Aus der Frauenklinik des Universitätsklinikums der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. M. W. Beckmann

Assoziationen zwischen Polymorphismen im Topoisomerase IIα Gen mit der

Länge des HER2-Amplikons auf Chromosom 17 - Implikationen für

Mechanismen der Genamplifikation und die Prognose bei

Mammakarzinompatientinnen

Inaugural-Dissertation zur Erlangung

der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Sebastian Bernd Weihbrecht

aus Erlangen

Erlangen, im Januar 2010

Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. M. W. Beckmann

Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. P. A. Fasching

Tag der mündlichen Prüfung: 13.04.2011

Meinen Eltern

1.  ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................................... 1  2.  EINLEITUNG...................................................................................................................................... 5  

2.1. EPIDEMIOLOGIE DES MAMMAKARZINOMS........................................................................................7  2.2. RISIKOFAKTOREN ......................................................................................................................................8  2.3. BEHANDLUNG DES MAMMAKARZINOMS ........................................................................................ 12  

2.3.1. Operation ............................................................................................................................................ 12  2.3.2. Strahlentherapie ............................................................................................................................. 15  2.3.3. Chemotherapie ................................................................................................................................ 17  2.3.4. Endokrine Therapie ...................................................................................................................... 19  2.3.5. Molekulare und zielgerichtete Therapie ............................................................................ 21  

2.4. THERAPIEENTSCHEIDUNG BEIM MAMMAKARZINOM ................................................................. 22  2.4.1. Prognosefaktoren und Prädiktivfaktoren .......................................................................... 23  2.4.2. Klinisch etablierte Prognosefaktoren .................................................................................. 25  2.4.3. Kombinierte Prognose- und Prädiktivfaktoren .............................................................. 28  2.4.4. Topoisomerase IIα......................................................................................................................... 33  

2.5. RATIONALE UND FRAGESTELLUNG.................................................................................................. 35  3.  MATERIAL  UND  METHODEN.................................................................................................... 36  

3.1. BESCHREIBUNG DER PATIENTINNENKOHORTE .......................................................................... 36  3.2. DATENMANAGEMENT ............................................................................................................................ 37  3.3. ISOLATION DER DNA AUS DEM PATIENTINNENBLUT ................................................................ 38  3.4. SNP ANALYSE MITTELS RTQ-PCR ................................................................................................ 38  3.5. PRINZIP UND HERSTELLUNG DES TISSUE MICROARRAY ....................................................... 39  3.6. DURCHFÜHRUNG DER FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG ........................................ 41  3.7. AUSWERTUNGSMETHODEN ................................................................................................................ 45  3.8. STATISTISCHE ÜBERLEGUNGEN....................................................................................................... 46  

4.  ERGEBNISSE................................................................................................................................... 47  4.1. PATIENTINNENCHARAKTERISTIKA .................................................................................................... 47  4.2. GENOTYPEN UND ASSOZIATION MIT TUMORCHARAKTERISTIKA ......................................... 50  4.3. UNIVARIATE KORRELATION MIT DEN PATIENTINNENCHARAKTERISTIKA .......................... 51  4.4. KORRELATION MIT DEM 10-JAHRES-GESAMTÜBERLEBEN UND DEM FERNMETASTASENFREIEN ÜBERLEBEN DDFS ................................................................................... 56  4.5. COX-REGRESSIONSANALYSE............................................................................................................ 58  

5.  DISKUSSION................................................................................................................................... 63  6.  LITERATUR .................................................................................................................................... 67  7.  ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................................... 97  8.  ANHANG........................................................................................................................................101  

8.1. SCREENSHOTS DES DOKUMENTATIONSPROGRAMMES DOMAS .....................................101  8.2. DOKUMENTATIONSBOGEN DER BAVARIAN BREAST CANCER CASES AND CONTROLS STUDIE ...............................................................................................................................................................105  

9.  DANKSAGUNG .............................................................................................................................122  

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1. Zusammenfassung

Titel: Assoziationen zwischen Polymorphismen im Topoisomerase IIα Gen mit

der Länge des HER2-Amplikons auf Chromosom 17 - Implikationen für

Mechanismen der Genamplifikation und die Prognose bei

Mammakarzinompatientinnen

Hintergrund und Hypothese: Eine Chemotherapie mit Anthrazyklinen stellt

zurzeit die Standardtherapie bei der Therapie von Patientinnen mit

Mammakarzinom dar. Der Amplifikationsstatus des Gens Topoisomerase IIα

(TOP2A) ist ein prädiktiver Faktor für die Wirksamkeit einer Anthrazyklin-

Chemotherapie. Dies wird damit in Zusammenhang gebracht, dass TOP2A

eines der Angriffsziele dieser Chemotherapie ist. Auf Chromosom 17q21 ist

TOP2A Bestandteil eines langen Amplikons, welches vom zentromerisch

gelegenen HER2-Gen bis zu TOP2A reicht. TOP2A wird nie ohne HER2

amplifiziert, allerdings ist HER2 in den meisten Fällen ohne TOP2A amplifiziert.

Die molekularen Gründe hierfür sind unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist es, den

Einfluss genetischer Polymorphismen im TOP2A-Gen auf die Prognose von

Mammakarzinompatientinnen und den TOP2A-Amplifikationsstatus zu

untersuchen.

Methoden: Die Bavarian Breast Cancer Cases and Controls Studie (BBCC) ist

eine prospektive Kohortenstudie zur Untersuchung von Risiko- und

Prognosefaktoren bei Mammakarzinompatientinnen. Von den meisten

Patientinnen sind Biomaterialien wie Keimbahn-DNA und Tumorgewebe

verfügbar. An Keimbahn-DNA wurde der Single Nucleotide Polymorphism

(SNP) rs13695 in der 3´UTR-Region von TOP2A mittels quantitativer Real-

Time-PCR genotypisiert. Zur Bestimmung des Amplifikationsstatus des TOP2A-

Gens wurde ein Tissue Microarray aus in Formalin fixiertem, in Paraffin

eingebettetem Tumormaterial hergestellt und mittels fluoreszierender in situ

Hybridisierung die Genkopienzahl von HER2 und TOP2A quantifiziert. Diese

molekularen Marker wurden untereinander und mit der Prognose des

Mammakarzinoms assoziiert.

2 Ergebnisse: Insgesamt 1.276 Patientinnen konnten für den SNP rs13695

genotypisiert werden. Der homozygote CC-Genotyp war bei 736 Patientinnen

(57,7 %) vorhanden, der heterozygote CT- und der homozygote TT-Genotyp

konnte in 459 (36 %) bzw. in 81 (6 %) Patientinnen gefunden werden. Für

Patientinnen, die eine Chemotherapie erhalten hatten, konnte in der

multivariaten Überlebensanalyse gezeigt werden, dass der Genotyp ein

unabhängiger prognostischer Faktor war. Die adjustierte Hazards Ratio (HR)

pro T-Allel betrug 1,69 (95 % Konfidenzintervall: 1,14 bis 2,51; p = 0,009). Für

Patientinnen, die keine Chemotherapie erhalten hatten, war der Genotyp nicht

von prognostischer Relevanz. Die Bestimmung der Genkopienzahl von TOP2A

im Tumor war in 629 Fällen durchführbar. 587 Patientinnen (93,3 %) hatten eine

normale Genkopienzahl, 33 Patientinnen zeigten eine Amplifikation (5,2 %) und

bei 9 Patientinnen war TOP2A im Tumor deletiert (1,4 %). Bei der

Untersuchung der Assoziation zwischen dem Genotyp rs13695 und dem

Amplifikationsstatus von TOP2A konnte gesehen werden, dass der Anteil der

amplifizierten Patientinnen mit dem T-Allel zunimmt. Bei Patientinnen mit dem

homozygoten CC-Genotyp zeigte sich in nur 3,9 % der Fälle eine Amplifikation,

während diese bei heterozygotem CT- und homozygotem TT-Genotyp in 6,8 %

bzw. 9,7% der Tumoren gesehen werden konnte (p = 0,042).

Schlussfolgerung: Der TOP2A Genotyp in Bezug auf den SNP rs13695

scheint bei Mammakarzinompatientinnen, die eine Chemotherapie erhalten,

eine unabhängige prognostische Bedeutung zu haben. Des Weiteren scheint

der Genotyp mit dem Amplifikationsstatus dieses Gens assoziiert zu sein. Die

kausale Beziehung zwischen dem Keimbahngenotyp, dem Amplifikationsstatus

und der Prognose ist noch unklar und sollte Bestandteil weiterer

Untersuchungen sein.

3 Title: Associations between Polymorphisms of the Topoisomerase IIα Gene

with the Length of the HER2 Amplicon on Chromosome 17 - Implications for

Mechanisms of Gene Amplification and Prognosis in Breast Cancer Patients

Background and hypothesis: The amplification status of the gene

Topoisomerase IIα (TOP2A) is a known predictive factor in breast cancer

patients, who are treated with anthracycline chemotherapy. TOP2A is located

on Chromosome 17q21. Topoisomerase IIα plays a key role in DNA replication

and repairing. Furthermore it is the molecular target of anthracycline

chemotherapies. Several studies could associate TOP2A gene amplification or

deletion with an altered response to anthracycline chemotherapy. It is never

amplified without a coamplification of the HER2 gene, which is located on the

same chromosome. However in most of the cases HER2 is amplified without

TOP2A. Aim of this study was therefore to examine whether genetic

polymorphisms in the TOP2A gene are prognostic factors in breast cancer

patients and whether the genotype is correlated with the TOP2A amplification

status of the tumor.

Methods: The Bavarian Breast Cancer Cases and Controls study (BBCC) is a

prospective cohort study, which aims at researching breast cancer risk and

prognostic factors. Biomaterials such as germline DNA and tumor tissue is

available from most of the patients. Real-time-PCR was performed in order to

genotype the single nucleotide polymorphism (SNP) rs13695 in the 3’UTR

region of the TOP2A gene. Amplification of the TOP2A gene was quantified by

fluorescent in situ hybridization (FISH) of the same patients. The tumours were

available as a tissue microarray (TMA), which was constructed from paraffin

embedded tumours. Genotyping results were analyzed concerning their

prognostic relevance in this breast cancer patient cohort and genotype and

amplification status were associated with each other.

Results: The genotype of the SNP rs13695 could be ascertained of 1.276

patients. A homozygous genotype CC could be seen in 736 patients (57,7 %),

the heterozygous CT genotype and the homozygous alternative genotype TT

was present in 459 (36 %) and 81 (6 %) patients respectively. In the multivariate

survival analysis the genotype of rs13695 was statistically only significant in

4 patients who received an adjuvant chemotherapy with an adjusted hazards ratio

per allele of 1,69 (95 % confidence interval CI: 1,14 to 2,51; p = 0,009). In

patients who did not receive a chemotherapy the genotype had no prognostic

relevance at all. FISH results for gene copy number variation analysis were

available of 629 patients. 587 (93,3 %) patients had a normal gene copy

number of TOP2A, 33 patients (5,2 %) and 9 patients (1,4 %) showed an

amplification or a deletion. Associating the rs13695 genotype with the

amplification status of TOP2A, an increasing proportion of tumors with an

amplification was seen with each T allele. Patients with a CC genotype had an

amplification of the TOP2A in the tumor in 3,9 % of all cases and in 6,8 % and

9,7 % for the CT and the TT genotype respectively (p = 0,042).

Conclusion: The genotype of the SNP rs13695 seems to be of independent

prognostic relevance in breast cancer patients, who are treated with a

chemotherapy. Furthermore the genotype was correlated with the gene

amplification status in the tumor. The reason for this observation remains

unclear. Further evaluation of the SNP as prognostic factor and the association

with the amplification status are to be subject to further investigation.

5

2. Einleitung

Bei einer Chemotherapie von Patientinnen mit Mammakarzinom stellt die

Therapie mit Anthrazyklinen zurzeit einen Therapiestandard dar. Der

weitverbreitete Gebrauch der Anthrazykline (z. B. von Doxorubicin und

Epirubicin) in der adjuvanten Chemotherapie von Patientinnen mit einer

Mammakarzinomerkrankung (Pritchard et al., 2006) beruht auf einer Vielzahl

von prospektiv randomisierten Studien und auf mehreren Metaanalysen, wie

z. B. die der Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (Abe et al.,

2005; EBCTCG, 2005; Gennari et al., 2008), welche implizierten, dass

Patientinnen mit einem positiven HER2-Status von einem anthrazyklinhaltigen

Chemotherapieschema mehr profitieren als von einem Schema ohne

Anthrazykline. Die EBCTCG konnte in dieser 15.000 Patientinnen aus 17

Teilstudien umfassenden Kohorte eine 3 bis 4,5 %ige Verbesserung des

rezidivfreien Überlebens (RFS) und Gesamtüberlebens (OS) für den

anthrazyklinhaltigen Studienarm im Vergleich zum methotrexathaltigen

Studienarm nachweisen (Abe et al., 2005; EBCTCG, 2005). Dennoch gibt es

zunehmend mehr Studien, die sich mit der Frage beschäftigen, ob die generelle

Annahme der Überlegenheit einer anthrazyklinbasierten Chemotherapie (CHT)

gegenüber einem konventionellen Schema in Anbetracht der nicht

unerheblichen anthrazyklinassoziierten Nebenwirkungen weiterhin Bestand hat

(Slamon and Press, 2009).

Bislang betrachtete man die Langzeitnebenwirkungen einer

Anthrazyklintherapie, nämlich die Kardiotoxizität (Hoff et al., 1979; Ryberg et al.,

2008) und Sekundärleukämien (Diamandidou et al., 1996) als akzeptabel in

Anbetracht der Verbesserung der Prognose. Zwei Studien deuteten jedoch

bereits vor einigen Jahren darauf hin, dass die Langzeittoxizität initial

unterschätzt wurde (Doyle et al., 2005; Hershman et al., 2007). Dies hat dazu

geführt, dass im Zeitalter der individualisierten Medizin das Nutzen-Schaden-

Verhältnis für eine anthrazyklinhaltige Therapie erneut diskutiert wird (Bergh et

al., 2001). Die molekulare Klassifikation von Mammakarzinomen hat dazu

geführt, dass nicht mehr wie vor zehn Jahren alle Patientinnen dieselbe

Therapie bekommen, sondern dass diese dem molekularen Subtyp angepasst

6 wird, um einen maximalen Therapieeffekt bei den Patientinnen zu erreichen

(Perou et al., 2000; Slamon and Press, 2009; van Veer et al., 2002).

Es stellt sich nun die Frage, warum HER2-positive Mammakarzinome sensitiver

gegenüber Anthrazyklinen sind. In den letzen Jahren haben sich die Hinweise

gemehrt, dass nicht HER2 kausal mit der höheren Sensitivität assoziiert ist,

sondern das telomerisch von HER2 gelegene Gen Topoisomerase IIα (TOP2A)

(Glynn, Miller et al. 2010). TOP2A kodiert für ein zellzyklusabhängiges Protein,

welches essentielle Funktionen für die Zellteilung, die mRNA-Transkription, die

DNA-Transkription und die DNA-Replikation hat. Darüber hinaus ist TOP2A als

ein wesentliches molekulares Ziel der Anthrazyklintherapie bekannt (Järvinen et

al., 2000; Konecny et al., 2010; Larsen et al., 2003). Es konnte nachgewiesen

werden, dass die Funktionsweise von TOP2A eng mit dem Amplifikationsstatus

des Gens zusammenhängt und dass eine Amplifikation nur in Zusammenhang

mit einer Amplifikation des HER2-Gens auftritt. Umgekehrt kommt aber eine

TOP2A-Amplifikation ohne eine HER2-Amplifikation nicht vor (Jarvinen and Liu,

2006; Olsen et al., 2004; Slamon D et al., 2007). Klinische Studien, die einen

anthrazyklinhaltigen und einen anthrazyklinfreien Chemotherapiearm haben,

sind bereits auf diese Zusammenhänge hin untersucht worden. Es konnte

gezeigt werden, dass die Vorteile im rezidivfreien Überleben RFS (HR = 0,35;

95 % CI: 0,17 bis 0,73, P = 0,005) und Gesamtüberleben OS (HR = 0,33,

95 % CI: 0,15 bis 0,75, p = 0,008) einer anthrazyklinbasierten CHT wie im Falle

des anthrazyklinhaltigen Arms auf Patientinnen beschränkt sind, die Tumoren

mit einem alterierten TOP2A-Amplifikationsstatus haben. Bei Patientinnen mit

regulärer Genkopienzahl konnte im Behandlungsarm nach dem

Anthrazyklinschema im RFS dagegen eine HR von

0,90 (95CI = 0,66 bis 1,23, p = 0,49) und im OS eine HR von

1,09 (95 CI = 0,77 bis 1,56, p = 0,62) demonstriert werden (O'Malley et al.,

2009). Über die molekularen Zusammenhänge der Koamplifikation von HER2

und TOP2A ist bislang nichts bekannt. Das Verständnis um die

Wirkmechanismen könnte neue prädiktive Faktoren für eine anthrazyklinhaltige

Chemotherapie identifizieren. Vor diesem Hintergrund beschäftigt sich diese

Arbeit mit dem Koamplifikationsverhalten von HER2 und TOP2A, sowie dem

Zusammenhang des Koamplifikationsverhaltens mit einem genetischen

7 Polymorphismus im TOP2A-Gen und den Auswirkungen auf die Prognose bei

Patientinnen mit Mammakarzinom.

2.1. Epidemiologie des Mammakarzinoms

Weltweit wird das Mammakarzinom der Frau über eine Million Mal pro Jahr

diagnostiziert (Bray et al., 2004). Mit über 57.000 Neuerkrankungen im Jahr und

einem relativen Anteil von etwa 27 % unter den häufigsten malignen

Erkrankungen der Frau in Deutschland ist es von herausragender Relevanz

(GEKID, 2008). Auf 100.000 Frauen kommen in Deutschland 104

Mammakarzinomneuerkrankungen und über 26 Todesfälle pro Jahr. Die

Inzidenz des Mammakarzinoms steigt seit 1980 in Deutschland kontinuierlich

an, während die Mortalität seit 1995 leicht sinkt. Die relative 5-Jahres-

Überlebensrate über alle Stadien lag im Jahr 2004 bei 81 % (GEKID, 2008).

Das Lebenszeitrisiko, an einem Mammakarzinom neu zu erkranken, beträgt bis

zum 70. Lebensjahr 10 % (Feuer et al., 1993). Das Mammakarzinom ist nach

Lungen- und Magenkrebs die dritthäufigste Krebsart der Welt und die häufigste

maligne Erkrankung der Frau. Des Weiteren ist es für 23 % aller

Krebstodesfälle bei Frauen weltweit verantwortlich und steht hierbei nach

Lungen-, Magen,- Kolorektal- und Leberkrebs an fünfter Stelle. Es ist die

Hauptursache für die Krebsmortalität bei Frauen in industrialisierten Ländern

(Parkin et al., 2002). Die Mammakarzinomraten stiegen in Amerika zwischen

1940 und 1980 jedes Jahr um 1,25 % . Die Wahrscheinlichkeit, ein invasives

Mammakarzinom zu entwickeln, ist in verschiedenen Altersgruppen

unterschiedlich. Die Wahrscheinlichkeit an einem invasivem Mammakarzinom

zu erkranken ist für das Lebensintervall bis zum 39. Lebensjahr mit 0,44% am

geringsten. Für die Altersintervalle 40. Bis 59. Lebensjahr und 60. bis 70.

Lebensjahr steigt das Risiko mit 4,14% und 7,53% stetig an. Die Betrachtung

des Gesamtlebenszeitraumes beinhaltet eine Erkrankungswahrscheinlichkeit

von 13,36% (Weir et al., 2003) (Jemal et al., 2004).

8

2.2. Risikofaktoren

Schon im 17. Jahrhundert sprach der Mönch Bernardo Ramazzini von einer

erhöhten Brustkrebsrate unter Nonnen (Ramazzini, 1713) und im Jahr 1866

berichtete Paul Broca von mehr als 10 Brustkrebsfällen in seiner Familie (Broca,

1866). Dies sind die ersten Beschreibungen der Risikofaktoren Nulliparität und

familiäre Häufung bei der Mammakarzinomerkrankung. Risikofaktoren sind

wichtige Parameter zur Einschätzung der Gefährdung der Patientinnen durch

die Krankheit, jedoch können bei etwa einem Drittel der Frauen mit

Mammakarzinom keine der bekannten Risikofaktoren gefunden werden (Colditz

et al., 1993; Harris et al., 1992a).

Frauen erkranken im Vergleich zu Männern etwa 135mal häufiger an

Brustkrebs (Bilimoria and Morrow, 1995; Giordano et al., 2002; Harris et al.,

1992a). Mit voranschreitendem Alter erhöht sich das Risiko. Es ist zu

erwarten, dass mit zunehmendem Alter die Inzidenz der

Brustkrebserkrankung zunimmt (Bilimoria and Morrow, 1995; Jemal et al.,

2004). Eine lange Phase der Fruchtbarkeit mit vielen menstruellen Zyklen

erhöht das Risiko an Brustkrebs zu erkranken. Daraus folgt, dass eine frühe

Menarche und eine späte Menopause Risikofaktoren sind (Brinton et al.,

1988). Ein unregelmäßiger Zyklus mit einer geringeren Gesamtzahl

ovulatorischer Zyklen konnte hingegen als protektiv identifiziert werden

(Parazzini et al., 1993). Nulliparität ist mit einem deutlich erhöhtem

Erkrankungsrisiko assoziiert (Kvale et al., 1987). Die Einnahme oraler

Kontrazeptiva erhöht das Risiko nicht. Die CARE Studie (Contraceptive and

Reproductive Experiences Study) zeigte ein relatives Risiko (RR) von 1,0 mit

einem 95 % Konfidenzintervall (CI) von 0,8–1,3 (Marchbanks et al., 2002).

Eine gegenwärtig verabreichte Hormonersatztherapie in der Menopause

erhöht das Risiko. Das RR steigt auf 1,66 mit einem 95% Konfidenzintervall

(CI) von 1,58 – 1,75 (p<0,0001). Die Einnahmedauer korreliert mit der

Risikozunahme. Die Zugabe von Gestagenen steigert das Risiko zusätzlich.

(Beral, 2003; Chlebowski et al., 2003). Die mammografische Dichte des

Drüsenkörpers ist ebenfalls mit einem erhöhten Krankheitsrisiko assoziiert.

Frauen mit einer mammografisch dichten Brust haben, verglichen mit Frauen

9 mit einer weniger dichten Brust, ein erhöhtes Erkrankungsrisiko. Die

Wahrscheinlichkeit prämaligne oder maligne Läsionen in einer radiografisch

dichten Brust frühzeitig zu entdecken ist vermindert. Die Dichte des

Drüsenkörpers scheint vererbbar zu sein. Sie nimmt in der Schwangerschaft,

der Menopause und unter Tamoxifentherapie

ab, unter Hormonersatztherapie (HRT) hingegen zu (Boyd et al., 1998; Tice

et al., 2005). Frauen mit atypischer Hyperplasie haben ein vierfach erhöhtes

Mammakarzinomrisiko. Fibrozystische Veränderungen ohne Proliferation

erhöhen das Risiko nicht (Dupont et al., 1993; Hartmann et al., 2005). Frauen

welche zuvor bereits an einem Endometrium- oder Ovarialkarzinom erkrankt

sind haben ein zweifach erhöhtes Erkrankungsrisiko (Antoniou et al., 2003;

Sánchez et al., 2008; Trentham-Dietz et al., 2007). Effekte ionisierender

Strahlung konnten in verschiedenen Studien ebenfalls mit dem

Brustkrebsrisiko in Verbindung gebracht werden. Die Effekte sind

altersabhängig. Zwischen der Pubertät und dem 30. Lebensjahr sind die

Wirkungen ionisierender Strahlung am schädlichsten (Dershaw et al., 1992).

Ab dem 50. Lebensjahr überwiegt der Nutzen der Mammografie den

potenziellen Schaden. Dies konnte für jüngere Frauen nicht gezeigt werden.

Die Mammografie für Frauen über 50 Jahren schadet also nicht (Bhatia et al.,

1996; John and Kelsey, 1993). Über die kausalen Zusammenhänge des

alkoholassoziierten Risikozuwachses wird noch diskutiert. Die Stärke des

Zusammenhanges wird von noch zu determinierenden Modifikatoren

beeinflusst. Für Frauen, deren erstgradige Verwandte täglich Alkohol

konsumieren ist das relative Risiko gegenüber Frauen die noch nie Alkohol

konsumiert haben mit einem RR von 2,45 deutlich erhöht. Für Frauen ohne

familiäre Risikokomponente oder weiterem Verwandtschaftsgrad konnte

lediglich ein geringeres Risiko nachgewiesen werden (Hartmann et al., 2005;

Vachon et al., 2001). Mögliche Modifikatoren des Alkoholeinflusses sind

genetische Suszeptibilität, Grad der Verwandtschaft, ein veränderter

Steroidhormonrezeptorstatus sowie eine Suchtassoziierte Reduktion der

Folatzufuhr (Singletary and Gapstur, 2001; Zhang et al., 2003). Bei dem

Auftreten eines Mammakarzinoms bei erstgradig Verwandten wird eine

Risikoerhöhung um den Faktor zwei beschrieben. Bei zwei erstgradig

Verwandten mit Brustkrebs ist das Risiko bereits um den Faktor vier bis

sechs erhöht. 85% der Mammakarzinomerkrankung sind familiär nicht

10 assoziiert (Fossland et al., 2009; Olsen et al., 1999; Ramsey et al., 2006).

Jedoch können zwischen 5 % und 10 % der Mammakarzinome in einem

vererbbaren Zusammenhang gesehen werden. Am besten sind hierbei die

Gene BRCA1 und BRCA2 (BReast CAncer) untersucht (Antoniou et al.,

2003). Es sind Tumorsuppressorgene, welche für DNA-Reparaturproteine

kodieren. Das Risiko zu erkranken, ist bereits erhöht, wenn eine einzige

Mutation der bereits mehr als 500 bekannten Mutationen vorliegt (Easton et

al., 1994; Ford et al., 1994). Das Lebenszeitrisiko, an einem

Mammakarzinom zu erkranken, wenn eine BRCA1-Mutation vorliegt, beträgt

etwa 50–80 % , bei einer BRCA2-Mutation etwa 40–70 % (Antoniou et al.,

2003). Das Lebenszeitrisiko für ein BRCA1-assoziiertes Ovarialkarzinom

beträgt 40 %, für ein BRCA2-assoziiertes Ovarialkarzinom liegt es bei 20 %

(Risch et al., 2001). Zur Beurteilung des Gesamtrisikos in Würdigung der

einezelnen Risikofaktoren wurden zwei mathematische Modelle entwickelt.

Das Gail-Modell vermag das persönliche Risikoprofil zu errechnen. Es gibt

das 5-Jahres-Risiko, an einem Mammakarzinom zu erkranken, im Vergleich

zu gleichaltrigen Populationen an und es kann das Lebenszeitrisiko für eine

Mammakarzinomerkrankung errechnen. Einschränkungen gibt es hinsichtlich

der Vorhersage für DCIS (duktales Carcinoma in situ) und LCIS (lobuläres

Carcinoma in situ), bei genetischen Mutationen und Fällen, die vermutlich

vererbt sind. Zweitgradig Verwandte werden nicht berücksichtigt (Decarli et

al., 2006; Gail and Rimer, 1998). Das Claus-Modell sagt das

Mammakarzinomrisiko über die Familienanamnese voraus. Es zieht hierzu

den Grad der Verwandtschaft und den Erstdiagnosezeitpunkt für das

kumulative Mammakarzinomrisiko in Betracht (Amir et al., 2010; Claus et al.,

1994). Weitere Modelle sind beschrieben, aber noch nicht ausgiebig evaluiert

(Fasching et al., 2007). Verschiedene potenziell risikomodifizierende

Faktoren, welche vor allem mit den Lebensgewohnheiten assoziiert, sind

wurden in diversen Studien untersucht (Linos et al., 2008). Es liegen unklare

Daten über eine fettreiche Diät vor (Thomson and Thompson, 2009), jedoch

sind kohlenhydratreiche Diäten über die elevierten Insulin- und IGF-Spiegel

mit einem erhöhten Risiko assoziiert (Hunter et al., 1996; Li et al., 2001; Velie

et al., 2005). In der Postmenopause ist Adipositas ein Risikofaktor.

Prämenopausal scheint sie präventiv zu wirken (Cleary and Grossmann,

2009; Morimoto et al., 2002; Renehan et al., 2008). Frauen, die in

11 wechselnden Nachtschichten arbeiten, haben ein erhöhtes

Mammakarzinomrisiko. Eine erhöhte Östrogenexposition durch den

Melatoninmangel wird hierfür verantwortlich gemacht (Kjaerheim et al., 2010;

Schernhammer et al., 2001). Risikosenkend wirkt sich ein junges Alter bei

erster ausgetragener Schwangerschaft aus (Lambe et al., 1994; Linos et al.,

2008). Die kumulative Dauer der Laktation und das junge Alter bei Laktation

senken das Risiko bei prämenopausalen Frauen an einem Mammakarzinom

zu erkranken. Ebenso gibt es Hinweise, dass gestillt worden zu sein vor

einem Mammakarzinom schützen kann (Kim et al., 2007; Lipworth et al.,

2000). Regelmäßige körperliche Aktivität kann das Mammakarzinomrisiko

senken (Sprague et al., 2007; Thune et al., 1997).

12

2.3. Behandlung des Mammakarzinoms

Die Behandlung des Mammakarzinoms richtet sich nach der Stadieneinteilung,

der Prognose der Erkrankung und der Einschätzung der Wirksamkeit der

geplanten Therapie. Patientinnen mit einer schlechten Prognose erhalten eine

umfangreichere Therapie als Patientinnen mit einer guten Prognose. Des

Weiteren können Tumor- oder Patientinnencharakteristika Hinweise auf die

Erfolgschancen einer Therapie geben wie z. B. der Hormonrezeptorstatus für

eine antihormonelle Therapie. Neben der Heilung ist auch die Erhaltung der

Lebensqualität ein wichtiges Ziel bei der Therapie des Mammakarzinoms.

Prinzipiell stehen Chemotherapie, Operation, Bestrahlung, Antihormontherapie

und zielgerichtete Therapie gegen spezifische Moleküle zur Verfügung (Chang

et al., 2001; Fasching et al., 2010; Harris et al., 1992b; Therasse et al., 2002).

2.3.1. Operation

Die Entscheidung für eine komplette Entfernung der Brust (Mastektomie) versus

einer brusterhaltenden Therapie (BET) wird von mehreren Faktoren abhängig

gemacht. Klar ist, dass die onkologische Sicherheit bei der operativen

Therapieentscheidung im Vordergrund steht (Pusic et al., 1999). Der Tumor

muss mit einem tumorfreien Resektionsrand (R0) exstirpiert werden

(BlichertToft et al., 1997; Solin, 2006). Mikroskopisch soll der gemessene

Sicherheitsabstand zwischen Tumor und Resektionsrand 1 mm und mehr für

das invasive Karzinom betragen (O'Higgins et al., 1998) und beim duktalen

Carcinoma in situ (DCIS) sollte der Resektionsabstand 5 mm oder mehr

betragen. Beinhaltet das Resektat eines invasiven Karzinoms einen großen

Anteil intraduktalen Karzinoms, wird empfohlen einen minimalen

Resektionsrand von 5 mm in alle Richtungen einzuhalten, vor allem, wenn die

intraduktale Komponente bis an den Resektionsrand des invasiven Karzinoms

heranreicht (Kerlikowske et al., 2003; Schnitt et al., 1994). Die historische

radikale Mastektomie, welche von Halsted (1894) und Rotter (1896) zur

Therapie des Mammakarzinoms empfohlen wurde, umfasst die En-bloc-

Entfernung des Brustdrüsenkörpers, des Pektoralmuskels, der ipsilateralen

13 axillären Lymphknotens und des axillären Fettgewebes. Die Inzision verläuft

normalerweise s-förmig geschwungen von der Axillamitte nach medial hin

abwärts zum Sternum (Fisher, 1999). Die häufigen Folgen dieses

ausgedehnten chirurgischen Eingriffes sind eine ästhetische Entstellung,

eingeschränkte Beweglichkeit des Armes und der Schulter und ein

ausgeprägtes Lymphödem des Arms und der Hand. Die klassische

Mastektomie gilt seit vielen Jahren nicht mehr als das Standardverfahren zur

Behandlung des operablen Mammakarzinoms (Harris et al., 1992b; Ohsumi et

al., 2007; Veronesi et al., 2002a). Die radikale Mastektomie nach Halsted und

Rotter ist heute lediglich bei Erkrankungen indiziert, bei welchen eine Infiltration

des Musculus pectoralis major vorliegt und die gleichzeitig noch keine

Fernmetastasierung aufweisen (Harris et al., 1992a). Zur Vermeidung der

ausgeprägten Nebenwirkungen der radikalen Mastektomie und mit dem Wissen,

dass die Prognose für die Patientin weniger von der Radikalität der Operation

abhängt, wurde die modifizierte radikale Mastektomie entwickelt (Mattig et al.,

1997; van Dongen et al., 2000). Es handelt sich hierbei um eine Ablatio

mammae mit axillärer Lymphadenektomie. Zur Prognoseabschätzung werden

10 Lymphknoten der axillären Level I und II mitreseziert und auf einen

Tumorbefall hin untersucht. Der Musculus pectoralis mitsamt Gefäß- und

Nervenversorgung bleib erhalten. Diese Operation wird meist über einen

Stewart-Hautschnitt durchgeführt, welcher im Anschluss eine operative

Rekonstruktion ermöglicht (Fowble et al., 1993). Dieses Operationsverfahren

kommt zum Einsatz, wenn eine brusterhaltende Therapie z. B. aufgrund eines

ungünstigen Tumor-zu-Brustgrößenverhältnisses, der Multizentrizität, bei mehr

als drei Lokalrezidiven oder wegen des Ausbreitungsgrades kontraindiziert ist

(Pusic et al., 1999; Romics et al., 2008). Bei einem günstigen Tumor-zu-Brust

Größenverhältnis, fehlender Haut- und Brustinfiltration und günstigem

Tumorsitz wird heutzutage eine brusterhaltende Therapie (BET) durchgeführt.

Allerdings ist bei einer BET ohne folgende Bestrahlung im Vergleich zur

Mastektomie das Risiko für die Entstehung eines Lokalrezidivs um das Drei- bis

Vierfache erhöht (Arndt et al., 2008; Martin et al., 2007; Pusic et al., 1999).

Deshalb wird an die BET obligat eine nachfolgende Brustbestrahlung

angeschlossen. Bezüglich des Überlebens ist die BET in Kombination mit der

obligaten Bestrahlung der alleinigen, modifiziert radikalen Mastektomie

gleichwertig (Fisher et al., 2002; Veronesi et al., 2002b; Weaver et al., 2000).

14 Bei der BET wird entlang der Hautfalten bogenförmig über dem Tumor oder,

wenn von dort erreichbar, durch einen areolären Randschnitt inzidiert und der

Tumor mitsamt der Haut und einem Sicherheitssaum von mindestens 1 cm

nach allen Seiten entfernt. Das Resektat muss für die nachfolgende

histologische Aufarbeitung dreidimensional fadenmarkiert werden, sodass im

Falle einer erforderlichen Nachresektion die Resektionsränder sicher zu finden

sind. In Abhängigkeit von der Beziehung des Tumors zur Brustwarze wird diese

mitentfernt. Von einer zweiten Inzision aus werden die axillären Lymphknoten

entfernt (Krag et al., 1993; Martin et al., 2007; Takashima, 1998). Für

Patientinnen mit größeren Tumoren (> 2 cm) gibt es auch die Möglichkeit einer

neoadjuvanten, präoperativen Chemotherapie zur Tumorverkleinerung. Für

diese therapeutische Möglichkeit bleiben aber noch viele Fragen offen, weshalb

diese Therapieoption nicht außerhalb von Studien angeboten wird (Afonso and

Bouwman, 2008; Laenkholm et al., 2008). Der Lymphknotenstatus ist einer der

wichtigsten prognostischen Faktoren des Mammakarzinoms, deshalb gehört die

axilläre Lymphonodektomie bei der BET und der Mastektomie obligat zum

diagnostischen und therapeutischen Konzept (Fitzgibbons et al., 2000;

Guadagnoli et al., 1998; Krag et al., 1993). Sie dient darüber hinaus der

Resektion von Lymphknotenmetastasen und dem pathologisch-anatomischen

Staging. Derzeit wird die offene axilläre Lymphadenektomie gegenüber der

sogenannten Sentinel-Node-Lymphonodektomie diskutiert. Bei der Sentinel-

Technik wird peritumoral Patentblau und/oder Technetium injiziert, um die

ersten vom Tumorgebiet drainierenden Lymphknoten zu identifizieren. Diese

werden reseziert und histologisch aufgearbeitet. Sind diese tumorfrei, kann auf

eine weitere Lymphknotendissektion verzichtet werden. Der Vorteil dieses

Verfahrens liegt in der Schonung bestehender Lymphstrukturen (Krag et al.,

1993; Luini et al., 2005). Nach einer Mastektomie kann die Brust während

derselben Operation oder nach einer Latenzzeit rekonstruiert werden. Die

Rekonstruktion kann mit heterologem Material oder autologem Gewebe

erfolgen. Die Vielzahl der plastischen Rekonstruktionsverfahren umfasst z. B.

die thorako-epigastrischen, den Latissimus-dorsi- und den Rectus-abdominis-

Schwenklappen (Reavey and McCarthy, 2008; Sandelin et al., 2003).

15

2.3.2. Strahlentherapie

In den letzten Jahren haben sich viele Therapiekonzepte für die Therapie des

Mammakarzinoms etabliert. Die Strahlentherapie leistet einen wichtigen Beitrag

zur postoperativen lokalen Tumorkontrolle (Rutqvist et al., 2003). Die

Forschung auf diesem Feld beschäftigt sich vornehmlich mit der Frage, das

Strahlenfeld zu reduzieren ohne geografische Verluste in Kauf nehmen zu

müssen (Costa et al., 2004). In 80–90 % der Fälle entstehen Rezidive an oder

in der Nähe des Lumpektomieareals. Tumorbettferne Rezidive treten mit einer

Inzidenz von weniger als 6 % auf (Kuerer et al., 2004). Im Anschluss an eine

brusterhaltende chirurgische Therapie ist eine Bestrahlung der Brust und der

angrenzenden Thoraxwand obligat (Clarke et al., 2005; Vinh-Hung and

Verschraegen, 2004). Bei der konventionellen Bestrahlung des Tumorbettes

und der Restbrust zeigen viele Studien eine Verbesserung des

Gesamtüberlebens (Overgaard et al., 1997; van de Steene et al., 2000). Das

Ziel der adjuvanten Radiotherapie ist die lokale Tumor- und Rezidivkontrolle

(Cuzick et al., 1994; Early Breast Cancer Trialists' Collaborative, 1995). Die

postoperative Radiatio nach BET gilt zurzeit als obligat, denn sie kann die

Lokalrezidivrate von 30 % auf 5 % senken (Livi et al., 2007; Mannino and

Yarnold, 2009). Sie kann durch vier verhinderte Lokalrezidive einen

krebsbedingten Todesfall im Verlauf von 15 Jahren verhindern (Clarke et al.,

2005). Die Teilbrustbestrahlung, ein derzeit noch experimentelles und nur

innerhalb von Studien durchgeführtes Verfahren, umfasst üblicherweise die

Lumpektomiehöhle mit einem sehr geringen Gerät zu Wundabstand und kann

sowohl interstitiell als Brachytherapie als auch extern z. B. unter Anwendung

eines 3D-CRT-Gerätes (three-dimensional-conformal radiation therapy device)

verabreicht werden. Hintergrund und Vorteil ist die direkte Applizierbarkeit

deutlich höherer Strahlungsdosen sowie die Schonung durchstrahlter Gewebe

und Organe. Im Vergleich zwischen der Teilbrustbestrahlung und der

konventionellen Bestrahlung der Brust beträgt die kumulative 5-Jahres-Inzidenz

für Lokalrezidive in beiden Gruppen 1 % (p = 0,65). Es gab keinen Unterschied

im erkrankungsfreien Überleben (DFS), im Gesamtüberleben oder in der

Fernmetastasierung. Einschränkend ist jedoch zu bemerken, dass das Kollektiv

der Teilbrustbestrahlten eine ausgewählte Gruppe von Patientinnen darstellt,

16 welche keinesfalls das Gros der Patientinnen repräsentieren kann (Vicini et al.,

2003). Weitere Teilbrustbestrahlungsverfahren sind MammoSite®

( = Verwendung eines Remote-Afterloading Systems mit High Dose Rate

Brachytherapie) sowie TARGIT ( = targeted intra-operative radiation therapy),

eine Teilbrustbestrahlungsmethode unter Einsatz intraoperativer

Photonenbestrahlung. Die Teilbrustbestrahlung ohne ergänzende

Homogenbestrahlung der Brust ist experimentell. Deshalb soll sie nicht

außerhalb von Studien erfolgen (Graham and Fourquet, 2006; Sauer et al.,

2005). Bislang ist der therapeutische Wert einer regionalen Bestrahlung des

Lymphabflussgebietes noch nicht durch prospektive und randomisierte Studien

belegt, weshalb nur nach individueller Risikoeinschätzung eine Entscheidung

für die Bestrahlung getroffen werden sollte (Hoebers et al., 2000; Recht et al.,

2001).

17

2.3.3. Chemotherapie

Die Tumorbiologie ist ein stetig an Bedeutung gewinnender Faktor für die

Auswahl eines Therapieregimens. So sind die Hormonrezeptoren- und der

HER2-Rezeptorstatus neben dem Lymphknotenstatus an die wichtigste Stelle

der Prognosefaktoren gerückt, gefolgt vom Grading und anderen Faktoren.

Basis für die Entscheidung für ein spezifisches Regimen bildet die

Risikoklassifikation und die Prädiktion eines endokrinen Ansprechens des

Tumors. Bislang wurde die zytostatische Therapie mit den AC/EC/FEC-

Schemata (A = Adriamycin, E = Epirubicin, F = Fluorouracil,

C = Cyclophosphamid) bzw. dem veralteten CMF-Schema (M = Methotrexat)

durchgeführt. Immer mehr rücken nun auch die Taxane (T) in den Vordergrund

(Hortobagyi, 2003; Kaklamani and Gradishar, 2005). In Metaanalysen der Early

Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (EBCTCG) konnte gezeigt werden,

dass die adjuvante Polychemotherapie mit oder ohne begleitende endokrine

Therapie das Gesamtüberleben in allen Altersgruppen unabhängig vom

Nodalstatus verbessert. Tamoxifen und Anthrazykline können jeweils für sich

alleine die relativen 15-Jahres-Mortalitätsraten um etwa 30 % senken, die

Kombination aus beiden vermindert die Mortalität noch deutlicher (EBCTCG,

2005). Die Auswahl der Art der adjuvanten Chemotherapie (CHT) und die

Risikoeinstufung erfolgt leitlinienbasiert (Bergh et al., 2001; Kreienberg, 2008).

Die CHT ist in den empfohlenen Dosierungen zu verabreichen. Bei einer zu

niedrigen Dosierung oder bei Reduktion der Zyklen droht ein Effektivitätsverlust.

Dosissteigerungen bei Cyclophosphamid oder Doxorubicin führen zu keiner

Effektivitätsverbesserung (Bonadonna et al., 1995; Fumoleau et al., 2003;

Henderson et al., 2003). Die Zytostatika können sequenziell oder simultan

verabreicht werden. Bei erhöhtem Rezidivrisiko können dosisdichte

Therapieschemata eingesetzt werden (Henderson et al., 2003; Untch et al.,

2009). Die adjuvante Kombinations-Chemotherapie sollte ein Anthrazyklin

enthalten. Die Indikationsstellung hierfür ist unabhängig vom Nodal- und

Rezeptorstatus. Sind die axillären Lymphknoten befallen, sollte zusätzlich ein

Taxan gegeben werden (Bria et al., 2006; Levine and Steering Comm Clin

Practice, 2001; Shenkier et al., 2004). Die nachgewiesenen positiven Effekte

einer adjuvanten CHT auf die Rezidiv- und Sterberisiken sind bei Frauen <50

Jahre am deutlichsten, dennoch profitieren auch postmenopausale Frauen. Die

18 Überlegenheit anthrazyklinhaltiger Schemata gegenüber CMF konnte nur in

Dreierkombinationen FAC, FEC in adäquater Dosierung und ausreichender

Zykluszahl (6 Zyklen) nachgewiesen werden. Eine Behandlung von über 6

Monaten bringt keinen zusätzlichen Benefit (Abe et al., 2005; Bria et al., 2006;

Campone et al., 2005). Die neoadjuvante systemische Therapie gilt heute als

weitere Therapieoption für Patientinnen mit lokal fortgeschrittenen, primär

inoperablen oder inflammatorischen Mammakarzinomen. Die neoadjuvante

CHT darf weiterhin bei allen Patientinnen durchgeführt werden, bei denen einen

Chemotherapie indiziert ist (Costa et al., 2009; Sarid et al., 2006). Sie stellt eine

weitere Therapieoption für Patientinnen dar, denen eigentlich eine Mastektomie

empfohlen wird, die aber eine brusterhaltende Therapie wünschen (Brito et al.,

2001; Kaufmann et al., 2006). Bei primär inoperablen Tumoren kann durch die

neoadjuvante Therapie eine operable Ausgangssituation vor der Operation

erreicht werden. Die Resektion ist dann in den neuen Grenzen möglich, wenn

dadurch eine komplette Resektion mit ausreichendem Sicherheitsabstand

erzielt werden kann (Kaufmann et al., 2003; Sarid et al., 2006). Bezüglich des

Langzeitüberlebens besteht kein Unterschied zwischen neoadjuvant und

adjuvant verabreichter CHT (Mauri et al., 2005). Bei postmenopausalen

Patientinnen mit hormonrezeptorpositiven Tumoren kann, wenn CHT oder

Operation nicht möglich sind, eine endokrine Therapie mit Aromatasehemmern

der dritten Generation durchgeführt werden (Ellis et al., 2001; Smith et al.,

2005).

19

2.3.4. Endokrine Therapie

Östrogen- und Progesteronrezeptoren sind Kernproteine, an die Östrogen und

Progesteron binden und die unter anderem das Wachstum des

hormonsensitiven Mammakarzinoms regulieren. Der Östrogenentzug ist die

wichtigste Methode in der anti-endokrinen Behandlung des Mammakarzinoms.

Tumoren prämenopausaler Frauen sind in der Hälfte der Fälle

hormonrezeptorpositiv (Anderson et al., 2001). Postmenopausal beträgt der

Anteil etwa 75 % (Chlebowski et al., 2007). Die Prognose bei

hormonrezeptorpositiven Frauen ist günstiger. Jede Patientin mit einem

positiven Hormonrezeptorstatus sollte eine anti-endokrine Therapie erhalten,

welche nach Abschluss der Chemotherapie begonnen wird (Bentrem et al.,

2003; Kreienberg, 2008). Bei prämenopausalen Frauen ist das Ovar der

Hauptsyntheseort für Östrogene und Gestagene. Hier bietet sich die

medikamentöse ovarielle Suppression mittels GnRH-Analoga an. Auch die

operative Ablation kann für manche Patientinnen erwogen werden. Die

Ovarsuppression mittels GnRH-Analoga oder Ovarektomie ist in ihrer

Wirksamkeit einer CMF-Chemotherapie vergleichbar. Die Therapie mit GnRH-

Analoga sollte mindestens zwei Jahre andauern. Der Effekt einer

Ovarsuppression nach Chemotherapie ist ungewiss (Cuzick et al., 2007;

Robertson and Blamey, 2003; von Alten et al., 2006). Der Nutzen einer

Tamoxifeneinnahme, welche üblicherweise mit 20 mg/d dosiert und für fünf

Jahre gegeben wird, besteht für Frauen jeden Alters, unabhängig vom

Menopausenstatus, vom Nodalstatus oder dem Einsatz einer adjuvanten CHT.

Sie kann das relative Risiko für ein Rezidiv um 40 % und die Sterblichkeit um

31 % nach 15 Jahren senken (Abe et al., 2005; EBCTCG, 2005). Nach der

Menopause wird die Hauptmenge des Östrogens durch Aromatisierung von

Androgenen in der Leber, dem Muskel und insbesondere dem Fettgewebe

synthetisiert. Hier kommen zur endokrinen Therapie beim

hormonrezeptorpositiven Mammakarzinom vor allem Aromatasehemmer zum

Einsatz (Howell et al., 2005). Die Hauptnebenwirkungen von

Aromataseinhibitoren sind muskuloskelettale Schmerzen und Osteoporose.

Dafür treten Hitzewallungen, thrombembolische Ereignisse und

Endometriumkarzinome seltener als bei Tamoxifen auf. Tamoxifen und

Aromatasehemmer können auch sequenziell nacheinander gegeben werden.

20 Bei dieser Therapie folgt auf zwei Jahre Tamoxifen für zwei bis drei Jahre eine

Behandlung mit einem Aromataseinhibitor (Abe et al., 2005; Long et al., 2004).

21

2.3.5. Molekulare und zielgerichtete Therapie

Trastuzumab ist ein rekombinanter Anti-HER2-Antikörper, der gezielt und mit

hoher Affinität die extrazelluläre Domäne des HER2-Wachstumsrezeptors

bindet und so die Signaltransduktion und konsekutiv die Proliferation von

Tumorzellen verhindert (Slamon et al., 2001). Der HER2-Expressionsstatus

wird mittels Immunohistochemie oder FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung)

zum Nachweis einer Genamplifikation bestimmt. In der Immunhistochemie

werden Werte von 0 bis 3+ vergeben (Wolff et al., 2007). Patientinnen mit

einem Wert von 3+ sind sicher positiv und sollten eine Behandlung mit

Trastuzumab über ein Jahr erhalten. Diese kann simultan zu einem Taxan oder

sequenziell zu einer Anthrazyklin-Taxan-Chemotherapie verabreicht werden

(Baselga et al., 2006; Slamon et al., 2006). Trastuzumab vermag in

Kombination oder Sequenz zur Standard-CHT die Rezidivrate bei HER2-

überexprimierenden Tumoren um 45 % bis 50 % zu senken. Die Mortalität wird

um etwa 30 % gesenkt (Joensuu et al., 2006). Die Therapiedauer beträgt ein

Jahr. Als relevante Komplikation ist die Kardiotoxizität von Trastuzumab, vor

allem in Kombination mit Anthrazyklinen, zu nennen. Die Inzidenz beträgt bis zu

4,1 % für klinisch relevante Herzinsuffizienzen (New York Heart Association

NYHA III/IV), weshalb ein Monitoring der linksventrikulären Auswurffraktion

obligat ist (Romond et al., 2005).

22

2.4. Therapieentscheidung beim Mammakarzinom

Das Wissen über die Prognoseveränderung oder den Erfolg einer möglichen

Therapie ist die wichtigste Grundlage für die Entscheidung über die Art und den

Umfang der Therapie. Noch wichtiger wird dieses Wissen im Kontext der heute

in beträchtlicher Anzahl zur Verfügung stehenden Therapieoptionen und der mit

ihnen verbundenen Nebenwirkungen. Diese Faktoren, die eine Prognose

und/oder eine Prädiktion auf das Überleben der Patienten voraussagen, geben

Wahrscheinlichkeiten für den Eintritt eines bestimmten Ereignisses (z. B. Tod

oder Rezidiv) an. Ein Prognosefaktor ist hierbei, unabhängig von der Therapie,

mit der Eintrittswahrscheinlichkeit eines bestimmten Ereignisses verbunden.

Der Prädiktivfaktor hingegen ist für die Eintrittswahrscheinlichkeit des

Ereignisses unter der Voraussetzung einer spezifischen Therapie verbunden.

Vom Prädiktivfaktor ist der Surrogatmarker abzugrenzen, der im Therapie- oder

Krankheitsverlauf noch vor dem Erreichen des Endpunktes diesen

vorherzusagen vermag (Abbildung 1) (P.A. Fasching, 2005).

Abbildung 1: Prognose- und Prädiktivfaktoren (P.A. Fasching, 2005)

23

2.4.1. Prognosefaktoren und Prädiktivfaktoren

Therapieentscheidungen beim Mammakarzinom werden aufgrund der

Risikoeinschätzung für die Endpunkte Rezidiv und Tod getroffen. Die

Risikoeinschätzung basiert auf empirischen Erfahrungswerten für Biomarker,

welche über die Korrrelation des Biomarkers mit den jeweils betrachteten

Endpunkten an großen Kollektiven valide Aussagen zulassen. Akzeptierte

Biomarker für das Mammakarzinom sind das Alter, die Klassifikation

entsprechend dem TNM-Atlas, das Grading, die Lymph- und Gefäßinfiltration,

der Steroidhormonrezeptorstatus und der HER2-Status (Broet et al., 1999;

Fasching et al., 2005). Prognosefaktoren können für das Überleben oder das

Rezidiv (Endpunkte) gut oder schlecht sein. Ein Prognosefaktor liefert eine

Aussage über den klinischen Verlauf ab dem Zeitpunkt der Diagnose der

Erkrankung, unabhängig von einer Therapie. Obgleich er unabhängig von einer

eventuellen Therapie ist, kann er Aufschluss über ein mögliches Ansprechen

einer therapeutischen Option geben (Fasching et al., 2005). Ein Prädiktivfaktor

liefert eine Aussage über den klinischen Verlauf in Abhängigkeit von einer

eingeleiteten Therapie, jedoch sind prädiktive Aussagen nur für die jeweiligen

Subgruppen entsprechend der Therapieoption valide (Fasching et al., 2005;

McGuire and Clark, 1992). Die Notwendigkeit dieser Differenzierung wird

deutlich, wenn man den folgenden Zusammenhang betrachtet. 30 % der

nodalnegativen Patientinnen würden ohne eine eingeleitete Therapie an ihrem

Mammakarzinom versterben. Das bedeutet aber auch, dass 70 % der Frauen

dieses Kollektivs ohne Therapie überleben würden (McGuire and Clark, 1992).

In Anbetracht dieser Zahlen stellt sich die Frage, ob es Determinanten, also

Prädiktiv- oder Prognosefaktoren gibt, die Frauen identifizieren können, welche

von einer Therapie profitieren und solche, denen eine Therapie erspart werden

kann. Der Vorteil wird in einer Veränderung der Prognose gemessen. Oftmals

sind aber die Biomarker, welche üblicherweise Marker der klinisch-

pathologischen Aufarbeitung des Tumormaterials oder des klinischen Stagings

sind, nicht eindeutig als Prognose- oder Prädiktivfaktor zu unterscheiden. Für

Patientinnen ist der Steroidhormonrezeptorstatus im Zusammenhang mit einer

Antihormontherapie sowohl ein prognostischer als auch ein prädiktiver Faktor.

Der Steroidrezeptorstatus lässt sich hierbei oft nicht eindeutig der Prognose

oder der Prädiktion zuordnen, weil Therapien oft multimodal verabreicht werden

24 und sich gegenseitig beeinflussen (Abbildung 2). Hormonrezeptornegative

Patientinnen profitieren nicht von einer endokrinen Therapie, sprechen aber

besser auf eine Chemotherapie an (Broet et al., 1999; Fasching et al., 2005;

Henderson et al., 2003).

Abbildung 2: Prognoseänderung, Faktoreigenschaft, Therapie (Fasching et al., 2005)

Aus Abbildung 2 wird ersichtlich, dass sich beim gemischten Prognose- und

Prädiktivfaktor die Prognose des Endpunktes mit der Durchführung einer

25 Therapie verbessert, unabhängig davon, ob der Faktor negativ oder positiv ist,

wenngleich natürlicherweise eine größere Prognoseverbesserung im Falle einer

Markerpositivität zu erwarten ist. Allerdings ist die Steigerung der

Prognoseverbesserung bei einem reinen Prognosefaktor, wenn er auch negativ

ist, größer als bei einem gemischten Faktor. Daraus folgt, dass der reine

Prognosefaktor verglichen mit einem reinen Prädiktivfaktor und verglichen mit

einem gemischten Prognose- und Prädiktivfaktor die größte Aussagekraft hat,

unabhängig davon, ob eine Therapie durchgeführt wird oder nicht.

2.4.2. Klinisch etablierte Prognosefaktoren

Zu einem Viertel drainieren die Lymphabflusswege aller Quadranten in die

Lymphabflussbahnen entlang der Arteria mammaria interna. Metastasen in

diesem Lymphabflussweg kommen ohne die Beteiligung axillärer Lymphknoten

nur in etwa 5 % der Fälle vor (Morrow and Foster, 1981). Der

Hauptlymphabfluss der Brust erfolgt über die Axillärlymphknoten, wobei die

Anzahl der befallenen Lymphknoten einen der aussagekräftigsten

Prognosefaktoren darstellt (siehe Tabelle 1) (Lønning, 2007).

Tabelle 1: Rezidiv, 5-Jahresüberlebensrate (5-JÜR) und Lymphknotenstatus (Valagussa et al., 1978) Anzahl der LK (+) Rezidiv nach 5 Jahren 10-Jahres-Überlebensrate

In % in %

0 20 65–80

1–3 30–40 35–65

4 44 -

>4 54–82 13–24

(+) = befallene Lymphknoten

Im Falle histologisch gesicherter Mikrometastasen in Lymphknoten ist deren

Bedeutung bezüglich der Prognose nicht gesichert. Sie dürfen deshalb nicht zur

Aussage über eine schlechtere Prognose herangezogen werden (Friedman et

al., 1988).

26 Die Tumorgröße korreliert positiv mit dem Ausmaß der Lymphknotenbeteiligung

(Tabelle 2) (Abner et al., 1998).

Tabelle 2: Tumorgröße und Lymphknotenbeteiligung (Rosen et al., 1993) Tumorgröße Axilläre Lymphknotenbeteiligung

in %

<1cm <20–30

1–2 cm 27–39

2–3 cm 29–57

Duktale oder lobuläre Läsionen mit einer Größe <1cm haben eine gute

Prognose, werden jedoch selten in diesem Stadium entdeckt. Eine Studie mit

20 Jahren Nachsorge nach Operation bei 767 Patientinnen, welche zum

Zeitpunkt der Diagnose mit Tumoren des Stadiums T1–T2 und negativem

Lymphknotenstatus diagnostiziert wurden, und die keine Chemo- oder

Radiotherapie erhielten, zeigte, dass 88 % ein rezidivfreies Überleben von 20

Jahren hatten. Lediglich 12 % erlitten in dieser Zeit einen Rückfall (Rosen et al.,

1993). Der Hormonrezeptorstatus ist ebenfalls ein wichtiger Prognosefaktor. Die

Detektion von Östrogen (ER)- und Progesteronrezeptoren (PR) erfolgt

immunohistochemisch. Frauen mit einem ER-positiven Mammakarzinom in

einem frühen Stadium und ohne postoperative CHT haben im Vergleich zu ER-

negativen Frauen eine 5–10 % geringere Wahrscheinlichkeit, nach 5 Jahren ein

Rezidiv zu entwickeln. Dieser Vorteil schwindet jedoch mit zunehmender Dauer

der Nachsorge (Allred et al., 1998). Ein positiver ER-Status ist deshalb ein

Prognosefaktor für das Rezidivmuster und beeinflusst damit eher das

rezidivfreie Überleben (DFS) als das Gesamtüberleben (Adami et al., 1985).

ER-positive Tumoren kommen häufiger bei älteren Patientinnen vor, sind

histologisch meist gut differenziert, haben häufig einen niedrigen

Proliferationsindex und sind meist diploid (Arisio et al., 2000).

Östrogenrezeptorpositive Karzinome sind zudem weniger häufig assoziiert mit

Amplifikation, Mutation oder Verlust von mammakarzinomassozierten Genen

wie z. B. p53, HER2 und dem epidermal growth factor receptor (EGFR), welche

alle mit einer schlechteren Prognose einhergehen (Diab et al., 2000; Wenger et

al., 1993). Östrogenrezeptorpositive Karzinome tendieren häufiger zur

27 Entwicklung klinisch apparenter Metastasen im Knochen- und Genitaltrakt.

Östrogenrezeptornegative Karzinome metastasieren eher in das Gehirn und die

Leber, was mit einem schlechteren Überleben assoziiert ist (Andrulis et al.,

1998). Für das Ansprechen auf eine Antihormontherapie ist der

Hormonrezeptorstatus der stärkste Prädiktivfaktor (Rody et al., 2005). Des

Weiteren ist das Grading ein essentieller Prognosefaktor. Das Grading ist ein

vom Pathologen determinierter morphologischer Marker, der die Abweichung

des untersuchten Gewebes vom originären Gewebe angibt. Die UICC

unterscheidet drei Differenzierungsgrade (Tabelle 3). Eine Kodierung mit 4 und

9 bezeichnet technische Sonderzustände.

Tabelle 3: Grading gemäß UICC Grad 1 = gut differenziertes malignes Gewebe, es besteht eine hohe Ähnlichkeit

zum benignen Gewebe

Grad 2 = mäßig differenziertes malignes Gewebe

Grad 3 = schlecht differenziertes malignes Gewebe

Grad 4 = nicht differenziertes malignes Gewebe; Die Zugehörigkeit zu einem

Gewebe kann nur mit Hilfe anderer Verfahren (IHC) bestimmt werden.

Grad 9 = Grad der Differenzierung ist nicht zu beurteilen.

Wichtige Zuordnungsparameter für den Pathologen sind die Form der Zellkerne,

die Zellkerngröße im Verhältnis zur Zellgröße und die Zellteilungsaktivität. Für

die verschiedenen Tumoren wurden weiterhin spezifische Einteilungsparameter

entwickelt. In multivariaten Analysen behält das Grading neben der Tumorgröße

und dem Lymphknotenstatus eine signifikante, unabhängige Aussagekraft. In

Zusammenführung dieser Prognosefaktoren wurde der Nottingham-Prognose-

Index entwickelt (Kollias et al., 1997). Die Invasion von Tumorgewebe in

umliegende Blut- und Lymphgefäße erlaubt als eigenständiger Faktor ebenfalls

eine Aussage über die Prognose. Bislang zeigen Studien, dass eine Infiltration

in die umliegenden Gefäße und Lymphbahnen mit einem erhöhten Risiko für

Lokalrezidive und Fernmetastasen assoziiert ist. Studien mit langem

Beobachtungszeitraum konnten schon früh nachweisen, dass das Risiko für

Rückfall und Tod erhöht ist (Broet et al., 1999; Gasparini et al., 1994).

28 2.4.3. Kombinierte Prognose- und Prädiktivfaktoren

Kombinierte Prognose- und Prädiktivfaktoren sind Biomarker, welche

unabhängig oder abhängig von einer durchgeführten Therapie die Prognose zu

beeinflussen vermögen. Das HER2-Onkogen, welches auf 17q21 lokalisiert ist,

kodiert für ein 185 kD schweres, transmembranöses Glykoprotein mit

intrazellulärer Tyrosinkinaseaktivität (Pietras et al., 1995b; Slamon et al., 1989).

Der Rezeptor für dieses Onkogen gehört zur Familie der epidermalen

Wachstumsfaktoren (EGFR). Der Rezeptor ist entscheidend für die

intrazelluläre Signaltransduktion, welche für Zellproliferation und -teilung

verantwortlich ist. Die Familie der human epidermal growth factor receptors

(HER) umfasst die Rezeptoren EGFR (HER1), c-erbB-2 (HER2), c-erbB-3

(HER3), c-erbB-4 (HER4), welche allesamt transmembranöse

Tyrosinkinaserezeptoren sind und direkt und/oder indirekt an der Regulation

des Zellwachstums und der Proliferation mitwirken (Pietras et al., 1995b). Es

besteht eine hohe Ähnlichkeit mit anderen Wachstumsfaktoren, wie z. B. dem

Insulin-like-growth-factor-Rezeptor (Kaufmann et al.) oder dem Transforming-

growth-factor-Rezeptor (TGFR). Der aktive Rezeptor ist ein Dimer. HER3 und

HER4 induzieren allein keine Signaltransduktion, können aber, wenn sie mit

HER2 ein Heterodimer bilden, über die Tyrosinkinase die Signaltransduktion in

Gang setzen. Beim Mammakarzinom gibt es eine komplexe Familie von

Liganden, welche vor allem durch selbststimulierende Rückkopplung ihre

Proliferation steigern (Hagen et al., 2007; Pegram et al., 2000). EGFR ist in

Mammakarzinomen selten amplifiziert und überexprimiert. Bei Überexpression

ist die Prognose ungünstig, weil eine Resistenz gegenüber einer endokrinen

Therapie, eine Medikamentenresistenz und eine umgekehrte Korrelation mit

dem ER-Status besteht (DiGiovanna et al., 2005). Eine Amplifikation von HER2

oder eine Überexpression des Proteins ist in 10–30 % der Fälle zu beobachten.

Jede normale epitheliale Zelle inklusive der benignen Brustzelle exprimiert

20.000 bis 50.000 HER2-Rezeptoren an ihrer Oberfläche. HER2-

überexprimierende Zellen zeigen Millionen von Rezeptoren auf ihrer

Zelloberfläche. Auf normalen Brustdrüsenzellen und Zellen mit Atypien oder

Hyperplasien sind die Rezeptoren vorhanden, aber nicht überexprimiert

(Klapper et al., 1999; Slamon et al., 1989). Die United States Food and Drug

Administration hat zwei kommerzielle FISH-Assays (Path Vision HER2 DNA

29 Probe Kit, Vysis, Inc und INFORM HER2 Test, Ventana, Inc.) und einen IHC Kit

(Herceptest, DAKO, Inc.) für folgende Anwendungssituationen zugelassen:

1. Selektion von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom für die

Trastuzumabtherapie,

2. Prognoseabschätzung bei lymphknotennegativen Patientinnen (INFORM

HER2-Test),

3. Auswahl von Doxorubicin in der adjuvanten Therapie (PathVision HER2

DNA Probe Kit).

30

Tabelle 4: Korrelation IHC und FISH (Couturier et al., 2000; Middleton et al., 2009) IHC (+) FISH-Amplifikation in %

HER2 3+ 90

HER2 2+ 20–25

HER2 0–1+ 10

Die Überexpression von HER2-Rezeptoren ist mit einer schlechten Prognose

assoziiert und wurde in vielen Studien als Marker für eine schlechte Prognose

bei Patientinnen mit positivem Lymphknotenbefall bestätigt (Slamon et al.,

2001). Eine Überexpression findet sich beim DCIS vom Komedotyp und ist

beim DCIS generell mit einem hohen Neovaskularisationsgrad und Aneuploidie

sowie invers proportional mit dem Hormonrezeptorstatus vergesellschaftet (van

de Vijver et al., 1988). Der HER2-Rezeptor ist ebenfalls beim inflammatorischen

Mammakarzinom und häufig beim Morbus Paget der Mammille unabhängig von

einem begleitenden DCIS überexprimiert. Die Überexpression von HER2 ist

eher ungewöhnlich bei BRCA1/2-assoziierten Tumoren, aber doppelt so häufig

beim DCIS im Vergleich zum invasiven Mammakarzinom (Mass et al., 2005).

Karzinome mit HER2-Rezeptor-Überexpression sind in der Regel deutlich

schlechter differenziert, hormonrezeptornegativ und lymphknotenpositiv.

Außerdem korreliert der HER2-Status mit der Aggressivität der Erkrankung und

ist umgekehrt proportional mit der Prognose assoziiert (Gusterson et al., 1992;

Tandon et al., 1989). Die Bestimmung des HER2-Status gehört heute zur

Routinediagnostik (Fitzgibbons et al., 2000). Der HER2-Status ist ein Prädiktor

des Ansprechens auf eine adjuvante endokrine Therapie. Zwischen den HER2-

und den ER-Signaltransduktionskaskaden existiert ein physiologischer

Crosstalk, der in vitro die Tamoxifenresistenz in ER-positiven humanen

Mammakarzinomzellen erklären kann (Pietras et al., 1995a). Eine relative

Resistenz HER2-positiver Frauen gegenüber einer endokrinen Therapie konnte

auch in vivo beobachtet werden. Es existieren zahlreiche Studien, einerseits

solche, die bei einer HER2-positiven Ausgangslage und zusätzlicher endokriner

Therapie eine schlechtere Prognose stellen, als auch jene, die keinen Einfluss

oder gar einen positiven Effekt nachweisen konnten. Es zeigte sich, dass die

31 Interferenz im Speziellen mit Tamoxifen assoziiert ist und deshalb der HER2-

Status wohl eher prognostischen als prädiktiven Charakter hat (Shou et al.,

2004). Der HER2- Status ist ein Prädiktor für die Effektivität einer adjuvanten

Chemotherapie (Ellis et al., 2001). Das Expertengremium für Tumormarker

beim Mammakarzinom der „American Society of Clinical Oncology“ stellte fest,

dass immunhistochemisch determinierte Überexpression von HER2 in

Mammakarzinomen zur Identifikation von Patientinnen führt, die von einer

anthrazyklinhaltigen adjuvanten Chemotherapie besonders profitieren.

Umgekehrt darf aber ein negativer HER2-Status nicht zum Zurückhalten bei der

Indikation für eine anthrazyklinhaltige CHT führen (Ellis et al., 2001). Beim

metastasierten Mammakarzinom liegen noch keine ausreichenden Daten vor,

um eine HER2-statusabhängige Therapieempfehlung bezüglich Anthrazyklinen

oder Taxanen auszusprechen (Bast et al., 2001; Penault-Llorca et al., 2001;

Viale et al., 2003).

32

Tabelle 5 gibt einen zusammenfassenden Überblick über die bekannten

Prognose- und Prädiktivfaktoren.

Tabelle 5: Etablierte und neue Prognose- und Prädiktivfaktoren (Fasching et al., 2005) (+: Zusammenhang in mehreren Studien bewiesen; (+): Zusammenhang wahrscheinlich; -: kein Zusammenhang gezeigt) Etablierte und neue Prognose- und Prädiktivfaktoren

Biomarker Prognosefaktor Prädiktivfaktor

Tumorgröße + -

Lymphknotenstatus + -

Lymphgefäßinvasion + -

Grading + (+)

Proliferationsmarker + (+)

Alter + -

ER-Status + +

PR-Status (+) +

HER2-Status + +

uPA/PAI + +

Genexpressionsprofile + (+)

Biomarkerset nach Paik et al. + -

Topo II alpha + +

Zirkulierende Tumorzellen

(CTC´s)

+ (+)

Knochenmarkmikrometastasen + -

P53-Mutationen + -

33

2.4.4. Topoisomerase IIα

Ein weiterer Prädiktivfaktor für das Ansprechen der Anthrazyklintherapie ist die

Amplifikation des Gens Topoisomerase IIα (TOP2A) (Knoop et al., 2005;

Tanner et al., 2006). Das TOP2A-Gen kodiert für ein 170 kD Enzym, welches

das Aufbrechen und die Wiedervereinigung von doppelsträngiger DNA

katalysiert, um sogenannte DNA-Supercoils während der Replikation zu

entspannen. Die Typ-II-Topoisomerasen sind wichtige Enzyme, die die

Replikation von DNA ermöglichen (Slamon and Press, 2009). Des Weiteren

spielen sie eine fundamentale Rolle in nukleären Prozessen wie z. B. der

Transkription, der chromosomalen Strukturgebung und der Kondensation. Das

TOP2A-Gen ist in gesunden diploiden Zellen in zwei Kopien vorhanden und ist

ebenso wie HER2 auf 17q21 lokalisiert (Sng et al., 1999). TOP2A wurde als

Proliferatiosmarker detektiert. Die Expression des Enzyms variiert mit dem

Zellzyklus sowohl in gesunden als auch in karzinomatösen Zellen (Smith et al.,

1993). Die Expression von TOP2A korreliert positiv mit der Expression von Ki67

(Mueller et al., 2004). Nur 20 % der TOP2A-überexprimierten Fälle gingen mit

einer Genamplifikation von TOP2A einher, jedoch korrelierte in 93 % der

TOP2A-amplifizierten Fälle die TOP2A-Überexpression (Callagy et al., 2005;

Olsen et al., 2004). Die Typ-II-Topoisomerasen sind eines der Ziele der

Anthrazyklintherapie (Hortobágyi, 1997). Ob nun die TOP2A-Überexpression

oder die Genkopienveränderung des TOP2A-Gens mit der Effektivität einer

Anthrazyklintherapie assoziiert ist, ist zum aktuellen Zeitpunkt noch strittig

(Slamon D et al., 2007). Eine Studie der Danish Breast Cancer Group mit

insgesamt 773 Patientinnen zeigte, dass die Aberration von TOP2A signifikant

mit einem kürzeren rezidivfreien Überleben (p<0,0001) und kürzerem

Gesamtüberleben (p<0,0001) vergesellschaftet ist (Nielsen et al., 2008). Fälle

mit einer Deletion von TOP2A hatten eine schlechtere Prognose als TOP2A-

amplifizierte Mammakarzinome (Knoop et al., 2005). In einem Cox-proportional-

hazards-Modell erwies sich die Amplifikation von TOP2A als signifikanter und

unabhängiger Prognosefaktor für das recurrence free survival (RFS) und das

overall survival (OS) (Brase et al., 2010). Bei der Stratifizierung nach dem

Therapiearm, welcher entweder anthrazyklinbasiert oder methotrexatbasiert

gestaltet wurde, zeigte sich für den Endpunkt RFS eine signifikante

Risikoreduktion um 61 % (p = 0,002) und für den Endpunkt OS um 51 %

34 (p = 0,01) für TOP2A-amplifizierte Mammakarzinome im

Anthrazyklintherapiearm (Nielsen et al., 2008). Es gibt zunehmende Evidenz,

dass der TOP2A-Genamplifikationsstatus ein Prognosefaktor und ein

Prädiktivfaktor für die Anthrazyklintherapie ist (Brase et al., 2010; Rody et al.,

2009). Wie bereits erwähnt, kommt eine Amplifikation von TOP2A nur

zusammen mit einer Amplifikation von HER2 vor. Ungefähr 30 % aller HER2-

positiven Tumoren haben auch eine Amplifikation von TOP2A. Umgekehrt

kommt eine TOP2A-Amplifikation nie ohne eine HER2-Amplifikation vor.

Hinweise auf eine unterschiedliche Effektivität der Anthrazykline in der HER2-

negativen Patientinnengruppe gibt es deswegen bislang nicht (Hicks et al.,

2005; Konecny et al., 2010).

35

2.5. Rationale und Fragestellung

Mit dem bisherigen Stand des Wissens ist klar, dass Patientinnen mit einem

HER2-positiven Tumor besser auf eine anthrazyklinhaltige Chemotherapie

ansprechen als HER2-negative. Insbesondere die Patientinnen, die eine zur

HER2-Amplifikation zusätzliche TOP2A-Amplifikation zeigen, scheinen

besonders von einer solchen Therapie zu profitieren. Relativ wenig ist bekannt

über weitere Biomarker, die in Zusammenhang mit TOP2A stehen. So könnten

auch genetische Polymorphismen mit dem Therapieansprechen und der

Prognose in Zusammenhang stehen.

Des Weiteren ist ebenfalls wenig über die Mechanismen der TOP2A-

Amplifikation bekannt. Da es Anhaltspunkte für einen Zusammenhang zwischen

genetischen Alterationen und dem Amplifikationsmuster der entsprechenden

Genregion gibt, soll sich diese Arbeit mit folgenden Fragen beschäftigen:

1) Haben genetische Polymorphismen im TOP2A-Gen einen Einfluss auf

die Prognose von Mammakarzinompatientinnen?

2) Stehen genetische Polymorphismen in Zusammenhang mit der TOP2A-

Amplifikation?

3) Bieten genetische Polymorphismen in der HER2-positiven

Patientinnengruppe weitere Hinweise auf eine differentielle

Chemotherapie-Effektivität?

36

3. Material und Methoden

3.1. Beschreibung der Patientinnenkohorte

Für die Fragestellung stand die Patientinnenkohorte der Bavarian Breast

Cancer Cases and Controls Studie (BBCC) zur Verfügung. Die BBCC ist eine

Kohorten-Kontroll-Studie und wurde konzipiert, um Suszeptibilitätsfaktoren und

Prognosemarker für die Erkrankung Mammakarzinom zu diagnostizieren. In

den Kohorten-Arm konnten Patientinnen mit einem histologisch gesicherten

Mammakarzinom eingeschleust werden und in den Kontrollarm gesunde

Frauen, bei welchen in ihrem bisherigen Leben keine Krebserkrankung

diagnostiziert worden ist. Für die vorliegende Arbeit wurde lediglich der

Kohorten-Arm der Studie untersucht. Der Rekrutierungszeitraum lag zwischen

2002 und 2006. 1.387 Mammakarzinompatientinnen konnten gewonnen werden,

bei denen die Diagnose nicht länger als ein Jahr zurücklag. Für die Studie liegt

ein positives Ethikvotum der Ethikkommission des Universitätsklinikums

Erlangen vor und alle Frauen gaben ihr schriftliches Einverständnis zur

Teilnahme an der Studie. Alle Patientinnen füllten in einem Interview einen

epidemiologischen Fragebogen aus und die patientinnenbezogenen und

krankheitsbezogenen Daten wurden aus der Krankenakte dokumentiert. Zur

Erfassung der Rezidive, der Fernmetatasen und Todesfälle wurden die

Patientinnen einmal pro Jahr kontaktiert, wenn die Nachsorge nicht ohnehin im

Brustzentrum des Universitätsklinikums erfolgte. Todesdaten wurden über

spezifische Abfragen bei den Einwohnermeldeämtern für alle Patientinnen

eingeholt. Für die vorliegende Auswertung wurde ein Datenbankschluss am 31.

August 2009 durchgeführt. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug zu

diesem Zeitpunkt 6,82 Jahre.

37

3.2. Datenmanagement

Die Frauenklinik des Universitätsklinikums Erlangen ist ein zertifiziertes

Brustzentrum der Deutschen Krebsgesellschaft, der Deutschen Gesellschaft für

Senologie und der European Society of Mastology (EUSOMA). Die

Zertifizierung ist auf eine Qualitätskontrolle und Qualitätsverbesserung

ausgerichtet. Teil dieser Zertifizierung ist eine prospektive Dokumentation.

Hierfür ist in der Frauenklinik ein Dokumentationssystem (DOMAS Version

2.0©) eingerichtet worden. Es erfasst die Krankengeschichte der Patientinnen

und gewährleistet eine organspezifische Tumordokumentation. Des Weiteren ist

in die Datenerfassung eine Reihe von epidemiologischen Parametern integriert,

die mit dem Risiko für das Entstehen einer Mammakarzinomerkrankung in

Verbindung gebracht werden können und die dem von den Patientinnen

ausgefüllten Fragebogen entsprechen. Die klinischen Daten wurden den

Originalbefunden der Krankenakte entnommen und über die Software DOMAS

Version 2.0© eingepflegt. Im Rahmen der Erstdokumentation der Erkrankung

wurde der Tumorstatus entsprechend der TNM-Klassifikation dokumentiert. Der

Tumortyp wurde entsprechend der ICD-O-3-Klassifikation für Tumoren erfasst

und zur Auswertung in folgende Kategorien eingeteilt: invasiv duktal, invasiv

lobulär, medullär und sonstige. In Bezug auf die histopathologischen

Untersuchungen sind alle immunhistochemischen Färbungen im Institut für

Pathologie des Universitätsklinikums Erlangen durchgeführt worden. Das

Grading wurde nach Elston und Ellis bestimmt (Elston and Ellis, 1993). Die

Färbung für den Wachstumsfaktorrezeptor HER2 ist mit dem HercepTest®

(Dako, Dänemark) erhoben worden, was den momentanen Anforderungn an

diese Testung entspricht (Wolff et al., 2007). Alle Ergebnisse, die 3+ beurteilt

worden sind, wurden im Rahmen dieser Analyse als positiv gewertet, während

die Intensitäten 0 bis 1+ als negativ gewertet worden sind. Für Fälle mit einem

Wert von 2+ in der klinischen Routine wurde ein FISH durchgeführt und

Patientinnen mit einer Genamplifikation wurden als positive erachtet. In Bezug

auf die Testung für den Östrogen- und den Progesteronrezeptor wurden solche

Patientinnen als positiv gewertet, die eine Anfärbung in mehr als 90 % der

Zellen aufwiesen.

38

3.3. Isolation der DNA aus dem Patientinnenblut

Die DNA wurde aus 8 ml EDTA-Blutproben, welche im Rahmen der BBCC-

Studie asserviert und bei -18°C gelagert wurden, extrahiert. Sofort nach dem

Zentrifugieren wurde der buffy coat aus dem Patientinnenblut entfernt und mit

dem RBC Lyse Puffer vermengt, welcher bei einem pH von 7,3; 0,15M NaH4Cl;

0,01M K2CO3 und 0,1M Na-EDTA enthielt. Nach zehnminütiger Inkubation

wurde das Lysat erneut bei 2.000 g zentrifugiert und mit 3 ml Zelllyse Puffer

inkubiert, welcher 20 mM Tris pH 7,4 sowie 15 mM Na-EDTA und 1 SDS

enthielt. Das Lysat wurde mit RNAase A und Proteinase K (alle von Aldrich

Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland) behandelt. Die Proteine wurden

anschließend mit 1 ml Proteinprezipitationslösung ausgefällt (Puregene). Die

DNA wurde durch Zugabe von Isopropanol ausgefällt, mit 70 % Ethanol

gewaschen, getrocknet und in Tris-EDTA Puffer bei pH 7,5 gelöst. Die DNA

wurde mittels Spektrophotometer quantifiziert und bei –20 °C gelagert. Bei

diesem Vorgehen konnten durchschnittlich 70–100 µg DNA pro Patientin

gewonnen werden (Visvikis et al., 1998).

3.4. SNP Analyse mittels RTq-PCR

Die Auswertung erfolgte mit dem im Applied Biosystems ABI Prism® 7700

enthaltenen Sequenzdetektionsprogramm. Der Fluoreszenzanstieg wurde mit

Hilfe des ABI 7700® Sequence Detector Zyklus für Zyklus erfasst. Die visuelle

Komponente des Systems ist eine CCD (Charge-coupled Device)-Kamera. Die

Emissionen der Reporterfarbstoffe wurden auf einen Spektrografen fokussiert

und von der CCD-Kamera nach Wellenlängen und Intensitäten detektiert und

von der zugehörigen Software analysiert, quantifiziert und ausgegeben, sodass

die genotypische Zuordnung für den untersuchten DNA-Abschnitt jeder

Patientin zugeordnet werden konnte. Das Prinzip der RTq-PCR besteht darin,

die gewonnene, aufbereitete und dilutierte DNA der Patientinnen mit einem für

den SNP spezifischen Primer sowie einer zur Sichtbarmachung der Ergebnisse

notwendigen Hydrolyse-Sonde (TaqMan) zu inkubieren und die Polymerase-

Kettenreaktion in einem Thermocycler durchzuführen (Mullis, 1990; Mullis et al.,

1994). Danach werden die Signalcodes und -intensitäten mit einer

39 Fluoreszenzreporter-Kamera erfasst und ausgewertet. Für jede untersuchte

Patientin kann nun angegeben werden, ob sie einen homozygoten Wildgenotyp

aufweist, heterozygot variant oder homozygot variant ist.

3.5. Prinzip und Herstellung des Tissue Microarray

Von allen Patientinnen, von denen Keimbahn-DNA aus der BBCC-Kohorte zur

Verfügung stand, wurden die Paraffinblöcke gesucht, die den Tumor enthielten.

Insgesamt 914 Tumorblöcke konnten so identifiziert werden. Ebenfalls wurden

die in der klinischen Routine angefertigten, zu den Blöcken korrespondierenden

Hematoxylin-Eosin (HE)-Färbungen herausgesucht. Die Tumor-Regionen

wurden auf den HE-Schnitten markiert. Somit konnte auf dem Anschnitt des

Paraffinblocks die Region des Tumors identifiziert werden. Für die Herstellung

des Tissue Microarrays wurden mit einem Stanzzylinder Gewebebiopsien aus

der Tumorregion innerhalb der Paraffinblöcke entnommen. Das Stanzgerät

enthielt zwei dünnwandige Hohlnadeln. Eine wird benötigt, um das Gewebe aus

dem Donorblock zu entnehmen, die andere braucht man, um im Rezipientblock

einen entsprechenden Hohlraum zu schaffen, in welchem die Biopsie der ersten

Hohlnadel dann ihren Platz findet. Auf diese Art und Weise ist es möglich, vor

den Färbe-, Inkubations- und Waschprozeduren der Fluoreszenz in situ

Hybridisierung, Biopsien mehrerer Donorblöcke auf einem Rezipientblock neu

zu arrangieren. Um das ausgestanzte Gewebe wieder herauslösen zu können,

ist jede Nadel mit einem inneren Stempel ausgestattet. So kann das Paraffin

des Rezipientblockes entfernt und die Biopsie des Donorblockes in das

vorgesehene Rezipientbett platziert werden. Besonders zu beachten ist, dass

alle Donorbiopsien in gleicher Höhe in den Rezipientblock eingesetzt werden,

weil sonst im Anschluss an den Schnitt des Blockes leere Regionen auftreten

können. Der Innendurchmesser einer Nadel betrug 0,6 mm (Hsu et al., 2002).

Diese Größe wird allgemein als ausreichend repräsentativ anerkannt (Hoos et

al., 2001). Durch digitale Steuerung der Biopsieplatzierung im Rezipientblock

kann ein Biopsieraster von bis zu einigen hundert Proben pro Block erzielt

werden. Für diese Studie enthielten ein Block 330, ein Block 323 und ein dritter

Block 261 Proben. Die hergestellten Schnitte wurden auf einen Objektträger

übertragen (Moch et al., 2001). Um für unsere Studie die Gewebematrix zu

40 dokumentieren, wurde eine Excel-Datei angelegt, die für jede Probe an jedem

Ort des Objektträgers eine zweifelsfrei eindeutige Identifizierung ermöglicht. Um

die Lesbarkeit für den Pathologen zu gewährleisten, wurde der Objektträger in

vier große Einzelblöcke A–D aufgeteilt. Innerhalb der Blöcke erhielten die

vertikalen Reihen eine fortlaufende Nummerierung 1–8, und innerhalb der

Reihen wurde fortlaufend mit Kleinbuchstaben des Alphabets unterschieden.

Von jedem Tumor gibt es nur eine eindeutige Probe auf dem aus dem TMA

gewonnenen Objektträger. Die Identifikation besteht dann aus dem Quadranten

auf dem Objektträger, der vertikalen Reihenhöhe, durchnummeriert und dem

Ortsindikator in der Reihe, einem kleinen Buchstaben des Alphabets, z. B. PF

ARRAY #1, A1a. Die Raster sind entsprechend folgender Abbildung konstruiert

worden (Abbildung 3).

Abbildung 3: Raster Tissue Microarray

41

3.6. Durchführung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Für die Ermittlung des Genamplifikationsstatus für TOP2A sowie HER2 mittels

Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurden folgende Reagenzien

verwendet: Für die FISH-Analyse wurde eine 3-fach DNA-Sonde für TOP2A,

Chromsome enumeration probe (CEP) 17 und HER2 mit den Farben

SpectrumOrange für den Locus specific identifier (LSI) TOP2A, SpectrumGreen

für den LSI HER2 sowie SpectrumAqua für den LSI der CEP 17 verwendet. Die

Reagenzien stammen von Vysis, Inc., jetzt Abbott Laboratories, Illinois, USA.

Die Gen-Sonden LSI binden an spezifischen DNA-Abschnitten auf dem

Chromosom. Folgende Darstellungen (Abbildungen 4 bis 6) zeigen, dass die

Bindungsstellen zwar relativ nah, aber dennoch so weit voneinander entfernt

liegen, dass eine akzidentielle Bindung der falschen Sonde nahezu

ausgeschlossen ist und dass sich die Sonden gegenseitig nicht behindern. Des

Weiteren ist der Abstand der Bindungsstellen auch für das spätere visuelle

Auszählen der Signale von Bedeutung (Bouchalova et al., 2006).

Abbildung 4: Bindungsstellen auf Chromosom 17 (Abbott Laboratories)

42

Abbildung 5: Locus specific identifier HER2 (Abbott Laboratories)

Abbildung 6: Locus specific identifier TOP2A (Abbott Laboratories)

43 Alle verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 6 gelistet:

Tabelle 6: Liste der Reagenzien zur Vorbehandlung und Gegenfärbung Gegenfärbung:

PathVysion HER2 DNA Probe Kit:

DAPI Gegenfärbung: 1000ng/ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) in

Phenylendiamin Dihydrochlorid, Glyzerin, Puffer

NP-40 (Nonyl-phenoxylpolyethoxylethanol)

20xSSC Salz, Natriumchlorid und Natriumcitrat (saline sodium citrate buffer)

Vysis Inc., Illinois

Paraffin-Vorbehandlung:

Vorbehandlung: 50ml Natriumthiozyanat (NaSCN)

Protease Puffer: 50ml Natriumchlorid (NaCl) pH 2,0

Protease: 25mg 2500-3000U/mg Pepsin A

Vysis Inc., Illinois

20xSSC: 88,2g Tri-Natrium Citrat Dihydrat + 175,3g Natrium Chlorid auf 1000ml H2O,

pH 7,0

2xSSC: 100ml 20xSSC auf 900ml H2O, pH 7,0

2xSSC/NP-40: 997ml 2xSSC+3ml NP-40, pH 7,0

Ethanol 100

Xylol, Merck

Steriles Aqua dest., Braun

4-Formaldehyd

Die Hybridisierung erfolgte am HyBrite Hybridisiergerät von Vysis, Inc., Illinois.

Die Auswertung erfolgte am Zeiss Axioscope (Carl Zeiss, Jena, Deutschland).

Die Signale wurden optovisuell ausgewertet. Der ungefärbte, 0,1 µm dicke,

formalinfixierte und paraffineingebettete Schnitt des zuvor erstellten Tissue

Microarrays wurde auf einen silanisierten Objektträger (DAKO) aufgezogen und

bei 37 °C über Nacht getrocknet. Die Entparaffinisierung erfolgte mittels

44 Wärmeinkubation mit 55°C über Nacht und anschließender Xylolbehandlung

(Xylol, Merck, Darmstadt, Deutschland). Es erfolgt die Entwässerung mit

Ethanol. Darauf folgte die Inkubation mit NHCL für 20 Minuten, Aqua dest. für

drei Minuten und Spülung mit 2xSSC (100ml 20xSSC auf 900ml H2O, pH 7,0).

Danach erfolgte eine 30-minütige Inkubation mit 50 ml Natriumthiozyanat bei

80 °C. Zusätzlich wurde nochmals mit Aqua dest. für eine Minute und zwei mal

fünf Minuten Waschpuffer gespült. Der Verdau erfolgt mit einer Protease über

90 Minuten bei 37 °C mit anschließender Fixation durch 4-Formaldehyd und

erneuter Spülung mit Pufferlösung. Der Objektträger wurde dann mit 10 µl DNA-

Sonde (3-fach DNA-Sonde: LSI, TOP2A SpectrumOrange; LSI, HER2

SpectrumGreen; LSI, CEP 17, SpectrumAqua (Vysis, Inc., jetzt Abbott

Laboratories, Illinois) inkubiert. Danach erfolgte im HyBrite-Gerät die

Denaturierung der Proben für 5 Minuten bei 75 °C und danach die

Hybridisierung für etwa 18 Stunden bei 37 °C. Nach erfolgter Hybridisierung

wurden die Deckgläser entfernt, der Überschuss der Detektionsverbindung

durch Spülung mit 2xSSC/NP-40 (997ml 2xSSC + 3ml NP-40, pH 7,0) für 5

Minuten bei Raumtemperatur und für 3 Minuten bei 75° im Wasserbad entfernt.

Die Gegenfärbung erfolgte mit 10 µl DAPI. Fixation. Die Lagerung erfolgte

lichtgeschützt bei -20°C. Zur Optimierung der Signalqualität wurde die Dauer

der Denaturierung und/oder die Dauer der Hybridisierung variiert (Press, 2007).

45

3.7. Auswertungsmethoden

Die Auswertung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung erfolgte durch

optovisuelles Erfassen der Signale für HER2- bzw. TOP2A-Genkopien.

Verwendet wurde hierzu das Mikroskop Axioscope von Zeiss. Das

TOP2A/HER2/Zentromer-17 Verhältnis wurde aus dem Signalverhältnis von

HER2/TOP2A zu CEP 17 aus 20 gezählten Zellkernen, welche eindeutig einem

Tumorareal zuzuordnen waren, gebildet. Die Ergebnisse wurden in einer Excel-

Datei erfasst. Die Ratios wurden automatisiert (Rechenvorschrift) gebildet. Dem

Protokoll von Vysis, Inc., Illinois folgend lag eine HER2- bzw TOP2A-

Amplifikation vor, wenn die Ratio > = 2,0 war. Ratios zwischen 1,8 und 2,2

wurden zur Verifikation mehrmals durchgezählt. Durch das Ratioverfahren war

eine von der Chromosomenanzahl (Chromosomenpolyploidie) unabhängige

Detektion der Genamplifikation möglich. Die Ergebnisse wurden von einem

zertifizierten Pathologen gegengeprüft.

Abbildung 7 zeigt das typische Bild einer erfolgreichen Fluoreszenz in situ

Hybridisierung. Zu erkennen sind Zellkerne mit der blauen Gegenfärbung DAPI,

welche an DNA und RNA (schwächer) bindet, sowie intrazelluläre Signale in

drei verschiedenen Farben. Grüne Signale repräsentieren die Anzahl der

HER2-Allele pro Zellkern, die orangen Signale die Anzahl der TOP2A-Allele.

Blau repräsentiert die Anzahl der Chromosomen 17 pro Zellkern.

Abbildung 7: Screenshot FISH-Signale (Abbott Laboratories)

46

3.8. Statistische Überlegungen

Alle drei Analysemethoden (HER2-Amplifikation, TOP2A-Amplifikation und

TOP2A-Genotypisierung) wurden univariat mit den Patientinnencharakteristika

assoziiert. Für kategoriale Variablen wurde dies mittels Pearson’s Chi-Quadrat-

Test durchgeführt. Sollte die Linearität eines Zusammenhangs geprüft werden,

wurde hierfür der Mantel-Haenszel-Test benutzt. Die Konstruktion der

Überlebenskurven in der univariaten Analyse wurden für das Gesamtüberleben

und das fernmetastasenfreie Überlebens mittels Kaplan-Meier-Schätzer

konstruiert. Um auf Unabhängigkeit der Prognoseparameter zu testen, wurden

Cox-proportional-hazards-Modelle konstruiert und adjustierte hazard Ratios, inkl.

95 % CI, angegeben. Cox-proportional-hazards-Modelle wurden gebildet für

das Gesamtüberleben und das fernmetastasenfreie Überleben, jeweils für die

Gesamtkohorte, für die Subgruppe, die eine Chemotherapie erhalten hatte, für

die Subgruppe, die keine Chemotherapie erhalten hatte, und letztendlich für die

Chemotherapiepatientinnen, klassifiziert nach HER2-Status. Alle statistischen

Analysen wurden mit dem Software-Programm SPSS (SPSS Software Inc.,

Chicago, Illinois) durchgeführt und p-Werte unter 0,05 wurden als signifikant

erachtet.

47

4. Ergebnisse

An einem Gesamtkollektiv von 1.387 Patientinnen wurde für die Patientinnen,

für die die jeweiligen Biomaterialien vorhanden waren, mittels FISH der HER2-

und der TOP2-Amplifikationsstatus, sowie mittels RTq-PCR der Genotyp von

rs13695 in TOP2A bestimmt. Im Folgenden soll gezeigt werden, dass

genetische Polymorphismen einen Einfluss auf die Prognose und das

Therapieansprechen von Mammakarzinompatientinnen haben und dass

genetische Polymorphismen mit dem Amplifikationsstatus von TOP2A

korrelieren.

4.1. Patientinnencharakteristika

Tabellen 7 und 8 stellen die Patientinnencharakteristika und deren Assoziation

mit den Genotypisierungsergebnissen für den TOP2A SNP rs13695 dar: Die

Patientinnen hatten ein Durchschnittsalter von 55,32 (±11,98) Jahren und einen

durchschnittlichen Body Mass Index von 26,03 (±4,86) kg/m2. In Bezug auf die

Tumorcharakteristika zeigte sich eine typische Verteilung. Die meisten

Patientinnen hatten einen Tumor ≤2cm (57,9 %), waren von duktalem

histologischen Typ (65,9 %) und waren nodalnegativ (63,7 %). Der Östrogen-

rezeptorstatus war bei 513 Patientinnen (75,6 %) positiv. Der in der klinischen

Routine bestimmte HER2-Status war in 16,3 % der Fälle positiv und die

Proliferation, bestimmt mit der Immunhistochemie gegen Ki67, zeigte in 43,2 %

der Patientinnen eine Positivität, welche definiert war als eine Anfärbung bei

mehr als 13 % aller Karzinomzellen. Der mit FISH bestimmte HER2-und

TOP2A-Status aus dem TMA war in 15,8 % und 5,2 % der Fälle amplifiziert.

48 Tabelle 7: Patientinnencharakteristika (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat Test; **: Mantel-Haenszel-Test)

Genotyp CC CT TT Gesamt p-Wert

Mittelwert 55,6 54,9 54,3 55,32 0,447‡ Patientinnenalter

S 11,7 12,4 11,8 11,98

Mittelwert 26,1 25,85 25,86 26,03 BMI

S 4,95 4,64 5,33 4,86 0,266‡

N 423 258 43 724 T1

% 58,5 57,2 56,6 57,9

N 246 156 27 429 T2

% 34,0 34,6 35,5 34,3

N 25 19 5 49 T3

% 3,5 4,2 6,6 3,9

N 29 18 1 48 T4

% 4,0 4,0 1,3 3,8

N 723 451 76 1250 0,761 *

Tumorstadium

Gesamt

% 100 100 100 100 0,789**

N 490 297 49 836 duktal

% 66,8 65,1 62,0 65,9

N 126 93 20 239 lobulär

% 17,2 20,4 25,3 18,8

N 117 66 10 193 andere

% 16,0 14,5 12,7 15,2

N 733 456 79 1268 0,343 *

Histologischer

Typ

Gesamt

% 100 100 100 100 0,884**

N 471 280 46 797 kein

Lymphknotenbefall % 65,5 61,9 57,5 63,7

N 248 172 34 454 Lymphknotenbefall

% 34,5 38,1 42,5 36,3

N 719 452 80 1251 0,229 *

Nodalstatus

Gesamt

% 100 100 100 100 0,087**

N 78 41 6 125 G 1

% 11,3 9,5 7,7 10,4

N 443 286 54 783 G 2

% 63,9 66,1 69,2 650

N 172 106 18 296 G 3

% 24,8 24,5 23,1 24,6

N 693 433 78 1204 0,754 *

Grading

Gesamt

% 100 100 100 100 0,663**

49 Tabelle 8: Fortsetzung Patientinnencharakteristika

Genotyp rs13695

CC CT TT Gesamt p-Wert

N 199 136 19 354 negativ

% 27,9 31,1 24,4 28,8

N 513 302 59 874 positiv

% 72,1 68,9 75,6 71,2

N 712 438 78 1228 0,353 *

Östrogenrezeptor

Gesamt

% 100 100 100 100 0,777**

N 92 52 8 152 positiv

% 16,9 15,8 12,9 16,3

N 452 277 54 783 negativ

% 83,1 84,2 87,1 83,7

N 544 329 62 935 0,693 *

HER IHC

Gesamt

% 100 100 100 100 0,419**

N 320 195 33 548 >13 %

% 57,6 56,5 51,6 56,8

N 236 150 31 417 <13 %

% 42,4 43,5 48,4 43,2

N 556 345 64 965 0,652 *

Ki67

Gesamt

% 100 100 100 100 0,425**

N 272 186 26 484 keine CHT

% 54,5 57,6 51,0 55,4

N 227 137 25 389 CHT

% 45,5 42,4 49,0 44,6

N 499 323 51 873 0,491 *

CHT

Gesamt

% 100 100 100 100 0,373**

N 264 145 27 436 normal

% 85,2 81,9 87,1 84,2

N 46 32 4 82 amplifiziert

% 14,8 18,1 12,9 15,8

N 310 177 31 518 0,577 *

HER2-Status

Gesamt

% 100 100 100 100 0,668**

N 6 2 0 8 deletiert

% 1,9 1,1 0 1,5

N 292 163 28 483 normal

% 94,2 92,1 90,3 93,2

N 12 12 3 27 amplifiziert

% 3,9 6,8 9,7 5,2

N 310 177 31 518 0,385 *

TOP2A-Status

Gesamt

% 100 100 100 100 0,042**

50

4.2. Genotypen und Assoziation mit Tumorcharakteristika

Die DNA der Patientinnen wurde auf SNPs im TOP2A-Gen mittels RTq-PCR

untersucht.

Der Genotyp wurde von 1.276 Patientinnen erhoben, von denen Keimbahn-

DNA vorhanden war. 736 Patientinnen (53,06 % ) hatten einen homozygoten

Wildtyp Genotyp (CC). 459 Patientinnen (33,09 % ) waren heterozygot (CT) und

81 Patientinnen (5,84 % ) waren homozygot variant (TT). Tabelle 12 zeigt die

Genotypenverteilung und die Allelverteilung. Bei der Testung auf das Hardy-

Weinberg-Equilibirium wurde keine Abweichung festgestellt (p = 0,407).

Tabelle 9: Allelverteilung

Genotypverteilung Allelverteilung

CC CT TT Gesamt C T Gesamt p-Wert 736 459 81 1276 1931 621 2552 0,407 58 % 36 % 6 % 76 % 24 %

Bei dem Vergleich von Genotyp und Tumor- und Patientinnencharakteristika

(Tabelle 8) war keiner der Parameter mit dem Genotyp assoziiert außer dem

TOP2A-Amplifikationsstatus. Patientinnen mit einem CC-Genotyp zeigten in

3,9 % der Fälle eine Amplifikation, während dies beim CT- oder TT-Genotyp in

6,9 % bzw. in 9,7 % der Fälle vorkam (p = 0,042).

51

4.3. Univariate Korrelation mit den Patientinnencharakteristika

Die weiteren Testergebnisse dieser Arbeit, der HER2-und der TOP2A-

Amplifikationsstatus wurden anhand eines Tissue Microarrays standardisiert

mittels FISH bestimmt. Von insgesamt 629 (69,4 %) der 906 Proben konnte ein

Status erhoben werden. Der Hauptgrund für fehlende Werte war eine

mangelnde Anfärbung der Proben. Die Ergebnisse wurden ebenfalls univariat

mit den Patientinnencharakteristika in Verbindung gebracht (Tabellen 10 und

11). Es scheint so zu sein, dass Patientinnen mit einem HER2-amplifizierten

Tumor eher jünger sind (55,25 Jahre vs. 58,19 Jahre; p = 0,027). Auch das

Tumorstadium war mit dem HER2-Amplifikationsstatus assoziiert.

Erkrankungen mit einer Amplifikation neigten zu einem größeren Tumor.

Tumoren kleiner 2 cm konnten bei normaler Genkopienzahl in 56,4 % der Fälle

gefunden werden, während diese bei einer Amplifikation nur in 45,5 % der Fälle

vorkamen (p = 0,009). Genauso ging eine Amplifikation mit einem höheren

Grading einher (p<0,001). Der Nodalstatus und der histologische Typ hingegen

zeigten keine Korrelation mit dem HER2-Amplifikationsstatus.

52 Tabelle 10: Univariate Analyse der Variablen mit dem HER2-Amplifikationsstatus (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat-Test; **: Mantel-Haenszel-Test)

HER2 Status deletiert normal amplifiziert Gesamt p-Wert

Mittelwert 58,19 55,25 57,71 0,027‡ Alter

S 12,31 11,84 12,27

N 0 294 46 340 T1

% 0 56,4 45,5 54,7

N 0 185 41 226 T2

% 0 35,5 40,6 36,3

N 0 23 5 28 T3

% 0 4,4 5,0 4,5

N 0 19 9 28 T4

% 0 3,6 8,9 4,5

N 0 521 101 622 0,053 *

Tumorstadium

Gesamt

% 0 100 100 100 0,009**

N 0 350 78 428 duktal

% 0 66,4 76,5 680

N 0 100 14 114 lobulär

% 0 19 13,7 18,1

N 0 77 10 87 andere

% 0 14,6 9,8 13,8

N 0 527 102 629 0,135 *

Histologischer Typ

Gesamt

% 0 100 100 100 0,058**

N 0 300 61 361 negativ

% 0 57,4 61,0 57,9

N 0 223 39 262 positiv

% 0 42,6 39,0 42,1

N 0 523 100 623 0,499 *

Nodalstatus

Gesamt

% 0 100 100 100 0,500**

N 0 51 4 55 G 1

% 0 9,8 4,0 8,9

N 0 351 59 410 G 2

% 0 67,5 59,0 66,1

N 0 118 37 155

Grading

G 3

% 0 22,7 37,0 25,0 Gesamt N 0 520 100 620 0,004 * % 0 100 100 100 0,001**

53 Tabelle 11: Fortsetzung univariate Analyse HER2

HER2 Status deletiert normal amplifiziert Gesamt p-Wert

N 0 114 45 159 negativ

% 0 21,8 44,6 25,5

N 0 408 56 464 positiv

% 0 78,2 55,4 74,5

N 0 522 101 623 <0,001 *

Östrogenrezeptor

Gesamt

% 0 100 100 100 <0,001**

N 0 41 49 90 positiv

% 0 8,2 50,0 15,0

N 0 462 49 511 negativ

% 0 91,8 50,0 85,0

N 0 503 98 601 <0,001 *

HER IHC

Gesamt

% 0 100 100 100 <0,001**

N 0 278 73 351 >13 %

% 0 55 73,7 58,1

N 0 227 26 253 <13 %

% 0 45 26,3 41,9

N 0 505 99 604 0,001

Ki67

Gesamt

% 0 100 100 100

N 0 130 27 157 CHT

% 0 46,8 46,6 46,7

N 0 148 31 179 keine CHT

% 0 53,2 53,4 53,3

N 0 278 58 336 0,977 *

Chemotherapie

Gesamt

% 0 100 100 100 0,977**

TOP2A war in 5,2 % (n = 33) der Fälle überamplifiziert und in 9 Fällen (1,4 %)

deletiert. In einem Fall wurde eine Amplifikation ohne eine HER2-Amplifikation

gesehen. Im Rest der Fälle (N = 32/33; 97 %) war HER2 immer koamplifiziert.

Dies bedeutet, dass 31,4 % (n = 32/102) der HER2-positiven Tumoren auch

eine Koamplifikation von TOP2A zeigten. Bei der Assoziation mit den Tumor-

und Patientinnencharakteristika zeigten TOP2A-positive Tumoren häufiger ein

fortgeschrittenes Tumorstadium und hatten ein höheres Grading (Tabelle12 und

13). Die übrigen Parameter zeigten keine signifikante Assoziation.

54 Tabelle 12: Univariate Analyse der Tumorcharakteristika mit dem TOP2A-Amplifikationsstatus (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat-Test; **: Mantel-Haenszel-Test)

TOP2A Status deletiert normal amplifiziert Gesamt p-Wert

Mittelwert 50,87 57,90 56,13 57,71 0,175‡ Alter

S 11,42 12,28 12,01 12,27

N 6 320 14 340 T1

% 66,7 55,1 43,8 54,7

N 3 212 11 226 T2

% 33,3 36,5 34,4 36,3

N 0 27 1 28 T3

% 0 4,6 3,1 4,5

N 0 22 6 28 T4

% 0 3,8 18,8 4,5

N 9 581 32 622 0,009 *

Tumorstadium

Gesamt

% 100 100 100 100 0,003**

N 6 398 24 428 duktal

% 66,7 67,8 72,7 680

N 1 108 5 114 lobulär

% 11,1 18,4 15,2 18,1

N 2 81 4 87 andere

% 22,2 13,8 12,1 13,8

N 9 587 33 629 0,899 *

Histologischer

Typ

Gesamt

% 100 100 100 100 0,520**

N 5 337 19 361 negativ

% 55,6 57,9 59,4 57,9

N 4 245 13 262 positiv

% 44,4 42,1 40,6 42,1

N 9 582 32 623 0,976 *

Nodalstatus

Gesamt

% 100 100 100 100 0,830**

N 1 54 0 55 G 1

% 11,1 9,3 0 8,9

N 7 382 21 410 G 2

% 77,8 66,0 65,6 66,1

N 1 143 11 155

Grading

G 3

% 11,1 24,7 34,4 250 Gesamt N 9 579 32 620 0,282 * % 100 100 100 100 0,040**

55 Tabelle 13: Fortsetzung Univariate Analyse der Tumorcharakteristika mit dem TOP2A-Amplifikationsstatus (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat Test; **: Mantel-Haenszel-Test)

TOP2A Status deletiert normal amplifiziert Gesamt p-Wert

N 2 147 10 159 negativ

% 22,2 25,3 31,3 25,5

N 7 435 22 464 positiv

% 77,8 74,7 68,8 74,5

N 9 582 32 623 0,732 *

Östrogenrezeptor

Gesamt

% 100 100 100 100 0,441**

N 2 71 17 90 positiv

% 22,2 12,6 56,7 15,0

N 7 491 13 511 negativ

% 77,8 87,4 43,3 85,0

N 9 562 30 601 <0,001 *

HER IHC

Gesamt

% 100 100 100 100 <0,001**

N 5 322 24 351 >13 %

% 55,6 57,2 75,0 58,1

N 4 241 8 253 <13 %

% 44,4 42,8 25,0 41,9

N 9 563 32 604 0,137 *

Ki67

Gesamt

% 100 100 100 100 0,072**

N 4 146 7 157 CHT

% 66,7 46,8 38,9 46,7

N 2 166 11 179 keine

CHT % 33,3 53,2 61,1 53,3

N 6 312 18 336 0,496 *

Chemotherapie

Gesamt

% 100 100 100 100 0,283**

56

4.4. Korrelation mit dem 10-Jahres-Gesamtüberleben und dem fernmetastasenfreien Überleben DDFS Um die prognostische Relevanz der Genotypisierung und des

Genamplifikationsstatus zu prüfen, wurden die 10-Jahres-Gesamt- und

fernmetastasenfreien Überlebenswahrscheinlichkeiten berechnet und mittels

Log-rank-test verglichen. In Bezug auf das Gesamtüberleben zeigten alle

bekannten prognostischen Faktoren eine statistische Signifikanz. Weder der

HER2- noch der TOP2A-Amplifikationsstatus waren mit dem Überleben

assoziiert, genauso wenig der rs13695 Genotyp. Ähnliches zeigte sich beim

fernmetastasenfreien Überleben. Hier war zusätzlich das Grading nicht von

prognostischer Relevanz (Tabelle 14).

57 Tabelle 14: Korrelation mit dem 10J-Gesamtüberleben (OS) und dem 10J-fernmetastasenfreien Überleben (DDFS)

Patientinnen- charakteristika N Events 10J-OS p-Wert

Tumorstadium <0,001 T1 763 53 89,8 T2 475 77 75,6 T3 51 13 73,6 T4 49 15 61,2 Gesamt 1338 158 Histologie 0,028 duktal 898 118 81,3 lobulär 253 29 84,1 andere 199 15 90,3 Gesamt 1350 162 Nodalstatus <0,001 negativ 822 53 90,4 positiv 506 103 73,5 Gesamt 1328 55 Grading <0,001 G1 134 5 94,6 G2 847 99 82,1 G3 318 56 79,1 Gesamt 1299 160 ER 0,001 negativ 367 64 79,6 positiv 955 95 84,3 Gesamt 1322 159 HER IHC 0,023 negativ 878 112 78,6 positiv 166 33 67,9 Gesamt 1044 145 Ki67 <0,001 <13 % 462 42 82,7 >13 % 610 101 76,4 Gesamt 1072 143 HER2 0,489 normal 527 67 79,1 amplifiziert 101 15 76,1 Gesamt 628 82 TOP2A 0,462 deletiert 9 0 normal 587 79 77,9 amplifiziert 32 3 90,1 Gesamt 628 82 Genotyp rs 13695 0,459

CC 721 84 84,6 CT 445 64 80,3 TT 79 11 82,8 Gesamt 1245 159

Patientinnen- charakteristika N Events 10DDFS p-Wert

Tumorstadium <0,001 T1 765 60 88,3 T2 476 90 72,9 T3 51 17 60,1 T4 49 15 81,4 Gesamt 1342 182 Histologie 0,001 duktal 900 138 78,6 lobulär 253 28 85 andere 200 15 88,2 Gesamt 1353 182 Nodalstatus <0,001 negativ 838 62 88,2 positiv 503 120 70 Gesamt 1341 182 Grading <0,001 G1 135 9 88,2 G2 847 104 82,7 G3 319 63 74,5 Gesamt 1301 176 ER 0,154 negativ 368 59 81,7 positiv 957 120 80,5 Gesamt 1325 179 HER IHC 0,027 negativ 878 109 80,2 positiv 166 31 72,6 Gesamt 1044 140 Ki67 <0,001 <13 % 462 38 86,3 >13 % 610 98 77,3 Gesamt 1072 136 HER2 0,059 normal 527 53 83,6 amplifiziert 101 16 80,0 Gesamt 628 69 TOP2A 0,981 deletiert 9 1 88,9 normal 587 65 82,4 amplifiziert 32 3 90,5 Gesamt 628 69 Genotyp rs 13695 0,848

CC 721 99 82,0 CT 448 66 79,5 TT 79 12 87,8 Gesamt 1248 177

58

4.5. Cox-Regressionsanalyse

Für die multivariate Analyse zur Testung der prognostischen Relevanz des

rs13695 Genotyps wurde ein Cox-proportional-hazards-Modell gebildet, in

welches das Tumorstadium, der Nodalstatus, das Grading und der

Östrogenrezeptorstatus einbezogen wurden. Die Modelle wurden einmal für das

Gesamtüberleben der Gesamtkohorte (Tabelle 15), das fernmetastasenfreie

Überleben der Gesamtkohorte (Tabelle 16) und gleiche Endpunkte für die

Subgruppen mit (Tabellen 17 und 18) und ohne Chemotherapie (Ergebnisse für

die Subgruppe ohne CHT nicht gezeigt) gebildet. In der Gesamtkohorte hat der

Genotyp von rs13695 weder in Bezug auf das Gesamtüberleben noch in Bezug

auf das fernmetastasenfreie Überleben eine prognostische Bedeutung. Es zeigt

sich zwar eine Tendenz, dass Genotypen mit dem T-Allel eine schlechtere

Prognose haben, diese Unterschiede waren aber nicht signifikant (p = 0,362

und p = 0,492).

Tabelle 15: Cox-Regression für das Gesamtüberleben

Adjustierte HR 95 % CI Signifikanz

CC 1 0,657

CT 1,018 0,724 - 1,431 0,919 TT 1,360 0,702 - 2,634 0,362

Genotyp rs13695

T1 1 <0,001

T2 2,249 1,553 - 3,258 <0,001 T3 2,285 1,169 - 4,467 0,016 T4 4,194 2,301 - 7,646 <0,001

Tumorstadium

N0 1 N1 2,319 1,631 - 3,295 <0,001

Nodalstatus

G1 1 0,204

G2 1,927 0,775 - 4,791 0,158 G3 2,282 0,894 - 5,828 0,085

Grading

negativ 1 ER Status positiv 0,603 0,423 - 0,858 0,005

59 Tabelle 16: Cox-Regression für das metastasenfreie Überleben in der Gesamtkohorte

Adjustierte HR 95 % CI Signifikanz

CC 1 0,715 CT 0,952 0,688 - 1,317 0,765 TT 1,247 0,664 - 2,342 0,492

Genotyp rs13695

T1 1 <0,001 T2 2,079 1,468 - 2,945 <0,001 T3 3,147 1,777 - 5,576 <0,001 T4 3,325 1,817 - 6,086 <0,001

Tumorstadium

N0 1 N1 2,500 1,791 - 3,491 <0,001

Nodalstatus

G1 1 0,034 G2 1,140 0,569 - 2,284 0,712 G3 1,765 0,856 - 3,638 0,124

Grading

ER Status negativ 1 positiv 0,910 0,643 - 1,288 0,595

Bei der Betrachtung der Untergruppen mit und ohne adjuvante Chemotherapie

konnte jedoch in der Untergruppe der Patientinnen, die eine Chemotherapie

erhalten hatten, ein prognostischer Effekt des rs13695 Genotyps gesehen

werden. Patientinnen, die mit einer adjuvanten Chemotherapie behandelt

worden waren, hatten mit zunehmender Anzahl von T-Allelen ein höheres

Risiko zu sterben. Patientinnen mit einem heterozygoten CT-Genotyp hatten mit

einer HR von 1,33 (95 % CI: 0,74 bis 2,38; p = 0,337) und Patientinnen mit

einem TT-Genotyp mit einer HR von 2,99 (95 % CI: 1,1 bis 8,4; p = 0,038) ein

höheres Risiko zu sterben als Patientinnen mit dem homozygoten CC-Genotyp

(Tabelle 17). Ein ähnlicher Effekt zeigte sich für das fernmetastasenfreie

Überleben. Hier lag die adjustierte HR für den CT-Genotyp bei 1,42 (95 % CI:

0,85 bis 2,37; p = 0,178) und für den TT-Genotyp bei 3,59 (95 % CI: 1,54 bis

8,40; p = 0,003).

60 Tabelle 17: Cox-Regression für das Gesamtüberleben für Patientinnen mit adjuvanter CHT (* Fallzahl für G1 zu gering zum Einschluss in das Modell)

Adjustierte HR 95 % CI Signifikanz

CC 1 0,110 CT 1,329 0,744 - 2,375 0,337 TT 2,990 1,061 - 8,424 0,038

Genotyp

T1 1 0,039 T2 2,009 1,058 - 3,815 0,033 T3 2,472 0,993 - 6,156 0,052 T4 3,573 1,277 - 9,998 0,015

Tumorstadium

N0 1 N1 1,779 0,941 - 3,363 0,076

Nodalstatus

G1* G2 G3

Grading

negativ 1 ER Status positiv 0,541 0,297 - 0,986 0,045

61 Tabelle 18: Cox-Regression für das metastasenfreie Überleben für Patientinnen mit adjuvanter CHT

Adjustierte HR

95 % CI Signifikanz

CC 1 0,012 CT 1,421 0,852 - 2,367 0,178 TT 3,591 1,536 - 8,397 0,003

Genotyp

T1 1 0,005 T2 1,952 1,113 - 3,422 0,020 T3 2,821 1,304 - 6,102 0,008 T4 3,826 1,595 - 9,178 0,003

Tumorstadium

N0 1 N1 1,589 0,905 - 2,790 0,107

Nodalstatus

G1 1 0,006 G2 3,692 0,500 - 27,25 0,200 G3 7,581 1,025 - 56,07 0,047

Grading

negativ 1 ER Status positiv 0,921 0,551 - 1,539 0,752

Da eine prognostische Relevanz von TOP2A nur in der Untergruppe der HER2-

positiven Tumoren zu vermuten war, wurde ein weiteres Modell für diese

Untergruppe gebildet und eine adjustierte HR von 22 (95 % CI: 1,6 bis 318,

p = 0,021) gefunden. Die entsprechenden Überlebenskurven sind in Abbildung

8 dargestellt.

62 Abbildung 8: Überlebenskurven aus der Cox-Regression für das

fernmetastasenfreie Überleben in der Subgruppe der HER2-positiven Tumoren,

die eine adjuvante Chemotherapie erhalten hatten.

63

5. Diskussion

In dieser Arbeit konnte der genetische Polymorphismus rs13695 im Gen

Topoisomerase IIα mit der Prognose von Mammakarzinompatientinnen unter

Chemotherapie korreliert werden. Des Weiteren wurde gesehen, dass der

Amplifikationsstatus des TOP2A Gens mit dem untersuchten Genotyp in der

3’UTR-Region des Gens zusammenhängt. Somit muss diskutiert werden,

inwieweit der Genotyp als prognostischer bzw. prädiktiver Faktor für

Patientinnen mit Mammakarzinom gesehen werden kann.

Für die Optimierung der Therapie des Mammakarzinoms wird es immer

wichtiger, durch eine individuelle Therapieplanung die Effektivität einer

durchgeführten Therapie so gut wie möglich vorherzusagen und somit ein

optimales Nutzen-Nebenwirkungsverhältnis für die Patientin zu erzielen. Für die

Vorhersage einer Effektivität einer Anthrazyklintherapie konnten bislang der

HER2-Expressionsstatus, der HER2-Amplifikationsstatus und der TOP2A-

Amplifikationsstatus herangezogen werden (Gennari et al., 2008; Pritchard et

al., 2006; Slamon D et al., 2007). Der Zusammenhang, dass eine TOP2A-

Amplifikation nur in HER2-positiven Tumoren gefunden wurde, beschränkt den

Stellenwert dieses Tests auf HER2-positive Patientinnen. Testverfahren, die

einen Hinweis auf eine alterierte TOP2A-Funktion geben, waren Bestandteil

dieser Arbeit. Wir untersuchten einen Polymorphismus in der 3’UTR-Region des

TOP2A-Gens. Polymorphismen in dieser Region konnten bereits bei anderen

Genen mit einem alterierten Expressionsverhalten oder einer alterierten

Proteinfunktion in Verbindung gebracht werden (Fasching et al., 2008;

Kristensen et al., 1998). Auch wird vermutet, dass sich in der 3’UTR-Region

Bindungsstellen für miRNA befinden, die ebenfalls regulatorisch in die

Organisation des Genoms eingreifen. In der Gesamtkohorte konnte kein

prognostischer Wert des Genotyps von SNP rs13695 gefunden werden. Jedoch

in der Subgruppe der mit Chemotherapie behandelten Patientinnen zeigte sich

eine schlechtere Prognose in Bezug auf das fernmetastasenfreie Überleben für

die Patientinnen, die den selteneren homozygot varianten Genotyp aufwiesen.

In der multivariaten Analyse zeigte diese Assoziation nur einen statistischen

64 Trend. Nach der Adjustierung für Tumorgröβe, Nodalstatus, Grading und

Östrogenrezeptorstatus jedoch war der Effekt mit einem p-Wert von 0,003

deutlich und mit einer HR pro Allel von 1,791 (95% CI 0,557–5,752) auch

klinisch relevant.

Zur Erklärung dieses Effektes ist unklar, ob der untersuchte SNP zu der

bedeutenden biologischen Veränderung im TOP2A-Enzym führt, welches mit

dem phänotypischen Verhalten assoziiert werden kann. Um den Bereich des

TOP2A-SNPs rs13695 findet man zwei Linkage-Blöcke, welche sich jeweils

über ca. 100.000 Basenpaare spannen (www.hapmap.org)(Gibbs et al., 2003).

Jeder mit rs13695 in Kopplung stehende SNP könnte für den biologischen

Effekt verantwortlich sein.

Gene, welche mit dem SNP rs13695 in Verbindung stehen (Abbildung 9), sind

z. B. CDC6 (cell division cycle 6 protein), RARA (retinoic acid receptor), GJC1

(gap junction protein), TOP2A, IGFBP4 (insulin like growth factor binding

protein 4). Ein weiteres sogenanntes fine-scale Mapping dieser Genregion

müsste zur weiteren Klärung durchgeführt werden, um zu sehen, ob andere

Polymorphismen stärker mit der Prognose in dieser Patientinnengruppe

assoziieren.

65 Abbildung 9: Lokalisation des SNPs rs 13695 auf Chromosom 17 (Pfeil) und Darstellung des Linkage Disequilibriums durch LD plots (nach www.hapmap.org) (Gibbs et al., 2003)

Da eine Amplifikation des TOP2A-Gens bislang zur Erklärung einer

differentiellen Effektivität der Anthrazyklintherapie herangezogen wurde, lag es

nahe zu prüfen, ob der genetische Polymorphismus mit dem

Amplifikationsverhalten dieses Gens assoziiert ist. Auch gibt es erste Hinweise,

dass die 3’UTR-Region von Genen beim Amplifikationsprozess eine Rolle zu

spielen scheint (Slack et al., 2006).

In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass eine Assoziation zwischen

dem Polymorphismus rs13695 und einer Amplifikation von TOP2A möglich

erscheint. Pro Allel schien sich die Anzahl der Patientinnen mit einem

amplifizierten Gen zu verdoppeln. Für eine kausale Analyse in Bezug auf den

prognostischen Effekt dieses Zusammenhangs ist die betrachtete Kohorte

jedoch zu klein.

In der Gruppe der HER2-negativen Patientinnen konnte kein prognostischer

Wert der TOP2A-Genotypisierung gesehen werden, was gezeigt hat, dass sich

66 der zusätzliche prognostische Stellenwert einer TOP2A-Genotypisierung auf die

HER2-positive Subgruppe beschränkt. HER2-negative Patientinnen zeigen

keine TOP2A-Amplifikation, was bedeutet, dass der Genotyp nur für ein

Patientinnenkollektiv von Relevanz ist, in dem prinzipiell die Möglichkeit für eine

Amplifikation gegeben sein muss. Die Anzahl der TOP2A-amplifizierten

Patientinnen ist zu klein, um die Frage zu beantworten, ob in der Gruppe der

TOP2A-amplifizierten Patientinnen der Genotyp von besonderer Relevanz ist.

Zumindest in der HER2-positiven Subgruppe zeigte sich ein deutlicher

prognostischer Effekt des TOP2A-Genotyps.

Um weitere Subgruppenanalysen in Bezug auf die Interaktion zwischen

TOP2A-Amplifikationsstatus und der Prognose zu machen, war das Kollektiv zu

klein, was für die erforderlichen Untersuchungen zum Thema dieser Arbeit

nachteilig war. Obwohl diese Studie mit mehr als 1.300 Patientinnen keine

kleine Studie ist, beschränkt sich der prognostische Wert der Genotypisierung

auf die HER2-positiven Patientinnen, die ca. 15 % der Gesamtkohorte

ausmachen.

Momentan kann eine Genotypisierung noch nicht in der klinischen Routine

eingesetzt werden. Die gefundenen Ergebnisse müssen zunächst an anderen

Kohorten validiert und bestätigt werden, bevor eine Rationale gegeben ist, den

Test in einer prospektiven Studie für eine Stratifikation von Patientinnen

einzusetzen. Ein solcher Test könnte zumindest für HER2-positive Patientinnen

neben den TOP2A-überamplifizierten Patientinnen eine weitere Subgruppe von

Frauen identifizieren, die besonders von einer Anthrazyklintherapie profitieren

könnten.

67

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97

7. Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius

µg Mikrogramm

3D-CRT-Device Three-dimensional-conformal radiation therapy device

ABC Avidin-Biotin-Komplex

AC Adriamycin Cyclophosphamid

ASCO American Society of Clinical Oncology

ATM Ataxia teleangiectasia mutated

Bcl-2 B-cell lymphoma-2

BCPT Breast Cancer Prevention Trial

BET Brusterhaltende Therapie

bFGF Basic fibroblast growth factor

BMI Body Mass Index

BRCA Brustkrebsgen (breast cancer gene)

BRCA1 BReast CAncer 1

BRCA2 BReast CAncer 2

CCD-Kamera Charge-coupled Device Kamera

CDH1 Cadherin 1

cDNA Complementary DNA

CEF Cyclophosphamid Epirubicin 5-Fluorouracil

CEP Chromosome enumeration DNA probe

CEP 17 Chromosome enumeration probe 17

c-erbB-2 Human epidermal growth factor receptor 2

CHK2 Checkpoint kinase 2

CHT Chemotherapie

CLIS Carcinoma lobulare in situ

CMF Cyclophosphamid Methotrexat 5-Fluorouracil

CNV Copy number variation

CPG Cytosin-phosphatidyl-Guanosin

CR Complete Remission

CTC Circulating tumor cells

DAB Diaminobenzidin

DAPI 4,6-Diamidino-2-phenylindol

98 DCIS Duktales Carcinoma in situ

DDE Dichlordiphenyldichlorethen

DDT Dichlordiphenyltrichlorethan

DFS Disease free survival

DDFS Distant disease free survival

DNA Deoxyribonucleic acid

DNA Desoxyribonukleinsäure

EBCTCG Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group

EBCTG Early Breast Cancer Trialists’ Group

EC Epirubicin Cyclophosphamid

EGFR Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

EORTC European Organisation for Research

and Treatment of Cancer

ER Estrogenrezeptor

ER(-) Estrogenrezeptor negativ

ER(+) Estrogenrezeptor positiv

EUSOMA European Society of Mastology

F(ab) Fragment antigen binding (antigenbindendes Fragment )

FAC 5-Fluorouracil Adriamycin Cyclophosphamid

FAM Fluorophor

Fc Fragment crystalline (kristallines Fragment )

FDA Food and Drug Administration

FEC 5-Fluorouracil Epirubicin Cyclophosphamid

FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung

FRET Förster-Resonanz-Energie-Transfer

GEKID Gesellschaft der epidemiologischen

Krebsregister in Deutschland e.V.

GEP Genexpressionsprofil

GnRH Gonadotropin Releasing Hormon

Gy Gray

HDR Brachytherapie High dose radiation Brachytherapie

HER Humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor

HER2 Human epidermal growth factor receptor 2

HR Hazard Ratio

99 HRT Hormonal replacement therapy

IBIS-1 International Breast Cancer Intervention Study

ICD-O International Classification of Diseases for Oncology

Ig Immunglobulin

IGF(R) Insuline like growth factor (receptor)

ICH Immunhistochemie

ICH Immunhistochemie

Kb Kilobasen

kD Kilo Dalton

LCIS Lobuläres Carcinoma in situ

LK Lymphknoten

LSAB Labelled streptavidin biotin method

LSI Locus specific identifier

M Molar (Mol/Liter)

Mg Milligramm

MINDACT Microarray In Node Negative

Disease may Avoid ChemoTherapy

Ml Milliliter

MLH1 Häufig mit Nonpolypösem Kolonkarzinom

vergesellschaftetes Gen

mM Millimolar

MORE Multiple Outcomes of Raloxifen Study

MRM Modifiziert radikale Mastektomie

mRNA Messenger ribonucleic acid

MRT Magnetresonanztomografie

MSH2 Häufig mit Nonpolypösem Kolonkarzinom

vergesellschaftetes Gen

N Anzahl unabhängiger Versuche

NCI National Cancer Institute

Ng Nanogramm

NP Nonylphenyl-polyethylenglycol

NSABP National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project

NYHA New York Heart Association

OS Overall survival

p27 Cyclin dependant kinase regulatorgene

100 p53 Tumorsuppressorgen

PAI Plasminogen Aktivator Inhibitor

PCB Polychlorierte Biphenyle

PCR Polymerase chain reaction

pH Negativer dekadischer Logarithmus der

Wasserstoffionenkonzentration

PR Progesteronrezeptor

PROSE Prevention and Observation of Surgical Endpoints

PTEN Phosphatase and tensin homolog

RB1 Retinoblastomgen 1

RBC Red Blood Cells

RFS Recurrence free survival

RR Relatives Risiko

RT Reverse Transkriptase

RTq-PCR Real-time quantitative polymerase chain reaction

SERM Selektiver Estrogen Rezeptor Modulator

SNP Single nucleotide polymorphism

SSC Raline sodium citrate

T Taxan

TAILORx Trial Assigning IndividuaLized Options for Treatment x

TARGIT Targeted intra-operative radiation therapy

TMA Tissue Microarray

TNM Tumor Nodes Metastases

TOP2A Topoisomerase IIα Gen

Topo II alpha Topoisomerase II alpha Genprodukt

.000 Tausend

TVT Tiefe Beinvenenthrombose

UICC Union International contre le Cancer

uPA Urokinase Plasminogen Aktivator

VEGF Vascular endothelial growth factor

VIC Fluorophor

VPF Vascular permeability factor

ZK Zellkern

Μl Mikroliter

95 % CI 95 % Konfidenzintervall

101

8. Anhang

8.1. Screenshots des Dokumentationsprogrammes DOMAS

Eingangsmaske

102 Dokumentation der Krankheiten nach ICD10

103 Dokumentation der Tumorereignisse im Verlauf

104 Spezielle Dokumentation der Tumoreigenschaften

105

8.2. Dokumentationsbogen der Bavarian Breast Cancer Cases and Controls Studie

106

107

108

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122

9. Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. Matthias W. Beckmann danke ich für die Überlassung des

Themas und die umfangreiche Unterstützung meiner Doktorarbeit in Erlangen

und Los Angeles.

Besonderer Dank gilt Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Peter A. Fasching für seine

engagierte und sachkundige Betreuung. Sein unermüdliches Engagement und

sein Fachwissen trugen wesentlich zur Fertigstellung dieser Arbeit bei.

Darüber hinaus danke ich Frau Pamela Strissel, PhD, und Herrn Priv.-Doz. Dr.

rer. nat. Rainer Strick für die Unterstützung meiner Laborarbeit in Erlangen.

Herrn Dr. med. Michael Schrauder, Herrn Dr. med. Christian Löhberg sowie

Frau Sonja Oeser gebührt ebenfalls Dank für die Unterstützung im Labor. Den

Mitarbeitern der Studienzentrale, im Besonderen Frau Doris Herbst und Ulrike

Müller, sei für die unermüdliche Betreuung des Dokumentationssystems und die

uneingeschränkte Hilfe gedankt. Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Arno Dimmler, der

bei der Markierung der Tumorregionen geholfen hat, gebührt ebenfalls Dank.

Für die Mitwirkung im Labor des Norris Comprehensive Cancer Center, Los

Angeles, gilt besonderer Dank Herrn Professor Michael Press, MD, PhD,

Yvonne Villalobos, Roberta Guzman, Angela Santiago, Sherin Shirazi, MD,

Armen Gasparyan und Yan Ling, MD PhD.

Reisekosten nach Los Angeles wurden durch ein Stipendium des Bavaria

California Technology Center (BaCaTec), Erlangen/San Francisco, unter dem

Titel „Association of gene amplification, prognostic factors and genetic

polymorphisms in breast cancer patients“ in der Bewilligungsperiode ab

01.01.2008 gefördert.

Abschließend gebührt mein ganz besonderer Dank meiner Familie, besonders

meinen Eltern, für die immerwährende Unterstützung bei dieser Arbeit und

während meines ganzen Studiums.