Autoimmunreaktionen gegenThrombozyten

Bielefelder Seminar zur Vorbereitung der Facharztprüfung fürTransfusionsmediziner 14.4–19.4.2013 (DGTI und BDT)

17.4.2013

Prof. Dr. V. Kiefel

Institut für TransfusionsmedizinUniversitätsklinikum Rostock

Hämorrhagische Diathese durch Störung derprimären Hämostase

• Thrombozytopenie• Thrombozytäre Funktionsstörungen

– hereditär

* Thrombasthenie Glanzmann

* Bernard-Soulier-Syndrom

* „Makrothrombozyopenien“

– erworben

* durch Medikamente ausgelöst (ASS, Antibiotika, . . . )

* im Rahmen bestimmter Erkrankungen Paraproteine, Niereninsuffizi-

enz, . . .

* durch Autoantikörper bedingt (meist Anti-GP IIb/IIIa)

• Schäden der Integrität des Endothels• pathologische Interaktion von vWF/GP und Ib/IX/V

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Thrombozytenkinetik – Elimination vonThrombozyten durch Alterung

„Cohort-labelling“

Thrombozytenelimination bei Nor-malpersonen

Thrombozytenumsatz bei Normalpersonen im steady state:27−73×109/l

2

Pathophysiologische Grundlagen der Entstehungeiner Thrombozytopenie

1. Eingeschränkte Thrombozyto-poese (•)

2. Splenomegalie (4)3. beschleunigter Ver-

brauch/Abbau der Thrombo-zyten (◦)

4. komplexe Ursachen

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Diagnostische Hinweise auf Pathogenese einerThrombozytopenie

• Lebensalter bei Auftreten/Fortbestehen der Thrombozytopenie• zeitlicher Zusammenhang des Eintritts einer Thrombozytopenie mit anderen Ereignissen,

auffälliger zeitlicher Verlauf

– Beginn der Thrombozytopenie während der Schwangerschaft– Beginn nach Medikamenteinnahme– Beginn nach Transfusion– Beginn wenige Tage nach einem (viralen) Infekt– Synchronisierung thrombozytärer Phasen mit weiblichem Zyklus

• begleitende klinische Symptome

– Skelettanomalien– Symptome, die auf einen Immundefekt hinweisen– zerebrale Symptome– Hautsymptome (Ekzeme)– thromboembolische Ereignisse– Splenomegalie– Nephropathie– Innenohrschwerhörigkeit– Hämangiome 4

Diagnostische Hinweise auf Pathogenese einerThrombozytopenie (Forts.)

• Laborbefunde

– morphologische Auffälligkeiten im Blutausstrich

* Agglutinationsphänomene: Pseudothrombozytopenie, Satellitismus

* Makrothrombozyten

* Einschlußkörperchen in Granulozyten

* Fragmentozyten

– Anäme, Laborparameter, die auf eine Hämolyse schließen lassen– Autoantikörper, Alloantikörper gegen Thrombozyten– Autoantikörper gegen Erythrozyten– Laborparameter, die Hinweise auf eine DIC geben– Antikörper gegen PF4/Heparinkomplexe/funktioneller Test auf HIT-Antikörper– erhöhte Aktivitäten von Transaminasen (Leberschädigung)

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Autoimmunthrombozytopenie (AITP)

Klassifikation nach dem zeitlichen Ablauf (neue Definition)∗

neu diagnostizierte AITP < 3 Monatepersistierende AITP 3–12 Monatechronische AITP > 12 Monate

primäre/idiopathische vs sekundäre AITPakute AITP („idiopathisch“) meist im Kindesalter, m=w, zeitlich limi-

tiert (6 Monate) meist zeitlicher Zusam-menhang mit Infekt

chronische AITP („idiopathisch“) in allen Lebensaltern, fluktuierenderVerlauf w>m

sekundäre AITP SLE, CLL, Evans-Syndrom, NHL, HIV,HCV

Sonderformzyklische Thrombozytopenie bei weibl. Pat.: zyklusabhängige

Schwankungen der Thrombozytenzahl

∗Rodeghiero F et al., Blood 2009;113:2386-23936

Klinische Kriterien einer AITP

• Thrombozytopenie

• normale bis vergrößerte Megakaryozytenmasse im Knochen-mark

• Fehlen anderer (als immunologischer) Ursachen für Throm-bozytenverbrauch oder beschleunigten Thrombozytenabbau

• Fehlen einer Splenomegalie

• (Nachweis von plättchenspezifischen Autoantikörpern)

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Pathologische Zustände durch thrombozytäreAutoantikörper

• AITP

• zyklische Thrombozytopenie:

• erworbene Thrombasthenie durch thrombozytäre Autoanti-körper

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Erworbene Thrombasthenie∗

• Anti-GP IIb/IIIa (Serum, autologe Thrombozyten)

• keine oder noch geringgradige Thrombozytopenie (ggf. Fluk-tuation zwischen „AITP“ und „ET“)

• Autoantikörper bewirkt eine massive Funktionsstörung

• Diagnose:

– immunologischer AutoAk-Nachweis

– Funktionstest mit Serum/Eluat (Aggregometrie)

∗Erstbeschreibung: Niessner et al. Blood 1986;68:5719

AITP – zerebrale Blutung (ICH) bei Kindern ∗

• 40 Kinder bei Patienten mit ICH bei AITP80 Kinder ohne ICH bei AITP (Kontrolle)

• Letalität: 10/40 (25%)

• Schätzung der Wahrscheinlichkeit einer ICH bei AITP: 0.19% .. 0.78%

• Intervall zwischen Diagnosestellung und ICH:0–7 Tage (n=18),8 Tage–6 Monate (n=22), davon chronische ITP (12)

• kein eindeutiger Zusammenhang zwischen Thrombozytenzahl und ICH

• starker Zusammenhang zwischen Hämaturie und ICH (9/40 vs. 0/80),kein starker Zusammenhang zwischen wet purpura undICH (11/40 vs. 15/80)

∗Psaila et al., Blood 2009;114:477713

Harrington 1951: Plasma-Übertragung von ITP-Patienten auf gesunde Probanden (J Lab ClinMed 1951;38:1)

Shulman et al. 1965: Der TP-auslösendeFaktor findet sich in einer γ-Globulin- rei-chen Plasmafraktion (Ann NY Acad Sci1965;24:499)

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Neuere Beobachtungen zur Pathogenese der ITP∗

• „Molecular mimicry“ als möglicher Mechanismus zur Auslösung einer ITP

• Defekte Tregs (T-regulatory cells: CD4+CD25+FoxP3+) bei Patienten mitITP

• T-Zell-vermittelte ITP („IVIG refraktäre ITP“?)

• ↑ BAFF (B-cell activating factor)-Konzentrationen bei Patienten mit ITP

• Zusammenhang zwischen oxidativen Stress und (chronischer/persistierender)ITP (vanin-1 ↑)†

• Thrombozytopenie bei ITP

– Folge eines beschleunigten Abbaus– teilweise auch Resultat einer reduzierten Thrombozytopoese‡

∗Semple et. al. Curr Opin Hematol 2010;17:590†Zhang et al., Blood 2011;117:4569‡Kuter und Gernsheimer Hematol-Oncol Clin N Am 2009;23:1193

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Übersicht: Techniken zum Nachweis thrombozytärerAntikörper

• Nachweistechniken

– Antiglobulintest mit intakten Thrombozyten

* PIFT, ELISA (T.-Suspension, Festphase); Agglutinationstechniken mit Parti-keln, die mit Anti-IgG beladen sind

* Problem: Antikörpergemische

– Glykoproteinspezifische Tests:

* Immunoblot, Immunpräzipitation,

* GP-spezifische Immuntests (MAIPA, Immunobead assay) unter Verwendungmonoklonaler Antikörper

• Freie/zellständige Antikörper

– Indirekte Tests– Direkte Tests (PAIgG, GP-PAIgG), Eluat → Ak-Nachweis im indirekten Test

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Von thrombozytären Antikörpern erkannte Antigene

• Autoantikörper• Alloantikörper

– HLA-Antikörper– plättchenspezifische Alloantikörper– Isoantikörper

• medikamentinduzierte thrombozytäre Antikörper

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Nachweis thrombozytärer Antikörper –„Antiglobulintest mit intakten Thrombozyten (PIFT,ELISA)“

• geeignet zum Nachweis plättchenreaktiver AK

• zur Charakterisierung thrombozytärer AK bei Diagnostik der meistenImmunthrombozytopenien nicht geeignet

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Plättchen-Suspensions-Immunfluoreszenztest(PSIFT)

• indirekt

– Inkubation Thrombozyten + Serum– Waschen– Inkubation Thrombozyten + FITC-

Anti-IgG– Waschen– Immunfluorezenz im Mikroskop

beurteilen

• direkt

– Inkubation Thrombozyten + FITC-Anti-IgG

– Waschen– Immunfluorezenz im Mikroskop

beurteilen

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a: freie und zellständige Antikörperb: zellständige Antikörper (AITP)c: freie Antikörper (Alloimmunthrombo-zytopenie)

PAIgG – GP-PAIgG

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Bestimmung von PAIgG: Sensitivität, Spezifität

Sensitivity Specificity Parameters,Techniques

References

44/74 (59.5%) 22/56 (39.3) PAIgG PRAT Mueller-Eckhardt etal., 1980

26/39 (67,7%) 6/15 (40%) PRAT Kiefel et al.,1986

38/49 (78%) 6/32 (19%) IRMA Warner et al.,1999

60/81 (74%) 12/46 (74%) CELIA Brighton et al.,1996

– (94%) – (67%) PIFT Hagenström etal., 2002

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PAIgG – Welche Mengen finden verschiedeneAutoren?

Assay IgG pro Thrombozyt Reference

quantitative complementlysis inhibition assay

200–400 fg Dixon et al., 1975

Fab anti-Fab assay 0.36–1.96 fg Luiken et al. 1977Competitive ELISA 1.3–15.3 fg Nel & Stevens, 1980Competitive ELISA 2.04 ± 1.1 fg Follea et al.Radial immunodiffusion(platelet lysate)

1.7 – 7.0 fg Morse et al., 1981

ELISA (platelet lysate) 2.6 – 17.4 fg Hegde et al., 1981“Rocket”-immunoelectrophoresis(platelet lysate)

4.3 ± 1.7 fg Kunicki et al., 1982

125I monoclonal anti-humanIgG assay

0.02 – 0.06 fg1 LoBuglio et al., 1983

Competitive ELISA < 1.8 fg Kiefel et al., 1987

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PAIgG – was ist das?

• IgG in α-Granula

• an IgG FcgR gebundenes IgG

• an Plättchenmembranen ge-bundenes IgG

• plättchenspzifische Autoanti-körper

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Von thrombozytären Autoantikörpern erkannteAntigene der Plättchenmembran

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Glykoproteinspezifisches IgG („GP-PAIgG“):diagnostischer Wert

Sensitivity Specificity Parameters,Techniques

References

36/78 (46.2%) 0/40 (100%) GP-PAIgG (MAI-PA)

Kiefel et al., 1996

19/49 (39%) 29/32 (91%) GP-PAIgG (MAI-PA)

Warner et al., 1999

40/81 (49%) 40/51 (78%) GP-PAIgG (MAI-PA)

Brighton et al., 1996

7/18 (38.9%) 59/61 (96.7%) GP-PAIgG (MAI-PA)

Hagenström et al.,2002

159/282 (56.4) 269/289 (93.1%) GP-PAIgG (IB-Assay)

McMillan et al., 2003

101/123 (82.1) 88/95 (92.6) GP-PAIgG flowcytometric beadassay

Liu et al. 2011

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Alternativverfahren: Elution, Untersuchung desEluats in einem Antiglobulinbindungstest∗

Patienten mit AITP 20/41 (→ Sensitivität 48,8%)Patienten mit NI-TP 0/24 (→ Spezifität 100%)

∗Kiefel et al., Ann. Hematol. 1996;72:280-28526

Nachweis freier thrombozytärer Autoantikörper∗

Patients with AITP No +ve/no studiedIgG anti-GP IIb/IIIa and/or Ib/IX 9/78 (11.5%)IgM anti-GP IIb/IIIa and/or Ib/IX 7/78 (9%)IgA anti-GP IIb/IIIa and/or Ib/IX 2/78 (2.6%)Patients with nonimmune TP No −ve/no studiedIgG anti-GP IIb/IIIa and/or Ib/IX 38/40 (95%)IgM anti-GP IIb/IIIa and/or Ib/IX 37/40 (93%)IgA anti-GP IIb/IIIa and/or Ib/IX 40/40 (100%)

∗Kiefel et al., Ann Hematol,1996;72: 280-28527

Korrelation GP-PAIgG/Eluate∗

∗Kiefel et al., Ann. Hematol. 1996;72:280-285 28

GP-PAIgG vs „freie“ Autoantikörper∗

∗Kiefel et al., Ann. Hematol. 1996;72:280-28529

Seltene Autoantikörperspezifitäten

GP-specificity ReferencesAnti-GP V (GP-PAIgG) in patients with AITP Joutsi-Korhonen et al.,

2001Anti-GP V Sera of patients with gold inducedimmune thrombocytopenia

Garner et al., 2002

Anti-Ia/IIa in a patient with a B-CLL and AITP Castaldi et al., 1989Anti-GP VI found in a Japanese, with steroid-refractory AITP

Sugiyama et al., 1987

Anti-GMP140 (CD62), one antibody identifiedamong sera of 55 patients

Bierling et al. 1994

Anti-CD9 (activation platelets), anti-Fcγ RII (inthe same patient) inhibiting anti-CD9 inducedplatelet activation

Yanabu et al., 1993

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Passive Immunthrombozytopenie desNeugeborenen (bei mütterl AITP)

Anteil Neugeborener mit Thrombozytenzahlenunter

ICH Autoren

100 000/µ l: 24/68 (35%),50 000/µ l: 12/68 (18%) 2/68 Christiaens et al., 1997

150 000/µ l: 11/46 (24%),50 000/µ l: 5/46 (11%) 0/46 Gandemer et al., 1999

150 000µ l: 28/64 (43.8%),50 000/µ l (bei der Geburt): 8/64 (12.5%),50 000/µ l (in der 1. Lebensw.): 12/64 (18.8%) 0/64 Valat et al., 1998

100 000/µ l: 1/52 (15.4%),50 000/µ l: 4/52 (7.7%) 0/52 Yamada et al., 1998

100 000/µ l: 35/88 (39.8%)50 000/µ l: 18/88 (20.5%) 2/88 Samuels et al., 1990

150 000/µ l: 31/109 (28.4%)50 000/µ l: 11/109 (10.1%) (1)/123 Webert et al., 2003

5/441 (1.13%)

33

ITP – Klassifikation der Therapiemodalitäten∗

1st line Steroide bei starker Blutung, zusätzlich IVIG (eventuell Anti-D, ggf.Thrombozytenkonzentrate)

2nd line Azathioprin, Vinca-Alkaloide oder Splenektomie, NEU: TRA, Rituximab3rd line Azathioprin, Vinca-Alkaloide, NEU: TRA, Rituximabpost 3rd line Anti-D, Cyclophosphamid, Cyclosporin, MMF, Danazol, Alemtuzu-

mab, StammzellTX

AITP in der Schwangerschaft: ivIgG, Prednisolon, Geburtsmodalitäten planen!

∗DGHO, DGTI, GTH-Leitlinien zur ITP: Onkologie 2010;33(Suppl 3):134

Cortikosteroide, IVIG, Anti-D

• Prednisolon: 2 mg/(kg*d) oder 60 mg/(m2*d)∗

• „Pulsed dexamethasone“-Therapie†

• IVIG: Gesamtdosis 2g/kg in 2–5 Tagen‡

• Rhesus Anti-D i.v. bei Rh D positiven Patienten, Anfangsdo-sis 50 µg/kg in 1–2 Gaben

∗George et al., A Practice guideline... Blood 1996;88:3†Andersen et al., NEJM;1994;330:329‡Imbach et al., Lancet 1981;i:1228

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Neues zur Therapie der AITP

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S.c. Gabe von Anti-D∗

• 22 Patienten mit 50 µg/kg Anti-D (Rhophylac, Rhesogam: 0.33ml/kg, 3–5 Minuten)

– bei 17/22 (77%) Anstieg der Thrombozytenzahl innerhalbeiner Woche, klinischer Effekt bereits innerhalb von 2 Tagen

• Nebenwirkungen:

– 0/3 der Patienten mit (zuvor erlebten) Nebenwirkungen aufi.v. Anti-D erlitten Nebenwirkungen auf das s.c. Anti-D

– keine lokalen Reaktionen auf die s.c. Injektion

– keine Hämolysen

∗Meyer, O et al., Vox Sang. 2006,91 Suppl. 1:1337

Rituximab (AITP bei Erwachsenen)∗

• Studien zur Wirksamkeit (n=19, 313 Patienten, bis April 2006)

– Remissionen (> 50.000/µ l): 62,5%– Komplette Remissionen (> 150.000/µ l): 43,6%

• Studien zu Nebenwirkungen (n=29, 306 Patienten)

– Todesfälle 9/306 (2,9%)– Sonstige Nebenwirkunen (andere Studien): Broncho-

spasmus, „Serumkrankheit“, anaph. Reaktionen, interst.Pneumionie, Infektionen

Indikation kritisch stellen: z.Zt. noch experimentelle Therapie.

∗Arnold et al., Ann Intern Med 2007;146:25-3338

Agonisten des Thrombopoietinrezeptors

• Romiplostim, [NplateR] (AMG 531, Amgen: mit dem TPO-Rezeptor reagierender „peptibody“, s.c.)

– Nebenwirkungen: Kopfschmerz, grippeähnliche Sym-ptome

– Retikulin-Fibrose bei einigen über längere Zeit behan-delten Patienten

• Eltrombopag [RevoladeR] Glaxo Smith Kline (oral)

– Niedrigmolekulare Substanz, wirkt über Interaktion mitder transmembranösen Domäne des TPO-Rezeptors

– Häufigste Nebenwirkungen: Übelkeit und Erbrechen

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Romiplostim (AMG 531 [NplateR] bei chronischertherapierefraktärer AITP)∗

• Randomisierte prospektive Studie: 63 Patienten ohne Milz,62 Patienten mit Milz

• Kriterium: durable response rate: 6 Wo mit > 50,000/µ l

splenektomiert nicht splenektomiert totalPlazebo Romiplostim Plazebo Romiplostim Plazebo Romiplostim

Inzidenz (durable response) 0/21 16/ 42 (38%) 1/21 (5%) 25/41 (61%) 1/42 (2%) 41/83 (49%)I. mit rescue drugs 1/21 (5%) 19/42 (45%) 3/21 (14%) 27/41 (66%) 4/42 (10%) 46/83 (55%)

∗Kuter et al., Lancet 2008;371:39540

Eltrombopag [RevoladeR] bei chronischertherapierefraktärer AITP∗

• Prospektive, randomisierte, plazebokontrollierte Studie: 73Patienten mit Eltrombopag, 37 Patienten mit Placebo

• Primäres Erfolgskriterium: Thrombozytenzahl an Tag 43 >50.000/µ l

Eltrombopag Placebo43/73 (59%) 6/37 (16%)

OR: 9,61; 0.95-CI: 3.31 .. 27.86

∗Bussel et al., Lancet 2009;373:64141

Neue Daten zu einer „alten“ Therapie:Splenektomie∗

CR∗ 3506/5087 (69%)CR in Serien ≥ 5 Jahren 779/1159 (67%)Rezidive nach CR 15% (Spannw. 0-51%)

Ereignisse bei chirurgischer Intervention:Tod

Laparotomie 48/4955 (1%)Laparoskopie 3/1301 (0.2%)

Sonstige Komplikationen:Laparotomie 318/2465 (12,9%)Laparoskopie 88/921 (9,6%)

∗komplette Remission, Thr > 150 000 über > 10 Tage

∗Kojouri et al. Blood 2004;104:2623 5087 Patienten aus 15 Studien mit ≥ 15Fällen

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Neuere Richtlinien zur Therapie, Diagnostik der ITP

• DGHO, DGTI, GTH: Diagnostik und Therapie der Immun-thrombozytopenie∗

• Leitlinie „Immunthrombozytopenie (ITP) im Kindes- und Ju-gendalter“ (GTH)†

• The ASH 2011 evidence-based practice guideline for ITP‡

• International consensus report on the investigation and ma-nagament of primary immune thrombocytopenia§

∗Onkologie 2010;33(Suppl 3):1†auf http://www.awmf.org‡Blood 2011;117:4190§Blood 2007;115:168

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Medikamentinduzierte Immunthrombozytopenie

• Akute und meist schwere Immun-thrombozytopenie nach Einnahmebestimmter Medikamente

• Nach Ersteinnahme Thrombozytope-nie nach mindestens 5–7 Tagen, beiReexposition nach wenigen Stunden

• in den meisten fällen lassen sichmedikamentabhängige Antikörpernachweisen (drug-dependent anti-bodies: ddab), die mit Epitopen aufGP IIb/IIIa oder GP Ib/V/IX reagieren

Prinzip Nachweis ddab

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Beispiel Nachweis eines ddab

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Medikamentinduzierte Immunthrombozytopenie,vermuteter Bindungsmechanismus von ddab∗

∗Aster and Bougie N Engl J Med 2007;357:580–58747

Medikamentinduzierte Immunthrombozytopenie -auslösende Substanzen∗

Drug n commentsQuinidine 18Quinine 3Quinidine & Quinine 5Trimethoprim-sulfamethoxazole 6 1 metabolite–specific

(sulfamethoxazole)Rifampicin 4Nomifensine 2Paracetamol 1 1 metabolite-specificCarbamazepine 4Diclofenac 5Ibuprofen 3 1 metabolite-specificRanitine 1Vancomycin 1Eptifibatide 1Ampcillin 1Methylpredisolon 1

∗(im Labor V.K.), weitere Substanzen: George JG (2009) Drug-Induced Thrombocytopenia –Database: http://www.ouhsc.edu/platelets/DITP/Database_single/Database_single.htm 48

Sonderfall GP IIb/IIIa-Antagonisten: Abciximab

• Abciximab induziert in 0.7% (5% bei wiederh. Anwendung)eine Immunthrombozytopenie (Literatur)

• Therapie lebensbedrohlicher Blutungen (extrem selten):Thrombozytentransfusion

• Abfall Thrombozyten auf < 50% in 5/53 (9.6%), auf < 25%2/52 (3.9%)

• GP-PAIgG Anstieg in 36/52 Fällen → Beeinträchtigung derAITP-Diagnostik

• in 24/52 Fällen entsteht unter Abciximab eine Pseudothrom-bozytopenie

49

50

Sonderfall Heparininduzierte Thrombozytopenie(HIT)

• Pathophysiologie: Antikörper gegen PF4/Heparinkomplexe →Thrombozytenaktivierung → Thrombingenerierung → thromboem-bolische Ereignisse

• Diagnostik: standardisierte Befunderhebung (4T Score), funktio-neller Test (HIPA), „Antigentests“ (PF4/Heparin-ELISA)

• Therapie (alternative Antikoagulation): OrgaranR, ArgatraR, (LepirudinR)

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Stellenwert immunologischer Diagnostik – AITP• Nutzen für Diagnosestellung

u./o. Therapieplanung

– Sicherung der Diagnosevor eingreifenden thera-peutischen Maßnahmen(z.B. Splenektomie)

– Sekundäre AITP (v.a. beimalignen Grunderkran-kungen)

– Wahrscheinlichkeit AK-Nachweis:

Akute ITP << chron.AITP << sek. AITP

• Möglichst GP-PAIgG bestim-men!

• Anforderungen andas Thrombozyten-immunologische Labor

– hoch

– GP-PAIgG bei sehrthrombozytopenischenPatienten oft schwierig zubestimmen

– Kommerzieller Test er-kennt Autoantikörperteilweise nicht

• Bewertung von Befunden!

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Stellenwert immunologischer Diagnostik –medikamentinduzierte Immunthrombozytopenie(MIT)

• Nutzen . . .

– Positiver Antikörpernach-weis gilt als spezifisch fürMIT

– Rate falsch negativerBefunde ist unbekannt

• Anforderungen . . .

– extrem hoch

– Problem: Immunisierunggegen Metaboliten

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Eine Zusammenstellung der Literatur zu diesem Seminarbeitragerhalten Sie auf der Webseite der Transfusionsmedizin am Univ.-Klinikum Rostock:http://www.tmed.med.uni-rostock.de

Anschrift:Prof. Dr. Volker KiefelInstitut für TransfusionsmedizinUniv.-Klinikum RostockErnst-Heydemann-Str. 6D-18057 Rostockvolker.kiefel@med.uni-rostock.de

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