VL Virusdiagnostik SS 2011 -...
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14.04.2011 1 Virologische Diagnos4k Prof. Dr. Chris4an Jassoy Ins4tut für Virologie Medizinische Fakultät Universität Leipzig Labor‐UntersuchungsauJrag und BefundmiMeilung ? Befundbericht (Kodierung) Probe plus AuJragsformular (Kodierung) Eingangsfragen Wann gebe ich virologische Diagnos4k in AuJrag? Welches Material und welche Informa4on sende ich ein? Was geschieht im virologischen Labor? Wie hilJ mir/dem Pa4enten der Befund weiter? Indika4onen: Wann gebe ich virologische Diagnos4k in AuJrag? • Klärung von klinischen Differenzialdiagnosen ‐> Therapie ‐> Hygienemaßnahmen ‐> Diagnoseabschluss ‐> Au]lärung/Prognose • Ausschluss von bes4mmten Virusinfek4on • Rötelninfek4on bei Schwangeren? • Blut eines Spenders potenziell infek4ös? • Klärung der Immunitätslage • Bei Kinderwunsch: Besteht Immunschutz gegen Röteln? • Vor Famulatur: Ist Hepa44s B‐Impfung erforderlich? • Verlauf‐ und Therapiekontrolle • HIV‐Infek4on: Soll Therapie eingeleitet werden?
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VirologischeDiagnos4k
Prof.Dr.Chris4anJassoyIns4tutfürVirologieMedizinischeFakultätUniversitätLeipzig
Labor‐UntersuchungsauJragundBefundmiMeilung
?
Befundbericht(Kodierung)
ProbeplusAuJragsformular
(Kodierung)
Eingangsfragen
WanngebeichvirologischeDiagnos4kinAuJrag?
WelchesMaterialundwelcheInforma4onsendeichein?
WasgeschiehtimvirologischenLabor?
WiehilJmir/demPa4entenderBefundweiter?
Indika4onen:WanngebeichvirologischeDiagnos4kinAuJrag?
• KlärungvonklinischenDifferenzialdiagnosen‐>Therapie ‐>Hygienemaßnahmen ‐>Diagnoseabschluss‐>Au]lärung/Prognose
• Ausschlussvonbes4mmtenVirusinfek4on• Rötelninfek4onbeiSchwangeren?• BluteinesSpenderspotenziellinfek4ös?
• KlärungderImmunitätslage• BeiKinderwunsch:BestehtImmunschutzgegenRöteln?• VorFamulatur:IstHepa44sB‐Impfungerforderlich?
• Verlauf‐undTherapiekontrolle• HIV‐Infek4on:SollTherapieeingeleitetwerden?
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Indika4onen:WanngebeicheherkeinevirologischeDiagnos4kinAuJrag?
‐ banaler,selbstlimi4erenderInfekt(z.B.Atemwege,gastrointes4nal)
‐ Diagnos4khatkeinetherapeu4schenKonsequenzenoderHygienemaßnahmenzurFolge
‐ Kostensindunverhältnismäßighoch
‐ Diagnoseistklinischeindeu4g(Bsp.:Windpocken,Gürtelrose)
häufig:Kombina4onmehrererFaktoren,Einzelfallentscheidungen
ProzesskeMedervirologischenLabordiagnos4k
Präanaly4k
NachOedingetal.inB.Neumeisteretal.MikrobiologischeDiagnos4k,G.ThiemeVerlagStuMgart2009
Analy4k
Postanaly4k
Untersuchungs‐auJrag
Proben‐gewinnung
Transport
Arbeitsplatz‐Listen(Eingangs‐Labor)
Testungen TechnischeValidierung
Zusammen‐führungderErgebnisse
MedizinischeValidierungFreigabe
Befund‐übermiMlung
DervirologischeUntersuchungsauJragUniversitätsklinikum LeipzigInstitut für Virologie gangsdatum Auftragsnumm
Univ.-Prof. Dr. med. U. G. liebertJohannisallee 30, 04103 LeipzigEingangslabor Tel: (0341) 9714 322, FAX 03419714319Befundinterpretation Tel: (0341) 9714 326, E-mail: [email protected]Ärztl. Rufbereitschaft Tel: 01752240471
Antrag auf virologische Untersuchung
PATIENT (ggfs. Etikett mit Barcode) EINSENDER (Stempel und Arztunterschrift)
r
A ;7 stel"1p Jr1 IJ 1t r"chr
Name, Vorname ..
Geburtsdatum .
Anschrift .
Kassen-Nummer .
Versicherten-Nr .
Anforderungs-Nr .
o rivat 0 Ärztl. Wahlleistun FAX f. Befundübermittlung................... f,,, r1er tlkett
Untersuchungsmaterial Entnahme-Datum: 0 Notfallo Serum 0 Liquor 0 EDTA-Blut* 0 Fetal-/Nabelschnurblut 0 Urin 0 Stuhlo BAL 0 Trachealsekret 0 Nasenabstrich 0 Rachenabstrich 0 Abstrich (Lokalisation: )o Biopsie 0 Abklatschpräparat (z.B. Celluloseacetatfolie) 0 Sonstiges ..
Klinische Angaben (unvollständige Angaben verzögern u.U. eine optimale Bearbeitung)Verdachtsdiagnose/aktuelle Symptomatik, Immunsuppression, Gabe von Blutprodukten, Impfungen, Immunglobulinen,
Virustatika, etc .
.............................................................. Nadelstichverletzung: Olndexperson o Exponierte Person
Antikörpernachweis (Untersuchungsmaterial: Serum oder Serum-liquor-Paar)
o HIV 1 & 2 0 Cytomegalievirus (CMV) 0 Influenza AlB-Virus
o Rötelnvirus 0 Herpes-Simplex-Virus (HSV 1 & 2) 0 Parainfluenzavirus (PIV)
OMasernvirus 0 Varizella-Zoster-Virus (VZV) 0 RS-Virus (RSV)
o Mumpsvirus 0 Epstein-Barr-Virus (EBV) 0 Adenovirus (ADV)
o Parvovirus B19 0 HHV-6 (Hum. Herpesvirus Typ 6) 0 Hantavirus
o HTLV 1 & 2 0 HHV-8 (Hum. Herpesvirus Typ 8) 0 Denguevirus Typ 1-4
o Coxsackie-AlB-Viren
o ECHO-Viren
o Poliomyelitisviren
o LCM-Virus
o FSME-Virus
0 .
Erregernachweis
o HIVOMasernvirus
o Mumpsvirus
o Rötelnvirus
o FSME-Virus
oWest-Nil-Virus
o Dengue-Virus
o Rift-Valley-Virus
0 ..
0 ..
0 ..
Nukleinsäurenachweiso HSV 1 & 2 0 Hepatitis A Virus
o CMV 0 Hepatitis B Virus
o VZV 0 Hepatitis C Virus
o EBV 0 Hepatitis D Virus
o HHV-6 0 Hepatitis E Virus
o Parvovirus B19 OlnfluenzavirenA/B
o Papillomviren 0 Parainfluenzavirus
o BK/JC-Virus 0 RS-Virus
o Norovirus 0 Metapneumovirus
o Rotavirus 0 Coronavirus
o Adenovirus 0 Rhinovirus
o Astrovirus 0 Bocavirus
o Sapovirus 0 Enteroviren(Coxsackie-, Echo-, Enterovirus)
Antigennachweiso CMV (pp65/EDTA-Blut*)
o Rotavirus 0 Norovirus(PcR)o Astrovirus 0 SapovirUS(pCR)
o Adenovirus
o Enteroviren
o RS-Virus
o Parainfluenzavirus Typ 1-3
o InfluenzavirenA/Bo HSV 1 & 2
OVZV
o andere: ..o ..0 .
VirusisolationTransport so rasch wie
möglich, gekühlt auf 4° C
Viren bitte angeben:
0 .
0 .
0 .
0 .
0 .
0 .
0 .
0 .
o .0 .
Virushepatitis und Resistenztestso Verdacht akut 0 vor Impfung Hepatitis AlB 0 unter Therapie Welche Virustatika, seit wann? ..o Verdacht chronisch 0 nach Impfung Hepatitis AlB 0 vor Therapie ..o gesichert .
o anti HBc 0 anti-HAV 0 HBV-PCR 0 HIV-Resistenztest 0 sonstiges
o anti-HBs 0 anti-HCV 0 HBV-Genotyp 0 HBV-Resistenztest
o anti-HBe 0 anti-HDV 0 HCV-PCR OCMV-Resistenztest
o HBs-Ag 0 anti-HEV 0 HCV-Genotyp 0 HSV-Resistenztest
o HBe-Ag 0 lnfluenzavirus-Resistenztest
* EDTA-Blut (7-9 ml) muß Innerhalb von 3 h zur Bearbeitung Im Labor sem!
Abgeschlagenheit,Übelkeit,Fieber,Türkeiaufenthaltbisvor10Tagen,V.a.Hepa44sA
Untersuchungs‐auJrag HäufigeUntersuchungsmaterialien
• Blut• Serum• PlasmafürPCR/RT‐PCR
• Nasenspülflüssigkeit,Rachenabstrich• Stuhl• Liquor• Urin• Bläscheninhalt,Biopsie
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Probengewinnung:WelchesMaterialsendeichein?
1.Material,indemmöglicherweiseVirusist:• Atemwegsinfekt:Rachenabstrich,Nasen‐/Rachenspülflüssigkeit,
Endotrachealaspirat,BronchoalveoläreLavage‐Flüssigkeit• Enteri4sundDurchfall:Stuhl• VesikuläreLäsionen:Vesikelflüssigkeit• Hepa44s:Blut• HIV‐Therapieverlaufskontrolle:Blut• ZNS‐Störungen:Liquor,Rachenabstrich• Exanthem:Rachenabstrich• PosMransplanta4onssyndrom:Rachenabstrich,Urin• AngeboreneAnomalie:Rachenabstrich,Urinaußerdem:Biopsien
2.Blut(Serum),Liquor,Speichel:• An4körper‐Bes4mmung
• wennVirusnachweisnichtmöglichodernichtzielführend• fürdieImmunitätslage
Proben‐gewinnung ProbentransportTransport
Op4maleVorbereitungdesLaborauJrags
1. MaterialentsprichtdenAnforderungenandieFragestellung2. KlinischeInforma4onundFragestellungwurdenausreichenddargestellt3. MaterialgelangtingutemZustandinsLabor
?
Befundbericht(Kodierung)
ProbeplusAuJragsformular
(Kodierung)
ZusammenfassungPräanaly4k
Indika4onenfürvirologischeUntersuchungensindmöglicheTherapie‐undHygienemaßnahmen,KlärungderImmunitätslageundTherapiekontrolle
FürVirusuntersuchungenerforderlichsindAuJragsformblaMundProbe
ProbenmaterialzumVirusnachweisstammtvondenbetroffenenOrganen,ausdemBlutundggf.zusätzlichausRachenund/oderUrin
Virus‐An4körpernachweisausBlut(Serum/Plasma),ggf.ausSpeichel,Liquor
KorrekteProbe,rascheProbenzusendungundklareInforma4onensindwich4gfürTestungundprak4schenWertderUntersuchungsergebnisse
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Eingangslabor‐FilmArbeitsplatz‐Listen(Eingangs‐Labor)
Methoden:WieuntersuchtdasLabor?
• Material,indemmöglicherweiseVirusist:• EM• Virus‐Isola4on(Anzüchtung)• Nukleinsäure‐Nachweis(PCR,RT‐PCR)• Virusprotein‐Nachweis(An4gen‐ELISA,IFT,Agglu4na4onstest)• quan4ta4verNukleinsäuretest
• An4körper:• EnzymeImmunoassay(EIA,ELISA)• Immunfluoreszenztest(IFT)• Immunblot(WesternBlot)• Komplementbindungsreak4on(KBR)• Hämagglu4na4ons‐Hemmtest(HAH/HHT)• Neutralisa4onstest
Testungen
Sensi4vitätundSpezifitätvonVirusnachweisverfahren
Nachweismethode Sensi4vität Spezifität
Elektronenmikroskopie (+) +Virusisolierung (+) +++An4gen‐Immunfluoreszenztest + ++An4gen‐ELISA ++ ++Nukleinsäuretest +++ ++
R.BrauninB.Neumeisteretal.,MikrobiologischeDiagnos4kG.ThiemeVerlagStuMgart2009
VirusisolierunganderSicherheitswerkbank
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Virusisolierung:zytopathischerEffekt
HeLa-Zellen Adenovirus
MRC-5-Zellen Herpes-Simplex- Virus 1
Virus‐Proteinnachweis(„An4gen‐Test“):Enzyme‐linkedImmunosorbentAssay,ELISA/
EnzymeImmunoAssay,EIA
An4körper,z.B.gegenInfluenza‐Virus
ProbemitInfluenza‐Virus
2.An4körpergegenInfluenza‐Virus
An4körpergegenAn4körper
Virus‐Nukleinsäurenachweis:Polymerase‐KeMenreak4on
Polymerase‐KeMenreak4on RT‐PCR:Reverse‐Transkrip4onplus Polymerase‐KeMenreak4on
DNA‐AmplifizierungdurchPolymerase‐KeMenreak4on
1.Zyklus 2.Zyklus
Primer1
Virus‐DNA
3.Zyklus
Primer2
Zyklus: 94°C1Minute DNA‐Doppelstrangaurruch(„Mel4ng“) 56°C1Minute AnlagerungderPrimer(„Annealing“) 72°C1Minute DNA‐Synthese
Taq‐Polymerase
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DurchführungundAnalysederPCRKon4nulierlicheDNA‐Amplifikat‐Quan4fizierungwährendderPCRdurchHybridisierungssondenundFluoreszenz‐Resonanz‐
Energie‐Transfer(FRET)‐Messung(„Real‐Time‐PCR“)
Hybridisierung(„Annealing“)
Anregung
DNA‐Elonga4on
λ=470nm
Fluorescein LC‐Red
Detektor
5Nt
Taq‐Pol.
Detektor
Real‐Time‐PCR‐ErgebnisundLightCycler Anwendungderquan4ta4venPCR
VerlaufskontrolleundTherapiemonitoringbeiHIV‐Infek4on
TherapiemonitoringbeiHBV‐undHCV‐Infek4on
AnalysederReak4vierungvonHerpesviren(CMV,EBV,HSV,VZV,HHV‐6)beiImmunsupprimierten
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AussagemöglichkeitenvonVirusnachweisen
‐ zeigtakute/persis4erendeInfek4on
‐ beipersis4erendenViren(Herpesviren)VirusnachweisnurbedingtaussagekräJigBesser:quan4ta4verNachweis
Befund‐übermiMlung ZusammenfassungII
Virusinfek4onenwerdenimLabordurchVirus‐oderAn4körpernachweisuntersucht
DerdirekteVirusnachweisgeschiehtüberdieUntersuchungvonProteinen(An4genen),Nukleinsäuren(DNA,RNA)unddieInfek4osität(Virusisolierung)
DerNukleinsäurenachweisistdiesensi4vsteVirusnachweismethode
Quan4ta4veVirusnachweisverfahrendienenderDiagnos4kvonReak4vierungenpersis4erenderVirenundderVerlaufskontrollechronischerInfek4onen
An4körper‐TestsTestungen
aus
‐Blut/Serum‐ Speichel(z.B.RSV,HIV)‐ Liquor(neurologischeErkrankungen)
Qualita4verundquan4ta4verAn4körpertest
• Qualita4v:posi4vodernega4v• Beispiele:HIV‐TestIgM‐Tests
• Quan4ta4v:An4körper‐Titer,An4körper‐Einheiten• Beispiele:Hämagglu4na4onstestfürRötelnImmunitätsstatusnachHepa44s‐B‐Impfung
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Sensi4vitätundSpezifitätvonAn4körpernachweisen
Nachweismethode Sensi4vität Spezifität
An4körper‐ELISA +++(<1ng/ml) ++/+++Immunblot ++ +++IndirekterImmunfluoreszenztest ++ ++Komplementbindungsreak4on +(1µg/ml) +Hämagglu4ona4onshemmtest +(15‐30µg/ml) +++Neutralisa4onstest +(µg/ml‐Bereich) +++Agglu4na4on (+)(1mg/ml)
NachR.BrauninB.Neumeisteretal.,MikrobiologischeDiagnos4k,G.ThiemeVerlagStuMgart2009undMurrayetal.ManualofClinicalMicrobiology,9.Aufl.ASMPressWashingtonD.C.,2007
An4körper‐Nachweisverfahren:ELISA
An4gen
Probe,z.B.Serum
2.An4körpermitEnzym
ELISA‐Automat
IndirekterAn4körpernachweis Sandwich‐ELISAzumAn4gen‐Nachweis
Ag Ag
HRPHRP
HRPHRP
AgAg
HRPHRP
ArtendesAn4körper‐undAn4gen‐Nachweises
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An4körper‐Nachweisverfahren:Immunblot Immunblot‐Film
BreitederHIV‐An4körperantwort(Immunblot)
z
An4körper‐Nachweisverfahren:Hämagglu4na4ons‐Hemmtest
Erythrozyten+Virus
Erythrozyten+Virus+An4körper
www.aht.org.uk
Serum1Serum2
Sedimenta4on Agglu4na4on
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An4körper‐Nachweisverfahren:Immunfluoreszenztest
AgAg Ag AgAg
FITCFITC FITC
FITC
FITCFITC
SerummitAn4körpern
An4‐Human‐An4körper(2.Ak)
Immunfluoreszenztest‐Film
1.Serum
2.An4körper
3.Mikroskopie
Immunfluoreszenztest‐Ergebnis ZusammenfassungIII
ELISA,Immunblot,IFTundseltenerHAHundNeutralisa4onstestwerdenzumNachweisundzurQuan4fizierungderAn4körperantworteingesetzt
Neutralisa4ons‐undmitEinschränkungauchHämagglu4na4onstestmessenneutralisierendeAn4körper
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AussagemöglichkeitenserologischerTests
‐ akuteoderzurückliegendeInfek4on,wennIgGposi4v
‐akuteInfek4on,wennIgMposi4v,An4körper‐Aviditätniedrig
Befund‐übermiMlung
UnterscheidungakuterErkrankungenvonfrüherenInfektendurchserologischeTests
• IgG‐Titerans4eg(4‐fach):Kontrollserumnach1‐2Wochen
• IgM‐Nachweis
• An4körper(IgG)‐Aviditätsbes4mmung(Röteln,CMV,Toxoplasma)
Konzentra4ondesAn4gen‐spezifischenIgMundIgGnachInfek4onimSerum
t
cc
Infek4on
IgMIgG
Diagnos4scheLücke
Aviditätsbes4mmung
www.euroimmun.com
Bes4mmungdesAn4körper‐TitersohneundmitWaschenderELISA‐PlaMemitHarnstoff
Affinität
Avidität
AviditätistdieGesamtheitderAffinitätenbeibi‐oderpolyvalentenBindungen
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Quan4ta4veMaßefürAn4körper
• Titer:WertoderreziprokerWertderAn4körper‐Verdünnung,beidergeradenocheinMesssignalnachweisbarist.AbhängigvonTestsensi4vität
• Grenz4ter:Wert,beidemdieAn4körperkonzenta4onineinerProbeSignifikanzerreicht
• TestspezifischeEinheit:Rela4vesMaßfürAn4körperkonzentra4onimVergleichmitStandard‐Reagenz.Maßeinheit:Einheiten(Units)/ml
An4körper‐Titer
WertoderreziprokerWertderAn4körper‐Verdünnung,beidergeradenocheinMesssignalnachweisbarist.AbhängigvonTestsensi4vität
Ak(µg/ml)
Verdünnung
Nachweisgrenze
Titer
101 102 103 104 105
Nachweisgrenze
Titer
HIV‐spezifischeAn4körper4terimSerum(ELISA)beiInfizierten
Grenz4ter
Wert,beidemdieAn4körperkonzenta4onineinerProbeSignifikanzerreicht
Signal
Grenz4ter(x+3σ)
Nega4veProben1 2 3 4 5
x
Messproben1 2 3 4 5 6
posi4v
nega4v
grenzwer4g
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TestspezifischeEinheiten
Rela4vesMaßfürAn4körperkonzentra4onimVergleichmitStandard‐ReagenzMaßeinheit:Interna4onaleEinheiten(I.E.)/Interna4onalUnits(IU)/ml
Signal(O
D45
0)
Messproben
1 2 3 4
Signal(O
D45
0)
Standardproben
15 40 75 1500 mI.E./ml
Standardkurve
18 70
Diagnos4scheHerausforderungbeiAn4körpertests:Kreuzreak4vität
Kreuzreak4vitätistdieBindungvonAn4körpernanProteinevonverwandtenViren
BeispielefürKreuzreak4vitätinangewandtenTests
‐MumpsvirusundParainfluenzaviren
‐DenguevirusundandereFlaviviren(West‐Nil‐Virus,Gelbfiebervirus)
Diagnos4scheHerausforderungbeiAn4körpertests:Falschposi4veundfalschnega4veResultate
Falschposi4v:Testistposi4v,Pa4enthatkeineakuteInfek4onoderImmunität
Ursachen:Kreuzreak4vität,anderetestspezifischeLimita4onenKonsequenzen:‐Testwiederholung,Bestä4gungstestmithöhererSpezifität
‐auch:keineRöteln‐IgM‐UntersuchungzurImmunitätsbes4mmung inSchwangerschaJ
Falschnega4v:Testistnega4v,Pa4enthatjedochakuteInfek4onoderImmunität
Ursachen:‐ niedrigeAn4körperkonzentra4on/diagnos4schesFenster‐ testspezifischeLimita4onenKonsequenzen:‐2.TestungmitspätererProbe
‐ggf.Virusnachweis(HIV,HCV)
BefundübermiMlung
Virusnachweise:qualita4vundAngabedesNachweisverfahrens,z.B.
‐ HSV‐PCR posi4v‐ Influenza‐A‐An4gennachweis nega4v‐ Virusisolierung Mumpsvirus
Serologie:qualita4vundquan4ta4v(TiterundEinheiten)undggf.AngabedesTestverfahrensz.B.
Hepa44sC‐Virus‐An4körper(EIA) nega4v
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Befundbericht ZusammenfassungIII
FürdenserologischenNachweiseinerakutenInfek4onwerdenIgM‐oderAn4körper‐Aviditätsbes4mmungdurchgeführt
Diediagnos4scheLückeistderZeitraumzwischenInfek4onundfrühestemAk‐Nachweis
DerAn4körper4teristeinMaßfürdieProbenverdünnung,beidernocheinposi4vesSignalauJriM.ErhängtaußervonderProbevomTestverfahrenab
BeiAnalysedertestspezifischenEinheitenwirdmiteinemReferenzserumverglichen
Kreuzreak4vitätenvonAn4körpernmitverwandtenVirensindmöglichunderfordernbesonderediagnos4scheAufmerksamkeit
