Einfluss von ultraviolettem Licht und extrazellulärer ...der Lamina lucida und der Lamina densa...

Klinik für Dermatologie und Venerologie

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof.Dr.med. Detlef Zillikens

Einfluss von ultraviolettem Licht und extrazellulärer Matrix

auf Pigmentzellhomöostase und Expression

melanozytärer Adhäsionsmoleküle

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

- Aus der Medizinischen Fakultät -

vorgelegt von

Christian Geuchen

aus Bocholt

Lübeck 2007

1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr.med. Sven Krengel

2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr.med. Thomas Peter Kurz

Tag der mündlichen Prüfung: 14.01.2008

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 14.01.2008

gez. Prof. Dr.med. Werner Solbach

- Dekan der Medizinischen Fakultät-

I

INHALTSVERZEICHNIS SEITE

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG ............................................................................................................ 1

1.1 MELANOZYTEN.................................................................................................... 1

1.2 BASALMEMBRAN UND EXTRAZELLULÄRE MATRIX ................................................... 2

1.3 MELANOZYTÄRE ADHÄSIONSMOLEKÜLE ................................................................ 4

1.4 SIGNALTRANSDUKTION DURCH INTEGRINE ............................................................ 6

1.5 ULTRAVIOLETTE STRAHLUNG UND DEREN EINFLUSS AUF MELANOZYTÄRE

HOMÖOSTASE ................................................................................................................ 8

1.6 EINFLUSS VON INTEGRINEN AUF DEN PROGRAMMIERTEN ZELLTOD (APOPTOSE) VON

MELANOZYTEN ..............................................................................................................10

1.7 FRAGESTELLUNG ...............................................................................................12

2 MATERIAL UND METHODEN.................................................................................13

2.1 ZELLKULTUREN ..................................................................................................13

2.1.1 Zellkulturmedium ..........................................................................................13

2.1.2 Melanozytenkultur ........................................................................................14

2.1.3 Keratinozytenkultur.......................................................................................14

2.1.4 Passagieren der Melanozyten und Keratinozyten .........................................15

2.1.5 Einfrieren und Auftauen von Melanozyten und Keratinozyten.......................15

2.1.6 Beschichtung der Kulturplatten .....................................................................16

2.2 UV-BESTRAHLUNG.............................................................................................17

2.2.1 UV-Lichtquelle ..............................................................................................17

2.2.2 Festlegung der UV-Dosis..............................................................................17

2.2.3 Bestrahlung der Melanozyten .......................................................................17

2.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ..................................................................................18

2.4 IMMUNFLUORESZENZ UND KONFOKALE LASERMIKROSKOPIE .................................22

2.5 STATISTISCHE AUSWERTUNG..............................................................................23

3 ERGEBNISSE .........................................................................................................24

3.1 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG DER INTEGRINEXPRESSION....................24

3.1.1 Integrinexpression nach UV-Bestrahlung......................................................24

3.1.2 Integrinexpression unter Einfluss von Zell-Matrix-Kontakt.............................25

3.1.3 Kinetik der α6-Integrin-Expression................................................................28

II

3.1.4 Einfluss des Radikalfängers Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) auf die

Expression von α6-Integrin.......................................................................................31

3.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG DER APOPTOSERATE ............................31

3.2.1 UVB-induzierte Apoptose auf unterschiedlichen EZM-Beschichtungen ........31

3.2.2 UVB-induzierte Apoptose bei Beschichtung mit Laminin-1 in unterschiedlicher

Konzentration...........................................................................................................35

3.2.3 UVB-induzierte Apoptose nach Zugabe eines Antikörpers gegen

α6-Integrin ......................................................................................................37

3.3 MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN ................................................................42

4 DISKUSSION...........................................................................................................46

4.1 MELANOZYTÄRE INTEGRINEXPRESSION ...............................................................46

4.1.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die Expression melanozytärer

Adhäsionsmoleküle ..................................................................................................46

4.1.2 Einfluss extrazellulärer Matrix auf die Expression melanozytärer

Adhäsionsmoleküle nach UVB-Bestrahlung .............................................................48

4.2 MELANOZYTÄRE APOPTOSERATE ........................................................................52

4.2.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die melanozytäre Apoptoserate...............52

4.2.2 Einfluss von EZM-Bestandteilen auf die melanozytäre Apoptoserate nach

UVB-Bestrahlung .....................................................................................................53

4.2.3 Einfluss eines blockierenden Antikörpers gegen α6-Integrin auf die

melanozytäre Apoptoserate nach UVB-Bestrahlung.................................................54

4.3 REGULATION DER EXPRESSION MELANOZYTÄRER ADHÄSIONSMOLEKÜLE AUF

ZELLULÄRER EBENE NACH UVB-BESTRAHLUNG...............................................................55

5 ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................59

6 LITERATURVERZEICHNIS.....................................................................................60

7 ANHANG (BILDER, TABELLEN)............................................................................76

8 ERKLÄRUNG ..........................................................................................................88

9 DANKSAGUNG.......................................................................................................89

10 LEBENSLAUF.........................................................................................................90

III

Abkürzungsverzeichnis

1,5K Zellen eines eineinhalbjährigen

„Kaukasiers“

2,5N Zellen eines zweieinhalbjährigen

„Negroiden“

a Jahr(e)

AIF Apoptosis inducing factor

BPE Bovine pituitary extract

BSA Bovine serum albumine

D Dalton

EGF Epidermal growth factor

EZM Extrazelluläre Matrix

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FACS Fluorescence activated cell sorter

FAK Focal adhesion kinase

FGF-2 Fibroblast growth factor 2

FITC Fluoresceinisothiozyanat

g Gramm

gn Normalfallbeschleunigung ( 9,81 m/s2 )

h Stunde(n)

Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-2-

Ethansulfonsäure

ICAM Intercellular adhesion molecule

K Kilo

Keratinocyte-SFM Serum free keratinocyte medium

KZ Keratinozyten

l Liter

µ Mikro

m Milli

MAPK Mitogen activated protein kinase

MGM-M2 Melanocyte growth medium M2

min Minute(n)

IV

M Molarität

MZ Melanozyten

nm Nanometer

PBS Phosphate buffered saline

(Phosphatpufferlösung)

PE Phycoerythrin

p.i. post irridiationem

PI Propidiumiodid

PIK3 Phosphoinositol-3-Kinase

PDTC Pyrrolidendithiocarbamat

SD Standardabweichung

TNS Trypsine neutralizing solution

TPA Tetraphorbolazetat

UV Ultraviolett

x Mittelwert

Einleitung

1

1 Einleitung

In den letzten Jahren ist die Interaktion zwischen Zellen und ihrer Umgebung

(Nachbarzellen bzw. extrazelluläre Matrix) stärker in den Blickpunkt der Forschung

gerückt. Viele der zugrunde liegenden Mechanismen werden durch Adhäsionsmoleküle

vermittelt. Adhäsionsmoleküle dienen nicht nur der Verankerung von Zellen, sondern

beeinflussen maßgeblich zelluläre Prozesse wie Proliferation, Migration,

Differenzierung und Apoptose. Sie binden an Liganden und übertragen Signale in das

Zellinnere. Für Melanozyten und die sie umgebenden Strukturen, insbesondere

Keratinozyten und Bestandteile der extrazellulären Matrix, sind die hierbei wirksamen

Zusammenhänge noch weitgehend ungeklärt. Auch zum Einfluss von ultraviolettem

Licht (UV-Licht) auf die Umgebungsinteraktion von Melanozyten existieren nur wenige

Daten.

1.1 Melanozyten

Melanozyten sind die pigmentproduzierenden Zellen der Epidermis. Während der

Embryogenese wandern sie aus der Neuralleiste in die Haut ein (Holbrook et al.,

1989). Durch ihre Dendriten haben die Melanozyten Kontakt zu circa 30 Keratinozyten,

den Hornzellen der Epidermis, und bilden die „epidermal-melanozytäre Einheit“

(Fitzpatrick und Breathnach 1963; Hsu et al., 2002). Keratinozyten üben Ammen- und

Kontrollfunktionen aus, indem sie Wachstumsfaktoren produzieren, die Überleben,

Proliferation und Funktion der Melanozyten regulieren (Gordon et al., 1989; Thody,

1995). Melanozyten synthetisieren Melanin, ein braun-schwarzes Pigment, das in

makromolekularen Komplexen (Melanosomen) über die dendritischen Fortsätze in

umgebende Keratinozyten transportiert wird (Riley, 1997). Melanin hat eine

photoprotektive Funktion für die Haut, da es UV-Strahlung direkt absorbiert und

Sauerstoffradikale, die durch die Interaktion der UV-Photonen mit Membranlipiden und

anderen zellulären Chromophoren entstanden sind, deaktiviert (Kobayashi et al., 1998;

Riley, 2003). In den Keratinozyten ist Melanin in Form „supranukleärer Kappen“

angeordnet, die die DNA im Zellkern vor Lichteinstrahlung schützen (Kobayashi et al.,

1998). Die zwei Hauptvarianten, Eu- und Phäomelanin, werden in mehreren

enzymatischen Schritten aus der aromatischen Aminosäure Tyrosin gebildet, die in

spezialisierten Zellorganellen, den sogenannten Prämelanosomen, vorliegt. An diese

Einleitung

2

lagert sich das Schlüsselenzym Tyrosinase an, das durch UV-Licht aktiviert wird. Durch

Polymerisation und Verbindung mit Proteinanteilen des Prämelanosoms entsteht

Melanin. Das Melanosom, das nach Verlust der Tyrosinaseaktivität als

Melaningranulum bezeichnet wird, stellt das Endprodukt des Melanozyten dar (Kvam

und Dahle, 2003; Petrides, 2006; Riley, 1997; Thody und Higgins, 1991).

Melanozyten liegen innerhalb der basalen epidermalen Zellschicht. Somit haben sie

nicht nur Kontakt zu den Keratinozyten, der vor allem durch das Adhäsionsmolekül E-

Cadherin vermittelt wird (Tang et al., 1994), sondern auch zur Basalmembran

(Tarnowski, 1970). Die Interaktion zwischen Melanozyten und

Basalmembranmolekülen, insbesondere Laminin und Kollagen Typ IV, wird durch

Integrine vermittelt (Danen et al., 1993; Etoh et al., 1993).

1.2 Basalmembran und extrazelluläre Matrix

Die extrazelluläre Matrix (EZM) stellt ein komplexes Netzwerk aus hochmolekularen

Proteinen und Polysacchariden dar, das von Epithel- und Bindegewebszellen

sezerniert und organisiert wird (Timpl et al., 1981; Van der Flier und Sonnenberg;

2001). Die Basalmembran ist eine spezialisierte Form der extrazellulären Matrix, die in

allen epithelialen Geweben als Grenzstruktur zur angrenzenden Bindegewebsschicht

zu finden ist. Die Basalmembran der Epidermis ist eine dünne Lamelle (Durchmesser:

30-150 nm), die bei elektronenmikroskopischer Betrachtung aus zwei Hauptschichten,

der Lamina lucida und der Lamina densa besteht (Briggaman und Wheeler, 1975). Die

Lamina lucida stellt einen Spaltraum dar, durch den Verankerungsfilamente (u.a.

Laminin Typ 5) und hemidesmosomale Proteine von der Plasmamembran der basalen

Keratinozyten zur Lamina densa reichen (Bruckner-Tuderman, 2005).

Verankerungsfibrillen und Mikrofibrillenbündel verbinden wiederum die Lamina densa

mit der Dermis. Beide Laminae, Fibrillen, feine dermale Kollagenfasern und Matrix

bilden zusammen die dermoepidermale Junktionszone, die lichtmikroskopisch als

feines homogenes Band erkennbar ist (Burgeson und Christiano, 1997).

Epitheliale Gewebe nutzen die Basalmembran, deren Komponenten von Epithel- und

Bindegewebszellen gebildet wird, zu vielfältigen Zwecken. So steuert die

Basalmembran die Differenzierung adhärierender Zellen (Ingber, 2002), dient als

Depot für Wachstumsfaktoren (Folkman et al., 1988) und als Gerüst, an dem die Zellen

durch konstante Anhaftung überleben. Es konnte gezeigt werden, dass durch Verlust

dieser Haftung eine spezielle Form der Apoptose, die sogenannte Anoikis, induziert

Einleitung

3

wird (Frisch und Ruoslahti, 1997). Somit beruht die Stabilität und Homöostase

epithelialer Gewebe maßgeblich auf einer intakten Basalmembran (Ingber, 2002;

Simian et al., 2001).

Zwei Proteine der EZM, Laminin und Kollagen Typ IV, sind die wichtigsten

Komponenten der Basalmembran in der dermoepidermalen Junktionszone. Sie

organisieren ihre räumliche Anordnung in der Basalmembran z.T. selbständig

(Yurchenko et al., 1992; Yurchenko und Furthmayer, 1984), z.T. werden sie dabei von

zellulären Adhäsionsmolekülen geleitet (Fleischmajer et al., 1998). Beide Moleküle

gewährleisten in vitro Zellhaftung und Migration verschiedener Zellen (Aumailley et al.,

1987; Deutzmann et al., 1990; Goodman et al., 1989).

Laminine sind heterotrimere Glykoproteine (ca. 850 kD), bestehend aus drei Ketten (α,

β und γ), die sich α-helikal über Disulfidbrücken zu kreuzförmigen Quartärstrukturen

verbinden (Sonnenberg et al., 1990; Timpl, 1996). Aus Isoformen dieser Untereinheiten

können sich verschiedene Laminine bilden (Aumailley und Krieg, 1996; Petrides,

2006). Bis heute sind elf verschiedene Isoformen bekannt (Suzuki et al., 2005). Sie

sind ausschließlich in Basalmembranen zu finden (Sonnenberg et al., 1990). Über

spezielle Bindungsstellen binden Laminine andere Proteine und Zellen. Die epidermale

Basalmembran enthält Laminin Typ 1, 5 und 6, das von epithelialen (Keratinozyten)

und mesenchymalen (Fibroblasten) Zellen bereitgestellt wird (Fleischmajer et al.,

1998).

Die Großfamilie der Kollagene wird in fibrilläre und nichtfibrilläre Kollagene unterteilt.

Zu letzteren zählen die Basalmembran-, kurzkettigen und fibrillenassoziierten

Kollagene (Petrides, 2006). Charakteristisches Merkmal aller Kollagentypen ist, dass

Teile des Moleküls aus Polypeptidketten bestehen, die in Form einer Tripelhelix

umeinander gewunden sind. Es sind neunzehn verschiedene Typen bekannt. Typ IV ist

für Basalmembranen spezifisch. Die Struktur dieses Moleküls kommt zum einen durch

die enzymatische Verknüpfung zweier C-terminaler Enden zu Dimeren und zum

anderen von vier N-terminalen Enden zu einem Tetramer zustande. Aus diesen Di- und

Tetrameren entsteht das Kollagen Typ IV-Netzwerk (Timpl, 1996). Dieses

unterscheidet sich von den fibrillären Kollagenen zudem durch N-glykosidische

Saccharidketten und einen wesentlich höheren Gehalt an hydroxylierten Lysyl- und

glykosylierten Hydroxylysylresten (Petrides, 2006).

Ein weiterer Bestandteil der extrazellulären Matrix sind adhäsive Glykoproteine oder

Nektine (u.a. Fibronektin), die den Kontakt zu den im Bindegewebe eingelagerten

Zellen vermitteln (Petrides, 2006; Ruoslahti, 1988). Fibronektin setzt sich aus zwei

Einleitung

4

Polypeptidketten zusammen, die durch Disulfidbrücken am C-terminalen Ende

verbunden sind und so ein Dimer (ca. 550 kD) bilden (Skorstengaard et al., 1986). Es

fördert Verankerung, Polarität, Migration und Differenzierung von Zellen (Ruoslahti,

1988) und die Zusammensetzung der Basalmembran (Couchman et al., 1990). Im

Zuge der Reepithelisierung von Wunden ist Fibronektin in der provisorischen Matrix

unter dem sich neu bildenden Epithel zu finden (Fritsch, 2004). Gleichzeitig

exprimieren einwandernde Zellen Fibronektinrezeptoren, um die Adhäsion zu

gewährleisten (Clark, 1990). Außerdem werden über Fibronektin Signaltransduktionen

im Zellinneren in Gang gesetzt und über eine Umorganisation des Zytoskeletts die

Migration der Zellen beeinflusst (Akiyama et al., 1995).

1.3 Melanozytäre Adhäsionsmoleküle

Melanozyten liegen nach der embryonalen Einwanderung aus der Neuralleiste in die

Haut im Stratum basale der Epidermis in direktem Kontakt zur Basalmembran. Somit

besteht neben der Interaktion mit Keratinozyten ein Einfluss durch Adhäsionsmoleküle,

die die Melanozyten mit der Basalmembran verbinden. Adhäsionsmoleküle sind

membranständige Moleküle, die die Interaktion der Zelle mit Nachbarzellen und

extrazellulärer Matrix gewährleisten. Zu ihnen zählen Cadherine (calcium dependent

adhesion), ICAMs (immunglobuline like cell adhesion molecule), Selektine und

Integrine (Albelda, 1993; Delwel et al., 1994; Tang et al., 1994; Tronnier et al., 1995).

Cadherine dienen hauptächlich als Adhäsionsmoleküle für die Interaktion zwischen

Melanozyten und Keratinozyten (Tang et al., 1994). ICAMs sind häufig mit

entzündlichen Prozessen assoziiert und sind unter physiologischen Bedingungen nicht

in der basalen Epidermis nachweisbar.

Adhäsionsmoleküle aus der Familie der Integrine sind auf beinahe allen Zellen zu

finden (Delwel et al., 1994; Hynes, 1992), und viele Zellen exprimieren mehrere

verschiedene Integrine auf ihrer Zelloberfläche. Der Name beruht auf ihrer Funktion,

extrazelluläre Proteine (EZM) mit dem Zellinneren (Zytoskelett) zu verbinden (Van der

Flier und Sonnenberg, 2001). Integrine sind heterodimere

Transmembranproteinkomplexe, die aus zwei nichtkovalent verbundenen α- und β-

Untereinheiten bestehen (Hynes, 1992; Rupp und Little, 2001). Die α-Untereinheit

variiert zwischen 120 und 180 kD, die β-Untereinheit zwischen 90 und 110 kD. Bis

heute sind 18 verschiedene α-Untereinheiten und acht verschiedene β-Untereinheiten

bekannt (Huhtala et al., 2005), die untereinander assoziiert sein können. Allerdings ist

Einleitung

5

die Vielfalt der Zusammenlagerungen dadurch begrenzt, dass viele α-Untereinheiten

nur an bestimmte β-Untereinheiten binden können (Hynes, 1992). Die Kombination der

beiden Untereinheiten determiniert die Ligandenspezifität des Integrins. Dabei können

zahlreiche Integrine an mehrere unterschiedliche Liganden binden, ferner binden

verschiedene Integrine an den gleichen Liganden (Van der Flier und Sonnenberg,

2001). Einige Integrine sind Zelltyp-spezifisch. So wird α6β4-Integrin nur von

Keratinozyten exprimiert (Danen et al., 1993; Kajiji et al., 1989). Um die Komplexität

der Integrinfamilie übersichtlicher zu gestalten, wird sie in drei Gruppen gegliedert: (1)

Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle, (2) Zell-Basalmembran-Bindungsmoleküle und (3)

matrixbindende Moleküle der Wundheilung, Entzündung und Entwicklung (Albelda,

1993; Clark, 1990; Shaw und Mercurio, 1994).

Die Ligandenbindungsstelle der Integrine befindet sich im globulären, aus α- und β-

Untereinheit geformten Kopf, der oberhalb des stielförmigen Halses aus der

Zellmembran ragt (Faull und Ginsberg, 1995). Der zytoplasmatische Anteil ist in der

Regel kurz. Er besteht aus 30 bis 50 Aminosäuren. Eine Ausnahme bildet die β4-

Untereinheit, deren zytoplasmatischer Schwanz aus ungefähr 1000 Aminosäuren

besteht (Humphries et al., 2004; Springer, 1997).

Abb.1. Struktur von Integrinen a) zeigt eine Übersichtsdarstellung des Aufbaus, wie er durch

Elektronenmikroskopie bekannt ist: Hervorgehoben sind die cystinreichen Repeats der β-Untereinheit

(schraffiert) und die Metallbindungsstellen in der α-Untereinheit (M++). Der schwarz ausgefüllte Bereich

repräsentiert die Liganden-Bindungsregion, die von beiden Untereinheiten gebildet wird. b) verdeutlicht

den chemischen Aufbau der Polypeptid-Ketten (nach Hynes, 1992)

Zellmembran

Einleitung

6

Die Integrinexpression durch humane Melanozyten bzw. deren Vorläuferzellen

unterliegt bereits im Rahmen der ontogenetischen Entwicklung (Einwanderung aus der

Neuralleiste in die Haut) einer gewissen Variabilität (Scott et al., 1992). Auch nach

Abschluß der Entwicklung ist die Expression von Integrinen auf Melanozyten

vermutlich durch exogene Faktoren beeinflussbar. So wirken sich Veränderungen der

Kulturbedingungen in vitro auf die Expression der Integrine aus (Scott et al., 1997;

Zambruno et al., 1993). Immunelektronenmikroskopisch konnten auf humanen

Melanozyten in vivo die Integrinuntereinheiten α3, α6, αV und β1 dargestellt werden

(Zambruno et al., 1993). In vitro wurde durch Immunopräzipitation α3β1-, α5β1-, α6β1-

und αVβ3-Integrin nachgewiesen (Zambruno et al., 1993). Danen et al. (1996) wiesen

auf Melanozyten in vitro α2β1- und α4β1-Integrin nach. Die Unterschiede in der

Expression der melanozytären Adhäsionsmoleküle in vitro sind durch die Zugabe

unphysiologischer Mitogene wie Phorbolester zum Kulturmedium (Danen et al., 1996),

die in vivo nicht vorliegen, zu erklären.

Durch α6-Integrin-Antikörper konnte die Haftung von Melanozyten an Laminin-1 in vitro

blockiert werden (Hara et al., 1994). In anderen Untersuchungen konnte durch α3-

Integrin-Antikörper die Bindung von Melanozyten an Laminin-5 inhibiert werden

(Mengeaud et al., 1996; Scott et al., 1999). Somit sind diese Integrinuntereinheiten als

wichtigste Rezeptoren für die Lamininisoformen zu betrachten. Melanozyten binden in

vitro über α2β1-Integrin an den Basalmembranbestandteil Kollagen Typ IV. Die

Bindung führt zu gesteigerter Zellmigration (Morelli et al., 1993). Die Bindung an

Fibronektin wird vor allem durch die Integrine α5β1 und αVβ3 vermittelt (Scott et al.,

1992; Zambruno et al., 1993).

1.4 Signaltransduktion durch Integrine

Zellen erhalten über Adhäsionsmoleküle Signale aus ihrer Mikroumgebung, wodurch

Proliferation (Frisch und Ruoslahti, 1997; Stupack et al., 2001), Migration (Neitmann et

al., 1999) und Differenzierung (Adams und Watt, 1993; Lin und Bissell, 1993)

maßgeblich beeinflusst werden. Die Bindungsstelle für viele Integrine, die an Proteine

der extrazellulären Matrix binden, ist das Tripeptid Arginin-Glycin-Aspartat (RGD;

Ruoslahti, 1991), das zunächst im Fibronektin-Molekül identifiziert werden konnte. Die

RGD-Bindungsstelle wird v.a. durch die Integrinuntereinheiten α4, α5, α8 und αV

erkannt. Laminine und Kollagene enthalten ebenfalls die RGD-Bindungsstelle, die

aufgrund der Molekülkonformation aber nicht als Rezeptorstelle erreichbar ist. Diese

Einleitung

7

EZM-Proteine werden von den Integrinen über die α3-, α6- oder α7-Untereinheit

(Laminin bindende Rezeptoren) erkannt (Van der Flier und Sonnenberg, 2001).

Adhäsionsmoleküle Bindungspartner

α2β1

α3β1

α5β1

α6β1

αVβ1

αVβ3

Kollagen, Laminin

Laminin (-5)

Fibronektin

Laminin (-1)

Fibronektin

Fibronektin

Tabelle 1. Bevorzugte Bindungspartner ausgewählter Integrine (nach Van der Flier und Sonnberg, 2001)

Zunächst müssen Integrine je nach Zelltyp durch Agonisten aktiviert werden, bevor sie

an Liganden binden. Für Leukozyten und Thrombozyten sind diese Agonisten z.B.

Epinephrin bzw. Thrombin (Van der Flier und Sonnenberg, 2001). Änderungen der

Affinität zum Liganden resultiert aus Konformationsänderungen des Integrins.

Insbesondere divalente Kationen (z.B. Mg2+) können die aktive Form der Integrine

induzieren und stabilisieren (Diamond und Springer, 1994; Van der Flier und

Sonnenberg, 2001). Ebenso wird die Bindungsaffinität der Integrine durch Clustering

erhöht. Die Clusterbildung kann durch Bindung eines Liganden mit multiplen

Bindungsstellen oder durch Interaktionen mit dem intrazellulären Zytoskelett entstehen

(Sampath et al., 1998). Ein weiterer Mechanismus, der die Bindungsfähigkeit der

Integrine reguliert, ist die Internalisierung (Leitinger und Hogg, 2002; Powelka und Sun,

2004). Aufnahme der Integrine in Vesikel, die sich aus der Zellmembran lösen und die

Integrine umschließen, verhindert die Ligandenbindung. In adhärierenden Zellen, zu

denen auch Melanozyten gehören, befinden sich die Integrine meistens in ihrer aktiven

Form (Cruz et al., 1997). An besonders eng zusammenliegenden Stellen zwischen

Zellmembran und darunter liegender extrazellulärer Matrix formen adhärierende Zellen

besondere fokale Kontaktstellen aus. Die Ausbildung ist zu beobachten, nachdem die

Liganden an Integrine binden (Miyamoto et al., 1995 A). Intrazellulär setzt dies eine

Signalkaskade in Gang. Da der kleine zytoplasmatische Anteil der Integrine keine

intrinsische katalytische Fähigkeit besitzt (Zhao et al., 2004), vermittelt eine große

Anzahl intrazellulärer Bindungspartner, von denen bislang erst ein Teil identifiziert

wurde, die intrazelluläre Signalübertragung. Diese Bindungspartner lassen sich

verschiedenen Gruppen von Signalmolekülen zuordnen. Das Adapterprotein Tensin

Einleitung

8

bindet an Aktin und interagiert über eine Phosphotyrosinbindungsstelle mit dem

zytoplasmatischen Integrinanteil (Lo, 2004). Über die Signalproteine FAK (focal

adhesion kinase), MAPK (mitogen-activated protein kinase) und PI3K (Phosphoinositol

3-Kinase) wird die Zellzyklusprogression reguliert (Chen und Bailey, 2000; Schwartz

und Assoian, 2001). Des Weiteren werden die Zytoskelettkomponenten Vinculin, Talin

und α-Aktinin gebunden (Aplin et al., 1999; Miyamoto et al., 1995 B; Sampath et al.,

1998). Hierdurch kommt es zu Umlagerungen des Zytoskeletts und

verankerungsabhängigem Übergang in die S-Phase des Zellzyklus sowie zu

integrinvermittelter Gentranskription (Boudreau und Bissell, 1998). Weitere

Transmembranproteine interagieren mit Integrinen als Korezeptoren (Porter und Hogg,

1998). Sie beeinflussen Zellmigration sowie die Expression und wahrscheinlich auch

das Clustering der Integrine (Miyamoto et al., 1995 A; Sterk et al., 2002). Neben der

allgemeinen zellbiologischen Bedeutung dieser Mechanismen scheint gerade die

integrinvermittelte Signaltransduktion eine wichtige Grundlage gewebs- bzw.

zellspezifischer Signalübertragungsprozesse darzustellen. Hierdurch kommt der

Charakterisierung der Integrinregulation in einzelnen Zelltypen eine besondere

Bedeutung zu. Für Pigmentzellen der Haut ist diese Regulation bislang unzureichend

bekannt.

1.5 Ultraviolette Strahlung und deren Einfluss auf melanozytäre

Homöostase

UV-Strahlung besteht aus elektromagnetischer Energie und deckt einen

Wellenlängenbereich zwischen 100 und 400 nm ab. Sie gliedert sich in Vakuum-UV,

UVC, UVB und UVA. Die prädominante Form der UV-Strahlung, die die Erde erreicht,

ist das langwellige UVA-Licht (320-400 nm). Nur wenig Strahlung (weniger als 10%)

erreicht die Erde in Form von UVB-Licht (280-320 nm; Dissanayake et al., 1993;

Kadekaro et al., 2003). Das kurzwellige UVC-Licht (200-280 nm) ist hochenergetisch,

durchdringt aber genau wie Vakuum-UV (100-200 nm) kaum die Erdatmosphäre. UVA-

und UVB-Spektrum differieren in ihrem biologischen Effekt und in ihrer Eindringtiefe in

die Hautschichten. Das kurzwelligere UVB-Licht wird größtenteils in der Epidermis

absorbiert, ist aber energetischer und vielfach stärker kanzerogen als UVA. Es hat eine

ungefähr eintausendfach höhere biologische Aktivität als UVA-Strahlung. UVB-Strahlen

werden direkt von der Zell-DNA absorbiert und verursachen charakteristische

Thymidindimere innerhalb des DNA-Stranges (Freeman et al., 1989; Kobayashi et al.,

Einleitung

9

1998; Schothorst et al., 1991). UVB-Licht induziert darüber hinaus die Bildung von

Sauerstoffradikalen (Kvam und Tyrell, 1997; Yaar und Gilchrest, 1998). Somit ist die

UVB-Strahlung hauptverantwortlich für das Entstehen von Sonnenbränden, Keratosen

und Hautkrebs. Bei hellen Hauttypen ist die Empfindlichkeit gegen UV-Licht erhöht. Es

reicht eine niedrige UV-Dosis aus, um einen Sonnenbrand zu induzieren. Aufgrund der

höheren Wellenlänge erreichen UVA-Strahlen die mittlere Dermis. UVA induziert, in

geringerem Ausmaß als UVB-Strahlung, primär Schäden durch die Bildung von

Sauerstoffradikalen, die Einzelstrangbrüche in der DNA hervorrufen und zu DNA-

Protein-Verbindungen führen (Kvam und Dahle, 2003).

In Melanozyten induziert UV-Strahlung die Melanogenese (Aberdam et al., 1993;

Bologna et al., 1989). Hierbei handelt es sich um einen zweistufigen Prozess: eine

sofortige Pigmentierung, die innerhalb weniger Minuten nach UV-Exposition einsetzt,

und eine verzögerte Bräunung, die zwei bis drei Tage nach Strahlungsexposition

erkennbar wird (Barker et al., 1995; Pathak und Fanselow, 1983). Sofortige Bräunung

wird primär durch UVA induziert und entsteht durch Photooxidation schon

vorgebildeten Melanins. Dieser sofortige Effekt erfordert die Reorganisation von

Intermediärfilamenten in Melanozyten und Keratinozyten, um die melaninhaltigen

Melanosomen von den Melanozyten in die Keratinozyten zu transportieren. Der

verzögerte Bräunungsprozess wird vorwiegend durch UVB-Licht induziert. Die Zahl

aktiver Melanozyten steigt dabei parallel zu Synthese und Transfer von Melanin an

(Gilchrest et al., 1999; Kadekaro et al., 2003; Slominski und Pawelek, 1998).

UV-Strahlung führt im Rahmen dieser metabolischen Veränderungen auch zu

morphologischen Veränderungen in Melanozyten. So kommt es nach UV-Exposition zu

einer Größenzunahme und zu einer Vermehrung der Melanozyten sowie zu einer

verstärkten Dendrizität (Archambault et al., 1995; Badawy et al., 2003; Stierner et al.,

1989). Auf molekularer Ebene ist eine verstärkte Expression des Antigens HMB-45,

einem Marker für melanozytäre Aktivität, festzustellen (Badawy et al., 2003; Tronnier et

al., 1995). Eine gesteigerte mitogene Aktivität lässt sich an der vermehrten Aufnahme

des Pyrimidin-Isotops 3H-methyl-Thymidin erkennen (Rosdahl und Szabó, 1978).

Auch sind Effekte von UV-Strahlung auf die Expression epidermaler

Adhäsionsmoleküle gezeigt worden: Sowohl eine Heraufregulation von α3β1 und α6β1

(Tronnier et al., 1997) wurde beschrieben, als auch die Herunterregulation von

Cadherinen und ICAMs (Jamal und Schneider, 2002; Norris et al., 1990; Seline et al.,

1996). Zudem konnte gezeigt werden, dass Melanozyten durch verstärkte Expression

Einleitung

10

von α5β1-Integrin nach UV-Bestrahlung stärker an Fibronektin haften (Neitmann et al.,

1999).

Ist die melanozytäre DNA durch Noxen wie z.B. UV-Strahlung geschädigt, wird sie

durch spezielle Enzyme repariert (De Leo et al., 1984; Schothorst et al., 1991). Gelingt

die Reparatur, kehrt die Zelle in ihren ursprünglichen Zustand zurück oder reagiert

wahrscheinlich sogar auf die DNA-Reparaturenzyme mit gesteigerter Melanogenese

(Eller et al., 1996; Gilchrest et al., 1993). Nehmen die DNA-Schäden allerdings ein zu

großes Ausmaß an, so kommt es zur Ausbildung von Mutationen. Die Zelle kann

entarten und den malignen Tumor der Pigmentzellen, das Melanom, entwickeln. Zum

Schutz vor negativen Folgen für den Gesamtorganismus kommt es ab einem gewissen

Ausmaß von z.B. UV-bedingter Schädigung der Zelle zum Zelltod, d.h. zu Nekrose

oder Apoptose (Bowen et al., 2003; Kim et al., 2000).

1.6 Einfluss von Integrinen auf den programmierten Zelltod (Apoptose)

von Melanozyten

Apoptose stellt den durch die Zelle selbst induzierten, programmierten Zelltod ohne

reaktive Begleitentzündung dar (Riede et al., 2003). Sie ist ein wichtiger Vorgang für

die Entwicklung und die Aufrechterhaltung von Geweben in Säugetierorganismen

(Cohen, 1993; Levine, 1997). Kernstück des Zelltodprogramms ist ein kaskadenartig

aktivierbares System von „Zelltod-Proteasen“ (Caspasen), die Zytoskelett,

Kernproteine und nukleäre Regulator- und Schutzproteine angreifen und letztendlich

die Zelle fragmentieren. Die Apoptose kann auf zwei Wegen induziert werden: zum

einen über sogenannte Todesrezeptoren, zum zweiten über den mitochondrialen Weg

(Riede et al., 2003). Apoptose als Antwort auf DNA-Schäden besteht aus einem

komplexen Ablauf von Schritten, in denen p53 und Mitglieder der p53-Proteinfamilie

eine entscheidende regulatorische Rolle spielen. p53 ist ein Tumorsuppressorprotein,

das nach der Einwirkung von DNA-Schäden und anderen Zellstressoren entscheidet,

ob die Zelle apoptotisch wird oder im Zellarrest verharrt (Levine, 1997; Wahl und Carr,

2001). Ist die DNA nur leicht geschädigt, kann sie durch Enzyme repariert werden

(Kastan et al., 1991; Kuerbitz et al., 1992), ist sie schwer geschädigt, so wird durch p53

die Apoptose über Caspasen induziert (Levine, 1997; McArthur Lewis et al., 2002). Aus

Mitochondrien freigesetzte Bestandteile aktivieren ebenfalls Caspasen. Die Aktivierung

dieses Weges wird durch eine Reihe von Inhibitoren in Schach gehalten. Zu diesen

Inhibitoren zählt das Protoonkogen c-bcl-2. Es verhindert die Freisetzung von

Einleitung

11

Cytochrom-c und einem mitochondrialen Apoptosefaktor, dem sogenannten AIF

(Apoptosis-inducing factor).

Es existiert eine Vielzahl von potentiellen proapoptotischen Stimuli. UV-Licht induziert

eine gesteigerte Expression von p53-abhängigen Genen (Aragane et al., 1998; El-

Deiry et al., 1993). In Melanozyten steigt die Apoptoserate nach UV-Bestrahlung

dosisabhängig an (Barker et al., 1995; Kim et al., 2000). Dabei kann der Beginn der

Apoptose durch unterschiedliche Signalwege vermittelt werden. Intrazelluläre

Sauerstoffradikale oder Rezeptoren auf der Zelloberfläche können der Auslöser sein

(Aragne et al., 1998; Kulms et al., 2002). Zum anderen stellt die Verankerung

(Attachment) epithelialer Zellen auf der Basalmembran für viele Zellen einen Schutz

vor Apoptose dar (Ingber, 2002; Stupack und Cheresh, 2004). In diesem

Zusammenhang kommt Integrinen vermutlich eine wichtige Rolle zu. So wie sie durch

Bindung eines Liganden die Proliferation fördern (s. 1.4), wird umgekehrt davon

ausgegangen, dass durch Verlust der Bindung intrazelluläre Signalwege induziert

werden, die zu Apoptose führen (Matters und Ruoslahti, 2001; Stupack et al., 2001).

Dieser durch Verankerungsverlust ausgelöste Vorgang hat eine besondere Bedeutung

für die Gewebeintegrität und wird daher begrifflich von anderen Formen der Apoptose

als Anoikis abgegrenzt. Adhäsionsverlust führt zur Induktion einer ganzen Reihe von

Ereignissen. Es kommt zur Reorganisation des Zytoskeletts (Flusberg et al., 2001)

sowie zur Umverteilung und Änderung der Aktivierung von Todesrezeptoren (Aoudjit

und Vuori, 2001; Arora et al., 1995). Diese Ereignisse können letztendlich zu einer

Aktivierung von Caspasen über Signalproteine führen (Frisch und Screaton, 2001;

Stupack und Cheresh, 2004). Andererseits können Integrine nicht nur im Rahmen der

Aufrechterhaltung normaler Zellhomöostase Apoptose verhindern, sondern sind auch

aktiv in der Lage, eine zelluläre Resistenz gegenüber apoptosefördernden Signalen

einzuleiten. So reguliert die Signaltransduktion durch α5β1- und αVβ3-Integrine die

Expression und Aktivierung von Proteinen der bcl-2-Familie (Matters und Ruoslahti,

2001).

Einleitung

12

1.7 Fragestellung

Es gibt bislang keine systematischen Untersuchungen zu der Frage, welchen Einfluss

UV-Bestrahlung auf die Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle hat. In

vorangegangenen Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe wurden erste Hinweise auf

eine UV-dosisabhängige Modifikation der Integrinexpression erarbeitet. Zunächst

galten meine Bemühungen daher der Vervollständigung dieser Ergebnisse,

insbesondere in Hinsicht auf die Frage, inwiefern die Integrinexpression vom Kontakt

der Melanozyten zu EZM-Molekülen beeinflusst wird und welchem zeitlichen Verlauf

sie unterliegt.

In einem weiteren Teil der Arbeit beschäftigte mich die Frage, ob die integrinvermittelte

Adhäsion von EZM-Molekülen die UV-induzierte Apoptose von Melanozyten

beeinflusst.

Schließlich sollten die durchflusszytometrischen Expressionsdaten durch eine

konfokalmikroskopische Analyse auch auf zellulärer Ebene morphologisch dargestellt

werden.

Material und Methoden

13

2 Material und Methoden

Die Arbeit lässt sich methodisch in zwei Teilbereiche gliedern:

1. Zum einen wurde an Melanozytenprimärkulturen die Expression von

Adhäsionsmolekülen in Abhängigkeit von UVB-Bestrahlung sowie von verschiedenen

Matrixbeschichtungen durchflusszytometrisch gemessen. Darüber hinaus wurde -

ebenfalls durchflusszytometrisch- die Apoptoserate von Melanozyten- und

Keratinozytenprimärkulturen in Abhängigkeit von UVB-Bestrahlung und den genannten

Matrixbeschichtungen gemessen.

Für die Untersuchung der Apoptoserate und der Expression der Adhäsionsmoleküle,

die Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Verbindungen vermitteln, stellt die Durchflusszytometrie

eine geeignete Methode dar. Im Gegensatz zu immunzytochemischen Färbungen, bei

denen die Intensität der Farbreaktion lediglich in groben Abstufungen zur Menge des

Antigens proportional ist und so nur richtungweisende Aussagen über die Stärke der

Expression erlaubt, ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse (FACS, fluorescence-

activated cell sorter) ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von

Oberflächenmolekülen. Auch die Apoptoserate der Melanozyten kann durch die

Kopplung von Aminosäuren an der Zelloberfläche durch spezifische Antikörper und

deren Bindung mit Fluoreszenz-aktiven Farbstoffen durchflusszytometrisch quantitativ

dargestellt werden.

2. Zum zweiten wurde die Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle mittels

Konfokalmikroskopie immunzytologisch untersucht. Die räumliche Anordnung von

Antigenen auf der Zelloberfläche bzw. innerhalb der Zelle ist durchflusszytometrisch

nicht darstellbar. Für qualitative morphologische Aussagen auf dem Niveau der

Einzelzellen stellt die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie eine geeignete Methode

dar.

2.1 Zellkulturen

2.1.1 Zellkulturmedium

Melanozytenmedium

Melanocyte growth medium M2 (Promo Cell, Heidelberg): definiertes, serum- und

phorbolesterfreies Kulturmedium. Eine genaue Zusammensetzung des Mediums gibt


14

die Firma nicht bekannt, ein Hauptbestandteil ist jedoch der Wachstumsfaktor FGF-2

(fibroblast growth factor-2). Das Medium enthält antibiotische Zusätze.

Keratinozytenmedium

Keratinocyte-SFM (serum-free medium), Invitrogen (Invitrogen, Karlsruhe). Eine

genaue Zusammensetzung des Kulturmediums gibt die Firma nicht bekannt,

Hauptbestandteile sind jedoch die Wachstumsfaktoren EGF (epidermal growth factor)

und BPE (bovine pituitary extract).

2.1.2 Melanozytenkultur

Für die Durchführung der Versuche verwendete ich Melanozytenprimärkulturen der

Firma Promocell (normal human epidermal melanocytes M2, NHEM M2; Promocell,

Heidelberg). Es handelte sich hierbei um epidermale, aus neonatalem Vorhautgewebe

eines hellhäutigen, 18 Monate alten Individuums („Kaukasier“) extrahierte

Melanozyten, die in der ersten Passage in kryokonservierter Form geliefert wurden.

Die Zellen wurden zunächst in 10ml MGM-M2 (melanocyte growth medium-M2;

Promocell, Heidelberg) resuspendiert. Nach zwei Tagen Wachstum bei 37°C, 5% CO2

in einer 75 cm2 Kulturflasche (Greiner, Frickenhausen) wurde das Medium erstmals

gewechselt und das Anwachsen der Zellen kontrolliert. Nun wurden die Melanozyten

so lange kultiviert, bis eine 80%ige Konfluenz erreicht war, wobei ein Mediumwechsel

dreimal wöchentlich stattfand.

Eine weitere Melanozytenkultur wurde aus epidermalen, neonatalen

Vorhautmelanozyten eines dunkelhäutigen Individuums („negroid“) extrahiert

(Promocell, Heidelberg). Die Kultivierung erfolgte analog zu den „kaukasischen“

Melanozyten.

2.1.3 Keratinozytenkultur

Normale humane Keratinozyten aus neonataler Vorhaut wurden von der Firma

Cambrex (Verviers, Belgien) erworben. Die Zellen wurden in serumfreiem K-SFM

(Keratinocyte serum-free medium; Invitrogen, Karlsruhe), das 0,12 mmol Ca2+ enthielt,

bei 37°C, 5% CO2 in 75 cm2 Kulturflaschen (Greiner, Frickenhausen) kultiviert. Das

Kulturmedium wurde dreimal pro Woche gewechselt, bis 80%-ige Konfluenz erreicht

war.


15

2.1.4 Passagieren der Melanozyten und Keratinozyten

Die Zellen wurden, sobald sie subkonfluent gewachsen waren, auf jeweils drei neue

Flaschen aufgeteilt. Hierfür wurde das Kulturmedium zunächst abgesaugt und durch

einmaliges Spülen mit PBS (Phosphate Buffered Saline ohne Ca2+ und Mg2+; Cambrex,

Verviers, Belgien) ausgewaschen. Nach Zugabe von 7,5 ml 0,025%-igem Trypsin

(Trypsin/ EDTA Solution; Sigma, Heidelberg) lösten sich die Zellen im Wärmeschrank

bei 37°C innerhalb von fünf bis zehn Minuten nahezu vollständig vom

Kulturplattenboden. Durch Zugabe von 7,5 ml TNS (Trypsine Neutralizing Solution,

TNS; Clonetics Cell Systems, Remagen) wurde die proteolytische Aktivität des

Trypsins abgesättigt und die Zellsuspension anschließend in ein 50 ml

Kunststoffröhrchen (Greiner, Frickenhausen) aufgenommen. Das Abzentrifugieren der

Zellen erfolgte bei 96 G für drei Minuten. Der zellfreie Überstand wurde abgesaugt,

das Zellpellet in 3 ml Kulturmedium resuspendiert und jeweils auf drei neue

Kulturflaschen verteilt.

Um in den Versuchen möglichst vergleichbare Bedingungen zu schaffen, benutzte ich

durchweg Melanozyten und Keratinozyten in ähnlichen Passagen (5.-10. Passage).

Hierfür wurden die Zellen nach Expansion zum Teil eingefroren.

2.1.5 Einfrieren und Auftauen von Melanozyten und Keratinozyten

Zum Einfrieren der Zellen wurden diese zunächst wie oben beschrieben trypsiniert und

das Zellpellet abzentrifugiert. Die anschließende Aufschwemmung des Pellets erfolgte

mit 1 ml eiskaltem Einfriermedium (Cryptoprotective Medium; Bio Whittaker/Cambrex,

Apen). Die Zellsuspension wurde dann in auf Eis stehende Einfriercups überführt und

die Zellen zunächst bei minus 70°C tiefgefroren. Nach 48 Stunden erfolgte das

Überführen in flüssigen Stickstoff (minus 196°C).

Für das Auftauen tiefgefrorener Zellen wurden diese aus dem Stickstoff genommen

und durch einmaliges, kurzes Öffnen des Einfriercups der darin befindliche Überdruck

abgelassen. Im 37°C warmen Wasserbad wurde das Röhrchen mit den gefrorenen

Zellen so lange geschwenkt, bis ca. 90% der Zellen aufgetaut waren. Die

Zellsuspension wurde mit einer Pipette aufgenommen und in das bereits erwärmte

Kulturmedium einer 25 cm2 Kulturflasche überführt. Nach 24 Stunden erfolgte der erste

Mediumwechsel. Zu diesem Zeitpunkt sollten ungefähr 70% der Zellen angewachsen

sein.


16

2.1.6 Beschichtung der Kulturplatten

Um den Einfluss der extrazellulären Matrix auf die Expression von

Adhäsionsmolekülen und die Apoptoserate zu untersuchen, kultivierte ich parallel zu

den bisher geschilderten Versuchen einen Teil der Melanozyten auf mit Laminin-1,

Kollagen-IV oder Fibronektin beschichteten Kulturplatten. Als charakteristische

Vertreter der extrazellulären Matrix (EZM) wurden für die Beschichtung Laminin-1

(Basalmembran), Kollagen Typ IV (Basalmembran) bzw. Fibronektin (dermale EZM)

ausgewählt, da diese Moleküle für melanozytäre Funktionen in vitro von besonderer

Bedeutung sind (Hedley et al., 1996; Mortarini et al., 1995; Scott et al., 1992).

Laminin-1 (Engelbrecht-Holm-Schwarm-Sarkom; Sigma, Deisenhofen) wurde in

Hepes-Puffer (N-2- Hydroxyethylpiperazin-2-Ethansulfonsäure; Clonetics, Verviers,

Belgien) in einer Konzentration von 20 µg/ml, Fibronektin (30 µg/ml; Sigma,

Deisenhofen) bzw. Kollagen Typ IV (60 µg/ml, Engelbrecht-Holm-Schwarm-Sarkom;

Sigma, Deisenhofen) in steril filtriertem destilliertem Wasser angesetzt. Von dieser

Lösung wurde je 1 ml pro Feld (9,5 cm2) einer 6-well-Platte (Greiner, Frickenhausen)

gegeben. Die so befüllten Kulturplatten wurden nun für 24 Stunden im Kühlschrank bei

4°C gelagert. Es folgte das Absaugen und ein einmaliges Waschen mit PBS, bevor die

Kulturplatten für eine Stunde bei 37°C mit 1 ml, denaturiertem, 3%-igem BSA (Bovine

Serum Albumine; Sigma, Deisenhofen) in Hepes überschichtet wurden. Hierdurch

wurden unspezifische, d.h. nicht durch Laminin-1 oder Fibronektin bzw. Kollagen-IV

abgesättigte Bindungsstellen der Plastikoberfläche blockiert. Dann wurde mit PBS das

nicht gebundene BSA ausgewaschen, und die Melanozyten nun in einer Dichte von

30.000/cm2 (Kontrolle in einer Neubauer-Zählkammer) ausgesät.

Für die Messung der Apoptoserate wurden die Zellen auf analoge Weise ausgesät. In

der Versuchsreihe, in der ich den blockierenden Ratte-anti-Mensch-Antikörper gegen

α6-Integrin (Isotyp Ratte IgG2a, Klon NKI-GoH3; Chemicon, Ternecula, USA)

verwendete, wurden die Melanozyten nach der Trypsinierung in Kunststoffröhrchen

pipettiert und für 20 min bei Raumtemperatur mit 1 µl/ml M2-Medium des Ratte-anti-

Mensch-Antikörpers (Antikörper-Endkonzentration: 1 mg/ml) inkubiert und regelmäßig

aufgeschwemmt, um Sedimentation und Koagulation zu verhindern. Die Melanozyten

wurden nach der Inkubation sofort auf 6-well-Platten, die mit Laminin-1 beschichtet

waren, ausgesät, ohne das Medium zu wechseln. Der Ratte-anti-Mensch-Antikörper

gegen α6-Integrin konnte so weiter wirken. Nach 24-stündiger Kultur erfolgte die UVB-

Bestrahlung.


17

2.2 UV-Bestrahlung

2.2.1 UV-Lichtquelle

Die Bestrahlung wurde mit einem UV-Monochromator durchgeführt. An dem Gerät

(Dermolum®; Müller Elektronik-Optik, Moosinning) kann mittels einer speziellen

Gitterfiltertechnik die Wellenlänge des austretenden Lichtes, das von einer 1 kW

Xenonlampe mit sonnenähnlichem Spektrum emittiert wird, im Bereich von 270 bis 700

nm stufenlos eingestellt werden. Dabei ist die Bandbreite von 5 bis 80 nm variierbar.

Die Bestrahlung in den hier dargestellten Versuchen erfolgte bei einer

Zentralwellenlänge von 297,5 nm mit einer Bandbreite von 35 nm, d.h. mit einem

Spektrum von 280 bis 315 nm. Dies entspricht dem unteren UVB-Anteil des

Sonnenlichtes. Die UV-Dosis wurde mit einem PRC-Photometer (Photometry,

Radiometry, Colorimetry; Krochmann, Berlin) gemessen.

2.2.2 Festlegung der UV-Dosis

In Vorversuchen stellte sich heraus, dass sich ab einer Bestrahlungsdosis von 10

mJ/cm2 UVB nach 24 Stunden zahlreiche Zellen von der Kulturplatte abgelöst hatten

und im Kulturmedium trieben. Mittels Trypanblauinklusion konnte der Anteil

abgestorbener Zellen in der Neubauer-Zählkammer quantifiziert werden und stellte sich

im Untersuchungsbereich in etwa linear dosisabhängig dar (10 mJ/cm2 24 h p.i. ca.

15%, 15 mJ/cm2 24 h p.i. ca. 18%, 20 mJ/cm2 24 h p.i. ca. 30%).

Daraus lässt sich ableiten, dass bereits bei dieser Dosis UV-Effekte wirksam sind und

den Anteil adhärenter, d.h. vitaler Zellen, an der Gesamtzahl reduzieren. Ich führte die

Versuche im Bereich dieser Bestrahlungsdosen durch, um zu untersuchen, ob

subletale UV-Dosen, wie sie in vivo bei einem Sonnenbrand wirksam sein dürften, zu

spezifischen Effekten für einzelne Adhäsionsmoleküle führen. Zudem konnte ich so die

Apoptoserate in Abhängigkeit von den Matrixbeschichtungen untersuchen.

2.2.3 Bestrahlung der Melanozyten

Für die Bestrahlung wurde das Kulturmedium zunächst abgesaugt und durch Spülen

mit PBS ausgewaschen. Pro Feld der 6-well-Platte wurde 1 ml PBS mit Ca2+ (130 mg/l;

Cambrex/Biowhittaker, Apen) vorgelegt. Dann erfolgte - bei einer UV-undurchlässigen

Abdeckung der nicht zu bestrahlenden Felder - die UVB-Bestrahlung

(Wellenlängenspektrum 280-315 nm) mit 10, 15 bzw. 20 mJ/cm2. In jedem

Versuchsansatz blieb die Hälfte der Kulturplatten zum Vergleich unbestrahlt. Die

Bestrahlung erfolgte in der Regel 24 Stunden nach der Aussaat. In dem Versuch zur


18

Apoptoserate nach Inkubation mit dem blockierenden Antikörper gegen α6-Integrin

(Isotyp Ratte IgG2a, Klon NKI-GoH3; Chemicon, Ternecula, USA) erfolgte die

Bestrahlung der Melanozyten bereits nach sechs Stunden. In Vorversuchen hatte sich

mikroskopisch gezeigt, dass Melanozyten auf Laminin-1-beschichteten

Kulturoberflächen in Gegenwart dieses Antikörpers nach sechs Stunden einen

rundlichen Zelleib und kurze, dicke Dendriten bei wesentlich geringerer Zellhaftung

aufwiesen, während Zellen in Abwesenheit des Antikörpers längere Dendriten

aufwiesen (Abb. 34 und 35 [s. Anhang]). Somit schien dieser Zeitpunkt für die UV-

Bestrahlung optimal, da eine frühere Bestrahlung (3h nach der Aussaat) zu nicht

verwertbaren Ergebnissen in der Durchflusszytometrie geführt hätte, und neun

Stunden nach der Aussaat die morphologischen Unterschiede zwischen den mit bzw.

ohne blockierenden Antikörper inkubierten Zellen mikroskopisch bereits nicht mehr so

deutlich zu erkennen waren.

2.3 Durchflusszytometrie

Die durchflusszytometrische Messung erfolgte 24 Stunden nach UVB-Bestrahlung. Die

Melanozyten wurden mit 0,025%-igem Trypsin von der 6-well-Platte abgelöst,

zentrifugiert und in PBS resuspendiert. Auf eine möglichst große Zellausbeute mit

einem Zielwert von etwa 100.000 Zellen pro ml war zu achten (Kontrolle in Neubauer-

Zählkammer).

Jeweils 100 µl Zellsuspension wurden in Eppendorfgefäße überführt und mit 10 µl des

jeweiligen primären Antikörpers (Verdünnung 1:50, entspricht 20 µg/ml) zehn Minuten

bei Raumtemperatur inkubiert. Die verwendeten Antikörper sind in Tabelle 3 (s.

Anhang) aufgelistet. Bei allen von uns verwendeten Primärantikörpern handelte es sich

um unkonjugierte Antikörper, an die der Fluoreszenzfarbstoff nicht direkt gekoppelt

war. In einem weiteren Schritt wurden sie mit einem fluoreszenzmarkierten

Sekundärantikörper (Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-F(ab`)2 Ziege-anti-Maus; Dako,

Hamburg) inkubiert (Konzentration 20 µg/ml, 10 min bei Raumtemperatur in

Dunkelheit). Zwischen bzw. nach den beiden Inkubationsschritten wurden die Zellen

mit PBS gewaschen und abzentrifugiert.

In einem Nebenversuch untersuchten wir die Expression von α6-Integrin unter Zugabe

des Radikalfängers Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) in einer Konzentration von 50

µM, den wir eine Stunde vor der Bestrahlung zur Zellkultur gaben und der auch nach

der Bestrahlung im Medium blieb.


19

Die Messung der Apoptoserate erfolgte durchflusszytometrisch mit dem Human

Annexin V-FITC Kit (Bender Med. Systems, Wien, Österreich). Zunächst wurden

hierfür das Kulturmedium mit den nach UV-Bestrahlung darin schwimmenden Zellen

aus der jeweiligen Kammer der 6-well-Platte in ein Kunststoffröhrchen überführt, um

auch die bereits abgelösten Zellen für die nachfolgende Messung zu erhalten. Dann

wurden die haftenden Zellen, wie oben beschrieben, trypsiniert. Die Suspension wurde

zu den abgeschwemmten Zellen in dasselbe Kunstoffröhrchen überführt und

zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde abpipettiert. Im nächsten Schritt wurde mit

einem nach Zellzählung ermittelten Volumen von Bindungspuffer aus dem Annexin V-

Kit, der in einer Verdünnung von 1:4 mit destilliertem Wasser vorlag, resuspendiert, so

dass sich eine Konzentration von 500.000 Zellen pro ml Bindungspuffer ergab. Von

dieser Zellsuspension wurden 195 µl in ein Eppendorfgefäß überführt und durch

Zugabe von 5 µl Annexin V für zehn Minuten bei Raumtemperatur in Dunkelheit

inkubiert. Anschließend wurde mit PBS auf ein Volumen von 500 µl aufgefüllt,

gewaschen, zentrifugiert und der zellfreie Überstand abpipettiert. Der Zellbodensatz

wurde mit 380 µl Bindungspuffer aufgeschwemmt. 20 µl Propidiumiodid (PI) wurden

hinzugegeben. Direkt danach erfolgte die durchflusszytometrische Messung. Die vom

Hersteller vorgeschlagenen Volumina an Bindungspuffer und Propidiumiodid wurden

jeweils verdoppelt, um ein ausreichendes Volumen für die durchflusszytometrische

Messung zu gewährleisten.

Humanes Annexin V erkennt Phosphatidylserin auf der äußeren Oberfläche von

Zellmembranen. Phosphatidylserin befindet sich vor allem in Membranschichten, die

sich auf zytoplasmatischer Seite befinden. Während der Apoptose wird

Phosphatidylserin jedoch an der Zelloberfläche exprimiert (Homburg et al., 1995;

Koopman et al., 1994; Vermes et al., 1995). Durch die FITC-Kopplung ist eine direkte

durchflusszytometrische Messung möglich. Gegenfärbung mit Propidiumiodid erlaubt

die Differenzierung von nekrotischen Zellen. Dadurch lassen sich bei der graphischen

Darstellung der durchflusszytometrischen Messergebnisse (sog. Dot-plot) nach

Annexin V- und PI-Färbung apoptotische, nekrotische und vitale Zellpopulationen

quantitativ differenzieren (Abb. 2):


20

Abb. 2. Dot plot. Beispiel einer durchflusszytometrischen Messung mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC,

Annexin V) und Propidiumiodid (PI): 1. nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv, links oben in

Quadrant F1), 2. spät apoptotisch bzw. früh nekrotische Zellen (Annexin V positiv, PI positiv, rechts oben

in Quadrant F2), 3. vitale Zellen (Annexin V negativ, PI negativ, links unten in Quadrant F3), 4. früh

apoptotische Zellen (Annexin V positiv, PI negativ, rechts unten in Quadrant F4).

Für die Untersuchungen stand das Durchflusszytometer EPICS/XL-MCL (Coulter-

Immunotech, Hamburg) des Instituts für Immunologie und Transfusionsmedizin des

Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, zur Verfügung, das ich

freundlicherweise in Zusammenarbeit mit Herrn Privatdozent Dr. P. Schlenke nutzen

durfte. Die Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein Verfahren zur

quantitativen Messung von Zelloberflächenmolekülen. Grundlage ist eine Antigen-

Antikörper-Reaktion dieser Moleküle mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Als

typische Fluorochrome dienen hierbei Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und

Phycoerythrin (PE). Die Lichtquelle besteht aus einem luftgekühlten Argonlaser mit

einer Wellenlänge von 488 nm, dessen Strahl durch Linsensysteme in eine elliptische

Form gebracht wird. Soll die Zelle vollständig und gleichmäßig beleuchtet werden,

muss sie direkt durch das Zentrum des Laserstrahls fließen, damit die Fluorochrome

maximal angeregt werden und das Licht direkt partikelabhängig gebeugt wird. Hierfür

werden die zu untersuchenden Zellen in Suspension, umgeben von einem inneren

Proben- und einem äußeren Hüllstrom, durch die Messzelle des Durchflusszytometers

geleitet. Durch den höheren Druck des äußeren Hüllstroms wird der innere

Probenstrahl zu einem dünnen Faden ausgezogen, in dem die Zellen perlschnurartig

hintereinander aufgereiht den Laserstrahl im rechten Winkel kreuzen.

PI

1.1.1


21

Abb.3: Schematische Darstellung des Prinzips der Durchflusszytometrie (aus: Internet;

http://www.berlin.ptb.de/8/83/832/DurchflussZytometrie; Tag des Zugriff: 10.03.2005)

Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den mono-

chromatischen Laserstrahl werden diese in ein höheres Energieniveau gehoben. Nach

dem Laserimpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie in Form von

Photonen auf ihr Ursprungsniveau zurück. Spezielle Photodetektorsysteme registrieren

die ermittelte Photonenkonzentration, die sich proportional zur Menge des gebundenen

Antikörpers pro Zelle verhält. Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und -streuung

Informationen über die Zellgröße und Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas,

Größe des Zellkerns) der Zellen gewonnen, die das Durchflusszytometer durch

Detektoren für das Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht der Zellen erhält. Es wird nur der

Teil der Einzelereignisse zur Fluoreszenzmessung herangezogen, der sich am

Bildschirm gezielt anhand der Streulichteigenschaften als vitale Zellpopulation

eingrenzen lässt. Für die Apoptosemessungen lassen sich, wie oben ausgeführt,

neben dem Anteil vitaler Zellen auch nekrotische sowie früh- und spätapoptotische

Zellen differenziert quantitativ erfassen.

In den vorliegenden Versuchen wurden als Negativkontrollen jeweils Färbungen mit

dem Sekundärantikörper allein (als Maß für die unspezifische Bindung des

Sekundärantikörpers) und mit einem Isotyp-Antikörper (als Maß für die unspezifische

Bindung von Maus-Immunglobulinen) mitgeführt. Diese Kontrollen zeigten eine jeweils

sehr schwache Fluoreszenz, deren Ausmaß zur Definition des Schwellenwertes für

positive Immunreaktivität (maximal 2% unspezifische Bindung) diente.


22

2.4 Immunfluoreszenz und konfokale Lasermikroskopie

Melanozyten wurden auf zweikammerigen sog. Chamber-Slides (Falcon, Beckton-

Dickinson, Heidelberg) ausgesät. Dabei handelt es sich um Glasobjektträger mit einem

Plastikaufsatz, auf denen die Zellen zunächst kultiviert, bestrahlt und dann ohne

zwischenzeitliches Ablösen fixiert und für die Mikroskopie gefärbt werden können. 24

Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen mit einer Dosis von 10 mJ/cm2 und 20

mJ/cm2 in jeweils nur einer Kammer der Kulturplatte bestrahlt, wobei die unbestrahlte

Kammer als Negativkontrolle diente. 24 Stunden später wurden die bestrahlten und

unbestrahlten Melanozyten mit 4%-igem Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt) für 10

Minuten fixiert und die Zellmembran in zehn Minuten mit 1%-igem Triton X-100 (Merck,

Darmstadt) perforiert. Danach wurden die Zellen auf der feuchten Kulturplatte mit

einem monoklonalen Ratte-anti-Mensch-Antikörper gegen α6-Integrin (Isotyp Ratte

IgG2a, Klon NKI-GoH3; Chemicon, Ternecula, USA) bzw. mit einen monoklonalen

Maus-anti-Mensch-Antikörper gegen α3-Integrin (Isotyp Maus IgG1; Klon P1B5;

Chemicon, Ternecula, USA) in einer Konzentration von 20 µg/ml für 30 Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Spülen mit PBS wurden die Zellen mit einem

Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörper Ziege-anti-Ratte IgG (20 µg/ml; Invitrogen,

Karlsruhe) für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaliger Spülung mit

PBS wurden die Zellen zur Kerngegenfärbung in einem weiteren Schritt mit

Bisbenzimid Hoechst 33258 (1:10.000; Sigma, Deisenhofen) für 30 bis 60 Minuten

inkubiert. Die Objektträger wurden mit Mowiol eingedeckt und mit dem konfokalen

Laser-scanning-Mikroskop Zeiss LSM 510 bei 351 nm und 543 nm untersucht.

Für diese Untersuchungen stand mir das Konfokalmikroskop des Instituts für Anatomie

des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, zur Verfügung, das ich

freundlicherweise in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Andreas Gebert nutzen durfte.

Die computergestützte Bilddarstellung gelingt bei dieser Technik durch Anregung der

fluorochrommarkierten Zellen mittels Laserbestrahlung. Das von den Lasermodulen

emittierte Anregungslicht wird an einem Hauptfarbteiler reflektiert und durch das

Objektiv in die Probe fokussiert. Im Fokuspunkt ist die Anregungsintensität am

höchsten, aber trotzdem werden Fluoreszenzfarbstoffe innerhalb des gesamten

Lichtkegels angeregt. Das vom Präparat zurückkommende Licht wird mit dem Objektiv

gesammelt und auf eine sehr kleine Blende, das Pinhole, fokussiert. Da der

Fokuspunkt im Präparat und das Pinhole in konjugierten Ebenen liegen, also konfokal


23

sind, kann nur Licht aus dem Fokuspunkt das Pinhole passieren und vom

Photomultiplier registriert werden. Emissionslicht, das oberhalb und unterhalb der

Fokusebene entstanden ist, wird durch die konfokale Blende wirksam unterdrückt. Das

Ergebnis ist eine scharfe, vom Streulicht weitestgehend befreite Abbildung des

Fokuspunktes. Mit Hilfe des Scanners, der das fokussierte Anregungslicht Punkt für

Punkt durch die Probe führt, kann so ein optischer Schnitt durch das Präparat gelegt

werden. Die auf dem Objektträger bestrahlten und anschließend gefärbten

Melanozyten wurden im xy-Durchlauf von der oberen zur unteren Zelloberfläche in 0,46

µm-Schritten abgesucht. Die Dicke der optischen Bereiche betrug in maximaler

Auflösung 0,9 µm.

2.5 Statistische Auswertung

Mittelwerte und Standardabweichungen der durchflusszytometrischen Daten werden

im Ergebnisteil dargestellt. In die Berechnung gingen die Messwerte aus fünf,

mindestens jedoch drei unabhängigen Versuchen ein. Die Versuchszahl n sowie die

Standardabweichung sind im Ergebnisteil im Text bzw. in den Diagrammen

angegeben. In Einzelfällen wird in den Abbildungen das Ergebnis eines

repräsentativen Versuchs gezeigt und ist dann als solches ausgewiesen. Die

Signifikanz nach Mann-Whitney wurde im U-Test, einem nicht-parametrischen Test für

ungepaarte Stichproben (Computerprogramm SPSS, Version 12.0) errechnet. Speziell

für die Auswertung der α6-Integrin-Expression an unbestrahlten Melanozyten kam der

Test nach Kruskal-Wallis zur Anwendung (s. 3.1.3). p-Werte <0,05 wurden als

signifikant gewertet.

Ergebnisse

24

3 Ergebnisse

3.1 Durchflusszytometrische Messung der Integrinexpression

3.1.1 Integrinexpression nach UV-Bestrahlung

Die Änderung der Expression der untersuchten Integrinuntereinheiten ist in Abbildung

4 und Tabelle 4 (s. Anhang) dargestellt. Insgesamt kam es bei allen untersuchten

Integrinen zu einem Rückgang der Expression. Das Säulendiagramm in Abbildung 4

zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchung mit Auftragung der einzelnen untersuchten

Integrinuntereinheiten auf der Abszisse gegenüber der jeweiligen Expressionsstärke in

Prozent auf der Ordinate.

0

20

40

60

80

100

Integrine

Unbestrahlt

UVB 10 mJ/cm²

UVB 15 mJ/cm²

UVB 20 mJ/cm²

α 2 α 3 α 5 α 6 α V β 3

Abbildung 4. Expression von Integrinuntereinheiten unbestrahlt und nach

einer UVB-Dosis von 10, 15 bzw. 20 mJ/cm2. Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

Der Rückgang der Expression war am ausgeprägtesten bei α2-Integrin. Die Expression

fiel von 83,1% für unbestrahlte Zellen auf 49,3% (UVB-Dosis 20 mJ/cm2).

Die Expression von α3-Integrin änderte sich durch UVB-Bestrahlung kaum. Sie blieb

konstant zwischen 97,5% (unbestrahlt) und 87,5% (10 mJ/cm2). Bei stärkeren UVB-

Dosen zeigte sich eine noch geringere Herunterregulation.

Die Expression von α5-Integrin ging unter UVB-Bestrahlung deutlich zurück. Sie fiel

von 93,2% (unbestrahlt) auf 66,8% (20 mJ/cm2).

Ergebnisse

25

Die Expression von α6-Integrin zeigte einen deutlichen Rückgang. Die Expression

erreichte ein Minimum von 53,5% (UVB-Dosis 15 mJ/cm2), die bei höheren UVB-Dosen

(20 mJ/cm2) wieder leicht auf durchschnittlich 62,9% anstieg.

Die Expression von αV-Integrin zeigte bei 10 mJ/cm2 konstante Werte (76,7%),

schwächte sich aber bei UVB-Dosen von 20 mJ/cm2 auf 50,2% deutlich ab.

Das Ausgangsniveau der Expression von β3-Integrin war sehr niedrig (33,1%). Die

Expression ging unter UVB-Bestrahlung auf 11,7% (20 mJ/cm2) zurück.

3.1.2 Integrinexpression unter Einfluss von Zell-Matrix-Kontakt

Um die Adhäsion an EZM-Moleküle, die Melanozyten in vivo aufweisen, zu simulieren

und einen eventuellen Einfluss dieser Adhäsion auf die Integrinexpression zu

überprüfen, wurden die in 3.1.1 geschilderten Experimente parallel auf EZM-

beschichteten Kulturschalen durchgeführt.

Die Änderung der Expression der untersuchten Integrinuntereinheiten auf

unterschiedlichen EZM-Beschichtungen ist in Tabelle 5 (s. Anhang) und in den

Abbildungen 5-7 dargestellt. Der Kontakt zu extrazellulären Matrixmolekülen führte bei

unbestrahlten Melanozyten zu keiner signifikanten Änderung der Expression von

Adhäsionsmolekülen im Vergleich zu unbeschichtet kultivierten Melanozyten (Tab. 4

und 5 [s. Anhang]).

Insgesamt kam es auch auf beschichteten Kulturplatten nach UVB-Bestrahlung mit

einer Dosis von 20 mJ/cm2 bei allen untersuchten Integrinen zu einem tendenziellen

Rückgang der Expression. Der Rückgang der Expression von α2-Integrin war bei 20

mJ/cm2 auf Laminin-1- und Kollagen Typ IV-Beschichtung im Vergleich zu den

Versuchen ohne Beschichtung bei gleicher UVB-Dosis (20 mJ/cm2) geringer

ausgeprägt. So fiel die Expression nur auf 64,5% für Laminin-1, bzw. auf 62,9% für

Kollagen Typ IV.

Der Rückgang der Expression von α3-Integrin war bei 20 mJ/cm2 auf Laminin-1-

Beschichtung im Vergleich zu den Versuchen ohne Beschichtung bei gleicher UVB-

Dosis (20 mJ/cm2) stärker ausgeprägt. Die Expression lag bei durchschnittlich 71,2%.

α5-Integrin zeigte auf Fibronektin-Beschichtung einen nahezu identischen Rückgang

der Expression wie bei den Versuchen ohne Beschichtung.

α6-Integrin zeigte auf Laminin-1-Beschichtung einen signifikanten Rückgang der

Expression nach UVB-Bestrahlung mit einer Dosis von 20 mJ/cm2. Die entsprechenden

Experimente für α6-Integrin sind im nächsten Abschnitt (3.1.3) mit genaueren Angaben

zur Kinetik beschrieben.

Ergebnisse

26

Die Expression für αV-Integrin blieb bei den Messungen auf Fibronektin unter UVB-

Bestrahlung konstant, lag im Vergleich zu den Messungen ohne Beschichtung bei

einer UVB-Dosis von 20 mJ/cm2 aber deutlich niedriger.

β1-Integrin hat in vivo Kontakt zu Laminin-1, Kollagen Typ IV und in bestimmten

Situationen auch zu Fibronektin. In meinen Messungen zeigte sich für β1-Integrin bei

Beschichtung mit diesen EZM-Molekülen keine Herunterregulation der Expression

nach UVB-Bestrahlung (20 mJ/cm2). In Voruntersuchungen unserer Arbeitsgruppe

ohne Beschichtung hatte sich für β1-Integrin ebenfalls eine unter UVB-Bestrahlung

unveränderte Expression gezeigt.

Der Rückgang der Expression von β3-Integrin war bei 20 mJ/cm2 auf Fibronektin-

Beschichtung im Vergleich zu den Versuchen ohne Beschichtung bei gleicher UVB-

Dosis (20 mJ/cm2) geringer ausgeprägt.

0

20

40

60

80

100

Laminin-1 Unbestrahlt

Laminin-1 UVB 20 mJ/cm²

Unbeschichtet 20 mJ/cm²

α 2 α 3 β 1α 6Integrine

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

Abbildung 5. Expression von Integrinuntereinheiten auf unbestrahlten und bestrahlten Melanozyten (Laminin-1-Beschichtung, 24 h p.i.). Zum

Vergleich unbeschichtete Melanozyten (20 mJ/cm2). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

*

*signifikant (p < 0,05) gegenüber unbestrahlten Melanozyten (Laminin-1-Beschichtung)

Ergebnisse

27

0

20

40

60

80

100

Kollagen IV Unbestrahlt

Kollagen IV UVB 20 mJ/cm²


α 2

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

β 1Integrine

Abbildung 6. Expression von Integrinuntereinheiten auf unbestrahlten und bestrahlten Melanozyten (Kollagen Typ IV-Beschichtung, 24 h p.i.). Zum Vergleich

unbeschichtete Melanozyten (20 mJ/cm2). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

0

20

40

60

80

100

Fibronektin Unbestrahlt

Fibronektin UVB 20 mJ/cm²


α 5 α V β 1 β 3

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

Integrine

Abbildung 7. Expression von Integrinuntereinheiten auf unbestrahlten und bestrahlten Melanozyten (Fibronektin-Beschichtung, 24 h p.i.). Zum Vergleich

unbeschichtete Melanozyten (20 mJ/cm2). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

Ergebnisse

28

3.1.3 Kinetik der α6-Integrin-Expression

Da der Einfluss der Basalmembran auf die Zellhomöostase von Melanozyten

Gegenstand meines besonderen Interesses war und aufgrund von Voruntersuchungen

der Arbeitsgruppe davon auszugehen war, dass die Interaktion zwischen α6-Integrin

und Laminin-1 einen Einfluss auf die UVB-Empfindlichkeit der Melanozyten haben

könnte, wendete ich mich gezielt der weiteren Ausarbeitung dieses Zusammenhanges

zu. Hierzu wurde der zeitliche Verlauf der α6-Integrinexpression in Abhängigkeit von

einer Laminin-1-Beschichtung gemessen.

In den Abbildungen 8 und 9 sowie in der Tabelle 6 (s. Anhang) ist die α6-

Integrinexpression für bestrahlte versus unbestrahlte Melanozyten dargestellt. Die

Abbildung 8 zeigt die α6-Integrinexpression nach unterschiedlichen Zeitintervallen (24,

48, 72 h p.i.) und UVB-Dosen (0, 10, 20 mJ/cm2) ohne Beschichtung. Die Ergebnisse

zeigen, dass die UVB-induzierte Herunterregulation der α6-Integrinuntereinheit

dosisabhängig und reversibel ist. 24 h nach Bestrahlung mit UVB 10 mJ/cm2 war die

Expression von α6-Integrin im Vergleich zu unbestrahlten Kontrollen signifikant

herunterreguliert (mittlere Expression 74,87%, n = 3, SD ± 3,25%). Dieser Effekt war

nach 48 bzw. 72 h nicht mehr vorhanden, die Expression normalisierte sich. UVB-

Dosen von 20 mJ/cm2 führten zu einer stärkeren, zu jedem der drei Messzeitpunkte

signifikanten Herunterregulation von α6-Integrin, die erst nach 72h nachließ.

Ich führte die Messungen zum zeitlichen Verlauf der Expression von α6-Integrin

parallel mit Laminin-1-Beschichtung durch (Abb. 9). Insgesamt zeigte sich ebenfalls

eine Abschwächung der Expression, jedoch nicht so deutlich wie bei den Versuchen

ohne Beschichtung.

Ergebnisse

29

0

20

40

60

80

100

Zeit nach Bestrahlung

unbestrahlt

UVB 10 mJ/cm²

UVB 20 mJ/cm²

24h 48h 72h

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

Abb.8. Zeitlicher Verlauf der Expression von α6-Integrin nach UVB-Bestrahlung. Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

*

* *

*

* signifikant (p < 0,05) gegenüber unbestrahlten Melanozyten

0

20

40

60

80

100


unbestrahlt

UVB 10mJ/cm²

UVB 20mJ/cm²

24h 48h 72h

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

Abb.9. Einfluss unterschiedlicher UVB-Dosen auf die Expression von α6-Integrin unter Laminin-1-Beschichtung. Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

*

**

*


Ergebnisse

30

In den Abbildungen 10 und 11 ist der Effekt der Laminin-Beschichtungen in direktem

Vergleich zu den unbeschichteten Kulturen erkennbar.

0

20

40

60

80

100


unbeschichtet

Laminin-1

24 h 48 h 72 h

Abb.10. Zeitlicher Verlauf der Expression von α6-Integrin (UVB; 10 mJ/cm2, 24 - 72 h p.i.). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

0

20

40

60

80

100


unbeschichtet

Laminin-1

24 h 72 h

Abb.11. Zeitlicher Verlauf der Expression von α6-Integrin (UVB; 20

mJ/cm2, 24 - 72 h p.i.). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).

Exp

ress

ion

[% d

er p

ositi

ven

Zel

len]

48 h

Ergebnisse

31

3.1.4 Einfluss des Radikalfängers Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) auf die

Expression von α6-Integrin

Um einen eventuellen Einfluss von durch UVB-Bestrahlung freigesetzten

Sauerstoffradikalen auf die α6-Integrinexpression auszuschließen, wurde die

Expression mit bzw. ohne Zusatz eines Radikalfängers vergleichend gemessen (Tab. 7

[s. Anhang]). Die Expression von α6-Integrin lag bei beiden Variablen ohne

Bestrahlung jeweils gleich hoch bei 90,4% bzw. 90,5%. Die mit einer UVB-Dosis von

20 mJ/cm2 bestrahlten Melanozyten zeigten 24 h p.i. eine Expression von 57,5%. Die

zusätzlich mit dem Radikalfänger PDTC inkubierten Melanozyten zeigten eine etwas

geringere Expression des Adhäsionsmoleküls von 48,4%, der Unterschied war

statistisch nicht signifikant.

3.2 Durchflusszytometrische Messung der Apoptoserate

Ausgehend von der Annahme, dass die integrinvermittelte Adhäsion an EZM-

Molekülen die Empfindlichkeit gegenüber UV-induzierter Apoptose beeinflusst,

untersuchte ich nun, inwiefern sich der Anteil von Zellen in frühen bzw. späten

Apoptosestadien sowie der Anteil nekrotischer Zellen unter Einfluss von UVB-

Bestrahlung und verschiedenen EZM-Beschichtungen ändert. Hierzu wurde das

Annexin-V-Kit (Bender Med. Systems, Wien, Österreich) eingesetzt.

Um die Ergebnisse des vorhergehenden Abschnitts außerdem auf ihre Spezifität für

die melanozytäre Zellreihe bzw. für Melanozyten von hellhäutigen Individuen zu

untersuchen, wurden die gleichen Experimente mit Keratinozyten aus der Vorhaut

eines kaukasischen Individuums und mit Primärkulturen von negroiden Melanozyten

aus der Vorhaut eines 2 ½-jährigen afrikanischen Kindes (Hauttyp VI nach Fitzpatrick;

im folgenden 2,5N genannt) durchgeführt.

3.2.1 UVB-induzierte Apoptose auf unterschiedlichen EZM-Beschichtungen

Insgesamt zeigte sich bei allen Melanozyten, unabhängig von der jeweiligen EZM-

Beschichtung, ein Anstieg der Apoptoserate in Abhängigkeit von der UVB-Dosis (Abb.

12 und 13; Tab. 8 und 9 [s. Anhang]). Bei den unterschiedlichen Beschichtungen

zeigten die auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten die geringste

Apoptoseempfindlichlichkeit, stärker war sie bei auf Fibronektin und Kollagen Typ IV

gewachsenen Melanozyten. Der Anteil nekrotischer Zellen stieg nach UVB-Bestrahlung

Ergebnisse

32

für auf Fibronektin und Kollagen Typ IV gewachsenen Melanozyten an, blieb aber für

unbeschichtet kultivierte, „negroide“ Melanozyten und für Keratinozyten in etwa

konstant (Abb. 14). Der Anteil vitaler Zellen fiel bei auf Fibronektin und Kollagen Typ IV

gewachsenen Melanozyten nach UVB-Bestrahlung signifikant ab, blieb aber für die

anderen Zellpopulationen (unbeschichtet, „negroid“, Keratinozyten) in etwa konstant

(Abb. 15). Den größten Anteil vitaler Zellen zeigten die auf Laminin-1 kultivierten

Melanozyten. Die Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4, [s. Tab.2])

lag nach UVB-Bestrahlung bei auf Laminin-1 kultivierten Melanozyten deutlich unter

der Apoptoserate der auf Fibronektin und Kollagen Typ IV gewachsenen Zellen.

0

10

20

30

UVB-Dosis

unbeschichtet (1,5K MZ)

Laminin-1 (1,5K MZ)

Fibronektin-1 (1,5K MZ)

Kollagen IV (1,5K MZ)

2,5N

Keratinozyten

Abb.12. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf UVB-induzierte Apoptose bei Melanozyten. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.

unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2

Ant

eil d

er fr

üh-a

popt

otis

chen

Zel

len

[%]

*

*

*

*

* signifikant ( p< 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis (Fibronektin und Kollagen IV mit einer UVB-

Dosis von 10 mJ/cm2 versus unbestrahlt bzw. 20 mJ/cm2 vs. 10 mJ/cm2)

Ergebnisse

33

0

5

10

15

20

25

30

UVB-Dosis

unbeschichtet (1,5K MZ)Laminin-1 (1,5K MZ)

Fibronektin (1,5K MZ)Kollagen IV (1,5K MZ)

2,5NKeratinozyten


Ant

eil d

er s

pät-

apop

totis

chen

Zel

len

[%]

Abb.13. Anteil FITC+, PI+ Zellen (entspricht späten Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf UVB-induzierte späte Apoptose bei Melanozyten. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

UVB-Dosis

unbeschichtet (1,5K MZ)

Laminin-1 (1,5K MZ)

Fibronektin (1,5K MZ)Kollagen IV (1,5K MZ)

2,5N

Keratinozyten

Abb.14. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf UVB-induzierte Nekrose bei Melanozyten. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.


Ant

eil d

er n

ekro

tisch

en Z

elle

n [%

] *

* signifikant ( p< 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis (Fibronektin mit einer UVB-Dosis von 20

mJ/cm2 vs. 10 mJ/cm2)

Ergebnisse

34

0

20

40

60

80

100

UVB-Dosis

unbeschichtetLaminin-1 (1,5K MZ)Fibronektin (1,5K MZ)Kollagen IV (1,5K MZ)2,5NKeratinozyten

Abb.15. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.


Ant

eil d

er v

itale

n Z

elle

n [%

]

**

* signifikant ( p< 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis ( für Kollagen IV Messung vs. unbestrahlte

Melanozyten, für Fibronektin Messung vs. 10 mJ/cm2)

UVB-Dosis \ EZM unbeschichtet Laminin-1 Fibronektin Kollagen IV

0 mJ/cm² 18,37% 3,86% 7,76% 20,71% 10 mJ/cm² 15,43% 10,35% 18,87% 36,80% 20 mJ/cm² 27,90% 24,50% 43,90% 47,20%

Tabelle 2. Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4 in Tab. 8 und 9 [s.Anhang]) der

kaukasischen Melanozyten nach UVB-Dosen von 10 mJ/cm² und 20 mJ/cm² für verschiedene EZM-

Bestandteile. Zum Vergleich unbeschichtet kultivierte Melanozyten.

Ergebnisse

35

3.2.2 UVB-induzierte Apoptose bei Beschichtung mit Laminin-1 in unterschiedlicher

Konzentration

Um den Einfluss der Konzentration der Beschichtung mit Laminin-1 zu untersuchen,

wurden zusätzlich Experimente mit einer Lamininkonzentrationen von 2 µg/ml

durchgeführt. Als Kontrolle dienten unbeschichtet kultivierte Melanozyten (Abb. 16-19;

Tab. 9 [s. Anhang]).

Die unbestrahlten Zellen zeigten nur geringfügige Abweichungen in Apoptoserate,

Nekrose und Vitalität. Insgesamt zeigte sich für beide Lamininkonzentrationen bei allen

UVB-Dosen (10, 15, 20 mJ/cm2) stets eine höhere Zellvitalität im Vergleich mit den

unbeschichteten Kontrollen (Abb. 19). Die Nekroserate der unbeschichtet kultivierten

Zellen lag außer im Bereich der UVB-Dosis von 20 mJ/cm2 durchgehend über der von

auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten (Abb. 18). Nach UVB-Bestrahlung waren die

frühe und die späte Apoptoserate für die niedrige Laminin-Konzentration stets niedriger

als bei Melanozyten ohne Beschichtung. Die höhere Laminin-Konzentration ergab bei

der frühen Apoptoserate keine eindeutigen Ergebnisse, bei der späten Apoptoserate

lag sie außer bei einer UVB-Dosis von 20mJ/cm2 stets unter der Vergleichspopulation

ohne Beschichtung (Abb. 16, 17).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1 (2 µg/ml)


Abb.16. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf UVB-induzierte frühe Apoptose.

unbestrahlt 10 mJ/cm2 15 mJ/cm2 20 mJ/cm2

Ant

eil d

er fr

üh-a

popt

otis

chen

Zel

len

[%]

Ergebnisse

36

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

UVB-Dosis

unbeschichtet




Abb.17. Anteil FITC+, PI+ Zellen (entspricht späten Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf UVB-induzierte späte Apoptose.

Ant

eil d

er s

pät-

apop

totis

chen

Zel

len

[%]

0

2

4

6

8

10

12

UVB-Dosis

unbeschichtet



Abb.18. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf UVB-induzierte Nekrose.

unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm215 mJ/cm2

Ant

eil d

er n

ekro

tisch

en Z

elle

n [%

]

Ergebnisse

37

0

20

40

60

80

100

UVB-Dosis

unbeschichtet



Abb.19. Anteil FITC-, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf die Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung.


Ant

eil d

er v

itale

n Z

elle

n [%

]

3.2.3 UVB-induzierte Apoptose nach Zugabe eines Antikörpers gegen α6-Integrin

Es sollte nun ermittelt werden, ob der bei Laminin-1-Beschichtung beobachtete UV-

protektive Effekt durch Bindung an α6-Integrin vermittelt wird. Hierzu wurde ein

inhibitorisch wirksamer Antikörper gegen α6-Integrin eingesetzt. Melanozytenkulturen

ohne Beschichtung wurden als dritte Vergleichspopulation mitgeführt. Die Messungen

erfolgten nach 24 und 48 h (Abb. 20-23, 24-27). Blieben die drei Populationen

unbestrahlt, waren kaum Unterschiede für Vitalität, Nekrose und Apoptoserate

messbar (Tabelle 10 [s. Anhang]).

Bei einer UVB-Bestrahlung von 10 mJ/cm2 zeigten sich nach 24 h signifikante

Unterschiede zwischen den auf Laminin-1 gewachsenen nicht blockierten und den

durch den Antikörper gegen α6-Integrin blockierten Melanozyten. Sowohl die Rate

früh- und spät-apoptotischer Zellen als auch der Anteil nekrotischer Zellen waren bei

den Melanozyten ohne α6-Integrin-Inhibition signifikant geringer (Abb. 20-22), die

Zellvitalität hingegen signifikant höher (Abb.23) als bei den mit dem α6-Integrin-

Antikörper blockierten Zellen. Bei einer UVB-Bestrahlung von 20 mJ/cm2 zeigten sich

analoge Effekte.

Ergebnisse

38

0

2

4

6

8

10

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1 + a6-block.mAb

Abb.20. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte frühe Apoptose.


Ant

eil d

er fr

üh-a

popt

otis

chen

Zel

len

[%]

* *

* signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1-kultivierte Melanozyten

0

5

10

15

20

25

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1 + a6-block.mAb

unbestrahlt 10 mJ/cm220 mJ/cm2

Ant

eil d

er s

pät-

apop

totis

chen

Zel

len

[%]

Abb.21. Anteil FITC+, PI+ Zellen (entspricht späten Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte späte Apoptose.

*1

*2

*1

*1 signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten

*2 signifikant ( p< 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten

Ergebnisse

39

0

2

4

6

8

10

12

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1+ a6-block.mAb


Abb.22. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss von Laminin-1mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf die UVB-induzierte Nekrose.

Ant

eil d

er n

ekro

tisch

en Z

elle

n [%

]

*1

*2

*1

*2

*1 signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten *2 signifikant ( p< 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten

20

40

60

80

100

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1 + a6-block.mAb


Abb.23. Anteil FITC-, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen). Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf die Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung.

Ant

eil d

er v

itale

n Z

elle

n [%

]

*1*1

*2

*1 signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten

*2 signifikant ( p< 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten

Ergebnisse

40

Eine weitere Messung erfolgte 48 h nach UVB-Bestrahlung (Abb. 24-27). Insgesamt

zeigte sich die durch den Antikörper gegen α6-Integrin induzierbare Erhöhung der

Apoptoseempfindlichkeit hier nicht mehr so deutlich.

Die unbestrahlten Zellen zeigten zu diesem Zeitpunkt kaum Unterschiede (Tab 11 [s.

Anhang]). Die auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten zeigten eine durchgehend

niedrigere Apoptoserate als die durch den Antikörper blockierten Melanozyten (Abb.

24-27), aber die Zellvitalität der auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten lag nur bei

20 mJ/cm2 UVB über der Vergleichskultur (Abb.27). Gleiches gilt für die Nekroserate

(Abb.26).

0

5

10

15

20

25

30

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1 + a6-block.mAb


Ant

eil d

er fr

üh-a

popt

otis

chen

Zel

len

[%]

Abb.24. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte frühe Apoptose.

Ergebnisse

41

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1 + a6-block.mAb


Ant

eil d

er s

pät-

apop

totis

chen

Zel

len

[%]

Abb.25. Anteil FITC+, PI+ Melanozyten (entspricht späten Apoptosestadien) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte Apoptose.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1 + a6-block.mAb

Abb.26. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte Nekrose.


Ant

eil d

er n

ekro

tisch

en Z

elle

n[%

]

Ergebnisse

42

0

20

40

60

80

100

UVB-Dosis

unbeschichtet

Laminin-1

LM-1 + a6-block.mAb

Abb.27. Anteil FITC-, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf die Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung.


Ant

eil d

er v

itale

n Z

elle

n [%

]

3.3 Mikroskopische Untersuchungen

Schließlich interessierte mich, wie die im ersten Teil der Experimente beobachtete UV-

induzierte Herunterregulation der α6-Integrinuntereinheit, der nach den Ergebnissen im

zweiten Teil möglicherweise eine Bedeutung für die Apoptoseempfindlichkeit der

Melanozyten zukommt, sich auf (sub-)zellulärer Ebene mit einem Konfokalmikroskop

darstellt.

Hierzu wurden Melanozyten auf zweikammerigen Chamber-Slides ausgesät. Nach UV-

Bestrahlung und Inkubation mit Antikörpern gegen α3- bzw. α6-Integrin wurden die

Zellen mit einem Sekundärantikörper markiert und mikroskopisch untersucht.

Es zeigte sich, dass unbestrahlte Melanozyten, die als Kontrolle mitgeführt wurden,

eine regelmäßige Verteilung von α3- bzw. α6-Integrin auf der Zelloberfläche aufwiesen

(Abb. 28 und 32). 24 Stunden nach UV-Bestrahlung war dagegen eine

zytoplasmatische Lokalisation der α6-Integrin positiven Granula erkennbar (Abb. 29

und 31), α3-Integrin positive Granula ließen sich nicht identifizieren (Abb. 33). Auf der

Zellmembran bestand lediglich eine schwache Restfluoreszenz gegen α6-Integrin

(Abb. 30).

Ergebnisse

43

Abb. 28. Immunfluoreszenz mit einem Antikörper gegen α6-Integrin. Unbestrahlte Melanozyten zeigen

eine relativ gleichmäßig und fein verteilte a6-Integrinexpression auf der Zellmembran.

Abb. 29. 24 h nach UVB-Bestrahlung mit 20 mJ/cm2 ist die membranöse a6-Integrin-Reaktivität

vermindert. Dagegen sieht man intensiv markierte zytoplasmatische Granula (Pfeile).

Ergebnisse

44

Abb. 30. Optische Schnitte (Dicke: 0,9 µm) durch die bestrahlten Zellen zeigen, dass auf der Ebene der

basalen Zellmembran lediglich eine schwache Restfluoreszenz besteht.

Abb. 31. Schnitte in der Ebene des Nukleus und des perinukleären Zytoplasmas derselben Zellen zeigen

die intrazelluläre, zytoplasmatische Lokalisation der α6-Integrin positiven Granula (Pfeile).

Ergebnisse

45

Abb. 32. Immunfluoreszenz mit einem Antikörper gegen α3-Integrin. Die unbestrahlten Melanozyten

zeigen eine gleichmäßig und fein verteilte α3-Immunfluoreszenz auf der Zellmembran.

Abb. 33. 24 h nach UVB-Bestrahlung (20 mJ/cm2) lässt sich weiterhin eine gleichmäßige Fluoreszenz des

Antikörpers gegen α3-Integrin erkennen. Intrazelluläre Granula lassen sich nicht identifizieren.

Diskussion

46

4 Diskussion

4.1 Melanozytäre Integrinexpression

4.1.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die Expression melanozytärer

Adhäsionsmoleküle

Es gibt bislang keine systematischen Untersuchungen zu der Frage, wie sich

Melanozyten unter UVB-Bestrahlung in Bezug auf die Expression von

Adhäsionsmolekülen verhalten. Die Wahl eines geeigneten Untersuchungsmodells ist

für diese Fragestellung von besonderer Bedeutung, da man weiß, dass sich

Melanozyten in vitro in vielerlei Hinsicht, so auch in der Expression von

Adhäsionsmolekülen, von Melanozyten in vivo unterscheiden. Das in vielen

Kulturmedien enthaltene chemische Mitogen 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-azetat

(TPA) induziert eine Proliferation der Melanozyten, wohingegen in Abwesenheit von

TPA eine stärkere Differenzierung der Melanozyten resultiert. Danen et al. (1996)

beobachteten bei Benutzung eines TPA-freien Kulturmediums eine höhere Expression

von α6-Integrin. Um Kulturbedingungen zu schaffen, die der Situation in vivo näher

kommen, habe ich deshalb Phorbolester-freies Kulturmedium verwendet. Somit sind

die Änderungen der Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle in meinen

Versuchsreihen nicht auf chemische Mitogene zurückzuführen, sondern ausschließlich

durch UV-Licht und EZM-Bestandteile induziert. Ferner nutzte ich in meinen Versuchen

ausschließlich UVB-Licht, da bekannt ist, dass dieser Wellenlängenbereich besonders

starke biologische Effekte in der Haut hervorruft (Kadekaro et al., 2003). Sonnenlicht

wird in vivo von der Haut reflektiert oder in der Epidermis teilweise absorbiert wird. Die

Zellen wurden daher in vitro einer etwas geringeren Strahlungsdosis ausgesetzt als der

durchschnittlichen minimalen Erythemdosis kaukasischer Probanden (15 – 100

mJ/cm2).

Schon in früheren Studien wurden die Veränderungen der Expression einiger

Adhäsionsmoleküle nach UVB-Exposition in vitro untersucht. Nakazawa et al. (1995)

konnten in Melanozytenmonokulturen keine Veränderung der Expression von E-

Cadherin feststellen. Andere Autoren beobachteten dagegen eine leichte Reduktion

der E-Cadherinexpression (Seline et al., 1996). Die UV-induzierte Produktion des

Wachstumsfaktors Endothelin-1 durch Keratinozyten führt zu einer Herunterregulation

von E-Cadherin auf Melanozyten (Jamal und Schneider, 2002). Immunzytochemisch

Diskussion

47

konnte in anderen Untersuchungen ein leichter Anstieg von α5β1- und αVβ3-Integrin

nach UVB-Bestrahlung gezeigt werden (Neitmann et al., 1999). Dieser Anstieg ließ

sich durchflusszytometrisch allerdings nicht messen. Immunhistologische

Untersuchungen von Tronnier et al. (1997) zeigten einen Anstieg von α3-, α6-, β1- und

in geringem Maß auch α2-Integrin in der Epidermis nach Bestrahlung mit UVB-Licht;

diese Ergebnisse erlauben für Melanozyten jedoch keine Aussage, da sich deren

Immunreaktivität von der der umgebenden Keratinozyten nicht sicher abgrenzen lässt.

Es ist zu beachten, dass die Melanozyten in den zitierten Studien unterschiedlichen

UVB-Dosen zwischen 2,5 mJ/cm2 und 30 mJ/cm2 ausgesetzt waren, die neben der

oben erwähnten Zusammensetzung des Kulturmediums ebenfalls eine je nach

Arbeitsgruppe unterschiedliche Ansicht der Zelltoleranz widerspiegeln.

In den vorliegenden Untersuchungen an humanen Melanozytenkulturen konnte ich

nach UVB-Bestrahlung eine Veränderung der Expression verschiedener Integrine

messen (s. 3.1.1, Abb.4). Die durchflusszytometrisch gemessene Immunreaktivität

entspricht ännähernd der Expression der Adhäsionsmoleküle der melanozytären

Zellmembran. Die Höhe der Expression wird durch den Prozentsatz der

immunreaktiven Zellen ausgedrückt. Der Schwellenwert von 2% wurde durch

Negativkontrollen ermittelt (s. 2.3).

Unbestrahlt war die Expression aller gemessenen Integrine durchgehend am höchsten.

Die Expression von α2-Integrin war bei einer UVB-Dosis von 10 mJ/cm2 am

niedrigsten, erreichte bei einer UVB-Dosis von 15 mJ/cm2 einen etwas höheren Wert

und war bei einer UVB-Dosis von 20 mJ/cm2 wieder leicht rückläufig. α3-Integrin zeigte

eine besonders starke Expression, die unter allen UVB-Dosen so gut wie konstant

blieb. α5-Integrin zeigte dagegen eine kontinuierliche, mit der UVB-Dosis korrelierende

Herunterregulation. Die Herunterregulation von α6-Integrin war bei UVB-Dosen von 10

mJ/cm2 und 15 mJ/cm2 am stärksten ausgeprägt. Die Expression von αV-Integrin zeigte

ihren niedrigsten Wert bei einer UVB-Dosis von 15 mJ/cm2, während man bei einer

Dosis von 20 mJ/cm2 erneut einen Anstieg beobachten konnte. Der Einfluss von UVB-

Licht auf die Expression von β1-Integrin wurde von mir nicht gemessen, da

Voruntersuchungen der Arbeitsgruppe hier bereits eine eindeutige Konstanz der

(hohen) Expression gezeigt hatten. Die ohnehin geringe Expression von β3-Integrin fiel

zunächst ab, stieg aber bei UVB-Dosen von 15 mJ/cm2 und 20 mJ/cm2 wieder an.

Insgesamt zeigte sich demnach, dass es im Vergleich zu unbestrahlten Melanozyten

nach UVB-Bestrahlung tendenziell zu einer Herunterregulation der

Integrinuntereinheiten kommt. Die Verminderung der Integrinexpression war für die

Diskussion

48

jeweiligen Integrine zwischen 10-15 mJ/cm2 am deutlichsten erkennbar.

Interessanterweise war die Expression von α3-Integrin vergleichsweise konstant.

Die Ergebnisse weichen von den Ergebnissen von Neitmann et al. (1999) ab.

Allerdings wurde dort mit der Immunzytologie eine für quantitative Aussagen weniger

geeignete Methode gewählt. Ferner könnten Unterschiede in Kulturbedingungen und

UV-Bestrahlung sowie die Verwendung anderer Antikörper die Unterschiede erklären.

Sollte die hier beobachtete tendenzielle Herrunterregulation melanozytärer

Adhäsionsmoleküle in vivo wirksam sein, würde das zu einer abgeschwächten Bindung

der Melanozyten an die EZM führen. Die durch Bestrahlung relativ gering beeinflusste

Expression von α3- und β1-Integrin weist daraufhin, dass die durch α3β1-Integrin

vermittelte Bindung von Melanozyten an Laminin-5-Moleküle der Lamina lucida eine

UV-stabilere Adhäsion darstellt, die möglicherweise die Adhäsion auch bei UV-

Bestrahlung aufrechterhält.

4.1.2 Einfluss extrazellulärer Matrix auf die Expression melanozytärer

Adhäsionsmoleküle nach UVB-Bestrahlung

Um die natürlichen Verhältnisse von Melanozyten näherungsweise zu simulieren,

beschichtete ich die Oberfläche der Kulturplatten mit Bestandteilen der extrazellulären

Matrix. Es ist bekannt, dass diese Bestandteile über Integrine viele Funktionen

epithelialer Zellen beeinflussen. Dabei ist zu beachten, dass die Affinität der Integrine

nicht für jeden dieser Liganden gleich ist (s. Einleitung, Tab. 1). Aus diesem Grund

wählte ich für die einzelnen Integrinuntereinheiten die jeweils relevanten

Beschichtungen (s. 3.1.2).

Epitheliale Zellen exprimieren eine Vielzahl von verschiedenen Adhäsionsmolekülen

auf ihrer Zelloberfläche. Wie diese Integrine in verschiedenen Stadien der epithelialen

Differenzierung und bei Zellantworten auf exogene Signale genutzt werden, ist in

Voruntersuchungen erarbeitet worden. Diese Ergebnisse werden im Folgenden vor der

Darstellung meiner Messergebnisse für die jeweiligen Integrinuntereinheiten kurz

rekapituliert.

α2β1-Integrin vermittelt den Kontakt von Keratinozyten zur epidermalen Basalmembran

(De Luca et al., 1990; Marchisio et al., 1991) sowie die Adhäsion von humanen

Melanozyten an Laminin und Kollagen Typ IV (Mengeaud et al., 1996). Es wurde

gezeigt, dass nach α2-Integrin-vermittelter Haftung von Melanozyten an Laminin und

Kollagen Typ IV eine verstärkte Differenzierung und Dendritenbildung einsetzt (Danen

et al., 1996; Hara et al., 1994). Morelli et al. (1993) konnten demonstrieren, dass die

Diskussion

49

Motilität von Melanozyten auf Kollagen Typ IV durch einen Antikörper gegen α2-

Integrin hemmbar ist. Dieser Effekt war auf Laminin und Fibronektin nicht nachweisbar.

Etoh et al. (1993) zeigten dagegen für Melanomzellen, dass durch α2β1-Integrin eine

durch entsprechende Antikörper blockierbare Migration auf Laminin und Kollagen Typ

IV vermittelt wird. In anderen Arbeiten konnte eine gesteigerte Expression von α2-

Integrin in Zusammenhang mit einer erhöhten Metastasierungspotenz von

Melanomzellen beobachtet werden (Danen et al., 1993).

In meinen Messungen war die UVB-induzierte Herunterregulation von α2-Integrin auf

Laminin-1 etwas geringer ausgeprägt als auf unbeschichteten Kulturoberflächen. Dies

könnte ein möglicher Hinweis auf eine UV-protektive Rolle des

Basalmembrankontaktes sein. Auf Kollagen Typ IV kultivierte Melanozyten zeigten

analog zu den Ergebnissen für Laminin-1 eine Herunterregulation der Expression von

α2-Integrin. Wie oben ausgeführt, vermittelt diese Integrinuntereinheit insbesondere die

Adhäsion der Zellen an Kollagen Typ IV (Danen et al., 1996; Hara et al., 1994). Auch

hier könnte die geringere Herunterregulation einen Hinweis für die UV-protektive Rolle

des Basalmembran-kontaktes darstellen.

Ähnlich wie für α2-Integrin konnte durch Morelli et al. (1993) eine gesteigerte Migration

von Melanozyten auf Kollagen Typ IV auch für α3-Integrin belegt werden. α3β1-Integrin

wurde sowohl auf der basalen als auch auf der lateralen Zellseite von Keratinozyten

gefunden (Carter et al., 1990). Dies lässt vermuten, dass es neben Zell-

Matrixverbindungen auch interzelluläre Adhäsion vermittelt. Bekannt ist, dass α3β1-

Integrin die Adhäsion an Laminin vermittelt (Mengeaud et al., 1996). Bei der Migration

von Melanomzellen auf Laminin und Kollagen scheint α3-Integrin dagegen keine

entscheidende Rolle zu spielen (Etoh et al., 1993).

In meinen Messungen konnte für α3-Integrin, im Gegensatz zur konstanten Expression

auf unbeschichteten Kulturplatten, eine UVB-induzierte Herunterregulation auf Laminin-

1 gezeigt werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Effekt der Beschichtung keineswegs

immer in dieselbe Richtung geht, die Bedeutung der Beobachtung ist jedoch fraglich.

Bei Relevanz in vivo würde der Kontakt zu Laminin-1 im Gegensatz zu den

Ergebnissen für andere Integrine eine erhöhte Empfindlichkeit der Melanozyten

gegenüber UV-Licht bedeuten.

α5β1-Integrin vermittelt die Haftung melanozytärer Zellen an Fibronektin (Mengeaud et

al., 1996) und führt zu inhibierbaren chemotaktischen Effekten (Neitmann et al., 1999).

Obwohl Fibronektin der bevorzugte Bindungspartner ist, konnte auch eine, durch die

Diskussion

50

α5-Integrinuntereinheit vermittelte Migration und Dendritenbildung von Melanozyten auf

Kollagen Typ IV und Laminin beobachtet werden (Hara et al., 1994).

Einen UV-induzierten Anstieg der Expression von α5-Integrin auf Fibronektin, den

Neitmann et al. (1999) immunzytologisch beobachtet hatten, konnte ich nicht

nachweisen. Für dieses Integrin ergab sich vielmehr eine in etwa gleich bleibende

Herunterregulation trotz Fibronektin-Beschichtung und damit kein Hinweis für einen

Einfluss des EZM-Kontaktes auf die UV-Reaktivität.

α6β1-Integrin zeigt eine hohe Affinität zu der Basalmembrankomponente Laminin (Hall

et al., 1990; Sonnenberg et al., 1990). Dabei vermittelt α6-Integrin nach der Bindung an

Laminin verschiedene zelluläre Antworten. So konnte in Anwesenheit von

Wachstumsfaktoren ein stimulatorischer Effekt von Laminin-1 auf die proliferative

Aktivität von Melanozyten gezeigt werden (Mortarini et al., 1995). Dieser Effekt war

durch monoklonale Antikörper gegen α6- und β1-Integrin hemmbar. Auch eine

gesteigerte Zelldifferenzierung und die Ausbildung von Dendriten als Reaktion auf

Laminin- und Kollagen-IV-Kontakt werden durch α6-Integrin vermittelt (Danen et al.,

1996). Dieser Effekt ist für Laminin durch α6-Integrin-Antikörper hemmbar.

Melanomzellen weisen eine durch α6β1-Antikörper hemmbare Bindung an Laminin-1

und Kollagen Typ IV auf (Danen et al., 1993).

In meinen Messungen war die UVB-induzierte Herunterregulation von α6-Integrin auf

Laminin-1 signifikant und geringer ausgeprägt als auf unbeschichteten Kulturplatten.

Da sich durch diese Ergebnisse ein Einfluss von Laminin-1 auf die Expression von α6-

Integrin vermuten ließ, führte ich eine weitere Versuchsreihe durch. Auch die

Messungen zum zeitlichen Verlauf der Expression von α6-Integrin zeigten eine

geringere Herunterregulation auf Laminin-1. Der Effekt war bei einer UVB-Dosis von 20

mJ/cm2 zu allen Messzeitpunkten (24 h, 48 h, 72 h) signifikant gegenüber

unbestrahlten Melanozyten. Dies könnte wiederum ein Hinweis auf eine UV-protektive

Rolle des Basalmembrankontaktes sein.

Die β1-Integrinuntereinheit spielt für Melanozyten als Bestandteil der Integrindimere

α2β1, α3β1, α5β1 und α6β1 eine Rolle (Plow et al., 2000). In diesen Verbindungen

haben β1-Integrine diverse, oben ausgeführte Funktionen. Scott et al. (1997) fanden

u.a. heraus, dass die durch β1-Integrin vermittelte Bindung an Fibronektin Melanozyten

vor dem Eintritt in die Apoptose schützt.

β1-Integrin zeigte in meinen Messungen eine sowohl auf unbeschichteten

(Voruntersuchungen der Arbeitsgruppe, s.o.) als auch auf Laminin-, Kollagen Typ IV-

und Fibronektin-Beschichtung eine gleichmäßige, nach UV-Bestrahlung unveränderte

Diskussion

51

Expression. Hendrix et al. (1998) konnten für Keratinozyten zeigen, dass eine hohe

Expression von β1-Integrin der Zelle antiapoptotische Signale vermittelt, im Gegensatz

dazu niedrige Expressionswerte die Zelle empfindlicher für Apoptose machen. Die

gegenüber exogenen Faktoren (UV-Licht, EZM-Beschichtungen) relativ stabile

Expression des Moleküls legt auch für Melanozyten eine zellprotektive Rolle nahe.

Die αV-Integrinuntereinheit kann mit verschiedenen β-Untereinheiten (β1, β3)

Heterodimere bilden (Van der Flier und Sonneberg, 2001). Das so entstandene Integrin

bindet je nach Zusammensetzung an verschiedene Liganden. αVβ3-Integrin bindet an

Fibronektin (Neitmann et al., 1999), nicht jedoch an Laminin und Kollagen Typ IV (Hara

et al., 1994).

αV-Integrin zeigte in meinen Messreihen nach UVB-Bestrahlung eine konstante, im

Vergleich zu unbeschichteten Kontrollen jedoch deutlich verringerte Expression auf

Fibronektin.

Über β3-Integrin sind bis jetzt nur wenige Ergebnisse bezüglich ihrer Funktion auf

Melanozyten verfügbar. So konnte eine durch α2-, α5- und αVβ3-Integrin geförderte

Bildung von Dendriten auf einer Laminin- und Kollagen Typ IV-Beschichtung

nachgewiesen werden (Hara et al., 1994); des Weiteren wurde eine durch αVβ3-

Integrin verstärkte Haftung von Melanozyten an Fibronektin gemessen (Neitmann et

al., 1999). Andere Untersuchungen weisen daraufhin, dass der Expression von αVβ3-

Integrin bei der Progression des Melanoms eine möglicherweise wichtige Rolle für die

Zell-Matrix-Interaktion zukommt (Li et al., 1998; Natali et al., 1997).

Eine nach UVB-Bestrahlung in etwa gleich bleibende Herunterregulation der

Expression war auch für das ohnehin schwach exprimierte β3-Integrin auf Fibronektin

zu beobachten. Daraus lässt sich folgern, dass der EZM-Kontakt die UV-Sensitivität

der β3-Integrin-Expression nicht beeinflusst.

Zusammengefasst betrachtet zeigten sich in meinen Untersuchungen bei einer UVB-

Dosis von 20 mJ/cm2 die deutlichsten Einflüsse des EZM-Kontaktes auf die Expression

von Integrinen (Abb. 5-7), wobei unbestrahlte Melanozyten unter Einfluss

extrazellulärer Matrixbestandteile bis auf αV-Integrin ein etwas höheres

Ausgangsexpressionsniveau als unbeschichtet gewachsene Melanozyten zeigten. Dies

könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Zellen in ihrem natürlichen Mikromilieu eine

von der in vitro-Situation verschiedene Expression von Adhäsionsmolekülen

aufweisen. Die deutlich verringerte Expression von αV-Integrin bei Beschichtung mit

Fibronektin dagegen weist daraufhin, dass die Präsenz des natürlichen Liganden zu

verminderter Expression dieses in vivo nur gering exprimierten Moleküls führt. Es ist

Diskussion

52

allerdings nicht auszuschließen, dass Unterschiede der Immunreaktivität nach

stattgehabter Bindung des Liganden ein methodisches Artefakt darstellen. Die

verminderte Expression bei Beschichtung wäre dann möglicherweise durch die

Blockade von Antikörperbindungsstellen erklärbar.

4.2 Melanozytäre Apoptoserate

4.2.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die melanozytäre Apoptoserate

Kim et al. (2000) sowie Kadekaro et al. (2003) konnten eine UVB-dosisabhängige

Zunahme der Zelltodrate in Melanozyten zeigen, wobei ähnliche UV-Wellenlängen wie

in meinen Versuchen verwendet wurden. Da ultraviolettes Licht die Bildung von

Sauerstoffradikalen induzieren kann, wurde von mir in einer parallelen Versuchsreihe

der Radikalfänger Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) eine Stunde vor der UVB-

Bestrahlung zu den kultivierten Melanozyten hinzugegeben. Die Herunterregulation

von α6-Integrin trat auch in diesem Experiment, also unabhängig von reaktiven

Sauerstoffspezies auf. Somit kann angenommen werden, dass der

Regulationsmechanismus nicht durch Radikale vermittelt, sondern direkt durch die

UVB-Strahlung auf der Zelloberfläche induziert wird oder einem anderen zellulären

Regulationsmechanismus unterliegt.

Es konnte von anderen Gruppen gezeigt werden, dass Keratinozyten im Vergleich zu

Melanozyten empfindlicher auf UV-Licht reagieren (Bowen et al, 2003; Larsson et al.,

2005). Melanozyten von dunkelhäutigen Individuen waren im Vergleich zu Melanozyten

von Individuen mit hellem Hauttyp („Kaukasier“) in vitro etwas weniger UV-empfindlich

(Barker et al., 1995). Um die Ergebnisse der Apoptoserate von „kaukasischen“

Melanozyten mit anderen Zellpopulationen vergleichen zu können, führte ich „negroide“

Melanozyten und Keratinozyten in den Experimenten mit.

Meine Ergebnisse zeigen einen dosisabhängigen Anstieg des Zelltodes in humanen

Melanozyten (s. 3.2.1, Abb. 12 u. 13). Hierbei war der Anstieg besonders deutlich für

die Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4 [s. Tab. 2]). Die Rate

apoptotischer Zellen (F2 + F4) stieg bei den „kaukasischen“ Melanozyten („1,5K“) von

18% (unbestrahlte Zellen) auf 28 % (20 mJ/cm2, 24 h p.i.). Die Ergebnisse ähneln

denen von Kim et al. (2000). In diesen Versuchen wurde eine insgesamt etwas

niedrigere Apoptoserate von 10% bzw. 21% bei UVB-Dosen von 10 mJ/cm2 bzw. 20

mJ/cm2 gemessen. Diese Unterschiede sind durch unterschiedliche Kultur- und

Bestrahlungsbedingungen zu erklären.

Diskussion

53

Die Messungen für Keratinozyten entsprachen den aus Voruntersuchungen bekannten

Ergebnissen, die eine gegenüber Melanozyten überwiegend erhöhte Vulnerabilität der

Zellen für UV-induzierte Apoptose gezeigt hatten (s.3.2.1, Abb.12 u. 13). Allerdings

fand sich in meinen Messungen keine klare Dosisabhängigkeit. Im Gegensatz zu der

oben zitierten Arbeit (Barker et al., 1995) konnte ich für „negroide“ Melanozyten keine

erhöhte Apoptoseresistenz gegenüber „kaukasischen“ Melanozyten feststellen.

4.2.2 Einfluss von EZM-Bestandteilen auf die melanozytäre Apoptoserate nach UVB-

Bestrahlung

Um zu untersuchen, inwiefern die Bindung von Melanozyten an Bestandteile der

Basalmembran die Empfindlichkeit gegenüber UVB-Licht verändert, führten wir

dieselben Bestrahlungsexperimente nach Beschichtung mit Laminin-1, Fibronektin und

Kollagen Typ IV durch. Scott et al. (1997) konnten zeigen, dass Melanozyten durch

Bindung an Fibronektin wirksam vor Apoptose geschützt werden. Gniadecki et al.

(1997) stellten fest, dass die Blockierung von Integrinen auf Keratinozyten zu einer

gesteigerten Apoptose nach UV-Bestrahlung führte. Meine Messungen zeigten für die

auf Fibronektin und Kollagen Typ IV kultivierten Melanozyten eine deutlich höhere

Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4 [s. Tab. 2]) und eine stärkere

Nekroserate als die ohne Beschichtung und auf Laminin-1 gewachsene Melanozyten

(3.2.1 und 3.2.2). Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Laminin-1 die

Melanozyten vor UV-induzierter Apoptose schützt. Unter dem Einfluss höherer UV-

Dosen kommt es zu einer gestörten Basalmembraninteraktion, die in der Apoptose

mündet. Der Anteil nekrotischer Zellen blieb auch unter höheren UVB-Dosen bei

Beschichtung auf Laminin-1 konstant (Abb. 14 [s. 3.2.1]), was diese Vermutung

zusätzlich stützt. Die Bindung an Laminin könnte somit auch in vivo einen wichtigen

Einfluss auf die Aufrechterhaltung der melanozytären Homöostase ausüben.

In einer weiteren Messreihe untersuchte ich, ob konzentrationsabhängige

Veränderungen der extrazellulären Matrixbestandteile unterschiedlichen Einfluss auf

die melanozytäre Apoptoserate haben. Die Konzentrationen wurden so gewählt, dass

entsprechend vorausgegangenen Studien von einem Sättigungseffekt bei einer

Konzentration von 20 µg/ml Laminin-1 auf die Melanozyten auszugehen war (Neitmann

et al., 1999). Weder eine Konzentration von 2 µg/ml noch eine Konzentration von 20

µg/ml Laminin-1 führten zu signifikanten Änderungen der Apoptoserate im Vergleich zu

unbeschichtet kultivierten Melanozyten.

Diskussion

54

4.2.3 Einfluss eines blockierenden Antikörpers gegen α6-Integrin auf die

melanozytäre Apoptoserate nach UVB-Bestrahlung

Durch die nachfolgenden Experimente sollte die funktionelle Relevanz der α6-Integrin-

vermittelten Basalmembraninteraktion für die Apoptoseempfindlichkeit von

Melanozyten überprüft werden. Aufgrund der Tatsache, dass die α6-Integrin-Laminin-

Interaktion in der Literatur für andere Zelltypen (Oligodendrozyten,

Mammaepithelzellen, Fibroblasten) als apoptoseprotektiv beschrieben wurde (Corley et

al., 2001; Farrelly et al., 1999; Lin und Bertics, 1995) und die natürliche Lage der

Melanozyten auf der Basalmembran eine solche Rolle beim Schutz vor UV-induzierter

Apoptose nahe legt, bin ich in den folgenden Untersuchungen einem derartigen

Zusammenhang weiter nachgegangen. Hierzu wurde vor Bestrahlung ein

blockierender Antikörper gegen α6-Integrin zu den frisch auf Laminin-1 ausgesäten

Melanozyten gegeben. Die visuelle Kontrolle (Abb. 34 und 35 [s. Anhang]) zeigte

lichtmikroskopisch ein Maximum der inhibitorischen Aktivität dieses Antikörpers für die

Bindung an Laminin-1 nach ca. 6 h. In der Messreihe zeigten sich 24 h nach UVB-

Bestrahlung signifikante Unterschiede der für 6 h vorinkubierten Melanozyten

gegenüber Kontroll-Melanozyten (s. 3.2.3, Abb. 20-23). So konnte sowohl bei 10

mJ/cm2 als auch bei 20 mJ/cm2 eine signifikant erhöhte Apoptoseempfindlichkeit und

Nekroserate bei den durch den Antikörper gegen α6-Integrin blockierten Melanozyten

gemessen werden. Auch 48 Stunden nach UVB-Bestrahlung konnte die erhöhte

Apoptoseempfindlichkeit tendenziell noch nachgewiesen werden (s. 3.2.3., Abb. 24-

27).

Übertragen auf die Situation in vivo lassen sich die Ergebnisse dahingehend

interpretieren, dass durch Bindung an die Basalmembran die Resistenz der

Melanozyten gegen UV-Licht erhöht wird. Dieser Schutz wird offenbar durch α6-

Integrin vermittelt, vermutlich als Heterodimer in der Verbindung mit β1-Integrin. Ein

solcher Mechanismus konnte bereits für andere Zelltypen gezeigt werden. So konnte

die durch α6- und β1-Integrin-vermittelte Haftung an Laminin in Langzeitkulturen von

Mammaepithelzellen die Apoptose wirkungsvoll unterdrücken (Farrelly et al., 1999;

Weaver et al., 2002). In anderen Arbeiten wurde gezeigt, dass die Haftung von

Oligodendrozyten an Laminin durch α6β1-Integrin der entscheidende Faktor in der

reduzierten Apoptoserate der Zellen ist (Corley et al., 2001). Di Persio et al. (2000)

konnten hingegen keine Induktion von Apoptose durch Blockierung von α3- und α6-

Integrin beobachten.

Diskussion

55

Der Verlust der Haftung von Epithelzellen an EZM-Bestandteile führt zur Anoikis, einer

speziellen Form der Apoptose (Frisch und Ruoslahti, 1997). Sowohl gesunde als auch

neoplastische Epithelzellen der Brustdrüse werden durch integrinvermittelte Bindung

an die Basalmembran resistent gegenüber proapoptotischen Stimuli (Weaver et al.,

2002). Speziell die α6-Integrin-Lamininbindung konnte in verschiedenen Zelltypen als

antiapoptotischer Mechanismus identifiziert werden. So vermittelt die α6-Integrin-

Lamininbindung in Fibroblasten das Überleben der Zelle und die Motiltität (Lin und

Bertics, 1995). Darüber hinaus stellt die α6-Integrin-Lamininbindung einen zentralen

antiapoptotischen Mechanismus in hepatozellulären und pankreatischen Karzinomen

dar (Nejiari et al., 1999; Sawai et al., 2003).

Interessanterweise reduzierte die Laminin-Bindung in meinen Experimenten nicht nur

die Apoptoseempfindlichkeit, sondern auch die UVB-induzierte Herunterregulation von

α6-Integrin (3.1.3, Abb. 10 und 11). Diese beiden gegensätzlichen Mechanismen

könnten eine über den Basalmembrankontakt fein regulierte Balance zwischen

Überleben und Apoptose der Melanozyten unter solarer Strahlung darstellen.

4.3 Regulation der Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle auf

zellulärer Ebene nach UVB-Bestrahlung

Die mögliche Rolle von α6-Integrin bei der Veränderung der UVB-Empfindlichkeit von

Melanozyten warf die Frage auf, welchem Mechanismus die UVB-induzierte

Herunterregulation dieser Integrinuntereinheit unterliegt. Es ist bekannt, dass Integrine

durch Endozytose in das Zytoplasma aufgenommen werden können. Durch diesen

Vorgang können sowohl Einflüsse auf zelluläre Adhäsion und Migration, als auch auf

Proliferation und Differenzierung ausgeübt werden.

So beobachteten Salicioni et al. (2004) und Poumay et al. (1993) eine Aufnahme von

β-Integrinuntereinheiten in das Zellinnere über Zellmembranproteine. Dieser Prozess

scheint eine kritische Rolle während der Zellmigration zu spielen. An der Zellseite, die

nicht in Bewegungsrichtung liegt, werden Integrine internalisiert, um an der Vorderseite

der Zelle wieder in die Zellmembran eingefügt zu werden (Powelka und Sun, 2004). In

weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, dass das Zellmembranprotein Tetraspanin

(CD82) mit α6-Integrin eine feste Verbindung eingeht, die via Internalisierung zur

verminderten Expression dieses Integrins an der Zelloberfläche führt. Daraus resultiert

eine verminderte Adhäsion an Laminin und eine Veränderung der Zellform (He et al.,

2005). Die Internalisierung des aus der Familie der Integrine stammenden LFA-1

Diskussion

56

(lymphocyte-function-associated antigen-1), auch als αLβ2-Integrin bezeichnet, scheint

der entscheidende Schritt in der Loslösung der Zellen von ihrem Untergrund zu sein.

Zellen, bei denen Punktmutationen im Gen dieses Integrins induziert wurden, waren

unfähig, dieses zu internalisieren. Bei der Zellmigration konnte man im Folgenden eine

ungewöhnliche Streckung der Zellform beobachten, die aus der schwer gestörten

Ablösung der Zellhinterseite von Polystyrolplatten resultierte (Tohyama et al., 2003).

Strachan und Condic (2004) beobachteten, dass die Internalisierung von Integrinen

von der Beschichtung abhängig ist, auf der die Zellen wachsen. So konnte auf Laminin

eine stärkere Aufnahme der Rezeptoren ins Zellinnere beobachtet werden als auf

Fibronektin.

Die Fähigkeit epithelialer Zellen, verschiedene Integrine auf der Oberfläche zu

exprimieren, könnte eine große Rolle während der Ontogenese und Regeneration von

Epithelien spielen. Der Mechanismus, mittels dessen durch Integrine ausgebildete

Zellkontakte unterbrochen werden und anschließend diese Adhäsionsmoleküle an

anderer Stelle der Zelloberfläche erneut exprimiert werden, ist unklar. Die

Rezeptorendozytose könnte eine mögliche Erklärung bieten.

Durch neuere Arbeiten scheint sich zu bestätigen, dass Veränderungen der

Integrinkonformation ebenfalls eine wichtige Rolle bei zellulärer Differenzierung und

Proliferation spielen. Die Bildung von Integrinclustern, die sich zu fokalen

Adhäsionsstellen formieren, ist detailliert untersucht worden. Sie scheinen an der

Signaltransduktion durch Bindung an zytoskelettale Verbindungsproteine und

nachfolgender Aktivierung der MAP (mitogen activated protein)-Kinase beteiligt zu sein

(Juliano und Haskill, 1993; Miyamoto et al., 1995). Integrine scheinen zudem mit

Tetraspaninen auf der Zelloberfläche assoziiert zu sein (s.o.). Diese Familie von

Zellmembranmolekülen induziert, neben der oben beschriebenen Internalisierung,

auch Signalwege durch Zusammenlagerung von Membranmolekülen in große

molekulare Komplexe. CD151 und CD36, Mitglieder der Tetraspaninfamilie, sind

spezifisch mit Laminin bindenden Integrinen assoziiert (Sterk et al., 2002; Thorne et al.,

2000). α3β1-Integrin scheint durch Komplexbildung mit Tetraspaninmolekülen an

Mechanismen, die die Apoptose und die Wundheilung regeln, beteiligt zu sein (Tsuji,

2004).

Die Zusammenlagerung von Integrinen in cholesterol- und sphingolipidreichen

Membranmikrodomänen („lipid rafts“) stellt einen alternativen Mechanismus der

Integrin-Umverteilung dar, der ebenfalls die Integrinaktivität reguliert (Leitinger und

Hogg, 2002). So wurde gezeigt, dass in den Membranmikrodomänen lokalisiertes

Diskussion

57

α6β1-Integrin bei Oligodendrozyten das wachstumsfaktorabhängige Überleben dieser

Zellen reguliert (Decker und Ffrench-Constant, 2004). Durch integrinvermittelte

Adhäsion, die die Internalisierung der Membranmikrodomänen verhindert, wird die

Signaltransduktion in haftungsabhängigen Zellen kontrolliert (Del Pozo et al., 2004).

Erst kürzlich wurde die Bildung von α2β1-Integrinclustern beschrieben, die aus lipid

rafts in intrazelluläre Vesikel verlagert werden, die sich aus Invaginationen der

Zellmembran bilden (Upla et al., 2004). Ich konnte mittels konfokaler Mikroskopie

zeigen, dass UVB-Bestrahlung zu einer Internalisierung von α6-Integrin führt. Die bei

unbestrahlten Melanozyten deutlich auf der Zelloberfläche sichtbare Fluoreszenz des

α6-Integrin-Antikörpers verlagerte sich nach UVB-Bestrahlung in das Zellinnere. Dort

lagen die internalisierten Integrine in Form kleiner Vesikel oder Granula vor. Im

Gegensatz dazu war bei Melanozyten, die mit einem fluoreszierenden Antikörper

gegen α3-Integrin angefärbt wurden, auch nach UVB-Bestrahlung keine Veränderung

der Lokalisation dieser Integrine erkennbar. Sie fanden sich weiterhin auf der

Zellmembran. Die Eigenschaft von UV-Licht, direkte stimulatorische Einflüsse auf

Zelloberflächenrezeptoren auszuüben, ist bekannt (Aragane et al., 1998; Kulms et al.,

2002). Ein Einfluss von UV-Licht auf die zelluläre Lokalisation bzw. eine UV-induzierte

Internalisierung von Integrinen wurde bisher noch nicht beschrieben. Es handelt sich

hierbei um einen neuen Mechanismus, dessen funktionelle Bedeutung noch zu klären

ist.

Setzt man voraus, dass vor allem α6β1- und α3β1-Integrin die Adhäsion der

Melanozyten an Laminin in der Basalmembran vermitteln (Zambruno et al., 1993), so

müsste es durch UV-induzierte α6-Integrin-Internalisierung zu einer Abschwächung der

Bindung an die Basalmembran kommen. In meinen Experimenten blieb die Expression

des Laminin bindenden Integrins α3β1 in der Versuchsreihe, die ohne zusätzliche

Beschichtungen durchgeführt wurde, fast unverändert, auf Laminin-1 zeigte sich nach

UV-Bestrahlung nur eine mäßige Herunterregulation dieses Adhäsionsmoleküls (s.

3.1.1 und 3.1.2). In den konfokalmikroskopischen Untersuchungen war

dementsprechend im Gegensatz zu α6-Integrin keine Internalisierung der α3-

Untereinheit nachweisbar.

Dies unterstreicht die Spezifität des beschriebenen UV-Effektes für α6-Integrin. Ob für

andere durchflusszytometrisch nach UVB-Bestrahlung herunterregulierte

Adhäsionsmoleküle, z.B. α2-Integrine, ebenfalls eine Internalisierung nachweisbar ist,

bleibt weiterführenden Untersuchungen vorbehalten. Zusammen mit der oben

beschriebenen, durch α6-Integrin vermittelten apoptoseprotektiven Eigenschaft von

Diskussion

58

Laminin ergibt sich aufgrund unserer Ergebnisse ein wichtiger Einblick in die Rolle von

Adhäsionsmolekülen für die Homöostase von Melanozyten unter Einfluss von UVB-

Licht. Spekulieren lässt sich darüber hinaus, ob die Internalisierung von α6-Integrin, die

die Melanozyten vermutlich durch Lockerung der Laminin-Bindung wiederum

empfindlicher für Apoptose macht, auch einen Schutz vor der Anhäufung UV-bedingter

DNA-Schäden darstellt. Demnach würde via α6-Integrin-Internalisierung ab einer

gewissen UV-Dosis der Untergang der einzelnen Zelle durch Lockerung der

Verankerung auf Laminin vorprogrammiert sein.

Der tatsächliche Einfluss der UV-induzierten α6-Integrin-Internalisierung auf die

Haftung der Melanozyten an Laminin-1 und Laminin-5 muss allerdings in Experimenten

zur Zellhaftung (attachment-assays) weiter untersucht werden. Des Weiteren muss

untersucht werden, ob die Internalisierung des α6-Integrins auf Melanozyten auch in

vivo zu beobachten ist, da in meinen Versuchen zwar die Lebensbedingungen der

Melanozyten möglichst genau simuliert wurden, es sich aber letztlich bislang lediglich

um in vitro-Befunde handelt.

Zusammenfassung

59

5 Zusammenfassung

Integrine sind auf der Zelloberfläche von Melanozyten lokalisiert und vermitteln die

Bindung an Bestandteile der extrazellulären Matrix. Jedes als EZM-Rezeptor dienende

Integrin hat dabei bestimmte Liganden, die es bevorzugt bindet. α6β1-Integrin

vermittelt die Haftung an Laminin-1, einer Komponente der epidermalen

Basalmembran. Durch Haftung an die extrazelluläre Matrix werden integrinvermittelte

Signale in das Zellinnere weitergeleitet. Dabei vermitteln Integrine sowohl proliferative

als auch antiapoptotische Signale. Ich konnte durchflusszytometrisch nachweisen,

dass es durch UVB-Bestrahlung zu einer reduzierten Expression von Integrinen auf der

Zellmembran von Melanozten kommt. Bei Experimenten mit EZM-Beschichtungen

zeigte sich zudem, dass die UV-induzierte Herunterregulation von α6-Integrin auf

Laminin-1 deutlich abgeschwächt ist.

Durch durchflusszytometrische Messung der Apoptoserate konnte ich zeigen, dass die

α6-Integrin-abhängige Adhäsion von Melanozyten an Laminin-1 zu einem Schutz

dieser Zellen vor UVB-induzierter Apoptose führt. Diese Schutzfunktion wurde durch

Zugabe eines blockierenden α6-Integrin-Antikörpers aufgehoben.

Konfokalmikroskopisch konnte ich eine UV-induzierte Internalisierung von α6-Integrin

als Erklärung für die durchflusszytometrisch messbare Herunterregulation

demaskieren.

Die Ergebnisse weisen auf die Bedeutung der durch α6-Integrin vermittelten Interaktion

zwischen Melanozyten und Basalmembran bei der Homöostase von Pigmentzellen hin,

insbesondere unter Einfluss von UV-Licht. Die UV-induzierte Internalisierung des α6-

Integrinmoleküls könnte einen dabei wirksamen Mechanismus darstellen. Die Relevanz

der Interaktion zwischen Melanozyten und Basalmembran bei physiologischen und

pathologischen Prozessen muss in weiterführenden Untersuchungen geklärt werden.

Literaturverzeichnis

60

6 Literaturverzeichnis

Das Literaturverzeichnis ist alphabetisch geordnet. Sind mehrere Artikel eines Autors

aufgeführt, erfolgt die Aufführung in chronologischer Reihenfolge. Die Abkürzungen der

Zeitschriften richtet sich nach den Richtlinien des Index medicus (Stand: Januar 2007).

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Anhang

76

7 Anhang (Bilder, Tabellen)

Abb. 34. Melanozyten, 6 h nach der Aussaat auf Laminin-1 (Melan A-Färbung, 10-fache Vergrößerung, s.

2.2.3)

Abb. 35. Melanozyten, 6 h nach der Aussaat auf Laminin-1 unter Zugabe eines monoklonalen Antikörpers

gegen α6-Integrin (Melan A-Färbung, 10-fache Vergrößerung; s. 2.2.3). Die abgerundete

Zellform bedingt eine im Vergleich zu Abb.34 wesentlich geringere Haftung der Zellen.

Anhang

77

Antikörper Klontyp Spezifität Hersteller

α2 Integrin, IgG1 16B4 Maus anti

Mensch

Acris (Bad

Nauheim,

Deutschland)

α5 Integrin, IgG2b SAM-1 Maus anti

Mensch

Acris (Bad

Nauheim,

Deutschland)

α6 Integrin, IgG2b 4F10 Maus anti

Mensch

Acris (Bad

Nauheim,

Deutschland)

β1 Integrin, IgG1 4B7R Maus anti

Mensch

Acris (Bad

Nauheim,

Deutschland)

β3 Integrin, IgG1 PM6/13 Maus anti

Mensch

Acris (Bad

Nauheim,

Deutschland)

α3 Integrin, IgG1 ASC-1 Maus anti

Mensch

Chemicon

(Temicula, USA)

αV Integrin, IgG1 P3G8 Maus anti

Mensch

Chemicon

(Temicula, USA)

α6 Integrin, IgG2a NKI-GoH3 Ratte anti

Mensch

Chemicon

(Temicula, USA)

Tabelle 3. Verwendete Antikörper (s. 2.3)

Anhang

78

Standard-Einzelmessungen Mittelwert abweichung

1 2 3 x SDα 2

0 mJ/cm2 86,90 79,50 82,80 83,10 3,7110 mJ/cm2 45,80 31,50 42,30 39,87 7,4515 mJ/cm2 48,00 57,50 52,90 52,80 4,7520 mJ/cm2

46,70 51,90 39,10 49,30 3,68α 3


95,20 92,60 92,70 93,50 1,47α 5


73,60 70,20 56,60 66,80 9,00α 6


71,20 57,00 60,60 62,93 7,38α V


45,60 55,70 49,20 50,17 5,12β 3

0 mJ/cm2 33,20 33,00 33,10 0,1410 mJ/cm2 2,82 2,08 3,53 2,81 0,7315 mJ/cm2 8,52 13,30 13,40 11,74 2,7920 mJ/cm2

12,10 11,20 11,90 11,73 0,47

Tabelle 4. Durchflusszytometrische Messung der Expression von Integrinuntereinheitenauf unbestrahlten und UVB-bestrahlten Melanozyten, 24 h p.i., n = 3,[% der positiven Zellen]

Anhang

79

Laminin-1 Mittel Standard-Einzelmessungen wert abweichung

1 2 3 x SDα 2

unbestr. 97,60 97,40 69,40 88,13 16,2220 mJ/cm2 74,20 75,70 43,60 64,50 18,12

α 3unbestr. 90,80 93,80 92,30 92,30 1,50

20 mJ/cm2 70,90 71,60 71,30 71,27 0,35

β 1unbestr. 99,60 100,00 99,70 99,80 0,21

20 mJ/cm2 91,00 96,30 92,10 93,10 2,80

α6unbestr. 95,90 97,60 96,80 96,77 0,85

20 mJ/cm2 70,30 60,60 65,50 65,47 4,85

Fibronektin Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung

1 2 3 x SD

α 5unbestr. 93,20 96,90 86,20 92,10 5,43

20 mJ/cm2 65,20 56,20 82,70 68,00 13,48

α Vunbestr. 38,80 21,00 29,90 12,59

20 mJ/cm2 24,80 34,60 29,70 6,93

β 1unbestr. 99,90 100,00 99,80 99,90 0,10

20 mJ/cm2 97,70 97,10 99,40 98,10 1,19

β 3unbestr. 36,30 35,50 61,90 44,60 15,02

20 mJ/cm2 12,00 13,40 56,80 27,40 25,47

Kollagen IV Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung

1 2 3 x SD

α 2unbestr. 98,70 99,10 70,30 89,40 16,51

20 mJ/cm2 74,70 78,00 36,00 62,90 23,35β 1

unbestr. 99,80 97,10 99,30 98,80 1,4420 mJ/cm2 97,50 96,00 93,10 95,50 2,24

Tabelle 5. Einfluss unterschiedlicher extrazellulärer Matrixmoleküle auf dieExpression von Integrinuntereinheiten bei unbestrahlten und UVB-bestrahltenMelanozyten. Durchflusszytometr. Messung, 24 h p.i., n = 3, [% der positiven Zellen]

Die Ergebniss für α6-Integrin sind in Tabelle 6 gesondert dargestellt.

Anhang

80

Standard-Einzelmessungen Mittelwert abweichung

24 h 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2 94,90 98,10 84,20 92,40 7,2810 mJ/cm2 78,60 72,70 73,30 74,87* 3,2520 mJ/cm2

55,60 43,60 56,40 51,87* 7,17

48 h 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2 94,20 95,10 89,80 93,10 2,8410 mJ/cm2 86,40 89,60 87,20 87,73 1,6720 mJ/cm2

61,80 43,10 43,80 49,57* 10,60

72 h 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2 94,60 87,60 86,40 89,53 4,4310 mJ/cm2 91,30 92,90 93,70 92,63 1,2220 mJ/cm2

76,70 77,20 67,40 73,77* 5,52

24 h (L) 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2 95,90 97,60 96,80 96,77 0,8510 mJ/cm2 92,10 91,90 82,40 88,80* 5,5420 mJ/cm2

70,30 60,60 65,50 65,47* 4,85

48 h (L) 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2 89,90 97,80 96,30 94,67 4,2010 mJ/cm2 95,60 94,00 94,50 94,70 0,8220 mJ/cm2

64,50 60,10 57,30 60,63* 3,63

72 h (L) 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2 94,60 93,40 96,10 94,70 1,3510 mJ/cm2 94,50 94,00 91,10 93,20 1,8420 mJ/cm2

76,20 63,40 77,80 72,47* 7,89

Durchflusszytometr. Messung, 24 h p.i. [% der positiven Zellen]


Tabelle 6. Kinetik der α6-Integrin-Expression nach UVB-Bestrahlung undEffekt einer Laminin-1-Beschichtung (L)

Anhang

81

unbeschichtet Standard-Einzelmessungen Mittelwert abweichung

1 2 3 x SD

0 mJ/cm294,3 83,9 93,2 90,5 5,7

20 mJ/cm259,9 58,1 54,6 57,5 2,7

unbeschichtet + PDTC

1 2 3 x SD

0 mJ/cm295,6 85,2 90,3 90,4 5,2

20 mJ/cm252,1 45,6 47,5 48,4 3,3

Tabelle 7. Expression von α6-Integrin unter der Zugabe des RadikalfängersPDTC. Annexin V-Assay. Durchflusszytometrische Messung, 24 h p.i.

Anhang

82

Standard-

Einzelmessungen Mittelwert abweichung

1,5K 1 2 3 4 x SD

0 mJ/cm2

F1: 1,97 F2: 10,0 F3: 78,7 F4: 9,29

F1: 3,02 F2: 8,19 F3: 79,3 F4:9,53

F1: 7,87 F2: 8,68 F3: 81,4 F4: 2,05

F1: 4,29 F2: 8,96 F3: 79,0 F4: 9,41

F1: 3,15 F2: 0,94 F3: 0,42 F4: 0,17

10 mJ/cm2

F1: 1,74 F2: 7,68 F3: 83,1 F4: 7,51

F1: 2,26 F2: 8,67 F3: 82,1 F4: 6,99

F1: 2,00 F2: 8,18 F3: 82,6 F4: 7,25

F1: 0,37 F2: 0,70 F3: 0,71 F4: 0,37

20 mJ/cm2

F1: 2,08 F2: 17,1 F3: 61,5 F4: 19,3

F1: 4,94 F2: 16,5 F3: 62,7 F4: 15,8

F1: 3,41 F2: 6,57 F3: 81,7 F4: 8,30

F1: 3,48 F2: 13,4 F3: 68,6 F4: 14,5

F1: 1,43 F2: 5,91 F3: 11,3 F4: 5,62

1,5KKollagen 1 2 3 4 x SD

0 mJ/cm2

F1: 5,72 F2: 19,8 F3: 68,0 F4: 6,46

F1: 9,32 F2: 14,3 F3: 72,8 F4: 3,56

F1: 7,11 F2: 10,7 F3: 74,2 F4: 7,99

F1: 6,79 F2: 7,43 F3: 78,6 F4: 7,22

F1: 7,24 F2: 14,4 F3: 73,4 F4: 6,31

F1: 1,51 F2: 5,49 F3: 4,37 F4: 1,94

10 mJ/cm2

F1: 8,17 F2: 12,7 F3: 59,7 F4: 19,4

F1: 6,25 F2: 13,3 F3: 60,9 F4: 19,5

F1: 9,57 F2: 22,9 F3: 42,7 F4: 24,8

F1: 8,31 F2: 13,6 F3: 57,2 F4: 20,9

F1: 8,08 F2: 15,6 F3: 55,1* F4: 21,2*

F1: 1,37 F2: 4,86 F3: 8,43 F4: 2,53

20 mJ/cm2

F1: 16,9 F2: 14,5 F3: 42,5 F4: 26,1

F1: 7,99 F2: 25,5 F3: 38,8 F4: 27,7

F1: 12,3 F2: 27,6 F3: 34,6 F4: 25,2

F1: 14,1 F2: 14,0 F3: 43,8 F4: 28,2

F1: 12,8 F2: 20,4 F3: 39,9 F4: 26,8*

F1: 3,74 F2: 7,16 F3: 4,13 F4: 1,39

1,5KFibronektin 1 2 3 4 x SD

0 mJ/cm2

F1: 4,23 F2: 5,85 F3: 86,9 F4: 3,01

F1: 11,6 F2: 8,21 F3: 74,8 F3: 5,40

F1: 4,54 F2: 2,41 F3: 92,2 F4: 0,85

F1: 3,33 F2: 3,63 F3: 91,4 F4: 1,65

F1: 5,93 F2: 5,03 F3: 86,3 F4: 2,73

F1: 3,82 F2: 2,56 F3: 8,03 F4: 1,99

10 mJ/cm2

F1: 2,71 F2: 6,10 F3: 80,4 F4: 10,8

F1: 7,46 F2: 4,27 F3: 82,7 F4: 5,59

F1: 9,06 F2: 13,9 F3: 64,7 F4: 12,3

F1: 5,89 F2: 10,8 F3: 71,4 F4: 11,9

F1: 6,28 F2: 8,77 F3: 74,8 F4: 10,1*

F1: 2,71 F2: 4,39 F3: 8,31 F4: 3,10

20 mJ/cm2

F1: 15,2 F2: 30,9 F3: 36,0 F4: 17,9

F1: 13,8 F2: 21,6 F3: 47,8 F4: 16,7

F1: 11,8 F2: 30,9 F3: 44,8 F4: 12,6

F1: 14,9 F2: 32,7 F3: 40,0 F4: 12,4

F1: 13,9* F2: 29,0 F3: 42,2* F4: 14,9*

F1: 1,54 F2: 5,02 F3: 5,21 F4: 2,82

Tabelle 8. Einfluss unterschiedlicher Beschichtungen auf UVB-induzierte Apoptose bei kaukasischen und negroiden Melanozyten bzw. bei Keratinozyten.Annexin V-Assay. Durchflusszytometrische Messung, 24 h p.i.

* signifikant (p < 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis

Anhang

83

Mittel- Standard-

Einzelmessungen wert abweichung

2,5N 1 2 3 4 x SD

0 mJ/cm2

F1: 5,31 F2: 6,25 F3: 74,6 F4: 13,8

F1: 5,51 F2: 6,95 F3: 68,9 F4: 18,6

F1: 5,41 F2: 6,60 F3: 71,8 F4: 16,2

F1: 0,14 F2: 0,49 F3: 4,03 F4: 3,39

10 mJ/cm2

F1: 6,95 F2: 9,10 F3: 69,4 F4: 14,5

F1: 5,98 F2: 8,81 F3: 64,8 F4: 20,4

F1: 6,47 F2: 8,96 F3: 67,1 F4: 17,5

F1: 0,69 F2: 0,21 F3: 3,25 F4: 4,17

20 mJ/cm2

F1: 4,89 F2: 4,97 F3: 70,9 F4: 19,3

F1: 4,20 F2: 5,87 F3: 69,2 F4: 20,7

F1: 4,55 F2: 5,42 F3: 70,1 F4: 20,0

F1: 0,49 F2: 0,64 F3: 1,20 F4: 0,99

Keratino-zyten 1 2 3 4 x SD

0 mJ/cm2

F1: 0,98 F2: 15,7 F3: 66,2 F4: 17,1

F1: 1,80 F2: 15,3 F3: 67,9 F4:15,0

F1: 4,06 F2: 25,6 F3: 49,4 F4: 21,0

F1: 1,88 F2: 17,1 F3: 59,4 F4: 21,6

F1: 2,18 F2: 18,4 F3: 60,7 F4: 18,7

F1: 1,32 F2: 4,85 F3: 8,40 F4: 3,16

10 mJ/cm2

F1: 1,56 F2: 12,6 F3: 70,7 F4: 15,1

F1: 1,01 F2: 10,4 F3: 73,6 F4: 15,0

F1: 0,92 F2: 19,0 F3: 60,3 F4: 19,8

F1: 1,42 F2: 19,8 F3: 60,2 F4: 18,6

F1: 1,23 F2: 15,5 F3: 66,2 F4: 17,1

F1: 0,31 F2: 4,66 F3: 6,97 F4: 2,45

20 mJ/cm2

F1: 1,14 F2: 12,2 F3: 72,6 F4: 14,1

F1: 1,78 F2: 7,06 F3: 79,6 F3: 11,6

F1: 0,62 F2: 21,8 F3: 50,4 F4: 27,2

F1: 0,34 F2: 20,1 F3: 54,6 F4: 24,9

F1: 0,97 F2: 15,3 F3: 64,3 F4: 19,5

F1: 0,63 F2: 6,90 F3: 14,0 F4: 7,75

Tabelle 8 (Fortsetzung)F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv)F2: spät apoptotisch / früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv)F3: vital (Annexin V negativ, PI negativ)F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)

1,5K = Melanozyten eines hellhäutigen Kaukasiers (Alter: 1,5 a)2,5N = Melanozyten eines dunkelhäutigen Negroiden (Alter: 2,5 a)

Die Ergebnisse für die Laminin-1-Beschichtung sind in Tabelle 9 (1,5K Laminin,20 µg/ml) gesondert dargestellt.

Anhang

84

Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung

1,5K 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2

F1: 6,05 F2: 2,12 F3: 90,0 F4: 1,81

F1: 7,55 F2: 2,47 F3: 87,9 F4: 2,06

F1: 5,60 F2: 1,13 F3: 91,8 F4: 1,51

F1: 6,40 F2: 1,91 F3: 89,9 F4: 1,79

F1: 1,02 F2: 0,70 F3: 1,95 F4: 0,28

10 mJ/cm2

F1: 6,97 F2: 6,65 F3: 79,1 F4: 7,28

F1: 3,87 F2: 4,82 F3: 86,5 F4: 4,77

F1: 6,54 F2: 4,15 F3: 86,6 F4: 2,67

F1: 5,79 F2: 5,21 F3: 84,1 F4: 4,91

F1: 1,68 F2: 1,29 F3: 4,30 F4: 2,31

15 mJ/cm2

F1: 10,2 F2: 14,6 F3: 60,0 F4: 15,2

F1: 5,22 F2: 12,3 F3: 70,8 F4: 11,6

F1: 6,56 F2: 13,6 F3: 68,6 F4: 11,2

F1: 7,33 F2: 13,5 F3: 66,5 F4: 12,7

F1: 2,58 F2: 1,15 F3: 5,71 F4: 2,20

20 mJ/cm2

F1: 6,89 F2: 14,6 F3: 69,3 F4: 9,21

F1: 7,80 F2: 15,3 F3: 64,3 F4: 12,6

F1: 5,91 F2: 11,4 F3: 75,4 F4: 7,35

F1: 6,87 F2: 13,8 F3: 69,7 F4: 9,72

F1: 0,95 F2: 2,08 F3: 5,56 F4: 2,66

1,5K; Laminin (2

µg/ml) 1 2 3 x SD

0 mJ/cm2

F1: 3,39 F2: 2,26 F3: 91,4 F4: 2,93

F1: 4,08 F2: 2,15 F3: 91,7 F4: 2,05

F1: 5,05 F2: 1,86 F3: 91,2 F4: 1,87

F1: 4,17 F2: 2,09 F3: 91,4 F4: 2,28

F1: 0,83 F2: 0,21 F3: 0,25 F4: 0,57

10 mJ/cm2

F1: 1,94 F2: 4,27 F3: 90,0 F4: 3,81

F1: 2,81 F2: 4,65 F3: 88,9 F4: 3,68

F1: 2,85 F2: 4,75 F3: 88,8 F4: 3,58

F1: 2,53 F2: 4,56 F3: 89,2 F4: 3,69

F1: 0,51 F2: 0,25 F3: 0,67 F4: 0,12

15 mJ/cm2

F1: 8,82 F2: 14,9 F3: 63,5 F4: 12,8

F1: 6,74 F2: 13,2 F3: 70,3 F4: 9,79

F1: 4,92 F2: 9,42 F3: 78,4 F4: 7,31

F1: 6,83 F2: 12,5 F3: 70,7 F4: 9,97

F1: 1,95 F2: 2,81 F3: 7,46 F4: 2,75

20 mJ/cm2

F1: 8,39 F2: 9,44 F3: 76,8 F4: 5,40

F1: 8,36 F2: 13,2 F3: 70,5 F4: 7,87

F1: 6,59 F2: 14,7 F3: 68,5 F4: 10,2

F1: 7,78 F2: 12,4 F3: 71,9 F4: 7,82

F1: 1,03 F2: 2,71 F3: 4,33 F4: 2,40

Tabelle 9. Einfluss der Laminin-1-Beschichtung in unterschiedlicher Konzentrationauf UVB-induzierte Apoptose. Durchflusszytometr. Messung, 24 h p.i.

Anhang

85

Mittel- Standard- Einzelmessungen wert abweichung

1,5K; Laminin

(20 µg/ml) 1 2 3 x SD

0 mJ/cm²

F1: 4,47 F2: 2,01 F3: 91,1 F4: 2,42

F1: 4,45 F2: 1,40 F3: 91,6 F4: 2,51

F1: 6,62 F2: 0,84 F3: 90,2 F4: 2,39

F1: 5,18 F2: 1,42 F3: 91,0 F4: 2,44

F1: 1,25 F2: 0,59 F3: 0,71 F4: 0,06

10 mJ/cm²

F1: 3,94 F2: 4,99 F3: 86,3 F4: 4,75

F1: 4,12 F2: 4,94 F3: 85,5 F3: 5,42

F1: 4,53 F2: 5,16 F3: 84,5 F4: 5,79

F1: 4,20 F2: 5,03 F3: 85,4 F4: 5,32

F1: 0,30 F2: 0,11 F3: 0,90 F4: 0,53

15 mJ/cm²

F1: 7,64 F2: 12,7 F3: 69,0 F4: 10,7

F1: 5,48 F2: 14,2 F3: 69,8 F4: 10,6

F1: 5,83 F2: 11,5 F3: 73,6 F4: 9,06

F1: 6,32 F2: 12,8 F3: 70,8 F4: 10,1

F1: 1,16 F2: 1,35 F3: 2,46 F4: 0,92

20 mJ/cm²

F1: 6,20 F2: 13,5 F3: 71,0 F4: 9,32

F1: 6,07 F2: 14,4 F3: 69,1 F4: 10,4

F1: 5,85 F2: 14,8 F3: 68,0 F4: 11,3

F1: 6,04 F2: 14,2 F3: 69,4 F4: 10,3

F1: 0,18 F2: 0,67 F3: 1,52 F4: 1,00

Tabelle 9 (Fortsetzung) F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv) F2: spät apoptotisch /früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv) F3: vital (Annexin V negativ, PInegativ) F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)

1,5 K = Melanozyten eines hellhäutigen Kaukasiers (Alter: 1,5a) 2,5 N = Melanozyten eines dunkelhäutigen Negroiden (Alter: 2,5a)

Anhang

86

Laminin Mittel- Standard-

Einzelmessungen wert abweichung

1 2 3 4 5 x SD

0 mJ/cm2

F1: 6,97 F2: 5,07 F3: 82,8 F4: 5,14

F1: 8,09 F2: 6,68 F3: 80,0 F4: 5,21

F1: 7,89 F2: 3,87 F3: 83,5 F4: 4,74

F1: 9,88 F2: 4,50 F3: 80,5 F4: 5,11

F1: 10,3 F2: 2,50 F3: 85,3 F4: 1,93

F1: 8,63 F2: 4,52 F3: 82,4 F4: 5,05

F1: 1,41 F2: 1,54 F3: 2,19 F4: 1,41

10

mJ/cm2

F1: 5,07 F2: 7,75 F3: 83,7 F4: 3,47

F1: 3,60 F2: 8,50 F3: 84,0 F4: 3,93

F1: 3,67 F2: 8,10 F3: 84,6 F4: 3,63

F1: 4,48 F2: 8,11 F3: 83,1 F4: 4,33

F1: 3,22 F2: 9,05 F3: 82,3 F4: 5,44

F1: 4,22² F2: 8,30² F3: 83,5² F4: 4,16

F1: 1,09 F2: 0,50 F3: 0,88 F4: 0,79

20

mJ/cm2

F1: 3,30 F2: 8,87 F3: 84,4 F4: 3,46

F1: 3,41 F2: 9,82 F3: 80,6 F4: 6,12

F1: 2,98 F2: 13,3 F3: 77,8 F4: 5,92

F1: 3,49 F2: 13,5 F3: 77,8 F4: 5,22

F1: 3,30² F2: 11,4 F3: 80,2 F4: 5,18

F1: 0,22 F2: 2,37 F3: 3,13 F4: 1,21

Laminin + GOH31 2 3 4 5 x SD

0 mJ/cm2

F1: 6,35 F2: 3,90 F3: 86,5 F4: 3,29

F1: 8,08 F2: 3,62 F3: 84,6 F4: 3,68

F1: 10,2 F2: 4,76 F3: 81,0 F4: 4,04

F1: 9,62 F2: 4,75 F3: 81,6 F4: 4,04

F1: 10,7 F2: 4,68 F3: 81,1 F4: 3,57

F1: 8,99 F2: 4,34 F3: 83,0 F4: 3,72

F1: 1,77 F2: 0,54 F3: 2,47 F4: 0,32

10

mJ/cm2

F1: 5,27 F2: 17,8 F3: 69,3 F4: 7,61

F1: 6,88 F2: 19,7 F3: 64,8 F4: 8,64

F1: 6,53 F2: 15,7 F3: 71,4 F4: 6,38

F1: 5,54 F2: 17,6 F3: 68,5 F4: 8,30

F1: 5,62 F2: 17,7 F3: 69,0 F4: 7,67

F1: 5,97¹ F2: 17,7¹ F3: 68,6¹ F4: 7,72¹

F1: 0,70 F2: 1,42 F3: 2,39 F4: 0,87

20

mJ/cm2

F1: 4,60 F2: 16,6 F3: 71,1 F4: 7,66

F1: 5,05 F2: 14,6 F3: 72,9 F4: 7,40

F1: 4,76 F2: 14,8 F3: 72,9 F4: 7,53

F1: 4,32 F2: 14,7 F3: 72,5 F4: 8,45

F1: 5,26 F2: 13,8 F3: 73,2 F4: 7,72

F1: 4,80¹ F2: 14,9¹ F3: 72,5¹ F4: 7,75¹

F1: 0,37 F2: 1,03 F3: 0,83 F4: 0,41

unbeschichtet1 2 3 4 x SD

0 mJ/cm2

F1: 6,04 F2: 5,98 F3: 83,6 F4: 4,37

F1: 7,55 F2: 4,68 F3: 83,7 F4: 4,08

F1: 8,65 F2: 4,65 F3: 83,5 F4: 3,24

F1: 7,41 F2: 5,10 F3: 83,6 F4: 3,90

F1: 1,31 F2: 0,76 F3: 0,10 F4: 0,59

10

mJ/cm2

F1: 4,95 F2: 13,6 F3: 76,4 F4: 5,07

F1: 6,85 F2: 14,1 F3: 73,1 F4: 5,88

F1: 4,21 F2: 11,8 F3: 78,6 F4: 5,37

F1: 5,81 F2: 11,7 F3: 78,0 F4: 4,55

F1: 5,34 F2: 12,8 F3: 76,5 F4: 5,22

F1: 1,36 F2: 1,23 F3: 2,46 F4: 0,56

20

mJ/cm2

F1: 5,47 F2: 9,47 F3: 80,1 F4: 4,91

F1: 7,07 F2: 12,5 F3: 75,1 F4: 5,26

F1: 5,83 F2: 9,64 F3: 79,5 F4: 5,04

F1: 5,18 F2: 8,94 F3: 81,2 F4: 4,66

F1: 5,89 F2: 10,1 F3: 79,0 F4: 4,97

F1: 0,83 F2: 1,60 F3: 2,68 F4: 0,25

Tabelle 10. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung bzw. α6-Integrin-blockier. Antikörper auf dieUVB-ind. Apoptose. Annexin V-Assay, durchflusszytom. Messung [% d. pos. Zellen], 24 h p.i.F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv)F2: spät apoptotisch / früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv)F3: vital (Annexin V negativ, PI negativ) F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)

¹ signifikant (p < 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten² signifikant (p < 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten

Anhang

87

Laminin Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung

1 2 3 x SD

0 mJ/cm2

F1: 4,72 F2: 3,12 F3: 89,0 F4: 3,16

F1: 5,74 F2: 1,83 F3: 90,4 F4: 2,06

F1: 8,49 F2: 1,55 F3: 87,9 F4: 2,06

F1: 6,31 F2: 2,17 F3: 89,1 F4: 2,43

F1: 1,95 F2: 0,84 F3: 1,25 F4: 0,64

10 mJ/cm2

F1: 9,04 F2: 29,1 F3: 36,7 F4: 25,2

F1: 5,94 F2: 37,1 F3: 36,2 F4: 20,7

F1: 7,77 F2: 25,3 F3: 41,0 F4: 26,0

F1: 7,58 F2: 30,5 F3: 34,2 F4: 24,0

F1: 1,56 F2: 6,02 F3: 5,83 F4: 2,86

20 mJ/cm2

F1: 3,56 F2: 34,5 F3: 44,4 F4: 17,6

F1: 4,11 F2: 29,6 F3: 46,6 F4: 19,7

F1: 3,55 F2: 26,8 F3: 51,8 F4: 17,8

F1: 3,74 F2: 30,3 F3: 47,6 F4: 18,4

F1: 0,32 F2: 3,90 F3: 3,80 F4: 1,16

Laminin+ GOH31 2 3 x SD

0 mJ/cm2

F1: 7,38 F2: 2,87 F3: 87,0 F4: 2,77

F1: 5,18 F2: 1,19 F3: 90,5 F4: 3,11

F1: 8,62 F2: 2,18 F3: 86,0 F4: 3,26

F1: 7,06 F2: 2,08 F3: 87,8 F4: 3,05

F1: 1,74 F2: 0,84 F3: 2,36 F4: 0,25

10 mJ/cm2

F1: 4,78 F2: 33,8 F3: 37,0 F4: 24,5

F1: 5,72 F2: 35,5 F3: 35,9 F4: 23,1

F1: 4,31 F2: 31,3 F3: 39,1 F4: 25,3

F1: 4,93 F2: 33,5 F3: 37,3 F4: 24,3

F1: 0,72 F2: 2,11 F3: 1,63 F4: 1,11

20 mJ/cm2

F1: 6,79 F2: 37,1 F3: 36,8 F4: 19,4

F1: 7,56 F2: 40,1 F3: 33,0 F4: 19,4

F1: 6,61 F2: 35,4 F3: 39,8 F4: 18,2

F1: 6,99 F2: 37,5 F3: 36,5 F4: 19,0

F1: 0,50 F2: 2,38 F3: 3,41 F4: 0,69

unbeschichtet1 2 3 x SD

0 mJ/cm2

F1: 8,59 F2: 4,23 F3: 84,3 F4: 2,89

F1: 13,1 F2: 2,45 F3: 82,6 F4: 1,87

F1: 10,9 F2: 1,90 F3: 85,3 F4: 1,87

F1: 10,9 F2: 2,86 F3: 84,1 F4: 2,21

F1: 2,26 F2: 1,22 F3: 1,37 F4: 0,59

10 mJ/cm2

F1: 7,18 F2: 28,6 F3: 49,4 F4: 14,8

F1: 12,8 F2: 32,0 F3: 37,8 F4: 17,4

F1: 11,7 F2: 28,6 F3: 42,1 F4: 17,6

F1: 10,6 F2: 29,7 F3: 43,1 F4: 16,6

F1: 2,98 F2: 1,96 F3: 5,86 F4: 1,56

20 mJ/cm2

F1: 10,3 F2: 33,3 F3: 41,8 F4: 14,5

F1: 11,3 F2: 39,7 F3: 31,8 F4: 17,3

F1: 11,2 F2: 36,4 F3: 35,9 F4: 16,5

F1: 10,9 F2: 36,5 F3: 36,5 F4: 16,1

F1: 0,55 F2: 3,20 F3: 5,03 F4: 1,44

Tabelle 11. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung bzw. α6-Integrin-blockierendem Antikörper auf die UVB-ind. Apoptose. Annexin V-Assay, durchflusszytometr. Messung [% d. pos. Zellen], 48 h p.i.F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv)F2: spät apoptotisch / früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv)F3: vital (Annexin V negativ, PI negativ)F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)

Erklärung

88

8 Erklärung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Klinik für Dermatologie, Allergologie und

Venerologie der Universität zu Lübeck unter Anleitung von PD Dr.med. Sven Krengel

durchgeführt. Ich habe die vorliegende Dissertation selbständig und ohne fremde Hilfe

angefertigt, keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel

verwendet und wörtlich oder inhaltlich entnommene Zitate aus den benutzten Werken

als solche kenntlich gemacht.

Ich versichere außerdem, nicht vorher oder gleichzeitig andernorts einen

Zulassungsantrag gestellt zu haben und habe mich zuvor keinem anderen

Promotionsverfahren unterzogen. Die Arbeit wurde keiner anderen Promotionsbehörde

im In- oder Ausland vorgelegt.

Lübeck, April 2007 Christian Geuchen

Danksagung

89

9 Danksagung

Ich bedanke mich herzlichst bei PD Dr. Sven Krengel für die Überlassung dieses

Themas, welches mir ermöglichte, experimentell tätig zu werden. Er unterstützte mich

über die ganze Promotionsabeit hinweg und erschloss mir stets neue, mir noch

verborgen gebliebene Sichtweisen.

Mein weiterer Dank gelten Herrn PD Peter Schlenke sowie Herrn Prof. Andreas

Gebert, die mir die notwendigen Gerätschaften zum erfolgreichen Durchführen meiner

Experimente zur Verfügung stellten.

Große Dankbarkeit gilt meinen Eltern, die mich während des Studiums und der

Promotionsarbeit fortwährend motivierten und finanziell unterstützten.

Ich bedanke mich auch bei Dorothea, die mich seit Beginn des Praktischen Jahres

immer wieder dazu animierte, den Abschluss der Doktorarbeit nicht aus den Augen zu

verlieren.

Lebenslauf

90

10 Lebenslauf

Persönliche Informationen

Name: Christian Geuchen

Geburtstag: 27.02.1980

Geburtsort: Bocholt

Familienstand: ledig

Eltern: Dr.med.Heinrich Geuchen,

Gisela Geuchen, geb. Kozok

Wohnhaft: Ratzeburger Allee 88 G, 23562

Lübeck

Tel.: 0451-7074302

E-Mail: [email protected]

1986 – 1990 Grundschule

1990 – 1999 Wittekind-Gymnasium Lübbecke/NRW

14.06.1999 Abitur am Wittekind-Gymnasium Lübbecke/NRW

September 1999 – Juli 2000 Wehrdienst

2000 - 2006 Studium der Humanmedizin

2000 – 2002 Vorklinisches Studium an der Universität des Saarlandes (Homburg/Saar)

Lebenslauf

91

2002 Ärztliche Vorprüfung

2002 – 2006 Klinisches Studium an der Universität Schleswig-Holstein (Campus Lübeck)

2003 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

2005 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Oktober 2005 – September 2006 Praktisches Jahr

01.November 2006 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Ab 02.01.2007 Assistenzarzt Innere Medizin

DRK KH Ratzeburg

September 2003 – April 2007: Experimentelle Promotionsarbeit zum Thema „Einfluss

von ultraviolettem Licht und extrazellulärer Matrix auf Pigmentzellhomöostase und

Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle“

Publikation: S. Krengel, I. Stark, C. Geuchen, B. Knoppe, G. Scheel, P. Schlenke, A.

Gebert, L. Wünsch, J. Brinckmann, M. Tronnier: Selective downregulation of the α6-

integrin-subunit in melanocytes by UVB-light. Exp Dermatol 14, 411-419 (2005)

Lübeck, im April 2007

Einfluss von ultraviolettem Licht und extrazellulärer ...der Lamina lucida und der Lamina densa...

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