Analyse der Struktur-Funktionsbeziehungen in OPR3 · modifizierten OPR1-Proteine im Peroxisom...

Universität Hohenheim

Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen

Prof. Dr. A. Schaller

Analyse der Struktur-Funktionsbeziehungen in OPR3

Diplomarbeit vorgelegt von Daniela Schwörer Fakultät Naturwissenschaften - Studiengang Biologie

Betreuung durch Dr. Annick Stintzi

Hohenheim, September 2007

Für meine Eltern

Zusammenfassung I

Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden Strukturanalysen zweier Proteine der

Oxophytodiensäure Reduktase Familie, OPR3 und OPR1, durchgeführt. Durch

zielgerichtete Mutationen sollte untersucht werden, welche Strukturen für die

Substratspezifität der Proteine verantwortlich sind. OPR3 ist in der Lage, sowohl

cis(+)OPDA als auch cis(-)OPDA umzusetzen, wohingegen OPR1 lediglich

cis(-)OPDA umsetzen kann. Es sollte ein OPR1 Protein durch zielgerichtete

Mutationen so modifizieren werden, dass es cis(+)OPDA umsetzen kann. Hierfür

wurden verschiedene Konstrukte der OPR1 cDNA hergestellt, bei welchen die

Aminosäuren Tyrosin an Position 74 in Phenylalanin getauscht und die Aminosäure

Tyrosin an Position 244 in Histidin ausgetauscht wurden. Außerdem wurde C-

Terminal ein peroxisomales SRL-Tag kloniert, welches die Lokalisation im

Peroxisomen sicherstellen sollte. Opr3-defiziente Arabidopsis thaliana wurden mit

den Konstrukten transformiert. Wenn die männliche Fertilität von opr3-defizienten

Pflanzen wiederhergestellt werden kann, so zeigt dies, dass die Aktivität von OPR3

durch die punktmutierten OPR1 Proteine komplementiert werden kann. Dies war

nicht der Fall, woraufhin weitere Untersuchungen klarstellen sollten, ob die

modifizierten OPR1-Proteine im Peroxisom vorhanden waren. Allerdings konnten

auch diese kein eindeutiges Ergebnis liefern.

Des Weiteren wurden punktmutierte OPR3-Proteine untersucht, die an Stellen die

für eine Dimerisierung entscheidend sind (Glutamat an Position 291 wurde durch

Lysin ersetzt) und eine Phosphorylierung bei Dimerisierung ausbilden (Tyrosin an

Position 364 wurde durch Phenylalanin ersetzt). Hierbei sollte untersucht werden,

ob die punktmutierten Proteine, die in vitro als Monomere kristallisieren auch in vivo

nicht dimerisieren können. Eine daraus resultierende eventuelle dauerhafte Aktivität

sollte untersucht werden. Die männliche Sterilität der opr3-defizienten Pflanzen

konnte durch die Mutierten OPR3-Proteine komplementiert werden, aber es zeigte

sich kein veränderter Phänotyp. Um eine dauerhafte Aktivität von OPR3

nachzuweisen, müssen weitere Experimente durchgeführt werden.

Außerdem wurde die Möglichkeit einer reversiblen Phosphorylierung zur Regulation

von OPR3 mit Hilfe von Western Blot Analysen untersucht. Hierbei wurden

Verwundungsexperimente an Tomaten und Arabidopsis thaliana durchgeführt. Es

stellte sich heraus, dass OPR3 nicht nur durch Verwundung induziert wird, sondern

auch, wenn eine benachbarte Pflanze verwundet wird und flüchtige Botenstoffe

(volatile organic compounds, kurz VOCs) freigesetzt werden. LeOPR3 scheint

sowohl induziert, als auch durch Phosphorylierung inaktiviert zu werden, während

Zusammenfassung II

bei Arabidopsis zwar eine Induktion von OPR3 zu erkennen ist, aber keine

eindeutige Phosphorylierung des Proteins festgestellt werden konnte.

Inhaltsverzeichnis III

INHALTSVERZEICHNIS

ZUSAMMENFASSUNG I

1. EINLEITUNG 1

1.1 Der Oktadekanoidweg 3

1.2 Das OPR3 Protein– Lokalisation und Aufgabe 5

1.3 Die opr3-Mutante 7

1.4 Strukturvergleich von OPR3 und OPR1 8

1.5 Volatiles – Kommunikation unter Pflanzen 12

1.6 Ziel dieser Arbeit 14

2. MATERIAL UND METHODEN 15

2.1 Organismen 15

2.1.1 Pflanzen 15

2.1.2 Bakterien 15

2.2 Vektoren und Plasmide 15

2.3 Oligonukleotide 17

2.4 Enzyme 18

2.5 Antikörper 19

2.5.1 Primäre Antikörper 19

2.5.2 Sekundäre Antikörper 19

2.6 Chemikalien und Verbrauchsmaterial 20

2.7 Laborgeräte 21

2.8 Antibiotika und Medien 22

2.8.1 Stammlösungen Antibiotika 22

2.8.2 Medien 22

Inhaltsverzeichnis IV

2.9 Allgemeine Methoden mit Pflanzen 23

2.9.1 Anzucht von Tomaten 23

2.9.2 Anzucht von Arabidopsis thaliana 23

2.9.3 Transformation von Arabidopsis thaliana mit der „floral dip“ Methode 23

2.9.4 Pollenkeimungstest 24

2.10 Molekularbiologische Techniken mit DNA 25

2.10.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 25

2.10.2 Auftrennung und Sichtbarmachen von DNA durch Gelelektrophorese 27

2.10.3 Restriktionsverdau 28

2.10.4 DNA-Gelextraktion 28

2.10.5 Klonierung 28

2.10.6 Transformation durch Elektroporation 29

2.10.7 DNA Extraktion 29

2.10.8 Zielgerichtete Mutagenese 32

2.10.9 DNA-Sequenzierung 34

2.11 Molekularbiologische Techniken mit Proteinen 35

2.11.1 Gradientenzentrifugation / Zellorganellfraktionierung 35

2.11.2 Katalaseaktivität 36

2.11.3 Proteinexpression und Aufreinigung 36

2.11.4 Gesamtproteinextraktion 39

2.11.5 Bradfordtest 39

2.11.6 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 40

2.11.7 Proteinfärbung 42

2.11.8 Western Blot 44

2.11.9 Antikörperaufreinigung 45

2.11.10 Immunologischer Nachweis der Proteine 47

3. ERGEBNISSE 49

3.1 Mutationen der OPR3 cDNA 49

3.2 Mutationen der OPR1 cDNA 50

3.3 Klonierung in pGreen 0229 54

3.4 Identifizierung transgener Pflanzen 56

3.5 Analyse der Mutation E291K 58

3.6 Ist die Männliche Fertilität in OPR1+SRL, Y244H und Y74F/Y244H wiederhergestellt?

60

Inhaltsverzeichnis V

3.7 Lokalisation der mutierten OPR1-Proteine 62

3.7.1 Gradientenzentrifugation 62

3.7.2 Katalaseaktivität 64

3.7.3 Western Blot auf OPR1 65

3.8 Wird OPR3 durch reversible Phosphorylierung reguliert? 67

3.8.1 OPR3 wird durch Green Leave Volatiles Induziert 71

3.8.2 LeOPR3 wird bei Induktion durch Green Leave Volatiles Phosphoryliert 73

3.8.3 Im Arabidopsis Wildtyp wird OPR1 durch die Induktion von OPR3 reprimiert 74

3.8.4 In opr1 Pflanzen ist OPR3 konstitutiv aktiv 76

4. DISKUSSION 79

4.1 OPR3 kann nicht durch punktmutierte OPR1Proteine ersetzt werden 79

4.2 Arabidopsis zeigt keinen Veränderungen durch punktmutierte OPR3 Proteine 81

4.3 OPR3 wird durch VOCs induziert 82

5. ANHANG VII

5.1 Ergebnisse der Pollenkeimungstests VII

5.1.1 Wildtyp VII

5.1.2 Arabidopsis opr3-Mutante VII

5.1.3 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR3 cDNA VIII

5.1.4 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit E291K VIII

5.1.5 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR1+SRL IX

5.1.6 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR1+SRL-Y244H X

5.1.7 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR1+SRL Y244H/Y74F XII

5.2 Sequenz des AtOPR3 Promotors XIV

5.3 Aminosäure und Basensequenz von LeOPR1 XV

5.4 Aminosäure und Basensequenz von LeOPR3 XVII

5.5 Sequenzen von OPR3-Mutanten XIX

5.5.1 OPR3 E291K XIX

5.5.2 OPR3 Y364F XIX

5.6 Sequenzen von OPR1Mutanten XX

5.6.1 OPR1+SRL XX

5.6.2 OPR1 Y74F XX

5.6.3 OPR1 Y244H XXI

Inhaltsverzeichnis VI

5.6.4 OPR1 Y74F/Y244H XXI

6. VERZEICHNISSE XXII

6.1 Literatur XXII

6.2 Abkürzungen und Einheiten XXVII

6.3 Abbildungen und Tabellen XXIX

DANKE XXXIV

EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG

1. Einleitung 1

1. Einleitung

Jeder Organismus muss, wenn er überleben will, gewisse Anforderungen in seiner

Umwelt erfüllen. Sind Umgebung oder Bedingungen suboptimal, ist der

Organismus Stress ausgesetzt. Viele dieser Stresssituationen lassen sich umgehen

oder lösen, indem zum Beispiel ein Tier einen Schattenplatz aufsucht, wenn es ihm

in der Sonne zu heiß ist, oder ein Hund sich durch Hecheln Kühlung verschafft.

Pflanzen aber sind Standort und Umgebung ausgeliefert. Daher mussten Pflanzen

im Laufe der Evolution Möglichkeiten entwickeln, um mit veränderten

Umweltbedingungen fertig zu werden. Hierfür stehen der Pflanze andere

Möglichkeiten zur Verfügung als Menschen oder Tieren. Sie empfängt

Umweltsignale, die dann intra- und interzellulär weitergegeben werden um

schließlich spezifische Reaktionen hervorzurufen, die die Pflanze an die

veränderten Umweltbedingungen anpasst. Hierfür hat eine Pflanze ein großes

Spektrum an Pflanzenhormonen zur Verfügung, die eine interzelluläre

Kommunikation ermöglichen. Ein bekannter Mechanismus hierbei ist die Bildung

von Jasmonsäure bei Verwundung durch Fraßfeinde. Jasmonsäure (vgl. Abb. 1) ist

bereits in den 60er Jahren entdeckt worden, aber erst in der allerjüngsten Zeit als

Pflanzenhormon anerkannt worden.

Abb. 1: Struktur der Jasmonsäure

Jasmonsäure kommt nicht nur in Arabidopsis thaliana, der Modellpflanze, die in

dieser Arbeit zum Großteil der Experimente herangezogen wird, sondern ubiquitär

im Pflanzenreich vor (Meyer et al., 1984). Sie ist verantwortlich für die Regulation

verschiedenster Prozesse (Creelman und Mullet, 1997). Zu den Jasmonsäure-

regulierte Entwicklungsprozesse gehören die Differenzierung des männlichen

Gametophyten, die Verlängerung der Antherenfilamente, die Öffnung der Stoma

während der Anthese und den Reifungsprozess von Pollenkörnern. (McConn and

Browse, 1996;Sanders et al., 2000; Stintzi and Browse, 2000; Ishiguro et al., 2001;

Park et al., 2002). Außerdem hat Jasmonsäure eine Wirkung auf die Seneszenz,

Wurzelentwicklung und Fruchtbildung der Pflanzen (Devoto und Turner, 2003). In

hohen Dosen wirkt sie auf das Wachstum der Pflanzen hemmend (Koda, 1997).

1. Einleitung 2

Weiterhin kommt ihr eine große Aufgabe als Signalmolekül in Antwort auf Stress zu

(Berger 2002). Abbildung 2 zeigt im linken Bereich die Wirkungen von Jasmonaten

auf Stressoren und im rechten Teil auf die Entwicklung der Pflanzen. Am meisten

ist aber von den Funktionen der Jasmonsäure durch Mutanten in Arabidopsis

bekannt, welche über so genannte loss-of-function Mutationen nicht mehr in der

Lage sind Jasmonsäure zu bilden oder zu erkennen.

Abb. 2: Die Wirkungen von Jasmonaten auf Stressoren und ihre Beteiligung an der

pflanzlichen Entwicklung (Wasternack, 2005)

1. Einleitung 3

1.1 Der Oktadekanoidweg

Der Oktadekanoidweg führt zur Bildung von Jasmonsäure. Sie wird ausgehend von

aus der Chloroplastenmembran freigesetzten α-Linolensäure (18:3) gebildet, die

von 13-Lipoxygenase (LOX) katalysiert in Hydroperoxylinolensäure umgewandelt

wird. Diese wird von der Allenoxid Synthetase (AOS) zu einem instabilen Epoxid,

welches sofort von der Allenoxid Cyclase (AOC) zyklisiert und somit zu

Oxophytodiensäure (OPDA) wird. Geschieht diese sofortige Umwandlung in

cis(+)OPDA nicht, entstehen racemische Formen von OPDA, die nicht als Vorläufer

der Jasmonsäure fungieren können. Cis(+)OPDA wird von einer NADPH2-

abhängigen OPDA Reduktase (OPR3) im Peroxisom an der 10,11-Doppelbindung

reduziert. Schließlich entsteht OPC 8:0, aus der nach 3 Zyklen β-Oxidation

Jasmonsäure, das Endprodukt des Biosynthesewegs entsteht (Review Schaller F.,

2005).

Abb. 3: Der Oktadekanoidweg der Jasmonysnthese (nach Vick und Zimmermann,

adaptiert nach Wasternack und Hause, 2002)

1. Einleitung 4

Es wurden fünf Isoformen der OPDA Reduktasen (OPRs) in Arabidopsis gefunden,

in Tomate drei, im Reis sogar 13 (Review: Schaller et al., 2005). Abbildung 4 zeigt

die Verwandtschaft der 3 OPR Isoformen aus Tomate und Arabidopsis.

AtOPR3

AtOPR1AtOPR2

10001000

10001000

999999

LeOPR3

LeOPR1LeOPR2

0.10.1

AtOPR3

AtOPR1AtOPR2

1000100010001000

1000100010001000

999999999999

LeOPR3

LeOPR1LeOPR2

0.10.1

Abb. 4: Verwandtschaftsvergleich der OPR Isoformen von Tomate und Arabidopsis.

Die OPRs aus Tomate und OPR1, 2, 3, 4 und 5 (Abu-Romman, Stintzi und Schaller

A., unveröffentlicht) aus Arabidopsis thaliana katalysieren die Reduktion von α,β-

ungesättigten Kohlenstoffverbindungen (Schaller F. et al., 2000; Strassner et al.,

1999). Zu dieser Gruppe gehört auch cis(+)OPDA, welche das physiologische

Substrat von OPR3 ist. Doch nur OPR3 ist in der Lage in vivo cis(+)OPDA zu OPC

8:0 umzusetzen (Stintzi und Browse, 2000). Keine der anderen Isoformen kann

diese Reaktion im Oktadekanoidweg ersetzen. OPR3 kann zwar auch cis(-)OPDA

in vitro umsetzen, allerdings bildet sich daraus nicht die aktive Form

(3R,7S)-Jasmonsäure, sondern die inaktive (3S,7R)-Jasmonsäure. Eine andere

Isoform der Oxophytodiensäure Reduktase, das OPR1, ist nur in der Lage

cis(-)OPDA umzusetzen und somit nicht für den Oktadekanoidweg geeignet

(Schaller F., 1998).

Jasmonsäure hat auf den Oktadekanoidweg eine positive Rückkopplung. Wenn

Jasmonsäure produziert wird, wird zugleich die Bildung von am Oktadekanoidweg

beteiligten Proteinen stimuliert. Ebenso ist OPDA ein Signalmolekül im

Oktadekanoidweg, das unter anderem die Bildung von im Oktadekanoidweg

vorgeschalteten Enzymen stimuliert. (Stintzi et al., 2001)

1. Einleitung 5

1.2 Das OPR3 Protein– Lokalisation und Aufgabe

Abb. 5: Vergleich der Sequenzen der 3 Isoformen von OPR in Tomaten (Le) mit

den Isoformen aus Arabidopsis thaliana (At)

AtOPR1 --MENGEAKQS--VPLLTPYKMGRFNLSHRVVLAPLTRQRSYGNVPQPHAAIYYSQRTTPGGFLITEATGVSDTAQGYQDTPGIWTKEHVEAWKPIVDAVHAKGGIFFCQ 106

AtOPR2 MEMVNAEAKQS--VPLLTPYKMGRFNLSHRVVLAPLTRQKSYGSVPQPHAILYYSQRTSPGGFLIAEATGVSDTAQGYPDTPGIWTKEHVEAWKPIVDAVHAKGGIFFCQ 108

LeOPR1 MENKVVEEKQVDKIPLMSPCKMGKFELCHRVVLAPLTRQRSYGYIPQPHAILHYSQRSTNGGLLIGEATVISETGIGYKDVPGIWTKEQVEAWKPIVDAVHAKGGIFFCQ 110

AtOPR3 ----MTAAQGNSNETLFSSYKMGRFDLSHRVVLAPMTRCRALNGVPNAALAEYYAQRTTPGGFLISEGTMVSPGSAGFPHVPGIYSDEQVEAWKQVVEAVHAKGGFIFCQ 106

LeOPR3 ----MASSAQDGNNPLFSPYKMGKFNLSHRVVLAPMTRCRALNNIPQAALGEYYEQRATAGGFLITEGTMISPTSAGFPHVPGIFTKEQVREWKKIVDVVHAKGAVIFCQ 106

1.......10........20........30........40........50........60........70........80........90.......100.......110

AtOPR1 IWHVGRVSNSGFQPNGKAPISCSDKPLMPQIRSNGI---DEALFTPPR--RLGIEEIPGIVNDFRLAARNAMEAGFDGVEIHGANG-YLIDQFMKDTVNDRTDEYGGSLQ 210

AtOPR2 IWHVGRVSNRGFQPRRQAPISCTGKPIMPQMRANGI---DEARFTPPR--RLSIEEIPGIVNDFRLAARNAMEAGFDGVEIHGAHG-YLIDQFMKDKVNDRTDEYGGSLQ 212

LeOPR1 IWHVGRVSNKDFQPNGEDPISCTDRGLTPQIMSNGI---DIAHFTRPR--RLTTDEIPQIVNEFRVAARNAIEAGFDGVEIHGAHG-YLIDQFMKDQVNDRSDKYGGSLE 214

AtOPR3 LWHVGRASHAVYQPNGGSPISSTNKPISENRWRVLLPDGSHVKYPKPR--ALEASEIPRVVEDYCLSALNAIRAGFDGIEIHGAHG-YLIDQFLKDGINDRTDQYGGSIE 213

LeOPR3 LWHVGRASHEVYQPAGAAPISSTEKPIS-NRWRILMPDGTHGIYPKPR--AIGTYEISQVVEDYRRSALNAIEAGFDGIEIHGAHG-YLIDQFLKDGINDRTDEYGGSLA 212

.......120.......130.......140.......150.......160.......170.......180.......190.......200.......210.......220

AtOPR1 NRCKFPLEIVDAVAKEIGPDRVGIRLSPFADYMESGDTNPGALGLYMAESLNKYG------ILYCHVIEARMKTMGEVHACPHT--------LMPMRKAFKGTFISAGGF 306

AtOPR2 NRCKFALEVVDAVAKEIGPDRVGIRLSPFADYMESGDTNPEALGLYMVESLNKYG------ILYCHMIEPRMKTVGEIAACSHT--------LMPMREAFKGTFISAGGF 308

LeOPR1 NRCRFALEIVEAVANEIGSDRVGIRISPFAHYNEAGDTNPTALGLYMVESLNKYD------LAYCHVVEPRMKTAWEKIECTES--------LVPMRKAYKGTFIVAGGY 310

AtOPR3 NRCRFLKQVVEGVVSAIGASKVGVRVSPAIDHLDATDSNPLSLGLAVVDMLNKLQDVNGLKLAYLHVTQPRYHAYGQTESGRQGSDEEEAKLMKSLRMAYKGTFMSSGGF 323

LeOPR3 NRCKFITQVVQAVVSAIGADRVGVRVSPAIDHLDAMDSNPLSLGLAVVERLNKIQLHSGSKLAYLHVTQPRYVAYGQTEAGRLGSEEEEARLMRTLRNAYQGTFICSGGY 322

.......230.......240.......250.......260.......270.......280.......290.......300.......310.......320.......330

AtOPR1 TREDGNEAVSKGRTDLVAYGRWFLANPDLPKRFQVDAPLNKYDRPTFYTSDPVVGYTDYPFLESTA-------- 372

AtOPR2 TREDGNEAVAKGRTDLVAYGRWFLANPDLPKRFQLDAPLNKYNRSTFYTSDPVVGYTDYPSLESTA-------- 374

LeOPR1 DREDGNRALIEDRADLVAYGRLFISNPDLPKRFELNAPLNKYNRDTFYTSDPIVGYTDYPFLETMT-------- 376

AtOPR3 NKELGMQAVQQGDADLVSYGRLFIANPDLVSRFKIDGKLNKYNRKTFYTQDPVVGYTDYPFLA------PSSRL 391

LeOPR3 TRELGIEAVAQGDADLVSYGRLFISNPDLVMRIKLNAPLNKYNRKTFYTQDPVVGYTDYPFLQGNGSNGPLSRL 396

.......340.......350.......360.......370.......380.......390.......400....

1. Einleitung 6

Während die ersten drei Enzyme des Oktadekanoidwegs im Plastiden lokalisiert

sind, ist OPR3 im Peroxisom (Siehe Abbildung 6). Ein Blick auf das C-terminale

Ende der OPR3-Sequenz zeigt, dass hier ein SRL-Tag vorhanden ist (Abbildung 5),

das für die Lokalisation im Peroxisom verantwortlich ist (Strassner et al. 2002). Hier

findet auch die β−Oxidation statt. OPDA muss also von den Plastiden ins

Peroxisom gelangen, um dort umgesetzt werden zu können (Stintzi und Browse

2000). Abbildung 6 verdeutlicht die Lokalisation der Proteine, die im

Oktadekanoidweg integriert sind und weitere Synthesewege, an denen

Jasmonsäure (JA) beteiligt ist.

Abb. 6: Lokalisation der Proteine des Oktadekanoidwegs, Jasmonsäurebiosynthese

und Metabolismus.

1. Einleitung 7

Der Umsatz von cis(+)OPDA zu cis(+)OPC-8:0 ist die Reduktion der 10,11-

Doppelbindung im Cyclopentenonring (siehe auch Abbildung 7). Hierbei wird der

FMN Cofaktor oxidiert, der von NADPH reduziert wird und somit wieder zur

Verfügung steht. Die Reduktion durch OPR3 ist also NADPH-abhängig.

OPR3O

COOH

O

COOH11

10

cis (+) OPDA OPC-8:0cis(+)cis(+)FMNH2 FMN

NADPH + H+NADP+

OPR3O

COOH

O

COOH

O

COOH11

10

O

COOH11

10

cis (+) OPDAcis (+) OPDA OPC-8:0cis(+)cis(+)OPC-8:0cis(+)cis(+)FMNH2 FMN

NADPH + H+NADP+

Abb. 7: Umsatz von cis(+)OPDA durch NADPH-abhängiges OPR3 zu cis(+)OPC-

8:0

1.3 Die opr3-Mutante

OPR3 kommt eine Aufgabe in der männlichen Fertilität zu. Für die männliche

Fertilität in Arabidopsis thaliana ist das Vorhandensein von Jasmonsäure unbedingt

nötig. In der opr3-Mutante sind zeitlichen Abläufe der Pollenfreisetzung gestört, der

Pollen wird zu spät freigesetzt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Stigmapapillen nicht

mehr empfänglich für eine Bestäubung (Sanders et al., 1999, Sanders et al., 2000).

Allerdings kann bei opr3-Pflanzen durch Applikation von exogener Jasmonsäure

die Fertilität wiederhergestellt werden. Durch eine exogene Applikation von OPDA

kann dies nicht erreicht werden. OPDA kann Jasmonsäure als chemisches Signal

für die Antheren- und Pollenreifung nicht ersetzen (Stintzi and Browse 2000). Alle

Mutationen im Oktadekanoidweg, die die Bildung von Jasmonsäure und den darauf

folgenden Signalweg (Xie et al. 1998) unterbrechen, haben eine männliche Sterilität

zur Folge. Die in dieser Arbeit verwendeten Mutanten sind durch T-DNA Insertion

hergestellt worden.

1. Einleitung 8

1.4 Strukturvergleich von OPR3 und OPR1

Um die Stereoselektivität von OPR1 besser zu verstehen, soll hier genauer auf die

Strukturen von OPR3 und OPR1 eingegangen werden. OPR3 und OPR1 haben

eine 53%ige Sequenzidentität (Abbildung 8 und Stintzi und Browse, 2000), aber

ihre Strukturen sind tatsächlich über weite Strecken identisch.

Abb. 8: 3D-Struktur von OPR1.

OPR1 (Abbildung 8) und OPR3 bilden ein 8 strängiges αβ-Fass (Breithaupt et al.,

2000 und 2006). Die Autoren konnten zeigen, dass 8 parallel verlaufende

β−Faltblätter ein Fass bilden, das von α−Helices umgeben ist. Das Aktive Zentrum

ist in allen OPR Isoformen hoch konserviert. OPR1 und OPR3 unterscheiden sich

allerdings in den β−Loops, die aus dem Protein herausragen. Exponiert hierbei ist

in OPR1 der β3-Loop (siehe Abbildung 9). Wie schon eingangs erwähnt, ist nur

OPR3 in der Lage cis(+)OPDA umzusetzen, wodurch eine aktive Form der

Jasmonsäure entsteht. Allerdings kann es in vitro auch cis(-)OPDA umsetzen. Das

nahe verwandte Protein OPR1 hingegen kann nur cis(-)OPDA umsetzen. Dies liegt

an einer strukturellen Besonderheit von OPR1. Hier ragt der β3-Loop weiter heraus

als in OPR3 und bildet somit eine Art Deckel über dem aktiven Zentrum. Dieser ist

dafür verantwortlich, dass nur cis(-)OPDA das aktive Zentrum von OPR1 erreichen

kann, nicht aber cis(+)OPDA. In OPR3 ist dieser Loop etwas kleiner, wodurch die

Höhlung um das aktive Zentrum größer wird, und sowohl cis(+) als auch cis(-

)OPDA das aktive Zentrum erreichen und umgesetzt werden können.

1. Einleitung 9

Abb. 9: Strukturvergleich von OPR3 (gelb) und OPR1(blau)

Exponierte Aminosäuren am β3-Loop sind die Tyrosine an den Positionen 246 und

78 (Breithaupt et al., 2006 und Abbildung 10). Tauscht man an OPR3 Proteinen die

korrespondierenden Aminosäuren Histidin an Position 244 und Phenylalanin an

Position 74 gegen die Tyrosine von OPR1 aus, so ist OPR3 in vitro nur noch mit

einer sehr geringen Effizient in der Lage cis(+)OPDA umzusetzen (F. Schaller und

T.Clausen, unveröffentlicht).

Abb. 10: Detaildarstellung des Aktiven Zentrums von OPR1 mit gebundenem

Substrat

Ein weiterer Unterschied zwischen den Strukturen ist der β6-Loop. In OPR1 ist

diese Struktur sehr flexibel, was dazu führt, dass sie in der Röntgenkristallstruktur

nicht visualisierbar ist (Malone et al., 2005, Breithaupt et al, 2006 und Abbildung 9,

blau). In OPR3 hingegen zeigt sie sich der β6-Loop als unflexible fingerartige

Struktur (Breithaupt et al., 2006 und Abbildung 9, gelb).

1. Einleitung 10

Röntgenkristallstrukturen haben gezeigt, dass OPR3 als Homodimer kristallisiert

(Breithaupt et al., 2006 und Abbildung 11). Hierbei lagert sich die fingerartige

Struktur des β6-Loop eines OPR3 Protomers in das aktive Zentrum eines anderen

Protomers. Genauso lagert sich der β6-Loop des zweiten Protomers spiegelbildlich

in das Aktive Zentrum des ersten. OPR3 inhibiert sich also durch Dimerisierung

selbst (Breithaupt et al., 2006).

Abb. 11: Röntgenkristallstruktur von OPR3. Der Fingerartige β6-Loop des einen

Protomers (rot) interagiert in der substratbindenden Tasche des anderen Protomers

(gelb) und umgekehrt. Nach Breithaupt et al., 2006

Die Dimerisierung wird stabilisiert durch exponierte Aminosäuren. Direkt an der

Spitze des β6-Loop befindet sich ein Glutamat (Position 291), das direkt oberhalb

des Cofaktors FMN in der Substrat bindenden Tasche des aktiven Zentrums bindet

(siehe Abbildung 12). Hierdurch wird das Aktive Zentrum blockiert. Eine

Punktmutation dieser Aminosäure hat gezeigt, dass ein Ersetzen von Glutamat

durch Lysin dazu führt, dass OPR3 als Monomer kristallisiert. Außerdem konnte

gezeigt werden, dass das mutierte OPR3 Protein E291K einen sechsfach höheren

Substratumsatz hat als das nicht-mutierte OPR3. Eine Inhibierung der Aktivität

durch Homodimerisierung konnte somit nachgewiesen werden (Breithaupt et al.,

2006).

1. Einleitung 11

Abb. 12: Aktives Zentrum von dimerisiertem OPR3. In gelb und dunkelrot: jeweils

ein Protomer von OPR3. Markiert (roter Kreis) sind Aminosäuren, die für die

Dimerisierung wichtig erscheinen.

Eine weitere für die Dimerisierung wichtige Aminosäure ist Tyrosin an Position 364.

In der Röntgenkristallstruktur ist sichtbar, dass dieses Tyrosin ein Sulfat über

Wasserstoffbrücken bindet (Siehe Abbildung 12). Hierbei bindet das Sulfat auch an

2 Argininreste des einen Protomers und an einen weiteren Argininrest des anderen

Protomers, wodurch die Dimerisierung stabilisiert wird. Dieses Sulfat imitiert eine

Phosphatrestbindung eines phosphorylierten Tyrosinrestes. Wenn Tyrosin gegen

Phenylalanin ausgetauscht wird, wodurch die an Tyrosin vorhandene

Hydroxylgruppe fehlt, kristallisiert OPR3 als Monomer (Breithaupt et al., 2006). Da

OPR3 jetzt nicht mehr dimerisieren kann, scheint eine dauerhafte Aktivität gegeben

zu sein. Dies wirft die Hypothese auf, ob OPR3 in vivo möglicherweise auch durch

reversible Phosphorylierung reguliert werden kann.

Bereits vorausgegangene Experimente konnten zeigen, dass OPR3 Substrat einer

Tyrosin-spezifischen Protein-Kinase ist (Schaller A., unveröffentlicht). Western Blot

Analysen mit einem Phosphotyrosin-spezifischen monoclonalen Antikörper (Anti

PT-66) haben bewiesen, dass OPR3 effizient Phosphoryliert wird, wenn es mit

einer Tyrosin-Kinase in E.coli coexprimiert wird (Abbildung 13 und Stratagene,

TKB1). Es ist bekannt, dass bei einer Verwundung einer Pflanze der Spiegel an

Jasmonsäure ansteigt, ebenso steigt der Transkriptspiegel der Gene, die für

Proteinen kodieren, die in der Biosynthese von Jasmonsäure beteiligt sind (Stintzi

et al., 2001).

1. Einleitung 12

Dennoch ist die Kinetik der Transkriptinduktion nicht schnell genug, um für die

schnelle Akkumulation der Jasmonsäure nach Verwundung zu genügen. Dies

suggeriert, dass weitere Regulationsmechanismen für den anfänglichen Anstieg

von Jasmonsäure verantwortlich sind. Eine Möglichkeit wäre reversible

Phosphorylierung und Dephosphorylierung.

Abb. 13: In vivo Phosphorylierung eines OPR3-Proteins durch eine

Typrosinspezifische Protein Kinase im Expressionsvektor in E.coil. (Schaller,

unveröffentlicht)

1.5 Volatiles – Kommunikation unter Pflanzen

Flüchtige organische Substanzen (engl.: Volatile organic compounds, kurz VOCs)

sind Stoffe, die eine Pflanze gezielt freisetzt und die der Kommunikation dienen –

sei es nun spezifisch und dauerhaft um befruchtende Insekten anzulocken oder ad

hoc um Feinde eines fressenden Insekts herbeizurufen. Sie werden durch den

Herbivorbefall induziert und freigesetzt, aber auch eine mechanische Verwundung

ist zur Induktion ausreichend. Solche tritrophe Interaktionen sind in wenigstens

zwölf Pflanzenfamilien beschrieben worden (Frey et al., 2004).

Bei der Untersuchung der Wundreaktion in Maispflanzen auf Befall von Raupen

konnte festgestellt werden, dass durch in Raupenregurgitat enthaltene Enzyme

Linolensäure mit Glutamat zu Volicitin reagiert. Die Pflanze kann also reine

mechanische Verwundung von der Verwundung durch das Fressen einer Raupe

unterscheiden. Das entstehende Volicitin wird freigesetzt und lockt spezifisch einen

Fressfeind der Raupe an, während in der Pflanze selber der Oktadekanoidweg in

Gang gesetzt wird, um Jasmonsäure zu bilden und die systemische Wundantwort

gestartet wird. (Alborn et al., 1997). Auch Jasmonsäurederivate wie cis-Jasmon

können bei Verwundung der Pflanze freigesetzt werden und als VOCs wirken um

somit natürliche Feinde von biotischen Stressoren anzulocken (Farmer EE, 2003).

130 k

75 k

55 k

45 k

35 k

Coomassie Anti PT-66

OPR3 OPR3-(P) OPR3 OPR3-(P)

1. Einleitung 13

VOCs sind also unter anderem das Resultat einer Coevolution mit Insekten

(Dobson und Bergstrom 2002). Wie Pflanzen über VOCs mit Insekten

„kommunizieren“ legt die Vermutung nahe, dass sie ebenso untereinander

Informationen austauschen (Dicke et al., 2003). Zu den bekannten VOCs gehören:

Mono- und Sesquiterpene wie (E)-β-Ocimene und (S)-Linalool, Aromaten wie Indol

oder Methylsalicylsäure, und Oxylipine, die so genannten „green leaf volatiles“

(kurz GLVs) wie (Z)-3-Hexenal und (Z)-3-Hexenylacetat.

Green leaf volatiles (GLVs) sind C-6-Aldehyde, Alkohole und ihre Ester, die durch

den Hydroperoxid-Lyase-Weg des Oxylipin-Metabolismus hergestellt werden.

Pflanzen beginnen mit der Bildung von GLVs, nachdem sie mechanische

Verletzung an ihren Blättern erfahren haben, oder biotischem oder abiotischem

Stress ausgesetzt sind. Man vermutet, dass die Bildung von GLVs von einem

Schritt der Lipid-Hydrolyse reguliert wird, die freie Fettsäuren für den Syntheseweg

zur Verfügung stellt. Neuste Studien haben gezeigt, das GLVs eine physiologische

Bedeutung haben, außerdem konnte gezeigt werden, dass sowohl in der

Signalübertragung zwischen Pflanzen als auch in der Kommunikation mit anderen

Organismen, die die Signale aufnehmen können (Pichersky et al., 2006).

Wird eine Mais-Pflanze verletzt, so setzt diese GLVs frei. Unverwundete Mais-

Keimlinge werden daraufhin induziert, schnell Jasmonsäure zu produzieren und

Sesquiterpene auszuschütten. Außerdem produzieren Mais-Keimlinge signifikant

mehr Jasmonsäure und flüchtige Sesquiterpene nach mechanischer Verwundung,

wenn sie vorher GLVs benachbarter Pflanzen ausgesetzt waren (Engelberth et al.,

2004).

Bei Nicotiana attenuata (Baldwin et al., 2007) konnte jedoch kein Anstieg des

Jasmonsäurelevels festgestellt werden, nachdem die Pflanzen GLVs verwundeter

Pflanzen ausgesetzt waren. Transkriptom Analysen konnten zeigen, dass der

Spiegel an verschiedenen, der Jasmonsäure im Oktadekanoidweg vorgeschalteten

Proteinen einen erhöhten Transkriptionsspiegel gegenüber Kontrollpflanzen

aufwiesen, insbesondere solche, die in der Abwehrreaktion beteiligt sind wie OPR3

(Paschold et al., 2006). Obwohl also ein Transkript von OPR3 und vorgeschalteten

Proteinen im Oktadekanoidweg vorhanden ist, wird keine Jasmonsäure gebildet.

Eine Inaktivierung von OPR3 oder der vorgeschalteten Proteine, beispielsweise

durch reversible Phosphorylierung, wäre eine Möglichkeit die Bildung von

Jasmonsäure zu verhindern.

1. Einleitung 14

1.6 Ziel dieser Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine strukturelle Analyse durch zielgerichtete

Mutationen von OPR3 und OPR1. Beide unterscheiden sich strukturell hauptsächlich

im β3-Loop, der bei OPR1 über das Aktive Zentrum ragt und somit den Zutritt von

cis(+)OPDA erschwert. In OPR3 ist dieser Loop kleiner, so dass cis(+)OPDA das

aktive Zentrum erreichen kann. Es wurde versucht, durch Aminosäureaustausch in

OPR1 die gleiche Substratspezifität wie in OPR3 herzustellen. Hierzu wurden

Aminosäuren des β3-Loops in OPR1 durch die korrelierenden Aminosäuren aus OPR3

ersetzt. Dadurch sollte der Zugang von cis(+)OPDA zum aktiven Zentrum ermöglicht

werden. Opr3-defiziente Arabidopsis thaliana wurden mit den punktmutierten OPR1-

Proteinen transformiert. Wenn durch die Mutationen an OPR1 die gleiche

Substratspezifität wie OPR3 hergestellt werden kann, so ist die männliche Fertilität in

opr3-defizienten Arabidopsis thaliana wieder hergestellt.

Außerdem ist bekannt, dass OPR3 Proteine als Homodimere kristallisieren und sich

dadurch in vitro selbst inhibieren. Bisher ist unklar ob sich die Proteine auch in vivo

durch Homodimerisierung inhibieren und somit eine Regulation von OPR3 stattfindet

und welche Aminosäuren an der Dimerisierung beteiligt sind. Um dies zu untersuchen

wurden opr3-defiziente Arabidopsis thaliana mit Punktmutierten OPR3 cDNAs

komplementiert. Diese enthielten Punktmutationen im Dimerisierungsloop Lβ6, und an

einem Tyrosin in der Nähe des aktiven Zentrums, dessen Hydroxylgruppe zusammen

mit 3 Argininresten eine Phosphorylierung ausbildet um die Dimerisierung zu

stabilisieren. Von beiden punktmutierten Proteinen konnte bereits gezeigt werden,

dass sie in vitro als Monomere kristallisieren. Es sollte untersucht werden, ob in vivo

eine Dimerisierung ebenfalls verhindert wird, somit eine konstitutive Aktivität besteht

und wie diese sich auf die Pflanze auswirkt.

Des Weiteren wurde untersucht ob eine Phosphorylierung von OPR3 in vivo existiert,

und falls denn so, wann sie eintritt. Zu diesem Zweck wurden sowohl Tomaten als

auch Arabidopsis-Pflanzen verwundet und der Spiegel der Phosphorylierungen durch

Western Blot Analysen untersucht.

2. Material und Methoden 15

2. Material und Methoden

2.1 Organismen

2.1.1 Pflanzen

Arabidopsis thaliana Wassilewskija

Arabidopsis thaliana Wassilewskija opr3 TDNA Insert Mutante

Arabidopsis thaliana Wassilewskija opr1 TDNA Insert Mutante

Solanum lycopersicum Castlemart

2.1.2 Bakterien

Escherichia coli OPR3-His

Escherichia coli OPR1-His

Escherichia coli OPR3-His mit TKB1 Vektor

Escherichia coli DH10B (Invitrogen)

Escherichia coli XL-1 blue (Stratagene)

Agrobacterium tumefaciens GV 3101 mit pSoup

2.2 Vektoren und Plasmide

pCR®2.1-Topo® Vektor für schnelle und effiziente Ligation von PCR-

Produkten mit T/A Überhang. (Abb. 14)

pGreen 0229 mit einem Fusionsprotein DsRED-OPR3 unter der Kontrolles des

Promotors von OPR3 (Abb. 15)

pSoup Vektor für Pflanzentransformation via Agrobakterien. Ermöglicht

pGreen-Replikation mit Hilfe des Replikationsproteins RepA


Abb. 14: Karte des pCR®2.1 Topo® Vektor

Abb. 15: Aufbau des Vektors pGreen 0229 OPR3 prom DsRED-OPR3

2130 bp

Sac

I(14

96)

Sac

II(1

487)

Not

I(14

75)

Xba

I(14

68)

Spe

I(14

62)

Bam

HI(

1456

)S

maI

(145

2)P

stI(

1448

)E

coR

I(14

38)

Eco

RV

(143

4)H

indI

II(1

426)

Cla

I(14

21)

Sal

I(14

11)

Xho

I(14

05)

Apa

I(14

00)

Kpn

I(13

94)

BglII

pSa-oriColEI ori

nptI

PvuI

BspHI

BspHI

pGreenII plasmid backbone2495 bp

nos-BarRB LBlacZ

BglII(1956)

BglII(3)

T-DNA (1959)

NotI

SacII SpeI Bam NotI1180 bp

PstI KpnI KpnIT 282

AtOPR3 prom AtOPR3 cDNARFP 7502130 bp

Sac

I(14

96)

Sac

II(1

487)

Not

I(14

75)

Xba

I(14

68)

Spe

I(14

62)

Bam

HI(

1456

)S

maI

(145

2)P

stI(

1448

)E

coR

I(14

38)

Eco

RV

(143

4)H

indI

II(1

426)

Cla

I(14

21)

Sal

I(14

11)

Xho

I(14

05)

Apa

I(14

00)

Kpn

I(13

94)

BglII

pSa-oriColEI ori

nptI

PvuI

BspHI

BspHI


nos-BarRB LBlacZ

Sac

I(14

96)

Sac

II(1

487)

Not

I(14

75)

Xba

I(14

68)

Spe

I(14

62)

Bam

HI(

1456

)S

maI

(145

2)P

stI(

1448

)E

coR

I(14

38)

Eco

RV

(143

4)H

indI

II(1

426)

Cla

I(14

21)

Sal

I(14

11)

Xho

I(14

05)

Apa

I(14

00)

Kpn

I(13

94)

Sac

I(14

96)

Sac

II(1

487)

Not

I(14

75)

Xba

I(14

68)

Spe

I(14

62)

Bam

HI(

1456

)S

maI

(145

2)P

stI(

1448

)E

coR

I(14

38)

Eco

RV

(143

4)H

indI

II(1

426)

Cla

I(14

21)

Sal

I(14

11)

Xho

I(14

05)

Apa

I(14

00)

Kpn

I(13

94)

BglII

pSa-oriColEI ori

nptI

PvuI

BspHI

BspHI


nos-BarRB LBlacZ nos-BarRB LBlacZ

BglII(1956)

BglII(3)

T-DNA (1959)

NotI

SacII SpeI Bam NotI1180 bp

PstI KpnI KpnIT 282

AtOPR3 prom AtOPR3 cDNARFP 750


2.3 Oligonukleotide

Primer wurden von Operon Biotechnologies (Köln) bezogen.

Primer Sequenz (5’ → 3’-Orientierung)

Primer M13 M13 reverse CAG GAA ACA GCT ATG AC

M13 forward GAC CGG CAG CAA AAT G

OPR3

primer

5mutLeOPR3 (34) Spe I

ACT AGT ATG GCG TCT TCA GCT CAA GAT

3mutLeOPR3 (35) Pst I

CTG CAG TCA CAG ACG CGA TAA CGG TCC A

OPR1

primer

5mutLeOPR1 (36)

Spe I

ACT AGT ATG GAA AAT AAA GTC GTT GAA GA

3mutLeOPR1 (37) Pst I

CTG CAG TCA CAG ACG CGA CGA CGG

TGTCATGGTTTCTAGAAATGGA

OPR1_876R (876) ATC GAT GGT ACC CAA CGA TTG GCT TCC

ATG CCT CCA

Mutations-

primer

LeOPR1Y74F-For TAT CTG AGA CTG GCA TAG GGT TTA AAG

ATG TAC CTG GTA TAT GG

LeOPR1Y74F-Rev

CCA TAT ACC AGG ATC TTT AAA CCC TAT

AGT CTC AGA TA

LeOPR1Y244H-For TAT CCC CAT TTG CGC ATC ATA ATG AAG

CAG GGG AC

LeOPR1Y244H-Rev

GTG CCC TGC TTC ATT ATG ATG CGC AAA

TGG GGA TA


ß-Tubulin

(TuB4)

TuB4F TGA GGA AGG AAG CTG AGA AC

TuB4R ATA CAC TCG TCA GCG TTT TC

OPR3

Promotor

1612 GCT AAT GAC CTA TCA ATG TAC

2.4 Enzyme

Calf intestine alkaline Phosphatase (CIAP) Fermentas

Ligase (T4-DNA-Ligase) Fermentas

Polymerase

(T4-DNA-Polymerase)

Fermentas

Proteinase K Fermentas

RNAse A Fermentas

Restriktionsenzyme Fermentas

Taq-DNA-Polymerase PEQLAB,

Erlangen, 5 Units/µl


2.5 Antikörper

2.5.1 Primäre Antikörper

Anti-AtOPR1 polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen

Anti-AtOPR3 polyklonaler Antikörper aus dem Kaninchen

beide Antiseren wurden freundlicherweise

von Dr. Florian Schaller zur Verfügung

gestellt.

Anti-AOS Serum polyklonales Antikörperserum aus dem

Kaninchen

Anti Phosphotyrosin PT-66 monoklonaler Antikörper aus der Maus

Lot:086K4751 (Sigma)

2.5.2 Sekundäre Antikörper

Anti- Rabbit IgG Peroxidasekonjugierter Antikörper aus der

Ziege (Calbiochem)

Anti-Mouse IgG Peroxidasekonjugierter Antikörper aus der

Ziege (Calbiochem)


2.6 Chemikalien und Verbrauchsmaterial

Soweit nicht anders angegeben, wurden Chemikalien von Roth (Karlsruhe) und Merck

(Darmstadt), Medien, Vitamine, Antibiotika und Agar von Duchefa (Haarlem),

Plastikverbrauchsmaterialien wie Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße von der Firma

Sarstedt (Nümbrecht) und Petrischalen von Greiner bio-one (Kremsmünster) bezogen.

Acrylamid-Rotiphorese Gel 40 Roth

6-Aminohexansäure Merck

AmmoniumPer(oxid)Sulfat (APS) Roth

Bradford Reagenz (Protein Assay) Roth

BugBuster Novagen

Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) Roth

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth

dNTPs MBI-Fermentas

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Fluka AG

Ethidiumbromid Roth

Formaldehyd Roth

GeneRuler™1kb DNA bzw100bp DNA Ladder. Fermentas

Kanamycin A Monosulfat Duchefa

LB Broth Low Salt Duchefa

ß-Mercaptoethanol Serva

Methyljasmonat Serva

Miracloth Calbiochem

Natriumdodecylsulfat (SDS) Fluka AG

Natriumthiosulfat Roth

Natiumorthovanadate Baack

PageRulerTM Prestained Protein Ladder Fermentas

Rifampicin Duchefa

Röntgenfixierer Kodak

Röntgenentwickler Kodak

Silwet L-77 Lehle Seeds, Round Rock

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth

Tetracyclin Duchefa

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Roth

Triton-X 100 Roth

Tween 20 Fluka AG

Tricine Roth

Xylen Cyanol Serva


2.7 Laborgeräte

Blotting-Apparatur LKB-Bromma/Pharmacia

Computerprogramme CaryWinUV (Varian Instruments, Walnut Creek)

Digitalkamera Nikon, Coolpix995

Digitalkamera für Mikroskop

und Stereomikroskop

Spot RT, Visitron Systems

Elektroporator EQUIBIO, Easyjec T

Elektrophorese-Kammer

für Agarosegele

EasyCast Electrophoresis Systems Owl Scientific, Inc.

Elektrophorese-Kammer

für Proteingele

BioRad

Fraktionatoren H.Hölzel (Hörlkofen bei Erding)

Gradientenmischer für Lineare Gradienten

H.Hölzel (Hörlkofen bei Erding)

PCR-Maschine BioRad MyCycler

Rotoren Eppendorf F 45-30-11

Eppendorf A 4-81

HB-5, Sorvall

F14, Sorvall

SW 27, Sorvall

AH 650, Sorvall

Schüttler Multitron HT Infors

Stereomikroskope Zeiss SV11

Hund SM33

UV-Vis Spektrophotometer Carry100Bio, Varian

Eppendorf bioPhotometer 6131

Zentrifugen Ultracentrifuge OTD-COMBI, Sorvall

5402, Eppendorf

Microspin 24, Sorvall

5810R, Eppendorf

RC 5B Plus, Sorvall


2.8 Antibiotika und Medien

2.8.1 Stammlösungen Antibiotika

Ampicillin 100 mg/ml in ddH2O,

Endkonzentration 100 µg/ml

Kanamycin 50 mg/ml in ddH2O,

Endkonzentration 50 µg/ml

Tetracyclin 12,5 mg/ml in 70 % EtOH

Endkonzentration 12,5 µg/ml

Alle Antikörper wurden sterilfiltriert und bei -20°C gelagert.

2.8.2 Medien

LB-Medium 2 % LB Broth (w/v)

für LB-Platten zusätzlich 1,2 % (w/v) Agar

SOC- Medium 2 % Bacto Tryptone (w/v)

0,5 % Bacto Yeast Extrakt (w/v)

10 mM NaCl

2,5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM Glucose

pH 6.8 - 7.0 mit NaOH


2.9 Allgemeine Methoden mit Pflanzen

2.9.1 Anzucht von Tomaten

Tomatensamen wurden bei 70°C über Nacht (ÜN) inkubi ert. Anschließend wurden sie

mit 70 % EtOH gewaschen und für 3 h in 10 % Trinatriumphosphat inkubiert. Nach

mehrmaligem Waschen (5 mal 10 min) der Samen mit ddH2O wurden sie im

Gewächshaus bei einer Photoperiode von 12 h angezogen.

2.9.2 Anzucht von Arabidopsis thaliana

Trockene Samen wurden zur Behandlung gegen Thripsen für 2-3 Stunden bei -70°C

gelagert, bevor sie für 48-72 Stunden in 0,1% Agar bei 4°C stratifiziert wurden und bei

einer Photoperiode von 12 h angezogen wurden.

2.9.3 Transformation von Arabidopsis thaliana mit der „floral dip“

Methode

Saccharose-Lösung 5 % Saccharose

0,03 % Silwet L-77

Jasmonsäure zum Besprühen 0,03 % Methyljasmonsäure

0,1 % Tween 20

Basta 35 mg/l

5 l pro Pflanzkasten

4 ml LB-Flüssigkultur eines Agrobaterium tumefaciens Stammes, der das zu

transformierende Konstrukt enthielt, wurde 2 Tage bei 28 °C im Wasserbadschüttler

angezogen und anschließend für 2 weitere Tage mit einem tausendstel Volumen in

400 ml LB-Medium angeimpft.


Bei einer OD600 von 1 wurde die Kultur bei 3400 x g für 30 min abzentrifugiert, der

Überstand abgenommen und das Pellet in 300 ml Saccharoselösung aufgenommen.

Der primäre Sproß der zu transformierenden opr3-Arabidopsis-Pflanzen wurde

abgeschnitten um die Bildung von Sekundärsprossen zu fördern. Sobald diese einen

Blütenstand von 2-10 cm erreicht hatten wurde die Transformation durchgeführt.

Hierzu wurden alle Blühorgane für einige Sekunden in die Bakteriensuspension

getaucht. Um eine Transformation der noch nicht blühenden Sekundärsprosse zu

ermöglichen, wurden einige Tropfen der Bakteriensuspension auf die Rosette getropft.

Die transformierten Pflanzen wurden gut gewässert und für 2 Tage mit einer

Plastikhaube luftdicht verpackt. Die hohe Luftfeuchtigkeit erhöht die Transformations-

rate.

Im Falle einer opr3-Mutanten Pflanze, die männlich steril ist, wurden die

transformierten Pflanzen wurden alle 2 Tage mit Jasmonsäurelösung besprüht um die

Fertilität der Pollen wieder herzustellen. Nach der Fruchtreife wurden alle Samen

geerntet und auf Basta getränkter Erde ausgelegt. Samen, die das Konstrukt

enthielten besaßen eine Resistenz gegen Basta und konnten wachsen. Sobald die

Keimlinge 2 bis 4 Blätter besaßen wurden sie auf normale Erde umgesetzt.

2.9.4 Pollenkeimungstest

Keimungsmedium 17% Saccharose

2 mM CaCl2

1,65 mM H3BO4

pH 7.0 mit NaOH

0,6% Agar

In 90 mm Petrischalen gießen

und erkalten lassen

Von je 6 Blüten im Stadium 13 (Bowman et al., 1991) einer Pflanze wurden, bis auf die

Antheren alle Blütenorgane entfernt. Die Pollen wurden durch Tupfen auf dem

Pollenkeimungsmedium verteilt und für 24 Stunden im Dunkeln gelassen. Ca 300

Pollen jeder Blüte wurden unter dem Mikroskop gezählt auf Keimung untersucht.


2.10 Molekularbiologische Techniken mit DNA

2.10.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

5x PCR Puffer 15 mM Magnesium Chlorid

100 mM Ammoniumsulfat

0,08% (v/v)Triton-X 100

20% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO)

50 mM Tris/HCl pH 8.3

0,4% (v/v) Tween® 20

dNTPs 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP

Taq 5 Units / µl

Die Standard-PCR wurde in einem Volumen von 25 µl durchgeführt. Bestandteile

waren je: 5 µl 5x PCR-Puffer, 0,5 µl 10 mM dNTP’s, 1 µl thermostabile Taq-DNA-

Polymerase und je 0,5 µl 10 µM Forward- bzw Reverse-Primer. Die Menge an

Template-DNA variierte je nach Ausgangsmaterial. Von Plasmid-DNA wurden 1 µl

einer 1:10 Verdünnung, bei genomischer DNA 1 µl unverdünnt verwendet.

Je nach Primerkombination wurden verschiedene Annealingtemperaturen gewählt. Die

Elongationszeit wurde entsprechend der Länge des zu amplifizierenden Produktes

gewählt. Die DNA-Polymerase amplifiziert etwa 1 kb/min.

Die verschiedenen Bedingungen sind in Abb. 16 und Tab. 1 dargestellt.


95°C 95°C2 min 30 sec 72°C 72°C

xx min 7 min

xx °C40 sec

10°C1x 25-35x 1x ∞

Abb. 16: Temperatur und Dauer der einzelnen Schritte einer PCR

Tab. 1: Verwendete Annealingtemperaturen und Elongationszeiten in Abhängigkeit der

Spezifischen Primerkombinationen

Primerkombination Annealingtemperatur Elongationszeit Zyklen

OPR3 komplett 34/35 58°C 75 sec 30

OPR1 komplett 36/37 58°C 75 sec 30

Tubulin

(Ladekontrolle)

TuB4F/TuB4R 50°C 40 sec 35

Nachweis der OPR1 Konstrukte

OPR1+SRL 1612/OPR1_876R 58°C 120 sec 35

OPR1Y74F 1612/Y74Frev 58°C 120 sec 35

OPR1Y244H 1612/Y244Hrev 58°C 120 sec 35

Nachweis der OPR3 Konstrukte

OPR3 1612/ 35 58°C 120 sec 35

E291K 1612/ 35 58°C 120 sec 35

Y364F 1612/ 35 58°C 120 sec 35

PCR Produkte wurden vor der weiteren Verwendung mit dem QIAquick® PCR

Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt.


2.10.2 Auftrennung und Sichtbarmachen von DNA durch

Gelelektrophorese

TAE-Puffer 40 mM Tris,

20 mM Essigsäure,

1 mM EDTA

14 µg/l Ethidiumbromid

pH 8.0 mit HCl

DNA-Ladepuffer

Bromphenolblau (10-fach)

50 % Glycerin,

1 mM EDTA,

1 Spatelspitze Bromphenolblau

für 20 min autoklaviert, und bei RT

aufbewahrt

DNA-Ladepuffer

Xylen-Cyanol (10-fach)

50 % Glycerin

1 % Xylen Cyanol

für 20 min autoklaviert und bei RT

aufbewahrt

Größenstandard GeneRuler™ 1 kb bzw.100 bp DNA

Ladder (Fermentas)

1% TAE Agarosegel 1 g Agarose elektrophoresis grade

(Duchefa) auf 100 ml TAE Puffer

Um DNA-Fragmente ihrer Größe nach aufzutrennen wurden sie nach Zugabe von 1/10

Volumen eines 10x Ladepuffers auf 1%ige TAE-Agarosegele geladen. Für Fragmente

einer Größe von unter 500 bp wurde Xylen-Cyanol Puffer, für größere Fragmente

wurde Bromphenolblau verwendet. Die Auftrennung erfolgte bei 80-120 V für 30-60

Minuten. Das Gel wurde anschließend unter UV-Licht betrachtet und fotografisch

dokumentiert.


2.10.3 Restriktionsverdau

Restriktionsverdaue wurden meistens in einem Volumen von 20 µl durchgeführt. Der

Ansatz beinhaltete 1 µg Plasmid-DNA, 1/10 bis 1/5 des Endvolumens an

entsprechendem Restriktionsenzympuffer, und 0,5 µl Restriktionsenzym (10 U/µl).

Nach einer 2 - 2,5stündigen Inkubation bei 37°C wu rden der komplette Ansatz zur

Kontrolle des Verdaus gelelektrophoretisch aufgetrennt.

2.10.4 DNA-Gelextraktion

In TAE-Agarosegelen aufgetrennte DNA-Fragment wurden aus dem Gel

herausgeschnitten und mit dem QIAquick® Gel Extraktions Kit (Qiagen) nach den

Anweisungen des Herstellers extrahiert.

2.10.5 Klonierung

2.10.5.1 Klonierung in pCR 2.1 TOPO Vektor (Invitro gen)

Aufgereinigte DNA-Fragmente wurden zuerst in den pCR2.1-Topo®-Vektor (siehe

http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf) nach dem Protokoll

des Herstellers (Invitrogen) kloniert.

2.10.5.2 Klonierung in pGreen 0229

Für eine Ligation von Vektor und Insert müssen diese mit Restriktionsenzymen so

geschnitten worden sein, dass die Überhänge sich aneinander lagern können. Eine

Dephosphorylierung des Vektors mittels Alkalischer Phosphatase verhindert eine

Selbstligation. Dafür wurden zu dem Plasmid 1 µl CIAP zugegeben und der Ansatz für

1 h bei 37°C inkubiert. Die Inaktivierung der Phosp hatase erfolgte für 10 min bei 75°C.

Für eine Ligation wurde ein molares Vektor-Insert Verhältnis von 1:5 gewählt. Die

Ligationsansätze besaßen ein Endvolumen von 15-20 µl und enthielten neben Vektor

(meinst 1 µl) und Insert, (1-6 µl) 1x Ligase-Puffer mit ATP und 1 U T4-DNA-Ligase. Die

Ligation wurde entweder in der PCR-Maschine (8 h bei 16°C, 60 min bei 30°C, 10 min

bei 65°C) oder bei Raumtemperatur (RT; Inkubation f ür 2 h) durchgeführt


2.10.6 Transformation durch Elektroporation

Zu 40 µl elektrokompetenten Bakterien E.coli DH10B (Invitrogen) oder XL-1 blue

(Stratagene), die auf Eis aufgetaut wurden, wurde 1 µl des Ligationsansatzes

pipettiert, vorsichtig gemischt und eine Minute auf Eis ruhen gelassen. Der Ansatz

wurde in vorgekühlte Elektroporationsküvetten mit 1 mm Elektrodenabstand überführt.

Die Elektroporation wurde mit den Parametern 2500 V, 15 µF, 335 Ω durchgeführt,

sofort 960 µl SOC Medium zugefügt und für 1h bei 37°C unter Schütteln inkubiert.

Anschließend wurden die Bakterien auf einem Selektionsmedium ausplattiert und bei

37°C über Nacht inkubiert. Die Inkubationstemperatu r bezieht sich auf die

Transformation von E. coli XL1-Blue bzw E. coli DH10b. Bei der Transformation von

Agrobacterium tumefaciens erfolgten alle Inkubationen bei 28°C.

2.10.7 DNA Extraktion

2.10.7.1 Plasmid DNA Extraktion aus E.coli

Lösung I 25 mM Tris pH 7.5 mit HCl

50 mM Glucose

50 mM EDTA

Lösung II 0,4 N NaOH

4 % SDS

getrennt ansetzen und kurz vor

Gebrauch 1:1 mischen

Lösung III 5 M Kaliumacetat

pH 5.5 mit Eisessig

Lösung IV 3 M Natriumacetat

pH 5.2 mit Eisessig


TE Puffer 10 mM Tris, pH 8.0 mit HCl

1mM EDTA

Pankreatische RNase 10 mg/ml in TE

10 min bei 85°C inkubieren zum

Inaktivieren von DNasen

TE Puffer gesättigtes Phenol,

Chloroform,

Phenol/Chloroform 1:1

Transgene Bakterien wurden in ca. 4 ml LB Medium mit entsprechendem

Selektionsantibiotikum unter Schütteln bei 37°C übe r Nacht angezogen. 1,5 ml der

Kultur wurden in ein Eppendorf gegeben und abzentrifugiert (20.000 x g, 2 min, RT).

Der Überstand wurde vollständig entfernt und das erhaltene Bakterienpellet in 100 µl

Lösung I resuspensiert. Anschließend wurden 150 µl Lösung II zugegeben, vorsichtig

gemischt und 5 min auf Eis stehen gelassen. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III

wurde erneut gut gemischt und für weitere 5 min auf Eis inkubiert. Das Gemisch wurde

5 min bei 4°C und 20.000g abzentrifugiert. Der erha ltene Überstand (400 µl) wurde

vorsichtig abpipettiert und die DNA mit dem doppelten Volumen (800 µl) eiskalten

Ethanol für 15-30 min auf Eis gefällt. Nachdem für 15 min bei 4°C und 20.000 g

zentrifugiert wurde, wurde der Überstand vollständig verworfen und das Pellet in 200

µl TE Puffer gelöst. Zum Verdau der RNA wurde außerdem 1 µl pankreatische RNase

zugesetzt und bei 37°C für 30 min inkubiert. Die Re inigung der Plasmid-DNA erfolgte

durch Ausschütteln mit 200 µl Phenol/Chloroform und nochmals mit 200 µl Chloroform,

wobei nach beiden Extraktionen für jeweils 2 min zentrifugiert wurde. Hierbei wurde

nur die Oberphase in ein neues Eppendorfgefäß überführt wurde. Es folgte eine

erneute Fällung mit dem 2,5 fachen Volumen eiskalten Ethanols (550µl) und 20µl

Natriumacetat (Lösung IV) auf Eis für 15 min. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 4°C

und 20.000 g wurde der Überstand vollständig verworfen, das Pellet mit 70%

eiskaltem Ethanol (500 µl) gewaschen und bei 37°C g etrocknet. Abschließend wurde

das Pellet in 30 µl TE Puffer gelöst und bei -20°C aufbewahrt.


2.10.7.2 Plasmid DNA Extraktion aus Agrobacterium tumefaciens

Die Plasmidextraktion aus Agrobakterien zur Überprüfung des Konstruktes wurde wie

die oben beschriebene Plasmidextraktion aus E. coli durchgeführt, allerdings nur bis

zur ersten ethanolischen Fällung. Das erhaltene Pellet wurde in 30 µl TE-Puffer gelöst

und konnte mit Restiktionsenzymen verdaut werden.

2.10.7.3 Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana

DEX-Puffer 0,14 M Sorbitol

0,22 M Tris pH 8.0 mit HCl

0,222 M EDTA

0,8 M NaCl

0,8% CTAB

1% Sarcosine (w/v)

Autoklavieren, bei RT aufbewahren.

Vor Gebrauch 20 µl ß-Mercaptoethanol

pro ml frisch zugeben.

Bei -70°C gelagerte Blattproben wurden schnell zerr ieben, mit 100 µl DEX-Puffer

versetzt und bis zum tauen des Materiales weiter zerrieben. Es wurden 100 µl

Chloroform zugegeben und nach zehnsekündigem Mischen für 30 Minuten bei 65°C

inkubiert. Nach einer Zentrifugation bei 16 000 x g für fünf Minuten (RT) wurde der

Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt und die DNA mit 100 µl

Isopropanol gefällt. Nach einer weiteren 5-minütigen Zentrifugation bei 16 000 x g

wurde das Pellet mit 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 30 µl TE-Puffer

resuspendiert. Die Lagerung der DNA erfolgt bei –20°C.


2.10.8 Zielgerichtete Mutagenese

Die Ortspezifische Mutagenese dient der gezielten Mutation, Deletion oder Insertion

einzelner Basen eines Genes. Dies erfolgt während einer PCR-Reaktion mit Hilfe

spezifischer Primer, die an die Region um die zu mutierenden Basen binden, jedoch

an der Stelle der einzuführenden Mutation die geänderte Baseabfolge enthalten. Die

Reaktionen wurden mit dem Stratagen QuikChange® Site-directed Mutagenesis Kit

durchgeführt. Abbildung 17 verdeutlicht die einzelnen Schritte der Reaktion.

Als DNA Matrize dient hierbei keine genomische DNA, sondern zirkuläre Plasmid-

DNA, welches das zu mutierende Gen enthält. Laut Protokoll sollten hierfür zwischen

10 und 50 ng eingesetzt werden, die effizientere Mutagenese fand aber mit 50 ng statt,

daher wurden alle folgenden Reaktion mit 50 ng durchgeführt.. Das gesamte Plasmid

wurde amplifiziert. Hierfür wurde eine „proof-reading“ DNA Polymerase verwendet

(PfuTurbo DNA Polymerase). Um die Matrize später von den neuen, mutierten

Plasmiden zu unterscheiden, muss Plasmid-DNA eines dam+ E. coli Stammes

verwendet werden. Diese enthalten methylierte GATC-Abschnitte im Genom, die vom

Restriktionsenzym Dpn I (10 Units/µl) verdaut werden können. Nach der PCR

Reaktion fehlt den neu amplifizierten Plasmide diese Methylierung und sie werden

nicht verdaut.

Die für die Mutagenese verwendeten Primer müssen verschiedene Parameter erfüllen:

Sie sollten zwischen 25 und 45 Basen lang sein, mit einer Schmelztemperatur über

78°C.

Die gewünschte Mutation sollte sich in der Mitte der Primer befinden, so dass noch

mindestens 10-15 Basen an beiden Seiten des Primers an die Matrize binden

können.

Beide Primer müssen die gewünschte Mutation beinhalten und sich über ihre

gesamte Länge überlagern.


Die Menge der Primer liegt bei 125 ng pro Reaktion. Die Mutagenese PCR läuft über

weniger Zyklen als eine normale PCR je nachdem, ob nur Punktmutationen

vorgenommen werden (12 Zyklen), ob Aminosäuren ausgetauscht werden (16) oder

ob Deletionen oder Insertionen vorgenommen werden (18). Im vorliegenden Fall

wurden Reaktionen mit 15 und 17 Zyklen durchgeführt, wobei eine höhere Zyklenzahl

eine effizientere Mutagenese zur Folge hatte. Mehr Zyklen sind, laut Anleitung von

Stratagen, nicht effizienter, da durch die Amplifikation des gesamten Plasmides keine

geschlossenen Plasmide entstehen, die also auch nicht als Matrize dienen können.

Dementsprechend ist die Vermehrung der Plasmide nicht exponentiell wie bei einer

normalen PCR, sondern linear.

Abb. 17: Prinzip der Zielgerichteten Mutation


Die Reaktionsparameter im Einzelnen:

5 µl 10X PCR Puffer (aus Kit)

10-50 ng Zirkuläre DNA

Je 125 ng 3’ und 5’ Primer

1 µl dNTP Mix (aus Kit, Konzentration Betriebsgeheimnis)

1 µl PfuTurbo DNA Polymerase (2,5 U/µl, aus Kit)

Mit sterilfiltriertem ddH2O auf 50 µl auffüllen

Die Elongationstemperatur betrug nicht, wie bei einer normalen PCR 72°C sondern

nur 68°C, die Elongationszeit wurde entsprechend de r Größe des Plasmides gewählt.

Für ein 5 kb großes Plasmid, wie in den hier durchgeführten Experimenten, benötigt

man eine 5-minütige Elongation bei 68°C.

Direkt nach der PCR wurden die Reaktionsgefäße auf Eis gekühlt und sofort 1 µl Dpn I

Restriktionsenzym zugegeben. Der Verdau wurde für eine Stunde bei 37°C

durchgeführt. 1 µl der nach dem Verdau noch verbleibenden Plasmide wurden mittels

Elektroporation (siehe Abschnitt 2.10.6) in kompetente E.coli XL1-Blue transformiert.

Zur Überprüfung der Mutationen wurden die Plasmide sequenziert.

2.10.9 DNA-Sequenzierung

Die Sequenzierung der DNA Fragmente wurde von der Firma 4baselab in Reutlingen

übernommen. Dazu wurden 50 ng DNA eingereicht.


2.11 Molekularbiologische Techniken mit Proteinen

2.11.1 Gradientenzentrifugation / Zellorganellfrakt ionierung

Tricinepuffer 0,15 M Tricine

1 mM EDTA

10 mM Kaliumchlorid

1 mM Magnesiumchlorid

10 mM Natriumsulfat

0,1 % BSA (w/v)

12% Saccharose

pH 7.5 mit NaOH konz.

Saccharosegradient 30% Saccharose (w/v)

65% Saccharose (w/v)

Für große Mengen Pflanzenmaterial (3-10 g) wurden jeweils 12 ml der 30%igen und

65%igen Saccharoselösungen in die zwei Kammern eines Gradientenmischers

gegeben und in ein 36 ml Zentrifugenröhrchen (Beckmann) geschichtet.

Für Mengen unter 3 g Blattmaterial wurden jeweils 2 ml der Saccharoselösungen

verwendet und der Gradient in ein 5 ml Zentrifugenröhrchen (Sorvall) geschichtet. Die

so gegossenen Gradienten wurden über Nacht bei 4°C gelagert.

Arabidopsis-Pflanzen wurden geerntet, abgewogen und im Verhältnis 1:2 mit

Tricinepuffer und einer Spatelspitze Seesand homogenisiert. Diese wurde durch 4

Lagen Miracloth gefiltert und der Überstand (3-12 ml für 36 ml Gradient, 100-600 µl für

5 ml Gradient) vorsichtig auf einen Gradienten geschichtet. Die Auftrennung der

Zellorganellen erfolgte mit einem Swingout Rotor in der Ultrazentrifuge bei 61 000 x g

für 3 Stunden bei 4 °C unter Vakuum. Der Gradient w urde von unten mit einer Kanüle

angestochen und Fraktionen in Eppendorfgefäßen aufgefangen. Die Größe der

Fraktionen betrug bei den 36 ml Gradienten jeweils 2 ml, bei den 5 ml Gradienten

jeweils 250 µl. Der Saccharosegehalt der einzelnen Fraktionen wurde mit Hilfe eines

Refraktometers bestimmt.


2.11.2 Katalaseaktivität

Kaliumphosphatpuffer 100 mM Kaliumdihydrogenphosphat

100 mM Dikaliumhydrogenphosphat

werden gemischt, bis pH 7.0 erreicht ist.

10 mM H2O2

Die Messung der Katalaseaktivität dient zur Lokalisation von Peroxisomen in

Fraktionen eines Gradienten. Je 20 µl der Fraktionen wurden zu 980 µl

Kaliumphosphatpuffer mit frisch zugesetztem H2O2 gegeben. Der Abbau von H2O2

wurde über 20 min spektrophotometrisch bei 240 nm gemessen. Über die Steigung

der erhaltenen Kurve ließ sich auf die relative Aktivität der Katalase schließen.

2.11.3 Proteinexpression und Aufreinigung

Binding-Puffer 50 mM Natriumdihydrogenphosphat/

Dinatriumhydrogenphosphat

werden gemischt, bis pH 8.0 erreicht ist.

300 mM Natriumchlorid

10 mM Imidazol

4 mM Benzamidin

Lyse-Puffer Bug Buster Mix (Novagene)

mit 1 Spatelspitze DNAseI


Elutionspuffer 50 mM Natriumdihydrogenphosphat

50 mM Dinatriumhydrogenphosphat

wurden gemischt, bis pH 8.0 erreicht war.

300 mM Natriumchlorid

200 mM Imidazol

4 mM Benzamidin

Je eine Kolonie eines Bakterienstammes, der mit einem Expressionsplasmid mit

OPR1, OPR3 bzw TKB1 transformiert war, wurde in einem selektiven LB-Medium als

Vorkultur über Nacht bei 37°C angeimpft.

Die Hauptkulturen (200 ml Medium mit Antibiotika entsprechend der Vorkultur im 1l

Erlenmeyerkolben) wurden mit 2 ml der Vorkultur angeimpft und bis zu einer OD600=1

bei 37°C im Schüttler bei 200 rpm inkubiert. Die Ku ltur wurde auf 30 °C

heruntergekühlt und die Expression durch die Zugabe von 1ml 100mM IPTG induziert.

Nach 4 Stunden wurde ein 300 µl Aliquot genommen und die Zellen abzentrifugiert.

Zu den sedimentierten Bestandteilen der Expressionskulturen wurde die 5-fache

Menge (w/v) BugBuster Mix zugegeben und das Pellet durch Pipettieren

resuspendiert. Die Suspension wurde danach für 20 Minuten auf einem

Eppendorfschüttler (150 rpm) bei Raumtemperatur inkubiert, 20 Minuten bei 16000 x g

und 4 °C zentrifugiert, der Überstand in ein neues Gefäß überführt und sofort bei 4 °C

aufgereinigt. Wurde die Aufreinigung nicht sofort durchgeführt, so wurde der

Aufschluss bei -80 °C gelagert.

Die Aufreinigung der Proteine erfolgte mit Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA)Agarose

Säulchen. 2,3 ml Ni-NTA-Agarose wurden in eine leere Säule gegeben und der

Lagerungspuffer ablaufen gelassen. Anschließend wurde drei Mal mit je 8 ml Binding

Puffer gewaschen. Auf die Säule wurde der Protein-Extrakt aus dem BugBuster

Aufschluss gegeben und 1 Stunde bei 4 °C im Überkop fschüttler durchmischt.

Nachdem die His-Tags der Proteine an die Säulenmatrix binden konnten, wurde der

Bindungpuffer ablaufen gelassen (Probe Durchfluss). Die Säule wurde anschließend

dreimal mit je 4 ml Bindingpuffer (Wasch1; Wasch2, Wasch3) gewaschen. Das

gebundene Protein wurde in drei Elutionsschritten mit je 750 µl Elutionspuffer (Elution1,

Elution2, Elution3) von der Säule eluiert.


Die Säule wurde drei mal mit je 8 ml Bindingpuffer gewaschen und für eine dauerhafte

Lagerung zuletzt mit 4 ml 30 % Ethanol gespült und in 4 ml 30 % Ethanol bei 4 °C bis

zur nächsten Anwendung aufbewahrt. In Abbildung 18 sind die einzelnen Wasch- und

Elutionsschritte sowie die zugehörige Coomassie gefärbte SDS-Page gezeigt.

Um das Expressionsprodukt innerhalb der Fraktionen zu identifizieren wurde eine

Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) durchgeführt um

Qualität und Reinheit des Proteins zu überprüfen (siehe Abschnitt 2.11.6.). Die

Quantifizierung des Protiengehaltes in den einzelnen Fraktionen erfolgte nach

Bradford (siehe Abschnitt 2.11.5) M

arke

r

Roh

extr

akt

Dur

chflu

ss

Was

ch 1

Was

ch 2

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Abb. 18: Durchfluss, Waschschritte und Elutionsschritte der Proteinreinigung von OPR3

und SDS-PAGE in Coomassiefärbung. Aufgetragen wurden jeweils 15 µl der 1:10 verdünnten

Fraktionen der Aufreinigung in denaturierter Form.


2.11.4 Gesamtproteinextraktion

Proteinextraktionspuffer 100mM NaCl

50 mM Tris HCl

0,5 %Triton-X 100

10 mM ß-Mercaptoethanol

10 µl/ml Protease Inhibitor Mix

10 µM Phenylarsineoxid

(in DMSO)

1 mM Natriumorthovanadate

20 mM Natriumfluorid

In flüssigem Stickstoff gefrorenes Blattmaterial wurde in einem vorgekühltem Mörser

zu einem feinen Staub gemörsert. Ca 200 mg des Materials wurden in 300 µl

Proteinextraktionspuffer aufgenommen, kurz gemischt und sofort auf Eis gestellt.

Anschließend wurden die Proben 5 min bei 4 °C und v oller Drehzahl (13.000 x g)

abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt.

2.11.5 Bradfordtest

Der Bradfordtest erlaubt eine Bestimmung der Gesamtproteinmenge einer Probe

durch kolorimetische Messung. 800 µl einer 1:100 Verdünnung der Proteinextrakte

wurden zu 200 µl Bradfordreagenz pipettiert, für 15 min bei RT inkubiert und bei 595

nm gemessen. Für eine höhere Genauigkeit wurden jeweils 2 Proben pipettiert und

arithmetisch gemittelt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte anhand einer

Kalibrierungskurve, die mit Hilfe einer Verdünnungsreihe im Bereich von 0,1-20 µg/ml

BSA erstellt wurde.


2.11.6 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektroph orese

(SDS-PAGE)

Sammelgelpuffer (4-fach) 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8)

0,4 % SDS

Trenngelpuffer (4-fach) 1,5 M Tris/HCl (pH 8,8)

0,4 % SDS

APS 10 % (w/v) AmmoniumPer(oxid)Sulfat

Trenngel 10 %ig,

für 2 Gele (1, 5 mm)

4,5 ml Acrylamid-Stammlösung

(Rotiphorese®Gel 40:1 Acyrlamid :

Bisacrylamid)

4,5 ml Trenngelpuffer (4-fach)

9 ml H2O

60 µl 10 % APS

13,5 µl TEMED

Die Komponenten wurden gemischt,

ca. 2/3 hoch in Gelkassetten

gegossen, mit H2O überschichtet und

ca. 30 min polymerisieren gelassen

Sammelgel 4,5 %ig,

für 2 Gele (1,5 mm)

0,75 ml Acrylamid-Stammlösung

1,7 ml Sammelgelpuffern

(4-fach)

4,25 ml H2O

20 µl 10 % APS

12 µl TEMED


Vor dem Auftragen des Sammelgels

wurde das Wasser vollständig

entfernt. Ein Kamm mit 10 oder 15

Taschen wurde eingeschoben und

das Gel weitere 30 min polymerisieren

gelassen.

SDS-Probenpuffer (4-fach) 200 mM Tris/HCl (pH 6,8)

400 mM Dithiotreitol

8 % (w/v) SDS

0,4 % (w/v) Bromphenolblau

40 % Glycerin (v/v)

SDS -Laufpuffer (10-fach) 0,25 M Tris

1,9 M Glycin

1 % (w/v) SDS

Protein Marker PageRuler™ Prestained Protein

Ladder (Fermentas)

Die Proteinextrakte wurden mit Proteinextraktionspuffer auf die kleinste erhaltene

Proteingesamtmenge verdünnt und mit 4x SDS Probenpuffer im Verhältnis 3:1

gemischt und in einem Wasserbad bei 100°C für 5 min denaturiert. Nach der

Denaturierung wurden die Proben kurz abzentrifugiert und sofort auf Eis gestellt. Es

wurden jeweils 40 µg Gesamtprotein der Proben pro Tasche geladen.


2.11.7 Proteinfärbung

2.11.7.1 Coomassie Färbung

Coomassie-Färbelösung 2,5 g/l Coomassie Brilliant Blue R 250

450 ml Methanol

100 ml Essigsäure

mit ddH2O auf 1 l auffüllen

Coomassie-Entfärbelösung 300 ml Methanol

100 ml Essigsäure

mit ddH2O auf 1 l auffüllen

Zur Überprüfung, ob die Proteinmengen der einzelnen Proben einander entsprechen,

wurden jeweils 2 Gele aufgetragen, von denen eines in Coomassie Färbelösung für 1-

2 h unter schütteln angefärbt wurde. Mit Entfärbelösung wurde so lange entfärbt, bis

kein blauer Hintergrund mehr zu sehen war. Das Gel wurde mit ddH2O gewässert und

eingescannt. Sowohl Färben als auch Entfärben wurde durch vorsichtiges Erwärmen

auf 70 °C beschleunigt.

2.11.7.2 Silberfärbung

Sol. I 50 % Methanol

12 % Essigsäure

0,05 % Formaldehyd

Sol. II 50 % Ethanol

Sol. III 200 mg/l Na2S2O3


Sol. IV 2 g/l Silbernitrat

0,75 ml/l Formaldehyd

Sol. V 60 g/l Na2CO3

0,5 ml/l Formaldehyd

4 mg/l Na2S2O3

Sol. VI 50 % Methanol

12 % Essigsäure

Sol. VII 50 % Methanol

Das Polyacrylamid-Gel wurde 20 min mit Sol. I fixiert, 3 x 10 min in Sol. II gewaschen

und mit Sol. III für 1 min vorbehandelt. Nach dem Waschen mit Wasser (3 x 20 sec)

wurde das Gel in Silbernitratlösung (Sol. IV) für 10 min inkubiert und nochmals in

Wasser geschwenkt (2 x 20 sec). Nach Entwicklung des Gels mit Sol. V wurde

abermals mit Wasser gewaschen. Diese Entwicklungsreaktion wurde anschließend

durch eine 5-minütige Inkubation mit Sol. VI abgestoppt. Als Letztes wurde das Gel mit

Sol. VII für 20 min inkubiert und bei 4°C in Wasser aufbewahrt. Zu

Dokumentationszwecken wurde das Gel eingescannt.

2.11.7.3 Ponceau-Färbung

Ponceau-Lösung(10 x) 2 g Ponceau S,

(Sigma-Aldrich, Steinheim)

30 g Sulfosalicylsäure

30 g Trichloressigsäure

mit ddH2O auf 100 ml auffüllen


Auf Nitrocellulose Membran geblottete Proteine konnten durch Färben mit Ponceau

sichtbar gemacht werden. Hierzu wurde die Membran für 10 Minuten in Ponceau-

Lösung gelegt und anschließend ca. 5 Minuten mit Wasser entfärbt, bis die

gewünschten Banden sichtbar waren.

2.11.8 Western Blot

Kathodenlösung 40 mM 6-Aminohexansäure

20 % Methanol

Anodenlösung I 0,3 M Tris-HCl (pH 10,4)

20 % Methanol

Anodenlösung II 25 mM Tris-HCl (pH 10,4)

20 % Methanol

Um bestimmte Proteine spezifisch nachzuweisen zu machen wurden die Proteine, die

auf einer SDS-PAGE aufgetrennt wurden mittels des Semi dry Western blot

Verfahrens auf eine Nitrocellulose Membran transferiert. Hierzu wurden jeweils 6

Blätter Whatmanpapier in Anodenlösung I, je 3 Blätter in Anodenlösung II und je 6

Blätter in Kathodenlösung inkubiert. Die Nitrocellulosemembran (PROTEAN Blotting

membrane) wurde kurz in ddH2O gewässert und dann ebenfalls in Anodenlösung I

inkubiert. Die Graphitplatten der Western Blot Apparatur wurden mindestens 30 min in

ddH2O gewässert und vor dem Aufbau abgetrocknet. Der Aufbau erfolgte

entsprechend Abbildung 19. Der elektrophoretische Transfer wurde bei 100 mA pro

Blot für 90 min durchgeführt.


Abb. 19: Schematischer Aufbau eines Western Blots

2.11.9 Antikörperaufreinigung

Blockierungslösung 1 x TBS (pH 7,4)

0,1 % Tween 20

6 % Milchpulver (für AntiOPR3

und AntiOPR1)

bzw.

3% BSA (für PT-66)

Bindung 1 M Tris/HCl pH 7.5

Elution Glycin/HCl pH 2.8

Stabilisierung Tris/HCl pH 9.0


Um nur bestimmte Proteine auf einer Nitrocellulosemembran sichtbar zu machen,

benötigt man spezifische Antikörper. Diese wurden aus Serum aufgereinigt. Etwa

100 µg gereinigtes Protein wurde auf eine 10%iges Acrylamidgel geladen und bei 120

V 1,5 h aufgetrennt. Das Gel wurde dann, wie bereits im Abschnitt 2.10.8 Western Blot

erörtert auf eine Nitrocellulosemembran (WESTRAN CLEAR SIGNAL) geblottet und

mit Ponceau angefärbt. Ein ca. 0,5 x 2 cm großes Stück der Membran, das nur die

gewünschte Proteinbande enthielt, wurde ausgeschnitten, in kleine Teile zerschnitten

und in ein 2 ml Eppendorfgefäß überführt.

2 ml Blockierungslösung (6% Milch in TBS Tween bei AntiOPR3 und AntiOPR1, 3%

BSA in TBS Tween für PT-66) wurden zugegeben und für mindestens 2,5 h bei RT

oder üN bei 4°C auf einen Überkopfschüttler inkubie rt. Es folgten 3 Waschschritte mit

2 ml TBS Tween für je 3 min. 200 µl Serum und 20 µl 1 M Tris/HCl pH 7.5 wurden

zugegeben und für weitere 1,5 h bei RT unter Schütteln inkubiert. Das Serum wurde

zurückbehalten und mit 0,1% NaN3 stabilisiert. Vor der Elution wurde die

Nitrocellulosemembran erneut 3 mal 3 min mit TBS Tween gewaschen und einmal 3

min mit ddH2O.

Die Elution erfolgte mit 200 µl Glycin/HCl pH 2.8 unter schütteln für 1 min. Das Eluat

wurde sofort in ein frisches Eppendorfgefäß gegeben, in dem bereits 40 µl Tris/HCl pH

9.0 vorgelegt waren. Die Membran wurde erneut mit 200 µl Glycin/HCl eluiert (E1). Die

Elution wurde wiederholt (E2). Zur Stabilisierung der so gereinigten Antikörper wurden

jeweils 1 mg/ml BSA und 0,02 % Timerosal zugegeben.

Da OPR3 und OPR1 sehr ähnlich sind, wurde ein zusätzlicher Reinigungsschritt für

die Seren von AntiOPR3 und AntiOPR1 durchgeführt. Hierbei wurde das Serum von

OPR1 zuerst mit einer Nitrocellulose gereinigt, auf die OPR3 Protein gebunden war.

Diese wurde anschließend verworfen. Ebenso wurde mit dem Serum von AntiOPR3

eine Aufreinigung gegen OPR1 Protein durchgeführt. Nach dem Verwerfen der

Membran wurde mit dem oben beschriebenen Protokoll fort gefahren.


2.11.10 Immunologischer Nachweis der Proteine

20x TBS-Puffer (Tris buffered

Saline)

10 mM Tris-HCl pH7.4

137 mM NaCl

2,68 mM KCl

Blockierungslösung 1 x Tris buffered Saline (TBS)

pH 7.4

0,1 % Tween 20

6 % Milchpulver (für AntiOPR3

und AntiOPR1)

bzw. 3% BSA (für PT-66)

Waschlösung TBS/Tween 1 x TBS pH 7.4

0,1 % Tween 20

ECL-Lösung

(„Enhanced

Chemiluminescence“)

SuperSignal® West Dura

Extended Duration Substrate

(Pierce, Rockford)

Röntgenentwickler

Röntgenfixierer

Nach dem elektrophoretischen Transfer der Proteine auf eine Nitrocellulosemembran

wurde diese für mindestens 2 h bei RT unter Schütteln in Blockierungslösung zur

Blockierung der freien Bindungsstellen inkubiert. Die Detektion der gesuchten Proteine

erfolgte mittels der jeweiligen primären Antikörper, welche in Blockierungslösung

entsprechend verdünnt wurden (1:1000 für AntiOPR3, 1:2000 für AntiOPR1, jeweils in

6% Milchpulver in TBS/Tween und 1:4000 für Anti-Phosphotyrosine PT-66 in 3% BSA

in TBS/Tween) und bei 4°C über Nacht und unter Schü tteln inkubiert wurden.


Es folgten 3 Waschschritte mit TBS/Tween für jeweils 5 Minuten bevor die Membranen

mit dem jeweiligen sekundären Antikörper inkubiert wurden. Dieser wurde ebenfalls in

Blockierungslösung verdünnt (jeweils 1:10000, für AntiOPR3 bzw. AntiOPR1

sekundärer AntiRabbit-Antikörper, für Anti-Phosphotyrosin PT-66 sekundärer

AntiMouse-Antikörper). Zur Detektion des gebundenen zweiten Antikörpers wurde

nach erneutem dreimaligem Waschen mit TBS/Tween und einem Waschschritt mit

TBS 200 µl frisch angesetzte ECL Lösung zugegeben. Das an den sekundären

Antikörper gekoppeltes Enzym HRP (horseradish peroxidase) katalysiert die

Umsetzung von Luminol in seine oxidierte Form, bei der eine Lumineszenz entsteht.

Abbildung 20 verdeutlicht diesen Vorgang. Nachdem die Nitrocellulosemembran

luftblasenfrei in eine Folie eingepackt und in eine Röntgenkassette gelegt wurde,

konnte die Lumineszensreaktion mit Hilfe eines Röntgenfilmes sichtbar gemacht

werden kann.

Abb. 20: Schema der Antikörperdetektion

3. Ergebnisse 49

3. Ergebnisse

3.1 Mutationen der OPR3 cDNA

Es ist bekannt, das OPR3 als Homodimer kristallisiert (Breithaupt et al., 2006). Die

Kristallisierungsanalyse zeigt eine fingerartige Struktur des β6-Loops, der sich nahezu

perfekt passend in das Aktive Zentrum eines anderen Protomers lagert, während der

β6-Loop dieses Protomers wiederum das aktive Zentrum des anderen blockiert. Auf

Grund dessen ist die Interaktion des Substrates cis(+)OPDA mit dem aktiven Zentrum

nicht mehr möglich und eine Katalyse kann nicht mehr stattfinden.

Des Weiteren ist bekannt, dass die Hydroxylgruppe des Tyrosins an Stelle 364 in vitro

eine Sulfatgruppe bindet. Wird Tyrosin durch Phenylalanin ersetzt, findet die

Dimerisierung nicht mehr statt und OPR3 kristallisiert als Monomer. Tyrosinreste

können durch Tyrosinkinasen phosophoryliert werden. Die Sulfatgruppe in der OPR3

Kristallstruktur könnte ein phosohoryliertes Tyrosin imitieren. Daher wurde die

Hypothese aufgestellt, dass die Aktivität von OPR3 durch reversible Phoyphorylierung

an Position 364 reguliert werden kann.

Es wurde daher untersucht, ob eine Mutation der Dimerisierungsschleife zu einer

dauerhaften Aktivität des OPR3 Proteins führt und wie diese sich auf die Pflanze

auswirkt. Hierzu wurde im OPR3 Protein das Glutamat an Stelle 291 durch Lysin

ersetzt (E291K), sowie das Tyrosin an Stelle 364 durch Phenylalanin ersetzt (Y364F).

Kristallstruktur Analysen hatten bereits gezeigt, dass beide OPR3-Mutanten als

Monomere kristallisieren (Breithaupt et al., 2006).

Alle OPR3 cDNAs waren bereits in einem Expressionsvektor vorhanden, mussten

aber mittels PCR mit den Restriktionsenzymschnittstellen für Spe I und Pst I versehen

werden um für eine Agrobakterien-vermittelte Transformation in Arabidopsis in pGreen

kloniert werden zu können. Hierfür wurden die Primer 5mutLeOPR3 (34) und

3mutLeOPR3 (35) verwendet (Siehe Abb. 21). Die PCR Produkte dieser Reaktionen

wurden in Topo-Vektoren kloniert und die Sequenz auf die verschiedenen Mutationen

überprüft. Hierbei wurden jeweils 2 Proben eingeschickt. Die Analyse der OPR3-

Sequenzen zeigte bei beiden Proben, dass beide Schnittstellen vorhanden waren und

keine Aminosäuren ausgetauscht waren. Mit der ersten der beiden Proben wurde

weiter gearbeitet.

3. Ergebnisse 50

Die Analyse einer der E291K OPR3 Sequenzen wies zwei Fehler in der DNA Sequenz

auf, die zum Aminosäureaustausch führten, diese wurde verworfen, die andere

Sequenz dagegen zeigte beide Schnittstellen und die Mutation von Glutamat nach

Lysin an Stelle 291. Mit dieser Probe wurde weiter gearbeitet. Die Sequenzen der

OPR3 cDNA mit der Punktmutation Y364F waren ebenfalls beide fehlerfrei und zeigte

sowohl die Mutation von Tyrosin 364 zu Phenylalanin, als auch beide Schnittstellen.

Auch hier wurde die Erste der beiden Proben zur weiteren Arbeit verwendet.

OPR3 E291K Y364F

Primer 34/35

Abb. 21: Ausschniktt eines Ethidiumbromid gefärbten 1% Agarosegels. PCR der OPR3

Konstrukte OPR3, E291K, Y364F mit Primer 34 und 35, 1191 bp, Annealingtemperatur

58°C, Elongationszeit 75 sec.

3.2 Mutationen der OPR1 cDNA

Anhand der Sequenzanalysen von OPR3 und OPR1 ist bekannt, dass OPR3 und

OPR1 in 53 % ihrer Aminosäuresequenz identisch sind (Stintzi und Browse, 2000 und

Abbildung 21). Auch ihre Struktur ist nahezu identisch. Beide haben die Struktur eines

(αβ)8-Barells und überlagern annähernd, das aktive Zentrum beider Enzyme ist hoch

konserviert. (Breithaupt et al., 2000 und 2006 und Abbildung 9 in Einleitung)

Es wurde gezeigt, dass OPR1 stereoselektiv ist und nur cis(-)OPDA umsetzt. OPR3

hingegen reduzierten sowohl cis(+)OPDA als auch cis(-)OPDA. Allerdings kann nur

cis(+)OPDA als Vorstufe in aktive Jasmonsäure umgesetzt werden (Schaller F. et al.,

1998). Dieser Unterschied in der Substratspezifität wird in der Beschaffenheit des β6-

Loops vermutet. Exponiert sind die Aminosäuren Y246 und Y78, die im OPR1 Protein

eine Verengung der Höhlung um das Aktiven Zentrums zur Folge haben, wohingegen

ihre Korrespondierenden Aminosäuren im OPR3 Protein (H244 und F74) eine größere

Höhlung um das Aktive Zentrum lassen. Dies hat vermutlich eine höhere Selektivität

der Substrate bei OPR1 zur Folge, wohingegen OPR3 ein breites Spektrum an

Substraten zulässt (Breithaupt et al., 2006 und Abbildung 10 in Einleitung).

3. Ergebnisse 51

Aufgrund dieser Tatsache stellte sich die Frage, ob man durch den Austausch der

korrespondierenden Aminosäuren im β6-Loop die Substratspezifität von OPR1 in die

von OPR3 umwandeln könnte. Um nicht nur das selbe Substratspektrum, sondern

auch die selbe Lokalisation des mutierten Proteins zu gewährleisten musste mittels

PCR noch ein Zieltag kloniert werden, welches dafür sorgt, dass OPR1, ebenso wie

OPR3, im Peroxisom und nicht wie sonst cytosolisch lokalisiert (Strassner et al.,

2002). Das Peroxisomentag selber besteht nur aus der Aminosäurenabfolge SRL, für

die Komplementation erschien es aber sinnvoll, die an AtOPR3 noch vorhandenen

zusätzlichen Aminosäuren Prolin (P) und Serin (S) ebenfalls zu klonieren (siehe

Abbildung 22, C-terminales Ende der Sequenzen).

Abb. 22: Sequenzvergleich von OPR1, OPR2 und OPR3 aus Tomaten (Le) und

Arabidopsis thaliana (At)

Die in OPR1 zu mutierenden Aminosäuren sind hellblau markiert, die in OPR3 zu

mutierenden Aminosäuren in gelb. Das in Dunkelrot markierte SRL Zieltag für

Peroxisomen wurde ebenfalls an OPR1 kloniert.

AtAt

At

AtAt

At

α7β7 β8 α8α6

AtAt

At

β5 β6α4 α5

Dimerization

AtAt

At

β3 β4α3βC βEβD βF

Substrate specificity

αB

αB

PTS1

βA βB β1 α1 β2 α2Y74

F74

Y244

H244

E291

Y364

AtAt

At

AtAt

At

α7β7 β8 α8α6

AtAt

At

β5 β6α4 α5

Dimerization

AtAt

At

β3 β4α3βC βEβD βF

Substrate specificity

αB

αB

PTS1

βA βB β1 α1 β2 α2βA βB β1 α1 β2 α2Y74

F74

Y244

H244

E291

Y364

3. Ergebnisse 52

Somit ergeben sich die folgenden Konstrukte:

LeOPR1-PSSRL Y74F (Tyrosin 74 wurde durch Phenylalanin ersetzt)

LeOPR1-PSSRL Y244H (Tyrosin 244 wurde durch Histidin ersetzt)

LeOPR1-PSSRL Y74F/Y244H (beide Tyrosine ausgetauscht)

Im Folgenden werden die Mutanten mit Y74F, Y244H und Y74/Y244H bezeichnet.

Außerdem wurde nicht mutierte OPR1 cDNA mit dem Peroxisomentag PSSRL

versehen, um zu überprüfen ob die Anwesenheit des OPR1 Proteins im Peroxisom

bereits ausreichend ist um die männliche Sterilität zu komplementieren. Diese Mutante

wird im folgenden OPR1+SRL bezeichnet.

Die Punktmutationen, die zum spezifischen Aminosäureaustausch führten wurden mit

Zielgerichteter Mutagenese durchgeführt. Hierzu wurde zuerst durch eine PCR-

Reaktion die OPR1 cDNA mit den Restriktionsenzymschnittstellen für Spe I und Pst I

versehen, sowie das C-terminale Tag PSSRL kloniert. Dabei wurden die Primer

5mutLeOPR1 (36) und 3mutLeOPR1 (37) verwendet (Siehe Abbildung 23). Die so

gewonnenen cDNAs wurden in Topo®-Vektoren kloniert. Zum einen ist Topo ein

prädestiniertes Plasmid um PCR Produkte zu klonieren, zum anderen diente dieses

Plasmid in der Mutagenese PCR als Matrize.

Primer 36/37

OPR1+SRL

Abb. 23: Ethidiumbromid gefärbtes 1% Agarosegel. Links: PCR der OPR3 Konstrukte

OPR3, E291K, Y364F mit Primer 34 und 35, 1191 bp, Rechts: PCR der OPR1-cDNA

mit Primern 36 und 37, 1131 bp. Annealingtemperatur 58°C, Elongationszeit 75 sec.

Die zielgerichtete Mutagenese PCR wurde in jeweils 4 Ansätzen durchgeführt, wobei

je 2 mal 10 bzw. 50 ng DNA Matrize eingesetzt wurden und mit beiden Ansätzen 15

bzw. 17 Zyklen durchgeführt wurden. Nachfolgend dargestellt (Abbildung 24) sind die

Mutagenese-Primer (blau) und ihre Bindung an die OPR1-Matrize (schwarz) mit dem

jeweiligen Basenpaar. Unterstrichen ist das Basentriplett, das mutiert wurde um die

gewünschte Aminosäure auszutauschen. Die komplette Sequenz von OPR1 mit den

Mutationsprimern ist im Anhang zu finden.

3. Ergebnisse 53

Abb. 24: DNA Sequenzauschnitt von OPR1 (schwarz) mit den jeweils bindenden

Mutageneseprimern (blau). Geänderte Basentriplets, die zum Aminosäureaustausch

führen sind unterstrichen

Nach der Mutagenese PCR wurden den Ansatz 1 U Dpn I zugegeben um die noch

vorhandenen nicht mutierten Template Plasmide zu verdauen. Die noch vorhandenen

Plasmide, die eine Mutation enthalten sollten, wurden in E. coli XL-1 blue transformiert

und auf LB-Platten mit Kanamycin (50 µg/ml) ausgestrichen. Von je 3 Kolonien wurden

Flüssigkulturen angeimpft und Plasmid DNA isoliert. Um die Mutation zu überprüfen

wurden die Plasmide sequenziert. Bei der Mutation Y244H wurden 3 Sequenzen

gefunden, die die Mutation enthielten, allerdings war bei einer keine Pst I Schnittstelle

zu finden. Diese wurde verworfen, mit der ersten Sequenz wurde weiter gearbeitet. Bei

der Mutation von Y74F musste die Mutagenese PCR 2 mal wiederholt werden, da

keine positiven Plasmide gefunden wurden. Es wurden jeweils 3 Plasmid DNAs zum

Sequenzieren geschickt. Die letzte Mutagenese PCR ergab dann 3 positive

Sequenzen mit beiden Schnittstellen. Die Doppelmutation Y74F/Y244H, die auf einer

positiv getesteten Y244H-Sequenz durchgeführt wurde - hier wurde die Mutagenese

PCR nochmals mit den Primern für Y74F durchgeführt - zeigte nur eine positive

Sequenz, bei der ebenfalls beide Schnittstellen vorhanden waren, bei den anderen

hatte die Mutation keinen Erfolg. Die Sequenzanalysen der Plasmide, die zur

Klonierung verwendet wurden sind im Anhang zu finden

LeOPR1Y74F- For 5' - tatctgagactggcataggg ttt aaagatgtacctggtatatgg - 3' ||||||||||||||||||||| |||||||||| |||||||||||

OPR1-Matrize 212- tatagactctgaccgtatcccat gtttctacatggaccatatacc -256 ||||||||||||||||||||| |||||||||| ||||||||||| LeOPR1Y74F-Rev 3'-atagactctgaccgtatcccaaa tttctacatggaccatatacc-5' LeOPR1Y7244H-For 5'-tatccccatttgcgcatcat aatgaagcaggggac-3' ||||||||||||||||| ||||||||||||| |||| OPR1-Matrize 718- tatccccatttgcgcattat aatgaagcaggggac -754 ||||||||||||||||| ||||||||||||| |||| LeOPR1Y244H-Rev 3'-ataggggtaaacgcgtagta ttacttcgtcccctg-5'

3. Ergebnisse 54

3.3 Klonierung in pGreen 0229

Plasmide, die die gesuchte Mutation enthielten wurden mit Spe I und Pst I verdaut und

anschließend auf ein Agarosegel aufgetragen (Siehe Abbildung 25). Da der Topo®-

Vektor eine weitere Schnittstelle für Pst I außerhalb der Multicloning site enthält, die

ein 1,2 kb großes Fragment ergibt, welches dieselbe Größe wie das gesuchte Insert

hat, musste der Vektor zunächst mit Nae I verdaut werden. Dieses Restriktionsenzym

schneidet im 1,2 kb großen PstI/PstI Fragment. Die gesuchten Inserts mit der Größe

von 1131 bzw. 1191 bp wurden aus dem Gel herausgeschnitten und mittels QIAquick®

Gel Extraktions Kit (Qiagen) aus dem Gel extrahiert.

Abb. 25: Ausschnitt eines 1% Agarosegels, gefärbt mit Ethidiumbromid.

Restriktionsverdau der Mutation-tragenden Topo® Plasmide mit Nae I, Spe I und Pst I.

OPR3 (links, OPR3, E291K, Y364F) Konstrukte haben eine Größe von 1191 bp, OPR1

Konstrukte (rechts, OPR1+SRL, Y74F, Y244H, Y74F/Y244H) haben eine Größe von

1131 bp. Der Topo®-Vektor ohne Insert hat eine Größe von ca. 3900 bp. Der Verdau

wurde bei 37°C für 2 Stunden durchgeführt.

Wie Abbildung 15 (Siehe Abschnitt 2.2. Vektoren und Plasmide) zeigt, konnte die in

pGreen vorhandene DNA des DsRED-OPR3 mit den Restiktionsenzymen Spe I und

Pst I aus dem Vektor herausgeschnitten werden, gleichzeitig wurde so eine Ligation

mit den Inserts E291K, Y364F, OPR1+SRL, Y74F, Y244H und Y74F/Y244H

ermöglicht, die mit den selben Enzymen verdaut wurden. Im pGreen Vektor war

bereits ein 2130 bp großes Fragment des OPR3 Promotors kloniert, womit

sichergestellt war, dass die mutierten OPR3 und OPR1-cDNAs auch unter Kontrolle

eines OPR3 Promotors standen. Abbildung 26 zeigt den Aufbau des zu

transformierenden Vektors. Als Kontrolle wurde zusätzlich eine nicht mutierte OPR3

cDNA zur Komplementation vorbereitet, um zu überprüfen, ob die Transformation an

sich bereits Auswirkungen auf die Pflanzen hat.

OPR3 E291K Y364F OPR1+SRL Y74F Y244H Y74F/Y244H

Insert 1191 bp

bzw. 1131 bp

Spe I Pst I Fragment

2700 bp

3. Ergebnisse 55

Abb. 26: Schematischer Aufbau des Transformationsplasmides mit OPR3-Promotor,

Konstrukt (grün hinterlegt), nos-Terminator (T), Resistenzgenen für BASTA (nos-bar) und

Kanamycin (npt) und Origin of replication für die Replikation in Agrobakterium (pSA ori) und

E.coli (ColEI ori).

Nach erfolgreicher Klonierung der Konstrukte in pGreen wurden diese in

Agrobacterium tumefaciens GV3101 transformiert. Dieser enthält bereits das Plasmid

pSoup, das eine Replikation von pGreen ermöglicht. Die Agrobakterium-vermittelte

Transformation überträgt nicht das gesamte Plasmid ins Arabidopsis-Genom, sondern

nur eine T-DNA, die von der Linken Grenze (LB) und der Rechten Grenze (RB)

begrenzt wird (Hellens et al., 2000). Vor der Transformation mussten die

Agrobakterien noch auf das Vorhandensein des Konstruktes überprüft werden. Hierzu

wurde Plasmid DNA mittels Minipräp extrahiert und durch eine PCR das Konstrukt

nachgewiesen (Siehe Abbildung 27). Erfolgreich transformierte Agrobakterienstämme

wurden zur Transformation in Pflanzen angezogen.

Primer 34/35

OPR3 E291K Y364F OPR1+SRL Y74F Y244H Y74F/Y244H

Primer 36/37

Abb. 27: 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt. PCR auf Konstrukte in

Agrobakterien. OPR3 Konstrukte (links, OPR3, E291K, Y364F) haben eine Größe von

1191 bp, OPR1 Konstrukte (rechts, OPR1+SRL, Y74F, Y244H, Y74F/Y244H) haben eine

Größe von 1131 bp. Annealingtermperatur: 58°C, Elong ationszeit 120 sec.

TOPR3 Promotor Konstrukt npt ColEI ori pSA ori nos-Bar

BspH I Bgl II Not I Sac II SpeI Pst I Knp I Knp I Bgl II BspH I PvuI

LBRB

T-DNA

2130 bp 1131 - 1171 bp 282 bp

3. Ergebnisse 56

3.4 Identifizierung transgener Pflanzen

Da opr3-defiziente Arabidopsis thaliana Pflanzen männlich steril sind, müssen die

transformierten Pflanzen durch die exogene Gabe von Methyl-Jasmonsäure zur

Samenbildung gebracht werden. Pflanzen wurden hierfür alle 2 Tage mit einer

0,03%igen Methyl-Jasmonsäurelösung besprüht. Zur Identifizierung transgener

Pflanzen wurden je 15.000 der durch Jasmonsäurebesprühung gewonnenen Samen

auf BASTA-getränkter Erde ausgelegt. Samen, die das Konstrukt enthielten, waren

gegen BASTA resistent (die T-DNA enthält das nos-bar-Gen, das die BASTA-

Resistenz vermittelt) und konnten nach der Kotyledonenbildung weiter wachsen.

Samen, die das Konstrukt nicht enthielten konnten sich nicht über das

Kotyledonenstadium hinaus entwickeln. Es wurden jeweils zwischen 5 und 10

resistenten Pflanzen gefunden. Da die Transformationsrate normalerweise zwischen

0,1 und 0,7% liegt ist dies eine sehr geringe Transformationsrate. Hierfür gibt es 2

mögliche Erklärungen: Entweder konnte der weibliche Gametophyt nicht befruchtet

werden, da die Jasmonsäurebehandlung zu diesem kritischen Zeitpunkt nicht

erfolgreich genug war um männlich fertile Pollen herzustellen, oder der weibliche

Gamethophyt konnte nicht von den Agrobakterien transformiert werden.

Die Samen der Transformanten des Konstrukt Y364F allerdings zeigten eine

ungewöhnliche hohe Keimungsrate von annähernd 50% Resistenz gegen BASTA

obwohl in keinem der Keimlinge - es wurden Stichprobenartig 100 Pflanzen getestet -

das Konstrukt nachgewiesen werden konnte. Vermutlich war unter den transformierten

Pflanzen eine BASTA-Resistente, deren Samen keimen konnten, ohne transformiert

worden zu sein. Eine Identifikation von eventuell transformierten Pflanzen war daher

nicht möglich.

Aus den resistenten Pflanzen wurde aus einem Blatt DNA extrahiert und mittels PCR

auf das Vorhandensein des Konstruktes getestet. Die Primer zur Überprüfung auf

Anwesenheit des Konstruktes waren 5’ im OPR3 Promotor (1612), bei OPR3

Konstrukten 3mutLeOPR3 (35), bei OPR1 Konstrukten hingegen OPR1_876R (876).

Um die Anwesenheit und Menge der DNA zu kontrollieren wurden die Primer TuB4F

und TuB4R verwendet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 28 dokumentiert.

3. Ergebnisse 57

OPR1+SRL Y244H Y74F/Y244H1 2 3 4 5 + – 1 2 3 4 5 6 7 + – 1 2 3 4 5 6 7 + –

1612/876

TuB4

Abb. 28: 1% Agarosegel in Ethidiumbromidfärbung. PCR Analyse der BASTA-

resistenten Pflanzen auf das jeweilige Konstrukt. Als Positive Kontrolle (+) diente das

jeweilige Transformationskonstrukt, Als Negative Kontrolle (–) diente Wildtypische

DNA. Als Ladekontrolle wurde eine PCR mit den Primern für Tubulin TuB4F und

TuB4R durchgeführt, positive Kontrolle hierfür war wildtypische DNA, negative

Kontrolle das Transformationskonstrukt. Annealingtemperatur: 50°C, Elongationszeit

40 sec. Oben: Analyse der OPR3 Konstrukte OPR3 (Komplementationskontrolle) und

E291K mit den Primern 1612 und 35 .Unten: Analyse der OPR1 Konstrukte

OPR1+SRL Y244H und die Doppelmutation Y74F/Y244H mit Primern 1612 und

OPR1_876R. Annealingtemperatur: 58°C, Elongationszeit: 120 sec.

Die Analyse der Pflanzen, die mit OPR1 Konstrukte transformiert wurden ergab für das

Konstrukt OPR1+SRL 4 positive Pflanzen, für das Konstrukt Y244H wurden 7 positive

Pflanzen und für die Doppelmutation Y74F/Y244H 5 positive Pflanzen gefunden. Die

Analyse der Pflanzen, die mit OPR3 Konstrukten transformiert wurde ergab für die

Transformationskontrolle OPR3 2 positiv getestete Pflanzen, für das Konstrukt E291K

wurden ebenfalls 2 positive Pflanzen gefunden.

Von den Konstrukten Y364F und Y74F konnten keine positiven Linien identifiziert

werden. Um Rückschlüsse über eine Transformation und ihre Auswirkungen ziehen zu

können müssen diese erneut transformiert werden.

OPR3 E291K 1 2 3 4 5 – + 1 2 3 4 5 6 + –

1612/35

TuB4

3. Ergebnisse 58

3.5 Analyse der Mutation E291K

Abbildung 29 zeigt ausgewählte repräsentative Blütenstände und Blüten und

Aufnahmen der Pollenkeimungsplatten und die graphisch Auswertung der

Pollenkeimung. Die exakten Daten der Pollenkeimung sind im Anhang zu finden.

WT

opr3 opr3+E291K

opr3+OPR3

Pollenkeimungstest OPR3 Konstrukte

77,9%77,7%79,0% 76,8% 75,2%

12,6%

0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%

100%

WT

opr3

OPR

3-4

OPR

3-5

E291

K-1

E291

K-6

Pol

lenk

eim

ung

Abb. 29: A, B und C: Blütenstände von Wildtypischen, opr3-defiziente A. thaliana und

mit E291K transformierten A. thaliana, D, E, F, G: Blüten von Wildtyp, opr3-defiziente A.

thaliana, und mit OPR3 bzw. E291K transformierten opr3-defiziente A. thaliana, sowie die

zugehörige Pollkeimung in vitro (jeweils rechts von den Blüten), unten: graphische

Darstellung des in vitro Pollenkeimungstests der transformierten opr3-defiziente A. thaliana

mit OPR3 und E291K im Vergleich mit Pollen von Wildtyp und opr3-defiziente A. thaliana.

Pollen wurde auf Pollenkeimungsmedium ausgebracht und nach 12 Stunden ausgezählt.

Von 6 bis 9 Blüten wurden jeweils ca. 300 Samen gezählt, der Mittelwert gebildet und eine

Standardabweichung berechnet.

WT opr3 opr3 + E291K

A B C

D E

F G

3. Ergebnisse 59

Wie bereits an den Blütenständen (siehe Abbildung 29 A, B und C) zu erkennen ist

und durch Pollenkeimungstest bestätigt wird, komplementiert die Mutation E291K die

männliche Sterilität. 29 A zeigt eine Wildtypische Pflanze, die bereits einige elongierte

Schoten ausgebildet hat (Pfeil) und somit Fertilität aufweist. 29 B zeigt eine opr3-

mutante Pflanze, die keine verlängerten Schoten hat. In Abbildung 29 C ist ein

Blütenstand einer E291K-komplementierten Pflanze abgebildet, bei dem ebenfalls

elongierte Schoten zu finden sind. Die männliche Sterilität konnte also durch die

Transformation mit E291K wieder hergestellt werden.

Detailaufnahmen der Blüten zeigen in 29 D (Arabidopsis Wildtyp), E (opr3-defiziente

Arabidopsis thaliana mit OPR3 Konstrukt transformiert) und G (opr3-defiziente

Arabidopsis thaliana mit E291K Konstrukt transformiert) fertile Blüten. Die Antheren

sind verlängert und Pollen ist freigesetzt worden. Die Pollenkeimung in vitro liegt bei

zwischen 75,2% und 76,8% der Pollen bei E291K-komplementierten Pflanzen, 77,7%

bis 77,9 % bei OPR3-komplementierten Pflanzen und 79% beim Wildtyp. Abbildung 29

F hingegen zeigt eine männlich sterile opr3-defiziente Pflanze. Die Filamente sind

nicht verlängert, es wurde kein Pollen freigesetzt. Die Pollenkeimung liegt bei 12,6%.

Eine dauerhafte Aktivität von OPR3 durch die Mutation E291K, die eine Dimerisierung

und somit Inaktivität des Proteins verhindert, ist phänotypsch nicht feststellbar. Diese

könnte eine dauerhafte Ausschüttung von Jasmonsäure zu Folge haben, durch die

anderer Jasmonsäure-induzierter Gene aktiv wären, ohne dass eine Verwundung

geschehen ist. Eine Native SDS-PAGE mit anschließender Western Blot Analyse

könnte Aufschluss darüber geben, ob OPR3 weiterhin dimerisieren kann oder nicht.

Die Pflanzen befanden sich zur Fertigstellung dieser Arbeit allerdings erst in der T1

Generation, so dass Western Blot Analysen noch nicht möglich waren, da eine

größere Menge an Pflanzenmaterial benötigt wird.

3. Ergebnisse 60

3.6 Ist die Männliche Fertilität in OPR1+SRL, Y244H un d

Y74F/Y244H wiederhergestellt?

opr3 + OPR1+SRL opr3 + Y244H opr3 + Y74F/Y244H

Pollenkeimungstest OPR1 Konstrukte

9,4% 8,0%0,0%0,0%5,9%

11,7%

79,0%

12,6%

1,0% 2,5%0,6% 0,0%8,5%2,8%6,8%

15,0%

6,6%

9,5%

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

WT

opr3

OPR1+SRL-

1

OPR1+SRL-

2

OPR1+SRL-

3

OPR1+SRL-

4

Y244H

-1

Y244H

-2

Y244H

-3

Y244H

-4

Y244H

-5

Y244H

-6

Y244H

-7

Y74F/Y

244H

-2

Y74F/Y

244H

-4

Y74F/Y

244H

-5

Y74F/Y

244H

-6

Y74F/Y

255H

-7

Kei

mun

gsra

te

Abb. 30: A, B und C: Blütenstände der opr3-defizienten A.thaliana, komplementiert mit

OPR1+SRL (A), Y244H (B) und Y74F/Y244H(C). D, E und F: Blüten und in vitro

Pollenkeimung (jeweils darunter) der opr3-defiziente A. thaliana, die mit OPR1+SRL

(D), Y244H (E) und Y74F/Y244H (F) transformiert wurden. Unten: Graphische

Darstellung des Pollenkeimungstests der mit OPR1-Mutanten transformierten opr3-

defiziente A. thaliana im Vergleich mit Pollen von Wildtyp und opr3-defiziente A.

thaliana. Pollen wurde auf Pollenkeimungsmedium ausgebracht und nach 12 Stunden

ausgezählt. Von 6 bis 9 Blüten wurden jeweils 300 Samen gezählt, der Mittelwert

gebildet und eine Standardabweichung berechnet.

opr3 + OPR1+SRL opr3 + Y244H opr3 + Y74F/Y244H

D E F

A B C

3. Ergebnisse 61

Abbildung 30 zeigt ausgewählte repräsentative Blütenstände und Blüten und

Aufnahmen der Pollenkeimungsplatten, sowie die graphische Auswertung der

Pollenkeimung im Vergleich mit Wildtypischen und opr3-defizienten Arabidopsis-

Pflanzen. Die genauen Datensätze zur Pollenkeimung jeder einzelnen Mutante finden

sich im Anhang. Abbildungen 30 A, B und C zeigen jeweils Blütenstände von opr3-

mutanten Pflanzen, die mit OPR1+SRL (A), Y244H (B) und Y74F/Y244H(C)

transformiert wurden. An keiner sind elongierte Schoten zu finden, die auf eine

männliche Fertilität schließen lassen. Die Abbildungen 30 D, E und F zeigen

Detailaufnahmen der jeweiligen Blüten. Keine der mit OPR1-Konstrukten

komplementierten Pflanzen zeigt eine Verlängerung der Filamente und eine Öffnung

der Antheren und eine Freisetzung von Pollen. In vitro Pollenkeimungstest haben

gezeigt, dass sich die Pollenkeimung nicht wesentlich von der einer opr3-Mutante

unterscheidet – opr3-Mutanten haben etwa 12 % Pollenkeimung, die Transformation

mit OPR1+SRL zeigte Pollenkeimung zwischen 0 und 11,7%. Y244H zeigte zwischen

0,6 und 15% Pollenkeimung und die Doppelmutation Y74F/Y244H 0 - 8,5%.

Eine Transformation von opr3-Arabidopsis Pflanzen mit den Konstrukten OPR1+SRL,

Y244H und Y244H/Y74F ist also nicht ausreichend um die männliche Fertilität wieder

herzustellen. Dies zeigt, dass die Anwesenheit von OPR1 im Peroxisom alleine noch

nicht genügt um die Abwesenheit von OPR3 zu komplementieren, da für die

Fortführung des Oktadekanoidweges cis(+)OPDA umgesetzt werden muss. OPR1

kann nur cis(-)OPDA umsetzen. Strukturelle Daten deuten darauf hin, dass Tyrosin an

den Stellen 246 und 78 als eine Art Torhüter vor dem Aktiven Zentrum fungieren,

wodurch der Zugang von cis(+)OPDA zum Aktiven Zentrum verhindert wird. Demnach

wäre zu erwarten, das durch den Austausch der beiden Aminosäuren der Umsatz von

cis(+)OPDA möglich werden sollte. Wie die Daten in Abbildung 30 aber zeigen ist die

männliche Fertilität nicht wieder hergestellt worden. Der Zugang von cis(+)OPDA zum

Aktiven Zentrum wird vermutlich noch durch weitere Aminosäuren im β6-Loop über

dem aktiven Zentrum reguliert. Alle männlich sterilen Pflanzen wurden erneut mit

Jasmonsäure besprüht um die männliche Fertilität wieder herzustellen und Samen zu

erhalten.

3. Ergebnisse 62

3.7 Lokalisation der mutierten OPR1-Proteine

3.7.1 Gradientenzentrifugation

Da eine Komplementation des Phänotyps durch die verschiedenen OPR1-Konstrukte

nicht erfolgreich war, musste zunächst noch überprüft werden, ob das mutierte OPR1-

Protein überhaupt in den Peroxisomen vorhanden war. Hierzu mussten Peroxisomen

isoliert werden. Zunächst wurden Pflanzen geerntet und mit Tricinepuffer

homogenisiert. 100µl und 600 µl des Filtrat dieses Zellaufschlusses wurde

anschließend auf einen 5 ml 65-30%igen Saccharosegradienten aufgetragen. Durch

Ultrazentrifugation werden hier die Zellorganellen entsprechend ihrer Dichte

aufgetrennt. Die Gradienten wurden in einen Fraktionator eingespannt, von unten

angebohrt und Fraktionen von je 250 µl aufgefangen. Der Zuckergehalt der einzelnen

Fraktionen wurde mit Hilfe eines Refraktometers bestimmt. In den Fraktionen

zwischen 58 % und 50 % Saccharose waren die Peroxisomen zu erwarten (Strassner

et al., 2002).

100 µl 600 µl

OPR1+SRL-1, Y244H-1, Y74F/Y244H-1 OPR1+SRL-1, Y244H-1, Y74F/Y244H-1

Abb. 31: 5 ml Gradienten der verschiedenen Linien, beladen mit 100 µl (links) und 600

µl (rechts) der Überstände von OPR1+SRL-1, Y244H-1 und Y74F/Y244H-1.

3. Ergebnisse 63

Jeweils 96 Samen einer positiven Linie von Y244H und OPR1+SRL wurden ausgesät

und nach Ausbilden von 4 Blättern mit BASTA besprüht, da nach der 2. Mendelschen

Regel (Spaltungsregel) nur 3:1 Pflanzen der Nachkommen in der T2-Generation das

Konstrukt tragen. Pflanzen, die das Konstrukt nicht trugen wurden so eliminiert. Die

Keimungsrate war sehr gering, so dass schlussendlich nur zwischen 20 und 5

Pflanzen jeder Linie überhaupt kleine Rosetten ausbildeten. Die übrigen Pflanzen

gingen entweder ein oder zeigten nur wenige kleine Rosettenblätter und bildeten

bereits Blütenstände aus, wie dies bei Hitze- und Lichtstress der Fall ist. Alle Rosetten

überlebender grünen Pflanzen wurden zur Gradientenzentrifugation geerntet

(Abbildung 31). Außerdem wurde eine positive Pflanze der Doppelmutation

Y74F/Y244H geerntet, von der noch keine Samen in der T2 Generation existierten.

.

66% 63,5% M 61% 57,5% 55% 52,5% 51% 48,5% 44% 41,5% 38,5% 35% M 30,5% 21% 18,5%

13096

72

56

43

34

26

kDa96

72

56

43

34

26

17

M 65% 63% 60% 58% 55,5% 52,5% 50% 46,5% 42% 38% M 36% 32,5% 25,5% 14%

96

72

56

43

34

26

17

kDa13096

72

56

43

34

26

Abb. 32: Coomassie- und Silber-Färbung der SDS-Gele der 2 Gradienten von Y244H.

Oben: 100µl beladener Gradient, Unten 600 µl beladener Gradient. Die Fraktion von

18,5% im 100µl Gradienten fehlt in der Silber-Färbung, da diese Fraktion nicht

vollständig gefüllt und deswegen im ersten Gel bereits aufgebraucht worden war.

3. Ergebnisse 64

Jeweils 20 µl jeder Fraktion wurden mit 5 µl SDS-Probenpuffer gemischt, denaturiert

und auf einem 10%igem SDS-Gel aufgetrennt um anschließend mit Coomassie- und

Silber-Färbung Proteine sichtbar zu machen. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass

die Proteinmengen so gering sind, dass in den Fraktionen zwischen 58 % und 50 %

Saccharose nur geringe Mengen an Proteinen um 70 kDa sichtbar sind.

Abbildung 32 zeigt hier stellvertretend Färbungen der Gele der beiden Gradienten von

Y244H-1, die mit 100 µl (oben) und 600 µl (unten) des Filtrats des Zellaufschlusses

beladen wurden. Obwohl in den Gradienten eine deutliche grüne Bande auszumachen

ist die die Chloroplasten enthält und in den entsprechenden Fraktionen ebenfalls eine

deutliche grüne Färbung zu sehen ist, sind in den selben Taschen im SDS-Gel nur

dünne Proteinbanden auszumachen. Im dünneren Bereich des Gradienten (oberhalb

30%) sind große Mengen an Proteinen zu sehen, die vermutlich aus den

aufgeschlossenen Chloroplasten und zerstörten Zellorganellen stammen. Die

einzelnen Fraktionen wurden mittels Western Blot analysiert, außerdem wurde

versucht mit einem spektrophotometischen Aktivitätstest die Fraktionen zu

identifizieren, die Peroxisomen enthalten.

3.7.2 Katalaseaktivität

Katalase ist ein Enzym, welches in den Peroxisomen lokalisiert ist und die Umsetzung

von H2O2 zu Wasser und Sauerstoff katalysiert. Diese Umsetzung lässt sich

spektrophotometrisch bestimmen, indem man die Adsorption von Wasserstoffperoxid

bei 240 nm misst (Strassner et al., 2002). Bei Versuchen mit Pflanzenmaterial, das in

Tricinepuffer aufgenommen wurde, aber nicht auf einen Gradienten geladen worden

war, konnten eindeutige Aktivitätsspektren erzielt werden. Experimente haben gezeigt,

dass sowohl in den Fraktionen zwischen 58% und 50% Saccharose, als auch in den

obersten Fraktionen eines Gradienten eine Katalaseaktivität festzustellen ist (eigene

Daten nicht gezeigt; Strassner et al, 2002). Die Aktivität im oberen Bereich des

Gradienten rührt von beim Zellaufschluss gespaltenen Peroxisomen und somit

freigesetzter Katalase, die sich dort ansammelt. Bei den oben gezeigten Gradienten

allerdings konnte aufgrund der geringen Pflanzenmenge und der dadurch bedingten

geringen Zellorganell- und Proteinmenge in keiner Fraktion eine eindeutige Aktivität

festgestellt werden (Daten nicht gezeigt).

3. Ergebnisse 65

3.7.3 Western Blot auf OPR1

Durch die geringe Menge an Pflanzenmaterial (ca. 2 g pro Linie) von transformierten

Pflanzen waren sowohl die Detektion der Peroxisomen durch Katalaseaktivitätstest,

als auch die Protein-Detektion in der Coomassie- und Silber-Färbung äußerst

schwierig (siehe Abbildung 32). Daher wurden Western Blot Analysen mit

verschiedenen Antikörpern durchgeführt, die ein Bild davon geben sollen, welche

Fraktionen des Gradienten welche Organellen enthalten. AOS ist ein Enzym des

Oktadekanoidweges, welches in den Chloroplasten lokalisiert ist. Ein Western Blot mit

AntiAOS-Serum (Siehe Abbildung 33, oben) wurde daher als Kontrolle hinzugezogen.

OPR1 soll nach erfolgreicher Transformation, zusätzlich zur normalen Lokalisation im

Cytosol, im Peroxisom vorhanden sein.

kDa

56

43

34

65% M 63% 60% 58% 55,5% 52,5% 50% 46,5% 42% 38% 36% M 32% 25% 14% OPR1kDa

56

43

34

AntiAOS

AntiOPR1

Abb. 33: Vergleich der beiden Western Blots des Gradienten von Y244H-1(beladen mit

600µl) mit Anti-AOS (oben) und Anti-OPR1 (unten) und OPR1 Protein als Kontrolle

Western Blot Analysen zeigen, dass in den oberen Fraktionen (25-14 % Saccharose)

OPR1 Protein vorhanden ist, welches entweder aus aufgeschlossenen Peroxisomen

oder auch aus dem Cytosol stammt (siehe Abb. 33, unten). Im Normalfall ist OPR1

Cytosolisch (Strassner et al., 2002). Im Gradienten würde es sich oberhalb der

Fraktionen sammeln, in denen sich Plastiden befindet.

3. Ergebnisse 66

Der Western Blot, der mit Anti AOS detektiert wurde zeigt hingegen Banden in den

Fraktionen zwischen 55,5% und 50% Saccharose sowie zwischen 36% und 14%

Saccharose. Die Banden zwischen 55,5% und 50% Saccharose sind höchst

wahrscheinlich unspezifische Bindungen, da es sich bei Anti AOS nur um

ungereinigtes Serum handelt. Endogenes OPR1 sollte sich in diesen Fraktionen finden

lassen, ist aber vermutlich aufgrund der geringen Menge an Pflanzenmaterial nicht

detektierbar. Die AOS-Signale zwischen 36% und 25% hingegen scheinen den

Plastiden abzugrenzen. Dies sind auch die Fraktionen, die eine grüne Färbung zeigen.

Oberhalb dieser Banden sammeln sich Proteine aus aufgeschlossenen Zellorganellen,

die ebenfalls Signale zeigen. Nach wie vor ist unklar, ob das veränderte OPR1 Protein

sich nicht im Peroxisomen befindet, oder ob es nur nicht oder zu wenig exprimiert wird.

3. Ergebnisse 67

3.8 Wird OPR3 durch reversible Phosphorylierung regu liert?

Wie bereits erwähnt wurde, kristallisiert OPR3 als Homodimer bei dem das jeweilige

Aktive Zentrum eines Protomers von einer fingerartigen Struktur blockiert wird, die aus

dem anderen Protomer herausragt. In der Kristallstruktur imitiert ein Sulfat-Ion in der

Nähe des Tyrosins 364 die Phosphatgruppe eines Phosphorylierten Tryrosinrestes

und bildet Wasserstoffbrücken zwischen beiden Untereinheiten aus, die zur

Stabilisierung des Dimers beitragen. Tauscht man Tyrosin 364 durch Phenylalanin

aus, wodurch die Hydroxylgruppe verloren geht, kann keine Phosphorylierung mehr

stattfinden, und das Protein kristallisiert als Monomer. (Breithaupt et al., 2006)

Bereits vorausgegangene Experimente konnten zeigen, das OPR3 Substrat einer

Tyrosin-spezifischen Protein Kinase ist (Schaller A., unveröffentlicht). Western Blot

Analysen mit einem Phosphotyrosin-spezifischen monoclonalen Antikörper (Anti PT-

66) haben bewiesen, dass OPR3 effizient Phosphoryliert wird, wenn sie mit einer

Tyrosin-Kinase in E.coli coexprimiert werden.

All diese Vorkenntnisse weisen darauf hin, dass das Momomer-Dimer Gleichgewicht

von OPR3 in vivo durch eine reversible Phosphorylierung erfolgen könnte. Daher soll

in dieser Arbeit untersucht werden ob OPR3 in vivo phosphoryliert werden kann. Es ist

bekannt, dass bei einer Verwundung einer Pflanze der Spiegel an Jasmonsäure

ansteigt, ebenso steigt der Transkriptspiegel der Gene, die in der Biosynthese von

Jasmonsäure beteiligt sind. Dennoch ist die Kinetik der Transkriptinduktion nicht

schnell genug um für die schnelle Akkumulation der Jasmonsäure nach Verwundung

zu genügen was suggeriert, dass weitere Regulationsmechanismen für den

anfänglichen Anstieg von Jasmonsäure verantwortlich sind. Ein Beispiel wäre

reversible Phosphorylierung und Dephosphorylierung.

Es wurden daher Verwundungsexperimente durchgeführt, bei denen wildtypische

Tomaten Pflanzen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verwundung geerntet wurden

(meist 5, 10, 20, 30, 60 und 180 Minuten nach Verwundung) zu denselben Zeitpunkten

wurden Pflanzen geerntet, die nicht verwundet wurden, um als Kontrolle zu dienen.

Gesamtproteinextrakte der geernteten Pflanzen wurden mit SDS-Page und Westen

Blot Analysen mit Antikörpern auf OPR3 und Phosphorylierung (Anti PT-66)

untersucht.

3. Ergebnisse 68

Als Kontrollen dienten hierbei gereinigtes OPR3 Protein und gereinigtes Protein aus

einem E.coli Expressionsstamm der eine Tyrosin-spezifischen Protein Kinase enthält

und somit OPR3 phosphoryliert. In den folgenden Western Blot Analysen ist

phosphoryliertes OPR3 Protein als Kontrolle aufgetragen und als TKB1 bezeichnet.

K0’ K120’ M vw10’ vw30’ vw60’ vw180’ TKB1 OPR3kDa13072554334

Abb. 34: Western Blot des ersten Verwundungsexperiment an Tomaten mit Anti PT-66.

Aufgetragen wurde Gesamtproteinextrakt. Unverwundete Kontrollpflanzen wurden zu

Beginn des Experimentes geerntet und nach 120 Minuten (K0’ und K120’), verwundete

Pflanzen nach 10, 30, 60 und 180 Minuten. Kontrollpflanzen und verwundete Pflanzen

befanden sich im selben Raum. Als Kontrolle wurden OPR3 Protein und OPR3 Protein

aus dem Expressionsvektor TKB1 aufgetragen, dass eine Tyrosinkinase enthält und

OPR3 somit Phosphoryliert(Im Bild bezeichnet als TKB1).

Abbildung 34 zeigt den Western blot eines Verwundungsexperiments mit

Tomatenpflanzen, der mit Anti PT-66 detektiert wurde. Sowohl in den Verwundeten

(Spuren vw10’, vw30’, vw60’, vw180’), als auch in den Kontrollpflanzen (K0’ und

K120’) sind dieselben Banden an phosphorylierten Proteinen zu erkennen. Auch zu

den verschiedenen Zeitpunkten ist keine Veränderung zu erkennen. Es liegt hier also

offenbar keine induzierbare Phosphorylierung vor. Es wurden weitere Experimente mit

mehr Zeitpunkten durchgeführt um der Spiegel an OPR3 zu verschiedenen

Verwundungszeiten zu messen.

3. Ergebnisse 69

Verwundete

Pflanzen

Kontrollpflanzen

Abb. 35: Western Blot Analyse eines Verwundungsexperimentes detektiert mit Anti

OPR3 Antikörper. Oben: verwundete Pflanzen, geerntet 5, 10, 20, 30, 60 und 180

Minuten nach Verwundung, Unten: Kontrollpflanzen, nicht verwundet, geerntet zu

denselben Zeitpunkten, einschließlich Nullkontrolle. Kontrollpflanzen und verwundete

Pflanzen befanden sich im selben Raum. Als Kontrollen wurden OPR3 und

Phosphoryliertes OPR3 Protein (TKB1) aufgetragen

Abbildung 35 zeigt die Western Blot Analyse ein weiteres Verwundungsexperiment mit

mehr Zeitpunkten, (5, 10, 20, 30, 60 und 180 Minuten jeweils verwundete

Tomatenpflanzen (obere Abbildung), sowie zum selben Zeitpunkt geerntete

unverwundete Kontrollpflanzen (untere Abbildung)) detektiert mit Anti OPR3. In der

oberen Abbildung sind die verwundeten Pflanzen zu sehen, die eine leichte Induktion

von OPR3 20 und 30 Minuten nach Verwundung zeigen. In den unverwundeten

Kontrollpflanzen hingegen ist eine weitaus größere Induktion an OPR3 zu bemerken,

obwohl diese Pflanzen unverwundet waren. Vermutlich ist diese auf den Einfluss von

flüchtigen organischen Substanzen (volatile organic compounds, kurz VOCs)

zurückzuführen

Die Induktion von OPR3-Transkript bei Verwundung ist bereits ausführlich untersucht

worden und im Experiment nachgewiesen worden (Strassner et. Al., 2002). Paschold

A. et al. (2006) fanden heraus, dass durch die Aufnahme von flüchtigen Aldehyden

(Volatile Organic Compounds, zukünftig kurz: VOCs) verschiedene Gene induziert

werden, anderem auch LeOPR3. Allerdings ist trotz OPR3-Induktion kein Anstieg des

Jasmonsäurespiegels messbar, wie es bei einer Verwundung der Fall ist.

kDa

55

43

34

55

43

34

0’ 5’ 10’ 20’ 30’ 60’ 180’ M OPR3 TKB1

5’ 10’ 20’ 30’ 60’ 180’ M OPR3 TKB1

3. Ergebnisse 70

Es scheint als würde die Verwundungsreaktion nur bis zu einem bestimmten Punkt

ablaufen und dort innehalten. Grundlage der folgenden Experimente war die

Vermutung, dass OPR3 durch die Aufnahme von VOCs zwar induziert wird, aber

eventuell durch eine vorübergehende Phosphorylierung inaktiv ist, wodurch die

Pflanze bei einer wirklichen Verwundung schneller eine Abwehrreaktion starten kann.

Zwischen 50 und 100 Tomatenpflanzen wurden in regelmäßigen Kreisen aufgestellt.

Jeweils in der Mitte der Kreise und um sie herum wurde eine Tomatenpflanze gestellt,

die mit einer Gefäßklemme an mehreren Blättern verwundet wurde. Die Verwundung

wurde jeweils so gesetzt, dass sie die Blatthauptader durchquerte. Diese Pflanzen, die

VOCs absondern, sind die Emitterpflanzen, unverwundete Pflanzen, die in

unmittelbarer Nähe stehen sind in diesem Fall Empfänger-Pflanzen, anhand derer die

OPR3 Induktion durch VOCs nachgewiesen werden soll. Zusätzlich wurden Blätter

von Tomaten in kleine Stücke zerschnitten, zerdrückt und zwischen den Töpfen

verteilt, um eine optimale Verteilung der so freigesetzten VOCs zu garantieren. Des

Weiteren sind Pflanzen in abgetrennten Räumen aufgestellt, die weder verwundet

werden, noch VOCs ausgesetzt sind, um als Kontrollen zu dienen. Bei Experimenten

mit Arabidopsis Pflanzen wurden diese in regelmäßigen Rechtecken von 9 oder 16

Pflanzen zusammengestellt, wobei immer bei einer bis vier Pflanzen pro Gruppen die

Rosettenblätter mit Gefäßklemmen verwunden wurden. Auch hier wurde darauf

geachtet, dass die Verwundung die Blattader durchquert.

Eventuellem Luftzug wurde vorgebeugt indem eine Stellage aus Brettern und Kisten

um den Versuchsaufbau gestellt wurde. Ein komplettes Abschotten der Pflanzen in

beispielsweise einem Plexiglasbehälter ist nicht sinnvoll. Durch Photosynthese wird

der CO2-Gehalt im abgeschlossenen Behälter schnell reduziert. Wenn die Pflanzen

ihren CO2-Kompensationspunkt erreicht haben, erhöht sich die Zahl der geöffneten

Stomata und erhöht somit die Aufnahme von VOCs wodurch eine inadäquate

Aufnahme von VOCs gegenüber der natürlichen stattfindet und somit eine ungleich

höhere oder womöglich sogar andere Reaktion hervorruft (Paschold A. et al., 2006).

Sowohl von den Emitterpflanzen, als auch von den nicht verwundeten Receiver-

Pflanzen wurden zu bestimmten Zeitpunkten von je 6-8 Pflanzen die jüngsten Blätter

geerntet und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Außerdem wurden weitere

Pflanzen in abgetrennte Räume gestellt, und ebenfalls zu bestimmten Zeitpunkten

geerntet um als Kontrolle zu dienen. Die so gewonnenen Pflanzenproben wurden

mittels Western Blot analysiert. Alle gezeigten Ergebnisse sind mindestens dreimal

wiederholt worden, in den meisten Fällen konnte ein biologisches Replikat erstellt

werden um die Ergebnisse zu verifizieren.

3. Ergebnisse 71

3.8.1 OPR3 wird durch Green Leave Volatiles Induzie rt

Wie aus Abbildung 36 ersichtlich ist, induziert die Anwesenheit von VOCs, die bei der

Verwundung von Pflanzen freigesetzt werden, OPR3. Ein gewisser Grundspiegel an

OPR3 ist vorhanden, andere Analysen zeigten einen geringeres oder gar keinen

Spiegel an OPR3 in den Kontrollpflanzen. In den Kontrollen sind sowohl eine Bande

von OPR3 als auch von phosphoryliertem OPR3 zu sehen. OPR1 ist als Kontrolle

aufgetragen um auszuschließen, dass der OPR3 Antikörper an das verwandte OPR1

Protein bindet.

kDa

72

55

43

K 0‘ K 60‘ K 180‘ TV 0‘ TV 60‘ TV 180‘ M OPR1 OPR3 TKB1

Abb. 36: Western Blot von Gesamtproteinextrakten von VOC-Empfänger

Tomatenpflanzen mit AntiOPR3 mit zugehöriger Ponceaufärbung

Gesamtproteinextrakt von Receiver-Tomaten aus getrennten Räumen (K0’, K60’, K180’)

und unverwundeten Tomaten, die den flüchtigen Aldehyden verwundeter Tomaten

ausgesetzt waren (TV0’, TV60’, TV180’) jeweils zu den Zeitpunkten 0, 60 und 180 Minuten.

Als Kontrollen waren jeweils 10 ng OPR1-Protein sowie 0,1 ng OPR3-Protein und

Phosphoryliertes OPR3-Protein (TKB1) aufgetragen. Ein Pfeil markiert die Größe von

OPR3.

3. Ergebnisse 72

vw5’ vw10’ vw20’ vw30’ vw45’ vw60’ vw120’ vw180’ M OPR3 TKB1kDa

72

55

43

34

Abb. 37: Western Blot von Gesamtproteinextrakten verwundeter Tomatenpflanzen mit

AntiOPR3

Gesamtproteinextrakte von verwundeten Tomatenpflanzen zu den Zeitpunkten 5, 10, 20,

30, 45, 60, 120 und 180 Minuten, im Bild bezeichnet durch vw5’, vw10’, vw20’, vw30’,

vw45’, vw60’, vw120’ und vw180’. Als Kontrollen wurden aufgetragen jeweils 0,1 ng OPR3-

Protein und phosphoryliertes OPR3-Protein. Ein Pfeil markiert die Höhe von OPR3.

Abbildung 37 zeigt, dass OPR3 durch Verwundung bereits nach 10 Minuten induziert

wird, mit einem geringen Rückgang nach 30 Minuten und einem erneuten Maximum

bei 60 Minuten. Nach 180 Minuten ist bereits kein OPR3 mehr vorhanden, während

bei der Induktion durch VOCs nach 180 Minuten das Maximum erreicht ist.

2 weitere Banden lassen sich am unteren Rand des Blots ausmachen, bei einer Höhe

zwischen 30 und 40 kDa. Diese könnten Degradationsbanden von OPR3 seien, da sie

im selben Maße zunehmen wie OPR3, allerdings um einen gewissen Zeitfaktor nach

hinten versetzt, oder Degradationsbanden anderer Proteine, die durch die

Verwundungsreaktion induziert werden und OPR3 ähnlich sind, wie z.B. andere

Proteine aus der OPR Familie, allerdings sind sie viel kleiner als OPR3.

Die Induktion bei Verwundung ist eine schnellere, aber zeitlich begrenztere Induktion

als durch VOCs. Wenn man bedenkt, dass die Induktion durch VOCs nur eine

Vorsichtsmaßnahme für eventuell folgende Verwundungen ist, macht dies durchaus

Sinn, da die Bildung von OPR3 sozusagen auf Vorrat für eine nur möglicherweise viel

später eintretende Verwundung erfolgt.

3. Ergebnisse 73

3.8.2 LeOPR3 wird bei Induktion durch Green Leave Volatiles

Phosphoryliert

Anti PT-66 bindet an phosphorylierte Tyrosine, die sich in einer Vielzahl in einer

Pflanze befinden. Deswegen zeigt der Western Blot mit PT-66 eine Vielzahl von

Banden kleiner als 43 kDa. Mit der Induktion von OPR3 durch VOCs geht ein Anstieg

des Phosphorylierungsspiegels einher. Insbesondere auf Höhe der OPR3-Bande ist

nach Induktion durch VOCs eine neue Bande erkennbar (Siehe Abb. 38). Dies legt die

Vermutung nahe, dass durch VOCs induziertes OPR3 vorerst Phosphoryliert wird, und

somit inaktiv ist um für eine eventuell folgende Wundreaktion sofort aktiviert werden zu

können um den Oktadecanoidweg bis zur Jasmonsäure und zur Wundabwehr

einzuleiten. Bei verwundeten Tomatenpflanzen (Abb. 39) ist ebenfalls ein geringer

Spiegel an Phosphorylierung zu sehen, allerdings in einem weit geringeren Maßstab

als bei der Induktion durch VOCs.

K 0‘ K 60‘ K 180‘ TV0‘ TV60‘ TV180‘ M OPR3 TKB1 kDa72

55

43

34

17

Abb. 38: Western Blot von Proteinextrakten von VOC-Empfänger Tomatenpflanzen mit

AntiPT-66

Gesamtproteinextrakte von Tomaten unverwundet aus getrennten Räumen (K0’, K60’,

K180’) und Tomaten unverwundet, die den flüchtigen Aldehyden verwundeter Tomaten

ausgesetzt waren (TV0’, TV60’, TV180’) jeweils zu den Zeitpunkten 0, 60 und 180 Minuten.

Als Kontrollen waren jeweils 10 ng OPR1-Protein sowie 0,1 ng OPR3-Protein und

phosphoryliertes OPR3-Protein (TKB1) aufgetragen. Ein Pfeil markiert die erwartete Größe

von OPR3.

3. Ergebnisse 74

vw5’ vw10’ vw20’ vw30’ vw45’ vw60’ vw120’ vw180’ M OPR3 TKB1kDa55

43

34

Abb. 39: Western blot von Proteinextrakten verwundeter Tomatenpflanzen mit Anti PT-

66

Gesamtproteinextrakte von verwundeten Tomatenpflanzen zu den Zeitpunkten 5, 10, 20,

30, 45, 60, 120 und 180 Minuten, im Bild bezeichnet durch vw5’, vw10’, vw20’, vw30’,

vw45’, vw60’, vw120’ und vw180’. Als Kontrollen wurden aufgetragen jeweils 0,1 ng OPR3-

Protein und phosphoryliertes OPR3-Protein (TKB1). Ein Pfeil markiert die Höhe von OPR3.

3.8.3 Im Arabidopsis Wildtyp wird OPR1 durch die In duktion von

OPR3 reprimiert

Um sicher zu gehen, dass es sich bei den angezeigten Signalen des OPR3

Antikörpers auch wirklich um ein OPR3 Protein handelt und nicht um eine

Kreuzreaktion mit einem OPR1 Protein, wurden zusätzliche Western Blot Analysen mit

Antikörpern gegen OPR1 und OPR3 Proteine durchgeführt. Hierfür wurde ein neues

Verwundungsexperiment geplant, bei dem zusätzlich klar gestellt werden sollte, ob

VOCs spezifisch intrafamiliär wirken, oder ob auch VOCs von Artfremden Pflanzen

eine Reaktion auslösen können. Hierfür wurden Arabidopsis-Pflanzen als VOC-

Empfänger gewählt, wohingegen Tomaten und Arabidopsis-Pflanzen in 2 getrennten

Experimenten als VOC Emitter Pflanzen verwundet wurden. In beiden Versuchsreihen

wurden die VOC Empfänger Pflanzen nach 0, 30, 60 und 90 Minuten geerntet.

Verwundete Emitter Pflanzen wurden nach 60 und 90 Minuten geerntet. Des Weiteren

wurde eine Arabidopsis opr3-Mutante Pflanze ebenfalls verwundet und nach 60

Minuten geerntet.

3. Ergebnisse 75

Anti OPR1

AntiOPR3

Anti PT-66

Abb. 40: Western Blots von Arabidopsis-Pflanzen, die VOCs von Tomaten (TV) und

Arabidopsis-Pflanzen (AV) ausgesetzt waren, geerntet nach je 0, 30, 60 und 90 Minuten.

Als Kontrolle dienten verwundete opr3 Pflanzen, die nach 60 Minuten geerntet wurden,

sowie verwundete Arabidopsis-Pflanzen nach 60 und 90 Minuten Verwundung, außerdem

0,1 ng aufgereinigtes OPR3 und 10 ng OPR1 Protein bzw. 0,1 ng Phosphoryliertes OPR3

Protein (TKB1). Detektion mit AntiOPR1 (Oben), AntiOPR3 (Mitte) und Anti PT-66 (Unten)

kb

72

55

43

34

TV

0’

TV

30’

TV

60’

TV

90’

AV

0’

AV

30’

AV

60’

AV

90’

Mar

ker

opr3

vw

60’

vw60

’

vw90

’

OP

R3

OP

R1

kb

72

55

43

TV

0’

TV

30’

TV

60’

TV

90’

AV

0’

AV

30’

AV

60’

AV

90’

Mar

ker

opr3

vw

60’

vw60

’

vw90

’

OP

R3

OP

R1

kDa

72

55

43

34

TV

0’

TV

30’

TV

60’

TV

90’

AV

0’

AV

30’

AV

60’

AV

90’

Mar

ker

opr3

vw 6

0’

vw60

’

vw90

’

TK

B1

OP

R3

3. Ergebnisse 76

Abbildung 40 zeigt die Gesamtproteinextrakte beider Versuchsanordnungen. Es zeigt,

dass OPR1 60 bis 90 Minuten, nachdem in die Pflanze entweder verwundet, oder von

VOCs erreicht wurde, im Western Blot nicht mehr nachweisbar ist. Im Gegenzug steigt

der Spiegel an OPR3 bei der Induktion durch VOCs bereits nach 30 Minuten deutlich

an. Dieses Experiment lässt darauf schließen, dass sowohl OPR1 als auch OPR3

durch eine Verwundung bzw. eine Reaktion auf VOCs reguliert werden. Weitere

Experimente mit opr1- und opr3-mutanten Pflanzen sollen weiteren Aufschluss über

diesen Zusammenhang geben.

Von denselben Proteinextrakten wurden nun auch eine Western Blot Analyse mit Anti-

PT 66 durchgeführt, um Aufschluss über die Phosphorylierung von OPR3 zu erlangen.

Wie allerdings Abbildung 40 (unten) zeigt sind zwar auf Höhe des OPR3 Proteins

Signale zu sehen, die aber in der opr3-Mutante ebenfalls zu finden sind. Es kann sich

hierbei also nicht um das gesuchte OPR3 Protein handeln.

3.8.4 In opr1 Pflanzen ist OPR3 konstitutiv aktiv

Wie bereits in den vorangegangenen Experimenten erwähnt, sollte sicher gestellt

werden, dass das von Anti OPR3 detektierte Protein wirklich OPR3 ist und nicht eine

Kreuzreaktion mit OPR1 ein Signal gibt. Deswegen wurde ein weiteres VOC

Experimente mit Arabidopsis opr1-Mutanten Pflanzen durchgeführt. Hierbei stellte sich

heraus dass durch die Abwesenheit von OPR1 OPR3 konstitutiv aktiv ist (siehe Abb.

41 oben). Sowohl in den Kontrollpflanzen, als auch in allen verwundeten und durch

VOCs induzierten Pflanzen ist bereits vom Nullpunkt an ein hoher Spiegel an OPR3 zu

beobachten. Bei einer Induktion durch VOCs erhöht und verringert sich dieser Spiegel

noch im selben Maße, wie es auch bei einer normalen Verwundungsreaktion der Fall

ist. Überraschenderweise ist 120 Minuten nach der ersten VOC-Freisetzung in den

Empfänger Pflanzen OPR3 nicht mehr detektierbar, wohingegen bei Abbildung 36

noch ein Maximum an OPR3 bei 180 Minuten nach dem Empfang von VOCs zu sehen

war.

3. Ergebnisse 77

In Abbildung 41 (unten) ist der Western Blot derselben Proteinextrakte, detektiert mit

Anti PT-66 zu sehen. Auch hier lässt sich zwar eine zusätzliche Bande bei den durch

VOCs induzierten Pflanzen im Vergleich zu verwundeten und Kontrollpflanzen

ausmachen, diese ist allerdings etwas höher als die zur Kontrolle aufgetragenen

OPR3 Proteine. Beim Vergleich mit Arabidopsis opr3-mutanten Pflanzen, die im

selben Muster verwunden und geerntet wurden wie das vorangegangene Experiment

ließ sich ungefähr dasselbe Bandenmuster ausmachen. (siehe Abbildung 42). Es ist in

Arabidopsis-Pflanzen also unklar, ob OPR3 durch reversible Phosphorylierung

reguliert wird.

K 0

’

K 1

20’

vw60

’

vw12

0’

Mar

ker

AV

5‘

AV

15’

AV

30’

AV

45’

AV

60’

AV

120

’

OP

R3

TK

B1

OP

R1

kDa

72

55

43

34

K 0

’

K 1

20’

vw 6

0’

vw 1

20’

Mar

ker

AV

5‘

AV

15’

AV

30’

AV

45’

AV

60’

AV

120

’

OP

R1

OP

R3

TK

B1

kDa

72

55

43

34

Abb. 41: Western Blot von Proteinextrakten verwundeter (vw) opr1-defizienter

Arabidopsis Pflanzen und VOC-Empfänger opr1-defizienter Arabidopsis Pflanzen (AV)

detektiert mit AntiOPR3 (oben) und mit Anti-PT 66 (unten). Als Kontrollen wurden jeweils

0,1 ng OPR3-Protein und phosphoryliertes OPR3-Protein (TKB1), sowie 10 ng OPR1

Protein aufgetragen. Ein Pfeil markiert die Höhe von OPR3.

3. Ergebnisse 78

K 0

’

K 1

20’

vw 6

0’

vw 1

20’

AV

5‘

AV

15’

AV

30’

AV

45’

AV

60’

AV

120

’

Mar

ker

OP

R3

OP

R1

TK

B1

kDa

72

55

43

34

Abb. 42: Western Blot von Proteinextrakten verwundeter (vw) opr3-defizienter

Arabidopsis Pflanzen und VOC-Empfänger opr1-defizienter Arabidopsis Pflanzen (AV)

detektiert mit Anti-PT 66. Als Kontrollen wurden jeweils 0,1 ng OPR3-Protein und

phosphoryliertes OPR3-Protein (TKB1) sowie 10 ng OPR1 Protein aufgetragen. Ein Pfeil

markiert die Höhe von OPR3.

4. Diskussion 79

4. Diskussion

4.1 OPR3 kann nicht durch punktmutierte OPR1 Proteine

ersetzt werden

Die Genfamilie der Oxophytodiensäure Reduktasen ist eine weit verbreitete Familie in

Pflanzen. In Tomate wurden bisher drei, in Arabidopsis fünf Isoformen identifiziert, die

eine Reduktion von α.β−ungesättigten Kohlenstoffverbindungen katalysieren. OPR3 ist

der am weitesten entfernte Verwandte der Familie und die einzige Isoform, die in der

Lage ist, die Reduktion von cis(+)OPDA zu katalysieren. OPR1 hingegen kann in vitro

nur cis(-)OPDA reduzieren. Die hohe Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz von

OPR3 und OPR1 und ihre ähnlichen Substrate in vitro legen nahe, dass OPR1 durch

zielgerichtete Mutationen dasselbe Substratspektrum erreichen könnte, wie OPR3.

Hierfür wurden OPR1 cDNAs an 2 Stellen punktmutiert. Diese Punktmutationen waren

im β3-Loop, der in der Struktur von OPR1 eine Art Deckel über das Aktive Zentrum

bildet und somit den Zutritt von cis(+)OPDA, des physiologischen Substrates von

OPR3, verhindert. Um die Lokalisation des mutierten Proteins im Peroxisom, dem

Wirkungsort von OPR3 sicherzustellen, wurde außerdem durch PCR ein SRL-Tag an

das C-terminale Ende von OPR1 kloniert.

Dennoch konnte eine opr3-defiziente Arabidopsis thaliana Pflanze nicht durch die

punktmutierten OPR1 Proteine komplementiert werden. Eine Komplementation durch

die Punktmutationen ist also nicht ausreichend um die Substratspezifität von OPR3

herzustellen. Um sicher zu gehen, dass die Proteine im Peroxisom lokalisiert sind und

nicht aufgrund einer Fehllokalisation keine Aktivität zeigen, wurden Zellorganellen mit

Hilfe eines Saccharosegradienten aufgetrennt und untersucht. Aufgrund der geringen

Menge an Pflanzenmaterial konnte allerdings nicht eindeutig geklärt werden, ob sich

die mutierten Proteine im Peroxisom befanden oder nicht.

Um diesen Sachverhalt eindeutig zu klären müssen erneut Samen der transformierten

Pflanzen ausgesät und die Lokalisation der Proteine durch Zellorganellfraktionierung

untersucht werden. Eine weitere Möglichkeit der Untersuchung der subzellulären

Lokalisation wäre eine Detektion durch eine in situ Protein Lokalisierung mit

fluoreszierenden Antikörpern gegen OPR1 (Sauer M. et al., 2006). Hierfür würde sich

allerdings eine opr1-defiziente Pflanze eignen, da OPR1 normalerweise im Cytoplasma

lokalisiert ist und eine Lokalisation im Peroxisom somit überstrahlt werden könnte.

Sollte wider erwarten das Protein nicht im Peroxisom vorhanden sein müsste ein neues

Konstrukt zur Transformation hergestellt werden.

4. Diskussion 80

Allerdings konnte bereits gezeigt werden, dass das SRL-Tag für eine Lokalisation

eines Proteins im Peroxisom ausreichend ist (Mullen, 1997). Ferner sollten neue

Transformationen von Arabidopsis opr3-Mutanten mit den verschiedenen Konstrukten

OPR1+SRL, Y74F, Y244H, und Y74F/Y244H erfolgen, um mehr unabhängige Linien

zu erhalten. Die Insertion der OPR1 enthaltenden T-DNA erfolgt zufällig im Genom. Es

ist möglich, dass weitere Linien einen Phänotyp zeigen.

Eventuell ist OPR1 nicht ausreichend exprimiert um eine ausreichende Menge an

Protein zu produzieren, die den Oktadekanoidweg vervollständigen kann. Es ist zwar

ein 2130 bp großes Fragment des OPR3 Promotors in der T-DNA vorhanden, das

ausreichend groß sein sollte um die Transkription von OPR1 zu gewährleisten, aber

eventuell ist durch das Vorhandensein nur einer Genkopie im diploiden Organismus die

Funktion nicht ausreichend. Die T2 Generationen der jeweiligen transformierten

Pflanzen, in denen zwei Kopien des mutierte Genes vorhanden sind, sollten hierüber

Aufschluss geben. Eventuell könnten weitere Konstrukte mit einem 35S-Promotor statt

des OPR3 Promotors Aufschluss über sowohl die Aktivität, als auch, bei einer erneuten

Zellorganellfraktionierung, über die Lokalisation der mutierten OPR1-Proteine geben.

Sollten auch diese Pflanzen männliche Sterilität zeigen, so müssen noch weitere

Aminosäuren im β3-Loop mutiert werden. Hierbei gibt es mehrere Möglichkeiten.

Entweder tauscht man die Aminosäuren aus, die in der Nähe der bereits mutierten

Tyrosine an Position 244 und 74 sind, oder man versucht den β3-Loop bereits im

Ansatz zu mutieren, um einen anderen Winkel des Loops zu erreichen, wodurch der

Zugang des Substrates zum aktiven Zentrum erleichtert wird.

4. Diskussion 81

4.2 Arabidopsis zeigt keinen Veränderungen durch

punktmutierte OPR3 Proteine

Durch Röntgenkristallanalysen konnte gezeigt werden, dass OPR3 als Homodimer

kristallisiert. Zielgerichtete Mutationen in der Dimerisierungsschleife des Glutamats an

Position 291 in Lysin (E291K) haben gezeigt, dass das so mutierte Protein in vitro nicht

mehr dimerisieren kann (Breithaupt et al., 2006). Eine Komplementation von opr3-

defizienten Arabidopsis thaliana mit dem punktmutierten Protein war erfolgreich, die

männliche Fertilität konnte wieder hergestellt werden.

Für eine weitere Mutation, Tyrosin an Position 364 wurde durch Phenylalanin ersetzt

(Y364F), konnten allerdings keine positiven transformierten Pflanzen identifiziert

werden. Eine erneute Transformation von opr3-defizienten Arabidopsis thaliana ist

notwendig um Rückschlüsse auf die Wiederherstellung der männlichen Fertilität ziehen

zu können.

Mit den T2 Generationen beider Transformanten müssen dann eine Vielzahl an

Experimenten durchgeführt werden, um Rückschlüsse ziehen zu können, ob OPR3 in

vivo durch die eingebrachten Mutationen nicht mehr dimerisieren kann. Durch native

SDS-PAGE lässt sich klären, ob das mutierte OPR3 als Monomer oder als Dimer

vorliegt.

Durch die dauerhafte Aktivität von OPR3 könnte auch konstant Jasmonsäure gebildet

werden. Ein solch erhöhter Jasmonsäurespiegel, ohne dass eine Pflanze verwundet

oder den bereits erwähnten Volatile organic compounds (VOCs) ausgesetzt wurde, ist

messbar. Wie in der Einleitung erwähnt, steuert Jasmonsäure eine Vielzahl an

Prozessen in der Pflanze. Durch eine dauerhafte Aktivität von OPR3 könnte auch

beständig Jasmonsäure gebildet werden und somit die Transkripte der durch

Jasmonsäure induzierten Gene dauerhaft vorhanden sein. Diese lassen sich durch

Microarray-Analysen im Vergleich mit wildtypischen Pflanzen und den transgenen

Pflanzen nachweisen. Auch ein erhöhter Jasmonsäurespiegel gegenüber dem Wildtyp

sollte durch die konstante Aktivität nachweisbar sein.

Sollten entgegen der Ergebnisse der Kristallisierung der beiden mutierten Proteine

OPR3 in vivo dennoch dimerisieren können, müssten Doppelmutationen der beiden

Proteine hergestellt werden um somit auszuschließen, dass nur eine der beiden

Mutationsstellen für eine erfolgreiche Dimerisierung ausreichend ist.

4. Diskussion 82

4.3 OPR3 wird durch VOCs induziert

Bei Verwundungsexperimenten und Experimenten, bei denen Tomatenpflanzen VOCs

von verwundeten Tomaten ausgesetzt waren, konnte gezeigt werden, dass OPR3

sowohl durch Verwundung, als auch durch VOCs induziert wird. Es ist also nicht nur

eine Transkript-Induktion von OPR3 wie bei Nicotiana attenuata (Paschold et al.,

2006), sondern auch ein Vorhandensein des Proteins nachweisbar.

Western Blots mit einem Phosphotyrosin spezifischem Antikörper (Anti PT-66) zeigten,

dass von der Größe des OPR3 Proteins eine zusätzliche Bande im Vergleich zu nicht

mit VOC induzierten Kontrollpflanzen sichtbar ist. Allerdings ist nicht eindeutig

nachweisbar, dass sich diese Bande auch auf OPR3 bezieht, oder ob ein anderes

Protein derselben Größe durch den Empfang von VOCs phosphoryliert wird.

Bei Arabidopsis Pflanzen hingegen ist zwar, wie in Tomatenpflanzen, dieselbe

Induktion von OPR3 durch Verwundung und VOCs sichtbar, allerdings konnte keine

eindeutige Phosphorylierung festgestellt werden. Der Vergleich von wildtypischen,

opr3-defizienten und opr1-defizienten Arabidopsis thaliana erbrachte ebenfalls keinen

Aufschluss darüber, welches Protein phosphoryliert wird. Eine zweidimensionale SDS-

Page könnte Aufschluss geben, ob OPR3 oder OPR1 durch die Induktion mit VOCs

phosphoryliert werden.

Es stellt sich natürlich die Frage, welchen Sinn ein Vorhandensein des OPR3-Proteins

hat, wenn keine Jasmonsäure gebildet wird (Paschold et al., 2006). Die Autoren

vermuten, dass durch die Transkription von Genen, die in einer Abwehrreaktion bei

Befall durch Herbivore beteiligt sind, die Fitness der Pflanze steigt, indem sie bei einem

eigenen Befall schneller Jasmonsäure ausschütten kann. Somit werden andere Gene

schneller induziert und eine Abwehrreaktion setzt schneller ein.

In Langzeitexperimenten ließe sich überprüfen, ob Pflanzen, die längere Zeit VOCs

ausgesetzt sind eine schnellere Abwehrreaktion und somit auch eine höhere Fitness

haben, als Pflanzen, die ohne vorherigen VOC-Einfluss verwundet wurden.

Es wäre interessant zu erfahren, an welchen Stellen OPR3 phosphoryliert wird und

durch welche Mechanismen diese Phosphorylierung vermittelt wird. Aktivitätstest eines

phosphorylierten OPR3 Proteins können Aufschluss darüber geben, wann eine

Phosphorylierung Einfluss auf die Aktivität hat.

4. Diskussion 83

Um einen Rückschluss auf Phosphorylierung von OPR3 im Zusammenhang mit der

Aktivität zu erhalten, empfehlen sich die mit den E291K und Y364F transformierten

Arabidopsis-Pflanzen für gleichartige Experimente. Die Mutation Y364F ist an einer

Stelle, die eine Dimerisierung durch Phosphorylierung stabilisieren soll. Wenn im

Wildtyp eine Dimerisierung durch eine Phosphorylierung auftritt und OPR3 somit

inaktiviert ist, sollte es bei dieser Mutante weder zu Phosphorylierung noch zur

Inaktivität kommen. Pflanzen die VOCs ausgesetzt sind, sollten also

unphosphoryliertes OPR3 bilden und somit auch Jasmonsäure, obwohl sie nicht

verwundet sind – gesetzt den Fall, dass Jasmonsäure nicht schon vorher durch eine

dauerhafte OPR3 Aktivität gebildet worden ist.

Des Weiteren sollten auch Experimente mit Emitter Pflanzen durchgeführt werden, die

nicht mit einer Gefäßklemme nur mechanisch verwundet wurden, sondern auf

natürliche Weise verwundet werden, beispielsweise durch Frass von Manduca sexta,

um zu überprüfen, ob sich die Reaktion der Empfänger-Pflanzen ändert. Möglich wäre,

dass sich der Phosphorylierungsspiegel ändert, wenn die Verwundung natürlicher Art

ist. Alborn et al. (1997) konnten zeigen, dass durch eine Verwundung von Mais durch

Raupenfrass Volicitin gebildet wird, was zur Freisetzung von VOCs führt. Die Pflanze

kann allerdings aufgrund der enzymatischen Aktivität des Raupenregurgitats

unterscheiden, ob sie mechanisch oder durch einen Fraßfeind verwundet wird. So

scheint die Verwundung durch Fraß einen höheren Stellenwert einzunehmen, als eine

reine mechanische Verwundung.

5. Anhang VII

5. ANHANG

5.1 Ergebnisse der Pollenkeimungstests

5.1.1 Wildtyp

Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen

1 106 282 388 72,7%

2 74 327 401 81,5%

3 66 259 325 79,7%

4 66 303 369 82,1%

5 65 215 280 76,8%

6 66 233 299 77,9%

7 48 253 301 84,1%

8 68 227 295 76,9%

9 75 282 357 79,0%

Mittelwert 79,0%

Standard-abweichung 3,4%

5.1.2 Arabidopsis opr3-Mutante

Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen 1 94 8 102 7,8% 2 31 12 43 27,9% 3 112 29 141 20,6% 4 152 7 159 4,4% 5 94 2 96 2,1%

Mittelwert 12,6%


Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen 1 129 22 151 14,6% 2 127 6 133 4,5% 3 156 7 163 4,3% 4 223 36 259 13,9% 5 186 53 239 22,2% 6 180 34 214 15,9%

Mittelwert 12,6%


5. Anhang VIII

5.1.3 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR3 cDNA

opr3-Mutante komplementiert mit OPR3 cDNA – Linie 4


Mittelwert 77,7%


opr3-Mutante komplementiert mit OPR3 cDNA – Linie 5


Mittelwert 77,9%


5.1.4 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit E291K

Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit E291K – Linie 1


Mittelwert 76,8%


5. Anhang IX

Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit E291K – Linie 6


Mittelwert 75,2%


5.1.5 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR1+SRL

Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR1+SRL – Linie 1


Mittelwert 11,9%

Standard-abweichung

4,1%


Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen 1 111 4 115 3,5% 2 96 8 100 8,0% 3 177 12 189 6,3%

Mittelwert 5,9%



Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen 1 172 0 172 0,0% 2 128 0 128 0,0% 3 217 0 217 0,0% 4 136 0 136 0,0%

Mittelwert 0,0%

Standard-abweichung

0,0%

5. Anhang X



Mittelwert 0,0%

Standard-abweichung

0,0%

5.1.6 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit O PR1+SRL-

Y244H

Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit OPR1+SRL Y244H – Linie 1


Mittelwert 15,0%

Standard-abweichung

4,8%


Blüte ungekeimt gekeimt gesamt %gekeimte Pollen 1 36 4 40 10,0% 2 93 10 103 9,7% 3 216 18 234 7,7% 4 141 16 157 10,2%

Mittelwert 9,4%

Standard-abweichung. 0,9%


Blüte ungekeimt gekeimt gesamt %gekeimte Pollen 1 195 2 197 1,0% 2 118 0 118 0,0% 3 210 7 217 3,2% 4 163 0 163 0,0%

Mittelwert 1,0%

Standard-abweichung. 1,4%

5. Anhang XI


Blüte ungekeimt gekeimt gesamt %gekeimte Pollen 1 262 22 284 7,7% 2 57 5 62 8,1% 3 153 11 164 6,7% 4 112 11 123 8,9% 5 46 4 50 8,0% 6 73 7 80 8,8%

Mittelwert 8,0%



ungekeimt gekeimt gesamt %gekeimte Pollen 1 30 0 30 0,0% 2 62 6 62 9,7% 3 12 0 12 0,0% 4 27 1 28 3,6%

Mittelwert 6,6%



ungekeimt gekeimt gesamt %gekeimte Pollen 1 36 6 42 14,3% 2 59 7 66 10,6% 3 212 32 244 13,1% 4 0 100 0,0%

Mittelwert 9,5%



ungekeimt gekeimt gesamt %gekeimte Pollen 1 276 0 276 0,0% 2 428 2 430 0,5% 3 273 1 274 0,4% 4 421 7 428 1,6% 5 370 2 372 0,5% 6 318 2 320 0,6% Mittelwert 0,6%


5. Anhang XII

5.1.7 Arabidopsis opr3-Mutante komplementiert mit O PR1+SRL

Y244H/Y74F


Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen 1 66 2 68 2,9% 2 113 7 120 5,8% 3 88 7 95 7,4% 4 73 2 75 2,7% 5 17 0 17 0,0% 6 126 5 131 3,8% 7 74 0 74 0,0% 8 78 0 78 0,0% 9 15 0 15 0,0%

Mittelwert 2,5%



Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen 1 57 6 63 9,5% 2 65 5 70 7,1% 3 124 3 127 2,4% 4 107 10 117 8,5% 5 101 9 110 8,2% 6 60 5 65 7,7% 7 73 7 80 8,8% 8 100 2 102 2,0%

Mittelwert 6,8%

Standard-abweichung

2,9%


Blüte ungekeimt gekeimt gesamt % gekeimte Pollen 1 83 6 89 6,7% 2 268 5 273 1,8% 3 378 2 380 0,5% 4 219 5 224 2,2%

Mittelwert 2,8%


5. Anhang XIII



Mittelwert 8,5%

Standard-abweichung

0,5%



Mittelwert 0,0%

Standard-abweichung

0,0%

5. Anhang XIV

5.2 Sequenz des AtOPR3 Promotors

NotI SacII Primer 19 OPR3PR-1 gGCGGCCGCGGttcgattgat tacatcctca gcgtgac

1 ttcgattgat tacatcctca gcgtgacaaa tccaaattca ca ataaatca tataagcaat 61 acagcttttc gattacatct taaaccacct tagtgaggtt ct ataactaa aatggttgaa 121 ttatattaaa ctaaacaaac aatgttttct aaaaatggta tg cccaaaaa tggtttacga 181 aaaatagact caaaaataca aatgtcattg gcgaaaaata aa tgacaatt aatgaatata 241 caaataatag ataaaaagca aaatgaaata aattttcaat gt ttcattta gttaaagata 301 gtgtatcttg aagatcataa cgtattttag attatgtacc tg atttataa gtggcttata 361 aatcacctac cattttacca gtaaccgatc taatctacac ac aaatatca tcttttactc 421 ttataagatt ttaaccatat ttttagatct cataagaatc aa tgcaattt catataaaac 481 atcaaaataa ttctataaat taaaattttc tcaagataat at ttaatttt atttataaat 541 ctcttaatta gccatctttc tacatttatc aaaagatatt ag ctatctgt tctcataggc 601 aatatgataa aaaaaaaaac tttttccaag ttaggggcac aa aaagagtt tccctgggac 661 ttgggctgag aataatgaag tggctgggaa atgattagtt aa ggatggct tgatgaattc 721 tcaatattct gttgagggaa caaaatatac taggaaggat gc aagtccag tttggtctaa 781 accattgtac gaaccaaaaa caatcaataa agtaactcag gg ctcacaaa tggtcgataa 841 tatttctaaa gtttcagttc tagaggatga gcaaaaggat tt gatgatgg gagatgtact 901 agaggtacaa gacaagagtc tcactgaagg gttgaatttc ag atatttta aatcacgttt 961 ggagtaacaa aaaacaaatg tgagaaggag ctcaattagc tc caactgaa tctagtgtta 1021 ttagggatac tttggaaact ccaattcaat ctttaagatg ta ggattgat gaattcatgg 1081 aaatcggcag atccatctat gaatttagta tggtggtgtt tc ctaggaat tgacaataca 1141 attttacttg gtgcaaagtg tcttcggagg tgtccctttc tt tttcactc ggaattggaa 1201 gttttaatat tggcaataaa aaatatcctt tcaagaagga ta aagtgtca ggcatttgaa 1261 acagataatt attcagagta agttttgatg gtacagtccc ct gaagaatg actcgctttc 1321 tctaattttt tagaagatct tgaattgcta tgtgtctcct tt tcttgctt tcttctattt 1381 catgtttatg taatactaag gcaaactatt tagcacaata tt ctaaactt ttattttctg 1441 aagttatttt ttaaaccctt tccctcctaa ttggacaacc aa tcatggaa ttagttttta 1501 cgtaatgttt taaactcact atttcacctt tattctgacc tg ttaatgga agacaactat 1561 gactttatac attgaaatgt tgtcaacctg ttatatatta at gttaacat agctaatgac 1621 ctatcaatgt acgtaaagcg aatgtcaatc atattcgtat cc gttaattt catttaggaa 1681 atcaggctca ttgccaatcc actaagaaac atctctgata ga tccaaata ataaaaataa 1741 tataatatga agcaaaatag aacgaaatat ctcacgcgga cc aaactttg aactttatta 1801 taaaacaaat cagcacgtga aagtaatggt cggttcggtc ca agatgcca agaactcctc 1861 cggtccatcc atcaacctaa ccttttttgg atataaaatt ta gcaaattc catttccacg 1921 accacacaac aacaacacat ccactcgaat tttctatttc cg aataacaa aaccggtaaa 1981 ctcatcacaa acttaagtta ctttgtagtt tgtgttttgt cc ttttatgt aatgaagaag 2041 atccaactaa ctactactca atatttttgt attgaccgtt ga tttctcag atctgacttt 2101 tacttctcct tcttccagat cggcggagac AAGAGGA AGAAGGTCTA GCCGCCTCTG TGATCAgg Primer 20 OPR3PR-R2120 SpeI

5. Anhang XV

5.3 Aminosäure und Basensequenz von LeOPR1

Farbig markiert sind Anlagerungsstellen der Mutageneseprimer, sowie die

auszutauschenden Basenpaare und daraus resultierenden ausgetauschten

Aminosäuren in der Proteinsequenz.

1: M E N K V V E E K Q V D K I P L M S P C

ATGGAAAATAAAGTCGTTGAAGAGAAACAAGTAGACAAGATCCCTCTAATGAGCCCTTGT

1 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 60

1: K M G K F E L C H R V V L A P L T R Q R

AAAATGGGAAAGTTTGAGTTATGTCATAGAGTTGTATTGGCACCATTAACAAGGCAAAGA

61 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 120

1: S Y G Y I P Q P H A I L H Y S Q R S T N

TCTTATGGTTATATTCCTCAACCACATGCTATACTTCATTACTCACAAAGAAGTACAAAT

121 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 180

LeOPR1Y74F-For tatctgagactggcatagggtttaaagat

1: G G L L I G E A T V I S E T G I G Y78 K D

GGTGGCCTTCTAATAGGAGAGGCCACAGTAATATCTGAGACTGGCATAGGGTACAAAGAT

181 ---------!---------!---------!---------!--- ------!- TTT-----! 240

LeOPR1Y74F-Rev F74

gtacctggtatatgg

1: V P G I W T K E Q V E A W K P I V D A V

GTACCTGGTATATGGACAAAAGAGCAAGTGGAGGCTTGGAAACCAATTGTAGATGCAGTT

241 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 300

1: H A K G G I F F C Q I W H V G R V S N K

CATGCTAAAGGAGGAATCTTCTTTTGCCAAATTTGGCATGTTGGTAGAGTTTCCAACAAA

301 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 360

1: D F Q P N G E D P I S C T D R G L T P Q

GATTTTCAGCCCAATGGAGAGGATCCTATCTCCTGCACAGACAGAGGACTAACACCTCAA

361 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 420

1: I R S N G I D I A H F T R P R R L T T D

ATTCGTTCCAATGGCATAGATATTGCACACTTTACACGACCTAGACGGTTGACAACAGAT

421 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 480

1: E I P Q I V N E F R V A A R N A I E A G

GAAATTCCTCAAATTGTTAACGAATTTCGAGTTGCTGCTAGAAACGCAATTGAAGCTGGA

481 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 540

5. Anhang XVI

1: F D G V E I H G A H G Y L I D Q F M K D

TTTGATGGGGTTGAGATCCACGGAGCTCATGGCTATCTAATTGATCAGTTTATGAAAGAT

541 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 600

1: Q V N D R S D K Y G G S L E N R C R F A

CAAGTTAACGATCGAAGTGATAAATATGGAGGGTCTTTAGAGAATCGTTGTAGATTTGCA

601 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 660

ta

1: L E I V E A V A N E I G S D R V G I R I

CTTGAAATAGTGGAAGCAGTTGCAAATGAGATTGGATCTGACCGAGTTGGTATAAGGATA

661 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 720

tccccatttgcgcatcataatgaagcaggggac LeOPR1Y244H-For

1: S P F A H Y246N E A G D T N P T A L G L Y

TCCCCATTTGCGCAT TATAATGAAGCAGGGGACACGAACCCGACTGCTTTGGGACTTTAC

721 ---------!----- CAT-!---------!---------!---------!---------! 780

H244 LeOPR1Y244H-Rev

1: M V E S L N K Y D L A Y C H V V E P R M

ATGGTGGAATCGTTGAACAAGTATGATCTCGCGTATTGCCATGTGGTTGAGCCTAGGATG

781 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 840

1: K T A W E K I E C T E S L V P M R K A Y

AAAACAGCTTGGGAAAAAATTGAATGTACTGAAAGCCTTGTACCGATGAGGAAGGCATAT

841 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 900

1: K G T F I V A G G Y D R E D G N R A L I

AAAGGTACTTTTATAGTAGCTGGTGGTTACGATAGAGAAGATGGAAACAGAGCTTTGATT

901 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 960

1: E D R A D L V A Y G R L F I S N P D L P

GAAGATCGAGCTGATCTTGTTGCGTATGGACGTTTATTCATATCTAATCCAGATTTACCA

961 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 1020

1: K R F E L N A P L N K Y N R D T F Y T S

AAGCGATTTGAGCTAAATGCTCCTCTTAACAAGTATAACAGAGACACATTTTATACTTCT

1021 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 1080

1: D P I V G Y T D Y P F L E T M T *

GATCCAATTGTTGGCTATACTGATTATCCATTTCTAGAAACCATGACATGA

1081 ---------!---------!---------!---------!--- ------!- 1131

5. Anhang XVII

5.4 Aminosäure und Basensequenz von LeOPR3

Farbig markiert sind die in OPR1 eingesetzten Basenpaare und daraus resultierenden

Aminosäuren in der Proteinsequenz.

1: M A S S A Q D G N N P L F S P Y K M G K

ATGGCGTCTTCAGCTCAAGATGGAAACAATCCCCTTTTCTCTCCTTACAAGATGGGCAAG

1 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 60

1: F N L S H R V V L A P M T R C R A L N N

TTCAATCTATCCCACAGGGTAGTATTGGCTCCGATGACAAGGTGCAGAGCACTGAATAAT

61 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 120

1: I P Q A A L G E Y Y E Q R A T A G G F L

ATTCCACAGGCGGCGCTAGGGGAGTATTACGAGCAGAGAGCGACGGCCGGTGGATTTCTG

121 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 180

1: I T E G T M I S P T S A G F74 P H V P G I

ATCACTGAAGGCACTATGATTTCTCCGACTTCAGCTGGGTTTCCTCATGTGCCAGGGATT

181 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 240

1: F T K E Q V R E W K K I V D V V H A K G

TTCACAAAGGAACAAGTAAGGGAATGGAAGAAAATAGTTGATGTAGTGCATGCAAAGGGT

241 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 300

1: A V I F C Q L W H V G R A S H E V Y Q P

GCTGTCATATTTTGTCAGCTGTGGCATGTTGGTCGTGCATCTCATGAAGTGTATCAACCT

301 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 360

1: A G A A P I S S T E K P I S N R W R I L

GCTGGAGCTGCACCAATATCATCCACTGAGAAGCCTATATCAAATAGGTGGAGAATTCTA

361 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 420

1: M P D G T H G I Y P K P R A I G T Y E I

ATGCCTGATGGAACTCATGGGATTTATCCAAAACCAAGAGCAATTGGAACCTATGAGATC

421 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 480

1: S Q V V E D Y R R S A L N A I E A G F D

TCACAAGTTGTTGAAGATTATCGCAGGTCGGCCTTGAATGCTATTGAAGCAGGTTTCGAT

481 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 540

1: G I E I H G A H G Y L I D Q F L K D G I

GGTATTGAAATCCATGGAGCTCACGGTTACTTGATTGATCAATTCTTGAAAGATGGGATC

541 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 600

5. Anhang XVIII

1: N D R T D E Y G G S L A N R C K F I T Q

AATGACCGGACAGATGAGTATGGTGGATCACTAGCCAACCGGTGCAAATTCATCACACAG

601 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 660

1: V V Q A V V S A I G A D R V G V R V S P

GTGGTTCAAGCAGTAGTCTCAGCAATAGGAGCTGATCGCGTAGGCGTTAGAGTTTCACCA

661 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 720

1: A I D H244L D A M D S N P L S L G L A V V

GCAATAGAT CATCTTGATGCCATGGACTCTAATCCACTCAGCCTTGGCTTAGCAGTTGTT

721 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 780

1: E R L N K I Q L H S G S K L A Y L H V T

GAAAGACTAAACAAAATCCAACTCCATTCTGGTTCCAAGCTTGCCTATCTTCATGTAACA

781 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 840

1: Q P R Y V A Y G Q T E A G R L G S E E E

CAGCCACGATACGTAGCATATGGGCAAACTGAAGCAGGCAGACTTGGCAGTGAAGAGGAA

841 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 900

1: E A R L M R T L R N A Y Q G T F I C S G

GAGGCTCGTTTAATGAGGACTTTGAGGAACGCGTATCAGGGGACATTCATTTGCAGTGGT

901 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 960

1: G Y T R E L G I E A V A Q G D A D L V S

GGATACACTAGGGAACTAGGAATTGAGGCTGTGGCACAAGGTGATGCTGATCTCGTGTCA

961 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 1020

1: Y G R L F I S N P D L V M R I K L N A P

TATGGTCGTCTTTTCATCTCTAATCCTGATTTGGTTATGAGAATCAAGCTAAATGCACCT

1021 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 1080

1: L N K Y N R K T F Y T Q D P V V G Y T D

CTAAATAAGTATAACAGGAAGACATTCTATACTCAAGATCCAGTTGTGGGATACACAGAT

1081 ---------!---------!---------!---------!--- ------!---------! 1140

1: Y P F L Q G N G S N G P L S R L *

TACCCTTTCCTTCAAGGAAATGGAAGCAATGGACCGTTATCGCGTCTGTGA

1141 ---------!---------!---------!---------!--- ------!- 1191

5. Anhang XIX

5.5 Sequenzen von OPR3-Mutanten

5.5.1 OPR3 E291K

Spe I Primer 5’mut LeOPR3 ccgccACTAG T ATGGCGTCT TCAGCTCAAG AT 1 ccgccACTAG TATGGCGTCT TCAGCTCAAG ATGGAAACAA TCCCCTTTTC TCTCCTTACA 61 AGATGGGCAA GTTCAATCTA TCCCACAGGG TAGTATTGGC TCCGATGACA AGGTGCAGAG 121 CACTGAATAA TATTCCACAG GCGGCGCTAG GGGAGTATTA CGAGCAGAGA GCGACGGCCG 181 GTGGATTTCT GATCACTGAA GGCACTATGA TTTCTCCGAC TTCAGCTGGG TTTCCTCATG 241 TGCCAGGGAT TTTCACAAAG GAACAAGTAA GGGAATGGAA GAAAATAGTT GATGTAGTGC 301 ATGCAAAGGG TGCTGTCATA TTTTGTCAGC TGTGGCATGT TGGTCGTGCA TCTCATGAAG 361 TGTATCAACC TGCTGGAGCT GCACCAATAT CATCCACTGA GAAGCCTATA TCAAATAGGT 421 GGAGAATTCT AATGCCTGAT GGAACTCATG GGATTTATCC AAAACCAAGA GCAATTGGAA 481 CCTATGAGAT CTCACAAGTT GTTGAAGATT ATCGCAGGTC GGCCTTGAAT GCTATTGAAG 541 CAGGTTTCGA TGGTATTGAA ATCCATGGAG CTCACGGTTA CTTGATTGAT CAATTCTTGA 601 AAGATGGGAT CAATGACCGG ACAGATGAGT ATGGTGGATC ACTAGCCAAC CGGTGCAAAT 661 TCATCACACA GGTGGTTCAA GCAGTAGTCT CAGCAATAGG AGCTGATCGC GTAGGCGTTA 721 GAGTTTCACC AGCAATAGAT CATCTTGATG CCATGGACTC TAATCCACTC AGCCTTGGCT 781 TAGCAGTTGT TGAAAGACTA AACAAAATCC AACTCCATTC TGGTTCCAAG CTTGCCTATC 841 TTCATGTAAC ACAGCCACGA TACGTAGCAT ATGGGCAAAC TAAAGCAGGC AGACTTGGCA E 291 in K 901 GTGAAGAGGA AGAGGCTCGT TTAATGAGGA CTTTGAGGAA CGCGTATCAG GGGACATTCA 961 TTTGCAGTGG TGGATACACT AGGGAACTAG GAATTGAGGC TGTGGCACAA GGTGATGCTG 1021 ATCTCGTGTC ATATGGTCGT CTTTTCATCT CTAATCCTGA TTTGGTTATG AGAATCAAGC 1081 TAAATGCACC TCTAAATAAG TTTAACAGGA AGACATTCTA TACTCAAGAT CCAGTTGTGG 1141 GATACACAGA TTACCCTTTC CTTCAAGGAA ATGGAAGCAA ACCTGGCAAT AGCGCAGACA 1201 CTGACGTCcc gcc CCTGGCAAT AGCGCAGACA CTGACGTC ccgcc Pst I Primer 3’mut LeOPR3

5.5.2 OPR3 Y364F

Spe I Primer 5’mut LeOPR3 ccgccACTAG T ATGGCGTCT TCAGCTCAAG AT 1 ccgccACTAG TATGGCGTCT TCAGCTCAAG ATGGAAACAA TCCCCTTTTC TCTCCTTACA 61 AGATGGGCAA GTTCAATCTA TCCCACAGGG TAGTATTGGC TCCGATGACA AGGTGCAGAG 121 CACTGAATAA TATTCCACAG GCGGCGCTAG GGGAGTATTA CGAGCAGAGA GCGACGGCCG 181 GTGGATTTCT GATCACTGAA GGCACTATGA TTTCTCCGAC TTCAGCTGGG TTTCCTCATG 241 TGCCAGGGAT TTTCACAAAG GAACAAGTAA GGGAATGGAA GAAAATAGTT GATGTAGTGC 301 ATGCAAAGGG TGCTGTCATA TTTTGTCAGC TGTGGCATGT TGGTCGTGCA TCTCATGAAG 361 TGTATCAACC TGCTGGAGCT GCACCAATAT CATCCACTGA GAAGCCTATA TCAAATAGGT 421 GGAGAATTCT AATGCCTGAT GGAACTCATG GGATTTATCC AAAACCAAGA GCAATTGGAA 481 CCTATGAGAT CTCACAAGTT GTTGAAGATT ATCGCAGGTC GGCCTTGAAT GCTATTGAAG 541 CAGGTTTCGA TGGTATTGAA ATCCATGGAG CTCACGGTTA CTTGATTGAT CAATTCTTGA 601 AAGATGGGAT CAATGACCGG ACAGATGAGT ATGGTGGATC ACTAGCCAAC CGGTGCAAAT 661 TCATCACACA GGTGGTTCAA GCAGTAGTCT CAGCAATAGG AGCTGATCGC GTAGGCGTTA 721 GAGTTTCACC AGCAATAGAT CATCTTGATG CCATGGACTC TAATCCACTC AGCCTTGGCT 781 TAGCAGTTGT TGAAAGACTA AACAAAATCC AACTCCATTC TGGTTCCAAG CTTGCCTATC 841 TTCATGTAAC ACAGCCACGA TACGTAGCAT ATGGGCAAAC TAAAGCAGGC AGACTTGGCA 901 GTGAAGAGGA AGAGGCTCGT TTAATGAGGA CTTTGAGGAA CGCGTATCAG GGGACATTCA 961 TTTGCAGTGG TGGATACACT AGGGAACTAG GAATTGAGGC TGTGGCACAA GGTGATGCTG 1021 ATCTCGTGTC ATATGGTCGT CTTTTCATCT CTAATCCTGA TTTGGTTATG AGAATCAAGC 1081 TAAATGCACC TCTAAATAAG TTTAACAGGA AGACATTCTA TACTCAAGAT CCAGTTGTGG Y 364 in F 1141 GATACACAGA TTACCCTTTC CTTCAAGGAA ATGGAAGCAA TGGACCGTTA TCGCGTCTGT 1201 GATCCATTTC TAGAAACCAT GACACCGTCG TCGCGTCTGT GACTGCAGGG CGG Primer 3’mut LeOPR3 A CTGTGGCAGC AGCGCAGACA CT GACGTCccgcc Pst I

5. Anhang XX

5.6 Sequenzen von OPR1Mutanten

5.6.1 OPR1+SRL

Spe I Primer 5’mut LeOPR1 ccgccACTAG T ATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGA 1 ccgccACTAG TATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGAGAAACA AGTAGACAAG ATCCCTCTAA 61 TGAGCCCTTG TAAAATGGGA AAGTTTGAGT TATGTCATAG AGTTGTATTG GCACCATTAA 121 CAAGGCAAAG ATCTTATGGT TATATTCCTC AACCACATGC TATACTTCAT TACTCACAAA 181 GAAGTACAAA TGGTGGCCTT CTAATAGGAG AGGCCACAGT AATATCTGAG ACTGGCATAG 241 GGTACAAAGA TGTACCTGGT ATATGGACAA AAGAGCAAGT GGAGGCTTGG AAACCAATTG 301 TAGATGCAGT TCATGCTAAA GGAGGAATCT TCTTTTGCCA AATTTGGCAT GTTGGTAGAG 361 TTTCCAACAA AGATTTTCAG CCCAATGGAG AGGATCCTAT CTCCTGCACA GACAGAGGAC 421 TAACACCTCA AATTCGTTCC AATGGCATAG ATATTGCACA CTTTACACGA CCTAGACGGT 481 TGACAACAGA TGAAATTCCT CAAATTGTTA ACGAATTTCG AGTTGCTGCT AGAAACGCAA 541 TTGAAGCTGG ATTTGATGGG GTTGAGATCC ACGGAGCTCA TGGCTATCTA ATTGATCAGT 601 TTATGAAAGA TCAAGTTAAC GATCGAAGTG ATAAATATGG AGGGTCTTTA GAGAATCGTT 661 GTAGATTTGC ACTTGAAATA GTGGAAGCAG TTGCAAATGA GATTGGATCT GACCGAGTTG 721 GTATAAGGAT ATCCCCATTT GCGCATTATA ATGAAGCAGG GGACACGAAC CCGACTGCTT 781 TGGGACTTTA CATGGTGGAA TCGTTGAACA AGTATGATCT CGCGTATTGC CATGTGGTTG 841 AGCCTAGGAT GAAAACAGCT TGGGAAAAAA TTGAATGTAC TGAAAGCCTT GTACCGATGA 901 GGAAGGCATA TAAAGGTACT TTTATAGTAG CTGGTGGTTA CGATAGAGAA GATGGAAACA 961 GAGCTTTGAT TGAAGATCGA GCTGATCTTG TTGCGTATGG ACGTTTATTC ATATCTAATC 1021 CAGATTTACC AAAGCGATTT GAGCTAAATG CTCCTCTTAA CAAGTATAAC AGAGACACAT 1081 TTTATACTTC TGATCCAATT GTTGGCTATA CTGATTATCC ATTTCTAGAA ACCATGACAC 1141 CG TCG TCG CGT CTG TGA CTGCAGggcgg AGG TAAAGATCTT TGGTACTGTG GC AGC AGC GCA GAC ACT GACGTC ccgcc P S S R L * Pst I

Primer 3’mut LeOPR3

5.6.2 OPR1 Y74F

Spe I ccgccACTAG T ATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGA 1 ccgccACTAG TATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGAGAAACA AGTAGACAAG ATCCCTCTAA 61 TGAGCCCTTG TAAAATGGGA AAGTTTGAGT TATGTCATAG AGTTGTATTG GCACCATTAA 121 CAAGGCAAAG ATCTTATGGT TATATTCCTC AACCACATGC TATACTTCAT TACTCACAAA 181 GAAGTACAAA TGGTGGCCTT CTAATAGGAG AGGCCACAGT AATATCTGAG ACTGGCATAG 241 GG TTTAAAGA TGTACCTGGT ATATGGACAA AAGAGCAAGT GGAGGCTTGG AAACCAATTG Y 74 in F 301 TAGATGCAGT TCATGCTAAA GGAGGAATCT TCTTTTGCCA AATTTGGCAT GTTGGTAGAG 361 TTTCCAACAA AGATTTTCAG CCCAATGGAG AGGATCCTAT CTCCTGCACA GACAGAGGAC 421 TAACACCTCA AATTCGTTCC AATGGCATAG ATATTGCACA CTTTACACGA CCTAGACGGT 481 TGACAACAGA TGAAATTCCT CAAATTGTTA ACGAATTTCG AGTTGCTGCT AGAAACGCAA 541 TTGAAGCTGG ATTTGATGGG GTTGAGATCC ACGGAGCTCA TGGCTATCTA ATTGATCAGT 601 TTATGAAAGA TCAAGTTAAC GATCGAAGTG ATAAATATGG AGGGTCTTTA GAGAATCGTT 661 GTAGATTTGC ACTTGAAATA GTGGAAGCAG TTGCAAATGA GATTGGATCT GACCGAGTTG 721 GTATAAGGAT ATCCCCATTT GCGCATTATA ATGAAGCAGG GGACACGAAC CCGACTGCTT 781 TGGGACTTTA CATGGTGGAA TCGTTGAACA AGTATGATCT CGCGTATTGC CATGTGGTTG 841 AGCCTAGGAT GAAAACAGCT TGGGAAAAAA TTGAATGTAC TGAAAGCCTT GTACCGATGA 901 GGAAGGCATA TAAAGGTACT TTTATAGTAG CTGGTGGTTA CGATAGAGAA GATGGAAACA 961 GAGCTTTGAT TGAAGATCGA GCTGATCTTG TTGCGTATGG ACGTTTATTC ATATCTAATC 1021 CAGATTTACC AAAGCGATTT GAGCTAAATG CTCCTCTTAA CAAGTATAAC AGAGACACAT 1081 TTTATACTTC TGATCCAATT GTTGGCTATA CTGATTATCC ATTTCTAGAA ACCATGACAC 1141 CG TCG TCG CGT CTG TGA CTGCAGggcgg AGG TAAAGATCTT TGGTACTGTG GC AGC AGC GCA GAC ACT GACGTC ccgcc P S S R L * Pst I

5. Anhang XXI

5.6.3 OPR1 Y244H

Spe I ccgccACTAG T ATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGA 1 ccgccACTAG TATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGAGAAACA AGTAGACAAG ATCCCTCTAA 61 TGAGCCCTTG TAAAATGGGA AAGTTTGAGT TATGTCATAG AGTTGTATTG GCACCATTAA 121 CAAGGCAAAG ATCTTATGGT TATATTCCTC AACCACATGC TATACTTCAT TACTCACAAA 181 GAAGTACAAA TGGTGGCCTT CTAATAGGAG AGGCCACAGT AATATCTGAG ACTGGCATAG 241 GGTACAAAGA TGTACCTGGT ATATGGACAA AAGAGCAAGT GGAGGCTTGG AAACCAATTG 301 TAGATGCAGT TCATGCTAAA GGAGGAATCT TCTTTTGCCA AATTTGGCAT GTTGGTAGAG 361 TTTCCAACAA AGATTTTCAG CCCAATGGAG AGGATCCTAT CTCCTGCACA GACAGAGGAC 421 TAACACCTCA AATTCGTTCC AATGGCATAG ATATTGCACA CTTTACACGA CCTAGACGGT 481 TGACAACAGA TGAAATTCCT CAAATTGTTA ACGAATTTCG AGTTGCTGCT AGAAACGCAA 541 TTGAAGCTGG ATTTGATGGG GTTGAGATCC ACGGAGCTCA TGGCTATCTA ATTGATCAGT 601 TTATGAAAGA TCAAGTTAAC GATCGAAGTG ATAAATATGG AGGGTCTTTA GAGAATCGTT 661 GTAGATTTGC ACTTGAAATA GTGGAAGCAG TTGCAAATGA GATTGGATCT GACCGAGTTG 721 GTATAAGGAT ATCCCCATTT GCGCATCATA ATGAAGCAGG GGACACGAAC CCGACTGCTT Y 244 in H 781 TGGGACTTTA CATGGTGGAA TCGTTGAACA AGTATGATCT CGCGTATTGC CATGTGGTTG 841 AGCCTAGGAT GAAAACAGCT TGGGAAAAAA TTGAATGTAC TGAAAGCCTT GTACCGATGA 901 GGAAGGCATA TAAAGGTACT TTTATAGTAG CTGGTGGTTA CGATAGAGAA GATGGAAACA 961 GAGCTTTGAT TGAAGATCGA GCTGATCTTG TTGCGTATGG ACGTTTATTC ATATCTAATC 1021 CAGATTTACC AAAGCGATTT GAGCTAAATG CTCCTCTTAA CAAGTATAAC AGAGACACAT 1081 TTTATACTTC TGATCCAATT GTTGGCTATA CTGATTATCC ATTTCTAGAA ACCATGACAC 1141 CG TCG TCG CGT CTG TGA CTGCAGggcgg AGG TAAAGATCTT TGGTACTGTG GC AGC AGC GCA GAC ACT GACGTC ccgcc P S S R L * Pst I

5.6.4 OPR1 Y74F/Y244H

Spe I ccgccACTAG T ATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGA 1 ccgccACTAG TATGGAAAAT AAAGTCGTTG AAGAGAAACA AGTAGACAAG ATCCCTCTAA 61 TGAGCCCTTG TAAAATGGGA AAGTTTGAGT TATGTCATAG AGTTGTATTG GCACCATTAA 121 CAAGGCAAAG ATCTTATGGT TATATTCCTC AACCACATGC TATACTTCAT TACTCACAAA 181 GAAGTACAAA TGGTGGCCTT CTAATAGGAG AGGCCACAGT AATATCTGAG ACTGGCATAG 241 GG TTTAAAGA TGTACCTGGT ATATGGACAA AAGAGCAAGT GGAGGCTTGG AAACCAATTG Y 74 in F 301 TAGATGCAGT TCATGCTAAA GGAGGAATCT TCTTTTGCCA AATTTGGCAT GTTGGTAGAG 361 TTTCCAACAA AGATTTTCAG CCCAATGGAG AGGATCCTAT CTCCTGCACA GACAGAGGAC 421 TAACACCTCA AATTCGTTCC AATGGCATAG ATATTGCACA CTTTACACGA CCTAGACGGT 481 TGACAACAGA TGAAATTCCT CAAATTGTTA ACGAATTTCG AGTTGCTGCT AGAAACGCAA 541 TTGAAGCTGG ATTTGATGGG GTTGAGATCC ACGGAGCTCA TGGCTATCTA ATTGATCAGT 601 TTATGAAAGA TCAAGTTAAC GATCGAAGTG ATAAATATGG AGGGTCTTTA GAGAATCGTT 661 GTAGATTTGC ACTTGAAATA GTGGAAGCAG TTGCAAATGA GATTGGATCT GACCGAGTTG 721 GTATAAGGAT ATCCCCATTT GCGCATCATA ATGAAGCAGG GGACACGAAC CCGACTGCTT Y 244 in H 781 TGGGACTTTA CATGGTGGAA TCGTTGAACA AGTATGATCT CGCGTATTGC CATGTGGTTG 841 AGCCTAGGAT GAAAACAGCT TGGGAAAAAA TTGAATGTAC TGAAAGCCTT GTACCGATGA 901 GGAAGGCATA TAAAGGTACT TTTATAGTAG CTGGTGGTTA CGATAGAGAA GATGGAAACA 961 GAGCTTTGAT TGAAGATCGA GCTGATCTTG TTGCGTATGG ACGTTTATTC ATATCTAATC 1021 CAGATTTACC AAAGCGATTT GAGCTAAATG CTCCTCTTAA CAAGTATAAC AGAGACACAT 1081 TTTATACTTC TGATCCAATT GTTGGCTATA CTGATTATCC ATTTCTAGAA ACCATGACAC 1141 CG TCG TCG CGT CTG TGA CTGCAGggcgg AGG TAAAGATCTT TGGTACTGTG GC AGC AGC GCA GAC ACT GACGTC ccgcc P S S R L * Pst I

6. Verzeichnisse XXII

6. VERZEICHNISSE

6.1 Literatur

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6. Verzeichnisse XXIV

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6. Verzeichnisse XXV

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SCHALLER F, BIESGEN C, MÜSSIG C, ALTMANN T, WEILER EW (2000) 12-Oxophytodienoate reductase 3 (OPR3) is the isoenzyme involved in jasmonate biosynthesis.

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6. Verzeichnisse XXVI

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6. Verzeichnisse XXVII

6.2 Abkürzungen und Einheiten

°C Grad Celsius

A Ampere

Abb. Abbildung

AOS Allenoxidsynthase

AOC Allenoxidcyclase

APS Ammoniumperoxodisulfat

At Arabidopsis thaliana

ATP Adenosin 5'-Triphosphat

bp Basenpaare

c centi (10P-2)

cDNA komplementäre DNA

CIP alkalische Phosphatase aus Kälberdarm

Col Columbia

CTAB Cethyltrimethyl-Ammoniumbromid

DEX DNA-Extraktionspuffer

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTPs Desoxy-Nukleotidtriphosphat

DTT Dithiothreit

ECL Enhanced Chemiluminescence

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EtOH Ethanol

Forw forward

F Farad

g Erdbeschleunigung (9,81 m/s²)

g Gramm

GLVs Green Leave Volatiles – flüchtige organische Substanzen

h Stunde

Ig G Immunglobulin G

IPTG Isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranosid

kb Kilobasenpaar

kDa Kilo Dalton

l Liter

LB Luria Bertani

6. Verzeichnisse XXVIII

LB Left Border

Le Lycopersicum esculentum bzw. Solanum lycopersicum

LOX Lipoxygenase

µ mikro (10-6)

m milli (10-3)

m Meter

min Minute

mRNA messenger Ribonukleinsäure

M Molar

NADPH Nicotinsäureamid-Adenosin-Dinucleotid-Phosphat, reduziert

Ω Ohm

OPDA Oxophytodiensäure

PCR Polymerase-Kettenreaktion

RB Right Border

rev reverse

RNA Ribonuklein-Säure

RT Raumtemperatur

SDS Natriumdodecylsulfat

TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

T-DNA Transfer-DNA

TE Tris-EDTA-Puffer

TBS Tris-Buffered Saline

TEMED Tetrametylethylendiamin

Tween20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

U Units/Enzymeinheiten

ÜN über Nacht

V Volt

VOCs Volatile Organic Compounds

v/v Volumen pro Volumen

Ws Wassilewskija

WT Wildtyp

w/v Gewicht pro Volumen

6. Verzeichnisse XXIX

6.3 Abbildungen und Tabellen

Tab. 1: Verwendete Annealingtemperaturen und Elongationszeiten in

Abhängigkeit der Spezifischen Primerkombinationen 27

Abb. 1: Struktur der Jasmonsäure ............................................................................ 1

Abb. 2: Die Wirkungen von Jasmonaten auf Stressoren und ihre Beteiligung an der

pflanzlichen Entwicklung (Wasternack, 2005) ................................................................ 2

Abb. 3: Der Oktadekanoidweg der Jasmonysnthese (nach Vick und Zimmermann,

adaptiert nach Wasternack und Hause, 2002) ............................................................... 3

Abb. 4: Verwandtschaftsvergleich der OPR Isoformen von Tomate und Arabidopsis

.................................................................................................................... 4

Abb. 5: Vergleich der Sequenzen der 3 Isoformen von OPR in Tomaten (Le) mit

den Isoformen aus Arabidopsis thaliana (At) ................................................................. 5

Abb. 6: Lokalisation der Proteine des Oktadekanoidwegs, Jasmonsäurebiosynthese

und Metabolismus. ......................................................................................................... 6

Abb. 7: Umsatz von cis(+)OPDA durch NADPH-abhängiges OPR3 zu cis(+)OPC-

8:0 ............................................................................................................ 7

Abb. 8: 3D-Struktur von OPR1.................................................................................. 8

Abb. 9: Strukturvergleich von OPR3 (gelb) und OPR1(blau).................................... 9

Abb. 10: Detaildarstellung des Aktiven Zentrums von OPR1 mit gebundenem

Substrat ........................................................................................................ 9

Abb. 11: Röntgenkristallstruktur von OPR3. Der Fingerartige β6-Loop des einen

Protomers (rot) interagiert in der substratbindenden Tasche des anderen Protomers

(gelb) und umgekehrt. Nach Breithaupt et al., 2006..................................................... 10

Abb. 12: Aktives Zentrum von dimerisiertem OPR3. In gelb und dunkelrot: jeweils

ein Protomer von OPR3. Markiert (roter Kreis) sind Aminosäuren, die für die

Dimerisierung wichtig erscheinen................................................................................. 11

Abb. 13: In vivo Phosphorylierung eines OPR3-Proteins durch eine

Typrosinspezifische Protein Kinase im Expressionsvektor in E.coil. (Schaller,

unveröffentlicht) ............................................................................................................ 12

Abb. 14: Karte des pCR®2.1 Topo® Vektor ......................................................... 16

6. Verzeichnisse XXX

Abb. 15: Aufbau des Vektors pGreen 0229 OPR3 prom DsRED-OPR3............... 16

Abb. 16: Temperatur und Dauer der einzelnen Schritte einer PCR ...................... 26

Abb. 17: Prinzip der Zielgerichteten Mutation ....................................................... 33

Abb. 18: Durchfluss, Waschschritte und Elutionsschritte der Proteinreinigung von

OPR3 und SDS-PAGE in Coomassiefärbung. Aufgetragen wurden jeweils 15 µl der

1:10 verdünnten Fraktionen der Aufreinigung in denaturierter Form............................ 38

Abb. 19: Schematischer Aufbau eines Western Blots........................................... 45

Abb. 20: Schema der Antikörperdetektion............................................................. 48

Abb. 21: Ausschniktt eines Ethidiumbromid gefärbten 1% Agarosegels. PCR der

OPR3 Konstrukte OPR3, E291K, Y364F mit Primer 34 und 35, 1191 bp,

Annealingtemperatur 58°C, Elongationszeit 75 sec. .. .................................................. 50

Abb. 22: Sequenzvergleich von OPR1, OPR2 und OPR3 aus Tomaten (Le) und

Arabidopsis thaliana (At) .............................................................................................. 51

Abb. 23: Ethidiumbromid gefärbtes 1% Agarosegel. Links: PCR der OPR3

Konstrukte OPR3, E291K, Y364F mit Primer 34 und 35, 1191 bp, Rechts: PCR der

OPR1-cDNA mit Primern 36 und 37, 1131 bp. Annealingtemperatur 58°C,

Elongationszeit 75 sec. ................................................................................................ 52

Abb. 24: DNA Sequenzauschnitt von OPR1 (schwarz) mit den jeweils bindenden

Mutageneseprimern (blau) ........................................................................................... 53

Abb. 25: Ausschnitt eines 1% Agarosegels, gefärbt mit Ethidiumbromid.

Restriktionsverdau der Mutation-tragenden Topo® Plasmide mit Nae I, Spe I und Pst I.

OPR3 (links, OPR3, E291K, Y364F) Konstrukte haben eine Größe von 1191 bp, OPR1

Konstrukte (rechts, OPR1+SRL, Y74F, Y244H, Y74F/Y244H) haben eine Größe von

1131 bp. Der Topo®-Vektor ohne Insert hat eine Größe von ca. 3900 bp. Der Verdau

wurde bei 37°C für 2 Stunden durchgeführt. ......... ....................................................... 54

Abb. 26: Schematischer Aufbau des Transformationsplasmides mit OPR3-

Promotor, Konstrukt (grün hinterlegt), nos-Terminator (T), Resistenzgenen für BASTA

(nos-bar) und Kanamycin (npt) und Origin of replication für die Replikation in

Agrobakterium (pSA ori) und E.coli (ColEI ori). ............................................................ 55

Abb. 27: 1% Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt. PCR auf Konstrukte in

Agrobakterien. OPR3 Konstrukte (links, OPR3, E291K, Y364F) haben eine Größe von

1191 bp, OPR1 Konstrukte (rechts, OPR1+SRL, Y74F, Y244H, Y74F/Y244H) haben

eine Größe von 1131 bp. Annealingtermperatur: 58°C, Elongationszeit 120 sec. ....... 55

6. Verzeichnisse XXXI

Abb. 28: 1% Agarosegel in Ethidiumbromidfärbung. PCR Analyse der BASTA-

resistenten Pflanzen auf das jeweilige Konstrukt. Als Positive Kontrolle (+) diente das

jeweilige Transformationskonstrukt, Als Negative Kontrolle (–) diente Wildtypische

DNA. Als Ladekontrolle wurde eine PCR mit den Primern für Tubulin TuB4F und

TuB4R durchgeführt, positive Kontrolle hierfür war wildtypische DNA, negative

Kontrolle das Transformationskonstrukt. Annealingtemperatur: 50°C, Elongationszeit

40 sec. Oben: Analyse der OPR3 Konstrukte OPR3 (Komplementationskontrolle) und

E291K mit den Primern 1612 und 35 .Unten: Analyse der OPR1 Konstrukte

OPR1+SRL Y244H und die Doppelmutation Y74F/Y244H mit Primern 1612 und

OPR1_876R. Annealingtemperatur: 58°C, Elongationsze it: 120 sec........................... 57

Abb. 29: A, B und C: Blütenstände von Wildtypischen, opr3-defiziente A. thaliana

und mit E291K transformierten A. thaliana, D, E, F, G: Blüten von Wildtyp, opr3-

defiziente A. thaliana, und mit OPR3 bzw. E291K transformierten opr3-defiziente A.

thaliana, sowie die zugehörige Pollkeimung in vitro (jeweils rechts von den Blüten),

unten: graphische Darstellung des in vitro Pollenkeimungstests der transformierten

opr3-defiziente A. thaliana mit OPR3 und E291K im Vergleich mit Pollen von Wildtyp

und opr3-defiziente A. thaliana. Pollen wurde auf Pollenkeimungsmedium ausgebracht

und nach 12 Stunden ausgezählt. Von 6 bis 9 Blüten wurden jeweils ca. 300 Samen

gezählt, der Mittelwert gebildet und eine Standardabweichung berechnet. ................. 58

Abb. 30: A, B und C: Blütenstände der opr3-defizienten A.thaliana, komplementiert

mit OPR1+SRL (A), Y244H (B) und Y74F/Y244H(C). D, E und F: Blüten und in vitro

Pollenkeimung (jeweils darunter) der opr3-defiziente A. thaliana, die mit OPR1+SRL

(D), Y244H (E) und Y74F/Y244H (F) transformiert wurden. Unten: Graphische

Darstellung des Pollenkeimungstests der mit OPR1-Mutanten transformierten opr3-

defiziente A. thaliana im Vergleich mit Pollen von Wildtyp und opr3-defiziente A.

thaliana. Pollen wurde auf Pollenkeimungsmedium ausgebracht und nach 12 Stunden

ausgezählt. Von 6 bis 9 Blüten wurden jeweils 300 Samen gezählt, der Mittelwert

gebildet und eine Standardabweichung berechnet. ..................................................... 60

Abb. 31: 5 ml Gradienten der verschiedenen Linien, beladen mit 100 µl und 600 µl

der Überstände von OPR1+SRL-1, Y244H-1 und Y74F/Y244H-1............................... 62

Abb. 32: Coomassie- und Silber-Färbung der SDS-Gele der 2 Gradienten von

Y244H. Oben: 100µl beladener Gradient, Unten 600 µl beladener Gradient. Die

Fraktion von 18,5% im 100µl Gradienten fehlt in der Silber-Färbung, da diese Fraktion

nicht vollständig gefüllt und deswegen aufgebraucht war. ........................................... 63

6. Verzeichnisse XXXII

Abb. 33: Vergleich der beiden Western Blots des Gradienten von Y244H-1

(beladen mit 600µl) mit Anti-AOS (oben) und Anti-OPR1 (unten) und OPR1 Protein als

Kontrolle 65

Abb. 34: Western Blot des ersten Verwundungsexperiment an Tomaten mit Anti

PT-66. Aufgetragen wurde Gesamtproteinextrakt. Unverwundete Kontrollpflanzen

wurden zu Beginn des Experimentes geerntet und nach 120 Minuten (K0’ und K120’),

verwundete Pflanzen nach 10, 30, 60 und 180 Minuten. Kontrollpflanzen und

verwundete Pflanzen befanden sich im selben Raum. Als Kontrolle wurden OPR3

Protein und OPR3 Protein aus dem Expressionsvektor TKB1 aufgetragen, dass eine

Tyrosinkinase enthält und OPR3 somit Phosphoryliert(Im Bild bezeichnet als TKB1). 68

Abb. 35: Western Blot Analyse eines Verwundungsexperimentes detektiert mit Anti

OPR3 Antikörper. Oben: verwundete Pflanzen, geerntet 5, 10, 20, 30, 60 und 180

Minuten nach Verwundung, Unten: Kontrollpflanzen, nicht verwundet, geerntet zu

denselben Zeitpunkten, einschließlich Nullkontrolle. Kontrollpflanzen und verwundete

Pflanzen befanden sich im selben Raum. Als Kontrollen wurden OPR3 und

Phosphoryliertes OPR3 Protein (TKB1) aufgetragen................................................... 69

Abb. 36: Western Blot von Gesamtproteinextrakten von VOC-Empfänger

Tomatenpflanzen mit AntiOPR3 mit zugehöriger Ponceaufärbung.............................. 71

Abb. 37: Western Blot von Gesamtproteinextrakten verwundeter Tomatenpflanzen

mit AntiOPR3................................................................................................................ 72

Abb. 38: Western Blot von Proteinextrakten von VOC-Empfänger

Tomatenpflanzen mit AntiPT-66................................................................................... 73

Abb. 39: Western blot von Proteinextrakten verwundeter Tomatenpflanzen mit Anti

PT-66 .................................................................................................... 74

Abb. 40: Western Blots von Arabidopsis-Pflanzen, die VOCs von Tomaten (TV)

und Arabidopsis-Pflanzen (AV) ausgesetzt waren, geerntet nach je 0, 30, 60 und 90

Minuten. Als Kontrolle dienten verwundete opr3 Pflanzen, die nach 60 Minuten

geerntet wurden, sowie verwundete Arabidopsis-Pflanzen nach 60 und 90 Minuten

Verwundung, außerdem 0,1 ng aufgereinigtes OPR3 und 10 ng OPR1 Protein bzw. 0,1

ng Phosphoryliertes OPR3 Protein (TKB1). Detektion mit AntiOPR1 (Oben), AntiOPR3

(Mitte) und Anti PT-66 (Unten) ..................................................................................... 75

Abb. 41: Western Blot von Proteinextrakten verwundeter (vw) Arabidopsis opr1-

mutanter-Pflanzen und VOC-Empfänger Arabidopsis-opr1-mutanter Pflanzen (AV)

detektiert mit AntiOPR3 (oben) und mit Anti-PT 66 (Unten) Als Kontrollen wurden

6. Verzeichnisse XXXIII

jeweils 0,1 ng OPR3-Protein und phosphoryliertes OPR3-Protein (TKB1), sowie 10 ng

OPR1 Protein aufgetragen. Ein Pfeil markiert die Höhe von OPR3. ............................ 77

Abb. 42: Western Blot von Proteinextrakten verwundeter (vw) Arabidopsis opr3-

mutanter-Pflanzen und VOC-Empfänger Arabidopsis-opr1-mutanter Pflanzen (AV)

detektiert mit Anti-PT 66. Als Kontrollen wurden jeweils 0,1 ng OPR3-Protein und

phosphoryliertes OPR3-Protein (TKB1) sowie 10 ng OPR1 Protein aufgetragen. Ein

Pfeil markiert die Höhe von OPR3................................................................................ 78

Danke

An Herrn Professor A. Schaller für die Möglichkeit meine Diplomarbeit am Institut für

Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen durchführen zu können und für die

Vergabe dieses interessanten Themas.

An Herrn Professor A. Pfitzner der freundlicherweise die Zweitkorrektur übernommen

hat.

An Dr. Annick Stintzi für die engagierte Betreuung und Unterstützung und für die vielen

Diskussionen während meiner Diplomarbeit.

An Mama und Papa, die meinen Studienweg stets unterstützt haben, sowohl finanziell

als auch moralisch, im letzten Jahr immer an meiner Seite waren, mir Beistand

geleistet haben und mich während meiner Lern- und Schreibphasen ertragen haben.

An Sebastian für Aufmunterung, Anstachelung, Hilfe bei Word und anderen

Absurditäten, kleine Gesten und Momente, Filmabende, Kochabende, Krupuk – kurz:

Dafür, dass er immer das Richtige zum passenden Zeitpunkt getan hat.

Des Weiteren danke ich:

Frau Brehm, die mein Biologisches Interesse entdeckt und gefördert hat und

einen großen Anteil daran hat, dass ich das Studium der Biologie in Angriff

genommen habe

Jedem Einzelnen vom Institut 260 und vom Gewächshausteam für

Hilfestellung, Kaffeeklatsch und Korrekturlesen, insbesondere Jutta, Saeid,

Klaus, Benni und Kristin

Charlie und Chrissie für ihre Ablenkungsmanöver

Ekki und Martin für Diskussionen, Tipps und Tricks

Corinna, Anne, Felix, Peter, Steffen, Oli, Benni und all meinen anderen

Kommilitonen für die vielen „Kippen-und-Kaffee-Pausen“ und dafür, dass sie

mich jammern ließen

Sandra für Bombus - ohne dich hätte es kein zweites Semester gegeben

Opeth, Queen und Incubus für nächtliche Motivation

Arabidopsis, dass sie sich stressen ließ

Dem Meer, denn es trägt den Blick,

den Sternen, denn es lohnt sich nach ihnen zu greifen

und dem Wind, denn er treibt das Boot immer weiter.

„Die Wissenschaft ist etwas noch nicht ganz gefundenes und

nie ganz aufzufindendes“ Wilhelm von Humboldt

Ehrenwörtliche Erklärung

Ich versichere hiermit ehrenwörtlich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig

und nur unter Benutzung der angegebenen Literatur und Hilfsmittel angefertigt

habe. Wörtlich übernommene Sätze und Satzteile sind als Zitat belegt, andere

Anlehnungen hinsichtlich Aussage und Umfang unter Quellenangabe kenntlich

gemacht.

Die Arbeit hat in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner Prüfungsbehörde

vorgelegen.

Leonberg, den 20. September 2007

_________________________________

Daniela Schwörer

Analyse der Struktur-Funktionsbeziehungen in OPR3 · modifizierten OPR1-Proteine im Peroxisom...

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