Charakterisierungsmethoden von Proteinen

Plasmonenspektroskopie

Protein-Protein Wechselwirkungen

Surface Plasmon Spectroscopy

prism

metal

Light50nm

Water/air/whatever…

Plasmon

Commercial Surface Plasmon Set-up: BIAcore

Assembling of a Peptide Supported Lipid Membranewith Incorporated Integrin Molecules

1.injection of the lamininepeptide CSRARKQAASIKVAVSADR,

2.rinsing,3.addition of EDC (N’-ethyl-N’-

(dimethylaminopropyl)-

carbodiimide)/NHS (N-hydroxysuccinimide),

4.addition of DMPE/Triton 0,01%,

5.rinsing, 6.addition of PC /integrin

vesicles, 7.rinsing

0

1

2

3

4

5

6

7

8

thic

knes

s[n

m]

peptidelayer

ED

C/N

HS

act

ivat

ion

DMPE

0 50 100 150

time [min]

gold

Incorporation of Cell Adhesion Receptors (Integrins) intothe Peptide Tethered Membrane

1.2.

3.4.

5.

6.

7.

PeptideDMPE after PBSDMPE after ETOHGuanidinium HydrochlorideNaCl

Why can we say ‚covalent binding‘ of DMPE…‘

without EDC/NHS activation with EDC/NHS activation

Fatma Nese Kök, Birgit Wiltschi

Ein Beispiel:Epitopmapping von Zelladhäsionsrezeptoren

Integrin - Epitop Mapping

TRIMER BTRIMER A

non-sequential adhesion epitope depends on the stagger of the single chainswithin the triple helix

RD

D

DR

D

Barbara Sacca, Luis MoroderSFB563

Comparison in Binding of the Trimer A/B with the Monomer

48 50 52 54 56 58 60 620.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

refle

ctiv

ity [a

.u]

angle of incidence [°]

6.0x10

8.0x10

1.0x10

1.2x10

1.4x10

1.6x10

4

4

5

5

5

5

trimer Atrimer B monomer background

fluor

esce

nce

[cou

nts/

s]

SFB563

Weitere Methoden der Proteinanalytik:Die Massenspektrometrie

Massenspektrometrie

Agilent

Dient der Massenbestimmung organische Molekule , wie Peptide, Proteine, Zucker, LipideUnd damit eine Methode zur Identifikation, bzw. „Kontrolle“

Massenspektrometrie

Ralf W. Glaser, BPCI, Massenspektrometrie

Massenspektrometrie

• Die Idee ist, dass „Stoffe“ unterschiedliche Fluggeschwindigkeiten im Vakuum haben.

• Die Massengenauigkeit / Thomson (minimaler Massenunterschied) und Massenauflösung / ppm (wie genau wird die Masse bestimmt), werden mit dieser Methode bestimmt -

• Im Aufbau besteht ein Massenspektrometer aus folgendem:

1. Ionenquelle , 2. Analysator, 3. Detektor

• Dabei unterscheiden sich die verschiedenen „Untermethoden“ durch die verschiedenen Arten der Komponenten entwickelt für die verschiedenen Fragestellungen.

• Grundsätzlich ist es nur möglich, zu analysieren, wenn das Signal einer „Vergleichsubstanz“ vorliegt.

Datenbank am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), Japan

http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng

MassenspektrometrieEinfaches Beispiel: Methanol

SDBS No.: 3302

Compound Name:methanol

Molecular Formula: CH4O

Molecular Weight: 32.0

CAS Registry No.: 67-56-1

CH3OH + e- ==> CH3OH+. + 2e- m/z (Masse zu Ladung) = 32CH3OH+. ==> CH3+ + .OH m/z = 15==> CH2OH+ + H. m/z = 31CH2OH+ ==> CHO+ + H2 m/z = 29

MassenspektrometrieEinfaches Beispiel: Methanol

CH3OH + e- ==> CH3OH+. + 2e- m/z (masse zu Ladung) = 32CH3OH+. ==> CH3+ + .OH m/z = 15==> CH2OH+ + H. m/z = 31CH2OH+ ==> CHO+ + H2 m/z = 29• Ionen und Radikal-Ionen (mit ungepaartem Elektron)

werden gebildet: vier Spezies im Massenspektrum.• Intensität (Bildungswahrscheinlichkeit) abhängig von

Anregungsbedingungen, Energie, Vakuum...• M+. Peak ("Molekülpeak") gibt Molekülmasse.• Fragmente liefern Information über die Struktur, da

Fragmentierung nach bestimmten Mustern erfolgt.• Datenbanken helfen bei der Zuordnung!

Ralf W. Glaser, BPCI, Massenspektrometrie

Lipidomics…

Ein Mustervergleich…

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

• Die isotherme Titrationskalorimetrie wurde speziell für die thermische Untersuchung von Bindungsprozessen entwickelt.

• Bei der Wechselwirkung zweier Komponenten wird entweder Wärme abgegeben oder absorbiert.

• Bei Messung dieser Energie in Betrag sowie über die Zeit, können daraus die Bindungskonstante (KB), Stöchiometrie (n), die Enthalpie (∆H) und die Entropie (∆S) der Reaktion bestimmt werden.

• Während einer ITC-Messung wird zu einem Reaktionspartner in der Messzelle der andere Partner schrittweise zutitriert. Dabei wird die abgegebene oder absorbierte Wärmemenge gemessen, welche in direktem Verhältnis zu neu entstandenen Bindungen steht.

http://www.fz-juelich.de/ibn/IBN4_Kalorimetrie/

Isotherme Titrationskalorimetrie (ITC)

•Das Beispiel zeigt die Messdaten des Titrationsprozesses des Lipids 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC) mit dem Detergens Octyl-D-glucopyranosid. Am Anfang bilden die Phospholipidmoleküle geschlossene Doppelschichten, sogenannte Vesikel. •Mit steigender Detergenskonzentration werden die Vesikel immer mehr mit Octyl-D-glucopyranosid gesättigt, bis sich die Doppelschichtstruktur auflöst und die Lipidmoleküle in Detergens-Mizellen vollkommen gelöst vorliegen. •Das Beispiel zeigt deutlich, dass man mit der ITC komplexe Prozesse untersuchen kann.

Literatur: Heerklotz H, Seelig J. (2000) Titration calorimetry of surfactant-membrane partitioning and membrane solubilization. Biochim Biophys Acta. 1508:69-85.

Titrationsisotherm von 0,2 w/w% DPPC titriert mit 506 mM Lösung von Octyl-D-glucopyranosid.

Circulardichroismus / Zirkulardichroismus (CD)

• CD ist ein Phänomen optisch aktiver Moleküle: die unterschiedliche Lichtabsorption der beiden Enantiomere eines chiralen Moleküles.

• CD erlaubt die Festlegung der absoluten Konfiguration eines Moleküles – verwendet wird die CD Spektroskopie für Proteine und Zucker.

• Hervorgerufen wird dieser Effekt von den asymmetrischen Elementen im Bereich des Peptidrückgrats und von den aromatischen Aminosäuren.

Circulardichroismus / Zirkulardichroismus (CD)

CD von Proteinen/Peptiden

• Winkel im Peptid-Rückgrat bestimmen CD-Signale mehrerer Übergänge

• im Bereich 160-225 nm (Wellenlänge und Intensität).• Starke Unterschiede im CD in Abhängigkeit von der

Sekundärstruktur.

• alpha-Helix, paralleles ß-Faltblatt, antiparalleles ß-Faltblatt, ß-turns,ungeordnete Struktur (random coil).

• CD: Gebräuchlichste Methode zur ersten Konformationsanalyse vonPolypeptiden und Proteinen. (neben IR)

• Quantitative Analyse der Sekundärstruktur nach der Faktoranalyse:Basisspektren für die einzelnen Sekundärstrukturformen werden aus Referenzsatz der CD-Spektren bekannter Kristall)Strukturen entnommen.

http://www.personal.uni-jena.de

Röntgenstrukturanalyse

Voraussetzungen:

• Reinheit und Homogenität • Faltung • Löslichkeit• Monodispersität• Ligandenbindung

Die Kristalle werden zur Strukturananalyse mit einem gebündelten Röntgenstrahl beschossen. Dieser kann aus einer konventionellen Röntgenröhre oder aus einer Synchrotronstrahlungsquelle stammen. Synchrotronstrahlung zeichnet sich durch hohe Brillanz, starke Intensität und Polarisierung aus.Sie ist gepulst, d.h. Pulsdauer (ps-Bereich) und -frequenz sind einstellbar.Da die Wellenlängen der Röntgenstrahlen im Ångstrom-Bereich liegen, werden sie an den Elektronen des Proteinkristalls gebeugt bzw. gestreut, wobei ein charakteristisches Diffraktionsmuster entsteht. Die zentralen Gesetzmäßigkeiten der Beugung bzw. Streuung werden durch das von Sir William Henry Bragg und seinem Sohn SirWilliam Lawrence Bragg aufgestellte Bragg'sche Gesetz erklärt.

http://www.chemgapedia.de

Röntgenstrukturanalyse

Dr. Hans Briemc/o Schering AG

Röntgenstrukturanalyse

Im Falle einer Proteinstruktur wird die dreidimensionale Anordnung des Moleküls durch einen Vergleich der Elektronendichte mit der Primärstruktur des Proteins erhalten. Die erhaltenen Strukturinformationen hängen stark von der Auflösung ab. Bei einer Auflösung von 4 bis 6 Å kann man meistens nicht mehr als die äußere Gestalt des Proteins und seiner Ligandenerkennen. Eine Auflösung von 3,5 Å ermöglicht es, das Peptidrückgrat zu verfolgen. Ab 3,0 Å können auch Seitenketten von Aminosäureresten zugeordnet werden und mit einigen Einschränkungen lässt sich die Elektronendichte mit den Vorgaben aus den Primärstrukturen interpretieren. Die Positionen einzelner Atome können bei einer Auflösung von 2,5 Å mit einer Genauigkeit von ± 0,4 Å und bei 1,9 Å sogar mit ± 0,2 Å bestimmt werden.

http://www.chemgapedia.de

Elektronenmikroskopie

AK Prof. Markl / AG Meißner

TEM, Transmissionselektronenmikroskopie

0,2-0,3nm AuflösungPräparat <100nm Dicke…Biologische Materialien:

Kontrasterhöhung durch Metallbedampfen

http://www.bio.uni-mainz.de/zoo/meissner/Dateien/F2-3D-EM-Praktikumsskript.pdf

Atomic Force „Microscopy“ (AFM) zur Proteinstrukturanalyse

http://blenderartists.org/forum/showthread.php?t=109254 ; hansmalab.physics.ucsb.edu/forcespec.htm

Titin consists of folded immunoglobulin domains located along a string. The drop of the force in this saw-toothed graph takes place whenone of the immunoglobulin domains unfolds when titin is pulled. Theincrease of force, following its collapse, occurs because theunfolded domains are being stretched by the force. [Makarov et al. Journal of Chemical Physics (June 2001) Vol. 114 (21):9663-9673].

Atomic Force „Microscopy“ (AFM) zur Proteinstrukturanalyse

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

Literatur

BiochemieJeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert StryerSpektrum Akademischer Verlag ISSBN: 3827413036

Molekulare ZellbiologieHarvey Lodish, David Baltimore, Arnold Berk, und James DarnellVerlag Gruyter ISSBN: 3110168154

Literatur

Lehrbuch der BiochemieDonald Voet, Judith G. Voet, Charlotte W. Pratt, und Annette G. Wiley-VCHISSBN: 352730519X

Taschenatlas der BiochemieJan Koolman und Klaus-Heinrich RöhmThieme-VerlagISSBN: 3137594030

Weiterführende Literatur / Online Ressourcen

Studium der aktuellen Forschung in einschlägigen Journalen / Websites sehr wichtig !!

WEB of Knowledge

http://portal.isiknowledge.com/

PubMED – Online Database

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/