Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen ...Untersuchungen+erblich...Untersuchungen...
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Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Ursachen erblich bedingter Erkrankungen
des zentralen Nervensystems
I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n
zur
Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
vorgelegt von
Laura-Kristina van Diepen
geboren am 02.01.1986
in Stade
Greifswald , 24.11.2017
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Werner Weitschies
1. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Andreas Kuss
2. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Herbert Hildebrandt
Tag der Promotion: 24.11.2017
Inhaltsverzeichnis III
I. Inhaltsverzeichnis
I. Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................................... III
II. Abbildungsverzeichnis .................................................................................................................... V
III. Tabbellenverzeichnis .................................................................................................................. VI
IV. Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. VII
Abstract ................................................................................................................................................... 1
Zusammenfassung .................................................................................................................................. 2
1. Einleitung ........................................................................................................................................ 3
1.1 Krankheitsbild geistige Behinderung ...................................................................................... 3
1.2 Glycosyltransferasen und “Congenital Disorders of Glycosylation“ ....................................... 5
1.3 Pluripotente Stammzellen .................................................................................................... 10
1.4 Embryonale Neurogenese..................................................................................................... 15
2. Ergebnisse ..................................................................................................................................... 18
2.1 Subzellulare Lokalisierung verschiedener ST3GAL3 Mutationsvarianten ............................ 18
2.2 Etablierung patientenspezifischer iPS ................................................................................... 22
2.3 Differenzierung zu Kortexneuronen ..................................................................................... 34
2.4 Funktionelle Analysen ........................................................................................................... 41
3. Diskussion ..................................................................................................................................... 56
3.1 Etablierung und Validierung eines patientenspezifischen iPS-Modells ................................ 56
3.2 Kortikale Differenzierung nach Yichen Shi et al. ................................................................... 61
3.3 Glycosylierung und zelluläre Adhäsion ................................................................................. 66
3.4 Die Neurogenese kortikaler Projektionsneuronen ................................................................... 72
3.4 Zusammenfassung/Ausblick ................................................................................................. 75
4. Material und Methoden................................................................................................................ 80
4.1 Nukleinsäurearbeiten ........................................................................................................... 80
4.2 Vektorarbeiten .................................................................................................................... 113
4.3 Stammlösungen .................................................................................................................. 123
IV Inhaltsverzeichnis
4.4 Säuger-Zellkultur Einführung .............................................................................................. 127
4.5 Reprogrammierung humaner primärer Fibroblasten ......................................................... 150
4.6 Kortikale Differenzierung .................................................................................................... 158
4.7 Funktionelle Analysen ......................................................................................................... 163
5. Literaturverzeichnis .................................................................................................................... 181
Abbildungsverzeichnis V
II. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1.1 ST3GAL3 Aufbau und Funktion ........................................................................... 6
Abbildung 1.2: Gastrulation und Neuralrohrbildung ............................................................... 16
Abbildung 1.3: Entwicklung des humanen Kortex ................................................................... 17
Abbildung 2.1: Mutationsvalidierung. ..................................................................................... 20
Abbildung 2.2: ST3GAL3-Lokalisierung .................................................................................... 21
Abbildung 2.3: Bindungsepitope der ST3GAL3-Antikörper ..................................................... 22
Abbildung 2.4: Schematischer Ablauf einer Reprogrammierung ............................................ 23
Abbildung 2.5: Morphologische Veränderungen während einer Reprogrammierung ........... 25
Abbildung 2.6: Vereinfachter Stammbaum und Sangerchromatogramme ............................ 26
Abbildung 2.7: Expressionsänderung der Pluripotenzmarker. ................................................ 28
Abbildung 2.8: Immunfluoreszenzfärbung der Pluripotenzmarker ......................................... 30
Abbildung 2.9: Hauptkomponentenanalyse ............................................................................ 32
Abbildung 2.10: Mengendiagramm differentiell exprimierter Gene ...................................... 33
Abbildung 2.11: Schematischer Ablauf des neuronalen Differenzierungsprotokolls ............. 36
Abbildung 2.12: Wichtige Entwicklungsstadien während der Differenzierung ....................... 37
Abbildung 2.13: Durchlichtbilder kortikaler Zellen in der Langzeitkultur ............................... 38
Abbildung 2.14: Expression Kortex assoziierter Marker. ......................................................... 40
Abbildung 2.15: Immunfluoreszenzfärbung kortexassoziierter Marker ................................. 41
Abbildung 2.16: Mittlere ST3GAL3-Expression mittels dPCR .................................................. 43
Abbildung 2.17: Differentielle Genexpression. ........................................................................ 44
Abbildung 2.18: Mengendiagramm der RNASeq Vergleiche ................................................... 46
Abbildung 2.19: Zelladhärenz .................................................................................................. 48
Abbildung 2.20: Neuronales Zell-Adhäsions-Molekül. ............................................................ 49
Abbildung 2.21: Polysialylierung von kortikalen Neuronen .................................................... 50
Abbildung 2.22: Lektinblots der Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal3 ............................................. 51
Abbildung 2.23: Projektionsneuronen im sich entwickelnden Kortex. ................................... 52
Abbildung 2.24: Quantifizierung der Projektionsneuronen .................................................... 53
Abbildung 2.25: Neuronale Stammzellen ................................................................................ 55
Abbildung 3.1: Projektionsneuronen des Kortexes ................................................................. 73
Abbildung 4.1: DNA Adsorption an einer Kieselgel Festphase ................................................ 84
VI Tabbellenverzeichnis
Abbildung 4.2 Phasentrennung TriZOL Aufreinigung .............................................................. 86
Abbildung 4.3 DNA Phase der TriZOL Aufreinigung ................................................................. 86
Abbildung 4.4: RNA Phase TriZOL Aufreinigung ...................................................................... 88
Abbildung 4.5: RNA Phase TriZOL Aufreinigung ...................................................................... 89
Abbildung 4.6: Typische Fluoreszenzkurven einer quantitativen PCR .................................... 97
Abbildung 4.7 „Quant Studio TM 3D Digital PCR System“ ...................................................... 101
Abbildung 4.8 Typisches Sequenzchromatogramm einer Sangersequenzierung ................. 106
Abbildung 4.9: Ablauf der FPNI PCR ...................................................................................... 110
Abbildung 4.10: Evolution der lentiviralen Vektorsysteme ................................................... 151
Abbildung 4.11: Zeitlicher Ablauf einer Reprogrammierung ................................................ 158
Abbildung 4.12: Proteinphase TriZOL Aufreinigung .............................................................. 166
Abbildung 4.13 Schematischer Aufbau eines Western Blots ................................................ 170
Abbildung 4.14 Schematischer Ablauf einer Immunfärbung ................................................ 170
Abbildung 4.15 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved. .......................... 174
Abbildung 4.16 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved. .......................... 176
III. Tabbellenverzeichnis
Tabelle 2.1: Sialyltransferaseexpression in verschiedenen Gehirnarealen ............................. 35
Tabelle 2.2 DAVID-Gen-Onthologie-Anreicherungsanalyse .................................................... 46
Tabelle 4.1 Primerliste ............................................................................................................. 82
Tabelle 4.2: Verwendete Vektoren ........................................................................................ 114
Tabelle 4.3: Verwendete Bakterienstämme .......................................................................... 115
Tabelle 4.4 Verwendete Zelllinien und Patientenmaterial .................................................... 128
Tabelle 4.5: Normales Gehirn Probenmaterial ...................................................................... 129
Tabelle 4.6 Primärantikörper ................................................................................................. 163
Tabelle 4.7 Sekundärantikörper............................................................................................. 164
Tabelle 4.8: Layout Vorschlag für einen Adhärenzassay ....................................................... 178
Abkürzungsverzeichnis VII
IV. Abkürzungsverzeichnis
Amp Ampicillin
AS Fibroblasten Referenzzelllini e
ASC23 Stammzellklon der Referenzzelllinie
bFGF „basic fibroblast growth factor“ humaner Wachstumsfaktor
CaCl2 Calciumdichlorid
DNA Desoxyribonukleinsäuren
DMEM „Dulbeccos modified Eagle Medium“ Basalmedium
DMEM/F12 1:1 Mischung aus DMEM und Ham‘s F12
DMSO Dimethylsulfoxid
DPBS „Phosphate buffered saline“ Phosphatpuffer
ECM Extrazellulärematrix
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EPC Diethyldicarbonat
EtOH Ethanol
FCS fetales Kälberserum
HD2 Stammzellreferenzlinie
HEPES Hydroxyethylpiperazinylethansulfonsäure Puffer
KCl Kaliumchlorid
KOSR Knock-out Serum Replacement
LB „Lysogeny broth“, Bakterienmedium
MEM-NEAA !Minimum Essential Medium“ „non-essential amino acids“
MEF embryonale Mausfibroblasten
MgCl2 Magnesiumdichlorid
MiliQ destiliertes, gefiltertes Wasser
MMC Mitomycin
NaCitrat Natrium-Citrat
NaOH Natronlauge
NaCl Natriumchlorid
NaN3 Natriumazid
NI dx Neuronal induziert Tag X
VIII Abkürzungsverzeichnis
NIM neuronales Induktionsmedium
NMM Neuronenmedium
NTP Nukleotidtriphosphat
PFA Paraformaldehyd
P/S Penicillin, Streptomycin
PVDF Polyvinylidenfluorid
RNA Ribonukleinsäuren
rpm „rounds per minute“ Umdrehungszahl
SCM Stammzellmedium
SDS „Sodiumdodecylsulfat“ Natriumlaurylsulfat
ST3GAL3 Gen CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-
sialyltransferase
ST3GAL3 Protein CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-
sialyltransferase
ΔSt3Gal3-HF Patientenfibroblastenlinie mit Punktmutation im ST3GA3I Gen
ΔSt3Gal3 Patientenstammzelllinie mit Punktmutation im ST3GAL3 Gen
TBE „Tris-Bor-EDTA“ Puffer
TBS Tris-Puffer
ÜN über Nacht
UPL „Universal probe library“ Sonden von Roche
VPA Valproinsäure
Abstract 1
Abstract
Intellectual disability (ID) is a cognitive impairment disorder characterized by an intelligence quotient
(IQ) below 70 and is one of the most common forms of cognitive handicaps resulting from genetic
aberrations [1]. Hereditary forms of ID are genetically heterogeneous but a considerable number
involve genes participating in the build-up and maintenance of the glycocalyx [2]. The glycocalyx is
composed of carbohydrates that are part of the cell surface exposed lipids and proteins (including
proteoglycans) or part of the extracellular matrix. We recently demonstrated that mutations in
ST3GAL3 (NM_006279.2), which encodes the Golgi enzyme β-galactoside-α2,3-sialyltransferase-III,
lead to varying clinical manifestations. Two independent mutations (p.Ala13Asp and p.Asp370Tyr)
identified in Iranian pedigrees were associated with mild forms of non-syndromic autosomal
recessive intellectual disability (NSARID)[3]. However, a third point mutation (p.Ala320Pro) identified
in a Palestinian family caused West Syndrome (WS), an age-dependent epileptic encephalopathic
syndrome associated with developmental arrest or, as in the case of our patients [3], regression[4].
In humans ST3GAL3 forms, among others, the sialyl Lewis a (sLea) epitope on proteins. Ectopic
expression of full-length-c-MYC fusion proteins with the respective mutations in LMTK- cells showed
severe functional impairment and subcellular mislocalization of all mutant gene products [5]. To
further elucidate the molecular and cellular mechanisms causing West Syndrome due to the lack of
ST3GAL3 function, we successfully generated induced pluripotent stem cell lines from fibroblasts
obtained from a patient with West Syndrome, carrying a mutation in exon 12 (c.958G>C,
p.Ala320Pro) of ST3GAL3, and a healthy sibling using lentiviral reprogramming.
Since ST3GAL3 showed highest expression in the frontal cortex, which is also in accordance with the
source of epileptic seizures, a differentiation protocol to cortical neurons was established and
successfully accomplished for both cell lines. One of its advantages is mimicking the in vivo
neurogenesis in vitro, enabling us to investigate temporal processes. IPSCs and cortical neurons
derived thereof were analysed by lectin blots, mRNA sequencing, adherence assays, and FACS. While
no significant difference was observed at stem cell or fibroblast level between patient and control
cells, patient-derived cortical neurons displayed an additional band (70 kDa) in the lectin blot
staining, enhanced adherence to a poly-L-ornithine/laminin coated surface and decreased levels of
neurons expressing T-box transcription factor brain 1 (2.28 fold).
Thus, our results indicate that ST3GAL3 function is important for the normal development and
functioning of the brain.
2 Zusammenfassung
Zusammenfassung
Geistige Behinderung ist eine der häufigsten Formen von erblich bedingten kognitiven
Beeinträchtigungen. Definiert wird sie durch einen Intelligenzquotienten unter 70 und obwohl ihre
genetischen Ursachen sehr heterogen sein können, gibt es unter ihnen eine beachtliche Menge
Gene, die am Aufbau der Glycocalyx beteiligt sind [1, 2]. Die Glycocalyx besteht aus
Zuckerbausteinen, die Teil von Lipiden und Proteinen der Zelloberfläche oder der extrazellulären
Matrix sind. Vor kurzem konnten wir belegen, dass Mutationen im ST3GAL3-Gen, welches für die
Golgi-lokalisierte β-Galactosid-α2,3-sialyltransferase-III codiert, zu verschiedenen klinischen
Befunden führt. Zwei unabhängige Mutationen (p.Ala13Asp and p.Asp370Tyr), gefunden in
iranischen Familien, konnten mit relativ milden Formen nicht-syndromaler geistiger Behinderung
(NSARID) in Verbindung gebracht werden [5]. Eine dritte Punktmutation (p.Ala320Pro), gefunden in
einer palästinensischen Familie, verursachte hingegen eine schwere, altersabhängige epileptische
Enzephalopathie, das West-Syndrom. Dieses Syndrom ist mit einem Arrest der geistigen Entwicklung
oder sogar, wie in unserem Fall, einer Regression assoziiert [3, 4]. ST3GAL3 bildet im Menschen
unter anderem das Sialyl Lewis-a (sLea)-Epitop auf Proteinen. Exogene Expression der Volllängen-c-
MYC-Fusionsproteine, der Mutationsvarianten in LMTK—Zellen, zeigte, dass alle Varianten eine
gestörte subzellulare Lokalisierung zeigen und zwei von ihnen (p.Ala13ASp und p.ALA320Pro) kaum
mehr messbare Aktivität besitzen [5]. Um die molekularen und zellulären Mechanismen näher zu
beleuchten, die dem ST3GAL3-bedingten West-Syndrom zugrunde liegen, haben wir erfolgreich ein
patientenspezifisches, induzertes pluripotentes Stammzellmodell etabliert. Hierfür wurden
Fibroblasten der Patientin, die eine Mutation im Exon 12 (c.958G>C, p.Ala320Pro) des ST3GAL3-Gens
trägt, und einer gesunden Schwester mittels eines lentiviralen Vektorsystems reprogrammiert. Da
ST3GAL3 die höchsten Expressionswerte im frontalen Kortex zeigte, und dies auch in
Übereinstimmung mit dem vorgeschlagenen Ursprung epileptischer Anfälle steht, wurde ein
Differenzierungsprotokoll für kortikale Neuronen etabliert und erfolgreich für beide Zelllinien durch
geführt. Einer der größten Vorteile dieses Protokolls ist, dass hier die Neurogenese in vitro nach
demselben temporalen Muster abläuft wie die Neurogenese in vivo. Die iPSC und die daraus
differenzierten Neuronen wurden anschließend mittels Lectinblot, mRNA-Sequenzierung,
Adhärenzassays und FACS untersucht. Während keine Unterschiede zwischen den iPSC und den
Fibroblasten festgestellt wurden, konnten für die kortikalen Neuronen der Patientin eine zusätzliche
Bande im Lektinblot (70 kDa), ein verändertes Adhärenzverhalten auf poly-L-Orinithin/Laminin-
beschichteter Oberfläche und eine deutlich reduzierte Menge T-box-transcription factor-brain-1-
exprimierende Neuronen festgestellt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die ST3GAL3-Aktivität
wichtig für die normale Entwicklung und Funktion des Gehirns ist.
Einleitung 3
1. Einleitung
1.1 Krankheitsbild geistige Behinderung
Wenn bei einem Patienten vor dem 18. Lebensjahr Defizite in einer oder mehreren
adaptiven oder intellektuellen Funktionen neben einem Intelligenzquotienten (IQ) von unter
70 festgestellt werden, gelten sie als geistig behindert (ICD-10). Unter adaptiven Fähigkeiten
versteht man die Anpassungsfähigkeit an äußere Einflüsse, wie das Erlernen von Sprache,
interpersonelle Fähigkeiten oder die Einhaltung von Routinen (z. B. Hygiene). Intellektuelle
Fähigkeiten betreffen basalere Abläufe, wie Lernen, logisches Denken oder Lösungen für
Probleme zu finden [6]. Die Prävalenz geistiger Behinderung liegt in der kaukasischen
Population bei ca. 1 - 3 %. Bei schlechterer Nahrungsverfügbarkeit, Schwächen im
Gesundheitswesen und elterlicher Prädisposition kann sie aber eine deutlich höhere
Prävalenz zeigen [7]. Sie wird anhand der verschiedenen Symptome in milde (IQ 55 - 69),
mäßige (IQ 40 - 54), schwere (IQ 25 - 39) und schwerste (IQ < 25) geistige Behinderung
unterteilt [6]. Viele dieser Patienten leiden neben der geistigen Behinderung auch noch an
anderen Symptomen, weshalb sie häufig einem bestimmten Syndrom zugeordnet werden
können. So ist die geistige Behinderung ein Teilsymptom von über 100 verschiedenen
syndromalen Erkrankungen, wobei die Heterogenität und variable Ausprägung der
Symptome eine eindeutige Diagnose deutlich erschweren können [8]. In 30 - 50 % aller Fälle
hingegen liegt eine nicht syndromale oder idiopathische geistige Behinderung vor. Die
Ursachen dieser Behinderung sind sehr heterogen. Neben den äußeren Einflüssen, wie
infektiösen Erkrankungen, dem fetalen Alkoholsyndrom oder Frühgeburten werden ca. 25 %
aller Fälle durch eine oder mehrere genetische Mutationen verursacht [9].
Auf Grund der vielfältigen Ursachen, muss der kausale Zusammenhang zwischen Genotyp
und Phänotyp für jeden Fall einzeln untersucht werden. Dies gelang bisher nur in wenigen
Fällen [10]. Eine der Limitationen dieser Untersuchungen ist sicherlich die Verfügbarkeit
eines adäquaten Modells. Für in-vivo-Untersuchungen zu Erkrankungen der neuronalen
Entwicklung wurden bisher hauptsächlich Mäuse oder Ratten herangezogen. Da sie aber nur
unzureichend die Komplexität des humanen Zerebrums darstellen können, konnten nur in
wenigen Fällen mit diesen Modellen die molekularen Ursachen ermittelt werden [11].
Genetische Untersuchungen idiopathischer Erkrankungen haben sich bisher hauptsächlich
4 Einleitung
auf x-chromosomale geistige Behinderungen fokussiert. Neuere Studien konnten aber die
Zahl der autosomalen genetischen Ursachen z. B. mittels „Next-Generation-Sequencing“ in
konsanguinen Familien deutlich erhöhen [12]. So konnte, unter anderem, für vier Patienten,
drei männliche (Abb. 2.6: 4713, 4696, 4694) und eine weibliche (Abb. 2.6: 4695), aus einer
konsanguinen palästinensischen Familie gezeigt werden, dass eine Mutation im ST3GAL3-
Gen ursächlich für ihre schwere Form des autosomal rezessiven West-Syndroms ist. Neben
den frühkindlich auftretenden epileptischen Anfällen, hauptsächlich des Flexortyps, leiden
diese Patienten an einer schwersten geistigen Behinderung, die noch vor den ersten
Anfällen erkennbar wurde. Der allgemeine Gesundheitszustand und die
Wachstumsparameter waren normal, darüber hinaus gab es keine Hinweise auf die
Beteiligung anderer Systeme. Eine Magnetresonanztomografie der Patienten (1.5T MRT)
zeigte keine Auffälligkeiten. Die Medikation mit verschiedenen antikonvulsiven Mitteln
konnte nur bei einem mild betroffenen Patienten eine Verbesserung herbeiführen. Alle
anderen Patienten entwickelten das Lennox-Gastaut-Syndrom, welches durch mehrfache
Anfälle und Anfallsformen am Tag und während der Nacht charakterisiert ist [3].
Um die molekularen Ursachen dieses schweren Krankheitsverlaufes genauer untersuchen zu
können, wurde uns Zellmaterial der Patientin (Abb.2.6: 4695) zur Verfügung gestellt. Die
hier vorgelegten Forschungsarbeiten beschäftigen sich deshalb vorrangig mit den
molekularen Konsequenzen dieser ST3GAL3-Mutation.
In zwei Fällen von nicht-syndromaler geistiger Behinderung konnten ebenfalls Mutationen
im ST3GAL3-Gen identifiziert werden [5].
West-Syndrom ist die häufigste Form einer generellen infantilen epileptischen
Enzephalopathie und manifestiert sich schon vor dem 12. Lebensmonat. Neben den in
Serien auftretenden axialen Spasmen, psychomotorischer Retardierung und einem inter-
iktalen EEG mit Hypsarrythmien, sind viele der Betroffenen geistig behindert [13]. West-
Syndrom zählt mit seiner Prävalenz von 1-1,6:100.000 zu den seltenen Erkrankungen. Die
Ursachen dieses Syndroms sind sehr heterogen. In 70 - 80 % aller Fälle werden
Hirnanomalien, zumeist Fehlbildungen (wie z. B. Tuberöse Sklerose, Bourneville Pringle)
gefunden. Andere Ursachen für diese Anomalien können Ischämien, Meningoenzephalitis
oder genetische Aberrationen, wie Trisomie 21 sein. Nur in seltenen Fällen konnte bisher
eine monogene Ursache gefunden werden [14].
Einleitung 5
1.2 Glycosyltransferasen und “Congenital Disorders of Glycosylation“
Um die molekularen Ursachen dieses Auslösers des West-Syndroms untersuchen zu können,
ist es zunächst notwendig, die möglichen Funktionen des betroffenen Gens zu betrachten.
Das ST3GAL3-Gen codiert für die β-Galactosidase-α-2,3-sialinsäuretransferase 3 und gehört
zur Glycosyltransferase-Familie 29 (EC 2.4). Glycosyltransferasen sind hauptsächlich im
Golgi-Apparat und Endoplasmatischen Reticulum (ER) zu finden, und am Aufbau der
Glycocalyx, einer dichten komplexen Zuckerhülle, auf einer jeden Zelle beteiligt [15]. Diese
Schicht besteht aus Glycoproteinen, Glycolipiden und Proteoglycanen, deren Glycosylierung
hauptsächlich im Golgi-Apparat und dem ER vollzogen wird. Die verwendeten
Zuckerbausteine sind hauptsächlich Glucose, Galactose, Fucose und Sialinsäure. Glycane
können in zwei Konfigurationen, α oder β, mehrfach modifiziert (z. B. N-Acetyl- oder
Hydroxygruppen), und in verschiedensten Verzweigungen vorkommen. So kann aus einer
relativ kleinen Anzahl an Zuckerbausteinen eine hoch komplexe Vielfalt an Oligosacchariden
entstehen. Die Diversität der Glycocalyx kann für jede Zellart, Gewebe und Zeitpunkt
unterschiedlich auf die momentanen Bedingungen angepasst werden. Da Glycane häufig
sehr groß, hydratisiert und anionisch sind, beeinflussen sie die physischen Eigenschaften der
Zelloberfläche deutlich. Sie bestimmen die Spannkraft, Stärke und Elastizität, extrazelluläre
Homöostase, Morphologie und physiologische Funktion des Gewebes [16]. Zusätzlich stellen
sie die kommunikative Schnittfläche der Zelle mit der Außenwelt dar und sind an der Zell-
Zell-Erkennung sowie der lokalen Interaktion der Zelle beteiligt [17]. Veränderungen in der
Glycosylierung, wie durch den Verlust der ST3GAL3-Aktivität, können somit dramatische
Folgen, wie Fehlfaltungen, Transportfehler oder sogar Funktionsverlust, haben.
So ist es auch nicht verwunderlich, dass es eine immer schneller wachsende Gruppe an
genetischen Erkrankungen gibt, die durch Mutationen in Genen des Glycometabolismus
verursacht werden. Diese Erkrankungen gehören zu den „Congenital Disorders of
Glycosylation“ (CDG). Bisher sind über 70 verschiedene erblich bedingte Erkrankungen die
den Glycometabolismus beeinflussen bekannt. Die Symptome der verschiedenen CDGs sind
äußerst heterogen und können nahezu jedes Organ betreffen [18]. Sie reichen über
Leberschäden, Herzinsuffizienzen und Wachstumsverzögerungen bis hin zu
Gesichtsmalformationen. Bei fast allen CDGs ist allerdings eine Beeinträchtigung der
neurologischen Entwicklung in Form von epileptischen Anfällen, Neuropathien und/oder
6 Einleitung
geistiger Behinderung vorhanden [19].
Die Nomenklatur der CDG richtet sich nach den verschiedenen betroffenen
Glycosylierungswegen. Insgesamt sind acht Hauptreaktionswege bei Säugern bekannt, die
innerhalb des ER und Golgi-Apparats katalysiert werden [20]. Hierzu zählen N- und O-
glycosidische Reaktionen sowie Reaktionen mit Glycosylphosphatidylinositol (GPI) -Ankern
und Glycosphingolipiden. Typ I CDGs umfassen Mutationen, die Glycosylierungen an GPI-
Ankern betreffen. Mutationen, die Defekte in der Glycosylierung von Proteinen betreffen,
sind Typ II CDGs und Defekte der α-Dystroglycan O-Mannosylierung werden als Typ III
klassifiziert [8]. Da wir die Reaktionspartner der ST3GAL3 bisher nicht kennen, konnte noch
keine Eingrenzung innerhalb der CDG-Klassen erfolgen. Eine der prominentesten CDGs, die
CDG Ia (früher Jaeken-Syndrom), wird durch Mutationen im PMM2-Gen verursacht. Die
Phosphomannomutase 2 (PMM2) katalysiert die Isomerisierung von Phospho-6-mannose zu
Phospho-1-mannose. Mutationen in diesem Gen führen zur gestörten GDP-Mannose-
Synthese, die einen wichtigen Baustein innerhalb der Glycosylierung darstellt. Der Phänotyp
der Patienten ist sehr heterogen und beinhaltet unter anderem Immunsystemdefekte,
Hypotonie und geistige Behinderung [21].
Abbildung 1.1 ST3GAL3 Aufbau und Funktion: (A) ST3GAL3-Gen- und Proteinstruktur. Dunkelgrau: proteincodierende Exons, hellgrau: 3‘- und 5‘-UTR. Bisher bekannte Mutationen sind auf cDNA- und Proteinebene benannt. Funktionale Domänen des Proteins, grün: Transmembrandomäne (TMD), orange: Sialyl-Motive „large“ (L), „small“ (S), „3“ und „very small“ (VS). (B) ST3GAL3-Akzeptorstrukturen Typ I und II sowie ein mögliches Produkt, Sialyl-Lewis a (sLe
a);
Zuckerbausteine: N-Acetyl-Glucosamin (GlcNAc), Sialinsäure (Sia), Galactose (Gal) und Fucose (Fuc). (Angelehnt an [5])
Einleitung 7
Nun zur genauen Funktion der ST3GAL3. Sie ist eine β-Galactosidase-α-2,3-sialyltransferase,
von denen es beim Menschen sechs bekannte Vertreter gibt (ST3GAL1 bis -6). Diese Enzyme
reagieren bevorzugt mit β-1,3-gebundener Galactose. Sie können unter anderem das bei
Säugern häufig vertretene Sialyl-Lewis-Epitop a (sLea) bilden (Neu5Ac-α2,3-Gal-β1,3-
GlcNAc(-1,4-Fucose)-β1,3-Galctose) [22] (Abb. 1.1 B). Die von Weinstein et al. [22]
untersuchte Sialyltransferase aus Rattenleber zeigte aber ebenso Aktivität mit β-1,4-
Galactose-β-1,3-N-Acetyl-Glucosamin. SLea-Epitope kommen beim Menschen hauptsächlich
auf Glycoproteinen in N-glycosidisch gebundener Form an Asparagin vor. ST3GAL3
katalysiert die Bindung von CMP-aktivierter Sialinsäure (CMP-Neu5Ac) auf eine β-1,3- oder
β-1,4-gebundene Galactose (Gal), ihre Substratspezifität ist dabei relativ breit. Es können
nicht nur sLea-Epitope gebildet werden [23].
Das ST3GAL3 Gen umfasst 15 Exons. Bisher konnten 39 Transkriptvarianten isoliert werden,
wobei sieben davon ausschließlich im Gehirn vorkommen [24] und 22 von ihnen
proteincodierend sind. Die Hauptisoform (B1, RefSeq accession number NM_006279.4) des
ST3GAL3-Gens umfasst die Exons 2, 4 ,5 ,7 ,8 ,9 ,10 ,11 ,12 ,13 und 14. Das translatierte
Enzym ist 375 Aminosäuren lang und enthält eine Transmembran-Domäne sowie vier Sialyl-
Motive, „Large“ (L), „small“ (S), „3“ und „very small“ (VS) die entscheidend zur Donor-
Erkennung und -Aktivität beitragen (Abb. 1.1A). Das Gen ist hoch konserviert und kommt
sowohl beim Schimpansen, Rhesusaffen, Hund, Kuh, Maus, Ratte, Huhn, Zebrafisch und
Frosch vor [25]. Bisher konnten drei verschiedene Variationen in diesem Gen mit geistiger
Behinderung assoziiert werden. Zwei von ihnen wurden in konsanguinen Familien aus dem
Iran gefunden. Hierbei sind die cDNA-Positionen c.38C>A und c.1108G>T (gDNA Positionen
g.44201971C>A und g.44395873G>T (GRCh37/hg19)) verändert. Sie verursachen einen
Aminosäureaustausch im Protein an den Positionen p.Ala13Asp und p.Asp370Tyr und
beeinträchtigen damit die Transmembrandomäne (TMD) und den C-terminalen (CD)
Bereich. Die betroffenen Patienten zeigen eine nicht-syndromale geistige Behinderung. Die
Variation der Patienten mit West-Syndrom wurde an der cDNA Position c.958G>C (gDNA
Position g.44386520G>C (GRCh37/hg19)) gefunden und verursacht im Protein einen
Aminosäureaustausch im Sialyl-Motiv S (SMS) an der Position p.Ala320Pro. Funktionale
Untersuchungen zeigten, dass die CD- und SMS-Varianten keine enzymatische Aktivität
mehr besitzen und die CD- als auch die TMD-Variante eine gestörte subzellulare Lokalisation
8 Einleitung
zeigen [5]. Für die SMS-Variante konnte bisher nur eine gestörte Sekretion bewiesen
werden [3], die Lokalisierung wurde noch nicht untersucht.
Über die Substratspezifität der ST3GAL3 beim Menschen ist bisher nichts bekannt, eine
Studie an St3gal3-Knockout-Mäusen zeigte jedoch eine drastisch reduzierte Menge an
Sialoglycoproteinen im Gehirn, wohingegen die Menge an Gangliosiden nur bei einem
Doppel-Knockout mit St3Gal2 signifikant war. In Folge dessen zeigte sich eine starke
Dysmyelinierung, deren Ursache in der verminderten Oligodenrocyten-Proliferation
postuliert wurde[26]. Die Auswirkung des ST3GAL3 Funktionsverlustes beim Menschen
sollte deshalb auf zellulärer Ebene in dieser Arbeit genauer untersucht werden. Auf Grund
seiner enzymatischen Aktivität und des Phänotyps unserer Patienten wären aber Defekte im
Sialinsäuremetabolismus und Störungen der Sialylierung der Glycocalyx des sich
entwickelnden Gehirns wahrscheinlich.
Das Gerüst der Sialinsäure, oder auch Neuraminsäure, besteht aus neun Kohlenstoffen und
hat somit etliche mögliche Modifikationsstellen. Die häufigste Modifikation ist eine N-
Acetylierung am C-5-Kohlenstoff. N-Acetylneuraminsäure (NeuAc) ist eine starke Säure (pKa
2,6), die über ihre exozyklischen Glycerinseitenketten stark hydratisiert sein kann [27].
Sialinsäuren kommen gehäuft in Vertebraten und einigen höheren Invertebraten vor [28]. In
Bakterien, Pflanzen und Pilzen kommen sie nur in einem sehr geringen Ausmaß vor [29]. Im
Gegensatz zu Affen (Schimpanse) produzieren Menschen nur NeuAc und keine N-
Glycolneuraminsäure (NeuGc) [30]. Interessanterweise ist NeuAc auch die im Gehirn
bevorzugte Sialinsäure bei Arten, die noch NeuGc produzieren können [31]. Innerhalb der
Glycocalyx können Sialinsäuren nur in nicht reduzierenden Endpositionen gefunden werden
[32]. Sie kommen als einzelne Sialinsäuren oder Sialinsäure-Oligomere von bis zu über 90
Sialinsäuren vor [33]. Ihre Funktion ist dabei immer abhängig vom darunter liegenden
Oligosaccharidgeäst und den Glycoprotein- oder -lipidstämmen [34].
In den meisten Geweben kommen Sialinsäuren auf Glycoproteinen, hauptsächlich N-
(Asparagin) oder O-glycosidisch (Serin oder Threonin), gebunden vor. Die häufigste Form der
N-gebundenen Glycane ist „NeuAc-α-2,3- (oder -α-2,6) Gal-β-1,4-GlcNAc“ [35]. Die meisten
O-glycosidisch gebundenen Glycane fangen mit einer GalNAc-Serin/Threonin-Bindung an
[36]. Im menschlichen Gehirn hingegen sind Sialinsäure am häufigsten auf Sialoglycolipiden,
auch Ganglioside genannt, zu finden [37].
Ganglioside bestehen aus einem Ceramid, an das ein Glycanbaum synthetisiert wird. Die
Einleitung 9
Synthese der Glycane wird in die „a“, „b“, „0“ und „α“-Serien unterteilt. Umso höher das
Gangliosid, desto länger und komplexer die Glycanstruktur. Das einfachste sialylierte
Gangiolisd ist das GM3, welches durch die ST3GAL5 synthetisiert wird. Während der frühen
Phase embryonaler Neurogenese in Ratten sind hauptsächlich die Ganglioside GM3 und
GD3 vorhanden und werden nach und nach durch höhere Ganglioside ersetzt (GM1, GD1a,
GD1b, und GT1b) [38, 39]. Die Sialylierung der höheren Ganglioside GD1a und GT1b werden
in Mäusen durch St3gal2 und St3gal3 katalysiert, interessanterweise zeigte aber nur die
St3Gal2-Einzel-Knockout-Maus einen deutlichen Phänotyp [40]. Ein Funktionsverlust der
St3gal3 hingegen kann hier offenbar kompensiert werden und steht damit in
Übereinstimmung mit den neuesten Ergebnissen, dass St3Gal3-Knockout-Mäuse
hauptsächlich eine Reduzierung der Sialoglycoproteinen zeigen [26]. Im menschlichen
Gehirn erhöht sich die Gangliosiddichte und -komplexität im letzten Trimester und den
ersten beiden Lebensjahren [41]. Ganglioside sind unter anderem an der Zell-Zell-
Kommunikation beteiligt und Mutationen im ST3GAL5-Gen verursachen unter anderem das
„Amish Infantile Epilepsy“-Syndrom [42].
Eines der prominentesten Glycoproteine der humanen zerebralen Entwicklung ist das poly-
sialylierte neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM). Hierbei wird an eine primäre α-2,3-
oder α-2,6-gebundene Sialinsäure eine mehr als 8 α-2,6-gebundene Sialinsäure lange Kette
durch die ST8SIA2 oder ST8SIA4 ligiert [43] [44]. Durch die hohe Flexibilität [45], starke
negative Ladung und Hydrophilie der PolySia-Ketten nehmen sie ein deutlich größeres
Volumen ein, so dass dies zu einer stereochemischen Abstoßung zwischen Zellen führt [46].
Welche ST3GAL-Transferase die Synthese der primären α-2,3-gebundenen Sialinsäure
katalysiert ist bisher nicht bekannt. Während der embryonalen Neurogenese wird PolySia
auf fast allen neuronalen Zellen z. B. auf radialen Gliazellen des Cortexes, gefunden. Hier ist
es unter anderem an der radialen Migration beteiligt [47, 48]. Andere Funktionen können
die negative Regulation der Zell-Zell-Anlagerung, -Signalweiterleitung, Zelladhäsion und
Zellplastizität sein.
Im Menschen gibt es 20 verschiedene hoch konservierte Sialyltransferasen, die alle zwei
größere und zwei kleinere Sialyl-Motive enthalten, die an der Donor (CMP-Sialinsäure)-
Bindung beteiligt sind [49]. Je nach Akzeptor (Galactose, N-Acetyl-Galactose oder
Sialinsäure) und katalysierter Bindung (α-2,3, α-2,6 oder α-2,8) können sie in vier
verschiedene Familien eingeteilt werden (ST3GAL, ST6GAL, ST6GALNAC oder ST8SIA). In
10 Einleitung
Vertebraten gibt es sechs verschiedene ST3GAL, zwei ST6GAL, sechs ST6GALNAC und sechs
ST8SIA Enzyme, die alle im Golgi-Apparat lokalisiert sind. Möglicherweise gibt es die
verschiedenen Enzyme für die gleiche Katalyse, da sie unterschiedliche Spezifitäten für den
vorhandenen Zuckerbaum, oder sogar das Glycoprotein, aufweisen könnten, aber auch das
Expressionsmuster kann von Gewebe zu Gewebe unterschiedlich sein. Beim Menschen sind
bisher krankheitsassoziierte Mutationen im ST3GAL3, ST3GAL5 und ST8SIA2 Gen bekannt.
Polymorphismen im Promotorbereich des ST8SIA2 Gens konnten mit einem erhöhten Risiko
für Schizophrenie assoziiert werden [50]. Mutationen in Sialinsäuremetabolismus-Genen,
wie dem Zuckertransporter SLC17A5 und der lysosomalen Sialidase NEU1 verursachen
Sialinsäure-Speicherkrankheiten, die eine starke kognitive Beeinträchtigung zeigen [51, 52].
1.3 Pluripotente Stammzellen
So heterogen wie die Ursachen nicht-syndromaler geistiger Behinderung sind, so heterogen
können auch ihre Konsequenzen auf molekularer, zellulärer oder Entwicklungsbiologischer
Ebene sein. Während bei Untersuchungen auf systemischer Ebene durch die Verbesserung
von bildgebenden und elektrophysiologischen Methoden deutliche Fortschritte erzielt
wurden, gestaltete sich die Aufklärung gestörter zerebraler Entwicklung und Funktion,
verursacht durch die veränderte molekulare Interaktion zwischen einzelnen neuronalen
Zelltypen, als deutlich schwieriger. In-vivo-Arbeiten zu den Ursachen zerebraler
Entwicklungsstörungen umfassten, neben Patientenuntersuchungen, bisher größtenteils
Ratten- oder Mausmodelle und konnten hauptsächlich in Fällen mit deutlichen
morphologischen Veränderungen, wie Mikrozephalien [53], einen Beitrag zur
Ursachenermittlung leisten. Die molekularen Quellen geistiger Behinderung, und vor allem
Epilepsien, hingegen, konnten anhand dieser Modelle nur wenig aufgeklärt werden [11]. Ein
Grund hierfür könnte die deutlich geringere zerebrale Komplexität eines Nagergehirns im
Gegensatz zum menschlichen sein. Neben den strukturellen Unterschieden, z. B. der
geringeren kortikalen Dicke, ist auch die Zusammensetzung der Strukturen mit
verschiedenen Zellsubtypen anders [54]. Da es kaum möglich ist, betroffenes Gewebe in
vitro zu untersuchen, stellen patientenspezifische induzierte pluripotente Stammzellen (iPS)
die momentan beste Alternative dar. Seitdem es Yamanaka und Kollegen 2006 gelungen ist,
durch die exogene Expression eines Sets an Transkriptionsfaktoren somatische Mauszellen
in einen pluripotenten stammzellähnlichen Zustand zurückzuversetzen (zu
Einleitung 11
reprogrammieren), erfuhr die Erforschung monogener Erkrankungen durch den Einsatz
patientenspezifischer iPS eine wahre Revolution [11, 55]. Patientenspezifische iPS bringen
die Hauptvorteile embryonaler Stammzellen mit, ohne die ethischen Bedenken. Sie sind
pluripotent und fähig zur Langzeitregeneration. Durch die immer besser und vielfältiger
werdenden Differenzierungsprotokolle stellen sie somit eine fast unendliche Quelle für
somatische Zellen aller drei Keimblätter dar. Insbesondere die Differenzierung zu
neuronalen Zelllinien wurde hierbei ergiebig erforscht und ermöglicht uns mit einem iPS-
Modell die Auswirkungen geistiger Behinderung in vitro zu untersuchen. Bisher konnte dies
für etliche neurodegenerative und entwicklungsbedingte Erkrankungen des zentralen
Nervensystems angewendet werden. Hierzu zählen unter anderem Morbus Alzheimer [56],
die Parkinson Erkrankung [57] und das Rett-Syndrom [58]. Für nicht-syndromale geistige
Behinderung konnte bisher kein Phänotyp in vitro mittels iPS abgebildet werden.
Grundsätzliches Prinzip der Reprogrammierung ist es, verschiedene Transkriptionsfaktoren
(TF) exogen in einer somatischen Zelle zu exprimieren. Diese Faktoren stoßen epigenetische
Veränderungen an, die es der Zelle ermöglichen, in einen „Genexpressions-Grundzustand“
zurückzukehren, der dem einer Stammzelle ähnelt. Die Erforschung der genauen
Wirkmechanismen sowie der molekularen und zeitlichen Abläufe hierbei präsentiert sich
allerdings bisher als sehr komplex und bedarf weiterer Arbeiten [59]. Es wurden bisher
verschiedene Kombinationen an TF verwendet. Neben den ursprünglichen Faktoren OCT4,
c-MYC, SOX2 und KLF4 wurden einzelne gegen NANOG oder LIN28a ausgetauscht [60].
Gerade der Verzicht auf das Protoonkogen c-MYC wurde hierbei untersucht [61]. Die
Methode konnte bisher für etliche Spezies, unter anderem den Menschen, und
verschiedenste somatische Zelltypen wiederholt werden [62, 63]. Die Verwendung von
peripheren Blutzellen bietet bisher die am wenigsten invasive Möglichkeit,
Patientenmaterial zu verwenden [64], die am häufigsten verwendeten Zellen sind allerdings
immer noch Hautfibroblasten. Für die exogene Expression der Faktoren wurden bisher
verschiedenste Wege genutzt. Die am weitesten verbreitete Methode nutzt ein lentivirales
Vektorsystem, um die Faktoren unter Kontrolle eines retroviralen Promotors persistent in
das Genom zu integrieren. Für die Anwendung der iPS in regenerativen Fragestellungen ist
es notwendig, eine nicht integrative Methode zu wählen. Etliche Ansätze gehen hierbei über
die kontinuierliche Zugabe an mRNA [65] oder die Verwendung von episomalen [66] oder
Sendai-Vektoren [67]. Für Anwendungen im nicht-regenerativen Bereich, wie auch in dieser
12 Einleitung
Arbeit, ist die Verwendung eines lentiviralen Systems die robusteste und günstigste
Variante.
Da die Integration des Vektorsystems und die Expression der TF drastische Eingriffe in die
Zellphysiologie darstellen, kann es häufig zu unbeabsichtigten oder unvollständigen
Veränderungen während der Reprogrammierung kommen. Für komparative Studien ist
deshalb die strikte Qualitätskontrolle der neu erhaltenen Zelllinien an mehreren Punkten
wichtig. Neben der Validierung der Pluripotenz der Zellen müssen auch genetische und
epigenetische Veränderungen überprüft werden. Die Pluripotenz der Zellen wird durch den
Nachweis verschiedener pluripotenzassoziierter Faktoren auf transkriptionaler und
translationaler Ebene überprüft. Die Fähigkeit zur Differenzierung in alle drei Keimblätter,
Mesoderm, Endoderm und Ectoderm, wurde meist über einen Teratom-Assay in Mäusen
überprüft [68]. In neueren Studien werden diese tierschutzrechtlich bedenklichen
Maßnahmen häufig durch die Verwendung eines RNA-Array-basierenden Ansatzes (z. B.
PluriTest) und der in-vitro-Differenzierung in alle drei Richtungen ersetzt [69]. Innerhalb des
PluriTests wird das RNA-Expressionsprofil der neuen iPS-Linie mit einer Datenbank
verschiedener iPS und embryonaler Stammzellen verglichen. Neben der Pluripotenz ist auch
gerade für komparative Studien die Vergleichbarkeit der Patientenlinie mit der Referenzlinie
wichtig. Die genetische Integrität der Zellen wurde anhand Karyotypisierung oder
„comparative genomic hybridization“ (Array-CGH) im Vergleich zum unbehandelten
somatischen Ausgangsmaterial überprüft [61] [70]. Untersuchungen der DNA-
Methylierungsmuster und RNA-Sequenzierungen geben Aufschluss über die epigenetische
Varianz der verschiedenen Linien [59]. Über diese Methoden hinaus sind auch
Standardqualitätskontrollen, wie der Test auf Mycoplasmen-Kontaminationen, wichtig. Die
Integration der verschiedenen TF in das Genom stellt den größten Eingriff in die genomische
Integrität der Zellen dar. Bei der Verwendung des retroviralen Vektorsystems kam es durch
die Mehrzahl an Integrationsereignissen, für jeden Faktor eine Integration, häufig zu
schwereren genomischen Anomalien. Bei Verwendung eines multicistronischen lentiviralen
Vektors der dritten Generation konnte die Stöchiometrie deutlich verbessert werden.
Vektoren dieser Art fehlen alle viralen, proteincodierenden Gene. Durch die starke
Verkürzung der die Transkriptionskasette einfassenden long terminal repeats (LTRs) ist nur
noch die Insertion in das Wirtsgenom, aber keine erneute Exzision mehr möglich. Anhand
der Codonoptimierung der Sequenzen ist eine spezifische Unterscheidung im Nachweis
Einleitung 13
exogener und endogener Faktoren erreichbar. Von diesem Vektor werden alle vier Faktoren
gleichzeitig exprimiert und über selbstschneidende Hydrolase-Schnittstellen vor der
Translation separiert. Darüber hinaus enthält er einen Reporterfarbstoff, der es ermöglicht,
die Expression der TF simultan nachzuverfolgen. Für eine erfolgreiche Reprogrammierung ist
somit nur noch eines anstatt vier Integrationsereignissen notwendig [71]. Epigenetische
Anomalien konnten erfolgreich durch den Einsatz von Histon-Deacetylase-Inhibitoren, wie
Valproinsäure [72] und Ascorbinsäure [73] direkt nach der Transduktion, abgemildert
werden. Trotz der steten Optimierung der Anwendung kommt es immer noch zu deutlichen
Unterschieden zwischen verschiedenen Klonen derselben Reprogrammierung. Besondere
Beachtung stellt deshalb neben der genomischen und epigenetischen Integrität auch die
Vergleichbarkeit zwischen Kontrolle und Patientin sowie den verschiedenen Klonen dar.
Für die regenerative und translationale Medizin, aber auch die Grundlagenforschung
monogener Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS), ist die Verwendung von iPS
nur der Startpunkt vieler Studien. Erst die erfolgreiche und reproduzierbare Differenzierung
der Zellen zu einem speziellen adulten, neuronalen Subtyp oder Gewebe ist der Schlüssel
zur Beantwortung vieler Fragestellungen. Die Differenzierung von iPS zu neuronalen Zellen
verlief früher entweder über die Kokultur mit Stromazelllinien oder die Generierung von
„Embryoid Bodies“ (EB), also kleiner embryonaler Körperchen [74, 75]. Beide Methoden sind
allerdings kompliziert, zeitintensiv und uneffektiv, so dass die Variabilität der Ergebnisse
relativ groß ist. In der Erforschung der verschiedenen Differenzierungsmöglichkeiten
konnten jedoch deutliche Fortschritte erzielt werden. Der Trend geht momentan zur
Verwendung eines chemisch definierten Kulturmilieus und zeitlich angepasster Zugabe
sogenannter „small molecules“, neuronaler Induktoren. Diese kleinen Moleküle sind
kosteneffektiv, stabil und reduzieren die experimentelle Variabilität. Darüber hinaus zeigen
sie einen schellen reversiblen, biologischen Effekt, der durch die Variation in Zeitpunkt und
Konzentration einfach anzupassen ist. Die Grundlage neuronaler Differenzierung ist
hauptsächlich ein Wechselspiel aus Aktivierung und Inhibition verschiedener
entwicklungsspezifischer Signalwege, die durch Cytokine, Wachstumsfaktoren und
Epigenetik gesteuert werden [76]. Das steigende Verständnis des Zusammenspiels dieser
Signalwege im Kontext der Differenzierung erlaubt es, gezielter in diese einzugreifen. Etliche
Veröffentlichungen über den Einsatz kleiner Moleküle für die Differenzierung von iPS zu
14 Einleitung
neuronalen Zellen beweisen dies. So zeigt sich der definierte Einsatz der beiden Inhibitoren
SB 431542 und Dorsomorphin, zwei SMAD-Inhibitoren, die den TGF-β/Actvin/Nodal-
Signalweg und den „bone morphongenic pathway“ (BMP) blockieren, als äußert effektiv für
die Differenzierung zu neuronalen Stammzellen [77, 78]. Neuronale Stammzellen können
dann im folgenden Verlauf zu verschiedenen Neuronen und Gliazell-Subtypen mit
verschiedener Regionalisierung differenziert werden. Während der Entwicklung des
zentralen Nervensystems kommt es zu einer Regionalisierung, unter anderem zum
Telencephalon, Mesencephalon und dem Rhombencephalon, unter Kontrolle verschiedener
Faktoren. Die wichtigsten hierbei sind Retinolderivate, fibroblastische Wachstumsfaktoren
(„Fibroblast Growth Factor“, FGF), das Sonic-Hedgehog-Protein und das Wnt-Protein 1 [79].
Die einzelnen Faktoren wirken konzentrations- oder aktivitätsabhängig entlang der
rostro/caudalen bzw. dorsal/ventralen Achsen [80, 81]. Durch gezielten Einsatz und
Kombination der verschiedenen Faktoren soll es möglich sein, spezifische neuronale
Subtypen einer bestimmten Region zu differenzieren. So konnten bisher die verschiedenen
neuronalen Subtypen, dopaminerge-, serotonerge-, GABAerge-, und cholinerge- Neuronen
bzw. Motorneuronen differenziert werden [77, 82-84]. Aber auch die Differenzierung zu
Interneuronen und verschiedene Gliazell-Subtypen, wie Astrocyten und Oligodendrocyten
konnte bereits realisiert werden [85-87]. Auch die Unterscheidung der verschiedenen
neuronalen Subtypen in zerebrale Regionen, wie Prosencephalon [88], Mesencephalon [79]
oder Rhombencephalon [89] konnte schon verwirklicht werden.
Dank der immer größeren Anzahl definierter und effektiver Differenzierungsprotokolle
konnten immer mehr Forschergruppen neurodegenerative Erkrankungen und Störungen
während der ZNS-Entwicklung in vitro untersuchen. Mesencephalische dopaminerge
Neuronen konnten bisher schon für die in vitro- und in vivo-Untersuchungen von Parkinson
eingesetzt werden [90, 91]. Darüber hinaus konnten etliche andere neurodegenerative
Erkrankungen, wie Alzheimer [56], Huntington [92] oder spinale Muskelatrophie [93] mittels
aus iPS differenzierter Neuronen untersucht werden.
Die molekularen Ursachen geistiger Entwicklungsstörungen hingegen wurden bisher
deutlich weniger intensiv mittels iPS erforscht. Trotzdem konnten erste Erfolge z. B. für das
Rett-Syndrom [94] oder das Fragiles-X-Syndrom-assoziiertes-Tremor/Ataxia-Syndrom
(FXTAS) [95] gezeigt werden. IPS-basierte Untersuchungen zum West-Syndrom wurden noch
gar nicht unternommen. Das Dravet-Syndrom ist das bisher untersuchte Syndrom mit der
Einleitung 15
größten Phänotypüberschneidung. Es zeichnet sich durch eine schwere und maligne Form
frühkindlicher myokloner Epilepsien, häufig begleitet durch geistige Behinderung, aus und
wird oft durch Mutationen im SCN1A-Gen verursacht. Studien an patientenspezifischen
GABAergen prosencephalischen Neuronen konnten hierbei zeigen, dass diese verminderte
Aktionspotentiale unter starken depolarisierenden Impulsen [96] sowie eine erhöhte Anzahl
an Natriumkanälen und Übererregbarkeit aufwiesen [95]. Diese Eigenschaften ermöglichen
es, die Zellen als ein Modell für die Wirkstoffsuche personalisierter antikonvulsiver
Therapien einzusetzen [97]. Mitarbeitern des Labors von Jürgen Knoblich gelang es mittels
zerebraler Organoide, die gestörte unreife Neurogenese von CDK5RAP2-abhängiger
Mikrozephalie in vitro abzubilden und konnten somit den Wert der Verwendung
dreidimensionaler Organoide zur verbesserten Annäherung an physiologische Bedingungen
beweisen [98]. Gerade die Erforschung komplexer Erkrankungen, wie geistiger Behinderung
oder Epilepsien, könnte durch die Verwendung zerebraler Organoide große Fortschritte
erzielen.
1.4 Embryonale Neurogenese
Um die Ursachen geistiger Entwicklungsstörung in vitro untersuchen zu können, ist es
notwendig, die basalen Abläufe während der embryonalen Entwicklung und Neurogenese
zu verstehen. Für das weitere Verständnis soll hier deshalb ein kurzer Überblick über
Gastrulation, Neuralrohrbildung und Neurogenese des humanen Kortexes gegeben werden.
Während der Embryogenese kommt es nach der Bildung der Blastocyste zur Einstülpung
und Entwicklung der drei Keimblätter, dieser Vorgang wird als Gastrulation bezeichnet
(Verlauf während der Embryogenese zwischen Tag E 13-20). Hierbei liegt das Endoderm
innen, in der Mitte das Mesoderm und die äußerste Schicht bildet das Ectoderm (Abb. 1.2A).
Aus dem äußersten, dorsalsten Teil, dem Neuroectoderm, entwickelt sich die Neuralplatte
aus der sich das Neuralrohr und schließlich das zentrale Nervensystem bilden (E 21-29). Aus
den ventralsten ectodermalen Zellen bilden sich Zellen der Neuralleiste, aus denen sich das
periphere Nervensystem bildet. Die Polarisierung des Neuralrohres wird durch einen
ventralen Sonic-Hedgehog (SHH) und einen dorsalen BMP-Konzentrationsgradienten
verursacht (Abb. 1.2B).
16 Einleitung
Abbildung 1.2: Gastrulation und Neuralrohrbildung (A) Gastrulation: Aus der Blastocyste bildet sich das Ectoderm (gelb) Endoderm (grün) und Mesoderm (im Zwischenraum) heraus. (B) Der Initialschritt der Bildung des Neuralrohres (Querschnitt aus A) ist die Bildung des Notochords (rot). Aus dem in dorsal (lila) und ventral (magenta) polarisierten Neuralrohr bildet sich das zentrale Nervensystem und aus den ventralsten Zellen des Ectoderms bilden sich die Zellen der Neuralleiste (blau), aus denen das periphere Nervensystem entsteht. Frei adaptiert nach [99].
Kurz vor Schließung des Neuralrohres bilden sich im anterioren Teil die drei Hauptvesikel
des späteren humanen Gehirns, Prosencephalon, Mesencephalon, Rhombencephalon. Der
posteriore Teil entwickelt sich zum Rückenmark. Aus dem Prosencephalon entwickelt sich
das Vorderhirn. Zunächst stülpen sich hieraus neben dem Diencephalon die
telencephalischen Ventrikel heraus, aus deren dorsalsten Teilen sich wiederum der
zerebrale Kortex entwickelt (zusammengefasst u.a. von [99]). Der humane Neokortex, der
den größten Teil des humanen Kortexes ausmacht, besteht im adulten Zustand aus sechs
distinkten Neuronenschichten. In diesem frühen Stadium liegt aber zunächst nur eine dünne
Schicht neuroectodermaler Zellen vor, die die dorsale Wand der Ventrikel bilden. Diese
erste Schicht wird ventrikuläre Zone (VZ) genannt. Aus diesen neuroectodermalen Zellen
bilden sich über asymmetrische Zellteilung die radialen Gliazellen (RG), die ersten
neuronalen Stammzellen. Diese ordnen sich nebeneinander an und bilden so die
Röhrenform des Neuralrohres. Dieses Verhalten führt bei RGs in vitro zum typischen
Wachstum in Rosettenform. Diese Schicht mitotischer neuronaler Stammzellen ist viel zu
gering, um die Masse an post-mitotischen Neuronen des adulten Gehirns zu produzieren,
weshalb es zunächst zu einer symmetrischen Vervielfältigung des Stammzellpools kommt (E
25-42). Während dieser teilungsreichen Phase kommt es neben der Anreicherung an RGs
auch zur asymmetrischen Teilung zu intermediären neuronalen Stammzellen (IPC) und
äußeren radialen Gliazellen (oRG) [100, 101]. Die IPC migrieren dorsal entlang der RGs und
bilden über ihnen die subventrikuläre Zone (SVZ). Die oRGs bilden die darüber liegende,
äußere subventrikuläre Zone (OSVZ). Beide Zellpopulationen sind in einem geringeren
Einleitung 17
Ausmaß als RGs zur symmetrischen Zellteilung fähig, hauptsächlich potenzieren sie aber die
Anzahl an Neuronen über asymmetrische oder sogar symmetrische Zellteilung [102] (Abb.
1.3). Die „intermediate progenitor Hypothese“ postuliert, dass die Menge an IPC mit der
evolutionären Expansion des Kortexes in gyrencephalischen Säugern einhergeht [103]. Die
ersten Neuronen migrieren entlang der radialen Gilazellen und bilden die „Preplate“ (PP),
die sich später in die obere Marginalzone (SMZ) und tiefere Subplatte (SP) aufspaltet.
Anschließend folgt die Bildung der spezifischen Projektionsneuronen (PN), welche die sechs
distinkten kortikalen Schichten (Lamina) bilden. Diese werden in überlappenden Wellen
nach einem strengen temporalen Muster von innen nach außen gebildet [104].
Abbildung 1.3: Entwicklung des humanen Kortex. Bildung des polarisierten Neuralrohres zwischen Tag 19 und 29 der embryonalen Entwicklung (E 19-29). Ectoderm (gelb), Endoderm (grün), Neuralleiste (blau), Neuralrohr (lila/magenta). Regionalisierung des Neuralrohres zu Telencephalon, Diencephalon, Mesencephalon und Rhombencephalon bis Tag 49 der embryonalen Entwicklung (E 27-49). Aufbau der kortikalen Schichten ab Tag 42 der embryonalen Entwicklung. Neuroectodermale Zellen (grün) teilen sich zu neuronalen Stammzellen. Zunächst zu radialen Gliazellen (blau), die die ventrikuläre Zone (VZ) bilden. Aus den radialen Gliazellen entwickeln sich über asymmetrische Zellteilung die intermediären neuronalen Stammzellen (orange), die in die subventrikuläre Zone (SVZ) migrieren und die äußeren radialen Gliazellen (türkis), die in die äußere SVZ migrieren. Alle drei Stammzellpopulationen tragen über asymmetrische und symmetrische Zellteilung zum Aufbau des neuronalen Zellpools (rot) bei. Im humanen adulten Gehirn besteht der Neokortex aus sechs distinkten Schichten (Lamina), die während der embryonalen Neurogenese in aufeinanderfolgenden Wellen von innen nach außen gebildet werden. Frei adaptiert nach [99, 105] [88].
Somit werden die Neuronen der Schicht VI zuerst gebildet, die der Schicht I zuletzt. Die
ersten PNs sind corticothalamische Projektionsneuronen und regulieren die Spaltung der PP.
Sie unterstützen sowohl die Migration der folgenden PNs, und somit die korrekte
Laminierung, als auch die Leitung der Axone der callosalen PNs über die Mittellinie, um das
Corpus Callosum zu bilden [106, 107]. Diese PNs sind TBR1-positiv und werden über eine
Kaskade aus radialen Gliazellen direkt aus den intermediären Stammzellen (IPC) gebildet
[108].
18 Ergebnisse
2. Ergebnisse
Grundlage dieser Forschungsarbeiten bildeten vier Patienten einer konsanguinen
palästinensischen Familie, die an einer schweren Form des West-Syndroms leiden. Die
Symptome dieses Syndroms sind frühinfantile epileptische Anfälle und eine geistige
Entwicklung, die im Bereich einer schweren geistigen Behinderung liegt. Bei allen vier
Patienten konnte die Basensubstitution c958G>C im ST3GAL3-Gen festgestellt werden, die
den Aminosäureaustausch p.320A>P in der CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-
galactosid-alpha-2,3-sialyltransferase verursacht [3](Abb. 2.6). Um die Auswirkungen und
somit die molekulare Ursache der Mutation genauer untersuchen zu können, wurde ein
patientenspezifisches in-vitro-Modell aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS)
etabliert. Patientenspezifische iPS bildeten hierbei mit ihrer Fähigkeit zur
Langzeitregeneration und der Möglichkeit, sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren,
eine nahezu unendliche Quelle für fast jedes reife humane Gewebe. Innerhalb dieser Arbeit
wurden Fibroblasten eines gesunden Geschwisterkindes zu iPS reprogrammiert und konnten
somit als Referenzlinie für eine bestehende Patienten-iPS-Linie genutzt werden. Dem
Phänotyp der Patientinen entsprechend wurde eine Differenzierung nach dem Protokoll von
Yichen Shi et al., zu Kortexneuronen etabliert [112]. Einer der Vorteile dieses
Differenzierungsprotokolls ist, dass die Zellen wichtige Stadien der embryonalen
Neurogenese in vitro nachbilden. So war es nicht nur möglich, die stationären Auswirkungen
der Mutation innerhalb einer Zellpopulation zu untersuchen, sondern auch die temporär
innerhalb der Entwicklung auftretenden Unterschiede. Die so etablierten Zelllinien wurden
als Fibroblasten, als iPS und während der kortikalen Entwicklung an den Tagen 12, 30, 35, 50
und 90 näher untersucht.
2.1 Subzellulare Lokalisierung verschiedener ST3GAL3 Mutationsvarianten
Die CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-sialyltransferase umfasst
eine Transmembrandomäne sowie vier Sialylmotive L (large), S (small), 3 und VS (very small)
(Abb. 2.1) und ist im Wildtypteil der Membran des Golgi-Apparates. Bisher sind drei
verschiedene Mutationsvarianten im ST3GAL3-Gen bekannt. Die Mutationen in der
Transmembrandomäne (p.Ala13Asp; TMD) sowie im C-terminalen Bereich (p.Asp370Tyr;
Ergebnisse 19
CD) verursachen eine schwere geistige Behinderung. Die Mutation im Sialylmotiv-S
(p.Ala320Pro) unseres Patientinen verursacht darüber hinaus starke epileptische Anfälle. In
vorhergehenden funktionellen Untersuchungen der drei Mutationsvarianten konnte mittels
eines radioaktiven in-vitro-Aktivitätsassays gezeigt werden, dass die TMD-Mutante eine
ähnliche enzymatische Aktivität wie das Wildtypenzym aufwies. Sowohl die CD-Mutante als
auch die Sialylmotiv-S-Mutante zeigten hingegen einen vollständigen Verlust der
enzymatischen Aktivität. Überexpression von c-Myc-fusionierten TMD- und CD-
Mutationsvarianten in LMTK--Zellen zeigten eine gestörte subzellulare Lokalisierung [5]. Die
bis dahin nicht erfolgte Untersuchung der subzellularen Lokalisierung der Sialylmotiv-S-
Mutationsvariante wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt.
2.1.1 Quick Change Mutagenese von pST3GAL3wt zu pST3GAL3A320P
Für eine Überexpression der Sialylmotiv-S-Mutationsvariante musste zunächst ein
Expressionsvektor mit einem ST3GAL3A320P-c-Myc-Fusionsprotein erstellt werden. Als
Ausgangsvektor wurde hierfür der pST3GAL3wt-c-Myc-Vektor verwendet (freundlicherweise
von Prof. Dr. Gerardy-Schahn zur Verfügung gestellt; Vektorkarte: siehe Anhang Abbildung
31-35 und Tabelle 8). Das Rückgrat dieses Vektors bildete der pcDNA3.1/myc-hisA-Vektor
von Invitrogen, in den die Volllängen-cDNA der Isoform B1 (accession no. NM_006279.2)
über XbaI/NotI eingefügt wurde. Für die Einführung der Basensubstitution an der Position
c.958 von G zu C wurde eine ortsspezifische Mutagenese mit dem unter 4.2.7
beschriebenen Kit der Firma Agilent Technologies durchgeführt. Das hierfür entworfene
Primerpaar (siehe 4.1.3) band an derselben Stelle im Vektor auf dem jeweils
komplementären Strang. Die einzelnen Primer waren 31 Basen lang, hatten eine
Schmelztemperatur von 80.2 °C, einen GC-Gehalt von 58 % und trugen mittig die
einzuführende Basensubstitution (rot markiert) GACGAGGTGGCAGTCCCAGGATTTGGCTATG
/CATAGCCAAATCCTGGGACTGCCACCTCGTC. Es wurden mehrere Proben mit einer
Verdünnungsreihe des Ausgangsplasmides von 50, 20, und 10 ng/50 µl angesetzt. Zu jedem
Ansatz wurden jeweils 125 ng der Primer (12.2 µl) gegeben. Jeweils eine Kolonie von jeder
Plasmidverdünnung wurde anschließend selektiert und angezogen. Jeweils von 2,5 ml der
Kultur wurde eine Plasmid Mini Isolation nach 4.2.5 durchgeführt, die anderen 2,5 ml
wurden als Glycerinkulturen nach 4.2.4 bei -80 °C konserviert. Anhand einer Sanger-
Sequenzierung des zu mutierenden Bereiches (siehe 4.1.9) von jedem isolierten Plasmid und
20 Ergebnisse
dem Ausgangsplasmid konnte eine erfolgreiche Basensubstitution innerhalb des
Fusionsproteins für die Plasmide der Plasmidverdünnung von 10 und 20 ng/50 µl
nachgewiesen werden. Das isolierte Plasmid der 50 ng/50 µl Plasmidverdünnung zeigte den
gleichen Genotyp wie das Wildtyp Plasmid (Abb. 2.1). Die dafür verwendeten Primer sind
unter 4.1.3 aufgeführt.
Abbildung 2.1: Mutationsvalidierung. Sequenzchromatogramme der ausgewählten Quick-Change-Mutageneseklone. Jeweils einmal des Wildtyps und der Ansätze mit 10, 20 und 50 ng Plasmid. Der zu mutierende Bereich ist mit einem Pfeil markiert.
2.1.2 Subzellulare Lokalisierung der exogen exprimierten ST3GAL3-Varianten
Die subzellulare Lokalisierung der ST3GAL3-Sialylmotiv-S-Mutationsvariante wurde anhand
einer Überexpression in LMTK--Zellen untersucht. LMTK--Zellen sind immortalisierte Maus
Fibroblasten und besonders für die Überexpression von Proteinen geeignet, da sie 5-Bromo-
2‘-deoxyuridine-resistent, Thymidinkinase-mangelhaft und Histonacetyltransferase-sensitiv
sind. Die Transfektion und Überexpression aller Mutationsvarianten und des Wildtypenzyms
erfolgte wie unter 4.4.7.2 mit Hilfe von Lipofectamin. Es wurden von allen
Mutationsvarianten und vom Wildtypplasmid ein Gemisch aus 500 ng Plasmid und 500 ng
Leervektor verwendet. Die verwendeten Plasmidmengen wurden vorher austitriert, um eine
zu starke Expression der Fusionsproteine zu vermeiden. Hierbei wurden Mengen zwischen
100 ng Plasmid bis zu 1 µg Plasmid verwendet. Die transfizierten Zellen wurden für 72 h
Ergebnisse 21
inkubiert und anschließend fixiert. Die so erhaltenen fixierten Zellen wurden genutzt, um die
subzellulare Lokalisierung der Fusionsproteine zu ermitteln. Anhand einer
Immunfluoreszenzfärbung des c-MYC-Epitopes bei gleichzeitiger Färbung des Golgimarkers
Giantin konnten sowohl die bisherigen Ergebnisse für das Wildtyp Enzym als auch für die
TMD- und die CD-Mutationsvarianten bestätigt werden (Durchführung siehe 4.7.7 und
4.7.1) [3]. Das c-Myc-Signal für das Wildtypfusionsprotein überlappte vollständig mit dem
Giantin-Signal und zeigte so die natürliche Golgi-Lokalisierung des Enzyms. Die Signale der c-
Myc-Färbungen der TMD- und CD-Mutationsvarianten zeigten keine spezifische
Überlappung mit dem Giantin-Signal. Das Signal der TMD-Variante zeigte Ähnlichkeiten zu
einem ER-Signalmuster, wohingegen das Signal der CD-Variante im ganzen Zytoplasma
verteilt zu sein schien. Das c-MYC-Signal der Sialylmotiv-S-Mutationsvariante zeigte
ebenfalls keine spezifische Überlappung mit dem des Golgimarkers (Abb. 2.2). Eine gestörte
subzellulare Lokalisierung des ST3GAL3-Enzyms konnte somit auch für die Sialylmotiv-S-
Mutationsvariante nachgewiesen werden.
Abbildung 2.2: ST3GAL3-Lokalisierung. Immunfluoreszenzbilder der exogenen Expression verschiedenener ST3GAL3-Mutationsvarianten in LMTK
--Zellen. Analysiert wurde das ST3GAL3-Myc-Fusionsprotein mit einem c-Myc-tag-Antikörper
(ac-MYC, Sigma-Aldrich, M4439, 1:1000) und der Golgi Apparat mit einem Giantin-Antikörper (aGia, Covance, PRB-114C, 1:1000).
2.1.3 Endogene ST3GAL3-Lokalisierung
Um die endogene Expression und die Lokalisierung der ST3GAL3 in den Patientenzellen zu
untersuchen, wurden drei verschiedene Antikörper gegen verschiedene ST3GAL3-Epitope
22 Ergebnisse
getestet. Die Färbungen wurden mit den Referenz iPS-Zelllinien HD2 und ASC23, HEK und
Myoblasten nach dem unter 4.7.7 beschriebenen Protokoll durchgeführt. Es wurden zwei
polyklonale Antikörper (ST3 und ST3S) und ein monoklonaler Antikörper (ST3M) getestet.
Alle drei Antikörper hatten den Isotyp IgG und stammten aus dem Kaninchen. Das Epitop
des Antikörpers ST3 liegt am c-terminalen Ende des Enzyms und umfasste die Sialylmotive 3
und VS. Das Epitop des Antikörpers ST3M liegt mittig im Enzym und umfasste das Sialylmotiv
L. Das Epitop des Antikörpers ST3 umfasste das gleiche Epitop wie der Antikörper ST3M,
außer dem Sialylmotiv L (Abb. 2.3).
Abbildung 2.3: Bindungsepitope der ST3GAL3-Antikörper. Schematische Darstellung des ST3GAL3-Proteins und der Epitope (ST3, ST3S und ST3M). Grün: Transmembrandomäne, gelb: Sialylmotive von links nach rechts large (L), small (S) und Domäne 3.
Für alle Antikörper wurden verschiedene Verdünnungen ausgetestet. Für keinen der
Antikörper konnte ein spezifisches Signal detektiert werden.
2.2 Etablierung patientenspezifischer iPS
Für die Erforschung von entwicklungsneurobiologischen Erkrankungen gibt es bisher wenige
Modelle, die eine realitätsnahe Untersuchung ermöglichen. Um diese Engpässe etwas zu
erweitern, kann man durch die exogene Expression von einem Set an Transkriptionsfaktoren
Patientenzellen zu induzierten pluripotente Stammzellen (iPS) reprogrammieren [63] [61].
Erfolgreich reprogrammierte iPS können dann in späteren Experimenten sowohl zu
neuronalen Stammzellen als auch adulten Neuronen differenziert werden und so als
patienten-spezifisches in-vitro-Modell genutzt werden, welches auch die Untersuchung von
Entwicklungsstörungen zulässt. Um die Vorteile dieses Modells nutzen zu können, wurden
deshalb patientenspezifische iPS etabliert. Zur besseren Übersichtlichkeit wurde der
schematische Ablauf dieser Methode zusammengefasst (Abb. 2.4).
Für die Etablierung der iPS dienten Fibroblasten der Patientin (4695) und des gesunden
Geschwisterkindes (4696) als Ausgangsmaterial (Abb. 2.6). Für die Reprogrammierung der
Zellen wurde ein lentivirales Vektorsystem genutzt, das die persistente Integration der vier
H2N COOH
ST3S
ST3M
ST3
p.Ala320Pro
Ergebnisse 23
Yamanaka Faktoren erlaubt. Die erfolgreiche Expression der Transkriptionsfaktoren konnte
anhand der Expression eines Reporterfarbstoffes (dTomato) überprüft werden. Ab Tag 20
nach der Transduktion waren stammzellähnliche Kolonien erkennbar und konnten manuell
selektiert werden.
Abbildung 2.4: Schematischer Ablauf einer Reprogrammierung. Transfektion von HEK-293-Zellen mit dem lentiviralen Transfervektor (p4in1), der für die vier Reprogrammierungsfaktoren und einen Reporterfarbstoff codiert sowie drei Hilfsvektoren (pg_p.4xCTE, pMD2.G, pRSV-Rev), die für die Verpackungsproteine, die reverse Polymerase und einen Transkriptionsfaktor codieren. Nach der Viruspartikelisolation wurden Primärfibroblasten (30.000/cm
2) mit diesen
transduziert (MOI 0.25). Nach 8 Tagen Inkubationszeit Passage auf Feederzellen (MEF). Um Tag 21 manuelle Selektion und Expansion der ersten stammzellähnlichen Kolonien.
Um eine geeignete Referenzzelllinie zu der Patientenlinie ΔSt3Gal3 nutzen zu können,
wurden Hautfibroblasten des weiblichen Geschwisterkindes 4696, im weiteren AS genannt,
für eine Reprogrammierung verwendet. Dieses Geschwisterkind ist homozygot für den
Wildtyp des ST3GAL3-Gens [3]. Kernstück des hierbei verwendeten Protokolls bildete das
unter 4.5 beschriebene multicistronische lentivirale Vektorsystem. Für die
Viruspartikelproduktion wurden zunächst HEK-293-Zellen mit den unter 4.5 beschriebenen
Vektoren (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. Axel Schambach) mit Hilfe
der unter 4.5.1 beschriebenen Calcium-Chlorid Methode transfiziert. Die
viruspartikelhaltigen Überstände wurden nach 36 h und 48 h entnommen und bei - 80 °C
kryokonserviert. Die Konzentration der Viruspartikel wurde anhand der unter 4.5.2
beschriebenen Virustiterbestimmung ermittelt. Es wurden hierfür HT1080-Zellen
verwendet. Diese humane fibroblastische Zelllinie stammt aus einem Fibrosarcoma und
wurde gewählt, da sie sich ähnlich zu den in der Reprogrammierung verwendeten primären
24 Ergebnisse
Hautfibroblasten verhält. Für die Titration wurden Verdünnungsreihen von 0, 0.3, 1, 3, 9 und
27 µl Viruspartikelkonzentrat in Dubletten verwendet. Die Menge der transfizierten Zellen
konnte anschließend über eine FACS-Analyse der dTomato-Reporterfarbstoff-
exprimierenden Zellen bestimmt werden.
Es wurden zwei Gefäße einer Mikrotiterplatte mit 6 Kavitäten mit je 30.000 AS-
Fibroblasten/cm2 der Passage 3 wie unter 4.5.3 reprogrammiert. Für die Transduktion der
AS-Zellen wurden Viruspartikel mit 470.000 IU/ml und einer MOI von 0,25 verwendet. Dies
ergab ein Volumen von 28 µl Viruspartikelkonzentrat pro 30.000 Zellen. Es wurde eine
„Spininoculation“ durchgeführt. Nach der Transduktion waren die Auswirkungen der
Expression der vier Transkriptionsfaktoren anhand von morphologischen Veränderungen bei
etlichen Zellen beobachtbar. Um Tag 13 der Reprogrammierung veränderten sich etliche
Zellen weg von der typischen, spindelförmigen Morphologie der Ausgangsfibroblasten. Viele
Zellen wiesen einen vergrößerten Zellkern und eine runde, stammzellähnliche Form auf.
Zellen, die die Transfektionskassette mit den vier Transkriptionsfaktoren integriert hatten,
konnten unter dem Fluoreszenzmikroskop im roten Kanal (Extinktion 530 - 560 nm) anhand
der Expression des Reporterfarbstoffes dTomato identifiziert werden. Viele dieser ersten
morphologisch veränderten Zellen proliferierten weiter und fingen an, kleine Kolonien zu
bilden, die sich im weiteren Verlauf zu größeren stammzellähnlichen Kolonien entwickelten.
Wichtige Charakteristika hierbei waren ein großer Zellkern, koloniales Wachstum in
Wabenstruktur und ein runder Zellkörper. Die stark proliferierenden Kolonien waren hierbei
von einer Vielzahl toter Zellen bedeckt. Ab einer Größe von ca. 150 µm, beziehungsweise
zwischen Tag 20 und Tag 25 der Reprogrammierung, wurden insgesamt 42 Klone manuell
selektiert. Es wurden einzelne Klone unterschiedlicher Größe und
Wachstumsgeschwindigkeit selektiert. Von diesen 42 Klonen konnten insgesamt 12 Klone
(3, 4, 11, 13, 20, 23, 24, 28, 31, 33, 39, 40) vereinzelt expandiert werden, bis genügend
Zellmasse vorhanden war, um, wie unter 4.4.6 beschrieben, mindestens vier
kryokonservierte Aliquote von jedem Klon anzulegen. Nach dem 25. Tag der
Reprogrammierung konnte das Signal des Reporterfarbstoffes dTomato in den Zellen nicht
mehr detektiert werden. Dies deutet auf ein episomales Silencing der Transkriptionskassette
hin (Abb. 2.5).
Ergebnisse 25
Abbildung 2.5: Morphologische Veränderungen während einer Reprogrammierung nach der persistenten Transduktion eines multicistronsichen lentiviralen Vektors. Dieser trägt die vier für die Reprogrammierung notwendigen Transkriptionsfaktoren OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC sowie einen Reporterfarbstoff (dTomato). Dargestellt sind Durchlichtbilder von Hautfibroblasten eines gesunden Geschwisterkindes zur ΔSt3Gal-3-Patientin, vor und 13, 18 und 25 Tage nach der Transduktion, kombiniert mit dem dTomato-Signal. Deutlich erkennbar war die Veränderung von einzeln wachsenden, spindelförmigen Zellen mit kleinem Zellkern hin zu runden Zellkörpern, großen Zellkernen sowie hin zu einem Wachstum in Kolonien. Auffällig ist der Rückgang des Reporterfarbstoffsignal und somit das Umschalten von exogener zu endogener Expression der Transkriptionsfaktoren.
2.2.1 Mutationsvalidierung der Patienten-iPS-Zelllinie ΔSt3Gal-3
Primäre Fibroblasten der Patientin 4695 wurden, durch das oben beschriebenes Protokoll
von unserem Kooperationspartner Dr. Dirk Hoffman vom Institut für experimentelle
Hämatologie der Medizinischen Hochschule Hannover, reprogrammiert. Für diese Arbeiten
wurden Fibroblasten einer Hautbiopsie der Patientin 4695 verwendet, die die Mutation
c958G>C im ST3GAL3-Gen homozygot tragen soll. Um die Identität dieser neu entstandenen
iPS-Linie (im weiteren ΔSt3Gal-3 genannt) zu überprüfen, wurde aus ihr, wie unter 4.1.4.1
beschrieben, genomische DNA isoliert. Anschließend wurde diese DNA für eine Sanger-
Sequenzierung des Exon 12 des ST3GAL3-Gens, der den mutierten Bereich umfassen soll,
aufbereitet. Die hierfür verwendeten Primer und Anweisungen wurden unter 4.1.3 und
4.1.9 beschrieben. Als Referenz wurde genomische DNA eines gesunden Blutspenders
verwendet. Mit Hilfe der MutationSurveyor-V3.23-Software (GATC BioTech AG, Konstanz)
konnten die Chromatogramme der Patienten-DNA mit der des gesunden Blutspenders
verglichen werden und so die homozygote Mutation im ST3GAL3-Gen für die ΔSt3Gal-3-
Linie bestätigt werden (Abb. 2.6).
26 Ergebnisse
Abbildung 2.6: (A) Vereinfachter Stammbaum der Familie der Patientin, gefüllte Symbole kennzeichnen Patienten. Chromatogramme eines Teils des Exon 12 von ST3GAL3 (B) eines Blutspenders und (C) des Patienten 4695. Das mutierte Basenpaar ist rot eingerahmt.
2.2.2 Validierung der Pluripotenz von drei verschiedenen iPS-Linien
Neben den angestrebten Veränderungen auf episomaler, translationaler und
morphologischer Ebene durch die persistente Integration der Transkriptionskassette in das
Wirtsgenom, können durch diesen gravierenden Eingriff auch anomale Veränderungen, wie
genomische Aberrationen und Insertionen oder Deletionen, auftreten. Um die Eignung der
gewonnenen iPS-Linien als komparables in-vitro-Modell zu überprüfen, wurden je ein Klon
der ΔSt3Gal-3, AS (ASC23) sowie einer weiteren Referenzzelllinie HD2 näher charakterisiert.
Die Pluripotenz der verwendeten Zelllinien wurde über q-RT-PCR einer Auswahl an
Pluripotenzmarkern sowie Immunfluoreszenzfärbungen nachgewiesen. Es wurden Array-
CGH sowie geschachtelte integrative PCRs mit Fusionsprimern durchgeführt, um die
genomische Integrität und den genauen Integrationsort der Kassette zu verifizieren.
Darüber hinaus wurde eine Sequenzierung der Gesamt-RNA aus den Stammzellen aller drei
Klone über die SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform sowie eine anschließende
Hauptkomponentenanalyse durchgeführt.
Ergebnisse 27
2.2.2.1 Quantitative PCR
Die Quantifizierung der mRNA-Expressionsintensität der Pluripotenzmarker wurde über die
quantitative Echtzeit-PCR, kurz q-RT-PCR nach 4.1.8.1 ermittelt. Als Plattform wurde ein
Light Cycler 480 und der Roche SYBR Green I Mastermix, beides von der Firma Roche (Basel,
Schweiz) genutzt. Es wurden die Pluripotenzmarker OCT3/4 (POU5F1), NANOG, SOX2, LIN28,
REX1 und PODXL für die Quantifizierung ausgewählt. Die hierfür verwendeten Primer, siehe
4.1.3, wurden Exon-Exon überspannend entworfen, um die Amplifikation genomischer
Bereiche auszuschließen. Als Referenzgene wurden für jede Probe die Gene ACTB und
GAPDH mitgemessen. Die RNA für diese Experimente wurde entweder über das TriZOL-
(4.1.4.4) oder das TriSpin-Protokoll (4.1.4.5) isoliert. Für die cDNA-Synthese wurden je
Ansatz 250 ng Gesamt-RNA eingesetzt. Geht man von einer vollständigen, reversen
Transkription aus, so wurden in der q-RT-PCR je Reaktion 12,5 ng cDNA eingesetzt. Jede
Probe und jedes Gen wurde in Dubletten oder Triplikaten gemessen. Die Auswertung
erfolgte anhand der ΔΔCt-Methode. Hierbei wurden die für jedes Gen erhaltenen Ct-Werte
zunächst gegen die interne Kontrolle, also die Referenzgene, verglichen:
. Danach wurde der FoldChange, also das Ausmaß der
Expressionsveränderung, dieser Gene von iPS im Vergleich zu den dazugehörigen
Fibroblasten als berechnet. In allen iPS-Linien konnte ein deutlicher Anstieg der
Expression der Pluripotenzmarker, variierend von einem 75-fachen Anstieg (NANOG in HD2)
bis zu einem 14.400-fachen Anstieg (OCT3/4 in ΔSt3Gal-3), nachgewiesen werden (Abb. 2.7).
28 Ergebnisse
A
B
Abbildung 2.7: Expressionsänderung der Pluripotenzmarker. (A) q-RT-PCR-Daten zur Expression von sechs Pluripotenzmarkern (LIN28a, NANOG, OCT3/4, PODXL, REX1 und SOX2), jeweils von der Referenzlinie (HD2), der gesunden Geschwisterkind- (ASC23) und der Patienten- (ΔSt3Gal-3) Zelllinie. Dargestellt ist der Anstieg der Expression der Marker in iPS, wobei die Expression in den korrespondierenden Fibroblasten als Bezugsgröße gewählt wurde. Die Stichprobenvarianz der einzelnen Marker wird als Fehlerbalken dargestellt. (B) RNA-Sequenzierungsdaten in „reads per kilobase per million“ wichtiger Pluripotenzmarker (PODXL, LIN28a, DNMT3B, SOX2, OCT4, MYC, NANOG) und Marker der Linien Mesoderm (T), Endoderm (SOX17) und Ectoderm (PAX6), jeweils von embryonalen Stammzellen (hES), zwei iPS-Referenzlinien (HD2, ASC23) und der Patientenlinie ΔSt3Gal-3.
Auffällig hierbei war, dass die Expression der Markergene in den Linien ΔSt3Gal-3 und ASC23
vergleichbar hohe Werte erreichte. Im Vergleich dazu lagen die insgesamt erreichten
Expressionswerte der Markergene bei der Linie HD2 deutlich darunter (Abb. 2.7). Diese
Ergebnisse scheinen mit der Passagenzahl sowohl zum Zeitpunkt der RNA-Isolation als auch
ihrer klonalen Einzigartigkeit zu korrelieren. Während die Linien ΔSt3Gal-3 und ASC23 mit
einer Passagenzahl von 36 und 16 relativ jung waren, waren die der Linie HD2 hingegen mit
einer Passagenzahl von 50 deutlich älter. Vergleiche von Ergebnissen der RNA-
Ergebnisse 29
Sequenzierung (siehe 4.1.11) der beiden Referenzlinien (HD2, ASC23) und der Patientenlinie
(ΔSt3Gal-3) mit embryonalen Stammzellen zeigen, dass sich die Expressionsintensität der
Pluripotenzmarker der iPS in der gleichen Größenordnung bewegt wie die der embryonalen
Stammzellen (Abb. 2.7B) (Detaillierte Betrachtung der RNA-Sequenzierungsergebnisse unter
2.4.2).
2.2.2.2 Immunfluoreszenzfärbung
Die Pluripotenzmarker OCT3/4 und SSEA4 wurden über eine Immunfluoreszenzfärbung in
den iPS-Linien nachgewiesen. OCT3/4 ist ein Transkriptionsfaktor, das Signal aus der IFF
hierfür wurde deshalb im Zellkern erwartet. SSEA4 hingegen ist ein Zuckerepitop auf
Glycolipiden, das Signal wurde deshalb auf der Oberfläche der Zellen erwartet. Zellen von
allen drei Linien wurden auf Mausfibroblasten und Deckgläschen kultiviert und anschließend
mit einer 4 % Paraformaldehydlösung fixiert (siehe 4.7.6). Die Zellen konnten dann mit
spezifischen Antikörpern markiert werden und diese dann mit fluoreszenzmarkierten
Sekundärantikörpern detektiert werden (4.7.7). Es wurden Primärantikörper gegen Epitope
des Transkriptionsfaktors OCT3/4 und das Oberflächenglycosid SSEA4 verwendet. Als
Sekundärantikörper konnte der Alexa-444-markierte Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet
werden (siehe 4.7.1). Das Einbettmedium enthielt den in die DNA interkalierenden Farbstoff
DAPI. Der Farbstoff gibt Signale innerhalb der Zellkerne, weshalb die Lokalisierung der
markierten Epitope näher eingegrenzt werden konnte. Die Färbungen zeigten für alle drei
Zelllinien deutliche Signale. Sowohl für die OCT3/4-Färbung, als auch die SSEA4-Färbung.
Das Signal des Transkriptionsfaktors überlappte vollständig mit dem DAPI-Signal im Zellkern
und das Signal der SSEA3/4-Färbung zeigte detailliert die Oberflächenstruktur der Zellen
(Abb. 2.8).
30 Ergebnisse
Abbildung 2.8: Immunfluoreszenzfärbung der Pluripotenzmarker. Immunfluoreszenzfärbungen gegen zwei Pluripotenzmarker (grün) und den Zellkern (blau) jeweils bei der Referenz iPS-Linie (HD2), der gesunden Geschwister- (ASC23) und der Patienten- (ΔSt3Gal-3) iPS-Linie. SSEA4 (aSSEA4, Biozol, BLD-330402, 1:100) ist ein Glycosphingolipid und Teil der Zelloberfläche, OCT4 (aOCT4, SCB, SC-5279, 1:50) ist ein Transkriptionsfaktor und im Zellkern lokalisiert. Maßstabsbalken 100 µm
2.2.3 Array-CGH
Um die genomische Integrität der iPS-Linien zu überprüfen, wurde von unserer
Kooperationspartnerin Prof. Dr. rer. nat. Doris Steinemann, TEAM funktionelle Genomik der
medizinischen Hochschule Hannover, eine hochauflösende Array-basierende, vergleichende
Genomhybridisierung (Array-CGH) durchgeführt. Bei der Array-CGH handelt es sich um eine
molekulare Analyse des gesamten Genoms mit der Mikrodeletionen und
Mikroduplikationen, allerdings keine balancierten Chromosomenaberrationen,
nachgewiesen werden können. Es wurde genomische DNA der Fibroblasten der Patientin
(ΔSt3Gal-3) und des gesunden Geschwisterkindes (AS) sowie der daraus reprogrammierten
iPS-Linien untersucht. Nach der Hybridisierung mit den DNA-Sonden und der Detektion der
Fluoreszenzsignale konnte bei keiner Probe eine Anomalie gegenüber der Referenz-DNA
(Fibroblasten) detektiert werden. Die iPS-Linie ASC23 zeigte zwei kleinere Deletionen auf
dem Chromosom 16, welche aber auch in den Fibroblasten (AS) gefunden wurden (Anhang
Abbildung 36).
Ergebnisse 31
2.2.4 Integrationsort der Viruskassette
Um den genauen Integrationsort der Transkriptionskassette innerhalb des Wirtsgenoms zu
bestimmen, wurde eine geschachtelte, integrative PCR mit Fusionsprimern (FPNI-PCR)
etabliert. Für die Amplifikation wurden Primer mit einer definierten Sequenz verwendet, die
am 5‘ Ende der Transkriptionskassette, also innerhalb der trunkierten „long terminal
repeats“ (LTRs), binden und eine Amplifikation aus der Kassette heraus in den unbekannten
genomischen Bereich hinein ermöglichen. Die weitere Amplifikation dieses ersten Stranges
wurde durch den Einsatz eines Pools an degenerierten Fusionsprimern ermöglicht. Die
hierfür verwendeten Primer und Protokolle sind unter 4.1.3 und 4.1.10 genauer
beschrieben. Die so gewonnenen Amplifikate wurden für eine Sanger-Sequenzierung
eingesetzt und die erhaltenen Sequenzen anschließend auf das humane Genom aligniert.
Die FPNI-PCR wurde für die Patienten-iPS-Linie ΔSt3Gal-3 und des gesunden
Geschwisterkindes ASC23 durchgeführt. Für die Zellen des gesunden Geschwisterkindes
(ASC23) konnte ein Integrationsereignis an der Position 158904392 (hg19, Feb. 2009) auf
dem langen Arm des Chromosoms 4 festgestellt werden. An dieser Stelle liegt kein offener
Leserahmen vor. 189326 bp davor befindet sich das Gen FAM198B, wahrscheinlich ein
Membranprotein, dass während der Entwicklung in Nerven und Epithelzellen exprimiert
wird. 762656 bp danach befindet sich das Gen GRIA2, ein Glutamat-Rezeptor, der in
Neuronen des ZNS exprimiert wird. Für die Patientenzellen der iPS-Linie ΔSt3Gal-3 wurden
zwei Integrationsereignisse an Position 6.956.876 (hg19, Feb. 2009) auf dem kurzen Arm des
X-Chromosoms und an Position 25.663.792 auf dem langen Arm des Chromosoms 17
gefunden. Der Integrationsort auf dem X-Chromosom liegt ebenfalls in keinem offenen
Leserahmen. Er liegt 10.085 bp oberhalb des Gens HDHD1, einer Haloacid-Dehalogenase-
ähnlichen Hydrolase ohne bekannte Funktion und 423219 bp unterhalb des Gens VCX3A,
einem Protein, das in der Spermatogenese eine Rolle zu spielen scheint, und mit X-
gebundener geistiger Behinderung in Verbindung gebracht wird [109]. Der Integrationsort
auf dem Chromosom 17 liegt 42686 bp unterhalb des Gens WSB1, der
Substraterkennungsuntereinheit eines Ubiquitinasekomplexes, und 81146 bp oberhalb des
Pseudogens TBC1D3P5.
32 Ergebnisse
2.2.5 Hauptkomponentenanalyse
Von den drei iPS-Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 wurde eine RNA-Sequenzierung
mittels der SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform (Applied Biosystems, Waltham,
Massachusetts, USA) durchgeführt. Für die RNA-Isolation wurden TriZOL-Proben aller drei
Zelllinien als iPS auf Matrigel kultiviert und nach 50 und 90 Tagen kortikaler Differenzierung
geerntet. Von den Zelllinien HD2 sowie ΔSt3Gal-3 wurden darüber hinaus Proben nach 12
Tagen kortikaler Differenzierung sequenziert. Von jedem Zustand jeder Zelllinie wurden
zwei biologische Replikate verwendet. Die RNA wurde anschließend, wie unter 4.1.4.4
beschrieben, isoliert und für eine RNA-Sequenzierung auf der SOLiD-5500-XL-
Sequenzierplattform eingesetzt. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit einem Barcode
versehen und 75 bp vorwärts sowie 35 bp rückwärts sequenziert. Die Rohdaten wurden
anschließend mit der Lifescope-Software auf das humane Genom (hg19) aligniert und
anschließend über das R-Paket DESeq normalisiert [110]. Die Hauptkomponentenanalyse
wurde ebenfalls unter Verwendung des R-Pakets DESeq durchgeführt.
Abbildung 2.9: Hauptkomponentenanalyse. Hauptkomponentenanalyse mittels des R-Pakets DESeq aus den RNA-Sequenzierungsdaten der drei Zelllinien ASC23, HD2 sowie ΔSt3Gal3 und den vier Zuständen iPS sowie nach 12, 50 und 90 Tagen (d12, d50 und d90) kortikaler Differenzierung.
Die Hauptkomponentenanalyse ergab drei verschiedene Hauptgruppen. Die erste Gruppe
bestand aus den sechs iPS-Proben, die zweite aus den vier Proben nach 12 Tagen kortikaler
Ergebnisse 33
Differenzierung und die dritte aus den acht Proben nach 50 bzw. 90 Tagen Differenzierung.
Die Gruppe der iPS-Proben zeigt, dass sich die biologischen Replikate der drei Zelllinien
relativ ähnlich sind. Die Zelllinien untereinander hingegen sind klar voneinander abgegrenzt.
Die Gruppe der Proben nach 12 Tagen Differenzierung zeigt die größte Heterogenität
zwischen den verschiedenen Zelllinien. Die Proben der beiden Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal-
3 nach 50 bzw. 90 Tagen Differenzierung konnten zu einer Gruppe zusammengefasst
werden und zeigten die geringste Heterogenität. Interessanterweise zeigten die
Patientenzellen nach 50 Tagen Differenzierung deutlich größere Unterschiede zur restlichen
Gruppe als nach 90 Tagen (Abb. 2.9). Während bei dem Vergleich zwischen den iPS-Linien
HD2 und ΔSt3Gal-3 89 Gene signifikant (p-Wert < 0.05) differentiell exprimiert waren,
wurden für den Vergleich zwischen den Linien ASC23 und ΔSt3Gal-3 nur 13 Gene signifikant
differentiell exprimiert (Abb. 2.10). Da die ST3GAL3-Expression in iPS nur basal vorhanden
ist und die Mutation in Übereinstimmung mit dem Krankheitsbild die Entwicklung auf
Stammzellebene nicht beeinflusst, kann man folgern, dass die Unterschiede zwischen den
drei iPS-Linien krankheitsunabhängig sind. Es ist somit wahrscheinlich, dass der genetische
Hintergrund der Zellen sowie die klonale Prägung während der Reprogrammierung zu
diesen Unterschieden geführt haben. Für die weiteren Analysen wurde deshalb die Zelllinien
ASC23 des gesunden Geschwisterkindes als Hauptreferenz zu den Patientenzellen gewählt.
Abbildung 2.10: Mengendiagramm differentiell exprimierter Gene. Verglichen werden DE-Gene der iPS-Vergleiche zwischen HD2 gegen ΔSt3Gal-3 (blau) sowie ASC23 gegen ΔSt3Gal-3 (grün). Die Gruppe der Gene, die in beiden Vergleichen signifikant differentiell exprimiert wurden, ist rot hinterlegt. Die Gene sind G0S2, PEG3, ZIM2, ZNF208 und SLC30A8, wobei die Pfeile die Richtung der Expressionsveränderung angeben.
34 Ergebnisse
2.3 Differenzierung zu Kortexneuronen
West-Syndrom-Patienten leiden an frühinfantilen epileptischen Anfällen und einer starken
geistigen Behinderung [3]. Um die molekularen Ursachen dieser Erkrankung des zentralen
Nervensystems untersuchen zu können, sollten die etablierten patientenspezifischen iPS-
Linien ΔSt3Gal-3 und ASC23 zu Neuronen differenziert werden. Für die Differenzierung von
iPS zu Neuronen wurden bisher etliche Methoden in der Literatur beschrieben. Mit diesen
Methoden können iPS zu unterschiedlichen Zelltypen differenziert (z.B. GABAerge Neuronen
oder Oligodendrocyten), aber auch die regionale Identität dieser Zellen (z. B. frontaler
Kortex, Mittelhirn oder dem Rhombencephalon) bestimmt werden. Für die Entscheidung,
welches Differenzierungsprotokoll etabliert werden sollte, wurde die ST3GAL3-
Expressionsintensität in verschiedenen Bereichen des adulten Gehirns untersucht. Darüber
hinaus wurde der Phänotyp und das Ansprechen der Patienten auf antiepileptische
Medikamente berücksichtigt (siehe 2.3.1).
2.3.1 ST3GAL3-Expressionsintensität in verschiedenen Bereichen des Gehirns
Wir haben Genexpressionsprofile verschiedener adulter Gehirnareale mittels Sequenzierung
der gesamt RNA über die SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform (Life Technologies Carlsbad,
USA) erstellt. Es wurden RNA-Proben von 11 verschiedenen Gehirnbereichen adulter
humaner Spender untersucht. Die ribosomale RNA wurde mittels des Ribo-ZeroTM-Kits
(Epicenter, Madison, WI) entfernt. Anschließend wurde die RNA mit den Materialien und
Anleitungen des SOLiD®-Gesamt-RNA-Seq-Kits (Life Technologies, Carlsbad, USA)
aufbereitet, für jede Probe wurde hierbei ein eigener Barcode verwendet. Je die Hälfte der
Bibliothek wurde mit der „exact call chemistry“ gemischt und 75 bp vorwärts sequenziert.
Die andere Hälfte wurde als „paired end“ 75 bp vorwärts und 35 bp rückwärts sequenziert.
Die resultierenden Einzelsequenzen werden im weiteren „Reads“ genannt und die
Expressionslevel der einzelnen Gene werden als Reads per kilobase per million (RPKM)
angegeben. Anhand dieser Daten konnte das Ausmaß der Expression der 6 ST3GAL-Gene in
verschiedenen Bereichen des Gehirns ermittelt werden. Im Durchschnitt aller sequenzierten
Bereiche zeigt das ST3GAL1-Gen mit 4.6 RPKM die niedrigste Expression und das ST3GAL5-
Gen mit 26.6 RPKM die höchste. Das ST3GAL3-Gen zeigt mit 10 RPKM im Durchschnitt aller
sequenzierten Bereiche die zweithöchste Expression. In den einzelnen Bereichen hatte das
ST3GAL3-Gen mit 15.56 RPKM seine höchste Expression aller untersuchten Areale im
Ergebnisse 35
zerebralen Kortex (siehe Tabelle 2.1). Mit Blick auf die Daten der Expressionsprofile und
dem Phänotyp der Patientin wurde daher ein Differenzierungsprotokoll für kortikale Zellen
etabliert.
Tabelle 2.1: Sialyltransferaseexpression in verschiedenen Gehirnarealen. Ausmaß der Expression der verschiedenen α-2,3-Sialyltransferasen als reads per kilobase per million [RPKM] für verschiedeneAreale im adulten humanen Gehirn.
ST3GAL1 ST3GAL2 ST3GAL3 ST3GAL4 ST3GAL5 ST3GAL6
Durchschnitt [RPKM] 4.62 6.89 10.06 9.40 26.64 7.96
Zerebraler Kortex 6.00 6.18 15.56 5.96 28.15 6.92
Corpus Callosum 2.99 3.18 7.21 17.98 18.23 4.33
Diencephalon 2.29 7.19 8.82 12.23 31.95 5.77
Thalamus 4.61 7.29 9.39 10.89 32.03 8.54
Cerebellum 2.38 14.05 11.24 4.79 16.01 16.62
Medulla oblongata 5.75 5.17 8.51 11.54 24.4 11.15
2.3.2 Modifiziertes Differenzierungsprotokoll nach Yichen Shi et al.
Der Beginn eines epileptischen Anfalles ist durch das zeitgleiche Auftreten zweier Ereignisse
gekennzeichnet: 1. das Auftreten eines Hochfrequenzaktionspotentials und 2. der
Hypersynchronisierung einer neuronalen Population im Kortex. Die pathophysiologischen
Ursachen dieser beiden Ereignisse sind bisher noch nicht vollständig geklärt, im Allgemeinen
geht man aber von einem Ungleichgewicht zwischen exzitatorischen Signalen durch
Projektionsneuronen und inhibierenden Signalen durch Interneuronen aus [111]. Die
Patientin 4695 sprach auf keine getestete Medikation an. Es wurden Arzneistoffe mit
verschiedenen Wirkmechanismen getestet. Hierzu gehörten das Mittel Vigabratin, ein
GABA-Transaminase-Suizid-Inhibitor, sowie Topiramat, ein AMPA-Rezeptor-Inhibitor [3].
Vigabratin erhöht die Halbwertzeit von GABA im Kortex der Patientin, welches von
GABAergen Interneuronen freigesetzt wird. Der AMPA-Rezeptor ist ein ionotroper
Glutamatrezeptor und ist somit an der Weiterleitung von Aktionspotentialen zwischen
Projektionsneuronen beteiligt. Da es keine eindeutigen Hinweise auf die molekularen
Ursachen und die hauptsächlich beteiligten Zelltypen der epileptischen Anfälle gab, wurde
die Etablierung eines Differenzierungsprotokolls bevorzugt, mit dem möglichst viele
Zelltypen des Kortexes abgebildet werden konnten. Die Entscheidung viel deshalb auf das
Differenzierungsprotokoll für kortikale Neuronen und neuronale Netzwerke nach Yichen Shi
36 Ergebnisse
et al. [112]. Der schematische Ablauf dieses Differenzierungsprotokolls wird in Abbildung
2.11 verdeutlicht.
Abbildung 2.11: Schematischer Ablauf des neuronalen Differenzierungsprotokolls nach Yichen Shi et al Modifiziertes Protokoll nach Yichen Shi et al., 2012, Nature Protocols: Zu iPS aus „Feeder“-freier Kultur in Konfluenz wird ein Induktionsmedium gegeben, welches zwei SMAD-Inhibitoren und Retinolsäure enthält (d 1). Nach ca. 10 Tagen bildet sich aus den Stammzellen ein Neuroectoderm (d 10). Nach einer Passage auf Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichtete Kulturgefäße fangen die neuronalen Vorläuferzellen an, sich in Rosetten zu formieren (~d 15). Nach einer weiteren Passage, in der die Zellen vereinzelt werden, wachsen die ersten Neuronen aus den Rosetten heraus (ab d 20).
Methodisch basiert dieses Protokoll auf der dualen Inhibition zweier SMAD-Proteine in
konfluent adhärenten iPS [77] bei gleichzeitiger Retinolsäurezugabe. Die Kultur im
konfluenten Monolayer bietet, im Gegensatz zu der häufig verwendeten Kultur von
„Embroyid Bodies“ (z.B. [75]), den Vorteil, dass die Zellen gleichmäßiger von den Reagenzien
erreicht werden und eine Entwicklung Richtung frontalem Kortex frühzeitig beeinflusst
werden kann. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll den Vorteil, dass die Zellen die
wichtigsten Schritte der embryonalen Neurogenese des Kortexes nachbilden. Hierbei
werden alle Entwicklungsstadien durchlaufen und alle kortikalen Zelltypen, bis auf
Interneurone, gebildet. Diese Differenzierung wurde mit den drei iPS-Linien HD2, ΔSt3Gal3
und ASC23 durchgeführt. Das Differenzierungsprotokoll wurde wie unter 4.6.1 beschrieben
durchgeführt. Direkt nachdem die iPS im Monolayer Konfluenz erreichten, wurde das
Medium für 8 - 10 Tage zu neuronalem Induktionsmedium (NIM) gewechselt. Der erste Tag
in NIM markierte den ersten Tag der neuronalen Differenzierung (Tag 1). Die folgenden
Ergebnisse 37
Tagesbezeichnungen der Differenzierung beziehen sich immer auf diesen Startpunkt. Die
wichtigsten darauf folgenden Stadien während der neuronalen Differenzierung waren die
Bildung des Neuroectoderms (Tag 9 - 12), dass sich nach der 1. Passage zu neuronalen
Stammzellen (Tag 12 - 20) entwickelte, welche in charakteristischen Rosettenstrukturen
wuchsen. Hieraus entwickelten sich neuronale Progenitorzellen, aus denen sich über
asymmetrische Zellteilung die ersten Neuronen entwickelten (ab Tag 20) (Abb. 2.11). Die
neuronalen Stammzellen wurden auf Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten Kulturgefäßen
bis maximal Tag 27 durch die Zugabe von 10 ng/ml bFGF expandiert und anschließend
kryokonserviert. Das Originalprotokoll wurde in mehreren Punkten in der Handhabung
leicht variiert. Während der 1. Passage des Neuroectoderms wurde vor der Dispase-II-
Behandlung zweimal mit 1x DPBS gewaschen und anschließend mit einer abgerundeten
Glaspasteurpipette 16 Quadrate erzeugt, um die reaktive Oberfläche zu vergrößern. Zudem
wurde auf die Verwendung von mTeSR-Medium vollständig verzichtet, da eine
Differenzierung in diesem Medium nicht möglich war. Die iPS wurden in konditioniertem
Stammzellmedium mit einer möglichst geringen bFGF-Konzentration bis zur gewünschten
Zellmenge kultiviert.
Abbildung 2.12: Wichtige Entwicklungsstadien während der Differenzierung zu kortikalen Neuronen. Von links nach rechts Durchlichtbilder von iPS auf Matrigel, konfluenten neuroectodermalen Zellen (Tag 8-12), neuronalen Stammzellen in Rosetten (ab Tag 13) und kortikalen Neuronen (ab Tag 20), Maßstabsbalken 50 µm.
Die morphologischen Veränderungen der konfluenten iPS hin zu einem konfluenten
Neuroectoderm waren sehr subtil und zeichneten sich hauptsächlich durch die
Verkleinerung der Zellen und Zellkerne aus. Zudem zeigten die neuroectodermalen Zellen
häufig eine erkennbare Wachstumsrichtung. Nach der 1. Passage organisierten sich die
neuronalen Stammzellen in polarisierten Rosettenstrukturen, welche Ähnlichkeiten zu
kortikalem Neuroepithelium aufwiesen. Deutlich erkennbar waren hierbei das apikale
Lumen und die basale Außenseite der Rosetten. Ab Tag 20 der Differenzierung traten erste
kortikale Neuronen auf, erkennbar an den typischen dreieckigen Zellkörpern und für den
Kortex typischen langen Axonen (Abb. 2.12). Für längere Inkubationszeiten wurden die
Zellen meistens in einer Zelldichte von ca. 50.000 Zellen/cm2 in poly-L-Ornithin/Laminin-
38 Ergebnisse
beschichtete Kulturgefäße inkubiert. Nach 30 Tagen Inkubation waren bereits eine
substantielle Neurogenese und erste neuronale Netzwerke erkennbar. Bis Tag 50 der
Differenzierung hatten sich aus diesen kleinen Netzwerken bereits dichte Neuronenteppiche
entwickelt, die aus den deutlich vergrößerten, rosettenförmigen Strukturen herauswuchsen.
Den Verlauf einzelner Axone nachzuvollziehen war kaum mehr möglich. Vereinzelt traten
Zellen unbestimmter Morphologie auf. Nach 90 Tagen Kultur hatten sich aus den Rosetten
große 3D-Strukturen gebildet, die über sehr dicke Neuronenbündel miteinander verbunden
waren. Bis zu diesem Zeitpunkt waren etliche Zellen unbestimmter Morphologie erkennbar.
Einzelne Zellen waren nur noch in Randgebieten, oder Bereichen, an denen der Zellteppich
aufgerissen und neu besiedelt war, erkennbar. Da Proben, die länger als 50 Tage in Kultur
wuchsen, Untersuchungen von einzelnen Zellen kaum mehr ermöglichten, wurden die
folgenden funktionellen Analysen auf die Zeitpunkte Tag 12, 30, 35 und 50 beschränkt (Abb.
2.13).
Abbildung 2.13: Durchlichtbilder kortikaler Zellen in der Langzeitkultur. Durchlichtbilder der beiden Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal-3 nach 30, 50 und 90 Tagen kortikaler Differenzierung in verschiedenen Vergrößerungen. Maßstabsbalken 50 µm.
Ergebnisse 39
2.3.3 Validierung der kortikalen Identität der differenzierten Zellen
Für die weiteren funktionellen Charakterisierungen der Zellen sollte die kortikale Identität
der Neuronen validiert werden. Wie bei der Pluripotenzvalidierung der iPS wurden hierbei
verschiedene kortexassoziierte Marker untersucht. Es wurden sowohl die in der Literatur
[112] empfohlenen Marker FOXG1, EMX1, SOX1, OTX1/2 und PAX6 als auch der
Pluripotenzmarker OCT4 mit q-RT-PCR und teilweise mit Immunfluoreszenzfärbung
untersucht.
2.3.3.1 Quantitative PCR
Die Quantifizierung der mRNA-Level der Kortexmarker wurde über die q-RT-PCR nach
4.1.8.1 in kortikalen Zellen nach 12 Tagen Differenzierung ermittelt. Es wurden die oben
genannten Kortexmarker neben dem Pluripotenzmarker OCT3/4 (POU5F1) für die
Quantifizierung ausgewählt. Die hierfür verwendeten Primer, siehe auch 4.1.3, wurden aus
der Literatur übernommen [112]. Als Referenzgene wurden für jede Probe die Gene ACTB
und GAPDH gemessen. Die RNA für diese Experimente wurde über das TriZOL-Protokoll
(4.1.4.4) isoliert. Für die cDNA-Synthese wurden je Ansatz 250 ng Gesamt RNA eingesetzt,
bei einer vollständigen reversen Transkription wurden je Reaktion 12.5 ng cDNA eingesetzt.
Jede Probe und jedes Gen wurde in Dubletten oder Triplikaten gemessen. Die Auswertung
erfolgte anhand der ΔΔCt-Methode. Der relative „FoldChange“, also das Ausmaß der
Expressionsveränderung, wurde aus den ΔCt-Werten der kortikalen Neuronen zu den
dazugehörigen iPS als berechnet. Für jedes Gen wurde die Stichprobenvarianz
berechnet. Für alle Kortexmarker konnte ein deutlicher Anstieg in den kortikalen Zellen
gegenüber den iPS ermittelt werden. Dieser variierte von einem 1.75-fachen Anstieg von
OTX1/2 in den ΔSt3Gal-3-d12-Zellen, bis zu einem 29.000 fachen Anstieg von PAX6 in den
ΔSt3Gal-3-d12-Zellen. Für den Pluripotenzmarker OCT4 konnte ein 9.500-facher für die
ΔSt3Gal-3-d12-Zellen, bzw. für die ASC23-d12-Zellen ein 6030-facher Rückgang der
Expression gegenüber den iPS ermittelt werden. (Abb. 2.14).
40 Ergebnisse
Abbildung 2.14: Expression Kortex assoziierter Marker. Relative q-RT-PCR-Daten der Expression von fünf Kortexmarkern (FOXG1, EMX1, SOX1, OTX1/2 und PAX6) und einem Pluripotenzmarker (OCT4) jeweils von Zellen d12 der Patientin (ΔSt3Gal-3) und des gesunden Geschwisterkindes (ASC23). Die Expression der Marker in den korrespondierenden iPS wurde Bezugsgröße gewählt. Der Fehlerbalken stellt die Stichprobenvarianz der einzelnen Marker dar, wobei n = 3 bzw. 6.
2.3.3.2 Immunfluoreszenzfärbung
Die kortexassoziierten Marker PAX6 und OTX1/2 wurden über eine
Immunfluoreszenzfärbung von kortikalen Zellen der Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 an
Tag 20 der Differenzierung untersucht. PAX6 ist ein Marker für neuronale Stammzellen, z.B.
radiale Gliazellen. OTX1 ist ein Transkriptionsfaktor, der in frühen kortikalen Stammzellen
exprimiert wird [113]. Alle drei Zelllinien wurden auf poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten
Deckgläschen kultiviert und an Tag 20 mit einer 4 % Paraformaldehydlösung für 30 Minuten
fixiert und anschließend permeabilisiert. Die Epitope wurde mit spezifischen
Primärantikörpern (aPAX6, SCB, SC81649, 1:300; aOTX1/2, Millipore, ab9566, 1:300)
markiert und konnten mit fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern detektiert werden
(4.7.7). PAX6 sowie OTX1/2 sind Transkriptionsfaktoren, die Signale wurden somit im
Zellkern der Zellen erwartet und konnten mit dem Signal der DAPI-Färbungen (blauer Kanal)
verglichen werden. Für alle drei Zelllinien konnten die kortexassoziierten Marker PAX6 und
OTX1/2 nachgewiesen werden. Die Signale lagen räumlich im Bereich der DAPI-Signale und
somit der Zellkerne der Zellen (Abb. 2.15).
Ergebnisse 41
Abbildung 2.15: Immunfluoreszenzfärbung kortexassoziierter Marker. Immunfluoreszenzfärbung gegen zwei Kortexmarker (grün und rot) und den Zellkern (blau) von der Referenz iPS-Linie (HD2), der gesunden Geschwister (ASC23) und der Patienten (ΔSt3Gal-3) iPS-Linie, jeweils nach 20 Tagen neuronaler Differenzierung. Pax6 (aPax6, SCB, SC-81649, 1:300) als auch Otx1/2 (aOtx1/2, Millipore, ab9566, 1:300) sind Transkriptionsfaktoren, die Signale wurde innerhalb des Zellkerns erwartet.
2.4 Funktionelle Analysen
Die molekularen Ursachen des West-Syndroms, verursacht durch die fehlende enzymatische
Aktivität der CMP-N-Acetylneuraminsäure-beta-1,4-galactosid-alpha-2,3-sialyltransferase
(ST3GAL3), sollten sowohl anhand der etablierten iPS-Linien, als auch bei den
differenzierten kortikalen Zellen von Patientin und gesundem Geschwisterkind näher
charakterisiert werden. An welche Galaktoseepitope die ST3GAL3 Sialinsäuren transferiert
und ob sie spezifisch für die daran gebundenen Protein- oder Lipidstrukturen ist, ist bisher
nicht bekannt. Da bisher keine konkreten Informationen zu den Zielstrukturen und somit
den Auswirkungen der Mutation vorliegen, wurden die Zellen hypothesenfrei auf
verschiedenen Ebenen (morphologischer, physikalischer, entwicklungsbiologischer und
Expressionsebene) untersucht.
42 Ergebnisse
2.4.1 Messung der ST3GAL3-Expression mittels digitaler PCR
Das Ausmaß der Expression des ST3GAL3-Gens sollte in den verschiedenen
Differenzierungsstadien der Patientin und des gesunden Geschwisterkindes untersucht
werden. Hierfür wurden zunächst intronüberspannende Primer für die Hauptisoform B1
konstruiert und anschließend mittels q-RT-PCR analysiert. Für die relative Quantifizierung
wurden die beiden Referenzgene ACTB und GAPDH gemessen. Es wurden iPS- und kortikale
Zellen nach 50 und nach 90 Tagen der Differenzierung von den Zelllinien ΔSt3Gal-3 und
ASC23 wie unter 4.1.8.1 beschrieben untersucht. Für qPCR-Messungen werden interne
Referenzgene gemessen, deren Expression in allen Proben auf einem vergleichbaren Niveau
liegen sollte. Da die Expressionswerte der Referenzgene, entgegen der Grundannahme
gleichbleibender Expression, zwischen den verschiedenen Differenzierungsstadien nicht
vergleichbar waren, erfolgte ein methodischer Wechsel zur digitalen PCR. Die digitale PCR
ermöglicht es, absolute mRNA-Mengen, ohne den Einsatz von Referenzgenen, zu
bestimmen. Für diese Untersuchungen wurde der FAM-markierte Taq-Man-Assay
Hs00544035_m1 von Life Technologies über die Exon-Exon-Grenze 7 und 8 der Isoform B1
des ST3GAL3-Gens genutzt. Die digitale PCR wurde wie unter 4.1.8.2 beschrieben
durchgeführt. Für jede Reaktion wurden 12.5 oder 22.5 ng Gesamt-cDNA eingesetzt. Dies
entsprach einer Konzentration von 1.25 oder 2.5 ng/µl. Das Auslesen der Chips erfolgte über
das Quant Studio 3D (Thermofisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) System in
Kopien pro µl und wurde anschließend in Kopien pro ng RNA umgerechnet.
Die einzelnen biologischen Replikate zeigten zum Teil eine relativ hohe Stichprobenvarianz.
Die technischen Replikate hingegen zeigten eine deutlich geringere Varianz, wie bei der
Messung der kortikalen Zellen nach 90 Tagen erkennbar. Bei den iPS lag der Durchschnitt
bei 129.8 Kopien/ng RNA in den ΔSt3Gal-3 und 125 Kopien/ng RNA in den ASC23 Zellen.
Nach 50 Tagen Differenzierung lag der Durchschnitt bei 647.7, bzw. 637.2 Kopien/ng RNA
und nach 90 Tagen bei 617.7, bzw. 523.6 Kopien/ng RNA. Es war in allen Proben ein
deutlicher Anstieg der ST3GAL3-Expression bei differenzierten Zellen im Vergleich zu
undifferenzierten iPS zu erkennen.
Der deutlich erkennbare Rückgang der ST3GAL3-Expression von 113 Kopien/ng RNA
zwischen den Tagen 50 zu 90 der Differenzierung in den ASC23 Zellen war in den
Patientenzellen nicht messbar. Hier betrug die Differenz lediglich 30 Kopien/ng RNA. Da die
Stichprobenvarianz zwischen den einzelnen biologischen Replikaten von Tag 50 aber mit ca.
Ergebnisse 43
168 Kopien/ng RNA sehr hoch war, und für die Messung der Zellen nach 90 Tagen
Differenzierung keine biologischen Replikate vorhanden waren, können wir keine
eindeutigen Schlüsse aus den vorliegenden Ergebnissen ziehen (Abb. 2.16 und Tabelle 9 des
Anhangs).
Abbildung 2.16: Mittlere ST3GAL3-Expression mittels dPCR. Dargestellt sind die mittleren ST3GAL3-Expressionslevel in Kopien/ng RNA als Balkendiagramm. Untersucht wurden jeweils Patientenzellen (ΔSt3Gal-3, rot) und Zellen des gesunden Geschwisterkindes (ASC23, grün) als iPS bzw. nach 50 und 90 Tagen kortikaler Differenzierung. Die Fehlerbalken stellen die Stichprobenvarianz (wobei n = 4)
2.4.2 Vergleichende RNA-Seq-Analysen
Von den drei Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 wurde jeweils eine RNA-Sequenzierung
mittels der SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform unternommen. Für die RNA-Isolation
dienten TriZOL-Proben aller drei Zelllinien als iPS auf Matrigel und nach 12, 50 und 90 Tagen
kortikaler Differenzierung. Die RNA wurde anschließend wie unter 4.1.4.4 beschrieben
isoliert und für eine RNA-Sequenzierung auf der SOLiD-5500-XL-Sequenzierplattform
eingesetzt. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit einem Barcode versehen und 75 bp vorwärts
sowie 35 bp rückwärts sequenziert. Abhängig von den verschiedenen biologisch relevanten
Fragestellungen wurden Vergleiche zwischen den verschiedenen Zelllinien und Zuständen
durchgeführt und so für jedes Gen ein FoldChange-Wert berechnet. Die Listen der
differentiell exprimierten Gene (DE-Gene) wurden anschließend gefiltert. Hierbei wurden
alle Vergleiche ausgeschlossen, deren p-Wert größer als 0.05 war. Als Konsequenz der
Ergebnisse der Hauptkomponentenanalyse (siehe Abb. 2.9) wurden nur Vergleiche zwischen
den beiden Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal-3 näher analysiert. Die Genlisten der drei
Hauptvergleiche jeweils von Patientenzellen gegen Zellen des gesunden Geschwisterkindes
44 Ergebnisse
als iPS, nach 50 und nach 90 Tagen kortikaler Differenzierung wurden genauer untersucht (1
ASC23 iPSC vs ΔSt3Gal-3 iPSC; 2 ASC23 d50 vs ΔSt3Gal-3 d50; 3 ASC23 d90 vs ΔSt3Gal-3 d90;
im Folgenden Vergleich 1,2 oder 3 genannt). Darüber hinaus wurden jeweils die Vergleiche
von kortikalen Zellen nach 50 Tagen Differenzierung gegen die jeweils korrespondierenden
iPS (jeweils von Patientin und gesundem Geschwisterkind) genauer ausgewertet(4 ASC23
iPSC vs ASC23 d50; 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50 im Folgenden Vergleich 4 und 5
genannt). Der Vergleich 1 der RNA-Sequenzierungsdaten der beiden iPS Zelllinien ergab 13
DE-Gene, beim Vergleich 2 der Patientenzellen und der Zellen des gesunden
Geschwisterkindes nach 50 Tagen kortikaler Differenzierung wurden 23 DE-Gene gefunden
und beim Vergleich 3 nach 90 Tagen Differenzierung 38 signifikante DE-Gene (Abb. 2.17).
Die Annotation der einzelnen Gene innerhalb der Listen sowie eine „Gen Ontologie
Enrichment Analyse“ (GO-Terme) der gesamten Liste wurde über die DAVID Software
erstellt [114]. Eine erweiterte Funktionsanalyse der einzelnen Gene wurde mittels manueller
Datenbankrecherche (Genecards, NCBI, Uniprot) durchgeführt.
Abbildung 2.17: Differentielle Genexpression zwischen Patientin und gesundem Geschwisterkind. (A) Anzahl der differentiell exprimierten (DE) Gene aus den Vergleichen zwischen Patienten und gesunden Geschwisterkind iPS, neuronal differenzierten Zellen nach 50 und 90 Tagen. (B) Mengendiagramm der DE-Genlisten der drei Zustandsvergleiche.
Innerhalb der Genlisten der drei Vergleiche (1-3) tauchten fünf Gene in allen Vergleichen
auf. Drei der Gene die in allen Vergleichen auftraten (PEG3, ZIM2 und MEG3) waren
paternal oder maternal geprägte Gene. CTFS codiert für die Thiol-Protease Cathepsin F, die
an der intrazellulären Degradation und dem Proteinumsatz beteiligt sein soll. TCERG1L
codiert für ein Transkriptionselongator-ähnliches Protein. Alle Gene bis auf MEG3 waren in
den Patientenzellen hochreguliert.
Unter den DE-Genen des iPS-Vergleichs 1 waren bis auf zwei Ausnahmen hauptsächlich
paternal oder maternal geprägte Gene. Darüber hinaus fiel nur das Gen G0S2 auf, es kodiert
Ergebnisse 45
ein Protein, das am G0-G1-Switch beteiligt ist. Die DAVID-Analyse dieser DE-Genliste ergab
keine interessanten angereicherten Gen-Onthologien.
Die DAVID-Analyse der Liste der DE-Gene des Vergleichs 2 (Zellen nach 50 Tagen
Differenzierung) zeigte, dass Gene mit dem GO-term „neural crest cell development“
(GO:0014032, Enrichment score 2.58, p-value 5.6 x 10-4; CYP26C1, GBX2, CYP26A1) vermehrt
vorkamen. Anhand der erweiterten Funktionsanalyse (siehe oben) der Gene konnten drei
weitere Gene einer Entwicklung in Richtung „hindbrain“ zugeordnet werden (POU4F1,
TFAP2B, IRX3). Darüber hinaus konnten damit 6 Gene den Auswirkungen und Vorgängen
einer erhöhten Zellzyklusrate zugeordnet werden (TCERG1L, RASAL1, CARTPT, CTSF,
HIST1H3C und VGLL3).
Die DAVID-Analyse der Liste der signifikanten DE-Gene des Vergleichs 3 (Zellen nach 90
Tagen Differenzierung) zeigte, dass Gene mit dem GO-term “regulation of transcription,
DNA-dependent“ (GO:0006355, Enrichment score 6.2, p-value 3.8 x 10-11; IRX3, IRX6, IRX5,
LMX1B, ZNF717, TFAP2B, ZNF667, POU4F2, SIX2, POU4F1, PAX3, FOXB1, TLX3, OTP), „eye
development“ (GO:0001654, Enrichment score 2.74, p-value 1.3 x 10-3; IRX5, LMX1B,
POU4F2, MAB21L2) sowie “cell motion“ (GO:0006928, Enrichment score 2.36, p-value 7.82 x
10-3; LMX1B, POU4F2, POU4F1, PAX3, TLX3) vermehrt vorkamen. Insgesamt konnten über
die erweiterte Funktionsanalyse 13 Gene einer Entwicklung in Richtung Auge via Zellen der
Neuralleiste zugeordnet werden (SPARCL1, MAB21L2, IRX5, TFAP2B, ESPN, IRX3, LMX1B,
C1QL4, PI15, SIX2, POU4F1, POU4F2, IRX6).
Unabhängig von der Enrichment Analyse fielen die drei Gene NTS, TAC1 und ADCYAP1 auf
bezüglich ihrer Funktion besonders auf. Das Gen NTS codiert für den Neurotransmitter
Neurotensin, TAC1 für Protachykinin-1 und ADCYAP1 (PACAP) für das Adenylatcylase
aktivierende Protein 1. Das NTS-Gen war in den Patientenzellen deutlich herunterreguliert
(fold change 0.00246), die Gene TAC1 und ADCYAP1 hingegen waren deutlich hochreguliert
(fold change 21.6, 24.6). Neurotensin ist ein 13 Aminosäuren langer Neurotransmitter, der
an der Modulation dopaminerger Neuronen beteiligt ist und eine Rolle bei vielen
neuropsychiatrischen Erkrankungen, wie z. B. Schizophrenie [115], beteiligt ist.
Protachykinin-1 ist die Vorstufe der beiden Neurotransmitter „Substanz P“ und „Neurokinin
A“ [116, 117]. Das Adenylatcyclase aktivierende Protein 1 erhöht die endogenen cAMP-Level
im zentralen Nervensystem [118].
46 Ergebnisse
Abbildung 2.18: Mengendiagramm der Vergleiche von neuronal differenzierten iPS nach 50 Tagen mit den korrespondierenden iPS jeweils von Patientin und Zellen des gesunden Geschwisterkindes (Darstellung nicht maßstabsgetreu)
Tabelle 2.2 DAVID-Gen-Onthologie-Anreicherungsanalyse P-Werte berechnen sich als modifizierter exakter Test nach Fisher und verdeutlichen die Signifikanz der Anreicherung dieser Gen-Onthologien.
Kategorie Name Anzahl p-Wert
ASC23 ΔSt3Gal-3 ASC23 ΔSt3Gal-3
SP_PIR_KEYWORDS glycoprotein 528 494 4.92E-19 4.43E-24
GOTERM_BP_FAT neuron differentiation
99 102 1.41E-17 9.97E-23
GOTERM_BP_FAT cell motion 97 98 4.25E-14 5.50E-18
GOTERM_BP_FAT forebrain development
42 45 1.32E-10 3.60E-14
Bei den Vergleichen 4 und 5 (4 ASC23 iPSC vs ASC23 d50; 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50)
konnten für die Patientin 1671 DE-Gene gefunden werden, für denselben Vergleich beim
gesunden Geschwisterkind wurden 1948 DE-Gene gefunden. 1237 dieser Gene tauchten in
beiden Vergleichen auf (Abb. 2.18). Die DAVID-Analysen der beiden Vergleiche zeigte eine
Anreicherung für etliche Gen-Onthologien. In beiden Vergleichen kamen unter anderem die
GO-Terme für „glycoprotein“, „neuron differentiation“, „cell motion“ und „forebrain
development“ vermehrt vor (Tabelle 2.2). Die Clustering-Analyse für die DE-Gene beider
Vergleiche ergaben ebenfalls insgesamt sehr ähnliche Gen-Onthologien. Die interessanten
Cluster hierbei sind das Annotations-Cluster 12 bzw. 8 der GO-Terme zur Entwicklung des
„forebrain“ , „telencephalon“, „pallium“, „hippocampus“, „limbic“ und „dentate gyrus“-
System, wobei der GO-Term zur „forebrain“ Entwicklung mit einem p-Wert von 5.36*10^-8
und 1.35*10^-11 und 42 beziehungsweise 45 Genen eindeutig der dominierende Term ist
(Anhang Tabelle 1-13).
Ergebnisse 47
In beiden Vergleichen taucht ein Cluster auf, das die GO-Terme der organspezifischen
Entwicklung umfasst. Für den Vergleich 4 (4 ASC23 iPSC vs ASC23) enthält dies die GO-
Terme „sensory organ development“, „embryonic organ morphogenesis“, „embryonic organ
morphogenesis“, „embryonic organ development“, „ear morphogenesis“, „inner ear
morphogenesis“, „ear development“ und „inner ear development“. Dieses Cluster enthält für
den Vergleich der Patientenzellen ( 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50)nur GO-Terme zur
Entwicklung des Auges. Dies sind die Terme „sensory organ development“, „eye
development“, „camera-type eye development”, “eye morphogenesis” und “camera-type
eye morphogenesis”. Dieses Annotations-Cluster ist beim gesunden Geschwisterkind das
Cluster 21 und erhielt die interne Anreicherungsbewertung von 3.26. Dahingegen rangierte
das gleiche Cluster bei der Patientin an Stufe 12 mit einer deutlich höheren
Anreicherungsbewertung von 5.99 (Anhang Tabelle 11-13).
2.4.3 Adhäsionsassay
Glycosylierungen von Oberflächenproteinen, Lipiden und Proteoglykanen können unter
anderem die richtige Faltung dieser Strukturen und die Interaktion mit anderen
Zielmolekülen beeinflussen. Unter anderem werden Signalmoleküle, wie Rezeptoren (Notch,
Insulin), oder Adhäsionsmoleküle, wie NCAM, glycosyliert. Um die Auswirkungen der
ST3GAL3-Mutation auf die adhäsiven Eigenschaften der Zellen zu untersuchen wurde ein
Adhäsionsassay entwickelt, der die Adhäsionsgeschwindigkeit auf einem definierten
Untergrund misst. Für diese Untersuchungen wurden die Zellen geerntet, gezählt und in
einer definierten Zellmenge wieder ausgesät. Da die Zellen für die Zellzahlbestimmung
vereinzelt werden mussten, wurden die Experimente nur mit neuronal differenzierten Zellen
nach 30 Tagen und Fibroblasten der beiden Zelllinien ΔSt3Gal-3 und ASC23, nicht aber mit
iPS, durchgeführt. Es wurde kein späterer Zeitpunkt der Differenzierung gewählt, da nach
diesem Zeitpunkt zu viele Neuronen gebildet worden waren, die für dieses Experiment zu
sensitiv sind. Die Fibroblasten wurden in einer Mikrotiterplatte mit 12 Kavitäten ohne
Beschichtung und die neuronal differenzierten Zellen nach 30 Tagen auf poly-L-
Ornithin/Laminin-beschichtete Mikrotiterplatten ausgesät. Nach definierten Zeitintervallen
wurde der Überstand abgenommen und die darin verbliebenen Zellen gezählt (4.7.9).
Diese Daten konnten als relative Mengen anhaftender Zellen über die Zeit aufgetragen
werden. Es wurden jeweils zwei technische Replikate und mindestens drei biologische
48 Ergebnisse
Replikate gemessen. Während für die Fibroblasten kein Unterschied im Adhärenzverhalten
nachgewiesen werden konnte, zeigten die neuronal differenzierten Zellen nach 30 Tagen
einen deutlichen Unterschied. Bereits nach 2 Minuten waren knapp 40 % aller
Patientenzellen angesiedelt, wohingegen erst 16 % aller Zellen des gesunden
Geschwisterkindes adhäriert waren. Von den Patientenzellen waren 85 % aller Zellen zum
letzten Zeitpunkt der Messung angesiedelt, bei den Zellen des gesunden Geschwisterkindes
nur 77.5 % (Abb. 2.19).
Abbildung 2.19: Zelladhärenz. Dargestellt sind die relativen Mengen adhärierter Zellen über die Zeit. Analysiert wurden jeweils die Patientenzellen (ΔSt3Gal3, rot) und die Zellen des gesunden Geschwisterkindes (ASC23, grün) als Fibroblasten und nach 30 Tagen kortikaler Differenzierung (NI d30). Die Fehlerbalken stellen die Stichprobenvarianz dar.
2.4.4 NCAM und PSA Nachweis in kortikalen Neuronen
Das neuronale Zelladhäsionmolekül, kurz NCAM, ist ein in der neurobiologischen
Entwicklung wichtiges Transmembranprotein Es soll unter anderem an der Zell-Zell-
Adhäsion, den Neurit-Auswüchsen und der neuronalen Plastizität beteiligt sein [119]. In
seiner nativen Form liegt es poly-sialyliert (PSA) vor. In seiner un-sialylierten Form ist es
homophil und kann an andere NCAMs auf der Oberfläche anderer Zellen binden. Die
Polysialylierung erfolgt α-2,8 an einem α-2,3-gebundenen Sialinsäurerest durch eine
Polysialyltransferase. Inwiefern die fehlende enzymatische Aktivität der ST3GAL3 die
Polysialylierung von NCAM, und somit seine Adhärenzeigenschaften, beeinflusst, sollte
mittels einer Immunfluoreszenzfärbung von NCAM und polysialyliertem NCAM (PSA)
überprüft werden. Die Antikörper 123C3 gegen NCAM und 735 gegen PSA wurden
freundlicherweise von Prof. Büttner, Zelluläre Chemie, Medizinische Hochschule Hannover,
zur Verfügung gestellt. Die Färbung wurde nach einer 4 % Paraformaldehyd-Fixierung, wie
unter 4.7.7 beschrieben, durchgeführt. Da beide Epitope Oberflächenstrukturen sind,
Ergebnisse 49
erfolgte keine Permeabilisierung Da beide Antikörper den Isotyp IgG1 hatten und aus der
Maus stammen, konnte keine Ko-Färbung erstellt werden. Von den drei Zelllinien HD2,
ASC23 und ΔSt3Gal-3 wurden kortikale Zellen nach 70 Tagen der Differenzierung markiert.
Bei allen drei Zelllinien und bei beiden Färbungen konnten NCAM und PSA-NCAM
nachgewiesen werden. Die Belichtungszeit und die Verstärkung waren in allen Aufnahmen
gleich, trotzdem können anhand dieser Färbungen keine definitiven quantitativen Aussagen
getroffen werden. (Abb. 2.20 und 2.21).
Abbildung 2.20: Neuronales Zell-Adhäsions-Molekül auf kortikalen Zellen. Anti-NCAM-immunfluoreszenzmarkierte kortikale Zellen nach 70 Tagen der Differenzierung jeweils von den Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3 (aNCAM, 123C3, 1:642, Prof. Büttner; aMaus IgG Alexa 488, life Technologies, A-11029, 1:200) Maßstab = 50 µm.
50 Ergebnisse
Abbildung 2.21: Polysialylierung von kortikalen Neuronen. Anti-PSA-immunfluoreszenzmarkierte kortikale Zellen nach 70 Tagen der Differenzierung jeweils von den Zelllinien HD2, ASC23 und ΔSt3Gal-3. (aPSA, 735, 1:800, Prof. Büttner, aMaus IgG Alexa 488, life Technologies, A-11029, 1:200) Maßstab = 50 µm.
2.4.5 Glycosylierungsmuster
Für die Analyse der direkten Auswirkungen der ST3GAL3-Mutation auf die
Glycosylierungsmuster der Zellen wurden Proteinlysate von den Zelllinien ΔSt3Gal-3 und
ASC23 jeweils als iPS nach 50 und nach 90 Tagen kortikalen Differenzierung von unserem
Kooperationspartner Prof. Dr. Büttner untersucht. Die Proben wurden zunächst durch
Ultraschallbehandlung in Lysepuffer aufgeschlossen und anschließend mittels einer SDS-
Gelelectrophorese getrennt und auf Nitrocellulose übertragen. Diese wurden mit
verschiedenen Lektinen gefärbt. Es wurden hierfür drei Lektine aus Maackia amurensis
(MAA), Sambucus Nigra (SNA) und Datura stramonium (DSA) verwendet. Das MAA-Lektin
bindet bevorzugt an α-2,3-gebundenen Sialinsäureresten, SNA an α-2,6-gebundenen
Sialinsäureresten und DSA an β-1,4-gebundener Galaktose. In allen Blots wurden 5 oder 10
µg Proteinlysat eingesetzt und mit einer Ko-Färbung auf die Ladungskontrolle GAPDH
überprüft.
Ergebnisse 51
Abbildung 2.22: Lektinblots der Zelllinien ASC23 und ΔSt3Gal3. Lektinblots der Proteinlysate der beiden Zelllinien als iPS und nach 50 (d 50) und 90 (d 90) Tagen Differenzierung. Jeweils 5 bzw. 10 µg Probe wurden aufgetragen. Färbung mit MAA-, SNA- oder DAS-Lektinen, Ladungskontrolle GAPDH. PR: Page Ruler (Marker), pos.: positiv Kontrolle Fetuin 1 µg, neg.: negativ Kontrolle BSA/Asialofetuin 1 µg.
Die Markierung der α-2,3-gebundenen Sialinsäurereste zeigte weder bei den iPS noch bei
den differenzierten Zellen ein verändertes Bandenmuster, lediglich die Bandenintensität
schien bei den Patientenzellen in jedem Zustand etwas stärker zu sein. Die Signale der α-2,6-
Sialinsäure-Färbung zeigten weder im Bandenmuster noch in der Bandenintensität einen
Unterschied. Die Markierung der β-1,4-gebundener Galaktose durch das Lektin DSA zeigte
ebenfalls eine leicht erhöhte Bandenintensität bei den Patientenzellen. Knapp oberhalb der
70-kDa-Bande des Markers war bei dieser Färbung der Patientenzellen eine zusätzliche
Bande erkennbar (Abb. 2.22 weißer Pfeil).
2.4.6 Projektionsneuronen im sich entwickelnden Kortex
Während der neuronalen Differenzierung zu kortikalen Zellen bilden sich aus dem
Neuroectoderm die ersten neuronalen Stammzellen. Diese bestehen zunächst aus apikalen
radialen Gliazellen (RG, PAX6+) und äußeren radialen Gliazellen (oRG, PAX6+), aus denen
später, wie auch in vivo, basale intermediäre Progenitorzellen (ISC, TBR2+) hervorgehen. Alle
drei Arten von neuronalen Stammzellen bilden über asymmetrische Zellteilung den
Ausgangspool für die Neurogenese der kortikalen Neuronen. Die nachfolgende
Neurogenese läuft nach einem stereotypen zeitlichen Muster ab. Hierbei werden die
Projektionsneuronen der verschiedenen Schichten des Kortexes innerhalb von 70 Tagen
nach FGF-Entzug von innen nach außen gebildet. Zunächst werden Neuronen der Lamina VI,
(TBR1+), gefolgt von Lamina V/VI (CTIP2+) und Lamina II-IV (SATB2+), gebildet [88]. Um die
gebildeten Projektionsneuronen und deren relativen Anteil an allen Zellen zu untersuchen,
52 Ergebnisse
wurden neuronal differenzierte Zellen nach 50 Tagen der Patientenzelllinie (ΔSt3Gal-3) und
der Zelllinie des gesunden Geschwisterkindes (ASC23) auf die Marker TBR1 (Kaninchen IgG,
Abcam, ab 31940) und SATB2 (Maus IgG, Abcam, ab51502) gefärbt und anschließend über
eine Messung mit einem BioAnalyzer (Agilent Technologies Inc. Santa Clara, USA)
quantifiziert. Zunächst wurde eine qualitative Immunfluoreszenzfärbung der Zellen mit dem
TBR1-Antikörper (1:200) nach den beschriebenen Protokollen (4.7.6 und 4.7.7)
durchgeführt. Als Sekundärantikörper wurde ein Alexa-Fluor-555-markierter Antikörper
gegen Kaninchen-IgG (1:600) verwendet. Für die Fluoreszenzaufnahmen wurde das Nikon
Eclipse T2000-U und die „Spot advanced“ Software (Spot Imaging Solutions, Sterling
Heights, USA) genutzt. Es wurden von beiden Zelllinien Fluoreszenzaufnahmen des roten
Kanals (TBR1 Signal) und des blauen Kanals (Dapi Signal) erstellt. Bei beiden Zelllinien waren
TBR1-positive Neuronen detektierbar (Abb. 2.23). Da das augenscheinliche Verhältnis von
allen Zellkernen (Dapi, blau) zu den TBR1-positiven Zellen (rot) im Vergleich zwischen
Patientenzellen und gesundem Geschwisterkind unterschiedlich zu sein schien, wurde eine
Quantifizierung der TBR1- und SATB2-Subpopulationen durchgeführt.
Abbildung 2.23: Projektionsneuronen im sich entwickelnden Kortex. Immunfluoreszenzfärbung gegen einen Marker der Kortexschicht VI (Tbr1, Abcam, ab31940, 1:300; aKaninchen IgG-Alexa Fluor 555, Life Technologies, 1:500) jeweils von Kortexneuronen an Tag 50 von gesundem Geschwisterkind (ASC23) und Patientin (ΔSt3Gal3). Maßstabsbalken 50 µm.
Für die Quantifizierung der TBR1- uns SATB2-positiven kortikalen Neuronen wurden die
„Agilent BioAnalyzer Plattform“ und das „Agilent Cell Kit“ sowie die dazugehörigen Chips
verwendet (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, USA). Die Färbung und Messung der
Zellen erfolgte an das vom Hersteller angelehnte, unter 4.7.10 beschriebene Protokoll. Von
jeder Zelllinie wurden mindestens drei biologische Replikate in jeweils drei technischen
Replikaten gemessen. Bei jeder Messung wurden ungefärbte Zellen als Negativkontrolle und
Ergebnisse 53
Zellen, die nur mit SYTO-16- oder APC-markierten Sekundärantikörpern gefärbt waren,
mitgemessen. Die Auswertung der Messungen erfolgte mittels der „Agilent 2100 Expert
Software“. Die Schwellenwerte für die Farbstoffe wurden anhand der mitgemessenen
Negativkontrolle und Sekundärantikörperkontrolle für jeden Chip individuell ermittelt und
auf die gemessenen Proben angewendet. Zunächst wurde die Population aller Zellen
anhand der SYTO-16-Kontrolle definiert. Hierfür wurde der Schwellenwert für den blauen
Kanal so definiert, dass der Hauptteil der SYTO-16-positiven Population eingeschlossen
wurde. Danach wurden von diesen Zellen die falsch-positiven Signale anhand der
Sekundärantikörperkontrolle ausgeschlossen, indem der Schwellenwert für den roten Kanal
so gelegt wurde, dass der Hauptteil der APC-positiven Population ausgeschlossen wurde.
Blieben trotzdem einzelne positive Ausreißersignale innerhalb der Auswahl der
Sekundärantikörperkontrolle, wurden diese von den Ergebnissen subtrahiert.
Abbildung 2.24: Quantifizierung der Projektionsneuronen. Geschwisterkind- (ASC23) und Patientenzellen (ΔSt3Gal-3) nach 50 Tagen kortikaler Differenzierung mit Tbr1- (Abcam, ab31940, 1:100) oder SATB2- (Abcam, ab51502, 1:50) Antikörpern markiert und mit APC-markierten Sekundärantikörpern (Life Technologies, A-10931, 1:350, A-865, 1:100, Ex/Em 650/660) im roten Kanal (Ex/Em 630/680) sichtbar gemacht. Die Gesamtmenge der Zellen wurde über eine Anfärbung aller Zellkerne mit SYTO 16 (Life Technologies, S7578, 1nM, Ex/Em 488⁄518) im blauen Kanal (Ex/Em 470/525) bestimmt. (A) Exemplarische Punktdiagramme der Tbr1- und SATB2-Färbung jeweils von gesundem Geschwisterkind (ASC23) und Patientin (ΔSt3Gal3). (B) Relative Mengen aller Tbr1- bzw. SATB2-positiven Zellen jeweils von gesundem Geschwisterkind (ASC23, grün, 54.51 % (Tbr1) , 5.65 % (SATB2)) und Patientin (ΔSt3Gal3, rot, 23.88 % (Tbr1), 4.54 %(SATB2)). Grafik und Statistik erstellt mit Graphpad Prism 6. Die Fehlerbalken zeigen den Standardfehler zum arithmetischen Mittel, wobei n = 9.
Im Mittel ergaben sich aus den Punktdiagrammen für die Zellen des gesunden
Geschwisterkindes 54.51 % TBR1-positive Zellen und 5.65 % SATB2-positive Zellen. Für die
Zellen der Patientin ergaben sich 23.88 % TBR1-positive Zellen und 4.54 % SATB2-positive
Zellen (Abb. 2.24). Die Student‘s t-Tests zeigten für alle Ergebnisse eine deutliche Signifikanz
(ASC23: <0.0001 (TBR1), 0.0029 (SATB2); ΔSt3Gal3: <0.0001 (TBR1), <0.0001 (SATB2)). Die
Subpopulation an kortikalen TBR1-positiven Projektionsneuronen ist beim gesunden
54 Ergebnisse
Geschwisterkind mehr als doppelt so hoch (2.28) wie bei der Patientin, wohingegen der
Unterschied in der Population der SATB2-positiven Neuronen nicht signifikant ist. Die
Rohdaten der einzelnen Replikate können in Tabelle 14 im Anhang eingesehen werden.
Ergebnisse 55
2.4.7 Neuronale Stammzellen
Projektionsneuronen entstehen durch asymmetrische Zellteilung aus neuronalen
Stammzellen, wie z.B. radialen Gliazellen (RG) und intermediären neuronalen Stammzellen
(ISC) (siehe auch 2.4.6). Um diese beiden Ursprungspopulationen der Neuronen näher zu
charakterisieren, wurden Immunfluoreszenzfärbungen gegen zwei Marker für diese
Zelltypen durchgeführt. Radiale Gliazellen exprimieren den Transkriptionsfaktor PAX6, sie
bilden den Hauptteil der Zellen innerhalb der Rosettenstrukturen. Durch asymmetrische
Zellteilung können aus den radialen Gliazellen intermediäre neuronale Stammzellen
entstehen. Die ISC haben einen größeren Zellkörper und im Gegensatz zur bipolaren
Morphologie der radialen Gliazellen keine Fortsätze, sie befinden sich gehäuft in
Randgebieten der Rosetten. Die Expression des ISC-spezifischen Transkriptionsfaktors TBR2
verdrängt dabei vollständig die Expression von PAX6 [108]. Untersucht wurden Zellen nach
35 Tagen kortikaler Differenzierung jeweils von der Patientin (ΔSt3Gal-3) und vom gesunden
Geschwisterkind. Fixierungen und Ko-Färbungen wurden wie unter 4.7.6 und 4.7.7
beschrieben durchgeführt. Für beide Zelllinien konnten sowohl Signale für die radialen
Gliazellen (grün) als auch für die intermediären neuronalen Stammzellen (rot) nachgewiesen
werden. In beiden Proben bildeten die RGs den Hauptteil der Rosettenstrukturen. Die ISCs
waren hauptsächlich in den Randgebieten der Rosetten zu finden. In keiner Probe wurden
Zellen detektiert, in denen beide Transkriptionsfaktoren gleichzeitig exprimiert wurden
(Abb. 2.25).
Abbildung 2.25: Neuronale Stammzellen. Immunfluoreszenzbilder von gefärbten kortikalen Zellen nach 35 Tagen Differenzierung jeweils von Patient (ΔSt3Gal-3) und gesundem Geschwisterkind (ASC23). Radiale Gliazellen PAX6
+ (aPax6,
SCB, SC-81649, 1:300, grün) und intermediäre Stammzellen TBR2+ (aTbr2, Abcam, ab23345, 1:100, rot) Maßstabsbalken 50
µm. Die Aufnahmen der verschiedenen Zelllinien wurden im selben Fluoreszenzkanal mit denselben Belichtungszeiten und Verstärkungen aufgenommen.
56 Diskussion
3. Diskussion
3.1 Etablierung und Validierung eines patientenspezifischen iPS-Modells
Bisher verwendete artifizielle in-vitro-Modelle für komplexe kognitive Erkrankungen
konnten zwar gegebenenfalls den Zelltyp von Interesse abbilden, Untersuchungen an
komplexen dreidimensionalen Zusammenhängen aber nicht darstellen. In-vivo-Modelle, wie
die Maus, können diese Zusammenhänge hingegen abbilden, zeigen jedoch eine deutlich
niedrigere zerebrale Komplexität im Vergleich zum humanen Gewebe [54]. Da es
normalerweise nicht möglich ist, Gewebematerial vom betroffenen lebenden Patienten zu
erhalten, bieten patientenspezifische iPS die momentan beste Möglichkeit, dieses Gewebe
in vitro abzubilden. Für die vorliegende Arbeit konnte ein patientenspezifisches iPS-Modell
genutzt werden. Hierfür wurden Fibroblasten einer Patientin mit der homozygoten
Punktmutation c.958G>C im ST3GAL3-Gen, ursächlich für eine schwere Form des West-
Syndroms, und einem weiblichen gesunden Geschwisterkind homozygot für das Wildtypallel
reprogrammiert [3]. Für die Reprogrammierung wurde ein lentivirales Vektorsystem
genutzt. Die morphologischen und epigenetischen Veränderungen wurden durch die
persistente Integration der vier Yamanaka-Faktoren [63, 71] in das Genom und deren
exogene Expression angestoßen.
Um die Vergleichbarkeit der beiden erhaltenen Linien zu gewährleisten, wurden die
Auswirkungen der Reprogrammierung genau untersucht. Von jeweils einem iPS-Klon der
Patientin und des gesunden Geschwisterkindes, die die morphologischen Kriterien für
Stammzellen erfüllten, wurden sowohl die genetischen und epigenetischen Veränderungen
als auch ihre Pluripotenz genauer untersucht. Die Pluripotenz der Linien konnte mittels
Immunfluoreszenzfärbungen und quantitativer PCR ausgewählter pluripotenzassoziierter
Faktoren bestätigt werden [62]. Darüber hinaus belegte die erfolgreiche Differenzierung zu
kortikalen Neuronen die Fähigkeit zur Pluripotenz für mindestens eine der drei
Keimblattrichtungen.
Auf den Einsatz von Teratoma zum Nachweis der Pluripotenz beider Linien wurde innerhalb
dieser Arbeit aus ethischen und zeitlichen Gründen komplett verzichtet. Für einen Teratom-
Assay werden immundefizienten Mäusen iPS injiziert und beobachtet, ob diese einen nicht-
malignen Tumor entwickeln, der eine Mixtur aus Zellen aller drei Keimblätter enthält [68]. Er
Diskussion 57
galt lange Zeit als Standardmethode, um Pluripotenz der iPS zu validieren. Problematisch
hierbei ist allerdings, dass dieser die tatsächliche Bildung aller humanen Zelltypen, ebenso
wie die Beteiligung an allen Keimblättern, nicht eindeutig nachweisen kann [120]. Darüber
hinaus ist der Erfolg eines Teratom-Assays von der Injektionsstelle abhängig und weder
diese noch das Alter der Mäuse oder die Zahl der Zellen, die injiziert werden, sind bei diesen
Assays standardisiert [121]. Wir hoffen, dass die erfolgreiche Differenzierung zu kortikalen
Neuronen, neben der Expression der ausgewählten pluripotenzassoziierten Faktoren,
ausreichend belegt, dass die Zellen pluripotent sind. Für zukünftige Arbeiten wäre es
angebracht, auch das Potenzial für Differenzierungen in die beiden anderen Keimblätter,
Endoderm und Mesoderm, beispielsweise über die Differenzierung zu Cardiomyocyten und
hepatische Zellen nachzuweisen.
Allgemein unterliegen iPS-Linien eines gemeinsamen Donors einer hohen genetischen und
epigenetischen Varianz, die ihren Einsatz als Modell für genetisch bedingte Erkrankungen,
aber auch regenerative Methoden in Frage stellen. Die Varianz der Linien kann neben den
Auswirkungen auf die Pluripotenz auch das Differenzierungspotential der Linien
beeinflussen [122] und wird deshalb im Vorfeld funktionaler Untersuchungen stringent
untersucht. All diese Unterschiede können dazu führen, dass die Vergleichbarkeit der Linien
für komparative Studien wie unsere nicht mehr gewährleistet ist. Die Ursachen dieser
Varianz können einerseits im gewählten somatischen Ausgangsmaterial, im
Reprogrammierungsprozess oder auch am Selektionsdruck während der Langzeitkultur
liegen [123].
Im Folgenden soll untersucht werden, welche verschiedenen Faktoren zu einer erhöhten iPS
Varianz führen können und wie wir versucht haben, diese Fehlerquellen zu überprüfen.
– Genetische Ursachen – Die genetischen Variationen in iPS können von Aneuploidien, über
subchromosomale „copy number variations“ (CNV) bis hin zu „single nucleotide variations“
(SNVs) reichen. Aneuploidien treten in ca. 13 % aller iPS- und hES-Linien auf [124], wobei
Trisomie 12 am häufigsten vorliegen. Sie korrelieren meist mit einer höheren Passagenzahl
und beruhen auf einer positiven Selektion während der Kultur. Das Chromosom 12 enthält
unter anderem die Pluripotenzgene NANOG und GDF3, wodurch sich ein Selektionsvorteil
bei einer Trisomie 12 erklären lässt [125]. CNVs treten ebenfalls vermehrt vor
Pluripotenzgenen wie DNMT3B auf und deuten auf eine Selektion während der
58 Diskussion
Langzeitkultur hin [126]. Einen zusätzlichen Ursprung soll der Prozess der
Reprogrammierung darstellen, wobei aber viele der Deletionen wahrscheinlich durch den
Selektionsdruck während der Langzeitkultur wieder verloren gehen [127]. In einer Deep-
Sequencing-Studie zu CNVs in iPS konnten die Ergebnisse der bisherigen arraybasierten
Studien (Laurent, Hussein) hingegen nicht bestätigt werden. Im Durchschnitt konnten nur
zwei CNVs pro Linie gefunden werden, die nicht schon im somatischen Ausgangsmaterial zu
finden waren [128]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die meisten CNVs ihren
Ursprung nicht im Reprogrammierungsprozess haben, sondern im geringgradigen CNV-
Mosaizismus des somatischen Ausgangsgsmaterials. In iPS-Linien konnten durchschnittlich
zwölf SNVs gefunden werden, wobei mehr als die Hälfte schon im Ausgangsmaterial
vorhanden war und keine Zusammenhänge zwischen der Art des Ausgangsmaterials oder
des Reprogrammierungsprozesses gefunden werden konnten [129-131].
Als Methode für die Reprogrammierung unserer Fibroblasten wurde ein integrierendes
lentivirales Vektorsystem genutzt. Die persistente Integration der Viruskassette in das
Wirtsgenom kann je nach Integrationsort unvorhergesehene Auswirkungen für die isolierte
Linie haben. Neben den integrierenden Methoden gibt es mittlerweile etliche nicht-
integrierende Systeme, die mRNA, Sendai-Viren [67] oder episomale mRNA [132] nutzen.
Der Hauptvorteil dieser Methoden besteht darin, dass das Genom nicht durch die
Integration verändert wird. Da unsere Zellen nicht für den Einsatz in regenerativen
Methoden vorgesehen waren, spielte für die Auswahl hauptsächlich die Anwendbarkeit der
Methoden eine Rolle. Mit einer Effizienz von 0,27 %, einem Erfolg von 95 - 100 %, und einer
Aneuploidierate von 4.5 % ist die lentivirale Methode immer eine der besten im Vergleich zu
den nicht-integrierenden Methoden [133]. Da alle anderen Methoden einen
kostenintensiven, kommerziellen Erwerb der Reagenzien voraussetzen, ist die lentivirale
Methode die günstigste Alternative.
In den meisten bisherigen Arbeiten wurde die genetische Integrität nur mittels
Karyotypisierungen, oder „Fluorescence in situ hybridization“ (FISH)-Analysen überprüft.
Wir konnten die genetische Integrität beider Linien anhand der unauffälligen Ergebnisse der
Array-CGH wie der FPNI-PCR validieren. Mittels der Array-CGH-Ergebnisse konnten wir
zeigen, dass keine chromosomalen Aneuploidien und darüber hinaus, im Gegensatz zur
FISH-Analyse, das keine CNVs in den Linien vorliegen. Das Auftreten von SNVs kann diese
Methode ebenfalls nicht untersuchen. Mittels der FPNI-PCR konnten wir erstmals den
Diskussion 59
genauen Integrationsort der Viruskassetten zeigen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen
zeigen, dass durch die Verwendung eines integrierenden Reprogrammierungssystems keine
offenen Leserahmen gestört wurden und somit die genetische Integrität erhalten blieb.
– Epigenetische Ursachen – Epigenetische Veränderungen reichen von variabler X-
Chromosom-Aktivierung über veränderte Histon-Acetylierungs bis hin zu DNA-
Methylierungsmustern, die in einer differentiellen Expression resultieren können.
Während der Reprogrammierung kann es zu einer Veränderung der X-Chromosom-
Inaktivierung kommen. In seltenen Fällen kann nach der Reprogrammierung eine
Aktivierung beider Chromosomen auftreten, häufiger aber kommt es zu einem Wechsel
zwischen aktivem und inaktivem Chromosom [134]. Der Wechsel zwischen den
Chromosomen stellt hauptsächlich ein Problem für Untersuchungen von X-chromosomal
rezessiven Erkrankungen dar. Im Fall einer Studie zum Rett-Syndrom konnte dieser Umstand
sogar zum Vorteil genutzt werden, um zwei isogene iPS-Linien zu isolieren [58].
Die Ursachen für Variationen im DNA-Methylierungs- und Histon-Deacethylierungsmuster
und damit einhergehender Veränderungen des Expressionsprofils von iPS können sowohl
das variierende Ausgangsmaterial aus verschiedenen somatischen Quellen als auch der
Reprogrammierungsprozess an sich sein [131]. Je länger diese Zellen kultiviert werden,
desto geringer wurden die Unterschiede [135]. In den meisten Fällen wurden die DNA-Hypo-
und
-Hypermethylierungsmuster des Ausgangsmaterials in den iPS-Linien beibehalten. Dies
spricht für eine nicht vollständige Reprogrammierung [136, 137].
Epigenetische Veränderungen drücken sich häufig in einem differentiellen Expressionsprofil
aus. Die beiden von uns validierten Klone ΔSt3Gal-3 und ASC23 zeigten in der
vergleichenden RNA-Sequenzierung kaum Unterschiede im Expressionsprofil, was auch
durch die Hauptkomponentenanalyse der iPS, hES und gingivalen Fibroblasten bestätigt
werden konnte. Diese Ergebnisse geben uns einen Hinweis darauf, dass sich auch die DNA-
Methylierungsmuster beider Linien nicht bedeutend voneinander unterscheiden. Die
auffälligsten signifikant differentiell exprimierten Gene der Vergleiche zwischen iPS von der
Patientin und gesundem Geschwisterkind waren maternal oder paternal geprägte Gene. Ob
die Expression der verschiedenen Allele durch den Reprogrammierungsprozess eingeführt
wurde [135], oder ob diese Allele schon im Ausgansmaterial exprimiert wurden, können wir
60 Diskussion
anhand unserer Ergebnisse leider nicht beantworten. Es ist möglich, dass sich das
Expressionsprofil der Patientenzellen in vivo, also während der Entwicklung der Patientin
deutlicher von dem des gesunden Geschwisterkindes unterscheiden würde und hier nur
eine artifizielle Ähnlichkeit vorliegt. Da unsere Patientin neben den kognitiven
Einschränkungen und der schweren Epilepsie aber keine Beteiligung anderer Gewebe zeigt,
scheint ein großer Unterschied im Genexpressionsprofil auf Stammzellebene
unwahrscheinlich. Um diese Bedenken gänzlich ausräumen zu können, wäre es notwendig,
weitere Klone der Patientin und des gesunden Geschwisterkindes für die funktionalen
Analysen einzusetzen.
– Klonale Varianz – Für die Untersuchungen von monogenen, erblich bedingten
Erkrankungen streben viele Gruppen einerseits die Verwendung von isogenen Kontrollen,
andererseits die Analyse von mehreren Klonen dieser Linien an [57, 94]. Als Vorteil erhofft
man sich einerseits einen identischen genetischen Hintergrund und andererseits eine
Streuung der Varianz in CNVs, SNVs und epigenetischen Mustern. Nach der
Reprogrammierung können die schon genannten epigenetischen Veränderungen dazu
führen, dass es zu einer hohen Varianz zwischen den einzelnen isolierten und expandierten
Klonen kommen kann [135, 138]. Besonderen Einfluss hat hierbei das sich ändernde DNA-
Methylierungs- und Histon-Acetylierungsmuster. Dieses kann zur Folge haben, dass sich
auch das Genexpressionsprofil umformt. Solche Änderungen können einerseits die
Vergleichbarkeit der Patientenzellen mit denen der Kontrolle beeinträchtigen, darüber
hinaus kann sich aber auch die Tendenz, in welche Richtung des Keimblattes diese Zelllinien
besser differenzierbar sind, ändern.
Um isogene Kontrollen zu erhalten, werden mittlerweile häufig Zinkfingernukleasen oder
das antivirale Abwehrsystem CRISPR aus Bakterien [139] verwendet. Hierbei wird gezielt das
Genom an einer bestimmten Stelle verändert, so dass ein Gendefekt eingeführt oder
korrigiert werden kann. Dies konnte bisher auf Pflanzen, Mäuse und humane permanente
und Primärzellen angewendet werden [140-142]. Die Einführung dieser genetischen
Veränderung ist sehr effizient und einfach in der Handhabung. Da die Selektion und
Expansion der erfolgreich editierten Zellen aber vor allem bei humanen Stammzellen sehr
aufwendig sein kann und zum Startzeitpunkt meiner Arbeiten (2012) noch nicht vollständig
erforscht war, wurde auf die Verwendung isogener Kontrollen innerhalb dieser Arbeit
verzichtet. Auch trotz der Nutzung von isogenen Kontrollen, können nicht alle
Diskussion 61
Veränderungen verhindert werden. Dies sind vor allem die Einflüsse einer extensiven
Langzeitkultur sowie der geringfügige Mosaizismus im Ausgangsmaterial.
Für die Erstellung unseres iPS-Modells wurde darauf geachtet, möglichst viele Fehlerquellen
von Anfang an zu umgehen. Veränderungen, die auf das somatische Ausgangsmaterial
zurückzuführen sind, wurden durch die Auswahl an gleichem Ausgangsmaterial
(Fibroblasten) vermieden. Um Veränderungen, die durch den Reprogrammierungsprozess
auftreten können, zu minimieren, wurde einerseits ein multicistronisches, lentivirales
Vektorsystem genutzt, welches nur eine Integrationsstelle pro Transkriptionskassette
erfordert [143] und so die Stöchiometrie verbessert, Zum anderen wurden der Histon-
Deacetylase-Inhibitor Valproinsäure [72] und Ascorbinsäure [73] direkt nach der
Transduktion eingesetzt, um Veränderungen der Genprägung, wie zum Beispiel beim Dlk-
Dio3-Lokus, zu verhindern. Darüber hinaus haben wir Fibroblasten einer direkten
Verwandten mit gleichem Geschlecht für die Reprogrammierung der Referenzlinie
ausgewählt. Wir erhofften uns, dass der genetische Hintergrund beider Geschwister einer
isogenen Kontrolle möglichst nah kommt. Nicht zuletzt zeigt uns die vergleichende RNA-
Sequenzierung, dass unser Modell die gleichen Anforderungen erfüllt, die auch an ein
isogenes Modell gestellt werden
Die Erfüllung aller von uns überprüften Qualitätskriterien an eine iPS Linie durch das
vorliegende patientenspezifische iPS-Modell schafft die Voraussetzung für die folgenden
komparativen Studien zur Charakterisierung des monogen erblich bedingten West-
Syndroms. Die unauffälligen Array-CGH- sowie RNASeq-Ergebnisse zeigen uns, dass das von
uns etablierte Modell nicht nur die Qualitätskriterien einer iPS-Linie erfüllt, sondern sich
darüber hinaus gut als Alternative zu einem isogenen Modell eignet.
3.2 Kortikale Differenzierung nach Yichen Shi et al.
Die komparativen Untersuchungen der Linien der Patientin und des gesunden
Geschwisterkindes zeigten keine signifikanten Unterschiede auf iPS-Ebene. Diese Ergebnisse
überraschten nicht, da die Patientin einen ausschließlich kognitiv beeinträchtigten Phänotyp
zeigt, ohne Beteiligung anderer körperlicher Systeme. Neben der starken geistigen
Behinderung zeigt unsere Patientin auch epileptische Anfälle. Da der Anfang solcher Anfälle
vorrangig im kortikalen Gewebe des Gehirns zu finden sein soll [111] und die ST3GAL3-
Expression hier auch im adulten Gewebe mit die höchsten Level zeigte, wurde eine
62 Diskussion
Differenzierung zu kortikalen Neuronen und neuronalen Netzwerken etabliert. Jeweils
Patienten-iPS und iPS des gesunden Geschwisterkindes konnten in mehreren Ansätzen zu
kortikalen Neuronen differenziert werden. Ihre kortikale Identität wurde mittels qPCR und
Immunfluoreszenzfärbungen kortexassoziierter Marker bestätigt [112].
Für die Auswahl des passenden Differenzierungsprotokolls von iPS zu neuronalen Zellen gibt
es bisher etliche gut etablierte Protokolle. Die meisten dieser Protokolle wurden zwar
anfänglich für embryonale Stammzellen etabliert, konnten aber erfolgreich auf die
Anwendung mit induzierten Stammzellen übertragen werden [144, 145]. Diese
unterscheiden sich nicht nur im methodischen Weg und der Effizienz, sondern vor allem
auch in der Prägung auf verschiedene subzerebrale Identitäten entlang der rostro-caudalen
und anterior-posterioren Achsen des Gehirns. Eine der ersten Methoden zur Differenzierung
von Stammzellen zu Neuronen nutzt den Übergangszustand der embryonalen Körperchen
(embroyid bodies; EB). Hierbei werden die Stammzellkolonien als Sphären in Suspension für
mehrere Tage kultiviert. Nach anschließender erneuter Kultur im Monolayer bilden sich aus
den Kolonien Zellen aller drei Keimblätter [75]. Diese Technik konnte durch die Einführung
definierter Medien [146], hängender Tropfenkultur [147] oder Aggrewell-Platten für eine
definiertere Größe der embryonalen Körperchen [148] zwar verbessert werden, ihre
Nachteile aber nicht überwiegen. Zum einen ist die Effizienz der Differenzierung relativ
niedrig und die neuronalen Stammzellen müssen manuell oder enzymatisch isoliert werden.
Des Weiteren ist die Durchführung der Methode anspruchsvoll und langwierig. Der größte
Nachteil ist, dass kaum Einfluss auf die Entwicklung im frühen Stadium der neuronalen
Stammzellen innerhalb der embryonale Körperchen genommen werden kann, [77], um sie
so für eine bestimmte zerebrale Identität zu prägen. Eine andere Methode ist die Kokultur
von Stammzellen mit ausgereiften Zellen. So können unter anderem durch die Kokultur mit
stromalen Mauszellen (PA6) dopaminergen Neuronen [149] oder mit Maus-Myoblasten
(C2C12) Motorneuronen [84] erhalten werden. Nachteil sind die undefinierten
Bedingungen, die eine zweite, zudem artfremde Zelllinie mit sich bringt und die Fähigkeit,
diese zu kultivieren.
Das von uns verwendete Protokoll basiert auf der Methode der dualen SMAD-Inhibition
[77]. Hierbei werden die iPS im konfluenten Monolayer kultiviert und eine Differenzierung
zu neuroektodermalen Zellen durch die Zugabe der beiden SMAD-Inhibitoren SB431542 und
Noggin induziert. Diese Agenzien inhibieren die TGFβ/Activin/Nodal und BMP-Signalwege
Diskussion 63
und unterdrücken so eine Differenzierung der iPS zu Mesoderm und Endoderm [77, 150].
Nach einer ersten Passage kann man mittels dieser Methode eine fast 100 % Konversion zu
neuronalen Stammzellen erhalten. Durch die Exposition der neuronalen Stammzellen mit
verschiedenen Faktoren und Inhibitoren kann die weitere Differenzierung zu verschiedenen
neuronalen Subtypen wie Motorneuronen, dopaminergen Neuronen oder Zellen der
Neuralleiste angeregt werden [77, 151]. Einer der größten Vorteile dieses Protokolls ist die
Möglichkeit, die Zellen frühzeitig mit Agenzien zu beeinflussen, um die Prägung auf eine
bestimmte subzerebrale Identität zu begünstigen. Das von uns verwendete Protokoll für die
Differenzierung von kortikalen Neuronen basiert auf dem Originalprotokoll zur dualen
SMAD Inhibition und vereint etliche Verbesserungen mit der frühzeitigen Exposition der
Zellen mit Retinolsäure [112]. Interessanterweise konnte nur durch die frühzeitige Addition
von Retinolsäure zum neuronalen Induktionsmedium eine Prägung auf die frontale kortikale
Identität der Zellen begünstigen. Dies Ergebnisse widersprechen der allgemein vertretenen
Meinung, dass Retinolsäure aufgrund seines Konzentrationsgradienten hauptsächlich für die
Entwicklung posteriorer/dorsaler Gebiete notwendig ist [152]. Das relativ teure,
rekombinante Protein Noggin wurde hierbei durch den BMP-Inhibitor Dorsomorphin
ausgetauscht [78, 153]. Die Handhabung der Methode hingegen gestaltete sich schwieriger
als vermutet, gerade die korrekte Passage des Neuroectoderms in adäquater
Fragmentgröße musste mehrfach optimiert werden. Einen deutlichen Vorteil hingegen bot
die Möglichkeit, die kortikalen neuronalen Stammzellen zu kryopräservieren. So konnte
dieselbe erfolgreich differenzierte Charge an Zellen mehrfach für verschiedene Experimente
eingesetzt werden, ohne die gesamte Differenzierung und Validierung wiederholen zu
müssen.
Nach der neuronalen Induktion der iPS zu kortikalen Stammzellen können sich aus diesen
Zellen fast alle kortikalen Zelltypen, wie Projektionsneuronen und Astrocyten entwickeln.
Die Differenzierung zu Interneuronen kann dieses Protokoll hingegen nicht abbilden, da
Interneuronen in der subpalliativen, proliferativen Zone des Telencephalons gebildet
werden, bevor sie in den Neokortex migrieren [154]. Eine Besonderheit des Protokolls ist,
dass die Neurogenese der Projektionsneuronen in vitro nach dem gleichen zeitlichen und
strukturellen Muster abläuft, wie während der Embryogenese in vivo [88]. Dies ermöglicht
es uns nicht nur, Veränderungen in einem bestimmten voll entwickelten neuronalen Subtyp
zu untersuchen, sondern auch Veränderungen, die nur in einem zeitlich begrenzten Rahmen
64 Diskussion
während der Neurogenese auftreten, näher zu erforschen. Gerade gegenüber den bisher
verwendeten Mausmodellen eröffnet uns diese Eigenschaft mögliche Störungen im
Zusammenspiel der verschiedenen neuronalen Stammzellen, wie äußeren radialen
Gliazellen oder intermedialen neuronalen Stammzellen (IPC), welche kaum in der Maus
vorhanden sind, zu beobachten [54, 155]. Der gesamte Ablauf der zerebralen Entwicklung
von Mensch und Nager unterscheidet sich deutlich voneinander; 20 % aller Gene werden
während dieser Entwicklung differentiell exprimiert [156]. Um das in-vitro-Modell der
patientenspezifischen iPS noch mehr an die tatsächliche Situation in vivo anzunähern,
könnten sie zu dreidimensionalen zerebralen Organoiden differenziert werden. Anhand
dieser zerebralen Organoide kann ein semi-organisiertes, humanes Gehirngewebe in vitro
untersucht werden. Besondere Merkmale hierbei sind, dass sich dorsale prosencephalische
Bereiche mit Progenitorzellen und primitiven kortikalen Schichten beobachten lassen (bis
Lamina V/VI). Darüber hinaus können auch Bereiche nachgewiesen werden, die auf den
Hippocampus und den ventralen Prosencephalon spezialisiert sind [157].
Für die Validierung der kortikalen Identität mittels qPCR wurden Zellen nach 20 Tagen
Differenzierung gegen die korrespondierenden iPS verglichen. Hierbei konnte für jede
untersuchte Differenzierung ein Anstieg in der Expression von fünf kortexassoziierten
Markern und der drastische Rückgang eines pluripotenzassoziierten Gens und somit eine
erfolgreiche Differenzierung nachgewiesen werden.
Im Gegensatz zum Originalprotokoll haben wir darüber hinaus für eine noch detailliertere
komparative Untersuchung des Genexpressionsprofils beider Linien vergleichende gesamt
RNA-Sequenzierungen von Patientin und gesundem Geschwisterkind jeweils von zwei
Proben nach 50 Tagen sowie zwei Proben nach 90 Tagen Differenzierung auf der SOLiD
5500XL-Plattform durchgeführt. Anschließend wurden dann die einzelnen Ergebnisse mit
einander verglichen. Im Detail waren hier die Vergleiche der beiden Linien im
differenzierten Zustand (2 ASC23 d50 vs ΔSt3Gal-3 d50 und 3 ASC23 d90 vs ΔSt3Gal-3 d90)
und der iPSC mit ihren jeweiligen differenzierten Zustände (4 ASC23 iPSC vs ASC23 d50; 5
ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50) interessant. Die Replikate beider Linien stammten jeweils
von derselben Differenzierung. Von allen Vergleichen wurde berechnet ob verschiedene
GO-Terme der DE-Gene vermehrt vorkommen und durch ihre Verwandtschaft ein Cluster
mit ähnlicher Funktion bilden.Die DAVID-Analysen der signifikant differentiell exprimierten
Gene der Vergleiche 4 und 5 (4 ASC23 iPSC vs ASC23 d50; 5 ΔSt3Gal-3 iPSC vs ΔSt3Gal-3 d50)
Diskussion 65
unterstützen die qPCR-Analysen und zeigen eindeutig, dass vermehrt Gene annotiert zur
Genothologie (GO-Term) „neuronal differentiation“- und „forebrain“-Entwicklung exprimiert
wurden (Tabelle 2.2).
Bei den Vergleichen 4 und 5 fielen neben den zu erwartenden GO-Termen „glycoprotein“,
„neuron differentiation“, „cell motion“ und „forebrain development“ auch GO-Terme zur
Entwicklung anderer Gehirnbereich wie dem „hindbrain“ oder „neural crest cell“/“eye
development“ auf. Für den Vergleich 4 (gesundes Geschwisterkind) ist dies das Cluster 12,
für den Vergleich 5 (Patientin) sogar das Cluster 8. Noch deutlicher wird dies, wenn man sich
die Enrichment Analyse der Vergleiche der differenzierten Zellen direkt gegeneinander
betrachtet (2 ASC23 d50 vs ΔSt3Gal-3 und 3 ASC23 d90 vs ΔSt3Gal-3 d90) Für den Vergleich
2 ist es das erste Cluster mit einem Enrichment score von 2,57 und für den Vergleich 3 das
zweite Cluster mit einem Enrichment score von 3,99. Beide Cluster verdeutlichen, dass in
den kortikal differenzierten Zellen viele Gene exprimiert werden, die während einer
Differenzierung anderer zerebraler Bereiche, wie dem Rhombencephalon („hindbrain“) oder
dem Auge, eine Rolle spielen. Interessanterweise sind die Gene mit den GO-Termen zur
Entwicklung von Augenzellen nur bei der Patientin erhöht exprimiert. Die verschiedenen
Teile des menschlichen Auges entwickeln sich aus allen drei Keimblättern, mesoderm,
endoderm und ectoderm. Hierbei sind die Zellen der Neuralleiste, die sich ebenfalls wie die
Kortexneuronen aus dem Neuroectoderm entwickeln, unter anderem für die Bildung der
Linse verantwortlich [158]. Das wir bei der Differenzierung der Patientenzellen vermehrt
Gene mit den GO-Termen „sensory organ development“ und „neural crest“ finden, könnte
daran liegen, dass sich aus dem Neuroectoderm während der Differenzierung neben den
kortikalen Stammzellen auch Zellen der Neuralleiste gebildet haben.
Betrachtet man diese Ergebnisse im größeren Zusammenhang zeigt die RNA-Sequenzierung
der kortikal differenzierten Zellen, dass es sich hierbei nicht um einen klar abgegrenzten
Prozess handelt, sondern eine Differenzierung in viele andere Bereiche unterschwellig
stattfindet. Da bisher noch keine anderen Arbeiten über RNA-Sequenzierungen zur
kortikalen Differenzierung veröffentlicht wurden, auch nicht in der Originalarbeit von Shi
und Kollegen, können wir anhand unserer Ergebnisse nicht eindeutig beantworten, ob sich
hierbei tatsächlich eine eigenständige neuronale Subpopulation gebildet hat oder ob es sich
um die differentielle Expression in allen Zellen handelt. Schaut man sich allerdings, ohne
einen Vergleich, die in beiden Linien am häufgsten exprimierten Gene an, so ist die reine
66 Diskussion
Expressionshöhe der Gene der „forebrain“-Entwicklung gegenüber denen, die an der
Differenzierung der anderen Bereiche beteiligt sind, so deutlich viel höher (RPKM), dass wir
davon ausgehen, dass die Zellen trotzdem hauptsächlich dem frontalen Kortex zuzuordnen
sind (Anhang Tabelle 11-13).Dies wird ebenfalls dadurch unterstrichen, dass die Ergebnisse
der qPCR und der Immunfluoreszenzfärbung im Vergleich zu den Arbeiten von Shi und
Kollegen die gleichen Erwartungen erfüllen, weshalb wir davon ausgehen, dass ihr Einsatz in
den funktionellen Analysen hierdurch nicht beeinträchtigt ist. Um diese Unsicherheit aber
gänzlich ausräumen zu können, hätte während der Differenzierung anhand einer FACS-
Analyse mit passenden Markern gegen kortikale Zellen und Zellen der Neuralleiste eine
Quantifizierung der Zellen vorgenommen werden müssen. Da nicht mehr von allen
Differenzierungsansätzen Zellen vorhanden sind, kann dies nicht nachgeholt werden. Für
folgende Experimente sollten die bereits bestehenden Qualitätskontrollen durch qPCR und
Immunfluoreszenzfärbung auch auf Marker anderer zerebraler Bereiche, wie dem
Rhombencephalon, Mesencephalon und der Neuralleiste, ausgeweitet werden, um die
Effizienz der kortikalen Differenzierung zu überprüfen.
3.3 Glycosylierung und zelluläre Adhäsion
In vorherigen Studien konnte schon gezeigt werden, dass die Sekretion der von uns
untersuchten Mutation im Sialylmotiv-S (p.Ala320Pro) der ST3GAL3 gestört ist sowie ein
vollständiger enzymatischer Aktivitätsverlust vorliegt [5]. Darüber hinaus zeigten unsere
Untersuchungen mit LMTK- Zellen, dass bei Überexpression unserer Mutationsvariante eine
gestörte Lokalisierung außerhalb des Golgi-Apparates vorliegt.
Daraus resultierend zeigten die Patientenzellen nach 50 und 90 Tagen Differenzierung eine
zusätzliche Bande in der DAS-Lektinfärbung bei 70 kDa. Das Lektin DAS bindet an
endständigen β-1,3-gebundenen Galactoseresten, welche auch eines der Hauptedukte der
ST3GAL3 sind. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die ST3GAL3, entgegen der bisherigen
Annahme, eine erhöhte Target Spezifikation besitzt und dieses Target beim Wegfall ihrer
enzymatischen Aktivität als zusätzliche Bande in der DAS Färbung sichtbar wird.
Zudem zeigen die Ergebnisse des Zelladhäsions Assays, dass Patientenzellen nach kortikaler
Differenzierung deutlich schneller an den Untergrund adhärieren, als gleich lang
differenzierte Zellen des gesunden Geschwisterkindes.
Für die weitere Untersuchung der Ursachen der erhöhten Zelladhäsion bei Patientenzellen
Diskussion 67
wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt. Die erste Hypothese postulierte, dass durch die
fehlende ST3GAL3-Aktivität ein oder mehrere Glycoepitope in allen Zellen nicht sialyliert
wurden und so die Adhärenzeigenschaften aller Zellen beeinflusst wurden. Die zweite
Hypothese postuliert, dass es durch die fehlende ST3GAL3-Aktivität zu einer funktionalen
Störung kam, die sich in einer Verschiebung im Mengenanteil der verschiedenen neuronalen
Subtypen ausdrückt. Die verschiedenen vorhandenen kortikalen Zelltypen, z.B. RG, IPC, oRG
oder PN können an sich unterschiedliche adhäsive Eigenschaften besitzen, so dass sich das
gesamte adhäsive Verhalten ändert, wenn die eine oder andere Populationsanzahl erhöht
oder erniedrigt wäre.
Strukturen, die für die Überprüfung der ersten Hypothese in Betracht kommen, wären
sialyliert und direkt oder indirekt an der Zelladhäsion beteiligt. Da eine drastische
Verminderung von Sialoglycoproteinen in der St3Gal3 Knock-out Maus [26] nachweisbar
war, sollen Glycoproteine im Vordergrund dieser Betrachtungen stehen.
Die Ergebnisse unseres Zelladhäsionsassays deuten vor dem Hintergrund der Ergebnisse der
Lektinfärbungen an, dass die fehlende Sialylierung durch die ST3GAL3 (70 kDa Bande)
ausschließlich in kortikal differenzierten Patientenzellen, aber nicht in den Fibroblasten zu
den differentiellen adhäsiven Eigenschaften führt. Deshalb beschränken wir uns im
Folgenden auf die Betrachtung der möglichen ST3GAL3 Substrate speziell im zentralen
Nervensystem (ZNS).
Im ZNS gibt es verschiedene spezifische Zelladhäsionsmoleküle, die eine wichtige Rolle
während der Entwicklung des Gehirns und im reifen adulten Zustand spielen. Die Zell-Zell-
Adhäsion im adulten zerebralen Gewebe kann hierbei in die Bildung der Synapsen [159], die
Adhäsion zwischen Axonen und anderen Zellen und die Axon-Axon-Adhäsion untergliedert
werden.. Die hieran beteiligten Zelltypen, Abläufe, Makro- und Mikrostrukturen sowie deren
möglichen Targets der ST3GAL3, die bei einer gestörten Sialylierung zu einem Phänotyp
führen können, sollen im Folgenden näher beleuchtet werden.
– Bildung der Synapsen – Im Aufbau neuronaler Synapsen können zwei verschiedene
Adhäsionsstrukturen unterschieden werden, die synaptischen Junctions (SJ) und die puncta
adharentia junctions (PAJ). Während die SJ an der Neurotransmission beteiligt sind, stellen
die PAJ die mechanische Adhäsion der beiden Zellen dar. In der aktiven Zone der Synapse
sind etliche Ca2+-Kanäle und Vesikel mit Neurotransmittern vorhanden. Die mechanische
Adhäsion wird innerhalb der PAJ über verschiedene Adhäsionsmoleküle vermittelt. N-
68 Diskussion
Cadherine und Catenine liegen symmetrisch verteilt vor und stellen die Verbindung zum
Actin-Skelett her. Nectin-1/3 sowie Afadin liegen unregelmäßig verteilt innerhalb der PAJ
vor [160]. Mutationen im Nectin-1-Gen können unter anderem das Zlotogora-Ogür-Syndrom
hervorrufen, dass sich durch geistige Behinderung, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, Syndaktylie
und ektodermale Dysplasie auszeichnet [161]. An der Schlüssel-Schloss-Funktion der
Synapsen sind die Adhäsionsmoleküle SYG-1/2 und Sidekick [162] beteiligt. Die Spezifität der
Synapsen könnte über die Protocadherindiversität vermittelt werden [163]. Die Bildung
einer Synapse wird über die Bindung von Neuroligin an β-Neurexin vermittelt [164].
– Die Axon-Zelladhäsion – besteht hauptsächlich zwischen Axonen und Astrozyten,
Oligodendrocyten oder anderen Axonen. Die mechanische Adhäsion von Astrozyten an
Axonen wird durch einen Komplex aus Necl-1, TSLL1 und SynCAM3 hergestellt [165].
Astrozyten regulieren die neuronale Transmission durch Glutamataufnahme [166],
Koaktivierung von NMDA-Rezeptoren oder sogar direkter Regulierung mittels
Thrombospondin [167].
– Die paranodale Adhäsion –, also die Adhäsion zwischen Axonen und Oligodendrocyten,
spielt eine wichtige Rolle für die Myelinierung von Axonen und somit der korrekten
Reizweiterleitung. Direkt um einen Ranvierschen Schnürring herum liegen drei verschiedene
Domänen vor, der Na+-Kanal-reiche Schnürring selbst, die angrenzenden paranodalen
„Septate Junctions“ und die juxtaparanodale Region mit ihren repolarisierenden K+-Kanälen.
Die „Septate Junctions“ vermitteln ihre mechanische Adhäsion hauptsächlich auf der
axonalen Seite durch das Transmembranprotein Caspr in Verbindung mit dem GPI-
verankerten Adhäsionsmolekül Contactin [168]. Mutationen im Caspr Gen CNTNP1 führen
zu Athrogryposis multiplex congenita. Bei dieser im frühkindlichen Alter letalen Krankheit
liegt unter anderem eine starke Vergrößerung der Ranvierschen Schnürringe und ein
deutlich verringerte Myelinierung des Ischiasnervs vor [169]. Dieser Komplex bindet an das
oligodendrocytische Adhäsionsmolekül Neurofascin 155 [170]. Unterstützt wird die Bildung
dieser Bindung durch die ECM-Glycoproteine Tensacin-R und –C [171].
– Axonale Faszikulation – Während der frühen neuronalen Entwicklung werden die Axone
longitudinal oder faszikulär durch anziehende und abstoßende Faktoren zu ihrem
Bestimmungsort geleitet. Die beiden wichtigsten Adhäsionsmoleküle der axonalen
Faszikulation sind L1 und NCAM [172]. Mutationen im humanen L1-Gen führen zu
verschiedenen Syndromen, die sich häufig durch zerebrale Agnesie, Hydrozephalus,
Diskussion 69
geistiger Behinderung sowie epileptischen Anfällen auszeichnen können [173]. Auf das
Neuronale Zell-Adhäsions-Molekül (NCAM) möchte ich später noch genauer eingehen.
– Zelltypen der Neurogenese – Während der Entwicklung des Gehirns spielen
unterschiedliche neuronale Stammzellen eine wichtige Rolle bei der Neurogenese. Ihre
Entstehung, symmetrische und asymetrische Zellteilung sowie die Interaktion untereinander
ist ebenfalls stark durch sialylierte Adhäsions Moleküle beeinflusst.
Zunächst kommt es zur Bildung der neuroektodermalen Zellen in der Neuralröhre. Diese
sind entlang ihrer apikal-basalen Achse stark polarisiert und enthalten an ihrem apikalen
Ende „Tight und Adherens Junctions“ [174]. Aus den neuroektodermalen Zellen entstehen
die neuronalen Stammzellen – zunächst die Radialen Gliazellen (RG), die die ventrikuläre
Zone des Gehirns bilden. Für den Übergang aus neuroektodermalen Zellen zu RG werden
vor allem Gene zur Bildung der „Tight Junctions“ herunterreguliert, nicht aber der
„Adherens Junctions“, so dass die Zellen ihren epithelialen Charakter verlieren und mehr
Eigenschaften von Astroglia übernehmen [175]. Die apikal-basale Polarität der RG befähigt
sie zur asymmetrische Zellteilung zu äußeren radialen Gliazellen (oRG), intermedialen
neuronale Stammzellen (IPC) oder Projektionsneuronen (PN) [101, 176]. Für die Migration
der intermedialen Stammzellen in den subventrikulären Raum verlieren diese ihre
„Adherens Junctions“ und die letzten epithelialen Eigenschaften [100, 177].
Die ECM bildet während der zerebralen Entwicklung eine Basallamina (BL), in der sich die
neuronalen Stammzellen aufhalten. Sie moduliert deren Erhaltung und Differenzierung
sowie Migration ihrer Nachkommen [178-180]. Besonders fallen hier die RG auf, die über
ihre Endfüße direkt an der Basallamina adhärieren. Die Entfernung der BL beeinflusst die
Überlebenschancen der RG sowie die kortikale Laminierung [181]. Die wichtigsten
Bestandteile der BL sind zu diesem Zeitpunkt, Laminin, Tenascin-C, Reelin und Notch-1.
Laminine fördern die Migration, Expansion und Differenzierung der neuronalen
Stammzellen [182, 183]. Mutationen in den Genen ihrer Dystroglycan- oder
Integrinrezeptoren haben große Auswirkungen auf das NSC-Verhalten. So führen
Mutationen im Dystroglycan oder seiner Glycosyltransferase zu kortikaler neuronaler
Ektopie [184, 185]. Inaktivierungen des β1-Integrins führen zu abnormaler Entwicklung der
neokortikalen Laminierung und Windung [186, 187]. Tenascin-C fördert die Neurogenese in
dem es den Wechsel von neuroektodermalen Zellen zu RG fördert [188-190]. Reelin wird im
Neokortex sekretiert und bindet an die ApoE2- und VLDL-Rezeptoren, die von migrierenden
70 Diskussion
Neuronen und RG exprimiert werden [191, 192]. Reelin wurde mehrfach als ein
Chemoattraktant vorgeschlagen, das die neuronale Migration steuert. Eine vorgeschlagene
Hypothese zum Wirkmechanismus ist, dass Reelin die Ablösung der Neuronen von den RG
und die Glia-unabhängige Migration fördert [192, 193]. Mutationen der beteiligten Faktoren
der Reelin-Signalwege führen beim Menschen zu Lissencephalie und zerebraler Hypoplasie
[194].
– Molekulare Strukturen – Obwohl die ST3GAL3 vermutlich hauptsächlich Glycoproteine
sialyliert, kann sie trotzdem direkt oder indirekt an der Sialylierung und Regulation anderer
Adhäsionsmoleküle beteiligt sein. Die wichtigsten molekularen Bausteine der ZNS-Adhäsion
sollen deshalb hier noch einmal gesondert diskutiert werden.
Veränderungen des Expressionsmusters von Glycolipiden, wie auch Ganglioside, korrelieren
häufig mit neurologischen Entwicklungspunkten [195] und beeinflussen so die Neurito-,
Axono- und Synaptogenese. Alle Ganglioside werden im Golgi-Apparat durch verschiedene
sequentielle Glycosyltransferasen modifiziert [38]. Die α-2,3-Sialylierungen von GA1 und
GD3 werden durch die ST3GAL2 und ST3GAL5 (GM3 Synthase) katalysiert. Die GM3-
Synthase ist ein kritisches Enzym für die Bildung aller komplexen Ganglioside und eine
Mutation in ihrem Gen ist assoziiert mit dem „Amish Infantile Epilepsy“ Syndrom [42]. Da
auch eine Beteiligung der ST3GAL3 indirekt an der Sialylierung von GA1 diskutiert wird,
sollte die Sialylierung dieses Gangliosids in zukünftigen Arbeiten beachtet werden [26].
Während der sehr frühen Phase der Neuralrohrbildung fördern Glycosaminoglycane und
hochmolekulare, unverzweigte Polysaccharide wie Hyaluronsäure ihre Struktur und
Spannkraft [196].
Proteoglycane zeigen im Gehirn eine sehr prominente Rolle, trotzdem sind kaum Störungen
durch Proteoglycandefekte bekannt. Gründe hierfür könnten einerseits ihre funktionale
Redundanz, aber auch ihre embryonale Letalität sein. Einzige Ausnahmen bildet Perlecan,
dessen Mutation bei Mäusen zu Exencephalie oder neuronaler Ektopie und schweren
Basallaminadefekten führt [197, 198].
Während der zerebralen Entwicklung nehmen zwei Glycoproteine eine besonders wichtige
Rolle ein, das Zell-Adhäsions-Moleküle NCAM und der Notch-1-Rezeptor.
Das NCAM liegt hauptsächlich im polysialylierten (PSA) Zustand vor. PSA ist ein lineares
Homopolymer, das bis zu 200 α-2,8-gebundene Sialinsäurereste trägt und ausschließlich auf
dem NCAM vorkommt. Die Reaktion wird von den Polysialyltransferasen ST8Sia-II und -IV
Diskussion 71
katalysiert [199], wobei eine α-2,3-gebundene Sialinsäure als Ausgangszucker vorhanden
sein muss. PSA ist ein stark negatives Molekül mit einer starken Hydratisierung und
Kationbindungsaffinität, das den PSA-NCAM-Komplex befähigt, sich an der Regulation der
Myelinierung, Axonleitung, Synapsenbildung und neuronaler funktionaler Plastizität zu
beteiligen [199-203]. Polysialyltransferase defiziente Mäuse zeigen Verhaltens- und
Entwicklungsdefizite, eine Reduktion der Langzeit-Potenzierung und -Depression sowie
gestörte Synapsenbildung im Hippocampus [204, 205]. Da die Polysialylierung von NCAM bei
unserer Patientin in kortikalen Zellen nicht gestört ist, schließe ich allerdings eine
Beteiligung der ST3GAL3 am Aufbau der PSA aus.
Der Notch-Rezeptor (NOTCH-1) spielt eine essentielle Rolle während der zerebralen
Entwicklung und beeinflusst unter anderem die Differenzierung von Oligodendrocyten und
Astrocyten, inhibiert die Neurogenese und stabilisiert den RG-Pool während der
embryonalen Neurogenese [206, 207]. Die Aktivität des Notch-Rezeptors kann durch die
Bindung von DLL1 (Delta-like 1) oder JAG1 (Jagged 1) reguliert werden. DLL1 wird von
neuronalen, intermediären Stammzellen exprimiert und kann in Verbindung mit LFMG
(Lunatic-Fringe-Protein) Notch in RG aktivieren [208, 209]. Für die korrekte Faltung,
Ligandenerkennung und Endocytose ist die O-Glycosylierung des Notch-Rezeptors essentiell
[210, 211]. An seinen dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnlichen Domänen werden die
Serine- oder Threoninreste mit einer Fucose O-glycosidisch modifiziert. Dieser Schritt wird
durch die Fucosyltransferase OFUT1 katalysiert [212]. Der Notch-Rezeptor wird im
Folgenden noch durch eine unbekannte β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase, β-1,4-
Galactosyltransferase und einer α-2,3-Sialyltransferase modifiziert [213]. Mutationen im
OFUT1-Gen führen bei Drosophila zu einem Notch-ähnlichen Phänotyp [214]. Die CDG IIc,
charakterisiert durch langsames Wachstum, geistige Behinderung und schwere
Immundefizite, wird durch Mutationen im GDP-Fucose-Transporter (SLC35C1) verursacht
[215]. Obwohl die ST3GAL3 hauptsächlich am Aufbau des Sialyl-Lewis-A-Epitops beteiligt
sein soll, können wir aufgrund seiner geringen Aktivität gegen β-1,4-Galactose und seiner
allgemein breiten Substratspezifität eine Beteiligung an der Bildung der Notch-
Glycosylierung momentan nicht ausschließen [5].
Da fast alle hier genannten Makro- und Mikrostrukturen der interzellulären Adhäsion im
ZNS durch die fehlende ST3GAL3-Aktivität verändert sein können, wäre es sehr interessant
in weiteren Arbeiten zu untersuchen welche Zielstrukturen genau von der ST3GAL3 sialyliert
72 Diskussion
werden, um die Auswirkungen auf das Adhäsivverhalten näher beleuchten zu können. Ein
Ansatzpunkt für die Suche dieser Strukturen liefert die zusätzliche Bande in der DAS
Lektinfärbung der kortikalen Patientenzellen. Da unsere Ergebnisse bisher noch keinen
Hinweis auf den konkreten Reaktionspartner angeboten haben, wäre es sinnvoll, zunächst
eine Gesamt-Sialom-Untersuchung durchzuführen, um das Glycosylierungmuster genauer zu
charakterisieren.
3.4 Die Neurogenese kortikaler Projektionsneuronen
Als nächstes sollte die zweite Hypothese, dass eine Verschiebung im Mengenanteil der
verschiedenen neuronalen Zellsubtypen zu dem differentiellen adhäsiven Verhalten der
kortikalen Patientenzellen führt, überprüft werden.. Hierfür wurde die Menge
verschiedener Projektionsneuronen an definierten Zeitpunkten der Differenzierung
kontrolliert. Im Vergleich zu den Zellen des gesunden Geschwisterkindes können wir bei den
Patientenzellen nach 50 Tagen kortikaler Differenzierung 2,28-mal weniger TBR1-positive
Neuronen detektieren. Interessanterweise können wir trotzdem in beiden Proben nach 50
Tagen kortikaler Differenzierung schon um die 5 % SATB2-positive Neuronen detektieren.
Da wir nur bei den TBR1-positiven Neuronen eine Reduktion messen, können wir davon
ausgehen, dass es sich hierbei nicht um einen totalen Entwicklungsrückstand handelt,
sondern um eine selektive Reduktion der TBR1-positiven corticothalamischen
Projektionsneuronen. Anscheinend liegt tatsächlich eine veränderte
Subpopulationszusammensetzung innerhalb der kortikalen Patientenzellen vor.
Während der Differenzierung der iPS zu kortikalen Zellen nach Shi et al. [112] werden alle
Klassen von Projektionsneuronen (PN) in einer in-vivo-ähnlichen temporalen Folge gebildet
[88]. Hierbei entstehen zuerst die Neuronen der Kortexschichten V und VI und danach der
Schichten II und III. Eine Einteilung der PN wurde hauptsächlich anhand ihrer Hodologie
erstellt, also in welche zerebrale Region ihre Axone projizieren. In der VI. Schicht befinden
sich corticothalamische Projektionsneuronen (CThPN; TBR1+)[216], in der V. subkortikale
Projektionsneuronen (SCPN; CTIP2+) [217] und in der II. - IV. Schicht callosale
Projektionsneuronen (CPN; SATB2+) [218]. In vitro sollen bis Tag 50 der kortikalen
Differenzierung fast alle TBR1-positiven Neuronen gebildet worden sein (Abbildung 3.1 (B)).
SATB2-positive Neuronen sollen hauptsächlich zwischen Tag 65 und 90 gebildet werden
Diskussion 73
[88]. Dieser zeitliche Ablauf entspricht in den Hauptpunkten dem Ablauf der humanen
kortikalen Neurogenese in vivo [219].
Abbildung 3.1: Projektionsneuronen des Kortexes (A) Bildung der TBR1-positiven CThPN (Projection neurons lamina VI) aus PAX6-positiven radialen Gliazellen (radial glia cells) und TBR2-positiven intermediären neuronalen Stammzellen (intermediate progenitors). (B) Schematischer Aufbau der kortikalen Schichten des adulten humanen Kortexes.
Um die Ursachen der Reduktion TBR1-positiver Projektionsneuronen genauer verstehen zu
können, sollen im Folgenden die molekularen Abläufe zur Bildung dieser Neuronen näher
beleuchtet werden.
Während des Schließeung des Neuralrohrs entwickeln sich aus den neuroektodermalen
Zellen die ersten neuronalen Stammzellen, die RG. RG sind durch eine apikal-dorsale
Polarität charakterisiert und führen über symmetrische Zellteilung zur Expansion des RG-
Pools. Über asymmetrische Zellteilung entstehen aus ihnen oRG, intermediäre Stammzellen
(IPC) oder direkt die ersten Projektionsneuronen [101, 176]. Die oRG sind ebenfalls unipolar,
im Gegensatz zu den RG fehlt es ihnen jedoch am apikalen Fortsatz. Sie kommen
hauptsächlich in der äußeren subventrikulären Zone (OSVZ) des Kortex vor und können sich
ebenfalls über asymmetrische Teilung selbst reproduzieren und Projektionsneuronen bilden
[220]. Im Mauskortex kommen sie zwar in der subventrikulären Zone (SVZ) vor, aber in
dramatisch geringerer Menge [54]. Die IPC haben eine multipolare Morphologie und liegen
ungebunden vor. Sie stellen eine Durchgangsstufe von RG zu Projektionsneuronen dar,
proliferieren nur wenig und teilen sich häufig über symmetrische Zellteilung zu zwei
Projektionsneuronen [102]. Sie amplifizieren so die Zahl aller möglichen
Projektionsneuronensubtypen aus dem RG-Pool deutlich.
In der Gesamtheit bilden diese Stammzellen die verschiedenen
Projektionsneuronensubtypen in aufeinanderfolgenden Wellen. Es wird diskutiert, dass man
74 Diskussion
diese neuronalen Stammzellen in verschiedene Linien unterscheiden kann, die eine
Beschränkung für einen bestimmten Subtyp, wie den der TBR1-positiven PN,
haben.Experimente mit retroviral markierten neuronalen Stammzelllinien in der Maus
zeigen, dass sich aus frühen Stammzellen noch PN aller Schichten bilden können, aus später
geborenen Stammzellen jedoch nur noch PN der oberen Schichten [221, 222]. Es käme
somit zu einer Verringerung der Multipotenz einer jeden Stammzelllinie im Verlauf der
Entwicklung. Eine weitere Hypothese besagt, dass es von Anfang an PN-Subtyp-beschränkte
Stammzelllinien gibt. Gestützt wird diese Hypothese von einem Experiment, das zeigt, dass
CUX2-positive neuronale Stammzellen, nur PN der oberen Schichten bilden, obwohl sie
schon zu einem frühen Zeitpunkt geboren wurden [223]. Es scheint demnach zwei
verschiedene Stammzelllinien zu geben (CUX2+ und CUX2-), die entweder
Projektionsneuronen der unteren (Cux2-) oder der oberen Schicht (Cux2+) liefern können.
Inwiefern ein Fehler, verursacht durch die Mutation im ST3GAL3-Gen, in der Cux2- Linie
vorliegen könnte und ob dieser sich auf die Produktion der TBR1-positiven PN auswirkt, ist
allerdings beim momentanen Forschungsstand nicht zu beantworten.
Es gibt Hinweise darauf, das sich TBR1-positive CThPN durch eine Entwicklungskaskade über
radiale Gliazellen (PAX6) aus intermediären Stammzellen (TBR2) entwickeln [108] (siehe
Abbildung 24 (A)). Der Übergang von RG zu IPC wird durch die verringerte Expression
adhäsiver Strukturen wie den „Adherens Junctions“ charakterisiert [89, 100]. Sie sollten
somit ein deutlich niedrigeres adhäsives Verhalten haben. Die Entwicklung einer RG zu einer
IPC wird durch die Aktivierung von TBR2 mittels NEUROG2 in einer der beiden Tochterzellen
angestoßen. TBR2 ist ein direktes Zielgen von NEUROG2. Wie genau die Aktivierung des
NEUROG2-Gens in nur einer der Tochterzellen reguliert ist, ist nicht bekannt.
Interessanterweise gibt es Hinweise darauf, dass Notch-Inhibierung zwischen der
entstehenden Tochterzelle und der Ausgangszelle die Expression von NEUROG2 inhibiert
[224]. Wie schon beschrieben ist für die Funktion des Notch-Rezeptors eine korrekte
Glycosylierung, unter anderem auch Sialylierung, wichtig.
Eine Reduktion der IPC-Population aufgrund fehlender ST3GAL3 Funktion könnte die
erhöhten adhäsiven Eigenschaften der kortikalen Patientenzellen und die verringerte
Population an TBR1-positiven Neuronen erklären.
Inwiefern die fehlende ST3GAL3-Funktion dieses Zusammenspiel beeinflusst, könnte anhand
einer Immunopräzipitation des Notch-Rezeptors und anschließender Lectinfärbung auf α-
Diskussion 75
2,3-Sialinsäure- und β-1,3-Galactoseepitope überprüft werden. Die Reduktion der IPC-
Population wurde mittels einer Immunfluoreszenzfärbung auf RG- und IPC-Marker (PAX6,
TBR2) von Patientenzellen und Zellen des gesunden Geschwisterkindes nach 35 Tagen
Differenzierung untersucht. Diese qualitative Methode zeigt, dass beide Subpopulationen in
beiden Proben vorhanden sind. Darüber hinaus wäre eine Quantifizierung mittels einer
FACS-Analyse notwendig, um zu untersuchen, ob die Menge an TBR2-positiven IPC reduziert
ist.
3.4 Zusammenfassung/Ausblick
Geistige Behinderung ist mit einer Prävalenz von 2-3 % in der Weltbevölkerung, eine relativ
häufige Erkrankung, wobei 30 -50 % dieser Fälle nicht-syndromal und/oder idiopatisch
verlaufen. In 25 % aller Fälle kann eine erblich bedingte Ursache gefunden werden [9].
Obwohl die genetische Ursache in vielen Fällen bekannt ist, konnte bisher nur in wenigen
Fällen eine molekulare Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp gezogen werden. In
vorangegangenen Studien konnten 3 verschiedene Mutationen im Gen der im Golgi-Apparat
lokalisierten β-Galactosidase-α-2,3-sialinsäuretransferase 3 (ST3GAL3) als ursächlich für
schwere Formen nicht-syndromaler geistiger Behinderung (c.38C>A und c.1108G>T) und
West Syndrom (c.958G>C), einer epileptischen Enzephalopathie, identifiziert werden [3, 5]
Vorangegangene und eigene funktionale Untersuchungen zeigten, dass zwei der
Mutationsvarianten (c.958G>C und c.1108G>T) keine enzymatische Aktivität mehr besitzen
und alle eine gestörte subzellulare Lokalisation außerhalb des Golgi-Apparates aufweisen
[5]. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Ursachen die zum erblich bedingtem
West Syndrom infolge einer Punktmutation im ST3GAL3 Gen (c.958G>C; p.320A>P) führen.
Die untersuchte Patientin, leidet neben ihrer starken geistigen Behinderung an
epileptischen Anfällen, hauptsächlich des Flexortyps, die schon im frühkindlichen Alter
auftraten [3]. Da häufig verwendete Modellsysteme, wie z.B. die Maus, nur bedingt geeignet
sind die komplexen kognitiven Defekte abzubilden die zu geistiger Behinderung oder
Epilepsie führen [54], konnten bisher selten die Funktionszusammenhänge die den
Erkrankungen zu Grunde näher untersucht werden. Um die in vivo-Bedingungen in vitro
bestmöglich wiederspiegeln zu können wurde deshalb für diese Forschungsarbeiten ein
neues Modellsystem auf Basis patientenspezifischer induzierter pluripotenter Stammzellen
76 Diskussion
(iPS) generiert.
Fibroblasten der Patientin und einer gesunden Schwester konnten durch persistente
Integration und Expression einer Transkriptionskassette, die die vier Yamanaka
Reprogrammierungsfaktoren, OCT4, SOX2, KLF4 und c-MYC, und einen Reporterfarbstoff
enthielt, zu iPS reprogrammiert werden. Die Auswirkung der morphologischen, genetischen
und epigenetischen Veränderungen während der Reprogrammierung wurden mitttels
Immunfluoreszenzfärbungen (IFF), qPCR, Differenzierung, RNA-Sequenzierung, FPNI-PCR
und Array-CGH untersucht. Die Pluripotenz, also das Vermögen sich in alle drei Keimblätter
zu differenzieren, wurde durch den Expressionsnachweis der Pluripotenz assoziierten
Faktoren OCT3/4 und SSEA4 in der IFF bzw. zusätzlich LIN28a, NANOG, c-MYC und REX1
durch qPCR nachgewiesen. Darüber hinaus konnten beide Zelllinien zu kortikalen Neuronen
differenziert werden. Um die Fähigkeit der iPS zur Bildung von Zellen aller drei Kiemblätter,
ähnlich wie bei Teratoma Versuchen in Mäusen, nachzuweisen, wäre eine Differenzierung
zu Vertretern der anderen beiden Keimblätter, wie Cardiomyozyten und Leberzellen
sinnvoll. Genetische und epigenetische Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien können
durch unterschiedliches Ausgangsmaterial, den Reprogrammierungsprozess als auch der
Selektion während der Langzeitkultur entstehen. Für unsere anschließenden komparativen
Studien wurde deshalb die Vergleichbarkeit der beiden Zelllinien durch FPNI-PCR, Array-CGH
und RNA-Sequenzierungen untersucht. Mittels der FPNI-PCR konnten wir zeigen, dass durch
die Integration der Transkriptionskassetten kein offener Leserahmen betroffen war. Die
geringen Unterschiede im RNA-Expressionsprofil und die beinahe identischen Array-CGH
Ergebnisse zeigten uns, dass die Auswirkungen des Reprogrammierungsprozesses relativ
gering waren. Alle Ergebnisse deuten darauf hin, dass es nur geringe Unterschiede zwischen
den beiden Zelllinien gibt und sie deshalb als Alternative zu isogenen Kontrollen geeignet
sind. Darüber hinaus wäre eine Wiederholung der bisherigen Experimente mit zusätzlichen
Klonen der Zelllinien sinnvoll.
Da epileptische Anfälle häufig ihren Ursprung im kortikalen Bereich des Zerebrums finden
und auch das adulte humane Gehirn dort mit die höchste ST3GAL3 Expression zeigt, wurden
beide iPS Linien für weitere Experimente mehrfach zu kortikalen Zellen differenziert. Der
Vorteil des verwendeten Protokolls besteht darin, dass hierbei die Neurogenese in vivo auch
in vitro nach vollzogen wird. Die kortikale Identität der differenzierten Zellen, sowie eine
Erhöhung der ST3GAL3 Expression im Vergleich zu den iPS konnte mittels qPCR und IFF
Diskussion 77
Kortex assoziierter Marker validiert werden. Des weiteren zeigten tiefergehende RNA-
Sequenzierungen dieser Zellen, dass die Patientenzellen signifikant mehr Gene exprimieren,
die normalerweise während der Entwicklung von Zellen der Neuralleiste Richtung
Augenzellen exprimiert werden. Inwiefern diese Ergebnisse Folge der Mutation oder der
Differenzierungseffizienz sind, kann auf Grund fehlender Analysetiefe in der
Vergleichsliteratur nicht beurteilt werden. Da die Ergebnisse der IFF und qPCR, welche in der
Literatur verwendet wurden, ähnlich sind, gehen wir davon aus, dass die Linien für
vergleichende Untersuchungen geeignet sind. Für zukünftige Differenzierungen sollte man
trotzdem über die im verwendeten Protokoll empfohlene qPCR der Expression kortikaler
Gene hinaus auch die Expression der Gene anderer zerebraler Bereiche überprüfen und die
Ergebnisse ggf. mittels FACS Analysen bestätigen.
Funktionale Untersuchungen zeigten, dass Patientenzellen, nach 30 Tagen kortikaler
Differenzierung, ein deutlich verstärktes Adhäsionssverhalten im Vergleich zu den Zellen des
gesunden Geschwisterkindes aufweisen. Dieses Unterschied zeigten die Fibroblasten beider
Linien nicht.
Zur Erklärung dieser Beobachtung wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt: Der
Unterschied im adhäsiven Verhalten der kortikal differenzierten Zellen könnte (I) von einer
Verschiebung im Sialylierungsmuster aller Zellen ausgehen und/oder (II) durch eine
Verschiebung im Mengenanteil neuronaler Subpopulationen mit unterschiedlich adhäsiven
Verhalten entspringen.
Zur Überprüfung der ersten Hypothese wurden die Glycosylierungsepitope von
Ganzzellysaten kortikal differenzierter Zellen (nach 50 und 90 Tagen beider Linien) mittels
Lektinfärbungen untersucht. Hierbei konnten für die α-2,3-gebundenen Sialinsäurereste
(Produkt der ST3GAL3) keine Unterschiede festgestellt werden. Die Markierung der β-1,4
gebundenen Galactose, dem hauptsächlichen Reaktionspartner der ST3GAL3, zeigte jedoch
eine zusätzliche Bande um 70 kDa bei kortikalen Patientenzellen nach 50 und 90 Tagen
Differenzierung. Diese Bande deutet darauf hin, dass durch die fehlende ST3GAL3-Aktivität
ein konkretes Epitop unsialyliert verbleibt und das Enzym entgegen der bisherigen Meinung
eine Subtratspezifität aufweisen könnte.
Da es unzählige glycosylierte Adhäsionsmoleküle während der neuronale Entwicklung gibt
wurde zunächst der prominenteste Vertreter, das neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM),
auf korrekte Sialylierung in Patientenzellen und Zellen des gesunden Geschwisterkindes
78 Diskussion
nach 70 Tagen kortikaler Differenzierung überprüft. Die IFF des NCAM und seiner
polysialylierten Form zeigte jedoch keine Unterschiede. Um das Substrat der ST3GAL3,
welches die zusätzliche Bande hervorrufen könnte, näher eingrenzen zu können, wäre eine
Untersuchung des kompletten Sialoms mittels Massenspektrometrie beider Zelllinien
sinnvoll.
Zur Überprüfung der zweiten Hypothese wurde eine quantitative Bestimmung der
neuronalen Subpopulationen während der Neurogenese verfolgt. Während der kortikalen
Differenzierung in vivo und in vitro entstehen aus neuronalen Stammzellen die
verschiedenen kortikalen Projektionsneuronen von innen nach außen in einem stereotypen
zeitlichen Muster. Tatsächlich zeigten qualitative Immunfluoreszenz-basierte
Untersuchungen, dass die Menge der bis Tag 50 differenzierten TBR1-positiven CThPN der
untersten kortikalen Schicht bei der Patientin deutlich reduziert (2,28 fach) ist.
Veränderungen bei den TBR1-positiven CThPNs konnten bisher mit etlichen neuronalen
Entwicklungsstörungen, wie Autismus, und Epilepsie in Verbindung gebracht werden [225-
227]. In verschiedenen TBR1-defizienten Mausmodellen konnte gezeigt werden, dass die
kortikale Laminierung deutlich gestört war. Fokale kortikale Dysplasie I (FCD I) ist eine
häufige Ursache von generalisierter Epilepsie. Sie ist selten im MRT erkennbar und meistens
durch lokale Dyslaminierung charakterisiert [228-230]. Eine erneute Untersuchung der
Patientin mit einem hochauflösenden MRT könnte zeigen, ob hier eine unerkannte FCD I
vorliegt.
Darüber hinaus zeigten TBR1-defiziente Mäuse eine Erhöhung der Autismus2 und eine
Verringerung der Neurotensin Expression. Eine ähnliche Verringerung der Neurotensin
Expression konnte auch in vitro bei unserer Patientin beobachtet werden. Neurotensin zeigt
eine erhöhte Expression in autistischen Patienten [231] und während sowie nach einem
epileptischen Anfall in Ratten [232]. Interessanterweise zeigt eine glycosylierte Form des
Neurotransmitters eine antikonvulsive Wirkung im Rattenmodell. Um die Signifikanz der
Neurotensin Expression und anderer Gene beurteilen zu können, müsste von weiteren
biologischen Replikaten eine RNA-Sequenzierung gemacht werden.
TBR1-positive CThPN sollen sich aus intermediären Stammzellen (IPC; TBR2-positiv)
entwickeln [108], die durch die verringerte Expression adhäsiver Strukturen wie den
„Adherens Junctions“ charakterisiert sind [89, 100]. Es konnten allerdings keine qualitativen
Unterschiede zwischen Patienten-IPC und IPC des gesunden Geschwisterkindes
Diskussion 79
nachgewiesen werden. Dennoch könnte eine qualitative Reduktion des IPC-Pools das
unterschiedlich adhäsive Verhalten, als auch die verringerte Menge TBR1-positiver
Neuronen erklären und könnte anhand einer FACS Analyse überprüft werden. Ein weiterer
interessanter Ansatzpunkt ist die Bildung der IPC. Diese wird wahrscheinlich durch einen
sialylierten Notch-abhängigen Mechanismus gesteuert [208]. Die korrekte Sialylierung des
Notch-Rezeptors könnte mittels Immunopräzipitation und anschließender selektiver
Markierung der α-2,3-Sialinsäureepitope überprüft werden. Um die Dyslaminierung und die
verschiedenen Subpopulationen neuronaler Stammzellen in vitro besser untersuchen zu
können, wäre eine Differenzierung beider Zelllinien zu zerebralen Organoiden möglich.
In dieser Arbeit konnte erfolgreich ein neues patientenspezifisches iPSC Model für genetisch
bedingtes West Syndrom etabliert werden. Dieses Modell zeigte, dass kortikale
Patientenzellen durch den Verlust der ST3GAL3 Aktivität während der Neurogenes in vitro
eine signifikante Reduktion an TBR1-positiven chorticothalamischen Projektionsneuronen
aufweisen. Des Weiteren zeigte sich, dass die ST3GAL3 anscheinend eine noch unbekannte
Substratspezifität besitzt die bei ihrem Aktivitätsverlust eine Struktur von ca. 70 kDa
unsialyliert hinterlässt. Obwohl der Zusammenhang zwischen diesen beiden Ergebnissen
noch nicht geklärt ist, lässt sich vermuten, dass dies zu dem beobachteten erhöhten
Adhäsivverhalten der kortikalen Neuronen führt.
80 Material und Methoden
4. Material und Methoden
4.1 Nukleinsäurearbeiten
4.1.1 Die Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (PCR: Polymerase Chain Reaction) dient zur gezielten
Amplifikation von Oligo-Nukleotidsequenzen. Die Grundlage für eine solche Amplifikation
stellt zunächst chromosomale oder Plasmid-DNA dar, des weiteren werden noch
Oligonukleotidstarter (Primer) benötigt, welche den Sequenzen beider Enden des zu
amplifizierenden Bereichs entsprechen [233]. Zu diesem Ansatz kommen anschließend noch
die desoxy-Nukleosidtriphosphate (dNTPs) eine hitzestabile DNA-Polymerase und der
Reaktionspuffer hinzu. Die wichtigsten Schritte einer jeden PCR sind zunächst die
Denaturierung der beiden Doppelstränge (94 – 95 °C), gefolgt von der Anlagerung
(Annealing, 51 -65 °C) der Primer und der anschließenden Elongation dieser durch die
entsprechende DNA-Polymerase. Die weiteren Zyklen von Denaturierung – Annealing –
Elongation dienen der exponentiellen Amplifikation dieser Nukleotidsequenzen. Um die
Bedingungen für die jeweilige Reaktion zu optimieren, können noch Dimethylsulfoxid
(DMSO) oder Magnesium-Chlorid in unterschiedlicher Konzentration beigefügt werden
[234].
Die Reaktion wurde in zugeschnittenen PCR 96-Well Platten (0.2 ml Kavitäten), mit extra
dünnen Wänden für eine optimale Hitzeverteilung pipettiert und anschließend in einem der
folgenden Thermocyclern mit 96 Well Block nach folgendem Programm durchgeführt.
Benötigte Materialien
AmpliTaq Gold® DNA-Polymerase mit Puffer I Life Technologies N8080240
GoTaq® Hot Start Polymerase Promega M5001
SureCycler Agilent Biometra
Material und Methoden 81
Arbeitsanweisung
Reaktionsmix
H2O 7 µl
Fw Primer (10 µM) 1 µl
Rev Primer (10 µM) 1 µl
GOTaq Mix 10 µl
DNA 1 µl
Programm des Thermocyclers
94/95 °C 5 min
94/95 °C 30 sec
51-65 °C 30 sec 30x
72/73 °C 1 min
72/73 °C 5 min
15 °C ∞
4.1.2 Primerdesign
Oligonukleotidstarter, auch Primer genannt, sind kurze DNA Einzelstränge, die innerhalb
einer PCR für verschiedene Anforderungen eingesetzt werden. Die am häufigsten
verwendeten Primer binden an einer spezifischen Stelle komplementär zur Matrize und an
ihrer freien 3‘ OH Gruppe kann die DNA Polymerase mit der Synthese beginnen. Sie
definieren so den Start und das Ende eines Amplifikats. Sie sollten im Schnitt ca. 20
Basenpaare (bp) lang sein, der GC Gehalt sollte nicht über 50 % liegen und die
Schmelztemperatur um die 60 °C [235].
Für das Primerdesign wurde die Primer3 Software [236] oder die Primer-BLAST Software von
NCBI verwendet. Hierbei wurde der zu amplifizierende Bereich entweder als FASTA Sequenz
oder über die RefSeq ID geladen und definiert.
Für die Amplifikation von cDNA Sequenzen bei der quantitativen PCR wurde darauf
geachtet, nur Intron überspannende Primer auszuwählen und die Größe der Amplifikate
zwischen 50 und 90 bp zu halten. Primer für eine sog. „Quick Change“ Mutagenese (siehe
4.2.7) wurden manuell ausgesucht und anschließend in einem der beiden Software
82 Material und Methoden
Werkzeuge (s.o.) auf GC-Gehalt, Schmelztemperatur und Sekundärstrukturen überprüft. Um
trotz des Missprimings eine stabile Anlagerung zu gewährleisten, sind diese Primer ca. 30 bp
lang.
4.1.3 Verwendete Primer
Tabelle 4.1 Primerliste
Target Oligo Name Sequenz Län
ge
Verwendung
ST3GAL3 g_St3gal3_fw CTCTAGGGAGCTTGGCTGAAG 21 Sanger Sequenzierung
ST3GAL3 g_St3gal3_rev GAGGGCACGTAGGATGCTTG 20 Sanger Sequenzierung
ST3GAL3 ST3GAL3_fw CAGTACGAGCGCGATTCTCT 20 qPCR
ST3GAL3 ST3GAL3_rev AATGAGGCTGAGTGCTGGTC 20 qPCR
ST3GAL3 St3 Insert Rev AGTGATGACGCGAGCTTTCA 20 Sanger Sequenzierung
ST3GAL3 QCc958G>CFw GACGAGGTGGCAGTCCCAGGATT
TGGCTATG
31 Quick Change
ST3GAL3 QCc958G>Crev CATAGCCAAATCCTGGGACTGCC
ACCTCGTC
31 Quick Change
GAPDH GAPDH_QRT2_
u
GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA 20 qPCR/Standard
GAPDH GAPDH_QRT2_
l
AACCATGTAGTTGAGGTCAATGA
A
24 qPCR/Standard
ACTB ACTB_QRT2_u CCCAGCACAATGAAGATCAA 20 qPCR/Standard
ACTB ACTB_QRT2_l ATCTGCTGGAAGGTGGACAG 20 qPCR/Standard
POU5F1 OCT4_fw AGAAGGAGAAGCUGGAGCAA 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
POU5F1 OCT4_rev CTTCCCAAATAGAACCCCCA 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
NANOG SOX2_fw GGACACTGGCTGAATCCTTCC 21 qPCR/Pluripotenzmark
er
NANOG SOX2_rev CTCGCTGATTAGGCTCCAACC 21 qPCR/Pluripotenzmark
Material und Methoden 83
er
SOX2 LIN28_fw ATGGAGAAAACCCGGTACGC 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
SOX2 LIN28_rev TTTTGCGTGAGTGTGGATGG 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
LIN28 NANOG_fw TTGAGGAGCAGGCAGAGTGG 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
LIN28 NANOG_rev TGCATTTGGACAGAGCATGG 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
REX1 REX1_fw AATAGCTGACCACCAGCACA 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
REX1 REX1_rev AAACACCTGCTGGACTGTGA 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
PODXL PODXL_fw ACAGCAGCATCAACTACCCA 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
PODXL PODXL_rev CTTCTCACTCTGTGTCTGTG 20 qPCR/Pluripotenzmark
er
EMX1 Emx1-Fw CTCTCCGAGACGCAGGTGAA 20 qPCR/Kortex Marker
EMX1 Emx1-Rev GTTGATGTGATGGGAGCCCT 20 qPCR/Kortex Marker
PAX6 Pax6-Fw GTGTCCAACGGATGTGTGAG 20 qPCR/Kortex Marker
PAX6 Pax6-Rev CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC 20 qPCR/Kortex Marker
FOXG1 Foxg1-Fw AGGAGGGCGAGAAGAAGAAC 20 qPCR/Kortex Marker
FOXG1 Foxg1-Rev TCACGAAGCACTTGTTGAGG 20 qPCR/Kortex Marker
SOX1 Sox1-Fw TACAGCCCCATCTCCAACTC 20 qPCR/Kortex Marker
SOX1 Sox1-Rev GCTCCGACTTCACCAGAGAG 20 qPCR/Kortex Marker
OTX1 Otx1-Fw AGCCACTCCGACAAGGTTGG 20 qPCR/Kortex Marker
OTX1 Otx1-Rev ATGCCGTATGGGGGTTGTTT 20 qPCR/Kortex Marker
84 Material und Methoden
4.1.4 Nukleinsäureisolation
In dieser Arbeit wurden verschiedenen Analysemethoden angewendet, für die hochreine
und intakte DNA und RNA benötigt wurden. Prinzipiell erfolgt die Isolation von
Nukleinsäuren immer in diesen vier Schritten: Zelllyse – Trennung – Präzipitation –
Reinigung. In den nachfolgenden Protokollen wurden diese Schritte mit verschiedene
Agenzien und Techniken durchgeführt. Die Zelllyse wird je nach Zelllinien und Anwendung
mit einem Lysepuffer, der Detergenzien oder Phenol enthält, durchgeführt. Die Abfolge von
Präzipitation und Trennung der Komponenten kann dabei ebenfalls variieren. So werden bei
der Kieselgel-Säulen Isolation die Nukleinsäuren zunächst voneinander getrennt und erst
später gefällt, bei der Phenol Chloroform Isolation werden die Komponenten zunächst in
verschiedenen Phasen voneinander getrennt und anschließend gefällt. Die Präzipitation und
Reinigung erfolgt immer über die Zugabe von Ethanol oder Isopropanol, unter Gegenwart
von Salzen.
4.1.4.1 Isolation genomischer DNA über Adsorption an Kieselgel
Der wichtigste Schritt dieser Isolationsmethode ist die selektive Bindung von DNA an eine
Kieselgel Festphase. Kieselgel ist ein stark hygroskopisches, amorphes Siliciumdioxid. Die
Bindung der DNA erfolgt über Wassestoffbrückenbindungen, wenn die Salzkonzentration
und der pH Wert optimal eingestellt wurden.
Abbildung 4.1: DNA Adsorption an einer Kieselgel Festphase
Hierfür werden die Zellen zunächst unter Zugabe von Detergenzien und Proteinase K lysiert.
Anschließend wird der Salzgehalt und der pH-Wert, durch die Zugabe von chaotropen Salzen
sowie Ethanol oder Isopropanol, für die Bindung von DNA optimiert. Nach der selektiven
Bindung von DNA an der Festphase können alle anderen Komponenten von der Phase
abgewaschen werden, so dass abschließend reine DNA von der Phase eluiert werden kann.
Material und Methoden 85
Benötigte Materialien
Nucleo Spin Tissue Marcherey-Nagel # 740952
Ethanol 100 %
Thermoschüttler (70 °C)
Bis zu 107 Zellen können pro Ansatz verarbeitet werden; jede Kieselgelsäule kann bis zu 60
µg DNA binden.
Arbeitsanweisung
+200 µl Puffer T1 + 25 µl Proteinase K + 200 µl Puffer B3 -> 15‘ 70 °C
Thermoschüttler
+ 210 µl EtOH 100 % -> vortexen
Je Probe eine Kieselgelsäule in ein Röhrchen setzen
Gesamte Probe auf die Säule geben -> 1‘ 11.000 g
Durchfluss verwerfen
+ 500 µl Waschpuffer BW -> 1‘ 11.000 g
Durchfluss verwerfen
+ 600 µl Waschpuffer B5 -> 1‘ 11.000 g
Durchfluss verwerfen -> 1‘ 11.000 g
Kieselgelsäule in ein beschriftetes 1.5 ml Eppendorf Gefäß setzen
+ 50 µl vorgewärmten Puffer BE (70 °C) -> 1‘ RT -> 1‘ 11.000
g
4.1.4.2 Präparation genomischer DNA mittels TriZOL
Diese Präparationsmethode wurde gewählt, wenn aus derselben Probe gleichzeitig RNA und
Protein isoliert werden sollte. Bei dieser Technik werden die Zellen mit TriZOL, einer
käuflichen Mischung aus Guanidinumthiocyanat Salzen und Phenol (Invitrogen, # 15596-
018)), lysiert und anschließend nach Zugabe von Chloroform eine Phasentrennung erzeugt.
In der oberen, wässrigen Phase (blau) befindet sich dann die gesamt RNA, in der milchigen
Interphase (weiß) die DNA und in der unteren, organischen Phase (rot) die Proteine [237].
86 Material und Methoden
Über eine sequentielle Trennung und Fällung dieser drei Komponenten können sie so
simultan aus einer Probe gewonnen werden.
Abbildung 4.2 Phasentrennung TriZOL Aufreinigung
Benötigte Materialien
TriZol Invitrogen # 15596-018
EtOH 100 % und 75 %
Chloroform
0,1 M NaCitrat/10 % EtOH
8 mM NaOH
Arbeitsanweisung
1ml TriZOL pro 10 cm2 oder 5-10 x 106 Säuger Zellen
Überstand (ÜS) absaugen; 1x mit 1x PBS waschen
+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben, mit Zellschaber abkratzen, durch mehrmaliges auf-
und abpipettieren homogenisieren (je nach Zelldichte Menge anpassen)
Hier Einfrierschritt bei -20 °C möglich
TriZol Pellet auf Eis auftauen lassen -> 15’ bei RT
+ 0,2 ml Chloroform pro 1ml TriZol -> 15“ schütteln
Falls notw. in 2 ml Gefäß überführen -> 3’ bei RT -> 15’ 12.000 G
Abbildung 4.3 DNA Phase der TriZOL Aufreinigung
Obere wässrige Phase in neues Gefäß überführen -> RNA Isolierung
+ 0,3 ml 100 % EtOH pro ml TriZol invertieren -> 3‘ RT -> 5‘ 2000 g 4°C
Material und Methoden 87
Organische Phase oberhalb des DNA Pellets
abnehmen und in neues 1,5 ml Gefäß überführen -> Protein Isolation
+ 1 ml 0.1 M NaCitrat/10 % EtOH pro ml TriZoL -> 30’RT -> 5‘ 2000g 4 °C
+ 1 ml 0.1 M NaCitrat/10 % EtOH pro ml TriZoL -> 30‘RT -> 5‘ 2000g 4 °C
Jeweils Überstand verwerfen
+ 1.5 – 2 ml 75 % EtOH pro ml TriZol -> 20‘RT -> 5‘ 2000g 4°C
Überstand verwerfen Pellet Lufttrocknen -> 5 – 15‘
In 8 mM NaOH resuspendieren
Lagerung bei -5 bis -20 °C
4.1.4.3 Gesamt-RNA
Während der Isolation von Gesamt-RNA aus Säugerzellen kommt es häufig zur Degradation
der RNA durch in der Zelle und/oder der Umwelt vorhandene RNAsen. Um möglichst intakte
RNA zu isolieren wurde deshalb eine Phenol-Chloroform basierte Exktraktionsmethode
gewählt. Die dabei verwendeten Salze inhibieren die RNAsen und durch die anschließende
Phasentrennung mittels Chloroform Zugabe können diese dann nahezu vollständig von der
RNA separiert werden [237].
Gesamt-RNA Präparation mittels TriZOL
Benötigte Materialien
TriZol Invitrogen # 15596-018
Ethanol 100 % und 75 %
Chloroform
0.1 M NaCitrat/10% EtOH
8 mM NaOH
1ml TriZOL pro 10 cm2 oder 5-10 x 106 Säuger Zellen
88 Material und Methoden
Arbeitsanweisung
ÜS absaugen; 1x mit 1xPBS waschen
+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben -> 15’ bei RT
Lysierte Zellen durch mehrmaliges auf- und abpipettieren homogenisieren (je nach
Zelldichte Menge anpassen) und in 2 ml Gefäß überführen
Hier Einfrierschritt bei -20 °C möglich
TriZol Pellet auf Eis auftauen lassen -> 15’ bei RT
+ 0,2 ml Chloroform pro 1ml TriZol -> 15“ schütteln
Falls notw. in 2 ml Gefäß überführen -> 3’ bei RT -> 15’ 12.000 g
4°C
Abbildung 4.4: RNA Phase TriZOL Aufreinigung
Obere, wässrige Phase in neues Gefäß überführen
+ 0,5 ml Isopropanol / ml TriZOL invertieren -> 10‘ RT -> 10‘ 12.000 g 4 °C
Überstand vorsichtig abnehmen (RNA pelletiert)
+ 1ml 75 % EtOH / ml TriZOL vortexen -> 5‘ 5000 g
Überstand komplett abnehmen
Pellet lufttrocknen
RNA in RNAse freiem Wasser resuspendieren
TriSpin RNA Präparation
Um gesamt RNA aus kleinen Proben möglichst verlustfrei und rein zu isolieren, wurde eine
kombinierte Methode aus TriZOL und Kieselgel-Säulen angewendet [238].
Benötigte Materialien
TriZol Invitrogen # 15596-018
Absolutely RNA Miniprep Kit Agilent # 400800
Chloroform
Material und Methoden 89
Ethanol 70 %
Arbeitsanweisung
ÜS absaugen; 1x mit 1x PBS waschen
+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben -> 15’ bei RT
Lysierte Zellen durch mehrmaliges auf- und abpipettieren homogenisieren (je nach
Zelldichte Menge anpassen) und in 2 ml Gefäß überführen
Hier Einfrierschritt bei -20 °C möglich
TriZol Pellet auf Eis auftauen lassen -> 15’ bei RT
+ 0,2 ml Chloroform pro 1ml TriZol -> 15“ schütteln
Falls notw. in 2 ml Gefäß überführen -> 3’ bei RT -> 15’ 12.000 G
Abbildung 4.5: RNA Phase TriZOL Aufreinigung
Obere, wässrige Phase in neues Gefäß überführen
Organische Phase für die Isolierung von DNA und Protein verwendbar
+ 1:1 70 % EtOH -> 2x 5“ vortexen
≤ 700 µl auf Säule geben -> 30-60“ 12.000 G
Durchfluss verwerfen
(Bei Proben >700 µl Schritt 9 und 10 wiederholen)
DNAse Behandlung für RT-PCR Anwendungen:
o + 600 µl Low-Salt Waschpuffer -> 30-60“ 12.000 G
o Durchfluss verwerfen -> 2’ 12.000 G
o DNAse Mix vorbereiten: 50 µl DNAse Puffer + 5 µl RNAse freier DNAse
o DNAse Mix direkt auf die Membran geben -> 15’ 37 °C
+ 600 µl High-Salt Waschpuffer > 30-60“ 12.000 G
Durchfluss verwerfen
+ 600 µl Low-Salt Waschpuffer -> 30-60“ 12.000 G
90 Material und Methoden
Durchfluss verwerfen
+ 300 µl Low-Salt Waschpuffer -> 2’ 12.000 G
Säule in neues RNAse freies 1,5 ml Gefäß
+ 30-100 µl Elutionspuffer (60°C) -> 2‘ RT -> 1‘ 12.000 G
Lagerung bei -20 °C für bis zu 1 Monat
Langzeitlagerung -80 °C
4.1.5 Gelelektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren
In der Gelektrophorese macht man sich die unterschiedliche Ionenbeweglichkeit von
Nukleinsäuremolekülen in einem elektrischen Feld zunutze, um diese nach ihrer Größe und
Ladung aufzutrennen. Als Matrix wird oft ein Agarosegel verwendet. Agarose ist ein
Polysaccharid aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose, welches hauptsächlich aus
Rotalgen gewonnen wird. In TBE gelöst bildet es ein gelartiges, negativ geladenes Polymer.
Je höher die Agarosekonzentration ist, desto kleiner sind die Poren des Gels. Die
Wanderungsgeschwindigkeit der unterschiedlichen Nukleinsäuremoleküle ist somit von der
Länge, der Ladung und der Sekundärstruktur des Moleküls abhängig. Um die Nukleinsäuren
nach der Gelelektrophorese im Gel sichtbar machen zu können, werden ihnen der
interkalierende Farbstoff Ethidiumbromid zugesetzt. Ethidiumbromid verändert durch die
Bindung an Nukleinsäuren sein Absorptionsspektrum und wird so unter UV-Licht sichtbar.
Als Größenstandard wird eine 1 kb oder 100 bp Leiter verwendet.
Agarosekonzentration Auftrennungsbereich
0,8 800 – 12.000
1,5 200 – 4000
2,0 50 – 2000
Benötigte Materialien
Agarose Biozym 850094
1x TBE-Puffer
Ethidiumbromid Roth HP47.1
Material und Methoden 91
Ladepuffer Fermentas R0611
Leiter 100 bp ThermoFisher SM0241
1kb DNA Ladder NEB N3232S
Gelektrophoresekammer
Gelkammer
Kamm
10x TBE Puffer
TRIS 121.1 g 1 M
Borsäure 61.8 g 1 M
EDTA (Dinatrium Salz) 7.4 g 0.02 M
Mit RNase freiem Wasser zubereiten. Für 1x TBE 100 ml auf 1 L verdünnen. Bis zu 6 Monate
bei RT lagerbar.
Arbeitsanweisung
Benötigte Menge Agarose einwiegen und in entsprechendem Volumen TBE-Puffer in
der Mikrowelle aufkochen, bis vollständig gelöst
Mehrmals zwischendurch schwenken, um Klumpen und Siedeverzug zu verhindern.
1 Tropfen Ethidiumbromid pro 100 ml Gellösung zugeben
Kurz abkühlen lassen und in vorbereitete Gelkammer mit Kamm eingießen
Nach ca. 30 Minuten sollte das Gel fest geworden sein; Kamm entfernen
Proben 6:1 mit Ladepuffer mischen und in die einzelnen Taschen pipettieren
In der ersten Spur 3 µl einer passenden Leiter pipettieren
In der Regel verwendet man eine Spannung von 5 Volt/cm Gellänge; diese sollte aber
an die jeweilige Anwendung angepasst werden
Detektion unter UV-Licht
4.1.6 Nukleinsäure Quantifizierung
Für nachfolgende Anwendungen war es meist notwendig, sowohl die Menge die Reinheit als
auch Unversehrtheit der isolierten Nukleinsäuren zu bestimmen. In dieser Arbeit wurden
92 Material und Methoden
dafür fluorometrische Messungen genutzt. Hierbei wurden zur Probe jeweils für DNA oder
RNA spezifische, interkalierende, fluoreszierende Farbstoffe zugegeben und anschließend
entweder im Qubit Fluorometer oder auf einem BioAnalyzer Chip gemessen. Die Menge
wurde dann anhand einer Standardreihe berechnet. Die Messung im Qubit wurde vor allem
für die Untersuchung von genomischer DNA bevorzugt. Der Vorteil ist, dass man die
Nukleinsäuren relativ störungsfrei auch bei niedrigen Konzentrationen messen kann, Der
Nachteil ist, dass man keine Aussage über den Reinheitsgrad der Probe erhält. Für die
Messung von DNA Fragmenten aus PCRs und RNAs bietet eine elektrophoretische Analyse
mit einem BioAnalyzer Kit mehr Vorteile. Bei dieser Lab-On-a-Chip Methode werden
mikrokapillare Chips verwendet, über die mehrere, vorher mit fluoreszierenden Farbstoffen
gefärbte Proben eine Gelelektrophorese durchlaufen können. Innerhalb des Gerätes können
dann die nach Ladung und Größe aufgetrennten Nukleinsäurefraktionen über eine
laserinduzierte Fluoreszenz gemessen werden. Die 2100 expert Software rechnet
anschließend die Fluoreszenzintensität gegen die Migrationszeit auf und erstellt so ein
Elektropherogramm. Über die Peakflächen der internen Standards und die Peakflächen der
gemessenen Nukleinsäuren wurde anschließend deren Menge berechnet. Für RNA bietet
die Messung mit dem BioAnalyzer den Vorteil, dass die „RNA integrity number“ berechnet
werden kann. Hierbei wird die gesamt Peakfläche der RNA über ein logarithmisches
Regressionsmodel mit den zu erwartenden Peakflächen der intakten 28S und 18S
ribosomalen RNA verglichen. Die Werte können zwischen 10 für vollkommen intakte RNA
und 1 für vollkommen degradierte RNA liegen [239].
4.1.6.1 Qubit Analysen
Benötigte Materialien
Qubit® dsDNA BR Assay Kit Life Technologies Q32850
Qubit® dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32851
Qubit® RNA HS Assay Kit Life Technoligies Q32852
Qubit® Protein Assay Kit Life Technoligies Q33211
Qubit® assay Gefäß Life Technologies Q32856
Material und Methoden 93
Arbeitsanweisung
Mastermix vorbereiten: n x 199 µl Qubit Puffer + n x 1 µl Qubit reagent
n x Assay Gefäß beschriften 1 – 10 µl Probe vorlegen
auf 200 µl mit Mastermix auffüllen
kurz vortexen und mit der Tischzentrifuge abzentrifugieren -> 2-20‘ RT
Im Qubit messen
4.1.6.2 BioAnalyzer Messungen
Benötigte Materialien
RNA 6000 Nano Kit Agilent 5067- 1511
RNA 6000 Pico Kit Agilent 5067- 1513
Small RNA Kit Agilent 5067- 1548
Chip priming station Agilent 5065- 4401
IKA vortex mixer
RNaseZAP® Ambion, Inc. 9780
RNase-Free Water Ambion, Inc. AM9938
Microzentrifuge
Heizblock oder Wasserbad
Arbeitsanweisung
Beispielhaft für RNA 6000 Nano Kit
Die Anweisungen für die anderen Kits variieren hauptsächlich in den Komponenten.
Chip Priming Station vorbereiten
Spritze austauschen:
o Alte Spritze aus dem Deckel heraus schrauben
o Alte Spritze aus dem Clip entlassen und verwerfen
o Plastickkappe der neuen Spritze entfernen und in den Clip einsetzen
o In das Loch des "Luer lock" einführen und festschrauben
Basisplatte einstellen
o Verriegelung öffnen.
94 Material und Methoden
o Mit Schraubenzieher Schraube auf Unterseite lösen.
o Platte anheben und an Position C wieder einsetzen; Schraube erneut
festziehen
Spritzenclip einstellen:
o den Cliphebel öffnen und bis zur obersten Position laufen lassen
RNA Leiter vorbereiten
o Leiter abzentrifugieren und in RNase freies Gefäß geben
o Temperaturdenaturierung für 2 min bei 70 °C.
o Sofort auf Eis kühlen
o Leiter aliquotieren in 0.5 mL RNase- freien Gefäß
o Aliquots bei - 70 °C lagern
o Wiederholte Temperaturdenaturierung
o Vor der Benutzung Leiter auf Eis auftauen
Gel vorbereiten
o 550 μL RNA gel matrix (red) in einen Spinfilter
o 1500 g ± 20 % für 10 min bei RT
o 65 μL gefilterte Gelaliquots in 0.5 mL RNase- freie Microzentrifugengefäß.
Filtriertes Gel in 4 Wochen aufbrauchen. Lagerung bei 4 °C.
Gel-Dye Mix vorbereiten
o RNA Farbkonzentrat (blau) auf RT für 30 min.
o RNA Farbkonzentrat (blau) für 10 s vortexen, abzentrifugieren und 1 μL des
Farbstoffes zu 65 μL filtriertes Gelaliquot.
o Lösung gut vortexen, bei 13000 g für 10 min RT zentrifugieren; Vorbereiteten
Gel-Farb-Mix innerhalb eines Tages verbrauchen.
Gel-Dye Mix beladen
o Neuen RNA chip in die Chip priming Station legen.
o 9 μL des gel- Gel-Dye Mix in das markierte Well.
o Kolben bei 1 mL schließen der Chippriming Station.
Material und Methoden 95
o Kolben runter drücken bis er vom Clip gehalten wird.
o 30 s warten, dann den Chip entlassen.
o 5 s warten. Langsam den Kolben auf 1 mL Position zurück führen.
o Öffnen der Chippriming Station + 9 μL des Gel-Dye Mix in das markierte Well.
o Restlichen Gel-Dye Mix verwerfen
Marker laden
o 5 μL des RNA Marker (grün) in alle 12 Proben Wells und in das markierte Well
Laden der Leiter und der Proben
o 1 μL der präparierten Leiter in das markierte Well.
o 1 μL der Probe in jedes der 12 Proben Wells. 1 μL des RNA Markers (grün) in
jedes unbenutzte Proben Well.
o Chip horizontal in den IKA-Vortexer und für 1 min bei 2400 rpm vortexen.
o Chip auf dem Agilent 2100 Bioanalyzer Instrument innerhalb 5 min laufen
lassen
4.1.7 cDNA Synthese
Für quantitative RNA Messungen muss die vorhandene RNA in doppelsträngige cDNA
(„complementary DNA“) umgeschrieben werden. Hierfür wurde eine reverse Transkriptase
genutzt. Die reverse Transkription von Gesamt-mRNA läuft ähnlich einer herkömmlichen
PCR ab. Anstatt der spezifischen Primer können hier Oligo(dT)18Primer oder sog. Random-
Hexamer-Primer verwendet werden. Oligo(dT)18Primer binden spezifisch an den Poly-A
Schwanz von mRNA und bilden mit ihrem freien 3‘ OH Ende den Anfangspunkt für die
reverse Transkription. Random-Hexamer-Primer liegen in einer Mischung aus Nukleotid-
Hexameren mit jeweils zufälliger Sequenzzusammensetzung vor. Sie bilden ebenfalls mit
ihrem freien 3‘ OH Ende den Start einer cDNA Synthese, binden aber im Gegensatz zu den
Oligo(dt) 18 Primern zufällig überall. Der Vorteil ist, dass man so auch Poly-A-Schwanz-freie
RNAs, wie teilweise degradierte RNA, microRNA oder ribosomale RNA amplifizieren kann.
Benötigte Materialien
96 Material und Methoden
Random Hexamer Primer Promega C118A
10 mM dNTPs
DEPC Wasser Ambion, Inc. AM9938
5x RT-Puffer Invitrogen Y02331
25 mM MgCl2 Promega A351B
0,1 M DTT Invitrogen Y00147
RNAse out NEB M0314L
Superscript III Invitrogen 56575
Arbeitsanweisung
Reaktions Mix Synthese Mix
≤5 µg RNA (max. 8 µl)
1 µl Random Primer
1 µl 10 mM dNTPs
Auf 8 µl mit DEPC Wasser auffüllen
5x RT Puffer 4 µl
25 mM MgCl2 4 µl
0,1 M DTT 2 µl
RNAse out 1 µl
SS III 1 µl
Reaktionsmix 5‘ 65 °C → 1‘ Eis
+ 10 µl Synthese Mix
10’ 25 °C
50’ 50 °C
5’ 75°C
Bei -20 °C lagern
250 ng RNA eingesetzt -> 12.5 ng/µl (Proben < 32 ng/µl RNA nicht für q/dPCR sinnvoll)
4.1.8 Quantitative PCR Methoden
Für die Quantifizierung von spezifischen mRNAs kann man verschiedene Methoden nutzen.
Für diese Arbeiten wurde einerseits die quantitative Echtzeit-PCR (RT-PCR), andererseits die
digitale PCR genutzt. Beide Techniken beruhen auf einer herkömmlichen PCR und können
Material und Methoden 97
nur mit cDNAs durchgeführt werden, weshalb eine cDNA-Synthese vorausgehen muss.
Während bei der quantitativen Echtzeit-PCR über einen bestimmten Zeitraum eine
fluorometrische Messung der gebildeten DNA-Amplifikate abläuft, wird bei der digital PCR
eine Endzeitpunktsmessung vorgenommen.
4.1.8.1 Light Cycler 480 SYBR Green Roche
Die Quantitative Echtzeit-PCR misst die Zunahme der Fluoreszenz über die Zeit. An den
daraus aufgetragenen sygmoidalen Kurven kann der Zeitpunkt ermittelt werden, zu dem die
Kurve eine definierte Fluoreszenzintensität überschreitet. Diese Punkte werden auch
Crossing Points/time, kurz Cp oder Ct Werte, genannt.
Abbildung 4.6: Typische Fluoreszenzkurven einer quantitativen PCR
Für eine relative Quantifizierung werden bei jeder Probe zusätzlich zur Expression der
Zielgene die Expression von Referenzgenen gemessen. Diese Referenzgene werden für die
interne Standardisierung der Proben genutzt, wobei man davon ausgeht, dass sie in jeder
Probe ungefähr gleich stark exprimiert werden. Aus den Ct Werten des Zielgens und dem
Durchschnitts Ct aller Ct Werte der Referenzgene kann so der ΔCt Wert gebildet werden.
Der relative Expressionsunterschied (Ratio) zwischen Probe und Kontrolle berechnet sich als
, wobei sich der delta-delta-Ct Wert aus der Subtraktion der ∆Ct Werte von Probe und
Kontrolle ergibt [240].
Benötigte Materialien
98 Material und Methoden
Ligth Cycler® 480 DNA SYBR Green I Master Roche 04707516001
Target Primer Fw und Rev
Referenz Primer Fw und Rev
Ligth Cycler® 480 Roche
Light Cycler Platten
PCR Klebefolien Thermo Fisher AB-0558
Material und Methoden 99
Arbeitsanweisung
10 µl Roche SYBR Green I Master
0,4 µl Forward Primer (10 µM → 200 nM Endkonzentration)
0,4 µl Reverse Primer (10 µM → 200 nM Endkonzentration)
≤ 20 ng/20 µl Reaktion cDNA
Auf 20 µl mit DEPC Wasser auffüllen
Mit Folie abkleben; Bis zur Reaktion auf Eis inkubieren
Programm
Program Name Cycles Analysis Mode
Pre-Incubation 1 None
Amplification 45 Quantification
Melting Curve 1 Melting Curves
Cooling 1 None
Program Name Target [°C] Acquisition mode Hold [mm:ss] Ramp Rate [°C/sec]
Pre Incubation 95 None 03:00 4.8
Amplification
95 None 00:10 4.8
55 None 00:20 2.5
72 SINGLE 00:01 4.8
Melting Curve
95 None 00:05 -
65 None 01:00 -
98 Continous 5-10 Acq. /°C -
Cooling 40 None 0:10 2.0
4.1.8.2 Quant Studio 3D
Bei der digitalen PCR läuft wie bei der q-RT-PCR eine herkömmliche PCR ab. Der Unterschied
ist, dass der gesamte Reaktionsansatz auf einem Chip verteilt wird, der ca. 10.000 Kavitäten
umfasst. Durch eine vorherige Grenzverdünnung des Ausgangsmaterials sollen pro Kavität
ca. 0,8 Reaktionen ablaufen. Am Ende der PCR wird aus jeder Kavität entweder ein positives
100 Material und Methoden
oder ein negatives Signal detektiert. Durch die Annahme, dass die Matrizen einer Poisson-
Verteilung folgend, verteilt wurden, kann direkt von der Anzahl der positiven Kavitäten auf
die Anzahl der Ausgangsmatrizen geschlossen werden.
Benötigte Materialien
QuantStudio™ 3D Digital PCR Chips Life Technologies 4485507
QuantStudio™ 3D Digital PCR Master Mix Life Technologies 4482710
QuantStudio™ 3D Digital PCR UV Sealing Kit Life Technologies 4488475
UPL Sonden
Taq-Man Assays
GeneAmp®PCR System 9700
Chip Loader Life Technologies
Quant Studio 3D Life Technologies
Arbeitsanweisung
1. PCR-Ansatz für 1 Probe und 1 Chip
(UPL-Sonden)
Material Volumen Stock Endkonzentration
Digital PCR MasterMix 2x 9,0 2x 1x
Vorwärtsprimer 1,8 10 pM 1 pM
Rückwärtsprimer 1,8 10 pM 1 pM
UPL (Sonde) 1,8 2,5 pM 0,2 pM
DNA 1,8 10 ng/μl 1 ng/μl
Aqua dest. 1,8 - -
Gesamtvolumen
(für einen Chip)
18 - -
(TaqMan Assay)
Material und Methoden 101
Material Volumen Stock Endkonzentration
Digital PCR MasterMix (2x) 9 2x 1x
TaqMan Assay (20x) 0,9 20x 1x
(c)DNA 1,8 10 ng/μl 1 ng/μl
Aqua dest. 6,3 - -
Gesamtvolumen
(für einen Chip)
18 - -
Vortexen (low-speed) oder auf- und abpipettieren, kurz abzentrifugieren
2. Chip beladen
PCR-Ansatz bei Raumtemperatur inkubieren (~5-10 Minuten)
ChipLoader starten (ChipLoader-Arm muss in Ausgangsstellung sein!)
ChipLoader-Arm in
Ausgangsstellung
(180°-Winkel)
Bereitstellung folgender Materialien:
Chip Chip-Deckel Loading-Blade
ImmersionFluid-Spritze* ** ChipSealant-Spritze** UV-Pen/ -Station
Abbildung 4.7 „Quant Studio TM
3D Digital PCR System“ Betriebsanleitung, life Technologies, Carlsbad, CA, USA entlehnt
* Wird eine neue Spritze verwendet, muss der Kolben kurz um ein oder zwei mm
zurückgezogen werden, um mögliche Blockaden zu lösen.
102 Material und Methoden
** Verpackung aufbewahren! Die Spritzen werden bei Nichtgebrauch darin bei
Raumtemperatur gelagert.
Wenn der ChipLoader betriebsbereit ist (grünes Dauer-
leuchten), den Chip in die Chiphalterung und die
Loading-Blade einspannen; den roten Schutzfilm vom
Chip-Deckel entfernen und den Deckel in die Halterung
am ChipLoader-Arm einspannen; dazu den Knopf nach
vorne drücken und wieder loslassen, sobald der Chip
eingelegt ist.
Den vorbereiteten PCR-Ansatz kurz vortexen und ab-
zentrifugieren; 14,5 μl PCR-Ansatz in den Sample-
LoadingPort der LoadingBlade pipettieren. Leichter,
wenn man die Blade in der Hand hält. Aufpassen! Nicht
gegen die Rückwand drücken. Versatzfrei in den ChipLoader einspannen und anschließend
den schwarzen Button des ChipLoaders betätigen, um den Beladungsvorgang zu starten
(Lampe blinkt dann grün).
Sofort nachdem der Beladungsvorgang abgeschlossen ist, den Chip mit ausreichend Tropfen
ImmersionFluid bedecken. Die gesamte schwarze Fläche sollte bedeckt sein! (ggf.
danebenge-gangenes mit einem mit Isopropanol-getränkten Tuch abwischen)
Den ChipLoader Arm um 180 ° rotieren und ca. 15s auf den Chip pressen. Danach mit
gedrücktem Release-Button den Arm wieder in die Ausgangsstellung bringen.
Alle Seiten des Chipdeckels kräftig und gleichmäßig mit der Hand andrücken, um
nachfolgende Verdunstung zu vermeiden.
Material und Methoden 103
Den Chip an den Seitenkanten fassen, aus der
Chiphalterung entnehmen und (mit der Öffnung nach
oben) im 45° Winkel halten. Dann den Chip mit
ImmersionFluid auffüllen, bis nur noch eine 2-3mm große
Luftblase im Chip ist.
Die Chip-Öffnung mit dem ChipSealant versiegeln.
Dazu ChipSealant mit der Spritze auf die Öffnung geben.
Den Chip anschließend in die UV-Curing Station des
ChipLoaders schieben und den Chip solange
hineindrücken, bis das UV-Licht aufleuchtet und wieder
erlischt (~15 Sek). Der Chip darf dabei das Dach der UV-
Curing Station nicht berühren.
Dann wird der Chip so in die „UV-Station“ eingelegt, dass
die Öffnung unter dem UV-Pen liegt. Den Chip 30 Sek.
mit UV-Licht bestrahlen.
Bei diesem Schritt unbedingt eine UV-Schutzbrille
tragen!!!
Den Chip auf einer sauberen und trockenen Arbeitsfläche zwischenlagern. Die PCR sollte in
den ersten 2h nach Beladung erfolgen.
3. PCR-Cycling
GeneAmp®PCR System 9700 starten.
dPCR-Chips gleichmäßig auf die Chip-Halter verteilen (die Chip-Öffnung muss nach
vorne zeigen), die Halter mit den ThermalPads bedecken und in den Cycler stellen.
Diesen schließen (Wird nur ein Halter verwendet, muss dieser immer auf die rechte
Heizplatte des Cyclers gestellt werden).
Folgende PCR-Reaktion starten:
Stage Step Temp (°C) Time (mm:ss) Ramp rate
104 Material und Methoden
Run speed: Standard
Volumen: 20 μL
Hold DNA polymerase activation 96.0 10:00
Default
Cycling
(39 cycles)
Anneal/extend 60.0 2:00
Denature 98.0 0:30
Hold Final extension 60.0 2:00
Hold Storage 10.0 ∞
Material und Methoden 105
4. Chip-Analyse durch QuantStudio3D
Chips aus dem PCR-Cycler entnehmen und ggf. Kondenswasser mit einem fusselfreien Tuch
abwischen.
Quant Studio 3D starten
Im Menü „USB“ als Speicherort auswählen und einen USB-Stick in den USB-Port einführen.
Schubfach des QuantStudios öffnen
und den Chip mit der Oberseite nach
oben auf den Schlitten legen.
Schubfach schließen.
Auf dem Touchpad des QuantStudios
„Start Run“ auswählen, um die Analyse zu starten.
Nachdem die Schritte „Processing Chip“ und „Analysing Chip“ abgeschlossen sind, werden
die vorläufigen Ergebnisse angezeigt
VIC und FAM stehen für die detektierbaren
Farbstoffe. Die Fähnchen können in den Farben grün,
gelb oder rot erscheinen und zeigen die Qualität der
Auswertung an. Bei „rot“ sollte die Messung (nach
Inspektion des Chips auf Verunreinigungen, etc.)
wiederholt werden.
Bei Verwendung von Negativkontrollen ohne Target oder DNA-Sample werden keine
Flaggen angezeigt. Diese müssen mit der AnalysisSuite-Software auf Amplifikationen
untersucht werden.
106 Material und Methoden
Die Probenauswertung kann mit Auswahl des Buttons „Done“ beendet und ein neuer Chip
analysiert werden.
Die Daten Analyse erfolgt in der Quant Studio 3D AnalysisSuite, einer Cloud Software.
4.1.9 Sangersequenzierung
Für die Sequenzierung von einzelnen DNA Fragmenten einer Größe bis ca. 1000 bp wurde
die Didesoximethode nach Sanger verwendet. Hierbei wird ein vorhandenes DNA-Fragment
in einer PCR erneut amplifiziert. Das Besondere ist der verwendete Mix aus Desoxy und
Didesoxynukleotiden. Durch den Einbau eines fluoreszenzmarkierten ddNTPs werden so
verschiedenlange Kettenabbruchprodukte gebildet. Die PCR Bedingungen werden so
gewählt, dass statistisch gesehen an jeder Position der Matrize mehrmals ein Abbruch
stattfindet. Die so gebildeten, unterschiedlich langen Kettenabbruchprodukte können
anschließend über eine Kapillargelelektrophorese aufgetrennt und analysiert werden.
Anhand der daraus gebildeten Sequenzchromatogramme kann die vorhandene
Basenabfolge mit einer Referenz verglichen werden.
Abbildung 4.8 Typisches Sequenzchromatogramm einer Sangersequenzierung
Benötigte Materialien
PCR Produkt
Material und Methoden 107
Primer Fw/Rev
DMSO Roth A994.2
3 M Natrium Acetat Ambion AM9740
Ethanol 100 bzw 70 %
100 mM dNTPs Life Technologies 10297-018 (wird von uns auf 10mM
verdünnt)
Light Cycler Platten Roche 05102413001
ExoSAP-IT Affymetrix 78205 10 ML
Big Dye Life Technologies 4337456
5x Puffer Life Technologies 4336699
HiDi-Formamide Life Technologies 4311320
Arbeitsanweisung
Aufreinigung PCR-Produkt mit ExoSAP-IT:
Ansatz je Sample:
PCR-Produkt: 0,5 - 2 µl
ExoSAP-IT: 0,75 µl
Aqua bidest: 2,25 – 3,75 µl
Mastermix (ExoSAP-IT + Aqua bidest) vorbereiten, in Platte vorlegen, PCR-Produkt
pipettieren; je nach Bandenstärke 0,5 bis 2 µl PCR-Produkt einsetzen (mit Menge an H2O
ausgleichen) (bei ganz schwachen Banden kann das Wasser auch ganz weggelassen werden,
dann 4,25 µl PCR-Produkt verwenden).
(Mastermix + DNA: pro Well 5 µl)
Inkubation:
Thermocycler Programm EXOSAP
37°C 20 min.
80°C 15 min.
Markierung für Sequenzierung mit ABI (BigDye® Terminator 3.1 Cycle Sequencing Kit):
108 Material und Methoden
Ansatz je Sample:
gereinigtes PCR-Produkt: 5 µl
Primer (5 pmol): 1 µl
Aqua bidest: 1 µl
Sequenzmix (Big Dye): 1 µl
5x Puffer: 1,5 µl
DMSO: 0,5 µl
Mastermix (5 µl) zu gereinigtem PCR-Produkt (5 µl) geben, Gesamtvolumen 10 µl.
Markierungsreaktion:
Thermocycler Programm ABI-Mark
1’ 96°
10’’ 96°
5’’ 50° 30 Cyclen* *bis zu 40 Cyclen mgl.
1’** 60° **bis 4 min
∞ 15°
Hinweis: Die Fluoreszenzmarkierung ist lichtempfindlich; Proben bei der weiteren
Bearbeitung (trocknen, lösen, aufbewahren) vor Licht schützen!
Fällung und Reinigung der Proben zur Sequenzierung:
Fällung der Proben:
Ansatz je Sample:
Natrium-Acetat (3M): 1 µl
Ethanol 100%: 25 µl
Material und Methoden 109
Zum Markierungsprodukt geben, kurz vortexen, 20 min zentrifugieren (max. rpm, ca. 3700,
4°C).
Flüssigkeit ausklopfen.
Waschen der Proben:
Ansatz je Sample:
Ethanol 70%: 100 µl
Zum Markierungsprodukt geben, kurz vortexen, 20 min zentrifugieren, Flüssigkeit
ausklopfen, Pellet 15 bis 30 min. auf 39 °C Heizplatte trocknen (Ethanol sollte vollständig
verdunstet sein, kann nach 15 min kontrolliert werden).
Lösen der Proben:
Ansatz je Sample:
HiDi : 20 µl
15 min bei Raumtemperatur stehen lassen, dann vortexen und runterzentrifugieren,
anschließend sequenzieren (oder bis zur Sequenzierung im Kühlschrank lagern oder
einfrieren).
110 Material und Methoden
4.1.10 FPNI-PCR
Um den genauen Integrationsort der
Transkriptionskasette innerhalb des
Wirtsgenoms zu bestimmen wurde eine
geschachtelte integrative PCR mit
Fusionsprimern (FPNI-PCR) etabliert.
Kernstück dieser Methode ist die
Verwendung von Fusionsprimern. Für die
Amplifizierung wurden einerseits Primer mit
einer definierten Sequenz verwendet, die
am 5‘ Ende der Transkriptionskassette, also
innerhalb der trunkierten LTRs binden und
eine Amplifizierung aus der Kassette heraus
ermöglichen. Die weitere Amplifikation
dieses ersten Stranges wird durch den
Einsatz eines Pools an degenerierten
Fusionsprimern ermöglicht. Diese Primer
haben einen zufällig degenerierten Teil und
eine bekannte Adaptersequenz. Die
verschieden langen Amplifikate konnten nun über eine Gelextraktion vereinzelt werden und
über anschließende nested PCR und die Verwendung von aufeinanderfolgenden
spezifischen Primern reine Amplifikate der die Kassette flankierenden DNA Bereiche
gewonnen werden. Die so gewonnenen Amplifikate wurden anschließend für eine Sanger
Sequenzierung eingesetzt. Die hierfür verwendeten Primer und Protokolle sind unter 4.1.3
gelistet [241].
Benötigte Materialien
Gen spezifische Primer 0,2 uM
Fusionsprimer Pool 1 uM
10 uM pool of each FP1-9, and use 0,555 ul.
Abbildung 4.9: Ablauf der FPNI PCR
Material und Methoden 111
FSP1 and FSP2 0,2 uM
GOTaq Mastermix
Arbeitsanweisung
1st PCR: (Primer: SIN_LTR_5For_0 + FP and RU5_LTR_5rev_0 + FP1-9 pool)
1 Zyklus 95 °C, 2 min
2 Zyklen 95 °C, 10 Sec; 55 °C, 30 sec, 72 °C, 2 min (ssDNA production)
1 Zyklus 95 °C, 10 Sec, 25 °C, 2 min, ramp +0,2 °C/Sec; 72 °C, 2 min (degenerate
oligo)
2 Zyklen 95 °C, 10 Sec; 55 °C, 30 sec, 72 °C, 2 min
1 Zyklus 95 °C, 10 Sec, 44 °C, 2 min; 72 °C, 2 min
2nd PCR: (Primer: SIN_LTR_5For_1 + FSP1 and RU5_LTR_5rev_1 + FSP1)
Verdünne 1st PCR 1:20: 1 µl 1st PCR für einen 20 µl Reaction
1 Zyklus 72 °C, 5 min (add 2nd PCR Mastermix, GoTaq + neue Primer, 20 ul)
1 Zyklus 95 °C, 2 min
30 Zyklen 95 °C, 10 sec; 55 °C, 30 sec; 72 °C, 2 min
1 Zyklus 72 °C, 5 min
3rd PCR: (Primers: SIN_LTR_5For_2 + FSP2 and RU5_LTR_5rev_2 + FSP2)
Verdünne 2nd PCR 1:50: 0.4 µl 2nd PCR auf 20 µl Reaktion
1 Zyklus 95 °C, 2 min
12 Zyklen 95 °C, 10 Sec; 55 °C, 30 sec, 72 °C, 2 min
1 Zyklus 72 °C, 5 min
Mastermixe
1st PCR mix: x µl DNA (~20 ng genomische DNA)
1 µl Gen spezifische Primer (10 µM, SIN_1 oder RU5_1)
0,55 µl FP Primer Pool (10 µM von jedem FP1-9 Primer, aus Stammlösung)
y µl Wasser (Ambion oder Sigma) auf 20 µl Endvolumen
10 µl 2 x GoTaq Mastermix
112 Material und Methoden
2nd PCR 1 µl 1st PCR Produkt
1 µl Gen spezifische Primer (10 µM, SIN_2 oder RU5_2)
1 µl FSP1 Primer (10 µM)
Wasser auf 20 µl
10 µl 2 x GoTaq Mastermix
3rd PCR Verdünne 2nd PCR Produkt 1:50 und nutze 1 µl als Templat für die 3rd PCR
(1:1000 Verdünnung)
1 µl Gen spezifische Primer (10 µM, SIN_2 oder RU5_2)
1 µl FSP2 primer (10 µM)
Wasser auf 20 µl
10 µl 2 x GoTaq Mastermix
5-10 µl auf einer Agarosegelelectrophorese laufen lassen
Genomische DNA ohne Viruskassette als Negativkontrolle verwenden
Anschließend Sangersequenzierung mit den letzten verwendeten Primern möglich.
4.1.11 Vergleichende RNA Expressionsanalysen
Für die vergleichenden RNA Expressionsanalysen wurde RNA aus TriZOL Proben nach 4.1.4.4
isoliert. Anschließend wurde die rRNA mittels des Ribo-ZeroTM Kits (Epicenter, Madison,
WI) entfernt. Die RNA wurde mit den Materialien und Anleitungen des SOLiD® Total RNA-
Seq Kit (Invitrogen) aufbereitet. Für jede Probe wurde hierbei ein eigener Barcode
verwendet. Einige der Bibliotheken wurde mit der „exact call chemistry“ gemischt und 75 bp
vorwärts sequenziert. Andere wurden als „paired end“ 75 bp vorwärts und 35 bp rückwärts
sequenziert. Nach dem Export der Daten wurden diese mittels des Lifescope software
analysis tools (Invitrogen) auf das humane Referenzgenome GRCh37/hg19 gemappt. Die
statistische Interpretation wurde mittels R durchgeführt. Die einzeln gemappten Fragmente
werden im weiteren „Reads“ genannt und die Expressionslevel der einzelnen Gene werden
als Reads per kilobase per million, kurz RPKM angegeben. Für die weiteren Analysen wurden
die Expressionslevel mittels des „R“ Pakets DESeq (Quelle) ausgewertet. Die Normalisierung
umfasst im DESeq Paket eine Berücksichtigung der Genlänge und des GC Gehaltes eines
Gens (-> In-lane normalization) sowie eine Umrechnung der Reads in Reads per kilobase of
exon per million mapped reads RPKM (->between-lane normalization). Abhängig von den
Material und Methoden 113
verschiedenen biologisch relevanten Fragestellungen wurden Vergleiche zwischen den
verschiedenen Zelllinien und Zustände durchgeführt. Die Genlisten wurden anschließend
gefiltert. Hierbei wurden alle Vergleiche, die einen FoldChange von kleiner 2 ergaben,
ausgeschlossen. Die verbliebenen Gene wurden anhand ihres P-Wertes gefiltert. Hierbei
wurden alle Vergleiche ausgeschlossen, deren p-Wert größer 0.05 war. Der p-Wert ist das
Ergebnis eines Likelihood-Ratio Testes (LRT) basierend auf der negativen binominal
Verteilung der normalisierten Genreads. Der hiervon gebildete padj ergibt sich durch eine
Bonferroni-Korrektur des p-Wertes. Hierbei wirkt man dem Auftreten von falsch-posi ven
Fehlern durch die erhöhte Menge an Wiederholungen der Anwendung des LRTs entgegen
(LRT wird pro Vergleich für 2x 17.000 Gene durchgeführt). Das R Paket DESeq wurde
ebenfalls genutzt um eine Hauptkomponentenanalyse durchzuführen. Die
Hauptkomponentenanalyse ist eine variablenorientierte Methode, die versucht, die
Originalvariablen durch eine kleinere Anzahl ,,dahinterliegender” Variablen zu ersetzen.
Hierbei wird eine orthogonale Transformation der ursprünglichen Variablen in eine neue
Menge unkorrelierter Variablen, den Hauptvariablen, vollzogen. Die Hauptkomponenten
werden nacheinander in absteigender Bedeutung konstruiert und stellen eine
Linearkombination der ursprünglichen Variablen dar. In unserem Fall wurde dies bis auf
zwei Hauptkomponenten vollzogen, so dass die Datensätze zweidimensional dargestellt
werden konnten.
4.2 Vektorarbeiten
Für die gezielte endogene Expression von Genen werden in der Gentechnik meistens
doppelsträngige DNA Vektoren eingesetzt. Die in dieser Arbeit verwendeten Vektoren
beruhen auf der Basis bakterieller Plasmide oder lentiviralen Ursprungs. Alle Vektoren
enthielten ein Resistenzgen, um sie in E.coli gezielt vermehren zu können, sowie einen
starken Säuger Promotor vor dem Zielgen, um eine Expression im Zielorganismus zu
gewährleisten. Die Plasmide wurden verwendet, um eine transiente Expression des Wildtyp
ST3GAL3 Proteins und seiner Mutationsvarianten in LMTK- Zellen zu erreichen. Der
multicistronische, lentivirale Vektor wurde genutzt, um vier Transkriptionsfaktoren
persistent in das Genom von primär Fibroblasten der Patientin zu integrieren.
114 Material und Methoden
4.2.1 Vektoren
Tabelle 4.2: Verwendete Vektoren
Name Vektor Resist
enz Stamm Beschreibung
pcDNA3.1/myc-his
A pcDNA3.1/myc-his A Amp XL1-blue
Euk. Expression vector for C-term
myc-His tag.
pST3GAL3wt-myc pcDNA3.1-
myc/His A Amp XL-1 blue
ST3GAL3 wt full length aus cDNA
(splice variant B1, accession no.
NM_006279.2) von Origene
(RC208261) in pcDNA3.1-myc/His A
über XbaI/BotI
pST3GAL3A13D-myc pcDNA3.1-
myc/His A Amp XL-1 blue
ST3GalIIIA13D (MutN), Umklonierung
über XbaI/NotI
pST3GAL3D370Y-myc pcDNA3.1-
myc/His A Amp XL-1 blue
ST3GalIIID370Y (MutC), Umklonierung
über XbaI/NotI
pST3GAL3A320D-myc pcDNA3.1-
myc/His A Amp XL-1 blue
ST3GalIIIA320D, Quick Change
Mutagenese aus pST3GAL3wt-myc
pMD2.G pMD2.G Amp DH5α Viruspartikel Produktion
VSV-G
pRSV-Rev pRSV-Rev Amp DH5α Viruspartikel Produktion HIV-1 Rev
pcDNA3.gp4xCTE pcDNA3 Amp Viruspartikel Produktion HIV-1 gag
und pol
pRRL.PPT.SF.hOKSMco-
idTom.pre.FRT
lentiviraler
Vektor 3.
Generation
Amp
hOct3/4, hKlf4, hSox2, hc-Myc;
Multicistronischer, lentiviraler
Transfervektor
4.2.2 Stämme und Medien
Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden zur Vervielfältigung von
Plasmiden genutzt. Die in vitro konstruierten Plasmide wurden in den Stamm DH5α
transformiert und dann nach entsprechender Anzucht reisoliert.
Material und Methoden 115
Tabelle 4.3: Verwendete Bakterienstämme
Stamm Genotyp Herkunft/Refrenz
DH5α supE44 hsdR17 (rk-mk+) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 ΔlacU169 (Φ80 ΔlacZ::M15)
Hanahan, 1985
Die Sterilisation der Medien erfolgte im Autoklaven für 20 min bei 120°C und 1 bar
Überdruck. Festmedien enthielten 2% Agar.
LB-Medium 1 % Trypton
0,5 % NaCl
0,7 % Hefeextrakt pH = 7,5
Zur Selektion Ampicillin-resistenter Klone wurde dem Medium Ampicillin in einer
Endkonzentration von 100 mg/l zugesetzt.
4.2.3 E.coli Transformation
Für die Transformation des E. coli-Stammes DH5α wurde die Calciumchlorid-Methode
verwendet [242].
Benötigte Materialien
MgCl2 100 mM
CaCl2 100 mM
CaCl2 in 15 %igem Glycerin 100 mM
LB-Medium
Plasmid/Virus-DNA
Arbeitsanweisung:
A) Herstellung und Lagerung transformationskompetenter Zellen
50 ml LB-Medium + 1 ml frische Stationärkultur des E. coli-Stammes DH5α
37 °C Orbitalschüttler -> Extinktion von 0,6 (600 nm)
jeweils in ein steriles Sarstedtröhrchen -> 15‘ Eis -> 10‘ 4000 Upm 4°C
116 Material und Methoden
in 15 ml eiskalter 0,1 M MgCl2-Lösung -> 10‘ 4000 Upm 4°C
15 ml eiskalter 0,1 M CaCl2-Lösung -> 20‘ Eis -> 10‘ 4000 Upm 4°C
+ 2,5 ml eiskalte 0,1 M CaCl2/Glycerin-Lösung resuspendiert
100 μl-Aliquots auf vorgekühlte 1,5 ml Eppendorf-Gefäße
Lagerung bei -80°C
B) Transformation der kompetenten Zellen
Auftauen auf Eis -> +DNA -> 30‘ Eis
2‘ 42 °C -> 5‘ Eis
+ 2 ml LB-Medium -> 30 – 60‘ 37 °C -> 1‘ 11.000 g
+100 µl LB-Medium -> LB-Amp Platten ausplattiert
37 °C ÜN
Bei Transformation von Ligationsansätzen wurde eine repräsentative Anzahl der
gewachsenen Einzelklone nach der „Mini-Screen“-Methode (4.2.5) untersucht.
4.2.4 E.coli Glycerinkultur
Für die Langzeitlagerung von transformierten E.coli Stämmen, wurden diese in einer 16 %
Glycerinlösung bei -80 °C kryokonserviert.
Benötigte Materialien
Wachsende E-coli Kultur (mid log phase)
80% Glycerin steril
Kryogefäß mit Innengewinde 2ml
Arbeitsanweisung
Material und Methoden 117
5 ml LB Medium mit einzelner Kolonie animpfen -> 37 °C Wasserbad bis mid log
phase
Nicht überwachsen lassen!!
800 µl der E-coli. Kultur in Kryogefäß vorlegen -> +200 µl 80% steriles Glycerin.
Vortexen
Lagerung bei -80 C
Zellen aus Glycerinkultur anziehen:
Mit sterilem 100 µl Tip die Oberfläche ankratzen -> zu 5 ml LB-Amp Medium geben
37 °C Wasserbad Schüttler
Stock NICHT auftauen lassen!!
4.2.5 Plasmidpräparation
Plasmidpräparationen wurden zur Validierung einzelner Klone nach einer Transformation im
Mini Ansatz (5 ml) oder im Maxi Ansatz (100 ml) für die quantitative Plasmidpräparation
durchgeführt. Beide Kits sind eine modifizierte Variante der alkalischen Lyse. Bei der
Alkalischen Lyse werden die Zellen durch die Zugabe eines alkalischen Detergenzien
enthaltenden Puffers (NaOH, SDS) lysiert. Die freiwerdende DNA kann dann anschließend,
wie bei der DNA Präparation, über eine Kieselgel-Festphase spezifisch isoliert werden [243].
Plasmid Mini Präparation
Benötigte Materialien
Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymogen Research D4036
Arbeitsanweisung
600 µl einer E.coli Kultur in 1,5 ml Gefäß
+100 µl 7x Lysis Puffer (blau)
o 4-6x invertieren 2‘ RT
118 Material und Methoden
+ 350 µl kalten Neutralisationspuffer (gelb) gut mischen
o 12.000 g 3‘
Überstand auf Zymo-Spin IIN Säule geben
o 12.000 g 15‘‘
o Durchfluss verwerfen
+ 200 µl Endo-Wasch Puffer auf Säule
o 12.000 g 30‘‘
+ 400 µl Zyppy Wasch Puffer auf Säule
o 12.000 g 1‘
Säule in sauberes, beschriftetes 1,5 ml Gefäß überführen
+ 30 µl Zyppy Elutionspuffer
o 1‘ RT
o 12.000 g 30‘‘
Plasmid Maxi Präparation
Benötigte Materialien
Endotoxin-free Plasmid Purification Kit JetStar 70-15014
Ethanol 100 %
LB-Medium
Isopropanol
Amp-Tabs Agilent 300021-61
Arbeitsanweisung
5 ml LB-Amp-Medium als Vorkultur mit E.coli animpfen.
o 37 °C Orbitalschüttler im Wasserbad ÜN
5 ml Übernachtkultur zu 100 ml LB-Amp-Medium geben.
o 37 °C Orbitalschüttler im Wasserbad ÜN
Material und Methoden 119
Säulen senkrecht über Behälter so platzieren, dass der Durchfluss aufgefangen werden
kann. Am besten eignen sich ein Eisbehälter und ein Falconständer.
+ 30 ml Equilibrierungspuffer pro Säule -> durch Schwerkraft durchlaufen lassen
Zellen in 50 ml Falcon sammeln -> 3‘ 12.000 g
Ggf. wiederholen
+ 10 ml Resuspensionspuffer mit RNase A -> resuspendieren bis homogen -> 5‘ RT
+ 10 ml Präzipitationspuffer -> sofort invertieren (nicht vortexen)
10‘ > 12.000 g RT -> + 1/10 des Volumen Endo-1 Puffer
Komplettes Volumen auf Säule laden -> durch Schwerkraft durchlaufen
lassen
+ 30 ml Endo-2 Puffer -> durch Schwerkraft durchlaufen
lassen
30 ml Waschpuffer E5 -> durch Schwerkraft durchlaufen
lassen
+ 15 ml Elutionspuffer -> 50 ml Falcon sammeln (Eluat
enthält DNA)
+ 10.5 ml Isopropanol -> gut mischen -> 30‘
>12.000 g 4 °C
Überstand verwerfen -> + 5 ml EtOH 70 % -> 5‘ > 12.000 g
Überstand verwerfen -> 10‘ lufttrocknen
Pellet in TE Puffer oder DEPC Wasser resuspendieren
Lagerung bei -20 °C
4.2.6 Enzymatische Restriktionsanalysen
In der Molekularbiologie werden oft Restriktionsenzyme vom Typ II verwendet, die eine
hexamere Palindromsequenz erkennen und spalten. Dabei entstehen definierte DNA-
Fragmente mit spezifischen Enden. Restriktionsspaltungen dienten hier entweder der
Überprüfung von Plasmidpräparationen oder wurden für Klonierungsreaktionen eingesetzt.
Die entsprechenden Enzyme wurden von der Firma New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)
bezogen, wobei die nötigen Reaktionspuffer mitgeliefert wurden. In welchem Puffer die
120 Material und Methoden
gewählten Enzyme am effektivsten schneiden können, kann über den NEB Double Digest
Finder ermittelt werden.
Benötigte Materialien
Restriktionsendonuklease NEB
10x NEB Puffer
DNA
DEPC Wasser
Arbeitsanweisung
1 Einheit des Restriktionsenzyms kann in der Regel 1 µg DNA in einem 50 µl
Reaktionsvolumen innerhalb 1 Stunde komplett verdauen. Enzyme sollten generell auf Eis
aufbewahrt werden und als letztes zum Ansatz pipettiert werden.
1 µg DNA in 1.5 ml Gefäß
+ 5 µl 10x NEB Puffer
Auf 49 µl mit DEPC Wasser auffüllen
+ 1µl Enzym
1h 37 °C
Ggf. auf einem Agarosegel überprüfen
Material und Methoden 121
4.2.7 Quick Change Mutagenese
Bei der Quick Change Mutagenese können ortsspezifisch Mutationen, wie
Basensubstitutionen, Deletionen oder Insertionen, über die verwendeten Primer in einen
Vektor eingeführt werden. Hierfür wird eine herkömmliche PCR mit der in diesem Kit
enthaltenen PfuTurbo Polymerase durchgeführt. Die verwendeten Primer wurden nach
folgenden Kriterien entworfen. Nach der PCR wird der parentale Mutterstrang durch die
Dpn I Endonuclease verdaut, welche spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA
schneidet (5´-Gm6ATC-3´) [244].
Primer Anforderung
Länge 25 – 45 bp
Schmelztemperatur ≥ 78 °C
Bindungsstelle Gleiche Stelle, unterschiedlicher Strang
Mutation In der Mitte des Primers
GC Gehalt ≥ 40 %
Wobei h
122 Material und Methoden
Benötigte Materialien
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit Agilent 200518
LB-Amp-Agarplatten
Arbeitsanweisung
Die einzusetzende Konzentration Primer für 125 ng berechnet sich wie folgt:
Kontrollreaktion:
5 µl 10x Reaktionspuffer
2 µl (10 ng) pWhitescript Kontrollplasmid
125 ng Kontrollprimer #1 und #2
1 µl dNTP Mix
DEPC Wasser auf 50 µl
Proben-Reaktion:
Ansatz mehrerer Proben mit einer Plasmid DNA Verdünnungsreihe 5 – 50 ng
5 µl 10x Reaktionspuffer
X µl (5-50 ng) Plasmid
X µl 125 ng Kontrollprimer #1 und #2
1 µl dNTP Mix
DEPC Wasser auf 50 µl
Zu beiden Reaktionsansätzen am Schluss 1 µl PfuTurbo Polymerase (2.5 U/µl) hinzufügen.
Material und Methoden 123
Thermozykler-Programm:
Zyklus Temperatur Zeit
1 95 °C 30‘‘
12 - 18 95 °C 30‘‘
55 °C 1‘
68 °C 1‘/kb Plasmidlänge
Für Punktmutationen werden 12 Zyklen Amplifikation benötigt.
2‘ Eis
+ 1 µl Dpn I zu jeder Reaktion gut mischen -> 1 h 37 °C
Transformation von je 1 µl Mutagenese Ansatz zu 50 µl XL1-Blue superkompetenten Zellen
Normale E.coli Transformation
Kontroll Mutagenese auf LB-Amp Platten mit 80 µg/ml X-gal und 20 mM IPTG
Mutagenesen auf LB-Amp Platten
37 °C > 16 h
Nach erfolgreicher Transformation Anzucht einzelner Kolonien; Kolonie PCR und
anschließende Sangersequenzierung, um die korrekte Mutation zu bestätigen.
4.3 Stammlösungen
Gelatine (Porcine) Fisher G/0150/53
SOLL 1,1 % 550 mg in 50 ml 1x PBS autoklavieren
Aufbewahrung 4 °C
Arbeitsverdünnung 1:10 0,1 % 50 ml zu 500 ml 1x PBS geben
bFGF lifeTech PHG0026
SOLL 100 ng/µl 50 µg in 500 µl MilliQ lösen
12 Aliquots à 40 µl
124 Material und Methoden
Aufbewahrung -20 °C
Arbeitsverdünnung je nach Linie zwischen 10 – 100 ng/ml SCM
bFGF RnD 4114-TC-01M
SOLL 200 µg/ml 1 mg in 5 ml 1x PBS lösen
Aliquots à 100 µl
Aufbewahrung -20 °C
Arbeitsverdünnung je nach Linie zwischen 10 – 100 ng/ml SCM
Dispase II Roche 4942078001
SOLL 10 mg/ml 200 mg abwiegen in 20 ml DMEM/F12 lösen, 22 µm filtersterilisieren
20 Aliquots à 1 ml
Aufbewahrung -20 °C
Arbeitsverdünnung 1:10 1 mg/ml 200 µl zu 2 ml (1 6W)
ROCK Inhibitor Sigma-Aldrich Y0503-1MG
MW 320,26
SOLL 10 mM 1 mg in 312 µl MiliQ lösen
Alliquots à 20 µl
Aufbewahrung -20 °C
Arbeitsverdünnung 1:1000 10 µM
Mitomycin (MMC) Sigma-Aldrich M4287-5x2MG
SOLL 0,5 mg/ml Komplettes Fläschchen (2 mg) in 4 ml MiliQ lösen, evtl, bei 37°C
Wasserbad
erwärmen
Arbeitsverdünnung 1:50 10 µg/ml (5 ml DMEM +100 µl MMC)
Aufbewahrung lichtgeschützt 4 °C
Vitamin C Sigma-Aldrich A4544-25G (Transduktion)
Material und Methoden 125
SOLL 10 mg/ml 100 mg in 10 ml DMEM lösen zu je 50 und 500 µl Aliquots in Alufolie
RT
Arbeitsverdünnung 1:200 50 µg/ml
Aufbewahrung -20 °C und lichtgeschützt
Chloroquine Sigma-Aldrich C6628-25G (Transfektion)
MW 515,9 g/mol
SOLL 25 mM 50 mg in 4 ml 1xPBS oder Wasser
Arbeitsverdünnung 1:1000 25 µM pro 6Well (a 2,5 ml) 2,5 µl
Aufbewahrung 4 °C und lichtgeschützt
Na Butyrat Sigma-Aldrich B5887 (Transfektion)
MW 110 g/mol
SOLL 0,5 M 250 µg in 4,5 ml Sigma Wasser lösen
Arbeitsverdünnung 1:100 5 mM pro 10 cm Schale (a 7 ml) 70 µl
Aufbewahrung 4 °C
VPA Sigma-Aldrich P4543-10G (Transduktion)
SOLL 400 mM 50 mg/ml in DMEM lösen zu je 50 µl und 500 µl Aliquots in Alufonie
bei -20°C Arbeitsverdünnung 1:200 2 mM
Aufbewahrung -20 °C und lichtgeschützt
Protamin Sigma-Aldrich P4020 (Transduktion)
SOLL 4 µg/ml 4 mg in 1 ml H2O lösen 1:1000 Verdünnung machen
Arbeitsverdünnung 1:1000 4 ng/ml
Aufbewahrung Aliquots bei 4 °C
Insulin SigmaAldrich 91077C (Dual SMAD)
SOLL 5 mg/ml 100 mg in 10 ml sterilem Wasser lösen + 1-2 Tropfen HCl bis sich alles gelöst
hat. Auf 20 ml auffüllen.
Arbeitsverdünnung 1:1000 5 µg/ml pro 50 ml N2-Medium 50 µl
Aufbewahrung Aliquots bei -20 °C
126 Material und Methoden
SB431542 Millipore 616464 (Dual SMAD)
5 mg in 119 µl DMSO gelöst
IST 100 Mm
Arbeitsverdünnung 1:10.000 10 µM pro 50 ml Medium 5 µl
Aufbewahrung Aliquots bei -20 °C
Dorsomorphin RnD Systems (Tocris) 3093/10 (Dual SMAD)
MW 472,1 g/mol
SOLL 10 mM 10 mg in 2,117 ml sterilem Wasser lösen 4 Aliquots à 500 µl
Verdünnung 1 mM 80 µl Stammlösung + 720 µl MiliQ 16 Aliquots à 50 µl
Arbeitsverdünnung 1:1000 1 µM pro 50 ml Medium 50 µl
Aufbewahrung Aliquots bei -20 °C
Laminin Sigma 1ml L2020 (Kortexneuronen)
SOLL 1 mg/ml Gefäß langsam bei 4 °C auftauen lassen;
in 8 Aliquots à 125 µl in vorgekühlte 1,5 ml Gefäß füllen
Arbeitsverdünnung 1:50 20 µg/ml (6 ml 1x PBS zu jedem Aliquot)
Aufbewahrung Aliquots -20 °C / Arbeitsverdünnung 4 °C
Digitonin Sigma D141-100MG (Kortexneuronen)
SOLL 1 mg/ml 100 mg in 2 ml Sigma-Wasser lösen (auf 95 °C im Schüttler aufheizen
und anschließend auf RT abkühlen lassen)
auf 20 ml à 1 ml Aliquots einfrieren
Arbeitsverdünnung 1:5
Aufbewahrung Aliquots -20 °C / Arbeitsverdünnung 4 °C
Torin-1 RnD 4247-10mg (Array-CGH)
SOLL 1 mM 10 mg (alles) in 16,45 ml DMSO lösen (1 h 37 °C)
2 Aliquots à 8 ml
SOLL 100 µM 200 µl 1 mM Stammlösung in 1800 µl DMSO verdünnen
2 Aliquots à 1 ml
Material und Methoden 127
Arbeitsverdünnung 1:1000 100 nM
Aufbewahrung -20 °C und lichtgeschützt
4.4 Säuger-Zellkultur Einführung
Die Kultur von Säugerzellen unter definierten Wachstumsbedingungen bietet die
Möglichkeit, Zellen in vitro, also außerhalb ihres Ursprungsorganismus, zu expandieren, zu
beobachten und zu analysieren. Die Zellen werden dabei unter spezifischen Temperatur und
Gasbedingungen (37 °C, 5 % CO2) in Plastikgefäßen unter der Zuführung spezifischer
Nährmedien in Inkubatoren angezogen. Bei der Bearbeitung dieser Zellen wurde ein
erhöhtes Augenmerk auf die Vermeidung von Kontaminationen gelegt. Um dies zu
gewährleisten, wurde immer äußerst genau auf die Einhaltung der guten Laborpraxis
Reinheitsgebote geachtet.
Alle Arbeiten mit lebenden Zellen sollten unter einer Sterilwerkbank ausgeführt
werden.
Die Sterilwerkbänke und Filter sollten regelmäßig gewartet werden.
Die Sterilwerkbänke sollten vor und nach einer jeden Benutzung mit 70 % Ethanol
desinfiziert werden.
Es sollten nur so viele Gegenstände wie notwendig unter einer Bank stehen.
Alle Gegenstände, die unter die Bank gebracht werden, sollten steril sein (Hände,
Pipetten, Tips, Medien, usw.).
Pipettierarbeiten sollten mit sterilen Einwegtips und einzeln verpackten, sterilen
sero-logischen Pipetten ausgeführt werden.
Der Experimentator sollte Handschuhe tragen, diese regelmäßig wechseln und vor
dem Kontakt mit den Zellen mit 70 % Ethanol desinfizieren.
Der Experimentator sollte einen Kittel, der nur für die Zellkultur benutzt wird, tragen.
Die Abfälle sollten in den dafür vorgesehenen Behältern gesammelt und vor der
Entsorgung steril autoklaviert werden.
Die Inkubatoren sollten regelmäßig sterilisiert werden (Heißluft oder chemisch).
Das Wasser in den Wasserbädern sollte regelmäßig gewechselt und vorsorglich mit
Kupfersulfat versetzt werden (Lösung).
128 Material und Methoden
Sollte es dennoch zu einer Kontamination kommen (Bakterien, Hefen, Pilze, andere
Zelllinien), sollten diese Kulturen sofort entsorgt werden.
4.4.1 Zellmaterial und Medien
Für die Verwendung des Patientenmaterials liegt eine Einverständniserklärung vor.
Material
Tabelle 4.4 Verwendete Zelllinien und Patientenmaterial
Genotyp Zellart Medien Herkunft Sex Anwendung
HeLa Aneuploid
n = 70 - 164
Immortalisiert
e
Zervixkarzino
m-Zellen
Basal
Medium
Human ♀ Transformation
en
HEK Hypotriploid
n = 64
embryonale
Nierenzellen
Basal
Medium
Human ♀? Transformation
en
HT1080 Pseudodiploi
d
n = 44 - 48
Fibroblasten
Fibrosarcom
Basal
Medium
Human ♂ Virustiter-
bestimmung
LMTK- Hyperdiploid
n = 42 - 48
Fibroblasten Basal
Medium
Maus ♂ Überexpression
ΔBUDR, ΔTK,
HAT sensitiv
CF1 Fibroblasten Basal
Medium
Maus „Feeder“ Zellen
AS Wt
n = 42
Primär
Fibroblasten
gesundes
Geschwister
Basal
Medium
Human ♀ Funktionelle
Analysen
/Re-
programmierun
g
ΔSt3Gal
3-HF
St3Gal3
A320D
n = 42
Primär
Fibroblasten
Patientin
Basal
Medium
Human ♀ Funktionelle
Analysen
ASC23 ihOKSMco- Induziert SCM/ Human ♀ Funktionelle
Material und Methoden 129
idTom
n = 42
pluripotente
Stammzellen
mTeSR/
kond.SCM
Analysen
/Differenzierung
ΔSt3Gal
3
ihOKSMco-
idTom
ΔST3GAL3
n = 42
Induziert
pluripotente
Stammzellen
SCM/
mTeSR/
kond.SCM
Human ♀ Funktionelle
Analysen
/Differenzierung
HD2 ihOKSMco-
idTom
n = 42
Induziert
pluripotente
Stammzellen
SCM/
mTeSR/
kond.SCM
Human ♂ Funktionelle
Analysen
/Differenzierung
Tabelle 4.5: Normales Gehirn Probenmaterial
Probe Lot. No. Kat. No. Geschlecht Alter
[Jahre]
Pool
von
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain: Cerebellum A508112 R1234039-50-BC ♂ 26 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain-
Diencephalon
A902009 R1234049-10-BC ♂ 26 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain-
Hippocampus
B308094 R1234052-10-BC ♂ 27 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Corpus
Callosum
A601516 R1234045-10-BC ♂ 26 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Cerebral
Kortex
B403060 R1234042-10-BC ♂ 24 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Frontal Lobe A505174 R1234051-50-BC ♂ 27 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Medulla
oblongata
A906047 R1234057-50-BC ♀ 60 1
Human Adult Normal Tissue A505663 R1234062-50-BC ♂ 27 1
130 Material und Methoden
Total RNA- Brain- Occipital
Lobe
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Parietal
Lobe
A611008 R1234066-50-BC ♂ 26 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Temporal
Lobe
A811245 R1234078-50-BC ♂ 22 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Thalamus A404119 R1234079-50-BC ♂ 23 1
Human Adult Normal Tissue
Total RNA- Brain- Occipital
Lobe
A505663 R1234062-50-BC ♂ 27 1
Material und Methoden 131
Medien
Grundsätzlich zu beachten: Stammzellmedien nie aus der 500 ml Flasche verwenden. Immer
in sterilen 250 ml Glasflaschen oder 50 ml Flacons als Aliquots ansetzen und bei 4 /-20 °C
lagern. Vor Verwendung nur benötigte Menge im Wasserbad (37 °C) erwärmen.
Feeder-Medium (teilungsinaktiviert)
MEF
DMEM Gibco 10313-039 4 °C
10 % FCS Life Technologies 10270-098
1 % P/S Gibco 15140-122
Bsp: 500 ml DMEM F12
50 ml FCS
5 ml P/S
Normales iPS Medium (SCM Kultivierung auf
Feederzellen)
In 250 ml sterilen Glasflaschen ansetzen.
Rest 192 ml DMEM/F12 Gibco 31331-028
20 % 50 ml KO Serum Replacement Gibco 10828010
1 % 2,5 ml Glutamax Gibco 35050038
1 % 2,5 ml MEM-NEAA Gibco 11140-050
1 % 2,5 ml P/S Gibco 15140-122
5 nM 500 µl β-Mercaptoethanol Gibco 31350-010
xxx xx µl bFGF (Konz. zw. 10 – 100 ng/ml) RnD 4114-TC-
01M
TIPP
!!! Maximal 7 Tage verwenden!!!
Wirklich wichtig! Zellen sehen mit älterem Medium deutlich schlechter aus und
differenzieren viel häufiger!
132 Material und Methoden
Konditioniertes iPS Medium (MEF-cm Zellkultur auf Matrigel ohne Feeder)
Benötigte Medien
Normales iPS Medium SCM
60.000 Zellen/cm² teilungsinaktivierte MEFs in mittelgroßen bis großen
gelatinebeschichtete Zellkulturflaschen aussäen
o In Feeder Medium 1 d bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren
Feeder Medium absaugen, 1x mit 1xPBS waschen
+ 0,5 ml/cm2 MEF-cm (vorher) auf die Zellen geben
o 22 – 26 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren
Medium abnehmen steril filtrieren und aliquotieren
o Bei -20 °C einfrieren, besser sofort verwenden
Konditionierung ist an 7 aufeinanderfolgenden Tagen wiederholbar
TIPP: Medium nicht bei 4 °C lagern, nach Benutzung maximal 1x wieder einfrieren.
Vor Benutzung benötigte Menge bFGF zugeben.
Neural maintenance medium (NMM)
1:1 Mix aus N2 und B27 Medium
N2: DMEM/F12 Gibco 31331-028
1x N-2 Gibco 17502-048
5 µg/ml Insulin Sigma Aldrich 91077C
1 mM Glutamin Gibco 35050038
100 µM NEAA Gibco 11140-050
100 µM β-ME Gibco 31350-010
1x P/S Gibco 15140-122
B27: Neurobasal Gibco 21103-049
Material und Methoden 133
1x B-27 mit Vit.A Gibco 17504-044
200 mM Glutamax Gibco 35050038
1x P/S Gibco 15140-122
Für die direkt Mischung von 100 ml NMM:
1 ml B27
500 µl N2
100 µl Insulin
1 ml Glutamin
1 ml P/S
500 µl NEAA
48,5 ml Neurobasal
47,5 ml DMEM/F12
Neural induction medium (NIM)
Neural maintenance medium +
500 ng/ml Noggin RnD 719-NG
10 µM SB431542 Millipore 616464-5MG
oder
1 µM Dorsomorphin RnD 3093
10 µM SB431542 Millipore 616464-5MG
Kryo-Medium
40 % frisches SCM
30 % konditioniertes SCM
30 % DMSO Gibco 10828010 -20 °C
→ alles zusammengeben und steril filtrieren
1x PBS für 1 L
134 Material und Methoden
800 ml MilliQ
8 g NaCl 137 mM
0,2 g KCl 2.7 mM
1,44 g Na2HPO4 8 mM
0,2 g KH2PO4 1.46 mM
pH-Wert mit NaOH oder HCl auf 7,4 einstellen auf 1 L auffüllen,
Heißautoklavieren (20 min, 121 °C)
Bei RT lagern
Basal-Medium
DMEM Gibco 10313-039 4 °C
20 % FCS
1 % P/S; GlutaMax; NEAA
Dieses Medium wurde für teilungsaktive MEF, primär Fibroblasten, HeLa, HEK, HT1080 und
LMTK- Zellen verwendet.
4.4.2 Oberflächenbeschichtung
Für die Kultur etlicher Zellen war es notwendig die zu verwendenden Plastikgefäße
zusätzlich mit unterschiedlichen Bestandteilen der Extrazellulären Matrix, wie z.B. Laminin
oder einer Mischung aller Bestandteile wie z.B Gelatine oder Matrigel zu beschichten.
Gelatinebeschichtung (iPS Zellkultur auf Feeder)
Benötigte Materialien
0,1 % Gelatine in 1x DPBS
Pro 25 cm2 Flasche 3 ml
6Well 2 ml
Arbeitsanweisung
Material und Methoden 135
Für 15-30 Minuten bei RT inkubieren.
Gelatine absaugen und entweder direkt verwenden, oder für 1 h bei RT eintrocknen lassen
und anschließend direkt verwenden.
136 Material und Methoden
Matrigel Beschichtung (iPS Zellkultur ohne Feeder)
Benötigte Materialien
Matrigel BD 356234 400 µl Aliquots -20 °C
DMEM/F12 Biochrom 500 ml Flasche 4 °C
Gemisch 24 ml 4 °C
Arbeitsanweisung
Matrigel über Nacht auf Eis im Kühlschrank auftauen. Kurz schwenken, um sicher zu stellen,
dass es vollständig aufgetaut ist. Mit vorgekühlten Einmalpipetten unter der Sterilwerkbank
zu je 400 µl in 1,5 ml Gefäß aliquotieren. Alle Arbeiten auf Eis durchführen.
Bei -20 °C lagern.
Matrigel wird 1:60 mit DMEM/F12 verdünnt und kann dann bis zu 3x verwendet werden.
Hierzu 24 ml DMEM/F12 abnehmen und 5 ml zu dem gefrorenen, aliquotierten Matrigel
geben. Unter ständigem auf- und abpipettieren auftauen und anschließend mit den
verbliebenen 19 ml DMEM mischen.
Pro 25 cm2 Flasche 2 ml
6Well 1 ml Matrigel mit Einmalpipette aufgeben und gut verteilen
1 h bei 37 °C inkubieren.
Matrigel mit Einmalpipette herausnehmen (nicht absaugen) und in Falcon zum wieder
verwenden sammeln. Immer Anzahl der Nutzungsrunden auf dem Deckel dokumentieren.
Bei 4 °C lagern. (2x mit 1x PBS waschen)
Beschichtete Kulturgefäße nicht trocken lagern, maximal mit 1x PBS überschichtet bis zu 1h
im Kühlschrank lagerbar. Vor Verwendung Mediumanteil vorlegen und bei RT bis zur
Nutzung unter der Werkbank lagern.
Material und Methoden 137
Poly-L-Ornithine/Laminin Beschichtung (neuronal differenzierte Zellen)
Benötigte Materialien
Laminin Sigma Aldrich L2020
Poly-L-Ornithine Sigma Aldrich P4957
Arbeitsanweisung
1ml pro 6Well Poly-L-Ornithin
4 h 37 °C
Überstand abnehmen und verwerfen
Aliquotiertes Laminin in 6 ml kaltem 1x PBS lösen
1ml pro 6Well
4 h 37 °C oder ÜN
Überstand abnehmen und verwerfen
4.4.3 Teilungsinaktivierung
Sowohl humane Stammzellen als auch iPS werden auf sogenannten Feederzellen kultiviert.
Für diese Arbeiten wurden murine embryonale Fibroblasten in Kokultur gehalten, um das
Medium für die Stammzellen zu konditionieren. Um zu verhindern, dass die Stammzellen
von den „Feederzellen“ überwachsen wurden, wurden diese durch eine
Mitomycinbehandlung teilungsinaktiviert.
Benötigte Materialien
Mitomycin (MMC) Sigma-Aldrich M4287-5x2MG
Teilungsaktive MEF
Basal Medium
0,25 % Trypsin/EDTA Life Technologies 25200-056
1x DPBS Life Technologies 14190-094
138 Material und Methoden
Arbeitsanweisung
Fibroblasten in Feeder Medium auf möglichst große Zellzahl anziehen
+ 10 µg je ml MMC → 2,5 h bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren
Medium absaugen
1x mit 1x DPBS waschen
+ adäquate Menge 0,25 % Trypsin/EDTA hinzufügen
5 – 10 min bei 37 °C inkubieren
Verdau mit 2 – 3 x Menge Medium stoppen
Bei 500 g für 5 min abzentrifugieren
Zellen zählen
Ca. 30.000 Zellen pro 1 cm2 → Für 1x 6Well Pl. 1,73 x 106
Zellen/ml
Für 2x 6Well Pl. 3,5 x 106 Zellen/ml
Kryo Stocks für 1x 6Well Pl und für 2x 6Well Pl anlegen (genaueres siehe Anleitung)
TIPP
Zellsupension auf die Konzentration von 2x 6Well Pl. 2,3 x 106 Zellen/ml verdünnen und für
1x 6Well Pl. 500 µl Kryomedium in Gefäß vorlegen (1:1 verdünnen).
4.4.3 Erhaltungskultur
Grundsätzlich zu beachten: ALLE Pipettierarbeiten werden mit serologischen
Einmalpipetten unternommen. Falls man nicht sicher ist, ob die Sterilität noch gewährleistet
ist, lieber einmal mehr wegschmeißen. Benutzte Pipetten werden in einer Plastiktüte neben
dem Autoklaviermüll gesammelt und bei der Verwendung eines neuen Sackes unten hinein
gelegt. Medien maximal 1 Woche verwenden, vorher auf Trübung untersuchen, immer für
jede Zelllinie einzeln aliquotieren und Zelllinien nacheinander bearbeiten. NIEMALS mit
benutzter Pipette in sterile Gefäße gehen.
Kulturgefäße
6Well Platten 9,6 cm2 Cellstar 657-160 2 – 4 ml maximal
Kleine Flaschen 25 cm2 Greiner 690160 3 – 5 ml maximal
Material und Methoden 139
140 Material und Methoden
Erhaltungskultur iPS:
Benötigte Materialien
Basalmedium
SCM
5-50 ng bFGF
0,1 % Gelatine in 1x PBS
Matrigel BD 356234 400 µl Aliquots -20
°C
ROCK Inhibitor Sigma-Aldrich Y0503-1MG
6Well-Platte
Arbeitsanweisung
Feederzellen aussäen -1 d
Kulturgefäße mit 0,1 % Gelatine beschichten → 15 min RT inkubieren
Benötigte Menge DMEM Medium aliquotieren und im Wasserbad erwärmen
Feeder sind in Kryobehälter: schwarzer Deckel, Hänger: Aufschrift Feeder
Kryogefäß im Wasserbad (37 °C) auftauen. Nur bis sie eben aufgetaut sind, NICHT
länger
10 – 12 ml DMEM/F12-Medium in 15 ml Falcon abnehmen, Zellen in 1 ml Medium
resuspendieren und in Falcon übertragen. Mehrmals auf- und abpipettieren um
DMSO zu depletieren.
Bei 500 g und für 5 min pelletieren
Währenddessen Gelatine absaugen und
pro 6Well 1 ml oder
pro 25 cm2 Flasche 2 ml MEF Medium vorlegen.
Medium von pelettierten Zellen vorsichtig absaugen und Pellet in 0,5 ml MEF
Medium pro 6Well oder 1 ml pro 25 cm2 Flasche resuspendieren.
0,5 ml Zellsuspension pro 6Well, bzw. 1 ml pro 25 cm2 Flasche aussäen
Kreuzweise verteilen
Material und Methoden 141
Für 1 d (min 8 h) bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren
TIPP: Feeder sollten für die iPS Kultur bei einer Zellzahl von min. 15.000 Zellen/cm2
ausgesät werden. Verwendungshinweis auf dem Kryogefäß beachten.
Stammzellen aussäen 0 d
Kulturgefäße mit Matrigel beschichten oder vorbereitete Feederzellen verwenden
Benötigte Menge SCM (MG → MEF-cm oder mTeSR) aliquotieren
Kryogefäß im Wasserbad (37 °C) auftauen. Nur bis sie eben aufgetaut sind, NICHT
länger.
10 – 12 ml DMEM/F12 Medium in 15 ml Falcon abnehmen, Zellen in 1 ml Medium
resuspendieren und in Falcon übertragen. Mehrmals auf- und abpipettieren um
DMSO zu depletieren.
Bei 250 g und SOFT Einstellung für 5 min pelletieren
Währenddessen Matrigel bzw. Feeder Medium absaugen
2x mit 1x PBS waschen und
pro 6Well 1 ml oder
pro 25 cm2 Flasche 2 ml SCM vorlegen.
Medium von pelettierten Zellen vorsichtig absaugen und Pellet in 0,5 ml SCM pro
6Well oder 1 ml pro 25 cm2 Flasche resuspendieren.
Zellen dabei möglichst wenig vereinzeln
0,5 ml Zellsuspension pro 6Well, bzw. 1 ml pro 25 cm2 Flasche aussäen
+ ROCK Inhibitor in der Verdünnung 1:1000 (3 µl pro Well) direkt zum Well
dazugeben
Kreuzweise verteilen
bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren
Mediumwechsel
Für die Erhaltungskultur von einer jeden Zelllinie ist es wichtig, dass die Zellen von einem für
sie spezifischen Medium mit genügend Nährstoffen und optimalem pH Wert umgeben sind.
Deshalb sollte es je nach Stoffwechselaktivität regelmäßig ausgetauscht werden.
142 Material und Methoden
Die meisten Medien enthalten den Farbstoff Phenol Rot. Dieser verfärbt sich bei sinkendem
pH-Wert von Pink über Rot zu Gelb. Er zeigt somit an, wie aktiv die Zellen die enthaltene
Glucose zu Calciumdioxid verstoffwechseln. Die meisten Zelllinien vertragen Medienwechsel
jeden zweiten Tag, bei einer Passage am Freitag.
Arbeitsanweisung
Vakuumpumpe + VacuumHand verwenden. Füllstand der Abfallflasche kontrollieren, evtl.
neue mit Desinfektionsmittel in angestrebter Verdünnung (aufs Endvolumen bezogen)
vorbereiten und austauschen. Autoklavierte Pasteurpipetten auf VacuumHand aufstecken
und für jeden neuen Arbeitsschritt wechseln. Gebrauchte Pipetten in Metallbehälter
außerhalb der Werkbank sammeln autoklavieren und abschließend im Glasmüll entsorgen.
VacuumHand am Ende einer jeden Benutzung mit 70 % EtOH und mit A.dest nacheinander
spülen.
Medienwechsel wurden bei WT und Mutanten iPS jeden Tag vorgenommen. Erscheint die
Kultur sehr robust, kann man versuchen, auf weniger Medienwechsel pro Woche zu
reduzieren.
z.B.: Bei Mo – Mi – Fr (Split) muss das Medium am Wochenende nicht
gewechselt werden.
Direkt nach der Passage können viele Linien zwei Tage ohne Medium auskommen,
da die Kolonien noch sehr klein sind.
ÜS absaugen
+ 1,5(2)/3 ml frisches Medium
Um einen vorzeitigen Abbau des bFGFs zu verhindern, immer nur benötigte Menge Medium
im Wasserbad erwärmen und Mediumvorrat bei +4 °C lagern oder bFGF immer direkt
vorher dazu geben.
Medienwechsel bei allen anderen Zelllinien müssen immer an die jeweiligen Teilungsraten
und Stoffwechselaktivitäten angeglichen werden. Im Allgemeinen können diese Zelllinien
aber auch in den oben genannte Rhythmus, Mo – Mi – Fr (Split), gebracht werden.
TIPP: Um Medium zu sparen, kann bei täglichem Mediumwechsel ein Volumen von 1,5
ml/6Well verwendet werden, bei Medienwechsel jeden zweiten Tag 2 ml
verwenden.
Material und Methoden 143
4.4.4 Passagieren
Neben der regelmäßigen Versorgung mit Nährstoffen ist es ebenfalls wichtig, die Zellen in
einem teilungsaktiven Zustand zu halten. Um dies zu gewährleisten, sollte den Zellen immer
genügend Raum für die Expansion gegeben werden. Hierfür wurden die Zellen geerntet und
in einer der Zelllinien angepassten Teilungsrate verdünnt und neu ausgesät.
4.4.4.1 EDTA/Trypsin Split
Die meisten Zelllinien können mit einer einfachen enzymatischen Methode passagiert
werden. Hierzu zählen HeLa, HEK, MEF, HT1080, LMTK- sowie primär Fibroblasten. Sie
beruht auf einem partiellen Verdau der Oberflächenproteine durch Trypsin und dem
zusätzlichen Entzug von Calcium- und Magnesiumionen durch das chelatierende Molekül
EDTA.
Benötigte Materialien
Basal Medium
0,25 % Trypsin/EDTA Life Technologies 25200-056
1x DPBS Life Technologies 14190-094
Arbeitsanweisung
Medium absaugen
1x mit 1x DPBS waschen
o Überstand verwerfen
+ adäquate Menge Trypsin/EDTA hinzufügen (6Well = 1 ml)
5 – 10 Min bei 37 °C inkubieren
o Sichtkontrolle unter dem Mikroskop, ob alle Zellen gelöst
o Ggf Zellgefäß einen kräftigen „Klapps“ geben
Verdau mit 2 – 3x Menge Medium stoppen
Zellsuspension in Falcon sammeln
Bei 500 g für 5 min abzentrifugieren
Überstand verwerfen
Zellen in adäquatem Volumen Basal Medium resuspendieren
144 Material und Methoden
In geeignetem Splitverhältnis in neue Kulturgefäße aussäen
4.4.4.2 Dispase II Split
iPS auf Feeder und auf Matrigel
Benötigte Materialien
DMEM/F12 Gibco 31331-028
Dispase Roche 4942078001
SCM
Arbeitsanweisung
Enzymatische und mechanische Passage
+ 200 µl Dispase Stammlösung direkt zum Medium (Verdünnung 1:1000)
5 min bei 37 °C inkubieren, nicht anstoßen
ÜS absaugen
15 – 45 min ohne ÜS bei 37 °C inkubieren
Unter Lichtmikroskop beobachten
Ränder der Kolonien sollten sich leicht aufwellen
Ansonsten: Inkubationszeit auf maximal 45 min verlängern
Kolonien mit 2 ml DMEM/F12 w/o KOSR abspülen
Alt. bei zu hoher Adhäsion mit steriler 1000 µl Spitze mit Druck die gesamte
Oberfläche einmal abspülen oder mit 10 ml Pipette abkratzen
Zellen in Falcon mit 10 ml DMEM/F12 sammeln
Zellen durch Gravitation oder für 3 min bei 250 g sedimentieren lassen
ÜS absaugen
Waschvorgang 1x wiederholen (Zellen reagieren empfindlich auf Dispase Reste)
+1 ml Medium; Kolonien durch auf- und abpipettieren zerkleinern, dabei bei Bedarf
von 5 ml über 1000 µl zu 200 µl kleiner werden. Kolonien sollten frei schwimmen,
nur langsam absinken (Schneekugel). Zell-Mediumsuspension in angemessener
Verdünnung auf vorbereitete Feederzellen verteilen
ggf. ROCK Inhibitor in der Verdünnung 1:1000 (3 µl pro Well) direkt zum Well
dazugeben
Material und Methoden 145
Kreuzweise verteilen → bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren
TIPP
Stammzellen NIE vereinzeln!! Vorsichtig pipettieren, Blasen vermeiden! Sind
Differenzierungs-anzeichen bzw. „Autofeeder“ zu sehen, Zellen länger mit Enzym inkubieren
und so depletieren. Zeitpunkt genau abpassen, um Stammzellkolonien nicht zu vereinzeln.
Differenzierte Zellen manuell vor der Passage lösen und entfernen. Splitraten können von
1:1 bis 1:20 variieren.
4.4.4.3 Manuelle Passage
iPS auf Feederzellen und auf Matrigel
Manuelle Passage
Kolonie unter dem Mikroskop beobachten
Mit steriler rundgezogener Pasteurpipette oder mit 200 µl Spitze kreuzweise in
kleinere Rechtecke schneiden (Schachbrettmuster)
Mit steriler 200 µl Pipettenspitze vorsichtig abschaben und einsaugen.
Vorsichtig zerkleinern und direkt auf vorbereitete Wells aussäen
In etwa können 2 – 3 große Kolonien pro 6Well reichen
4.4.4.4 Accutase Passage
Die enzymatische Passage mit dem Accutase Mix ist für neuronal differenzierte Zellen ab
Tag 25 des Differenzierungsprotokolls vorgesehen.
146 Material und Methoden
Benötigte Materialien
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent Life Technologies A11105-01
1x DPBS Life Technologies 14190-094
NMM
Arbeitsanweisung
ÜS abnehmen
1x mit 1x DPBS spülen
+ 500 µl Accutase
3‘ , 37 °C
+2 ml DMEM w/o mit 1000 µl Pipette alles gut abspülen und in 15 ml Falcon
sammeln; 1 – 2 x wdh.
3‘ 350 G
ÜS abnehmen
+2 ml NMM resuspendieren
1:10 Verdünnung mit „Neubauer Improved“ auszählen
Zellen 50.000 Zellen/cm2 auf Laminin/Ornithin beschichtete Wells aussäen
+1 d Mediumwechsel; nachfolgend jeden 2. Tag Medium wechseln
4.4.5 Kryokonservierung
Benötigte Materialien
Kryomedium 30 % DMSO
Kryogefäß mit Innengewinde
DMEM/F12 Gibco 31331-028
Arbeitsanweisung
ÜS absaugen
1x mit 1x PBS waschen
Material und Methoden 147
+ 200 µl Dispase II
5 min bei 37 °C inkubieren nicht anstoßen
ÜS absaugen
15 - 45 min ohne ÜS bei 37°C inkubieren
Unter Lichtmikroskop beobachten
Ränder der Kolonien sollten sich leicht aufwellen
Ansonsten: Inkubationszeit auf maximal 45 min verlängern
Kolonien mit 2 ml DMEM/F12 abspülen
Zellen in Falcon mit 10 ml DMEM/F12 sammeln
Zellen durch Gravitation oder für 3 min bei 250 g sedimentieren lassen
ÜS absaugen
Waschvorgang 1x wiederholen (Zellen reagieren empfindlich auf Dispase Reste)
Kulturen sollten „flockig“ im Medium schwimmen
NICHT zerkleinern!
+ [Anzahl Kryos] x 1ml SCM
+ [Anzahl Kryos] x 0,5 ml SCM w 30 % DMSO tropfenweise zugeben (!!)
10 % DMSO Endkonzentration
ZÜGIG 1,5 ml Zellsuspension pro Kryogefäß austeilen und in Kryocell bei -80 °C
wegfrieren
+ 1 d Kryogefäß in Flüssig-N2 übertragen
Dauerhaft lagerbar
Gefäße IMMER nach folgendem Muster korrekt beschriften:
Zelllinie – ggf. Mutation – Passage – Datum – Verwendungszweck – Initialen
iPS – ΔG6PC3 – #15 – 040512 – 1x6Well – Falk
TIPP: DMSO ist ein starkes Zellgift, nach Zufügen zügig arbeiten!
4.4.6 Transfektion
Für die gezielte Expression von Genen innerhalb eines eukaryotischen Systems wird die
genetische Information meistens in Form von Vektoren transient oder persistent in die
148 Material und Methoden
Wirtszelle eingeschleust. Die Aufnahme von Fremd-DNA in die Zellen kommt normalerweise
nur bei infektiösen Angriffen von Bakterien oder Viren vor. Mit Hilfe der entwickelten
Transfektionsmethoden wurde es aber dennoch möglich, die Membran der Zellen für die
DNA durchlässig zu machen.
4.4.6.1 Calcium-Chlorid-Präzipitation
Bei der Calcium-Phosphat-Präzipitation wird einer Calcium-Chlorid Lösung die zu
transfizierende DNA hinzugefügt. Mischt man diese Lösung anschließend mit einem HBS
Puffer, fallen feine Calcium-Phosphat Kristalle, an deren Oberfläche die DNA gebunden ist,
aus. Über einen noch nicht vollständig verstandenen Vorgang werden diese Kristalle dann
von den Zellen aufgenommen [245].
Benötigte Materialien
Calcium-Phosphat Transfektions Kit Clontech #631312
Medium DMEM w Glu
10 % FCS
1 % Natriumpyruvat Sigma-Aldrich B5887
1 % P/S
10 mM HEPES
25 mM Chloroquine Sigma-Aldrich C6628-25G
HEK Zellen
10 cm Schalen Cellbind Corning 3296
Arbeitsanweisung
Tag 1
5x106 Zellen pro 10 cm Schale in Basalmedium (zwei Schalen pro UC Ladung)
Tag 2
Plasmide und Komponenten auftauen, TF Medium aufwärmen
Plasmide mit Wasser auf 450 µl verdünnen
+ 50 µl CaCl2-Lsg in 1,5 ml Gefäß
+ 500 µl 2x HBS in 15 ml Falcon
Material und Methoden 149
DNA/CaCl2 durch “air-bubbling” mit den 500 µl 2x HBS mischen oder vortexen
o 20‘ RT
Altes Medium von HEK 293 Zellen absaugen
+ 10 ml TF Medium incl. 25 µM Chloroquine
+ DNA Calciumphosphate Mix
o 6 – 12’, 37 °C, 5 % CO2
Medium wechseln (7 ml TF Medium)
4.4.6.2 Lipofektion
Bei der Lipofektion werden kationische Lipide, wie z.B. Lipofectamine, für die Transfektion
genutzt. Sie bilden in wässriger Lösung Liposome, die mit der zu transfizierenden DNA
Komplexe bilden. Diese Komplexe werden dann über Endocytose in die Zellen
aufgenommen. Da die kationischen Lipide toxisch für die Zellen sind, muss das optimale
Verhältnis aus DNA, kationischen Lipiden und der Transfektionsdauer für jede Zelllinie neu
bestimmt werden [246].
Benötigte Materialien
Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent Life Technologies 11668027
OptiMEM Life Technologies 31985-070
Basalmedium
Plasmide
Arbeitsanweisung (Transfektion von LMTK- Zellen)
am Vortag im 6Well LMTK- à 3,0 – 3,5x 105 Zellen/Well auf Deckgläschen aussäen
Transfektion (70 – 80% Konfluenz; alle Angaben für ein Well einer 6Well Platte)
DNA-Menge austitrieren, um Überexpression zu vermeiden:
a) 500 ng pInteresse + 500 ng pcDNA3-Leervektor
b) 100 ng pInteresse + 900 ng pcDNA3-Leervektor
• 100 µl OptiMEM + 1 µg DNA mischen
150 Material und Methoden
• 100 µl OptiMEM + 6 µl Lipofectamine mischen
• beide Verdünnungen vereinigen, mischen und 15 - 45 min bei RT inkubieren
• nach der Inkubationszeit auf 1 ml mit OptiMEM auffüllen und mischen
• in der Zwischenzeit Zellen 2x mit 1-2 ml PBS waschen, 1x mit 1 ml OptiMEM
(Zellen können mit OptiMEM im Brutschrank stehen, bis das Transfektionsgemisch fertig ist)
Zellen trocken saugen und Transfektionsgemisch mit der Pipette gleichmäßig
auftropfen (nie mit Glaspipetten!!)
Zellen für 7 h bei 37 °C inkubieren
Transfektion abstoppen durch Zugabe von 1 ml Kulturmedium mit 15 % FCS
Am nächsten Tag Medium absaugen und durch normales Kulturmedium ersetzen
Proteinnachweis möglich ab 24 h nach Transfektionsbeginn (z.B. IF-Färbung)
Lipofectamin nicht mit Glaspipetten pipettieren
4.5 Reprogrammierung humaner primärer Fibroblasten
Für die Erforschung von entwicklungsneurologischen Erkrankungen gibt es bisher wenige
Modelle, die eine realitätsnahe Untersuchung ermöglichen. Um diese Engpässe etwas zu
erweitern, kann man durch die exogene Expression von einem Set an Transkriptionsfaktoren
Patientenzellen zu induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) reprogrammieren [63] [61].
Erfolgreich reprogrammierte iPS können dann in späteren Experimenten sowohl zu
neuronalen Stammzellen als auch adulten Neuronen differenziert werden und so als
patienten-spezifisches in vitro Model genutzt werden, welches auch die Untersuchung von
Entwicklungsstörungen zulässt.
Durch die persistente Integration von vier humanen Transkriptionsfaktoren in das Genom
und deren exogenen Expression wurden diese Zellen in einen stammzellähnlichen Zustand
zurückversetzt. Dieser Vorgang wird im folgenden Reprogrammierung genannt. In dieser
Arbeit wurden hierfür die vier Yamanaka Faktoren, OCT4, KLF4, SOX2 und c-MYC, unter
Kontrolle des spleen focus-forming Virus Promoters, über einen integrativen,
multicistronischen, lentiviralen Vektor der dritten Generation genutzt [71]. Vektoren dieser
Art fehlen alle viralen proteincodierenden Gene. Die Transkriptionskasette einfassenden
long terminal repeats (LTRs) sind stark verändert und ermöglichen so nur noch die Insertion
Material und Methoden 151
in das Wirtsgenom, aber keine erneute Exzision. Die 3‘LTR ist in diesem System stark
deletiert und die 5‘LTR ist darüber hinaus an einen RSV Promoter fusioniert [247]. Für die
Produktion der Viruspartikel wurden HEK 293 Zellen mit drei Hilfsvektoren ko-transfiziert.
Auf dem Vektor pcDNA3.gp4xCTE sind die Informationen für die RNA abhängige DNA
Polymerase (pol) und der Strukturproteine (gag) codiert. Auf dem Vektor pRSV-Rev ein
lentiviraler Transkriptionsfaktor (Rev) und auf dem Vektor pMD2.G das Verpackungsprotein
des Vesikular stomatitis Virus (Abb. 25).
Abbildung 4.10: Evolution der lentiviralen Vektorsysteme. Oben der lentivirale Ursprungsvektor, darunter der lentivirale Transfervektor der 3. Generation und die dazugehörigen Verpackungsvektoren. LTR: long terminal repeats, GAG: Strukturprotein, POL: Polymerase, REV: Transkriptionsfaktor, SFFV: Promotor des Spleen focus forming Virus, IRES: Interne ribosomale Eintrittsstelle, CMV: Promotor des Cytomegalie Virus, VSV-G: Strukturprotein des Vesikular stomatitis Virus.
Während der Transkription werden die vier Transkriptionsfaktoren als eine prä-mRNA
gebildet, die sich anschließend über selbstschneidende Endohydrolase Schnittstelle
voneinander separieren und einzeln translatiert werden. Der Reporterfarbstoff wird über
eine eigene interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES) exprimiert. Die darauf folgenden
Veränderung sind noch nicht umfassend verstanden, wahrscheinlich ändert sich aber die
Epigenetik weniger Zellen derart, dass sie sich zu einem morphologisch wie auch
transkriptionell stammzell-ähnlichen Zustand zurückentwickeln. Um die Effizienz der
Reprogrammierung noch zu steigern, wurde dem Ansatz Valproinsäure beigefügt [72].
GAG PRO POL
VIF
VPR
VPU
NEF
TAT REV LTRLTR ENV
3' LTR
POLGAG
RR
E
CMVREVCMV
Poly-AVSV-GCMV
RSV-5'LTR SFFV KFL4 SOX2 c-MYC dTomOCT4 P2A
T2A
E2A IRES
152 Material und Methoden
4.5.1 Viruspartikel Produktion
Benötigte Materialien
Siehe benötigte Materialien 4.4.7.1
HEK 293 Zellen
Plasmide pMD2.G
pRSV_Rev
pcDNA3.gp4xCTE
pRRL.PPT.SF.hOKSMco-idTom.pre.FRT
10 cm Schalen
Ultrazentrifuge (~112.000 g)
Arbeitsanweisung
Tag 1
5x106 Zellen pro 10 cm Schale in Basalmedium (zwei Schalen pro UC Ladung)
Tag 2
Plasmide und Komponenten auftauen, TF Medium aufwärmen
Plasmide mit Wasser auf 450 µl verdünnen
+ 50 µl CaCl2-Lsg in 1,5 ml Gefäß
+ 500 µl 2x HBS in 15 ml Falcon
DNA/CaCl2 durch “air-bubbling” mit den 500 µl 2x HBS mischen oder vortexen
o 20‘ RT
Altes Medium von HEK 293 Zellen absaugen
+ 10 ml TF Medium incl. 25 µM Chloroquin
+ DNA Calciumphosphate Mix
o 6 – 12’, 37 °C, 5 % CO2
Medium wechseln (7ml TF Medium)
Tag 3
Überstand vorsichtig mit einer Einmalspritze abnehmen
Material und Methoden 153
Durch 22 µm Filter sterilisieren
+ 7 ml TF-Medium
Überstand bei 4 °C in Falcons bis zur Ultrazentrifugation lagerbar
Erntezeiten
0 h Transfektion
12 h nach Transfektion Überstand verwerfen + 7 ml TF-Media
36 h nach Transfektion Ernte 7 ml + 7 ml TF media
48 h nach Transfektion Ernte 7 ml Zellen verwerfen oder mit 4 % PFA 15´ RT fixieren
Überstände vereinigen und bei 33.000 rpm (112.000 g) für 2 h und 4 °C
zentrifugieren
Viruspartikel in 1/100 Basalmedium des Ausgangsvolumens resusp. (28 ml > 280 µl)
Lagerung bei – 80°C oder Flüssigstickstoff
Plasmids: Transfer Vector 10 µg / 10 cm Schale
Gagpol 12 µg / 10 cm Schale
Rev 5 µg / 10 cm Schale
Env 1,5 µg / 10 cm Schale
Zeitschema:
Tag 1 Zellen aussäen 20:00 Uhr
Tag 2 Transfektion 8:00 Uhr 1. Mediumwechsel 16:00 - 20:00
Uhr
Tag 3 1. Viruspartikel Überstand Abnahme 20:00 Uhr
Tag 4 2. Viruspartikel Überstand Abnahme 08:00 Uhr Ultrazentrifugation 2 h, 4 °C,
33,000 rpm
Sofortige Titrierung
Tag 3 HT1080 aussäen
Tag 4 Transduktion
154 Material und Methoden
Tag 5 Mediumwechsel
Tag 6 Fixierung + FACS Messung innerhalb einer Woche
4.5.2 Virustiterbestimmung
Benötigte Materialien
Siehe Benötigte Materialien 4.5.2
HT1080 Zellen anstatt Primärfibroblasten
Arbeitsanweisung
HT1080 Zellen auftauen
Tag 0
HT1080 Zellen mit Trypsin/EDTA passagieren
30,000 Zellen pro Well einer 6Well-Platte aussäen
Tag 1
Transduktion
Verdünnungsreihe in Dubletten erstellen
o z.B.: Negativkontrolle, 1 µl, 3 µl, 9 µl und 27 µl des Viruspartikelkonzentrats
Medium absaugen
+ 4 ml Basalmedium + 4 ng/ml Protaminsulfat
o Mindestens 4 ml verwenden, andernfalls können die Zellen bei der
„Spininoculation“ trocken fallen und sterben
+ ausgerechnetes Volumen Viruspartikel
o Platten mit Parafilm versiegeln
1 h „Spininoculation“ bei 711 g und 37 °C mit einem Plattenrotor
37 °C, 5 % CO2 ÜN
Tag 3
Überstand absaugen
Material und Methoden 155
Vorsichtig 2x mit 1x PBS waschen
+ 2 ml 0,25 % Trypsin-EDTA
o 3 – 5’ 37 °C, 5 % CO2
Reaktion mit fünffachem Volumen Basalmedium abstoppen
o Zellen ernten
o 5’ 500 G
Überstand absaugen und in 1 ml frischer warmer 4 % PFA 1x PBS ordentlich
resuspendieren
o 15’ RT
o 5’ 500 G
Überstand absaugen
Vorsichtig 2x mit 1x PBS waschen
in 200 µl FACS-Flow Puffer resuspendieren (2 % FCS, 0,02 % NaN3 und 2 mM EDTA)
Zellen können bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden bis zur Messung
FACS Analyse
Negativkontrolle messen
Parameter für vorwärts und seitwärts Scatter so definieren, dass Zellen lebend und
dTOmato positive
Verdünnungsreihe nacheinander messen; 10.000 Zellen min. bei jeder Messung
% lebende dTomato positive Zellen (von allen lebenden Zellen)
Titerberechnung
z.B.
HT1080 Fibrosarcoma: 18.2 h Verdopplungszeit → 2,6 Verdopplungen in 48 h
156 Material und Methoden
4.5.3 Transduktion, Selektion, Expansion
Benötigte Materialien
Basalmedium
SCM
Ascorbinsäure Sigma-Aldrich A4544-25G
Valproinsäure Sigma-Aldrich P4543-10G
ROCK Inhibitor Sigma-Aldrich Y0503-1MG
Viruspartikel
Beheizbare Zentrifuge mit Plattenrotor
Arbeitsanweisung
Primär Fibroblasten auftauen und für min. 1 Woche kultivieren
Tag 0
Fibroblasten mit Trypsin/EDTA passagieren
30,000 Zellen pro Well einer 6Well-Platte aussäen
Tag 1
Transduktion
MOI 0,25 der Viruspartikel
Medium absaugen
+ 4 ml Basalmedium + 4 ng/ml Protaminsulfat
o Mindestens 4 ml verwenden, andernfalls können die Zellen bei der
„Spininoculation“ trocken fallen und sterben
+ ausgerechnetes Volumen Viruspartikel
o Platten mit Parafilm versiegeln
1 h „Spininoculation“ bei 711 g und 37 °C mit einem Plattenrotor
37 °C, 5 % CO2 ÜN
Tag 2 und 4
Material und Methoden 157
Überstand absaugen
+ Basalmedium + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure
Tag 6
Überstand absaugen
+ Basalmedium 1:1 SCM + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure
Tag 7
MMC behandelte MEF Feeder Zellen auf Gelatine beschichtete 6Well-Platten
aussäen (75.000 - 150.000 Zellen/Well)
Tag 8
Primär Fibroblasten passagieren Trypsin/EDTA Split
In SCM + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure + 10 µM ROCK Inhibitor
resuspendieren
Auf vorbereitete Feeder aussäen (1:5 – 1:50, je nach Wachstumsstärke)
Tag 10
Überstand absaugen
SCM + 50 µg/ml Vitamin C + 2 mM Valproinsäure
Tag 12
Überstand absaugen
SCM + 50 µg/ml Vitamin C
Ab Tag 13 täglich, bis Kolonien groß genug zum picken sind
Überstand absaugen
SCM + 50 µg/ml Vitamin C
Tag 18 – 25
Manuelle Selektion der Kolonien (siehe auch 4.4.5.3)
158 Material und Methoden
Jeden Klon einzeln weiter expandieren, bis er 1 – 3 6Wells füllt (wie unter 4.4.4 und
4.4.5.2 beschrieben)
Kryokonservierung (4.4.6)
TIPP
Beim Selektieren der Klone sollte darauf geachtet werden, dass man Klone jeder Größe
wählt. Ebenfalls sollte man Klone jeder Replikationsgeschwindigkeit wählen. An
verschiedenen Tagen selektieren!
Abbildung 4.11: Zeitlicher Ablauf einer Reprogrammierung
4.6 Kortikale Differenzierung
Die erste Differenzierungsstufe während der Embryogenese ist die Entwicklung der drei
Keimblätter, Endoderm, Mesoderm und Ectoderm aus der Blastula. Sie bilden die Grundlage
für alle weiteren reifen Gewebe, wie den Verdauungstrakt, die Muskulatur oder das Gehirn.
Die meisten bisher etablierten Differenzierungsprotokolle für iPS beinhalten die Bildung von
sog. „Embryoid bodies“ und einer terminierten Zugabe von „small molecules“. Die
Grundlage des in dieser Arbeit optimierten Differenzierungsprotokolls bildete hingegen ein
Ansatz in adhärenter Kultur. Hierbei wurden die Stammzellen in Konfluenz unter Zugabe von
zwei SMAD Inhibitoren und Retinolsäure kultiviert. Das sich daraus entwickelnde
Neuroectoderm durchlief anschließend unter weiterer Zugabe von Retinolsäure die
embryonale Neurogenese des humanen Kortexes [112].
Material und Methoden 159
4.6.1 Modifiziertes Protokoll nach Yichen Shi et al.
Benötigte Materialien
Laminin Sigma Aldrich L2020
Poly-L-Ornithin Sigma Aldrich P4957
Matrigel BD 356234 400 µl Aliquots -20
°C
ROCK Inhibitor Sigma-Aldrich Y0503-1MG
bFGF RnD 4114-TC-01M
Dispase II Roche 4942078001
Accutase Gibco A1110501
SCM
MEF-cm
NMM
NIM
Glaspasteurpipetten
Bunsenbrenner
6- und 12Well-Platten
45 µm Zellsieb
Arbeitsanweisung
Voraussetzung: Gesunde iPS Kultur auf MG/MEF-cm in 6Wells ~70 % konfluent
WICHTIG: bFGF Konzentration sollte so gering wie möglich sein!!! Hohe bFGF
Konzentrationen reduzieren die Effektivität der Differenzierung drastisch!
Herstellung einer konfluenten iPS Kultur auf Matrigel
Vorweg: 12Well Platte mit Matrigel beschichten
+ 1:10 Dispase II (10 mg/ml) direkt zum Medium
5‘ ,37 °C 5 % CO2
ÜS abnehmen
10 – 15‘ ohne ÜS 37 °C, 5 % CO2
160 Material und Methoden
Mit genügend Basalmedium ohne KOSR abspülen
Mit 1 G für 5‘ oder 250 G 3‘ abzentrifugieren
Waschvorgang 1x wiederholen
Zellen in MEF-cm + evtl. 10 µM ROCK Inhibitor resuspendieren, dabei Zellen
möglichst vereinzeln
Ggf. mit 45 µm Zellsieb Zellklumpen entfernen
In MG beschichtete 12Wells aussäen
Zellen sollen nächsten Tag konfluent sein, meist reicht ein Splitverhältnis von 6:1 aus
(ca. 3x 6Well auf 1x 12 Well; wenn die Kultur vorher recht dicht war ~70 %)
37 °C, 5 % CO2, ÜN
Neuronale Induktion (Tag 1 – Tag 8-12)
Kontrolle der Zellen unter dem Mikroskop: konfluent?
o Nein
In MEF-cm weiter kultivieren, bis konfluent
o Ja
1x mit 1x PBS waschen
+ 1ml NIM
37 °C, 5 % CO2, täglich Medium wechseln
Ca. um Tag 8 – 12 sollten sich alle großen Stammzellen zu einem gleichmäßigen, dicht
gepackten Neuroectoderm entwickelt haben und können/müssen dann passagiert werden.
o Kleinere Zellen mit deutlich kleinerem Zellkern zeigen oft Wachstumsrichtung
Passage
Vorweg
o 6Well mit Poly-L-Ornithin/Laminin beschichten (jeweils 4 h, 37 °C)
o Sterile Glaspasteurpipetten über dem Bunsenbrenner zu runden (!!) Spitzen
ziehen
Material und Methoden 161
Zellrasen mit vorbereiteten Pasteurpipetten in ca. 16 kleine Quadrate teilen
+ 100 µl Dispase II (Stlsg.: 10 mg/ml) direkt zum Medium
o 3-10‘ ,37 °C, 5 % CO2
Zeit muss jedes Mal neu bestimmt werden, unter dem Lichtmikroskop
beobachten
ÜS vorsichtig absaugen (!!!!)
Mit genügend Basalmedium ohne KOSR/FCS vorsichtig abspülen
o Möglichst große Klumpen behalten
Mit 1 G für 5‘ absinken lassen
Waschvorgang 1x wiederholen
In NIM sehr vorsichtig resuspendieren
o Durch auf- und abpipettieren mit einer 1000 µl Pipette in Aggregate von 300
– 500 Zellen brechen. Nicht kleiner!
Auf Poly-L-Ornithin/Laminin beschichtete 6Wells aussäen
o Splitrate 1:2 (1x12Well in 1x 6Well aussäen)
37 °C, 5 % CO2 ÜN
Wechsel zu NMM am nächsten Tag, tägliche Mediumwechsel
NSC Expansion (- 20 – 30 d)
Tägliche Kontrolle auf erste neuronale Rosetten (12 -17 d); falls ja
o + 20 ng/ml bFGF für 2 - 4 Tage, um Rosettenwachstum zu fördern
Dispase Passage
Vorweg: 6Well-Kulturgefäß mit Laminin beschichten
+ 200 µl Dispase II (Stlsg.: 10 mg/ml) direkt zum Medium
o 5‘ ,37 °C, 5 % CO2
Mit genügend Basalmedium ohne KOSR/FCS abspülen
Durch auf- und abpipettieren mit einer 1000 µl Pipette in Aggregate von 300 – 500
Zellen brechen.
Mit 1 G für 5‘ oder 350 G 3‘ abzentrifugieren
Waschvorgang 1x wiederholen
162 Material und Methoden
In NMM resuspendieren
Auf Poly-L-Ornithin/Laminin beschichtete 6Wells aussäen
o Splitrate 1:2-3 (1 6Well in 2-3 6Wells aussäen)
37 °C, 5 % CO2
Mediumwechsel jeden 2. Tag
Accutase Passage (25-30 d)
ÜS abnehmen
1x mit 1x PBS spülen
+ 500 µl Accutase
3‘, 37 °C
+2 ml DMEM w/o mit 1000 µl Pipette alles gut abspülen und in 15 ml Falcon
sammeln; 1 – 2x wdh.
3‘ 350 G
ÜS abnehmen
+2 ml NMM resuspendieren
1:10 Verdünnung mit „Neubauer improved“ auszählen
Zellen 50.000 Zellen/cm2 auf Poly-L-Ornithin/Laminin beschichtete Wells aussäen
+1 d Mediumwechsel; nachfolgend jeden 2. Tag Medium wechseln
Oder
Kryokonservierung (siehe 4.4.6)
Ab hier keine weiteren Splits mehr, da nun starke Neurogenese!!
Material und Methoden 163
4.7 Funktionelle Analysen
4.7.1 Antikörper
Tabelle 4.6 Primärantikörper Abkürzungserklärung: Intra: Intrazelluläres Epitop, Extra: extrazelluläres Epitop, ER: Endoplasmatisches Reticulum, NCAM: Neurales Zell Adhäsionsprotein, PSA: Polysialinsäure, pAb: polyklonaler Antikörper, Mab: monoklonaler Antikörper
Antikörper Antigen Spezies Firma Best.Nr Konz. WB IF/FC FACS Beschreibung Bemerkung Lagerung
Giantin Giantin human (Golgi)
Kaninchen Covance PRB-114C
- 1:5000 1:1000 -
polyclonal, Antiserum. Golgi
Marker; also works in IF with murine cell
line
Western transfer in presence of
0,1%SDS, after Transfer, rinse blot with 50%MeOH to
remove any residual SDS Intra
-20 °C
IRE1 IRE1 (ER)
Kaninchen Abcam ab37073 1
mg/ml 1:1000-1:2000
1: (1µg/ml)
- ER Marker alte Bestellnummer:
ab48189 Intra -20 °C
Calnexin Calnexin
(ER) Maus Millipore MAB3126
1 mg/ml
1:200 - 1:2000
1:500 - monoclonal, IgG1,
ER Marker
nicht sicher, ob der so gut funktioniert!
Intra -20 °C
NCAM 123C3
human NCAM IgG1
Maus (MHH) - 6,42
mg/ml
1 µg/ml (bis 5 µg/ml)
1:642 (10
µg/ml)
-
IgG1,subspez.2.AK IgG1 1:10000,
besser H+L 2.AK IgG 1:20000
in Magermilch/PBST OHNEAzid (bei
anschl. ECL Entwicklung) Extra
-20 °C
735 PSA Maus (MHH) - 2
mg/ml 1:800 1:800 - IgG2a Extra -20 °C
St3 St3Gal3 Kaninchen Abcam ab103837 - - 1:100 - PAb IgG Intra -20 °C
ST3S St3Gal3 Kaninchen Sigma AV46706-
50UG 50 µg/ - 1:500 - PAb IgG
Hu et al Paper Intra
-20 °C
164 Material und Methoden
Oct3/4 Oct3/4 Maus Santa Cruz
Biotechnoligies SC-5279
200 µg/ml
- 1:50 - MAb IgG2B Intra 4°C
SSEA4 SSEA4 Maus Biozol BLD-
330402 100 µg - 1:100 - Mab IgG3 Extra 4°C
Pax6 Pax6 Maus Santa Cruz
Biotechnoligies SC81649
200 µg/ml
- 1:300 - MAb IgG1 Intra 4°C
Otx1/2 Otx1/2 Kaninchen Millipore ab9566 100 µl - 1:300 - Serum Intra -20°C
Tbr1 Tbr1 Kaninchen Abcam ab31940 1
mg/ml - 1:200 1:200 PAb Intra -20°C
Satb2 Satb2 Maus Abcam ab51502 0,1
mg/ml - 1:200 1:200 MAb Intra -20°C
Tbr2 Tbr2 Kaninchen Abcam ab23345 0,5 – 1 mg/ml
- 1:100 PAb Intra -20°C
c-Myc c-MYC-
tag Maus Sigma Aldrich M4439
2 mg/ml
1:5000 1:1000 - MAb - 4 °C
Tabelle 4.7 Sekundärantikörper Abkürzungserklärung: APC: Alophycocyanin
Antikörper Antigen Spezies Firma Best.Nr Konz. WB IF/FC FACS Lagerung
Anti-Maus IgG Alexa Fluor 488 Maus IgG Ziege LifeTechnologies A-11029 2 mg/ml - 1:300 - -20 °C
dunkel
Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 555 Kaninchen IgG Ziege LifeTechnologies A-21429 2 mg/ml - 1:600 - -20 °C
dunkel
Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488 Kaninchen IgG Ziege LifeTechnologies A-11008 2 mg/ml - - - -20 °C
dunkel
Material und Methoden 165
Anti-Maus IgG APC Kaninchen IgG Ziege LifeTechnologies A-10931 1 mg/ml - - 1-10
µg/ml
-20 °C
dunkel
Anti-KaninchenIgG APC Maus IgG Ziege LifeTechnologies A-865 1mg/ml - - 1-10
µg/ml
-20 °C
dunkel
166 Material und Methoden
4.7.2 Proteinisolation
4.7.2.1 Proteinisolation aus TriZOL Proben
Benötigte Materialien
TriZol Invitrogen # 15596-018
EtOH 100 %
Chloroform
Isopropanol
Lösung A 0.3 M Guanidine hydrochloride in 95% Ethanol
Probenpuffer 8 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff
Arbeitsanweisung
1ml TriZoL pro 10 cm2 oder 5-10 x 106 Säugerzellen
ÜS absaugen; 1x mit 1x PBS waschen
+ 1 ml/10 cm² TriZol aufgeben, mit Zellschaber abkratzen, durch mehrmaliges auf-
und abpipettieren homogenisieren (je nach Zelldichte Menge anpassen)
Hier Einfrierschritt bei -20 °C möglich
TriZol Pellet auf Eis auftauen lassen -> 15’ bei RT
+ 0,2 ml Chloroform pro 1ml TriZol -> 15“ schütteln
Falls notw. in 2 ml Gefäß überführen -> 3’ bei RT -> 15’ 12.000 G
Phasentrennung
Abbildung 4.12: Proteinphase TriZOL Aufreinigung
Obere wässrige Phase in neues Gefäß überführen -> RNA Isolierung
+ 0,3 ml 100 % EtOH pro ml TriZol invertieren -> 3‘ RT -> 5‘ 2000 g, 4 °C
Organische Phase oberhalb des DNA Pellets abnehmen und in neues 1,5 ml Gefäß
überführen
Material und Methoden 167
+ 1,5 ml Isopropanol pro ml TriZol -> 10‘RT -> 10‘ 12000g, 4 °C
Überstand verwerfen
+ 2 ml Lösung A pro ml TriZol -> 20‘RT -> 5‘ 7500 g, 4 °C
Überstand verwerfen
Waschvorgang mit Lösung A zweimal wiederholen
+ 2ml 100 % EtOH -> 30‘ RT -> 5‘ 7500 g, 4 °C
Überstand verwerfen -> Vakuumzentrifuge 5-10‘
+ Probenpuffer -> ÜN RT
Lagerung bei -5 bis -20 °C
4.7.2.2 Lysepufferkit
Benötigte Materialien
ProteoJet Mammalian Cell Lysis Kit Fermentas K0301
Protease Inhibitor Cocktail
DPBS
Arbeitsanweisung
Protease Inhibitor zu benötigter Menge Lysepuffer zufügen
Überstand von den Zellen abnehmen
1x mit DPBS waschen
Überstand verwerfen
+ Lysepuffer (400 µl 6Well, 1 ml 10 cm Schale)
o 10‘ RT Schüttler
Lysierte Zellen in 1.5 ml Gefäß sammeln (ggf. Zellschaber nutzen)
o 15‘ 16.000 – 20.000 g
Überstand in neues Gefäß überführen
Sofort verwenden, ansonsten Lagerung bei -80 °C
168 Material und Methoden
4.7.3 SDS-Gelelektrophorese
Bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) nach einer Methode von Laemmli
(1970) erfolgt die Auftrennung von denaturierten Proteinen unter Zugabe eines Detergens
(Natriumdodecylsulfat, SDS) und somit nur anhand der Molekülgröße. Das negativ geladene
anionische Tensid SDS denaturiert die Proteine, der resultierende Komplex erhält durch die
angelagerten Sulfatgruppen eine gleichmäßig verteilte negative Ladung. Dementsprechend
wandern bei dieser Methode alle Proteine im elektrischen Feld zum Pluspol. Dabei werden
die Proteine zunächst in einem relativ großporigen Sammelgel fokussiert und anschließend
in einem feinporigen Trenngel deutlich voneinander separiert. Die nötige Trennschärfe wird
durch einen pH-Sprung von 6,8 auf 8,8 an der Grenze zwischen Sammel- und Trenngel
erreicht.
Das hier verwendete Sammelgel enthielt standardmäßig 3% des Polymers. Die
Acrylamidkonzentration des Trenngels wurde in Abhängigkeit von der Größe der
aufzutrennenden Proteine gewählt (10 – 12 %)
Benötigte Materialien
Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels 10 % BioRad 456-1031
Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Gels 12 % BioRad 456-1041
Laemmli Proben Puffer BioRad 161-0737EDU
10x Tris/Glycine/SDS Electrophoresis Buffer BioRad 161-0772EDU
Bio-Safe Coomassie Stain BioRad 161-0786
Beta-ME
Mini-PROTEAN Tetra Cell
Netzteil
Pre-stained Page Ruler Plus LifeTechnologies 26619
Arbeitsanweisung
2 Gele in Kammer einspannen (ggf. Leergel verwenden)
o Klebestreifen unten abziehen
In Mini-PROTEAN Kammer einsetzen
Mit 1x TGS-Puffer Zwischenraum und Kammer bis Markierung auffüllen
20 – 30 µg Gesamtprotein 1:1 mit Laemmli-Puffer mischen
Material und Methoden 169
o 10‘ 98 °C
Kamm aus dem Gel entfernen
o Taschen spülen
Proben in Taschen auftragen
Konstant 200 V max. 40 mA
Um Proteinmenge zu überprüfen, kann anschließend mit Bio-Safe Coomassie gefärbt
werden
Gel in Schale mit A.dest waschen
o 3x 5‘
+ 50 ml Bio-Safe Coomassie
o 1 h Schüttler
Coomassie verwerfen
+ A.dest waschen bis nur noch Banden sichtbar
4.7.4 Western Blot
In der SDS-PAGE aufgetrennte Proteine können mit dieser Methode auf eine Nitrocellulose
oder PVDF Membran übertragen werden. Es wurde hierbei das sog. „Semi-dry“ Verfahren
verwendet.
Benötigte Materialien
Nitrocellulose Whatman 10401196
PVDF Membran Roche 03010040001
Whatman Paper Whatman 3030672
Transferpuffer BioRad 1610771
Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell
Arbeitsanweisung
Gel, Filterpapier und Membran in Transferpuffer einlegen
o 5‘ RT
Blotting-Sandwich zusammen bauen
170 Material und Methoden
Abbildung 4.13 Schematischer Aufbau eines Western Blots
o Mit leerem 15 ml Falcon vorsichtig evtl. Blasen aus dem Sandwich
herausrollen (mit wenig Druck immer nur in eine Richtung arbeiten)
Nochmals mit wenig Transferpuffer befeuchten
15 – 30‘ 10 – 15 Volt
Mit einer Ponceau S Färbung kann die Bloteffizienz überprüft werden
4.7.5 Detektionsmethoden
Für den Nachweis von einzelnen Proteinen wurden die Epitope zunächst mit spezifischen
Primärantikörpern markiert. Diese werden spezifisch gegen ein Epitop, wie etwa ein c-Myc-
Tag, z.B. in Kaninchen oder Mäusen, gebildet.
Bei der Auswahl der Antigene für Western Blot Antikörper wurde in dieser Arbeit darauf
geachtet, dass diese im denaturierten Zustand markierbar waren. Die daran bindenden
Sekundärantikörper waren jeweils für den Fc-Teil des Antikörpers des jeweiligen Wirtes
spezifisch. (Primär = IgG aus der Maus -> sekundär gegen Fc-Teil des IgG aus der Maus). Sie
waren entweder mit einer Peroxidase aus dem Meerrettich (HRP), mit dem Infrarot
Farbstoff 800CW oder mit den Alexa Fluor Farbstoffen 488 oder 555 konjugiert.
Abbildung 4.14 Schematischer Ablauf einer Immunfärbung. Bindung der Primärantikörper an distinkte Epitope, Bindung mehrerer markierter Sekundärantikörper an den Fc-Teil der Primärantikörper.
4.7.5.1 Chemielumineszenz
Bei der Detektion mit HRP-konjugierten Antikörpern gibt man zu den mit Primär und
Sekundär-antikörpern markierten Proteinen eine Luminol enthaltende Lösung. Die
Oxidation von Luminol wird nun folgend von der Peroxidase katalysiert. Die hierbei
freiwerdende Lumineszenz kann dabei auf einem photosensitiven Film detektiert werden.
Material und Methoden 171
Benötigte Materialien
Pierce™ ECL Western Blotting Substrate Life Technologies 32106
Primärantikörper
Sekundärantikörper αRb-HRP GE NA9340V
Amersham Hyperfilm ECL GE 28-9068-36
1x TBS
Blockierlösung 5 % FBS in 1x TBS
Entwickler Fixierer
Arbeitsanweisung
Membran in 1x TBS waschen
o 5‘ RT Schüttler
Überstand verwerfen
+ 10 – 50 ml Blockierlösung
o 1 h RT Schüttler
Überstand verwerfen
Primärantikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken
o 4 °C ÜN
o 1 h RT Schüttler
3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler
Sekundär Antikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken
o 1 h RT Schüttler
o 3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler
Membran in Folie einschlagen und in Kassette in Dunkelkammer bringen
Detektionsreagenz 1und 2 1:1 mischen und auf Blot geben
o 1‘ RT
o Überstand verwerfen
Blot in Folie in Kassette legen, Hyperfilm auflegen
o Film 1‘ – 1 h belichten
Film entwickeln
172 Material und Methoden
4.7.5.2 Fluoreszenz
Für die fluorogene Detektion der Proteine wurden diese mit von Infrarot-Farbstoffen
konjugierten Sekundärantikörpern markiert.
Benötigte Materialien
Primärantikörper
Sekundärantikörper αRbIgG-IR Dye 800CW LI-COR 925-32213
1x TBS
Blockierlösung 5 % FBS in 1x TBS
Entwickler Fixierer
Arbeitsanweisung
Membran in 1x TBS waschen
o 5‘ RT Schüttler
Überstand verwerfen
+ 10 – 50 ml Blockierlösung
o 1 h RT Schüttler
Überstand verwerfen
Primär Antikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken
o 4 °C ÜN
o 1 h RT Schüttler
3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler
Sekundärantikörper in 1 ml pro Blot verdünnen, mit Parafilm abdecken
Alle weiteren Arbeiten abgedeckt, dunkel ausführen!!!
o 1 h RT Schüttler
o 3 x 5‘ in 1x TBS Schüttler
Membran in Folie einschlagen und in Kassette zur Detektion bringen
4.7.6 Fixierung von Säugerzellen
Die Fixierung von Säugerzellen wurde in dieser Arbeit mit Formaldehyd durchgeführt.
Hierfür wird eine 8 % Paraformaldehydlösung hergestellt. Paraformaldehyd zerfällt in
Material und Methoden 173
Wasser zu Formaldehyd, welches mit den Proteinen in den Zellen reagiert und sie
miteinander vernetzt.
Benötigte Materialien
8 % PFA Lösung
1x DPBS
Arbeitsanweisung
ÜS absaugen
o 2x mit 1x PBS waschen
Mit 1,5 ml 4 % PFA in 1x PBS überschichten
o 15 – 30 min bei RT auf Schüttler inkubieren
Oder:
+ 1:1 8 % PFA in 1x PBS direkt zum Medium
15 – 30 min bei RT auf Schüttler inkubieren
3 x mit 1x DPBS waschen
Letztes DPBS Volumen darauf belassen
Platte mit Parafilm versiegeln
Lagerung bei 4 °C bis zu 1 Monat
4.7.7 Immunfluoreszenzfärbung
Die Immunfluoreszenzfärbung von fixierten Zellen beruht auf den gleichen Prinzipien wie
die Markierung von Epitopen in der Western Blot Detektion.
Bei der Auswahl der Antikörper wurde in dieser Arbeit darauf geachtet, dass die Antigene
für die Antikörperproduktion Epitope aus der nativen Form des Proteins waren. Die
Sekundärantikörper waren entweder mit Alexa Fluor 488 oder 555 markiert.
174 Material und Methoden
Name Absorptionsmaximum Emmissionsmaximum Filter
Alexa Fluor-488 490 525 FITC
Alexa Fluor 555 555 580 TRITC
Abbildung 4.15 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved.
Benötigte Materialien
Blockierlösung (5 % FBS oder Ziegenserum in DPBS)
Permeabilisierungslösung (0.1 % Triton X-100 in 1x DPBS)
1x DPBS
MiliQ
Primärantikörper
Sekundärantikörper Alexa Fluor 488 oder 555
ProLong® Gold Antifade Mountant with DAPI Life Technologies P36941
Arbeitsanweisung (für 1x 6Well)
Alle Inkubationszeiten nach Zugabe des Sekundärantikörpers abgedunkelt ausführen
(dunkle Schale auflegen), Zellen vorher mit PFA fixieren
Optional: Permeabilisierung bei Markierung von intrazellularen Epitopen
Mit 1,5 ml 0,1 % Triton X-100 in 1x PBS überschichten
o 15 min bei RT auf dem Schüttler inkubieren
+ 1,5 ml Blockierlösung 2 % NGS in 1x PBS
o 30 – 60 min bei RT auf dem Schüttler inkubieren
Primärantikörper in vorgeschriebener Verdünnung in Blockierlösung mischen
Material und Methoden 175
50 µl Antikörper aufgeben und Verdunstung durch Auflegen eines
Parafilmplättchens verhindern
o 1 h bei RT auf dem Schüttler inkubieren
o Alternativ bei 4 °C ÜN
o Nächsten Tag 1 h bei RT inkubieren
Parafilm entfernen
3x mit 1x PBS waschen
o 5 min bei RT auf dem Schüttler inkubieren
Sekundärantikörper in vorgeschriebener Verdünnung in Blockierlösung mischen
50 µl Sekundärantikörper auf die markierte Stelle pipettieren und ebenfalls vor
Verdunstung durch Auflegen eines Parafilmplättchen schützen
o 1 h bei RT auf dem Schüttler inkubieren
3x mit 1x PBS waschen, jeweils
o 5 Min bei RT auf dem Schüttler inkubieren
2x mit MiliQ waschen, jeweils
o 5 Min bei RT auf dem Schüttler inkubieren
Kurz unter dem Abzug antrocknen lassen
10 – 20 µl DAPI II mounting solution auf Objektträger geben, trockenes Deckgläschen
über einen Rand vorsichtig, blasenfrei auflegen
o 24 h bei RT im Dunkeln trocknen lassen
Die Ränder mit Nagellack verschließen
Bei 4 °C bis zu 1 Jahr lagerbar
TIPP
Parafilm lässt sich am einfachsten entfernen, indem direkt 1,5 ml 1x PBS des ersten
Waschschrittes aufgegeben wird und das aufschwimmende Parafilmplättchen mit einer
Pinzette entfernt wird.
4.7.8 DiI Färbung
DiI, genauer 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate, ist ein
lipophiler kationischer Indocarbocyanid Farbstoff. Er wurde in dieser Arbeit genutzt, um die
176 Material und Methoden
Zellmembranen von Neuronen zu färben. Die so gefärbten Zellen sollten anschließend unter
dem Fluoreszenz-mikroskop morphologisch charakterisiert werden.
Name Absorptionsmaximum Emmissionsmaximum Filter
DiI 549 565 TRITC
Abbildung 4.16 © 2015 Thermo Fisher Scientific Inc. All Rights Reserved.
Benötigte Materialien
8 % PFA Lösung
1x DPBS
DiI Kristalle Life Technologies D3911
ProLong® Gold Antifade Mountant with DAPI Life Technologies P36941
Arbeitsanweisung
Fixierung
2 % frisch aufgetautes PFA (Endkonz.) -> 15 min RT (zu 2 ml Medium kommen 666 µl 8 % PFA)
ÜS ab, 1x mit PBS gewaschen
DiI Färbung
ÜS ab + DiI Kristalle
10 min RT
2x mit PBS waschen, trocknen lassen, anschl. in DAPI eindeckeln
Analyse nach 72 h möglich
Material und Methoden 177
4.7.9 Adhärenz Assay
Die Adhärenz von Zellen sowohl an ihren Untergrund als auch an andere Zellen wird
hauptsächlich über die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix bestimmt.
Veränderungen in der ECM, aber auch in intrazellulären Signalwegen und dem Cytoskelett,
können so auch das Adhärenzverhalten dieser Zellen ändern. In diesem Assay wurde die
Adhärenzgeschwindigkeit einer Zellsuspension auf einen spezifischen Untergrund
gemessen. Hierfür wurden neuronale Vorläuferzellen (NI d30) geerntet, gezählt und auf
einen Poly-L-Ornithin/Laminin beschichteten Untergrund wieder ausgesät. Nach definierten
Zeitpunkten wurden die noch nicht adhärierten Zellen abgenommen und gezählt. Aus
diesen Daten konnte anschließend eine Anheftungskurve über die Zeit bestimmt werden.
Benötigte Materialien
0.5 µM sterile EDTA Lösung
1x DPBS Life Technologies 14190-094
Laminin Sigma Aldrich L2020
Poly-L-Ornithin Sigma Aldrich P4957
NMM
„Neubauer improved“ Kammer
Arbeitsanweisung
Voraussetzung: lebende Zellkultur, die als einzelne Zellen wachsen können, hier als Beispiel
für neuronale Kortexzellen dargestellt.
12Wells mit Poly-L-Orinthin/Laminin beschichten
1-2 6Wells mit NI d30 Zellen
ÜS absaugen
+ 1,5 ml 1x PBS kreuzweise waschen
ÜS absaugen
+ 1,5 ml 1x PBS kreuzweise waschen
ÜS absaugen
+ 1 ml EDTA-Lsg (0,5 µM) 7‘ 37 °C
178 Material und Methoden
Mit insgesamt min 6 ml DMEM w/o abspülen
5‘ 250 g
ÜS absaugen
+ 12 ml NMM
o Zellen zählen und Zellzahl pro ml notieren
1 ml Zellsuspension pro 12Well aussäen
o 2‘ – 1 h bei 37 °C inkubieren
Nach Ablauf der Zeit jeweils den kompletten Überstand abnehmen
o Zellen erneut zählen
o Mittelwert aus allen drei Replikaten bilden
Je größer desto schneller der Adhäsionsprozess!
Mögliches Layout:
Tabelle 4.8: Layout Vorschlag für einen Adhärenzassay
2 min 5 min 10 min 30 min
ASC23
ASC23
ASC23
4.7.10 Bio Analyzer Cell Assay
Für die quantitative Bestimmung fluoreszenzmarkierter Zellen wurde die Zwei-Farben-
Durchflusszytometrie-Methode des BioAnalyzer Systems (Agilent Technoligies, Santa Clara,
USA) genutzt. Hierbei wurden alle Zellen mit SYTO16 (grün) gefärbt und die spezifischen
Primärantikörper mit einem APC (rot) markierten Sekundär-antikörper sichtbar gemacht.
Die Probenansätze konnten anschließend auf Chips geladen und einzeln vom BioAnalyzer
Material und Methoden 179
ausgewertet werden. Das BioAnalyzer System kann Farbstoffe über einen roten (Ex/Em
630/680) und einen blauen (Ex/Em 470/525) Kanal detektieren. So wird die Anzahl aller
Zellen (SYTO16), und davon die Anzahl der Untergruppe, die ebenfalls für das gesuchte
Epitop positiven Zellen (SYTO16 + APC), bestimmt.
Benötigte Materialien
Agilent Cell Kit Agilent Technologies 5067-1519
SYTO16 Life Technologies S7578
Blockierlösung (5 % FBS in DPBS)
Permeabilisierungslösung (0,1 % Triton X-100 in 1x DPBS)
1x DPBS Life Technologies 14190-094
MiliQ
Primärantikörper
Sekundärantikörper, APC konjugiert
SYTO16 Life Technologies S7578
Arbeitsanweisung (Optimiert für die Färbung von Kortex Neuronen NI d50)
Vorweg: Cell Assay Kit auf RT stellen.
Zellen ernten und in Blockierlösung resuspendieren
Zählen und Zellzahl auf 2 x 106 Zellen/ml einstellen (min. 4 x 106 Zellen)
o 500 µl für die Negativkontrolle wegstellen (1 x 106 Zellen)
Restliche Zellen + 1 µl/ml SYTO16 (1 µM) gut durchmischen → 30 min 37 °C dunkel
5‘ 500 g in 1.5 ml Blockierlösung resuspendieren
+ 500 µl 8 % PFA sofort vortexen
o 10 min. dunkel Eis(2 % Endkonzentration)
+ 330 µl 0,06 % Triton X-100 Lösung
o 10 min. dunkel Eis (0.014 % Endkonzentration)
5‘ 500 g
ÜS ab
+ Blockierlösung auf 1 x 106 Zellen/100 µl
o 100 µl für die nur SYTO16 Kontrolle wegstellen (1 x 106 Zellen)
180 Material und Methoden
o 100 µl für nur 2. Ab wegstellen (1 x 106 Zellen)
o Je 100 µl + 1. Ab
30 min. RT dunkel
5‘ 500 g
ÜS ab
+ je 100 µl Blockierlösung
o + Korrespondierende 2. Ab
30 min RT dunkel
Nur markierte 5‘ 500 g
o ÜS ab + 1.5 ml Blockierlösung
Alle Proben 5‘ 500 g
o ÜS ab + ABI „cell buffer“ auf 2 x 106 Zellen/ml
8 x 106 Zellen in 3 ml BL lösen
→ 4x 2 x 106 Zellen/ml →500 µl für Negativ (1 x 106 Zellen)
→ 3.5x 2 x 106 Zellen/ml →SYTO16, PFA, Triton
→ 7x 1x 106 Zellen/100 µl → 100 µl nur SYTO16, 100 µl je 2. Ab
→ 4x 1x 106 Zellen/100 µl → 200 µl je 1. Ab
→ 6x 1x 106 Zellen/100 µl → 2. Ab
Alle Proben in 500 µl ABI Zellpuffer resuspendieren.
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Eigenständigkeitserklärung
Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-
Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch
einer anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion
eingereicht wurde.
Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbstständig verfasst und keine anderen
als die darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte
eines Dritten ohne Kennzeichnung übernommen habe.
Laura van Diepen
Danke…
Meinem Doktorvater, Prof. Dr. rer nat Kuss für die Vergabe dieses spannenden
Themas, das Vertrauen und die wissenschaftliche Anleitung und Anregung.
Herrn Dr. Jensen dafür mir immer neue Denkanstöße und Perspektivenwechsel zu
geben.
Herrn Weißmann für die unermüdlichen Diskussionen und Frau Jensen und Herrn
Sperling für die Hilfe im Labor.
Allen Kollegen herzlichst für die vielen freundschaftlich gemeinsam verbrachten
Stunden in und außerhalb des Labors.
All meinen Freunden und Verwandten, ohne euren Beistand hätte mir wohl manches
Mal der Mut und die Ausdauer gefehlt. Und meinem geliebten Mann Hannes. Mein
ewiger Optimist der mir die Liebe und Geborgenheit schenkt die mich stark macht.
Für meine Großmutter und mich