Post on 08-Jan-2020
Instrumentelle Analytik
Refraktometrie, Polarimetrie und
Zirkulardichroismus
Wintersemester 2019/20
Dr. Stefanie Kellner, Apothekerin
stkech@cup.lmu.de
Refraktometrie
Grundlagen
Lichtgeschwindigkeit
• Die Lichtgeschwindigkeit c = 3x108m/s ist eine Konstante
• Aber: die Lichtgeschwindigkeit verändert sich beim Übergang eines
Lichtstrahls in ein optisch dichteres Medium.
• Der Wert von c hängt vom optischen Medium ab !
• 3x108m/s gilt für das Vakuum
• Die Veränderung der Lichtgeschwindigkeit beim Übergang in ein
anderes optisches Medium führt zur Lichtbrechung.
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Welle im brechenden Medium
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Snellius'scher Brechungsdindex
• Übergang aus einem optisch dünnen Medium 1 in ein optisch
dichteres Medium 2
• Der eintretende Strahl wird zum Lot hin gebrochen
• Eintretender und austretender Strahl bilden mit dem Lot die
Winkel a und b
• Der Quotient der Sinuswerte dieser Winkel entspricht dem
Verhältnis der Brechungsindices und dem Quotienten der
Lichtgeschwindigkeiten c1,c2, in Medium 1 und 2
• Beim Übergang vom dichteren Medium 2 in dünneres Medium
1 gilt alles umgekehrt
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dünneres Medium 1
dichteres Medium 2
c1
c2
b
a
b
a
sin
sin
Medium
Vakuum
t
Vakuum
t
Medium
C
C
n
n
Umkehrung des Strahlenganges
dünneres Medium 1
dichteres Medium 2
c1
c2
b
a dünneres Medium 1
dichteres Medium 2
c1
c2
b
a
dünn nach dicht: zum Lot hin dicht nach dünn : vom Lot weg
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Brechungsindex (oder Brechzahl)
• Der Brechungsindex gilt laut Definition RELATIV, d.h. für einen
bestimmten Übergang zwischen zwei Medien
• Im Allgemeinen dient Luft als Bezugsmedium.
• Absolute Werte für n in der Literatur beziehen sich auf Vakuum oder Luft (fast
identisch). n gibt dann an, um wie viel Mal langsamer das Licht im Medium als
im Vakuum ist :
n=c/cmedium(man beachte Definition der Lichtgeschwindigkeit: c=3x108m/s im Vakuum)
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hängt ab von …
• Der Brechungsindex ist stark von
der Temperatur abhängig.
• Der Brechungsindex ändert sich
mit der Wellenlänge des Lichts
(Dispersion).
• Im Allgemeinen gibt man den
Brechungsindex bei der
Spektrallinie des gelben
Natriumlichtes (D-Linie, 589 nm)
an.
• Temperatur und Wellenlänge bzw.
Spektrallinie werden als Indizes
vermerkt
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Totalreflexion
dünneres Medium 1
dichteres Medium 2
c1
c2
b1
a1
dicht nach dünn : vom Lot weg
b2
b2
• Wenn der austretende Strahl mehr als 90° vom Lot weg gebrochen wird, entsteht Totalreflexion.
– der Strahl verläßt das dichtere Medium nicht
– Austritswinkel = Eintrittswinkel (b2)
• Der Grenzwinkel der Totalreflexion ist der Einstrahlwinkel, bei dem gerade die 90° bzw. die Totalreflexion erreicht werden
bb
sinsin
)90sin(t
dünnt
dünn
t
dicht
nnn
• Tritt nur beim Übergang in ein optisch dünneres Medium auf
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• Bekannt und beliebt aus dem OC-Praktikum
• Genutzt zur Bestimung des Brechungsindex`
• Meßprinzip:
die Bestimmung des Grenzwinkels der Totalreflexion
• Funktioniert mit Tageslicht
• Temperiert (normalerweise 20°C)
• Ggf. auf Zuckergehalt geeichte Skala
Abbé-Refraktometer
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Messung des Grenzwinkels der Totalreflexion
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Beleuchtungsprisma
Messprisma
Beleuchtungsprisma
Messung des Grenzwinkels der Totalreflexion
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Dichtes Medium
Dichtes Medium
Dünnes Medium
Lot
Lot
Messprisma
BeleuchtungsprismaLichtquelle
Fall 1
Alle Einfallswinkel kleiner
Totalreflexion gelangen von
Beleuchtungsprisma durch
Substanz ins Messprisma
Messung des Grenzwinkels der Totalreflexion
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Dichtes Medium
Dichtes Medium
Dünnes Medium
Lot
Messprisma
BeleuchtungsprismaLichtquelle
Fall 2
Der Einfallswinkel welcher
dem Grenzwinkel der
Totalreflexion entspricht
Messung des Grenzwinkels der Totalreflexion
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Dichtes Medium
Dichtes Medium
Dünnes Medium
Lot
Messprisma
BeleuchtungsprismaLichtquelle
Fall 3
Der Einfallswinkelist größer
als die Totalreflexion. Daher
erreicht dieses Licht nicht das
Messprisma
Messung des Grenzwinkels der Totalreflexion
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Messprisma
Beleuchtungsprisma
Dichtes Medium
Dichtes Medium
Dünnes Medium
Lot
Spiegel
Okular
Lichtquelle
hell dunkel
Anwendungen
• Identitäts-, Reinheits-, Gehaltsprüfung• Der Brechungsindex binärer Mischungen ist linear von der
Konzentration (in Vol-%) der Komponenten abhängig, wenn bei ihrer Mischung keine Volumenänderung auftritt. Im anderen Falle treten Abweichungen von der Linearität auf. Für genaue Konzentrationsbestimmungen müssen dann Kalibriergeraden aufgestellt werden.
• Gehaltsbestimmung• CsCl in Molekularbiologie
• Zucker im Weinbau
• Detektor in der Chromatographie
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Quiz-Time
Raumname: KELLNERINSTRU
Polarimetrie
Überblick: Polarimetrie
In der Polarimetrie wird die Drehung der Schwingungsebene
des linear polarisierten Lichtes durch optisch aktive
Substanzen gemessen (optische Drehung) und zur Analyse
herangezogen
Anwendung in der Pharmazie:
• Identitätsprüfung, z.B. N-acetyl-L-cystein
• Reinheitsprüfung, z.B. Atropin
• Gehaltsbestimmung, z.B. Ethambutol
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*
*
**
Linear polarisiertes Licht
• Natürliches Licht schwingt in allen Ebenen, dieses Licht wird als nicht polarisiert bezeichnet.
• Unter linear polarisiertem Licht versteht man Licht, welches nur in einer Ebene schwingt.
• Linear polarisiertes Licht kann mit Hilfe eines Polarisators (Nicol`sches Prisma) erhalten werden.
X
Z
Y
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Polarisator, Analysator: Nicol´sches Prisma
• Das Nicol´sche Prisma besteht aus einem Kalkspatkristall, der geteilt und mit Kanadabalsam zusammengefügt wird.
• Fällt Licht auf das Prisma, so wird dies in zwei verschiedene Lichtstrahlen mit gleicher Intensität geteilt. Durch unterschiedliche Brechung beim Eintritt in das Prisma entstehen ein ordentlicher Strahl und ein außerordentlicher Strahl.
• Beide Strahlen sind linear polarisiert, ihre Schwingungsebenen liegen senkrecht zueinander. Der ordentliche Strahl wird am Kanadabalsam totalreflektiert (er überschreitet den Grenzwinkel der Totalreflektion von 90°). Er wird auf diese Weise entfernt.
• Der außerordentliche Strahl schwingt in der Papierebene, er fällt nahezu gerade durch das Prisma und wird zur Messung verwendet.
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Linear polarisiertes Licht
• Natürliches Licht schwingt in allen Ebenen, dieses Licht wird als nicht polarisiert bezeichnet.
• Unter linear polarisiertem Licht versteht man Licht, welches nur in einer Ebene schwingt.
• Linear polarisiertes Licht kann mit Hilfe eines Polarisators (Nicol`sches Prisma) erhalten werden.
• Bei linear polarisiertem Licht schwingt der E-Vektor in der entsprechenden Ebene (z.B. XZ)
Z
Y
X
X
Z
Y
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Vektoraddition
23
Vektorsubtraktion ? ! !
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Polarisator/Analysator
• Steht der Analysator parallel zur Ebene von linear polarisiertem Licht, läßt er alles Licht passieren
• Steht der Analysator senkrecht zur Ebene von linear polarisiertem Licht, blockiert er alles Licht
• Und dazwischen ?
• Der senkrecht zur Analysatorebene stehenden Teil wird blockiert
• Der parallel stehende Teil wird durchgelassen
Polarisator Analysator
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Analysator
• Ein Analysator steht senkrecht in der Papierebene
• Ein Strahl polarisierten Lichtes schwingt in einem Winkel a, wobei 0<a<90
• Der Analysator lässt die Komponente durch, die in seiner Ebene schwingt.
• Diese Komponente hängt vom Winkel a ab, und kann durch Zerlegung des Schwingungsvektors in zwei Komponenten bestimmt werden, von denen eine parallel, die andere senkrecht zum Analysator steht
a
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x
y
z
Polarisierung in der XZ-Ebene
Phase:180° oder p
Phase:360°
oder 2pPhase:90°
oder 1/2p
Vektor schwingt in der XZ-Ebene:
wenn die Welle z.B. bei 90° die Amplitude 0 hat, (cosinus)
dann hat der Vektor bei 360° maximalen Betrag
27
x
y
z
Polarisierung in der XY-Ebene
Phase:180° oder p
Phase:360°
oder 2pPhase:90°
oder 1/2p
28
x
y
z
Vektoraddition bei gleichen Phasen
Auge
z
y
Ergebnis: bei Addition zweier senkrechter Schwingungen
mit gleicher Phase erhält man linear polarisiertes Licht,
dessen Vektor diagonal zwischen den beiden
Ausgangsvektoren schwingt
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y
z
Vektoraddition bei verschobenen Phasen
Auge
Ergebnis: bei Addition zweier senkrechter Schwingungen
mit um 90° verschobener Phase erhält man polarisiertes Licht,
dessen Vektor sich in Abhängigkeit von der Phase dreht.
Es handelt sich um zirkular polarisiertes Licht
z
y
Phase:180° oder p
Phase:360°
oder 2p
Phase:90°
oder 1/2p
z
y
p
z
y
1/2 p
/2p
z
y
3/2p
Phase:270°
oder 3/2p
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Zirkular polarisiertes Licht
• Dieses Licht schwingt ebenfalls nur in einer Ebene, wobei
sich die Schwingungsrichtung bei der Ausbreitung dreht.
Erfolgt die Drehung der Schwingungsebene nach links, so
spricht man von linkszirkular polarisiertem Licht, dreht sie
sich nach rechts, so liegt rechtszirkular polarisiertes Licht
vor.
• Besitzen diese beiden Strahlen die gleiche Frequenz,
Amplitude und Phase so addieren sie sich zu einem
linearpolarisierten Lichtstrahl.
Linear polarisierte Welle
http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/dedemo0.htm
Überlagerung von zwei linear polarisierten Wellen gleicher Phase
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Überlagerung von zwei linear polarisierten Wellen mit
Phasendifferenz +90°
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Überlagerung von zwei linear polarisierten Wellen mit
Phasendifferenz -90°
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Überlagerung von zwei zirkular polarisierten Wellen
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Chirale Substanzen sind optisch aktiv
• Steht der Analysator senkrecht zum Polarisator, dringt kein Licht durch
• Aber: Wenn im Lichtstrahl eine Küvette mit einer Lösung einer chiralen Substanz eingebracht wird beobachtet man Durchlass von Licht am Analysator
• Die Lösung hat die Ebene des polarisierten Lichtes gedreht.
• Man bezeichnet die Substanz als optisch aktiv
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Optisch aktive Substanzen
• Man stellt sich einen linear polarisierten
Strahl vor als zusammengesetzt aus zwei
gegenläufig zirkulär polarisierten Strahlen
• Optisch aktive Moleküle wechselwirken
unterschiedlich stark mit beiden Strahlen
• Im Falle der Polarimetrie ist die
Wechselwirkung Brechung, d.h. das Licht
wird unterschiedlich stark beschleunigt.
• Dadurch verschiebt sich die Phase beider
zirkulär polarisierten Wellen
• Aus der Überlagerung der
phasenverschoben zirkluar polarisierten
Wellen ergibt sich eine linear polarisierte
Welle, deren Ebene gegenüber dem
Ausgangsstrahl gedreht ist
• Aus der Messung des Drehwinkels kann
man Rückschlüsse auf die optisch aktive
Substanz ziehen
Linear polarisierte Wellen und Zirkulare Doppelbrechung
http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/dedemo0.htm
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(einfaches) Polarimeter
• Ein einfacher Aufbau besteht aus
- Lichtquelle
- Polarisator
- Küvette
- Analysator
- Detektor
• Der Analysator wird senkrecht zum Polarisator gestellt
• Kein Licht erreicht den Detektor
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α
Polarimeter
• Die Lösung hat die Ebene des polarisierten Lichtes gedreht.
• Eine in die Küvette gefüllte Lösung bewirkt, dass ein Teil des Lichtes durch den Analysator geht
42
α
α
• Indem man den Analysator so einstellt, dass er kein Licht durchlässt, steht er senkrecht zur Ebene des polarisierten Lichtes NACH Durchgang durch die Küvette
• Der Unterschied zur Senkrechten ohne Küvette entspricht dem Drehwinkel der durch die Substanz verursacht wurde
Polarimeter
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• Spezifischer Drehwert
– Die optische Drehung einer Substanz ist von mehreren Faktoren
abhängig:
– Wellenlänge des polarisierten Lichtes
– Temperatur
– Lösungsmittel
– Schichtdicke der durchstrahlten Lösung
– Konzentration
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spezifische Drehung
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Molarrotation (molarer Drehwert)
• Gibt den Drehwert einer 1 M
Lösung an
• Umrechnung spezifische und
Molare Rotation analog dem
spezifischen und molaren
Absorptionskoeffizienten
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Halbschattenpolarimeter
• Maximale Dunkelheit ist für das Auge schwer zu erkennen
• Das Halbschattenpolarimeter enthält ein zusätzliches Hilfsnicol
• Nullmessung ohne Probe:– Das Hilfsnicol wird so eingestellt ist, dass die Referenzmessung einen Teil des Lichtes
durchlässt
– Der Analysator wird so eingestellt, dass beide Strahlengänge gleich viel Licht durchlassen
• Messung mit Probe– Einfüllen einer optisch aktiven Substanz verändert die Ebene des Messstrahls
– Analysator wird nachgeführt bis wieder beide Strahlengänge gleich viel Licht durchlassen.
– Drehung des Analysators relativ zur Nullmessung ergibt den Drehwert der Probe
α
Nullmessung ohne Probe:
Das Hilfsnicol wird so eingestellt ist, dass
die Referenzmessung einen Teil des
Lichtes durchlässt
48
α
Der Analysator wird so eingestellt, dass beide Strahlengänge gleich viel Licht durchlassen
Es gibt nur einen Analysator,
obwohl er hier als zwei Scheiben dargestellt ist
49
Analysator
Ebene nach Hilfsnicol
½ α½ α
Polarisator/Küvette
50
α
- Messung mit Probe
Einfüllen einer optisch aktiven
Substanz verändert die Intensität im
Messstrahl
Es gibt nur einen Analysator,
obwohl er hier als zwei Scheiben dargestellt ist
β
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Polarisator/KüvetteAnalysator
Ebene nach Hilfsnicol
½ α½ α
Polarisator Analysator
Ebene nach Hilfsnicol
Nach Küvette
½ α
β
52
α
-Messung mit Probe
Analysator wird nachgeführt bis wieder
beide Strahlengänge gleich viel Licht
durchlassen.
Es gibt nur einen Analysator,
obwohl er hier als zwei Scheiben dargestellt ist
β
53
Polarisator Analysator
Ebene nach Hilfsnicol
Nach Küvette
β
Polarisator Analysator (alt)
β
Analysator (neu)
Drehwinkel des Analysators = ½β
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Quiz-Time
Raumname: KELLNERINSTRU
Überlagerung von zwei zirkular polarisierten Wellen
Ein linear polarisierter Lichtstrahl kann auch als 2 zirkular
polarisierte Wellen betrachtet werden
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Alle Videos zum Anschauen unter:
http://cddemo.szialab.org/
Rückblick: Polarimetrie
• Optisch aktive Substanzen ändern den Drehwinkel des
linear polarisierten Lichts
• Linear polarisiertes Licht kann aufgeteilt werden in
rechtszirkular(R)- und linkszirkular(L) polarisiertes Licht
• Der Analyt interagiert unterschiedlich mit der R- und L-
Lichtwelle
– Z.B.: L-Welle wird stärker abgebremst
als R-Welle. Dadurch ändert sich die
Ebene des Lichtstrahls (=Drehwinkel)
• In der Polarimetrie wird die Absorption
des Analyten NICHT betrachtet
Zirkulardichroismus
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Interaktion mit zirkularpolarisiertem Licht
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ÜberblickLinks- bzw rechtszirkular
polarisiertes Licht
opt. aktive Substanz
Unterschiedliche Ausbrei-
tungsgeschwindigkeit
(cL≠cR)
Optische Drehung
(Polarimetrie)
Zirkulare Doppelbrechung
(nL≠nR)
Unterschiedliche Licht-
absorption (AL≠AR)
Zirkulardichroismus
(CD)
Anomale Optische
Rotationsdispersion
(Cotton-Effekt)
Zirkulardichroismus
Überblick: Zirkulardichroismus
Bei der Messung des Zirkulardichroismus wird die Lichtabsorption von
zirkular polarisiertem Licht durch optisch aktive Substanzen in
Abhängigkeit von der Wellenlänge beobachtet und zur sterischen
Analyse der Substanz herangezogen.
Anwendung in der Pharmazie:
• Charakterisierung von Campfersulfonsäure
und Isoandrosteron
• Qualitätskontrolle von Antibiotika, Alkaloiden, Steroiden, etc.
(allerdings keine Arzneibuchvorschriften)
60
*
Rückblick: Absorption elektromagnetischer Strahlung
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Die Absorption A ist der dekadische Logarithmus des
Verhältnisses des in die Probe eingestrahlten
Lichtes (I0) zur Intensität des nicht absorbierten
Lichtes (I).
Lambert-Beersches Gesetz:
Aλ=ελ*c*d c = Konzentration [mol/L] = [M]d = Schichtdicke der Küvette [cm] ελ= molarer Extinktionskoeffizient bei λ
I0 I
Küvette
A=log10
𝐼0
𝐼
Definition
Definition CD
Bei Durchgang von rechts- und linkszirkularem Licht (R und L
Welle) wird eine Welle stärker absorbiert.
R-Welle L-Welle
vor Durchtritt
durch den Analyt
nach dem Analyt
Absorptions-
spektrum
AR
λ (nm)
AL
λ (nm)
ΔA ΔA=AL-AR
hier:AL>AR
+CD
Spektrum
Absorption = Abnahme der IntensitätGraphisch: Der Vektor verkürzt sich
Aufbau eines Dichrographen
Die Messung des Zirkulardichroismus erfolgt mittels eines
Dichrographen.
Aufbau:
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~
Lichtquelle Monochromator Polarimeter
CD-ModulatorKüvette Detektor/
Photomultiplier
Fährt in nm-Schritten
den gesamten
Wellenlängenbereich
ab.
Der Lichtstrahl wird abwechselnd in
rechts- oder linkszirkulares Licht
umgewandelt.
(Spannung an (NH4)3PO4 Kristall)
Anwendungsbeispiel: Peptide und Proteine
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Abbildung von: Miles and Wallace, Chem. Soc. Rev. 2016, 45, 4859-4872
Rot: α-Helix, z.B. Na-Kanal Membranprotein
Blau: β-Faltblatt, z.B. Cobalamin Transporter der Außenmembran
Grün: Gemischte Struktur, z.B. Membrantranslokon für Polysaccharide
Quiz-Time
Raumname: KELLNERINSTRU