Analytik von Speisefetten und -ölen1) Bestimmung des Fettgehaltes (Gesamtfett oder freies Fett)2) Charakterisierung von Fetten und Ölen (chemische Kennzahlen; Fettsäurezusammensetzung; Frische- oder Verderbszustand etc.)

3) Analytik von Fettbegleitstoffen (Sterole; fettlösliche Vitamine etc.)

Methoden zur Erfassung der Lipide („Fettbestimmung“)• z.B. zur Nährwertberechnung: Früher galt Fett in LM als wertgebender Bestandteil; heute („Schlankheitskult“) eher unerwünschter Bestand- teil, den es zu minimieren gilt (Light-Produkte)

• ausserdem: Isolierung des Fettanteils für weitergehende Analysen, z.B. zur Bestimmung des Milch- bzw. Butterfettanteils im LM, oder der Menge an essentiellen Fettsäuren

Gesamtfett = ! [freies (ungebundenes) Fett + gebundenes Fett]

Extraktionsverfahren

• ohne Aufschluss: nur Bestimmung des „freien“ Fettes• mit Aufschluss: auch zur Bestimmung des Gesamtfettgehalts• kontinuierliche oder diskontinuierliche Extraktionsverfahrten

Schnellmethoden

Prinzip:• zerkleinerte, homogenisierte und getrocknete Probe mit einem organischem Lösungsmittel (z.B. Diethylether, Petroleumbenzin, Hexan, Dichlormethan etc.) extrahieren• rühren, dann fetthaltige Phase abtrennen, z.B. durch Zentrifugation, Filtration oder nach Phasentrennung im Scheidetrichter• Extraktion 2-3 mal (ggf. öfter) wiederholen• Fettgehalt der org. Phase bestimmen: - Dichtemessung - Refraktometrie - gravimetrisch nach Abdampfen des organ. Lösungsmittels und Wiegen des Rückstands (genaueste Methode, aber zeitaufwendig)

25

FetthaltigeProbe

Lösungsmittelzugabe Fettextraktion Dekantieren

Extrakt

Prinzip:

• zerkleinerte, wasserfreie Analysenprobe mit organischem Lösungsmittel extrahieren• ca. 15 - 20 Durchläufe (entscheidend für die Effizienz ist nicht die Extraktionszeit, sondern die Anzahl der Durchlaufzyklen!)

• Lösungsmittel abdampfen

• Kolben mit Rückstand bei 103°C trocknen

• Kolben zurückwiegen (Differenzwägung)

In der Extraktionshülse befinden sich das zu ex-trahierende Material. Durch das rechte Rohr (Dampf-rohr) steigt aus dem darunter befindlichen Kolbendas Lösungsmittel auf, im Kühler (oben) kondensiertund dann in die Extraktionshülse tropft. Dort löst dasLösungsmittel das Fett aus der Probe heraus. Durchweiter zutropfendes Lösungsmittel steigt derFlüssigkeitsspiegel in dem Soxhlet-Aufsatz, bis erdie Höhe der Biegung des dünnen Heberröhrchenserreicht hat. Auf Grund der dann auftretenden Saug-heberwirkung wird die Flüssigkeit mit dem Extraktin den darunter liegenden Kolben mit dem Lösungs-mittel überführt. Dieser Vorgang wird ca. 15 - 20 malwiederholt („erschöpfende“ Extraktion).

Vorteile der Methode• gute Erfassung der Lipide (in Abhängigkeit vom Extraktionsmittel)• vielfach als Referenzmethode empfohlen bzw. vorgeschrieben• gut reproduzierbare Werte• in Kombination mit einem vorgeschalteten Aufschlussverfahren (z.B. nach Weibull-Stoldt) Bestimmung des Gesamtfettgehaltes möglich

Nachteile• Brand-/Explosionsgefahr bei unsachgemäßem Arbeiten!• relativ arbeits- und zeitaufwendig

Fehlermöglichkeiten• Falls Analysensubstanz ungenügend vorgetrocknet (nicht wasserfrei) -> evtl. Kohlenhydrate aus dem LM mit extrahiert -> zu hohe Werte• Nicht erschöpfend extrahiert (-> zu wenige Durchläufe; Temperatur zu niedrig; Extraktionsmittel mit zu hohem Siedepunkt verwendet)• Kolben nach dem Abdampfen des Lösungsmittels nicht ausreichend lange bei 103°C getrocknet

Extraktionsverfahren nach Soxhlet

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Soxhlet-Extraktionsapparatur

Rück-fluss-kühler

Dampf-rohr

Heber-rohr

Hülsemit

Extrak-tions-

gut

Rund-kolben

Lösungs-mittel

Heiz-haube

Kühl-wasser-eintritt

Kühl-wasser-austritt

Aufschlussverfahren zur Bestimmung des Gesamtfetts

103°C

Vorteile der Methode• zuverlässig und sehr genau; oft als Referenzmethode vorgeschrieben• nahezu universell anwendbar

Nachteile• Arbeiten mit aggressiver Salzsäure• arbeits- und zeitaufwendig• Phospho- und Glykolipide (z.B. in Ei) werden z.T. zersetzt -> Verluste

• Gesamtfett = ! [freies (ungebundenes) Fett + gebundenes Fett]

• Fett liegt in vielen Lebensmitteln (Milch, Ei) in gebundener Form vor, z.B. von einer Protein- oder Lipoproteinhülle eingeschlossen• Zur Bestimmung des Gesamtfettgehaltes muss diese Proteinhülle zerstört werden, um das gebundene Fett freizusetzen• anschliessend Fettextraktion, meist in einer Soxhlet-Apparatur

Aufschluss mit:• Säuren (Salz-, Schwefel- oder Perchlorsäure) -> universell anwendbar z. B. Verfahren nach Weibull-Stoldt oder Gerber

• Alkali (Ammoniak); v.a. bei Milch (z.B. Verfahren nach Röse-Gottlieb)• Enzymen (z. B. Proteasen); selten angewandt; jedoch sehr schonend

Verfahren nach Weibull-Stoldt (Referenzmethode)

Prinzip• zerkleinerte Probe ca. 20-30 min mit 12-14%iger Salzsäure kochen• Aufschlusslösung durch ein angefeuchtetes Faltenfilter filtrieren• Faltenfilter säurefrei waschen und bei 103°C trocknen• Filter (mit Fett) mit org. Lösungsmittel extrahieren (Soxhlet)

• Lösungsmittel abdampfen und Kolben zurückwiegen (Differenzwägung)

27

Schnellmethode nach Gerber(Acidobutyrometrisches Verfahren)

Prinzip• Probe in einem Butyrometer (= Spezialzentri- fugenglas) mit Schwefelsäure (ca. 60-90%-ig, je nach Wassergehalt des Lebensmittels) ver- setzen und mischen, wobei Erwärmung eintritt• Butyrometer im Wasserbad bei 65°C erwärmen; mehrmals kräftig durchschütteln• Die heisse (65°C) Schwefelsäure setzt die Lipide frei (saurer Aufschluß)• Nach Zugabe von Amylalkohol (zur besseren Phasentrennung) sammelt sich das geschmol- zene Fett nach dem Zentrifugieren im oberen, graduierten Teil des Butyrometers• Nach abermaligem Temperieren auf 65°C kann der Fettgehalt direkt abgelesen werden (ggf. Umrechnung auf genormte Einwaage nötig)

Butyrometer für MilchVorteile der Methode

Nachteile• Verwendung stark ätzender H2SO4

• weniger genau als die Verfahren nach Weibull-Stoldt oder Röse-Gottlieb

• relativ schnell (10-20 min, je nach Lebensmittel) und wenig störanfällig• bis zu 48 Proben können simultan analysiert werden• gut für Serienanalysen geeignet• kostengünstig• für viele Lebensmittel tierischen Ur- sprungs einsetzbar (v.a. Milch, Milch- pulver, Sahne, Rahm, Käse, Wurst)

Butyrometer+ Becher fürKäse oder

Wurst

Gerber-Zentrifuge für 48Butyrometer-Röhrchen

Fehlermöglichkeiten• zu lange bei 65°C temperiert -> evtl. Hydro- lyse der Triglyceride• Aufschlusszeit zu kurz -> Fettverlust• falsche Konzentration der H2SO4 (bei Milch 90%-ige H2SO4, bei Wurst und Käse ca. 60%-ige Schwefelsäure verwenden!)

28

Fettbestimmung nach Röse-Gottlieb

Vorteile der Methode

Nachteile• für andere Lebensmittel nicht ohne weiteres anwendbar• zeit- und arbeitsaufwendiges Verfahren• Verwendung leichtentzündlicher Lösungsmittel -> Brandgefahr!

• Genauestes Verfahren zur Gesamtfettbestimmung bei Milch und Milch- produkten (Standard- /Referenzmethode)

Fehlermöglichkeiten• Fettverluste beim Schütteln aufgrund undichter Stopfen• versehentlich einen Teil der wässr. Phase in den Kolben dekantiert

Mojonnierrohr

Prinzip:• Der Aufschluß erfolgt mit Ammoniak bei Raumtemperatur

• Alle Arbeitsschritte bis auf das Abdampfen des Lösungsmittels und dem Wiegen erfolgen in einem speziellen, gebogenen Glasgefäß, dem sog. Mojonnierrohr

• Zur Vermeidung einer Emulsionsbildung wird Ethanol zugegeben, welches zum besseren Erkennen der Grenzschicht zwischen wäss- riger und organischer Phase mit Phenolphthalein versetzt wird (-> Rotfärbung der wässrigen Phase)

• Das freigesetzte Fett wird anschliessend mit organischen Lösungs- mitteln (Dietylether und Petrolether) durch Schütteln extrahiert und die obere Phase in einen getrockneten, gewogenen Kolben dekantiert

• Extraktion 2 mal wiederholen und organ. Phasen im Kolben sammeln

• Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird der Kolben mit dem isolierten Fett bei 103°C getrocknet und anschließend gewogen (gra- metrische Bestimmung (Differenzwägung))

29

Abdekantieren der

organ. Phase mit

dem extrahieren

Fett in einen ge-

wogenen Kolben

wässrigePhase

organische Phase

Fettgehaltsbestimmung mittels NIR-Spektrometrie

• instrumentelles Analysenverfahren

• schnelle, einfache, zerstörungsfreie Messung

• unkomplizierte Probenaufbereitung

• Einsatzbereiche: v.a. während der LM-Produktion u. für Serienanalysen

• Jedoch Kalibrierung mit Referenz- methode erforderlich!

Fettgehaltsbestimmung: Zusammenfassung • Bestimmung des freien Fettes oder des Gesamtfetts?

• Aufschluss zur Fettfreisetzung: Säure- o. Alkalibehandlung (je nach LM)

• Fettextraktion/Abtrennung: meist mit organischen Lösungsmitteln; z.T. auch durch Zentrifugation (-> z.B. Methode nach Gerber)

• eigentliche Bestimmung der freigesetzten Fettmenge: - wiegen (Gravimetrie): sehr genau, aber zeitaufwändig - Volumenmessung - Dichtemesung schnell, aber temperaturabhängig -> Fehlerquelle! - Brechungsindex

• Konventions- / Schieds- /Referenzmethoden:

- sehr genau, jedoch arbeits- und zeitaufwändig - Methoden nach Weibull-Stoldt (universell) bzw. Röse-Gottlieb (Milch)

• Schnellmethoden - meist ungenauer als Referenzmethoden, jedoch erheblich schneller - v.a. für Serienanalysen während der LM-Produktion; z.B. Methode nach Gerber; Foss-Let-Fettanalysator (Dichtemessung, ca. 5-10 min); - heute: überwiegend NIR oder FT-IR- Messung; jedoch häufige Kalibrierung erforderlich

Densitometrische Fettgehaltsbestimmung (Foss-Let Methode)

Prinzip:• Probe mit Tetrechlorethen verrühren und filtrieren oder zentrifugieren• Bestimmung des spezifischen Gewichtes des Fett-Tetrachlorethen- Gemisches durch einen Schwimmer mit einem Magnetkern, der von einem elektromagnetischen Feld umgeben ist• spezif. Gewicht von Fett: ca. 0.9 g/cm3, Tetrachlorethen: 1.614 g/ cm3

30

CH2-Schwingungen von Fettsäuren

Charakterisierung von Fetten und Ölen

• z.B.: Frische- bzw. Verderbszustand (z.B. Fettoxidation); Lagerstabilität, Rein- /Unverfälschtheit bzw. Authentizitätsnachweis; technologische Behandlung (Hydrierung, Trans-Fettsäuren); Fettsäurespektrum

• Analytik: früher meist mithilfe sog. „Fettkennzahlen“; heute über- wiegend mittels GC / HPLC sowie mit spektroskopischen Verfahren

Beispiele• Autoxidation -> Peroxidzahl (POZ); Epihydrin- bzw. Malondialdehyd

• Oxidationsbreitschaft -> POZ nach Wärmebehandlung oder Rancimat

• Ungesättigter Charakter von Fetten/Ölen -> Iodzahl

• Milchfettanteil am Gesamtfett -> Buttersäurezahl; GC-FSME

• Essentielle Fettsäuren (Linol-/Linolensäure) -> Enzymatik oder GC

Frische- bzw. Verderbszustand eines Fettes; Lagerstabilität

Autoxidation

Peroxidzahl

• Hydroperoxide sind die bei der Autoxidation von Fetten entstehenden primären Oxidationsprodukte; Bestimmung mittels Peroxid-Zahl (POZ)

• POZ ist ein Maß für den peroxidisch gebundenen Sauerstoff in Fetten• Die POZ ermöglicht innerhalb gewisser Grenzen Aussagen über den Verderbszustand bzw. die Lagerfähigkeit eines Fettes / Öls

• POZ < 10: Fett genussfähig (Ausnahme: natives Olivenöl POZ < 20)

• Achtung: Bei fortgeschrittenem Verderb zerfallen die Hydroperoxide -> POZ kann folglich wieder sinken!

Hauptursachen für Fettverderb:• enzymatische Vorgänge (insbesondere Hydrolyse von Triglyceriden durch Lipaseaktivität) -> Freisetzung von Fettsäuren -> ranziger Ge- schmack (v.a. bei Buttersäure); Nachweis v.a. mittels Säurezahl

• autoxidative Vorgänge: Radikalketten-Reaktion -> Induktionsperiode, danach schneller Anstieg, v.a. bei mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Linol-, Linolensäure). Primärprodukte: Hydroperoxide, welche zu ge- ruchsintensiven Aldehyden und Ketonen weiterreagieren können Nachweis: Peroxidzahl; Epihydrin- und Malondialdehyd; sensorisch

31

Prinzip der Bestimmung der POZ• definierte Menge an Fettprobe in Chloroform / Eisessig lösen

• mit Kaliumiodid (KI) versetzen

• durch Redoxreaktion mit Hydroperoxiden entsteht freies Iod (I2) (-> Gelb-Braunfärbung)

• Bestimmung der Menge des entstandenen I2 durch Titration mit Natriumthiosulfat-Maßlösung (Indikator: Stärke)

R1 - CH-R2 + 2 I + 2 H+ R1 - CH - R2 + H2O + I2 I I OOH OH

I2 + 2 S2O32- 2 I- + S4O6

2-

Nachweis / Bestimmung von Epihydrin- bzw. Malondialdehyd

Malondialdehyd(tautomer zu

Epihydrinaldehyd)

2-Thiobarbitur-säure

farbiges /fluoreszierendes

Kondensationsprodukt

+ 2

• Weiterreaktion/Zerfall der Hydroperoxide -> Aldehyde / Ketone

• Nachweis einzelner Aldehyde am Ende der Abbaukette; v.a. Epihydrin- und Malondialdehyd erfolgt durch eine Farbreaktionen (je intensiver die Färbung, desto mehr Aldehyd ist vorhanden), oder mittels HPLC

+

+

+

32

Oxidationsbereitschaft eines Öls / Fettes

• POZ allein erlaubt nur begrenzte Aussagen zur Lagerstabilität eines Öls, da der Gehalt an Radikalfängern (z.B. Tocopherole, Vitamin E) ebenfalls eine wichtige Rolle spielt (Radikalfänger hemmen die Autoxidation)• Beschleunigung der Autoxidation nach Verbrauch dieser Antioxidantien

-> Messung der Oxidationsbereitschaft nach Lagerung bei erhöhter Tem- peratur, z.B. durch Bestimmung der POZ oder mittels Rancimat

Bestimmung der Oxidationsstabilität von Fetten/Ölen mittels Rancimat

• Probe bei 50–220 °C einem Luftstrom aussetzen

• Die leichtflüchtigen Oxidationsprodukte (u.a. flüchtige Säuren) werden mit dem Luftstrom in ein Messgefäß mit einer Absorptionslösung über- und anschließend durch eine Leitfähigkeitsmessung quantifiziert

Induktionszeit bei___ 120°C 3 h___ 110°C 6 h___ 100 °C 12 h

Luft-einlass

Reaktions-gefäß

Öl-/Fett-Probe

Heizblock(50-200°C)

Messzelle mitAbsorptions-

lösung(Wasser)

Mess-sonde

0 5 h 15 h10 h

Rancimat- Messapparatur

Rancimat: schematischer AufbauInduktionszeiten der Autoxidationin Abhängigkeit von der Tempera-

turbelastung eines Fettes/Öls

33

120°C 110°C

100°C

Le

itfäh

igk

eit

Induktionszeit

Zeit

Iodzahl (IZ)• Die Iodzahl (IZ) charakterisiert den Gehalt an ungesättigten Fettsäuren (-> ungefähre Zahl an Doppelbindungen)• Definition: IZ = Menge an Halogen, berechnet als Iod, die von 100 g Fett gebunden wird. Je größer die Anzahl der -C=C-, desto größer die Iodzahl: Reine Ölsäure (1 x -C=C- ) IZ ! 90; reine Linolsäure (2 x -C=C-) IZ ! 180; reine Linolensäure (3 x -C=C-) IZ ! 270 Fette/Öle: Iodzahl zwischen 10 und 180, je nach FS-Zusammensetzung

• Die IZ erlaubt Aussagen über Reinheit, Herkunft, Authentizität eines Fettes/Öls• Prinzip der Bestimmung: Elektrophile Addition eines Reagenzes (Br2) an die Doppelbindungen der ungesättigten Fettsäuren

• Durchführung:

- Fett in CHCl3 lösen - Reagenzzugabe (im Überschuss) - nach 1-2 h (im Dunkeln): Freisetzung von I2 aus zugesetztem KI durch das unverbrauchte Reagenz - Rücktitration mit Natriumthiosulfat

Bestimmung essentieller Fettsäuren• Mehrfach ungesättigte Fettsäuren mit einer cis-cis-1,4-Pentadienstruktur (Linol- und Linolensäure) können vom menschlichen Organismus nicht synthetisiert werden; sie haben Vitamincharakter und müssen da- her mit der Nahrung zugeführt werden

• Die Bestimmung der essentiellen Fettsäuren kann entweder enzymatisch (summarische Bestimmung) oder gaschromatographisch (GC) nach Um- estern der Triglyceride zu Fettsäuremethylestern (FSME) erfolgen

#$Linolensäure (Omega-3-Fettsäure)

Linolsäure (Omega-6-Fettsäure)

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Iodzahlen typischer Fette und Öle

butter

Enzymatische Bestimmung essentieller Fettsäuren

Isolierte Doppelbindung

-C=C-CH2-CH2-C=C-" max ! 200 nm

konjugierte Doppelbindung

-C=C-CH2-C=C-CH-" max ! 234 nm

Prinzip der Bestimmung

• Die cis-cis-1,4 Dienstruktur (isolierte Doppelbindungen) wird in Gegen- wart des Enzyms Lipoxidase (Lipoxygenase) und Luftsauerstoff (O2) zu Dienhydroperoxiden oxidiert

• Hierbei bildet sich eine konjugierte Doppelbindung aus, deren charak- teristische Absorption bei ca. 234 nm die Messgrundlage bildet

• Doppelbindungen in isolierter Stellung weisen hingegen ein Absorpti- onsmaximum im kurzwelligeren UV-Bereich (< 200 nm) auf

• Aus Linol-, Linolen- und Arachidonsäure entsteht jeweils nur ein Mol Dienhydroperoxid, d.h. sie werden summarisch erfasst

Durchführung

• Da dass Enzym Lipoxidase wasserlöslich ist, Fett (Triglycerid) jedoch nicht, muß das Fett zunächst mit alkoholischer KOH verseift werden

• Es entstehen wasserlösliche Kalium-Salze der Fettsäuren (Seifen)

• Versuchsansatz mit HCl neutralisieren und pH-Wert mit einem Puffer auf das Optimum der Lipoxidase (pH 9) einstellen

• Messung der Extinktion bei 234 nm (Quarzküvetten verwenden!)

• Dann Aufteilen des Versuchsansatzes: zum Hauptversuch aktive Lipoxidase zugeben und einwirken lassen; zum Kontrollversuch („Blindwert“) inaktive (d.h. erhitzte) Lipoxidase geben

• Nach 45 min erneute Messung der Extinktion bei 234 nm

• Aus der Extinktionsdifferenz (nach und vor Enzymzugabe), abzüglich des Blindwertes den Gehalt an essentiellen Fettsäuren berechnen

Gaschromatographische Bestimmung essentieller FettsäurenDie gaschromatographische Bestimmung von Linol-, Linolen- und Ara-chidonsäure erfolgt prinzipiell genau so wie bei der Bestimmung derButtersäure (s. dort), nämlich nach Umesterung der Fettsäuren zu Fett-säuremethylestern (FSMEs).

35

Bestimmung des Milchfettgehaltes

Prinzip:

• Buttersäure (CH3H7-COOH) ist eine kurzkettige Fettsäure, die fast ausschliesslich in Milchfett vorkommt• Da ihr Gehalt in Milchfett relativ konstant ist (ca. 3.5%), wird sie häufig zur Bestimmung des Milchfettanteils in einer Fettmischung (z.B. in Butterkuchen, Butterkeks, Milchschokolade) herangezogen

Buttersäure

• Die Bestimmung der Buttersäure erfolgt entweder über die „Butter- säurezahl“ oder gaschromatographisch nach Umesterung zu FSMEs

Bestimmung der Buttersäurezahl• Die „Buttersäurezahl“ (BsZ) ist ein Maß für den Gehalt eines Fettes (bzw. einer Fettmischung) an Milchfett• Die BsZ von reinem Milchfett (Butterschmalz) beträgt ca. 20, während alle anderen reinen Fette eine BsZ < 1 aufweisen

Durchführung (vereinfachte Darstellung)• Fett (z. B. nach Isolierung mittes Soxhlet-Extraktion) mit alkoholischer KOH verseifen -> Kaliumsalze aller im Fett enthaltenen Fettsäuren

• längerkettige Fettsäuren (> 10 C-Atome) durch Zugabe von Kaliumsulfat ausfällen („aussalzen“) und abfiltrieren

• Buttersäure durch Ansäuren mit H2SO4 aus dem Salz freisetzen u. durch Wasserdampfdestillation abtrennen (Buttersäure ist leicht flüchtig)

• Bestimmung des Buttersäuregehaltes im Destillat durch Titration des Destillates mit 0,01 N NaOH. Blindwert ist erforderlich!

Verseifung Filtration Destillation Titration

Bestimmung der Buttersäurezahl

36

Fettsäurespektrum (GC-FSME)

• zur Bestimmung des Milchfettanteils in einer Fettmischung• zur Tierartunterscheidung• Herkunfts- bzw. Authentizitätsnachweis• zur Bestimmung essentieller Fettsäuren in einem Fett oder Öl

Prinzip:

• Fette sind Triglyceride = Ester von Fettsäuren mit dem dreiwertigen Alkohol Glycerol; weisen hohe Siedepunkte auf (schwerflüchtig)

• Umestern der Fettsäuren, z.B. mit Natriummethylat -> Methylester der Fettsäuren (FSME) (niedrigerer Siedepunkt, leichter flüchtig) (Anmerkung: auch bei der Herstellung von Biodiesel aus Rapsöl)

TriglyceridFett/Öl

Methanol +Katalysator

bzw. Na-Methylat

Glycerol

Fettsäure-methylester

(FSME)

• Bestimmung der FSME nach gaschromatographischer Auftrennung

• Quantifizierung: über die Peakhöhen oder die Peakflächen,entweder mit Hilfe eines externen, oder - besser- eines internen Standards

Fettsäurespektrum von Milchfett (GC-FSME)Quantifizierung mittelsinternem Standard (IS)

37

Buttersäure-methylester

Enzymatische Analysen

Haupteinsatzgebiete von Enzymen in der LM-chemischen Analytik:• Nachweis von Enzymaktivitäten als Indikatorreaktion zur Beurteilung der Beschaffenheit eines Lebenmittels (z.B. ausreichende Erhitzung von pasteurisierter Milch)

• Zur quantitativen Bestimmung von Lebensmittelinhaltsstoffen (z.B. Glucose, Lactose) mit Hilfe von Enzymen

• als Indikatoren in Enzym-Immunoassays (ELISA)

1. Enzymaktivitätsbestimmung• Das im Lebensmittel enthaltene Enzym stellt hier den Analyten dar

• Bestimmung der Geschwindigkeit der enzymkatalysierten Reaktion: Ermittlung des Substratumsatzes pro Zeiteinheit

• Messung von Enzymaktivitäten: sowohl für qualitative Nachweise als auch für quantitative Bestimmungen

• meist photometrische Messung über ein gefärbtes Reaktionsprodukt; aber auch titrimetrisch oder Viskositätsmessung (z.B. Polymerabbau)

• Beispiele:

- Kurzzeit- oder Hocherhitzung von Milch (Nachweis der Aktivität der alkalischen Phosphatase bzw. Lactoperoxidase) - ausreichendes Blanchieren von Gemüse (-> Peroxidase-Aktivität) - Eutererkrankungen bei Milch (-> Katalase) - bakterielle Verunreinigungen in Milch (Anwesenheit vonReduktasen)Nachweis einer ausreichenden Kurzzeiterhitzung von Milch

• Inaktivierung der alkalischen Phosphatase (71-74°C, 20-40 Sekunden)• Nachweis der Phosphatase-Aktivität mit Lactognost-Reagenz:

Blaufärbung: Phosphatase stark positivGrünfärbung: Phosphatase schwach positivGraufärbung: Phosphatase negativ

38

- HCl

AlkalischePhosphatase

+ H2O

Farbstoff(blau)

Nachweis einer ausreichenden Hocherhitzung von Milch

NH2H2N

NH2H2N NHHN ==[ O ]

+ H2OPeroxidase

Guajakolp-Phenylendiamin

2. Bestimmung von Substraten (Lebensmittelinhalts-stoffen) mit Hilfe von Enzymen

• Vorreinigung: Flüssige Analysenprobe (Fruchtsaft, Wein, Milch) bzw. wässrigen Extrakt des Lebensmittels klären (z.B. mit Carrez-Reagenz)

• Mit geeignetem Enzym, ggf. auch Co-Enzym, sowie Aktivatoren (z.B. Mg2+) und Puffer (zur Einstellung des optimalen pH-Werts) versetzen und Reaktion ablaufen lassen bis das Substrat komplett verbrauchtist

Messung - in den meisten Fällen eine photometrische Messung (UV/Vis) einer Substanz, deren Konzentration sich im Verlauf der Reaktion propor- tional zu der des Analyten ändert, z.B. das bei der Reaktion gebildete Produkt, oder die Abnahme des Edukts, oder das umgesetzte Co- Enzym (meistens NAD(P)H)

- aber auch andere Messtechniken möglich, z.B. Titrimetrie wenn eine Säure entsteht oder verbraucht wird

• Nachweis der Peroxidase-Aktivität: z.B. mit Guajak-Reagenz:

• aktive Lactoperoxidase spaltet aus Wasserstoffperoxid (H2O2) atomaren Sauerstoff ab und überträgt ihn auf einen Akzeptor (z.B. Guajakol oder p-Phenylendiamin) unter Bildung einer farbigen Verbindung

• Peroxidase wird bei Temperaturen > 85°C (10 Sekunden) inaktiviert

• Achtung: Bei zu kurzer Erhitzungs- dauer kann Peroxidase renaturieren!

MHD

39

Beispiele

Isolierte Doppelbindung" max < 200 nm

konjugierte Doppelbindung" max ! 234 nm

Enzymatische Bestimmung essentieller Fettsäuren• photometrische Messung der Extinktionszunahme bei 234 nm

Enzymatische Bestimmung von Lactose in Milch/ -produkten

(I) Lactose + H2O Galactose + Glucose

(II) Galactose + NAD+ Galacturonsäure + NADH + H +

ß-Galactosidase

Galactose-

Dehydrogenase

Vorteile enzymatischerBestimmungen

• hochspezifisch• hohe Sensitivität• gute Reproduzierbarkeit• einfache Probenvorbereitung• unkomplizierte Arbeitsweise• relativ schnell (20-30 min)• teil- bzw. vollautomatisierbar• keine toxischen Chemikalien erforderlich• umweltfreundlich

Nachteile• nur auf eine begrenzte Anzahl von Analyten anwendbar• Testkombinationen z.T. teuer• Störungen durch: - Schwermetallionen - oxidierende Substanzen - Gerbstoffe (Polyphenole) - unreine Enzyme

(I) (II)

Ab

sorp

tio

n 3

40

nm

Ab

s or p

tio

n

Extinktions-zunahme(-> NADH)

%E

Zeit (min)

Wellenlänge (nm)

40

Optische Verfahren

Prinzip / Beispiele:Wechselwirkungen von elektromagnetischer Strahlung und Materie:

• Absorption von Strahlung (UV/Vis - Photometrie)

• Emission von Strahlung (z.B. Fluoreszenzmessung)

• Messung von Streulicht (Nephelometrie, Turbidimetrie)

• Brechung von Licht (Refraktometrie)

• Drehung der Schwingungsebene polarisierten Lichtes (Polarimetrie)

Refraktometer Polarimeter

Unterscheidung: Spektrometrie und Spektroskopie (vereinfacht):„Spektrometrie“ = meist quantitative Messung (-> Intensität)„Spektroskopie“ = Spektrum aufnehmen (-> Lage der Linien)

41

Licht-quelle

Polari-sator

Proben-behälter

Analy-sator

Photometer

0.257

Kolorimetrie / Photometrie

. .

Kolorimetrie

d1

d2c1

c2

• Konzentrationsbestimmung eines farbigen Stoffes durch Vergleich mit einer Referenzlösung bekannter Kon- zentration (i.d.R. visuell)

• Veränderung der Schichtdicke, bis identische Farbintensitäten• in diesem Fall gilt:

c1 x d1 = c2 x d2

• Vorteil: einfach und billig• Nachteil: nur für gefärbte Lösungen; Messung: teilweise subjektiv, v.a. bei unterschiedlichen Farbtönen

Kolorimetrie (Prinzip)

Absorptionsmessung

„Bouguer-Lambert-Beersches“ Gesetz: E = & c d

E = Extinktion; & = molarer Extinktionskoeffizient; c = Konzentration der

absorbierenden Substanz (meist in mol/l); d = Schichtdicke der Küvette

• Schwächung der Strahlungsintensität mit der Weglänge beim Durchgang durch eine absorbierende Substanz• Intensitätsschwächung in Abhängigkeit von der Konzentration der absorbierenden Substanz

• Gilt streng genommen nur für monochromatisches Licht und verdünnte, sowie klare (d.h. nicht-trübe) Lösungen (andernfalls Lichtstreuung) Beispiel: E = 1.0 -> 90% des einfallenden Lichtes werden absorbiert (für E = 2.0 -> 99%; für E = 3.0 -> 99.9% Absorption )

c1 > c2

42

10nm

200 nm 2500 nm

fernes UV nahes UV nahes Infrarot (IR)

Photometrische Messungen

sichtbarer Bereich (Vis)

400 nm 700 nm

UV/Vis-PhotometrieVergleichende Messung von Lichtintensitäten

Strahlungsquellen

Vorteile von Linienstrahlern gegenüber Kontinuumstrahlern• höhere Intensität• schmale Wellenlängenbereiche, die mit relativ kleinem Aufwand erhal- ten werden können (z.B. mit Interferenzfiltern); preisgünstig

Nachteile gegenüber Kontinuumstrahlern• es steht nur Licht bestimmter Wellenlängen zur Verfügung, die nicht immer mit der optimalen Absorption der zu messenden Substanz zusammenfallen (z.B. NADH: "max = 340 nm; Hg-Lampe: 365 nm)

Wichtig: Lampen mindestens 15 min vor der Messung einschalten, dadie Strahlungsintensität bei Erwärmung zunimmt!

Linienspektrum(Hg-Lampe)

Kontinuierliches Spektrum (Wolframfadenlampe)

• Kontinuumstrahler: strahlen Licht kontinuierlich über einen bestimm- ten Wellenlängenbereich ab - Wolframfadenlampe (engl. „Tungsten“; Glühbirne); Bereich von 300 - 1000 nm; jedoch schwache Leistung im UV-Bereich < 340 nm - Deuteriumlampe: 180-360 nm; besonders geeignet für UV-Bereich

• Linienstrahler: strahlen nur Licht ganz bestimmter Wellenlängen ab, z.B. Hg-Lampe: 254, 265, 280, 365, 405, 492, 578 nm etc. Werden meist in preisgünstigen Filter-Photometern eingesetzt

43

0.257

Strahlungsquelle

Intensitäts-einstellung

(Blende)

Monochromatorzur Wellenlängen-

einstellung

Blende Blende

Detektor /Empfänger

Signalmessung

Probenbehälter(Küvette mit

Probe)

Anzeige-instrument

Intensitätsschwächung / Strahlungsschwächung

Absorptionsfilter Interferenzfilter

Je nach Spaltbreite oder Stel-lung der Kämme tritt mehroder weniger Licht hindurch-> Intensitätseinstellung

• verstellbarer Spalt, Kammblende etc.

Herstellung von monochromatischem Licht• Isolierung von Licht einer genau definierten Wellenlänge

• Entweder durch Filter (Absorptions- oder Interferenzfilter) Absorptionsfilter: Gefärbte Gläser, die nur Licht eines bestimmten, jedoch relativ breiten Wellenlängenbereichs (> 30 nm) durchlassen. Meist in Kombination mit Linienstrahlern (z.B. Hg-Lampe)

• Oder durch Monochromatoren (Prisma, Beugungsgitter) -> Zerlegung von weissem Licht in seine Spektralfarben

Spektrale Bandbreite: Ausschnitt des Spektrums, welcher durch dieMeßküvette geschickt wird. Je enger die SB, desto besser: Prismen u.Gitter: < 5 nm; Interferenzfilter: 10-20 nm; Absorptionsfilter > 30 nm

44

Prisma

Interferenz

Beugungsgitter

Probenbehälter (Küvetten)

Lichtdurchlässigkeit (Transmission) in Abhängigkeit von der Wellenlänge• Glasküvetten (Bezeichnung: „OS“ oder „QS“): > 320 nm• Quarzglas („UV“): > 180 nm• Kunsstoff (z.B. „PS“) meist > 340 nm (je nach Kunststoff)

Chemikalienbeständigkeit• Glasküvetten („OS“ oder „QS“)

• Quarzglasküvetten („UV“)

• Kunsstoff („PS“ u.a.): ±, je nach Kuststoff; z.B. Polystyrol (PS):

- nicht beständig gegen: Aceton, Chloroform, Dioxan, DMF, Essig- säure (100%), Ethylacetat, Hexan, Salpetersäure (65%)

- beständig gegen: Ammoniak, Isopropanol, Natronlauge, Salzsäure

100

200 300 400 500 600 nm

80

60

40

20

Tra

ns

mis

sio

n i

n %

Quarzglas (UV) Optisches Spezialglas(OS, QS)

Poystyrol (PS)

Spektrale Durchlässigkeitunter-schiedlicher Glas-

und Kunsstoffsorten

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+++ (ausser gegen starke Laugen)

• Küvettenmaterial: Glas, Quarzglas und Kunststoffe

• Kriterien:- spektrale Durchlässigkeit (UV/Vis- oder nur Vis-Bereich)- Chemikalienbeständigkeit (v.a. gegen organische Lösungsmittel)- Preis: 0,05 # (Kunststoffküvette) bis 200,- # (Quarzküvette)- Füllmenge (Mikro-, Halbmikro- und Makroküvetten)- Präzision (Schichtdicke: 10 mm oder 10.00 mm)- Länge des Strahlengangs (10 mm, 20 mm, 50 mm)

Signalmessung - Empfänger / Detektor

• Detektor = lichtempfindliches Element, das das optische Signal in ein elektrisches Signal umwandelt. Die Stärke des elektrischen Stroms ist proportional zum einfallenden Licht

• Photozelle, Photomultiplier, Photodiodenarray

Anzeige-Einrichtung • Digitalanzeige; Analoganzeige (Zeiger, Schreiber); Computerbildschirm

UV-/Vis-Spektroskopie

• zur„qualitativen“ Analyse, d.h. zur Strukturaufklärung von Molekülen; • heute nur noch selten eingesetzt; z.B. zur Abschätzung der Anzahl konjugierter Doppelbindungen im Molekül

"max ! 220 nm

"max ! 265 nm

Fotozelle Diodenarray-Detektor (simultane Messung bei vielen Wellenlängen)

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0.225

220 240 260 280 nm

A

"max ! 134 * " n + 31 [nm]

n = Anzahl konjugierter Doppelbindungen

UV-Absorptionsspektrumvon Benzene

R

R

Quantitative Analyse • Lebensmittel enthalten oft Mischungen unterschiedlicher Substan- zen, welche im UV- und/oder /Vis-Bereich Licht absorbieren -> entweder: Vortrennung erforderlich -> oder: spezifische Detektion nach Derivatisierung (-> Farbreaktion)

Einzelkomponenten

220 250 280 nmWellenlänge

Vortrennung• Extraktion (z.B. mittels Scheidetrichter; vgl. Coffeinbestimmung)oder Wasserdampfdestillation und anschliessende photometrische Messung bei einer für die Substanz charakteristischen Wellenlänge

• Falls nach der Vortrennung ein Gemisch zweier Substanzen vorliegt (z.B. Sorbinsäure und Benzoesäure), die sich in ihren Absorptions- maxima unterscheiden, ist eine Simultanbestimmung durch Mes- sung bei zwei Wellenlängen möglich (-> Lösung von zwei Gleichun- gen mit zwei Unbekannten)

• Heutzutage: meist chromatographische Auftrennung (HPLC) und quantitative Bestimmung mit UV/Vis-Durchflussdetektor

Spezifische Farbreaktionen

Analyt farbige VerbindungSpezifische chemische

Reaktion („Farbreaktion“)

Beispiele

• Hydroxyprolin-Bestimmung• Nitrit-Bestimmung (-> Azofarbstoff)

++

+

+

linearerBereich

Kalibrier-kurve

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Remissionsphotometrie• Prinzip: Teststäbchen („Dip-Stick“), basierend auf enzymatischer oder chemischer Messmethodik (-> Farbreaktion)

• Anschließend: Messung des an dem Teststäbchen reflektierten Lichts mit Hilfe eines Remissionsphotometers („Reflektometer“)

• Bestimmung der Konzentration bestimmter LM-Inhaltsstoffe anhand der Intensitätsunterschiede zwischen emittiertem und reflektiertem Licht

• Vorteile: - sehr schnell (15 sek-10 min); einfache Handhabung - niedrige Analysen- und Anschaffungskosten; umweltfreundlich - Ideal für vor-Ort-Analysen zur schnellen Ermittlung wichtiger Parameter

• Messgenauigkeit: +/- 10 Prozent

• Einsatzbereich: Rohstoffuntersuchung, Prozess- und Produktkontrolle, Einhaltung von Grenzwerten, Überprüfung von Reinigung / Desinfektion, zur Vorselektion von Proben für exaktere Analysen etc.

Kunststoff-Trägerfolie

Teststäbchen in die zuuntersuchende

Flüssigkeit eintauchen

Das Testfeld mit derFarbskala auf derDose vergleichen

Remissionsmessung(Prinzip) Reflektometer (Merck)

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Io = 100%

Reaktions-zone

Ir = 25%

Photo-zelle

Chromatographische Trenntechniken

Chromatographie = Verfahren zur Stofftrennung, die auf unterschiedlichstarken Wechselwirkungen des Analyten mit einer mobilen Phase undeiner stationären Phase beruhen

• Mobile Phase: Flüssigkeit oder Gas (-> Flüssig- /Gas-Chromatographie)

• Stationäre Phase: - Feststoffe, z.B. Kieselgel (-> Adsorptionschromatographie) - dünner Flüssigkeitsfilm (-> Verteilungschromatographie)

• Besitzen die zu analysierenden Komponenten der Probe unterschied- liche Affinität zur mobilen bzw. stationären Phase, so können sie von- einander getrennt werden

• Sind die Wechselwirkungen mit der stationären Phase stark, so bewegt sich die Substanz langsam, im umgekehrten Fall schnell

• Schließlich müssen die getrennten Substanzen sichtbar gemacht (detektiert) werden

Chromatographische Trennverfahren in der LM-Analytik• Niederdruck-Säulenchromatographie (SC)• Dünnschicht- bzw. Papierchromatographie (DC bzw. PC)• Gaschromatographie (GC)• Hochleistungs- (bzw. Hochdruck-)Flüssigchromatographie (HPLC)

Säulenchromatographische Trennung undIsolierung von Pflanzenfarbstoffen M. Tswett

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Proben-gemsch

Dünnschichtchromatographie (DC)• entweder als Adsorptionschromatographie (stationäre Phase: Kieselgel)

• oder als Verteilungschromatographie (stationäre Phase: Cellulose mit dünnem Flüssigkeitsfilm)

• Papierchromatographie: Verteilungschromatographie; jedoch auf Chro- matographiepapier anstelle von mit Cellulose beschichteten DC-Platten• überwiegend für qualitativen Nachweis / halbquantitative Bestimmung

Durchführung• Probenauftragung: möglichst kleiner Startpunkt; ggf. mehrmals kleine Volumina (1 $l) auftragen und zwischendurch mit dem Fön trocknen

• Eigentliche chromatographische Trennung („Entwicklung“): 10-90 min, je nach Fließmittel, stationärer Phase und Länge der Trennstrecke

• Nach der Entwicklung: Trocknen mit dem Fön (Abzug!); evtl. bei 100°C

• Nachweis (Detektion) der getrennten Substanzen

- manchmal direkt sichtbar (bei farbigen / fluoreszierenden Substanzen) - meistens: Besprühen mit einem Farbreagenz + Erhitzen bei 100°C

Deckel

Fließ-

mittel-

front

DC-

Platte

Fließ-

mittel-Auftragen der Probe Entwicklung Rf-Wert

Nachweisreagenzien• universelle Nachweis-Reagenzien (z.B. KMnO4 oder konz. H2SO4) -> nahezu alle Komponenten detektierbar; jedoch selten angewandt• spezifische (selektive) Nachweisreagenzien -> nur bestimmte Kom- ponenten werden gezielt detektiert (Beispiel: Ammoniummolybdat-

Reagenz zum Nachweis kondensierter Phosphate in Wurst)

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Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)• wesentlich höhere Trennleistung als die DC

• deutlich schneller als DC durch Anwendung hoher Drücke (5 - 25 MPa)

• ausgezeichnete Quantifizierbarkeit der getrennten Substanzen

• vor allem für Verbindungen, die nicht flüchtig sind bzw. die sich nicht unzersetzt verdampfen lassen -> polare Substanzen (Zucker, Amino- säuren, organische Säuren etc.)

Aufbau einer HPLC-Anlage

Pumpe

Proben-aufgabe-

vorrichtung

Elutions-mittel

Trenn-säule

Detektor

Signal-Verstärker/-Umwandler

Elutionsmittel-abfall

Rekorder /Computer

• Säulenfüllung: überwiegend „Umkehrphasen“ (Reversed-Phase) = modifiziertes Kieselgel (z.B. RP-8, RP-18); seltener „Normalphasen“

• Elutionsmittel: meist Wasser/Methanol oder Wasser/Acetonitril-Gemische

• Trennzeiten: je nach Säulenlänge (10 - 25 cm), Druck (5-25 MPa) und Elu- tionsmittelzusammenstzung: 2 - 40 min

• Detektor: meist UV-/Vis-Durchflussphotometer; seltener RI-Detektor

• Quantifizierung: meist mittels Kalibrierkurve über „externen“ Standard“ = Vergleichssubstanz bekannter Konzentration; Quantifizierung über die Peakhöhen oder -flächen. Voraussetzung:

- identische Trennbedingungen (Elutionsmittelzusammensetzung, Druck, Flussrate, Temperatur, Säulenfüllung etc.) - identische Probenauftragevolumina (Probenschleife, 10 oder 20 $l)

HPLC-Anlage

Probenaufgabe-vorrichtung

(Probenschleife)

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Gaschromatographie (GC)• Trennverfahren für Stoffgemische, die gasförmig vorliegen, oder die sich unzersetzt verdampfen lassen; v.a. für (unpolare) Substanzen mit niedrigen Siedepunkten, z.B. Kohlenwasserstoffe, kurzkettige Alkohole

• Nichtflüchtige, polare Verbindungen (z.B. Zucker, Aminosäuren) lassen sich nach Derivatisierung (z.B. Methylierung, Umesterung, Silylierung) soweit stabilisieren, daß sie analysiert werden können

• Extrem hohe Trennleistung, v.a. bei Verwendung von Kapillarsäulen

• Detektoren: Flammenionisationsdetektor (FID), Wärmeleitfähigkeits- detektor (WLD), Elektroneneinfangdetektor (ECD), Stickstoff-Phos- phordetektor (NPD), oder Massenspektrometer (MS)

Aufbau einer GC-Anlage Gepackte Säule (oben)Kapillarsäule (unten)

Qualitative Analyse (Identifizierung unbekannter Substanzen)• Vergleich mit Retentionszeiten bekannter Substanzen in einer Probe• Zumischung von bekannten Substanzen („Aufstocken“)• mit Hilfe homologer Reihen (z.B. Alkohole)• Identifizierung mit unterschiedlichen Detektoren (z.B. FID-ECD)• Identifizierung mit Hilfe anderer Analysenverfahren, z.B. Massen- spektrometrie (MS), NMR- oder IR-Spektroskopie

Quantitive Analyse• Mit externem Standard (= Vergleichssubstanz bekannter Konzentration) Voraussetzung: identische Probenvolumina und Trennbedingungen• Mit internem Standard = zusätzliche Substanz, die in der Probe natür- licherweise nicht vorkommt, und die sich von den Probenkomponenten gut trennen lässt, wird der Analyse und dem Vergleichsstandard zur Normalisierung der Peakflächen zugesetzt.

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