Verteilung des Flavonols Quercetin in Organen und Geweben ... · Die typische Drei-Ring-Struktur...

Aus dem Institut für Tierernährung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und dem Institut für Tierernährung und Stoffwechselphysiologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel

Verteilung des Flavonols Quercetin

in Organen und Geweben beim Schwein nach mehrwöchiger Verabreichung mit dem Futter

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Juliane Bieger

aus Preetz

Hannover 2007

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. J. Kamphues

Prof. Dr. S. Wolffram

1. Gutachter: Prof. Dr. J. Kamphues

Prof. Dr. S. Wolffram

2. Gutachter: Prof. Dr. W. Ternes

Tag der mündlichen Prüfung: 22. Mai 2007

I. Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung................................................................................1

2. Schrifttum ...............................................................................3

2.1 Struktur und Synthese von Flavonoiden ........................................3

2.2 Vorkommen und Aufgaben von Flavonoiden in Pflanzen ..............4

2.3 Aufnahme von Flavonoiden über pflanzliche Produkte ..................7

2.4 Wirkungen von Flavonoiden im menschlichen und tierischen

Organismus..................................................................................11

2.4.1 Antioxidative Eigenschaften.............................................11

2.4.2 Wirkung auf Enzyme, Signaltransduktion und

Genexpression.................................................................14

2.5 Bioverfügbarkeit von Flavonoiden................................................16

2.5.1 Intestinale Absorption ......................................................17

2.5.1.1 Einfluss des Glycosylierungsmusters: beteiligte

Enzyme und Transporter .....................................17

2.5.1.2 Die Rolle der intestinalen Mikroflora....................20

2.5.1.3 Einfluss der Nahrungszusammensetzung ...........21

2.5.2 Metabolisierung und Verteilung von Flavonoiden im

Organismus .....................................................................23

2.5.2.1 Konjugation .........................................................24

2.5.2.2 Intestinale und biliäre Sekretion ..........................27

2.5.2.3 Plasmatransport und Gewebeverteilung .............29

2.6 ß-Glucuronidase...........................................................................33

2.6.1 Subzelluläre Lokalisation .................................................33

2.6.2 Funktion ...........................................................................33

3. Material und Methoden.........................................................37

3.1 Fütterungsstudie ..........................................................................37

3.1.1 Versuchsaufbau und -durchführung.................................37

3.1.2 Flavonolanalytik ...............................................................39

3.1.2.1 Kalibrierung und Auswertung ..............................41

3.1.2.2 Korrektur Residualblut .........................................44

3.2 Bestimmung der Aktivität der ß-Glucuronidase............................45

3.2.1 Probenaufarbeitung und Testprinzip................................45

3.2.2 Proteinbestimmung und Auswertung...............................46

3.3 Statistische Auswertung...............................................................47

4. Ergebnisse ...........................................................................48

4.1 Gewebeverteilung von Quercetin und seiner methylierten

Metaboliten Isorhamnetin und Tamarixetin ..................................48

4.2 ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe.........................55

4.2.1 Eignung der Methode ......................................................55

4.2.2 ß-Glucuronidaseaktivität in einigen ausgewählten

Geweben des Schweins ..................................................56

5. Diskussion ............................................................................65

6. Zusammenfassung...............................................................78

7. Summary ..............................................................................80

8. Literaturverzeichnis ..............................................................82

II. Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Grundstruktur und Numerierung von Flavonoiden..............................3 Abbildung 2: Flavonoidunterklassen........................................................................3 Abbildung 3: Molekulare Struktur von Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid).......................................5 Abbildung 4: Methylierung von Quercetin zu Tamarixetin (4'-Methylquercetin) und Isorhamnetin (3'-Methylquercetin) .............................................26 Abbildung 5: Kalibriergeraden zur quantitativen Bestimmung von Quercetin, Tamarixetin und Isorhamnetin in Plasma und Geweben ..................42 Abbildung 6: Chromatogramme eines Standards der Kalibriergeraden

sowie einer Plasmaprobe und einer Leberprobe vom Schwein nach vierwöchiger Verabreichung einer täglichen Dosis von 50 mg Quercetin pro kg Körpergewicht mit dem Futter.....................43

Abbildung 7: Gesamtkonzentration der Flavonole in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon .................................52 Abbildung 8: Konzentrationen der Flavonolaglyca in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon .................................53 Abbildung 9: Prozentuales Verhältnis von Quercetinaglyca und -konjugaten in den verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon ....................................................54 Abbildung 10: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unter-

schiedliche Konzentrationen einer ß-Glucuronidase/Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 7,2...............................................55

Abbildung 11: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unterschiedliche Konzentrationen einer ß-Glucuronidase/ Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 4,6 ..............................56 Abbildung 12: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuroni- dase im Lungen-, Nieren- und Lebergewebe eines Schweins..........58 Abbildung 13: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuroni- dase in Zwerchfell- und Rückenmuskulatur eines Schweins ............59 Abbildung 14: ß-Glucuronidaseaktivität in der Zwerchfell- und Rückenmusku- latur von drei Schweinen ..................................................................61

Abbildung 15: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Niere und Leber von drei Schweinen........................................................................................62 Abbildung 16: Spezifische ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe von drei Schweinen.................................................................................63 Abbildung 17: Darstellung der Beziehungen zwischen der ß-Glucuronidase- aktivität und dem Aglycongehalt in Leber, Zwerchfellmuskulatur und M. longissimus dorsi von drei Schweinen..................................64

III. Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Gehalte verschiedener Flavonole (Angaben in mg/kg bzw. mg/l Frischsubstanz, Nachweis der Aglyca nach Hydrolyse der Glycoside ...............................................................................................10 Tabelle 2: Chemische Zusammensetzung der Versuchsration ..............................37 Tabelle 3: Gesamtkonzentration der Flavonole in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon................50 Tabelle 4: Konzentration der Flavonolaglyca in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon................51 Tabelle 5: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Niere, Leber, Zwerchfell- und Rückenmuskulatur von drei Schweinen.................................................60 Tabelle 6: Mittelwerte der ß-Glucuronidaseaktivität in verschiedenen Geweben von drei Schweinen ...............................................................................61

IV. Abkürzungsverzeichnis

ATP Adenosintriphosphat

BCRP1 Breast Cancer Resistance Protein 1

COMT Catechol-O-Methyltransferase

COX Cyclooxygenase

dpm disintegrations per minute

ε molarer Extinktionskoeffizient

HPLC High Performance Liquid Chromatography

Km Michaelis-Menten-Konstante

LDL Low Density Lipoprotein

LM Lebendmasse

LPH Laktasephlorizinhydrolase

MAPK mitogen-aktivierte Proteinkinasen

MRP1 bzw. 2 Multidrug Resistance Associated Protein 1 bzw. 2

NFκB Nuclear-Factor-Kappa-B

PCR Polymerase Chain Reaction

PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase

PKC Proteinkinase C

ppm parts per million

ROS Reaktive Sauerstoffspezies

Sc. Streptococcus

SGLT1 Sodium Dependend Glucose Transporter 1

UGT UDP-Glucuronosyltransferase

V. Bezugsquellenverzeichnis

Chemikalie Bezugsquelle Artikelnummer Reinheitsgrad [%]

Quercetin Dihydrat Rotichrom® HPLC

Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 7417.1 98 - 99

Isorhamnetin Rotichrom® HPLC


Tamarixetin Rotichrom® HPLC


Rhamnetin Rotichrom® HPLC


Quercetin Dihydrat Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 7138.1 ≥ 98,5

4-Nitrophenyl-β-D-glucuronid

Fluka/Sigma Aldrich Chemie

GmbH, Steinheim 73677 ≥ 99,0

Essigsäure Fluka/Sigma

Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

45730 99,5

ß-Glucuronidase/ Sulfatase

Sigma Aldrich Chemie GmbH,

Steinheim G-0876

Aceton J. T. Baker, Holland 8142 99,7

Methanol HPLC Gradient Grade

J. T. Baker, Holland 8402 99,8

Salzsäure 32% Merck KGaA, Darmstadt 100319.1000 p. a.

Acetonitril HPLC Gradient Grade

J. T. Baker, Holland 9012 99,8

Aluminiumnitrat Nonhydrat Fluka/Sigma

Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

06275 ≥ 98,0

2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich

Chemie GmbH, Steinheim

M-3148 ≥ 98,0

Albumin Fraktion V biotinfrei

Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe 0163.2 ≥ 98,0

Bio-Rad Protein Assay, Dye Reagent Concentrate

Bio-Rad Laboratories

GmbH, München 500-0006 99,8

Natriumphosphat-Monohydrat

Calbiochem/Merck,Darmstadt 567549 99,8

Di-Natriumhydrogenphosphat

Merck KgaA, Darmstadt 106586.0500 99,0

1. Einleitung

1. Einleitung

Quercetin gehört zu den Flavonoiden, einer großen heterogenen Gruppe von sekun-

dären Pflanzeninhaltsstoffen mit polyphenolischer Struktur. Diese werden in nahezu

allen höheren Pflanzen in variierender Konzentration und Zusammensetzung synthe-

tisiert und übernehmen im pflanzlichen Stoffwechsel durch ihre Beteiligung an

Wachstums- und Differenzierungsvorgängen sowie Prozessen der Photosynthese

wichtige Funktionen. Ihre antioxidativen, antifungalen und bakteriziden Eigenschaften

machen sie zudem zu einem wichtigen Bestandteil des pflanzlichen Abwehrsystems.

Aufgrund ihrer weiten Verbreitung im Pflanzenreich werden Flavonoide dem mensch-

lichen und tierischen Organismus kontinuierlich mit der Nahrung zugeführt und sind

zahlreichen Studien zufolge auch hier in der Lage, den Zellstoffwechsel zu beeinflus-

sen. In den 30er Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts rückten diese polyphenoli-

schen Verbindungen erstmals durch ihre vitaminähnlichen Eigenschaften v. a. bei

Ernährungswissenschaftlern in den Mittelpunkt des Interesses. Der heutige Stand

der Forschung weist auf zahlreiche biologische Wirkungen verschiedener Flavonoide

im Säugerorganismus hin, die vor allem auf ihrem hohen antioxidativen Potential,

aber auch auf Interaktionen mit zahlreichen Enzymsystemen und dem Einfluss auf

zelluläre Signaltransduktionskaskaden und die Genexpression basieren. Eine protek-

tive Wirkung von Flavonoiden wird vor allem im Zusammenhang mit der Prävention

bestimmter Krankheitsformen, den sogenannten ’free radical diseases’, diskutiert, zu

denen Arteriosklerose, damit verbundene Herz-Kreislauf-Erkrankungen, bestimmte

kanzerogene Tumorformen und chronische Entzündungen gerechnet werden. Quer-

cetin, das zu den Flavonolen gehört und damit zu den häufigsten Flavonoiden in un-

serer Nahrung zählt, stellt eine der am intensivsten bearbeiteten Verbindungen aus

dieser Substanzgruppe dar. Seine Wirkungen wurden vielfach vor allem in entspre-

chenden in vitro-Studien nachgewiesen. In welchem Umfang diese Effekte auch un-

ter in vivo-Bedingungen gelten, bedarf noch weiterer Klärung. Eine Frage, die sich

stellt, ist unter anderem die nach der Verteilung von Flavonoiden im Organismus

nach einmaliger bzw. kontinuierlicher Aufnahme polyphenolreicher Nahrungsmittel.

Das Wissen über das Verhalten der Verbindungen nach ihrer Absorption, über ihre

1

1. Einleitung

Gewebeverteilung und Metabolisierung ist zum Verständnis ihrer Wirkungen im Kör-

per unerlässlich. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Verteilung von Quer-

cetin und einiger seiner Metaboliten im Organismus von Schweinen nach oraler Ap-

plikation zu untersuchen. Da aus zahlreichen Studien bekannt ist, dass nach oraler

Aufnahme von Quercetin praktisch ausschließlich Konjugate (Sulfate, Glucuronide)

von Quercetin und seinen methylierten Metaboliten in die Zirkulation gelangen, sollte

weiterhin untersucht werden, ob möglicherweise zwischen dem Auftreten hoher

Aglycagehalte in den Geweben und der gewebespezifischen Aktivität des Enzyms ß-

Glucuronidase eine Korrelation besteht.

2

2. Schrifttum

2. Schrifttum

2.1 Struktur und Synthese von Flavonoiden

Die typische Drei-Ring-Struktur des Flavonoidgrund-

moleküls, welches man als Flavan bezeichnet, wird

gebildet aus den aromatischen Ringen A und B, die

über drei C-Atome gekoppelt sind (Abb. 1). Letztere

bilden zusammen mit Sauerstoff den heterozyklischen

Ring C, wodurch das Molekül die Grundstruktur von

Diphenylpropan (C6-C3-C6) erhält (Formica & Regelson

1995, Manach et al. 2004, Bravo 1998).

Abb. 1: Grundstruktur und Numerierungvon Flavonoiden

Die Flavonoide lassen sich anhand des Oxidationsstatus’ und der

funktionellen Gruppen des C-Rings, sowie seiner Verbindung mit dem

B-Ring in die folgenden sechs Hauptunterklassen einteilen: Flavanole

(Catechine), Flavanone, Flavone, Flavonole, Anthocyanidine und Iso-

flavone (Abb. 2) (Beecher 2003, Ross & Kasum 2002). Flavonole

zeichnen sich beispielsweise durch eine Doppelbindung zwischen C-

Atom 2 und 3 sowie eine 4-Oxo-Gruppe und einer Hydroxylgruppe an

Position C-3 aus (Ader et al. 1999). Zusätzliche Hydroxylierungen an

den C-Atomen 3’ und 4’ sind am häufigsten (Rice-Evans et al. 1996).

Etwa 90 % der Flavonole besitzen außerdem eine Hydroxylgruppe an

Position C-5 und C-7 (Manach et al. 1996). Auch die meisten Antho-

cyanidine stimmen untereinander durch OH-Gruppen in diesen bei-

den Lokalisationen des A-Ringes überein und unterscheiden sich

voneinander durch das Substitutionsmuster im B-Ring (Böhm et al.

1998).

Isoflavon

Anthocyanidin

Flavonol

Flavon

Flavanon

Flavanol (Catechin)

Abb. 2: Flavonoid-unterklassen

Die Synthese der Flavonoide erfolgt über den Phenylpropanoidweg,

über den der Säugerorganismus nicht verfügt. Dabei stellt die aroma-

tische Aminosäure Phenylalanin die Hauptausgangssubstanz für den

Aufbau des B-Ringes und des heterozyklischen C-Ringes dar. Sie

3

2. Schrifttum

entsteht als Endprodukt des Shikiminsäureweges aus Erythrose-4-Phosphat und

Phosphoenolpyruvat, zwei Metaboliten des Kohlenhydratstoffwechsels. Aus der Ami-

nosäure wird durch enzymatische Katalyse über Zimtsäure 4-Cumarsäure gebildet

(Heller & Forkmann 1994). Die auf diese Weise entstandenen C9-Körper werden bei

Speicherung in den Pflanzen meist kovalent an Zellwandpolysaccharide - vor allem

durch Veresterung mit Arabinoseeinheiten der Hemicellulose - oder an das soge-

nannte Kernlignin gebunden (Bravo 1998). Der A-Ring wird unter Abgabe von drei

CO2-Molekülen aus drei Malonyl-CoA-Einheiten gebildet. Durch die anschließende

Kondensation dieser C6-Körper mit 4-Coumaroyl-CoA (C9), die durch die Chalkon-

synthase, das Schlüsselenzym der Flavonoidbiosynthese, katalysiert wird, sowie

nachfolgenden Ringschluss, entstehen letztendlich die Vorstufen der Flavonoidmole-

küle (Strack 1997). Die zahlreichen strukturellen Variationen innerhalb der Flavonoi-

dunterklassen resultieren des Weiteren aus diversen nachfolgenden Reaktionen wie

Hydratisierungen, Hydroxylierungen, Glycosylierungen, Methylierungen oder Sulfatie-

rungen (Duthie et al. 2003, Aisling Aherne & O’Brien 2002). Die Substituenten haben

einen signifikanten Einfluss auf das Molekulargewicht, ihre Wasserlöslichkeit und die

biologischen Eigenschaften der Moleküle.

2.2 Vorkommen und Aufgaben von Flavonoiden in Pflanzen

Flavonoide stellen eine große Fraktion der zahlreichen polyphenolischen Verbindun-

gen dar, die Pflanzen als sogenannte sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe synthetisieren.

Abgesehen von den Catechinen liegen Flavonoide in den Pflanzen fast ausschließ-

lich als Glycoside vor (Aisling Aherne & O’Brien 2002). Die meist ß-O-glycosidische

Bindung an einen Zuckerrest erhöht unter anderem die Polarität und damit die Was-

serlöslichkeit der Moleküle, was für ihre Speicherung im Zellsaft der Pflanzen not-

wendig ist (Aisling Aherne & O’Brien 2002). Die Glycosylierung am Flavonolmolekül

findet bevorzugt in der C-3-Position statt, weniger häufig auch am C-7-Atom und

eher selten an den Positionen 4’, 3’ und 5 (Hollman & Arts 2000). In der Regel erfolgt

dabei die Bindung über ein Sauerstoffatom, seltener kommen entsprechende Deriva-

tisierungen direkt an den Kohlenstoffatomen der Grundgerüste vor (Böhm et al.

4

2. Schrifttum

1998). Mehr als 80 verschiedene Zuckerreste sind in diesem Zusammenhang bereits

identifiziert worden.

Die unterschiedlichen Glycolysierungsmuster erklären die große Liste an Einzelver-

bindungen, die sich bei den Flavonoiden bereits auf über 6000 identifizierte Verbin-

dungen beläuft und kontinuierlich ergänzt wird. Für Quercetin allein wurden bereits

weit über 100 verschiedene Glycoside beschrieben, darunter das häufig vorkommen-

de Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid)

(Williams & Harborne 1994, 2000) (Abb. 3). Weit verbreitete Monosaccharide sind ne-

ben Glucose unter anderem Rhamnose, Galactose, Xylose oder Arabinose, die in

Form von Mono-, Di- und Oligosacchariden mit den Aglyca verknüpft sind. Seltener

findet die Substitution mit Glucuron- und Galacturonsäure statt. (Duthie et al. 2003,

Bravo 1998, Herrmann 1990).

O

OOH

OH

HO

OHOH

O - Glucose

O

OOH

OH

HO

OHOH

Isoquercitrin Rutin

O - Glucose - Rhamnose

Abb. 3: Molekulare Struktur von Isoquercitrin (Quercetin-3-O-Glucosid) und Rutin (Quercetin- 3-O-Gluco-rhamnosid)

Die höchsten Flavonoidkonzentrationen sind im allgemeinen in unreifen Geweben, in

denen aktive Zellteilung vorkommt, sowie in den dem Licht zugewandten Anteilen

von Pflanzen, wie Blättern, Blüten und Früchten zu finden (Herrmann 1990). Eine

Anreicherung der Flavonoide findet daher bevorzugt in der Epidermis statt, wobei sie

entweder gelöst in den Vakuolen (v. a. Flavon- und Flavonolglycoside) oder auch in

den epikutikularen Bereichen (v. a. Methylester) anzutreffen sind. Die Akkumulierung

in peripheren Arealen lässt sich dadurch erklären, dass Flavonoide lichtabhängig in

Photosynthese betreibenden Zellen synthetisiert werden (Manach et al. 1996), in de-

nen sie während der Lichtphase Elektronentransportprozesse katalysieren (Das

5

2. Schrifttum

1994). Gleichzeitig verhindern sie Schädigungen des Pflanzengewebes durch ihre

Eigenschaft, als effektive UV-B-Filter wirken zu können (Harborne & Williams 2000).

Überdies sind sie als Radikalfänger in der Lage, reaktive Sauerstoffspezies (ROS),

die im Zuge der Photosynthese gebildet oder durch ultraviolette Strahlung freigesetzt

werden, zu neutralisieren (Shirley 1996). Daneben besitzen Flavonoide eine große

Anzahl weiterer Eigenschaften, die im Zusammenhang mit Wachstum und Fortpflan-

zung und der Abwehr von Pathogenen und Fressfeinden stehen. Bestimmte Flavo-

noide sind für die charakteristische Färbung von Laub-, Blütenblättern und Früchten

verantwortlich und dienen somit als Lockstoff für Insekten, Vögel und Säuger, die

Pollen und Samen weiter verbreiten können (Das 1994, Harborne & Williams 2000).

Die als Pigmente in Pflanzen am häufigsten auftretenden Flavonoide sind die

Anthocyanidine (z. B. Cyanidin, Delphinidin oder Malvidin), welche rote, violette und

blaue Farbtöne aufweisen, dicht gefolgt von den gelben Flavonolen und Flavonen

(Cheynier 2005). Auch ein Einfluss auf Wachstums- und Differenzierungsvorgänge

wird diesen Verbindungen zugeschrieben, da sie vermutlich den Spiegel bestimmter

Phytohormone, den Auxinen, kontrollieren, die für die Regulation dieser Prozesse

zuständig sind (Formica & Regelson 1995, Brown et al. 2001). Des Weiteren inter-

agieren Flavonoide auf verschiedene Art und Weise mit Pilzen, Bakterien und Viren.

So induzieren verschiedene aus den Wurzeln freigesetzte Flavonoide bei Legumino-

sen die Transkription von bakteriellen Nodulationsgenen, woraus letztendlich die

Knötchenbildung an den Pflanzenwurzeln resultiert (Treutter 2005, Rolfe 1988). Sol-

che Wechselbeziehungen wurden auch zwischen Mikroorganismen und Nicht-

Leguminosen beobachtet. In Weizenpflanzen beispielsweise wird durch einen ähnli-

chen Mechanismus die Ausbildung von Kollateralwurzeln stimuliert (Treutter 2005).

In anderen Fällen übernehmen Flavonoide dagegen durch antibakterielle, antifungale

und antivirale Wirkungen Schutzfunktionen gegenüber Pflanzenpathogenen, indem

sie im allgemeinen deren Wachstum und Vermehrung hemmen. Zu den Mechanis-

men zählen dabei unter anderem die Blockierung von Enzymen oder die Bildung von

kristallinen Strukturen als physikalische Barrieren (Treutter 2005). Durch bitteren Ge-

schmack oder unangenehme Gerüche verleihen sie vielen Pflanzen außerdem einen

6

2. Schrifttum

wirksamen Schutz gegenüber Herbivoren, verschiedenen Insektenarten und anderen

Parasiten.

Die Verbindungen werden während der normalen Entwicklung des Pflanzengewebes

synthetisiert, ihre Produktion kann jedoch auch als Antwort auf eine Infektion, eine

Verletzung oder umweltbedingten Stress wie Strahlung und extreme Witterungsver-

hältnisse (Dürre, Kälte) induziert werden (Treutter 2005, Harborne & Williams 2000).

2.3 Aufnahme von Flavonoiden über pflanzliche Produkte

In welchen Konzentrationen Flavonoide im Endeffekt mit der Nahrung aufgenommen

werden, hängt von verschiedenen Parametern ab. Unter den Lebensmitteln stellen

Obst und Getränke wie Rotwein und Tee die Hauptquellen für Polyphenole dar. Die

Polyphenolzusammensetzung und der Gehalt dieser Substanzen variiert jedoch ins-

gesamt hinsichtlich der Quantität und Qualität zwischen und innerhalb der Pflanzen-

spezies zum Teil erheblich; manche Verbindungen kommen ubiquitär vor, andere

sind auf bestimmte Familien oder Spezies beschränkt. Flavonole können beispiels-

weise in unterschiedlichen Konzentrationen in nahezu allen pflanzlichen Produkten

angetroffen werden. Die reichhaltigsten Quellen für Quercetin und Kaempferol, die

diese Flavonoidunterklasse dominieren, sind unter anderem Zwiebeln, Brokkoli,

Blaubeeren, Weintrauben und auch Ginkgo biloba (Manach et al. 2004, Williamson &

Manach 2005) (Tab. 1). In Zwiebeln ist Quercetin meist an ein oder zwei Glucosemo-

leküle gebunden (Quercetin-4’-glucosid und Quercetin-3,4’-diglucosid), in Äpfeln an

Galactose und in Beerenfrüchten an Arabinoseeinheiten (Erlund 2004). Flavanone

wie Hesperidin kommen v. a. in Zitrusfrüchten vor, Isoflavone (z. B. Genistein und

Daidzein) sind wiederum typisch für Sojabohnen und Sojaprodukte (Scalbert &

Williamson 2000). Variationen innerhalb einer Pflanzenart resultieren auch aus der

Züchtung verschiedener Sorten. Der Quercetingehalt in Cherrytomaten beträgt zum

Beispiel etwa das 6-fache der Menge in Tomaten normaler Größe, da sie im Verhält-

nis zum Volumen eine größere Oberfläche haben und Flavonole in den äußeren

Schichten synthetisiert und gespeichert werden (Duthie & Crozier 2000). Auch eine

unterschiedliche Sonnenlichtexposition während des Wachstums beeinflusst den

7

2. Schrifttum

Flavonoidgehalt der Früchte, und bei jeder einzelnen Frucht findet an der dem Licht

zugewandten Seite wiederum eine deutliche Akkumulation statt (Price et al. 1995).

Eine Ausnahme bildet die unterirdisch wachsende Zwiebel, in der Flavonoide insge-

samt relativ gleichmäßig verteilt sind (Price & Rhodes 1997).

Demnach spielt es eine Rolle, welche Teile der Pflanzen letztendlich konsumiert

werden und unter welchen Bedingungen diese kultiviert worden sind. Weitere nicht

zu unterschätzende Faktoren, die den Gehalt an Flavonoiden in Lebensmitteln

pflanzlicher Herkunft beeinflussen, sind der Erntezeitpunkt bzw. der Reifegrad, die

Lagerungsbedingungen und Verarbeitung (Cheynier 2005, Manach et al. 2004). Auf-

grund der Bearbeitung während der Lebensmittelherstellung ergibt sich i. d. R. ein

Verlust von Flavonoiden (Hollman & Arts 2000). Schon das einfache Entfernen der

Schale bzw. äußeren Schichten von Früchten und Gemüse führt zu einer Verringe-

rung des Flavonoidgehaltes. Auch Erhitzen (Kochen, Frittieren, Backen) oder längere

Lagerung bei Zimmertemperatur haben erhebliche Auswirkung auf die Flavonoidkon-

zentrationen. So verlieren Zwiebeln und Tomaten durch einen 15-minütigen Koch-

vorgang etwa 75 - 80 % ihres Quercetingehaltes, durch Erwärmung in der Mikrowelle

etwa 65 % und 30 % nach dem Frittieren (Crozier et al. 1997). Die Gehalte an Flavo-

nolen in Obst- und Gemüsekonserven betragen nur etwa die Hälfte des jeweiligen

Rohmaterials, wobei ein großer Teil des Verlustes eher der Auswaschung als dem

Substanzabbau zugeschrieben wird. Während Flavonole und Flavone als relativ sta-

bile Verbindungen gelten, sind Anthocyanidine eher labil, wofür das Verblassen ein-

geweckter Erdbeeren ein bekanntes Beispiel darstellt (Böhm et al. 1998).

Aus dem bisher Gesagten geht hervor, dass die tatsächliche tägliche Aufnahme von

Flavonoiden sehr schwer zu kalkulieren ist. Hinzu kommen regionale Unterschiede in

Vegetation und Essgewohnheiten, die ebenfalls zu Differenzen in Menge und Art der

aufgenommenen Flavonoide führen. Vor dreißig Jahren wurde die Aufnahme von

Flavonoiden in den Vereinigten Staaten auf etwa 1 g pro Tag geschätzt (Kühnau

1976). Nach aktuellem Stand der Forschung geht man jedoch von geringeren Men-

gen aus. Betrachtet man ausschließlich die Flavonole, liegt die Aufnahme in den

USA und Holland bei 20 - 25 mg, in Italien bei 5 - 125 mg täglich (Sampson et al.

2002, Hertog et al. 1993, Pietta et al. 1996). Das in der Nahrung dominierende Fla-

8

2. Schrifttum

vonol ist nach Hertog et al. (1995) Quercetin mit einer durchschnittlichen Aufnahme-

menge von etwa 16 mg pro Tag. In Bayern liegt die durchschnittliche Tagesaufnah-

me an Flavonoiden nach Linseisen et al. (1997) bei ca. 54 mg pro Tag. Die Flavo-

nolmenge liegt bei ca. 12 mg, von denen Quercetin mit 10,3 mg den Hauptteil aus-

macht.

Über die Flavonoidaufnahme von Tieren ist wenig bekannt, sie dürfte bei Herbivoren

unter Umständen jedoch ein Vielfaches über der Tagesmenge des Menschen liegen.

Auf dem Nutztier- bzw. Haustiersektor besteht durch gezielte Supplementierung von

Flavonoiden oder flavonoidhaltigen Pflanzenextrakten die Möglichkeit, den Tieren

bestimmte Mengen dieser Substanzen zuzuführen, um potenziell gesundheitsför-

dernde oder qualitätssteigernde Effekte zu erreichen (s. Kapitel 8).

9

2. Schrifttum

Tab. 1: Gehalte verschiedener Flavonole (Angaben in mg/kg bzw. mg/l Frisch-

substanz, Nachweis der Aglyca nach Hydrolyse der Glycoside)

Nahrungsmittel Flavonol Gehalt Zwiebel Quercetin 280-490 3)

Kaempferol <2 3)

Myricetin <1 3)

Brokkoli Quercetin 30-37 1)

Kaempferol 60-72 1)

Salat (grün) Quercetin 147 2)

Äpfel Quercetin 21-72 3)

Kaempferol <2 3)

Myricetin <1 3)

Trauben (rot) Quercetin 15-37 1)

Myricetin 4,5 1)

Johannisbeeren (schwarz) Quercetin 37 1)

Kaempferol 11)

Erdbeeren Quercetin 6-8,6 1)

Kaempferol 5-12 1)

Myricetin <1 3)

Tee (schwarz) Quercetin 14-17 1)

Kaempferol 14-16 1)

Myricetin 3 1)

Rotwein Quercetin 4-16 3)

Kaempferol <1 3)

Myricetin 7-9 3)

1) Hollman & Arts (2000), 2) Crozier et al. (1997), 3) Hertog & Katan (1998)

10

2. Schrifttum

2.4 Wirkungen von Flavonoiden im menschlichen und tieri-schen Organismus

Die biologische Aktivität von Polyphenolen wurde v. a. in in-vitro-Studien untersucht,

in denen meistens die Eigenschaften der Aglyca, jedoch weniger der Glycoside in

Zellkulturen oder isolierten Geweben im Mittelpunkt standen. Weit weniger ist be-

kannt über die Wirkungen der konjugierten Derivate, zu denen die Ausgangsverbin-

dungen im Organismus metabolisiert werden, da Daten über ihre Identität erst seit

einigen Jahren bekannt sind.

Im Folgenden werden die wichtigsten biologischen Effekte bzw. Wirkungsmechanis-

men beschrieben.

2.4.1 Antioxidative Eigenschaften

Zwischen der oxidativen Schädigung von Biopolymeren (Lipide, Nukleinsäuren, Pro-

teine) und der Entstehung chronischer Erkrankungen des Menschen wie Arterioskle-

rose, Krebs und Diabetes mellitus Typ 2 werden seit mehreren Jahren kausale Be-

ziehungen vermutet (Böhm et al. 1998). Daher besteht seitens der Präventivmedizin

großes Interesse, das Abwehrsystem des Körpers mittels exogener Antioxidantien

aktiv zu unterstützen. Die Annahme, dass Polyphenole in diesem Zusammenhang

eine entscheidende Funktion übernehmen könnten, basiert auf ihrer ausgeprägten

antioxidativen Kapazität, die allerdings v. a. in vitro nachgewiesen wurde (Manach et

al. 2005a). Viele Flavonoide sind in der Lage, eine große Zahl reaktiver Sauerstoff-

spezies (ROS) zu „neutralisieren“ und damit unschädlich zu machen (Halliwell et al.

2005). Unter der Bezeichnung ROS werden sowohl Radikale (Superoxid-, Hydroxyl-

radikale u. a.), Singulett-Sauerstoff als auch nicht-radikalische Sauerstoffverbindun-

gen wie Wasserstoffperoxid oder hypochlorige Säure zusammengefasst (Middleton

et al. 2000). Sie entstehen spontan an verschiedenen Stellen im oxidativen Stoff-

wechsel eukaryontischer Zellen, zeichnen sich durch ein hohes Reaktionspotential

aus und führen zur Schädigung wichtiger Zellstrukturen, sobald die zelleigenen

Schutzmechanismen überlastet sind. Zu diesen zählen zum einen Enzyme wie Kata-

11

2. Schrifttum

lase, Peroxidasen und Dismutasen, zum anderen nicht-enzymatische Faktoren wie

beispielsweise Ascorbat und α-Tocopherol (Pietta 2000, Middleton et al. 2000).

Kriterien für das Vorhandensein eines antioxidativen Potenzials sind vor allem die

Existenz bestimmter Strukturen und Substituenten, wie beispielsweise eine Doppel-

bindung zwischen dem C2- und C3-Atom in Verbindung mit einer 4-oxo-Gruppe im

heterozyklischen Ring, die eine Delokalisation von Elektronen ermöglicht, ohne dass

die Ringstruktur an Stabilität verliert. An der Abnahme der antioxidativen Wirkung

von 2,3-Dihydroquercetin (Taxifolin) gegenüber Quercetin von ca. 50 % lässt sich

außerdem schließen, dass ein insgesamt ungesättigter Charakter dieses Ringes, der

eine Elektronenwanderung ermöglicht, von ausschlaggebender Bedeutung ist (Böhm

et al. 1998). Des Weiteren sind eine ortho-Dihydroxystruktur im B-Ring und zusätzli-

che Hydroxylgruppen an Position 3 und 5 als aktivitätssteigernde Strukturmerkmale

zu nennen (Manach et al. 1996, van Acker et al. 1996, Bravo 1998, Pietta 2000, Ri-

ce-Evans et al. 1996, Bors et al. 1997). Eine Erklärung für die hohe antioxidative Ak-

tivität von Flavonolen scheint außerdem ihre planare Struktur und die Ausbildung von

intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen zu sein (van Acker et al. 1996).

Quercetin besitzt alle diese Merkmale in Kombination und ist daher eines der poten-

testen natürlich vorkommenden phenolischen Antioxidantien. Eine Rangfolge von

Flavonoiden gemäß ihrer antioxidativen Wirkung kann jedoch nicht allgemeingültig

aufgestellt werden, da die Reaktionen der Flavonoide auf verschiedene ROS sehr

unterschiedlich sein können (Böhm et al. 1998). Die Unterbrechung von Kettenreak-

tionen, die durch hochreaktive Radikale ausgelöst werden, erfolgt im allgemeinen bei

allen phenolischen Verbindungen durch die Übertragung eines Wasserstoffatoms

aus einer ihrer OH-Gruppen, wodurch sie den Radikalen ein Elektron zur Verfügung

stellen. Sie tragen zwar nun selber ein ungepaartes Elektron, sind jedoch im Gegen-

satz zu den ROS relativ reaktionsträge (Bravo 1998). Durch die Reaktion mit einem

zweiten Radikal können sie in eine stabile Chinonstruktur übergehen (Pietta 2000).

Neben ihrer Fähigkeit als Radikalfänger sind Flavonoide außerdem in der Lage durch

Komplexbildung mit prooxidativen Metallen wie Kupfer, Aluminium und Eisen indirekt

antioxidativ zu wirken. Eisen, welches aus seinen Komplexen mit den Transport-

proteinen (z. B. Ferritin, Transferritin) freigesetzt wird, kann unter anderem die Bil-

12

2. Schrifttum

dung von hochreaktiven Hydroxylradikalen initiieren, die durch die Reduktion von

Wasserstoffperoxid (Fenton-Reaktion) gebildet werden (Ferrali et al. 1997). Flavo-

noide mit zwei benachbarten Hydroxylgruppen an den Positionen 3’ und 4’ im B-Ring

sowie einer Carbonylstruktur im C-Ring können mit Metallen Chelate bilden und die-

se effektiv neutralisieren (Kühnau 1976).

Eine weitere indirekte antioxidative Wirkung der Flavonoide besteht in der Unterstüt-

zung und Regeneration anderer mit der Nahrung zugeführter bzw. endogener Fakto-

ren des antioxidativen Abwehrsystems, zu denen beispielsweise verschiedene Vita-

mine zählen. Durch ihre phenolischen Hydroxylgruppen, die für die antioxidative Ak-

tivität der Flavonoide verantwortlich sind, weisen sie deutliche strukturelle Ähnlichkei-

ten zu starken Antioxidantien wie α-Tocopherol auf, welches sie sogar an Wirksam-

keit übertreffen (van Acker et al. 2000). Dadurch sind sie in der Lage, andere antioxi-

dative Systeme zu regenerieren und das Level dieser Substanzen im Körper aufrecht

zu erhalten (Zhu et al. 2000, Pietta 2000). Chen et al. (2005) wiesen zudem einen

synergistischen Effekt von Flavonoiden und den Vitaminen C und E bei der Wider-

standsfähigkeit von LDL (low density lipoproteins) gegenüber Oxidation nach. Aus

einer Oxidation von LDL, die im Rahmen des Fettstoffwechsels Cholesterin aus der

Leber in periphere Gewebe transportieren, resultiert die Bildung von atheroskleroti-

schen Plaques an den Gefäßwänden (Fuhrman & Aviram 2001, Hertog et al. 1993,

Chopra & Thurnham 1999).

Der größte Teil dieser Erkenntnisse basieren auf Ergebnissen von in vitro-Studien, in

denen meistens Aglyca eingesetzt wurden. Untersuchungen mit Glycosiden und

Konjugaten, die bisher weitaus weniger häufig durchgeführt wurden, deuten darauf

hin, dass die antioxidative Kapazität der Quercetinmetaboliten im Vergleich zum

Aglycon erheblich reduziert sein kann (Manach et al. 1998, Morand et al. 1998, Day

et al. 2000a). Zudem muss berücksichtigt werden, dass das Redoxverhalten der ein-

gesetzten antioxidativ wirksamen Verbindungen stark abhängig von den gewählten

Versuchsbedingungen ist, wodurch eine Übertragbarkeit auf die tatsächliche in vivo-

Situation nur schwer gewährleistet werden kann. Neben der Art des Versuchs-

mediums (lipophil oder hydrophil) spielen zum Beispiel Parameter wie der pH-Wert,

sowie Konzentrationen und Redoxpotenziale der Reaktionspartner eine entschei-

13

2. Schrifttum

dende Rolle. Der Vollständigkeit halber soll an dieser Stelle erwähnt werden, dass

Flavonoide, wie alle Verbindungen mit antioxidativem Potenzial, unter bestimmten

Bedingungen prooxidative Aktivität entwickeln können und in jedem Fall immer auf

diese hin untersucht werden sollten (Fukumoto & Mazza 2000).

2.4.2 Wirkung auf Enzyme, Signaltransduktion und Genexpression

Durch Interaktionen mit zahlreichen Enzymsystemen, die an dieser Stelle anhand

einiger ausgewählter Beispiele dargestellt werden sollen, sind Flavonoide in der La-

ge, in Schlüsselreaktionen des Metabolismus einzugreifen. Eine umfangreiche Über-

sicht involvierter Enzyme wurde im Jahr 2000 von Middleton et al. veröffentlicht.

Viele der direkten antiinflammatorischen und kardiovaskulären Effekte von Flavonoi-

den lassen sich auf die Beeinflussung des Arachidonsäuremetabolismus zurückfüh-

ren. Die Produkte dieses Stoffwechselweges, die Eicosanoide, können als homöo-

statische Agentien verstanden werden, die die Integrität der renalen und kardio-

vaskulären Systeme bewahren und Entzündungsvorgänge steuern (Formica & Re-

gelson 1995). Der initiale Schritt der Eicosanoidsynthese, welcher die Freisetzung

von Arachidonsäure aus Phospholipiden beeinhaltet, wird durch die Phospholipase

A2 katalysiert. Anschließend erfolgt unter anderem die Bildung von Leukotrienen,

Thromboxanen und Prostaglandinen durch Lipoxy- und Cyclooxygenasen (Middleton

et al. 2000). Flavonoide können als Inhibitoren der genannten Enzyme die Produkti-

on dieser Entzündungsmediatoren unterdrücken. Flavonole wie Quercetin mit drei

oder mehr Hydroxylgruppen, darunter orthoständige im B-Ring, gelten als selektive

Lipoxygenasehemmer, während Verbindungen mit weniger OH-Gruppen selektiv die

COX hemmen. Die jeweiligen Aglyca sind dabei wirksamer als die Glycoside (Böhm

et al. 1998). Daher sind sie nicht nur aus ernährungswissenschaftlicher Sicht interes-

sant, sondern geben auch auf den Arzneimittelsektor ein exzellentes Modell für die

Entwicklung synthetischer Entzündungshemmer ab (Yoon & Beak 2005). Eine weite-

re ebenfalls besonders aus medizinischer Sicht hervorzuhebende Eigenschaft von

Flavonoiden ist ihre Interaktion mit Enzymen des Phase-I-Metabolismus, den Cyto-

chrom P450-Oxygenasen. Eine Hydroxylierung durch diese Enzymfamilie ist Voraus-

setzung für eine anschließende Konjugation und Ausscheidung einer Reihe endoge-

14

2. Schrifttum

ner aber auch exogener Verbindungen, so dass eine Hemmung oder Induktion der

Cytochrom P450-Enzyme durch Flavonoide eine direkte Auswirkung auf die Biover-

fügbarkeit von Xenobiotika hat. Dabei nehmen Flavonoide nicht nur Einfluss auf die

Enzymaktivität, sondern auch auf die Gentranskription. So konnte bezüglich be-

stimmter Cytochrom P450-Isoformen für Quercetin beispielsweise ein stimulierender

Effekt nachgewiesen werden, während Kaempferol hemmend auf die Transkription

der gleichen Isoformen wirkte (Ciolino et al. 1999). Der hemmende Einfluss ver-

schiedener Flavonoide bezieht sich auf eine Vielzahl von Cytochrom P450-

Oxidoreduktasen in Leber- und Dünndarmepithelzellen, wodurch Flavonoide auch in

der Krebsprävention weiter in den Mittelpunkt des Interesses rücken (Zhai et al.

1998). Durch einen spezifischen und stark inhibitorischen Einfluss auf Cytochrom

P450-1A1-Enzyme senken vor allem Flavonole (u. a. Quercetin, Myricetin) und Flavo-

ne z. B. die metabolische Aktivierung von heterozyklischen Aminen aus der Nahrung,

die im allgemeinen zur Entfaltung ihrer genotoxischen Wirkung führt (Kanazawa et al.

1997).

Der Eingriff in Signaltransduktion und Genexpression durch Modulation von Enzy-

men und Transkriptionsfaktoren zieht nachhaltige Veränderungen grundlegender

zellulärer Mechanismen wie Proliferation, Apoptosis, Zelldifferenzierung und Zellalte-

rung nach sich (Williams et al. 2004). Proteinkinasen, die zu Hunderten in eukaryon-

tischen Zellen vertreten sind, übernehmen bei der Steuerung nahezu aller Zellfunkti-

onen eine wichtige Rolle. Ein hemmender Effekt von Flavonoiden wurde unter ande-

rem für die Proteinkinase C (PKC) (Agullo et al. 1997, Ferriola et al. 1989), die Phos-

phatidylinositol-3-kinase (PI3K) (Agullo et al. 1997, Gamet-Payrastre et al. 1999) und

Protein-Tyrosinkinasen (Cunningham et al. 1992) beschrieben. Durch die Modifikati-

on spezifischer Zielproteine in Form von Phosphorylierungen sind Proteinkinasen

Bestandteil einer Vielzahl zellulärer Signalkaskaden, die u. a. an der Regulierung der

Genexpression beteiligt sind. Regulatorische Proteine, die am Ende solcher Signal-

transduktionswege stehen, binden nach Aktivierung an die Promotorregion von Ziel-

genen und leiten damit die Anbindung von Polymerasen und somit die Transkription

ein. Einige dieser Transkriptionsfaktoren und der an der Genexpression beteiligten

Proteinkinasen reagieren zum Teil sehr sensitiv auf Änderungen des Redoxstatus’

15

2. Schrifttum

der Zelle, da sie durch freie Radikale aktiviert werden können. Flavonoide, die mit

DNA-Sequenzen, welche genregulatorische Eigenschaften besitzen, selbst nicht zu

interagieren scheinen (Kuo 2002), sind durch ihr antioxidatives Potenzial daher in der

Lage, die Genexpression indirekt zu regulieren. So besitzt Quercetin beispielsweise

eine inhibitorische Wirkung auf den Nuclear-Factor-κ-B (NFκB) (Sen & Packer 1996)

und verschiedene mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) (Ishikawa & Kitamura

2000).

Die hier beschriebenen Effekte sind nur einige wenige aus einer großen Palette von

komplexen Wirkungsmechanismen, die zum Teil sogar gegensätzlich sind. Sie las-

sen erkennen, dass Flavonoide ein extrem hohes Potenzial zur Beeinflussung von

Stoffwechselvorgängen besitzen, das zum heutigen Zeitpunkt noch nicht überschau-

bar ist. Auch erscheint die Einschätzung dieser Wirkungen durch die unzulängliche

Übertragbarkeit von in vitro-Studien auf die tatsächliche in vivo-Situation fragwürdig.

2.5 Bioverfügbarkeit von Flavonoiden

Eine der ersten Untersuchungen zur Bestimmung der absoluten Bioverfügbarkeit von

Quercetin stellten Gugler et al. (1975) an, indem sie die Pharmakokinetik des Flavo-

nols nach oraler und intravenöser Applikation beim Menschen verglichen. Da die Au-

toren nach oraler Aufnahme weder im Plasma noch im Urin Quercetinmetaboliten

fanden, schätzten sie die Verfügbarkeit auf weniger als 1 % der zugeführten Menge.

Zahlreiche Folgestudien, die sich mit der Absorbierbarkeit von Quercetin beschäftig-

ten, deuten darauf hin, dass je nach eingesetzter Spezies und Ausgangssubstanz

(Aglycon, Glucosid, Rhamnosid) mehr oder minder starke Variationen in der systemi-

scher Verfügbarkeit von Quercetin aufzutreten scheinen. Bei ileostomierten Proban-

den wurde beispielsweise die Aufnahme einer Fraktion von 24 % einer zugeführten

Aglyconmenge, 17 % Rutin (Quercetin-3-O-Glucorhamnosid) sowie 50 % der Quer-

cetinglycoside aus Zwiebeln nachgewiesen (Hollman et al. 1995). Die Aufnahme von

Quercetinmonoglucosiden wurde in einer vergleichbaren Studie auf 65 – 81 % ge-

schätzt (Walle et al. 2000). Aus der Applikation von Quercetin an Ratten resultierten

bisher recht unterschiedliche Ergebnisse. Während Ueno et al. (1983) nach einmali-

16

2. Schrifttum

ger Verabreichung einer Dosis radioaktiv markiertem Quercetin von 2,3 mg/kg Kör-

pergewicht eine Absorption von 20 % ermittelten, wurde in einer Studie nach der Ap-

plikation von 7,6 mg Quercetin-4’-O-Glucosid pro kg Körpergewicht lediglich 6 % in

der systemischen Zirkulation detektiert (Graf et al. 2005). Chen et al. (2005) ermittel-

ten sogar eine annähernd 50 %ige Bioverfügbarkeit von Quercetin bei der Ratte.

Beim Schwein wiederum wurde nach Verabreichung von Quercetinaglycon über das

Futter in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht eine orale Bioverfügbarkeit von 17

% nachgewiesen (Ader et al. 2000). Von Bedeutung - auch im Hinblick auf die mögli-

che Verteilung von Quercetin in bestimmte Zielgewebe - ist die Tatsache, dass sich

die Plasmaspiegel selbst bei extrem hohen Dosierungen im Bereich weniger µmol/l

bewegen.

2.5.1 Intestinale Absorption

Wie unter 2.2 bereits erwähnt, liegen Flavonoide mit Ausnahme der Flavanole in

pflanzlichen Nahrungsbestandteilen in glycosylierter Form vor und sind aus diesem

Grund relativ polar. Eine passive Diffusion durch biologische Membranen ist für Gly-

coside deswegen im allgemeinen weitgehend ausgeschlossen und erst nach Abspal-

tung der Zuckerreste erfolgt die Absorption in Form der lipophileren Aglyca (Crespy

et al. 2003, Scalbert & Williamson 2000). Dabei wurde zunächst angenommen, dass

eine Spaltung von Glycosiden v. a. im Dickdarm durch mikrobielle Enzyme stattfindet

(Kühnau 1976, Formica & Regelson 1995, Manach et al. 1997), da pankreatische

Enzyme nicht in der Lage sind, die ß-glycosidische Bindung aufzuspalten (Kühnau

1976, Arts et al. 2004). Später wurde jedoch anhand von Quercetinmonoglucosiden

gezeigt, dass diese schneller und effizienter als die Quercetinaglyca absorbiert wer-

den, was auf die Aufnahme im proximalen Darmtrakt zurück zu führen ist.

2.5.1.1 Einfluss des Glycosylierungsmusters: beteiligte Enzyme und Transporter

In situ-Versuche an Ratten weisen darauf hin, dass die Absorption einiger Flavonoid-

aglyca (Quercetin, Daidzein, Genistein) bereits aus dem Magen möglich ist, was je-

doch nicht für ihre Glycoside gilt (Crespy et al. 2002, Piskula et al. 1999). Diese sind

17

2. Schrifttum

im allgemeinen resistent gegen eine Hydrolyse im Magen, so dass sie das Duode-

num intakt erreichen (Hertog et al. 1992). Für Anthocyanidinmonoglycoside wurde

bei Ratten allerdings eine Absorptionsrate von ca. 25 % nachgewiesen (Talavéra et

al. 2003) und auch beim Menschen waren intakte glycosylierte Formen von Anthocy-

anidinen nur einige Minuten nach oraler Verabreichung im Blut nachweisbar (Cao et

al. 2001, Matsumoto et al. 2001). Ein Grund für diese Ausnahmestellung der Antho-

cyanidine ist, dass ihre Aglyca im pH-Bereich des Gastrointestinaltraktes sehr instabil

sind und abgebaut werden, bevor eine Absorption stattfinden kann (Erlund 2004).

Für Flavonoidglycoside, die im allgemeinen unversehrt in den Darmtrakt gelangen,

besteht abhängig von der Art ihres Zuckerrestes, die Möglichkeit, intakt oder nach

Abspaltung des Zuckers über die Enterozyten aufgenommen zu werden. Die Hydro-

lyse der Glycoside wird durch ß-Glucosidasen katalysiert, von denen drei in Säuge-

tieren ausführlich charakterisiert worden sind. Die lysosomale Glucocerebrosidase

(EC 3.2.1.62) und die intestinale Laktasephlorizinhydrolase (LPH) (EC 3.2.1.108)

sind membranständig und weisen substratspezifische Aktivitäten auf. Die dritte ß-

Glucosidase befindet sich hingegen frei im Cytosol vor allem in Leber- und Nieren-

und Dünndarmzellen und interagiert relativ unspezifisch mit verschiedenen Substra-

ten (Hays et al. 1996, Day et al. 1998). Bei der Bestimmung der Aktivität von ß-

Glucosidasen aus der Dünndarm-Bürstensaummembran von Menschen und Schafen

bezüglich einiger Flavonoid- und Isoflavonoidglycoside, darunter auch Quercetinmo-

no- und -diglucoside, wurden die meisten der eingesetzten Verbindungen mit ver-

schieden hoher Effizienz gespalten. Rutin (Quercetin-3-Glucorhamnosid) konnte je-

doch nicht hydrolysiert werden (Day et al. 1998, 2000b). Nach der oralen Aufnahme

von Rutin in Humanstudien zeigte sich, dass die Plasmawerte der Quercetinmetabo-

liten ihr Maximum erst 6 - 9 Stunden später erreichten, während dies bei Quercetin-

monoglucosiden wie dem Quercetin-4’-Glucosid schon innerhalb der ersten Stunde

der Fall ist (Hollman et al. 1997, 1999, Graefe et al. 2001, Cermak et al. 2003). Diese

Ergebnisse deuten darauf hin, dass Rutin bzw. Polyphenole, die mit einem Rhamno-

serest verbunden sind, erst absorbiert werden können, wenn sie im hinteren Ileum

oder im Colon durch mikrobielle Enzyme hydrolysiert worden sind. Die Absorption im

distalen Darmtrakt bedeutet für diese Verbindungen nicht nur eine verzögerte Ver-

18

2. Schrifttum

fügbarkeit in der systemischen Zirkulation, sondern auch eine wesentlich ineffiziente-

re Aufnahme, da im Dickdarm die absorptionsfähige Oberfläche geringer ist als im

Dünndarm (Manach et al. 2004). Zudem unterliegen die freigesetzten Aglyca der Me-

tabolisierung durch die im distalen Gastrointestinaltrakt reichlich vorkommenden Mik-

roorganismen.

Die LPH befindet sich auf der apikalen Seite der Enterozyten, wodurch die Moleküle

nach Abspaltung der Zuckerreste als Aglyca ins Darmlumen freigesetzt werden und

danach passiv durch die Membranen diffundieren, wohingegen die cytosolische ß-

Glucosidase durch Carrier aktiv in die Zelle transportierte Glucoside hydrolysiert

(Németh et al. 2003, Petri et al. 2003). Das Quercetin-4’-glucosid beispielsweise

stellt ein potentielles Substrat für beide Enzyme dar, während das Quercetin-3-gluco-

sid erst nach Hydrolyse durch die LPH aufgenommen wird (Sesink et al. 2003, Day

et al. 2003). Der Umsatz der Substrate variiert allerdings inter-individuell, da sich die

Aktivitäten dieser Enzyme durch ausgeprägten Polymorphismus, also Genvariation

eines Allels innerhalb einer Population, unterscheiden. Németh et al. beobachteten in

ihren Untersuchungen mit zellfreien Extrakten humaner Dünndarmproben von zehn

verschiedenen Probanden eine etwa 87-fache Variation der Aktivität der im Dünn-

darm lokalisierten ß-Glucosidasen gegenüber dem Substrat Quercetin-4'-glucosid.

Die Lactasephlorizinhydrolase scheint der ausschlaggebende Faktor bei der Absorp-

tion von Quercetinmonoglucosiden zu sein. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass

durch die Inhibition des Enzyms die Aufnahme von Quercetin-3-glucosid bei Ratten

um 67 % sank, einhergehend mit einer 75 %igen Reduktion der Plasmakonzentration

(Sesink et al. 2003).

Für einfache Monoglucoside wird ein weiterer Aufnahmemechanismus in Betracht

gezogen, bei dem die Flavonoide in ihrer glycosilierten Form über den natriumab-

hängigen Glucosetransporter 1 (SGLT1) in die Enterozyten gelangen und anschlie-

ßend intrazellulär hydrolysiert werden (Hollman et al. 1999, Wolffram et al. 2002,

Walgren et al. 2000a). Die Wahrscheinlichkeit, dass dieser Glucosetransporter als

Transportmedium für Flavonoidglucoside dient, ist hoch, da er nachweislich ver-

schiedene glycosylierte Verbindungen zu transportieren vermag (Hirayama et al.

1994, Lostao et al. 1994). Versuche haben gezeigt, dass in Anwesenheit von Quer-

19

2. Schrifttum

cetin-3-glucosid (Isoquercitrin) und Quercetin-4’-glucosid (Spiraeosid) die intestinale

Aufnahme von Zuckermolekülen wie Glucose und Galactose kompetetiv gehemmt

wurde (Gee et al. 2000, Ader et al. 2001, Wolffram et al. 2002, Cermak et al. 2004).

Durch Untersuchungen zur Absorption von Flavonoiden an humanen Caco-2-Zellen

und SGLT1-transfizierten Hamsterovarzellen (G6D3) konnte sowohl mittels Fluores-

zenzmikroskopie als auch HPLC-Analysen die Aufnahme von Quercetin-4’-glucosid

in die Monolayer demonstriert werden, die sich im Beisein von Glucose und Phlorid-

zin, einem flavonoidähnlichen Polyphenolglucosid, verringerte. Die G6D3-Zellen wie-

sen zudem gegenüber parentalen Hamsterzellen eine gesteigerte Aufnahme auf

(Walgren et al. 2000a). In Experimenten mit der sogenannten „mucosal-uptake“-

Technik sowie Ussing-Kammer-Versuchen wurde die Annahme, dass eine Beteili-

gung des SGLT1 am Transport von Quercetinglucosiden sehr wahrscheinlich ist, er-

härtet. Dafür sprach eine Aufnahme von Isoquercitrin im Jejunum, in der der SGLT1

lokalisiert ist, nicht jedoch über die Colonschleimhaut, in der keine Exprimierung die-

ses Glucosetransporters stattfindet. Die Aufnahme von Quercetin-3-glucosid verrin-

gerte sich außerdem nach Zugabe von D-Glucose oder Phloridzin, sowie in Abwe-

senheit von Na+-Ionen, die für die Funktion des Carriers notwendig sind (Wolffram et

al. 2002). Weiterhin zeigten Cermak et al. (2004), dass der Na+-abhängige Glucose-

transport über den SGLT1 durch die genannten Quercetinmonoglucoside spezifisch

gehemmt wurde.

2.5.1.2 Die Rolle der intestinalen Mikroflora

Die enzymatische Aktivität der Mikroflora trägt einen nicht unerheblichen Teil dazu

bei, dass die Absorption und damit einhergehend auch die Bioverfügbarkeit von Fla-

vonoiden verringert wird, denn verstoffwechselt werden nicht nur die Flavonoidglyco-

side, die direkt mit der Ingesta den Dickdarm erreichen, sondern auch die Verbin-

dungen, die über die Galle ins Darmlumen resezerniert werden (Scalbert & William-

son 2000).

Die Abspaltung der Zuckerreste wird unter anderem durch ß-Glucosidasen und ß-

Rhamnosidasen katalysiert, die von einer Vielzahl verschiedener Bakterienspezies

stammen, darunter Streptokokkensubspezies (z. B. Sc. faecium VHG-1) (MacDonald

20

2. Schrifttum

et al. 1984), Escherichia coli-Stämme (Hur et al. 2000) und Bacteroides ssp.

(Bokkenheuser et al. 1987). Einige Bakterien metabolisieren ausschließlich den

Zuckerrest, während das Aglycon unverändert bleibt. So setzt beispielsweise Entero-

coccus cassiliflavus die Glucoseeinheit des Quercetin-3-O-glucosids zu Laktat, Ace-

tat und Formiat um (Schneider et al. 1999). Andere Mikroorganismenarten bauen

auch die Aglyca in großem Umfang weiter zu diversen aromatischen Verbindungen

ab (Kühnau 1976). Bestimmte strukturelle Merkmale scheinen jedoch Schutz vor

mikrobiellem Abbau zu bieten, wie z. B. die Abwesenheit von Hydroxylgruppen an

Position 5, 7 oder 4’ (Griffiths & Smith 1972). Zur Spaltung des Flavonoidgrundge-

rüstes sind u. a. Clostridium orbiscindens (Schoefer et al. 2003) und Eubacterium

ramulus befähigt (Blaut et al. 2003, Braune et al. 2001). Diese und andere Bakterien

spalten je nach chemischer Struktur den heterozyklischen Ring an verschiedenen

Stellen, wodurch aromatische Säuren entstehen. Flavonole werden dabei hauptsäch-

lich zu Hydroxyphenylessigsäuren umgesetzt, Flavone und Flavanone zu Hydro-

xyphenylpropionsäuren. Diese werden weiter zu Benzoesäurederivaten verstoff-

wechselt, welche letztendlich absorbiert und mit Glycin, Glucuronsäure oder Sulfaten

konjugiert werden oder weiter abgebaut werden. Im letzteren Fall entstehen kurzket-

tige Fettsäuren und Kohlenstoffdioxid (Hollman & Katan 1998). Walle et al. (2001)

konnten in ihrer Studie demonstrieren, dass radioaktiv markiertes Quercetin nach

oraler und intravenöser Applikation beim Menschen zu 24 – 81 % der zugeführten

Dosis in Form von CO2 abgeatmet wird. Ueno et al. (1983) hatten ebenfalls von der

Produktion radioaktiven Kohlenstoffdioxids kurz nach der oralen Verabreichung von

[14C] Quercetin an Ratten berichtet.

2.5.1.3 Einfluss der Nahrungszusammensetzung

Neben der chemischen Struktur der Verbindungen ist hinsichtlich der Bioverfügbar-

keit außerdem zu berücksichtigen, mit bzw. in Form welcher Nahrungsmittel sie auf-

genommen werden, da bei bestimmten diätetischen Komponenten die Möglichkeit

besteht, dass diese die Absorption von Flavonoiden beeinflussen. Diese Annahme

beruht auf Untersuchungen zur Aufnahme von Flavonoiden als Reinsubstanz in

Form der Aglyca oder von Glycosiden sowie als natürlicher Bestandteil einer Mahl-

21

2. Schrifttum

zeit bzw. in Verbindung mit bestimmten Nahrungskomponenten. Je nachdem, ob

Flavonoide in pflanzlicher Matrix eingeschlossen sind, aus der die Glycoside zu-

nächst während des Verdauungsvorganges durch mechanische, enzymatische und

chemische Prozesse freigesetzt werden müssen, oder ob sie mit bestimmten Lö-

sungsmitteln verabreicht werden, entstehen mehr oder weniger ausgeprägte Unter-

schiede in der Bioverfügbarkeit. Der Vergleich der Bioverfügbarkeit von Quercetin

nach einmaliger Aufnahme einer großen Menge Zwiebeln (225 µmol) bzw. Äpfel (325

µmol) ergab eine Differenz von 70 % (zugunsten der Zwiebeln), welche u. a. auf

Unterschiede in der Zellwandsstruktur, im Bindungsverhalten des Flavonols

gegenüber Zellbestandteilen und der Lokalisation der Glycoside in der Zelle

zurückgeführt wurde (Hollman et al. 1997). In einer weiteren Bioverfügbarkeitsstudie

wurde Probanden Zwiebelsupplement und Buchweizentee einerseits sowie isoliertes

Quercetin-4’-O-glucosid und Rutin andererseits verabreicht, um den Einfluss der

Pflanzenmatrix zu bestimmen. Ein Effekt konnte lediglich im Fall von Rutin

verzeichnet werden, wobei die Bioverfügbarkeit der Reinsubstanz nur rund zwei

Drittel derjenigen aus dem Teeextrakt betrug (Graefe et al. 2001). Neben der

Einwirkung der Struktur flavonoidhaltiger Nahrungsbestandteile wurde der Einfluss

bestimmter Nahrungskomponenten untersucht, darunter einige Fette und Alkohole.

Anhand verschiedener Experimente erhärtet sich die Annahme, dass Alkohole als

Extraktionsmittel für Polyphenole in der Lage ist, deren Aufnahme aus der Ingesta zu

steigern. Dazu wurden bereits mehrfach die Absorptionsprofile nach oraler

Administration von in Alkoholen (z. B. reines Ethanol oder Propylenglycol, Rot- und

Weißwein) und in nichtalkoholischen Getränken (Wasser, Fruchtsäfte) gelöstem

Quercetin verglichen (Goldberg et al. 2003, Piskula & Terao 1998, Dragoni et al.

2006, Azuma et al. 2002). Weinalkohol beispielsweise scheint den

Quercetinmetabolismus zudem in Richtung Isorhamnetin- und Tamarixetinbildung zu

lenken (Dragoni et al. 2006). Andere Studien deuten darauf hin, dass auch Fette und

emulsionsfördernde Agentien die Absorption von bestimmten Flavonoiden

verbessern können. In diesem Zusammenhang wurde die Wirkung von Fischöl,

Sojaöl, Rindertalg und Lecithin überprüft, welches in einer zwiebelhaltigen Diät in

einer Kurzzeitstudie an Ratten verfüttert wurde. Mehr als 4,6 % Sojaöl im Futter

führte zu einer deutlich gesteigerten Akkumulation von Quercetinmetaboliten im

22

2. Schrifttum

tinmetaboliten im Plasma. Ein Gehalt von 9,5 % Fischöl, Rindertalg oder Sojaöl in

der Diät hatte jeweils einen ähnlichen Effekt auf die Bioverfügbarkeit, während Leci-

thin noch effektiver wirkte, als die drei anderen Lipide. Eine gleichzeitige Verabrei-

chung von Emulgatoren mit dem Trinkwasser führte zu einer zusätzlichen Steigerung

der Bioverfügbarkeit der Quercetinglycoside aus der Diät (Azuma et al. 2003). In ei-

nem ähnlichen Experiment wurde Quercetin in der tendenziell lipophilen Aglyconform

und als hydrophiles 3-O-Glucosid in Testmahlzeiten mit unterschiedlichem Fettgehalt

(3, 17 oder 32 g Fett/100 g Futter) an wachsende Schweine verabreicht. Die Biover-

fügbarkeit des Glucosids war nach Aufnahme jeder Diät höher als die des Aglycons.

Ungeachtet der applizierten Verbindung wurde nach der 17 %igen im Vergleich zur 3

%igen Fettdiät eine Steigerung der Bioverfügbarkeit verzeichnet, eine Erhöhung des

Fettanteils erbrachte jedoch keinen weiteren Effekt. Mit Fett angereicherte Diäten

führten zudem zu einer deutliche Verzögerung der Elimination von Quercetin aus der

systemischen Zirkulation (Lesser et al. 2004).

2.5.2 Metabolisierung und Verteilung von Flavonoiden im Organismus

Dass Flavonoide schon im Lumen des Gastrointestinaltraktes und in der Darmmuco-

sa bereits vor dem Erreichen der Leber umfangreich metabolisiert werden und dem-

nach einem ausgeprägten intestinalen First-Pass-Effekt unterliegen, wurde durch

den Nachweis von entsprechenden Konjugaten im Kreislauf kurz nach oraler

Applikation in einigen in vivo-Studien dargelegt (Ader et al. 2000, Manach et al. 1998,

Morand et al. 1998). Einmal absorbiert, werden polyphenolische Verbindungen ver-

schiedenen Stoffwechselprozessen unterworfen, in die Phase-I- und Phase-II-En-

zyme involviert sind. Cytochrom P450-Monooxygenase-abhängige Hydroxylierungen

und Demethylierungen sind Beispiele für mögliche Aktivierungsreaktionen aus dem

Phase-I-Metabolismus, die jedoch im Flavonoidstoffwechsel eher eine untergeordne-

te Rolle zu spielen scheinen. Vielmehr wird angenommen, dass Flavonoide durch

ihre bereits vorhandenen Hydroxylgruppen in ihrer Ausgangsform sehr empfänglich

für Phase-II-Konjugationen sind (Day et al. 2004).

23

2. Schrifttum

2.5.2.1 Konjugation

Polyphenole sind hauptsächlich drei verschiedenen Konjugationstypen unterworfen:

Glucuronidierung, Sulfatierung und Methylierung. Es handelt sich dabei um allgemei-

ne Detoxifizierungsreaktionen, durch die u. a. toxische Effekte von Xenobiotika abge-

schwächt werden und deren Ausscheidung mit der Galle oder dem Harn durch die

Erhöhung ihrer Löslichkeit beschleunigt wird. Konjugation kann an einzelnen oder

mehreren Hydroxylgruppen des Polyphenolmoleküls stattfinden. Da bei Flavonoiden

die biologische Aktivität signifikant durch das Hydroxylierungsmuster bestimmt wird,

gehen aus dieser Art der Biotransformation, abhängig von der Position, an der eine

Konjugation stattfindet, Metaboliten mit veränderten Eigenschaften hervor (Boersma

et al. 2002).

Bei der Glucuronidierung wird die Übertragung von Glucuronsäuren auf Akzeptor-

moleküle wie Steroide, Gallensäuren, Polyphenole und viele Arzneimittel durch UDP-

Glucuronosyltransferasen (UGT) katalysiert, welche membranständig im endo-

plasmatischen Retikulum diverser Gewebe zu finden sind (Manach et al. 2004,

Taskinen et al. 2003). Im menschlichen Organismus gibt es verschiedene Isoformen

der UGT, von denen die meisten in der Leber lokalisiert sind. Einige Unterfamilien -

wie beispielsweise die UGT1A8 - kommen jedoch auch spezifisch im Gastrointesti-

naltrakt vor, andere in Niere oder Gehirn (King et al. 2000, Day et al. 2000a). Die in-

testinalen UGTs sind zu einem großen Teil am First-Pass-Metabolismus von Poly-

phenolen beteiligt. Ergebnisse mehrerer Studien am Modelltier Ratte zeigten, dass

Verbindungen dieser Substanzgruppe während der Absorption im Darm bereits ex-

tensiv glucuronidiert werden. In diesem Zusammenhang wurde z. B. die Metabolisie-

rung von Quercetin und Isoquercetrin während einer in situ-Perfusion des Jejunums

und Ileums untersucht, wonach sich ausschließlich konjugierte Formen im mesente-

rialen Blut anfanden (Crespy et al. 2001). Schon zuvor wurde die im Verhältnis zu

anderen Körpergeweben höchste UGT-Aktivität in Dünn- und Dickdarmpräparaten

von Ratten nach Messung von Epicatechinmetaboliten im Plasma registriert (Piskula

& Terao 1998), und auch durch Versuche am isolierten Rattendünndarm konnte eine

hohe Aktivität der UDP-Glucuronosyltransferase u. a. gegenüber einigen Flavonolen,

Flavonen und Flavanonen in den Enterozyten nachgewiesen werden (Spencer et al.

24

2. Schrifttum

1999). In einer Studie von Gee et al. (2000) zur Absorption von Quercetinaglyca und

-glucosiden durch die jejunale Mucosa von Ratten zeigte sich, dass Quercetin haupt-

sächlich in Form von Quercetin-7- und Quercetin-3-glucuroniden auf der serosalen

Seite des Darms erschien. Zudem konnte eine zusätzliche Konjugation an Position 4’

und 3’ durch UDP-Glucuronosyltransferasen aus menschlichen Dünndarmmikroso-

men demonstriert werden (Boersma et al. 2002).

Bei der Sulfatierung von Polyphenolen katalysieren Sulfotransferasen den Transfer

eines Sulfatrestes von der aktivierten Verbindung 3’-Phosphoadenosin-5’-phospho-

sulfat auf eine der Hydroxylgruppen (Piskula & Terao 1998, Falany 1997, Day et al.

2004). Durch die Konjugation mit Sulfaten wird die Wasserlöslichkeit stark erhöht und

damit die Exkretion mit dem Harn gesteigert (Weinshilboum & Otterness 1994). Es

liegt im allgemeinen eine hohe Affinität zur Sulfatierung vor, jedoch sind die Kapazi-

täten dieses Stoffwechselweges verglichen mit der Glucuronidierung relativ schnell

ausgeschöpft, so dass bei einer Erhöhung der Substratdosis eine Verschiebung zur

Konjugation mit Glucuronsäure vorliegt. Da aber normalerweise eine große Menge

an Konjugaten im Kreislauf auftauchen, die sowohl glucuronidiert als auch sulfatiert

sind, scheint eine Glucuronidierung kein Hindernis für eine nachfolgende Sulfatierung

darzustellen (Koster et al. 1981, Day et al. 2004). Cytosolische und membranständi-

ge Sulfotransferasen sind in Körpergeweben von Mensch und Tier weit verbreitet

und weisen überlappende Substratspezifitäten auf (Falany 1997). Vor allem in der

Leber scheinen Polyphenole umfangreich zu Sulfokonjugaten umgesetzt zu werden

(Piskula & Terao 1998). Die Methylierung ist eine weitere biologische Transformati-

on, die im Flavonoidmetabolismus eine Rolle spielt. Dabei katalysiert die Catechol-O-

Methyltransferase (COMT) die Übertragung eines Methylrestes von S-Adenosyl-L-

methionin auf Polyphenole, die eine Catecholgruppe im Molekül enthalten wie bei-

spielsweise Quercetin, Catechin oder Luteolin (Manach et al. 2004). Auch die Methy-

lierung von Cyanidin zu Peonidin im Menschen wurde nachgewiesen (Wu et al.

2002). Die COMT ist ubiquitär präsent im Körper, wobei Leber und Nieren relativ ho-

he Aktivitäten aufweisen (Piskula & Terao 1998). Zudem deuten einige Studien dar-

auf hin, dass die Methylierung von Flavonoiden bereits in den Enterozyten des

Dünndarms stattfindet. Dies demonstrierten neben Spencer et al. (1999) auch

25

2. Schrifttum

26

Kuhnle et al. (2000), die den Metabolismus von Catechin und Epicatechin im jejuna-

len Abschnitt des Rattendünndarms untersuchten und neben ca. 45 % Glucuroniden

etwa 20 % Metaboliten mit sowohl Glucuronyl- als auch Methylresten identifizierten,

sowie ca. 30 % Konjugate, die ausschließlich in Position 3’ und 4’ methyliert waren.

In diesen Lokalisationen werden Methylgruppen vorrangig gebunden, was auch an-

hand hoher Tamarixetin- und Isorhamnetinkonzentrationen (= 4’- und 3’-

Methylquercetin (Abb.4)) im Plasma, Urin und Gallenflüssigkeit von Ratten, denen

hohe Dosen an Quercetin mit dem Futter verabreicht worden waren, gezeigt werden

konnte (Manach et al. 1996b). Auch beim Schwein erscheinen beide Metaboliten

schon kurz nach oraler Aufnahme von Quercetin im Plasma, was für eine umfangrei-

che Methylierung in den Enterozyten spricht (Ader et al. 2000).

Tamarixetin

Quercetin

Isorhamnetin

Abb. 4: Methylierung von Quercetin zu Tamarixetin (4'-Methylquercetin) und Isorhamnetin (3'-Methylquercetin)

Das Konjugationsmuster der Metaboliten kann zwischen Individuen verschiedener

Spezies stark variieren, da es durch bestimmte Faktoren beeinflusst wird. Beispiels-

weise werden bei der Ratte im allgemeinen hohe Gehalte an methylierten Verbin-

dungen gefunden (Manach et al. 1996b), während dieser Stoffwechselprozess beim

Menschen eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint und nach Applikation von

Quercetin nur ca. 20 – 30 % an methylierten Konjugaten im Blut auftreten. (Manach

et al. 1998, Day et al. 2000a). Auch die Sulfokonjugation überwiegt bei den Ratten im

Vergleich zum Menschen, bei dem die Glucuronidierung als Hauptkonjugationsme-

chanismus angegeben wird (Wittig et al. 2001, Crespy et al. 1999, Manach et al.

2. Schrifttum

1995). Letzteres gilt auch für das Schwein, in dessen Organismus Sulfatierung nicht

statt zu finden scheint (Caldwell 1982). Neben speziesspezifischen Unterschieden im

Metabolismus von Flavonoiden, sind auch geschlechtsabhängige Variationen beob-

achtet worden, wie z. B. geschlechtsspezifischer Dimorphismus bei Nagern bezüg-

lich der Sulfotransferaseaktivität (Piskula 2000, Klaassen et al. 1998). Ungeachtet

dieser interindividuellen Unterschiede hinsichtlich der Enzymkapazitäten ist die Ten-

denz zur Konjugation von Flavonoiden im Organismus von Säugern sehr hoch. Ab-

gesehen von Epigallocatechingallaten (Lee et al. 2002), sind daher sind bei der Auf-

nahme von nahrungsphysiologischen Dosen im allgemeinen nur sehr geringe Kon-

zentrationen der Aglyca im Plasma zu erwarten (Manach et al. 2004).

2.5.2.2 Intestinale und biliäre Sekretion

Flavonoide erreichen über die systemische Zirkulation nur zu einem bestimmten Pro-

zentsatz der zugeführten Menge die peripheren Gewebe. Dies liegt zum einen daran,

dass die intestinale Absorption nicht komplett zu sein scheint und zum anderen be-

stimmte Fraktionen in konjugierter Form über die Hepatozyten und Enterozyten ins

Darmlumen resezerniert werden. In welchem Ausmaß diese Vorgänge stattfinden,

hängt vor allem von den strukturellen Merkmalen der einzelnen Flavonoide ab

(Crespy et al. 2003).

Nach der intrazellulären Bildung von Flavonoidkonjugaten können diese Konjugate -

wie übrigens auch intakte Quercetinmonoglucoside - über die Bürstensaummembran

ins Darmlumen resezerniert werden. Anhand von Studien am Dünndarm von Ratten,

bei dem jejunale und ileale Segmente mit flavonoidangereicherter Lösung perfundiert

wurden, erhielten Crespy et al. (1999, 2003) Informationen über Absorption und Sek-

retion über den Darmtrakt, sowie die Verteilung von Quercetin und weiteren Flavo-

noiden. Zwei Drittel des zugeführten Quercetins wurden absorbiert, 52 % der Ge-

samtmenge wurden durch die Darmzellen ins Lumen resezerniert, und nur etwa 15

% konnten im mesenterialen Blut registriert werden. Zwei Fünftel dieses Anteils un-

terlagen der Sekretion über die Galle, so dass im Endeffekt lediglich 9 % der einge-

setzten Quercetinmenge in der Peripherie verfügbar waren. Ein mehr oder weniger

großer Anteil der absorbierten und in Darm und Leber konjugierten Flavonoide unter-

27

2. Schrifttum

liegt also dem enterohepatischen Kreislauf. Die resezernierten konjugierten Verbin-

dungen erreichen den Zwölffingerdarm, werden jedoch während ihrer Passage durch

den Dünndarm nicht reabsorbiert. Erst durch die enzymatische Aktivität der Mikroflo-

ra im distalen Darmtrakt (s. 2.5.1.2) findet eine Dekonjugation statt. Die freigesetzten

Aglyca werden entweder erneut absorbiert oder weiter abgebaut (Manach et al.

2004).

Ein Efflux von Flavonoiden aus den Zellen wird vermittelt durch sogenannte

ABC(ATP-binding cassette)-Transporter wie dem MRP1 bzw. MRP2 (multidrug

resistance associated protein 1 und 2), dem P-Glykoprotein und dem BCRP1 (breast

cancer resistance protein), die sich vor allem in Organen befinden, die an der Elimi-

nation von Xenobiotika beteiligt sind, also unter anderem auch in der Bürstensaum-

membran der Enterozyten und der kanalikulären Membran der Hepatozyten (Ofer et

al. 2005, Sesink et al. 2005, O’Leary et al. 2002). Es handelt sich hierbei um primär

aktive Mechanismen, die durch Energie aus der Hydrolyse von ATP ihre Substrate

aus der Zelle „bergauf“ transportieren können (Litman et al. 2001).

MRP1 und 2 akzeptieren im allgemeinen ein ähnliches Spektrum von organischen

Anionen, darunter Konjugate von lipophilen Verbindungen wie Glutathion-, Glucuro-

nid- und Sulfokonjugate (König et al. 1999, Borst & Elferink 2002). Es wurde jedoch

auch gezeigt, dass MRPs auch den Efflux nichtanionischer Verbindungen, wie zum

Beispiel von Quercetin-4’-glucosid, vermitteln können (Walgren et al. 2000b). MRP1

ist zwar in Körpergeweben weit verbreitet, kommt aber im Gegensatz zu MRP2 in

Leber- und Darmzellen nur limitiert vor, und trotz ähnlicher Molekülstruktur und Sub-

stratspektra weisen MRP1 bzw. MRP2 unterschiedliche Affinitäten zu verschiedenen

Flavonoiden auf. Diese Eigenschaft beobachteten unter anderem van Zanden et al.

(2005) bei ihren Untersuchungen zur inhibitorischen Wirkung von insgesamt 29 Fla-

vonoiden aus der Subklasse der Flavone und Flavonone auf MRP1 und 2.

BCRP1, ein weiteres Mitglied der ABC-Transporter-Familie, wurde initial in humanen

Brustkrebszellen entdeckt (Doyle et al. 1998). In vitro-Studien haben gezeigt, dass

Flavonoide auch potenzielle Substrate für BCRP1 darstellen (Zhang et al. 2004, Imai

et al. 2004). Neben der direkten inhibitorischen Wirkung auf den Transporter sind

28

2. Schrifttum

zumindest einige Flavonoide in der Lage, die ATPase-Aktivität zu modulieren

(Cooray et al. 2004). BCRP1 scheint am apikalen Efflux von in Enterozyten gebilde-

ten Quercetinglucuroniden beteiligt zu sein, da nach Einsatz von FTC (Fumitremorgin

C), einem spezifischen Inhibitor dieses Effluxtransporters, bei Ratten ein mehr als

zweifacher Anstieg des Plasmaquercetinspiegels verzeichnet werden konnte (Sesink

et al. 2005). Auch in der Leber ist dieser Transporter nachweisbar, was die Beteili-

gung an der effizienten Exkretion von Quercetinkonjugaten über die Galle sehr wahr-

scheinlich macht (Arts et al. 2004).

Das P-Gykoprotein, welches eine ähnliche Gewebeverteilung wie das BCRP1 auf-

weist, spielt eine Rolle beim Transport von amphipatischen oder positiv geladenen

lipophilen Molekülen, vorrangig in Grenzgeweben wie der Blut-Hirn- oder der Blut-

Hoden-Schranke, der Plazenta oder dem Colon. Auch in Tumoren kann es in gro-

ßem Umfang exprimiert werden (Cooray et al. 2004). Durch seine Lokalisation an

zellulären Barrieren übernimmt dieser Transporter eine Schutzfunktion bei der Ver-

teidigung von Zellen gegenüber toxischen Substanzen, im Fall der Behandlung von

malignen Tumoren kann er jedoch das Eindringen von therapeutisch eingesetzten

Medikamenten wie Zytostatika stark behindern (Ofer et al. 2005). Für Flavonoide be-

stehen derzeit gegensätzliche Aussagen über ihre Wirkung auf das P-Glykoprotein.

Im allgemeinen sind sie in der Lage, durch kompetetive Hemmung die Akkumulation

anderer Substrate des P-Glykoproteins zu fördern, ihre Effekte auf die ATPase-

Aktivität des Transporters scheinen jedoch unterschiedlich zu sein. So beobachteten

Wang et al. (2005) in einem entsprechenden Experiment mit Flavonoiden aus Ginkgo

biloba eine Hemmung der ATPase-Aktivität des Proteins durch Quercetin und

Kaempferol, jedoch einen stimulierenden Effekt durch Isorhamnetin.

2.5.2.3 Plasmatransport und Gewebeverteilung

Polyphenole bzw. ihre Metaboliten zirkulieren nicht in freier Form im Blutkreislauf,

sondern gehen zum größten Teil eine Bindung mit Plasmaproteinen ein. Die Interak-

tionen von Quercetin mit diesen Transportproteinen ist eingehend untersucht worden

(Boulton et al. 1998, Zsila et al. 2003, Sengupta & Sengupta 2002). Dabei stellte sich

heraus, dass das Quercetinaglycon in vitro umfangreich (~99 %) an menschliches

29

2. Schrifttum

Serumalbumin gebunden wird, eine Kopplung an andere Proteine und LDLs dagegen

eine untergeordnete Rolle spielt. Von größerer Bedeutsamkeit ist jedoch die Unter-

suchung des Bindungsverhaltens der Konjugate, die nach Aufnahme polyphenolhal-

tiger Nahrung im Organismus entstehen. Ihre Affinität zum Albumin bestimmt letzt-

endlich, in welchem Maße sie als biologisch aktive Verbindungen in periphere Ge-

webe aufgenommen, verteilt und weiter verstoffwechselt werden. Nach Untersuchun-

gen von Dufour & Dangels (2005) zur Bindungsaffinität von Quercetinkonjugaten ist

davon auszugehen, dass auch diese im Kreislauf zum größten Teil als Komplex mit

Albumin zirkulieren, obwohl ihre Affinität zu dem Plasmaprotein, verglichen mit dem

Aglycon, abgeschwächt ist. Eine in vitro-Studie deutet außerdem darauf hin, dass

menschliche Erythrozyten durch die Bindung von Quercetin an Hämoglobin eine Rol-

le in der Bioverfügbarkeit von Flavonoiden spielen könnten (Fiorani et al. 2003).

Die Gewebeverteilung von Flavonoiden - insbesondere von Quercetin - wurde schon

von einigen Autoren behandelt, wobei es zwischen Kurz- und Langzeitstudien zu dif-

ferenzieren gilt. Ein relativ häufig verwendeter Versuchsansatz stellt beispielsweise

die Untersuchung der Verteilung der Radioaktivität nach einmaliger oraler Applikation

von radioaktiv markiertem Quercetin bei der Ratte dar. Als Ergebnis einer solchen

Studie wurde sechs Stunden nach Gabe einer Einzeldosis von [14C]-Quercetin-

aglycon die mit Abstand höchste Konzentration der zugeführten Radioaktivität im

Gastrointestinaltrakt und nur etwa 0,2 % in Leber und Nieren gefunden. Alle weiteren

untersuchten Organe (Lunge, Skelettmuskulatur, Herz) enthielten eine um ein Viel-

faches geringere Menge an radioaktiven Molekülen (Ueno et al. 1983). Mullen et al.

(2002) und Graf et al. (2005) widmeten sich in zwei inhaltlich zusammenhängenden

Studien der Verteilung und Metabolisierung von Quercetin-4’-glucosid. Sie wiesen

eine Absorption in einem Bereich von ca. 6 % der eingesetzten Dosis (7,6 mg/kg

[14C]-Quercetin-4’-glucosid = 58,5 x 106 dpm) sowie bezüglich der Organverteilung

ebenfalls vorrangig eine Anreicherung in Leber und Niere (je ~1 % der absorbierten

Radioaktivität) nach. Über 95 % der absorbierten Substanz wurde in Form von mehr

als 20 verschiedenen methylierten, glucuronidierten und/oder sulfatierten Quercetin-

konjugaten wiedergefunden. In Darm, Leber und Niere handelte es sich fünf Stunden

nach oraler Aufnahme hauptsächlich um Diglucuronide, im Plasma um glucuronidier-

30

2. Schrifttum

te Sulfate von methylierten Quercetinderivaten. Freies Quercetin konnte lediglich in

sehr geringen Mengen in Leber und Nieren detektiert werden (Graf et al. 2005). Ähn-

liche Ergebnisse ergaben sich aus einer Studie zur Bioverfügbarkeit von Quercetin

und Catechin bei Ratten, in der die Tiere über einen Zeitraum von zwei Wochen eine

mit Quercetin bzw. Catechin angereicherte Diät (je 0,25 %) erhielten (Manach et al.

1999).

Daneben scheint eine längerfristige Verabreichung von Quercetin außerdem eine

gewisse Retention der Verbindung in bestimmten Geweben nach sich zu ziehen. De

Boer et al. (2005) erweiterten und optimierten den Versuchsrahmen, indem sie in

ihrer Studie den Fütterungszeitraum ausdehnten und zwölf verschiedene Organe in

ihre Analysen einbezogen. Zusätzlich zu den Ratten untersuchten sie verschiedene

Gewebe vom Schwein, einer dem Menschen hinsichtlich der Anatomie und Physio-

logie des Gastrointestinaltraktes weitaus ähnlicheren Spezies. Die Ratten erhielten

über elf Wochen eine 0,1 bzw. 1 % Quercetin enthaltende Diät, was einer täglichen

Dosis von ~50 bzw. 500 mg pro Kilogramm Körpergewicht entsprach. Die höchsten

Konzentrationen von Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin wurden - abgesehen

vom Plasma - in Lunge, extrem niedrige Gehalte in Gehirn, Milz und weißem Fett

nachgewiesen. Die an der Elimination beteiligten Organe Leber und Niere enthielten

mittlere Konzentrationen. Die Gewebeverteilung wies bei beiden Diäten ein ähnliches

Muster auf, wobei eine zehnfache Erhöhung der Quercetindosis eine etwa vierfache

Konzentrationssteigerung in den Geweben bedingte. In den meisten Geweben beider

Gruppen betrug der Quercetinanteil ca. 30 % der Gesamtflavonolkonzentration; in

der Knochensubstanz, der Muskulatur, braunem Fett und Thymus überwogen wie-

derum deutlich die Gehalte an Methylquercetin, was auf unterschiedliche Methylie-

rungsraten der Gewebe und/oder verschiedene Aufnahmekapazitäten für methylierte

Metaboliten hindeutet. Tamarixetin stellte in allen Proben die kleinste Fraktion dar, im

Plasma (beider Tierarten) konnte es in keinem Fall detektiert werden. Einige Gewebe

wie die Lunge, die Leber und die Nieren, wiesen einen beachtlich hohen Gehalt an

freiem Quercetin auf (12 – 40 %), die meisten anderen Organe enthielten dagegen

niedrige oder nicht detektierbare Mengen. Im Plasma betrug der Aglyconanteil nur

0,4 - 0,8 %. Hinsichtlich der für das Auftreten von Aglyca in den Geweben verant-

31

2. Schrifttum

wortlichen Mechanismen konnte eine Aktivierung von Glucuronidasen während der

Aufarbeitung der Gewebeproben nicht ausgeschlossen werden.

In den Geweben von zwei Schweinen, denen über drei Tage lang hochdosiert Quer-

cetin mit dem Futter (500 mg/kg Lebendmasse pro Tag) verabreicht worden war, tra-

ten im Vergleich zu den Ratten die höchsten Quercetinkonzentrationen nicht im

Plasma (1,1 µmol/L) auf, sondern in der Leber (3,8 nmol/g Gewebe) und Niere (1,8

nmol/g Gewebe). Gehirn, Herzmuskulatur und Milz enthielten nur sehr geringe Men-

gen an Quercetin. Tamarixetin und Isorhamnetin konnten in den letztgenannten Ge-

weben nicht detektiert werden.

32

2. Schrifttum

2.6 ß-Glucuronidase

Die Dekonjugation von Flavonoidglucuroniden wird durch eine ß-Glucuronidase (EC

3.2.1.31) katalysiert, welche zu den sauren Hydrolasen zählt und im Säugerorganis-

mus in einer Vielzahl von Geweben exprimiert wird (Paigen 1989, Brunelle & Ver-

beeck 1993).

2.6.1 Subzelluläre Lokalisation

Bei der aktiven Form des Enzyms handelt es sich um ein Tetramer, das sich aus vier

identischen Untereinheiten zusammensetzt und in erster Linie in den Lysosomen lo-

kalisiert ist (Tomino & Paigen 1975). In höheren Eukaryonten durchläuft das Enzym

auf seinem Weg zu den Lysosomen über das Endoplasmatische Retikulum (ER) und

den Golgi-Apparat eine Reihe von posttranslationalen Modifikationen, zu denen bei-

spielsweise Glycosylierungen und die Bildung von Disulfidbrücken zählen (Shipley et

al. 1993, Rosenfeld et al. 1982). Untersuchungen an kleinen Nagern haben gezeigt,

dass in einigen Geweben, wie der Leber, der Lunge und der Niere, ein Teil des En-

zyms im Lumen des ER durch die Komplexierung mit dem membrangebundenen

Glycoprotein Egasyn verbleibt (Lusis et al. 1976, Lusis & Paigen 1977, Ganschow &

Paigen 1967) und anteilig etwa ein Drittel des intrazellulär vorhandenen Enzyms

ausmachen kann (Swank et al. 1986). Die microsomale und die lysosomale Form

stammen von demselben Gen ab, unterscheiden sich jedoch in ihrem Glycosylie-

rungsgrad (O’Leary et al. 2001).

2.6.2 Funktion

Die physiologische Rolle der ß-Glucuronidase besteht im schrittweisen Abbau von

Proteoglykanen in den Lysosomen durch die Abspaltung von Glucuronosylresten

(Tomino & Paigen 1975). Schwere Aktivitätsstörungen der ß-Glucuronidase führen

zur Mucopolysaccharidosis Typ VII, einer Speicherkrankheit, bei der es durch An-

schoppung von Glycosaminoglycanen in den Lysosomen zu Funktionsstörungen der

Zellen kommt (Birkenmeier et al. 1989, Glaser & Sly 1973). Diese Krankheit, die zu-

33

2. Schrifttum

nächst für den Menschen (Sly et al. 1973), später auch für Hunde (Haskins et al.

1984) und Mäuse (Birkenmeier et al. 1989) beschrieben wurde, ist gekennzeichnet

durch Zwergwuchs mit deutlicher Verkürzung von Gliedmaßen und Rumpf, schwerer

Skelettdeformation an Thorax und Wirbelsäule, Hepato- und Splenomegalie, geisti-

gem Zerfall und massiver Ausscheidung von Mucopolysacchariden mit dem Harn

(Glaser & Sly 1973). Milde Formen der ß-Glucuronidasedefizienz können bei der

Maus auch gänzlich symptomlos verlaufen (Birkenmeier et al. 1989).

Die Tatsache, dass dieses Enzym Glucuronide spaltet, macht es auch zu einem

Schlüsselenzym im Stoffwechsel von Xenobiotika. Eine Vielzahl von Studien belegt,

dass es bei chronischer Anwendung von Medikamenten zu einer Akkumulierung von

Glucuroniden kommen kann, die teilweise eine direkte, von der Muttersubstanz

abweichende oder verminderte pharmakologische Wirkung aufweisen. Eine

Abspaltung der Glucuronosylreste durch die ß-Glucuronidase würde demnach eine

Freisetzung der ursprünglichen Substanz bewirken und zudem ihr Verteilungsmuster

im Organismus modifizieren (Sperker et al. 1996). ß-Glucuronidase scheint in

Tumorgeweben nicht nur vermehrt exprimiert zu werden (Connors & Whisson 1966,

Mürdter et al. 1997, Sperker et al. 2000), sondern sie gelangt auch durch

nekrotischen Zelluntergang in den extrazellulären Raum (Bosslet et al. 1995),

wodurch eine Dekonjugation der im allgemeinen hydrophilen Glucuronide außerhalb

der Zellen stattfinden kann. Ähnliches gilt für entzündliche Gewebebereiche, in

denen Zellen wie beispielsweise neutrophile Granulozyten durch chemotaktische

Stimuli eine gesteigerte Freisetzung der ß-Glucuronidase aufweisen (Shimoi &

Nakayama 2005). Wie auch Lysozym wirkt das Enzym durch Schädigung von

Bakterienzellwänden mikrobizid (Krumholz et al. 2000).

Dem Umsatz von Flavonoidglucuroniden durch Enzyme wie die ß-Glucuronidase

wurde bisher noch relativ wenig Beachtung geschenkt. Shimoi et al. (2001) verwen-

deten Luteolin als Modellverbindung in einem ex vivo-Versuchsansatz mit stimulier-

ten humanen neutrophilen Granulozyten, um zu ermitteln, ob aus dem Luteolinmo-

noglucuronid möglicherweise während eines Entzündungsprozesses das im allge-

meinen biologisch aktivere Aglycon freigesetzt werden kann. Nach der Behandlung

von Versuchsratten mit LPS (Lipopolysaccharide) konnte ein deutlicher Anstieg der

34

2. Schrifttum

ß-Glucuronidaseaktivität und ein Absinken des Luteolinmonoglucuronidspiegels im

Vergleich zu nicht-behandelten Kontrolltieren gezeigt werden. Dieses Ergebnis deu-

tet darauf hin, dass im Zuge von Entzündungsreaktionen, wie sie beispielsweise in

der Pathogenese von Arteriosklerose, Krebs, rheumatoider Arthritis oder diabetischer

Nephropathie vorkommen, vermehrt glucuronidierte Konjugate der mit der Nahrung

zugeführten Flavonoide hydrolysiert werden. Die lipophilen Aglyca könnten demnach

in den umgebenden Zellen ihre biologische Wirkung entfalten. O’Leary et al. (2001)

untersuchten, ob eine mögliche Verfügbarkeit der Flavonoidaglyca in bestimmten

Körpergeweben auf die Substratspezifität der dekonjugierenden ß-Glucuronidase

zurückzuführen ist. Die Bestimmung der Affinität des aus Lebergewebe, Dünndarm

und neutrophilen Granulozyten gewonnenen Enzyms zu Quercetin-3-, 3’, 4’ und 7-

Glucuroniden ergab jedoch keine wesentlichen Unterschiede. Die Möglichkeit, dass

Quercetinglucuronide auch in vivo Substrate für die ß-Glucuronidase darstellen, setzt

voraus, dass sie in Geweben das zelluläre Kompartiment erreichen, in dem das En-

zym aktiv ist. Aus diesem Grund untersuchten O’Leary et al. (2003) in einer weiter-

führenden Studie an HepG2-Zellen den Metabolismus von Quercetin-7- und Querce-

tin-3-Glucuroniden nach Erreichen der Leber. Ihren Resultaten zufolge können die

Flavonolglucuronide zwei verschiedene Stoffwechselwege einschlagen: 1. die Methy-

lierung der Catecholgruppe (44 % der Quercetin-7-Glucuronide und 32 % der Quer-

cetin-3-Glucuronide), 2. die Hydrolyse der Glucuronide durch die endogene ß-

Glucuronidase (7 % der Quercetin-7-Glucuronide und 10 % der Quercetin-3-Glu-

curonide), gefolgt von einer Sulfatierung zu Quercetin-3’-Sulfat. Diese Metabolisie-

rung der Glucuronide zu Monosulfaten zeigt, dass sie von den Zellen aufgenommen

und intrazellulär von der ß-Glucuronidase dekonjugiert worden sein müssen. Dies

wiederum würde einen vorübergehenden Kontakt des Aglycons mit dem Intrazellular-

raum bedeuten. Über den Absorptionsmechanismus, durch den die Glucuronide in

die Leberzellen gelangen, besteht noch Unklarheit. Es wurde die Beteiligung eines

bisher noch unidentifizierten Influx-Transporters, der Ähnlichkeiten zur OATP-

Familie, insbesondere zu OATP2 (organic anion-transporting polypeptide 2) aufweist,

vermutet (O’Leary et al. 2003). Dieser Transporter spielt unter anderem bei der Auf-

nahme von Bilirubinglucuroniden in die Leber eine Rolle (Cui et al. 2000). Obwohl

35

2. Schrifttum

das Protein in den HepG2-Zellen nicht direkt nachgewiesen werden konnte, zeigte

sich, dass Quercetin-7-Glucuronide in Anwesenheit eines OATP2-Inhibitors nicht me-

tabolisiert wurde.

Bei den Überlegungen, ob die ß-Glucuronidase die Bioaktivität und Verteilung von

Flavonoiden im Organismus nachhaltig verändern kann, dürfen Faktoren, die das

Enzym selbst beeinflussen, nicht außer acht gelassen werden. Dazu zählen zu-

nächst gewebespezifische Unterschiede sowie eine große interindividuelle Variation

in der Expression der ß-Glucuronidase. Sperker et al. (1997) beschrieben solche Un-

terschiede anhand von Untersuchungen von 30 Leber- und 18 Nierenproben vom

Menschen. Die gemessenen Enzymaktivitäten der Leberproben rangierten von 0,32

bis 1,85, die der Nieren von 0,07 bis 1,0 µmol/mg Protein/h. Die Aktivität bzw. das

Vorkommen der ß-Glucuronidase im Organismus kann zudem nicht nur durch die

bereits genannten pathologischen Vorgänge im Körper moduliert werden, sondern

auch durch den gewöhnlichen Alterungsprozess. Sowohl in der Leber als auch in den

Nieren scheint die Aktivität mit dem Alter zuzunehmen, wobei eine gesteigerte Fragi-

lität der Lysosomenmembranen als Grund angenommen wird (Cristofalo & Kabakiji-

an 1975).

Eine weitere Möglichkeit, wie das Enzym in seiner Aktivität beeinflusst werden kann,

scheint in der Aufnahme bestimmter Nahrungskomponenten zu bestehen. In Ratten

verminderte beispielsweise die Verabreichung von Futter mit supplementiertem Cal-

ciumglucarat die ß-Glucuronidaseaktivität in Lebermicrosomen und Serum (Dwivedi

et al. 1990). Lampe et al. (2002) stellten eine inverse Korrelation zwischen der En-

zymaktivität im menschlichem Serum und der gesteigerten Aufnahme einer vorwie-

gend pflanzlich ausgerichteten Diät fest.

36

3. Material und Methoden


3.1 Fütterungsstudie

3.1.1 Versuchsaufbau und -durchführung

Bei den im Versuch verwendeten Tieren handelte es sich um sieben männliche kast-

rierte Hybridschweine (DL x DE) mit einem Anfangsgewicht von 33 - 37 kg aus dem

Mastbetrieb des Versuchsgutes Hohenschulen der Agrar- und Ernährungswissen-

schaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Zur Fütterung wurde

ein kommerzielles Alleinfutter für Mastschweine eingesetzt (J. Aug. Plambeck, 24582

Brügge), das vorwiegend aus Weizen- und Gerstenschrot, Gerstenfuttermehl, Rog-

genkleie, Sojaextraktionsschrot, Rapsextraktionsschrot und Zuckerrohrmelasse be-

stand. Inhalts- und Zusatzstoffe sind der Tabelle 2 zu entnehmen. Aufgrund des

Energiebedarfs von wachsenden Schweinen wurde die tägliche Futtermenge be-

rechnet (Kirchgeßner) und auf 80 % der ad libitum-Aufnahme festgelegt. Diese re-

striktive Fütterungsweise sollte die vollständige und zügige Aufnahme der Versuchs-

ration gewährleisten. Die Tiere hatten jederzeit über Nippeltränken Zugang zu Frisch-

wasser. In der letzten Versuchswoche wogen die Tiere 48,5 - 56,5 kg.

Tab. 2: Chemische Zusammensetzung der Versuchsration (in % der Ursprungssubstanz)

Rohprotein 16,50 Rohfaser 5,25 Rohfett 2,10 Rohasche 5,25 Calcium 0,70 Phosphor 0,50 Natrium 0,15 Lysin 0,90

Zusatzstoffe: 10.000 I. E. Vitamin A, 1.200 I. E. Vitamin D3, 80 mg α−Tocopherolacetat, 15 mg Kupfer, 500 FTU-3-Phytase; Umsetzbare Energie: 12,6 MJ ME/kg

Die Haltung der Tiere erfolgte einzeln in Stoffwechselkäfigen auf Kunststoffgittern

ohne Einstreu bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 – 70 %. Die Raumtempera-

37


tur wurde im Laufe des Versuches von 24°C auf 22°C reduziert. Die erste Woche

nach Einstallung diente der Adaptation der Tiere an die neuen Haltungsbedingungen.

Während dieser Phase wurde der Diät kein Quercetin zugesetzt. Um endogenen Pa-

rasitenbefall auszuschließen, wurden die Schweine am 5. Tag mit einem Antiparasi-

tikum (Flubenol 5 %) behandelt. Die tägliche Futterration wurde in zwei Mahlzeiten

pro Tag verabreicht. Nach der Adaptationszeit erhielten die Tiere über einen Zeit-

raum von vier Wochen eine Tagesdosis von 50 mg Quercetin (Quercetin-Dihydrat,

Carl Roth GmbH + Co, Karlsruhe) pro kg Lebendmasse (LM), von der jeweils die

Hälfte (25 mg/kg LM) mit der Morgen- bzw. Abendmahlzeit verabreicht wurde. Dazu

wurde wöchentlich das Gewicht der Versuchstiere bestimmt, die Quercetinmenge

individuell berechnet und alle zwei Tage auf Basis der Tageszunahmen aus der vo-

rausgegangenen Woche erhöht. Die jeweilige Quercetindosis wurde den mit Wasser

angefeuchteten Mahlzeiten (feucht-krümelige Konsistenz) vor jeder Fütterung manu-

ell zugemischt und von den Schweinen innerhalb von ca. 10 min aufgenommen. Die

letzte Quercetinapplikation erfolgte jeweils 60 - 90 Minuten vor der Tötung der Ver-

suchstiere.

Vor der Supplementierung mit Quercetin wurde einmalig eine Blutabnahme durchge-

führt und durch sofortige Zentrifugation (Zentrifuge: 3K12, Sigma) des Blutes über 10

Minuten bei 2000 x g und 4°C Plasma gewonnen. Zur Tötung wurden die Schweine

mit einer Ketamin/Azaperon-Narkose (Präparate: Ursotamin® /Stresnil®) abgelegt und

entblutet. Pro Tier wurden etwa 100 ml Blut aufgefangen und in heparinisierte Röhr-

chen (Sarstedt) überführt. 80 ml wurden anschließend unter den beschriebenen Be-

dingungen zur Plasmagewinnung zentrifugiert. Im folgenden wurden die Gewebe-

proben von jeweils mindestens 10 g als Doppelprobe entnommen. Dazu zählten je-

weils beide Gehirnhälften, ein Teil der Lunge, ein Abschnitt des mittleren Jejunums

und des proximalen Colons (komplett, ohne Inhalt), Anteile von Leber und Nieren,

Gekrösefett aus dem großen Netz des Magens und Rückenspeck sowie Teile des

M. longissimus dorsi und der Zwerchfellmuskulatur. Alle Gewebeproben wurden zu-

nächst auf Trockeneis durchgefroren und anschließend bis zur weiteren Aufbereitung

zusammen mit Plasma und Vollblut bei einer Temperatur von -70°C gelagert. Nach

Gewichtsbestimmung der Organproben wurden diese über einen Zeitraum von 72

38


Stunden lyophilisiert und danach erneut gewogen. Die weitere Verarbeitung bestand

in der pulverförmigen Zerkleinerung der Proben, die je nach Beschaffenheit der Ge-

webe in einem Kryomörser oder einer wassergekühlten Analysenmühle (A10 Jahnke

& Kunkel) vorgenommen wurde. Alle Proben wurden vor der Zerkleinerung in flüssi-

gem Stickstoff durchgefroren. Die Lagerung bis zur Analyse erfolgte bei -70°C unter

Luftabschluss in kältebeständigen Kunststoffröhrchen (Sarstedt), um die Aufnahme

von Fremdwasser zu verhindern.

3.1.2 Flavonolanalytik

Zur Extraktion der Plasmaproben wurden jeweils 980 µl Plasma verwendet. Von den

Geweben wurden zu diesem Zweck jeweils 100 mg in 980 µl physiologischer Natri-

umchlorid-Lösung suspendiert. Zu jedem Ansatz erfolgte die Zugabe von 20 µl einer

methanolischen Rhamnetinlösung (1 mg pro 20 ml Methanol; Rotichrom® HPLC, Carl

Roth GmbH, Karlsruhe) als interner Standard. Anschließend wurde der pH-Wert mit

jeweils eine zuvor ermittelte Menge an Essigsäure (0,583 mol/l) auf 4,5 – 6, dem pH-

Optimum der ß-Glucuronidase/Sulfatase (Crude solution aus Helix pomatia, Sigma-

Aldrich AG) eingestellt. Diese Enzymmischung dient dazu, Quercetin und seine Me-

taboliten aus den entsprechenden Konjugaten freizusetzen, da diese mit der ver-

wendeten Methode nicht eindeutig darstellbar sind. Zu diesem Zweck wurden die

angesäuerten Proben mit je 75 µl der Enzymmischung über eine Dauer von 60 min

bei 37°C im Schüttelwasserbad inkubiert. Bei parallel durchgeführten Bestimmungen

wurde keine enzymatische Behandlung durchgeführt, um den ursprünglichen Agly-

congehalt der Gewebe bestimmen zu können. Der folgende Schritt bestand in der

Versetzung der Proben mit 4 ml Aceton zur Fällung der Proteine. Nach 20-minütiger

gründlicher Durchmischung auf einem Horizontalschüttler erfolgte die Abtrennung

des flavonoidhaltigen Extraktes durch eine 45-minütige Zentrifugation bei 4000 U/min

und einer Temperatur von 4°C (Varifuge 20RS, Heraeus, Hanau). Die Überstände

wurden abgenommen und bei 45°C und unter einem partiellen Vakuum bis zur Tro-

ckene eingedampft (SPD 2010 SpeedVac® System). Die Rückstände wurden in 200

µl Methanol aufgenommen und 15 min bis zur vollständigen Lösung in ein Ultra-

schallbad verbracht. Danach wurden zur Optimierung der chromatographischen

39


Trennung 77,5 µl aqua bidest und 22,5 µl Salzsäure (10 mol/l) hinzu pipettiert, ge-

mischt und die Ansätze ein weiteres Mal zentrifugiert (14000 U/min, Centrifuge

5415C, Eppendorf). Der Überstand wurde im Anschluss für die Analyse mittels HPLC

(High Perfomance Liquid Chromatography) verwendet. Zur Trennung und Darstel-

lung des in den Probenextrakten enthaltenen Quercetins und seiner methylierten Me-

taboliten Isorhamnetin und Tamarixetin (Abb. 4) wurde eine leicht modifizierte HPLC-

Methode nach Hollman et al. (1996b) verwendet. Die Injektion von 30 µl der aufgear-

beiteten Proben erfolgte über einen Autosampler (950-AS, Firma Jasco, Gross Um-

stadt) in das HPLC-System. Die stationäre Phase bestand in einer „Reversed Pha-

se“-Trennsäule (C-18 Kromasil 100, 250 x 4 mm, Partikelgröße: 5 µm, Jasco), der

zum Schutz der Trennmatrix vor Verunreinigungen eine Vorsäule (C-18 Inertsil ODS-

2, 10 x 4 mm Partikelgröße: 5 µm, Jasco) vorgeschaltet war. Als mobile Phase wurde

ein Fließmittel aus 135 Teilen Phosphatpuffer (0,025 M Natriumdihydrogenphosphat-

Monohydrat), 56 Teilen Acetonitril und 9 Teilen Methanol mit einem pH-Wert von

2,96 verwendet und die Flussrate auf 1 ml/min eingestellt. Um die aufgetrennten

Substanzen bestimmen zu können, wird bei dieser Analysemethode durch die soge-

nannte Nachsäulenderivatisierung die Fähigkeit der Flavonole genutzt, mit dreiwerti-

gen Aluminiumionen (Al3+) Komplexe zu bilden. Dazu wurde das Derivatisierungs-

reagenz, eine methanolische Aluminiumnitratlösung (1 mol/l), über ein „low-dead-

volume“-Mischstück dem Fließmittel mit einer Flussrate von 0,4 ml/min zugeführt. Die

Komplexbildung erfolgte anschließend in einem Kapillarreaktor (Teflonkapillare,

Innendurchmesser 0,5 mm, Länge 3 m), der zusammen mit der Trennsäule in einem

Säulenofen (30°C) untergebracht war. Mit dieser Methode werden nur Flavonole er-

fasst, die über eine freie Hydroxylgruppe in Position 3 verfügen und zusammen mit

der 4-Oxo-Gruppe an dieser Stelle einen Komplex mit Al3+ bilden können (Hollman et

al.1996b). Zur Detektion der komplexierten Einzelsubstanzen bei einer Anregungs-

wellenlänge von 422 nm und einer Emissionswellenlänge von 485 nm wurde ein Flu-

oreszenzdetektor (920-FP, Jasco) verwendet. Die Identifikation der enthaltenen Ver-

bindungen erfolgte durch den Vergleich der Retentionszeiten mit denen der Reinsub-

stanzen.

40


3.1.2.1 Kalibrierung und Auswertung

Zur Herstellung von Kalibrationsreihen für Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin

(Rotichrom® HPLC, Carl Roth GmbH, Karlsruhe) wurde eine methanolische Stan-

dardlösung angesetzt, die die genannten Flavonole in einer Konzentration von 125

mg/ml enthielt und schrittweise verdünnt wurde. Insgesamt wurde ein Konzentrati-

onsbereich von 125 bis 0,03 mg/ml abgedeckt. Um vergleichbare Bedingungen wie

im Versuchsansatz zu schaffen, wurden 20 µl dieser Lösungen sowie 20 µl Rhamne-

tin als interner Standard zu 960 µl einer physiologischen Kochsalzlösung mit 7 %

Albuminfraktion gegeben. Die Aufarbeitung erfolgte wie unter 3.1.2 bereits beschrie-

ben. Die Konzentrationen wurden anhand der relativen Peakflächen berechnet, wo-

bei mit der Fläche des Quercetin- und Isorhamnetinstandards und der Fläche des

internen Standards jeweils der Quotient gebildet wurde, um eventuelle Substanzver-

luste während der Aufarbeitung und der Messung zu berücksichtigen. Insgesamt

wurden drei Kalibrationsreihen erstellt und die Mittelwerte der Eichgeradensteigun-

gen zur Berechnung der Flavonolkonzentrationen im Plasma und in den Geweben

verwendet. Für jede der drei Verbindungen konnte regelmäßig ein linearer Konzen-

trationsverlauf dargestellt werden (Abb. 5).

Zur Bestimmung der Wiederfindung wurde entsprechenden Geweben vom Schwein

eine definierte Menge der Testsubstanzen als methanolische Lösung zugesetzt und

die Ansätze auf die gleiche Weise wie die Proben aufgearbeitet. Die ermittelten

Peakflächen wurden mit einer entsprechenden methanolischen Probe ins Verhältnis

gesetzt. Geprüft wurde die Wiederfindung in Leber und Muskelgewebe und lag für

Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin zwischen 85 und 94 %. Verluste traten vor

allem während dem Eindampfen der Proben auf. Eine Korrektur der Daten war je-

doch nicht notwendig, da die Aufarbeitung der Proben und Standards (Eichgeraden)

identisch war und damit die Verluste während der Probenaufarbeitung berücksichtigt

wurden. Die Wiederfindung der Testsubstanzen im Plasma mit der in dieser Studie

verwendeten Analysemethode wurde bereits ermittelt (Ader et al. 2000) und betrugen

für Quercetin 83 bzw. 101 %, für Isorhamnetin 87 % und für Tamarixetin 83 %. Die

Nachweisgrenze für Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin lag bei ca. 1 ng/g Ge-

41


webe. Nur diejenigen Peaks, die mindestens fünfmal so hoch wie das “Basisrau-

schen“ waren, wurden ausgewertet.

0 100 200 300 400

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

0 100 200 300 400

0

1.0×106

2.0×106

3.0×106

4.0×106

5.0×106

0 100 200 300 400

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5Konzentration [ng /ml]

Rel

ativ

e Pe

akflä

che

I/R

Tamarixetin y = 12682x R2 = 0,9988

Isorhamnetin y = 0,0034x R2 = 0,9973

T [µ

V]

Konzentration [ng /ml]

Rel

ativ

e Pe

akflä

che

Q/R

Quercetin y = 0,0014x R2 = 0,9979

Abb. 5:

Kalibriergeraden zur quantitativen Bestimmung von Quercetin, Tamarixetin und Isorhamnetin inPlasma und Geweben. Mittelwerte mit SEM von drei Bestimmungen (SEM teilweise im Symbol ent-halten). (R2 = Bestimmtheitsmaß; Q/R = Peakfläche Quercetin/Peakfläche Rhamnetin; I/R =Peakfläche Isorhamnetin/Peakfläche Rhamnetin; T = Peakfläche Tamarixetin)

Konzentration [ng /ml]

42


0 10 20 30 40 50

2.5×104

7.5×104

1.3×105

1.8×105

2.3×105

[µV]

t [min]

0 10 20 30 40 50

0

5.0×104

1.0×105

1.5×105

[µV]

t [min]

0 10 20 30 40 50

0

5.0×10 4

1.0×10 5

1.5×10 5

2.0×10 5

2.5×10 5

3.0×10 5

[µV]

t [min]

A

B

C

4

4

4

3

3

3

2

2

2

1

1

1
Abb. 6:
Chromatogramme eines Standards der Kalibriergeraden (A), sowie einer Plasmaprobe (B) undeiner Leberprobe (C) vom Schwein nach vierwöchiger Verabreichung einer täglichen Dosis von50 mg Quercetin pro kg Körpergewicht mit dem Futter; 1 = Quercetin, 2 = Isorhamnetin, 3 = Ta-marixetin, 4 = Rhamnetin (interner Standard)

43


3.1.2.2 Korrektur Residualblut

Tierisches Gewebe enthält nach dem Entbluten einen Restblutanteil. Die im Blut ent-

haltene Menge der Testsubstanz und deren Metaboliten muss von der in der Gewe-

beprobe bestimmten Gesamtmenge subtrahiert werden, um die tatsächlich im Ge-

webe enthaltene Menge der Testsubstanz zu ermitteln. Zu diesem Zweck wurde der

Hämoglobingehalt der lyophilisierten Gewebe mit dem Hämoglobingehalt von lyophi-

lisiertem Vollblut verglichen. Die Bestimmung erfolgte in Anlehnung an eine spektro-

photometrische Methode nach de Boer et al. (2005). Dazu wurden jeweils Doppel-

proben der Gewebe bzw. der Vollblutproben jedes Tieres von 0,1 g verwendet, die in

10 ml Tris-HCl (pH 7,4; mit 50 mmol/L EDTA (Titriplex III)) suspendiert wurden. Nach

zehnminütiger Zentrifugation bei 14000 x g und 10°C wurden 500 µl des Überstan-

des abgenommen und in einer Verdünnung von 1:1 mit Tris-HCl zur photometrischen

Messung eingesetzt. Das in der Literatur etablierte Peakmaximum von Hämoglobin

bei einer Wellenlänge von 540 nm wurde durch die Messung des Spektrums einer

Vollblutprobe im Wellenlängenbereich von 220 - 750 nm nachvollzogen. Um die Ge-

webekonzentrationen um den Flavonolanteil im Restblut zu korrigieren, wurden

durch Quotientenbildung aus den ermittelten Peakmaxima des Hämoglobins in Ge-

webe und Vollblut (Hbtissue/Hbbl) für jede Probe die Residualblutfraktion (fbl) berech-

net. Das Produkt aus diesem Faktor und der Gesamtplasmakonzentration wurde im

Anschluss von der totalen Gewebekonzentration subtrahiert (Ccorr = Ctot - fbl * Cpl).

44


3.2 Bestimmung der Aktivität der ß-Glucuronidase

3.2.1 Probenaufarbeitung und Testprinzip

Die Messung der Enzymaktivität erfolgte mit einer leicht modifizierten Methode von

O’Leary et al. (2001).

Die Bestimmung der Enzymaktivität erfolgte über die kontinuierliche Messung von p-

Nitrophenol, welches durch enzymatische Spaltung aus dem eingesetzten Modell-

substrat p-Nitrophenylglucuronid gebildet wird. Das in der Literatur etablierte Absorp-

tionsmaximum des Reaktionsproduktes von 400 nm wurde über die Messung des

Absorptionspektrums im Bereich von 200 bis 500 nm bestätigt und diese Wellenlän-

ge anschließend zur kinetischen Messung verwendet.

Zur Validierung des Versuchsansatzes und insbesondere, um den Bereich des linea-

ren Konzentrationsanstieges festzustellen, wurde anstelle der Gewebeproben zu-

nächst eine aufgereinigte Enzymmischung eingesetzt (ß-Glucuronidase/Sulfatase,

crude solution, Sigma-Aldrich AG, 111480 U/ml (1 Unit setzt 1,0 µl Phenolphthalein

aus Phenolphthaleinglucuronid bei pH 5 und 37°C frei)). Dazu wurde in vier Küvetten

Natriumphosphatpuffer (20 mmol/l, pH 7,2) in unterschiedlichen Volumina (800 - 875

µl) vorgelegt und mit der mit Puffer im Verhältnis 1:100 verdünnten Enzymlösung in

den Mengenanteilen 25 µl, 50 µl, 100 µl und 200 µl auf 900 µl ergänzt. Als Lösungs-

mittel für das entstehende farbige Produkt diente 2-Mercaptoethanol, das dem An-

satz in einer Konzentration von 10 mmol/l zugesetzt wurde. Die Reaktion wurde

durch die Zugabe von 100 µl einer Substratlösung (p-Nitrophenylglucuronid in Phos-

phatpuffer, 100 mmol/l, pH 7,2) gestartet. Die photometrische Messung wurde nach

Durchmischung der Komponenten über 60 Minuten (13 Intervalle à 5 Minuten) UV-

Spektrophotometer (UV-1602, Shimadzu, Europa GmbH Photometer) vorgenommen.

Zur Bestimmung der Enzymaktivität in den bereits lyophilisierten und zerkleinerten

Gewebeproben von Lunge, Leber, Nieren, M. longissimus dorsi und Zwerchfellmus-

kulatur dreier Schweine wurden aus 0,1 bzw. 0,2 g des Frischgewichtes durch Ho-

mogenisierung in eisgekühltem Natriumphosphatpuffer (20 mmol/l, pH 7,2) mit 2-

Mercaptoethanol (10 mmol/l) und anschließender halbstündiger Zentrifugation bei

45


14000 x g und 4°C zellfreie Extrakte hergestellt. Zur Messung wurden jeweils 100 µl

des Extraktes eingesetzt.

3.2.2 Proteinbestimmung und Auswertung

Zur Berechnung der spezifischen Aktivitäten der ß-Glucuronidase wurde der Protein-

gehalt der jeweiligen Extrakte bestimmt. Die Proteinbestimmung erfolgte mittels des

Bio-Rad-Protein Assays (Bio-Rad-Laboratories GmbH, München). Aus der Bindung

von Coomassie Brilliant Blau an die im Ansatz enthaltenen Proteine resultiert eine

Farbänderung, die zur Verschiebung des Absorptionsmaximums führt und sich pro-

portional zur Proteinkonzentration verhält. Die Farbänderung wurde photometrisch

bei einer Wellenlänge von 578 nm bestimmt (UV Spectrophotometer 1602, Shimad-

zu, Europa GmbH Photometer). Als Standard zur Erstellung einer Kalibrationsreihe

wurde bovines Serum-Albumin (Roth) eingesetzt.

Die spezifische Enzymaktivität wurde als Einheiten pro mg Protein berechnet. Eine

Einheit wurde definiert als Enzymmenge, die 1 nmol Produkt pro Minute bei 37°C

und einem pH-Wert von 7,2 freisetzt. Die Berechnung der Zunahme der Produktkon-

zentration im linearen Bereich erfolgte mit Hilfe des molaren Extinktionskoeffizienten

von p-Nitrophenol (ε = 18,3 mol/l /cm).

c =

c = Ko

ε = mo

A = A

b = Sc

A
(ε ⋅ b)
nzentration [mol/l]

larer Extinktionskoeffizient [mol/l/cm]

bsorption

hichtdicke = 1 cm

46


3.3 Statistische Auswertung

Die Werte in den Abb. 7, 8, 14, 15 und 16 sind Mittelwerte ± SEM (Standardfehler),

die mit dem Programm Graph Pad Prism berechnet wurden. In Abb. 7 und 8 sind die

jeweiligen Konzentrationen der Aglyca bzw. die Konzentrationen nach enzymatischer

Behandlung der Proben (vorhandene Aglyca und Konjugate) angegeben. Alle Daten

sind Mittelwerte aus den Einzelwerten der Gewebe (n = 7) und sind bezogen auf das

Gewebefrischgewicht. Der Hämoglobingehalt in den Geweben wurde zweifach be-

stimmt und der Mittelwert zur Berechnung der Residualblutfraktion verwendet. Die

errechneten Flavonolkonzentrationen im Residualblutvolumen wurden anschließend

von den Gewebekonzentrationen subtrahiert.

Die ß-Glucuronidaseaktivitäten in den Muskelgeweben, der Lunge, Niere und Leber

von drei Schweinen (Abb. 14 und 15) stellen Mittelwerte aus jeweils drei Wiederho-

lungsmessungen dar. Die gewebespezifischen Aktivitäten der ß-Glucuronidase in

Abb. 16 sind Mittelwerte aus allen Messungen (n = 18).

Die Regressionsgeraden bei der Bestimmung der Standardkurven (Abb. 5) und zur

Berechnung der Enzymaktivitäten (Tab. 5) wurden in Microsoft Excel erstellt.

47

4. Ergebnisse

4. Ergebnisse

4.1 Gewebeverteilung von Quercetin und seiner methylierten Metaboliten Isorhamnetin und Tamarixetin

Nach dietätischer Applikation von Quercetin über vier Wochen in einer Dosierung

von 50 mg/kg Körpergewicht und Tag sowie einer Aufnahme von 25 mg/kg Körper-

gewicht 60 - 90 min vor der Schlachtung trat die mit Abstand höchste Quercetinkon-

zentration (inkl. Methylquercetin) im Colon (15,49 nmol/g Gewebe) auf, gefolgt von

Nieren (8,46 nmol/g Gewebe) und Dünndarm (7,21 nmol/g Gewebe), wobei zwischen

den Darmabschnitten verschiedener Versuchstiere relativ große interindividuelle

Konzentrationsunterschiede verzeichnet werden konnten (Colon: 2 - 34 nmol/g Ge-

webe; Jejunum: 1 - 13 nmol/g Gewebe). Die Leber enthielt mit 4,24 nmol/g Gewebe

etwa 50 % der in den Nieren registrierten Konzentrationen. Alle übrigen untersuchten

Gewebe und das Plasma wiesen, mit Ausnahme der mesenterialen Lymphknoten

(2,4 nmol/g Gewebe), Flavonolgehalte von unter 1 nmol/g auf. Die Werte von Plasma

(0,79 nmol/ml), Gekröse (0,7 nmol/g Gewebe) und Lunge (0,49 nmol/g Gewebe)

rangierten im Mittelfeld, die niedrigsten Konzentrationen wurde in der untersuchten

quergestreiften Muskulatur (Zwerchfellmuskulatur: 0,14 nmol/g Gewebe; Rücken-

muskulatur: 0,10 nmol/g Gewebe) und dem Gehirn (0,03 nmol/g Gewebe) detektiert.

In allen Geweben war Quercetin mit meist über 80 % (67 – 98 %) an der Gesamt-

konzentration der Metaboliten das vorherrschende Flavonol. Die vorrangig an der

Metabolisierung und Ausscheidung beteiligten Organe enthielten erwartungsgemäß

prozentual hohe Gehalte der methylierten Quercetinderivate Isorhamnetin und

Tamarixetin (Niere: 12 % bzw. 13 %, Leber: 22 % bzw. 11 %, Dünndarm: 17 % bzw.

7 %). Die im Verhältnis höchsten Isorhamnetinkonzentrationen wurden im Jejunum

gefunden (1,19 ± 0,46 nmol/g Gewebe), die höchsten Tamarixetinkonzentrationen in

der Niere (1,11 ± 0,16 nmol/g Gewebe).

In allen Gewebeextrakten konnte auch ohne enzymatische Hydrolyse während der

Extraktion ein mehr oder weniger großer Anteil an freiem Quercetin nachgewiesen

werden. Im Mittel lag Quercetin in Gehirn-, Lungen- und Dickdarmgewebe sowie im

Gekröse des Magens nahezu 100 % dekonjugiert vor. Ähnlich hohe Gehalte zeigten

48

4. Ergebnisse

die Zwerchfellmuskulatur (97 %), die Leber (93 %) und das Jejunum (89 %). Rü-

ckenspeck, Lymphknoten und die Rückenmuskulatur wiesen mit 60 %, 46 % und 40

% mittlere Aclyconkonzentrationen auf. Die Konzentration im Nierengewebe betrug

dagegen nur knapp ein Drittel der Gesamtkonzentration. Im Plasma war der Anteil

der unkonjugierten Flavonole, wie zu erwarten, verschwindend gering (6 %). In den

Tabellen 3 und 4, sowie den Abbildungen 6 und 7 sind die ermittelten Gesamtkon-

zentrationen bzw. die Konzentrationen der Aglyca (keine enzymatische Behandlung

während der Analyse) zusammengefasst. Abbildung 9 zeigt das prozentuale Vorlie-

gen der Aglyca und Konjugate in den untersuchten Geweben.

49

55

Tab. 3: Gesamtkonzentration der Flavonole in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon

∑ Quercetin, Isorhamnetin, Tamarixetin

Quercetin Isorhamnetin Tamarixetin

[nmol/g Gewebe]

nmol/g Gewebe % der Summe nmol/g

Gewebe % der Summe nmol/g Gewebe % der Summe

Colon 14,21 13,92 ± 4,16 98 0,14 ± 0,08 1 0,14 ± 0,05 1

Niere 8,46 6,31 ± 1,14 75 1,04 ± 0,11 12 1,11 ± 0,16 13 Jejunum 7,21 5,51 ± 1,87 76 1,19 ± 0,46 17 0,51 ± 0,20 7

Leber 4,24 2,83 ± 0,54 67 0,92 ± 0,19 22 0,49 ± 0,12 11

Lymphknoten 2,40 2,23 ± 0,16 93 0,11 ± 0,02 4 0,06 ± 0,01 3

Plasma 0,79 0,67 ± 0,11 85 0,05 ± 0,01 7 0,06 ± 0,01 8

Gekröse 0,68 0,57 ± 0,20 83 0,05 ± 0,02 8 0,06 ± 0,04 9

Lunge 0,34 0,28 ± 0,07 83 0,03 ± 0,01 9 0,02 ± 0,03 8

Rückenspeck 0,21 0,17 ± 0,03 82 0,01 ± 0,003 7 0,02 ± 0,01 11

Zwerchfellmuskulatur 0,14 0,12 ± 0,02 81 0,02 ± 0,003 14 0,006 ± 0,001 5

M. longissimus dorsi 0,10 0,09 ± 0,007 86 0,01 ± 0,002 10 0,004 ± 0,003 4

Gehirn 0,03 0,02 ± 0,01 95 0,001± 0,001 5 *

4. Ergebnisse

50

Angegeben sind die jeweiligen Konzentrationen nach enzymatischer Behandlung der Proben (vorhandene Aglyca und Konjugate). Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM aus Einzelwerten von sieben Tieren und bezogen auf das Gewebefrischgewicht. Die Flavonolkonzentrationen im Residualblutvolumen wurden subtra-hiert; * Wert unter dem Detektionslimit

Tab. 4: Konzentration der Flavonolaglyca in verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon

∑ Quercetin, Isorhamnetin, Tamarixetin

Quercetin

Isorhamnetin

Tamarixetin

[nmol/g Gewebe]

nmol/g Gewebe % der Summe nmol/g

Gewebe % der Summe nmol/g Gewebe % der Summe

___________________________________________________________________________________________________________

Colon 15,49 15,21 ± 3,28 98 0,14 ± 0,02 1 0,14 ± 0,04 1

Niere 3,07 1,81 ± 0,38 60 0,58 ± 0,07 19 0,67 ± 0,11 22 Jejunum 6,39 4,89 ± 1,61 76 1,10 ± 0,48 17 0,40 ± 0,15 6

Leber 3,89 2,64 ± 0,50 68 0,79 ± 0,11 20 0,46 ± 0,12 12

Lymphknoten 1,19 1,02 ± 0,25 86 0,10 ± 0,02 8 0,07 ± 0,01 6

Plasma 0,01 0,005 ± 0,002 36 0,004 ± 0,001 29 0,004 ± 0,001 35

Gekröse 0,70 0,63 ± 0,38 90 0,05 ± 0,03 7 0,02 ± 0,02 3

Lunge 0,49 0,43 ± 0,17 87 0,03 ± 0,01 6 0,03 ± 0,005 7

Rückenspeck 0,11 0,10 ± 0,02 91 0,005 ± 0,003 5 0,004 ± 0,004 4

Zwerchfellmuskulatur 0,13 0,12 ± 0,05 86 0,01 ± 0,004 14 0,006 ± 0,002 5

M. longissimus dorsi 0,04 0,04 ± 0,004 89 0,003 ± 0,002 10 0,003 ± 0,0003 1

Gehirn 0,03 0,03 ± 0,006 100 * *

4. Ergebnisse

51

56

__________________________________________________________________________________________________________Angegeben sind die Konzentrationen der in Geweben und Plasma enthaltenen Aglyca. Alle Daten sind Mittelwerte ± SEM aus Einzelwerten von sieben Tieren und bezogen auf das Gewebefrischgewicht. Die Flavonolkonzentrationen im Residualblutvolumen wurden subtrahiert. *Wert unter dem Detektionslimit

57

Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge



-

Abb. 7: Gesamtkonzentration der Flavonole in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon (n = 7; Mittelwerte ± SEM) Quercetin, Isorhamnetin und Tamarixetin in Geweben und Plasma; Nachweis der Aglyca nach enzymatischer Hydrolyse der Konjugate (Co = Co-lon; Ni = Niere; Je = Jejunum; Le = Leber; Ly = Lymphknoten; Pl = Plasma; Gk = Gekröse; Lu = Lunge; Rü = Rückenspeck; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi; Ge =Gehirn)

0

Quercetin

Isorhamnetin

Tamarixetin

nmol

/g G

eweb

e bz

w.

nmol

/ml P

lasm

a nm

ol/g

Gew

ebe

bzw

. nm

ol/m

l Pla

sma

1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

1.75 1.50 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00

20

15

10

5

nmol

/g G

eweb

e bz

w. n

mol

/ml P

lasm

a

4. Ergebnisse

52

15

20m

l Pla

sma

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

nmol

/g G

eweb

e bz

w.

nmol

/ml P

lasm

a

Isorhamnetin

58

0

5

10

nmol

/g G

eweb

e bz

w. n

mol

/ Quercetin 0.00

0.00.10.20.30.40.50.60.70.8


Co Ni Je Le Ly Pl Gk Lu Rü Zw Ml Ge nm

ol/g

Gew

ebe

bzw

. nm

ol/m

l Pla

sma

Tamarixetin

Abb. 8: Konzentrationen der Flavonolaglyca in Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon (n = 7; Mittelwerte ± SEM) (Co = Colon; Ni = Niere; Je = Jejunum; Le = Leber; Ly = Lymphknoten; Pl = Plasma; Gk = Gekröse; Lu = Lunge; Rü = Rückenspeck; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi; Ge =Gehirn)


4. Ergebnisse

53

59

Co Ge Lu Gk Zw Le Je Rü Ly Ml Ni Pl0

102030405060708090

100AglycaKonjugate

%

Abb. 8: Prozentuales Verhältnis von Quercetinaglyca und -konjugaten in den verschiedenen Geweben des Schweins nach oraler Applikation von Quercetinaglycon (Co = Colon; Ni = Niere; Je = Jejunum; Le = Leber; Ly = Lymphknoten; Pl = Plasma; Gk = Gekröse; Lu = Lunge; Rü = Rückenspeck; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi; Ge =Gehirn)

4. Ergebnisse

54

4. Ergebnisse

4.2 ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe

4.2.1 Eignung der Methode

Die grundsätzliche Eignung der gewählten Methode zur Bestimmung der ß-Glucuro-

nidase-Aktivität wurde anhand einer aufgereinigten Enzymmischung (Glucuronidase/

Sulfatase crude solution, Sigma-Aldrich AG) bei einem pH-Wert von 7,2 demonst-

riert. Die Verdoppelung der eingesetzten Enzymmenge resultierte in einem etwa

zweifachen Anstieg der gemessenen Umsatzrate unter Berücksichtigung des linea-

ren Abschnittes des Zeitverlaufs (s. Inset Abb. 10). Bezüglich des eingesetzten Sub-

strates ergaben sich für den Konzentrationsanstieg des Reaktionsproduktes (p-Nitro-

phenol) pro Minute folgende Werte: 246 nmol/ml, 519 nmol/ml, 1131 nmol/ml und

2349 nmol/ml.

0 10 20 30 40 50 60

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

2,79 U*

11,15 U*22,3 U*

5,57 U*

t[min]

Extin

ktio

n

10 15 20 25

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

t[min]

Extin

ktio

n

Abb. 10: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unterschiedliche Konzentrati-onen einer ß-Glucuronidase/Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 7,2. Darstellung des Zeitfensters des linearen Konzentzrationsanstiegs von p-Nitrophenol (Inset) * nach Herstellerangaben; 1 Unit setzt 1,0 µl Phenolphthalein aus Phenolphthaleinglucuronid pro

Stunde bei pH 5 und 37°C frei

pH 7,2

55

4. Ergebnisse

Das in der Literatur genannte pH-Optimum des Enzyms von pH 4,5 - 6 konnte aller-

dings nicht bestätigt werden (Abb. 11). Im Vergleich zu den bei pH 7,2 erhaltenen

Werten, konnten bei pH 4,6 unter ansonsten identischen Bedingungen nur wesent-

lich geringere Umsatzraten pro min gemessen werden (65,6 nmol/ml, 98,3 nmol/ml,

191,3 nmol/ml, 229,5 nmol/ml). Des Weiteren ergab sich im Unterschied zu pH 7,2

ein schlechterer linearer Bezug zwischen Enzymkonzentration und Umsatzrate.

Selbst O’Leary et al. (2001), deren Methode zur Messung der ß-Glucuronidase-

aktivität in dieser Arbeit angewandt wurde, geben diesen pH-Bereich als Optimum

an, verwenden jedoch in ihrem Assay den fast neutralen pH-Wert von 7,2.

10

0.0

0.1

0.2

0.32,79 U*

Extin

ktio

n

6

Abb. 11: Zeitverlauf der Hynen einer ß-Glucuronidase* nach Herstellerangaben;

Stunde bei pH 5 und 37°C

4.2.2 ß-GlucuronidSchweins

Nach einer Lag-Phase

25 min gemessen. Zu

trophenol pro Minute w

pH 4,

15 20 25

5,57 U*11,15 U*22,3 U*

t[min]drolyse von p-Nitrophenylglucuronid durch unterschiedliche Konzentratio-

/Sulfatase-Mischung bei einem pH-Wert von 4,6. 1 Unit setzt 1,0 µl Phenolphthalein aus Phenolphthaleinglucuronid pro frei

aseaktivität in einigen ausgewählten Geweben des

von 5 min wurde die Extinktion in 5-Minuten-Intervallen über

r Berechnung der mittleren Konzentrationsänderung von p-Ni-

urden Regressionsgeraden erstellt.

56

4. Ergebnisse

Die Abbildungen 12 und 13 zeigen exemplarisch den Zeitverlauf der Freisetzung von

p-Nitrophenol für ein Versuchstier bei Dreifachbestimmung. Auf ß-Glucuronidase-

aktivität getestet wurden Lunge und Leber, in denen hohe Gehalte an freiem Querce-

tin (bis zu 100 %) nachgewiesen werden konnten, außerdem die Niere als Exkreti-

onsorgan mit verhältnismäßig niedrigen Aglyconkonzentrationen (29 %) sowie zwei

verschiedenen Muskelproben mit verschiedenen Aglyconanteilen (40 % und 93 %).

Bei den Messungen fiel auf, dass unabhängig von der eingesetzten Gewebemenge

oft nur ein geringer oder gar kein Umsatz gemessen werden konnte. Des Weiteren

lag nicht immer ein linearer Konzentrationsanstieg von p-Nitrophenol vor. Die be-

rechneten Aktivitäten wiesen nicht nur zwischen den Tieren erhebliche Schwankun-

gen auf, sondern auch die Wiederholungsmessungen der Gewebe ein und dessel-

ben Tieres differierten zum Teil deutlich (Tab. 5).

Zusammengenommen ergab sich die höchste Aktivität aus den Mittelwerten der un-

tersuchten Nierenproben (144,1 ± 31,18 Units), gefolgt von Lungen- und Lebergewe-

be (125,1 ± 21,26 und 96,92 ± 11,66 Units). In den Muskelproben wurden dagegen

wesentlich geringere Aktivitäten nachgewiesen (Zwerchfellmuskulatur: 38,6 ± 7,25,

M. longissimus dorsi: 33,93 ± 4,59 Units) (Abb. 16).

57

4. Ergebnisse

Lunge A B

Leber A B

Niere A B

0 10 20 30 40

0.3

0.4

0.5

0.6

0.71. Messung2. Messung3. Messung

t [min]

AB

S

0 10 20 30 40

0.7

0.8

0.9

1.0


t [min]

AB

S

0 10 20 30 40

0.3

0.4

0.5

0.6


t [min]

AB

S

0 10 20 30 40

0.00

0.25

0.50

0.75


t [min]

AB

S

0 5 10 15 20 25 30 35

0.5

0.6

0.7


t [min]

AB

S

0 5 10 15 20 25 30 35

0.85

0.95

1.05

1.15

1.25

2. Messung1. Messung

3. Messung

t [min]

AB

S

Abb. 12: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuronidase im Lungen-, Nieren- und Lebergewebe eines Schweins (Tier 1) A: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,1 g Frischgewebe (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,2 g Frischgewebe (drei Messungen)

58

4. Ergebnisse

Zwerchfellmuskulatur A B

0 10 20 30 40

0.2

0.3

0.4


t[min]

AB

S

M. longissimus dorsi A B

0 10 20 30 40

0.5

0.6


t [min]

AB

S

0 10 20 30 40

0.20

0.25

0.30


t [min]0 10 20 30 40

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4


t [min]

AB

S

AB

S

Abb. 13: Zeitverlauf der Hydrolyse von p-Nitrophenol durch die ß-Glucuronidase in Zwerchfell- und Rückenmuskulatur eines Schweins (Tier 1) A: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,1 g Frischgewebe (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus 0,2 g Frischgewebe (drei Messungen)

59

4. Ergebnisse

Tab. 5: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Niere, Leber, Zwerchfell- und Rücken-

muskulatur von drei Schweinen

Tier 1 Tier 2 Tier 3 Lunge

A 59,03 84,86 54,55 84,33 93,14 136,37 118,06 91,07 401,3

B 59,03 69,34 81,80

54,82 155,24 236,7 57,35 181,12 232,8

Niere A 576,42 415,71 95,58

235,18 58,76 31,85 293,59 120,45 65,10

B 109,9 105,03 92,12

92,00 142,49 268,03 36,89 157,18 70,65

Leber A 67,04 187,64 0

233,23 140,45 40,95 61,91 160,85 141,62

B 49,53 74,62 18,77

68,62 98,75 58,01 81,52 168,98 92,99

Zwerchfellmuskulatur A 27,58 100,44 54,75

39,19 34,05 73,70 98,36 45,96 63,17

B 0 11,92 21,06

5,81 22,98 17,90 0 19,58 55,81

M. longissimus dorsi A 29,24 39,76 46,11

16,71 33,31 26,52 49,30 62,33 92,23

B 11,70 30,63 17,87

14,62 11,82 13,84 24,74 53,19 36,89

Angaben in Units (nmol mg-1 Protein min-1); A: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,1 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,2 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen)

60

4. Ergebnisse

Tab. 6: Mittelwerte der ß-Glucuronidaseaktivität in verschiedenen Geweben von drei Schweinen

Gewebe

Tier 1 Mittelwerte ± SEM



Lunge 72,1 ± 10,2 112,5 ± 18,25 190,6 ± 52,15

Niere 224,2 ± 80,48 166,6 ± 51,73 103,9 ± 34,13

Leber 93,48 ± 28,07 138,5 ± 17,8 58,72 ± 21,14

Zwerchfellmuskel 28,49 ± 15,42 39,16 ± 13,18 47,73 ± 9,36

M. long. dorsi 24,39 ± 5,66 38,51 ± 7,27 38,91 ± 11,72

Angabe der Mittelwerte ± SEM von jeweils 6 Messungen

B

Zwerchfell

0

25

50

75

100Tier 1Tier 2Tier 3

Uni

ts

0

25

50

75

A

Uni

ts

Abb. 14:. ß-GlucuronidaA: 100 µl GewebeextrakB: 100 µl Gewebeextrak

A B A B A

M. lonissimus dorsi

Tier 1Tier 2Tier 2

M. longissimus dorsi

B A B A B

seaktivität in der Zwerchfell- und Rückenmuskulatur von drei Schweinen t aus ursprünglich 0,1 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen) t aus ursprünglich 0,2 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen)

61

4. Ergebnisse

62

Lunge

0

100

200

300


Niere

0

100

200

300

400


Leber

0

50

100

150


A B A B A B

A B A B A B

A B A B A B

Uni

ts

Uni

ts

Uni

ts

Abb. 15: ß-Glucuronidaseaktivität in Lunge, Nieren und Leber von drei Schweinen (n = 3) A: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,1 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen) B: 100 µl Gewebeextrakt aus ursprünglich 0,2 g Frischgewebe im Ansatz (drei Messungen)

4. Ergebnisse

0

100

200

300

Uni

ts

Ni Lu Le Zw Ml

Abb. 16: Spezifische ß-Glucuronidaseaktivität verschiedener Gewebe von drei Schweinen (n = 18; Mittelwerte ± SEM); Ni = Niere; Lu = Lunge; Le = Leber; Zw = Zwerchfellmuskulatur; Ml = M. longissimus dorsi

Um einen möglichen Zusammenhang zwischen einer hohen Aktivität der ß-Glucuro-

nidase und einer hohen Aglyconkonzentration zu klären, wurden diese beiden Para-

meter zueinander ins Verhältnis gesetzt. Zu diesem Zweck wurde jeweils der Mittel-

wert der Aktivitäten aus den Wiederholungsmessungen gebildet. Wie der Abbildung

17 zu entnehmen ist, konnte jedoch in keinem Fall ein Hinweis auf eine positive Kor-

relation zwischen den beiden Parametern gefunden werden. Aus diesem Grund wur-

de auf die Bestimmung der Enzymaktivitäten in den Geweben der übrigen Tiere ver-

zichtet.

63

4. Ergebnisse

Lunge

0.0 0.5 1.0 1.50

50

100

150

200

Aglyconkonz. [nmol/g Gewebe]

Enzy

mak

tivitä

t [U

]

Niere

0 1 2 3 490

140

190

240


Enzy

mak

tivitä

t [U

]

Leber

0 1 2 3 450

75

100

125

150


Enzy

mak

tivitä

t [U

]

Zwerchfellmuskel

0.0 0.1 0.2 0.3 0.425

30

35

40

45

50

55


Enzy

mak

tivitä

t [U

]

M. longissimus dorsi

0.030 0.035 0.040 0.04520

25

30

35

40

45


Enzy

mak

tivitä

t [U

]

Abb. 17: Darstellung der Beziehungenzwischen der ß-Glucuronidaseaktivitätund der Aglyconkonzentration verschie-dener Gewebe von drei Schweinen

64

5. Diskussion

5. Diskussion

Flavonoide werden von Menschen und pflanzenfressenden Tieren fast täglich mit der

Nahrung aufgenommen, da sie in nahezu allen höheren Pflanzen als natürliche In-

haltsstoffe vorkommen. Aufgrund der Hinweise, dass Flavonoide über vielseitige Me-

chanismen gesundheitsfördernde Effekte haben können, ist es von großer Bedeu-

tung, Informationen über das Verteilungs- und Akkumulierungsverhalten der Sub-

stanzen zu erhalten, um beispielsweise mögliche Zielgewebe zu identifizieren. Zu

diesem Zweck wurden Schweine, deren Gastrointestinaltrakt und Herz-Kreislauf-

System dem des Menschen anatomisch und physiologisch ähnlich ist, über vier Wo-

chen mit einer quercetinhaltigen Diät versorgt und anschließend in verschiedenen

Geweben die Konzentrationen von Quercetin und seinen methylierten Metaboliten

Isorhamnetin und Tamarixetin bestimmt. Um die Flavonolverbindungen im Tierkörper

sicher nachweisen zu können, wurde mit 50 mg/kg Lebendmasse und Tag eine rela-

tiv hohe Dosierung verwendet. Mit Einmischung der Testsubstanz in die Ration wur-

den mögliche Interaktionen mit anderen Nahrungsbestandteilen berücksichtigt. Des

Weiteren erfolgte exemplarisch an Muskel-, Leber-, Nieren- und Lungengewebe von

drei Tieren die Bestimmung der Aktivität der ß-Glucuronidase, einem Enzym, das die

Hydrolyse von Flavonolglucuroniden katalysiert und damit zur Freisetzung der Aglyca

im Körper führen kann. Das Enzym könnte demnach als Modulator der intrazellulären

biologischen Aktivität von Flavonoiden fungieren und durch eine gesteigerte Aktivität

möglicherweise den Quercetinaglycongehalt in bestimmten Körpergeweben erhöhen.

Flavonolgehalte in Plasma und untersuchten Geweben

Die Bestimmung von Flavonoiden im Plasma war bereits Gegenstand zahlreicher

Studien. Sehr sicher ist nach aktuellem Stand der Forschung, dass vom serosalen

Pol der Enterozyten nur Flavonolkonjugate die Zellen in Richtung systemische Zirku-

lation verlassen (Murota & Terao 2003). Auch in dieser Arbeit konnte erneut gezeigt

werden, dass der Anteil der konjugierten Derivate von Quercetin, Isorhamnetin und

Tamarixetin im Blut annähernd 100 % betrug. Hinsichtlich der in der vorliegenden

Studie verwendeten Versuchstiere dürfte es sich bei den Konjugaten überwiegend

65

5. Diskussion

um Glucuronide handeln, da Sulfatierungen im Phase-II-Metabolismus von Schwei-

nen nicht aufzutreten scheinen (Caldwell 1982). Insgesamt handelte es sich im

Plasma bei 85 % der bestimmten Metaboliten um Quercetinkonjugate. Tamarixetin

und Isorhamnetin waren zu 8 % und 7 % enthalten. Dass die beiden Methylether un-

gefähr zu gleichen Teilen im Plasma von Schweinen auftreten, ist bereits in voraus-

gegangenen Studien gezeigt worden (Ader et al. 2000, Cermak et al. 2003). In ande-

ren Spezies können im Blut aufgrund unterschiedlicher Metabolisierung abweichende

Metabolitenmuster auftreten. So wurde in humanen Plasmaproben beispielweise

bisher kein Tamarixetin nachgewiesen (Graefe et al. 2001, de Vries et al. 2001). Bei

Ratten wird wesentlich mehr Isorhamnetin als beim Schwein gebildet, so dass bei

der Ratte die Plasmakonzentration dieses Metaboliten mehr als Doppelte des Quer-

cetinspiegels betragen kann (de Boer et al. 2005; Morand et al. 2000). Eine Erklä-

rung für die im Vergleich zur Ratte wesentlich niedrigeren Konzentration an Methyl-

derivaten beim Schwein könnte eine vergleichsweise geringe Aktivität der Catechol-

O-Methyltransferase (COMT) sein.

Nicht nur das Metabolitenmuster, sondern v. a. auch die Gesamtflavonolkonzentra-

tion im Plasma variiert zwischen Schweinen und Ratten erheblich (s. u.). Der Plas-

maspiegel von Quercetin in der vorliegenden Studie mit einem Wert von ca. 0,8

µmol/l waren fast 30 mal niedriger als derjenige bei Ratten (ca. 23 µmol/l), die unter

ähnlichen Versuchsbedingungen gehalten wurden (de Boer et al. 2005), obwohl die

Schweine die letzte quercetinhaltige Mahlzeit ca. 60 - 90 min vor der Schlachtung

aufgenommen hatten. Eine mögliche Erklärung für die niedrigen Plasmakonzentrati-

onen beim Schwein im Vergleich zur Ratte könnte eine extrem schnelle Elimination

bzw. eine rasche Verteilung in die Gewebe sein. Hätte man die Tiere vor der Tötung

genüchtert, wäre eine deutlich geringere Plasmakonzentration zu erwarten gewesen,

da diese im allgemeinen bei der gewählten Dosierung nach ca. 8 Stunden weniger

als die Hälfte der maximalen Konzentration beträgt (Ader et al. 2000).

Die höchsten Gewebekonzentrationen von Quercetin wurden im Dickdarm detektiert.

Dies deutet darauf hin, dass trotz gründlicher Spülung mit physiologischer NaCl-

Lösung quercetinhaltige Ingestapartikel an der Darmschleimhaut zurückgeblieben

sind. Dies wäre auch eine Erklärung für die großen Schwankungen der Quercetin-

66

5. Diskussion

konzentrationen, die zwischen den Tieren festgestellt wurden. Die Flavonolkonzen-

trationen im Dickdarmlumen dürften allgemein sehr hoch gewesen sein, da Flavonoi-

de nur beschränkt aus dem Dünndarm absorbiert und außerdem zum Teil über Galle

und Enterozyten resezerniert werden (Manach et al. 1996b, Crespy et al. 1999, Ueno

et al. 1983). Dass ein großer Teil des zugeführten Quercetins den Weg bis zum Co-

lon unverändert passiert, würde auch den extrem hohen Aglycongehalt in diesen

Gewebeextrakten erklären.

Die Entfernung der Ingesta aus dem Dünndarmabschnitt stellte sich weniger auf-

wändig dar als beim Colon, jedoch wurden auch hier extrem hohe Aglycongehalte

nachgewiesen. Neben Quercetin enthielten die Proben außerdem einen verhältnis-

mäßig hohen prozentualen Anteil an Isorhamnetin und Tamarixetin (17 % + 7 %), die

jeweils nahezu vollständig in freier Form vorlagen. Dieses spricht für eine rasche Me-

thylierung von Quercetin in den Enterozyten, die bevorzugt an Position 3’ stattzufin-

den scheint (Bildung von Isorhamnetin). Wie erwartet sind auch in Leber und Niere,

die besonders stark am Stoffwechsel beteiligt sind, aufgrund der hohen enzymati-

schen Aktivität die prozentualen Anteile der beiden methylierten Quercetinkonjugate

an der Gesamtkonzentration relativ hoch (Leber: 22 % Isorhamnetin + 11 % Tamari-

xetin, Niere: 12 % Isorhamnetin + 13 % Tamarixetin). Dass Flavonoide bereits kurz-

fristig nach ihrer Absorption umfangreich verstoffwechselt werden (First-Pass-Effekt),

wurde durch Identifikation der Metaboliten im Kreislauf in mehreren Studien gezeigt

(Morand et al. 1998, Manach et al. 1998, Ader et al. 2000). Das Verhältnis von freien

Molekülen und Konjugaten in den Enterozyten unterliegt verschiedenen zeitgleich

ablaufenden Stoffwechselvorgängen. Es wird von der Absorptions- und Sezernie-

rungsrate sowie der Konjugation und Dekonjugation beeinflusst. Besonders komplex

wird dieser Zusammenhang durch die Tatsache, dass Flavonoidmoleküle mehrfach

und wiederholt mit Methylgruppen, Sulfaten und Glucuroniden konjugiert werden

können, die durch die in diesem Versuch angewendete Analysemethode weder in Art

noch Menge unterschieden werden konnten.

Eine vergleichsweise hohe Gesamtkonzentration an Flavonolkonjugaten enthielten

die mesenterialen Lymphknoten (Quercetin: 2,23 ± 0,16, Isorhamnetin: 0,11 ± 0,02,

Tamarixetin: 0,06 ± 0,01 nmol/g Gewebe), insgesamt mehr als die Hälfte des Flavo-

67

5. Diskussion

nolgehaltes in der Leber. Diese Daten sprechen dafür, dass Flavonoide neben dem

Blutweg auch über die Lymphe transportiert werden können. Untersuchungen dazu

wurden erstmals 2005 von Murota & Terao angestellt, die den thorakalen Lymph-

gang (ductus thoracicus) von Ratten kannulierten. Die Lymphe enthält lipophile Ver-

bindungen, die aus dem Dünndarm absorbiert und nach Metabolisierung in den Ente-

rozyten via Chylomikronen ins Interstitium sezerniert werden. Bei Ratten konnte 30

min nach Applikation einer Dosis von 10 mg Quercetin pro kg Körpergewicht das in-

takte Quercetinaglycon in einer Konzentration zwischen 0,04 und 0,11 µmol/l in der

Lymphe detektiert werden. Nach der enzymatischen Hydrolyse der Konjugate mit

Glucuronidase/Sulfatase wurde eine maximale Konzentration von 2,54 ± 0,43 µmol/l

nachgewiesen. Während die Quercetinkonjugate innerhalb der Zeitspanne von 7

Stunden nach Quercetingabe eine deutliche Akkumulierung in der Lymphe zeigten,

blieben die Gehalte des Aglycons und von Isorhamnetin nach den ersten 45 Minuten

relativ konstant.

Bei dem untersuchten Anteil des Gekröses handelte es sich um das Omentum ma-

jus, das an der großen Kurvatur des Magens befestigt ist. Es bestand bei diesen re-

striktiv gefütterten Tieren zum größten Teil aus Bindegewebe und war nur wenig von

Fett durchsetzt. Die Gesamtflavonolkonzentration war trotz Korrektur des residualen

Blutgehaltes im Schnitt fast so hoch wie im Plasma. Auffällig ist, dass Quercetin im

Gegensatz zum Plasma zum größten Teil in dekonjugierter Form vorlag. Da den Tie-

ren kein Glycosid sondern das Aglycon zugeführt wurde, besteht die Möglichkeit

einer Absorption über die Magenschleimhaut. Die Rolle des Magens als Stoffwech-

selorgan neben anderen extrahepatischen Organen, wie den Nieren oder dem Darm,

wird im allgemeinen immer noch als relativ unbedeutend eingestuft. Bezüglich der

Quercetinaglyca wurde am Rattenmodell jedoch schon mehrfach bewiesen, dass

diese Verbindungen über den Magen schnell und effizient aufgenommen werden

können. Crespy et al. (2002) zeigten, dass 38 % einer zugeführten Menge von freiem

Quercetin bei einer 30-minütigen Verweildauer im Magen von Ratten mit einer Ab-

sorptionsrate von 1,11 ± 0,08 nmol/min über die Magenwand aufgenommen wurden

und die Metaboliten etwa 20 Minuten später in der Gallenflüssigkeit auftauchten.

Übereinstimmend mit diesem Ergebnis konnte bereits in einer vorausgegangenen

68

5. Diskussion

Studie die äußerst schnelle Absorption der Isoflavone Genistein und Daidzein auf

Magenebene demonstriert werden. Isoflavonmetaboliten konnten in diesem Fall

schon drei Minuten nach Applikation im Plasma nachgewiesen werden (Piskula et al.

1999).

Die Lunge scheint beim Schwein bei der Umverteilung von Quercetin und seiner Me-

tabolite eine wesentlich geringere Rolle zu spielen als bei der Ratte. Dass Quercetin,

wie von de Boer et al. (2005) am Rattenmodell gezeigt, sich nach mehrwöchiger Ex-

position in der Lunge anreichert, konnte in diesem Versuch nicht bestätigt werden

(s. u.). Unter den in dieser Studie untersuchten Geweben befand sich die Lunge mit

einer Gesamtflavonolkonzentration von ca. 0,4 nmol/g Gewebe bei den Geweben mit

niedrigem Gehalt.

Die mit Abstand niedrigsten Konzentrationen wurden im Unterhautfettgewebe, in der

untersuchten Skelettmuskulatur und im Gehirn gefunden. Das Gehirn nimmt zwi-

schen den untersuchten Geweben eine Sonderstellung ein, da Substanzen durch die

Blut-Liquor-Schranke nur beschränkt oder mit großer Verzögerung ins Zentral-

nervensystem übertreten können. Durch den morphologischen Aufbau des Gefäß-

systems können nur sehr kleine Moleküle (Wasser, Harnstoff, Kohlendioxid, Sauer-

stoff) ungehindert passieren. Für alle größeren polaren Verbindungen, also auch die

wasserlöslichen Flavonolkonjugate, ist die Blut-Hirn-Schranke nicht permeabel, eini-

ge wenige kleine Hirnareale (z. B. Hypo- und Epiphyse) ausgenommen. Eine nen-

nenswerte Diffusion ist somit nur im Falle von lipophilen Substanzen möglich. Für

körpereigene Stoffe (Glucose, Aminosäuren, Transmitter) und auch Xenobiotika be-

steht die Möglichkeit eines Carrier-vermittelten Transports. Bei körperfremden Stof-

fen kann der Auswärtstransport jedoch oft eine höhere Kapazität als der Einwärts-

transport haben, wodurch der Aufbau wirksamer Konzentrationen verhindert wird

(Frey 2000). In einigen vorausgegangenen Studien ist jedoch vom Übertritt einiger

Flavonoide nach oraler oder intravenöser Applikation ins Gehirn berichtet worden

(Peng et al. 1998, Prasain et al. 2004, Datla et al. 2001).

Auch die Konzentration der Flavonole im Rückenspeck war sehr niedrig (0,21 nmol/g

Gewebe). In Fett werden nur lipidlösliche Verbindungen angereichert, die Ergebnisse

lassen jedoch nicht erkennen, dass in den Proben fast ausschließlich das hydropho-

69

5. Diskussion

bere Aglycon enthalten war, dessen prozentualer Anteil an der Gesamtflavonolmen-

ge bei 60 % lag.

In der Rückenmuskulatur war die Gesamtflavonolkonzentration (0,1 nmol/g Gewebe)

extrem niedrig. Bei solch geringen Konzentrationen ist zu beachten, dass sich ein

Restfehler bei der Residualblutkorrektur vergleichsweise stark auswirkt. Insgesamt

gesehen ist der Anteil an Quercetin, der sich in der Muskulatur befindet selbst nach

dieser hohen Dosierung sehr klein, auch wenn man berücksichtigt, dass die Musku-

latur insgesamt einen großen prozentualen Anteil des Körpers einnimmt. Kritisch an-

zumerken ist, dass die Ergebnisse für Lunge, Rückenspeck, Skelettmuskulatur und

Gehirn aufgrund der niedrigen Konzentrationen mit Vorsicht zu betrachten sind. Je

niedriger die Gehalte sind, desto eher besteht vor allem im Fall von Tamarixetin und

Isorhamnetin die Möglichkeit, dass die Konzentrationen im Bereich der Nachweis-

grenze liegen. Eine relativ kleine Versuchstiergruppe birgt zudem die Gefahr, dass

Durchschnittswerte von „Ausreißern“ stark beeinflusst werden. Zudem ist es nicht

auszuschließen, dass sich die Testsubstanz in Gefäßwänden anreichert und der Fla-

vonolgehalt in gut durchbluteten Geweben dadurch erhöht sein kann.

Vergleich mit Befunden bei der Ratte

Die Ratten in der vorausgegangenen Studie von de Boer et al. (2005), welche eine

0,1 %ige Quercetindiät (~50 mg/kg) bekamen, lassen sich bedingt zu einem Ver-

gleich mit den in der vorliegenden Studie verwendeten Tieren heranziehen, da in

beiden Versuchen über einige Wochen Quercetin gefüttert wurde und die Tiere vor

der Tötung nicht genüchtert wurden. Wie schon erwähnt, fällt besonders der extreme

Unterschied in der Plasmakonzentration auf, der bei den Schweinen ca. 30 mal nied-

riger war. Bei den Schweinen traten 10-fach höhere Flavonolkonzentrationen in der

Niere (8,46 nmol/g Gewebe) und 5-fach höhere Flavonolkonzentrationen in der Leber

(4,24 nmol/g Gewebe) im Vergleich zum Plasma (0,79 µmol/l) auf. Dagegen betrug

der Plasmaspiegel der Ratten mit 23,4 µmol/l etwa das 8-fache des Gehaltes der

Niere (2,85 nmol/g Gewebe) und das 13-fache des Flavonolspiegels der Leber (1,79

nmol/g Gewebe). Auch unter anderen Versuchsbedingungen (Kurzzeitexposition,

10-fache Dosis, 8-stündige Nüchterung vor der Gewebeentnahme) wurden beim

70

5. Diskussion

Schwein hohe Leber- und Nierenwerte festgestellt, wobei das Verhältnis der Gehalte

umgekehrt war, also im Lebergewebe doppelt soviel Testsubstanz gefunden wurde

wie in der Niere (de Boer et al. 2005). Aus den speziesspezifischen Unterschieden

im Stoffwechsel, insbesondere der verschiedenen Konjugationsmechanismen für

Xenobiotika resultieren stark variierende Eliminationsgeschwindigkeiten. Bei Schwei-

nen scheint die Verweildauer im Plasma im Vergleich zur Ratte kürzer zu sein. Dass

einige Gewebe beim Schwein eine erheblich höhere Konzentration aufweisen als das

Plasma 60 - 90 min nach der Quercetinapplikation spricht dafür, dass in den Gewe-

ben nach Langzeitapplikation eine gewisse Retention der Testsubstanz stattgefun-

den zu haben scheint. Auch eine effektivere Aufnahme durch die Gewebe beim

Schwein wäre denkbar, wobei es in der Literatur bisher grundsätzlich an Informatio-

nen über den Aufnahmemechanismus von Flavonoiden in Zellen fehlt.

Ein weiterer Unterschied besteht in den Flavonolkonzentrationen, die in der Lunge

der beiden Spezies gefunden wurden und bei der Ratte ca. das 10-fache der Kon-

zentration beim Schwein betrug. Vereinbar mit den Ergebnissen von de Boer et al.

(2005) ist die Tatsache, dass auch in den Lungenextrakten der Schweine der über-

wiegende Teil der enthaltenen Flavonole in freier Form vorlag. Der Grund für die

niedrigeren Gehalte beim Schwein könnte zum einen die kürzere Versuchsdauer

sein, zum anderen aber vor allem auch der bereits angesprochene Unterschied im

Stoffwechsel der beiden Tierspezies. Im Falle der Ratten scheint es sich jedenfalls

um einen Langzeiteffekt zu handeln, denn in Studien, in denen die Tiere einer einma-

ligen Quercetindosis ausgesetzt waren, traten nur geringe Konzentrationen in den

Lungen auf (Mullen et al. 2002, Ueno et al. 1983).

Korrelationen ß-Glucuronidaseaktivität und Aglycongehalt

Der unterschiedlich große Anteil des Quercetinaglycons in den untersuchten Gewe-

ben deutet grundsätzlich auf enzymatische Dekonjugation durch die ß-Glucuronidase

hin. So ergab sich für die Enzymaktivität die Reihenfolge Niere > Lunge > Leber >

Zwerchfellmuskulatur > M. longissimus dorsi und für die jeweiligen Aglycagehalte

Lunge > Zwerchfell > Leber > M. longissimus dorsi > Niere. Insgesamt wurden kei-

nerlei Hinweise auf positive Korrelationen zwischen der gemessenen spezifischen

71

5. Diskussion

Aktivität der ß-Glucuronidase und dem Aglycagehalt in den verschiedenen Geweben

festgestellt.

Die höchste ß-Glucuronidaseaktivität der fünf Gewebeproben wurde in der Niere

(144,1 ± 31,18 Units, Aglycongehalt: 29 %) festgestellt. Dieses Ergebnis scheint im

Widerspruch zur eigentlichen Funktion der Niere zu stehen, nämlich der Ausschei-

dung der glucuronidierten Verbindungen mit dem Harn. Im Endeffekt würde dies be-

deuten, dass eine hohe ß-Glucuronidaseaktivität in der Niere die Elimination von

Quercetin und seiner methylierten Metabolite vermindert. Denkbar wäre auch eine

partielle Dekonjugation mehrfach glucuronidierter Moleküle und erneute Konjugation

oder nachfolgende Einschleusung der freigesetzten Glucuronsäure in andere Stoff-

wechselwege.

Leber und Lunge wiesen hohe ß-Glucuronidaseaktivitäten bei sehr hohen Aglycon-

gehalten (93 und 100 %) auf. Die Leber ist maßgeblich an der Metabolisierung von

Flavonoiden beteiligt. Ihr werden die nach Absorption in den Darmzellen entstande-

nen Flavonoidglucuronide über das Pfortaderblut zugeführt und in den Hepatozyten

weiter verstoffwechselt. Im HepG2-Zellmodell unterlagen das Quercetin-3- und -7-

Glucuronid zwei unterschiedlichen Stoffwechselwegen: Methylierung oder Deglucu-

ronierung durch die ß-Glucuronidase mit anschließender Sulfatierung, was für eine

Rolle der Leber beim Umsatz von Glucuroniden spricht (O’Leary et al. 2003).

Die Enzymaktivität der beiden Muskelproben (Zwerchfellmuskulatur und M. longissi-

mus dorsi) war ähnlich gering. Im M. longissimus dorsi aller Tiere lag weit mehr als

die Hälfte des enthaltenen Quercetins in Form von Glucuroniden vor, in der Zwerch-

fellmuskulatur immerhin bei vier von sieben Tieren.

Generell muss die Bewertung des Gehaltes an freiem Quercetin in den Organen kri-

tisch beurteilt werden, da die Möglichkeit einer nachträglichen Freisetzung von Quer-

cetin aus seinen Konjugaten besteht, die während der Aufarbeitung und insbesonde-

re der Extraktion stattfinden kann (de Boer et al. 2005). Einige Proben zeigten zudem

ohne vorausgegangene enzymatische Hydrolyse höhere Aglyconkonzentrationen als

dasselbe Ausgangsmaterial nach Behandlung mit ß-Glucuronidase/Sulfatase. Dafür

können Materialverluste oder Abbau während der Aufarbeitung und Messung ver-

antwortlich sein. Insgesamt scheint ist es wenig wahrscheinlich, dass das Aglycon in

72

5. Diskussion

Organen mit hoher metabolischer Aktivität (Darm, Leber, Niere) über längere Zeit

unverändert bleibt. Bei nebeneinander ablaufenden entgegengesetzten Reaktionen

wie der Glucuronidierung durch die UGT und der Dekonjugation durch die ß-Glucu-

ronidase bestimmt letztendlich die Kinetik, welches der beiden Produkte in der höhe-

ren Konzentration vorliegt. In diesem Zusammenhang ermittelten Day et al. (2000a)

für die Aktivität der UGT gegenüber Flavonoidaglyca einen 5 - 10-fach niedrigeren

Km-Wert als für die ß-Glucuronidase bezüglich der Flavonoidglucuronide. Das bedeu-

tet, dass die Bildung von Glucuroniden gegenüber der Hydrolyse von Konjugaten zu

überwiegen scheint.

Denkbar ist außerdem, dass es nach der Aufnahme von Quercetinkonjugaten in be-

stimmte Gewebe nach der Deglucuronidierung zur erneuten Konjugation und/oder

anschließender Abgabe aus dem Gewebe kommt, was die Darstellung einer Korrela-

tion zwischen Aglycagehalten und ß-Glucuronidaseaktivität erschwert.

Auch die Aussagekraft der Bestimmung der Enzymaktivität unter den beschriebenen

Versuchsbedingungen ist kritisch zu bewerten. Der Einsatz der aufgereinigten En-

zymmischung in definierter Menge (Abb. 10) zeigt, dass die Methode an sich funktio-

niert. Für die Messung der Aktivität des Enzyms aus Gewebeextrakten scheint dies

jedoch nur eingeschränkt zu gelten. Die mangelnde Reproduzierbarkeit der Daten

spricht dafür, dass die Methode nicht sensitiv genug ist und die Messung durch einen

oder mehrere unbekannte Faktoren beeinflusst wird. Die Auswahl des Modellsubstra-

tes könnte ebenfalls eine gewisse Rolle spielen, da das Enzym zu verschiedenen

Verbindungen unterschiedliche Affinitäten aufweisen kann. O’Leary et al. (2001) un-

tersuchten die Substratspezifität von rekombinanter menschlicher ß-Glucuronidase

zum Modellsubstrat p-Nitrophenylglucuronid einerseits und verschiedenen Flavonol-

und Isoflavonglucuroniden andererseits. Für das künstliche Substrat p-Nitrophenol

ergab sich ein weitaus höherer Km-Wert als für die Flavonoidglucuronide, was auf

eine viel geringere Affinität des Enzyms zu diesem Substrat hindeutet. Gleichzeitig

konnte anhand verschiedener Quercetinglucuronide festgestellt werden, dass die

Position der Konjugation keinen nennenswerten Einfluss auf die Enzymaktivität hat.

Eine weitere Erklärung für die niedrigen und wenig reproduzierbaren Enzymaktivitä-

ten in den untersuchten Geweben könnten die verwendeten Gewebeextrakte sein,

73

5. Diskussion

die nach Homogenisierung durch einfache Zentrifugation bei 14000 x g gewonnen

wurden. Lysosomen stellen eine sehr heterogene Fraktion dar, so dass sich generell

eine Isolation dieser Zellorganellen durch Unterschiede in Dichte und Sedimentati-

onskoeffizienten als extrem schwierig erweist (Arai et al. 1991). Um zu erreichen,

dass sich wirklich die komplette Lysosomenfraktion nach dem Zentrifugationsschritt

im Überstand befindet, werden spezielle Verfahren wie die Dichtegradientenzentrifu-

gation angewendet. Eine derartige Aufreinigung bzw. Aufkonzentration der Lysoso-

menfraktion könnte zu einer erheblichen Steigerung der Enzymaktivität im Extrakt

führen. Allerdings ist eine Präparation der Lysosomen nicht aus jedem Gewebe mög-

lich.

Eine weitere Möglichkeit zur Untersuchung des Vorkommens der ß-Glucuronidase in

Körpergeweben wäre eine Analyse auf Ebene der Genexpression mittels PCR (Po-

lymerase Chain Reaction). Das Ergebnis der mRNA-Quantifizierung spiegelt jedoch

nicht zwingend den Proteingehalt oder gar die Enzymaktivität wieder. Eine direkte

Bestimmung des Proteins wäre stattdessen mittels Western Blot zu realisieren. Da-

bei ist aber zu bedenken, dass die gebildeten Proteine posttranskriptional auch inak-

tiv vorliegen können und sie beispielsweise durch fehlende Brückenbindungen noch

nicht zur Ausbildung der Tertiär- oder Quartärstruktur befähigt sind. Viele Enzyme

benötigen zur Aktivierung zudem bestimmte Co-Faktoren.

Generell muss in diese Überlegungen die Möglichkeit einbezogen werden, dass Fla-

vonoide als „multifunctional inducers“ in der Lage sein können, Phase-II-Enzyme zu

induzieren, zu denen auch Glucuronosyltransferasen zählen (Liska 1998, Moon et al.

2005, Walle & Walle 2002).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie dargestellten Daten

über die Verteilung und Konzentrationen von Quercetin in den untersuchten Gewe-

ben letztendlich sehr stark von den gewählten Versuchsbedingungen abhängen. Aus

Bioverfügbarkeitsstudien ist bekannt, dass maximale Quercetinkonzentrationen im

Plasma nach 60 - 120 min erreicht werden und nach 12 Stunden bereits nur noch

Spuren detektierbar sind. Das bedeutet, dass bei der Applikation hoher Dosen in nur

zwei Mahlzeiten am Tag erhebliche Schwankungen der Flavonolspiegel im Plasma

und mit großer Wahrscheinlichkeit auch entsprechende Fluktuationen in den Gewe-

74

5. Diskussion

ben zu erwarten sind. Die Flavonolgehalte der Gewebe, v. a. der Darmabschnitte,

der Mesenteriallymphknoten sowie von Leber, Niere und Gekröse, wurden mit großer

Wahrscheinlichkeit deutlich von der zuletzt vorgenommenen Quercetinapplikation

ungefähr 60 min vor der Tötung beeinflusst. Die erhobenen Daten sollten daher als

eine Art Momentaufnahme betrachtet werden, vor allem weil es bezüglich der Kinetik

von Quercetin in Körpergeweben noch an Informationen fehlt. Bisher noch uner-

forschte Metabolisierungswege von Flavonoiden und ihren Konjugaten sowie damit

verbundene Umverteilungen der Flavonolmoleküle im Organismus können auch ein

Grund für die in der vorliegenden Studie fehlende Korrelation zwischen Aglyconge-

halt und ß-Glucuronidaseaktivität in den verschiedenen Geweben sein. Dennoch lie-

fert die Studie insgesamt wertvolle Erkenntnisse über das Verhalten von Quercetin

im Organismus vom Schwein, gibt deutliche Hinweise auf Zielgewebe des Flavonols

und zeigt im direkten Vergleich mit anderen Spezies die Auswirkungen von Unter-

schieden im Stoffwechsel auf die Verteilung der Metaboliten in den Körpergeweben

auf.

75

5. Diskussion

Bedeutung für die Tiermedizin

Bisherige Untersuchungen zur Wirkung von Flavonoiden auf den Stoffwechsel von

Nutztieren befassen sich vor allem mit Inhaltsstoffen aus Sojaerzeugnissen. Soja,

das natürlicherweise einen hohen Gehalt an Isoflavonen aufweist, wird vielen Futter-

mitteln als Proteinquelle beigemischt. Sojabohnen und auch Klee enthalten Konzen-

trationen von 100 bis 5000 ppm (Wang & Murphy 1994), wobei die dominierenden

Isoflavone in Sojaerzeugnissen Daidzein und Genistein sind (Greiner et al. 2001).

Neben den bereits in 2.4 angesprochenen Wirkungen zeichnen sich Isoflavone vor

allem durch eine strukturelle und funktionale Ähnlichkeit mit nativen Östrogenen aus

und werden daher zu den Phytoöstrogenen gerechnet. Obwohl sie eine weniger

ausgeprägte Affinität zu Östrogenrezeptoren aufweisen als natürliche Östrogene,

besteht eine gewisse Konkurrenz um die Rezeptorbindungsstellen (Kelly et al. 1993).

Aufgrund dieser hormonähnlichen Eigenschaften können Isoflavone eine potentielle

Rolle bei der Beeinflussung von Wachstums- und Reproduktionsvorgängen spielen.

Dieser Aspekt gewinnt besonders heutzutage bei Tieren, die zur Fleischgewinnung

dienen, an Bedeutung, da sich der Trend immer noch dahin bewegt, die Muskelmas-

se bei gleichzeitiger Reduktion des Fettansatzes zu steigern (Payne et al. 2001). Um

einen Zusammenhang zwischen der Aufnahme von Soja und Änderungen in Wachs-

tum und Körperzusammensetzung herzustellen, wurden in Studien nach Verabrei-

chung von isoflavonreichen und -armen Diäten Masttiere und deren Schlachtkörper

verglichen. Ergebnisse von Payne et al. (2001) bestätigen die Verminderung des

Fettansatzes beim Schwein durch Sojafütterung, die sich jedoch nicht über Erhöhung

des gängigen Isoflavongehaltes im Futter steigern ließ. In einem Fütterungsversuch

von Kuhn et al. (2004) konnten zwischen Schweinen zweier Fütterungsgruppen mit

mehr als 6-fachem Konzentrationsunterschied in der Isoflavonzufuhr keine signifikan-

ten Unterschiede in der Körperzusammensetzung (Gewebeanteile, Protein/Fett-

Verhältnis) und Wachstum festgestellt werden. Andererseits konnte gezeigt werden,

dass das prä- und postnatale Wachstum von männlichen Ferkeln, deren Muttersauen

während der Trächtigkeit vermehrt Daidzein über das Futter erhalten hatten, verbes-

sert werden konnte (Liu et al. 1999). Zurückgeführt wurde dies auf eine durch das

76

5. Diskussion

Isoflavon induzierte Erhöhung der Expression von IGF-1R (insulin-like growth factor

receptor type 1) im Skelettmuskel der Ferkel. IGF-I und -II spielen bedeutende Rollen

im Muskelwachstum und führen über den IGF-1R zu wachstumsfördernden Effekten

(Ren et al. 2001).

Von Interesse in der Nutztierhaltung sind außerdem die immunmodulierenden und

antipathogenen Wirkungen, die Flavonoiden zugeschrieben werden und durch die

Verluste während der Aufzucht und Haltung vermindert werden könnten.

Der Einsatz von Flavonoiden als Futterzusatz findet aufgrund ihrer potenziell gesund-

heitsfördernden Effekte dieser Pflanzeninhaltsstoffe seit einiger Zeit auch bei der

Haltung von "Liebhabertieren" Beachtung. Kleintiere wie Hunde und Katzen errei-

chen in der Obhut des Menschen im Durchschnitt ein relativ hohes Alter, das wie

beim Menschen auch von Herz- und Gefäßerkrankungen, Krebs, Diabetes mellitus

Typ 2 oder ähnlichen Leiden begleitet sein kann. Aus diesem Grund wird nicht nur in

der Humanernährung (functional food), sondern auch in der Futtermittelindustrie da-

zu übergegangen, Pflanzenextrakte oder daraus isolierte Verbindungen wie Querce-

tin Tiernahrungsmitteln zuzusetzen.

77

6. Zusammenfassung

6. Zusammenfassung

Juliane Bieger (2007):

Verteilung des Flavonols Quercetin

in Organen und Geweben beim Schwein

nach mehrwöchiger Verabreichung mit dem Futter

Die im Rahmen dieser Arbeit vorgenommenen Untersuchungen hatten zum Ziel, die

Kenntnisse über die Verteilung des Flavonols Quercetin sowie seiner Metaboliten

Isorhamnetin und Tamarixetin im Säugetierorganismus zu vertiefen. Informationen

über das Verhalten der allgemein als gesundheitsförndernd geltenden Flavonoide,

die dem Körper kontinuierlich mit pflanzlicher Nahrung zugeführt werden, sind zum

Verständnis ihrer Wirkungsweise von größter Bedeutung. Studien, die bisher vor-

zugsweise an Ratten durchgeführt worden sind, geben Hinweise auf eine weite Ver-

teilung von Flavonoiden in verschiedenen Körpergeweben. Erste Untersuchungen an

Schweinen (de Boer et al. 2005) deuten ferner darauf hin, dass es bei dieser Spezies

im Vergleich zur Ratte zu erheblichen Differenzen im Verteilungs- und Metaboliten-

muster kommt.

In der vorliegenden Studie erfolgte die Verabreichung von Quercetin in einer hohen

Dosierung (50 mg/kg Körpergewicht) über einen Zeitraum von vier Wochen an

Schweine. Die Ergebnisse demonstrieren, dass nach einer Langzeitapplikation von

Quercetin in allen untersuchten Geweben Quercetin und dessen Metaboliten nach-

gewiesen werden konnten. Anhand der relativ hohen Konzentrationen in Darmwand,

Leber und Niere wird jedoch deutlich, dass das zugeführte Flavonoid umfangreich

metabolisiert und eliminiert wird. Die wesentlich niedrigeren Konzentrationen in Fett,

Muskulatur, Lunge und Gehirn der Schweine lassen vermuten, dass eine nennens-

werte Anreicherung von Quercetin in diesen Organen auch nach langer oraler Expo-

sition nicht auftritt. Bei den Metaboliten handelte es sich in allen untersuchten Gewe-

ben überwiegend um Quercetinkonjugate (67 – 98 %). In den Geweben konnten im

Gegensatz zum Plasma regelmäßig Gehalte von dekonjugiertem Quercetin nachge-

wiesen werden, die ca. 30 – 100 % der Gesamtkonzentration ausmachten. Ein direk-

ter Zusammenhang zwischen der Konzentration an Aglyca und der spezifischen Ak-

78

6. Zusammenfassung

tivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Geweben ließ sich allerdings nicht

zeigen. Grundsätzlich ist anzumerken, dass die in dieser Arbeit ermittelten Gewebs-

konzentrationen von Flavonolen eine „Momentaufnahme“ darstellen und Effekte ei-

ner langfristigen Applikation von Quercetin und der akuten Zufuhr des Flavonols mit

der letzten Mahlzeit 60 - 90 min vor der Gewebeentnahme widerspiegeln.

79

7. Summary

7. Summary

Juliane Bieger (2007):

Tissue distribution of the flavonol quercetin

in the pig after long-term feeding of a quercetin-containing diet

The aim of this study was to improve our knowledge about the distribution of the

flavonol quercetin as well as its methylated metabolites isorhamnetin and tamarixetin

in mammals. Information about the post-absorptive fate of the health-promoting

flavonoids which are continuously ingested with plant-derived food, is of crucial

importance for the understanding of their mode of action. Few studies carried out in

rats indicate a distribution of flavonoids in different body tissues. Furthermore,

preliminary data obtained in pigs (de Boer et al. 2005) indicate, that remarkable

differences between rats and pigs concerning the distribution and metabolite

transformation of flavonols do exist.

In the present study pigs were fed a high quercetin diet (50 mg per kg body weight

daily) for a period of four weeks. The results demonstrate that a long-term application

of quercetin leads to a broad distribution of the test substance and its methylated

metabolites within the organism. The high concentrations in the intestinal wall, liver

and kidneys, however, indicate that the flavonoid is extensively metabolized and

eliminated by these organs. The considerably lower concentrations found in adipose

tissue, skeletal muscle, lungs and brain suggest that even after long-term oral

application of quercetin a significant accumulation within these organs is unlikely. In

most tissues the majority of flavonols (67 - 98 %) were present as conjugates of

quercetin. Unlike in plasma the other tissues investigated contained a variable

amount of deconjugated quercetin in the range of 30 - 100 % of the total

concentration. A correlation, however, between aglyca concentration and the specific

activity of the enzyme ß-glucuronidase of the respective tissue could not be

demonstrated.

With respect to the tissues distribution of quercetin and its metabolites, the present

results are some kind of a “snap-shot” reflecting effects of the long-term quercetin

80

7. Summary

application and the acute intake with the last meal consumed about 60 min prior to

slaughtering.

81

8. Literaturverzeichnis


ADER, P., BLÖCK, M., PIETZSCH. & WOLFFRAM, S. (2001). Interaction of quercetin glucosides with the Na+-dependent glucose carrier (SGLT1) in rat small intestine. Cancer Lett. 162, 175-180. ADER, P., WESSMANN, A. & WOLFFRAM, S. (2000). Bioavailability and metabolism of the flavonol quercetin in the pig. Free Rad. Biol. Med. 28, 1056-1067. AGULLO, G., GAMET-PAYRASTRE, L., MANENTI, S., VIALA, C., REMESY, C., CHAP, H. & PAYRASTRE, B. (1997). Relationship between flavonoid structure and inhibition of phosphatidylinositol-3-kinase: a comparison between tyrosine kinase and protein kinase C inhibition. Biochem. Pharmacol. 53: 1649-1657. AISLING AHERNE, S. & O’BRIEN, M. N. (2002). Dietary flavonols: chemistry, food content and metabolism. Nutr. 18, 75-81. ARAI, K., KANASEKI, T. & OHKUMA, S. (1991). Isolation of highly purified lysosomes from rat liver: identification of electron carrier components on lysosomal membranes. J. Biochem. 110, 541-547. ARTS, I. C. W., SESINK, A. L. A., FAASSEN-PETERS, M. & HOLLMAN, P. C. H. (2004). The type of sugar moiety is a major determant of the small intestinal uptake and subsequent biliary excretion of dietary quercetin glycosides. Br. J. Nutr. 91(6), 841-847. AZUMA, K., IPPOUSHI, K., ITO, H., HIGASHIO, H. & TERAO, J. (2002). Combination of lipids and emulsifiers enhances the absorption of orally administered quercetin in rats. J. Agric. Food Chem. 50, 1706-1712. AZUMA, K., IPPOUSHI, K., ITO, H., HORIE, H. & TERAO, J. (2003). Enhancing effect of lipids and emulsifiers on the accumulation of quercetin metabolites in blood plasma after short-term ingestion of onion by rats. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67(12), 2548-2555. BEECHER, G. R. (2003). Overview of dietary flavonoids: nomenclature, occurrence, and intake. J Nutr. 133(10), 3248S-3254S. BIRKENMEIER, E. H., DAVISSON, M. T., BEAMER, W. G., GANSCHOW, R. E., VOGLER, C. A., GWYNN, B., LYFORD, K. A., MALTAIS, L. M. & WAWRZYNIAK, C. J. (1989). Murine Mucopolysaccharidosis Type VII. Characterization of a mouse with ß-glucuronidase deficiency. J. Clin. Invest. 83, 1258-1266. BLAUT, M., SCHOEFER, L. & BRAUNE, A. (2002). Transformation of flavonoids by intestinal microorganisms. Int. J. Vitam. Nutr. Res. 73(2), 79-87.

82


BÖHM, H., BOEING, H., HEMPEL, J., RAAB, B. & KROKE, A. (1998). Flavonole, Flavanole und Anthocyane als natürliche Antioxidantien der Nahrung und ihre mögli-che Rolle bei der Prävention chronischer Erkrankungen. Z. Ernährungswiss. 37, 147-163. BOERSMA, M. G., VAN DER WOUDE, H., BOGAARDS, J., BOEREN, S., VERVOORT, J., CNUBBEN, N. H. P., VAN IERSEL, M. L. P. S., VAN BLADEREN, P. J. & RIETJENS, I. M. C. M. (2002). Regioselectivity of phase II metabolism of luteolin and quercetin by UDP-glucuronosyltransferases. Chem. Res. Toxicol. 15, 662-670. BOKKENHEUSER, V. D., SHACKLETON, C. H. L. & WINTER, J. (1987). Hydrolysis of dietary flavonoid glycosides by strains of intestinal Bacteroides from humans. Biochem. J. 248, 953-956. BORS, W., MICHEL, C. & STETTMAIER, K. (1997). Antioxidant effects of flavonoids. Bio Factors 6, 399-402. BORST, P & ELFERINK, R. O. (2002). Mammalian ABC transporters in health and disease. Annu. Rev. Biochem. 71, 537-592. BOSSLET, K., CZECH, J. & HOFFMANN, D. (1995). A novel one-step tumor-selective activation system. Tumor Targeting 1, 45-50. BOULTON, D. W., WALLE, U. K. & WALLE, T. (1998). Extensive binding of the bioflavonoid quercetin to human plasma proteins. J. Pharm. Pharmacol. 50, 243-249. BRAUNE, A., GUTSCHOW, M. ENGST, W. & BLAUT, M. (2001). Degradation of quercetin and luteolin by Eubacterium ramulus. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5558-5567. BRAVO, L. (1998). Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutr. Rev. 56(11), 317-333. BROWN, D. E., RASHOTTE; A. M., MURPHY, A. S., NORMANLY, J., TAGUE, B. W., PEER, W. A., TAIZ, L. & MUDAY, G. K. (2001). Flavonoids act as negative regulators of auxin transport in vivo in Arabidopsis. Plant Physiol. 126, 524-535. BRUNELLE, F. M. & VERBEECK, R. K. (1993). Glucuronidation of diflunisal by rat liver microsomes. Effect of microsomal beta-glucuronidase activity. Biochem. Pharmacol. 46(11), 1953-1958. CALDWELL, J. (1982). Conjugation reactions in foreign-compound metabolism: definition, consequences, an species variations. Drug Metabolism reviews 13(5), 745-777.

83


CAO, G., MUCCITELLI, H. U., SANCHEZ-MORENO, C. & PRIOR, R. L. (2001). Anthocyanins are absorbed in glycated forms in elderly women: a pharmacokinetic study. Am. J. Clin. Nutr. 73, 920-926. CERMAK, R., LANDGRAF, S. & WOLFFRAM, S. (2003). The bioavailability of quercetin in pigs depends on the glycoside moiety and on dietary factors. J. Nutr. 133(9), 2802-2807. CERMAK, R., LANDGRAF, S. & WOLFFRAM, S. (2004). Quercetin glucosides inhibit glucose uptake into brush-border-membrane vesicles of porcine jejunum. Br. J. Nutr. 91, 849-855. CHEN, C.-Y., MILBURY, P. E., LAPSLEY, K. & BLUMBERG, J. B. (2005). Flavon-oids from almond skins are bioavailable and act synergistically with vitamins C and E to enhance hamster and human LDL resistance to oxidation. J Nutr. 135, 1366-1373. CHEYNIER, V. (2005). Polyphenols in foods are more complex than often thought. Am J Clin Nutr. 81(suppl), 223S-9S. CHOPRA, M. & THURNHAM, D. I. (1999). Antioxidants and lipoprotein metabolism. Proc. Nutr. Soc. 58, 663-671. CIOLINO, H. P., DASCHNER, P. J. & Yeh, G. C. (1999). Dietary flavonols quercetin and kaempferol are ligands of the aryl hydrocarbon receptor that affect CYP1A1 transcription differentially. Biochem. J. 340, 715-722. CONNORS, T. A. & WHISSON, M. E. (1966). Cure of mice bearing advanced plasma cell tumors with aniline mustard: the relationship between glucuronidase activity and tumor sensitivity. Nature 210, 866-867. COORAY, H. C., JANVILISRI, T., VAN VEEN, H. W., HLADKY, S. B. & BARRAND, M. A. (2004). Interaction of breast cancer resistance protein with plant polyphenols. Biochem. Biophys. Res. Commun. 317(1), 269-275. CRESPY, V., MORAND, C., BESSON, C., MANACH, C., DEMIGNE, C. & REMESY, C. (1999). Part of quercetin absorbed in the small intestine is conjugated and further secreted in the intestinal lumen. Am. J. Physiol. 277, G120-126. CRESPY, V., MORAND, C., BESSON, C., MANACH, C., DEMIGNE, C. & REMESY, C. (2002). Quercetin, but not its glycosides, is absorbed from the rat stomach. J. Agric. Food Chem. 50, 618-621. CRESPY, V., MORAND, C., BESSON, C., MANACH, C., DEMIGNE, C. & REMESY, C. (2001). Comparison of the intestinal absorption of quercetin, phloretin and their glucosides in rats. J. Nutr. 131, 2109-2114.

84


CRESPY, V., MORAND, C. BESSON, C., COTELLE, N., VEZIN, H., DEMIGNE, C & REMESY, C (2003). The splanchnic metabolism of flavonoids highly differed according the nature of the compound. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 284, G980-G988. CRISTOFALO, V. J. & KABAKIJIAN, J. (1975). Lysosomal enzymes and aging in vitro: subcellular enzyme distribution and effect of hydrocortisone on cell life-span. Mech. Ageing Dev. 4(1), 19-28. CROZIER, A., LEAN, M. E. J., MCDONALD, M. S. & BLACK, C. (1997). Quantitative analysis of the flavonoid content of commercial tomatoes, onions, lettuce and celery. J Agric Food Chem. 45, 590-595. CUI, Y., KÖNIG, J., LEIER, I., BUCHHOLZ, U. & KEPPLER, D. (2000). Hepatic uptake of bilirubin and its conjugates by the human organic anion transporter SLC21A6. J. Biol. Chem. 276(13), 9626-9630. CUNNINGHAM, B. D. M., THREADGILL, M. D. , GROUNDWATER, P. W., DALE, I. L. & HICKMAN, J. A. (1992). Synthesis and biological evaluation of series of flavones designed as inhibitors of protein tyrosine kinases. Anti-Cancer Drug Des. 7, 356-384. DATLA, K. P., CHRISTIDOU, M. WIDMER, W. W., ROOPRAI, H. K. & DEXTER, D. T. (2001). Tissue distribution and neuroprotective effects of citrus flavonoid tangeretin in a rat model of Parkinson’s disease. Neuroreport 12, 3871-3875. DAS, D. K. (1994). Naturally occuring flavonoids: structure, chemistry and high performance liquid chromatography methods for separation and characterization. In: Methods in Enzymology, 234, pp. 410-420. Academic Press Inc., New York DAY, A., BAO, Y., MORGAN, M. R. & WILLIAMSON, G. (2000a). Conjugation position of quercetin glucuronides and effect on biological activity. Free Radic. Biol. Med. 29(12),1234-1243. DAY, J. A., CANADA, F. J., DIAZ, J. C., KROON, P. A., MCLAUCHLAN, R., FAULDS, C. B., PLUMB, G. W., MORGAN, M. R. A. & WILLIAMSON, G. (2000b). Dietary flavonoid and isoflavone glycosides are hydrolysed by the lactase site of lactase phlorizin hydrolase. FEBS Lett. 468, 166-170. DAY, A. J., DUPONT, M. S., RIDLEY S., RHODES, M. RHODES, M. J. C., MORGAN, M. R. A. & WILLIAMSON, G. (1998). Deglycosylation of flavonoid and isoflavonoid glycosides by human small intestine and liver glucuronidase activity. FEBS Lett. 436, 71-75.

85


DAY, A. J., GEE, J. M., DUPONT, M. S., JOHNSON I. T. & WILLIAMSON, G. (2003). Absorption of quercetin-3-glucoside and quercetin-4’-glucoside in the rat small intestine: the role of lactase phlorizin hydrolase and the sodium-dependent glucose transporter. Biochem. Pharmacol. 65,1199-1206. DAY, A. J., ROTHWELL, J. A. & MORGAN R. A. (2004). Characterization of polyphenol metabolites. In Phytochemicals in Health and Disease (Bao, Y. P. & Fenwick, R.) Marcel Dekker, New York, Basel. DE BOER, V. J. C., DIHAL, A. A., VAN DER WOUDE, H., ARTS, I. C. W., WOLFFRAM, S., ALINK, G. M., RIETJENS, I. M. C. M., KEIJER, J. & HOLLMAN, P. C. H. (2005). Tissue distribution of quercetin in rats and pigs. J. Nutr. 135(7), 1718-1725. DE VRIES, J. H. M., HOLLMAN, P. C. H., VAN AMERSFOORT, I., OLTHOF, M. R. & KATAN, M. B., (2001). Red wine is a poor source of bioavailable flavonols in men. J. Nutr. 131, 745-748. DOYLE, L. A., YANG, W., ABRUZZO, L. V., KROGMANN, T. GAO, J., RISHI, A. K. & ROSS, D. D. (1998). A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 15665-15670. DRAGONI, S., GEE, J., BENNETT, R.,VALOTI, M. & SGARAGLI, G. (2006). Red vine alcohol promotes quercetin absorption and directs its metabolism towards isorhamnetin and tamarixetin in rat intestine in vitro. Br. J. Pharmacol. 147(7), 765-771. DUTHIE, G. & CROZIER, A. (2000). Plant-derived phenolic antioxidants. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 3(6), 447-451. DUTHIE, G. G., GARDNER, P. T. & KYLE, J. A. M. (2003). Plant polyphenols: are they the new magic bullet? Proc. Nutr. Soc. 62(3), 599-603. DWIVEDI, C., HECK, W. J., DOWNIE, A. A., LARROYA, S. & WEBB, T. E. (1990). Effect of calcium glucarate on ß-glucuronidase activity and glucarate content of certain vegetables and fruits. Biochem. Met. Metab. Biol. 43, 83-92. ERLUND, I. (2004). Review of the flavonoids quercetin, hesperetin, and naringenin. Dietary sources, bioactivities, bioavailability, and epidemiology. Nutr. Res. 24, 851-874. FALANY, C. N. (1997). Enzymology of human cytosolic sulfotransferases. FASEB J. 11(4), 206-216.

86


FERRALI, M., SIGNORINI, C., CACIOTTI, B., SUGHERINI, L., CICCOLI, L., GIACHETTI, D. & COMPORTI, M. (1997). Protection against oxidative damage of erythrocyte membrane by the flavonoid quercetin and its relation to iron chelating activity. FEBS Lett. 416, 123-129. FERRIOLA, P. C., CODY, V. & MIDDLETON, E. (1989). Protein kinase C inhibition by plant flavonoids. Biochem. Pharmacol. 38, 1617-1624. FIORANI, M., ACCORSI, A. & CANTONI, O. (2003). Human red blood cells as a natural Flavonoid reservoir. Free Radic. Res. 37(12), 1331-1338. FISHMAN, W. H. (1974). ß-Glucuronidase. In Methoden der enzymatischen Analyse Band I (Hrsg. Hans Ulrich Bergmeyer), Verlag Chemie Weinheim/Bergstr., pp. 964-979. FORMICA, J. V. & REGELSON, W. (1995). Review of the biology of quercetin and related bioflavonoids. Fd Chem. Toxic. 33, 1061-1080. FREY, H.-H. (2000). Zentrales Nervensystem (ZNS). In Physiologie der Haustiere. W. v. Engelhardt & G. Breves (Hrsg.), Enke im Hippokrates Verlag GmbH, Stuttgart, pp. 44-68. FUHRMAN, B. & AVIRAM, M. (2001). Flavonoids protect LDL from Oxidation and attenuate atherosclerosis. Curr. Opin. Lipidol. 12, 41-48. FUKUMOTO, L. R. & MAZZA, G. (2000). Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds. J. Agric. Food. Chem. 48, 3597-3604. GAMET- PAYRASTRE, L., MANENTI, S., GRATACAP, M. P., TULLIEZ, J., CHAP, H. & PAYRASTRE, B. (1999). Flavonoids and the inhibition of PKC and PI 3-kinase. Gen. Pharmacol. 32, 279-286. GANSCHOW, R. & PAIGEN, K. (1967). Glucuronidase phenotypes of inbred mouse strains. Genetics 59, 335-349. GEE, J. M., DUPONT, M. S., DAY, A. J., PLUMB, G. W., WILLIAMSON, G. & JOHNSON, I. T. (2000). Intestinal transport of quercetin glycosides in rats involves both deglycosylation and interaction with the hexose transport pathway. J. Nutr., 130(11), 2765-2771. GEE, J. M., DU PONT, M. S., RHODES M. J. C. & JOHNSON, I. T. (1998). Quercetin glucosides interact with the intestinal glucose transport pathway. Free Radic. Biol. Med. 25, 19-25. GLASER, J. H. & SLY, W. S. (1973). ß-glucuronidase deficiency. Mucopolysacchari-dosis: methods for enzymatic diagnosis. J. Lab. Clin. Med. 82(6), 969-977.

87


GOLDBERG, D. M., YAN, J. & SOLEAS, G. J. (2003). Absorption of three wine-related polyphenols in three different matrices by healthy subjects. Clin. Biochem. 36, 79-87. GRAEFE, E. U., WITTIG, J., MUELLER, S., RIETHLING, A.-K., UEHLEKE, B., DREWELOW, B., PFORTE, H., JACOBASCH, G., DERENDORF,H. & VEIT, M. (2001). Pharmacokinetics and bioavailability of quercetin glycosides in humans. J. Clin. Pharmacol. 41, 492-499. GRAF, B. A., MULLEN, W., CALDWELL, S. T., HARTLEY, R. C., DUTHIE, G. G., LEAN, M. E. J., CROZIER, A. & EDWARDS, C. A. (2005). Disposition and metabo-lism of [2-14C]quercetin-4’-glucoside in rats. Drug Metab. Dispos,. 33(7), 1036-1043. GREINER, L. L., STAHLY, T. S. & STABEL, T. J. (2001). The effect of the dietary soy daidzein on pig growth and viral replication during a viral challenge. J. Anim. Sci. 79, 3113-3119. GRIFFITHS, L. A. & SMITH, G. E. (1972). Metabolism of myricetin and related compounds in the rat. Metabolite formation in vivo and by the intestinal microflora in vitro. Biochem. J. 130,141-151. GUGLER, R., LESCHIK, M. & DENGLER H. J. (1975). Disposition of quercetin in man after single oral and intravenous doses. Eur. J. Clin. Pharmacol. 9, 229-234. HALLIWELL, B., RAFTER, J. & JENNER, A. (2005). Health promotion by flavon-oids, tocopherols, tocotrienols and other phenols: direct or indirect effects? Antioxi-dants or not? Am. J. Clin. Nutr., 81(suppl): 268S-76S. HARBORNE, J. B. & WILLIAMS C. A. (2000). Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry 55, 481-504. HASKINS, M. E. R. J., DESNICK, N., DIFERRANTE, N. JEZYK, P. F. & PATTERSON, D. F. (1984). ß-glucuronidase deficiency in a dog: a model of human mucopolysaccharidosis VII. Pediatr. Res. 18, 980-984. HAYS, W. S, JENISON, S. A., YAMADA, T., PASTUSZYN, A. & GLEW, R. H. (1996). Primary structure of the cytosolic ß-glucosidase of guinea pig liver. Biochem. J., 319: 829-837. HELLER, W. & FORKMANN, G. (1994). Biosynthesis of flavonoids. In The Flavonoids: Advances in research since 1986 (ed. J. B. Harborne), Chapman & Hall, London, pp. 499-531. HERTOG, M. G. L., FESKENS, E. J. M., HOLLMAN, P. C. H., KATAN, M. B. & KROMHOUT, D. (1993). Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: The Zutphen Elderly Study. The Lancet 342, 1007-1011.

88


HERTOG, M. G. L., HOLLMAN, P. C. H., KATAN, M. B. & KROMHOUT, D. (1993). Intake of potentially anticarcinogenetic flavonoids and their determinants in adults in The Netherlands. Nutr. Cancer, 20, 21-29. HERTOG, M. G. L., HOLLMAN, P. C. H, & VENEMA, D. P. (1992). Optimization of a quantitative HPLC determination of potentially anticarcinogenic flavonoids in vegetables and fruits. J. Agric. Food Chem. 40, 1591-1598. HERTOG, M. L. G, KROMHOUT, D., ARAVANIS, BLACKBURN, H., BUZINA, R., FIDANZA, F., GIAMPAOLI, S., JANSEN, A., MENOTTI, A., NEDELJKOVE, S., PEKKARINEN, M, SIMIC, B. C., TOSHIMA, H., FESKENS, E. J. M., HOLLMAN, P. C. H. & KATAN, M. B. (1995). Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the Seven Countries Study. Arch. Intern. Med., 155, 381-386. HERTOG, M. G. L. & KATAN, M. B. (1998). Quercetin in foods, cardiovascular disease and cancer, In Flavonoids in health and disease, 1st Ed. 1998, Marcel Dekker, New York, pp. 447-467. HERRMANN, K. (1990).Vorkommen und Gehalte der Flavonoide in Obst. Teil II: Flavonolglycoside, Anthocyanine und Dihydrochalcone. Erwerbsobstbau 32, 32-37. HIRAYAMA, B., HAZAMA, A., LOO, D. F., WRIGHT, E. M. & KISBY, G. E. (1994). Transport of cycasin by the intestinal Na+/glucose cotransporter. Biochim. Biophys. Acta, 1193,151-154. HOLLMAN, P. C. H. & ARTS, I. C. W. (2000). Flavonols, flavones and flavanols - nature, occurrence, and dietary burden. J. Sci. Food Agric. 80, 1081-1093. HOLLMAN, P. C. H., BUYSMAN, M. N. C. P., VAN GAMEREN, Y., CNOSSEN, E. P. J., DE VRIES, J. H. M. & KATAN, M. B. (1999). The sugar moiety is the major determinant of the absorption of dietary flavonoid glycosides in man. Free Radic. Res. 31, 569-573. HOLLMAN, P. C. H.; DE VRIES, J. H. M., VAN LEEUWEN, S. D., MENGELERS, M. J. & KATAN, M. B. (1995). Absorption of dietary quercetin glycosides and quercetin in healthy ileostomy volunteers. Am. J. Clin. Nutr. 62, 1276-1282. HOLLMAN, P. C. H & KATAN, M. B. (1998). Absorption, metabolism, and bioavailability of flavonoids. In: Flavonoids in health and disease (Rice-Evans, C. A., Packer, L., eds.), chapter 22, pp. 483-522, Marcel Dekker, New York. HOLLMAN, P. C. H., V. D. GAAG, M., MENGELERS, M. J., VAN TRIJP, J. M., DE VRIES, J. H. & KATAN, M. B. (1996a). Absorption and disposition kinetics of the dietary antioxidant quercetin in man. Free Radic. Biol. Med. 21, 703-707.

89


HOLLMAN, P. C. H., VAN TRIJP, J. M. P. & BUYSMAN, M. N. C. P. (1996b). Fluorescence detection of flavonols in HPLC by postcolumn chelation with alumin-ium. Anal. Chem. 68, 3511-3515. HOLLMAN, P. C. H., VAN TRIJP, J. M. P., BUYSMAN, M. N. C. P.,V. D. GAAG, M., MENGELERS, M. J. B., DE VRIES, J. H. M. & KATAN, M. B. (1997). Relative bioavailability of the antioxidant flavonoid quercetin from various foods in man. FEBS Lett. 418, 152-156. HUR, H. G., LAY Jr., J. O., BEGER, R. D., FREEDMAN, J. P. & RAFII, F. (2000). Isolation of human intestinal bacteria metabolising the natural isoflavone glycosides daidzin and genistin. Arch. Microbiol. 174, 442-448. IMAI, Y., TSUKAHARA, S., ASADA, S. & SUGIMOTO, Y. (2004). Phytoestrogens / flavonoids reverse breast cancer resistance protein/ABCG2-mediated multidrug re-sistance. Cancer Res. 64, 4346-4352. ISHIKAWA, Y. & KITAMURA, M. (2000). Antiapoptotic effect of quercetin: Interven-tion in the JNK- and ERK-mediated apoptotic pathways. Kidney Int. 58, 1078-1087. KANAZAWA, K., YAMASHITA, T., ASHIDA, H. & DANNO, G. (1997). An-timutagenicity of flavones und flavonols to heterocyclic amines by specific and strong inhibition of the cytochrome P450 1A family. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62(5), 970-977. KELLY, G. E., NELSON, C., WARING, M. A., JOANNOU, G. E. & REEDER, A. Y. (1993). Metabolites of dietary (soya) isoflavones in human urine. Clin. Chim. Acta 223, 9-22. KING, C. D., RIOS, G. R., GREEN, M. D. & TEPHLY, T. R. (2000). UDP-Glucuronosyltransferases. Curr. Drug. Metab. 1, 143-166. KIRCHGESSNER, M. (1992). Tierernährung: Leitfaden für Studium, Beratung und Praxis. DLG-Verlag, Frankfurt (Main). KLAASSEN, C. D., LIU, L. & DUNN, R. T. (1998). Regulation of sulfotransferase in mRNA expression in male and female rats of various ages. Chem. Biol. Interactions 109, 299-313. KÖNIG, J., NIES, A. T., CUI, J., LEIER, I. & KEPPLER, D. (1999). Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRD) family: localisation, substrate specifity, and MRP2-mediated drug resistance. Biochim. Biophys. Acta 1461, 377-394.

90


KOSTER, H., HALSEMA, I., SCHOLTENS, E., KNIPPERS, M. & MULDER, G. J. (1981). Dose-dependent shifts in the sulfation and glucuronidation of phenolic compounds in the rat in vivo and in isolated hepatocytes. The role of saturation of phenolsulfotransferase. Biochem. Pharmacol. 30, 2569-2575. KRUMHOLZ, W., WEIDENBUSCH, H. & MENGES, T. (2000). Der Einfluss von Midazolam Flunitrazepam auf die Freisetzung von Lysozym und ß-Glucuronidase aus neutrophilen Granulozyten in vitro. Anästhesiol. Intensivmed. Notfallmed. Schmerzther. 35, 316-318. KÜHNAU, J. (1976). The Flavonoids. A class of semi-essential food components: Their role in human nutrition. Wld Rev. Nutr. Diet. 24, 117-191. KUHNLE, G., SPENCER, J. P. E., SCHROETER, H. SHENOY, B., DEBNAM, E. S., SRAI, S. K. S., RICE-EVANS, C. & HAHN, U. (2000). Epicatechin and catechin are O-methylated and glucuronidated in the small intestine. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 507-512. KUHN, G., HENNIG, U., KALBE, C., REHFELDT C., REN, M. Q., MOORS, S. & DEGEN, G. H. (2004). Growth performance, carcass characteristics and bioavailabil-ity of isoflavones in pigs fed soy bean based diets. Arch. Anim. Nutr. 58(4), 265-276. KUO, S.-M. (2002). Flavonoids and gene expression in mammalian cells. In Buslig, B. & Manthey, J. (Eds) Flavonoids in cell function, pp. 191-200, New York: Kluwer Academic/Plenum Publisher. LAMPE, J. W., LI, S. S., POTTER, J. D. & KING, I. B. (2002). Serum ß-Glucuronidase activity is inversely associated with plant food intakes in humans. J. Nutr. 132(6), 1341-1344. LEE, M. J., MALIAKAL, P. , CHEN, L., MENG, X., BONDOC, F. Y., PRABHU, S., LAMBERT, G., MOHR, S. & YANG, C. S. (2002). Pharmacokinetics of tea catechins after ingestion of green tea and (-)-epigallocatechin-3-gallate by humans: formation of different metabolites and individual variability. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 11, 1025-1032. LESSER, S., CERMAK, R. & WOLFFRAM, S. (2004). Bioavailability of quercetin in pigs is influenced by the dietary fat content. J. Nutr. 134(6),1508-1511. LINSEISEN, J., RADTKE, J. & WOLFRAM, G. (1997). Flavonoidzufuhr Erwachse-ner in einem bayerischem Teilkollektiv der Nationalen Verzehrsstudie. Z. Ernäh-rungswiss. 36, 403-412. LISKA, D. J. (1998). The detoxification enzyme systems. Altern. Med. Rev. 3(3), 187-198.

91


LITMAN, T., DRULEY, T. E., STEIN, W. D. & BATES, S. E. (2001). From MDR to MXR: new understanding of multidrug resistance systems, their properties and clinical significance. CMLS 58, 931-959. LIU, G. T., ZHENG, Y. L., CHEN, W. H., CHEN, J. & HAN, Z. K. (1999). Effect of daidzein fed to pregnant sows on milk production and the levels of hormones in colostrum. Journal of Nanjing Agricultural University 22, 68-72. LOSTAO, M. P., HIRAYAMA, B. A., LOO, D. D. & WRIGHT, E. M. (1994). Phenylglucosides and the Na+/glucose cotransporter (SGLT1): analysis of interac-tions. J. Membr. Biol. 142, 161-170. LUSIS, A. J. & PAIGEN (1977). Relationships between levels of membrane-bound glucuronidase and the associated protein egasyn in mouse tissues. J. Cell Biol. 73, 728-735. LUSIS, A. J., TOMINO S. & PAIGEN K. (1976). Isolation, characterization, and radioimmunoassay of murine egasyn, a protein stabilizing glucuronidase membrane binding. J. Biol Chem. 251, 7753-7760. MACDONALD, I. A., BUSSARD, R. G., HUTCHINSON, D. M. & HOLDEMAN, L. V. (1984). Rutin-induced beta-glucosidase activity in Streptococcus faecium VHG-1 and Streptococcus sp. strain FRP-17 isolated from human faeces: formation of the mutagen, quercetin, from rutin. Appl. Environ. Microbiol. 47, 350-355. MANACH, C., MAZUR, A. & SCALBERT, A. (2005a). Polyphenols and prevention of cardiovascular diseases. Curr. Opin. Lipidol. 16, 77-84. MANACH, C., MORAND, C., CRESPY, V., DEMIGNE, C., TEXIER, O., REGERAT, F. & REMESY, C. (1998). Quercetin is recovered in human plasma as conjugated derivatives which retain antioxidant properties. FEBS Lett. 426, 331-336. MANACH, C., MORAND, C., DEMIGNE, C., TEXIER, O., REGERAT, F. & REMESY, C. (1997). Bioavailability of rutin and quercetin in rats. FEBS Lett. 409, 12-16. MANACH, C., MORAND, C., TEXIER, O., FAVIER, M. L., AGULLO, G., DEMIGNE, C., REGERAT, F. & REMESY, C. (1995). Quercetin metabolites in plasma of rats fed diets containing rutin or quercetin. J. Nutr. 125, 1911-1922. MANACH, C., REGERAT, F., TEXIER, O., AGULLO, G., DEMIGNE, C. & REMESY, C. (1996a). Bioavailability, metabolism, and physiological impact of 4-oxo-flavonoids. Nutr. Res. 16, 517-544 MANACH, C., TEXIER, O., REGERAT, F., AGULLO, G., DEMIGNE, C. & REMESY, C. (1996b). Dietary quercetin is recovered in rat plasma as conjugated derivatives of isorhamnetin and quercetin. Nutr. Biochem. 7, 375-380.

92


MANACH, C., SCALBERT, A., MORAND, C., REMESY, C. & JIMENEZ, L. (2004). Polyphenols: food sources and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr. 79, 727-47. MANACH, C., WILLIAMSON, G. MORAND, C., SCALBERT, A. & REMESY, C. (2005b). Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. I. Review of 97 bioavailability studies. Am. J. Clin. Nutr. 81(suppl), 230S-242S. MATSUMOTO, H., INABA, H., KISHI, M., TOMINAGA, S., HIRAYAMA, M. & TSUDA, T. (2001). Orally administered delphinidin 3-rutinoside and cyanidin 3-rutinoside are directly absorbed in rats and humans and appear in the blood as the intact forms. J. Agric. Food Chem. 50, 618-621. MIDDLETON, E., KANDASWAMI, C. & THEOHARIDES, T. C. (2000). The effect of plant flavonoids on mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. Pharmacol Rev. 52, 673-751. MOON, Y. J., WANG, X. & MORRIS, M. E. (2005). Dietary flavonoids: effects on xenobiotic and carcinogen metabolism. Toxicol. In Vitro 20(2), 187-210. MORAND, C., CRESPY, V., MANACH, C., BESSON, C., DEMIGNE, C. & REMESY, C. (1998). Plasma metabolites of quercetin and their antioxidant properties. Am. J. Physiol. 275, R212-R219. MORAND, C., MANACH, C., CRESPY, V. & REMESY, C. (2000). Respective bioavailability of quercetin aglycone and its glycoside in a rat model. BioFactors 12, 169-174. MÜRDTER, T. E., GODEHARD, F., BACKMAN, J. T., McCLELLAN, M., SCHICK, M., GERKEN, M., BOSSLET, K., FRITZ, P., TOOMES, H., KROEMER, H. K. & SPERKER, B. (2002). Dose optimization of a doxorubicin prodrug (HMR 1826) in isolated perfused human lungs: low tumor pH promotes prodrug activation by ß-glucuronidase. J. Pharmacol. Exp. Ther. 301(1), 223-228. MÜRDTER, T. E., SPERKER, B., KIVISTÖ, K. T., McCLELLAN, M., FRITZ, P., FRIEDEL, G., LINDER, A., BOSSLET, K., TOOMES, H., DIERKESMANN, R. & KROEMER, H. K. (1997). Enhanced uptake of doxorubin into bronchial carcinoma: elevated levels of ß-glucuronidase mediate release of doxorubicin from a glucuronide prodrug at the tumor site. Cancer Res. 57, 2440-2445. MULLEN, W., GRAF, B. A., CALDWELL, S. T., HARTLEY, R. C., DUTHIE, G. G., EDWARDS, C. A., LEAN, M. E. J. & CROZIER A. (2002). Determination of flavonol metabolites in plasma and tissues of rats by HPLC-radiocounting and tandem mass spectrometry following oral ingestion of [2-14C]quercetin-4’-glucoside. J. Agric. Food Chem. 50, 6902-6909. MUROTA, K. & TERAO, J. (2003). Antioxidative flavonoid quercetin: implications of its intestinal absorption and metabolism. Arch. Biochem. Biophys. 417(1), 12-17.

93


MUROTA, K. & TERAO, J. (2005). Quercetin appears in the lymph of unanesthe-tized rats as its phase II metabolites after administered into the stomach. FEBS Lett. 579, 5343-5346. NEMETH, K., PLUMB, G. W., BERRIN, J.-G., JUGE, N., JACOB, R., NAIM, H. Y., WILLIAMSON, G., SWALLOW, D. M. & KROON, P. A. (2003). Deglycosylation by small intestinal epithelial cell ß-glucosidases is a critical step in the absorption and metabolism of dietary flavonoid glycosides in humans. Eur. J. Nutr. 42, 29-42. OFER, M., WOLFFRAM, S., KOGGEL, A., SPAHN-LANGGUTH, H. & LANGGUTH, P. (2005). Modulation of drug transport by selected flavonoids: Involvement of P-gp and OCT? Eur. J. Pharm. Sci. 25(2-3), 263-271. O’ LEARY, K. A., DAY, A. J., NEEDS, P. W., MELLON, F. A., O’BRIEN, N. M. & WILLIAMSON, G. (2002). Metabolism of quercetin-7- and quercetin-3-glucuronides by an in vitro hepatic model: the role of human ß-glucuronidase, sulfotransferase, catechol-O-methyltransferase and multi-resistant protein 2 (MRP2) in flavonoid metabolism. Biochem. Pharmacol. 65, 479-491. O’LEARY, K., DAY, A. J., NEEDS, P. W., SLY, W. S., O’BRIEN, N. M. & WILLIAMSON, G. (2001). Flavonoid glucuronides are substrates for human liver ß-glucuronidase. FEBS Lett. 503, 103-106. PAIGEN, K. (1989). Mammalian beta-glucuronidase: genetics, molecular biology, and cell biology. Prog. Nucleic. Acid. Res. Mol. Biol. 37, 155-205. PAYNE, R. L., BIDNER, T. D., SOUTHERN, L. L. & GEAGHAN, J. P. (2001). Effects of dietary soy isoflavones on growth, carcass traits, and meat quality in growing-finishing pigs. J. Anim. Sci. 79, 1230-1239. PENG, H. W., CHENG, F. C., HUANG, Y. T., CHEN, C. F. & TSAI, T. H. (1998). Determination of naringenin and its glucuronide conjugate in rat plasma and brain tissue by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 714, 369-374. PETRI, N., TANNERGREN, C., HOLST, B., MELLON, F. A., BAO, Y., PLUMB, G. W., BACON, J., O’LEARY, K. A., KROON, P. A., KNUTSON, L., FORSELL, P., ERIKSSON, H. L. & WILLIAMSON, G. (2003). Absorption/metabolism of sulforaphane and quercetin, and regulation of phase II enzymes in human jejunum in vivo. Drug Metab. Dispos. 31(6), 805-813. PIETTA, P.-G. (2000). Flavonoids as Antioxidants. J. Nat. Prod. 63, 1035-1042. PIETTA, P., SIMONETTI, P., ROGGI, C. et al. (1996). Dietary flavonoids and oxida-tive stress. In: Kumpulainen, J. T., Salonen, J. T., eds. Natural antioxidants and food quality in atherosclerosis and cancer prevention. London: Royal Society of Chemis-try, pp. 249-255.

94


PISKULA, M. K. (2000). Soy isoflavone conjugation differs in fed and food-deprived rats. J. Nutr. 130(7), 1766-1771. PISKULA, M. K. & TERAO, J. (1998a). Accumulation of (-)-epicatechin metabolites in rat plasma after oral administration and distribution of conjugation enzymes in rat tissues. J. Nutr. 128(7),1172-1178. PISKULA, M. K. & TERAO, J. (1998b). Quercetin’s solubility affects its accumulation in rat plasma after oral administration. J. Agric. Food Chem. 46, 4313-4317. PISKULA, M. K., YAMAKOSHI, J. & IWAI, Y. (1999). Daidzein and genistein but not their glucosides are absorbed from the rat stomach. FEBS Lett. 447, 287-291. PRASAIN, J. K., JONES, K., BRISSIE, N., MOORE, R., WYSS, J. M. & BARNES, S. (2004). Identification of puerarin and its metabolites in rats by liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry. J. Agric. Food. Chem. 52(12), 3708-3712. PRICE, S. F., BREEN, P. J., VALLADAO, M. & WATSON, B. T. (1995). Cluster sun exposure and quercetin in pinot noir grapes and wine. Am. J. Enol. Vitic. 46, 187-194. PRICE, K. P. & RHODES, M. J. C. (1997). Analysis of the major flavonol glycosides present in four varieties of onion (Allium crepe) and changes in composition resulting of autolysis. J. Sci. Food. Agric. 74, 331-339. REN, M. Q., KUHN, G., WEGENER, J., NÜRNBERG, G., CHEN, J. & ENDER, K. (2001). Feeding daidzein to late pregnant sows influences the estrogen receptor beta and type 1 insulin-like growth factor receptor mRNA expression in newborn piglets. Journal of Endocrinology, 170, 129-135. RICE-EVANS , C. A., MILLER, N. J. & PAGANGA, G. (1996). Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Rad. Biol. Med. 20(7), 933-956. ROLFE, B. G. (1988). Flavones and isoflavones as inducing substances of legume nodulation. Biofactors 1(1), 3-10. ROSS, J. A. & KASUM, C. M. (2002). Dietary fllavonoids: bioavailability, metabolic effects, and safety. Annu. Rev. Nutr. 22, 19-34. SAMPSON, L., RIMM, E., HOLLMAN, P. C., DE VRIES, J. H. & KATAN (2002). Flavonol and flavone intakes in US health professionals. J. Am. Diet Assoc. 102 1414-1460. SCALBERT, A. & WILLIAMSON, G. (2000). Dietary Intake and bioavailability of polyphenols. J Nutr.130, 2073S-2085S.

95


SCHNEIDER, H., SCHWIERTZ, A., COLLINS; M. D. & BLAUT, M. (1999). Anaerobic transformation by bacteria from the human intestinal tract. Arch. Microbiol. 171, 81-91. SCHOEFER, L., MOHAN, R., SCHWIERTZ, A., BRAUNE, A. & BLAUT, M. (2003). Anaerobic degradation of flavonoids by Clostridium orbiscindens. Appl. Environ. Microbiol. 69, 5849-5854. SEN, C. K. & PACKER, L. (1996). Antioxidant and redox regulation of gene transcription. FASEB J. 10, 709-720. SENGUPTA, B. & SENGUPTA, P. K. (2002). The interactions of quercetin with human serum albumin: a fluorescence spectroscopic study. Biophys. Res. Commun. 299, 400-403. SESINK, A. L. A., ARTS, I. C. W., DE BOER, V. C. J., BREEDVELD, P., SCHELLENS, J. H. M., HOLLMAN, P. C. H. & RUSSEL, F. G. M. (2005). Breast cancer resistance protein (Bcrp1/Abcg2) limits net intestinal uptake of quercetin in rats by facilitating apical efflux of glucuronides. Mol. Pharmacol. 67(6), 1999-2006. SESINK, A. L. A., ARTS, I. C., FAASSEN-PETERS, M. & HOLLMAN, P. C. H (2003). Intestinal uptake of quercetin-3-glucoside in rats involves hydrolysis by lactase phlorizin hydrolase. J. Nutr. 133, 773-776. SHIMOI, K & NAKAYAMA, T. (2005). Glucuronidase in Inflammation. In Methods in Enzymology, Vol. 400, pp. 263-272. SHIMOI, K., SAKA, N, NOZAWA, R., SATO, M., AMANO, I., NAKAYAMA, T. & KINAE, N. (2001). Deglucuronodation of a flavonoid, luteolin monoglucuronide, during inflammation. Drug Metab. Dispos. 29(12), 1521-2524. SHIPLEY, J. M., GRUBB, J. H. & SLY, W. S. (1993). The role of glycosylation and phosphorylation in the expression of active human ß-glucuronidase. J. Biol. Chem. 268(16), 12193-12198. SHIRLEY, B. W., (1996). Flavonoid biosynthesis: ‘new’ function for an ‘old’ pathway. Trends Plant Sci. 1, 377-382. SLY, W. S.,QUINTON, B. A., McALLISTER, W. H., & RIMOIN, D. L. (1973). Beta-glucuronidase deficiency: report of clinical, radiologic and biological features of a new mucopolysaccharidosis. J. Pediatr. 82, 249-257. SPENCER, J. P. E., CHOWRIMOOTOO, G., CHOUDHURY, R., DEBNAM, E. S., SRAI, S. K. & RICE-EVANS, C. (1999). The small intestine can both absorb and glucuronidate luminal flavonoids. FEBS Lett. 458, 224-230.

96


SPERKER, B., MÜRDTER, T. E., SCHICK, M. ECKHARDT, K. BOSSLET & KROEMER, H. K. (1997). Interindividual variability in expression and activity of human ß-glucuronidase in liver and kidney: consequences for drug metabolism. J. Pharmacol. Exp. Ther. 281(2), 914-920. SPERKER, B., WERNER, U., MÜRDTER, T. E., TEKKAYA, C., FRITZ, P., WACKE, R., ADAM, U., GERKEN, M., DREWELOW, B. & KROEMER, H. K. (2000). Expres-sion and function of ß-glucuronidase in pancreatic cancer: potential role in drug tar-geting. Naunyn Schmiedenbergs Arch. Pharmacol., 362, 110-115. STRACK, D. (1997). Phenolic metabolism. In Plant Biochemistry (ed. P. M. Dey & J. B. Harborne) Academic Press, London, pp 387-416. SWANK, R. T., PFISTER, K., MILLER, D. & CHAPMAN, V. (1986). The egasyn gene affects the processing of oligosaccharides of lysosomal ß-glucuronidase in liver. Biochem. J. 240, 445-454. TALAVERA, S., FELGINES, C., TEXIER, O., BESSON, C., LAMAISON, J.-L. & REMESY, C. (2003). Anthocyanins are efficiently absorbed from the stomach in anaesthetized rats. J. Nutr. 133(12), 4178-4182. TASKINEN, J., ETHELL, B. T., PIHLAVISTO, P, HOOD, A. M., BURCHELL, B. & COUGHTRIE, M. W. H. (2003). Conjugation of catechols by recombinant human sulfotransferases, UDP-glucuronosyltransferases, and soluble catechol-O-methyl-transferase: structure-conjugation relationships and predictive models. Drug Metab. Dispos. 31(9), 1187-1197. TOMINO, S. & PAIGEN, K. (1975). Purification and chemical properties of mouse liver lysosomal (L-Form) ß-Glucuronidase. J. Biol. Chem. 250(21), 8503-8509. TREUTTER, D. (2005). Significance of flavonoids in plant resistance and enhancement of their biosynthesis. Plant. Biol. 7, 581-591 UENO, I., NAKANO, N. & HIRONO, I. (1983). Metabolic fate of [14C]Quercetin in the ACI rat. Japan. J. Exp. Med. 53(1), 41-50. VAN ACKER, F. A. A., SCHOUTEN, O., HAENEN, G. R. M. M., VAN DER VIJGH, W. J. F. & BAST, A. (2000). Flavonoids can replace α-tocopherol as an antioxidant. FEBS Lett. 473, 145-148. VAN ACKER, S. A. B. E., DE GROOT, M. J., VAN DEN BERG, D.-J., TROMP, M. N. J. L., DONNE-OP DEN KELDER, G., VAN DER VIJGH, W. J. F. & BAST, A. (1996). A quantum chemical explanation of the antioxidant activity of flavonoids. Chem. Res. Toxicol. 9, 1305-1313.

97


VAN ZANDEN, J. J., WORTELBOER, H. M., BIJLSMA, S., PUNT, A., USTA, M., BLADEREN, P. J., RIETJENS, I. M. & CNUBBEN, N. H. (2005). Quantitative structure activity relationship studies on the flavonoid mediated inhibition of multidrug resistance proteins 1 and 2. Biochem. Pharmacol. 69, 699-708. WALGREN, R. A., LIN, J. T., KINNE, R. K. & WALLE, T. (2000a). Cellular uptake of dietary flavonoid quercetin 4’-beta-glucoside by sodium-dependent glucose transporter SGLT1. J. Pharmacol. Exp. Ther. 294, 837-843. WALGREN, R. A., KARNAKY JR., K. J., LINDENMAYER, G. E. & WALLE, T. (2000). Efflux of dietary flavonoid quercetin 4’-ß-glucoside across human intestinal Caco-2 cell monolayers by apical multidrug resistance-associated protein-2. J. Pharmacol. Exp. Ther. 294, 830-836. WALLE, U. K. & WALLE, T. (2002). Induction of human UDP-glucuronosyltrans-ferase UGT1A1 by flavonoids-structural requirements. Drug Metab. Dispos. 30(5), 564-569. WALLE, T., OTAKE, Y., WALLE, U. K. & WILSON, F. A. (2000). Quercetin gluco-sides are completely hydrolized in ileostomy patients before absorption. J. Nutr. 130, 2658-2652. WALLE, T., WALLE U. K. & HALUSHKA, P. V. (2001). Carbon dioxide is the major metabolite of quercetin in humans. J. Nutr. 131(10), 2648-2652. WANG, H. & MURPHY, P. A. (1994). Isoflavone content in commercial soybean foods. J. Agric. Food Chem. 42, 1666-1673. WANG, Y., CAO, J. & ZENG, S. (2005). Involvement of P-glycoprotein in regulating cellular levels of ginkgo flavonols: quercetin, kaempferol, and isorhamnetin. J. Pharm. Pharmacol. 57(6), 751-758. WEINSHILBOUM, R. M. & OTTERNESS, D. M. (1994). Sulfotransferase enzymes. In Conjugation-deconjugation reactions in drug metabolism and toxicity (Kauffman, F. C., ed) Chapt. 22, “Handbook Of Experimental Pharmacology” series, vol. 112, pp. 45-78, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg. WILLIAMS, R. J., SPENCER, J. P. E & RICE-EVANS, C. (2004). Flavonoids: antioxidants or signalling molecules? Free Radic. Biol. Med. 36(7), 838-849. WILLIAMSON, G. & MANACH, C. (2005). Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in humans. II. Review of 93 intervention studies. Am. J. Clin. Nutr. 81, 243S-55S. WOLFFRAM, S., BLÖCK, M. & ADER, P. (2002). Quercetin-3-glucoside is trans-ported by the glucose carrier SGLT1 across the brush border membrane of rat small intestine. J. Nutr. 132, 630-635.

98


WU, X., CAO, G. & PRIOR, R. L. (2002). Absorption and metabolism of anthocyanins in elderly women after consumption of elderberry or blueberry. J. Nutr., 132(7): 1865-1871. YOON, J.-H. & BEAK, S. J. (2005). Molecular targets of dietary polyphenols with anti-inflammatory properties. Yonsei Med. J. 46(5), 585-596. ZHAI, S., DAI, R., FRIEDMAN, F. K. & VESTAL, R. E. (1998). Comparative inhibition of human cytochromes P450 1A1 and 1A2 by flavonoids. Drug Metab. Dispos. 26(10), 989-992. ZHANG, S., YANG, X. & MORRIS, M. E. (2004). Flavonoids are inhibitors of breast cancer resistance protein (ABCG2)- mediated transport. Mol. Pharmacol. 65, 1208-1216. ZHU, Q. Y., HUANG, Y. & CHEN, Z.-Y. (2000). Interactions between flavonoids and α-tocopherol in human low density lipoprotein. J. Nutr. Biochem. 11, 14-21. ZSILA, F., BIKADI, Z. & SIMONYI, M. (2002). Probing the binding of the flavonoid Quercetin to human serum albumin by circular dichroism, electronic absorption spectroscopy and molecular modelling methods. Biochem. Pharmacol. 65, 447-456.

99

Danksagung

Danksagung Ich danke ganz herzlich:

Herrn Professor Dr. S. Wolffram für die Überlassung des Themas, für die vielen hilf-

reichen Verbesserungsvorschläge und seine Unterstützung bei der Anfertigung der

Arbeit.

Herrn Professor Dr. J. Kamphues dafür, dass er sich dazu bereit erklärt hat, mich als

externe Doktorandin zu betreuen und es mir dadurch ermöglicht hat, an der Tierärzt-

lichen Hochschule Hannover promoviert zu werden.

Herrn Professor Dr. R. Cermak für die Einarbeitung in das Thema meiner Arbeit so-

wie für die Mithilfe bei der Durchführung der Fütterungsstudie.

Petra Schulz für die Einweisung an der HPLC und ihre tatkräftige Unterstützung bei

der Aufarbeitung meiner Proben.

Maike Jürgensen, die mir nicht nur bei der Arbeit am Photometer mit Rat und Tat zur

Seite stand.

Clemens Benthin und allen fleißigen Hiwis, die für mich im Stall eingesprungen sind.

Sabine, Miriam und Birga, die immer ein offenes Ohr für mich hatten und oft sehr zu

meiner Motivation beigetragen haben, sowie allen Kollegen aus dem Institut für Tier-

ernährung und Stoffwechselphysiologie und dem Institut für Humanernährung und

Lebensmittelkunde, die für eine nette Atmosphäre und ein gutes Arbeitsklima gesorgt

haben.

Martin für alle aufmunternden Worte, den Rückhalt und die Hilfe, die er mir während

der Zeit gewährt hat.

Meinen Eltern, die es mir ermöglicht haben, in Hannover Tiermedizin zu studieren.

100

Verteilung des Flavonols Quercetin in Organen und Geweben ... · Die typische Drei-Ring-Struktur...

Documents

Transcript of Verteilung des Flavonols Quercetin in Organen und Geweben ... · Die typische Drei-Ring-Struktur...