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Universitätsklinikum Ulm
Institut für Klinische Chemie
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. A. Grünert
Saccharide als Modulatoren von Leukozytenfunktionen
im angeborenen Immunsystem
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der Universität Ulm
von
Sandra Wohlhaupter
aus Nürtingen
2002
Amtierender Dekan: Prof. Dr. R. Marre
1.Berichterstatter: Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. A. Grünert
2.Berichterstatter: PD Dr. S. Fulda
Tag der Promotion: 13.12.2002
1 EINLEITUNG 1 1.1 Functional Food....................................................................................................................................................... 1 1.2 Das gastrointestinale Immunsystem ..................................................................................................................... 1 1.3 Kohlenhydrate als Zellerkennungsmoleküle ........................................................................................................ 3 1.4 Lektine als Phagozytenrezeptoren......................................................................................................................... 4 1.5 Immunmodulation durch Kohlenhydrate .............................................................................................................. 8 1.6 Zentrale Mechanismen der Immunabwehr.......................................................................................................... 11
1.6.1 Phagozytose 11 1.6.2 Oxidativer Burst 12
1.7 Fragestellung ......................................................................................................................................................... 13
2 MATERIAL UND METHODIK 15 2.1 Geräte und Material ............................................................................................................................................... 15 2.2 Gewinnung und Behandlung von Probenmaterial ............................................................................................. 18
2.2.1 Granulozyten und Monozyten 18 2.2.2 Makrophagen 18
2.3 Versuchsdurchführung......................................................................................................................................... 20 2.3.1 Phagozytose-Test 20 2.3.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst 23 2.3.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst 25
2.4 Auswertung der Testergebnisse.......................................................................................................................... 28 2.4.1 Parameter zur Beurteilung der Meßergebnisse 28 2.4.2 Arithmetisches Mittel und Spannweite 30 2.4.3 Beurteilung der Relevanz der Meßergebnisse 30 2.4.4 Präzision der verschiedenen Tests 31 2.4.5 Weitere Auswertungsaspekte 32
3 ERGEBNISSE 33 3.1 Adaptation der Testsysteme................................................................................................................................. 33
3.1.1 Phagozytose-Test 33 3.1.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst 40 3.1.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst 43 3.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen 47
3.2 Saccharidscreening im Phagozytose-Test.......................................................................................................... 51 3.3 Einfluß von Lipopolysaccharid auf die Phagozytose und den oxidativen Burst ............................................ 57
3.3.1 LPS-Konzentrationen verschiedener Zucker 57 3.3.2 Einfluß der Vorinkubation mit LPS auf die Phagozytose 57 3.3.3 Einfluß der LPS-Konzentration auf die Phagozytose und den oxidativen Burst 58
3.4 Stimulationstests................................................................................................................................................... 60 3.4.1 Vergleich von pyrogenfreien, LPS-versetzten und LPS-kontaminierten Sacchariden 60 3.4.2 Stimulation mit dem Echinacea-Extrakt Arabinogalaktan 63
3.5 Inhibitionstests ...................................................................................................................................................... 64 3.5.1 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit pyrogenfreien Sacchariden 64 3.5.2 Inhibition mit dem Polysaccharid Fucoidan 66 3.5.3 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit als immunmodulierend bekannten Sacchariden 68
4 DISKUSSION 72 4.1 Testbedingungen................................................................................................................................................... 75
4.1.1 Phagozytose-Test 75 4.1.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst 76 4.1.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst 77 4.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen 78
4.2 Auswirkung der LPS-Kontamination von Saccharidlösungen.......................................................................... 78 4.3 Stimulation von Leukozytenfunktionen mit Sacchariden.................................................................................. 79 4.4 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit Sacchariden ..................................................................................... 82 4.5 Schlußfolgerung .................................................................................................................................................... 88
5 ZUSAMMENFASSUNG 89
6 LITERATURVERZEICHNIS 91
Abkürzungsverzeichnis
BSA bovine serum albumin, Rinderserumalbumin
C.albicans Candida albicans
CD cluster of differentiation, Nomenklatur der Leukozyten-Antigene
C3b Spaltprodukte des Komplementfaktors 3
CR Komplementrezeptor
ECD Handelsname der Fa. Coulter für ein Phycoerythrin-Texas Red -Conjugat
E.coli Escherichia coli
Mean mittlere Fluoreszenzintensität
FcγR Rezeptor für den konstanten Teil des Immunglobulin G
FITC Fluoresceinisothiocyanat
fMLP N-formyl-Met-Leu-Phe
FSC forward scatter; linear aufgetragene Vorwärtsstreuung
GPI Glycosylphosphatidylinositol
i.G. inaktive Granulozyten
i.M. inaktive Monozyten
IC Immunkomplex
IgG Immunglobulin G
KB Modulationskoeffizient des oxidativen Burst
KFcB Modulationskoeffizient des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
KPh Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose
LPS Lipopolysaccharid
p.G. phagozytierende Granulozyten
p.M. phagozytierende Monozyten
PE Phycoerythrin
PBS Phosphate buffered saline
PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat
RB Burstrate
RFcB Rate des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
RPh Phagozytoserate
S.aureus Staphylococcus aureus
spp. Spezies
SSC sideward scatter; linear aufgetragene Seitwärtsstreuung
uPAR Urokinase-Typ Plasminogenaktivator Rezeptor
1 Einleitung In den letzten Jahren wurden vermehrt Lebensmittel mit gesundheitsfördernden Substan-
zen als sogenanntes „functional food“ auf den Markt gebracht. Damit kommen zu den
klassischen Vitaminen, Mineralstoffen und Spurenelementen beispielsweise Bakterienkul-
turen und spezielle Pflanzenhormone, die die Gesundheit fördern und das Risiko für be-
stimmte Krankheiten reduzieren sollen. Somit ändern sich die primären Zielsetzungen der
Ernährung zur ausreichenden Versorgung des Körpers mit wichtigen Nährstoffen. Durch
die Modulation bestimmter Zielfunktionen im Körper wie beispielsweise der Immunab-
wehr, soll die Ernährung auch zum physischen und psychischen Wohlbefinden beitragen
[12].
1.1 Functional Food Bis jetzt gibt es noch keine einheitliche Definition von „functional food“. Im Rahmen des
Functional Food Science in Europe (FUFOSE) Projektes wurde jedoch folgende von der
Europäischen Union anerkannte Arbeitsdefinition erstellt:
„Ein Nahrungsmittel darf als „funktionell“ betrachtet werden, wenn in zufriedenstellen-
dem Ausmaß gezeigt wurde, daß es über adäquate nutritive Effekte hinaus eine oder meh-
rere Zielfunktionen des Körpers in einer Art und Weise förderlich beeinflußt, die für einen
verbesserten Allgemein- und Gesundheitszustand und/oder zur Risikoreduktion von Krank-
heiten relevant sind. Functional foods müssen Nahrungsmittel bleiben. Sie müssen ihre Ef-
fekte in Mengen zeigen, die bei einer normalen Ernährung verzehrt werden können. Es
sind keine Tabletten oder Kapseln, sondern Bestandteile einer normalen Ernährung.“ [12]
1.2 Das gastrointestinale Immunsystem Die gastrointestinale Immunität unterscheidet sich in vieler Hinsicht vom systemischen
Immunsystem, um folgende spezifische Aufgaben zu gewährleisten:
• Schutz vor dem Eindringen potentieller Antigene aus dem Darmlumen
• Elimination intestinaler Pathogene
• Toleranz gegenüber oral aufgenommenen, physiologischen Nahrungsmittelbestandtei-
len und gegenüber der Darmflora
1 Einleitung 2
• Kontrolle der systemischen Immunantwort bei zahlreichen über den Gastrointestinal-
trakt aufgenommenen Antigenen, um schädigende Reaktionen des Immunsystems ge-
gen diese Stoffe zu verhindern
• Intestinale Resorptions- und Sekretionsvorgänge und vermutlich auch Mitwirkung an
der Aufrechterhaltung der Struktur der Dünndarmschleimhaut.
Wegen seiner Resorptions- und Sekretionsfunktion ist der Magen-Darm-Trakt im Gegen-
satz zur Haut nur mit einem einschichtigen Epithel ausgekleidet. Aus diesem Grund spie-
len bei der Aufrechterhaltung der Mukosabarriere weniger mechanische als biochemisch-
funktionelle Abwehrmechanismen eine entscheidende Rolle. Die antiseptische Beschich-
tung der Epitheloberfläche mit sekretorischem IgA verhindert die Aufnahme von Antige-
nen in den Organismus. Da IgA im Gegensatz zu anderen Immunglobulinen keine Aktivie-
rung des Komplementsystems hervorruft, bleibt eine phlogistische Immunreaktion aus.
Antigene, welche in der Lage sind die Mukosabarriere des Gastrointestinaltraktes zu über-
winden, stimulieren die „Immunelimination“. Sie arbeitet hauptsächlich mit IgG und mit
IgG-aktivierten Komplementfaktoren, die in Verbindung mit einer Stimulation poly-
morphkerniger Leukozyten und Makrophagen zu einer unspezifischen, funktionellen Im-
munantwort führen. Außerdem besteht sie aus einer IgG-abhängigen zellvermittelten Zyto-
toxizität durch Killerzellen, Makrophagen und T-Lymphozyten (spezifische, funktionelle
Immunabwehr) [2, 52].
Im Gastrointestinaltrakt stellen die polymorphkernigen Leukozyten und Makrophagen die
erste Abwehrfront gegen Pathogene dar, denen es gelang die antiseptisch beschichtete Mu-
kosa zu überwinden [2, 52]. Die Fähigkeit zur Diapedese ermöglicht es Neutrophilen und
Monozyten aufgrund eines Entzündungsreizes aus den Blutgefäßen ins Gewebe einzuwan-
dern (Extravasation), wo sich die Monozyten zu Makrophagen differenzieren. Unter dem
Einfluß von den als Chemoattraktoren wirkenden Zytokinen, wie beispielsweise TNF-α
und den Interleukinen IL-1, IL-6 und IL-8, wandern die phagozytierenden Zellen schnell
an den Infektionsort im Darmlumen und der gastrointestinalen Mukosa [21, 24]. Kürzlich
konnte gezeigt werden, daß polymorphkernige Granulozyten durch diese transepitheliale
Migration eine Steigerung ihrer Fähigkeit E.coli-Bakterien zu phagozytieren erlangen und
vermehrt CR3 exprimieren [19].
Neben diesen Schutzfunktionen besitzt die „Immunelimination“ jedoch auch ein hohes
Entzündungspotential. So kann die verstärkte Aktivierung von unspezifischen Abwehrme-
chanismen zu einer Gewebeschädigung führen, wie dies beispielsweise bei der Pathogene-
1 Einleitung 3
se der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitits ulcerosa
sowie bei der glutensensitiven Enteropathie der Fall ist [2, 52].
1.3 Kohlenhydrate als Zellerkennungsmoleküle Zu den wichtigsten Zellen des angeborenen Immunsystem gehören die neutrophilen poly-
morphkernige Leukozyten, Monozyten und Makrophagen. Diese körpereigenen Freßzellen
besitzen die Fähigkeit zur Phagozytose und zur intrazellulären Abtötung von Mikroorga-
nismen, welche für den Menschen lebenswichtige Funktionen darstellen [9].
Die Abtötung von in den Körper eindringenden Mikroben durch Phagozyten erfordert die
Erkennung und Anheftung der Erreger an die phagozytierenden Zellen über komplementä-
re Zelloberflächenstrukturen. Alle Zellen besitzen auf ihrer Oberfläche Kohlenhydrate in
Form von Glykoproteinen und Glykolipiden, deren Oligosaccharidseitenketten die soge-
nannte Glykokalix bilden. Trotz der seit über hundert Jahren existierenden Kenntnis vom
Vorkommen der Lektine als sogenannte Agglutinine in Pflanzenbestandteilen, stammt die
Erkenntnis, daß sie als Zellerkennungsmoleküle fungieren könnten, erst aus neuer Zeit
[55]. Nach der Definition von Kocourek und Horejsi sind Lektine eine von Antikörpern zu
unterscheidende Klasse von Proteinen, die mindestens eine Zuckerbindungsstelle besitzen
und fähig sind Kohlenhydratbestandteile spezifisch zu erkennen und reversibel zu binden,
ohne dabei die kovalente Struktur des erkannten Glykosylliganden zu verändern [29].
Hochspezifische Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen spielen besonders bei der Phagozytose
in Körperregionen mit niedrigen lokalen Opsoninkonzentrationen eine wichtige Rolle. Im
Vergleich zum Serum niedrige Opsoninkonzentrationen sind in den Lungen und im Nie-
renmark, sowie während Phasen mit niedrigem Komplementvorkommen, wie in der Neo-
natalperiode oder bei Patienten mit einem Komplementdefekt von C3 zu finden. Der von
Ofek und Sharon als Lektinophagozytose bezeichnete Vorgang erfordert spezifische Inter-
aktionen zwischen Lektinen und komplementären Kohlenhydraten auf der Oberfläche von
Zellen. Die Lektinophagozytose von Bakterien kann auf verschiedenen Wegen geschehen.
Entweder binden Bakterien, die auf ihrer Oberfläche Lektine tragen, an komplementäre
Kohlenhydrate auf der Zelloberfläche von Phagozyten, oder Lektine, die Bestandteile der
Zellwand von Phagozyten sind, binden an Kohlenhydrate auf der Bakterienoberfläche. Au-
ßerdem kann ein lösliches Lektin oder ein lösliches Glykoprotein eine Brücke zwischen
1 Einleitung 4
Bakterien und Phagozyten herstellen, indem es an Kohlenhydrate oder Lektine auf der
Zelloberfläche bindet [43, 55].
In den letzten Jahren wurden neue Kohlenhydratstrukturen auf Mikroorganismen entdeckt,
die bei der Zell- und Gewebsadhäsion eine Rolle spielen. Meist handelt es sich dabei um
Lektine, die an Glykokonjugatliganden auf Phagozyten binden. Tabelle 1 zeigt eine Reihe
von Sacchariden, die spezifische Liganden für die Zelloberflächenlektine verschiedener
Pathogene sind.
Tabelle 1: Zuckerspezifität von mikrobiellen Zelloberflächenlektinen [16, 42, 55]
Zuckerspezifität Mikroorganismus
Mannose Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Escherichia coli Typ 1, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., Serratia marcescens, Shigella flexnerii, Candida albicans
Galaktose Escherichia coli, Fusobacterium nucleatum
L-Fucose Vibrio cholerae, Streptomyces spp. Pseudomonas aeruginosa
N-Acetylgalactosamin Escherichia coli, Eikenella corrodens
N-Acetylglucosamin Escherichia coli Typ G
Galα1→4Gal Escherichia coli Typ P, Actinomyces naeslundii, Actinomyces vi-scosus, Bacteroides spp., Clostridia, Lactobacillus, Propionibac-terium
Galβ1→4GlcNAc Staphylococcus saprophyticus, Entamoeba histolytica
GalNAcβ1→4Gal Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonor-rhoeae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cepacia
GlcNAcβ1→3Gal Streptococcus pneumoniae
NeuAcα2→3Gal Escherichia coli K99, Escherichia coli Typ S, Bordetella bronchi-septica, Campylobacter pylori, Mycoplasma pneumoniae, Strepto-coccus sanguis, Influenzavirus
NeuAcα→6Gal Influenzavirus
Abkürzungen: Gal: Galaktose; Glc: Glucose; NAc: N-Acetyl; NeuAc: 5-N-Acetyl-Neuraminsäure
1.4 Lektine als Phagozytenrezeptoren Auf polymorphkernigen Leukozyten und Makrophagen wurden eine Reihe von Rezeptoren
charakterisiert, die Kohlenhydrate wie Lektine als Liganden binden. Diese lektinähnlichen
Rezeptoren ermöglichen es den Phagozyten Glykansequenzen als fremd zu erkennen, die
in vielen Pathogenen enthalten sind. Janeway stellte die Hypothese auf, daß das angebore-
1 Einleitung 5
ne Immunsystem zur Unterscheidung von „fremd“ und „eigen“ Lipopolysaccharide, Man-
nane, Glykane und doppelsträngige RNA durch Rezeptoren erkennt, die im Laufe der Evo-
lution selektioniert wurden. Auf diese Weise wird über eine Rezeptorbindung solcher in
pathogenen Mikroorganismen verbreiteten Bestandteile ein breitgefächertes Erkennungs-
spektrum für schädliches Fremdmaterial gewährleistet [23].
Bild 1 zeigt eine Übersicht von auf Phagozyten exprimierten Rezeptoren, die Bestandteile
von Mikroorganismen erkennen und die Phagozytose auslösen können.
CR3 (CD11b/CD18) CR4 (CD11c/CD18) Mannose-Rezeptor
LPS-Rezeptor (CD14)
Fcγ-Rezeptor
Glykan-Rezeptor Scavenger-Rezeptor
Bild 1: Phagozytenrezeptoren zur Erkennung verschiedener Bestandteile von Mi-
kroorganismen
Phagozyten exprimieren verschiedene Rezeptoren, die Bestandteile von Mikroorganismen (rot) erkennen und
die Phagozytose auslösen: Der Komplementrezeptor Typ 3 und Typ 4 (CR3 und CR4, blau) bindet das inak-
tive Komplementspaltprodukt C3bi, der LPS-Rezeptor (CD14, hellgrün) bindet bakterielle Lipopolysacchari-
de, der Glykan-Rezeptor (hellblau) bindet z.B. Lipophosphoglykan von Leishmania, der Mannose-Rezeptor
(dunkelgrün) auf Makrophagen bindet Mannose-haltige Oberflächenkohlenhydrate auf Bakterien, der Fcγ-
Rezeptor bindet Immunglobulin G und der Scavenger-Rezeptor (gelb) bindet viele Sialinsäureliganden [25].
Der zu den Lektinen gehörende Mannose-Rezeptor besitzt zwei Arten von Kohlenhydrat-
Erkennungsdomänen: acht C-Typ Lektindomänen und eine Cystein-reiche Domäne (Bild
2). Erstere bindet Oligosaccharide mit endständiger Mannose, Fucose oder N-
Acetylglucosamin, während letztere sulfatierte Glykane von Hormonen und sulfatierte
Glykosaminoglykane erkennt [32]. Die einzelnen C-Typ Lektindomänen besitzen eine
schwache Affinität für Monosaccharide. Erst durch die multivalenten Interaktionen von
1 Einleitung 6
Oligosacchariden mit mehreren Erkennungsdomänen erreicht der Rezeptor seine hohe
Bindungsaffinität [41, 60]. Er findet sich auf der Zelloberfläche von Gewebsmakrophagen,
jedoch nicht auf frisch isolierten Monozyten. Letztere exprimieren den Mannose-Rezeptor
erst nach einer in vitro Kultivierung von drei bis vier Tagen, indem sie sich zu Makropha-
gen differenzieren [14]. Die Hauptaufgabe des Rezeptors scheint, neben seiner Fähigkeit
die Endozytose von Glykoproteinen mit endständiger Mannose einzuleiten, in der Immun-
abwehr von Bakterien, Hefepilzen und Parasiten zu liegen. Er vermittelt die Bindung von
Mannose-Glykanen auf der Oberfläche von pathogenen Mikroorganismen, wie zum Bei-
spiel Candida albicans, und deren Phagozytose [8, 57].
Das mannanbindende Lektin (bzw. mannosebindende Lektin, MBL) spielt als lösliches
Serumprotein vermutlich eine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunabwehr (Bild 2).
Zum einen wirkt es als Opsonin, indem seine Lektindomänen an Kohlenhydrate auf Mi-
kroorganismen, wie beispielsweise C.albicans und E.coli binden. Obwohl die Affinität der
einzelnen Kohlenhydraterkennungsdomänen schwach ist, kann auch hierbei durch die clu-
sterartige Bindung von repetitiven Zuckersequenzen auf der Oberfläche eines Mikroorga-
nismus eine hohe funktionelle Avidität erreicht werden. Andererseits sind seine kollagenen
Regionen Liganden des Kollektinrezeptors auf Phagozyten und aktivieren den klassischen
Komplementweg [63].
Ein weiterer lektinähnlicher Rezeptor ist der Komplementrezeptor Typ 3 (CR3, Mac-1,
CD11b/CD18) auf neutrophilen Granulozyten und Makrophagen (Bild 2). Dieses Integrin
besitzt neben der Bindungsstelle für iC3b-opsonisierte Partikel auch eine Lektin-Bindungs-
stelle für mikrobielle Polysaccharide wie lösliches Zymosan, ein Zellwandextrakt aus Sac-
charomyces cerevisiae, und β-Glucan. Letzteres ist ein Polysaccharid mit niedrigem Mole-
kulargewicht (10 kDa), das aus Zymosan isoliert wurde und hauptsächlich aus Mannose
und 5 % Glucose besteht. Der CR3 interagiert mit bestimmten Mannose-, N-Acetyl-D-
glucosamin- oder Glucose-haltigen Polysacchariden, wodurch er eine breitere Zuckerspezi-
fität besitzt als zunächst vermutet wurde. Ross und Mitarbeiter nahmen an, daß es sich bei
der Lektinbindungsstelle des CR3 um den früher von Czop und Mitarbeitern beschriebenen
β-Glucan-Rezeptor handelt [35, 62]. Der Komplementrezeptor erkennt verschiedene Sub-
stanzen von Mikroorganismen, darunter das bakterielle Lipopolysaccharid von Escherichia
coli [49], β-Glucan und Zymosan [46, 49], das Lipophosphoglycan von Leishmania und
einige Strukturen auf Hefen wie Candida albicans [15, 58].
1 Einleitung 7
A B
CY Mannose-Rezeptor
F2
Disulfidbrücke CL
Interaktion mit
Kollektin-
Komplement-Rezeptor Typ 3 (CD11b/CD18)
α cd11b
β cd18
Bild 2: Schematische Darstellung der Domänen des Mannose
zeptors (A), sowie des mannanbindenden Lektins (B) [
Abkürzungen: CY: cysteine-rich domain, F2: fibronectin-type-two-like repeats
α-integrin subunit, β: β-integrin subunit
Galektine gehören ebenfalls zur Familie der Lektine und besitzen
Erkennungsdomäne für β-Galactose-haltige Oligosaccharide. Durc
nen wird die Expression von Galektin-3 auf neutrophilen Granulo
krophagen, Eosinophilen und Mastzellen gesteigert. Galektin-3 er
der Zelloberfläche von Effektorzellen und spielt bei Interaktionen
zwischen Zellen und extrazellulärer Matrix eine Rolle [36].
Makrophagen, Monozyten und polymorphkernige Leukozyten bes
che einen LPS-Rezeptor (CD14) mit dem sie bakterielles Lipopo
standteil der Zellwand gramnegativer Bakterien (Endotoxin), erke
gibt es Hinweise darauf, daß CD14 auch für die Zellaktivierung du
rien und Mykobakterien verantwortlich ist. Dies untermauert die H
kollagene
Triplehelix
Rezeptor
Kohlenhydrat Erkennungsdomäne
- und Komplementre-
35, 63]
, CL: C-type lectin domain, α:
eine Kohlenhydrat-
h Entzündungsreaktio-
zyten, Monozyten, Ma-
kennt Glykoproteine auf
zwischen Zellen bzw.
itzen auf ihrer Oberflä-
lysaccharid, einen Be-
nnen können. Daneben
rch grampositive Bakte-
ypothese, daß dieser
1 Einleitung 8
Rezeptor eine große Anzahl verschiedener bakterieller Oberflächenmoleküle erkennen
kann und somit ein Mustererkennungsrezeptor von Zellen des angeborenen Immunsystems
ist [48]. CD14 ist ein 55 kDa GPI-verankertes Membranprotein (mCD14), das zur Signal-
transduktion mit dem Integrin CR3 in der Zellmembran interagiert (siehe Tabelle 2). Ob-
wohl von weiteren Proteinen eine LPS-Rezeptorfunktion vermutet wird, ist CD14 bisher
das einzige Protein mit vollständig definierter Struktur, das sowohl die Bindung und Auf-
nahme von LPS als auch eine Zellaktivierung bewirkt [64]. Es genügen nanomolare Kon-
zentrationen an LPS, um eine Zellaktivierung hervorzurufen [53, 70]. CD14 spielt bei der
Bakterienbindung an Phagozyten und der Internalisierung nonopsonierter Bakterien eine
Rolle [45]. Neben seiner Schlüsselrolle bei der Initiierung der angeborenen Immunabwehr
bewirkt die Erkennung von Endotoxin durch CD14 auch die Auslösung von proinflamma-
torischen Reaktionen, die bis zum septischen Schock führen können [48, 65].
Durch die Bindung von LPS an ein Serumprotein, das Lipopolysaccharid-bindende Protein
(LBP), entsteht ein LPS-LBP Komplex, der die Bindung an CD14 auf der Oberfläche von
polymorphkernigen Leukozyten [69], Monozyten und Makrophagen erleichtert. Somit
dient LBP als Opsonin für LPS-tragende Partikel (gramnegative Bakterien) und verstärkt
deren Phagozytose [65, 64].
Die Scavenger-Rezeptoren auf Makrophagen sind eine strukturell heterogene Rezeptoren-
familie und unterscheiden sich von vielen anderen Endozytose-Rezeptoren durch ihre un-
gewöhnlich breite Ligand-Bindungsspezifität. Die Klasse A Scavenger-Rezeptoren binden
beispielsweise acetylierte und oxidierte Low Density Lipoproteine (LDL), Lipopolysac-
charid, sowie grampositive und gramnegative Bakterien. Der Klasse B Scavenger-Rezeptor
CD36 ist an der Phagozytose apoptotischer Zellen beteiligt [1]. Die einzige Gemeinsamkeit
dieser Moleküle ist, daß sie, wie fast alle Proteine, polyanionisch sind. Sie sind an der Er-
kennung von konservierten Strukturen auf pathogenen Mikroorganismen und deren Endo-
zytose beteiligt [30] und spielen bei der Beseitigung und Degradation von Endotoxinen aus
dem Körper eine wichtige Rolle [47].
1.5 Immunmodulation durch Kohlenhydrate Die Adhärenz an das Wirtsgewebe ist ein Schlüsselereignis bei der mikrobiellen Kolonisa-
tion und Infektion. Dabei spielt die Bindung mikrobieller Lektine an komplementäre Gly-
kolipid- oder Glykoprotein-Rezeptoren auf der Wirtszelle eine wichtige Rolle. Die Patho-
1 Einleitung 9
genität der verschiedenen Mikroorganismen ist von der Expression spezifischer Kohlenhy-
dratstrukturen auf deren Oberfläche abhängig [27].
In jüngster Zeit wurden die immunmodulatorischen Effekte zahlreicher Kohlenhydrate und
kohlenhydrathaltiger Zellwandbestandteile neu entdeckt. Dazu gehört beispielsweise ein
lösliches, β-1,6-verzweigtes, β-1,3-verknüpftes Glucosehomopolymer aus der Zellwand
von Saccharomyces cerevisiae (PGG-Glucan), welches die Leukozytenaktivität gegen In-
fektionen erhöht. Das Polysaccharid interagiert mit humanen Neutrophilen über das Gly-
kosphingolipid Lactosylceramid. Diese Bindung aktiviert direkt nukleäre Transkriptions-
faktoren und verstärkt den durch einen sekundären Stimulus induzierten oxidativen Burst.
Somit kann das Glucan die Zellen in einen aktivierten Zustand versetzen ohne eine in-
flammatorische Zytokinproduktion hervorzurufen [67].
Auch der Einfluß von komplexen Kohlenhydraten in der Nahrung auf die bakterielle Kolo-
nisation des Gastrointestinaltraktes wurde in letzter Zeit verstärkt untersucht. So belegten
verschiedene Studien eine Modulation der Mikroflora des Darmes durch mit der Nahrung
zugeführte Saccharide. Oligofruktose und Inulin, ein natürlich vorkommendes Fruktoseoli-
gomer, hatten demnach einen stimulatorischen Effekt auf das Wachstum der für den Men-
schen gesundheitsfördernden Gattung Bifidobacterium infantis. Im Gegensatz dazu wurden
potentielle Pathogene wie Escherichia coli und Clostridium perfringens im Wachstum ge-
hemmt [68]. Die gesundheitsfördernde Wirkung von täglich mit der Nahrung zugeführter
Lactosucrose, die das Wachstums von Bifidobacterium induzierte, wurde auch bei der An-
wendung von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen nachgewiesen
[44, 61]. Diese Beobachtungen zeigen, daß spezifische Saccharide die Bindung von Mi-
kroorganismen an das Wirtsgewebe beeinflussen und eine Modulation der Aktiviät des an-
geborenen, unspezifischen Immunsystems bewirken können.
Kohlenhydrate spielen jedoch nicht nur bei den konventionellen Vorstellungen der Signal-
transduktion in Zellmembranen eine wichtige Rolle, bei denen einer Ligand-Rezeptor Bin-
dung ein transmembranäres Signal folgt, welches dann chemische Veränderungen an der
Innenseite der Membran triggert (Bild 3). Auch bei der im Rahmen der Signaltransduktion
stattfindenden lateralen Interaktion von GPI-verankerten, selektiven Rezeptoren mit trans-
membranären, unselektiven Transduktoren spielen Kohlenhydrate eine wichtige Rolle. Da-
bei erkennt ein selektiver Plasmamembran-Rezeptor mit einer ganz bestimmten Spezifität
einen Liganden, während ein zweiter unselektiver, transmembranärer Rezeptor oder ein
Protein als Transduktor für viele verschiedene Signale dient. Es wurde gezeigt, daß die
1 Einleitung 10
Leukozyten-Integrine CR3 und CR4 solche unselektiven Transduktoren für eine Reihe von
GPI-verbundenen Leukozytenrezeptoren sind (Tabelle 2).
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
Signal Signal
Konventionelle Signaltransduktion
Laterale Interaktion von GPI-Proteinen mit transmembranären Rezeptorproteinen
Ligand
Ligand
GPI-Protein
transmembranärerRezeptorRezeptor�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
Signal Signal
Konventionelle Signaltransduktion
Laterale Interaktion von GPI-Proteinen mit transmembranären Rezeptorproteinen
Ligand
Ligand
GPI-Protein
transmembranärerRezeptorRezeptor
Bild 3: Mechanismen der transmembranären Signalleitung [45]
Tabelle 2: Laterale Interaktionen des unselektiven Transduktors CR3 auf dem
transmembranären Signalweg [45]
Selektiver Rezeptor Expression Interaktion hemmbar durch folgende Saccharide
FcγRIIIB GPI N-Acetyl-D-glucosamin, α-Methyl-D-mannosid, D-Mannose
FcγRIIIB Löslich N-Acetyl-D-glucosamin, α-/β-Methyl-D-mannosid, α-/β-Methyl-D-glucosid, Zymosan
uPAR GPI N-Acetyl-D-glucosamin, D-Mannose, α-Methyl-D-mannosid
CD14 (LPS/LBP) GPI nicht bekannt
FcγRII Trans-membranär
nicht bekannt
Abkürzungen: uPAR: urokinase-type plasminogen activator receptor; GPI: glycosyl-phosphatidylinositol
Diese neuen Erkenntnisse über Interaktionen von GPI-verankerten Proteinen mit Integri-
nen bei der Signaltransduktion in biologischen Membranen ermöglichen die gezielte Erfor-
schung und Entwicklung von Substanzen, welche an die Lektinbindungsstelle der β2-
Integrine binden und die anschließende GPI-vermittelte Protein-Integrin-Koppelung beein-
flussen. So stärken Agonisten möglicherweise die Immunabwehr gegen verschiedene Tu-
1 Einleitung 11
moren, wie es schon für β-Glucan gezeigt wurde. Antagonisten könnten dagegen die Kon-
trolle von inflammatorischen Prozessen bei Arthritis, beim septischen Schock und bei post-
ischämischen Reperfusionsschäden unterstützen [45].
1.6 Zentrale Mechanismen der Immunabwehr Wie vorangehend beschrieben spielen in der Anfangsphase einer Infektion hochspezifische
Lektin-Kohlenhydrat Interaktionen bei zwei zentralen Mechanismen der unspezifischen
Immunabwehr, nämlich bei der Phagozytose von Mikroorganismen und dem oxidativen
Burst von Leukozyten, eine wichtige Rolle.
1.6.1 Phagozytose
Unter dem Begriff Phagozytose versteht man die Aufnahme großer Partikel (>0,5 µm), wie
beispielsweise Mikroorganismen oder Zelldebris, in Zellen. Sie verläuft in mehreren Pha-
sen und beinhaltet zunächst die Erkennung und Bindung der Partikel durch spezifische Re-
zeptoren auf der Zelloberfläche der Phagozyten. Anschließend kommt es am Ort der Inge-
stion zu einer Polymerisation von Aktin und zur Internalisierung des Partikels über Aktin-
abhängige Mechanismen. Nach der Internalisierung wird das Aktin vom entstandenen
Phagosom abgespalten und das Phagosom fusioniert mit einem oder mehreren Lysosomen
zu einem Phagolysosom. Durch die Freisetzung lysosomaler Enzyme in das Phagosom
werden die Pathogene gespalten und zerstört.
Bei der Erkennung von Phagozytosepartikeln sind sowohl zelluläre als auch humorale Fak-
toren beteiligt. Zu den zellulären Rezeptoren gehören der Mannose-Rezeptor, Integrine wie
beispielsweise CD11b/CD18, der LPS-Rezeptor CD14 und Scavenger-Rezeptoren, die
Zellwandbestandteile von Bakterien erkennen. Humorale Faktoren im Serum führen über
die Opsonierung der Erreger zu einer erheblichen Steigerung der Adhärenz an spezifische
Phagozytenrezeptoren und der Ingestion von Pathogenen [1].
Zu diesen Serumopsoninen zählt das mannanbindende Lektin (MBL), das Mannosereste
auf der Oberfläche von Hefen (Candida albicans, Cryptococcus neoformans) oder Bakteri-
en (Escherichia coli, Streptokokken) bindet und vom C1q-Rezeptor erkannt wird [59, 63].
Die Opsonisierung der Erreger mit der Komplementkomponente C3b und ihrem inaktiven
Derivat C3bi erfolgt nach Aktivierung des Komplementsystems.
An den Stellen im Organismus, an denen schon einmal ein Antigenkontakt mit einem be-
stimmten Mikroorganismus stattgefunden hat, opsonieren die von Plasmazellen sezernier-
1 Einleitung 12
ten, spezifischen Antikörper den Erreger. Die Aufnahme des Partikels wird durch die Er-
kennung des konstanten Teiles der Antikörper von spezifischen Fc-Rezeptoren (FcγRII =
CD32, FcγRIII = CD16) auf der Oberfläche von phagozytierenden Zellen verstärkt [1].
1.6.2 Oxidativer Burst
Bakterien, Pilze und einige behüllte Viren können von Phagozyten auch durch die Bildung
von toxischen Produkten geschädigt werden. Dieser als oxidativer Burst bezeichnete Pro-
zeß beinhaltet die Aktivierung der NADPH-Oxidase und ist für die Abtötung von infektiö-
sen Mikroorganismen durch Neutrophile essentiell [3].
Eine Vielzahl von Stimuli wie fMLP, C5a und Immunkomplexe aktivieren die NADPH-
Oxidase durch rezeptorvermittelte Mechanismen, während PMA und langkettige, ungesät-
tigte Fettsäuren eine rezeptorunabhängige Stimulation bewirken. Durch diese Aktivierung
kommt es zur Zusammenlagerung der zytoplasmatischen und membrangebundenen Kom-
ponenten zu einem aktiven NADPH-Oxidase-Komplex auf der Zellmembran von Neu-
trophilen [9]. Das membranständige Enzym katalysiert gemäß folgender Reaktion die Um-
setzung von Sauerstoff (O2) zum Superoxidanion (●O2-):
NADPH + O2 NADPH-Oxidase NADP + H+ + ●O2-
Superoxidanion ist Ausgangssubstanz für die Bildung weiterer mikrobizider Sauerstoffme-
tabolite wie Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hydroxylradikal (OH-). Um eine Schädigung
des körpereigenen Gewebes zu verhindern, werden während der Phagozytose zusätzlich
Enzyme gebildet, die einen kontrollierten Abbau der reaktiven Sauerstoffprodukte gewähr-
leisten [3].
Andererseits kann eine gesteigerte Sauerstoffradikalproduktion durch Neutrophile, wie
dies in entzündlichen Geweben oder bei inflammatorischen Erkrankungen vorkommt, ne-
ben der protektiven Funktion bei der Abtötung von Pathogenen auch eine Gewebszerstö-
rung verursachen [11].
1 Einleitung 13
1.7 Fragestellung Die zentrale Frage dieser Arbeit, die im Rahmen eines Drittmittelprojektes des Bundesmi-
nisteriums für Bildung und Forschung und in Kooperation mit der Südzucker AG stattfand,
war:
Eignen sich chemisch und enzymatisch synthetisierte Saccharide pflanzlichen Ursprungs
als Functional Food zur Modulation immunologischer Funktionen von humanen Leukozy-
ten?
Als experimenteller Zugang sollten Modelle zur Erforschung der Modulation wichtiger
Immunabwehrmechanismen mit Sacchariden aufgebaut werden, welche auf die besondere
immunologische Funktion des Magen-Darm-Trakts übertragbar sind. Als zelluläre Modelle
wurden polymorphkernige Granulozyten und Monozyten im periphervenösen Vollblut ge-
sunder Spender, sowie kultivierte Makrophagen als physiologisches Zellmodell für die
Mucosa-assoziierten Phagozyten eingesetzt. Diese Phagozyten sind zur Transmigration in
den Gastrointestinaltrakt befähigt und bilden eine erste Abwehrfront gegen das Eindringen
von pathogenen Erregern auf mukösen Oberflächen.
Die folgenden funktionellen Testverfahren für Phagozyten sollten etabliert werden:
• ein Phagozytosetest, mit welchem die Aufnahme von Escherichia coli, Staphylococcus
aureus und Candida albicans gemessen werden kann.
• ein Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst, mit welchem die durch
Immunkomplexe ausgelöste Sauerstoffradikalproduktion gemessen werden kann.
• ein Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst, mit welchem die Escheri-
chia coli-, PMA- und fMLP-stimulierte Sauerstoffradikalproduktion und
• ein Phagozytosetest mit aus humanen Monozyten kultivierten Makrophagen, mit wel-
chem die Aufnahme von Escherichia coli und Staphylococcus aureus gemessen werden
kann.
Durch den Einsatz verschiedener Partikel im Phagozytosetest sollte die Rezeptorspezifität
der Saccharide überprüft werden.
Ziel war es, funktionelle Tests zu etablieren, die sich nicht auf die Erforschung einzelner
Rezeptoren beschränken, sondern die die komplexen Rezeptor-Ligand-Interaktionen der
Phagozyten bei der unspezifischen Immunabwehr berücksichtigen. Die Tests sollten insbe-
sondere auf die Untersuchung der Interaktionen zwischen Mikroorganismen und Phagozy-
1 Einleitung 14
ten, die über die Expression von Lektinen und komplementären Kohlenhydraten auf deren
Zelloberflächen stattfinden, ausgelegt werden.
Mit den optimierten Tests sollte ein primäres Screening der aus Zuckerrüben, stärkehalti-
gen Pflanzen und Zichorien synthetisierten Saccharide durchgeführt werden. Dieses hatte
die Erforschung der immunmodulierenden Saccharideigenschaften bzw. die Definition von
wirksamen Kohlenhydratbasisstrukturen zum Ziel. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse
sollten langfristig als Grundlage für die gezielte Isolierung und Synthese von Functional
Food Glykanen dienen. Sie könnten zukünftig zur Stimulation bzw. Hemmung des unspe-
zifischen, angeborenen Immunsystems im Gastrointestinaltrakt eingesetzt werden.
Bei Messung einer Stimulations- oder Inhibitionswirkung einzelner Saccharide im Scree-
ning sollten artifizielle Effekte durch eine Kontamination der Zucker bei den Isolierungs-
prozessen oder der Aufbereitung der Substanzen ausgeschlossen und gegebenenfalls Stra-
tegien zur Vermeidung solcher Artefakte entwickelt werden.
Abschließend sollten die in der Literatur vorbeschriebenen immunstimulierenden bzw.
-inhibierenden Wirkungen definierter Saccharide in den funktionellen Testverfahren verifi-
ziert und mit den Effekten der auf pflanzlicher Basis synthetisierten Saccharide verglichen
werden.
2 Material und Methodik
2.1 Geräte und Material Geräte
Durchflußzyto-
metriesystem: COULTER EPICS XL,
System II Software Version 1.0
COULTER Electronics GmbH, D-47807 Krefeld
Cell-Dyn 3500 ABBOTT GmbH Diagnostika, D-65205 Wiesbaden-Delkenheim
Material
Probengefäße: S-Monovette LH, Lithium-Heparin, 7,5 ml, Art.Nr.: 01.1604,
Fa. SARSTEDT, D-51588 Nümbrecht
Testgefäße: Röhren-Tubes, 5 ml, 75 × 12 mm ∅, Art.Nr.: 55.476,
Fa.SARSTEDT, D-51588 Nümbrecht
Mikrotiterplatten 96 well, v-Form PS, Art.Nr.: 651101, Greiner GmbH
Folie für Makro-
phagenkultur:
bio Folie 25, in vitro systems & services, Osterode
Endotoxin-
Bestimmung
Freundlicherweise in Mithilfe von Dr. Steinbach, Klinische Chemie,
Universität Ulm, mit dem Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test
Test-Reagenzien: • PHAGOTEST
ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg
• BURSTTEST
ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg
• Lysing Solution, 20 ml, 10 × Stammlösung, Art.Nr.: 1679
ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg
• DNA-Färbelösung (Propidiumjodid), 20 ml, Art.Nr.: 1633
ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg
• Quenchlösung, 10 ml, Art.Nr.: 1620
ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg
• Instamed-Salze für die Waschlösung, Art.Nr.: 2014
ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg
• Fc OxyBURST Green assay reagent, 500 µl,
Art.Nr.: F-2902, Molecular Probes - MoBiTec, D-37077 Göttingen
2 Material und Methodik 16
• Nicht-opsonisierte FITC-markierte E.coli-Suspension, 1 × 10 9 Bak-
terien pro ml, ORPEGEN Pharma GmbH, D-69115 Heidelberg
• Staphylococcus aureus (Wood strain without protein A) BioParti-
cles, 7 × 10 5 Bakterien pro ml, non-opsonized, fluorescein conju-
gate, 10 mg, Art.Nr.: S-2851,
Molecular Probes - MoBiTec, D-37077 Göttingen
• Human IgG - Reagent Grade, From Serum, Art.Nr.: I-2511,
SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, D-82041 Deisenhofen
• Candida albicans, FITC-markiert, non-opsonized, 2 × 10 5 Partikel
pro ml, freundlicherweise von der Fa.ORPEGEN Pharma GmbH zur
Verfügung gestellt
• seromed, INSTAMED 9,55 g/l, PBS DULBECCO;
Art.Nr.: L182-50, Biochrom KG, D-12247 Berlin
• X-VivoTM-10, Art.Nr.: 04-380 Y,
Bio Whittaker, 21793 Maryland, USA
• Cell-wash, Art.Nr.: 349524, Becton Dickinson
• Fetal Calf Serum, Art.Nr.: 210471, Boehringer Mannheim GmbH
• Ficoll-PaqueTM PLUS, Art.Nr.: 17-1440-02,
Amersham Pharmacia Biotech AB; SE-751 84, Uppsala Sweden
• CD14 Antikörper ECD, Maus IgG2, Art.Nr.: PN IM 2707, Coulter-
Immunotech
• PE labeled anti-human Macrophage Mannose-Recepto, Maus IgG1,
Art.Nr.: 35975X, Pharmingen
• Galectin-3 PE Set, Maus IgG1, Art.Nr.: 36985K, Pharmingen
Testsaccharide: • Methyl-α-D-mannosid, Art.Nr.: M6882,
• Methyl-β-D-galactosid, Art.Nr.: M0285,
• Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid, Art.Nr.: M0257,
• Lactose (β-D-Gal [1→4]-β-D-Glc), Art.Nr.: L-3750,
• (+)-Arabinogalactan, Art.Nr.: 85,136-1,
SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, D-82041 Deisenhofen
• D-Mannose-6-phosphate, Disodium Salt, Art.Nr.: 444100,
• α-1,3-α-1,6-Mannotriose, Art.Nr.: 444043,
• Chitotetraose, Art.Nr.: 220474,
2 Material und Methodik 17
• Chitopentaose, Art.Nr.: 220475,
• Chitohexaose, Art.Nr.: 220476,
• Disialyllacto-N-tetraose, Art.Nr.: 322030,
• Fucoidan Fraction 7, Fucus vesiculosus, Art.Nr.: 344800,
CALBIOCHEM-NOVABIOCHEM GmbH, D-65812 Bad Soden
• N-Acetyllactosamin (2-Acetamido-2-deoxy-4-O-β-galactose-D-
glucosid), Dextra Laboratories Ltd, UK
Die folgenden Testsaccharide wurden von der Firma Südzucker zur Verfügung gestellt
und mußten zur Wahrung der Geheimhaltung größtenteils codiert werden. Sie wurden
durch chemische bzw. enzymatische Synthese und zum Teil durch anschließende Deriva-
tisierung aus pflanzlichen Rohstoffen, wie der Zuckerrübe, stärkehaltigen Pflanzen und
Zichorien, hergestellt:
Beschreibung: Monomere Bausteine: Bezeichnung:
• Disaccharide: - Galactose, Glucose Lactose
• oxidierte Disaccharide: - Glucose, Gluconsäure BC-D-146
BC-D-185
• Trisaccharide: - Glucose, Fructose, Galactose Lactosucrose
- Glucose, Fructose, Galactose Raffinose
- Glucose, Fructose BC-O-71
- Galactose, Glucose BC-O-207
- Glucose, Sorbit, Mannit, Polyol BC-O-150
• Tetrasaccharide: - Glucose, Fructose Nystose
- Galactose, Glucose, Fructose Stachyose
- Glucose, Fructose BC-O-50
- Glucose, Sorbit, Mannit, Polyol BC-O-76
- Galactose, Glucose BC-O-191
• Pentasaccharide: - Galactose, Glucose BC-O-192
- Glucosamin-Derivat BC-O-290
• Heptasaccharide: - Glucose, Fructose BC-O-25
• Aminozucker: - Glucose, aminiertes Hexit BC-O-145
• Glucuronsäurederviat: - oxidiertes Glucose-Derivat BC-D-148
• Xylooligosaccharid-Gemisch: - Xylose BC-O-282
2 Material und Methodik 18
2.2 Gewinnung und Behandlung von Probenmaterial
2.2.1 Granulozyten und Monozyten
Heparin-antikoaguliertes Vollblut wurde durch die Punktion einer peripheren Vene des
Armes von gesunden Spendern gewonnen. Die Blutentnahme erfolgte maximal eine Stun-
den vor Testbeginn, um Veränderungen der Leukozytenfunktionen durch lange Lagerungs-
zeiten zu verhindern [13].
Es wurde ausschließlich Heparin-Vollblut verwendet, da aufgrund der Calciumkomplexie-
rung von EDTA- oder Citrat-Blut keine hohe Phagozytoseaktivität erreicht werden kann
[28, 33].
Im Anschluß an die Blutentnahme erfolgte eine Messung des Differentialblutbildes (Cell-
Dyn), um Spender mit Granulozytopenie oder Granulozytose auszuschließen. Bei allen
Blutproben befanden sich sowohl die Leukozytenzahl (4300-10800 / µl) als auch auch der
Anteil an Monozyten (0-15 %) und Neutrophilen (37-80 %) im physiologischen Wertebe-
reich.
2.2.2 Makrophagen
2.2.2.1 Makrophagenkultur
Humane Makrophagen konnten durch die Kultivierung von Monozyten aus dem periphe-
ren Blut gesunder Spender oder aus Buffy Coats gewonnen werden.
Dazu wurden die mononukleären Zellen (Monozyten und Lymphozyten) unter sterilen Be-
dingungen mit Ficoll-Paque isoliert. Anschließend konnte im Cell-Dyn 3500 die Zellzahl
bestimmt und 1x 106 Zellen pro ml Medium (X-Vivo mit 10 % FCS) suspendiert werden.
In sterilisierten Säckchen aus Spezialfolie wurden 16 ml dieser Zellsuspension ausgesät
und bei 37 °C und 5% CO2-Atmosphäre im Brutschrank für 10-14 Tage inkubiert. Nach 4-
5 Tagen mußte erneut 4-5 ml Medium zugegeben werden. Nach insgesamt 10-14 Tagen
konnten die Makrophagen durch das vorsichtige Ziehen der Folie über eine Kante abgelöst
werden.
Die abgelösten Zellen wurden in 50 ml Zellkulturröhrchen überführt und mit 1200 U/min
bei 12°C für 5 min zentrifugiert, der Überstand dekantiert und dieser Waschvorgang drei
Mal mit PBS wiederholt. Anschließend wurden die Makrophagen in gepooltem Humanse-
2 Material und Methodik 19
rum resuspendiert (ca. 1.500 Zellen/µl Serum) und eine Stunde bei Raumtemperatur rekon-
stituiert.
2.2.2.2 Viability der Phagozyten
Mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Propidiumjodid, welcher nur geschädigte Zellmem-
branen passieren kann, war eine Differenzierung von vitalen Zellen mit intakter Zellmem-
bran und geschädigten Phagozyten möglich. Dazu wurde dem Vollblut bzw. der Ma-
krophagenzellsuspension 4 µg Propidiumjodid pro ml Ansatz zugegeben und die
Suspension 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und
sofort im Anschluß erfolgte die durchflußzytometrische Analyse. Die rotfluoreszierenden
Phagozyten konnten dabei als geschädigt identifiziert werden.
2.2.2.3 Charakterisierung von Makrophagen
Auf Mikrotiterplatten wurden pro Loch ca. 200.000 Zellen der kultivierten Makrophagen-
präparation pipettiert. Die Zellen wurden drei Mal mit ca. 100 µl Cell-wash gewaschen,
mit 1200 U/min bei 12°C für 5 min zentrifugiert und der Überstand dekantiert.
Anschließend erfolgte eine Immunphänotypisierung der Makrophagen mit folgenden Anti-
körpern:
1. Kontrolle: 20 µl Isotypkontrolle PE-markiert + 7 ml CD14-Rezeptor-Antikörper ECD-
markiert
2. Probe: 20 µl Mannoserezeptor-Antikörper PE-markiert + 7 ml CD14-Rezeptor-
Antikörper ECD-markiert
mit je 60 µl Cell-wash.
Die Antikörper inkubierten für 20 min bei 12°C im Kühlschrank. Anschließend wurden sie
zwei Mal mit je 100 µl Cell-wash gewaschen und nach obengenanntem Schema zentrifu-
giert. Nach Resuspension der Zellen in 400 µl PBS erfolgte die durchflußzytometrische
Analyse. Anhand der Expression des LPS-Rezeptors CD14 auf Monzyten und Makropha-
gen konnten diese von den CD14 negativen Lymphozyten abgegrenzt werden. Die Expres-
sion des Mannoserezeptors erlaubte die Differenzierung zwischen Makrophagen und Mo-
nozyten (siehe Bild 18 und Bild 19 in Kapitel 3.1.4.2).
2 Material und Methodik 20
2.3 Versuchsdurchführung
2.3.1 Phagozytose-Test
Testprinzip:
Der auf dem etablierten Phagotest basierende Test diente der quantitativen Bestimmung
der Phagozytoseaktivität von Monozyten und Granulozyten in heparinisiertem Vollblut.
Der Test konnte mit nicht opsonierten E.coli-Bakterien durchgeführt werden. Außerdem
wurden Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierte Escherichia coli-Bakterien mit gepool-
tem Serum opsoniert, wodurch eine effektivere Bindung an die Komplementrezeptoren
(C3b-Rezeptoren) und die Rezeptoren für den konstanten Teil des Immunglobulin-
Moleküls (Fc-Rezeptoren) der Monozyten und Granulozyten erreicht wurde.
Eine Differenzierung des Beitrages der verschiedenen Rezeptoren an der Phagozytose soll-
te durch eine Erweiterung des Tests mit einem grampositiven Bakterium (opsonierter bzw.
nicht opsonierter Staphylococcus aureus) und einem Sproßpilz (nicht opsonierter Candida
albicans) erreicht werden.
Nach der Inkubation der Bakterien mit den Phagozyten wurde die Fluoreszenz der nicht in
die Zelle aufgenommenen, Membran-adhärenten Bakterien durch die Zugabe einer
Quenchlösung unterdrückt. So war gewährleistet, daß in der durchflußzytometrischen Ana-
lyse ausschließlich die Grünfluoreszenz der phagozytierten Bakterien gemessen wurde.
Opsonisierung von Staphylococcus aureus:
Ein Teil der rekonstituierten S.aureus-Lösung wurde mit einem Teil der Lösung des huma-
nen IgG eine Stunde bei 37,0 °C im Wasserbad inkubiert und anschließend drei Mal mit
PBS gewaschen.
Testablauf:
Stimulationstest:
Bei diesem Test wird vor dem gewöhnlichen Testablauf eine Vorinkubation der Phagozy-
ten mit den Sacchariden vorangestellt.
Dazu werden die Blutproben 10 min im Eiswasserbad inkubiert, um sie auf 0°C abzuküh-
len. Anschließend werden die Saccharide hinzugegeben und die Proben 60 min bei 37,0°C
im vorgewärmten Wasserbad inkubiert.
2 Material und Methodik 21
Inhibitionstest:
Eine Vorinkubation ist bei der Durchführung des Inhibitionstests nicht notwendig. Die Zu-
gabe der Saccharide erfolgt während der zehnminütigen Vorkühlung der Blutproben im
Eiswasserbad.
Vorkühlung: Pro Ansatz werden 100 µl heparinisiertes Vollblut in ein 5 ml-
Teströhrchen pipettiert.
Alle Blutproben sollten ca. 10 min im Eiswasserbad auf 0°C ab-
kühlen; ebenso die Bakterien und die Quenchlösung.
Aktivierung: Nach guter Mischung der vorgekühlten Bakterien bzw. der Hefe
werden die E.coli-, S.aureus-Bakterien bzw. C.albicans zur Blut-
probe gegeben.
Inkubation: Die Röhrchen mit den Testansätzen werden 5-10 min bei 37,0 °C
im Wasserbad inkubiert, während die Röhrchen mit den Kontroll-
ansätzen auf Eis stehen bleiben.
Abstoppen der Phago-
zytose:
Exakt zum Inkubationszeitende werden alle Blutproben gleichzei-
tig auf Eis gestellt.
Quenchen: Je Ansatz pipetiert man 100 µl (bei Makrophagen 200 µl) eiskalte
Quenchlösung dazu.
Zweimalige Wäsche: Nach dem Mischen jeder Blutprobe mit 3 ml Waschlösung werden
alle Röhrchen 5 min bei 250 × g und 4°C zentrifugiert. Der Über-
stand wird dekantiert und der Waschvorgang in gleicher Weise
wiederholt.
Lyse und Fixierung: Durch die Zugabe von je 2 ml Lysing Solution werden die Voll-
blutproben 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden
sie 5 min mit 250 × g bei 4°C zentrifugiert; der Überstand wird
dekantiert.
Erneute Wäsche: Alle Proben werden mit 3 ml Waschlösung gewaschen, wiederum
zentrifugiert (5 min, 250 × g, 4°C) und der Überstand dekantiert.
DNA-Färbung: Abschließend wird je Ansatz 200 µl DNA-Färbelösung zugegeben
und die Proben werden 10 min im lichtgeschützten Eiswasserbad
inkubiert. Die durchflußzytometrische Analyse sollte innerhalb
von 60 min stattfinden.
2 Material und Methodik 22
Durchflußzytometrische Analyse:
Die Zellen werden im Durchflußzytometer (COULTER EPICS XL) analylsiert.
Messung:
Der Ausschluß von Bakterienaggregaten geschieht mit Hilfe der DNA-Färbelösung. Diese
enthält Propidiumjodid zur Anfärbung von DNA. Nach Anregung mit dem Argonlaser
zeigt sie eine Emission bei 617 nm. Auf diese Weise kann während der Datenaufnahme im
Histogramm der Rotfluoreszenz ein „Auswertungs-Gate“ auf die Ereignisse gesetzt wer-
den, die mindestens den DNA-Gehalt einer humanen diploiden Zelle besitzen (Bild 4). Da-
durch werden Bakterienaggregate, welche ähnliche Streulichteigenschaften wie Leukozy-
ten besitzen und demzufolge das Ergebnis verfälschen könnten, von der Auswertung
ausgeschlossen.
Leukozyten
Bakterien
Gate
Bild 4: Histog fluoreszenz zur Differenzierung zwischen Bakterienag-
gregat
Je Testansatz w
Der Photomulti
wärtsstreulicht (
logarithmischem
Auswertung:
Im Streulichtdia
das heißt die M
(siehe Bild 7 Ka
ramm der Rot
en und Leukozyten
erden 15.000-20.000 Leukozyten aufgenommen.
plyer (PMT) wird im Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) und Seit-
Sideward Scatter, SSC) in linearem Modus und in Fluoreszenz 1 bis 3 in
Modus eingestellt.
gramm (FSC gegen SSC) wird die entsprechende Leukozytenpopulation,
onozyten und die Granulozyten, durch das Setzen eines „Gate“ eingegrenzt
pitel 3.1.1.1).
2 Material und Methodik 23
Anschließend können im Histogramm der Grünfluoreszenz anhand der FITC-markierten
Bakterien (Emission von FITC bei 520nm) folgende Parameter bestimmt werden:
1. Der prozentualen Anteil der Zellen, die FITC-markierte Bakterien phagozytiert haben
an der Gesamtzahl der Zellen (Phagozytoserate).
2. Die mittlere Fluoreszenzintesität pro Einzelzelle (= Mean), die zur Anzahl an aufge-
nommenen Bakterien pro einzelnem Phagozyt proportional ist (Bild 5).
67,6 % p.G.1,6 % p.M.
67,6 %
Phagozytierende
Granulozyten
1,6 %
Phagozytierende
Monozyten
0,9 %
Inaktive
Monozyten
29,9 %
Inaktive
Granulozyten 0,9 % i.M. 29,9 % i.G.
Bild 5: Histogramm der Grünfluoreszenz zur Messung der Phagozytoserate und der
mittleren Fluoreszenzintensität von Monozyten und Granulozyten
2.3.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
Testprinzip:
Das Reagenz besteht aus kovalent an BSA gebundenem Dichlorodihydrofluorescein
(H2DCF), das mit gereinigten, polyklonalen anti-BSA IgG Hasen-Antikörpern einen Im-
munkomplex bildet. Dies ermöglicht die Messung der Fc-Rezeptor-vermittelten Internali-
sierung und des anschließenden oxidativen Bursts bei neutrophilen Granulozyten.
Die Immunkomplexe binden an die Fc-Rezeptoren der Neutrophilen und werden direkt in
die Phagovakuolen internalisiert. Sie stimulieren die Produktion von reaktiven Sauerstoff-
metaboliten durch die membrangebundenen NADPH-Oxidase Enzyme und deren Freiset-
zung in die Vakuolen und den extrazellulären Raum. Durch diese Metaboliten wird das
nichtfluoreszierende H2DCF-Molekül zu dem grünfluoreszierenden Dichlorofluorescein
2 Material und Methodik 24
(DCF) oxidiert. Die Fluoreszenz ist nach den ersten 30 Sekunden linear vom Ausmaß der
Oxidation abhängig [50].
In geringem Umfang findet auch bei 0°C eine Rezeptorbindung des Immunkomplexes
statt, doch die Phagozytose und der anschließende oxidative Burst ist bei dieser Tempera-
tur blockiert.
Testablauf:
Anstelle der aus Citrat-Blut separierten Leukozyten wurde der Einsatz von heparinisiertem
Vollblut etabliert und der Testablauf analog dem Phagozytose-Test auf die Untersuchung
der potentiell aktivierenden bzw. inhibierenden Wirkung von Sacchariden adaptiert.
Eine maximale Aktivierung des oxidativen Burst wird bei einer IC-Konzentration von 360
µg/ml erreicht. Im Test wählten wir eine IC-Konzentration von 150 µg IC/ml zu 5,0 × 106
Zellen/ml. Diese Konzentration entsteht, wenn man bei der Blutprobe eines gesunden Pro-
banden von durchschnittlich 5000 Leukozyten pro µl Vollblut ausgeht und 10 µl einer 1:2
mit PBS verdünnten IC-Stammlösung (3mg/ml) je 100 µl Heparin-Blut ansetzt. Die IC-
Konzentration entspricht genau der Hälfte der Konzentration, die beim oxidativen Burst
von polymorphkernigen Leukozyten ein halbmaximales Fluoreszenzsignal (120 µg IC/ml
pro 2,0 × 106 Zellen/ml) auslöst.
Versuchsvorbereitung: Für jeden Test werden folgende Kontroll- und Testansätze benötigt
Kontrollansatz ohne IC-Aktivierung - Inkubation bei 37°C •
•
•
Testansätze mit IC-Aktivierung - Inkubation bei 37°C und
dazugehörige Kontrollansätze mit IC-Aktivierung - Inkubation bei 0°C
Aliquotieren Je Ansatz werden 100 µl heparinisiertes Vollblut, das zuvor gut
gemischt wurde, in ein 5 ml Teströhrchen gegeben.
Vorkühlung Die Blutproben und die IC-Suspension werden 10 min auf Eis ge-
stellt, um sie auf 0°C abzukühlen.
Inkubation Zu jedem Ansatz werden 10 µl der 1:2 verdünnten IC-Suspension
zugegeben. Die Testansätze und ein zusätzlicher Kontrollansatz
ohne IC werden 5 min im Wasserbad bei 37,0°C inkubiert, wäh-
rend die weiteren Kontrollansätze auf Eis stehen bleiben.
2 Material und Methodik 25
Abstoppen der Phago-
zytose:
Exakt zum Ende der Inkubationszeit werden gleichzeitig alle Blut-
proben aus dem Wasserbad genommen und ebenfalls auf Eis ge-
stellt.
Lyse und Fixierung: Den im Eiswasserbad stehenden Vollblutproben werden je 2 ml
Lysing Solution zugegeben und für 20 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend werden sie 5 min mit 250 × g bei 4°C zen-
trifugiert; der Überstand wird dekantiert.
Einmalige Wäsche: Alle Proben werden mit 3 ml Waschlösung gewaschen, wiederum
zentrifugiert (5 min, 250 × g, 4°C) und der Überstand dekantiert.
DNA-Färbung: Die Proben werden mit 200 µl DNA-Färbelösung pro Ansatz 10
min im lichtgeschützten Eiswasserbad inkubiert und innerhalb von
60 min durchflußzytometrisch gemessen.
Durchflußzytometrische Analyse:
Die Messung erfolgt wie im Phagozytosetest beschrieben (siehe Kapitel 2.3.1.).
Auswertung:
Die Leukozytenpopulation wird im Streulichtdiagramm durch das Setzen eines „Gate“ e
gegrenzt (siehe Bild 7 Kapitel 3.1.1.1).
in-
Anschließend können im Histogramm der Grünfluoreszenz (siehe Bild 13 Kapitel 3.1.2.1)
anhand des fluoreszierenden Reagenz (Emission von Dichlorofluorescein bei ca. 520 nm)
folgende Werte ermittelt werden:
1. Die FcBurstrate, die dem prozentualen Anteil der Zellen die Immunkomplexe phagozy-
tiert haben, an der Gesamtzahl aller Zellen entspricht.
2. Die mittlere Fluoreszenzintensität pro Einzelzelle (= Mean), die zur Menge an durch
reaktive Sauerstoffmetabolite zu grünfluoreszierendem Dichlorofluorescein oxidierten
Immunkomplexen pro einzelnem Leukozyt proportional ist.
2.3.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst
Testprinzip:
Dieser Test wurde auf der Basis des Bursttests an die Untersuchung des immunmodulie-
renden Effektes der Saccharide beim oxidativen Burst von polymorphkernigen Leukozyten
adaptiert.
Der Test ermöglicht die quantitative Bestimmung der durch verschiedene Stimuli ausgelö-
2 Material und Methodik 26
sten Freisetzung reaktiver Sauerstoffmetabolite, des sogenannten oxidativen Burst, von
polymorphkernigen Granulozyten in heparinisiertem Vollblut.
Mit Hilfe einer Waschlösungs-Kontrolle wird der spontane oxidative Burst der Leukozyten
gemessen. Nichtmarkierte opsonisierte E.coli-Bakterien dienen als partikulärer Stimulus,
während Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA; ein Proteinkinase C Aktivator) als “high
stimulus” und N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP; ein chemotaktisches Pep-
tid) als physiologischer “low stimulus” dient.
Nach Stimulation der Leukozyten kommt es zur Aktivierung des membranständigen
NADPH-Oxidase-Komplexes und folglich zur Produktion von reaktiven S
boliten (Wasserstoffperoxid, Superoxid-Anion und Hydroxyl-Radikal). Letztere oxidier
das nicht fluoreszierende Substrat Dihydrorhodamin (DHR) 123 zu dem grünfluoreszie-
renden Produkt Rhodamin 123.
auerstoffmeta-
en
Testablauf:
Vor Versuchsbeginn wird die Substratlösung durch eine 30-45minütige Auflösung der
Substratscheibe in 1 ml Waschlösung hergestellt. Die fMLP- und PMA-Gebrauchslö-
sungen werden durch 1:200 Verdünnung der Stammlösungen mit Waschlösung in einem
zuvor errechneten Verbrauchsvolumen angesetzt.
Analog zu den beiden vorangehenden Testsystemen kann auch dieser Test als Stimulati-
ons- oder Inhibitionstest durchgeführt werden.
Vorkühlung: Die aliquotierten Blutproben, die E.coli-Bakterien, die fMLP- und
PMA-Gebrauchslösungen werden 10 min im Eiswasserbad auf 0°C
abgekühlt.
Aktivierung: Die Testansätze werden durch die Zugabe von 10 µl gut gemischter
E.coli-Bakterien pro Blutprobe hergestellt.
Außerdem werden folgende Kontrollansätze benötigt:
Negativkontrolle: ein Röhrchen mit 10 µl Waschlösung
„Low Control”: ein Röhrchen mit 10 µl fMLP-Gebrauchslösung
“High Control”: ein Röhrchen mit 10 µl PMA-Gebrauchslösung
Erste Inkubation: Alle Test- und Kontrollansätze werden 10 min bei 37,0°C im Was-
serbad temperiert.
Exakt zum Ende der Temperierzeit werden alle Blutproben gleich-
zeitig aus dem Wasserbad genommen und auf Eis gestellt.
2 Material und Methodik 27
Oxidation: Es folgt die Zugabe von 20 µl Substratlösung je Probe mit anschlie-
ßender guter Mischung der Ansätze.
Zweite Inkubation: Die Test- und Kontrollansätze werden ein weiteres Mal über 10 min
bei 37°C im Wasserbad temperiert.
Wiederum genau zum Ende der Temperierzeit werden alle Ansätze
gleichzeitig aus dem Wasserbad genommen und auf Eis gestellt.
Lyse und Fixierung: Zu allen Proben werden 2 ml Lysing-Solution gegeben. Sie werden
nach Mischen 20 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend erfolgt eine Zentrifugation von 5 min mit 250 × g bei
4°C. Der Überstand wird dekantiert.
Waschen: Die Proben werden durch die Zugabe von 3 ml Waschlösung und
anschließender Zentrifugation (5 min, 250 × g, 4°C) gewaschen. Der
Überstand wird dekantiert.
DNA-Färbung: Alle Ansätze werden mit 200 µl DNA-Färbelösung 10 min im licht-
geschützten Eiswasserbad inkubiert und innerhalb von 30 min durch-
flußzytometrisch analysiert.
Durchflußzytometrische Analyse:
Die Messung erfolgt analog zum Phagozytose-Test (siehe Kapitel 2.3.1.).
Auswertung:
Die Leukozytenpopulation wird im Streulichtdiagramm durch das Setzen eines „Gate“ e
gegrenzt (siehe Bild 7 Kapitel 3.1.1.1).
in-
Im Histogramm der Grünfluoreszenz können aus der Oxidation von Dihydrorhodamin 123
zu fluoreszierendem Rhodamin 123 (Emission von Rhodamin 123 bei ca. 530 nm) durch
reaktive Sauerstoffmetaboliten, folgende Kenngrößen ermittelt werden:
1. Die Burstrate, die dem prozentualen Anteil der Zellen, die Sauerstoffmetabolite produ-
ziert haben entspricht.
2. Die mittlere Fluoreszenzintensität pro Einzelzelle (= Mean), die zur Menge an zu Rho-
damin 123 umgesetztem Substrat, also zur Menge an Oxidationsprodukten pro einzel-
nem Leukozyt, proportional ist (siehe Bild 16 in Kapitel 3.1.3.1).
2 Material und Methodik 28
2.4 Auswertung der Testergebnisse
2.4.1 Parameter zur Beurteilung der Meßergebnisse
Die Beurteilung der Versuchsergebnisse erfolgte mit folgenden Parametern:
1. Phagozytoserate (RPh)
2. FcBurstrate (RFcB)
3. Burstrate (RB)
4. Mittlere Fluoreszenzintenstiät (Mean)
5. Modulationskoeffizienten (KPh, KFcB, KB)
Zu 1.: Die Phagozytoserate (RPh) entspricht dem prozentualen Anteil aktiv phagozytie-
render Leukozyten ( ) an der Gesamtzahl aktiver und inaktiver Leukozyten ( iZ ) der
Testansätze:
taZ t
%100×+
=tt
tPh
iZaZaZ
R [%]
Zu 2.: Die FcBurstrate (RFcB) entspricht dem prozentualen Anteil der, nach Fc-Rezeptor
vermittelter Aufnahme von Immunkomplexen, aktiv Sauerstoffradikale produzierenden
Leukozyten ( ) an der Gesamtzahl von aktiven und inaktiven Leukozyten ( ) der
Testansätze:
taZ tiZ
%100×+
=tt
tFcB
iZaZaZ
R [%]
Zu 3.: Die Burstrate (RB) entspricht dem prozentualen Anteil aktiv Sauerstoffradikale
produzierender Leukozyten ( ) an der Gesamtzahl von aktiven und inaktiven Leukozy-
ten ( ) der Testansätze:
taZ
tiZ
%100×+
=tt
tB
iZaZaZ
R [%]
Zu 4.: Die mittlere Fluoreszenzintensität (Mean) pro Einzelzelle wird in der System IITM
Software des EPICS XL ermittelt und entspricht
2 Material und Methodik 29
• im Phagozytose-Test der Anzahl an aufgenommenen Partikeln pro einzelnem Leukozy-
ten,
• im Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst der Menge an reaktiven
Sauerstoffmetaboliten, welche die Immunkomplexe zu grünfluorezierendem Dichloro-
fluorescein oxidieren, pro einzelnem Leukozyten, und
• im Test für den E.coli-stimulierten oxidativen Burst der Menge an fluoreszierendem
Rhodamin 123, also der Sauerstoffradikalproduktion, pro einzelnem Leukozyten.
Zu 5.: Der Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh) entspricht dem relati-
ven Anteil des Produkts der Phagozytoserate ( ) und der mittleren Fluoreszenzintensität
( ) des Testansatzes (mit Sacchariden bzw. LPS) an dem Produkt der Phagozytoserate
( ) und der mittleren Fluoreszenzintensität ( ) der Kontrollansätze (ohne Saccharide
bzw. LPS):
PhtR
0F
tF
R0Ph
00 FF
RR
K tPh
PhtPh ×=
Der Modulationskoeffizient des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst (KFcB) ent-
spricht dem relativen Anteil des Produkts der FcBurstrate ( ) und der mittleren Fluo-
reszenzintensität des Testansatzes (mit Sacchariden bzw. LPS) an dem Produkt der FcBur-
strate ( ) und der mittleren Fluoreszenzintensität der Kontrollansätze (ohne Saccharide
bzw. LPS):
FcBtR
FcBR0
FcB
FcBtFcB
RR
K0
=0F
Ft×
Der Modulationskoeffizient des oxidativen Burst (KB) entspricht dem relativen Anteil
der mittleren Fluoreszenzintensität ( ) von mit Sacchariden bzw. Lipopolysacchariden
vorinkubierten Leukozyten des Testansatzes an der mittleren Fluoreszenzintensität ( )
ohne Saccharide bzw. LPS vorinkubierter Leukozyten der Kontrollansätze:
tF
0F
0FF
K tB =
Wenn keine Modulation der Phagozytose oder des oxidativen Burst von Leukozyten durch
die Saccharide oder LPS stattfindet beträgt der Modulationskoeffizient K = 1. Bei Stimula-
2 Material und Methodik 30
tion der Phagozytose oder des oxidativen Burst von Leukozyten durch die Saccharide oder
LPS wird der Modulationskoeffizient K > 1, während bei Inhibition dieser Leukozyten-
funktionen K < 1 wird.
2.4.2 Arithmetisches Mittel und Spannweite
Alle Versuche wurden mit zwei Ansätzen pro Meßpunkt durchgeführt. Aus diesen zwei
Meßwerten wurde das Arithmetische Mittel errechnet.
Als Streumaß dieser Doppelwerte um das Arithmetische Mittel wurde die Spannweite als
die Differenz zwischen dem größeren und kleineren Meßwert angegeben (Bild 6):
Phag
ozyt
oser
eate
Spannweite ωArithmetisches Mittel
Maximum
Minimum
Phag
ozyt
oser
eate
Spannweite ωArithmetisches Mittel
Maximum
Minimum
Bild 6: Arithmetisches Mittel und Spannweite ω
Aus den jeweils doppelt bestimmten Meßwerten mit und ohne Saccharide lassen sich vier
Werte für den Modulationskoeffizient wie oben erklärt errechnen. Die Spannweite des
Modulationskoeffizienten ergibt sich aus der Differenz zwischen dem größten und dem
kleinsten ermittelten Modulationskoeffizienten:
SaccharidohneMaximumSaccharidmitMinimum
SaccharidohneMinimumSaccharidmitMaximumSpannweite −=ω
2.4.3 Beurteilung der Relevanz der Meßergebnisse
Anhand der Untersuchungsergebnisse zur Testpräzision kann innerhalb der Modulations-
koeffizienten von 0,8 < KPh, KFcB, KB < 1,2 von einer normalen Teststreuung und ab KPh,
KFcB, KB ≤ 0,8 oder KPh, KFcB, KB ≥ 1,2 von einem sicher erfaßbaren Inhibitions- bzw.
Stimulationseffekt auf die Phagozytose, den Fc-Rezeptor- und E.coli-vermittelten oxidati-
ven Burst von Leukozyten ausgegangen werden.
Die Beurteilung der biologischen Relevanz der Meßergebnisse ist aufgrund mangelnder
Erfahrungswerte eine Ermessensfrage. Wir setzten deshalb in Übereinkunft mit unseren
2 Material und Methodik 31
Projektpartnern fest, daß eine biologisch relevante Modulation der Phagozytenfunktionen
durch Functional Food Saccharide erst bei einer Inhibition des KPh, KFcB, KB ≤ 0,6 bzw.
einer Stimulation des KPh, KFcB, KB ≥ 1,4 stattfinden kann. Die Effekte solcher Substanzen
müssen in weiteren Tests, unter Umständen auch tierexperimentell, genauer untersucht
werden.
2.4.4 Präzision der verschiedenen Tests
Zur Beurteilung der Präzision der Testdurchführung und Messung der einzelnen Tests
wurden aus den doppelten Meßwerten von jeweils zehn unter gleichen Bedingungen
durchgeführten Tests folgende Parameter ermittelt:
1. der Mittelwert (MW) der absoluten Spannweiten ω errechnet sich aus der Summe
der Spannweiten der zehn Doppelwerte dividiert durch 10:
10)( 101
∑−=
ωω
SpannweiteSpannweiteabsoluteMW
2. der Mittelwert der relativen Spannweiten errechnet sich aus der Summe der Q
tienten aus der Spannweite und dem Arithmetischen Mittel der zehn Doppelwerte divi-
diert durch zehn. Die relative Spannweite berücksichtigt somit die Höhe der Phag
serate, FcBurstrate bzw. mittleren Fluoreszenzintensität:
uo-
ozyto-
10)( 101
∑−
=MittelschesArithmetri
Spannweite
SpannweiterelativeMW
ω
ω
In Tabelle 3 ist aus der absoluten und relativen Spannweite die Präzision aller Tests er-
sichtlich. Diese Berechnung sind unabhängig von den interindividuellen Schwankungen
der Phagozytoserate, FcBurstrate und mittleren Fluoreszenzintensität zwischen den ver-
schiedenen Spendern.
Die Präzision der Tests ist bei Messung der Granulozytenfunktionen sehr hoch und liegt
zwischen einer relativen Spannweite von 1,16 % bei dem mit opsonierten E.coli durchge-
führten Phagozytose-Test und einer relativen Spannweite der mittleren F
stität von 5,42 % bei dem Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst.
luoreszenzinten-
Aufgrund des gegenüber Granulozyten niedrigeren Monozytenanteils im peripheren Blut
wurden bei der durchflußzytometrischen Analyse geringere Zellzahlen dieser Population
analysiert, weshalb die Präzision der Tests bei den Monozyten geringer ausfiel.
2 Material und Methodik 32
Tabelle 3: Präzision der verschiedenen Tests bei Mono- und Granulozyten
Monozyten Granulozyten
Mittelwerte von
ω absolut ω relativ ω absolut ω relativ
Phagozytose-Test
ops E.coli RPh 2,56 % 4,87 % 0,74 % 1,16 %
Mean 3,85 13,83 % 1,53 4,29 %
non E.coli RPh 1,66 % 4,55 % 1,61 % 3,65 %
Mean 5,08 15,78 % 0,83 2,09 %
ops S.aureus RPh 3,39 % 8,63 % 0,76 % 1,34 %
Mean 12,38 9,19 % 5,37 3,42 %
non S.aureus RPh 3,31 % 10,85 % 1,35 % 3,30 %
Mean 13,80 9,25 % 3,53 2,93 %
non C.albicans RPh 2,64 % 10,09 % 1,33 % 3,40 %
Mean 0,75 6,13 % 0,31 2,36 %
Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
RFcB 3,95 % 13,52 % 1,66 % 4,71 %
Mean 1,44 8,37 % 0,97 5,42 %
Test für die quantitative Bestimmung des oxidativen Burst
Mean 0,50 8,69 % 0,22 2,76 %
Abkürzungen: ω: Spannweite; RPh: Phagozytoserate; RFcB: FcBurstrate; Mean: mittlere Fluoreszenzinten-
sität; ops: opsoniert; non: nonopsoniert
2.4.5 Weitere Auswertungsaspekte
Ziel der Arbeit war es unter einer Vielzahl an untersuchten Sacchariden einen Hinweis auf
Struktur-Funktionsbeziehungen zwischen Kohlenhydraten und Lektinen bei Interaktionen
von Phagozyten mit Mikroorganismen zu bekommen. Um Trends bei den Modulationsef-
fekte zu sehen wurde zunächst ein Screening mit relativ wenig Messungen pro Saccharid
bei einer großen Anzahl verschiedener Saccharide durchgeführt. Nach Beratung durch
Herrn Muche (Abteilung Biometrie und Medizinische Dokumentation, Universität Ulm) ist
bei dieser Fragestellung eine weitere statistische Auswertungen, insbesondere statistische
Tests zum Vergleich der biochemischen Tests, nicht sinnvoll. Eine Zusammenfassung auf
der Grundlage der Relevanz der Ergebnisse (siehe Kapitel 2.4.3) reicht bei dieser Frage-
stellung hier aus. Die Saccharide, welche im Screening einen relevanten Stimulation- bzw.
Inhibitionseffekt zeigen müssen in folgenden Tests genauer untersucht werden.
3 Ergebnisse
3.1 Adaptation der Testsysteme Zunächst wurden funktionelle Tests für eine Erforschung der Modulation von zentralen
Funktionen des angeborenen Immunsystems durch Functional Food Glykane entwickelt
bzw. spezifisch an diese Fragestellung adaptiert.
Zu diesem Zweck wurde die Abhängigkeit aller Tests von folgenden Testbedingungen un-
tersucht: Vorinkubationszeit, Inkubationszeit und Konzentration der fluoreszenten Mikro-
organismen.
3.1.1 Phagozytose-Test
Der Test ermöglicht die quantitative Bestimmung der Aufnahme von fluoreszenzmarkier-
ten Mikroorganismen durch Leukozyten. Im Durchflußzytometer wird die Emission der
phagozytierten Fluoresceinisothiocyanat-markierten Mikroorganismen gemessen. Sie er-
laubt die Ermittlung des prozentualen Anteils der phagozytierenden Leukozyten an der Ge-
samtzahl der phagozytierenden und inaktiven Leukozyten (Phagozytoserate, RPh). Weiter-
hin kann die mittlere Fluoreszenzintensität als Maß für die Anzahl der von einem einzelnen
Leukozyten aufgenommenen Mikroorganismen bestimmt werden.
3.1.1.1 Ergebnisse der Durchflußzytometrischen Analyse des Phagozytose-
Tests
Die Streulichtdiagramme (Vorwärts- gegen Seitwärtsstreulicht, FSC gegen SSC) der mit
E.coli oder S.aureus durchgeführten Phagozytose-Tests unterschieden sich von denen mit
C.albicans. Beim Einsatz von E.coli (Bild 7) oder S.aureus zeigte sich im Streulichdia-
gramm eine homogene Granulozytenpopulation, bei C.albicans (Bild 8) dagegen zwei
Granulozytenpopulationen unterschiedlicher Zellgröße.
3 Ergebnisse 34
Gate A
Granulozyten
Monozyten
Lymphozyten
Bild 7: Streulichtdiagramm eines Phagozytose-Tests mit E.coli zur Differenzierung
der verschiedenen Leukozytenpopulationen
Bild
Abk
Gran
In d
beid
A
8: Streulichtdiagramm eines Phagozytose
riges Histogramm (B)
ürzungen: p.M.: phagozytierende Monozyten, i.M.: i
ulozyten, i.G.: inaktive Granulozyten
em mit C.albicans durchgeführten Phagozytos
en Leukozytenpopulationen durch die separate
B
6,7 % p.M. 38,9 % p.G.
51,4 % i.G.3,0 % i.M.
-Tests mit C.albicans (A) und zugehö-
naktive Monozyten, p.G.: phagozytierende
e-Test gelang eine Differenzierung der
Eingrenzung der Populationen im
3 Ergebnisse 35
Streulichtdiagramm mit Hilfe des „Gate A“. Wurde lediglich die Leukozytenpopulation
geringerer Zellgröße eingegrenzt, so zeigten sich im zugehörigen Histogramm vor allem
die phagozytoseinaktiven Granulozyten (Bild 9A). Bei Eingrenzung der Leukozyten höhe-
rer Zellgröße konnte diese Population im Histogramm als die aktiv C.albicans phagozytie-
rende Granulozytenpopulation identifiziert werden (Bild 9B). Die Messung der Phagozyto-
se von C.albicans erforderte deshalb die Erfassung beider Leukozytenpopulationen im
Streulichtdiagramm.
AI AII
2,4 % p.G.1,3 % p.M.
12,9 % i.M. 83,5 % i.G.
BII BI85,8 % p.G.5,0 % p.M.
0,3 % i.M. 9,1 % i.G.
Bild 9: Streulichtdiagramm eines Phagozytose-Tests mit C.albicans unter Eingren-
zung der Granulozytenpopulation geringerer (AI) und höherer (BI) Zell-
größe, sowie zugehörige Histogramme (AII/BII)
3 Ergebnisse 36
Im Histogramm der Grünfluoreszenz konnte anhand des Fluoreszenzanstieges der Leu-
kozyten durch die Phagozytose von FITC-markierten E.coli-Bakterien die Phagozytoserate
(RPh) und die Anzahl der pro Leukozyt aufgenommenen Bakterien (mittlere Fluoreszenzin-
tensität) bestimmt werden.
Der Kontrollansatzes bei 0 °C, bei dem die Phagozytose blockiert ist, diente zur Einstel-
lung des „Quadrantengitters B“ (Bild 10). Im Testansatz bei 37 °C wanderte die aktiv
FITC-E.coli phagozytierende Leukozytenpopulation aufgrund der ansteigenden Grünfluo-
reszenz nach oben. Sie war deshalb leicht von den lediglich autofluoreszierenden, inakti-
ven Phagozyten abgrenzbar. Die Abgrenzung von phagozytoseaktiven und -inaktiven Pha-
gozyten war bei allen Partikeln möglich, wobei in absteigender Reihenfolge mit S.aureus,
E.coli und C.albicans die höchste Fluoreszenzintensität gemessen werden konnte.
Bild
3.1.
Zur
char
Was
durc
Sacc
A
0,6 % p.G.0,2 % p.M.
5,0 % i.M. 94,2 % i.G.
10: Vergleich des Kontrollansatzes bei 0 °C
eines Phagozytose-Tests mit FITC-mar
1.2 Einfluß der Vorinkubation auf die P
Untersuchung eines phagozytosestimulierende
ide vor Beginn des Test sechzig Minuten mit d
serbad inkubiert. Um eine artifizielle Stimulat
h diese Vorinkubation auszuschließen, wurden
haride über 0, 30, 60, 90 und 120 Minuten vo
B
67,6 % p.G.1,6 % p.M.
0,9 % i.M. 29,9 % i.G.
(A) mit dem Testansatz bei 37 °C (B)
kierte E.coli-Bakterien
hagozytose
n Saccharideffektes wurden die Testsac-
em heparinisiertenVollblut bei 37 °C im
ion oder Inhibition der Phagozytose
Kontrollproben des Vollblutes ohne
rinkubiert.
3 Ergebnisse 37
Anschließend konnten im Phagozytose-Test die Phagozytoseraten und die mittleren Fluo-
reszenzintensitäten gemessen werden. Diese ergaben innerhalb der zweistündigen Vorin-
kubationszeit keine relevanten Änderungen bei opsonierten E.coli (RPh zwischen 26,2 %
und 30,2 %; Mean zwischen 31,3 und 36,7) und nonopsonierten E.coli (RPh zwischen 14,0
% und 17,4 %; Mean zwischen 32,6 und 37,6).
Ebenso wurden bei einer Vorinkubation bis zu 60 Minuten nur geringe Veränderungen der
granulozytären Phagozytoserate und der mittleren Fluoreszenzintensität mit opsoniertem
S.aureus (RPh zwischen 48,2 % und 50,4 %; Mean zwischen 122,2 und 126,8) und no-
nopsoniertem S.aureus (RPh zwischen 28,6 % und 31,0 %; Mean zwischen 109,7 und
111,7) gemessen. Erst nach einem Vorinkubationszeitraum von 120 Minuten konnte, ohne
relevante Änderung der mittleren Fluoreszenzintensität, eine Abnahme der Phagozytosera-
te von 50,4 % auf 44,3 % bei opsoniertem und von 31,0 % auf 23,8 % bei nonopsoniertem
S.aureus ermittelt werden.
Insgesamt konnte gezeigt werden, daß es durch eine sechzigminütige Vorinkubation zu
keiner relevanten Stimulation oder Inhibition der Phagozytose von E.coli- oder S.aureus-
Bakterien durch Granulozyten kam.
3.1.1.3 Einfluß der Konzentration der Mikroorganismen auf die Phagozytose
Die Phagozytose von Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Candida albicans durch
polymorphkernige Granulozyten nahm mit steigender Konzentration der Mikroorganismen
im Test zu (Bild 11). Ein Vergleich zwischen den drei Phagozytosepartikeln zeigte eine
analog verlaufende Sättigungskinetik der Phagozytoseraten. Allerdings waren in abstei-
gender Reihenfolge für E.coli, S.aureus und C.albicans höhere Verhältnisse von Mikroor-
ganismen zu Leukozyten notwendig um vergleichbare Phagozytoseraten zu erhalten. Au-
ßerdem war die Phagozytoserate der Granulozyten bei Einsatz opsonierter Partikel stets
größer als bei nonopsonierten.
Demgegenüber nahm die Anzahl der phagozytierten Partikel pro einzelnem Mono- bzw.
Granulozyt (mittlere Fluoreszenzintensität) bei allen drei Phagozytosepartikeln annährend
linear mit dem Verhältnis von Mikroorganismen zu Leukozyten zu.
Analog zu den Granulozyten zeigten auch die Monozyten eine konzentrationsabhängige
Sättigungskinetik der Phagozytoserate und einen annähernd linearen Anstieg der mittleren
Fluoreszenzintensität bei allen drei Mikroorganismen (Ergebnisse nicht dargestellt).
3 Ergebnisse 38
0 5 10 15 20 25E.coli : Leukozyten - Verhältnis
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%Ph
agoz
ytos
erat
e
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9S.aureus : Leukozyten - Verhältnis
Phag
ozyt
oser
ate
B A
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 1 2 3 4C.albicans : Leukozyten - Verhältnis
Phag
ozyt
oser
ate
C
Bild 11: Einfluß der Konzentration an E.coli (A), S.aureus (B) bzw. C.albicans (C) auf
die Phagozytose von Granulozyten
Heparinisiertes Vollblut wurde während der Durchführung des Phagozytose-Tests mit den angegebenen
Konzentrationen von E.coli, S.aureus bzw. C.albicans fünf Minuten bei 37 °C im Wasserbad inkubiert. Er-
gebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist das Arithmetische
Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.
3.1.1.4 Einfluß der Inkubationszeit auf die Phagozytose
Die Phagozytose von Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Candida albicans durch
Leukozyten war bei der Kontrolle (Inkubationszeit 0 min) auf Eis blockiert und nahm mit
ansteigender Inkubationszeit der Mikroorganismen im heparinisierten Vollblut bei 37 °C
im Wasserbad zu. Dabei unterlag die granulozytäre Phagozytose aller drei Partikel einer
ähnlichen Zeitkinetik, wobei opsonierte Partikel stets schneller und in größerem Ausmaß
phagozytiert wurden als nicht opsonierte. Außerdem wurde S.aureus, trotz des geringeren
Bakterien : Leukozyten-Verhältnisses gegenüber E.coli, schneller und in höherem Ausmaß
3 Ergebnisse 39
durch Granulozyten aufgenommen. Die Phagozytoserate von Granulozyten bei C.albicans
lag in einem Bereich dazwischen (Bild 12). Auch die Anzahl an phagozytierten Partikeln
pro Leukozyt (mittlere Fluroeszenzintenstiät) stieg vor allem bei S.aureus mit zunehmen-
der Inkubationszeit an. Monozyten zeigten eine ähnlichen Inkubationszeitkinetik bei der
Phagozytoserate und mittleren Fluoreszenzintensität wie Granulozyten.
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0
Phag
ozyt
oser
ate
C.albicans
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0
Mittl
ere F
luor
esze
nzin
tens
ität
Bild 12: Einfluß
zenzint
Heparinisiertes Vol
(E.coli : Leukozyte
Candida albicans (
Wasserbad inkubie
ist das Arithmetisch
A
10 20 30 40 50 60Inkubationszeit [min]
S.aureusopsoniert
S.aureusnonopsoniert
E.coliopsoniert
E.colinonopsoniert
C.albicansB
10 20 30 40 50 60Inkubationszeit [min]
S.aureusopsoniert
S.aureusnonopsoniert
E.coli opsoniert
E.colinonopsoniert
der Inkubationszeit auf die Phagozytose (A) und mittlere Fluores-
ensität (B) von Granulozyten
lblut wurde während der Durchführung des Phagozytose-Tests mit Escherichia coli
n-Verhältnis 6:1), Staphylococcus aureus (S.aureus : Leukozyten-Verhältnis 2:1) oder
C.albicans : Leukozyten-Verhältnis 2:1) über die angegebenen Zeiträume bei 37 °C im
rt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben
e Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.
3 Ergebnisse 40
3.1.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
Der Test ermöglicht die Bestimmung der Fc-Rezeptor vermittelten Aufnahme von farb-
stoffmarkierten Immunkomplexen in Phagozyten. Die internalisierten Immunkomplexe
stimulieren die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen in den Phagozyten, wodurch
der zunächst nicht fluoreszierende Farbstoff-Immunkomplex durch Oxidation fluoreszent
wird. Die Messung im Durchflußzytometer erlaubt die Bestimmung des Anteils der aktiv
Immunkomplexe phagozytierenden Leukozyten an der Gesamtzahl aller Leukozyten (=
FcBurstrate). Außerdem kann die mittlere Fluoreszenzintensität als Maß für die produzier-
te Menge an reaktiven Sauerstoffradikalen je Einzelzelle ermittelt werden.
3.1.2.1 Ergebnisse der durchflußzytometrischen Analyse des Tests für den Fc-
Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
Das Streulichtdiagramm des Tests für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst war
dem des Phagozytose-Tests mit E.coli oder S.aureus (Bild 7 Kapitel 3.1.1.1) analog.
Die Gegenüberstellung eines Kontrollansatzes bei 0 °C und eines Testansatzes bei 37 °C
im Histogramm der Grünfluoreszenz (Bild 13) zeigt, daß eine nahezu vollständige Blok-
kierung des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst bei 0 °C möglich ist. Der Kontroll-
ansatz diente der Differenzierung von phagozytoseaktiven und -inaktiven Leukozyten
durch eine Separation der Leukozytenpopulationen mit Hilfe des „Quadrantengitters B“.
3 Ergebnisse 41
Bild
3.1.
Im S
der T
Fc-R
Voll
60, 9
Inne
tose
resz
artif
gesc
3.1.
Die
Saue
(FcB
A
0,7 % p.G.0,1 % p.M.
9,2 % i.M. 90,1 % i.G.
13: Vergleich des Kontrollansatzes bei 0 °C
im Test für den Fc-Rezeptor vermittelt
2.2 Einfluß der Vorinkubationzeit auf d
tiven Burst
timulationstest sollte ausgeschlossen werden,
estsaccharide mit dem heparinisierten Vollbl
ezeptor abhängigen Phagozytose von Immun
blut, analog zum Phagozytose-Test, ohne Test
0 bis zu 120 Minuten vorinkubiert.
rhalb der zweistündigen Vorinkubation wurde
rate von Immunkomplexen (RFcB zwischen 28,
enzintensität der Granulozyten (Mean zwische
izielle Stimulation oder Inhibtion des Fc-Reze
hlossen werden konnte.
2.3 Einfluß der Konzentration an Immu
vermittelten oxidativen Burst
Phagozytose von Fc-Rezeptor gebundenen Im
rstoffradikale produzierenden Mono- und Gra
urstrate) nahm linear zur Konzentration der Im
B
46,3 % p.G.3,3 % p.M.
3,9 % i.M. 46,5 % i.G.
(A) mit dem Testansatz bei 37 °C (B)
en oxidativen Burst
en Fc-Rezeptor vermittelten oxida-
daß eine sechzigminütige Vorinkubation
ut eine artifizielle Zu- oder Abnahme der
komplexen auslöste. Dazu wurde das
saccharide über die Zeitintervalle 0, 30,
keine relevante Änderung der Phagozy-
0 % und 29,7 %) und der mittleren Fluo-
n 11,1 und 12,0) ermittelt, so daß eine
ptor vermittelten oxidativen Burst aus-
nkomplexen auf den Fc-Rezeptor
munkomplexen und der Anteil der aktiv
nulozyten an der Gesamtzahl der Zellen
munkomplexe im Versuchsansatz zu
3 Ergebnisse 42
(Bild 14). Auch die Menge an produzierten Sauerstoffradikalen je Einzelzelle (mittlere
Fluoreszenzintensität) zeigte einen linearen Anstieg mit der Immunkomplexkonzentration.
Insgesamt war die Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten um den Faktor 1,3 bis
2,1 höher als bei Monozyten. Bei einer Steigerung der Immunkomplexkonzentration von
34 µg/ml auf 272 µg/ml zeigten die Granulozyten zudem einen stärkeren Anstieg des oxi-
dativen Burst (von 9,4 auf 17,9) als die Monozyten (von 5,5 auf 8,4).
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 50 100 150 200 250 300Konzentration [µg/ml]
FcBu
rstra
te
Monozyten
Granulozyten
Bild 14: Einfluß der Immunkomplexkonzentration auf den Fc-Rezeptor vermittelten
oxidativen Burst von Monozyten und Granulozyten
Heparinisiertes Vollblut wurde während der Durchführung des Tests für den Fc-Rezeptor vermittelten oxida-
tiven Burst mit den angegebenen Konzentrationen an Immunkomplexen fünf Minuten bei 37 °C im Wasser-
bad inkubiert. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen mit Einzelwerten.
3.1.2.4 Einfluß der Inkubationszeit auf den Fc-Rezeptor vermittelten oxidati-
ven Burst
Die Phagozytose von Fc-Rezeptor gebundenen Immunkomplexen und der nachfolgende
oxidative Burst stiegen mit zunehmender Inkubationsdauer der Immunkomplexe mit dem
Vollblut im 37 °C-Wasserbad an.
Der Anteil der Mono- bzw. Granulozyten die Sauerstoffradikale produzierten, an der Ge-
samtzahl der jeweiligen Zellpopulation zeigte im Verlauf der dreißigminütigen Inkubation
eine Sättigungskinetik. Dagegen stieg die Produktion von reaktiven Sauerstoffradikalen je
einzelnem Mono- bzw. Granulozyt linear mit der Inkubationsdauer an (Bild 15).
3 Ergebnisse 43
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0
FcBu
rstra
te70
t
Bild 15
Heparin
tiven Bu
Wasserb
ist das A
3.1.3
Der Te
sten Sa
E.coli
stoffpe
fluores
fen. Di
laubt d
pro ein
len.
A
5 10 15 20 25 30Inkubationszeit [min]
0
10
20
30
40
50
60
0
Mittl
ere F
luor
esze
nzin
tens
itä: Einfluß der Inkubationszeit auf die FcB
zenzintensität (B) von Monozyten und G
isiertes Vollblut wurde während der Durchführung de
rst mit Immunkomplexen (150 µg IC / ml Vollblut) ü
ad inkubiert. Ergebnisse aus einem repräsentativen v
rithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die z
Test zur quantitativen Bestimmu
st ermöglicht die quantitative Bestimmung d
uerstoffradikalproduktion von Leukozyten.
produzieren Granulozyten und Monozyten re
roxid, Superoxid-Anion, Hydroxylradikal),
zierenden, zellmembranpermeablen Farbsto
e Messung der Emission dieses Farbstoffes
ie Ermittlung der mittleren Fluoreszenzinten
zelnem Mono- bzw. Granulozyt produzierte
B
5 10 15 20 25 30Inkubationszeit [min]
urstrate (A) und die mittlere Fluores-
ranulozyten
s Tests für den Fc-Rezeptor vermittelten oxida-
ber die angegebenen Zeiträume bei 37 °C im
on drei durchgeführten Versuchen. Angegeben
ugehörige ( ) Spannweite ω.
ng des oxidativen Burst
er mit verschiedenen Stimuli ausgelö-
Nach Stimulation mit fMLP, PMA oder
aktive Sauerstoffmetaboliten (Wasser-
welche die Umwandlung eines nicht
ffes in einen fluoreszierenden hervorru-
erfolgt im Durchflußzytometer und er-
sität als Maß für die durchschnittlich
Menge an reaktiven Sauerstoffradika-
3 Ergebnisse 44
3.1.3.1 Ergebnisse der durchflußzytometrischen Analyse des Tests zur quanti-
tative Bestimmung des oxidativen Burst
Das Streulichtdiagramm des Tests zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst
war dem des Phagozytose-Tests mit E.coli oder S.aureus (Bild 7 Kapitel 3.1.1.1) analog.
Die Gegenüberstellung eines Kontroll- und Testansatzes im Histogramm der Grünfluo-
reszenz zeigt die geringe Autofluoreszenz der Leukozyten im Kontrollansatz durch eine
Blockierung des oxidativen Burst auf Eis (0 °C), sowie einen Anstieg der mittleren Fluo-
reszenzintensität (Mean) bei Inkubation des Testansatzes im 37 °C-Wasserbad (Bild 16).
B
A
Mean G. 13,4Mean M. 0,8 Mean G. 0,8 Mean M. 6,2
Bild 16: Vergleich der Fluoreszenzintensität des Kontrollansatzes bei 0 °C (A) mit
dem Testansatz bei 37 °C (B) bei der quantitativen Bestimmung des oxidati-
ven Burst von Monozyten (Mean M.) und Granulozyten (Mean G.)
3.1.3.2 Einfluß der Vorinkubationzeit auf die quantitative Bestimmung des
oxidativen Burst
Zum Ausschluß einer artifiziellen Modulation des oxidativen Burst von Leukozyten im
Stimulationstest durch eine einstündige Vorinkubation mit den Testsacchariden, wurde das
heparinisierte Vollblut über 0, 30, 60, 90 bis zu 120 Minuten ohne Testsaccharide bei
37 °C vorinkubiert.
Innerhalb dieser Zeitintervalle wurde keine relevante Änderung der Burstrate (RB zwischen
95,2 % und 96,5 %) und der mittleren Fluoreszenzintensität von Granulozyten (Mean zwi-
3 Ergebnisse 45
schen 12,5 und 16,3) gemessen, so daß eine artifizielle Zu- oder Abnahme des durch E.coli
stimulierten oxidativen Bursts ausgeschlossen werden konnte.
3.1.3.3 Einfluß der Stimuluskonzentration auf die quantitative Bestimmung
des oxidativen Burst
Der prozentuale Anteil der Monozyten und Granulozyten mit oxidativem Burst und die
Produktion von reaktiven Sauerstoffmetaboliten pro Leukozyt nahm mit ansteigender
Konzentration des partikulären Stimulus E.coli und des chemischen Stimulus PMA zu,
während er durch den physiologischen Stimulus fMLP und die Kontrolle ohne Stimulus
unbeeinflußt blieb. Bei Einsatz des Stimulus PMA verursachten bereits geringste Konzen-
trationen einen starken Anstieg der Burstrate, so daß mit 0,24 µM PMA bereits 93 % der
Granulozyten Sauerstoffradikale produzierten (Bild 17AI).
Die von einem Leukozyt durchschnittlich produzierte Menge an reaktiven Sauerstoffmeta-
boliten zeigte eine annährend lineare Zunahme mit dem E.coli:Leukozyten-Verhältnis bzw.
der PMA-Konzentration (Bild 17AII).
Vor allem bei höheren Stimuluskonzentration lag die Sauerstoffradikalproduktion von
Granulozyten deutlich über der von Monozyten. So wurde bei einem E.coli:Leukozyten-
Verhältnis von 40:1 bei Granulozyten ein um den Faktor 2,4 höherer bzw. mit 1,9 µM
PMA ein um den Faktor 4,8 höherer oxidativer Burst als bei Monozyten ermittelt.
3.1.3.4 Einfluß der Inkubationszeit auf die quantitative Bestimmung des oxida-
tiven Burst
Der prozentuale Anteil der Leukozyten mit oxidativem Burst und die Sauerstoffradikalpro-
duktion pro Leukozyt nahm mit steigender Inkubationdauer des Vollblutes in Anwesenheit
des partikulären Stimulus E.coli und des „High Stimulus“ PMA bei 37 °C zu. Dagegen
zeigte sich in Gegenwart des physiologischen „Low Stimulus“ fMLP und der Kontrolle
ohne Stimulus keine Zunahme der Burstrate oder der mittleren Fluoreszenzintensität von
Leukozyten in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Bei Einsatz von 1,6 µM PMA pro-
duzierten nach einer Inkubation von 3,5 Minuten bereits 94 % und nach 7 Minuten 99 %
der Granulozyten Sauerstoffradikale, während bei einem E.coli:Leukozyten-Verhältnis von
34:1 nach einer 10 minütigen Inkubation 91 % der Granulozyten einen oxidativen Burst
aufwiesen (Bild 17BI).
3 Ergebnisse 46
Die nach einer Stimulation mit E.coli von einem Granulozyten durchschnittlich produzierte
Menge an reaktiven Sauerstoffmetaboliten nahm bis zu einer Inkubationsdauer von 10 Mi-
nuten annähernd linear zu (Bild 17BII).
Analog konnte bei Granulozyten auch in Abhängigkeit von der Inkubationszeit eine mit
den Stimuli E.coli circa zweifach und mit PMA circa fünffach erhöhte Sauerstoffradikal-
produktion im Vergleich zu Monozyten nachgewiesen werden.
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 5 10 15 20 25Stimulusfaktor
Burs
trate
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25Stimulusfaktor
Mittl
ere F
luor
esze
nzin
tens
ität
AI AII
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 5 10 15 20 25 30Inkubationszeit [min]
Burs
trate
0102030405060708090
100
0 5 10 15 20 25 30Inkubationszeit [min]
Mittl
ere F
luor
esze
nzin
tens
ität
BI BII
Bild 17: Einfluß der Stimuluskonzentration (A) bzw. der Inkubationszeit (B) auf den
prozentualen Anteil von Granulozyten mit oxidativem Burst (I) und die Sau-
erstoffradikalproduktion (II)
Heparinisiertes Vollblut wurde beim Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst (A) mit ver-
schiedenen Konzentrationen an Stimuli zehn Minuten, bzw. (B) mit 20 µl Waschlösung, 1,0 µM fMLP (N-
formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine), 1,62 µM PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) bzw. mit einem
Escherichia coli:Leukozyten-Verhältnis von 34:1 über die angegebenen Zeiträume, bei 37 °C im Wasserbad
3 Ergebnisse 47
inkubiert. Bei Stimulusfaktor 1 betrug das Escherichia coli:Leukozyten-Verhältnis 1:1, die Konzentration an
fMLP 0,03 µM und an PMA 0,05 µM. Alle weiteren Konzentrationen ergeben sich durch Multiplikation mit
dem angegebenen Stimulusfaktor. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen
mit Einzelwerten.
3.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen
Um für die Mucosa-assoziierten Phagozyten des Gastrointestinaltraktes ein verbessertes
physiologisches Zellmodell zur Verfügung zu haben, wurden aus humanen Blutmonozyten
in Kultur Makrophagen erzeugt.
3.1.4.1 Makrophagenkultur
Die Kultivierung von Monozyten aus peripherem Spenderblut oder Buffy Coats und deren
Differenzierung zu humanen Makrophagen wurde als Standardmethode etabliert (Kapitel
2.2.2.1).
Nach einer Differenzierung von zehn bis vierzehn Tagen konnten die humanen Makropha-
gen geerntet werden. Wegen der gegenüber anderen Kulturgefäßen geringeren Makropha-
genadhärenz an eine spezielle Kulturfolie konnten die Zellen in guter Ausbeute von der
Folie abgelöst werden. Diese Ablösung erfolgte ohne Kollagenase und Proteasen, um eine
intakte Zelloberfläche und -funktion zu gewährleisten. Außerdem wurden die Zellen bei
der Ablösetechnik so gut vereinzelt, daß sie für die durchflußzytometrische Analyse geeig-
net waren.
3.1.4.2 Durchflußzytometrische Charakterisierung der Makrophagen
Im Streulichtdiagramm ließen sich die kultivierten Makrophagen anhand der Zellgröße
(Vorwärtsstreulicht, FSC) und der Zellgranularität (Seitwärtsstreulicht, SSC) von den Mo-
nozyten und Lymphozyten abgrenzen. Dabei zeigten die Makrophagen (Bild 18B) gegen-
über den Monozyten (Bild 18A) sowohl eine erhöhte Zellgröße als auch -granularität.
3 Ergebnisse 48
B A Makrophagen
Lymphozyten
Monozyten
Lymphozyten
Bild 18: Streulichtdiagramm eines Phagozytose-Test mit E.coli zur Differenzierung
von humanen Monozyten (A) und kultivierten Makrophagen (B)
Aus peripherem Spenderblut wurde mit Ficoll-Paque die mononukleäre Fraktion isoliert, und mit dem Durch-
flußzytometer wurden Lymphozyten und Monozyten anhand ihrer Zellgröße und -granularität analysiert
(Bild 18A). Nach 10 Tagen in vitro-Kultur (gemäß Kapitel 3.1.4.1) differenzierten sich die Monozyten zu
Makrophagen mit höherer Zellgröße und -granularität (Bild 18B).
Die Überprüfung der Vitälität mit Propidiumjodid ergab, daß die im Makrophagen-Gate
eingegrenzten Zellen zu über 95 % vital waren.
Der simultane Einsatz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern sowohl gegen den CD14-
Rezeptor, der auf Monozyten und Makrophagen exprimiert ist, als auch gegen den Manno-
se-Rezeptor, der nur auf Makrophagen exprimiert wird, ermöglichte eine exakte Charakte-
risierung der Makrophagen und eine Abgrenzung gegenüber den Monozyten. Die Antikör-
per zur Isotyp-Kontrolle dienten zur Ermittlung der Autofluorezenz und zur Einstellung
des Quadrantengitters im Histogramm.
Aus dem Histogramm, in dem die Fluoreszenz der Mannoserezeptor-Antikörper gegen die
Fluoreszenz der CD14-Antikörper aufgetragen wurde, ist folgendes ersichtlich:
Auf der im Streulichtdiagramm als Monozyten identifizierte Population ließ sich CD14
(CD14 Expressionshöhe: Mean 20-30) nachweisen. Diese Monozytenpopulation war für
den Mannose-Rezeptor praktisch negativ (Bild 19A).
Dagegen exprimierte die Makrophagenpopulation (Bild 19B) CD14 um den Faktor 10 hö-
her (CD14 Expressionshöhe: Mean ca. 200) und war nahezu vollständig für den Mannose-
Rezeptor positiv (Mannoserezeptor Expressionshöhe: Mean ca. 30-60).
3 Ergebnisse 49
A B Monozyten
(CD14+/MR-)
Makrophagen
(CD14+/MR+)
Bild 19: Charakterisierung von humanen Monozyten (A) und kultivierten Makropha-
gen (B) anhand der Expressionshöhe des Mannoserezeptor (MR) und CD14
Aus peripherem Spenderblut wurde mit Ficoll-Paque die mononukleäre Fraktion isoliert und mit dem PE-
markierten Mannoserezeptor-Antikörper und dem ECD-markierten CD14-Rezeptor-Antikörper eine Im-
munphänotypisierung der Monozyten (A) und der 10 Tage kultivierten Makrophagen (B) gemäß Kapitel
2.2.2.2 durchgeführt.
3.1.4.3 Optimierung der Testbedingungen für Makrophagen
Vergleichende Untersuchungen der Phagozytose von E.coli mit Makrophagen, die über
verschiedene Zeiträume inkubiert wurden, zeigten eine 60-100 % Steigerung der Phagozy-
toserate von elf Tage kultivierten Zellen gegenüber der Kultur von acht Tagen. Auf diesen
Erfahrungswerten basierend wurden die Makrophagen in den Tests standardisiert zehn Ta-
ge in vitro kultiviert.
Weiterhin mußten die kultivierten Makrophagen in gepooltem Humanserum ca. eine Stun-
de bei Raumtemperatur rekonstituiert werden, da die Phagozytoseraten dieser Zellen an-
sonsten um ca. 20 % geringer waren.
Da Makrophagen größer als Granulo- und Monozyten sind konnte von einer höheren Ad-
härenz der Phagozytosepartikel an unspezifische Rezeptoren ausgegangen werden. Um die
Autofluoreszenz von nicht phagozytierten, sondern lediglich adhärenten Bakterien mög-
lichst vollständig zu unterdrücken, wurden Untersuchungen mit höheren Konzentrationen
an Quenchlösung (100-200 µl) durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, daß die Ver-
doppelung der Konzentration an Quenchlösung von 100 µl auf 200 µl bei einem
3 Ergebnisse 50
E.coli:Makrophagen-Verhältnis von 10:1 zu einer Verminderung der Phagozytoserate von
36,5 % auf 26,2 % und der mittleren Fluoreszenzintensität von 168 auf 166 führte. Bei den
folgenden Untersuchugen wurde deshalb 200 µl Quenchlösung als Standard gewählt.
Die Phagozytose von Escherichia coli und Staphylococcus aureus durch die kultivierten
Makrophagen nahm mit steigender Konzentration der Mikroorganismen (Bild 20A) und
mit der Inkubationszeit (Bild 20B) nahezu linear zu. Im Vergleich zu Granulozyten im
Vollblut lag die Phagozytoserate der kultivierten Makrophagen insgesamt um ca. 10-20 %
niedriger. Außerdem fanden sich mit Makrophagen im Gegensatz zu Neutrophilen bei Ein-
satz von opsonierten und nonopsonierten E.coli nur geringe Differenzen der Phagozytose-
raten.
Die Inkubationszeit wurde standardisiert auf 5 Minuten beschränkt, um den Verlust der
Makrophagen durch eine Adhärenz am Inkubationsgefäß zu minimieren.
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0
Phag
ozyt
oser
ate
90%100%
Bild 20
Die 10 T
den ange
me, bei 3
sche Mit
A
2 4 6 8 10E.coli : Makrophagen - Verhältnis
120%
10%20%30%40%50%60%70%80%
0
Phag
ozyt
oser
ate
: Einfluß der Konzentration von E.coli (A)
Phagozytose durch Makrophagen
age kultivierten Makrophagen wurden während der Du
gebenen E.coli-Konzentrationen 10 Minuten, bzw. (B)
7 °C im Wasserbad inkubiert. Ergebnisse aus jeweils e
tel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spann
B
2 4 6 8 10 12 14 1Inkubationszeit [min]
6
und der Inkubationszeit (B) auf die
rchführung des Phagozytose-Tests (A) mit
mit S.aureus über die angegebenen Zeiträu-
inem Versuch. Angegeben ist das Arithmeti-
weite ω.
3 Ergebnisse 51
3.2 Saccharidscreening im Phagozytose-Test Die stimulierende bzw. inhibierende Wirkung verschiedener Saccharide auf die Phagozy-
tose von Escherichia coli ist anhand des „Modulationskoeffizienten der Gesamtphagozyto-
se“ (KPh) zu ersehen. Er bezeichnet den Quotient aus der Gesamtphagozytose (= Phagozy-
toserate × mittlerer Fluoreszenzintensität) des Testansatzes mit Saccharid und der
Gesamtphagozytose der Kontrolle ohne Saccharid.
Es wurden drei Testreihen mit doppelten Testansätzen je Saccharid und mit dreifachen
Kontrollansätzen ohne Saccharid als Stimulations- und als Inhibitionstest durchgeführt.
Anhand dieser Testreihen ist ersichtlich, daß starke interindividuelle Schwankungen der
Saccharideffekte trotz der hohen Testpräzision (geringe Spannweite der Doppelwerte)
auftreten können. Außerdem stellten wir im Rahmen der Auswertung fest, daß bestimm
Probanden, unabhängig von den eingesetzten Testsacchariden, ein generell erniedrigtes
bzw. erhöhtes Phagozytoseniveau aufwiesen. Da sich das Differentialblutbild dieser Perso-
nen im physiologischen Bereich befand, spielt hierfür möglicherweise eine latente Stimula-
tion der Leukozyten eine Rolle.
te
Wie in Tabelle 4 dargestellt zeigte im Stimulationstest ausschließlich BC-D-146 eine Stei-
gerung der granulozytären Phagozytose von nonopsonierten E.coli. Im Inhibitionstest
(Tabelle 5), das heißt ohne Saccharidvorinkubation, fanden sich ausschließlich hemmende
Effekte der Saccharide auf die granulozytäre Phagozytose von nonopsonierten E.coli, wo-
bei das Polysaccharid Fucoidan bereits in sehr niedrigen Konzentrationen (KPh ≤ 0,3 bei
0,5 mg/ml) den stärksten Hemmeffekt zeigte.
Eine Hemmung der Gesamtphagozytose mit einem KPh ≤ 0,5 wurde in mindestens zwei
Testreihen mit BC-O-148 und BC-O-145 und ein KPh ≤ 0,6 mit oxidierter Saccharose, BC-
O-71, BC-O-150 und BC-O-282 erreicht.
3 Ergebnisse 52
Tabelle 4: Einfluß verschiedener Saccharide auf die Phagozytose von nonopsonier-
ten Escherichia coli durch Granulozyten im Stimulationstest
Test 1 Test 2 Test 3
KPh (ω) KPh (ω) KPh (ω)
Monosaccharide
BC-O-148* (Glucuronsäurederivat) 0,65 (0,13) 0,68 (0,08) 0,74 (0,14)
D-Mannose-6-phosphat 1,01 (0,18) 0,44 (0,06) 0,98 (0,06)
Disaccharide
Lactose* (Galβ1,4Glc) 0,83 (0,12) 0,92 (0,14) 1,10 (0,28)
BC-D-146* (Glc, Gluconsäure) 1,37 (0,46) 1,17 (0,15) 1,35 (0,28)
BC-O-145* (Aminozucker, Glc) 0,89 (0,11) 0,54 (0,08) 0,63 (0,25)
BC-D-185* (oxidiert) 0,74 (0,14) 0,73 (0,10) 0,77 (0,15)
N-Acetyllactosamin (Galβ1,4GlcNAc) 1,03 (0,31) 0,43 (0,05) 0,97 (0,14)
Trisaccharide
Lactosucrose* (Galβ1,4Glcα1,2Fru) 0,92 (0,19) 0,96 (0,14) 1,21 (0,20)
Raffinose* 0,5 mg/ml (Galα1,6Glcα1,2Fru)
0,73 (0,02) 1,02 (0,17) 0,67 (0,13)
BC-O-71* (Glc, Fru) 0,66 (0,08) 0,68 (0,10) 0,78 (0,14)
BC-O-150* (Polyol, Glc, Sorbit, Man-nit)
0,76 (0,13) 0,93 (0,15) 1,16 (0,17)
BC-O-207* (Gal, Glc) 0,82 (0,14) 0,75 (0,09) 1,13 (0,33)
α-1,3-α-1,6-Mannotriose (Manα1,3Manα1,6ManαOMethyl)
1,08 (0,21) 0,46 (0,08) 0,95 (0,13)
Tetrasaccharide
Nystose* 0,5 mg/ml (Glcα1,2Fruα1,2Fruα1,2Fru)
0,71 (0,04) 1,10 (0,24) n.l. ( - )
Stachyose* (Galα1,6Galα1,6Glcα1,2Fru)
0,68 (0,15) 0,68 (0,10) 0,94 (0,16)
BC-O-50* (Glc, Fru) 0,81 (0,06) 0,80 (0,12) 1,24 (0,43)
BC-O-76* (Polyol; Glc, Sorbit, Man-nit)
0,70 (0,11) 0,68 (0,08) 0,89 (0,22)
BC-O-191* (Gal, Glc) 0,84 (0,13) 0,68 (0,10) 1,08 (0,24)
Chitotetraose (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]3)
1,00 (0,28) 0,48 (0,01) 0,99 (0,24)
Pentasaccharide
BC-O-192* (Gal, Glc) 0,91 (0,15) 0,98 (0,15) 1,13 (0,23)
BC-O-290* 0,68 (0,14) 0,78 (0,17) 0,85 (0,21)
3 Ergebnisse 53
Chitopentaose 0,6 mg/ml (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]4)
0,94 (0,17) 0,60 (0,03) 0,97 (0,10)
Hexasaccharide
Disialyllacto-N-tetraose, 0,5 mg/ml (Neu5Acα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)-GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc)
1,36 (0,21) 0,71 (0,04) 1,09 (0,13)
Chitohexaose (0,6 mg/ml) (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]5)
0,97 (0,16) 0,51 (0,07) 1,09 (0,17)
Heptasaccharide
BC-O-25* (Glc, Fru) 0,70 (0,18) 0,55 (0,08) 0,90 (0,21)
Oligosaccharidmischung
BC-O-282* 0,69 (0,13) 0,74 (0,12) 1,06 (0,15)
Polysaccharid
Fucoidan (v.a. sulfatierte Fucose) 0,5 mg/ml
0,54 (0,22) 0,08 (0,03) 0,28 (0,01)
Tabelle 4: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit den angegebenen Sacchariden bei 37 °C
im Wasserbad vorinkubiert. Die Saccharidkonzentration betrug 2 mg/ml. Die wegen mangelnder Saccharid-
löslichkeit vom Standard abweichenden Konzentrationen bzw. die nicht in höheren Konzentrationen verfüg-
baren Saccharide sind in der Tabelle extra aufgeführt. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit 5 µl
nonopsonierten E.coli und einer Inkubationszeit von fünf Minuten durchgeführt. Angegeben ist der Modula-
tionskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spannweite (ω) der je Saccharid doppelt bestimmten
Meßwerte. * Saccharide der Südzucker AG. n.l.: Saccharid von Südzucker AG nicht weiter lieferbar.
3 Ergebnisse 54
Tabelle 5: Einfluß verschiedener Saccharide auf die Phagozytose von nonopsonier-
ten Escherichia coli durch Granulozyten im Inhibitionstest
Test 1 Test 2 Test 3
KPh (ω) KPh (ω) KPh (ω)
Monosaccharide
BC-O-148* (Glucuronsäurederivat)
0,49 (0,12) 0,53 (0,07) 0,36 (0,07)
D-Mannose-6-phosphat 0,65 (0,09) 0,52 (0,09) 0,72 (0,03)
Disaccharide
Lactose* (Galβ1,4Glc) 0,82 (0,17) 0,83 (0,21) 0,76 (0,23)
BC-D-146* (Glc, Gluconsäure) 0,94 (0,21) 0,90 (0,23) 0,77 (0,18)
BC-O-145* (Aminozucker, Glc) 0,48 (0,12) 0,66 (0,18) 0,34 (0,06)
BC-D-185* (oxidiert) 0,56 (0,11) 0,62 (0,10) 0,46 (0,07)
N-Acetyllactosamin (Galβ1,4GlcNAc) 0,69 (0,10) 0,56 (0,07) 0,76 (0,02)
Trisaccharide
Lactosucrose* (Galβ1,4Glcα1,2-Fru) 1,03 (0,33) 0,88 (0,29) 0,78 (0,16)
Raffinose* 0,5 mg/ml (Galα1,6Glcα1,2Fru)
1,02 (0,20) 0,89 (0,15) 0,98 (0,03)
BC-O-71* (Glc, Fru) 0,59 (0,14) 0,69 (0,14) 0,37 (0,23)
BC-O-150* (Polyol, Glc, Sorbit, Mnit)
an- 0,55 (0,14) 0,69 (0,135) 0,50 (0,16)
BC-O-207* (Gal, Glc) 0,73 (0,26) 0,87 (0,11) 0,48 (0,09)
α-1,3-α-1,6-Mannotriose (Manα1,3Manα1,6ManαOMethyl)
0,80 (0,17) 0,64 (0,10) 0,83 (0,02)
Tetrasaccharide
Nystose* 0,5 mg/ml (Glcα1,2Fruα1,2Fruα1,2Fru)
0,98 (0,18) 0,96 (0,14) 0,99 (0,05)
Stachyose* (Galα1,6Galα1,6Glcα1,2Fru)
0,61 (0,13) 0,78 (0,19) 0,52 (0,13)
BC-O-50* (Glc, Fru) 0,75 (0,18) 0,83 (0,12) 0,59 (0,10)
BC-O-76* (Polyol; Glc, Sorbit, Mnit)
an- 0,61 (0,13) 0,72 (0,19) 0,47 (0,08)
BC-O-191* (Gal, Glc) 0,71 (0,17) 0,88 (0,22) 0,62 (0,13)
Chitotetraose (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]3)
0,73 (0,10) 0,61 (0,09) 0,81 (0,05)
Pentasaccharide
BC-O-192* (Gal, Glc) 0,83 (0,17) 0,85 (0,14) 0,66 (0,11)
3 Ergebnisse 55
BC-O-290* 0,74 (0,14) 0,84 (0,11) 0,69 (0,12)
Chitopentaose, 0,6 mg/ml (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]4)
0,75 (0,06) 0,86 (0,18) 0,91 (0,08)
Hexasaccharide
Disialyllacto-N-tetraose, 0,5 mg/ml (Neu5Acα2,3Galβ1,3(Neu5Acα2,6)-GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc)
0,77 (0,04) 0,69 (0,09) 0,77 (0,02)
Chitohexaose, 0,6 mg/ml (GlcNAc-[β1,4GlcNAc]5)
0,69 (0,05) 0,77 (0,10) 0,86 (0,04)
Heptasaccharide
BC-O-25* (Glc, Fru) 0,71 (0,18) 0,81 (0,19) 0,55 (0,10)
Oligosaccharidmischung
BC-O-282* 0,56 (0,12) 0,84 (0,12) 0,48 (0,14)
Polysaccharid
Fucoidan (v.a. sulfatierte Fucose) 0,25 mg/ml
0,39 (0,02) 0,47 (0,14) 0,44 (0,03)
Fucoidan, 0,5 mg/ml 0,31 (0,02) 0,25 (0,16) 0,29 (0,02)
Tabelle 5: Die Saccharide wurden direkt vor Testbeginn (während der Eisinkubation) dem heparinisierten
Vollblut zugegeben. Die Saccharidkonzentration betrug 2 mg/ml. . Die wegen mangelnder Saccharidlöslich-
keit vom Standard abweichenden Konzentrationen bzw. die nicht in höheren Konzentrationen verfügbaren
Saccharide sind in der Tabelle extra aufgeführt. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit 5 µl nonopso-
nierten E.coli und einer Inkubationszeit von fünf Minuten durchgeführt. Angegeben ist der Modulationskoef-
fizient der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spannweite (ω) der je Saccharid doppelt bestimmten Meßwer-
te. * Saccharide der Südzucker AG.
Daneben wurde ein einmaliges Saccharidscreening mit nonopsoniertem S.aureus im
Stimulationstest der Phagozytose durchgeführt (Tabelle 6). Dabei konnte eine Aktivierun
der Gesamtphagozytose mit einem KPh ≥ 1,4 durch BC-D-146, Lactosucrose und BC-O-
192, Chitopentaose, Nystose und Lactose gezeigt werden.
g
Am Beispiel eines Phagozytose-Tests mit S.aureus (Tabelle 7) wurde gezeigt, daß sich die
Stimulationseffekte von BC-D-146 bei verschiedenen Versuchen trotz gleicher Testbedin-
gungen und hoher Präzision der Tests erheblich unterschieden. Die Modulationskoeffizien-
ten der Gesamtphagozytose schwankten zwischen 1,40 und 1,71.
3 Ergebnisse 56
Tabelle 6: Einfluß verschiedener Saccharide auf die Phagozytose von nonopsonier-
tem Staphylococcus aureus durch Granulozyten im Stimulationstest
KPh (ω) KPh (ω)
Monosaccharide Tetrasaccharide
BC-O-148 1,03 (0,10) Nystose 1,43 (0,18)
BC-O-145 1,11 (0,15) Stachyose 1,26 (0,19)
Disaccharide BC-O-50 1,37 (0,16)
Lactose 1,43 (0,06) BC-O-76 1,34 (0,10)
BC-D-146 1,71 (0,10) BC-O-191 1,19 (0,10)
BC-D-185 0,87 (0,12) Pentasaccharide
Trisaccharide BC-O-192 1,50 (0,09)
Lactosucrose 1,58 (0,26) Chitopentaose 1,47 (0,27)
Raffinose 1,11 (0,15) Heptasaccharide
BC-O-71 1,21 (0,10) BC-O-25 1,11 (0,08)
BC-O-150 1,01 (0,13) Xylooligosaccharid-Gemisch
BC-O-207 1,18 (0,12) BC-O-282 1,26 (0,02)
Tabelle 6: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit den angegebenen Sacchariden (2 mg/ml)
bei 37 °C im Wasserbad vorinkubiert. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit 5 µl nonopsonierten
E.coli und einer Inkubationszeit von fünf Minuten durchgeführt. Angegeben ist der Modulationskoeffizient
der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spannweite (ω) der je Saccharid doppelt bestimmten Meßwerte.
Tabelle 7: Variabilität der Stimulationswirkung von BC-D-146 bei der Phagozytose
von Staphylococcus aureus durch Granulozyten
BC-D-146 Test 1 Test 2 Test 3 Test 4
KPh 1,40 1,45 1,58 1,71
(ω) (0,05) (0,02) (0,21) (0,10)
Tabelle 7: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit BC-D-146 (1,8 mg/ml) bei 37 °C im
Wasserbad vorinkubiert. Anschließend wurde ein Phagozytose-Test mit einer Inkubationszeit von fünf Minu-
ten durchgeführt. Angegeben ist der Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh) und die Spann-
weite (ω).
3 Ergebnisse 57
3.3 Einfluß von Lipopolysaccharid auf die Phagozytose und
den oxidativen Burst
3.3.1 LPS-Konzentrationen verschiedener Zucker
Um die bakterielle Kontamination der Saccharidlösungen zu untersuchen wurde der LPS-
Gehalt einiger ausgewählter Saccharide vor und nach einer Lagerung der Saccharidlösun-
gen bei 4 °C im Kühlschrank gemessen (Tabelle 8).
Nach einer längeren Lagerungsperiode zeigte sich eine drei- bis vierfach höhere LPS-Kon-
zentration in BC-D-146, Lactosucrose und Nystose als vor der Lagerung. Die geringe Zu-
nahme der LPS-Konzentration von gelagerter Raffinose im Vergleich zu den anderen Sac-
charidlösungen läßt sich durch die kürzere Lagerungszeit dieser Substanz erklären.
Tabelle 8: Veränderung der LPS-Konzentration verschiedener Saccharidlösungen
nach einer Lagerung von circa einem Monat
Saccharidlösung [100mg/ml] LPS-Konzentration der Saccharidlösung [ng/ml]
frisch gelöst nach Lagerung bei 4 °C
BC-D-146 2,8 12,5
Lactosucrose 32,2 119,3
Raffinose* 3,2 3,5
Nystose 3,1 14,9
Arabinogalactan 5,5 n.b.
Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid
n.n. n.b.
Lactose 0,11 n.b.
Methyl-α-D-mannosid 0,01 n.b.
Methyl-β-D-galactosid n.n. n.b.
Abkürzungen: n.n.: nicht nachweisbar; n.b.: nicht bestimmt; *Lagerung ca. 2 Wochen
3.3.2 Einfluß der Vorinkubation mit LPS auf die Phagozytose
Als Parameter für den stimulierenden bzw. inhibierenden Effekt von Lipopolysaccharid
auf die Phagozytose wurde der „Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose“ (KPh)
eingeführt. Er bezeichnet den Quotient aus der Gesamtphagozytose (= Phagozytoserate ×
3 Ergebnisse 58
mittlerer Fluoreszenzintensität) des Testansatzes mit LPS und der Gesamtphagozytose der
Kontrolle ohne LPS.
Bereits der Zusatz von Lipopolysaccharid (4,5 ng/ml Ansatz) zum heparinisierten Vollblut
ohne Vorinkubation erhöhte die Phagozytose von E.coli bei Granulozyten. Nach einer Vor-
inkubation von zehn Minuten konnte ein relevanter Anstieg der granulozytären Phagozyto-
se von opsonierten und nach zwanzig Minuten auch von nonopsonierten E.coli-Bakterien
nachgewiesen werden.
Die stärkste Stimulation der Gesamtphagozytose von opsonierten und nonopsonierten
E.coli-Bakterien bei Granulozyten wurde nach einer 45 minütigen Vorinkubation mit LPS
erreicht (Tabelle 9).
Tabelle 9: Einfluß der Vorinkubationszeit mit Lipopolysaccharid auf die Ge-
samtphagozytose (KPh) von E.coli durch Granulozyten
E.coli Vorinkubationszeit mit LPS [min]
o. LPS 0 5 10 20 30 45 60
opsoniert KPh 1,00 1,25 1,37 1,55 1,66 1,65 1,67 1,51
(ω) (0,06) (0,08) (0,11) (0,15) (0,11) (0,17) (0,16) (0,14)
KPh 1,00 1,15 1,19 1,22 1,43 1,55 1,61 1,50 non-opsoniert
(ω) (0,07) (0,11) (0,10) (0,15) (0,12) (0,19) (0,14) (0,13)
Tabelle 9: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst mit Lipopolysaccharid (4,5 ng/ml Ansatz) in den angege-
benen Zeitenräumen, bzw. die Kontrolle ohne LPS (o. LPS) 60 Minuten, bei 37 °C im Wasserbad vorinku-
biert und anschließend ein Phagozytose-Test mit Escherichia coli durchgeführt. Die Werte stammen aus ei-
nem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist der Modulationskoeffizient der
Gesamtphagozytose (KPh).
3.3.3 Einfluß der LPS-Konzentration auf die Phagozytose und den
oxidativen Burst
Die Phagozytose von Mikroorganismen, der Fc-Rezeptor abhängige und der E.coli stimu-
lierte oxidative Burst von Leukozyten stiegen in Abhängigkeit von der LPS-Konzentration
im vorinkubierten Vollblut (Tabelle 10).
Im Phagozytose-Test wurde eine sicher meßbare Stimulation (KPh ≥ 1,2) der granulozytä-
ren Aufnahme von nonopsonierten E.coli und C.albicans ab 10 ng LPS/ml Ansatz und bei
S.aureus ab 50 ng LPS/ml Ansatz bestimmt. Die Ergebnisse mit opsonierten E.coli-
3 Ergebnisse 59
(KPh = 1,34 bei 100 ng LPS/ml) und S.aureus-Bakterien (KPh = 1,38 bei 100 ng LPS/ml)
waren ähnlich.
Ebenso fand eine sicher meßbare Stimulation des Fc-Rezeptor abhängigen oxidativen
Burst (KFcB ≥ 1,2) erst ab LPS-Konzentrationen von 10 ng/ml statt.
Auch die E.coli-induzierte Produktion von Sauerstoffmetaboliten durch Granulozyten
wurde durch Lipopolysaccharid ab Konzentrationen von 10 ng LPS/ml stark stimuliert.
Allerdings nahmen gleichzeitig die Meßschwankungen im Test zu, wie aus den Spannwei-
ten in Tabelle 10 ersichtlich.
Tabelle 10: Einfluß der Konzentration von Lipopolysacchariden auf die Phagozytose,
den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst und den oxidativen Burst
von Granulozyten
LPS-Konzentration im Ansatz [ng/ml]
0 1 5 10 50 100
Phagozytose-Test
nonopsonierte E.coli KPh 1,00 1,07 1,20 1,26 1,27 1,36
(ω) (0,12) (0,09) (0,10) (0,13) (0,08) (0,19)
nonopsonierter S.aureus KPh 1,00 1,00 1,14 1,19 1,38 1,40
(ω) (0,06) (0,11) (0,05) (0,06) (0,06) (0,06)
nonopsonierte C.albicans KPh 1,00 1,05 1,05 1,21 1,20 1,25
(ω) (0,12) (0,07) (0,10) (0,20) (0,08) (0,21)
Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
KFcB 1,00 1,06 1,19 1,40 1,51 1,57
(ω) (0,31) (0,17) (0,19) (0,31) (0,25) (0,43)
Test für die quantitative Bestimmung des oxidativen Burst
E.coli KB 1,00 1,03 1,47 2,48 3,68 3,01
(ω) (0,87) (0,52) (1,02) (1,16) (1,80) (2,28)
Tabelle 10: Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit den angegebenen Konzentrationen von
Lipopolysaccharid bei 37 °C im Wasserbad vorinkubiert und anschließend die verschiedenen Tests durchge-
führt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist der Modula-
tionskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh), des Fc-Rezeptor abhängigen oxidativen Burst (KFcB) und des
oxidativen Burst (KB) und die zugehörige Spannweite (ω).
3 Ergebnisse 60
3.4 Stimulationstests
3.4.1 Vergleich von pyrogenfreien, LPS-versetzten und LPS-
kontaminierten Sacchariden
Der im Saccharidscreening ermittelte Stimulationseffekt auf die Phagozytose von S.aureus
wurde mit den drei Sacchariden BC-D-146, Lactosucrose und Nystose und der kaum sti-
mulierenden Raffinose auch bei der Phagozytose von E.coli und C.albicans, dem Fc-
Rezeptor vermittelten und dem E.coli-stimulierten oxidativen Burst genauer untersucht.
Um den potentiellen Stimulationseffekt durch eine LPS-Kontamination der Saccharidlö-
sungen zu untersuchen, wurde ein Vergleich mit pyrogenfrei gereinigten, pyrogenfrei ge-
reinigten und anschließend gezielt mit Lipopolysaccharid (28,6 µg LPS/ml Saccharidlö-
sung bzw. 0,5 µg LPS/ml Testansatz) versetzten und LPS-kontaminierten Sacchariden (1,8
mg/ml Testansatz) durchgeführt.
Der Vergleich in Bild 21 zeigt, daß die granulozytäre Phagozytose der drei Mikroorganis-
men mit den pyrogenfrei gereinigten Sacchariden BC-D-146, Raffinose, Lactosucrose und
Nystose nicht relevant stimuliert oder inhibiert werden konnte (0,90 < KPh < 1,10). Die
Zugabe von LPS zu den pyrogenfrei gereinigten Saccharidlösungen führte mit Ausnahme
von Raffinose in ähnlichem Umfang wie die kontaminierten Saccharide zu einer Steige-
rung der granulozytären Phagozytoserate von E.coli- und S.aureus-Bakterien.
Dagegen wurde die Aufnahme von C.albicans durch Granulozyten in geringerem Ausmaß
durch LPS-versetzte oder kontaminierte Saccharide stimuliert.
Die Phagozytosestimulation durch LPS-versetzte bzw. kontaminierte Saccharidlösungen
fiel bei opsonierten E.coli bzw. S.aureus-Bakterien etwas höher aus als bei nonopsonierten.
3 Ergebnisse 61
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0Mo
dulat
ions
koef
fizien
t der
Ges
amtp
hago
zyto
se1,8
2,0
ytos
e
A
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
er G
esam
tpha
gozy
tose
0
0
Bild
Hepar
ten (0,
serbad
opsoni
durchg
ge ( )
Auch
nuloz
(KFcB
Wie i
sucro
den E
BC-D-146 Raffinose Lactosucrose Nystose0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
er G
esam
tpha
goz
BC-D-146 Raffinose Lactosucrose Nystose
py
py
un
21: Vergleich einer Stimulation der granulo
S.aureus (B) bzw. C.albicans (C) mit pyr
kontaminierten Sacchariden
inisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit pyro
5 µg LPS/ml Ansatz) oder mit LPS-kontaminierten Sac
vorinkubiert. Anschließend wurde ein Phagozytose-Te
erten E.coli, S.aureus bzw. C.albicans durchgeführt. E
eführten Versuchen. Angegeben ist das Arithmetische
Spannweite ω.
der Fc-Rezeptor vermittelte und der mit E.co
yten wurde, mit Ausnahme eines geringen Sti
= 1,13; KF = 1,19), durch die pyrogenfreien S
n den Phagozytose-Tests zeigte sich bei Zuga
se und Nystose ein ähnlicher Stimulationseffe
.coli stimulierten oxidativen Burst wie bei de
B
BC-D-146 Raffinose Lactosucrose Nystose
C
1,01,
1,01,0rogenfrei
rogenfrei + LPS
1,01,gereinigt
zytären Phagozytose von E.coli (A),
ogenfreien, LPS-versetzten und LPS-
genfreien, pyrogenfreien und mit LPS versetz-
chariden (1,8 mg/ml Ansatz) bei 37 °C im Was-
st mit einer fünfminütigen Inkubation von
rgebnisse aus einem repräsentativen von zwei
Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehöri-
li stimulierte oxidative Burst von Gra-
mulationseffekts von Lactosucrose
accharide nicht signifikant moduliert.
be 0,5 µg/ml LPS zu BC-D-146, Lacto-
kt auf den Fc-Rezeptor vermittelten und
n mit LPS kontaminierten Sacchariden.
3 Ergebnisse 62
Die im Vergleich mit den anderen Sacchariden geringer mit LPS kontaminierte Raffinose-
lösung hatte auch beim oxidativen Burst der Granulozyten keine stimulierende Wirkung
(Bild 22).
0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,02,2
BC-D-146 Raffinose Lactosucrose Nystose
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
es F
cBur
st
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
BC-D-146 Raffinose Lactosucrose Nystose
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
es o
xidat
iven
Burs
t
A B
1,01,0 1,0
Bild 22: Vergleich einer Stimulation des Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
(A) bzw. des E.coli stimulierten oxidativen Burst (B) mit pyrogenfreien, LPS-
versetzten und LPS-kontaminierten Sacchariden
Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst 60 Minuten mit pyrogenfreien, mit LPS versetzten (0,5 µg LPS/ml
Ansatz) oder mit LPS-kontaminierten Sacchariden (1,8 mg Saccharid/ml Ansatz) bei 37 °C im Wasserbad
vorinkubiert. Anschließend wurde ein Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst bzw. zur quan-
titativen Bestimmung des oxidativen Burst mit dem Stimulus E.coli mit einer Inkubation von zehn Minuten
durchgeführt. Angegeben ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spann-
weite ω aus einem durchgeführten Versuch.
3 Ergebnisse 63
3.4.2 Stimulation mit dem Echinacea-Extrakt Arabinogalaktan
Die Phagozytose insbesondere von nonopsonierten E.coli-Bakterien bei Granulozyten ließ
sich durch eine zehnminütige Vorinkubation des heparinisierten Vollblutes mit dem Poly-
saccharid Arabinogalaktan stimulieren (Bild 23).
Eine Steigerung der Aufnahme von nonopsonierten E.coli (KPh = 1,26) durch Granulozy-
ten konnte ab 2 mg/ml Arabinogalaktan gemessen werden. Mit 8 mg/ml Arabinogalaktan
wurde die maximale Aktivierung der granulozytären Gesamtphagozytose von opsonierten
(KPh = 1,21, ω = 0,08) und nonopsonierten E.coli (KPh = 1,55, ω = 0,18) erreicht. Höhere
Arabinogalaktankonzentrationen (50 mg/ml) führten dagegen wieder zu einer Inhibition
der Gesamtphagozytose von Bakterien bis auf den Kontrollwert.
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0 10 20 30 40 50Konzentration [mg/ml]
Phag
ozyt
oser
ate
E.coliopsoniertE.colinonopsoniert
Bild 23: Einfluß der Arabinogalaktankonzentration auf die Phagozytose von E.coli
durch Granulozyten
Heparinisiertes Vollblut wurde zunächst zehn Minuten mit den angebenen Konzentrationen von Arabinoga-
laktan bei 37 °C im Wasserbad vorinkubiert und anschließend ein Phagozytose-Test mit einem Leukozyten :
Bakterien-Verhältnis von 1 : 6 und einer Inkubationszeit von zehn Minuten durchgeführt. Ergebnisse aus
einem repräsentativen von drei durchgeführten Versuchen. Angegeben ist das Arithmetische Mittel aus zwei
Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.
3 Ergebnisse 64
3.5 Inhibitionstests
3.5.1 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit pyrogenfreien Sac-
chariden
Untersucht wurde die Inhibition der Phagozytose von Mikroorganismen mit LPS-freien,
auf pflanzlicher Basis synthetisierten Sacchariden. Diese ließ sich bei nonopsonierten
E.coli-Bakterien ab circa 20 mM proportional zu den ansteigenden Konzentrationen an py-
rogenfreier Nystose, Lactosucrose, BC-D-146 und Raffinose im Vollblut hemmen. Im Ge-
gensatz zu der nur geringen Phagozytosehemmung durch Raffinose führten höhere Kon-
zentrationen (ab ca. 25 mM) an BC-D-146, Lactosucrose und Nystose zu einem annähernd
linearen Abfall der Phagozytoserate. Außerdem verminderte sich im gesamten Meßbereich
die durchschnittlich von einem einzelnen Granulozyten aufgenomme Anzahl an E.coli-
Bakterien (mittlere Fluoreszenzintensität) proportional zu den steigenden Saccharidkon-
zentrationen.
Ein Vergleich der Effekte von 40 mM Sacchariden unter allen Phagozytosepartikeln zeigte,
daß BC-D-146 insbesondere bei nonopsonierten E.coli (KPh = 0,48) die stärkste, und Raf-
finose sowie Nystose die geringste Inhibitionswirkung auf die Phagozytose der Mikroor-
ganismen hatte. Im Vergleich aller Phagozytosepartikel wurde vor allem die Aufnahme
von nonopsonierten E.coli-Bakterien gehemmt (Bild 24 A).
Außerdem wurde mit den oben genannten, pyrogenfreien Sacchariden die Inhibition des
E.coli-induzierten oxidativen Bursts gemessen. Analog ergaben diese Untersuchungen eine
Hemmung der Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten mit 40 mM BC-D-146 (KB =
0,56), Lactosucrose (KB = 0,63), Raffinose (KB = 0,79) und Nystose (KB = 0,81). Dagegen
wurde der PMA-stimulierte oxidative Burst von Granulozyten durch BC-D-146 (KB =
2,94), Nystose (KB = 2,31), Lactosucrose (KB = 1,89) und Raffinose (KB = 1,86) gesteigert
(Bild 24 B).
3 Ergebnisse 65
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
ops. E.coli nonops. E.coli
ops.S.aureus
nonops.S.aureus
C.albicans
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
er G
esam
tpha
gozy
tose
Nystose
Lactosucrose
Raffinose
BC-D-146
0,0
0,5
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
es o
xidat
iven
Burs
t
Bild 24: Inhi
E.co
lozy
Die Saccharide
Vollblut zugege
mit PMA (Phorb
Burst durchgefü
ist das Arithmet
beim PMA-stim
B
b
l
t
(4
b
h
is
u
A
1,01,0Nystose
Lactosucrose
Raffinose
1,01,0
E.coli PMA
BC-D-146
ition der Phagozytose von E.coli, S.aureus und C.albicans (A) sowie der
i- oder PMA-stimulierten Sauerstoffradikalproduktion (B) von Granu-
en mit pyrogenfreien, auf pflanzlicher Basis synthetisierten Sacchariden
0 mM) wurden direkt vor Testbeginn (während der Eisinkubation) dem heparinisierten
en. Anschließend wurde (A) ein Phagozytose-Test bzw. (B) ein mit Escherichia coli bzw.
ol-12-myristat-13-acetat) stimulierter Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen
rt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von zwei durchgeführten Versuchen. Angegeben
che Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω bzw. Einzelwerte
lierten oxidativen Burst. Abkürzungen: ops: opsoniert, nonops: nonopsoniert.
3 Ergebnisse 66
3.5.2 Inhibition mit dem Polysaccharid Fucoidan
Da das Polysaccharid Fucoidan im Saccharidscreening als stärkster Inhibitor der Phagozy-
tose von nonopsonierten E.coli-Bakterien auffiel, sollten die Saccharideffekte im folgen-
den verifiziert und näher untersucht werden. Dabei wurde bereits bei niedrigen Fucoidan-
konzentrationen ein Inhibitionseffekt nachgewiesen, der sich konzentrationsabhängig
steigern ließ (Bild 25A). In einem Vergleich zwischen den verschiedenen Mikroorganis-
men konnte gezeigt werden, daß 0,25 mg/ml Fucoidan die Phagozytose von opsonierten
(KPh = 0,26) und nonopsonierten E.coli (KPh = 0,20), sowie von nonopsoniertem S.aureus
(KPh = 0,22) in größerem Ausmaß inhibierte als die des Sprosspilzes C.albicans (KPh =
0,57) (Bild 25B).
3 Ergebnisse 67
0%
10%
20%
30%
40%
50%
0
Phag
ozyt
oser
ate
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
er G
esam
tpha
gozy
tose
Bild 25: Inhibit
von de
Das Polysaccharid
Eisinkubation) dem
nopsonierten E.col
aus zwei Einzelwe
Spannweite ω aus
A
200 400 600 800Konzentration [µg/ml]
Granulozyten
Monozyten
Bops. E.coli nonops. E.coli
nonops.S.aureus
C.albicans
0,25 mg/mlFucoidan
0,50 mg/mlFucoidan
ion der granulozytären Phagozytose mit Fucoidan (A) in Abhängigkeit
r Konzentration bei E.coli und (B) bei E.coli, S.aureus und C.albicans
Fucoidan wurde in den angegebenen Konzentrationen direkt vor Testbeginn (während der
heparinisierten Vollblut zugegeben und anschließend ein Phagozytose-Test mit (A) no-
i, (B) den angegebenen Keimen durchgeführt. Angegeben ist (A) das Arithmetische Mittel
rten, (B) der Modulationskoeffizient der Gesamtphagozytose (KPh), und die zugehörige ( )
einem Versuch. Abkürzungen: ops: opsoniert, nonops: nonopsoniert.
3 Ergebnisse 68
3.5.3 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit als immunmodulie-
rend bekannten Sacchariden
In der Literatur wurde für 0,15 M Methyl-α-D-mannosid, D-Mannose, und N-acetyl-D-
glucosamin eine Hemmung der Interaktionen der Lektinbindungsstelle des CR3 mit dem
Fcγ-Rezeptor [45, 17] beschrieben. Außerdem sollen diese Saccharide die mit Immunkom-
plexen stimulierte Sauerstoffradikalproduktion bei Granulozyten, die aus dem Vollblut iso-
lierten wurden, inhibieren [54].
Daher sollte der Inhibitionseffekt des obengenannten Methyl-α-D-mannosids sowie von
Methyl-β-D-galactosid, Lactose, Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid und N-
Acetyllactosamin auf die granulozytäre Phagozytose von Mikroorganismen, den Fc-
Rezeptor vermittelten sowie den mit E.coli stimulierten oxidativen Burst mit unseren funk-
tionellen Tests überprüft werden. Hierzu wurden die Saccharide direkt vor Testbeginn
(während der Eisinkubation) dem heparinisierten Vollblut zugegeben.
Bei allen Sacchariden konnte eine konzentrationsabhängige Hemmung der Phagozytose
von opsonierten und nonopsonierten E.coli, S.aureus und von C.albicans bei Granulozyten
nachgewiesen werden. Bild 26A zeigt am Beispiel von Staphylococcus aureus die linear
zur N-Acetyllactosaminkonzentration sinkende Phagozytoserate.
Im Folgenden wurden die Inhibitionseffekte der obengenannten Saccharide bei einer Kon-
zentration von 100 mM unter den verschiedenen Mikroorganismen verglichen (Bild 26B).
Dabei konnte die Phagozytose von nonopsonierten E.coli durch alle Saccharide stärker ge-
hemmt werden als die von opsonierten E.coli-Bakterien. Die stärkste Hemmung wurde bei
der Phagozytose von nonopsonierten E.coli mit N-Acetyllactosamin (KPh = 0,44) und Me-
thyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (KPh = 0,48), bei nonopsoniertem S.aureus mit
Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (KPh = 0,54) und bei C.albicans mit Methyl-α-
D-mannosid (KPh = 0,43) erreicht. Alle anderen Saccharide zeigten im Vergleich innerhalb
eines Phagozytosepartikels kaum differierende Inhibitionseffekte.
3 Ergebnisse 69
0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%
100%
0
Phag
ozyt
oser
ate
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
op
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
er G
esam
tpha
gozy
tose
Bild 26: Inhibit
Acetyll
Saccha
(A) Das Saccharid N
nannten 100 mM Sa
Vollblut zugegeben
angegebenen Mikro
Versuchen. Angege
te ω. Abkürzungen:
Eine konzentrati
ven Burst von M
A
50 100 150 200Konzentration [mMol/l]
S.aureusopsoniertS.aureusnonopsoniert
Methyl-α-D -mannosid
Bs. E.coli nonops. E.coli
ops.S.aureus
nonops.S.aureus
C.albicans
Methyl-β-D -galactosid
β-Lactose
Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosidN-Acetyllactosamine
ion der granulozytären Phagozytose (A) in Abhängigkeit von der N-
actosamin-Konzentration bei S.aureus und (B) mit verschiedenen
riden bei E.coli, S.aureus und C.albicans
-Acetyllactosamin wurde in den angegebenen Konzentrationen bzw. (B) die obenge-
ccharide wurden direkt vor Testbeginn (während der Eisinkubation) dem heparinisierten
und anschließend ein Phagozytose-Test mit (A) Staphylococcus aureus bzw. (B) den
organismen durchgeführt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten
ben ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannwei-
ops: opsoniert, nonops: nonopsoniert.
onsabhängige Hemmung des durch Immunkomplexe ausgelösten oxidati-
onozyten und Granulozyten konnte bei allen Sacchariden nachgewiesen
3 Ergebnisse 70
werden (Bild 27). Der Fc-Rezeptor vermittelte oxidative Burst von Granulozyten wurde in
absteigender Reihenfolge durch folgende für 100 mM interpolierten Saccharide gehemmt:
Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (KFcB = 0,39), Methyl-β-D-galactosid (KFcB =
0,44), Methyl-α-D-mannosid (KFcB = 0,47), Lactose (KFcB = 0,52) und N-Acetyl-
lactosamin (KFcB = 0,69).
Wie am Beispiel von Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid (Bild 28A) demonstriert,
konnte auch der mit E.coli stimulierte oxidative Burst von Granulozyten durch ansteigende
Konzentrationen der obengenannten Saccharide gehemmt werden. In einem Vergleich der
Inhibitionseffekte von 100 mM Sacchariden zeigte N-Acetyllactosamin (KB = 0,24) die
stärkste Hemmung der Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten, wobei die anderen
Saccharide ähnliche Effekte (KB = 0,29-0,33) aufwiesen (Bild 28B).
Im Gegensatz dazu wurde der oxidative Burst mit dem Stimulus PMA vor allem bei Gra-
nulozyten durch die Saccharide von minimal KB = 2,84 mit Methyl-α-D-mannosid bis ma-
ximal KB = 4,34 mit Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid extrem gesteigert.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
0
FcBu
rstra
te
4550
t
Bild 2
Das Sa
inkubat
telten o
chen. A
Fluores
A
50 100 150 200 250Konzentration [mMol/l]
05
10152025303540
0
Mittl
ere F
luor
esze
nzin
tens
itä
7: Einfluß der Lactose-Konzentration auf
durch Immunkomplexe ausgelöste Saue
Leukozyten
ccharid Lactose wurde in den angegebenen Konzentra
ion) dem heparinisierten Vollblut zugegeben und ansc
xidativen Burst durchgeführt. Ergebnisse aus einem re
ngegeben ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einze
zenzintensität und die zugehörige ( ) Spannweite ω.
B
50 100 150 200 250Konzentration [mMol/l]
die Phagozytoserate (A) und die
rstoffradikalproduktion (B) von
tionen direkt vor Testbeginn (während der Eis-
hließend ein Test für den Fc-Rezeptor vermit-
präsentativen von drei durchgeführten Versu-
lwerten der Phagozytoserate bzw. der mittleren
3 Ergebnisse 71
0,00,51,01,52,02,53,03,54,04,55,0
0 50 100 150 200Konzentration [mMol/l]
Mittl
ere F
luor
esze
nzin
tens
ität
Monozyten
Granulozyten
0,0
0,5
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
Modu
latio
nsko
effiz
ient d
es o
xidat
iven
Burs
t
01 0
Bild 28: Inhib
Abhä
gluco
(A) Das Sacchar
Testbeginn (wäh
Test zur quantita
12-myristat-13-a
chen. Angegeben
B
A
Methyl-α-D -mannosid
Methyl-β-D -galactosid
β-Lactose
Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-
1,,E.coli PMA
glucosid
N-Acetyllactosamine
ition der Produktion von Sauerstoffmetaboliten bei Granulozyten (A) in
ngigkeit von der Konzentration an Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-
sid und (B) mit verschiedenen Sacchariden
id wurden in den angegebenen Konzentrationen bzw. (B) die 100 mM Saccharide direkt vor
rend der Eisinkubation) dem heparinisierten Vollblut zugegeben. Anschließend wurde ein
tiven Bestimmung des oxidativen Burst mit (A) E.coli bzw. (B) ) E.coli und PMA (Phorbol-
cetat) durchgeführt. Ergebnisse aus einem repräsentativen von drei durchgeführten Versu-
ist das Arithmetische Mittel aus zwei Einzelwerten und die zugehörige ( ) Spannweite ω.
4 Diskussion Bei der Immunabwehr gegen mikrobielle Infektionen spielt die schnelle Erkennung, Bin-
dung und Eliminierung von Pathogenen eine wichtige Rolle. Zu Beginn einer Infektion
stellen insbesondere die spezifischen Interaktionen zwischen Lektinen auf Phagozyten-
oberflächen und komplementären Kohlenhydraten auf Bakterien und umgekehrt einen kri-
tischen Schritt bei der Erkennung und Bindung der Bakterien dar. Die Aufnahme von Mi-
kroorganismen über Kohlenhydrat- und Lektin-abhängige Zellinteraktionen wurde von
Ofek und Sharon als Lektinophagozytose bezeichnet. Weiterhin beschrieben sie die Mög-
lichkeit der Mikrobenbindung über eine Brücke aus löslichen Lektinen oder Zuckern an die
Phagozyten [43, 55]. Demzufolge könnten Functional Food Saccharide zu einer verstärkten
Bakterienbindung an Phagozytenoberflächen beitragen (Bild 29 B). Andererseits würde die
kompetitive Hemmung der Bakterienadhäsion durch Functional Food Saccharide zu einer
verminderten Pathogenaufnahme führen (Bild 29 C).
Auf der Grundlage dieses Modells wäre durch Functional Food Saccharide eine gezielte
Stimulation bzw. Hemmung der Kohlenhydrat- und Lektin-vermittelten Interaktionen zwi-
schen Phagozyten und Mikroorganismen und damit der Mikrobenaufnahme und -abtötung
möglich.
B
(
u
o
A
Lektin
Bakterium
Oberflächen- glykan
Phagozyt
ild 29: Mechanismen der Bin
A) Bindung von bakteriellen Lektine
ms über eine aus einem Functional F
n durch Functional Food Saccharide
B
Functional Food Saccharid
dung von Mikroorganismen
n an Oberflächenglykane auf Phagoz
ood Saccharid bestehende Brücke, (C
[56]
C
Functional Food Saccharide
an Wirtszellen
yten, (B) Bindung eines Bakteri-
) Inhibition der Bakterienadhäsi-
4 Diskussion 73
Eine Beeinflussung der Phagozytose und des oxidativen Burst durch Saccharide kann zum
einen über eine Verstärkung bzw. Hemmung der Mikrobenbindung an den Mannose-, Ga-
lactose-Rezeptor oder die Lektinbindungsstelle des Komplementrezeptors Typ 3 (CR3) auf
Phagozyten erreicht werden [35].
Des weiteren ist eine Hemmung von lektinvermittelten Rezeptorinteraktionen bei der Si-
gnaltransduktion durch Functional Food Saccharide denkbar, wie dies von Petty et al. po-
stuliert wurde. Sie stellten die Hypothese auf, daß die Lektinbindungsstelle des CR3 mit
vielen Komponenten, unter anderem GPI-verknüpften Rezeptoren (Bild 30), β-Glucan,
Zymosan und E.coli interagiert. Saccharide wie N-acetyl-D-glucosamin, α-Methyl-D-
mannosid und β-Glucan, die an die Lektinbindungsstelle des CR 3 binden, seien demnach
in der Lage, die Verbindung von GPI-verankerten Proteinen mit Integrinen zu blockieren
und in Folge die Leukozytenaktivierung zu beeinflussen [45].
C3bi-Bindungsstelle
Lektin-bindungsstelle
Fc-Bindungsstelle
C3bi-Bindungsstelle
Lektin-bindungsstelle
Fc-Bindungsstelle
Bild 30: Modell einer CR3
Abkürzungen: CR3: Komplemen
Durch die Interaktionen vo
der Komplementrezeptor in
geprimte CR3 kann anschli
zum Beispiel iC3b-behüllte
primten Zustand in der Lag
opsonierten Bakterien einz
CR 3
CHOCHO
-FcγR-Interaktion [5
trezeptor Typ 3; GPI: Gly
n Kohlenhydraten mit
einen rezeptiven Zus
eßend durch ein zweit
Partikel, aktiviert we
e, die Phagozytose un
uleiten, die ohne ein P
FcγR
ZytoskelettZytoskelett
4]
cosylphosphatidylinositol; CHO: Kohlenhydrat
der Lektinbindungsstelle des CR3 kann
tand versetzt werden („Priming“). Dieser
es, auslösendes Signal („Trigger“), wie
rden. Der Komplementrezeptor ist im ge-
d intrazelluläre Abtötung von iC3b-
riming nicht möglich gewesen wäre.
4 Diskussion 74
Vorteil dieses selektiven Primings des CR3 mit Kohlenhydraten ist, daß keine unspezifi-
sche Leukozytenaktivierung durch die Freisetzung von Zytokinen und somit keine inflam-
matorische Reaktion stattfindet [49]. Dagegen führt das Priming von polymorphkernigen
Leukozyten mit LPS, TNF-α oder PMA zur Erhöhung der Chemotaxis, der Exprimierung
bestimmter Leukozytenrezeptoren, der Substratadhäsion, der Phagozytose, des oxidativen
Burst und der Degranulation [66].
Im Gegensatz zu den meisten mit Zelllinien oder isolierten Granulozyten durchgeführten
Studien untersuchten wir den Effekt von Sacchariden auf Phagozytenfunktionen mit funk-
tionellen Testverfahren in humanem Vollblut, um eine artifizielle Aktivierung oder Hem-
mung der Leukozyten zu vermeiden. Die Testverfahren erfassen die komplexen,
multifunktionellen Rezeptor-Ligand-Interaktionen bei der Bindung von Mikroorganisme
an humane Phagozyten und reflektieren so am ehesten die in vivo-Situation der
angeborenen Imm
n
unabwehr.
Die Fähigkeit von neutrophilen Granulozyten zur Extravasation aus dem Blut und zur Mi-
gration ins Darmlumen und die subepitheliale Mukosa des Magen-Darm-Trakts [24, 21]
machen die Phagozyten im humanen Vollblut zu einem geeigneten Modell, um die Effekte
von Functional Food Sacchariden auf das gastrointestinale Immunsystem des Menschen zu
erforschen. Zudem wurde mit den aus humanen Monozyten kultivierten Makrophagen ein
weiteres physiologisches Zellmodell für die Mucosa-assoziierten Phagozyten geschaffen.
Untersucht werden sollte, ob sich chemisch bzw. enzymatisch synthetisierte Saccharide
pflanzlichen Ursprungs als Functional Food eignen und als Bestandteile einer normalen
Ernährung zu einer Modulation des angeborenen Immunsystems im Gastrointestinaltrakt
beitragen können. Diese Saccharide werden im Dünndarm nicht oder nur partiell durch
Verdauungsenzyme hydrolisiert, wie dies von der Südzucker AG mit in-vitro-Methoden
für die pH-Stabilität (Magen) und die Spaltbarkeit durch Pankreatin, Saccharase und Mal-
tase (dünndarmständige Enzymkomplexe) geprüft wurde. Die Substanzen erreichen des-
halb den Dickdarm, wo sie durch Dickdarmbakterien fermentiert werden.
Ergänzend wurden Saccharide eingesetzt, welche nach Literatur in der Lage sein sollten,
einzelne Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zu stimulieren bzw. zu hemmen.
4 Diskussion 75
4.1 Testbedingungen
4.1.1 Phagozytose-Test
Polymorphkernige neutrophile Granulozyten und aus Monozyten herangereifte Makropha-
gen, die in großer Zahl im Gastrointestinaltrakt zu finden sind, spielen in allen Phasen der
Immunabwehr eine wichtige Rolle. Sie können nicht nur mit Antikörpern oder Komple-
ment opsonierte Mikroorganismen phagozytieren, sondern erkennen viele Mikrobenbe-
standteile direkt über Lektin-Kohlenhydrat Interaktionen [20]. Daher spielen Mannose-,
Fucose-, N-Acetyl-glucosamin-, Galactose- und β-Glucan-spezifische Lektine eine Schlüs-
selrolle bei der Aufnahme von Mikroorganismen [35]. Mit dem Phagozytose-Test sollte
der stimulierende bzw. hemmende Effekt von Functional Food Sacchariden auf die Lektin-
Kohlenhydrat-Interaktionen zwischen Phagozyten und Mikroorganismen bei der Ingestion
verschiedener Pathogene untersucht werden.
Zum Nachweis einer potentiellen Phagozytosestimulation durch Saccharide wurden diese
mit dem Vollblut vorinkubiert. Somit sollte eine „Phagozytoseaktivierung“ bzw. ein „Pri-
ming“ durch die Bindung der Saccharide an entsprechende Lektine auf den Phagozyten
ermöglicht werden. Eine artifizielle Veränderung der Phagozytoserate oder der mittleren
Fluoreszenzintensität von Leukozyten durch die Vorinkubation über sechzig Minuten
konnte in Kontrollversuchen ausgeschlossen werden. Erst nach einer zweistündigen Vorin-
kubation konnte ein Abfall der Phagozytoserate nachgewiesen werden, der vermutlich auf
eine Adhärenz der Phagozyten an die Probengefäße zurückzuführen ist.
Aufgrund der unterschiedlichen Zuckerspezifität der an der Mikrobenbindung beteiligten
Zelloberflächenlektine, wurde der Phagozytose-Test mit drei verschiedenen Mikroorgan-
gismen (E.coli, S.aureus und C.albicans) durchgeführt (siehe Tabelle 1, Kapitel 1.1). An
der Aufnahme von Escherichia coli ist beispielsweise die Lipid A-Region von LPS betei-
ligt, die bei gramnegativen Enterobakterien in großem Umfang konserviert ist und bei
grampositiven Bakterien wie Staphylococcus aureus fehlt. Sie besteht aus einem β-1‘,6-
verbundenen D-Glucosamin Disaccharid, das in den Positionen 1 und 4‘ phosphoryliert ist
(Bild 31) und an den Phagozytenrezeptor CD14 bindet [64].
4 Diskussion 76
O
O
O
O
NH P
O
O-
O-
HO
O
O
O
O
NH
P
O
-O
-O
OHO O
HO
OO
OOO
O
Bild 31: Chemische Struktur der Lipid A-Region von Lipopolysaccharid
Dagegen besteht die Zellwand des Sproßpilzes Candida albicans hauptsächlich aus Man-
nan (einem α-gebundenen Mannosepolymer), Glucan (einer β-verknüpften, verzweigten
Polysaccharidkette aus Glucose) und Chitin (einem vorwiegend aus N-Acetyl-D-
glucosamin bestehenden, zelluloseähnlichen Polymer). Die Bindung der Mannosereste in
der Zellwand von C.albicans an den Mannose-Rezeptor auf Makrophagen ermöglicht die
Phagozytose dieser Hefezellen [38]. Demzufolge erlaubt der Einsatz verschiedener Phago-
zytosepartikel Rückschlüsse auf die Spezifität der Saccharide bei der Stimulation bzw. In-
hibition der Phagozytose von Mikroorganismen.
Um die Rezeptorspezifität der Saccharide zu überprüfen wurde der Test mit opsonierten
und nonopsonierten Bakterien aufgebaut, da bekannt ist, daß Lektin-Kohlenhydrat Interak-
tionen vor allem bei niedrigen Serumopsoninkonzentrationen wichtig sind. Dabei mußte
berücksichtigt werden, daß es im Verlauf der Inkubationszeit zu einer sekundären Opsonie-
rung der initial nonopsonierten Mikroorganismen durch die Opsonine im Serum kommt.
Deshalb wurden für die Tests kurze Inkubationszeiten von fünf bis zehn Minuten ange-
setzt, bei denen die nonopsonierten Mikroorganismen eine, im Vergleich zu in-vitro prä-
opsonierten Partikeln, deutlich geringere Phagozytoserate aufwiesen.
Die Konzentration und Inkubationszeit der Mikroorganismen wurden so standardisiert, daß
die Phagozytose der Leukozyten bei einem Überschuß an freien Partikeln einen nahezu
linearen Anstieg zeigte. Auf diese Weise wurden auch kleinere Stimulations- bzw. Inhibi-
tionseffekte der Saccharide erkannt, die in der Sättigungsphase aufgrund des Verbrauchs
der freien Phagozytosepartikeln nicht mehr nachgewiesen werden konnten.
4.1.2 Test für den Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen Burst
In der Literatur wurde eine Hemmung der durch Immunkomplexe ausgelösten Sauerstoff-
radikalproduktion von neutrophilen Granulozyten mit Sacchariden beschrieben [71].
4 Diskussion 77
Der Inhibitionseffekt der Saccharide setzt, nach der Bindung der Immunkomplexe an die
Fcγ-Rezeptoren der Phagozyten, auf der Ebene der Signaltransduktion ein. Durch die kom-
petitive Bindung bestimmter Kohlenhydrate an die Lektinbindungsstelle des Komplement-
rezeptors Typ 3 kommt es zu einer Hemmung der Rezeptorinteraktion des GPI-verankerten
Fcγ-Rezeptors mit der Lektinbindungsstelle des CR3 (Bild 30 Kapitel 4; Tabelle 2 Kapitel
1.3) und somit zur Unterbrechung der Signalleitung [45]. Auf diese Weise konnte eine
Hemmung der Sauerstoffradikalproduktion von neutrophilen Granulozyten mit Functional
Food Sacchariden auftreten. Eine Erhöhung des oxidativen Burst wäre über eine Kostimu-
lation der Interaktion des Fcγ-Rezeptors mit dem CR3 durch Saccharide vorstellbar.
Die Konzentration der Immunkomplexe und die Inkubationszeit wurden auch beim Fc-
Rezeptor abhängigen oxidativen Burst so gewählt, daß die FcBurstrate und die mittlere
Fluoreszenzintensität der Leukozyten im linearen Anstieg der Sättigungskurve lagen. Dies
ermöglichte auch die Erkennung kleinerer Stimulations- bzw. Inhibitonseffekte der Sac-
charide, die in der Phase der maximalen Sauerstoffradikalproduktion kaum detektierbar
waren.
4.1.3 Test zur quantitativen Bestimmung des oxidativen Burst
In diesem Test konnte die Produktion von reaktiven Sauerstoffmetaboliten gemessen wer-
den, die durch eine Bindung von nonopsonierten E.coli-Bakterien an die entsprechenden
Rezeptoren auf Granulozyten induziert wurde. Bei der Bindung von E.coli an die Granulo-
zyten spielen die gleichen lektinähnlichen Rezeptoren wie bei der Phagozytose des Bakte-
riums eine Rolle. Die kompetitive Inhibition bzw. Stimulation der Lektin-Kohlenhydrat-
Interaktionen zwischen dem Bakterium und den Phagozyten mit Functional Food Saccha-
riden hat somit eine Hemmung bzw. Steigerung der Sauerstoffradikalproduktion von Neu-
trophilen zur Folge.
Um die Rezeptorspezifität der Saccharide bei der Modulation der Lektin-Kohlenhydrat-
Interaktionen zu überprüfen, wurden neben dem partikulären Stimulus E.coli zwei weitere
Stimuli mit anderen Wirkungsmechanismen eingesetzt. Zum einen das chemotaktische
Tripeptid N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), das strukturell bakteriellen Peptiden ähnelt und
an spezifische fMLP-Rezeptoren auf der Phagozytenoberfläche bindet. Dieses Tripeptid
stimulierte den oxidativen Burst von Granulozyten allerdings so gering, daß es zur Kon-
trolle der Spezifität von Saccharideffekten ungeeignet war. Dagegen ist PMA eine chemi-
4 Diskussion 78
sche Substanz, die unter Umgehung einer Rezeptorbindung spezifische Enzyme der
Signaltransduktionskette (z.B. Proteinkinase C) aktiviert [7].
Wie in den vorangehenden Test wurde die Konzentration und Inkubationszeit des Stimulus
E.coli so standardisiert, daß eine submaximale Sauerstoffradikalproduktion der Granulozy-
ten erreicht wurde, und somit auch ein geringerer Modulationseffekt des oxidativen Burst
durch die Saccharide gemessen werden konnte.
4.1.4 Phagozytose-Test mit Makrophagen
Neben dem Komplementrezeptor Typ 3 und CD14, die auch auf Neutrophilen und Mono-
zyten vorkommen, exprimieren Makrophagen weitere wichtige Lektine, wie den Mannose-
Rezeptor und verschiedene Scavenger-Rezeptoren [1, 35], für die Erkennung und Bindung
von Mikrobenbestandteilen. Da diese Zellen zusammen mit den polymorphkernigen neu-
trophilen Leukozyten eine Schlüsselrolle bei der angeborenen Immunreaktion im sube-
pithelialen Bindegewebe des Gastrointestinaltraktes spielen, wurde der Phagozytose-Test
auch für den Einsatz von Makrophagen, die aus humanen Monozyten kulitiviert wurden,
adaptiert. Die Saccharideffekte bei der Phagozytose von E.coli, S.aureus und C.albicans
bei Makrophagen werden derzeit untersucht.
4.2 Auswirkung der LPS-Kontamination von Saccharidlö-
sungen Im Screening mit 27 Sacchariden sollten deren stimulierende bzw. inhibierende Effekte auf
die Phagozytose von E.coli und S.aureus erforscht werden. Wegen der trotz hoher Testprä-
zision (Tabelle 3 Kapitel 2.4.4) schlechten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei S.aureus
mußte ein artifizieller Effekt angenommen werden. Bei der Ursachenabklärung kamen un-
ter anderem Differenzen im Ansprechen der Leukozyten von verschiedenen Blutspendern
in Frage. Diese könnten beispielsweise auf der individuellen Ausbildung des immunologi-
schen Gedächtnisses durch frühere Kontakte mit Pathogenen oder einer latent gesteigerten
Immunabwehr ohne klinisch manifeste Infektzeichen beruhen. Durch den Einsatz des
Vollblutes von ausschließlich gesunden Spendern sollten diese Störgrößen minimiert wer-
den. Außerdem wurden bei der Bestimmung der Testpräzision die Schwankungen zwi-
schen den verschiedenen Blutspendern mitberücksichtigt.
Nach der Abklärung der möglichen Störgrößen des Tests konnte als Ursache eine Verun-
reinigung der eingesetzten Saccharidlösungen mit bakteriellem Lipopolysaccharid nach-
gewiesen werden. Lipopolysaccharide sind für ihre Stimulation von Funktionen der ange-
4 Diskussion 79
borenen Immunabwehr bekannt. Sie binden an CD14, ein GPI-verankertes Membranprote-
in, das auf Makrophagen und Monozyten stark, und auf polymorphkernigen Granulozyten
schwach exprimiert ist, und bei der Signaltransduktion mit dem Integrin CR3 interagiert.
Auf diese Weise kommt es durch LPS zu einer gesteigerten Zelladhäsion und Phagozytose
von Bakterien, sowie zur Auslösung proinflammatorischer Reaktionen [22, 45].
Demgemäß konnte in unseren Tests durch eine Vorinkubation des Vollblutes mit LPS ein
Anstieg der granulozytären Phagozytose von E.coli, S.aureus und C.albicans, des Fc-
Rezeptor vermittelten und des E.coli stimulierten oxidativen Burst erzielt werden. Analog
wurde eine konzentrationsabhängige Stimulation der Phagozytose und des oxidativen
Burst von Neutrophilen mit 5 bis 100 ng/l LPS gezeigt. Somit konnten wir nachweisen,
daß die von Böhmer et al. beschriebene, konzentrationsabhängige Stimulation (0,1 – 100
mg /l LPS) der Phagozytose von S.aureus bei Neutrophilen [6] bereits ab LPS-
Konzentrationen von 10 ng/l ausgelöst werden kann und ebenso auf die Phagozytose von
E.coli-Bakterien und C.albicans übertragbar ist.
Auch eine Stimulation des mit fMLP ausgelösten oxidativen Bursts von isolierten Neutro-
philen mit 200 mg/l LPS war von Leet und Mitarbeiter beschrieben worden [31]. Unsere
Untersuchungen zeigten, daß bereits 5 ng/l LPS zu einer relevanten Erhöhung des mit Im-
munkomplexen und insbesondere des mit E.coli-Bakterien ausgelösten oxidativen Burst
von Granulozyten im Vollblut führen.
Demzufolge muß bei der Untersuchung der Saccharideffekte auf die Phagozytose und den
oxidativen Burst von Leukozyten eine artifizielle Stimulation durch Lipopolysaccharid
ausgeschlossen werden. Dies sollte bei der Herstellung und Aufarbeitung der Saccharide
sowie bei der Testdurchführung berücksichtigt werden.
4.3 Stimulation von Leukozytenfunktionen mit Sacchari-
den Im Saccharidscreening wurde mit BC-D-146, Lactosucrose, BC-O-192, Chitopentaose,
Nystose und Lactose eine relevante Stimulation der Phagozytose von S.aureus gemessen.
Aufgrund der inkonstanten Testergebnisse wurde anhand der drei stimulierenden Sacchari-
de BC-D-146, Lactosucrose und Nystose, sowie der kaum modulierenden Raffinose ver-
sucht, einen unspezifischen Stimulationseffekt nachzuweisen. Dabei konnte gezeigt wer-
den, daß die Saccharidlösungen der als stimulierend ermittelten Saccharide BC-D-146,
Lactosucrose und Nystose eine höhere Kontamination mit LPS aufwiesen als die von Raf-
finose. Um nun das Ausmaß des artifiziellen Stimulationseffektes durch die LPS-
4 Diskussion 80
Kontamination in den funktionellen Tests beurteilen zu können, wurde ein Vergleich zwi-
schen den pyrogenfreien, den pyrogenfrei gereinigten und anschließend gezielt mit bakte-
riellem LPS versetzten und den mit LPS kontaminierten Saccharidlösungen gemacht. Da-
bei konnte bestätigt werden, daß die LPS-freien Saccharidlösungen keine relevante
Stimulation der Phagozytose und des oxidativen Burst hervorrufen. Dagegen ließ sich der
Stimulationseffekt der kontaminierten Saccharidlösungen durch den Zusatz von bakteriel-
lem LPS zu den pyrogenfrei gereinigten Saccharidlösungen rekonstruieren, so daß die im
Screening gemessene Erhöhung der Phagozytose durch obengenannte Saccharide vor al-
lem auf einen unspezifischen Stimulationseffekt von Lipopolysaccharid zurückgeführt
werden konnte. Die schwächere Stimulationswirkung von kontaminierter gegenüber mit
LPS versetzter, pyrogenfreier Raffinose erklärt sich durch den geringeren LPS-Gehalt die-
ser Saccharidlösung (Tabelle 8). Bei den anderen Saccharidlösungen war die Kontaminati-
on durch eine längere Lagerung und die wiederholte unsterile Entnahme dagegen höher.
Trotz der relativ hohen Saccharidkonzentration von 1,8 mg/ml konnte in diesen Untersu-
chungen kein relevanter Stimulationseffekt von pyrogenfreien Sacchariden auf zentrale
Leukozytenfunktionen nachgewiesen werden. Dagegen verdeutlichen diese Ergebnisse die
artifizielle Stimulation der Phagozytose von Mikroorganismen und des oxidativen Burst
von Granulozyten durch geringe Verunreinigungen der synthetisch hergestellten Sacchari-
de mit LPS.
In der Phytotherapie werden die ethanolischen Echinacea purpurea-Extrakte wegen ihrer
Stimulation des unspezifischen Immunsystems zur Stärkung der körpereigenen Abwehr-
kräfte und Prophylaxe bei Infektanfälligkeit eingesetzt. In-vivo-Studien zeigten eine ma-
ximale Stimulierung der Phagozytose bei Granulozyten am vierten oder fünften Tag der
oral oder intravenös applizierten Echinacea-Extrakte. Bei in-vitro-Versuchen wurde ge-
zeigt, daß Echinacea-Lösung in Konzentrationen zwischen 10-4 und 10-7 ml/ml Versuchs-
ansatz zu einer Steigerung der Phagozytose und in Konzentrationen von 10-1 bis 10-3 ml/ml
zu einer dosisabhängigen Suppression führten [26]. Obwohl bisher kein genauer Wir-
kungsmechanismus nachgewiesen werden konnte wird angenommen, daß ein in Echinacea
purpurea-Extrakten enthaltenes, saures Arabinogalaktan für die immunstimulierende
Wirkung der Echinacea-Präparate verantwortlich ist [5]. Dieses Polysaccharid konnte in-
vitro und in-vivo die Phagozytose von Leishmania enriettii [37], sowie die Freisetzung von
TNF-α, Interleukin-1 und Interferon-α bei isolierten Mausmakrophagen erhöhen [4].
4 Diskussion 81
Diese von Beuscher et al. bei isolierten Mausmakrophagen beschriebene Stimulation der
Bakterienphagozytose durch Arabinogalaktan konnten wir in unseren funktionellen Test-
verfahren auch bei humanen Granulozyten im Vollblut nachweisen. Allerdings waren für
eine relevante Steigerung der Aufnahme von nonopsonierten E.coli-Bakterien (KPh = 1,55)
durch humane Granulozyten Arabinogalactankonzentrationen bis 8mg/ml im Ansatz not-
wendig. Dies kann bei oraler Zufuhr von Echinacea-Päparaten lediglich lokal im Darmlu-
men, jedoch nicht systemisch erreicht werden.
Die stärkere Steigerung der Phagozytose nonopsonierter Bakterien im Vergleich zu opso-
nierten mit dem lektinbindenden Arabinogalactan bestätigt die spezifische Wirkung dieses
Polysaccharids und zeigt, daß Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen bei der Bindung und
Aufnahme nonopsonierter Partikeln eine zentrale Rolle spielen. Da bis zu 80 % der Neu-
tralzucker-Bausteine von pflanzlichen Arabinogalaktanen oder Arabinogalaktanproteinen
aus Galaktose und Arabinose bestehen [5], wäre die Bindung der Arabinogalaktane über
ein Galactose-spezifisches Lektin (Galectin) denkbar. Beispielsweise wurde auf Ma-
krophagen ein 42-kDa großer Galactose-Rezeptor mit nahezu gleicher Affinität für end-
ständige Galactose- und N-Acetyl-Galactosamin-Reste von Oligosacchariden identifiziert.
Diesem Rezeptor wurde auch eine potentielle Beteiligung bei der Phagozytose von Mi-
kroorgansimen zugeschrieben [35]. Demnach wäre durch eine Vorinkubation der Phagozy-
ten mit Arabinogalactan eine Bindung des Polysaccharids an ein Galactose-spezifisches
Lektin möglich, die in Folge zu einer Arabinogalactan-vermittelten Bindung von Bakterien
bzw.einer Aktivierung von Leukozytenfunktionen führen könnte.
Dagegen könnte die geringere Steigerung der Phagozytose von opsonierten E.coli durch
Arabinogalactan auf der primären Bindung und Aufnahme der Bakterien über kohlenhy-
dratunabhängige Rezeptorinteraktionen beruhen. So wird über die Bindung von iC3b- und
IgG-opsonierten Bakterien an die iC3b-Bindungsstelle des CR3, den CR4 bzw. den trans-
membranären FcγRIIA (CD32A) auf polymorphkernigen Leukozyten direkt die Phagozy-
tose von Bakterien und der oxidative Burst ausgelöst [18]
Bei der Interpretation der Stimulationseffekte von Arabinogalaktan muß jedoch berück-
sichtigt werden, daß in der frisch gelösten Arabinogalaktanlösung Lipopolysaccharid in
einer Konzentration von 5,5 ng/ml nachgewiesen wurde. Da aber LPS bei diesen geringen
Konzentrationen in unseren Stimulationsversuchen keine relevante Steigerung der Phago-
zytose hervorrief, ist ein Stimulationseffekt von LPS wenig wahrscheinlich.
4 Diskussion 82
4.4 Inhibition von Leukozytenfunktionen mit Sacchariden Die Untersuchungen des hemmenden Effektes von pyrogenfreien, auf pflanzlicher Basis
synthetisierten Sacchariden ergaben, mit Ausnahme des geringen Inhibitionseffektes von
pyrogenfreier Raffinose, eine konzentrationsabhängige Hemmung der Phagozytose von
nonopsonierten E.coli-Bakterien mit BC-D-146, Lactosucrose und Nystose ab circa 25
mM. Ein Vergleich unter allen Mikroorganismen zeigte, daß bei allen Partikeln, aber ins-
besondere bei nonopsonierten E.coli-Bakterien, mit 40 mM BC-D-146 die stärkste Hem-
mung der Phagozytose möglich war. Das Saccharid weist als ein Baustein Gluconsäure
auf, welches die Funktionalität erhöht. Diese Eigenschaft könnte der Grund für die höhere
Affinität des Moleküls an Phagozytenrezeptoren, wie zum Beispiel den CR3, der unter an-
derem Glucose-haltige Saccharide bindet, sein.
Abgesehen von dem Inhibitionseffekt mit BC-D-146 bei nonopsonierten E.coli und der
fehlenden Wirkung von Raffinose und Nystose bei opsonierten S.aureus-Bakterien, waren
die Hemmeffekte der vier Saccharide bei Betrachtung des jeweiligen Mikroorganismus
relativ ähnlich. Dieses Ergebnis ist bemerkenswert, da von strukturdifferenten Zuckern un-
terschiedliche Inhibitionseffekte bei der Phagozytose von Mikroorganismen erwartet wur-
den (Bild 32).
O
HO
OH
HOO
OH
O
HO O
HO OH
OH OHO
HOOH
O
HO
OH
HOO
OH
OOHO
OH
OHO
HO
HO OH
OH
O
HO
OH
HOO
OH
O
HO
OH
HOO
O
HO
OH
HOO
OHO
HO
OH
OH
A B C
Bild 32: Strukturformeln von Raffinose (A), Lactosucrose (B) und Nystose (C)
Andererseits kann vor allem bei höheren Saccharidkonzentrationen von 30-100 mM ein
unspezifischer Hemmeffekt nicht sicher ausgeschlossen werden. Dieser könnte durch die
Adsorption der Zucker an die Zelloberfläche und folglich eine Blockade von Phagozyten-
rezeptoren bedingt sein. Gegen diese unspezifische Zuckeradsorption, bei der eine ähnliche
Hemmwirkung der granulozytären Phagozytose von nonopsonierten E.coli-Bakterien
durch alle vier getesteten Saccharide zu erwarten wäre, spricht jedoch die geringere Hem-
4 Diskussion 83
mung durch Raffinose. Eine unspezifische Inhibition könnte auch auf einem osmotischen
Effekt der Zucker mit Veränderungen der Zellmorphologie von Phagozyten beruhen. Die
Streulichteigenschaften der Monozyten und Granulozyten, als Maß für die Zellgröße waren
allerdings bei Saccharidkonzentrationen bis 50 mM im Vergleich zur Kontrolle unverän-
dert. Außerdem kam es zu keiner Anfärbung der Leukozyten mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Propidiumjodid, welcher nur für Membranen geschädigter Zellen permeabel ist, so daß bei
diesen Konzentrationen die Integrität der Zellmembran erhalten blieb. Demnach ist eine
unspezifische Hemmung der Phagozytose bei Granulozyten durch einen osmotischen Sac-
charideffekt unwahrscheinlich.
Auch die mit E.coli stimulierte Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten konnte
durch 40 mM pyrogenfreie BC-D-146 (KB = 0,56) und Lactosucrose (KB = 0,63) gehemmt
werden. Als Mechanismus der Inhibitonswirkung von Sacchariden beim oxidativen Burst
ist einerseits eine Hemmung der Bindung des Stimulus E.coli an entsprechende lektinähn-
liche Rezeptoren auf der Oberfläche von Granulozyten denkbar. Andererseits wäre eine
Blockierung der Interaktion von GPI-verankerten Phagozytenrezeptoren, wie dem Fcγ-
Rezeptor Typ III oder dem LPS-Rezeptor (CD14), mit dem Komplementrezeptor Typ 3 bei
der Signaltransduktion denkbar (Bild 3 und Tabelle 2, Kapitel 1.5), so daß die Auslösung
der Sauerstoffradikalproduktion verhindert werden würde.
Eine systemische Wirkung dieser als Functional Food zugeführten Saccharide ist nach un-
seren Untersuchungen kaum möglich, da für einen meßbaren Saccharideffekt die Serum-
konzentration mindestens 25 mM erreichen müßte. Obwohl es bisher kaum Daten dazu
gibt, ist eine gastrointestinale Resorption von intakten Oligosacchariden in größerem Um-
fang eher unwahrscheinlich. Allerdings könnten die in die Darmmukosa ausgewanderten
Granulozyten bei oraler Zufuhr der Functional Food Saccharide im Gastrointestinaltrakt
lokal mit hohen Saccharidkonzentrationen in Kontakt kommen.
Andererseits ist der Einsatz unphysiologisch hoher Saccharidkonzentrationen in den funk-
tionellen Tests sinnvoll, um einen Anhalt für die Struktur-Funktionsbeziehungen einzelner
Mono- bzw. Oligosaccharide bei der Modulation zentraler Leukozytenfunktionen zu be-
kommen. Denn trotz der relativ niedrigen Affinität der einzelnen Monosaccharidbausteine
von Polysacchariden und Glykokonjugaten können diese durch die simultane Adhäsion an
multiple Bindungsstellen (Multivalenz) eine hohe Avidität erreichen [51, 67, 71]. Die mul-
tivalente Bindungsfähigkeit der Polysaccharide würde den Einsatz geringerer Saccharid-
konzentrationen mit der gleichen Wirkung wie höhere Konzentrationen an Mono- und Oli-
4 Diskussion 84
gosacchariden ermöglichen, und könnte in Zukunft bei der Synthese von Functional Food
Sacchariden genutzt werden.
Neben den obengenannten Sacchariden wurde mit Methyl-α-D-mannosid, Methyl-β-D-
galactosid, Lactose, Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid und N-Acetyllactos-
amin eine Blockade von Leukozytenfunktionen im Vollblut untersucht. Methyl-α-D-
mannosid ist in der Literatur als Inhibitor von Lektin-vermittelten CR3-FcγRIII-Inter-
aktionen [45, 17], sowie der Immunkomplex-stimulierten Sauerstoffradikalproduktion bei
aus dem Vollblut isolierten Granulozyten [54] bekannt.
Bei der Hemmung der Phagozytose von Mikroorganismen, als auch bei der Fc-Rezeptor
vermittelten und der E.coli-stimulierten Sauerstoffradikalproduktion durch obengenannte
Saccharide spielen vermutlich ähnliche biochemische Mechanismen eine Rolle. Die Pha-
gozytose von Mikroorganismen wird ebenso wie der E.coli-stimulierte oxidative Burst
durch die Bindung der Bakterien an lektinähnliche Rezeptoren, Komplement- und Fcγ-
Rezeptoren auf Granulozyten induziert. Auch beim Fc-Rezeptor vermittelten oxidativen
Burst werden die Immunkomplexe über die Bindung an Fcγ-Rezeptoren auf Granulozyten
phagozytiert und die intrazelluläre Sauerstoffradikalproduktion gemessen. Demzufolge
führt die Inhibition der Bindung von Mikroorganismen bzw. Immunkomplexen an lektin-
ähnliche Granulozytenrezeptoren und an die Lektinbindungsstelle des CR3, sowie die
Blockade der lektinvermittelten CR3-FcγRIIIB-Interaktion zu einer Hemmung der Phago-
zytose und des oxidativen Burst.
Ein Vergleich der Inhibitionswirkung obengenannter Saccharide unter allen Phagozytose-
partikeln zeigte die stärkste Phagozytosehemmung bei nonopsonierten, gramnegativen
E.coli mit N-Acetyllactosamin (2-Acetamido-2-deoxy-4-O-β-D-galactose-D-glucosid) und
Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid und bei nonopsonierten, grampositiven
S.aureus mit Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid. Im Gegensatz zu den anderen
drei getesteten Sacchariden enthalten N-Acetyllactosamin und Methyl-2-acetamido-2-
deoxy-α-D-glucosid ein Glucosemonomer mit einer in C2-Position gebundenen Acetami-
do-Gruppe (Bild 33). Diese könnte für die stärkere Affinität dieser Zucker an die Phagozy-
tenrezeptoren und somit für die kompetitive Inhibition der E.coli-Bindung verantwortlich
sein. Außerdem führt die Bindung von N-Acetyllactosamin an Galectin-3 auf Neutrophilen
vermutlich zu einer Hemmung der Bakterienbindung an die Phagozyten.
4 Diskussion 85
OOHO OH
OH
HN
O
O
HO
HO OH
OH
OHO
HO
OC
OH
HN
O
A B
H3
OOHO OH
OH
OH
O
HO
HO OH
OH
O
HO
HO OH
OHOCH3
3
OHO
HO
OCH
OH
OH
C D E
Bild 33: Strukturformeln von N-Acetyllactosamin (A), Methyl-2-acetamido-2-deoxy-
α-D-glucosid (B), Lactose (C), Methyl-β-D-galactosid (D) und Methyl-α-D
mannosid (E)
Analog zu den oben angeführten Untersuchungen mit Arabinogalactan zeigte sich mit allen
Sacchariden eine stärkere Blockade der Phagozytose von nonopsonierten, als von
opsonierten E.coli. Bei nonopsonierten Phagozytosepartikeln können die Saccharide zu
einer Hemmung der Mikrobenbindung führen, indem sie kompetitiv die Lektine bzw.
Kohlenhydrate binden, die an der Bindung der Mikroorganismen an die
Lektinbindungsstelle des CR3 auf Leukozyten beteiligt sind. Beispielsweise wurde von
Ross und Mitarbeitern eine konzentrationsabhängige Hemmung der Bindung von
löslichem Zymosanpolysaccharid bzw. β-Glucan an die Lektinbindungsstelle des CR3
durch 25 mM bis 100 mM N-acetyl-D-glucosamin, α- oder β-Methylmannosid und α
β-Methylglucosid bei Ficoll-Hypaque isolierten
- oder
Neutrophilen gezeigt [62].
Unsere Tests mit humanen Granulozyten im Vollblut ergaben bei der Phagozytose von no-
nopsonierter C.albicans die stärkste Blockade mit Methyl-α-D-mannosid. Dies weist auf
eine Beteiligung von Mannose bei der Rezeptorbindung des Sproßpilzes hin. In der Litera-
tur ist vorbeschrieben, daß bei der Bindung von nonopsonierter Candida Interaktionen zwi-
schen dem β-1,2-verknüpften Mannotetraose-Anteils der Zellwand von C.albicans und
entsprechenden Lektinen auf Makrophagen eine wichtige Rolle spielen [16, 34]. Im Ge-
gensatz zu Makrophagen exprimieren Monozyten und Granulozyten jedoch keinen Man-
nose-Rezeptor. Allerdings wirkt das im Serum vorkommende mannanbindende Lektin
(MBL), das an Mannosereste von zuckerreichen Pathogenen bindet, als ein Opsonin für
Monozyten und Granulozyten und aktiviert den Lektinweg des Komplementsystems [63].
Die kompetitive Hemmung der Bindung von C.albicans an das MBL durch Methyl-α-D-
4 Diskussion 86
mannosid führt demnach auch zu einer verminderten Phagozytose der Hefe durch Mono-
und Granulozyten.
In den Studien von Petty und Mitarbeitern wurde eine Blockade der mit Immunkomplexen
stimulierten, intrazellulären Ca2+-Freisetzung und der Sauerstoffradikalproduktion von
Granulozyten mit 150 mM N-acetyl-D-glucosamin, Mannose und α-Methylmannosid ge-
zeigt. Die Inhibiton des oxidativen Burst der mit Ficoll-Hypaque isolierten Granulozyten
wurde auf eine kompetitive Hemmung der Interaktion des FcγRIII mit der Lektinbindung-
stelle des CR3 durch diese Saccharide (Bild 30) zurückgeführt [54].
Bei unseren Untersuchungen konnten wir hingegen nachweisen, daß auch bei Granulozy-
ten im Vollblut eine relevante Inhibition der mit Immunkomplexen stimulierten Produktion
von reaktiven Sauerstoffmetaboliten in absteigender Reihenfolge mit folgenden 100 mM
Sacchariden möglich ist: Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid > Methyl-β-D-
galactosid > Methyl-α-D-mannosid > Lactose > N-Acetyllactosamin.
Den drei Sacchariden mit dem stärksten Inhibitionseffekt ist dabei lediglich gemeinsam,
daß es sich um Monosaccharide mit einer in C1 substituierten Methylgruppe handelt, die
zu einer erhöhten Lipophilie der Saccharide führt. Weitere Struktur-Funktionsbeziehungen
liesen sich dabei nicht ableiten.
Unter allen getesteten Leukozytenfunktionen konnte die mit E.coli-Bakterien stimulierte
Sauerstoffradikalproduktion bei Granulozyten im Vollblut am stärksten mit den obenge-
nannten Sacchariden gehemmt werden. Allerdings muß wegen des ähnlich starken Inhibi-
tionseffektes aller fünf Saccharide (KB zwischen 0,24 und 0,33) an eine unspezifische
Hemmung des E.coli-induzierten oxidativen Burst gedacht werden. Dagegen spricht je-
doch die Beobachtung, daß sowohl der mit nonopsonierten E.coli ausgelöste oxidative
Burst als auch die Phagozytose von nonopsonierten E.coli in gleicher absteigender Rang-
folge durch folgende Saccharide gehemmt wurde: N-Acetyllactosamin > Methyl-2-
acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid, Methyl-β-D-galactosid > Methyl-α-D-mannosid, Lacto-
se. Da bei der Auslösung der Phagozytose und des oxidativen Burst durch die nonopsonier-
ten E.coli-Bakterien die gleichen Phagozytenrezeptoren beteiligt sind, spricht die Hem-
mung dieser beiden Leukozytenfunktionen mit denselben Zuckern für eine spezifische
Saccharidwirkung auf Rezeptorebene. Dementsprechend wurde der durch Immunkomplexe
über Fcγ-Rezeptoren ausgelöste oxidative Burst nur schwach mit N-Acetyllactosamin ge-
hemmt.
4 Diskussion 87
Im Gegensatz zu der Stimulation mit E.coli wurde der mit PMA induzierte oxidative Burst
der Granulozyten durch die obengenannten Saccharide stark erhöht. Da PMA jedoch ein
rezeptorunabhängiger Stimulus ist, stellt diese Beobachtung kein Widerspruch zu unserer
Theorie dar, daß die Zucker zu einer spezifischen Hemmung des rezeptorvermittelten oxi-
dativen Burst von Leukozyten führen. Der Wirkungsmechanismus wie die Saccharide bei
PMA zu einer Stimulation des oxidativen Burst führen bleibt jedoch offen.
Im Saccharidscreening fiel das Polysaccharid Fucoidan durch den bereits bei niedrigen
Konzentrationen ausgeprägten Inhibitionseffekt bei der granulozytären Phagozytose von
nonopsonierten E.coli-Bakterien auf.
Das von uns eingesetzte Fucoidan ist eine hochgereinigte Fraktion eines aus der Alge Fu-
cus vesiculosus isolierten Polysaccharidgemisches von unterschiedlichem Molekularge-
wicht (ca. 100000 - 150000 Dalton). Es besteht aus sulfatierter Fucose und ist ein Ligand
des Scavenger-Rezeptors A, der bei der Immunabwehr von Mikroorganismen durch Ma-
krophagen eine wichtige Rolle spielt [47]. Fucoidan ist für seine antikoagulative und fibri-
nolytische Wirkung [39], sowie antivirale Aktivität auch gegen AIDS-Viren [40] und seine
Wirkung gegen Krebszellen [10] bekannt.
In unseren Untersuchungen konnte der starke Inhibitionseffekt von Fucoidan bei der Pha-
gozytose von neutrophilen Granulozyten bereits bei niedrigsten Konzentrationen des Poly-
saccharids (250 µg/ml) nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Inhibitionseffekt von
Fucoidan in Abhängigkeit von der Saccharidkonzentration, vor allem bei den Bakterien
Escherichia coli und Staphylococccus aureus, sowie in geringerem Ausmaß bei dem
Sproßpilz Candida albicans gezeigt.
Da Fucoidan ein sehr heterogenes Polysaccharidgemisch von vorwiegend 1,2-α-glykosi-
disch, aber auch 1,3-α- und 1,4-α-glykosidisch verknüpfter, zum Teil sulfatierter, anioni-
scher L-Fucose ist (Bild 34), werden zur Erforschung des Wirkungsmechanismus derzeit
Untersuchungen mit verschiedenen Molekulargewichtsfraktionen von Fucoidan durchge-
führt.
CH3
O
O
OO
CH3
O
HO
OH RestRest
O-OSO2
O-OSO2
Bild 34: Strukturformel von Fucoidan
4 Diskussion 88
4.5 Schlußfolgerung Zur Beantwortung der Frage, ob sich chemisch bzw. enzymatisch synthetisierte Saccharide
pflanzlichen Ursprungs als Functional Food zur Steigerung bzw. Hemmung der Phagozy-
tose von Mikroorganismen und des oxidativen Burst von Leukozyten eignen, wurden spe-
zifisch auf diese Fragestellung adaptierte Tests für die durchflußzytometrische Analyse im
Vollblut etabliert.
Die Erforschung der Stimulations- bzw. Inhibitionseffekte von Functional Food Sacchari-
den auf die Phagozytose und Sauerstoffradikalproduktion von Granulozyten erfordert den
Ausschluß artifizieller Stimulationseffekte durch bakterielle Lipopolysaccharide.
Um bei der Untersuchung der Modulation von Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zwi-
schen Mikroorganismen und Phagozyten durch Saccharide mit funktionellen Testverfahren
im Vollblut einen Anhalt für die Struktur-Funktionsbeziehungen zu bekommen, ist der
Einsatz relativ hoher Saccharidkonzentrationen notwendig. Trotz der fehlenden Datenlage
ist eine gastrointestinale Resorption von Oligosacchariden in größerem Umfang eher un-
wahrscheinlich. Allerdings könnten die in den Magen-Darm-Trakt ausgewanderten Granu-
lozyten lokal mit hohen Zuckerkonzentrationen in Kontakt kommen.
In unseren Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß die Phagozytose von non-
opsonierten E.coli-Bakterien und der mit nonopsonierten E.coli stimulierte oxidative Burst
von Granulozyten am stärksten durch das anionisch geladene Glucosederivat BC-D-146
bzw. durch die 2-Acetamido-Glucose-haltigen Saccharide N-Acetyllactosamin und Me-
thyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid inhibiert wurden. Die granulozytäre Phagozytose
von nonopsonierter C.albicans konnte dagegen relevant durch Methyl-α-D-mannosid ini-
biert werden.
Zukünftig könnte die Isolierung und Synthese von auf diesen Monomeren basierenden Po-
lysacchariden den Einsatz weitaus geringerer Saccharidkonzentrationen mit ähnlichen Mo-
dulationseffekten ermöglichen, da Polysaccharide trotz der geringen Bindungsaffinität ih-
rer Mono- bzw. Disaccharidbausteine durch ihre multivalente Bindungsfähigkeit eine hohe
Avidität erreichen. Diese Hypothese wurde durch das Beispiel des Polysaccharids Fucoi-
dan, welches bei sehr geringen Konzentrationen (500 µg/ml) eine nahezu hundertprozenti-
ge Blockierung der granulozytären Phagozytose von E.coli und S.aureus hervorrief, unter-
stützt.
5 Zusammenfassung Die Elimination von pathogenen Mikroorganismen im Rahmen der angeborenen Immun-
abwehr erfordert die schnelle Erkennung und Bindung der Erreger durch Phagozyten. Da-
bei spielen die spezifischen Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zwischen Bakterien und
Phagozyten eine wichtige Rolle.
In dieser Arbeit war zu untersuchen, ob sich chemisch bzw. enzymatisch synthetisierte
Saccharide pflanzlichen Ursprungs als Functional Food zur Modulation der Phagozytose
von Mikroorganismen und des oxidativen Burst bei Leukozyten eignen.
Zunächst wurden funktionelle Testverfahren ausgearbeitet, die eine durchflußzytometri-
sche Analyse der Phagozytose von Escherichia coli, Staphylococcus aureus und Candida
albicans, sowie des Fc-Rezeptor vermittelten und des mit E.coli-Bakterien stimulierten
oxidativen Burst ermöglichten. Als Modell zur Erforschung der Effekte von Functional
Food Sacchariden auf die Lektin-Kohlenhydrat-Interaktionen zwischen Mikroorganismen
und Phagozyten im humanen Gastrointestinaltrakt dienten die zur Extravasation in den
Magen-Darm-Trakt befähigten Granulozyten im periphervenösen Vollblut, sowie kultivier-
te, humane Makrophagen.
Ein zur Erforschung von Kohlenhydratbasisstrukturen durchgeführtes Saccharidscreening,
zeigte eine Stimulation der Phagozytose von S.aureus. Die aufgrund der schlechten Repro-
duzierbarkeit dieser Testergebnisse betriebene Ursachenforschung ergab eine Stimulation
der Phagozytose als auch des oxidativen Burst durch eine Kontamination der Testsacchari-
de mit bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS). Dies konnte ein Vergleich der Stimulations-
effekte von pyrogenfreien, gezielt mit LPS versetzten sowie LPS kontaminierten Saccha-
ridlösungen bestätigen.
Weiterhin wurde am Beispiel von Arabinogalactan der Effekt bekannter Immunstimulanzi-
en mit unseren funktionellen Testsystemen überprüft. Dieses saure Polysacharid, welches
vermutlich der wirksame Bestandteil von Echinacea-Präparaten ist, führte in unseren Un-
tersuchungen ab 2 mg/ml zu einer meßbaren und mit 8 mg/ml zur maximalen Steigerung
der granulozytären Phagozytose von insbesondere nonopsonierten E.coli. Solche Serum-
spiegel können bei oraler Zufuhr sicherlich nicht erreicht werden.
Bei den Untersuchungen der inhibitorischen Saccharideffekte zeigte sich insbesondere mit
nonopsonierten E.coli-Bakterien eine relevante Hemmung der Phagozytose und der Sauer-
5 Zusammenfassung 90
stoffradikalproduktion von Granulozyten durch 40 mM pyrogenfreie BC-D-146, sowie 100
mM N-Acetyllactosamin und Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid. Der Inhibitions-
effekt von BC-D-146 könnte auf einer erhöhten Rezeptoraffinität durch die anionische La-
dung dieser Gluconsäure beruhen. Dementsprechend führt bei N-Acetyllactosamin und
Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid das in beiden Molekülen enthaltene 2-Acet-
amido-Glucosemonomer möglicherweise zu einer erhöhten Rezeptoraffinität.
Dagegen wurde die granulozytäre Phagozytose von nonopsonierter C.albicans vor allem
mit Methyl-α-D-mannosid gehemmt. Dieses Mannosederivat inhibiert vermutlich kompe-
titiv die Bindung des mannanbindenden Lektins an die mannosehaltigen Zellwandbestand-
teile von C.albicans. Die herabgesetzte Bindung dieses Serumopsonins führt zu einer ver-
minderten Aktivierung des Lektinweges des Komplementsystems und somit zu einer ge-
ringeren Phagozytose von C.albicans.
Der stärkste Inhibitionseffekt konnte mit dem Polysaccharid Fucoidan nachgewiesen wer-
den, welches bereits bei Konzentrationen von 250µg/ml die Phagozytose von opsonierten
und nonopsonierten E.coli, von nonopsoniertem S.aureus und in geringerem Ausmaß von
C.albicans bei Granulozyten inhibierte. Eine nahezu hundertprozentige Phagozytoseblok-
kade von E.coli und S.aureus wurde mit 500 µg/ml Fucoidan erreicht.
Eine Hemmung der Fc-Rezeptor vermittelten Sauerstoffradikalproduktion von Granulozy-
ten konnte mit 100 mM Methyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-glucosid, Methyl-β-D-galacto-
sid, Methyl-α-D-mannosid, Lactose und N-Acetyllactosamin nachgewiesen werden.
Die Ergebnisse zeigen, daß bei der Erforschung der immunmodulierenden Saccharideffek-
te eine unspezifische Leukozytenstimulation durch bakterielles LPS stets ausgeschlossen
werden muß.
In Zukunft könnte die Isolierung und Synthese von Polysacchariden, die auf hydrophiler
Glucose und 2-Acetamido-Glucose bzw. auf Mannose basieren, eine Hemmung der Pha-
gozytose und des oxidativen Burst bei nonopsonierten E.coli bzw. C.albicans mit deutlich
geringeren Saccharidkonzentrationen ermöglichen. Denn trotz der niedrigen Bindungsaffi-
nität der Monomere kann ein Polysaccharid durch die multivalente Bindungsfähigkeit eine
hohe Rezeptoraffinität erreichen. Der ausgeprägte Inhibitionseffekt des Polysaccharids Fu-
coidan, der bei vergleichsweise geringen Konzentrationen eintritt, unterstützt diese
Hypothese.
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98
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei meinen Betreuern Prof. Dr. Groß für die Unterstüt-
zung bei theoretischen und praktischen Fragestellungen während der Promotionsarbeit und
bei Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. Grünert für die Beratung bei der Fertigstellung der Arbeit bedan-
ken.
Weiterhin danke ich Dr. Vogel von der Firma Südzucker AG für die nützlichen Hinweise
in Zusammenhang mit Sacchariden und Functional Food und die gute Zusammenarbeit in
diesem Projekt.
Herrn Dr. Muche aus der Abteilung Medizinische Biometrie und Dokumentation danke ich
für die Beratung in statistischen Fragen.
Ralph Müller möchte ich für die Hilfestellung bei technischen Fragen zur Software und zur
Datenverarbeitung im Rahmen der Forschungarbeit danken.
Ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir während des Studiums immer unterstüt-
zend zur Seite standen und mir damit erst diese Promotion ermöglichten