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei Hunden mit

Bandscheibenvorfällen untersucht.

Material und Methoden

15

2. Material und Methoden

2.1. IgA – Microsphere-based immunofluorescence ass ay

In der vorliegenden Arbeit wurde in gepaarten Serum- und Liquorproben von Hunden

die IgA-Konzentration mit der im Folgenden beschriebenen Methode („microsphere-

based immunofluorescence assay“) bestimmt. Zusätzlich wurde der intrathekale und

systemische IgA-Gehalt dieser Hunde mit Hilfe eines ELISA nach TIPOLD et al.

(1994) für Serum und Liquor cerebrospinalis sowie mit einem kommerziell

erhältlichem ELISA (Immunology Consultants Laboratory, Inc., Portland, OR, USA)

gemessen und mit den Ergebnissen des MIA verglichen.

2.1.1. Patientenmaterial

Von 44 Hunden, die in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule

in Hannover vorstellig waren, wurden gepaarte Serum- und Liquorproben in

Allgemeinanästhesie entnommen und bis zur Messung bei -20°C aufbewahrt.

Die Patienten wurden entsprechend der im ELISA nach TIPOLD et al. (1994)

gemessenen IgA-Konzentrationen in drei Gruppen eingeteilt:

- Gruppe 1: 17 Hunde mit normalen IgA-Konzentrationen

- Gruppe 2: 14 Hunde mit mittelgradig erhöhten IgA-Konzentrationen

- Gruppe 3: 13 Hunde mit hochgradig erhöhten IgA-Konzentrationen

Eine Übersicht über Signalement und Erkrankungen der Hunde gibt Tabelle 1.

Die genauen klinischen Daten und Messwerte sind im Anhang tabellarisch

dargestellt.


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Rasse (Anzahl der Hunde)

Mischling (8) Boxer (6) Berner Sennenhund (4) Jack Russell Terrier (3) Weimaraner (2) Deutscher Schäferhund (2) Golden Retriever (2) Novia Scotia Duck Tolling Retriever Französischer Bullterrier Zwergpinscher Cocker Spaniel Französischer Griffon Portugiesischer Hirtenhund Rhodesian Ridgeback Labrador Retriever Mops Irish Setter Eurasier Kleiner Münsterländer Border Collie Katalanischer Hirtenhund

Alter Mittelwert Intervall

3,3 0,58 - 12,75

Geschlecht (Anzahl der Hunde)

Weiblich Weiblich kastriert Männlich Männlich kastriert

18 4 20 2

Diagnose SRMA Anfallsgeschehen Neoplasie Meningoenzephalitis Diskopathie sonstige

30 3 3 1 1 6

Tabelle 1: Signalement und Diagnose der Patienten im Überblick


17

2.1.2. Material

Geräte

- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure,

Fa. TKA Thermo Fisher Scientific, Niederelbert

- Durchflusszytometer FACSCalibur™ mit Apple & Macintosh™ -Computer,

Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- Mikrobiologische Sicherheitswerkbank HERAsafeKS,

Fa. Thermo Fisher Scientific, Niederelbert

- Gefrierschrank Premium NoFrost, Fa. Liebherr, Ochsenhausen

- Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen

- Laborwaage LabStyle204, Fa. Mettler Toledo, Giessen

- Magnetrührer mit Heizplatte, Typ MR 3001,

Fa. Heidolph, Schwabach

- Plattenrüttler Promax 1020, Fa. Heidolph, Schwabach

- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach

- Tischzentrifuge Rotina 35R, Fa. Hettich, Tuttlingen

- Wasserbad mit Einhängethermostat,

Fa. Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach

- Plattformschüttler Polymax, 1040 Fa. Heidolph, Schwabach

- Ultraschallbad Ultrasound-7-neutral (Art. 5356),

Fa. Roth, Karlsruhe

- Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten,

Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall

Laborbedarf

- Polystyrolröhrchen 3,5 ml und 5 ml (Art.-Nr. 55.1579 bzw. 55.484.001),

Fa. Sarstedt, Nümbrecht

- Immuno Platte Maxisorp F96-well (Best.-Nr. 75-0083),

Fa. VWR, Darmstadt


18

- Einmalhandschuhe Novaglove® -Latex (Best.-Nr. 905451),

Fa. NOBA Verbandsmittel, Wetter

- Glas-Pasteurpipetten, 150 ml (Best.-Nr. 612-1798), Fa. VWR, Darmstadt

- Pipettenspitzen: 10 µl (kristall), (Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim

200 µl (gelb), (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt

1000 µl (blau), (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich

- Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl), Fa. Brand, Wertheim

- Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim

- Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100), Fa. Brand, Wertheim

- Präzisionsdispenserspitzen 5 ml, 25 ml (Best.-Nr. 702376, 702380),

Fa. Brand, Wertheim

- Eppendorf Safelock-Tubes, 1,5 ml (Best.-Nr. 0030121694),

Fa. Eppendorf, Hamburg

- Bio-Spin Tris Columns (Best.-Nr.732-6231), Fa. Bio-Rad Laboratories, USA

- Bechergläser, Fa. VWR, Darmstadt

- Polypropylenröhrchen mit Deckel, 2 ml (Art.-Nr. 72.694), Fa. Sarstedt, Nümbrecht

- Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen 15 ml (Best.-Nr. 62.554.001),


Reagenzien, Chemikalien

- BSA, bovines Serumalbumin (Best.-Nr. A4503-50G),

Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim

- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Best.-Nr. D-5879),


- Dithiothreitol (DTT) (Best.-Nr. 43815), Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim

- Sulfosuccinimidyl 4-N-maleimidomethyl cyclohexane 1-carboxylate (Sulfo-SMCC)

(Best.-Nr. 22322), Fa. Pierce Thermo Fischer Scientific, Niederelbert

- N-Ethylmaleinimid (NEM) (Best.-Nr. E1271),


- Natriumazid (NaN3; Best.-Nr. 71289)

Fa. Fluka, Neu-Ulm


19

- Tween 20 (Art.-Nr. 8.22184.0500), Fa. Merck, Darmstadt

- o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) (Best.-Nr. P8287),


- Perborat-Kapsel (Best.-Nr. P4922), Fa. Sigma- Aldrich-Chemie, Steinheim

- FACSClean (Best.-Nr. 340345), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- FACSRinse (Best.-Nr. 340346), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- FACSFlow (Best.-Nr. 342003), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- Functional Bead Conjugation Buffer Set, BD™ Cytometric Bead Array (CBA)

(Best.-Nr. 558556), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- Functional Beads A5 (Best.-Nr. 560031), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- Coupling Buffer (Best.-Nr. 51-9004756), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- Functional Bead Storage Buffer (Best.-Nr. 51-9004758),


- Wash Buffer CBA (Best.-Nr. 51-9003797), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg

- Canine IgA ELISA Kit (Best.-Nr. E-40),

Fa. ICL Laboratories Inc., Portland, OR, USA

Antikörper

- Ziege-gegen-kanines-IgA (Best.-Nr. A40-104A),

Fa. Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA

- F(ab´)2-Fragment-spezifisches R-Phycoerythrin (RPE)-konjugiertes F(ab´)2-

Fragment Ziege-gegen-murines-IgG (Art.-Nr.115-116-072),

Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Suffolk, UK

- Esel-gegen-caprines-IgG, R-Phycoerythrin konjugiert (Art.-Nr. 705-116-147),


- Maus-gegen-kanines-IgA (Best.-Nr. MCA631),

Fa. AbD Serotec, Oxford, UK

- Esel-gegen-murines-IgG, Peroxidase konjugiert (Art.-Nr. 715-035-151),



20

Puffer, Lösungen und Suspensionen

- Waschpuffer Beads: PBS (steril) 250ml

bovines Serumalbumin (BSA) 2,5 g

Na-Acid (10%ig) 250 µl

- PBS, Phosphatgepufferte Salzlösung (pH 7,4): NaCl 137,0 mM

KCl 2,7 mM

Na2HPO4 8,1 mM

KH2PO4 1,5 mM

Computer-Software

- Cell-Quest™-Software (für Apple & Macintosh™-Computer),


- Flow Jo Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA

- Gen5™ Reader Control and Data Analysis Software,


- GraphPad Prism® Version 5.0, Fa. GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)


21

2.1.3. Methode

Testprinzip des „Microsphere-based immunofluorescence assays“

Bei dem „Microsphere-based immunofluorescence assay“ (MIA) dienen

mikroskopisch kleine Kügelchen (im Folgenden als Mikrosphären oder Beads

bezeichnet) als Festphase für biochemische Nachweisreaktionen.

In dieser Studie wurden 7,5 µm große Mikrosphären aus Polystyrol der Firma

Becton Dickinson genutzt.

Verschiedene Proteine wie zum Beispiel Antikörper können an die Oberfläche der

Mikrosphären gekoppelt werden. Das Funktionsprinzip entspricht dem eines

SANDWICH-ELISA (siehe Abb.1.).

Die mit dem primären Antikörper beschichteten Mikrosphären binden nach Zugabe

des Patientenserums oder -liquors den darin enthaltenen Analyten (IgA). Es folgt die

Bindung eines zweiten Antikörpers. Dieser kann entweder selbst fluoreszieren oder

er wird mit einem dritten fluoreszierenden Antikörper markiert. Zwischen den

einzelnen Schritten werden überschüssige Antikörper durch Waschvorgänge

entfernt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips eines MIA


22

Die Fluoreszenzintensität verhält sich proportional zur Konzentration des Analyten

(IgA) in der Probe. Mit Hilfe einer Standardkurve können die IgA-Konzentrationen in

den Patientenproben berechnet werden. Somit erlaubt der MIA eine quantitative

Bestimmung von IgA.

Kopplung des Antikörpers an die Mikrosphären und Bestätigung der Konjugation

Die Kopplung eines Ziege-gegen-kanines-IgA-Antikörpers mittels kovalenter Sulfo-

SMCC-Bindung an die Oberfläche der Mikrosphären wurde nach Angaben des

Herstellerprotokolls durchgeführt. Der genaue Ablauf ist im Anhang beschrieben.

Die Konjugation wurde als erfolgreich abgeschlossen angesehen, wenn die mittlere

Fluoreszenzintensität (MFI) der Probe mit dem Detektionsantikörper um mindestens

500 größer war als die MFI der Negativkontrolle.

Entwicklung einer Standardkurve

Um aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten die IgA-Konzentration berechnen

zu können, wird eine Standardkurve benötigt. Diese sollte durch die Austestung

verschiedener Verdünnungen des Detektionsantikörpers ermittelt werden. Es wurden

die folgenden sechs Verdünnungsstufen eingesetzt:

• 1:200

• 1:100

• 1: 50

• 1: 10

• 1: 5

• 1: 2,5

Eine IgA-Serumpool-Probe mit einer Konzentration von 162 µg/ml diente der

Erstellung einer Standardreihe mit den folgenden Konzentrationen:

• 162 ng/ml

• 81 ng/ml

• 40,5 ng/ml


23

• 20,25 ng/ml

• 10,13 ng/ml

• 5,07 ng/ml

• 2,54 ng/ml

• 1,27 ng/ml

• 0,64 ng/ml

• 0,32 ng/ml

• 0 ng/ml

Die Auswertung der im Durchflusszytometer gemessenen Fluoreszenzintensitäten

erfolgte mit dem Analyseprogramm Flow Jo (Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland,

OR, USA). Die Erstellung einer mathematischen Funktion zur Beschreibung des

Kurvenverlaufs erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism® (Version 5.0,

GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) mit der Vorgabe einer

Kalibrierungskurve mit sigmoidalem Verlauf und vier Parametern. Die Bestimmung

der idealen Standardkurve erfolgte zum einen durch die graphische Darstellung und

Beurteilung der Fluoreszenzen bei den verschiedenen Verdünnungsstufen und zum

anderen anhand der berechneten Kalibrierungskurven (vergleiche Abb. 2).

Der optimale Messbereich wurde als der Bereich der Kurve definiert, der den

linearen Anstieg der Kurve umfasst. Nur dieser Bereich wurde später bei der

Probenmessung zur Interpolation der Konzentrationen aus den Fluoreszenz-

intensitäten genutzt.


24

0 1 20

500

1000

1500

2000

IgA (ng/ml)

fluor

esce

nce

inte

nsity

Abbildung 2: Standardkurve mit sigmoidalem Verlauf (IgA-Konzentrationen

zwischen 0-162 ng/ml, Werte logarithmiert dargestellt)

Präzision und Reproduzierbarkeit der Methode

Für die Präzision einer Methode sind die Intraassay-Varianz und die Interassay-

Varianz wichtige Kenngrößen, denn sie geben das Maß der analytischen Streuung

wieder. Diese wird als Variationskoeffizient (CV%) angegeben. Die Intraassay-

Varianz beschreibt dabei die Abweichungen innerhalb eines Messdurchlaufs,

wohingegen die Interassay-Varianz die Messabweichung derselben Proben an

mehreren aufeinanderfolgenden Tagen angibt.

Im Intraassay-Vergleich wurden die Variationskoeffizienten der Fluoreszenz-

intensitäten (jede Probe wurde als Duplikat gemessen) der Proben an einem Tag

berechnet und getrennt für Serum und Liquor cerebrospinalis als Median angegeben.

Für den Interassay-Vergleich wurden die IgA-Konzentrationen der gleichen Proben

an sechs Tagen bestimmt und anschließend pro Serum- bzw. Liquorprobe der

Variationskoeffizient errechnet.

Nach denselben Prinzipien erfolgten die Berechnungen für den ELISA nach TIPOLD

et al. (1994). Anstelle der Fluoreszenzintensitäten wurden die Extinktionswerte

entsprechend verwendet.


25

Messung der Proben

Für die Messung der Proben mittels des „microsphere-based immunofluorescence

assay“ wurden die Liquorproben in der Verdünnung 1:20 bzw. 1:40 und die

Serumproben in der Verdünnung 1:2000, 1:4000 oder 1:5000 eingesetzt. Zur

Probenverdünnung wurde der Waschpuffer verwendet.

Das detaillierte Versuchsprotokoll ist im Folgenden beschrieben:

1. Erstellen der Standardreihe

Jede der oben genannten Standardkonzentrationen wurde als Triplikat angesetzt,

so dass pro Reihe insgesamt 150 µl der jeweiligen Verdünnungsstufe benötigt

wurden.

Zunächst wurde 1 µl der IgA-Serumpool-Probe mit 499 µl Waschpuffer verdünnt.

Davon wurden 200 µl in weiteren 200 µl Waschpuffer verdünnt und die

Verdünnungsreihe entsprechend in 2er Schritten fortgeführt. Anschließend

wurden jeweils 50 µl der Standard-Verdünnungen in 5-ml Röhrchen pipettiert. Zur

Herstellung des Standards „0“ wurde ausschließlich Waschpuffer verwendet.

2. Herstellung der Kontrollprobe:

Das Kontrollserum hat eine IgA-Konzentration von 100 µg/ml. Es wurde in einer

Konzentration von 100 ng/ml eingesetzt. Dazu wurde 1 µl Kontrollserum in 999 µl

Waschpuffer verdünnt und im Folgenden jeweils 50 µl in die entsprechenden

5 ml-Röhrchen pipettiert.

3. Proben:

Die korrespondierenden Liquor- und Serumproben wurden bei Raumtemperatur

aufgetaut und gemäß den oben genannten Verdünnungsstufen als Duplikate

pipettiert.


26

4. Verdünnung der Beads:

Die präparierten Beads wurden 5 sek. mit Hilfe des Reagenzglasschüttlers

gemischt und anschließend mit dem Wachpuffer 1:50 verdünnt.

5. In jedes Standard-, Kontroll- und Probenröhrchen wurden 50 µl der verdünnten

Beads pipettiert. Damit die Beads in Suspension bleiben, wurden die Röhrchen

dabei leicht geschwenkt. Es folgte eine Inkubationszeit von 30 min., wobei die

Röhrchen lichtgeschützt bei Raumtemperatur auf dem Plattformschüttler (Stufe 3)

aufbewahrt wurden.

6. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Beads gewaschen. Dazu wurde in

jedes Röhrchen 1 ml Waschpuffer pipettiert, dieses 5 min. bei 1000 x g

zentrifugiert und der Überstand vorsichtig mittels Pasteurpipette abgenommen.

7. In jedes Röhrchen wurden 50 µl des Detektions-Antikörpers (Maus-gegen-

kanines-IgA; Verdünnung 1:2,5) hinzugefügt und mittels Reagenzglasschüttler gut

vermischt.

8. 30 min. Inkubationszeit und anschließender Waschvorgang (siehe Punkt 5 und 6)

9. In jedes Röhrchen wurden 50 µl des RPE-konjugierten F(ab´)2-Fragments Ziege-

gegen-murines-IgG (Verdünnung 1:100) hinzugefügt und mittels Reagenzglas-

schüttler gut vermischt.

10. 30 min. Inkubationszeit und anschließender Waschvorgang (siehe Punkt 5 & 6)

11. Die Beads wurden in 100 µl Waschpuffer resuspendiert und dann der FACS-

Messung unterzogen.


27

FACS-Analyse

Die Durchflusszytometrie im ursprünglichen Sinne dient der Sortierung von Zellen

bzw. Partikeln anhand ihrer Größe und Beschaffenheit. Die sogenannte FACS-

Analyse (Fluorescence activated cell sorting) ermöglicht die Sortierung von Partikeln

anhand der Farbe und Intensität emittierter Fluoreszenzen (JAROSZESKI u.

RADCLIFF 1999).

Aufgrund des verwendeten Fluorochromfarbstoffes PhycoErythrin wurde die

Fluoreszenzintensität im FL2-Kanal des Durchflusszytometers (FACSCalibur™)

gemessen. Des Weiteren wurden das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) und

das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Das Vorwärtsstreulicht erlaubt

Rückschlüsse auf die Größe der Partikel, während das Seitwärtsstreulicht

Informationen über die Komplexität der Teilchen liefert (JAROSZESKI u. RADCLIFF

1999). Eine Mindestanzahl von 1000 Ereignissen pro Probe wurde im Vorhinein

festgelegt.

Die Auswertung der gemessenen Fluoreszenzintensitäten erfolgte mit dem

Analyseprogramm Flow Jo (Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland, OR USA). Der

geometrische Mittelwert der Fluoreszenzen wurde berechnet und anhand des

mitgeführten Standards wurden die Konzentrationen der gemessenen Liquor- und

Serumproben mit Hilfe des Programms GraphPad Prism® (Version 5.0, GraphPad

Software, Inc., La Jolla, CA, USA) ermittelt.

IgA-ELISA nach Tipold

Der ELISA wurde, wie im Anhang beschrieben, entsprechend dem Protokoll aus der

Studie von TIPOLD et al. (1994), durchgeführt.

Kommerzieller IgA-ELISA

Der ELISA wurde entsprechend der Herstellerangaben durchgeführt. Ein detailliertes

Protokoll ist im Anhang zu finden.


28

2.1.4. Statistische Auswertung - Methodenvergleich

Ziel der Studie war neben der Etablierung eines neuen Messverfahrens auch der

Vergleich der neuen (MIA) mit der etablierten Methode (ELISA).

Die statistische Aussagekraft dieses Vergleichs ist unter anderem abhängig von der

Anzahl der verwendeten Proben und dem von den Proben umfassten

Analysebereich. Die vorliegende Studie beinhaltet die Messung von 44

korrespondieren Serum- und Liquorproben und folgt somit der Empfehlung

verschiedener Autoren, eine Mindestanzahl von 40 Proben einzusetzen (LUMSDEN

2000; JENSEN u. KJELGAARD-HANSEN 2006). Die Auswahl und Einteilung der

Proben in die drei oben aufgeführten Gruppen erfolgte in der genannten Art und

Weise, um einerseits den klinisch bedeutsamen Referenzbereich abzudecken und

andererseits, um neben der SRMA als wichtigste Erkrankung auch weitere

neurologische Erkrankungen für die Methodenvalidierung mit einzubeziehen.

Dieser Vergleich der beiden Methoden zur Bestimmung der IgA-Konzentration wurde

auf zwei unterschiedlichen Wegen durchgeführt. Zum einen erfolgte eine Beurteilung

anhand des in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule

Hannover verwendeten klinischen Referenzbereiches. Diese Referenzwerte

entstammen einer vorhergehenden Studie, bei der IgA bei gesunden Beageln

gemessen wurde (TIPOLD et al. 1994) (siehe Tabelle 2).

IgA-Konzentration in µg/ml Intervall (+ 10%)

CSF < 0,2 (Referenzbereich) < 0,22 µg/ml

> 0,2-0,9 (geringgrad. Erhöhung) > 0,22-0,99 µg/ml

> 0,9 (deutliche Erhöhung) > 0,99 µg/ml

Serum < 100 (erniedrigt od. Referenzbereich) < 110 µg/ml

> 100-200 (geringgrad. Erhöhung) > 110-220 µg/ml

> 200 (deutliche Erhöhung) > 220 µg/ml

Tabelle 2: Klinisch relevante Referenzbereiche für IgA in Serum und Liquor


29

Eine Übereinstimmung der Messwerte wurde bejaht, wenn die mit den Beads

gemessenen IgA-Konzentrationen zur Einordnung in denselben Referenzbereich +

ein 10%-Intervall führte wie die mit dem ELISA gemessenen Konzentrationen.

Erfolgte die Einordnung allerdings in unterschiedliche Gruppen, wurde dies als

fehlende Übereinstimmung gewertet.

Zum anderen wurde ein statistischer Methodenvergleich nach dem von BLAND und

ALTMAN (1986) entworfenen Prinzip durchgeführt. Hierbei werden die Differenzen

der Messwerte aus beiden Methoden gegen den Mittelwert der Messwerte beider

Methoden aufgetragen, so dass insbesondere die Streuung und Verzerrung der

Daten mit berücksichtigt werden. Bei einer hinreichend symmetrischen Verteilung der

Differenzen liegen 95% der Messwerte im Bereich der Übereinstimmungsgrenzen

(„limits of agreement“; berechnet aus d ± 2 x s; d = Mittelwert der Messwerte beider

Methoden und s = Standardabweichung der Differenzen). Eine Vorraussetzung für

die Gültigkeit des Verfahrens ist, dass die Differenzen keine systematischen

Veränderungen aufweisen. Sollte dies doch der Fall sein, kann eine gleichförmige

Variabilität der Daten durch eine logarithmische Transformation der Messwerte

erreicht werden (BLAND u. ALTMAN 1986). Ein Bland-Altman-Diagramm erlaubt

eine gute visuelle Beurteilung der Übereinstimmung bzw. Differenzen zweier

Methoden. Eine anschließende Interpretation der Übereinstimmungsintervalle unter

klinischen Gesichtspunkten ermöglicht dann die Einschätzung der Güte der

Übereinstimmung und somit ein abschließendes Urteil über die Vergleichsmethode.


30

2.2. Messung von Tau-Protein im Liquor cerebrospina lis

2.2.1. Patientenmaterial und Datenerhebung

In die Studie konnten 51 Hunde, die in den Jahren 2005 bis 2011 in der Klinik für

Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover aufgrund eines

Bandscheibenvorfalls in Hals-, Brust- oder Lendenwirbelsäule vorgestellt wurden,

aufgenommen werden. Einschlusskriterien waren neurologische Symptome mit dem

Schweregraden 2 bis 5 (Einteilung nach SHARP u. WHEELER 2005) sowie eine

stattgefundene Liquorentnahme.

Die Patientendaten wurden hinsichtlich Signalement (Rasse, Geschlecht, Alter),

Dauer der Erkrankung bis zur Erstvorstellung, Vorbehandlung, neurologischem

Status bei der Erstuntersuchung, Lokalisation der Läsion, Befunde aus der

bildgebenden Diagnostik und klinischem Verlauf während des stationären

Aufenthaltes retrospektiv aufgearbeitet.

Entsprechend der Dauer der Symptome bis zur Erstvorstellung wurden die Hunde in

die folgenden Gruppen unterteilt:

• Akut: 1-5 Tage, (n = 15)

• Subakut: 5-14 Tage, (n = 14)

• Chronisch: > 14 Tage, (n = 20)

• Unbekannt, (n = 2).

Abhängig von der Art der Vorbehandlung erfolgte eine Unterteilung der Hunde in:

• Vorbehandlung mit Glukokortikosteroiden, (n = 23)

• Vorbehandlung ohne Glukokortikosteroide, (n = 26)

• Unbekannt, (n = 2).


31

Anhand der Befunde der neurologischen Untersuchung am Tag der Erstvorstellung

und des Schweregrades der Symptome wurden die Patienten in folgende Gruppen

unterteilt (nach SHARP u. WHEELER 2005):

• Grad 1: Schmerzhaftigkeit der Wirbelsäule ohne neurologische

Ausfallserscheinungen, (n = 0)

• Grad 2: Gering- bis mittelgradige Parese, Ataxie und

Propriozeptionsdefizite, selbstständig lauffähig, (n = 24)

• Grad 3: Hochgradige Parese; nicht lauffähig, (n = 7)

• Grad 4: Plegie mit erhaltenem Tiefenschmerz, (n = 14)

• Grad 5: Plegie ohne Tiefenschmerz, (n = 6)

Für die spätere statistische Auswertung der Daten wurden die Hunde mit einer

Parese (Grad 2 und Grad 3) und die Hunde mit einer Plegie (Grad 4 und 5) in jeweils

eine Gruppe zusammengefasst.

Bei 50 Hunden wurde eine MRT (bis 2009 mittels Magnetom Impact Plus, 1.0 Tesla,

Siemens AG, Erlangen; ab 2010 mittels Philips Achieva 3.0 Tesla, Philips, Hamburg)

in Allgemeinanästhesie durchgeführt. Neben der genauen Lokalisation des

Bandscheibenvorfalls wurde insbesondere auf intramedulläre hyperintense Läsionen

in der T2-gewichteten SE Sequenz geachtet, da diese einen wichtigen

Beitrag zur Prognosestellung liefern (ITO et al. 2005; LEVINE et al. 2009;

BOEKHOFF et al. 2012).

Dementsprechend wurden die Patienten in die nachstehend genannten

Befundgruppen eingeteilt:

• Hunde mit Bandscheibenvorfall im Bereich der Halswirbelsäule,

(n = 18)

• Hunde mit Bandscheibenvorfall im Bereich der Brust- oder

Lendenwirbelsäule, (n = 33)

o Rückenmark ohne intramedulläre hyperintense Läsion, (n = 26)

o Rückenmark mit intramedullärer hyperintenser Läsion, (n = 24)


32

Bei einem Hund erfolgte anstelle eines MRTs ein Myelo-CT, so dass dieser Hund

bezüglich der MRT-Befunde nicht mit in die Auswertung genommen werden konnte.

Die Entwicklung der neurologischen Symptomatik während des stationären

Aufenthaltes wurde durch tägliche Verlaufskontrollen beobachtet. Eine Verbesserung

um einen neurologischen Grad innerhalb einer Woche wurde als positives Ergebnis

gewertet. Diese Entwicklung wurde sowohl für die Gesamtheit der erkrankten Hunde

als auch getrennt für die einzelnen Erkrankungsgrade (Grad 2/3 und Grad 4/5)

betrachtet, um insbesondere die Prognose für die plegischen Hunde beurteilen zu

können. Demnach ergab sich folgende Einteilung:

• Besserung alle Hunde, (n = 23)

• Keine Besserung alle Hunde, (n = 28)

o Besserung Hunde Grad 2/3, (n = 17)

o Keine Besserung Hunde Grad 2/3, (n = 14)

� Besserung Hunde Grad 4/5, (n = 6)

� Keine Besserung Hunde Grad 4/5, (n = 5)

Von den 51 Hunden mussten 13 Hunde aufgrund einer schlechten Prognose

euthanasiert werden, so dass eine weitere Gruppierung in

• Euthanasierte Hunde, (n = 13)

• Weiterhin lebende Hunde, (n = 38)

vorgenommen wurde.

Die detaillierten Angaben zu den Tieren einschließlich Signalement und erhobenen

Befunden sind im Anhang V. und VI. zu finden.


33

2.2.2. Liquorentnahme

Die Gewinnung der Gehirnrückenmarksflüssigkeit erfolgte in Allgemeinanästhesie

aus der Cisterna cerebellomedullaris. Unmittelbar nach Entnahme wurden 200 µl des

Liquors der routinemäßigen Laboruntersuchung (Bestimmung von Zellzahl, Gehalt

an Glukose und Protein) zugeführt. Die verbleibende Probenmenge wurde in

Polypropylen-Röhrchen bei -20°C für die spätere Bes timmung der Tau-Protein-

Konzentration aufbewahrt.

Als Negativkontrolle diente der Liquor cerebrospinalis von 12 Hunden, die klinisch

und neurologisch gesund oder an anderen, für diese Studie unbedeutenden

Krankheiten bekannter Genese (z.B. intramuskulärer Abszess, Pankreatitis) erkrankt

waren.


34

2.2.3. Material

Geräte

- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure,

Fa. TKA Thermo Fisher Scientific, Niederelbert

- Gefrierschrank Premium NoFrost,

Fa. Liebherr, Ochsenhausen

- Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen

- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach

- Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten,


Laborbedarf

- Bechergläser Fa. VWR, Darmstadt

- Pipettenspitzen: 10 µl (kristall; Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim

200 µl (gelb) (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt

1000 µl (blau) (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich

- Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl)

Fa. Brand, Wertheim

- Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim

- Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100),

Fa. Brand, Wertheim

- Präzisionsdispenserspitzen 5 ml (Best.-Nr. 702376),

Fa. Brand, Wertheim

- Polypropylenröhrchen mit Verschluss 2 ml (Art.-Nr.72.694),


- Polypropylenröhrchen 4 ml (Best.- Nr. 55.532),


- Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen, 15 ml (Best.- Nr. 62.554.001),



35

Reagenzien und Chemikalien

- INNOTEST® hTAU Ag, (Artikel-Nr. 80323)

Fa. Innogenetics®, Ghent, Belgien

- 2 N Schwefelsäure (H2SO4) (Stopplösung für den ELISA)

PC Software

- Gen5™ Reader Control and Data Analysis Software,


- GraphPad Prism®, Version 5.0,

Fa. GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA


36

2.2.4. Messung des Tau-Proteins

Für die Messung des Tau-Proteins im Liquor cerebrospinalis wurde ein kommerziell

erhältlicher ELISA verwendet (INNOTEST® hTAU Ag, Innogenetics, Ghent, Belgien).

Das Funktionsprinzip eines ELISA beruht auf einer spezifischen Antigen-Antikörper-

Reaktion, die mittels Farbumschlag quantitativ ausgewertet werden kann.

Waschvorgänge zwischen den einzelnen Reaktionsschritten verhindern

unspezifische Bindungen und beseitigen überschüssige Reagenzien.

Der verwendete ELISA erfasst humanes Tau-Protein oder dessen Fragmente mittels

eines ersten monoklonalen (AT120) und zweier sekundärer, biotinylierter Antikörper

(HT7bio und BT2bio). Dieser Antigen-Antikörper-Komplex wird anschließend durch

ein peroxidasemarkiertes Streptavidin (HRP-SV) nachgewiesen (siehe Abbildung 2).

Die eingesetzten Antikörper binden sogenanntes „Total Tau“, das heißt, es wird

sowohl phosphoryliertes als auch nicht-phosphoryliertes Tau gebunden.

Abbildung 3: Prinzip des Tau-ELISA

Aufgrund der Tatsache, dass Tau ein in vielen verschiedenen Spezies

vorkommendes Protein ist und gezeigt werden konnte, dass es konservierte

Proteinregionen besitzt, war die Wahrscheinlichkeit groß, dass auch kanines Tau

von den verwendeten Antikörpern gebunden wird (VIERECK et al. 1988; JANKE

et al. 1999). Außerdem gelang es in einer Studie von TANAKA et al. (2011), kanines

Tau-Protein mit den genannten Antikörpern nachzuweisen.


37

Vorangegangene Studien zeigten, dass es zu keiner Beeinträchtigungen des Testes

durch Hämoglobin, Bilirubin, Albumin und Globulin kommt (NISHIMURA et al. 1998).

50 µL (2 x 25 µl) unverdünnter Liquor cerebrospinalis wurden für die Bestimmung der

Konzentration des Tau-Proteins genutzt. Dabei erfolgte die Messung der Proben und

des Standards in Duplikaten. Die errechneten Mittelwerte konnten im Folgenden für

die statistische Auswertung verwendet werden.

Wurde bei den Messungen innerhalb einer Probe ein Variationskoeffizient von 20%

überschritten, so erfolgte eine Wiederholung des Tests für die betroffene Probe.

Die Gesamtheit der Messwerte wurde nur dann als zuverlässig angesehen, wenn die

vom Hersteller empfohlenen Validierungskriterien erfüllt waren. Die Extinktion der

Leerwertvertiefungen sollte bei 450 nm < 0,200 OD und die Extinktion des höchsten

Standards bei 450 nm > 1,600 OD betragen.

Der mitgeführte Standard erlaubte die Erstellung einer sigmoidalen Standardkurve,

anhand derer die Interpolation der unbekannten Tau-Protein-Konzentrationen in den

CSF-Proben (pg/ml) durchgeführt wurde.

Die Nachweisgrenze für humanes Tau lag gemäß Herstellerangaben bei 60 pg/ml.

TANAKA et al. (2011) validierte den ELISA für den Hund, wobei gesunde Hunde eine

Tau-Protein-Konzentration von im Mittel 29,3 pg/ml aufwiesen. Für die folgende

statistische Auswertung der Daten wurden Messwerte zwischen 18,7 und 60,0 pg/ml

als Zahlenwerte belassen, während Messwerte < 18,7 pg/ml als nicht messbar (0)

klassifiziert wurden (TANAKA et al. 2011).


38

Versuchsprotokoll des Tau-ELISA

1. Alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen

Liquorproben bei Raumtemperatur auftauen und vor dem Verwenden für 10 sek.

mit Hilfe des Reagenzglasschüttlers mischen.

2. Standard vorbereiten:

Lyophilisiertes, rekombinantes Tau mit 500 µl Probenverdünner rekonstituieren;

15 min. stehen lassen, danach 15 sek. mittels Reagenzglasschüttler mischen.

Ausgehend vom Standard (1200 pg/ml) weitere Verdünnungsstufen (1:2)

herstellen (jeweils 300 µl der vorherigen Verdünnung + 300 µl Probenverdünner)

durchführen.

- Standardkonzentrationen: 1200, 600, 300, 150 und 75 pg/ml

- Die Leerprobe enthält nur Probenverdünner

3. Herstellung der Arbeitslösung 1 (monoklonale Anti-hTAU-Antikörper BT2 und

HT7, markiert mit Biotin):

- 100 µl Arbeitslösung 1 mit 10 ml der zugehörigen Verdünnungsflüssigkeit

mischen

- In jede Kavität 75 µl Arbeitslösung 1 pipettieren

4. 25 µl jeder Standardkonzentration, 25 µl Probenverdünner (Leerprobe) und

25 µl jeder Liquorprobe (unverdünnt) im Doppelansatz in die entsprechenden

Kavitäten pipettieren und durch vorsichtiges Klopfen des Teststreifenhalters

mischen.

5. Inkubation der ELISA-Platte für 14-18 Stunden (über Nacht) bei 25 ± 2°C.

6. Herstellung der Arbeitslösung 2 (Peroxidase-markiertes Streptavidin):

- 120 µl Arbeitslösung 2 mit 12 ml der zugehörigen Verdünnungsflüssigkeit

mischen

7. Herstellen der Waschlösung (Phosphatpuffer):

- 40 ml Waschlösung mit 960 ml Aqua destillata mischen

8. Platte 4x waschen

9. In jede Kavität 100 µl Arbeitslösung 2 pipettieren

10. Platte für 30 ± 3 min. bei 25 ± 2°C inkubieren


39

11. Herstellung der Substratlösung (Tetramethylbenzidin gelöst in Dimethylsulfoxid)

- 120 µl Substratlösung mit 12 ml Substratpuffer mischen

12. 4x waschen

13. In jede Kavität 100 µl Substratlösung pipettieren

14. Platte für 30 min. bei Raumtemperatur (18-30°C ) lichtgeschützt inkubieren

15. Stoppen der Reaktion: Zugabe von 100 µl 2N-Schwefelsäure in jede Kavität in

derselben Reihenfolge und in denselben Zeitabständen wie die Zugabe der

Substratlösung

16. Photometrische Auswertung mit Hilfe des ELISA-Readers bei einer Wellenlänge

von 450 nm mit Hilfe des Programms Gen5™ (Referenzwellenlänge 620 nm)


40

2.2.5. Statistische Auswertung

Die deskriptive Auswertung der Messwerte, deren graphische Darstellung in Form

von Box-and-Whisker-Plots sowie alle statistischen Berechnungen erfolgten mithilfe

des Statistikprogramms GraphPad Prism®, Version 5.0, (GraphPad Software, Inc., La

Jolla, CA, USA).

Zunächst wurden die Werte einer jeden Gruppe mittels Kolmogorov-Smirnov Test auf

ihre Normalverteilung überprüft. Da die Daten keine Normalverteilung aufwiesen,

wurden nicht-parametrische Tests (Kruskal-Wallis und Mann-Whitney U Test) für die

Beurteilung statistischer Zusammenhänge angewendet. Alle statistischen Methoden

wurden als zweiseitige Tests durchgeführt und als Irrtumswahrscheinlichkeit wurde

p< 0,05 angesetzt.

Eine ROC-(Receiver Operating Characteristic)-Kurvenanalyse einschließlich der

Berechnung der AUC (Area under the curve), der Testsensitivität und –spezifität

wurde durchgeführt, um diejenige Tau-Protein-Konzentration zu ermitteln, die als

Schwellenwert für die Einschätzung der Prognose dienen kann.

Ergebnisse

41

3. Ergebnisse

3.1. Measurement of IgA in canine CSF using MIA

Evaluation of a microsphere-based immunofluorescenc e assay for the

determination of immunoglobulin A concentrations in

cerebrospinal fluid of dogs

A. Roerig, R. Carlson, A. Tipold

Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine

Hannover, Hannover, Germany

Research in Veterinary Sciene

DOI: 10.1016/j.rvsc.2012.07.013

Ergebnisse

42

Abstract

The simultaneous increase of immunoglobulin A (IgA) in serum and cerebrospinal

fluid (CSF) is a characteristic finding in dogs suffering from canine steroid-responsive

meningitis–arteritis (SRMA). The study aimed at developing and evaluating a

microsphere-based immunofluorescence assay (MIA) for the measurement of IgA,

trying to fulfil the need of a quicker method using only small volumes of CSF.

Microsphere beads were coated with goat anti-dog IgA antibodies and bound IgA

was detected by a mouse anti-dog IgA antibody in combination with a PE-labeled

goat anti-mouse IgG. CSF from 44 dogs were tested for IgA and compared with an

in-house utilized ELISA.

Ergebnisse

43

3.2. CSF Tau in dogs with IVDH

Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of spinal cord injury

in canine intervertebral disk herniation

A. Roerig, R. Carlson, A. Tipold, V.M. Stein*

Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine

Hannover, Hannover, Germany

*Corresponding author: Tel: +49-511-953-6311

Email: [email protected] (V.M. Stein)

Ergebnisse

44

Abstract

Intervertebral disk herniation (IVDH) is a common cause of spinal cord injury (SCI) in

dogs. Microtubule-associated protein tau derives predominantly from neurons and

axons, making it a potential marker of neuronal injury.

A retrospective study, including fifty-one dogs with thoracolumbar or cervical IVDH

and 12 clinically normal dogs, was designed to describe associations between

cerebrospinal fluid (CSF) tau concentration, degree of neurological signs and motor

functional recovery in dogs with IVDH. Signalement, degree of neurological

dysfunction and outcome were recorded. Cisternal CSF tau values were determined

by an ELISA. Associations between CSF tau concentration and various clinical

parameters were evaluated.

Tau protein was significantly elevated in dogs showing plegia (median: 79.9 pg/mL;

P = 0.016) compared to healthy dogs and dogs with paresis (median: 30.1 pg/mL;

P = 0.025). Plegic dogs that improved by one neurological grade within one week

had significantly lower tau protein levels compared to plegic dogs that needed more

time for recovery or did not show an improvement (P =0.008). A CSF tau

concentration of > 41.3 pg/mL had a sensitivity of 86% and specificity of 83% to

predict an unsuccessful outcome in plegic dogs based on receiver-operating

characteristics curve analysis (area under the curve = 0.887, P = 0.007, 95%

confidence interval [CI]: 0.717 to 1.057).

In conclusion, CSF protein tau levels are positively associated with the severity of

spinal cord damage and therefore may serve as a prognostic indicator in dogs with

IVDH.

Keywords: spinal cord injury, dog, CSF analysis, protein tau

Ergebnisse

45

Introduction

Tau proteins belong to the microtubule-associated proteins family (Weingarten et al.,

1975). These phosphoproteins specifically localize in neurons where they bind to

microtubules, promoting their assembly and stability (Weingarten et al., 1975; Binder

et al., 1985). Tau is not physiologically secreted; its release into the cerebrospinal

fluid (CSF) is most probably due to neuron damage or death (Mori et al., 1995).

Therefore CSF tau protein concentrations can serve as a biological marker for axonal

damage in the central nervous system (CNS) (Zemlan et al., 1999; Shiiya et al.,

2004).

Elevated levels of CSF tau protein have been described in human neurodegenerative

disorders such as Alzheimer’s disease and in multiple sclerosis (Blennow et al.,

1995; Andreasen et al., 1998; Terzi et al., 2007). At present, information on tau

protein in veterinary medicine is rare. So far tau protein expression in the aging

brains of dogs and cats as well as CSF tau levels in dogs with encephalitis have

been examined (Head et al., 2005; Pugliese et al., 2006; Tanaka et al., 2011)

Intervertebral disk herniation (IVDH) is a common cause of spinal cord injury (SCI) in

dogs, resulting in pain and neurological dysfunction. Severity of neurological signs is

determined by neuroanatomical location, velocity and amount of the compressive

material as well as duration of compression (Brisson, 2010). IVDH leads to SCI via a

combination of primary and secondary events. Primary spinal cord injury refers to the

initial mechanical insult whereas secondary injury is a biochemical cascade following

the primary event and consisting of vascular dysregulation, neurogenic shock,

oxidative stress and excitotoxicity (Dumont et al., 2001).

Several prognostic factors for IVDH were previously studied in CSF samples, such as

the percentage of CSF macrophages (Srugo et al., 2011), CSF levels of myelin basic

protein and creatinine kinase activity (Levine et al., 2010; Witsberger et al., 2012),

concentration of beta-2-microglobulin (Muñana et al., 2007) and CSF glutamate

concentration (Olby et al., 1999). These described studies included dogs with

thoracolumbar IVDH or dogs with acute signs (Levine et al., 2006; Levine et al.,

2010; Srugo et al., 2011). Therefore additional reliable prognostic factors that allow

Ergebnisse

46

differentiating between good and poor functional outcome, are needed. Moreover

clear cut-off points for unfavourable outcome should be stated (Levine et al., 2010;

Witsberger et al., 2012).

CSF tau levels were highly elevated in human head trauma patients and a correlation

was established between clinical improvement and decreased CSF tau levels

(Zemlan et al., 1999). We therefore hypothesized that high levels of protein tau reflect

the severity of spinal cord damage and that determination of CSF tau concentration

has a pivotal value as a prognostic biomarker for motor functional recovery in dogs

with IVDH.

Material and Methods

Study design and animals

Medical records of the Department of Small Animal Medicine and Surgery,

University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany, were retrospectively

reviewed (2005 - 2011) for dogs diagnosed with IVDH. The study was performed

according to the ethical rules of the University.

On the basis of the severity of the neurological signs 51 dogs were categorized

according to Sharp and Wheeler (2005) into five grades: paraspinal hyperesthesia

(grade 1), ambulatory paresis, ataxia and proprioceptive deficits (grade 2),

nonambulatory paresis (grade 3), plegia with nociception (grade 4), plegia with no

deep nociception (grade 5) (Sharp and Wheeler, 2005). Inclusion criteria for this

study were dogs suffering from cervical or thoracolumbar IVDH as suggested by

magnetic resonance imaging (MRI) findings and in most cases confirmed by

decompressive surgery, a severity of grade 2 to 5 at presentation and subsequent

analysis of CSF. Dogs were neurologically re-examined seven days after first

presentation.

Ergebnisse

47

The information retrieved from the medical records included signalement (sex, age,

breed), time from onset of clinical signs to presentation, previous drug administration

with emphasis on glucocorticosteroids, localization of the disk protrusion/extrusion,

the occurrence of pathological changes in the myelon detected by MRI and functional

neurological outcome (Levine et al., 2009; Boekhoff et al., 2012). All MR images were

reviewed by certified neurologists. MR images were evaluated for the presence of an

intramedullary hyperintensity over the length of one vertebral body or more (Levine et

al., 2009). The outcome was defined to be successful if the dog improved by at least

one neurological grade within a week after first presentation at the Department of

Small Animal Medicine and Surgery.

Normal research colony dogs (n = 8, Animal Experiment number: 33.42502/05-12.05)

as well as four dogs, which were presented at our clinic because of orthopedic, non-

neurologic diseases, were used as a control population. All control dogs were

required to have normal physical and neurological examinations as well as CSF

analysis.

Cerebrospinal fluid (CSF) collection

Cerebrospinal fluid was collected at the time of presentation/admission under general

anesthesia from the cerebellomedullary cistern. 200 µL of samples without iatrogenic

blood contamination were subsequently used for routine examination (cell count,

glucose and protein concentrations) and remaining CSF samples were frozen and

stored in polypropylene tubes at -20°C (Lachno et a l., 2011).

Biochemical analysis of Tau protein

Tau protein was determined by a commercially available enzyme-linked

immunosorbent assay (ELISA) (Innotest hTAU, Innogenetics), which recognizes non-

phosphorylated and phosphorylated tau protein (Vandermeeren et al., 1993). It is a

solid-phase enzyme immunoassay in which tau protein or tau fragments are captured

by a primary monoclonal antibody (AT120) and two biotinylated secondary antibodies

(HT7bio and BT2bio). 50 µL of CSF was used for each measurement, each sample

was measured in duplicates, and the mean was used for further evaluation. Previous

Ergebnisse

48

examinations excluded interferences in the assay format for hemoglobin, bilirubin,

albumin or globulin (Nishimura et al., 1998).

Statistical Analysis

Data obtained were analyzed using a commercially available software package

(GraphPad Prism Version 5.0, GraphPad Software). Variables were controlled for

normal distribution using Kolmogorov-Smirnov normality test. As data were not

consistent with a Gaussian distribution, nonparametric tests (Kruskal-Wallis and

Mann-Whitney U test) were applied. All statistical tests were two-tailed and a P-value

≤ 0.05 was considered to be statistically significant.

For the purpose of analyzing the relation between tau protein levels and severity of

neurological dysfunction, dogs were divided into two groups (A: paresis = grade 2/3,

B: plegia with and without deep pain sensation = grade 4/5). Within these groups

dogs were further categorized based on occurrence of functional improvement by

one grade within 7 days or no functional improvement.

For the purpose of describing duration of clinical signs before admission dogs were

divided into three subcategories (acute: < 5 days, subacute: 5 - 14 days, chronic: >

14 days). For analyzing the effect of administration of corticosteroids (yes vs. no),

location of the spinal cord compression (cervical vs. thoracolumbar) and spinal cord

TW2 hyperintensity (yes vs. no) dogs were divided in two groups, respectively.

Receiver-operating characteristics (ROC) curve analysis was performed to determine

the overall effectiveness of CSF tau concentration to predict an unsuccessful

outcome in dogs showing plegia due to IVDH. Additionally, ROC curve analysis was

used to find out if CSF tau concentrations are able to distinguish between paretic and

plegic dogs. The cut-off that maximized the Youden index (sensitivity + specificity -1)

was selected as optimal.

Ergebnisse

49

Results

Fifty-one dogs with cervical (n = 18) or thoracolumbar (n = 33) IVDH of various

breeds and with a different degree of neurological dysfunction met the inclusion

criteria. Mean age of the dogs was 7.3 years (range 3 - 12.25 years). Breeds

included Dachshund (n = 19), mixed breed (n = 13), Beagle (n = 2), Bernese

Mountain Dog (n = 2), Cocker Spaniel (n = 2), Rottweiler (n = 2), French

Bulldog (n = 2) and 9 other breeds with one dog each. Twenty-three male, 11

castrated male, 7 female and 10 spayed female dogs were examined. The

neurological examination revealed 24 dogs with paresis and/or ataxia with

proprioceptive deficits (grade 2) whereas 7 dogs were nonambulatory paraparetic

(grade 3). Fourteen dogs displayed plegia with nociception (grade 4) whereas in 6

dogs nociception was lost (grade 5). Dogs with paresis (grade2/3, n = 31) and dogs

showing plegia (grade 4/5, n = 20) were combined for further evaluation. Forty-four

dogs (grade 2: n = 18, grade 3: n = 7, grade 4: n = 14, grade 5: n = 5) underwent

decompressive surgery whereas 6 dogs (all classified as grade 2) were treated

conservatively and one dog (grade 5) was euthanized after diagnostic imaging.

Glucocorticosteroids were administered to 23 of the 51 dogs with IVDH (45.1%)

before presentation (Table 1).

The control group consisted of 12 dogs with a mean age of 5.0 years (range 1.8 - 8.8

years). One female, two spayed females, two males and seven castrated males were

examined. Breeds included Beagle (n = 8) and one of each of the following breeds

(mixed breed, Labrador Retriever, Boxer, Chihuahua).

Ergebnisse

50

n Neurologic grade

Grade 2 Grade 3 Grade 4 Grade 5

24 7 14 6

Paretic dogs Neurologic improvement No improvement

31 17 14

Plegic dogs Neurologic improvement No improvement

20 6 14

Clinical signs before admission Acute Subacute Chronic Unknown

15 14 20 2

Location of spinal cord compression Cervical

Grade 2 Grade 3 Grade 4

Thoracolumbar Grade 2 Grade 3 Grade 4 Grade 5

18 11 3 4 33 13 4 10 6

administration of glucocorticosteroids yes no unknown

23 26 2

T2W Hyperintensity of spinal cord (length > one vertebrae)

yes no no MRI (Myelo-CT)

24 26 1

Treatment Decompressive surgery Conservative treatment Euthanasia

44 6 1

Table 1. Clinical signs, treatment and MRI findings of 51 examined dogs with IVDH.

Ergebnisse

51

Tau was measurable in seven of 12 dogs of the control group (58.3%) and in 33 of

51 dogs with IVDH (64.7%). Median tau protein level in the control group was

20.6 pg/mL (range: 0 – 51.2 pg/mL) whereas in dogs with IVDH it was 41.8 pg/mL

(range: 0 – 778.7 pg/mL). Significant differences (P = 0.049) were detected between

CSF tau protein in dogs with IVDH and dogs of the control group. These differences

were even more distinct with evaluation of neurological grade (Fig. 1).

cont

rol

grad

e 2/3

grad

e 4/5

0

100

200

300

400

500500600700800

*

*

Tau

in p

g/m

l

Figure 1. CSF tau protein concentrations show significant (*) differences between

plegic dogs with IVDH (grade 4/5, n = 20) and both, control dogs (n = 12, P = 0.016)

and paretic dogs with IVDH (grade 2/3, n = 31, P = 0.025).

The CSF tau protein concentrations were significantly (P = 0.016) higher in dogs with

plegia (grade 4/5, median: 79.9 pg/mL, range: 0 – 778.7 pg/mL) compared to control

dogs. In dogs with paresis (grade 2/3) CSF tau levels were also higher

Ergebnisse

52

(median: 30.1 pg/mL, range: 0 – 193.1 pg/mL) than in control dogs, however, this

difference did not reach the level of significance (P = 0.175). Moreover, a difference

was noted within the group of dogs with IVDH as plegic dogs showed significantly

higher tau concentrations compared to paretic dogs (P = 0.025).

An association could be assessed for CSF tau concentration and functional outcome.

Dogs with IVDH (n = 51) that improved by one neurologic grade within a week

(n = 23) had significant lower CSF tau levels (P = 0.015) than dogs which needed

more time for neurological improvement or that did not show any improvement

(n = 28; Fig. 2). Considering only plegic dogs, this correlation revealed to be even

more significant (P = 0.008; Fig. 3).

improv

emen

t

no im

prov

emen

t

0

100

200

300

400400500600700800

*

Tau

in p

g/ml

Figure 2. Association of CSF tau levels in dogs with IVDH (n = 51) and outcome.

Twenty-three dogs showed neurologic improvement whereas 28 dogs did not

improve after one week. Low CSF tau concentrations correlate significantly (*) with a

better functional outcome (P = 0.015)

Ergebnisse

53

improv

emen

t

no im

prov

emen

t

0

200

400

600

800*

Tau

in pg

/ml

Figure 3. Comparison of CSF tau protein concentrations within the group of plegic

dogs due to IVDH (grade 4/5, n = 20) with 6 of the dogs showing neurological

improvement defined as amelioration by one neurologic grade within one week and

14 with no improvement. Lower CSF tau levels in plegic dogs with IVDH correlate

significantly (*) with a better functional outcome (P = 0.008)

CSF tau concentrations were evaluated in relation to MRI T2-weighted (T2W)

hyperintensities in the myelon, previous treatment with corticosteroids, duration of

clinical signs before admission and localization of IVDH (cervical vs. thoracolumbar).

Protein tau levels in dogs with thoracolumbar IVDH (median: 48.3 pg/mL, range: 0 –

282.6 pg/mL) were higher compared to dogs with cervical IVDH (median: 24.3

pg/mL, range: 0 – 778.7 pg/mL), even though this difference was not significant.

(P = 0.238)

Ergebnisse

54

No statistical difference (P = 0.319) in tau levels between dogs with or without the

administration of glucocorticosteroids could be detected. Additionally, no correlation

of the CSF tau concentrations was found for T2W spinal cord hyperintensity

(P = 0.087) and duration of clinical signs at admission (P = 0.759)

The ROC curve analysis suggested an optimal CSF tau cut-off value of > 41.3 pg/mL.

At this point the sensitivity and specificity for predicting an unsuccessful functional

outcome in plegic dogs were 86% and 83%, respectively. Area under the ROC curve

(AUC) was estimated at 0.887 (95% CI: 0.717 to 1.057) and the overall ability of CSF

tau concentration to predict unsuccessful functional outcome was significant

(P = 0.07). (Fig. 4)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1 - Specif icity

Sen

sitiv

ity

Figure 4. Receiver-operating characteristic curve (ROC) to predict unsuccessful

outcome for tau protein concentration in the CSF of 20 dogs showing paraplegia due

to IVDH. Sensitivity and specificity of this test at 41.3 pg/ml were 86% and 83%,

respectively and indicated by a circle.

A CSF tau cut-off value of > 59.5 pg/mL with a sensitivity of 60% and specificity of

84% to identify plegic dogs out of all dogs with IVDH was recommended by ROC

curve analysis. AUC was estimated at 0.684 (95% CI: 0.519 to 0.849) and the ability

of CSF tau concentration to classify dogs as grade 4/5 was significant (P = 0.028).

Ergebnisse

55

Discussion

The pathophysiology of intervertebral disk herniation includes primary and secondary

injury of the spinal cord and associated vascular structures. The severity of the injury

and therefore the extent of neuronal damage is thought to be a function of the

amount, speed and duration of cord compression (Kearney et al., 1988; Carlson et

al., 2003). Axons are damaged either because of direct physical disruption or nerve

transmission is negatively influenced by regional hemorrhages or edema (Anderson

and Hall, 1993). Furthermore, secondary injury may lead to neuronal cell death due

to necrosis and apoptosis. This contributes to a loss of neurons which most likely has

a negative impact on outcome (Li et al., 2000). Necrosis typically occurs shortly after

the primary injury, whereas apoptosis can occur weeks following the injury (Crowe

et al., 1997).

Several biomarkers have been examined for their potential to indicate axonal injury.

The study of Brisby et al. (1999) demonstrated that patients with disk herniation have

increased concentrations of neurofilament protein in the CSF, indicating the damage

of axons in the affected nerve root. Additionally, the measurement of glial fibrillary

acidic protein (GFAP) in CSF of humans after trauma to the cervical spine revealed

the possibility to quantify the degree of nerve cell injury (Guéz et al., 2003).

Neuronal cell death is likely to cause a release of intracellular microtubule binding

proteins such as tau into the extracellular space where they are transported by

convective bulk flow to CSF (Segal, 1993). Tau protein was hypothesized to be a

good marker for axonal injury because this protein is localized primarily in neurons

and is enriched in the axonal compartment (Binder et al., 1985).

In humans tau is expressed from a single gene that undergoes alternate splicing

resulting in six tau isoforms which range from 352 to 441 amino acids (Goedert et al.,

1989). Tau proteins can be separated into two groups, the low molecular weight tau

proteins expressed in neurons of the CNS, and the high molecular weight tau

proteins most abundant in the peripheral nervous system (Georgieff et al., 1993). Tau

proteins play an important role in the neuronal microtubules network involved in

axonal transport and neuronal transmission (Drubin, 1986). By regulating microtubule

Ergebnisse

56

assembly, tau proteins participate in modulating axonal morphology and growth

(Buee et al., 2000).

Tau has been the focus of multiple studies over the last years and different authors

have shown that CSF tau levels correlate with the degree of pathological changes in

the CNS. In human patients with head trauma a correlation/positive association

between clinical improvement and decreased CSF tau levels was observed (Zemlan

et al., 1999). Moreover, a severity-dependent elevation of tau in humans with acute

SCI has been demonstrated (Kwon et al., 2010). In contrast, as tau is an

intraneuronal nonreleased protein, CSF tau levels in dogs free of axonal injury are

expected to be low (Mori et al., 1995). This assumption was confirmed in our study by

the low median tau concentration in the control group and was proven in a previous

study where a mean tau level of 29.3 pg/mL was detected in the CSF of healthy dogs

(Tanaka et al., 2011).

A concentration gradient was assessed along the spinal cord for some CSF proteins

(Blennow et al., 1993). However, Sjögren et al., (2001) demonstrated that the volume

of CSF does not influence the tau concentration measured. This enables the

introduction of CSF tau measurements into the clinical routine, where the volume of

CSF collected often differs due to different sizes and bodyweights of the various dog

breeds.

Results of the present study indicate that in dogs with IVDH, CSF tau concentration

was associated with the degree of neurologic dysfunction and the functional

outcome. Although CSF tau has not been investigated previously in dogs with IVDH,

data from human traumatic brain injury as well as SCI are consistent with these

results (Zemlan et al., 1999; Kwon et al., 2010).

Disk herniations with the same dynamic properties and identical volume of extruded

material usually cause more severe damage in the thoracolumbar than in the cervical

spine, due to the smaller epidural space in the thoracolumbar region (Brisson, 2010).

This observation was confirmed in our study by higher protein tau levels in patients

with thoracolumbar IVDH compared to dogs with cervical IVDH, even though this

difference did not reach significance.

Ergebnisse

57

An area of hyperintensity greater than or equal to the length of the L2 vertebral body

in T2W MRI in paraplegic dogs with thoracolumbar IVDH has proven to correlate with

poor functional recovery (Schouman-Claeys et al., 1990; Ito et al., 2005). This

hyperintensity was thought to be caused by hemorrhage, inflammation, edema, and

necrosis (Flanders et al., 1999). As of this multifactorial pathogenesis it is not entirely

surprising that there was no clear association between high protein tau levels and

spinal cord T2W hyperintensity.

In our study no statistical difference in tau levels between dogs with or without the

administration of glucocorticosteroids could be detected. The benefit of this treatment

is controversially discussed, partly because of the risk of harmful side effects (Faden

et al., 1984; Olby, 1999; Davis and Brown, 2002). In dogs with encephalitis tau

protein levels were shown to be significantly lower if they were treated with

glucocorticosteroid (Tanaka et al., 2011).

Using a cut-off value of 41.3 pg/mL CSF tau concentration was a significant and

sensitive predictor of functional outcome in plegic dogs with IVDH. As the AUC

implies a way to measure the accuracy of a diagnostic test, it can be concluded, that

measuring protein tau in the CSF of plegic dogs to determine the functional outcome,

has a test precision of 89% (Hanley and McNeil, 1982). According to Swets (1988)

this is only a moderate accuracy for a diagnostic test. Other studies which

investigated possible prognostic biomarkers in the CSF of dogs with IVDH showed

comparable test accuracy (Levine et al., 2010; Srugo et al., 2011). A combination of

different biomarkers might still result in the most accurate outcome prediction

(Witsberger et al., 2012).

With a sensitivity of 60% and a test accuracy of 68% CSF tau concentrations could

not identify the neurologic grade. This lack of sensitivity is most likely due to the fact

that severity of neurologic signs can not only be explained by the amount of

damaged neuronal tissue but is also substantiated in acute edema, demyelination

and accompanying inflammation of the myelon. Therefore dogs may show severe

neurologic signs even though the loss of neurons and with it the release of protein

tau is minimal.

Ergebnisse

58

A possible limitation of this study is the collection site of CSF samples from the

cerebellomedullary cistern. Lumbar samples are more sensitive for the detection of

abnormalities because of the mainly caudal flow of CSF (Thomson et al., 1989,

1990). Thus, present results might underestimate CSF tau levels in dogs with IVDH,

particularly thoracolumbar IVDH. Lumbar samples were not chosen because of

possible iatrogenic blood contamination.

Previous investigations have shown that the material of test tubes may affect the

results obtained for tau. Even though tau levels did not decrease when samples were

collected in polystyrene tubes it is recommended to use non-absorbent

polypropylene tubes, which definitely have no impact on tau concentrations (Sjögren

et al., 2001). Another study examined the influence of freezing and storage on CSF

tau, revealing that neither a long period of storage nor repetitive freezing and thawing

(up to six cycles) influenced tau concentrations (Schoonenboom et al., 2005). This is

important as the retrospective design of our study implied that some samples had

been stored for a longer time before they were analyzed.

Conclusion

The measurement of protein Tau with an ELISA is reliable and easily performed.

CSF tau concentrations correlate with the degree of damaged neuronal tissue. Thus

CSF tau can be considered as a good biomarker for SCI in dogs with IVDH. A high

protein tau level has a strong potential as a useful prognostic factor in dogs showing

plegia due to IVDH. The biomarker tau protein can be used to support other

assessment tools such as clinical and MRI findings.

Ergebnisse

59

Conflict of interest statement

None of the authors of this paper has a financial or personal relationship with other

people or organisations that could inappropriately influence or bias the content of the

paper.

Acknowledgment

This study was partly funded by the German Research Foundation (FOR 1103). V.M.

Stein was supported by the Frauchiger Stiftung, Berne, Switzerland.

The author wishes to thank Arianna Maiolini for her general assistance and Dr. Rohn

(Department of Epidemiology and Information Processing, University of Veterinary

Medicine Hannover, Germany) for helping with statistical analysis.

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Übergreifende Diskussion

67

4. Übergreifende Diskussion

Der Liquor cerebrospinalis ist physiologischerweise eine klare, zell-, protein- und

metabolitenarme Flüssigkeit. Die Untersuchung dieser Gehirnrückenmarksflüssigkeit

liefert bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen wertvolle Hinweise für die

Stellung der richtigen Diagnose (ABATE et al. 1998). Dabei ermöglicht die moderne

Labordiagnostik neben der Bestimmung einiger Standardparameter wie Zellzahl,

Glukose- und Proteingehalt auch die Messung von Stoffwechselmetaboliten,

Enzymen und speziellen Antikörpern (DI TERLIZZI u. PLATT 2006).

Im Vergleich zu Serum weist physiologischer Liquor cerebrospinalis eine deutlich

niedrigere Gesamtproteinkonzentration auf. Pathologische Prozesse resultieren in

einer unspezifischen Erhöhung des Proteingehaltes im Liquor. Dieser Anstieg ist

entweder die Folge einer Störung der Blut-Hirn-Schranke und einem damit

verbundenen, verstärkten Proteineinstrom oder das Ergebnis einer lokalen

(intrathekalen) Produktion von Immunglobulinen (FISHMAN 1992).

Der Hauptanteil der Proteine (Albumin, Immunglobuline) des Liquor cerebrospinalis

entstammt dem Blutplasma oder entsteht nach Entzündungsreaktion infolge einer

intrathekalen Produktion. Die übrigen Proteine werden im ZNS selbst gebildet;

trotzdem sind sie selten spezifisch für das Gehirn (THOMPSON 1988). Diese so

genannten „brain-derived proteins“ können entsprechend ihrer unterschiedlichen

Herkunft aus dem Gehirnparenchym in drei Gruppen unterteilt werden (REIBER

2001):

1. Proteine aus Neuronen und Gliazellen wie z.B. Tau-Protein, S-100, NSE

(Neuronen-spezifische Enolase)

2. Proteine aus den Leptomeningen wie z.B. β-trace Protein, Cystatin C

3. Proteine mit einem zusätzlichen Anteil aus der Blutbahn wie z.B.

Transthyretin, ACE (angiotensin converting enzyme).

Die Analyse dieser speziellen Proteinfraktionen stellt in der Humanmedizin eine

wichtige Erweiterung der Liquordiagnostik dar (REIBER 2001). So können erhöhte

Gehalte an Tau-Protein im CSF beim Menschen einen Hinweis auf das Vorliegen

einer Alzheimer Erkrankung geben (BLENNOW et al. 1995; ANDREASEN et al.


68

1998). Die gezielte Messung einzelner Immunglobuline hat auch in der Tiermedizin

bereits an Bedeutung gewonnen, da gezeigt werden konnte, dass eine simultane

Erhöhung von Immunglobulin A in Serum und Liquor ein starkes Indiz für das

Vorliegen einer steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis ist (TIPOLD u. JAGGY 1994).

Die vorliegende Arbeit gibt einen Überblick über die Bedeutung der Analyse des CSF

in der neurologischen Diagnostik mit dem Schwerpunkt der Bestimmung von

Immunglobulin A bei der kaninen steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis sowie der

Messung von Tau-Protein bei Hunden mit Bandscheibenvorfall.

Das Ziel der ersten Studie war die Etablierung und Validierung einer neuen

Messmethode für die zeitnahe Bestimmung von IgA in Serum und Liquor

cerebrospinalis des Hundes.

Die Einführung einer neuen Labormethode kann aus verschiedenen Gründen, wie

zum Bespiel Zeitersparnis oder Kostenreduktion, erfolgen. Für die Bestimmung von

Immunglobulin A in Serum und Liquor cerebrospinalis wurde bisher ein in unserem

Labor entwickelter ELISA genutzt (TIPOLD et al. 1994). Der früher verwendete radial

immunodiffusion assay (RID), welcher als Goldstandard anzusehen ist, steht nicht

mehr zur Verfügung. Kommerziell erhältliche ELISA-Testkits sind nur für die

Messung von IgA im Serum geeignet. Gründe für die Etablierung einer neuen

Messmethode waren demnach:

• Der Bedarf an einer alternativen Messmethode für die Bestimmung

von IgA im CSF

• Die Aussicht auf eine zeitnahe Bestimmung von Einzelproben

• Die Möglichkeit der Messung von IgA in geringen Probenvolumina.

Der „microsphere-based immunofluorescence assay“ (MIA) wurde als potentielle

neue Messmethode ausgewählt, da diesem Verfahren ein dem ELISA ähnliches

Funktionsprinzip zu Grunde liegt und somit die im ELISA etablierten Antikörper

genutzt werden konnten. Zudem war es bereits in anderen Studien gelungen, eine

gute Korrelation zwischen den Ergebnissen beider Messverfahren aufzuzeigen

(MCHUGH et al. 1989; SYRJALA et al. 1991; KWITTKEN et al. 1994).


69

Beide Methoden benötigen eine Festphase für die stattfindende biochemische

Nachweisreaktion, wobei im ELISA die flachen Böden der Mikrotiterplatten und im

MIA die sphärische Oberfläche der „Beads“ diese Vorraussetzung erfüllen. Im

Gegensatz zur kolorimetrischen Bestimmung der Analyten im ELISA, nutzt der

MIA allerdings die Fluoreszenz zur Detektion. Durchflusszytometrische

immunfluoreszenz-basierte Methoden bieten einige Merkmale, die besonders für die

serologische Diagnostik wertvoll sind. Neben der Möglichkeit zur Quantifizierung der

Fluoreszenzintensität und der einzelnen Betrachtung von Zell-/Partikelpopulationen

ist auch die Steigerung der statistischen Genauigkeit durch die hohe Anzahl

gemessener Partikel von Vorteil (MCHUGH et al. 1989).

Die Validierung einer neuen Messmethode ist ein komplexes Unterfangen.

Verschiedene Autoren in der Human- und Veterinärmedizin beschreiben

unterschiedliche Vorgehensweisen bei der Gestaltung einer Methodenvalidierung

und der Interpretation der Ergebnisse. Die OIE (Office International des Epizooties)

hat 1996 einen Leitfaden zur Validierung von Testmethoden für die Diagnose von

Infektionskrankheiten in veterinärmedizinischen Laboren erstellt. Prinzipien der

Standardisierung und Validierung von ELISAs im Speziellen wurden bereits 1993 von

WRIGHT et. al. diskutiert. Da die genannten Autoren sich insbesondere mit

diagnostischen Tests zur Erkennung von Infektionskrankheiten bei Tieren beschäftigt

haben, sind diese Protokolle für die Validierung einer Methode zur Messung von IgA

mit anschließendem Vergleich der Methoden allerdings nur begrenzt geeignet.

LUMSDEN (2000) sowie JENSEN u. KJELGAARD-HANSEN (2006) beschreiben

mögliche Vorgehensweisen für die Beurteilung einer neuen Messmethode und die

statistische Aufarbeitung der Daten für den Methodenvergleich in der

Veterinärmedizin. Neben der Abschätzung der benötigten Probenanzahl, der

Definition des klinisch relevanten Messbereiches, der Bestimmung der Präzision und

Reproduzierbarkeit der neuen Methode ist die Beurteilung der klinischen

Anwendbarkeit von wesentlicher Bedeutung (LUMSDEN 2000; JENSEN u.

KJELGAARD-HANSEN 2006). Des Weiteren gilt es Vor- und Nachteile der neuen

Methode aufzudecken und diese im Zusammenhang mit Merkmalen der

Vergleichsmethode zu bewerten. Die Besonderheit des Methodenvergleichs bei


70

Immunoassays ist die Verwendung möglichst vieler gleicher Komponenten, denn

unterschiedliche Antikörper, Puffer, Substrate und Inkubationszeiten können zu

deutlichen Veränderungen der Ergebnisse führen und so eine vergleichende

Bewertung unmöglich machen (LAPPIN 2000). Wie bereits erwähnt, war es durch

das ähnliche Funktionsprinzip beider Methoden möglich, die gleichen Antikörper

einzusetzen. Um eine optimale Standardkurve zu erhalten, musste allerdings eine

Anpassung der Verdünnung des Sekundärantikörpers (Maus-gegen-kanines-IgA)

erfolgen. Bei einer Verdünnung von 1:2,5 zeigte sich ein sigmoidaler Verlauf der

Standardkurve, anhand derer die IgA-Konzentrationen der insgesamt 44

korrespondieren Serum- und Liquorproben berechnet werden konnten.

Präzision und Reproduzierbarkeit einer Methode werden durch Intra- und Interassay-

Varianz, ausgedrückt als Variationskoeffizient, beschrieben. Die Intraassay-Varianz

für die Bestimmung von IgA im Liquor cerebrospinalis lag bei beiden Methoden in

einem sehr guten Bereich (Beads: 5,5%, ELISA: 4,09%). Im Serum zeigte sich

allerdings ein deutlicher Unterschied zwischen den Methoden (Beads: 11,2%,

ELISA: 4,0%), welcher dann auch bei der Interassay-Varianz für Serum und Liquor

festgestellt wurde (Beads CSF: 41,9% Serum: 42,6%; ELISA CSF: 29,7%

Serum: 16,1%). Diese hohe Variabilität des MIAs könnte einerseits durch

Quervernetzungen zwischen den Beads, die den Anteil freier Antikörperbindungs-

stellen reduzieren und so zu Messschwankungen führen, oder andererseits durch

unspezifische Bindungsreaktionen mit sonstigen im Serum enthaltenen Proteinen

hervorgerufen worden sein.

Der Vergleich der Methoden nach BLAND u. ALTMAN (1986) ergab für die CSF-

Proben zunächst eine gute Übereinstimmung, da 97,3% der Messwerte im Bereich

der „limits of agreement“ lagen. Bei genauer Betrachtung des Bland-Altman-Plots

wurde allerdings die große Spannweite des Übereinstimmungsintervalls deutlich, so

dass letztendlich nur noch eine moderate Konformität bestätigt werden konnte.

Die bei den Serumproben ermittelte große Streuung und Verzerrung der Daten mit

weit auseinander liegenden Grenzen des Übereinstimmungsintervalls waren nicht

akzeptabel und die Hypothese der Gleichheit der Methoden musste abgelehnt

werden.


71

Um zu prüfen, ob der MIA für die Diagnosestellung der SRMA geeignet ist, wurde ein

zusätzlicher Vergleich der Messwerte anhand des klinischen Referenzbereiches

durchgeführt. Bei den Liquorproben stimmten 84,2% der mit den Beads gemessenen

Werte mit der im ELISA ermittelten IgA-Konzentration überein. Somit ist der MIA als

Methode zur Messung von IgA im Liquor gut anwendbar, aber nicht geeignet für die

Konzentrationsbestimmung im Serum, da hier nur 18,2% der Werte übereinstimmten.

Die mit dem kommerziell erhältlichen ELISA gemessenen IgA-Konzentrationen im

Serum waren weder mit den Ergebnissen des ELISAs nach TIPOLD et al. (1994),

noch mit den Messwerten des MIAs vereinbar. Dies bestärkt den Gedanken, dass

jeder Test individuell und in Zusammenhang mit seinen eigenen Referenzbereichen

bewertet werden sollte (JACOBSON u. ROMATOWSKI 1996). Die Tatsache, dass in

der veterinärmedizinischen Literatur uneinheitliche Referenzwerte für die IgA-

Konzentrationen in Serum und Liquor zu finden sind, unterstreicht die Notwendigkeit,

allgemein anerkannte Werte für IgA-Konzentrationen bei Hunden anzugeben bzw. zu

erarbeiten (REYNOLDS u. JOHNSON 1970; HEDDLE u. ROWLEY 1975;

FELSBURG et al. 1985; GLICKMAN et al. 1988; SCHREIBER et al. 1992; TIPOLD et

al. 1994; GRIOT-WENK et al. 1999).

Verschiedene Faktoren hatten einen limitierenden Einfluss auf die Studie. Zum einen

fehlte zum Vergleich ein definitiver Goldstandard, denn der ELISA stellte lediglich

eine Referenzmethode dar. Somit gestaltete sich die Validierung der neuen Methode

schwierig und es war ausschließlich ein Vergleich der Methoden untereinander

möglich. Zum anderen gab es einen Unterschied in den verwendeten Verdünnungs-

stufen des Sekundärantikörpers. Dies führte zu einer nicht komplett gleichartigen,

materiellen Ausgangsbasis und muss somit als mögliche Ursache für die detektierten

Variationen in Erwägung gezogen werden.

Schlussfolgernd lässt sich sagen, dass der MIA den ELISA nicht ersetzen wird, die

Methode aber durchaus Vorteile mit sich bringt. Es konnte gezeigt werden, dass die

Methode einfach durchzuführen ist und dass trotz der statistisch gesehenen eher

geringen Übereinstimmung eine gute klinische Anwendbarkeit für die Messung von

IgA im Liquor cerebrospinalis vorliegt. Die Evaluierung eigener Referenzwerte für

den MIA kann im Rahmen weiterer Studien empfohlen werden. Zusätzlich bietet der


72

MIA die Möglichkeit, andere Proteine (z.B. Cytokine, Chemokine), gegebenenfalls

auch in Multiplex-Systemen, im Liquor zu bestimmen. Diese simultane Messung

verschiedener Analyten in einer einzelnen Probe ermöglicht nicht nur eine

Erweiterung der diagnostischen Möglichkeiten in der Neurologie, sondern könnte

auch zur Erforschung von bisher noch unbekannten Pathomechanismen beitragen.

In der zweiten Studie wurde der Gehalt an Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei

51 Hunden mit zervikalem oder thorakolumbalem Bandscheibenvorfall, sowie bei 12

gesunden Hunden bestimmt.

Bandscheibenvorfälle beim Hund sind eine häufige Ursache einer traumatischen

Schädigung des Rückenmarks. Durch die komplette oder partielle Verlagerung der

Bandscheibe aus ihrer physiologischen Lage zwischen den Wirbelkörpern entsteht

eine mehr oder weniger starke Kompression des Rückenmarks mit Durchblutungs-

störungen und Hypoxie als Konsequenz (JAGGY 2005). Die Weiterleitung von

neuronalen Signalen wird aufgrund der direkten physikalischen Durchtrennung von

Axonen oder durch den negativen Einfluss von Blutungen und Ödemen in der

Umgebung gestört (ANDERSON u. HALL 1993). Zusätzlich kann es im weiteren

Verlauf durch eine Kaskade sekundärer pathophysiologischer Reaktionen zur

Nekrose und Apoptose von Nervenzellen kommen (PLATT u. OLBY 2004).

Der Untergang neuronaler Zellen resultiert in der Freisetzung von intrazellulären

Bestandteilen, darunter auch Tau-Protein, in das umliegende Gewebe, von wo aus

sie in den Liquor cerebrospinalis gelangen (SEGAL 1993). Da Tau-Protein primär in

den Nervenzellen und dort besonders in den Axonen lokalisiert ist, wurde die

Hypothese aufgestellt, dass Tau-Protein als Biomarker für axonale Schäden dienen

könnte (BINDER et al. 1985).

In der Vergangenheit ist eine Vielzahl von Biomarkern auf ihr Potential axonale

Zellschäden zu quantifizieren untersucht worden. So erlauben zum Beispiel die

Konzentrationen an Neurofilament-, sauren Gliafaser- und S-100beta-Proteinen in

der Gehirnrückenmarksflüssigkeit die Abschätzung neuronaler Schäden bei

Menschen mit Rückenmarkstrauma (BRISBY et al. 1999; GUÉZ et al. 2003; KWON

et al. 2010).


73

Studien in der Humanmedizin an Patienten mit Schädel-Hirn-Trauma bzw. mit

Rückenmarksverletzungen konnten zeigen, dass die Konzentration von Tau-Protein

im Liquor cerebrospinalis im Zusammenhang mit der Schwere neurologischer

Defizite der Patienten steht (ZEMLAN et al. 1999; KWON et al. 2010).

Das Ausmaß der Rückenmarksläsionen bei einem Bandscheibenvorfall ist variabel

und dementsprechend variieren auch die resultierenden neurologischen Defizite, die

von Hyperästhesien im Bereich der Wirbelsäule bis zu vollständigen Lähmungen der

Gliedmaßen reichen können (JAGGY 2005). Grundsätzlich gesehen ist der

Bandscheibenvorfall eine gut zu therapierende Erkrankung. Für die Entscheidung,

welches Therapiekonzept zum Einsatz kommt, ist die Einschätzung der Prognose

von großer Bedeutung.

In den letzten Jahren wurden insbesondere die Beurteilung der Tiefensensibilität

sowie die Befunde der Magnetresonanztomographie als Anhaltspunkte für die

Stellung der Prognose verwendet (SCOTT 1997; LEVINE et al. 2009; BOEKHOFF et

al. 2012). Da aber auch Hunde mit Verlust des Tiefenschmerzens eine Erholungs-

chance von 43 bis 75% besitzen, und da das Auffinden von veränderten

Signalintensitäten im betroffenen Rückenmarksabschnitt im MRT nicht zwangsläufig

auf Gewebsnekrosen und -malazien schließen lässt, bedarf es weiterhin eines

verlässlichen prognostischen Faktors (YOVICH et al. 1994; DUVAL et al. 1996;

FLANDERS et al. 1999; OLBY et al. 2003; ITO et al. 2005; RUDDLE et al. 2006).

Aus diesem Grund beschäftigten sich verschiedene, in den letzten Jahren

erschienene Veröffentlichungen, mit Möglichkeiten zur genaueren Stellung der

Prognose von Bandscheibenvorfällen beim Hund, wobei auch Studien mit Analyse

unterschiedlicher Substanzen im Liquor cerebrospinalis durchgeführt wurden.

Ein Zusammenhang zwischen dem Grad der neurologischen Defizite und den

Konzentrationen an Glutamat und Beta-2-Microglobulin im Liquor wurde entdeckt

(OLBY et al. 1999; MUÑANA et al. 2007). Messungen der Kreatinkinase und des

Myelin-basischen Proteins ergaben signifikant höhere Werte bei Hunden, die nach

der Operation keine Spontanbewegungen aufwiesen (LEVINE et al. 2010;

WITSBERGER et al. 2012). SRUGO et al. (2011) zeigten, dass eine Pleozytose mit

der Schwere der Rückenmarksläsion korreliert. Der prozentuale Anteil an


74

Makrophagen, sowie die Aktivität der Kreatinkinase im Liquor sind mögliche

prognostische Indikatoren (SRUGO et al. 2011; WITSBERGER et al. 2012).

In der vorliegenden Studie wurden die Zusammenhänge zwischen der Anamnese

(Dauer der Erkrankung, Vorbehandlung), dem Grad der neurologischen Symptome,

den Befunden der bildgebenden Diagnostik (Magnetresonanztomographie), dem

Verlauf während des stationären Aufenthaltes und der Konzentration des Tau-

Proteins im Liquor cerebrospinalis beurteilt.

Tau-Protein gehört nicht in die Gruppe der sekretorischen Proteine, so dass bei

gesunden Hunden niedrige Messwerte im Liquor erwartet werden. Diese Vermutung

wurde durch die geringen Konzentrationen an Tau-Protein bei den gesunden

Kontrollhunden in dieser, sowie in einer vorhergehenden Studie, bestätigt (TANAKA

et al. 2011).

Aufgrund des schmaleren Epiduralraums im Bereich der thorakolumbalen Wirbel-

säule verursachen Bandscheibenvorfälle mit gleichen dynamischen Eigenschaften

und identischem Volumen an extrudiertem Material in dieser Region in der Regel

schwerere Schäden als im Bereich der Halswirbelsäule (BRISSON 2010). Diese

Beobachtung bestätigte sich in der Studie durch höhere Tau-Protein-Konzentrationen

bei Patienten mit thorakolumbalem Bandscheibenvorfall im Vergleich zu Hunden mit

zervikaler Läsion, auch wenn dieser Unterschied keine Signifikanz erreichte.

Vorhergehende Studien an der Klinik für Kleintiere verdeutlichten die Bedeutung der

Befunde im MRT für die Stellung der Prognose (BULL 2006; BOEKHOFF 2010).

Eine intramedulläre hyperintense Läsion in der T2-gewichteten MRT-Sequenz, die

mindestens der Länge des zweiten Lendenwirbelkörpers entspricht, korreliert

signifikant mit einem schlechteren Genesungserfolg (ITO et al. 2005). Solch eine

Hyperintensität des Myelon kann durch pathologische Prozesse wie Nekrosen,

Myelomalazien, Blutungen oder Ödeme bedingt werden (SANDERS et al. 2002).

Aufgrund dieser multifaktoriellen Genese ist es nicht überraschend, dass kein

signifikanter Zusammenhang zwischen erhöhten Tau-Protein-Gehalten im Liquor

cerebrospinalis und einer Hyperintensität des Rückenmarks in der T2-gewichteten

Sequenz gefunden werden konnte. Es zeigte sich allerdings, dass Hunde mit


75

T2-gewichteten hyperintensen Läsionen im Myelon tendenziell höhere Tau-Protein-

Konzentrationen aufwiesen als Hunde ohne einen derartigen MRT-Befund.

Eine Behandlung mit Glukokortikosteroiden bei Hunden mit Enzephalitiden äußert

sich in signifikant niedrigeren Tau-Protein-Konzentrationen im Liquor (TANAKA et al.

2011). Im Gegensatz dazu konnte in der vorliegenden Studie bei Hunden mit

Bandscheibenvorfällen kein eindeutiger Effekt durch die Gabe von steroidalen

Antiphlogistika auf den Tau-Protein-Gehalt im Liquor nachgewiesen werden. Es gab

eine leichte Tendenz, dass Hunde unter Glukokortikosteroid-Einfluss geringere Tau-

Messwerte aufzeigen, aber diese Beobachtung erreichte keine Signifikanz.

Glukokortikosteroide werden oft mit der Absicht verabreicht, die Kaskade sekundärer

Pathomechanismen zu beeinflussen, um Schäden im Rückenmark zu minimieren

(HALL 1993). Der tatsächliche Nutzen dieser Behandlung ist allerdings umstritten,

unter anderem aufgrund der potentiellen Nebenwirkungen (FADEN et al. 1984;

OLBY 1999; DAVIS u. BROWN 2002).

BOEKHOFF et. al (2012) konnten zeigen, dass das Ausmaß der Rückenmarks-

kompression signifikant mit der Dauer des Krankheitsgeschehens ansteigt. Eine

Assoziation zwischen den Tau-Protein-Messwerten und der Zeitspanne der

Erkrankung ließ sich jedoch nicht nachweisen. Eine mögliche Erklärung dafür ist die

Tatsache, dass eine Kompression des Rückenmarks auch durch Ödeme und

Blutungen hervorgerufen werden kann. Dies sind potentiell reversible Erscheinungen

und müssen daher nicht in einer erhöhten Menge an geschädigtem neuronalem

Gewebe respektive einer gesteigerten Tau-Protein Freisetzung resultieren.

Die Tau-Protein-Konzentration im Liquor cerebrospinalis von Hunden mit Band-

scheibenvorfällen korreliert sowohl mit dem Grad der neurologischen Symptome als

auch mit dem Krankheitsverlauf. Hunde, die eine Besserung des neurologischen

Status innerhalb von einer Woche zeigten, hatten signifikant niedrigere Tau-Protein-

Messwerte als Hunde, bei denen keine Verbesserung der Symptomatik innerhalb

dieses Zeitraums auftrat (p = 0,015). Eine noch deutlichere Signifikanz erreichte der

genannte Zusammenhang bei alleiniger Betrachtung des Krankheitsverlaufes der

plegischen Hunde (p = 0,008). Der mittels der ROC-Kurvenanalyse errechnete

Grenzwert von 41,3 pg/ml lässt schlussfolgern, dass bei höheren CSF-Tau-Protein-


76

Messwerten ein ungünstigerer klinischer Verlauf bei plegischen Hunden

wahrscheinlich ist. Die Beobachtungen dieser Studie decken sich mit Erkenntnissen

aus der Humanmedizin (KWON et al. 2010) und bestätigen die eingangs gestellte

Hypothese, dass die Tau-Protein-Konzentration im Liquor mit der Schwere der

Schädigung des Rückenmarks bei Hunden mit Bandscheibenvorfall korreliert.

Einen limitierenden Einfluss auf die Ergebnisse hatte die Entnahme des Liquor

cerebrospinalis aus der Cisterna cerebellomedullaris. Aufgrund des vorwiegend

caudalen Flusses der Gehirnrückenmarksflüssigkeit bieten lumbal gewonnene

Liquorproben in der Regel eine größere Sensitivität für die Detektion von Pathologien

im Bereich des thorakolumbalen Rückenmarks, bergen aber auch ein höheres Risiko

der iatrogenen Blutkontamination (THOMSON et al. 1989, 1990). Die vorliegenden

Ergebnisse könnten somit den tatsächlichen Gehalt an Tau-Protein im Liquor noch

unterschätzen, insbesondere bei Hunden mit thorakolumbalen Bandscheiben-

vorfällen.

Neben den klinisch bedeutsamen Erkenntnissen ist auch die Probenhandhabung ein

wichtiger Aspekt für die Etablierung der Messung des Tau-Proteins in der

veterinärmedizinischen Liquordiagnostik. Weder eine längere Lagerung noch

wiederholtes Auftauen und Einfrieren (bis zu sechs Zyklen) beeinflussen die Tau-

Protein-Konzentration im CSF (SCHOONENBOOM et al. 2005). Das Material der

Teströhrchen kann jedoch die Messergebnisse von bestimmten Proteinen im Liquor

beeinträchtigen. Auch wenn keine bedeutende Abnahme der Konzentration an Tau-

Protein bei der Verwendung von Polystyrol-Röhrchen bemerkt werden konnten, ist es

trotzdem empfehlenswert, nicht absorbierende Polypropylen-Röhrchen, welche

definitiv keine Auswirkungen auf die Messwerte haben, zu verwenden (SJÖGREN et

al. 2001).

Die Studie konnte zeigen, dass Tau-Protein bei Hunden im Liquor cerebrospinalis mit

einem kommerziell erhältlichen ELISA messbar ist und dass die Konzentration an

Tau-Protein mit dem Schweregrad der Rückenmarksschäden bei Hunden mit

Bandscheibenvorfällen korreliert. Damit eignet sich Tau-Protein als Biomarker für

Rückenmarksläsionen im Allgemeinen und kann im Speziellen bei plegischen

Hunden (Grad 4 bzw. 5 nach SHARP u. WHEELER, 2005) als prognostischer Faktor


77

angesehen werden. Die bestmögliche Einschätzung der Prognose gelingt durch eine

Kombination verschiedener diagnostischer Mittel. Der Gehalt an Tau-Protein im

Liquor ergänzt die Befunde der klinischen Untersuchung und bildgebenden

Diagnostik und schafft damit eine gute Basis für die Stellung der Prognose.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Analyse spezifischer Proteine im

Liquor cerebrospinalis wichtige Hinweise für die Diagnose und Prognose

neurologischer Erkrankungen liefert. Bei der kaninen steril-eitrigen Meningitis-

Arteriitis ist das Ergebnis der parallelen Bestimmung von Immunglobulin A in Serum

und Liquor ein entscheidendes Kriterium für die Stellung der Diagnose. Bei Hunden

mit einem Bandscheibenvorfall kann Tau-Protein als Biomarker das Ausmaß der

Rückenmarksschäden beschreiben und so zur besseren Einschätzung der Prognose

beitragen.

Zusammenfassung

78

5. Zusammenfassung

Andrea Rörig: Beurteilung von Immunglobulin A und T au-Protein im kaninen

Liquor cerebrospinalis als diagnostische Hilfsmitte l in der klinischen

Neurologie

Die Untersuchung spezifischer Proteine im Liquor cerebrospinalis liefert wichtige

Anhaltspunkte für die Diagnose und Prognose von neurologischen Erkrankungen.

Die parallele Erhöhung von Immunglobulin A (IgA) in Serum und Liquor (CSF) ist ein

charakteristischer Befund bei Hunden mit steril-eitriger Meningitis-Arteriitis. Die erste

Studie dieser Arbeit diente der Entwicklung und Evaluierung eines „microsphere-

based immunofluorescence assay“ (MIA) zur Messung von IgA mittels

Durchflusszytometrie. Es sollte eine Methode gefunden werden, die schnell

durchführbar ist, nur geringe Probenvolumina von CSF benötigt, die Messung von

Einzelproben erlaubt und einfach in die klinische Labordiagnostik einzugliedern ist.

Die Mikrosphären wurden mit Ziege-gegen-kanines-IgA-Antikörpern beschichtet und

das gebundene IgA dann mit einem Maus-gegen-kanines-IgA-Antikörper in

Kombination mit einem PE-markierten Ziege-gegen-Maus-IgG-Antikörper detektiert.

Die Messergebnisse von 44 kaninen gepaarten Serum- und Liquorproben wurden mit

einem in der Klinik für Kleintiere etablierten ELISA sowie mit einem kommerziell

erhältlichen ELISA verglichen. Die neue Methode ergab eine gute Übereinstimmung

(84,2%) mit dem ELISA zur Messung von IgA im Liquor, aber nur eine geringe

Korrelation für die Serumproben (18,2%). Die Intraassay-Varianz war zufrieden-

stellend (CSF: 5,5%, Serum: 11,2%), die Interassay-Varianz dagegen erreichte für

die Proben einen sehr hohen (CSF: 41,9%, Serum: 42,6%) und für die

Serumkontrollen einen akzeptablen Wert (25,6%). Der „microsphere-based

immunofluorescence assay“ ist ein wertvolles Verfahren zur Bestimmung und

klinischen Interpretation von IgA im Liquor cerebrospinalis des Hundes, das aber

nicht für die Messung von IgA im Serum anwendbar ist. Der Methodenvergleich

belegte, dass jedes Testverfahren unter Beachtung der eigenen Referenzbereiche

ausgewertet werden muss. Der MIA wird den ELISA nicht ersetzen, eröffnet aber

Zusammenfassung

79

Möglichkeiten für weitere Forschungen mit Mikrosphären-Tests, um verschiedene

Proteine im kaninen CSF zu messen. Die Einführung dieser Art von Immunoassays

bietet eine potentielle Verbesserung der Diagnosemöglichkeiten bei verschiedenen

Spezies.

Bandscheibenvorfälle beim Hund sind eine häufige Ursache für Verletzungen des

Rückenmarks. Ein potentieller Marker für neuronale Schädigung ist das mikrotubuli-

assoziierte Protein Tau, welches überwiegend in Nervenzellen und dort besonders in

den Axonen lokalisiert ist. Um die bestmögliche Therapie bei Bandscheibenvorfällen

zu wählen, ist eine vorherige Einschätzung der Prognose wichtig. Aus diesem Grund

sollte in der zweiten Studie dieser Arbeit die Hypothese bewiesen werden, dass Tau-

Protein im Liquor cerebrospinalis mit dem Schweregrad der neurologischen

Symptome und der Genesung bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen korreliert.

Dazu wurden die Daten von 51 Hunden mit thorakolumbalen oder zervikalen

Bandscheibenvorfällen retrospektiv ausgewertet. Signalement, Grad der

neurologischen Störungen, Zeit vom Auftreten der klinischen Symptome bis zur

Vorstellung in der Klinik, Vorbehandlungen (mit besonderer Beachtung der Gabe von

Glukokortikosteroiden), Lokalisation des Bandscheibenvorfalls, pathologische

Veränderungen des Myelon im MRT und der Verlauf der neurologischen

Symptomatik wurden beurteilt. Der Gehalt an Tau-Protein im CSF wurde mittels

eines ELISA bestimmt. Eine statistisch signifikante Korrelation zwischen dem

Schweregrad der neurologischen Symptome und der Konzentration an Tau-Protein

im Liquor konnte gefunden werden. Plegische Hunde zeigten höhere CSF Tau-Werte

(Median: 79,9 pg/ml) im Vergleich zu gesunden (Median: 20,6 pg/ml) und

paretischen Hunden (Median: 30,1 pg/ml). Plegische Hunde, welche sich innerhalb

von einer Woche um einen neurologischen Grad verbesserten, hatten signifikant

niedrigere Tau-Protein Werte als plegische Hunde, die mehr Zeit für die Erholung

benötigten oder keine neurologische Verbesserung zeigten. Eine CSF-Tau-

Konzentration größer als 41,3 pg/ml lässt mit einer Sensitivität von 86% und einer

Spezifität von 83% einen ungünstigen klinischen Verlauf bei plegischen Hunde

vorhersagen. Es ließen sich keine eindeutigen Zusammenhänge zwischen der

Konzentration an Tau-Protein im Liquor und den pathologischen Veränderungen des

Zusammenfassung

80

Myelon im MRT, der Vorbehandlung mit Glukokortikosteroiden, der Lokalisation der

Rückenmarkskompression sowie der Dauer der klinischen Symptome bis zur

Erstvorstellung aufzeigen. Abschließend lässt sich sagen, dass der Gehalt an Tau-

Protein im CSF mit der Schwere der Rückenmarkschädigung bei Hunden mit

Bandscheibenvorfällen korreliert und somit als Indikator für neuronale Verletzungen

angesehen werden kann.

Summary

81

6. Summary

Andrea Rörig: Canine cerebrospinal fluid immunoglob ulin A and tau protein as

diagnostic tools in clinical neurology

The analysis of specific proteins in cerebrospinal fluid supports diagnosis and

prognosis of neurological diseases.

The simultaneous increase of immunoglobulin A (IgA) in serum and cerebrospinal

fluid (CSF) is a characteristic finding in dogs suffering from canine steroid-responsive

meningitis–arteritis. The first study aimed at developing and evaluating a

microsphere-based immunofluorescence assay (MIA) for the measurement of IgA,

trying to establish a quick method requiring only small volumes of CSF and

applicable in daily clinical work-up. Microsphere beads can be measured by flow

cytometry, the evaluation of single probes is feasible. Beads were coated with goat-

anti-dog IgA antibodies and bound IgA was detected by a mouse-anti-dog IgA

antibody in combination with a PE-labeled goat-anti-mouse IgG. Sera and CSF from

44 dogs were tested for IgA concentration and compared with an in-house utilized

ELISA as well as a commercially available ELISA. The new method showed a good

agreement (84.2%) with the ELISA concerning the measurement of IgA in CSF but a

low correlation in serum samples (18.2%). The intraassay variance was within a good

range (CSF: 5.5%, serum: 11.2%), the interassay variance appeared to be quite high

for the samples (CSF: 41.9%, serum: 42.6%), but acceptable for the serum control

(25.6%). The microsphere based immunofluorescence assay proved to be a valuable

method for the determination and the clinical interpretation of IgA in canine CSF, but

this method was not applicable for assessment of IgA values in serum. In conclusion,

the two methods cannot be used interchangeably and method comparison showed

that each test needs to be evaluated with its own reference ranges. The MIA will not

replace the ELISA, but it opens the possibility for further research with microsphere-

based assays, measuring different proteins in canine CSF.

Intervertebral disk herniation (IVDH) is a frequent cause of spinal cord injury (SCI) in

dogs. A prior assessment of prognosis is helpful for the selection of the best

Summary

82

therapeutical approach. Microtubule-associated protein tau derives predominantly

from neurons, especially axons, making it a potential marker of neuronal injury.

Therefore, in the second study the hypothesis should be proven that CSF tau

concentration correlates with the severity of neurological signs and functional motor

recovery in dogs with IVDH. Medical records of fifty-one dogs with thoracolumbar or

cervical IVDH were evaluated retrospectively. Signalement, degree of neurological

dysfunction, time from onset of clinical signs to presentation, previous drug

administration (with emphasis on glucocorticosteroids), localization of the disk

protrusion/extrusion, pathological changes of the myelon detected by magnetic

resonance imaging, and functional neurological outcome were recorded. Cisternal

CSF tau levels were determined by an ELISA. Statistically significant correlation was

found between the neurological status and concentration of protein tau in the CSF.

Dogs displaying plegia had higher CSF tau levels (median: 79.9 pg/ml) compared to

healthy dogs (median: 20.6 pg/ml) and dogs with paresis (30.1 pg/ml). Plegic dogs

that improved by one neurological grade within a week had significantly lower tau

protein levels compared to plegic dogs that needed more time for recovery or did not

show an improvement. A CSF tau concentration of >41.3 pg/ml had a sensitivity of

86% and specificity of 83% to predict an unsuccessful outcome in plegic dogs based

on receiver-operating characteristics curve analysis. No correlation of the CSF tau

concentration was found for T2 hyperintensities detected by magnetic resonance

imaging, administration of glucocorticosteroids, localization of spinal cord

compression (cervical vs. thoracolumbar IVDH), and duration of clinical signs at

admission. In conclusion, CSF protein tau levels are positively associated with the

severity of spinal cord damage in dogs with IVDH and can be used as a marker of

axonal injury. High protein tau levels have strong potential as a useful prognostic

factor in dogs showing plegia due to IVDH.

Abkürzungsverzeichnis

83

7. Abkürzungsverzeichnis

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

Abb. Abbildung

AK Antikörper

Art.-Nr. Artikelnummer

AUC Area under the curve

Best.-Nr. Bestellnummer

BSA Bovines Serum Albumin

bzw. beziehungsweise

°C Grad Celsius

CI Confidence interval, Konfidenzintervall

CNS Central nervous system

CSF Cerebrospinal fluid, Liquor cerebrospinalis,

Gehirnrückenmarksflüssigkeit

CV Coefficient of variation, Variationskoeffizient (%)

DTT Dithiothreitol

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

et al. und andere

Fa. Firma

FACS Fluorescence activated cell sorting

g Erdbeschleunigung, Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/sek2)

g Gramm

h Stunde

IVDH Intervertebral disk herniation, Bandscheibenvorfall

Ig Immunglobulin

kDa Kilodalton

log Logarithmus

M molar, Molarität

MAP Microtubule associated protein

Abkürzungsverzeichnis

84

MFI Mittlere Fluoreszenzintensität

mg Milligramm

MIA Microsphere-based immunofluorescence assay

min. Minute

ml Milliliter

MRI Magnetic Resonance Imaging, (siehe auch MRT)

MRT Magnetresonanztomographie

mM millimolar, Millimolarität

N normal, Normalität

NEM N-Ethylmaleinimid

ng Nanogramm

Nr. Nummer

OPD o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid

p Signifikanzwert

PE PhycoErythrin

PBS Phosphate-Buffered Saline, phosphatgepufferte Salzlösung

pg Picogramm

RID Radial Immunodiffusion assay

ROC Receiver-operating characteristics

SCI Spinal cord injury

sek. Sekunde

Std. Standard

SRMA Steroid-responsive Meningitis-Arteriitis bzw. steril-eitrige Meningitis-

Arteriitis

T2W T2-weighted, T2-gewichtete MRT Sequenz

Tab. Tabelle

u.a. unter anderem

V.a. Verdacht auf

z.B. zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

85

8. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildungen

Abb. 1: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips des MIA S. 21

Abb. 2: Standardkurve mit sigmoidalem Verlauf (IgA-Konzentrationen S. 24

zwischen 0-162ng/ml, Werte logarithmiert)

Abb. 3: Prinzip des Tau-ELISA S. 36

Tabellen

Tabelle 1: Signalement und Diagnose der Patienten im Überblick S. 16

Tabelle 2: Klinisch relevante Referenzbereiche für IgA in Serum und Liquor S. 28

Literaturverzeichnis

86

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Anhang

106

10. Anhang

I. Protokoll IgA-ELISA nach Tipold (1994)

1. Beschichtung der Mikrotiterplatte mit dem Primärantikörper (Ziege-gegen-

kanines-IgA-Antikörper, 1:750 mit 0,1 M Na-Carbonat-Bicarbonat (pH 9,6)

verdünnt); 100 µl/Kavität. Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur in der

feuchten Kammer

2. 3x Waschen der Platte mit Waschpuffer (= 0,9% NaCl-Lösung + 0,5% Tween 20).

3. Auftragen der verdünnten Serum- und Liquorproben, des Standards und der

Leerprobe (jeweils 100 µl/Kavität)

• Verdünnungspuffer (= 0,02 M Tris, pH 8,0 + 0,5 M NaCl + 0,5 %Tween 20)

• Verdünnung des Serums: 1:3000 und 1:6000

• Verdünnung des Liquor cerebrospinalis: 1:10

• Standard: Serumpool (162 µg/ml); acht Verdünnungsstufen, Beginn mit

einer 1:50-Verdünnung, weitere Verdünnungen 1:4

• Leerprobe: nur Verdünnungspuffer

Inkubation für 90 min. bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer auf einem

Plattenrüttler

4. 3x Waschen der Platte mit Waschpuffer

5. Zugabe des Sekundärantikörpers (monoklonaler Maus-gegen-kanines-IgA-

Antikörper, 1:100 Verdünnung mit Verdünnungspuffer); 100 µl/Kavität. Inkubation

für 90 min. bei Raumtemperatur in der feuchten Kammer auf einem Plattenrüttler.


7. Zugabe des Konjugates (Esel-gegen-murines-IgG-Antikörper, Peroxidase-

konjugiert, 1:2 vorverdünnt mit Glycerol, weitere 1:1000 Verdünnung mit

Verdünnungspuffer); 100 µl/Kavität. Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur

in der feuchten Kammer


Anhang

107

9. Herstellung der Substratlösung: 1 Sodium-Perborat-Kapsel mit Phosphat-Citrat-

Puffer in 100 ml Aqua bidest. lösen. 1 Tablette OPD (o-Phenylendiamin

Dihydrochlorid) in 25 ml des angesetzten Puffers lösen. Zugabe der

Substratlösung (100 µl/Kavität). Inkubation für ca. 3 min. bei Raumtemperatur bis

zur Gelbfärbung

10. Zugabe der Stoplösung (= 3 M Schwefelsäure) (50 µl/Kavität)

11. Photometrische Auswertung mit Hilfe des ELISA-Readers (bei einer Wellenlänge

von 450 nm mit Hilfe des Programms Gen5™)

Anhang

108

II. Protokoll IgA-ELISA der Firma ICL Laboratories Inc., USA

1. Vorbereitung der Reagenzien

• Alle Reagenzien auf Raumtemperatur erwärmen

• Lösungspuffer 1:5 verdünnen

• Waschlösung 1:20 verdünnen

2. Vorbereitung der Proben und des Standards

• Verdünnung des Serums: 1:4000

• Standard: 5 µl „Dog IgA Kalibrator“ mit 495 µl 1x Puffer verdünnen (� Std. A).

Dann 40 µl von Std. A mit 654 µl 1x Puffer mischen; weiter in 1:2

Verdünnungsschritten

• Leerprobe: nur Lösungspuffer

3. Versuchsablauf

• Auftragen der verdünnten Serumproben, des Standards und der Leerprobe

(jeweils 100 µl/Kavität).

• Platte für 30 min. bei Raumtemperatur inkubieren

• 4x Waschen der Platte mit Waschpuffer

• Jeweils 100 µl des Konjugats in jede Kavität pipettieren

• Für 30 min. bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt inkubieren

• 4x Waschen der Platte mit Waschpuffer

• Jeweils 100 µl des TMB-Substrates in jede Kavität pipettieren

• Für genau 10 min. vor Licht geschützt bei Raumtemperatur inkubieren

• Pro Kavität 100 µl Stopp-Lösung (Schwefelsäure) pipettieren

• Photometrische Auswertung mit Hilfe des ELISA-Readers (bei einer

Wellenlänge von 450 nm mit Hilfe des Programms Gen5™)

Anhang

109

III. Versuchsprotokoll zur Kopplung des Antikörpers an die Beads

Alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen (Beads vor Licht schützen)

(1) Bead-Konjugation

1. Die Beads 30 sek. mittels Reagenzglasschüttler mischen, 75 µl der Bead-

Suspenison in ein Eppendorf-Safelock-Tube pipettieren und anschließend für

1 min. im Ultraschall behandeln

2. 1,9 µl DTT (1 M) zu den Beads pipettieren und für 5 sek. auf dem

Reagenzglasschüttler mischen

3. Vor Licht geschützt für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, dabei Beads-

Suspension alle 15 min. mittels Reagenzglasschüttler mischen

4. Beads nach Ablauf der Inkubationszeit 4x waschen: jeweils 1 ml

Kopplungspuffer zugeben, 3 min. 900x g zentrifugieren, Überstand vorsichtig

abnehmen und verwerfen. Nach dem letzten Waschen die Beads mit 20 µl

Kopplungspuffer resuspendieren

(2) Protein-Modifikation

1. 90 µl von dem Ziege-gegen-kanines-IgA-Antikörper (1 mg/ml) in ein

Eppendorf-Safelock-Cup pipettieren und 2 µl Sulfo-SMCC hinzufügen,

anschließend 5 sek. mittels Reagenzglasschüttler mischen

2. Für 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, dabei Suspension alle 15 min. mittels


(3) Puffer-Austausch

1. Vorbereitung der Absorptionssäule: Die Säule mehrfach kräftig schwenken,

um das abgesetzte Gel zu resuspendieren und Luftblasen zu entfernen. Die

Säule dann für 2 min. bei 1000x g zentrifugieren, um den Puffer zu entfernen

2. Die Säule mit Kopplungspuffer füllen und durchlaufen lassen; diesen Vorgang

zweimal wiederholen

Anhang

110

3. Säule in ein 5 ml-Röhrchen stellen, 2 min. bei 1000x g zentrifugieren,

Röhrchen anschließend verwerfen und die Säule in ein neues 5 ml-Röhrchen

geben

4. Komplettes Volumen der Protein-Sulfo-SMCC-Lösung auf die Säule

überführen, 2min. 15 sek. bei 1000x g zentrifugieren. (modifiziertes Protein

befindet sich dann in dem 5-ml-Röhrchen)

(4) Protein-Konjugation

1. Gesamte Proteinlösung zu den vorbereiteten Beads pipettieren und 5 sek.

mittels Reagenzglasschüttler mischen

2. Für 1 h lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubieren, dabei alle 15 min.

mittels Reagenzglasschüttler mischen

3. 2 µl N-Ethylmaleinimid zu dem Beads-Protein-Gemisch pipettieren, 5 sek.

vorsichtig mischen

4. Für 15 min. bei Raumtemperatur inkubieren, zwischendurch mittels


5. 4x waschen: 1 ml Aufbewahrungspuffer zufügen, 3 min. bei 900x g

zentrifugieren, Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen

6. Bead-Pellet in 0,5 ml Aufbewahrungspuffer resuspendieren

Präparierte Beads vor der ersten Anwendung über Nacht ruhen lassen und generell

lichtgeschützt aufbewahren.

(5) Kontrolle der Proteinkonjugation

1. Präparierte Beads für 5 sek. vortexen

2. Zubereiten einer 1:50- und 1:100-Verdünnung des PE-konjugierter Esel-

gegen-caprines-IgG-Antikörpers

3. Vier FACS-Röhrchen wie folgt vorbereiten:

• verdünnte Beads: 245 µl Waschpuffer + 5 µl präparierte Beads

• Negativ-Kontrolle: 50 µl Waschpuffer + 50µl der verdünnten Bead-

Suspension

Anhang

111

• Antikörper 1: 50 µl der 1:50 AK-Verdünnung + 50 µl der verdünnten Bead-

Suspension

• Antikörper 2: 50 µl der 1:100 AK-Verdünnung + 50 µl der verdünnten Bead-

Suspension

4. Röhrchen für 30 min. lichtgeschützt bei Raumtemperatur inkubieren

5. Hinzufügen von 1 ml Waschpuffer, dann Röhrchen bei 1000x g für 5 min.

zentrifugieren, Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen

6. Bead-Pellet in jedem Röhrchen mit 150 µl Waschpuffer resuspendieren

7. Messung und Analyse im Durchflusszytometer

Anhang

112

IV. Signalement, Diagnose und IgA-Messwerte in Seru m und Liquor der 44 Hunde aus der Studie „Evaluatio n of a

microsphere-based immunofluorescence assay for the determination of immunoglobulin A concentration in serum and

cerebrospinal fluid of dogs“

Lfd. Nr. Rasse Alter Geschlecht Diagnose

IgA Beads CSF

(µg/ml)

IgA Beads Serum (µg/ml)

IgA ELISA Tipold CSF

(µg/ml)

IgA ELISA Tipold Serum (µg/ml)

IgA ELISA

kommerziell Serum (µg/ml)

1 Austrian Black and Tan Hound 16 M w SRMA 0,08 164,6 0,06 56,9

2 Jack Russell

Terrier 1,9 J m SRMA 0,16 192,8 0,07 57,3 370,23

3 Jack Russell

Terrier 2,1 J m SRMA 0,116 205 0,08 61 443,82 4 Boxer 13 M w SRMA 0,12 345 0,04 136 1768,60 5 Boxer 15 M w SRMA 0,12 o.P. 0,06 135 98,59

6 Berner

Sennenhund 11,5 M w SRMA 0,08 132 0,04 95,5 602,78 7 Mischling 10,5 M w SRMA 2,27 259 2,2 86,5 658,41 8 Mischling 1,6 J wk SRMA 0,35 94,6 0,29 44,5 431,83 9 Beagle 12,5 M w SRMA 0,26 242 0,13 64,8 471,54

10

Novia Scotia Duck Tolling

Retriever 14 M w SRMA 0,13 114,3 0,08 25,6 317,68 11 Zwergpinscher 1,7 J m SRMA 0,19 290 0,1 72,8 383,90

Anhang

113


IgA Beads CSF

(µg/ml)



(µg/ml)


IgA ELISA kommerziell

Serum (µg/ml)

12 Cocker Spaniel 15 M m SRMA 1,08 o.P. 0,76 35 281,06 13 Weimaraner 11 M w SRMA 0,22 293,8 0,1 104 767,16

14 Französischer

Griffon 1,7 J m SRMA 1,2 132 0,85 54,7 279,98

15 Portugiesischer

Hirtenhund 3,7 J wk Epilepsie 0,18 144,8 0,07 72,6 511,83

16 Labrador-Mischling 7 M m

V.a. degenerative ZNS-Erkrankung 0,3 69,4 0,02 19,3 192,66

17 Mops 11 M m

Intramedulläre Läsion Th9/10,

Syringohydromyelie, Subarachnoidalzyste 0,02 62,7 0,03 33,7 309,04

18 Berner

Sennenhund 16,5 M m SRMA 1,04 o.P. 0,42 175 1717,58 19 Mischling 15,5 M w SRMA 0,96 256 0,69 146

20 Berner

Sennenhund 1,8 J m SRMA 0,38 o.P. 0,24 168 2068,43 21 Mischling 1,9 J w SRMA 0,37 o.P. 0,28 177 1874,38

22 Berner

Sennenhund 13 M m SRMA 0,22 o.P. 0,2 183,2 2302,22 23 Boxer 10,5 M m SRMA 0,42 492 0,47 148,3 2527,92

24 Labrador Retriever 5,3 J w SRMA 1,12 172,8 0,84 84,6 1331,56

Anhang

114


IgA Beads CSF

(µg/ml)



(µg/ml)



Serum (µg/ml)

25 Boxer 1,8 J m SRMA 0,86 149,3 1 108 950,86 26 Irish Setter 15 M w SRMA 0,31 286 0,36 67,8 776,54

27 Eurasier 8,25 J m Meningoenzephalitis 0,6 322 0,52 147,7 1264,36 28 Mischling 3,5 J wk Meningiom 0,54 o.P. 0,41 98,9 1126,82

29 Kleiner

Münsterländer 12,6 J m Diskopathie 0,54 o.P. 0,42 159,9 1720,12

30 Border Collie 3,7 J mk

Aggressions-verhalten unklarer

Genese 0,09 o.P. 0,06 266,3

31 Katalanischer

Hirtenhund 15 M w Anfallsgeschehen 0,26 98 0,2 115,1

32 Jack Russell

Terrier 2,8 J w SRMA 1,45 163,8 1,6 271 1735,2

33 Deutscher

Schäferhund 6,6 J wk Meningiom 2,3 o.P. 1,8 150

34 Beagle 2,85 J m SRMA 2,3 315 2,0 326 1587,99 35 Boxer 11 M w SRMA 2,44 292 2,0 308 4055 36 Weimaraner 1,8 J m SRMA 2,04 348 1,9 204,6 3078

37 Rhodesian Ridgeback 16 M mk SRMA 1,54 254 1,6 229,2 20,41

Anhang

115


IgA Beads CSF

(µg/ml)



(µg/ml)



Serum (µg/ml)

38 Mischling 5,25 J w Anfallsgeschehen 2,38 450 2 177,8 39 Golden Retriever 10 M m SRMA 1,4 o.P. 1,65 511,7

40 Mischling 11,9 J w

multifokale Läsionen in Kortex und

Kleinhirn 1,7 546,5 1,53 282,1 3908 41 Boxer 10,5 M m SRMA 0,93 282 1,22 168,3

42 Französische

Bulldogge 10 J m Otitis 2,67 328 3 216,3 2338

43 Golden Retriever 12,3 J m

V.a. demyelinisierende

Polyneuropathie mit sekundärer Myopathie 3,8 o.P. 2,4 330,3

44 Deutscher

Schäferhund 9,7 J w

Zubildung Bulbus olfactorius,

V.a. Metastase eines Schilddrüsen-

karzinoms 1,37 530 1,4 303,8 3569,14 M = Monate, J = Jahre; w = weiblich, wk = weiblich kastriert, m = männlich, mk = männlich kastriert; V.a. = Verdacht auf; o.P. = oberes Plateau (Messwert nicht auswertbar)

Anhang

116

V. Signalement, erhobene Daten und Tau-Potein-Messw erte der 51 Hunde mit Bandscheibenvorfall aus der S tudie

„Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of spinal cord injury in canine intervert ebral disk herniation“

LfdNr. Rasse

Alter (Jahre) Geschlecht

Grad der neurolog.

Symptome Lokali-sation

Dauer der Symptome

bis zur Erstvor-stellung

Vorbe-hand-lung

Gluko-korti-koide

Besserung der

neurolog. Symptome < 7 Tage

Hyper-intensität MRT (T2-Sequenz)

Eutha-nasie

Tau in pg/ml

1 Kurzhaar-

dackel 5 m 2 TL chronisch ja ja nein nein 48,3

2 Mischling 10 m 2 TL akut nein ja nein nein 50,8

3 Rauhaar-

dackel 10 m 2 TL chronisch nein ja nein nein 55,2

4 Beagle 8,7 wk 2 C chronisch nein nein nein nein 22,3

5 Langhaar-

dackel 10,8 mk 2 C chronisch ja nein ja nein 51,7

6 Mischling 4,4 m 2 C chronisch nein ja ja nein 127,4

7 Mischling 10 m 2 TL chronisch ja nein k.A.

(Myelo-CT) nein 30,1

8 Gordon Setter 9,9 m 2 TL akut ja ja ja nein 41,8

9 Rauhaar-

dackel 6 mk 3 TL subakut ja nein nein nein 24,1

10 Rauhaar-

dackel 8 wk 3 C chronisch ja ja nein nein 26,3

Anhang

117

LfdNr. Rasse


Grad der neurolog.


Dauer der Symptome


Vorbe-hand-lung

Gluko-korti-koide

Besserung der



Eutha-nasie

Tau in pg/ml

11 Mischling 10,3 wk 3 TL chronisch ja nein ja nein 54,8

12 Weißer

Schäferhund 10 w 3 TL chronisch ja nein nein nein 104,8

13 Rauhaar-

dackel 5,8 wk 3 TL subakut ja ja nein nein <18,7

14 Fox Terrier 3,5 mk 2 C subakut nein ja nein nein <18,7

15 Französische

Bulldogge 3,8 mk 2 TL chronisch nein ja ja nein <18,7

16 Dalmatiner 7,8 m 3 C chronisch nein nein ja ja <18,7

17 Berner

Sennenhund 5,5 m 2 TL chronisch nein ja ja nein 75,2

18 Cocker Spaniel 4,8 wk 2 TL subakut ja ja nein nein <18,7

19 Rottweiler 7 m 2 C subakut nein ja nein nein <18,7

20 Cocker Spaniel 5 mk 2 C chronisch ja ja nein nein <18,7

21 Deutsche

Dogge 6,3 m 2 C chronisch ja nein ja nein <18,7

Anhang

118

LfdNr. Rasse


Grad der neurolog.


Dauer der Symptome


Vorbe-hand-lung

Gluko-korti-koide

Besserung der



Eutha-nasie

Tau in pg/ml

22 Rauhaar-

dackel 9 mk 2 C subakut nein nein ja ja 35,4

23

Bayrischer Gebirgs-

schweißhund 8 w 3 C akut nein ja ja nein 180,7

24 Deutscher

Schäferhund 9,5 m 2 TL subakut nein nein nein nein 57,8

25 Französische

Bulldogge 3 m 2 C subakut ja ja nein nein 193,1

26 Mischling 7,8 m 2 TL chronisch nein nein ja nein 30,9

27 Beagle 5 w 2 C akut ja ja ja nein <18,7

28 Rauhaar-

dackel 6,5 w 2 TL chronisch nein ja nein nein <18,7

29 Berner

Sennenhund 6,5 wk 2 TL chronisch nein nein nein ja 46,1

30 Langhaar-

dackel 8 m 2 TL akut nein nein nein nein <18,7

31 Rauhaar-

dackel 5 m 2 C chronisch nein nein nein ja <18,7

Anhang

119

LfdNr. Rasse


Grad der neurolog.


Dauer der Symptome


Vorbe-hand-lung

Gluko-korti-koide

Besserung der



Eutha-nasie

Tau in pg/ml

32 Langhaar-

dackel 7,7 wk 4 C akut nein nein ja ja 61,2

33 Dackel 8,3 m 4 TL akut nein nein ja nein 89,4

34 Dackel 7,4 mk 4 TL akut ja ja ja nein <18,7

35 Langhaar-

dackel 10 w 4 TL subakut ja ja nein nein <18,7

36 Mischling 8 w 4 C akut nein ja nein nein <18,7

37 Mischling 4 mk 4 TL akut ja ja Ja nein <18,7

38 Mischling 12 m 4 TL k.A. k.A. nein Ja ja 778,7

39 Golden

Retriever 5,8 wk 4 TL subakut ja Ja nein nein 135,4

40 Rauhaar-

dackel 5,5 m 4 TL subakut ja ja Ja nein <18,7

41 Rauhaar-

dackel 8 w 4 TL subakut ja nein nein nein 479,4

42 Mischling 4,5 w 5 TL akut nein nein ja nein 70,3

Anhang

120

LfdNr. Rasse


Grad der neurolog.


Dauer der Symptome


Vorbe-hand-lung

Gluko-korti-koide

Besserung der



Eutha-nasie

Tau in pg/ml

43 Schäferhund-

Mischling 7 m 5 TL k.A. k.A. nein ja ja 224,3

44 Langhaar-

dackel 7,8 mk 4 TL subakut nein nein ja nein 266,3

45 Rottweiler 5 mk 5 TL chronisch ja nein nein ja <18,7

46 Yorkshire

Terrier 11,9 m 4 C akut nein nein nein ja 39,5

47 Rauhaar-

dackel 6,8 m 5 TL subakut ja nein ja ja 719,8

48

Kurzhaar-dackel-

Mischling k.A. m 4 TL akut nein nein ja ja 105,1

49 Mischling 10 m 5 TL chronisch nein nein nein ja 162

50 Kurzhaar-

dackel 12,3 m 4 C akut nein nein ja ja 282,6

51 Mischling 7 mk 4 TL akut ja nein nein nein 43 m = männlich, mk = männlich kastriert, w = weiblich, wk = weiblich kastriert; C = zervikal, TL = thorakolumbal; akut = 1-5 Tage, subakut = 5-14 Tage, chronisch = > 14 Tage; k.A. keine Daten vorhanden

Anhang

121

VI. Signalement und Tau-Protein-Messwerte der 12 Ko ntrollhunde aus der Studie „Cerebrospinal fluid tau protein as a

biomarker for severity of spinal cord injury in can ine intervertebral disk herniation“

Lfd. Nr. Rasse Geschlecht Alter (Jahre) Tau in pg/ml

1 Beagle mk 6,3 36,1

2 Beagle mk 5 51,2

3 Beagle mk 6,5 <18,7



6 Beagle wk 5 19,8

7 Beagle mk 5 <18,7

8 Beagle k.A. k.A. 21,4

9 Labrador m 2,9 <18,7

10 Boxer w 1,75 <18,7

11 Chihuahua m 4,5 25,1

12 Mischling mk 8,8 <18,7 m = männlich, mk = männlich kastriert, w = weiblich, wk = weiblich kastriert; k.A. keine Daten vorhanden

Danksagung

122

11. Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Andrea Tipold und Frau PD Dr. Veronika

Stein, PhD für die Überlassung des interessanten Themas, sowie für ihre

unermüdliche Unterstützung und Motivation bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Ein herzlicher Dank gebührt Frau Regina Carlson für ihren wissenschaftlichen

Beistand, ihre stete Hilfsbereitschaft und die freundliche Atmosphäre im Labor.

Des Weiteren danke ich der gesamten Neurologie-Abteilung für die gute

Zusammenarbeit und die tolle Stimmung im Team. Vielen Dank an Arianna, Maren

und Emma für die Hilfe in verschiedensten Situationen und die schöne gemeinsame

Zeit.

Ohne die zahlreichen Serum- und Liquorproben wäre meine Arbeit erst gar nicht

möglich gewesen. Ich danke daher ganz herzlich den Mitarbeiterinnen und

Mitarbeitern der Klinik für Kleintiere für ihre Hilfe beim Sammeln des

Probenmaterials.

Mein Dank gilt ebenso Herrn Dr. K. Rohn aus dem Institut für Biometrie,

Epidemiologie und Informationsverarbeitung für die Unterstützung in statistischen

Fragen.

Ich danke meinen Eltern und Karsten, dass sie immer für mich da waren und mich

unterstützt haben.

Ein großer Dank geht zudem an meinen Bruder für die stete Bereitschaft

computertechnische Probleme zu beheben.

Meinen Freunden, insbesondere Sabine, Lotte, Anne, Verena, Annika und Sonja

danke ich für viele, tolle gemeinsame Unternehmungen zur geistigen Ablenkung.

Tierärztliche Hochschule Hannover Beurteilung von ......Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine...

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