Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik I
der Universität Würzburg
Direktor: Prof. Dr. med. G. Ertl
Hämodynamische Auswirkungen synthetischer, pflanzlicher und endogener Cannabinoide im Modell
der isolierten Kaninchenlunge
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Jürgen Wolf
aus Obersulm
Würzburg, Oktober 2005
Referent: Priv.-Doz. Dr. J. Wagner
Koreferent: Prof. Dr. O. Elert
Dekan: Prof. Dr. G. Ertl
Tag der mündlichen Prüfung: 29. November 2005
Der Promovend ist Arzt
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung .......................................................................................................................... 1 1.1 Die Entdeckung eines Endocannabinoidsystems............................................................... 1 1.2 Kardiovaskuläre Wirkungen von Cannabinoiden............................................................ 4 1.3 Pulmonale Wirkungen von Cannabinoiden ...................................................................... 8 1.4 Zielsetzung der Arbeit ......................................................................................................... 9
2 Material und Methoden................................................................................................... 11 2.1 Modell der isolierten, perfundierten und ventilierten Kaninchenlunge ....................... 11
2.1.1 Versuchsaufbau ............................................................................................................................. 11 2.1.2 Versuchsvorbereitung.................................................................................................................... 14 2.1.3 Präparation .................................................................................................................................... 14 2.1.4 Kalibrier- und Aufwärmphase....................................................................................................... 17 2.1.5 Steady-State-Phase........................................................................................................................ 17
2.2 Messgrößen und Messtechnik........................................................................................... 17 2.2.1 Messung der pulmonalarteriellen und pulmonalvenösen Perfusionsdrücke (PAP,LAP) .............. 18 2.2.2 Bestimmung des pulmonalkapillären Druckes (PCP) ................................................................... 18 2.2.3 Bestimmung der Gefäßwiderstände (Ra, Rv) ................................................................................. 18 2.2.4 Bestimmung des kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c)............................................................ 19 2.2.5 Bestimmung der Compliance ........................................................................................................ 22 2.2.6 Bestimmung der Retention (∆W).................................................................................................. 22
2.3 Versuchsdurchführung...................................................................................................... 22 2.3.1 Versuchsablauf und Stimulation ................................................................................................... 22
2.4 Biochemische Analytik ...................................................................................................... 23 2.4.1 Bestimmung der Konzentrationen von Anandamid und 2-AG mittels Flüssigkeits-
chromatographie / Massenspektrometrie (LC/MS) ....................................................................... 23 2.5 Substanzen .......................................................................................................................... 24 2.6 Statistische Auswertung .................................................................................................... 25
3 Ergebnisse........................................................................................................................ 26 3.1 Pulmonalarterieller Druck................................................................................................ 26 3.2 Pulmonalkapillärer Druck und Verteilung der pulmonalen Gefäßwiderstände ......... 31 3.3 Gefäßpermeabilität und Compliance ............................................................................... 35 3.4 Endocannabinoidgehalt der Lunge .................................................................................. 35
4 Diskussion........................................................................................................................ 36
5 Zusammenfassung........................................................................................................... 42
6 Literatur ........................................................................................................................... 43
7 Publikationen und Vorträge zur vorliegenden Promotion ............................................ 54
Danksagung............................................................................................................................. 55
Lebenslauf ............................................................................................................................... 57
I
1. Einleitung
1 Einleitung Die Marihuana-Pflanze, Cannabis sativa, ist der Menschheit seit Jahrtausenden als
Arzneipflanze bekannt. Bereits in der Arabischen Medizin des Mittelalters sind viele
ihrer heute bekannten therapeutischen Indikationen sowie ihr Missbrauch als Droge
beschrieben [1,2].
1.1 Die Entdeckung eines Endocannabinoidsystems
Die Entdeckung der Strukturformel des ∆ 9-Tetrahydrocannabinol (∆ 9-THC), dem
psychoaktiven Hauptwirkstoff der Marihuana-Pflanze, im Jahre 1964 [3] ermöglichte
erstmals eine differenzierte Erforschung der Wirkung von Cannabis.
Abbildung 1: Chemische Struktur von ∆ 9-THC, Abbildung aus [4]
Zwei Jahre nachdem experimentelle Hinweise die Existenz eines Cannabinoid-
rezeptors vermuten ließen [5], gelang es im Jahr 1990 den CB1-Rezeptor zu
identifizieren. 1993 folgte die Entdeckung des CB2-Rezepors [6].
Während der CB2-Rezeptor fast ausschließlich von immunkompetenten Zellen
gebildet wird [6], findet sich der CB1-Rezeptor vor allem im Gehirn [7] und in
zahlreichen peripheren Geweben [8].
1992 wurde man bei der Suche nach einem körpereigenen Liganden des
Cannabinoidrezeptors fündig. Aus Schweinehirnen gelang damals die Isolierung des
Arachidonsäurederivats Arachidonylethanolamid (Anandamid) [9]. Dabei handelt es
sich, wie aufgrund der Fettlöslichkeit pflanzlicher Cannabinoide bereits vermutet
wurde, um ein Lipid.
1
1. Einleitung
Abbildung 2: Chemische Struktur von Arachidonylethanolamid (Anandamid), Abbildung aus [4]
Wenig später wurde ein zweites Endocannabinoid, das 2-Arachidonylglycerol (2-AG)
entdeckt [10]. Anandamid und 2-AG sind die beiden bekanntesten und biologisch
relevantesten Endocannabinoide.
Abbildung 3: Chemische Struktur von 2-Arachidonylglycerol (2-AG), Abbildung aus [4]
Die Einführung von Cannabinoidrezeptor-Knockout-Mäusen [11,12], die Synthese
von spezifischen Cannabinoidrezeptoragonisten und –antagonisten [13] sowie
Inhibitoren des Endocannabinoidabbaus [14], hat in den letzten Jahren geholfen,
Wissen über die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Endo-
cannabinoide zu gewinnen.
Man weiß heute, dass endogene Cannabinoide – neben ihrer kardiovaskulären
Funktion, auf die noch im Detail eingegangen werden soll – Funktionen in unserem
Nervensystem haben, wo sie zum Beispiel Schmerz und Spastik beeinflussen
können [4]. Außerdem interagieren sie mit unserem Immunsystem, haben Einfluss
auf grundlegende Zellfunktionen wie zum Beispiel Zellproliferation [15] und
Embryonalentwicklung [16] und beeinflussen die Appetitregulation [17]. Daher
überrascht es auch nicht, dass in verschiedensten Fachbereichen die therapeutische
Nutzung von Cannabinoiden in Erwägung gezogen wird. Seit 1998 kann in
Deutschland Dronabinol, das natürlich vorkommende (-)-trans-Isomer des ∆ 9-THC,
auf Betäubungsmittelrezept verschrieben werden. In Amerika ist Dronabinol unter
dem Markennamen Marinol® erhältlich und auf zwei Indikationen beschränkt:
Gewichtsverlust bei Aids-Patienten in Folge von Appetitlosigkeit sowie Übelkeit und
2
1. Einleitung
Erbrechen infolge einer Chemotherapie bei Krebserkrankung. Das deutsche Gesetz
sieht eine derartige Beschränkung nicht vor.
Mit Rimonabant®, dem CB1-Rezeptorantagonisten SR141716A, befindet sich ein
weiteres Medikament in der klinischen Phase III Studie und soll noch im Verlauf des
Jahres 2005 auf den Markt kommen [18]. Indikationen für Rimonabant® sind die
Gewichtsreduktion bei Patienten mit metabolischem Syndrom [17] und die
Unterstützung der Abstinenz bei Rauchern [19].
Neben seiner aktivierenden Wirkung auf CB1- und CB2- Cannabinoidrezeptoren [20]
stimuliert Anandamid noch spezifische Anandamidrezeptoren [21,22] und VR1-
Vanilloidrezeptoren [23]. Außerdem gelang es in den letzten Jahren mit Noladinäther,
Virodhamine (O-Arachidonoylethanolamine) und N-archidonoyldopamine (NADA)
weitere endogene Cannabinoide zu identifizieren [24].
Anandamid entsteht aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe, dem N-
Arachidonyl-Phosphatidyl-Ethanolamid, das der Phospholipase D als Substrat dient
und unter Abspaltung von phosphoriger Säure zu Anandamid abgebaut wird [25]. 2-
AG ist ein Arachidonsäureester und entsteht in einem ähnlichen Mechanismus wie
Anandamid aus anderen Fettsäurevorstufen [26].
N-Arachidonyl-Phosphatidyl-Ethanolamid
Arachidonylethanolamid (Anandamid)
Phosphorsäure
Abbildung 4: Synthese von Anandamid aus einer membrangebundenen Vorläuferstufe, modifiziert nach [25]
3
1. Einleitung
Anandamid wird durch das Enzym Anandamid-Amidohydrolase, auch Fettsäuren-
Amidohydrolase (FAAH) genannt, zu Arachidonsäure und Ethanolamid hydrolysiert
[25,27]. 2-AG kann durch dieselbe Fettsäuren-Amidohydrolase (FAAH) wie
Anandamid zu Arachidonsäure und Glycerol hydrolysiert werden [28]. Wahrscheinlich
ist das Hauptenzym für den Abbau von 2-AG jedoch eine Monoacylglycerol-Lipase
(MGL), wie durch die Blockade des Enzyms mit einen spezifischen Inhibitor gezeigt
werden konnte [29,30]. Für Anandamid ist zusätzlich noch ein in Neuronen [31] und
Makrophagen [32,33] lokalisierter Transportmechanismus beschrieben, der
Anandamid durch selektive Aufnahme in die Zelle inaktivieren kann.
In den letzten Jahren wurde eine weitere Möglichkeit des Abbaus von Anandamid
und 2-AG entdeckt. Beide Endocannabinoide können der Cyclooxygenase-2 als
Substrat dienen [34,35]. Es entstehen dabei für Anandamid Prostacyclin- und
Prostaglandinethanolamide (Prostamide) und für 2-AG Prostacyclin- und
Prostaglandinglycerylester. Diese neuen Lipide sind eng verwandt mit den
bekannten, aus freier Arachidonsäure entstehenden Prostaglandinen und
Prostacyclinen. Im Falle von Anandamid sind die Hauptprodukte aus diesem
Abbauweg das unstabile PGH2–Ethanolamid, das nichtenzymatisch zu hauptsächlich
PGE2-Ethanolamid und in geringerem Ausmaß zu PGD2 -Ethanolamid isomerisiert
[36].
1.2 Kardiovaskuläre Wirkungen von Cannabinoiden
Cannabinoide zeigen vielfältige kardiovaskuläre Wirkungen. Eine sehr häufig
gesehene Reaktion auf Cannabinoide ist die Erweiterung von Gefäßen. Dies konnte
für viele Organsysteme mit verschiedensten experimentellen Ansätzen gezeigt
werden. Beim genaueren Betrachten verbirgt sich dahinter ein recht komplexes
System, mit unterschiedlichsten Wirkmechanismen, auf das im folgenden Abschnitt
kurz eingegangen werden soll.
Bereits in den 70er Jahren wurde die Wirkung der Kulturdroge ∆9-THC auf Blutdruck
und Herzfrequenz untersucht. Beim Menschen zeigt sich als akuter Effekt eine
Tachykardie ohne signifikante Veränderung des Blutdrucks [37]. Der Langzeitkonsum
beim Menschen hingegen, sowie die akute und chronische Verabreichung bei
Versuchstieren führt zu einem lang anhaltenden Blutdruckabfall und zu Bradykardie
[38].
Verabreicht man narkotisierten Ratten oder Mäusen Anandamid intravenös als Bolus,
so kann man eine reproduzierbare, triphasische Reaktion beobachten. Zunächst
4
1. Einleitung
kommt es zu einer wenige Sekunden dauernden, durch den Vagusnerven
vermittelten Bradykardie, die sekundär einen Blutdruckabfall bewirkt. Darauf folgt ein
kurzdauernder Blutdruckanstieg, der aber weder sympathisch, noch durch CB1-
Rezeptor-Aktivierung vermittelt wird und dessen Ursache letztlich noch nicht geklärt
ist. Anschließend folgt eine 5-10 min andauernde Phase von Hypotonie und milder
Bradykardie, die durch den CB1-Rezeptor vermittelt wird und durch den CB1-
Rezeptorantagonist SR 141716A geblockt werden kann [39]. Die Hypotonie nach
intravenöser Gabe von Anandamid wird sowohl durch Blockade von α-Rezeptoren,
als auch durch Rückenmarksdurchtrennung (in Höhe HWK 2) und der damit
verbundenen Ausschaltung des Sympathikus verhindert [39]. Sie findet sich
hingegen kaum in nichtnarkotisierten, ungestörten Ratten, bei denen
bekanntermaßen der Sympathikotonus niedrig ist [40]. Anandamid scheint also einen
sympathikolytischen Effekt zu haben. Im Einklang dazu zeigen einzelne ältere
Arbeiten, dass ∆9-THC durch eine zentral vermittelte Hemmung des Sympathikus
den Blutdruck senken kann [41]. Inzwischen mehren sich die experimentellen
Hinweise, dass dieser sympathikusreduzierende Effekt von Anandamid nicht
zentralen Ursprungs, sondern peripher lokalisiert ist: durch die Aktivierung von
Cannabinoidrezeptoren auf präsynaptischen, postganglionären Nervenendigungen
wird die Ausschüttung von Noradrenalin gehemmt [8,42].
Eine Blutdruckerniedrigung kann durch Verminderung des Gefäßwiderstands oder
des Herzminutenvolumens, oder aus einer Kombination beider Mechanismen erreicht
werden. Eliminiert man den sympathischen Tonus durch einen Ganglien-Blocker und
hebt anschließend den Blutdruck durch Vasopressin über reine Vasokonstriktion,
bleibt die stark blutdrucksenkende Wirkung des potenten synthetischen
Cannabinoids HU-210 erhalten, obwohl die Bradykardie nun fehlt [43]. Man vermutet
daher, dass Cannabinoide durch Hemmung des kardialen Sympathikotonus die
Herzfrequenz senken können, sie ihre blutdrucksenkende Wirkung jedoch durch
direkte Gefäßerweiterung entfalten. Bestätigt wurde dies durch Versuche, in denen
chemisch der Sympathikus von Ratten zerstört wurde [44]. Auch zeigte sich, dass
das Ausmaß der Blutdrucksenkung – bereits nanomolare Gaben von HU-210 senken
den mittleren arteriellen Blutdruck in narkotisierten Ratten über Stunden hinweg um
mehr als 80 mm Hg – weit über die durch α-Rezeptorblockade oder Rückenmarks-
durchtrennung erreichbaren Werte hinausgeht [45]. Erstaunlicherweise überstehen
die Tiere diese massive Hypotonie unbeschadet, was an mögliche protektive
5
1. Einleitung
Eigenschaften von Endocannabinoiden bei akutem Kreislaufversagen, das mit stark
erniedrigtem Blutdruck einhergeht, denken lässt.
Viele Untersuchungen zeigen, dass die Hypotonie nach Cannabinoidgabe durch
CB1-Rezeptoren vermittelt wird. Sie kann durch vorherige Gabe des CB1-
Antagonisten SR141716A verhindert werden [39,45]. Außerdem kann in CB1-
Rezeptor-Knockout-Mäusen durch Cannabinoidgabe keine Hypotonie ausgelöst
werden [46].
Der selektive CB1-Rezeptorantagonist SR141716A alleine verändert den Blutdruck
jedoch nicht. Dies legt nahe, dass unter physiologischen Ruhebedingungen
Cannabinoide wenig zum Gefäßtonus beitragen [47].
Völlig anders stellt sich die Situation im experimentellen Blutungsschock der Ratte
dar. Hier konnte gezeigt werden, dass der CB1-Rezeptorantagonist SR141716A
dosisabhängig und deutlich den Blutdruck erhöht. Im Blutungsschock kommt es
durch die Minderperfusion der Organe zur Endocannbinoidaktivierung. Makrophagen
synthetisieren vermehrt Anandamid, welches im Schock über periphere CB1-
Rezeptoren hypotensiv wirkt [47].
Ähnliches gilt für den Endotoxinschock, der durch Lipopolysaccharide,
– Zellbestandteile gramnegativer Bakterien – ausgelöst wird und ein folgenschweres
klinisches Problem mit hohen Mortalitätsraten um 50 % bei Patienten mit schwerer
Sepsis darstellt. Im experimentellen, durch Lipopolysaccharid-Infusion ausgelösten,
septischen Schock der Ratte synthetisieren Thrombozyten vermehrt das
Endocannabinoid 2-Arachidonylglycerol (2-AG) und Makrophagen Anandamid. Beide
Endocannabinoide tragen zur Hypotonie im septischen Schock bei [48]. Inzwischen
konnten auch bei Patienten im Endotoxinschock erhöhte Serumspiegel von
Anandamid und 2-AG nachgewiesen werden [49].
Sowohl im hämorrhagischen als auch im durch experimentelle Ligatur der linken
Herzkranzarterie bei Ratten induzierten kardiogenen Schock verkürzt die
Antagonisierung der Endocannabinoideffekte das Überleben, obwohl der Blutdruck
angehoben wird. Im kardiogenen Schock entwickelte sich rasch eine endotheliale
Dysfunktion, die durch SR141716A noch verstärkt wird [50]. Vermutlich üben
Endocannabinoide in der Schocksituation durch Gefäßerweiterung der Hirn- und
Herzkranzarterien eine wichtige biologische Schutzfunktion aus [43].
Neben der direkten Aktivierung von CB1-Rezeptoren, wie es zum Beispiel für glatte
Gefäßmuskelzellen von Hirnarterien der Ratte gezeigt ist [51], gibt es eine Reihe
6
1. Einleitung
weiterer Regulationsmechanismen. Die durch Anandamid an Ringpräparationen der
Herzkranzarterie des Schafes verursachte Gefäßerweiterung konnte sowohl durch
den Cyclooxygenaseinhibitor Indomethacin, als auch durch den Fettsäure-Amido-
hydrolaseinhibitor Phenylmethyl-Sulfonyl-Fluorid (PMSF) deutlich abgeschwächt
werden. Die Blockade des CB1-Rezeptors durch SR 141716A zeigte keinen Effekt. In
diesem Fall scheint der Effekt also durch ein Produkt der Cyclooxygenase, einem
vasoaktiven Prostanoid verursacht zu sein [52].
Wie dieses Beispiel ferner zeigt, ist die Beurteilung kardiovaskulärer Effekte von
Endocannabinoiden durch eine Varianz, abhängig von der verwendeten Tierspezies,
erschwert. Im Gegensatz zu den beschriebenen Befunden an Ringpräparationen von
Herzkranzarterien des Schafes beschreiben verschiedene Arbeitsgruppen für
Herzkranzarterien der Ratte eine rezeptorabhängige und durch SR 141716A
hemmbare Vasodilatation [43,53].
Zwar verursachen Cannabinoide in fast allen vaskulären Stromgebieten
Vasodilatation, jedoch ist auch vereinzelt Vasokonstriktion zu beobachten. In
anästhesierten Ratten konnte unter Verwendung radioaktiv markierter Mikrosphären
in Hirn-, Herz- und Nierengefäßen eine Verringerung des vaskulären Widerstandes
gezeigt werden, während sich der vaskuläre Widerstand der Milz erhöhte [43].
Ein indirekter Mechanismus, Gefäße zu erweitern ist die Aktivierung von Vanilloid-
rezeptoren. Vanilloide wie Olvanil oder Capsaicin ähneln Anandamid strukturell. In
Gefäßen unterschiedlicher Tierarten konnte gezeigt werden, dass Anandamid
endothelunabhängig durch VR1-Rezeptor-Aktivierung Vasodilatation vermittelt.
Cannabinoide mit einer von Anandamid abweichenden Struktur, wie das
synthetische HU-210 oder das endogene 2-AG, zeigen diesen Effekt nicht.
Anandamid bindet an VR1-Rezeptoren perivaskulärer, sensibler Nerven und setzt
dadurch das Calcitoningen-verwandte Peptide (CGRP) frei, welches für die
Relaxation verantwortlich ist [23]. Wie inzwischen an TRPV1-Rezeptor-Knockout-
mäusen – die keine VR1-Rezeptoren besitzen – gezeigt werden konnte, spielt der
VR1-Rezeptor bei der Blutdruckantwort nach Anandamidgabe im Vergleich zum CB1-
Rezeptor jedoch eine untergeordnete Rolle [54].
Stickstoffmonoxid (NO) hat bei der physiologischen Regulation der Gefäßweite eine
große Bedeutung. In der Nierenarterie der Ratte verursacht Anandamid durch
endotheliale Freisetzung von NO Vasodilatation. Sowohl durch den CB1-Rezeptor-
7
1. Einleitung
antagonisten SR141716A als auch durch den NO-Synthase-Inhibitor L-NAME wurde
der Effekt gehemmt [55].
Neben den klassischen Cannabinoidrezeptoren scheint es weitere Rezeptoren zu
geben, an denen Endocannabinoide ihre Wirkungen entfalten. So konnte zumindest
funktionell durch Arbeiten mit CB1/CB2-Doppelknockout-Mäusen ein endothel-
ständiger „Anandamidrezeptor“ in der Mesenterialarterie der Ratte identifiziert
werden, der dort nach Anandamidgabe Vasodilatation vermittelt. Dieser
Anandamidrezeptor wird durch Anandamid, R-Methanandamid und „Abnormal
Cannabidiol“, einem synthetischen Cannabidiol-Analogon ohne psychoaktive
Wirkung aktiviert und durch SR 141617A und dem Cannabidiol-Analogon O-1918
gehemmt [22]. Bestätigt wird dieser Anandamidrezeptor auch durch Untersuchungen
an der Kaninchenaorta, wo ebenfalls eine endothelabhängige, SR 141716A sensitive
Vasodilatation gezeigt werden konnte [56]. Allerdings ist dieser Rezeptor noch nicht
geklont.
Auch andere Arbeitsgruppen vermuten weitere Cannabinoidrezeptoren [53,57].
Allerdings ist noch unklar, ob diese zusätzlichen Rezeptoren tatsächlich
eigenständige Cannabinoidrezeptoren sind. Möglicherweise besitzen Cannabinoide,
analog der Wirkung von Anandamid am Vanilloidrezeptor, auch nur Struktur-
ähnlichkeiten mit den eigentlichen Agonisten dieser Rezeptoren und haben daher die
Fähigkeit an sie zu binden.
1.3 Pulmonale Wirkungen von Cannabinoiden
Im Vergleich zu den kardiovaskulären Effekten der Endocannabinoide ist über ihre
pulmonalen Effekte weit weniger bekannt. Hierbei konzentrierte sich die Forschung
auf die Atemwege und weniger auf die Lungengefäße.
Von ∆ 9-THC weiß man, dass es beim Menschen bronchialerweiternd wirkt [58,59].
Merkwürdigerweise zeigen manche Asthmatiker aber Bronchospasmen nach ∆ 9-
THC Gabe [60,61]. Anandamid scheint bei der intrinsischen Kontrolle der
Atemwegsregulation eine Rolle zu spielen. Dabei führt es, wie an Ratten und
Meerschweinchen gezeigt werden konnte, zu gegensinnigen Effekten. Einerseits
verhindert Anandamid das Auftreten von Husten und Bronchienverengung nach
Provokation durch den Reizstoff Capsaicin, andererseits verursacht es
Bronchienverengung wenn der verengende Einfluss des Vagusnerven ausgeschaltet
ist [62]. Möglicherweise hängt die Reaktionsweise – Bronchodilatation oder
-konstriktion – vom Kontraktionszustand der Bronchialmuskulatur ab. Sowohl
8
1. Einleitung
Bronchienverengung als auch Bronchienerweiterung waren CB1-Rezeptor vermittelt,
während die Blockade des VR1-Vanilloidrezeptors keinen Effekt hatte. In dieser
Studie konnte auch gezeigt werden, dass Anandamid in Ratten und
Meerschweinchenlungen durch einen Ca2+-ionenabhängigen Mechanismus
synthetisiert wird [62]. Auch 2-AG kommt in Rattenlungen vor, wobei die
physiologische Bedeutung von 2-AG in der Lunge bisher nicht bekannt ist [63].
Im Widerspruch dazu zeigen Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe keinen
antiobstruktiven Effekt von Anandamid in Meerschweinchenlungen, in denen zuvor
durch Calcimycinexposition ein Bronchospasmus verursacht wurde. Jedoch vermag
Anandamid die Verletzung des Atemwegsepithels zu begrenzen und die
Einwanderung von Leukozyten zu reduzieren [64].
Ob und wie Endocannabinoide auf die pulmonalen Gefäße wirken ist bisher nicht
beschrieben. In zwei Studien aus den 70er Jahren wurde die Wirkung von ∆ 9-THC
auf die Lungenstrombahn untersucht. Bei narkotisierten Hunden konnte nach
intravenöser Gabe von ∆ 9-THC ein signifikanter Anstieg des Lungenwiderstandes
festgestellt werden, der durch beidseitige Vagotomie praktisch gänzlich verhindert
wurde und auf einen vagalen Reflexmechanismus zurückgeführt wurde [65]. Eine
zweite Arbeit zeigt nach Injektion von ∆ 9-THC einen dosisabhängigen Anstieg des
Perfusionsdrucks in der isolierten Meerschweinchenlunge. Dieser Effekt wurde durch
vorherige Gabe von Aspirin verhindert und von den Autoren durch die Freisetzung
„prostaglandinartiger Substanzen“ erklärt [66]. Lange vor Entdeckung der
Cannabinoidrezeptoren, sind diese beiden Studien durch fehlende pharma-
kologische Möglichkeiten, cannabinoidezeptorvermittelte Mechanismen aufzu-
decken, erschwert.
1.4 Zielsetzung der Arbeit
Die pulmonale Hypertonie ist eine Erkrankung mit deutlich eingeschränkter
Lebenserwartung und begrenzter Therapiemöglichkeit. Neben Calciumkanal-
antagonisten kommen Thromboxanantagonisten, Prostacyclinanaloga, Endothelin-
rezeptorantagonisten oder der Phosphodiesteraseinhibitor Sildenafil (Viagra®) zum
Einsatz [67]. Leider versagen die zur Verfügung stehenden Therapiemöglichkeiten
bei einem erheblichen Anteil der Patienten und der Einfluss auf die Sterblichkeit ist
nach wie vor unklar [68].
Nachdem Cannabinoide im systemischen Kreislauf hauptsächlich vasodilatierend
wirken [43], haben wir versucht, ihren Einfluss auf die Lungenstrombahn zu
9
1. Einleitung
charakterisieren. Wir wollten sehen, ob Cannabinoide auch in der Lunge
vasodilatierend wirken und damit als neue Substanzklasse zur Behandlung des
Lungenhochdrucks denkbar wären. Diese Arbeit setzte sich deshalb mit dem
biologischen Effekt verschiedener endogener, pflanzlicher und synthetischer
Cannabinoide auf den pulmonalarteriellen Druck in einem isolierten Lungenmodell
auseinander. Außerdem sollte geprüft werden, ob biologisch relevante Endo-
cannabinoidspiegel im Lungengewebe vorhanden sind und damit ein
endocannabinoid-vermitteltes Regulationssystem des pulmonalarteriellen Druckes
bestehen könnte.
10
2. Material und Methoden
2 Material und Methoden 2.1 Modell der isolierten, perfundierten und ventilierten Kaninchenlunge
Das verwendete Organmodell wurde bereits 1912 von Knowlton und Starling
beschrieben [69] und kommt in modifizierter Form seit 1996 an der Medizinischen
Universitätsklinik Würzburg in der Arbeitsgruppe von Dr. H. Wahn zur Anwendung.
2.1.1 Versuchsaufbau
Die Lungen wurden beim verwendeten Versuchsaufbau in einem geschlossenen
Kreislaufsystem kontinuierlich mit Hilfe einer Peristaltikpumpe (Gambro PP10-1a)
volumenkonstant perfundiert. Dazu wurde ein PVC-freies Schlauchsystem (Tygon®,
Norton, Akron USA) verwendet. Im Perfusionskreislauf konnte man das verwendete
Perfusionsmedium aus zwei parallel geschalteten doppelwandigen Vorratsbehältern
aus Glas (400 ml; Glasgerätebau Ochs, 37120 Bovenden) entweder in den Kreislauf
einspeisen oder über einen Ablauf verwerfen. Den beiden Vorratsbehältern
vorgeschaltet war eine Verteilerbank (B. Braun, 34209 Melsungen) über die der
venöse Abfluss und die Befüllung mit frischer Perfusionslösung gesteuert werden
konnte. Weitere an die Verteilerbank angeschlossene Dreiwegehähne (B. Braun,
34209 Melsungen) ermöglichten die Entnahme von Perfusatproben. Zwischen der
Peristaltikpumpe und dem isolierten Organ befand sich, zum Schutz der Lunge vor
Embolien, ein Transfusionsfilter (40 µm SQ 40SE; Pall Biomedizin GmbH, 63303
Dreieich) und eine Blasenfalle. Das Perfusat wurde der Lunge über einen in der A.
pulmonalis platzierten Katheter zugeleitet. Der venöse Abfluss wurde über einen im
linken Ventrikel platzierten zweiten Katheter ermöglicht und über ein
kaskadenförmiges Leitersystem in die Vorratsbehälter zurückgeleitet. Dieses
Leitersystem ermöglichte, während des Experiments durch Verschluss der unteren
Kaskadensprosse den pulmonalvenösen Druck bezogen auf den Lungenhilus um 10
cm H20 zu erhöhen (Hydrostatic Challenge).
11
2. Material und Methoden
Blasenfalle
Mehrkanalschreiber Wägezelle
Beatmungs-pumpe
Pulmonalarterie
Trachea
Verstärker
Wärmekammer
Filter
Perfusatbehälter
Umschaltventil
RollerpumpeInjektionsport
Kaskadensystem fürvenöse Druckbelastung
linker Ventrikel
Innenkathedermit Druck-aufnehmer
Abbildung 5: Schematische Darstellung der isolierten Kaninchenlunge
Während des eigentlichen Versuchs hing die Lunge frei schwebend in einer 37°C
warmen, feuchten Kammer aus Glas (doppelwandig; Glasgerätebau Ochs) an einem
Kraftaufnehmer mit Wägezelle (Messkonverter MC3; Hottinger Baldwin, Darmstadt),
die mit einem Messverstärker (Eigenbau) verbunden war. Das doppelwandige
Glassystem der feuchten Kammer und der Vorratsbehälter war mit einem
Wärmetauscher (HKB 2219 Multitemp II; Bromma) verbunden und über eine
zirkulierende Flüssigkeit temperiert. Dadurch konnte die Temperatur der
Perfusionsflüssigkeit nach Wunsch eingestellt werden. Die pulmonalarteriellen (PAP)
und pulmonalvenösen, linksatrialen Drücke (LAP) wurden mittels dünnlumiger
Innenkatheter in A. pulmonalis und auf Höhe des linken Vorhofs kontinuierlich erfasst
und über Druckaufnehmer (Combitrans Monitoring-Set venös; B. Braun) an den
Messverstärker weitergeleitet. Die kontinuierliche Registrierung der Parameter
erfolgte über einen Mehrkanalschreiber (Servogor 960; BBC Goerz). Alle zum Druck-
12
2. Material und Methoden
ausgleich im System benötigten Entlüftungseinrichtungen an Vorratsbehältern und
Kaskadensystem waren zum Schutz vor einer möglichen bakteriellen Kontamination
durch hydrophobe, bakteriendichte Filtereinheiten mit einer Porengröße von 0,2 µm
gesichert (ReZist 30/0,2; Schleicher + Schuell, 37582 Dasel).
Abbildung 6: Abbildung der Versuchsanlage
13
2. Material und Methoden
2.1.2 Versuchsvorbereitung
Alle an der Versuchsdurchführung beteiligten Systeme wurden in einer Spülmaschine
gereinigt. Die kunsstoffhaltigen Anteile wurden anschließend mit 60°C heißem
Formaldehyddampf sterilisiert, die Vorratsbehälter aus Glas mit Wasserdampf
dampfsterilisiert. Das Schlauchsystem wurde aufgebaut und der prä- und
postpulmonale Anteil kurzgeschlossen.
Nach Befüllung des Systems mit steriler, 0,9%iger Kochsalzlösung (NaCl 0.9
Infusionslösung; Fresenius AG, 61346 Bad Homburg) und anschließender
Entlüftung, erfolgte der mehrmalige Austausch der zirkulierenden Flüssigkeit über die
abwechselnd aufgefüllten, parallel geschalteten Vorratsgefäße (Gesamtvolumen der
pyrogenfreien Spülflüssigkeit ca. 1 l). Dadurch wurde die Gefahr einer bakteriellen
Kontamination reduziert. Anschließend wurde die Kochsalzlösung durch Krebs-
Henseleit-Puffer (KHB; Serag Wiesner, 95119 Naila) (Zusammensetzung: NaCl
132,8 mmol/l, KCl 5,2 mmol/l, KH2PO4 1,1 mmol/l, NaHCO3 24,1 mmol/l, CaCl 2,4
mmol/l, MgPO4 1,3 mmol/l und Glucose 240 mg/dl) ersetzt und es folgte ein weiterer
Spülgang (Spülvolumen: 1l). Während dieses Spülgangs wurde das gesamte System
von eventuell noch vorhandenen Luftblasen befreit. Die Innenkatheter für die
pulmonalarterielle und pulmonalvenöse Druckmessung wurden entlüftet und
arterieller sowie venöser Schenkel des Perfusionssystems nach Abschalten der
Zirkulation mit Kocher-Klemmen (alle Instrumente Aesculap, Tuttlingen) vor einem
unerwünschtem Auslaufen während der Präparation gesichert.
2.1.3 Präparation
Als Versuchstiere wurden männliche Kaninchen der Rasse Chinchilla Bastard
(Charles River Deutschland GmbH, 88353 Kißlegg) mit einem Gewicht zwischen 2,2
und 3,5 kg verwendet. Eine behördliche Genehmigung zur Organentnahme lag vor.
Ein Ohr des Kaninchens wurde mit einem Schleimhautanästhetikum (Xylocain®
Pumpspray; Astra GmbH, 22876 Wedel) eingesprüht. Nach kurzer Einwirkungszeit
wurde die Ohrvene mit einer Butterfly-Kanüle (Venofix® S ID 0,5 mm; B. Braun,
34209 Melsungen) punktiert und dieser venöse Zugang anschließend mit
Pflasterstreifen fixiert. Zur Narkoseeinleitung. wurde dem Kaninchen 1 ml des
verwendeten Narkosegemisches, bestehend aus 25 mg (S)-Ketaminhydrochlorid
(Ketanest® S 5 mg/ml, 5 ml Injektionslösung; Parke-Davis GmbH, Berlin) und 80 mg
Xylazinhydrochlorid (Rompun® 2 %, 25 ml Injektionslösung; Bayer AG, Leverkusen),
14
2. Material und Methoden
als Einschlafdosis injiziert. Danach erfolgte eine gewichtsadaptierte Antikoagulation
des Tieres mittels eines Heparin-Kochsalzgemisches (Liquemin® N 25000, 5 ml
Injektionslösung mit 5000 I.E./ml; Hoffmann-La Roche AG, 79630 Grenzach-Whylen;
1000 I.E./kg Körpergewicht).
Das Kaninchen wurde nun auf dem Rücken gelagert. Das Präparationsfeld über der
Trachea wurde rasiert. Der Bereich zwischen oberer Thoraxapertur und Larynx
wurde mit 5 ml Lidocain 2 % (Xylocain® 2 % 5 ml Injektionslösung; Astra) infiltriert
Dann das restliche Präparationsgebiet über Thorax und Abdomen vom Fell befreit
und mit einem Hautantiseptikum (Braunol®; B. Braun) bepinselt. Im nächsten Schritt
wurde die Trachea des Kaninchens freipräpariert und eröffnet. Anschließend wurde
ein Beatmungstubus in die Trachea eingebracht und das Tier mittels eines
Kleintierrespirators (Rodent Ventilator 7025; Ugo Basile, Comero/Italien) künstlich mit
Raumluft und einem Atemzugvolumen von 10 ml/kg KG beatmet. Unter
kontinuierlicher Kontrolle des Herzschlags wurden weitere 4 ml des
Narkosegemisches langsam (ca. 0,1 ml/15-30 s) injiziert. Die Reaktion auf
Schmerzreize wurde überprüft und gegebenenfalls die Narkose vorsichtig weiter
vertieft. Im Regelfall war die bis dahin verabreichte Menge von insgesamt 5ml
Narkosegemisch, die etwa 60% der vorbereiteten Gesamtmenge entsprach,
allerdings ausreichend.
Anschließend wurde die Haut über dem Processus xiphoideus eingeschnitten und
Thorax und Abdomen freipräpariert. Unterhalb des Processus xiphoideus wurde das
Abdomen eröffnet und der Processus xiphoideus mit einer Kocherklemme gefasst.
Dieser Einschnitt im Oberbauchbereich wurde quer erweitert, um den abdominellen
Zugang zum Thorax zu ermöglichen. Der Ansatz des Zwerchfells am Sternum wurde
mit einer spitzen gebogenen Pinzette unterfahren und mit einer Darmklemme
gefasst. Das Zwerchfell wurde oberhalb der Darmklemme am Sternum durchtrennt
und der Thorax durch leichten Zug an der Darmklemme eröffnet. Dadurch entstand
ein Pneumothorax und die Lunge löste sich von der Thoraxwand. Das Zwerchfell
wurde auf beiden Seiten entlang des Rippenbogens abpräpariert. Unter Schonung
von Aorta und Vena cava wurden die übrigen durch das Zwerchfell tretenden
Strukturen durchtrennt.
Als nächstes wurde der Brustkorb, von unten kommend mit einer Knochenschere
durch eine mediane Längssternotomie eröffnet. Das Präparationsfeld wurde nun von
einem Assistenten mit 2 Klemmen aufgehalten. Der Thymus wurde stumpf entfernt,
15
2. Material und Methoden
das Perikard eröffnet und ebenfalls vorsichtig entfernt. Aorta und A. pulmonalis
wurden am Gefäßursprung mit jeweils einem Faden angeschlungen. Der rechte
Ventrikel wurde dann knapp unterhalb der Pulmonalklappe eröffnet und der
vorbereitete pulmonalarterielle Katheter unter minimalem Perfusatfluss in die Arterie
eingeführt und mittels des vorbereiteten Fadens eingebunden. Anschließend wurde
die Herzspitze unter Eröffnung beider Ventrikel abgetrennt, die Aorta ligiert und der
Beatmungsluft CO2 zur pH-Regulation bei jetzt fehlendem Körperkreislauf und damit
fehlender CO2-Produktion beigemischt. Die nun isolierte Lunge wurde vorsichtig aus
dem Brustkorb entnommen.
Vorsichtig wurden zwei Drittel der Wand des rechten Ventrikels, sowie die Segel der
Mitralklappe entfernt. Das linke Herzohr wurde mit einer Fadenligatur abgebunden,
um Störungen der Gewichtsregistrierung durch unterschiedliche Füllungszustände zu
vermeiden. Zuletzt wurde mit Hilfe einer Tabaksbeutelnaht der Adapter für den
venösen Abfluss in den linken Ventrikel eingenäht (Mersilene™; Ethicon®). Die
Lunge wurde in der feuchten Kammer freischwingend an der Wägezelle
(Messkonverter MC3; Hottinger Baldwin, Darmstadt) aufgehängt (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Versuchspräparat
Der Adapter wurde an das venöse System angeschlossen und somit der Kreislauf
geschlossen. Eventuell in den venösen Anteil des Systems eingedrungene Luft
wurde entfernt um eine Störung des venösen Abflusses zu vermeiden. Die
Perfusionsgeschwindigkeit betrug zu diesem Zeitpunkt 25 ml/min bei einer
16
2. Material und Methoden
Perfusattemperatur von 4°C und das Organ wurde mit einem Atemzugvolumen von
30ml und einer Frequenz von 30 min-1 beatmet.
2.1.4 Kalibrier- und Aufwärmphase
Die Druckaufnehmer wurden über Dreiwegehähne an die Innenkatheter
angeschlossen, entlüftet und kalibriert, wobei der Luftdruck in Hilushöhe als
Nullpunkt definiert wurde. Das Perfusat wurde auf 37°C aufgewärmt und die
Perfusionsgeschwindigkeit nach einem festgelegten Modus (15°C: 50 ml/min, 25°C:
75 ml/min, 35°C: 100 ml/min) langsam erhöht. Der pulmonalvenöse Druck (LAP)
wurde am Ende der Aufwärmphase mittels der höhenverstellbaren Kaskaden-
vorrichtung auf 2 mm Hg eingestellt.
Der pH-Wert des Perfusats wurde in regelmäßigen Abständen (4°C, 15°C, 25°C,
37°C, sowie nach Perfusatwechsel) an einem BGA-Messgerät (ABL 30; Radiometer
Copenhagen) gemessen. Dabei wurde er mittels variabler CO2-Zumischung zur
Beatmungsluft zwischen 7,35 und 7,45 möglichst konstant gehalten. Nach erreichen
einer Perfusattemperatur und Lufttemperatur von 37°C in der feuchten Kammer,
wurde das Perfusat nochmals gewechselt und der pH-Wert erneut kontrolliert. Durch
die beschriebene Versuchsanordnung und -durchführung kann – wie bereits von
anderen Arbeitsgruppen gezeigt – ein nahezu endotoxinfreies rezirkulierendes
Perfusat erreicht werden [70].
2.1.5 Steady-State-Phase
Dem eigentlichen Versuch vorgeschaltet war eine 45 Minuten dauernde Steady-
State-Phase, in der die Lunge unter konstanten äußeren Bedingungen perfundiert
und beatmet wurde. Folgende Bedingungen mussten erfüllt werden, damit die Lunge
für den anschließenden Versuch zugelassen werden konnte: Es durfte kein Verlust
von Perfusatflüssigkeit an den Einbindungsstellen der Katheter auftreten. Ferner
sollte die Lunge homogen weiß entblutet sein und keine äußeren Anzeichen einer
Atelektase oder Ödembildung aufweisen, sowie nicht spontan an Gewicht- oder
Perfusionsdruck zunehmen.
2.2 Messgrößen und Messtechnik
Die Druckregistrierung und -darstellung erfolgte in der Maßeinheit mm Hg, die zwar
nach der internationalen SI-Vereinbarung nicht mehr gebräuchlich, in der Medizin
jedoch noch immer weit verbreitet ist. Zur Berechnung der Widerstände wurden die
17
2. Material und Methoden
Drücke nach dem Umrechnungsfaktor: 133,322 Pa = 1 mm Hg in Pascal
umgerechnet.
2.2.1 Messung der pulmonalarteriellen und pulmonalvenösen Perfusions-drücke (PAP,LAP)
Die Messung der Perfusionsdrücke vor und nach der Lungenstrombahn erfolgte mit
kliniküblichen Einmaldruckwandlern (Combitrans Monitoring-Set venös; B. Braun)
über flüssigkeitsgefüllte Innenkatheter auf Höhe der A. pulmonalis
(pulmonalarterieller Druck, PAP) beziehungsweise des linken Vorhofs
(pulmonalvenöser Druck, LAP). Das gemessenen Signal wurde mit einem
Messverstärker (Eigenbau) verstärkt und mit Hilfe eines Mehrkanalschreibers
(Servogor 960; BBC Goerz; Papiervorschub 2 mm/min, Empfindlichkeit 1 mm/ mm
Hg) kontinuierlich registriert. Um Schreiberungenauigkeiten vorzubeugen, wurde
während des Versuchs in regelmäßigen Abständen der Nullpunkt an Schreiber und
Druckaufnehmer abgeglichen.
2.2.2 Bestimmung des pulmonalkapillären Druckes (PCP)
Der pulmonalkapilläre Druck PCP wurde mit Hilfe der “Double−Occlusion−Methode“
bestimmt. Dazu wurde gleichzeitig der pulmonalarterielle Zufluss und der
pulmonalvenöse Abfluss der Lunge mit Hilfe einer Klemme unterbrochen und das
Perfusat über eine Kurzschlussverbindung an der Lunge vorbei geleitet. Die nun
gemessenen pulmonalarteriellen und pulmonalvenösen Drücke (Papiervorschub 60
mm/min) gleichen sich innerhalb weniger Sekunden an und entsprechen dem Druck
im Kapillarbett, der mit dieser Methode hinreichend genau bestimmt werden kann
[71].
2.2.3 Bestimmung der Gefäßwiderstände (Ra, Rv)
Der pulmonalarterielle (Ra) und der pulmonalvenöse (Rv) Widerstand wurden nach
dem Ohm´schen Gesetzes berechnet:
QpR ∆
=
R: Widerstand
∆p: Druckdifferenz
Q: Stromstärke
18
2. Material und Methoden
Somit gilt für Ra:
QppR pcpa
a−
=
Ra: pulmonalarterieller Widerstand
pa: pulmonalarterieller Druck
ppcp: pulmonalkapillärer Druck
Q: Perfusionsgeschwindigkeit (konstant 100 ml/min)
Analog gilt für Rv:
QppRv vpcp −
=
Rv: pulmonalvenöser Widerstand
pv: pulmonalvenöser Druck
Die Widerstände werden in folgender Einheit angegeben:
[Pa·s / ml]
(Zur Berechnung der Widerstände erfolgte die Umrechnung der Drücke von mm Hg
nach Pascal)
2.2.4 Bestimmung des kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c)
Physiologische Grundlagen: Der Kf,c ist eine rechnerisch ermittelte, konstante Größe,
die ein Maß für die Permeabilität der Kapillarwand für isotone Lösungen darstellt.
Nach der Theorie von Starling besteht unter Normalbedingungen ein
Fließgleichgewicht zwischen Filtrations- und Reabsorptionsvorgängen zwischen
Intravasalraum und Interstitium. Dieser Vorgang wird hauptsächlich durch die
hydrostatischen (∆p) und kolloidosmotischen (∆π) Drücke in den jeweiligen
Kompartimenten bestimmt. Der effektive Filtrationsdruck (peff) wird durch folgende
Gleichung beschrieben:
19
2. Material und Methoden
peff = ∆p − ∆π = (pc − pis) – ( πpl − πis) (1)
pc: hydrostatischer Kapillardruck
pis: hydrostatischer Druck im Interstitium
πpl: kolloidosmotischer Druck im Plasma/Perfusat
πis: kolloidosmotische Druck im Interstitium
Bei Störungen des Gleichgewichtes treten Volumenverschiebungen zwischen
intravaskulärem und interstitiellem Raum auf. Unter diesen Voraussetzungen gilt für
das pro Zeiteinheit über die vaskuläre Grenzfläche tretende Volumen Iv nach der
Starling-Gleichung [72] folgender Zusammenhang:
Iv = Kf,c · peff = Kf,c[(pc − pis) − σ( πpl − πis)] (2)
σ: Reflexionskoeffizient
Für nicht-isogravimetrische Zustände, d.h. bei einem Ungleichgewicht zwischen
Filtration und Reabsorption, gilt σ = 0. In diesem Fall ist Iv direkt proportional zur
effektiv wirksamen Druckdifferenz ∆p zwischen Perfusat und Interstitium. Für den Kf,c
gilt somit:
∆pIvK cf, = (3)
Iv ist außerdem proportional der Gewichtszunahme der Lunge ∆W pro Zeiteinheit ∆t
und somit eine bekannte Messgröße:
ρ∆t∆WIv∗
= (4)
ρ: Perfusatdichte [ρ = 1 g / cm3]
20
2. Material und Methoden
Somit gilt:
ρ∆p∆t∆WK cf,
∗∗= (4) in (3)
Für die experimentelle Bestimmung des Kf,c war es daher erforderlich, das in der
Steady-State-Phase zwischen Filtration und Reabsorption eingetretene
Fließgleichgewicht (∆p = 0) zu stören. Dies erfolgte durch eine Erhöhung des
linksatrialen (und damit auch des intrakapillären) Druckes um ∆p = 10 cm H2O für
einen Zeitraum von 8 min (Hydrostatic Challenge) [73]. In Folge dieser
Druckerhöhung kam es zum Einstrom von Perfusat aus dem Intravasalraum ins
Interstitium, der mit Hilfe der Registrierung als Gewichtszunahme registriert wurde.
(Papiervorschub 15 mm/min zwei Minuten vor und während des Hydrostatic
Challenge; Empfindlichkeit der Gewichtsregistrierung 10 mm/g). Dieser Perfusat-
einstrom war zu Beginn des Hydrostatic Challenge am größten und nahm im Verlauf
ab, bis sich ein neues Gleichgewicht auf höherem Niveau eingestellt hatte. Der Kf,c
lässt sich in Abhängigkeit von der Zeit mit folgender Exponentialfunktion
beschreiben:
Kf,c(t) = Kf,c · e-kt
(daraus folgt: Kf,c(0) = Kf,c)
e: Euler´sche Zahl, e = 2,718...
k: Proportionalitätsfaktor
Der initial überproportionale Gewichtsanstieg, verursacht durch druckpassive
Flüssigkeitsfüllung des pulmonalen Gefäßbettes wird als Compliance bezeichnet und
hat zur Folge, dass die Bestimmung von Iv(0) als Steigung der Gewichts−Zeit−Kurve
zum Zeitpunkt t = 0 min des Hydrostatic Challenge nicht möglich ist. Deshalb war es
notwendig, Iv(t) zu den Zeitpunkten t = 3,4,5,6,7,8 min zu ermitteln und nach
Logarithmieren der so ermittelten Werte für Kf,c(t) den Kf,c als Steigung einer
Regressionsgeraden durch diese Werte zu berechnen [74]. Der so ermittelte Wert
wurde delogarithmiert und auf das Lungenfeuchtgewicht (wet weight lung, WWL)
bezogen. Dieses wurde nach folgender Formel aus dem Körpergewicht (body weight,
BW) des verwendeten Versuchtieres berechnet [75]:
21
2. Material und Methoden
WWL = BW · 0,0024 [g]
Der Kf,c hat somit folgende Dimension:
[Kf,c = cm3 / s · cmH2O · g]
2.2.5 Bestimmung der Compliance
Die Compliance (C) ist ein Maß für die druckpassive Dehnung der pulmonalen
Gefäße und somit auch für den vermehrten intravasalen Flüssigkeitsgehalt der Lunge
nach experimenteller Erhöhung des LAP.
Der Zahlenwert wurde abgeschätzt durch Anlegen einer Tangente an die
Gewichts−Zeit−Kurve des Hydrostatic Challenge bei t=2 min und Extrapolation der
gesamten Gewichtszunahme der Lunge von diesem Zeitpunkt zurück zum Beginn
des Hydrostatic Challenge (t=0 min). Der so gefundene Wert wurde auf den Betrag
der pulmonalvenösen Druckerhöhung bezogen [73]. Als Dimension von C ergibt sich
somit:
[C = g / cmH2O]
2.2.6 Bestimmung der Retention (∆W)
Unter der Retention ∆W versteht man die Differenz der Lungengewichte vor und
nach Ablauf des Hydrostatic Challenge in [g]. Sie ist ein Maß für die irreversible
Zunahme der interstitiellen Flüssigkeit im Verlauf einer Druckkaskade. Nach
Aufheben der Erhöhung des LVP näherte sich das Lungengewicht ebenfalls einer
Exponentialfunktion folgend ihrem nun um ∆W erhöhten Ausgangswert.
Experimentell wurde ∆W deshalb nicht zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt
bestimmt, sondern erst wenn sich ein neues Gleichgewicht mit kleinstmöglichem
Wert eingestellt hatte.
2.3 Versuchsdurchführung
2.3.1 Versuchsablauf und Stimulation
Dem eigentlichen Versuch war eine 45 minütige Steady-State-Phase vorgeschaltet,
die zum Zeitpunkt t = - 45 min begann. Während dieser Steady-State-Phase wurde
zum Zeitpunkt t = - 30 min der pulmonalkapillären Druck, mittels “Double−Occlusion−
22
2. Material und Methoden
Methode“ bestimmt. Zum Zeitpunkt t = - 15 wurde zur Bestimmung der Compliance
(C) und des kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c) ein Hydrostatic Challenge
durchgeführt.
Im Anschluss begann die eigentliche, 45 min dauernde, Versuchsphase. Zum
Zeitpunkt t = 0 wurden die Cannabinoidrezeptoragonisten Anandamid (0,5 µmol/l, 1
µmol/l, 5 µmol/l), 2-AG (0,2 µmol/l, 0,4 µmol/l), R-Methanandamid (5 µmol/l), Noladin-
äther (4 µmol/l), HU-210 (5 µmol/l), ∆9-THC (5 µmol/l) direkt in das Perfusats-
vorratsgefäß gegeben, von wo aus sie innerhalb kurzer Zeit in die pulmonale
Zirkulation gelangten. Bei den Kontrollversuchen wurde zum Zeitpunkt t = 0 reiner
Äthanol (1,5 ml) verabreicht, um einen Effekt des Lösungsmittels auszuschließen.
Der CB1-Cannabinoidrezeptorantagonist AM-251 (5 µmol/l) und der VR1-Vanilloid-
rezeptorantagonist Capsazepin (10 µmol/l) wurden 5 min vor Beginn der Gabe von
Anandamid ins Perfusat gegeben. Dieser 5 min dauernde zusätzliche Abschnitt im
Anschluss an die Steady-State-Phase, sollte sicherstellen, dass sich die
Antagonisten ausreichend im Perfusat verteilt hatten und eine sichere Hemmung der
pulmonalen Cannabinoid- beziehungsweise Vanilloidrezeptoren erreicht wurde.
Anandamid, 2-AG, R-Methanandamid, Noladinäther, Capsazepin und ∆9-THC
wurden in reinem Äthanol gelöst, für HU-210 und AM-251 wurde DMSO
(Dimethylsulfoxid) als Lösungsmittel verwendet. Zum Zeitpunkt t = 15 min wurde der
pulmonalkapilläre Druck bestimmt und bei t = 30 min wurde ein Hydrostatic
Challenge zur Bestimmung des pulmonalkapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c) und
der Compliance (C) durchgeführt. Nach t = 45 min wurde der Versuch beendet.
2.4 Biochemische Analytik
2.4.1 Bestimmung der Konzentrationen von Anandamid und 2-AG mittels Flüssigkeitschromatographie / Massenspektrometrie (LC/MS)
Zur Bestimmung des Anandamid- und 2-AG-Gehalts wurde natives Lungengewebe
von fünf Kaninchen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur weiteren
Aufarbeitung bei -80 °C gelagert.
Zunächst wurde das Gewebe gewogen und dann nach Zugabe von Trispuffer
homogenisiert. 7 nmol 2H4-Anandamid wurde als interner Standard hinzugegeben.
Die Lipidfraktion wurde durch Hinzufügen eines 4°C kalten Chloroform-
Methanolgemisches (2:1) extrahiert und durch Zentrifugation und anschließendem
Abpipettieren der unteren, organischen Phase von den Zellen und dem Trispuffer
23
2. Material und Methoden
getrennt. Dieser Vorgang wurde unter Hinzufügen eines Chloroform-Methanol-
Gemisches zweimal wiederholt, um eine möglichst vollständige Extraktion der
Lipidfraktion zu erreichen. Die organische Phase wurde nun unter Stickstoffbegasung
vollständig evaporiert und anschließend zur Entfernung der Proteine in einer
eiskalten Chloroform-Aceton-Mischung wieder in Lösung gebracht. Hierdurch kam es
zur Präzipitation der Proteine, die nun nach Zentrifugation abpippetiert werden
konnten. Nach nochmaligem Evaporieren der verbleibenden Lösung wurde die Probe
erneut in Methanol gelöst und bis zur Analyse bei -80 °C gelagert. Die
vorbeschriebenen Arbeitsschritte wurden in Würzburg durchgeführt.
Die Detektion der Endocannabinoide erfolgte durch Flüssigkeitschromatographie/
Massenspektrometrie (LC /MS) [76] unter Verwendung eines Agilent LC-MSD der
1100-Reihe, ausgestattet mit einem thermostatreguliertem Autosampler und
Säulenkompartiment im Labor von Prof. Kunos, NIAAA, NIH, Bethesda, Maryland,
USA. Der für molekulare Masse empfindliche Detektor (Modell LS) ermöglichte die
chemische Ionisierung positiv geladener Ionen unter atmosphärischem Druck
(atmospheric pressure chemical ionization (APCI)) und das Messen ausgewählter
Ionen (selected-ion-monitoring (SIM)), in unserem Fall Anandamid (Arachidonyl-
ethanolamid (AEA)) mit einer molekularen Masse von 348 g/mol, 2H4-Anandamid
(2H4-AEA) mit 352 g/mol und 2-AG mit 379 g/mol. Eine Eichkurve wurde mittels
synthetischem AEA und 2-AG erstellt. Die Konzentrationen von Anandamid und 2-
AG in den Proben wurden durch eine invers-lineare Regressionsgerade der
Standardkurve bestimmt und sind in pmol/g beziehungsweise nmol/g Lungenfeucht-
gewebe angegeben.
2.5 Substanzen
Die folgende Tabelle enthält ein Verzeichnis der verwendeten Chemikalien und
Pharmaka. Die Bezugsquelle der für die Tierpräparation verwendeten Substanzen
und Pharmaka, sowie die Hersteller der für den Aufbau der Versuchsanlage
verwendeten Materialien sind bereits in den Abschnitten 2.1.2 und 2.1.3 genannt.
Substanz Hersteller/Lieferant
Aceton (2-Propanon) Carl Roth GmbH & Co KG, 76185
Karlsruhe
Anandamid (Arachidonylethanolamid) Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen
24
2. Material und Methoden
2H4-AEA Geschenk von Prof. Kunos, NIAAA, Bethesda, Maryland, USA.
AM-251 Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln
2-AG (Arachidonylglycerol) Alexis Biochemicals, 4415 Lausen,
Schweiz
Capsazepin Alexis Biochemicals, 4415 Lausen,
Schweiz
Chloroform (Trichlormethan, CHCl3) Merck KGaA, 64271 Darmstadt
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen
Äthanol, absolut rein Mallinckrodt Baker Chemikalien, 64347
Griesheim
HU-210 Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln
Krebs-Henseleit-Puffer Serag Wiesner, 95119 Naila
Methanol Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen
(R)-(+)-Methanandamid Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln
Noladinäther Biotrend Chemikalien GmbH, 50933 Köln
NaCl 0.9 % Infusionslösung Fresenius AG, 61346
Bad Homburg
∆9-Tetrahydrocannabinol (∆9-THC) Sigma-Aldrich GmbH, 82024 Taufkirchen
Tabelle 1: Substanzenverzeichnis
2.6 Statistische Auswertung
Sämtliche Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler der Mittelwerte (SEM)
dargestellt. Unterschiede zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen wurden
durch One-Way-Anova ermittelt und mit dem Bonferroni Post-Hoc Test korrigiert.
Unterschiede mit einer Fehlerwahrscheinlichkeit (p-Wert) < 0,05 wurden als
signifikant bewertet.
25
3. Ergebnisse
3 Ergebnisse 3.1 Pulmonalarterieller Druck
Der durchschnittliche Ausgangsdruck aller Versuche am Ende der Steady-State-
Phase lag bei 5,0 ± 0,2 mm Hg (N = 85).
Das endogene Cannabinoid Anandamid erhöht dosisabhängig den pulmonal-
arteriellen Druck. Abbildung 8 zeigt die Differenz (∆PAPmax) zwischen dem maximal
erreichten Druck nach Gabe von Anandamid und dem jeweiligen Ausgangsdruck vor
Beginn der Substanzgabe. Nach Gabe von 0,5 µmol/l Anandamid wird ein ∆PAPmax
von 6,1 ± 1,1 mm Hg (N = 6) erreicht. 1 µmol/l Anandamid verursacht einen
maximalen Druckanstieg von 15,6 ± 3,8 mm Hg (N = 5). Die Gabe von 5 µmol/l
Anandamid führt zu einem maximalen Druckanstieg von 19,9 ± 3,4 mm Hg (N = 6).
Auch das endogene Cannabinoid 2-Arachidonylglycerol (2-AG) erhöht dosisabhängig
den pulmonalarteriellen Druck (Abbildung 8). Jedoch zeigt bereits eine um den
Faktor 10 niedrigere Dosis von 0,2 µmol/l 2-AG mit einem ∆PAPmax von 19,6 ± 8,8
mm Hg (N = 3) einen vergleichbaren Effekt wie 5 µmol/l Anandamid. Nach Gabe von
0,4 µmol/l 2-AG wird ein maximaler Druckanstieg um 39,5 ± 10,8 mm Hg (N = 4)
erreicht.
Abbildung 8: Maximaler Druckanstieg nach Gabe verschiedener Dosen von Anandamid (weiße, hellgraue und graue Säulen) und 2-Arachidonylglycerol (2-AG) (dunkelgraue und schwarze Säule). Die vertikalen Balken stellen die Standardabweichung des Mittelwertes dar. Alle Effekte unterscheiden sich signifikant von der Nulllinie (p < 0.05 für 0,5 µmol/l Anandamid und 0,2 µmol/l 2-AG; p < 0.01 für 1 µmol/l und 5 µmol/l Anandamid sowie 0,4 µmol/l 2-AG).
26
3. Ergebnisse
Etwa 2 Minuten nach Gabe von 5 µmol/l Anandamid beziehungsweise 0,4 µmol/l 2-
AG, beginnt der Anstieg des pulmonalarteriellen Druckes, der im Falle von 5 µmol/l
Anandamid etwas träger als bei 0,4 µmol/l 2-AG verläuft. Nach 8,8 ± 0,7 Minuten
erreicht der pulmonalarterielle Druck sein Maximum und bildet sich dann langsam
wieder zurück um am Versuchsende zum Zeitpunkt t = 45 min bei 8,6 ± 2,0 mm Hg
und damit nicht mehr signifikant über den Druckwerten in den Kontrollversuchen zu
liegen (Abbildung 9).
Im Gegensatz dazu erreicht 2-AG sein Druckmaximum bereits nach 3,8 ± 0,4
Minuten. Der Druck fällt nach dem im Vergleich zu Anandamid bedeutend
schnelleren Anstieg auch wesentlich schneller wieder ab und liegt bereits nach 15
Minuten mit 7,8 ± 2,0 mm Hg nicht mehr signifikant über dem Druck in den
Kontrollversuchen (Abbildung 9).
‡
**‡
**
+ ** **
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
t in min
p in
mm
Hg
KontrollversucheAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l
Abbildung 9: Druck-Zeitverlauf von 5 µmol/l Anandamid (gestrichelte Linie mit hellen Rechtecken), 0,4 µmol/l 2-AG (gepunktete Linie mit dunklen Dreiecken) und Kontrollversuchen (durchgezogenen Linie mit hellen Rauten). Die vertikalen Balken stellen die Standardabweichung des Mittelwertes dar. (** p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid vs. Kontrollversuche; + p < 0,05 für 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrollversuche; ‡ p < 0,01 für 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrollversuche)
27
3. Ergebnisse
Die Vorbehandlung mit dem Cannabinoidrezeptorantagonisten AM-251 (5 µmol/l) 5
Minuten vor der Gabe von Anandamid (5 µmol/l) – in dieser Konzentration wirkt
AM-251 antagonistisch am CB1- und CB2-Rezeptor – zeigt keinen signifikanten Effekt
auf den Druckanstieg nach Anandamidgabe (12,9 ± 1,5 mm Hg; N = 6 vs.19,9 ± 3,4
mm Hg für 5 µmol/l Anandamid alleine) (Abbildung 10).
Gibt man AM-251 in CB1-Rezeptor-selektiver Dosierung von 0,1 µmol/l wird der
Druckanstieg nach Gabe von 5 µmol/l Anandamid sogar noch verstärkt (48,7 ± 11,8
mm Hg; N = 5 vs. 19,9 ± 3,4 mm Hg für 5 µmol/l Anandamid alleine). Der VR1-Vanilloidrezeporantagonist Capsazepin (10 µmol/l), 5 min vor Anandamid-
gabe (5 µmol/l) verabreicht, zeigt keinen Einfluss auf den Druckanstieg nach
Anandamid.
Abbildung 10: Auswirkung des Cannabinoidrezeptorantagonisten AM-251 (schraffierte Säulen; 1.schraffierte Säule 5 µmol/l AM-251, 2. schraffierte Säule 0,1 µmol/l AM-251) und des Vanilloid-rezeptorantagonisten Capsazepin (schwarze Säule) auf den Druckanstieg nach Gabe von 5 µmol/l Anandamid (graue Säule) (p > 0,05 für 5 µmol/l AM-251 und 10 µmol/l Capsazepin vs. 5 µmol/l Anandamid alleine; p < 0,05 für 0,1 µmol/l AM-251 vs. 5 µmol/l Anandamid alleine)
28
3. Ergebnisse
Im Gegensatz zu den Endocannabinoiden Anandamid und 2-AG führen vergleich-
bare Dosen des synthetischen Cannabinoids HU-210 (0,5 ± 0,1 mm Hg; N = 3) und
des pflanzlichen Cannabinoids ∆ 9-Tetrahydrocannabinol (∆ 9-THC) (1,5 ± 0,4 mm
Hg; N = 5) zu keinem signifikanten Druckanstieg (Abbildung 11).
Abbildung 11: Druckverhältnisse nach Gabe von HU-210 (schraffierte Säule) und ∆ 9-Tetrahydro-cannabinol (∆ 9-THC) (weiße Säule) im Vergleich zu 5 µmol/l Anandamid (graue Säule). (p > 0,05 für HU-210 und ∆ 9-THC vs. Kontrolle; p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid vs. Kontrolle).
29
3. Ergebnisse
(R)-(+)-Methanandamid und Noladinäther sind stoffwechselstabile Analoga von
Anandamid und 2-AG. Im Gegensatz zu Anandamid und 2-AG kommt es zu keinem
Druckanstieg nach Gabe von 5 µmol/l Methanandamid (0,3 ± 0,2 mm Hg; N = 4) oder
4 µmol/l Noladinäther (0,3 ± 0,1 mm Hg; N = 4) (Abbildung 12).
Abbildung 12: Druckverhältnisse nach Gabe von 5µmol/l Methanandamid (2.Säule) und 4 µmol/l Noladinäther (4. Säule) im Vergleich zu 5 µmol/l Anandamid (Graue Säule) und 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säule) (p > 0,05 für Methanandamid und Noladinäther vs. Kontrolle; p < 0,01 für 5µmol/l Anandamid und. 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrolle).
30
3. Ergebnisse
3.2 Pulmonalkapillärer Druck und Verteilung der pulmonalen Gefäßwider-
stände
Abbildung 13 zeigt die pulmonalkapillären Druckverhältnisse 15 Minuten (t = - 30
min) nach Beginn der Steady-State-Phase (und damit 30 Minuten vor
Substanzgabe), 15 Minuten (t = 15min) nach Substanzgabe und am Versuchsende (t
= 45 min), die mittels der „Double-Occlusion-Methode“ bestimmt wurden (siehe
2.2.2).
Nach Anandamid- beziehungsweise 2-AG-Gabe kommt es zu einem geringen aber
dennoch signifikanten Anstieg des pulmonalkapillären Druckes 4,4 ± 0,3 mm Hg (für
5 µmol/l Anandamid) bzw. 4,1 ± 0,1 mm Hg (für 0,4 µmol/l 2-AG) vs. 2,8 ± 0,3 mm Hg
bei den Kontrollversuchen).
Am Versuchsende, 45 Minuten nach Substanzgabe, gibt es keine pulmonalkapillären
Druckunterschiede zwischen 5 µmol/l Anandamid sowie 0,4 µmol/l 2-AG und den
Kontrollversuchen.
0
1
2
3
4
5
6
t = -30 min t = 15 min t = 45 min
Pc (m
m H
g)
KontrolleAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l
Abbildung 13: Pulmonalkapilläre Drücke (Pc) zu den Zeitpunkten t = – 30 min (während der Steady-State-Phase vor Substanzgabe), t = 15 min (15 Minuten nach Substanzgabe) und t = 45 min (45 Minuten nach Substanzgabe) bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid (graue Säule), 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säule) und den Kontrollversuchen (weiße Säule). Die vertikalen Balken stellen die Standardabweichung des Mittelwertes dar (Zeitpunkt t = 15 min: p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid und 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrolle).
Abbildung 14 zeigt das Verhalten der pulmonalarteriellen Widerstände (Ra). Hierbei
ergibt sich für die Versuche mit 5 µmol/l Anandamid nach 15 Minuten eine deutliche
31
3. Ergebnisse
Zunahme des pulmonalarteriellen Widerstandes auf 1332 ± 255 Pa*s/ml (vs. 220 ±
60 Pa*s/ml bei den Kontrollversuchen), die in etwa einer Versechsfachung des
Ausgangswertes entspricht. Bei den Versuchen mit 0,4 µmol/l 2-AG ist der pulmonal-
arterielle Widerstand zum Zeitpunkt t = 15 min mit 290 ± 173 Pa*s/ml (vs. 220 ± 60
Pa*s/ml bei den Kontrollversuchen) nicht signifikant erhöht.
Der scheinbare Widerspruch – 2-AG führt bereits in geringerer Dosierung zu einer
stärker ausgeprägten Erhöhung des pulmonalkapillären Druckes als Anandamid
(siehe Abbildung 8), aber zu keinem signifikanten Anstieg des pulmonalarteriellen
Widerstandes – erklärt sich durch die unterschiedliche Dynamik im Druck-Zeitverlauf
der beiden Substanzen. Zum Zeitpunkt t = 15 min, dem Zeitpunkt der Messung des
pulmonalkapillären Widerstandes, ist im Falle von 0,4 µmol/l 2-AG der
Ausgangsdruck vor Substanzgabe bereits wieder erreicht, bei 5 µmol/l Anandamid
aber noch eine deutliche Druckerhöhung feststellbar (vergleiche Abbildung 9). Im
Falle von 2-AG ist damit keine Erhöhung des pulmonalkapillären Druckes mehr
messbar.
Am Versuchsende, zum Zeitpunkt t = 45, sind keine Unterschiede zwischen den
pulmonalarteriellen Widerständen messbar.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
t = -30 min t = 15 min t = 45 min
RA
(Pa*
s/m
l)
KontrolleAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l
Abbildung 14: Pulmonalarterielle Widerstände (Ra) zu den Zeitpunkten t = - 30 min, t = 15 min und t = 45 min bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid (graue Säule), 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säule) und den Kontrollversuchen (weiße Säule) (Zeitpunkt t = 15 min: p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid vs. Kontrolle).
32
3. Ergebnisse
Die pulmonalvenösen Widerstände sind in Abbildung 15 dargestellt. Auch hier kommt
es zu einem signifikanten, wenn auch im Vergleich zu den pulmonalarteriellen
Widerständen weit geringer ausgeprägten Anstieg (vergleiche Abbildung 14). Für 5
µmol/l Anandamid ergibt sich ein Anstieg auf 185 ± 40 Pa*s/ml, für 0,4 µmol/l 2-AG
auf 155 ± 39 Pa*s/ml (vs. 61 ± 10 Pa*s/ml bei den Kontrollversuchen). Dies
entspricht im Falle von Anandamid in etwa einer Verdreifachung des
Ausgangswertes.
0
50
100
150
200
250
300
t = -30 min t = 15 min t = 45 min
RV
(Pa*
s/m
l)
KontrolleAnandamid 5 µmol/l2-AG 0,4 µmol/l
Abbildung 15: Pulmonalvenöse Widerstände (RV) zu den Zeitpunkten t = - 30 min, t = 15 min und t = 45 min bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid (graue Säulen), 0,4 µmol/l 2-AG (schwarze Säulen) und den Kontrollversuchen (weiße Säulen)(Zeitpunkt t = 15 min: p < 0,01 für 5 µmol/l Anandamid sowie 0,4 µmol/l 2-AG vs. Kontrolle).
Die Druckerhöhung durch Anandamid und 2-AG ist vor allem der massiven Erhöhung
des pulmonalarteriellen Widerstandes (Ra) zuzuschreiben. Die Erhöhung des
pulmonalkapillären Druckes (Pc) sowie des pulmonalvenösen Widerstandes (Rv) sind
zu klein um den massiven Druckanstieg nach Anandamid- beziehungsweise 2-AG-
Gabe zu erklären. Die Druckerhöhungen durch Anandamid und 2-AG sind also vor
allem durch eine Widerstandserhöhung im präkapillären Gefäßbett der Lungen-
strombahn verursacht.
Die Erhöhung der pulmonalvenösen Widerstände und pulmonalkapillären Drücke
muss nicht unbedingt die Folge einer direkten Wirkung von Anandamid und 2-AG auf
den betreffenden Gefäßabschnitt sein. Bedingt durch die massive Druck- und
33
3. Ergebnisse
Widerstandserhöhung im arteriellen Abschnitt des Gefäßbetts kommt auch eine eher
unspezifische Mitreaktion des venösen beziehungsweise pulmonalkapillären
Gefäßbetts als Erklärung in Betracht.
Für die Versuche mit HU-210, ∆9-THC, R-Methanandamid und Noladinäther wurden
ebenfalls Daten zu den pulmonalkapillären Druckverhältnissen und zur
Widerstandsverteilung erhoben. Infolge der ausbleibenden Druckerhöhung nach
Verabreichung der Substanzen ergaben sich aber erwartungsgemäß keine
signifikanten Unterschiede im Vergleich zur Kontrollgruppe (Daten nicht im Detail
dargestellt).
Bei den Versuchen mit dem CB1-Rezeptorantagonisten AM-251 und dem VR1-
Vanilloidrezeptorantagonisten Capsazepin ergaben sich Werte, die vergleichbar mit
denen bei alleiniger Gabe von 5 µmol/l Anandamid sind (Daten nicht im Detail
dargestellt).
34
3. Ergebnisse
3.3 Gefäßpermeabilität und Compliance
Die Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse zum kapillären Filtrationskoeffizienten (Kf,c), zur
Compliance (C) und zur Retention bei den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid, 0,4
µmol/l 2-AG und den Kontrollversuchen.
Durch die Verabreichung von Anandamid und 2-AG kommt es zu keiner signifikanten
Änderung des kapillären Filtrationskoeffizienten, der Compliance und der Retention.
Steady state VersuchGruppe t = -15 t = 30
Kontrolle Kf,c [·10-4cm3 · s-1 · cmH2O-1 · g-1] 1,23 ± 0,09 1,26 ± 0,15
C [g/cm H2O] 0,40 ± 0,02 0,41 ± 0,02
∆W [g] 2,33 ± 0,18 3,02 ± 1,07
Anandamid 5 µMol Kf,c [·10-4cm3 · s-1 · cmH2O-1 · g-1] 1,25 ± 0,21 1,56 ± 0,25
C [g/cm H2O] 0,45 ± 0,02 0,40 ± 0,02
∆W [g] 1,93 ± 0,47 2,65 ± 0,48
2-AG 0,4 µMol Kf,c [·10-4cm3 · s-1 · cmH2O-1 · g-1] 1,38 ± 0,39 2,07 ± 1,33
C [g/cm H2O] 0,37 ± 0,03 0,39 ± 0,02
∆W [g] 1,64 ± 0,42 6,33 ± 5,2
Hydrostatic challenge
Tabelle 2: Kf,c, C und ∆W für die Versuche mit 5 µmol/l Anandamid, 0,4 µmol/l 2-AG und den Kontrollversuchen (p > 0,05 für Kf,c, C und ∆W zu den Versuchen mit 5 µmol/l Anandamid, sowie 0,4 µmol 2-AG vs. Kontrollversuche).
3.4 Endocannabinoidgehalt der Lunge
Anandamid und 2-AG sind im nativen Lungengewebe mittels
Flüssigkeitschromatographie/ Massenspektrometrie (LC /MS) nachweisbar. Dazu
wurde das Gewebe von 5 nativen Kaninchenlungen untersucht. Sowohl Anandamid
wie auch 2-AG waren in jeder dieser Lungen messbar. Die Konzentration von
Anandamid betrug 99 ± 55 pmol/g Lungenfeuchtgewicht, die von 2-AG 19.6 ± 8.4
nmol/g Lungenfeuchtgewicht. 2-AG kommt damit in 200-fach höherer Konzentration
im nativen Lungengewebe vor als Anandamid.
35
4. Diskussion
4 Diskussion Nachdem Cannabinoide in verschiedenen vaskulären Stromgebieten Gefäße
dilatieren [43], wollten wir wissen, ob sie dazu auch in der pulmonalen Strombahn in
der Lage sind und damit als potentiell neue Stoffklasse zur Behandlung des
pulmonalen Hochdrucks denkbar wären.
Überraschenderweise erhöhen die endogenen Cannabinoide Anandamid und 2-AG
jedoch im Modell der isolierten Kaninchenlunge dosisabhängig den
pulmonalarteriellen Druck.
Wenn auch unerwartet, so ist es trotzdem kein ungewöhnlicher Befund, dass eine
Substanz im systemischen Blutkreislauf Gefäße erweitert, während sie
Pulmonalgefäße verengt. Bradykinin ist ein Beispiel dafür [77,78]. Vasopressin
hingegen erhöht – zumindest in supraphysiologischen Konzentrationen – den
mittleren arteriellen Blutdruck, während es bereits in niedrigen Plasma-
konzentrationen in der Pulmonalarterie vasodilatierend wirkt [79]. Sauerstoffmangel
ist ebenfalls ein Stimulus, der im systemischen Blutkreislauf Gefäße verengt, im
Lungenkreislauf hingegen gefäßerweiternd wirkt [80].
Vieles deutet darauf hin, dass Abbauprodukte von Anandamid für den Druckanstieg
verantwortlich sind. HU-210 ist das potenteste synthetische Cannabinoid bezüglich
seiner hypotensiven und bradykardisierenden Wirkung [45]. Es ist ein starker Agonist
an CB1-Rezeptoren, aber auch am CB2-Rezeptor [20]. Seine chemische Struktur
ähnelt dem ∆9-THC und unterscheidet sich grundlegend von der Arachidonsäure-
struktur der endogenen Cannabinoide Anandamid und 2-AG (vergleiche Abbildung 1
bis Abbildung 3 in Abschnitt 1.1). Im Gegensatz zu Anandamid und 2-AG zeigt HU-
210 keinerlei Effekt auf die pulmonalarteriellen Drücke in der isolierten Kaninchen-
lunge, was gegen eine Vermittlung des Druckanstiegs durch klassische
Cannabinoidrezeptoren zu werten ist.
Im Einklang dazu erhöht das pflanzliche Cannabinoid ∆9-THC – auch ∆9-THC hat
nicht die Fettsäurenstruktur von Anandamid und 2-AG – den pulmonalarteriellen
Druck ebenfalls nicht. In einer Studie aus den 70er Jahren mit narkotisierten Hunden
kam es zwar zum Anstieg des pulmonalen Gefäßwiderstandes nach ∆9-THC, jedoch
wurde dieser Effekt, den die Autoren durch einen vagalen Reflex erklären, durch
bilaterale Vagotomie verhindert [65]. In unserem isolierten Lungenmodell ist ein
Einfluss des Nervus Vagus von vorneherein ausgeschlossen, ein gleichartiger Reflex
36
4. Diskussion
könnte daher aus methodischen Gründen gar nicht auftreten. Im Widerspruch dazu
und zu unseren eigenen Ergebnissen zur Wirkung von ∆9-THC stehen die
Ergebnisse einer anderen Arbeitsgruppe, ebenfalls aus den 70er Jahren. Sie konnte
zeigen, dass ∆9-THC den pulmonalen Perfusionsdruck in der isolierten
Meerschweinchenlunge erhöht. Der Effekt konnte durch die vorherige Gabe von
Aspirin verhindert werden und wurde durch die Entstehung von „prostaglandinartigen
Substanzen“ erklärt [66]. Eine mögliche Erklärung für die Erhöhung des pulmonalen
Perfusionsdrucks durch ∆9-THC könnte die, im Vergleich zu unseren Versuchen,
höhere Dosierung sein. Eine Druckerhöhung zeigte sich bei der recht hohen
Dosierungen von 15 – 30 µmol/l ∆9-THC. In der isolierten Kaninchenlunge testeten
wir ∆9-THC nur in einer Konzentration von 5µmol/l und sahen keinen Effekt.
Möglicherweise unterscheiden sich verschiedene Tierspezies in der Reaktionsweise
ihrer pulmonalen Gefäße auf Cannabinoide aber auch.
Ein weiteres Argument gegen die Aktivierung von CB1-Rezeptoren als Ursache des
Druckanstieges liefert das Ergebnis unserer Experimente mit AM-251. AM-251 ist
strukturell mit dem CB1-Cannabinoidrezeptorantagonisten SR 141716A verwandt und
selbst ein noch potenterer CB1-Rezeptorantagonist. In der von uns verwendeten,
relativ hohen Dosierung von 5 µmol/l wirkt es aber auch antagonistisch am CB2-
Rezeptor [81,82]. In dieser Dosierung zeigt es keinen Effekt auf den Druckanstieg
nach Anandamidgabe. Erstaunlicherweise verursacht die Verabreichung von AM-251
in der CB1-Rezeptor-selektiven Dosierung von 0,1 µmol/l eine weitere Verstärkung
des Druckanstiegs nach Anandamidgabe. Die Frage nach der Ursache dieses
Effekts kann zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Weitere
Versuche mit CB1-Rezeptorantagonisten, wie zum Beispiel SR 141716A, wären ein
erster Schritt zur Aufklärung dieser Beobachtung. Daher bleibt die Möglichkeit offen,
dass der Nettoeffekt von Anandamid pulmonale Vasokonstriktion ist, gleichzeitig aber
eine Aktivierung von CB1-Rezeptoren, in gewissem Maße, zur pulmonalen
Vasodilatation führt. Die Demaskierung eines solchen Effekts durch CB1-
Rezeptorantagonisten könnte einen, im Vergleich zur alleinigen Gabe von
Anandamid verstärkten Druckanstieg zur Folge haben. Leider gibt es kein wirklich
etabliertes Modell zur Erzeugung eines chronischen Lungenhochdrucks beim
Kaninchen, bei dem man diese Hypothese testen könnte.
Anandamid kann seine Wirkungen nicht nur durch Bindung an CB1-und CB2-
Rezeptoren entfalten. Es hat auch die Fähigkeit an VR1-Vanilloidrezeptoren zu
37
4. Diskussion
binden und dadurch Einfluss auf den Gefäßtonus zu nehmen [23]. Die Aktivierung
von VR1-Vanilloidrezeptoren als Ursache der Druckerhöhung konnten wir jedoch
ausschließen. Capsazepin, ein spezifischer Antagonist am VR1-Vanilloidrezeptor [83]
zeigt keine Beeinflussung des Druckanstiegs nach Anandamidgabe.
Eine elegante Methode, um Effekte durch Abbauprodukte aufzudecken, ist die
Verwendung des stoffwechselstabiler Analoga, wie z.B. des Anandamidanalogons
(R)-(+)-Methanandamid. R-Methanandamid ist durch Methylierung gegen
enzymatischen Abbau geschützt [84]. Im Modell der isolierten Kaninchenlunge führt
die Gabe von R-Methanandamid zu keinerlei Druckänderung im Vergleich zum
Ausgangsdruck. Wir werten dies als starken Hinweis dafür, dass Abbauprodukte von
Anandamid für den Druckanstieg verantwortlich sind.
Noladinäther ist selbst ein endogenes Cannabinoid und ein stoffwechselstabiles
Analogon zu 2-AG. Ähnlich wie R-Methanandamid zeigt Noladinäther keinen Effekt
auf den pulmonalarteriellen Druck in unserem Modell. Auch im Falle von 2-AG
scheinen also Abbauprodukte für den Druckanstieg verantwortlich zu sein.
Eine Mitbeteiligung des in der Mesenterialarterie der Ratte beschriebenen
endothelständigen „Anandamidrezeptors“ [21,22] am pulmonalarteriellen
Druckanstieg erscheint äußerst unwahrscheinlich. Wir haben zwar keine Versuche
mit Anandamid nach vorheriger Blockade dieses Rezeptors mit dem Antagonisten O-
1918 gemacht, jedoch zeigt die Gabe von R-Methanandamid – das wie Anandamid
agonistisch an diesem Rezeptor wirkt [21] – keine Beeinflussung des pulmonal-
arteriellen Druckes.
Neben der Unbeeinflussbarkeit der Anandamidwirkung durch den
Cannabinoidrezeptorantagonisten AM-251, dem fehlenden Druckanstieg von
strukturell abweichenden Cannabinoiden wie HU-210 oder ∆9-THC, ist es vor allem
das Unvermögen der stoffwechselstabilen Analoga R-Methanandamid und
Noladinäther den pulmonalarteriellen Druck zu erhöhen, das uns an Abbauprodukte
von Anandamid und 2-AG als Ursache der pulmonalarteriellen Druckerhöhung
denken lässt.
Doch welche Abbauprodukte kommen dafür in Betracht? Anandamid und 2-AG
werden durch die Fettsäuren-Amidohydrolase (FAAH) zu Arachidonsäure und
Ethanolamid beziehungsweise zu Arachidonsäure und Glycerol abgebaut [85]. Bei 2-
AG ist das hauptsächlich für den Abbau verantwortliche Enzym neben der FAAH
wahrscheinlich eine Monoacylglycerol-Lipase [30]. Auch in diesem Fall entstehen
38
4. Diskussion
Arachidonsäurederivate. Die entstehende Arachidonsäure könnte entweder der
Cyclooxygenase als Substrat dienen und zu Prostaglandinen, Thromboxanen oder
Prostacyclinen oder durch Lipoxygenasen zu Leukotrienen oder Monohydroxy-
tetraensäuren (HETEs) abgebaut werden. Während Prostacyclin und seine Analoga
pulmonale Vasodilatatoren sind und in der Therapie des pulmonalen Hochdrucks
zum Einsatz kommen [86] führt Thromboxan zur Vasokonstriktion der
Pulmonalarterie [87]. Ein wichtiges Produkt der Cyclooxygenase ist Prostaglandin-E2.
Es vermittelt seine Wirkungen über vier verschiedene Rezeptorsubtypen (EP1-EP4).
EP1-Rezeptoraktivierung vermittelt Schmerz und Blutdruckanstieg im systemischen
Kreislauf [88]. In isolierten Ringen menschlicher Pulmonalarterien führt EP3-
Aktivierung zur Kontraktion [89]. PGF2α wirkt in menschlichen Pulmonalgefäßen
spasmogen [90] aber auch Monohydroxytetraensäuren wie 5-HETE und 15-HETE
sind als pulmonale Vasokonstriktoren in Betracht zu ziehen [91]. Die medizinische
Doktorarbeit von Florian Kram mit dem Thema „Das endogene Cannabinoid
Anandamid erhöht cyclooxygenase-2 abhängig den pulmonalarteriellen Druck in der
isolierten Kaninchenlunge“ widmet sich ausführlich der Frage, durch welche
Abbauprodukte von Anandamid der pulmonalarterielle Druckanstieg zustande kommt
[92].
Eine weitere Möglichkeit des Endocannabinoidabbaus ist die direkte Umwandlung
von Anandamid und 2-AG durch die Cyclooxygenase-2 (COX-2) [34,35]. Dabei
entstehen neue Klassen von Prostaglandinen, nämlich die
Prostaglandinethanolamide aus Anandamid und die Prostaglandinglycerylester aus
2-AG. Diese ähneln strukturell den aus freier Arachidonsäure entstehenden
Prostaglandinen. Aus Anandamid entsteht hauptsächlich PGE2-Ethanolamid und in
geringerem Ausmaß PGD2-Ethanolamid [36]. Die biologische Bedeutung dieser
Substanzen ist bisher weitgehend unklar. PGE2-Ethanolamid kontrahiert im Versuch
durch Interaktion mit dem EP1-Prostanoidrezeptor die Trachea von
Meerschweinchen [93]. Eine andere Arbeitsgruppe berichtet, dass PGE2-
Ethanolamid die Iris der Katze kontrahiert und vermutet die Aktivierung neuartiger,
bisher unbekannter Rezeptoren als Ursache [94].
Nachdem Anandamid und 2-AG den pulmonalarteriellen Druck in unserem Modell
erhöhen, wollten wir wissen, ob die beiden Endocannabinoide auch im nativen
Lungengewebe vorkommen und damit möglicherweise eine Rolle bei der Regulation
des pulmonalarteriellen Gefäßtonus spielen könnten. Es ist uns gelungen,
39
4. Diskussion
Anandamid und 2-AG durch Flüssigkeitschromatographie / Massenspektrometrie im
nativen Lungengewebe nachzuweisen. Die Konzentration von 2-AG (19,6 ± 8,4
nmol/g) war dabei um den Faktor 200 höher als die von Anandamid (99 ± 55 pmol/g).
Die Literatur beschreibt den Nachweis beträchtlicher Mengen von 2-AG in der Lunge
der Ratte, wobei die festgestellten Spiegel im Vergleich zu denen im Rattengehirn
erheblich niedriger waren [63]. Dies verwundert wegen der Funktion der
Endocannabinoide als Neurotransmitter nicht, ursprünglich wurde Anandamid ja auch
im Schweinehirn entdeckt [9]. In einer anderen Studie ist der Nachweis von
Anandamid im Lungengewebe der Ratte sowie in einer Reihe anderer Gewebe der
Ratte nicht gelungen [95]. Am besten sind die Endocannabinoidspiegel im
Nagergehirn untersucht. Dort wirken sie als Neuromodulatoren. Im Vorderhirn der
Maus beträgt der spezifische 2-AG-Gehalt ungefähr 9 nmol/g Gewebe [76,96] und
der Anandamidgehalt 3,2 pmol/g Gewebe [76] beziehungsweise 53 pmol/g Gewebe
[96] – je nach Studie, die man zu Grunde legt. Der Endocannabinoidgehalt der
Kaninchenlunge (99 ± 55 pmol/g für Anandamid und 19,6 ± 8,4 nmol/g für 2-AG) ist
im Vergleich dazu zumindest doppelt so hoch und legt eine biologische Relevanz
nahe. Wie im Mäusegehirn ist auch in der Lunge die Konzentration an 2-AG
wesentlich höher als die von Anandamid.
In weiteren Experimenten mit einem Antagonisten der Fettsäuren-Amidohydrolase
(FAAH) konnte unsere Arbeitsgruppe inzwischen zeigen, dass die für die
Druckerhöhung verantwortlichen Stoffe durch Abbau von Anandamid durch die
Fettsäuren-Amidohydrolase entstehen [92,97]. Wie sich durch Blockade der Cyclo-
oxygenase-2 mit einem Antagonisten zeigte, wird die mutmaßlich entstehende
Arachidonsäure durch die Cyclooxygenase-2 weiter verarbeitet. Für den
Druckanstieg sind offensichtlich die dabei entstehenden Prostanoide verantwortlich.
Während eine Blockade des Thromboxanrezeptors ohne Wirkung blieb, schwächte
die Blockade des EP1-Prostanoidrezeptors durch einen Antagonisten den
Druckanstieg ab, sodass wohl ein Teil des Druckanstiegs durch eine Aktivierung des
EP1-Rezeptors durch Prostaglandin E2 zustande kommen könnte. Diese Befunde
konnten durch den Nachweis der m-RNA sowohl der Fettsäuren-Amidohydrolase,
wie auch der Cyclooxygenase-2 im Kaninchenlungengewebe untermauert werden
[92,97].
Ursprünglich wollten wir mit unseren Untersuchungen eine neue Klasse von
pulmonalarteriellen Vasodilatatoren finden, jedoch zeigen Endocannabinoide –
40
4. Diskussion
entgegen unserer Erwartung – pulmonalarterielle Vasokonstriktion. Pulmonale
Hypertonie könnte daher als Nebenwirkung auftreten, sollten Endocannabinoide
therapeutisch eingesetzt werden, wie es zum Beispiel zur Therapie der
Bewegungsstörungen bei Chorea Huntington denkbar wäre [98]. Eine Therapie mit
∆9-THC hingegen wäre diesbezüglich ungefährlich.
Unsere Ergebnisse könnten zum besseren Verständnis der Pathophysiologie des
pulmonalen Hochdrucks unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen
beitragen. So kommt es beispielsweise im Rahmen des akuten Lungenversagens
(acute respiratory distress syndrom = ARDS) bei der Sepsis zum akuten pulmonalen
Hochdruck. Bakterielle Lipopolysaccharide (LPS) spielen eine große Rolle in der
Sepsis nach Infektion mit gram-negativen Bakterien und im akuten septischen
Lungenversagen [99]. Neben einer LPS induzierten Hochregulation des
Prostaglandin G/H Synthase-2 (COX-2)-Gens in der Kaninchenlunge mit nach-
folgender Umwandlung von freier Arachidonsäure in Thromboxan-B2 als Ursache
pulmonaler Vasokonstriktion [100], könnten auch erhöhte Endocannabinoidspiegel
zur Entstehung des pulmonalen Hochdrucks beitragen. LPS aktivieren im septischen
Schock in Makrophagen und Blutplättchen der Ratte die Produktion von
Endocannabinoiden [48]. Auch im Blut von Patienten im Endotoxinschock konnten
erhöhte Spiegel von Anandamid und 2-AG gemessen werden [49].
Endocannabinoide könnten also durch den von uns aufgezeigten Weg – Abbau
durch die Fettsäuren-Amidohydrolase und die Cyclooxygenase-2 mit Entstehung von
Prostaglandinderivaten – zur Entstehung des pulmonalen Hochdrucks im septischen
Lungenversagen mit beitragen.
41
5. Zusammenfassung
42
5 Zusammenfassung Die endogenen Cannabinoide Anandamid und 2-Arachidonylglycerol (2-AG) erhöhen
dosisabhängig den pulmonalarteriellen Druck in der isolierten, perfundierten und
ventilierten Kaninchenlunge. Cannabinoide, mit einer von der Arachidonsäurestruktur
von Anandamid und 2-AG abweichenden chemischen Struktur, wie das synthetische
HU-210 oder das pflanzliche ∆9-THC erhöhen den pulmonalarteriellen Druck nicht.
Im Gegensatz zu Anandamid und 2-AG führen die stoffwechselstabilen, gegen
enzymatischen Abbau geschützten Analoga von Anandamid und 2-AG, R-
Methanandamid und Noladinäther zu keinem Anstieg des pulmonalarteriellen
Druckes. Blockade des CB1-Rezeptors durch den spezifischen Antagonisten AM-251
verhindert die pulmonalarteriellen Druckerhöhung nach Anandamidgabe nicht. Wir
folgern daraus, dass Abbauprodukte von Anandamid und 2-AG für die
Druckerhöhung verantwortlich sind. Erstmalig konnten wir quantitativ Anandamid und
2-AG in der Kaninchenlunge nachweisen, was eine physiologische Relevanz der
beiden Endocannabinoide bei der Tonus-Regulation des Lungenkreislaufes nahelegt.
6. Literatur
43
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Endogenous cannabinoids increase pulmonary arterial pressure via cyclooxygenase-
2 products in isolated rabbit lungs.
IACM Kongress 12.-13.9.2003, Köln
2) Kram F, Wolf J
Endogene Cannabinoide erhöhen den pulmonal-arteriellen Druck in isolierten
Kaninchenlungen
5. Würzburger Promomed Kongress 16.-17. Januar 2004, Würzburg
3) Wagner JA, Wolf J, Kram F, Frantz S, Wahn H
Endogene Cannabinoide erhöhen den pulmonalarteriellen Druck in isolierten
Kaninchenlungen durch Cyclooxygenase-2-Produkte.
70. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie 15.4.-17.4.2004,
Mannheim
4) Wagner JA, Wolf J, Kram F, Frantz S, Wahn H
Endogenous Cannabinoids Increase Pulmonary Arterial Pressure via
Cyclooxygenase-2 Products in Isolated Rabbit Lungs
European Society of Cardiology Congress 3.-7.9.2005, Stockholm, Sweden
Danksagung
Mein Dank gilt allen, die mir beim Erstellen dieser Dissertationsschrift mit Rat und Tat
zur Seite gestanden haben.
Besonders hervorheben möchte ich Herrn Priv.-Doz. Dr. Jens Wagner. Bei ihm
bedanke ich mich für die Stellung des Themas und die stetige Unterstützung bei
allen Fragen, die im Rahmen der Experimente und dem Verfassen der
Dissertationsschrift auftraten. Seine ansteckende Begeisterung für die Wissenschaft
und die Innere Medizin haben mich nachhaltig geprägt. Bedanken möchte ich mich
auch für die große Gastfreundschaft, die ich bei zahlreichen Besuchen im Hause
Wagner erfahren durfte.
Ebenso gilt mein Dank Herrn Dr. Hans Wahn, inzwischen Oberarzt der
pneumologischen Abteilung der Fachkliniken Wangen. Neben der Stellung des
Themas möchte ich mich für die tatkräftige Hilfe, vor allem in der schwierigen Phase
der Einarbeitung, bedanken. Seine große Gastfreundschaft durfte ich auf diversen
Sommerfesten und bei meinen Besuchen in Wangen im Allgäu erfahren.
Herrn Prof. Dr. G. Ertl danke ich für das Überlassen der Laborräumlichkeiten zur
Durchführung der Experimente.
Bei Herrn Prof. O. Elert für das Korrekturlesen dieser Arbeit in seiner Funktion als
Koreferent.
Bei Herrn Florian Kram für die immer gute und freundschaftlich Zusammenarbeit bei
der Durchführung der Versuche. Seine aufbauende Art und moralische
Unterstützung an manchem langen Versuchstag wird mir immer positiv in Erinnerung
bleiben.
Herrn Henning Kaufmann und Herrn Florian Finter für die geduldige Einarbeitung in
die Versuchstechnik.
Bei Herrn Dr. S. Frantz für die Durchführung der RT-PCR zur Expression der FAAH
und COX-2.
Bei Herrn Prof. G. Kunos für die Durchführung der Flüssigkeitschromatographie/
Massenspektrometrie in seinem Labor in Bethesda, Maryland.
Frau Helga Wagner, Frau Charlotte Dienesch, Frau Lisa Bauer und Herrn Marco
Abeßer für die Tatkräftige Unterstützung in Fragen der Labororganisation,
wissenschaftlichen Methodik und die vielen aufmunternden Worte.
Meinem Bruder Felix für Durchsicht und Korrektur der Arbeit und meinen Eltern für
ihre stete Förderung, die dies alles erst ermöglicht hat.
Lebenslauf Persönliche Daten Name Jürgen Wolf
Geburtsdatum: 17.05.1978
Geburtsort: Heilbronn
Schulausbildung 1984 - 1988 Michael-Beheim-Grundschule Willsbach
1988 - 1997 Justinus-Kerner-Gymnasium Weinsberg
Zivildienst 1997 - 1998 Tätigkeit im Pflegebereich an der Klinik Löwenstein,
Zentrum für Pneumologie, Thorax- und Gefäßchirurgie
Hochschulausbildung
10/1998 – 5/2005 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians-
Universität Würzburg
9/2000 Ärztliche Vorprüfung
9/2001 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
4/2004 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
5/2005 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Praktisches Jahr
4/2004 – 8/2004 Chirurgie am Krankenhaus Brixen, Brixen, Italien
8/2004 – 11/2004 Praktisches Jahr in Innere Medizin, Medizinische Klinik der
Universität Würzburg
11/2004 – 3/2005 Praktisches Jahr in Neurologie, Neurologische Klinik und
Poliklinik der Universität Würzburg
Beruf seit 06/2005 Assistenzarzt an der Medizinischen Klinik und Poliklinik I der
bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Würzburg, November 2005
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