Expression und Verteilung von VIP, Substanz P, CGRP und...

Expression und Verteilung von VIP, Substanz P, CGRP und Bombesin im Larynx und der oberen Trachea

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Simone Schön geb. Kaußen

aus

Stolberg (Rheinland)

Berichter: Herr Professor Dr. med. Ercole Francois Nikolaus Di Martino Herr Universitätsprofessor Dr. med. Martin Westhofen Tag der mündlichen Prüfung: 20. April 2007 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 EINLEITUNG .......................................................................................................1

1.1 Larynx und Trachea .........................................................................................................2 1.1.1 Anatomie ....................................................................................................................2 1.1.2 Histologie....................................................................................................................4 1.1.3 Innervation..................................................................................................................6 1.1.4 Funktion......................................................................................................................7 1.1.5 Erkrankungen von Larynx und Trachea .....................................................................7

1.2 Neuropeptide .................................................................................................................11 1.2.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid .........................................................................12 1.2.2 Substanz P ...............................................................................................................13 1.2.3 Calcitonin gene-related peptide................................................................................14 1.2.4 Bombesin .................................................................................................................16

2 MATERIAL ........................................................................................................17

2.1 Erstellung der Paraffinschnitte .......................................................................................17

2.2 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode..............17

2.3 Fotodokumentation ........................................................................................................18

3 METHODEN ......................................................................................................19

3.1 Auswahl der Präparate ..................................................................................................19

3.2 Fixierung und Einbettung ...............................................................................................20

3.3 Erstellung der Paraffinschnitte .......................................................................................20

3.4 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode..............20

3.5 Positivkontrollen / Negativkontrollen ..............................................................................23

3.6 Bewertungskriterien .......................................................................................................24

4 ERGEBNISSE ...................................................................................................26

4.1 Patientendaten...............................................................................................................26 4.1.1 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Larynx..........................................26 4.1.2 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Trachea .......................................27

4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Larynxpräparate.........................28 4.2.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid .........................................................................28 4.2.2 Substanz P ...............................................................................................................30 4.2.3 Calcitonin gene-related peptide................................................................................31 4.2.4 Bombesin .................................................................................................................32

Inhaltsverzeichnis II

4.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Tracheapräparate ......................33 4.3.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid .........................................................................33 4.3.2 Substanz P ...............................................................................................................34 4.3.3 Calcitonin gene-related peptide................................................................................35 4.3.4 Bombesin .................................................................................................................36

4.4 Ergebnis der Positivkontrollen .......................................................................................38

4.5 Ergebnis der Negativkontrollen......................................................................................39

4.6 Tabellarische Ergebnisübersicht....................................................................................40 4.6.1 Larynx.......................................................................................................................40 4.6.2 Trachea ....................................................................................................................42

5 DISKUSSION.....................................................................................................44

6 ZUSAMMENFASSUNG.....................................................................................49

7 ANHANG ...........................................................................................................50

8 LITERATURVERZEICHNIS...............................................................................51

9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .........................................................................58

10 DANKSAGUNG.................................................................................................60

11 LEBENSLAUF...................................................................................................61

Abbildungsverzeichnis III

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Makroskopische Ansicht eines Larynx. Blick von dorsal und lateral auf

die Epiglottis.................................................................................................3

Abbildung 1.2: Makroskopische Ansicht von Larynx und Trachea einschließlich ihrer

Bifurkation von dorsal...................................................................................4

Abbildung 1.3: Larynx; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung:

Azan. 1: Zilien; 2: basale Zellen; 3: intermediäre Zellen; 4:

Becherzellen; 5: Lamina propria. [aus: „Taschenatlas der Zytologie,

Histologie und mikroskopischen Anatomie“, Wolfgang Kühnel, Georg

Thieme Verlag 1995; S. 83, Abb. 111]. ........................................................5

Abbildung 1.4: Trachea; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung:

Azan. 1: Basalknötchenreihe; 2: Gefäß; 3: Kinozilien; 4: Kern einer

Becherzelle. [aus: „Taschenatlas der Zytologie, Histologie und

mikroskopischen Anatomie“, Wolfgang Kühnel, Georg Thieme Verlag

1995; S. 83, Abb. 110]. ................................................................................6

Abbildung 3.1: Immunhistochemie nach der ABC-Methode. Der Avidin-Biotin-Enzym-

Komplex bindet über einen biotinylierten Sekundärantikörper an den

Primärantikörper.........................................................................................23

Abbildung 3.2: Protein S-100; Stimmlippe; Vergrößerung: 500fach; Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun. Nervenfaszikel (Pfeilmarkierung) im

Stroma des Stimmlippengewebes..............................................................24

Abbildung 4.1: Altersverteilung – Larynx ............................................................................26

Abbildung 4.2: Altersverteilung – Trachea..........................................................................27

Abbildung 4.3: VIP; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. VIP-haltige seröse Drüsen (Pfeilmarkierung) im Verband

mit mukösen Drüsen, die VIP-negativ sind. Im Stroma Fibrozyten mit

geringer Neuropeptidexpression. ...............................................................28

Abbildung 4.4: Substanz P; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach, Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun. Mit Pfeilen dargestellt die serösen

Drüsen eines Ausführungsganges, die in mäßiger Konzentration

Abbildungsverzeichnis IV

Substanz P exprimierten. Unten eine muköse Drüse ohne Substanz

P. Das Cytoplasma mit mäßiger Neuropeptidexpression. .........................30

Abbildung 4.5: CGRP; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun. Oben ein nicht braun angefärbtes und

somit nicht CGRP-haltiges Feld muköser Drüsen, unten ein mäßig

braun gefärbtes seröses Drüsenfeld. Dazwischen Fibrozyten mit

hohem Gehalt an CGRP. ...........................................................................31

Abbildung 4.6: Bombesin; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun. Dargestellt sind muköse Drüsenfelder

ohne Bombesingehalt. Rechts ein Ausführungsgang mit stark

angefärbten serösen Drüsen. In den Fibrozyten wurde Bombesin

sehr stark exprimiert...................................................................................32

Abbildung 4.7: VIP; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. Mit Pfeilen dargestellt sind seröse Drüsen, die im

Gegensatz zu den abgebildeten mukösen Drüsen eine deutliche

Braunfärbung im Sinne einer mäßigen VIP-Expression aufzeigen. ...........33

Abbildung 4.8: Substanz P; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun. Nicht angefärbte muköse Drüsenanteile

neben Fibrozyten mit mäßiger Substanz-P-Expression (Pfeile).

Ebenso gelang ein mäßiger Nachweis in Blutgefäßen. .............................34

Abbildung 4.9: CGRP; Trachea; Vergrößerung 500fach. Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. Dargestellt sind Nervenfaszikel mit sehr hoher Expression

von CGRP (Pfeile), sowie Anteile von mukösen Drüsen, die einen

mäßigen Gehalt an CGRP aufweisen. Rechts oben eine Arteriole mit

mäßiger CGRP-Expression........................................................................35

Abbildung 4.10: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun. Die Pfeile deuten auf Nervenfaszikel mit

hoher Bombesin-Expression. Das muköse Drüsenfeld enthält kein

Bombesin. Die Fibrozyten zeigen einen hohen Transmittergehalt.............36

Abbildung 4.11: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun: Die Pfeile zeigen auf die intensiv braun

angefärbte Lamina propria; ein Zeichen für eine sehr starke

Expression von Bombesin innerhalb der Basalmembran. .........................37

Abbildungsverzeichnis V

Abbildung 4.12: Positivkontrolle mit VIP; Duodenalschleimhaut; Vergrößerung

500fach; Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Braungefärbte

Epithelzellen und Fibrozyten (Pfeile) als Zeichen einer VIP-

Expression in der Duodenalschleimhaut....................................................38

Abbildung 4.13: Negativkontrolle ohne Substanz P; Trachea; Vergrößerung 500fach,

Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Keine Braunfärbung im Sinne

eine Substanz-P-Expression sichtbar. .......................................................39

Tabelle 4.1: Intensität der Immunreaktionen der Neuropeptide an

unterschiedlichen histologischen Strukturen des Larynx. Drüsen

waren nur in Einzelfällen nachweisbar. n = 10 Stimmlippenpräparate. .....40

Tabelle 4.2: Intensität der Immunreaktionen der Neuropeptide an

unterschiedlichen histologischen Strukturen der Trachea. n = 25

Tracheapräparate.......................................................................................42

Einleitung 1

1 Einleitung

Für die Aufrechterhaltung einer optimalen Organfunktion ist u.a. das

Zusammenwirken unterschiedlichster Enzyme, Hormone sowie verschiedener

Transportsysteme von Bedeutung. Dies trifft auch für die Gruppe der Neuropeptide

zu, deren Relevanz für den oberen Respirationstrakt in der Vergangenheit sowohl an

Tierpräparaten als auch am Menschen nachgewiesen werden konnte [Basterra et al.,

1989; Hisa et al., 1992; Hauser-Kronberger et al., 1992, 1993, 1994].

Neuropeptide, wie das Vasoaktive intestinale Polypeptid (VIP), Substanz P (SP),

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) und Bombesin (BN), setzen sich aus

Aminosäuren zusammen und erreichen, nach ihrer Synthese in Nervenzellen,

entweder über Diffusion durch den synaptischen Spalt oder aber als Neurohormone

über die Blutbahn ihr Zielorgan. Sie üben eine modulierende Wirkung auf die

klassischen Transmitter Noradrenalin und Acetylcholin aus, ohne eigenständig

adrenerge oder cholinerge Effekte hervorrufen zu können. Aus diesem Grund

bezeichnet man sie auch als non-adrenerges, non-cholinerges (NANC-) System.

Einige Neuropeptide vermindern oder verstärken Effekte wie Vasodilatation,

Ödembildung und Hypersekretion an Drüsen [Richardson & Webber, 1987; Lundberg

et al., 1991], andere führen zur Kontraktion glatter Muskulatur [Said, 1987]. Die

Peptide Bombesin und Substanz P sollen an Reparaturmechanismen beteiligt sein

[Yule et al., 1999; Lunn et al., 2000]. Durch derartige Effekte erhält das gesamte

neuronale System eine höhere Präsizion und mehr Komplexität.

Im Kopf-Hals-Bereich gehen eine Vielzahl von entzündlichen, aber auch malignen

Erkrankungen von Larynx und Trachea unter anderem mit Ödembildung, Alteration

der Durchblutung, vermehrter Schleimsekretion und narbigen Stenosen einher. In

diese Prozesse sind Neuropeptide in vielfältiger Weise involviert. Ziel der Arbeit war

es, die Expression und Verteilung der Neuropeptide VIP, SP, CGRP und BN in den

einzelnen histologischen Substrukturen von Kehlkopf und Luftröhre zu untersuchen.

Da über die Präsenz von Neuropeptiden insbesondere in der menschlichen Trachea

nur wenige Studien vorliegen [u.a. Berisha et al., 2002], war nicht nur die

Untersuchung von erkranktem Gewebe von Interesse.

Einleitung 2

1.1 Larynx und Trachea

1.1.1 Anatomie

Das Kehlkopfskelett setzt sich aus dem Schildknorpel (Cartilago thyroidea), dem

Ringknorpel (Cartilago cricoidea), den beiden Stellknorpeln (Cartilago arytenoidea)

und dem Kehldeckel (Epiglottis) zusammen. Diese knorpeligen Komponenten des

Larynx, der nach kranial vom Zungenbein und nach kaudal von der Trachea begrenzt

wird, stehen sowohl über Gelenke als auch über Bänder miteinander in Verbindung.

Aufgrund der sagital gestellten, paarig angelegten Taschen- und Stimmfalte wird der

Kehlkopf in drei Etagen unterteilt:

Die Supraglottis erstreckt sich vom Larynxeingang bis zur Höhe der Taschenfalten.

Die Glottis reicht von den Taschenfalten bis zu den Stimmlippen.

Der Bereich unterhalb der Stimmlippen bis zum Unterrand des Ringknorpels wird als

Subglottis bezeichnet.

Die unmittelbare Nachbarschaft der Stimmlippen stellt den sogenannten

Reinke´schen Raum dar.

Die Kehlkopfmuskeln, die in äußere und innere Muskeln weiter untergliedert werden

können, regeln durch Lageveränderungen der Knorpel zueinander die Stellung der

Stimmritze. Einziger Öffner der Stimmritze ist dabei der M. cricoarytenoideus

(„Postikus“).

Arteriell wird der Kehlkopf durch die A. laryngea superior (aus der A. thyroidea

superior) und aus der A. laryngea inferior (aus der A. thyroidea inferior) versorgt. Das

venöse Blut des oberen Larynxanteils gelangt über die V. laryngea superior in die V.

thyroidea superior, während aus dem unteren Anteil Blut von der V. laryngea inferior

in den Plexus thyroideus impar abgegeben wird.

Der Lymphabfluss erfolgt im sehr dichten Lymphkapillarnetz der Supraglottis in die

vertikalen zervikalen Lymphabflussketten und insbesondere in die Lymphknoten im

Bereich des jugulofazialen Venenwinkels. Die Drainage kann dabei ipsilateral,

kontralateral oder bilateral erfolgen. Die prälaryngealen Lymphknoten, die aufgrund

ihrer prognostischen Bedeutung bei Larynxmalignomen eine übergeordnete Stellung

einnehmen, werden auch als „Delphi-Lymphknoten“ bezeichnet.

Einleitung 3

Da die Glottis nur spärlich über Lymphkapillaren verfügt, erfolgt hier die Drainage

hauptsächlich nach kranial in das supraglottische Kapillarnetz sowie in das

präepiglottische Fett [Westhofen M., 2001].

Identisch erfolgt der Lymphabfluss im Bereich der Subglottis. Zusätzlich bestehen

Verbindungen zu den peritrachealen und mediastinalen Lymphknoten.

bbildung 1.1: Makroskopische Ansicht eines Larynx. Blick von dorsal und lateral auf die

Die Trachea stellt die Verbindung zwischen Kehlkopf und Lunge her. Das 10 bis 12

A

Epiglottis.

cm lange und 13 bis 20 cm breite Rohr gabelt sich vor dem 4. und 5.

Brustwirbelkörper in die beiden Hauptbronchien auf. In die Wand der Trachea sind 12

bis 16 hufeisenförmige, hyaline Knorpelspangen eingelassen, die nach dorsal

geöffnet sind. Diese Knorpelspangen, die für Stabilität sorgen und das

Tracheallumen offen halten, sind über starke elastische Bänder miteinander

verbunden. Die Rückseite der Trachea wird von einer Bindegewebs-Muskel-

Membran (Paries membranaceus) gebildet. Die in dieser Hinterwand

querverlaufende, glatte Muskulatur bewirkt durch Kontraktion eine Lumenverengung

der Trachea – die Schleimhaut legt sich daraufhin in Längsfalten. Weiterhin

ermöglichen elastische Fasernetze eine Verlängerung des Organs.

Einleitung 4

Die Blutversorgung der Trachea erfolgt überwiegend über Rami tracheales aus der

A. thyroidea inferior, zu einem kleinen Teil auch aus der A. thyroidea superior. Das

venöse Blut gelangt in den Plexus thyroideus impar.

Die Lymphe fließt über den Truncus bronchomediastinalis ab.

Abbildung 1.2: Makroskopische Ansicht von Larynx und Trachea einschließlich ihrer Bifurkation

von dorsal.

1.1.2 Histologie

Histologisch ist der Larynx von mehrreihigem Flimmerepithel mit Becher-, Basal- und

Flimmerepithelzellen ausgekleidet und weist eine kollagen-elastische Tunica propria

mit gemischten tubulo-alveolären Drüsen auf. Eine Ausnahme bildet die Stimmlippe:

im Bereich der Plica vocalis ist die Schleimhaut unverschieblich mit der Unterlage

Einleitung 5

verwachsen und besteht aus einem mehrschichtigen, stellenweise verhornten

Abbildung 1.3: Larynx; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung: Azan.

Plattenepithel, welches keine Drüsen enthält.

1:

Zilien; 2: basale Zellen; 3: intermediäre Zellen; 4: Becherzellen; 5: Lamina

Die Trachea beste ina

epithelialis und Lamina propria -, einer Tunica fibromusculocartilaginea und einer

tracheales besonders im Bereich der Pars membranacea. Anschließend an die

propria. [aus: „Taschenatlas der Zytologie, Histologie und mikroskopischen

Anatomie“, Wolfgang Kühnel, Georg Thieme Verlag 1995; S. 83, Abb. 111].

ht histologisch aus einer Tunica mucosa – aufgeteilt in Lam

Tunica adventitia. Das respiratorische Epithel ist mit Schleim aus Becherzellen und

Glandulae tracheales bedeckt, der durch den Kinozilienschlag auf der Oberfläche

zum Einfangen des Staubes verteilt und dann rachenwärts abtransportiert wird, um

von dort in den Verdauungstrakt zu gelangen. In der Lamina propria, einem

kollagenfaserigen Bindegewebsbereich, sitzen die seromukösen Glandulae

Tunica fibromusculocartilaginea, die sich dem Namen nach aus Bindegewebe,

Muskulatur und Knorpel zusammensetzt, stellt die aus lockerem Bindegewebe

bestehende Adventitia die Verbindung zum Mediastinum her.

Einleitung 6

Abbildung 1.4: Trachea; histologisches Präparat; Vergrößerung 400fach; Färbung: Azan. 1:

Basalknötchenreihe; 2: Gefäß; 3: Kinozilien; 4: Kern einer Becherzelle. [aus:

„Taschenatlas der Zytologie, Histologie und mikroskopischen Anatomie“,

Wolfgang Kühnel, Georg Thieme Verlag 1995; S. 83, Abb. 110].

1.1.3 Innervation

Die nervale Innervation des Larynx wird vom Nervus vagus übernommen, der neben

dem motorischen Anteil auch sensible und sekretorische Fasern führt. Motorisch

innerviert der N. laryngeus superior aus dem N. vagus über einen Ramus externus

lediglich den M. cricothyroideus. Alle anderen Muskeln werden über den N. laryngeus

inferior versorgt. Die sensiblen Fasern des Ramus externus aus dem N. laryngeus

superior innervieren den vorderen Teil der Stimmlippe, wohingegen die restliche

Stimmlippenschleimhaut über den Ramus internus versorgt wird. Alle

Larynxabschnitte, die sich unterhalb der Stimmritze befinden, erhalten ihre sensible

Innervation über den N. laryngeus inferior. Sowohl der N. laryngeus superior als auch

der N. laryngeus inferior führen sympathische Fasern des Grenzstranges und

versorgen auf diesem Weg die Drüsen und Gefäße der Schleimhaut.

Die nervale Innervation der Trachea wird sowohl über Rami tracheales aus dem N.

laryngeus inferior als auch über den Brustgrenzstrang gewährleistet.

Einleitung 7

1.1.4 Funktion

Zu den Funktionen des Larynx gehören Atmung, Verhinderung der Aspiration bei der

Nahrungsaufnahme, Stabilisierung des Thorax sowie die Phonation, bei der es zu

Schwingungen der Stimmlippe kommt. Für alle Funktionen des Kehlkopfes ist der

Öffnungszustand der Stimmritze sowie die Stimmlippenspannung von erheblicher

Bedeutung. Bei der Phonation wird mit Hilfe des von den Drüsen produzierten

Schleims ein Flüssigkeitspolster bereitgestellt, welches Faltenbildungen des Epithels

ermöglicht und damit die aerodynamischen Abläufe bei der Tonerzeugung

gewährleistet.

Die Trachea gehört zusammen mit den Bronchi zu den luftleitenden Abschnitten der

Atmungsorgane. Damit nimmt sie nicht am aktiven Gasaustausch teil, sondern stellt

im Hinblick auf die Atmung einen Totraum dar. Zu ihren Aufgaben gehören

hauptsächlich die Kontrolle, Anfeuchtung, Aufwärmung und Reinigung der Atemluft.

Dabei spielt ein oberflächlicher, dem Epithel aufgelagerter Schleimfilm eine große

Rolle, der von seromukösen Drüsen ständig produziert wird. Darin abgelagerte

Partikel gelangen durch die Aktivität der Kinozilien mit einer Geschwindigkeit von 15

mm pro Minute Richtung Larynx. Weiterhin besteht eine der Hauptfunktionen der

Trachea in der Aufrechterhaltung eines ausreichend großen Lumens, um die

ungehinderte Passage der Atemluft zu gewährleisten.

1.1.5 Erkrankungen von Larynx und Trachea

Krankheitsprozesse im Larynx lassen sich nach ätiologischen Gesichtspunkten in

entzündliche und traumatische Geschehen sowie in benigne und maligne Tumoren

unterteilen. Wichtige Unterschiede liegen neben den auslösenden Faktoren vor allem

in den klinischen Untersuchungsbefunden.

Entzündungen

Akute Laryngitis:

Die akute Laryngitis wird durch virale oder bakterielle Infekte, durch

Stimmüberlastungen, inhalative Noxen oder durch absteigende Entzündungen

hervorgerufen [Werda, 1994]. Vorherrschende Symptome sind Heiserkeit,

Schmerzen und ein Druckgefühl im Hals. Bei der Laryngoskopie ist eine

Einleitung 8

Gefäßinjektion im Stimmlippenbereich sowie ein symmetrisch ausgeprägtes Ödem

der Larynxschleimhaut erkennbar [Westhofen M., 2001].

Laryngitis subglottica acuta („Pseudokrupp“):

Betroffen sind vorwiegend Säuglinge und Kleinkinder zwischen dem 6. Lebensmonat

und dem 4. Lebensjahr männlichen Geschlechts mit Virusinfekt [Beck, 1997]. Ein

plötzlich auftretender bellender Husten mit Dyspnoe, inspiratorischem Stridor und

hohem Fieber sind die typischen Symptome. Bei der Kehlkopfspiegelung sind

gerötete, polsterartige Schwellungen mit ebenfalls geröteten subglottischen

Stimmbändern erkennbar [Werda, 1994].

Akute Epiglottitis:

Die akute Epiglottitis wird bei Kindern durch eine Infektion mit Haemophilus

influenzae Typ B hervorgerufen. Bei Erwachsenen kann sie aufgrund von Zysten am

Zungengrund oder der Epiglottis, Verletzungen, radiogenen Ödemen, postoperativen

Abflusstörungen oder Abszessen auftreten. Kennzeichnend sind Dyspnoe mit in- und

exspiratorischem Stridor, Schluckschmerzen sowie eine kloßige Sprache. Bei der

Spiegeluntersuchung fallen starke Schwellungen und Rötungen der Epiglottis und

der Aryregion auf [Werda, 1994; Beck, 1997].

Perichondritis:

Die Perichondritis des Kehlkopfes wird vornehmlich durch Verletzung oder zu hohe

Tracheotomie hervorgerufen. Weitere Faktoren sind Entzündungen, vor allem nach

Bestrahlungen. Die Symptome sind Heiserkeit sowie ein zunehmender Stridor. Bei

der Laryngoskopie sind Rötungen, schmierige Beläge und ggf. auch

Knorpelnekrosen zu sehen [Werda, 1994].

Laryngitis chronica:

Die chronische Laryngitis, von der häufiger Männer als Frauen betroffen sind, hat

vielfältige Ursachen. Dazu gehören die akute Laryngitis, chronische Noxen wie

Nikotin, Arbeitsbelastungen durch Staub oder Hitze, chronische

Nasennebenhöhlenentzündungen, Stimmüberlastungen oder Bronchitiden.

Kennzeichnende Symptome sind Reizhusten sowie Globusgefühl mit ständigem

Räusperzwang. Die gesamte Larynxschleimhaut zeigt sich gerötet mit erweiterten

Gefäßen. Ebenfalls sind in einigen Fällen Schleim oder Eiter erkennbar. Die

Larynxmukosa ist ödematös oder atrophisch verändert [Werda, 1994].

Einleitung 9

Larynxtuberkulose:

Der Befall des Kehlkopfes bei der meldepflichtigen Tuberkulose macht sich durch

chronische Heiserkeit bemerkbar. Oft imponieren einseitig rötlichbraune Knoten,

Granulationen oder Ulzerationen an den Stimmbändern.

Ein Beispiel für eine traumatische Erkrankung ist die Kehlkopfsynechie. Als Folge

von Verätzungen durch Säuren und Laugen, durch Verbrühungen oder Operationen

entstehen Vernarbungen, die meist im vorderen Drittel der Stimmlippen lokalisiert

sind.

Benigne Tumoren

Polypen:

Die histologisch als Fibrome, Angiofibrome oder Intubationsgranulome

imponierenden Polypen werden überwiegend durch chronische Stimmbelastungen

und chronische Laryngitiden hervorgerufen. Je nach Größe und Lokalisation kommt

es zu mehr oder weniger ausgeprägter Heiserkeit. Bei der Spiegelung sieht man

gestielt oder breitbasig aufsitzende Tumoren mit bevorzugtem Sitz am freien

Stimmbandrand [Werda, 1994].

Reinke-Ödem:

Das Reinke-Ödem ist vorwiegend auf chronische Noxen, vor allem Nikotinabusus,

sowie unsachgemäßen Stimmeinsatz zurückzuführen und äußert sich durch

Heiserkeit. Bei der Untersuchung erkennt man ein subepitheliales Ödem der

Stimmbänder [Werda, 1994].

Sängerknötchen:

Sie sind meist beidseitig vorhanden und entstehen durch chronische

Überbeanspruchung der Stimme. Bei der Diagnostik ist eine Hyperkeratose im

Übergang vom vorderen zum mittleren Drittel der Stimmbänder vorhanden [Werda,

1994].

Papillome:

Papillome entstehen auf dem Boden einer Virusinfektion. Die blumenkohlartigen

Auflagerungen, die einzeln oder multipel auftreten können, führen zu Heiserkeit bis

hin zu Aphonie [Werda, 1994].

Einleitung 10

Laryngozele:

Unter einer Laryngozele versteht man eine Aussackung des Sinus Morgagni, die

angeboren oder – vor allem bei Glasbläsern und Trompetern – erworben sein kann

und sich durch Heiserkeit bemerkbar macht [Werda, 1994].

Retentionszyste:

Durch einen Einschluss von Schleim entstehen an der Epiglottis und im

Taschenband rundliche, glasige Tumoren, die bei Schmerzen und

Funktionseinschränkungen des Larynx reseziert werden [Werda, 1994].

Die wichtigste maligne Veränderung im Kehlkopf stellt das Larynxkarzinom dar. Die

Erkrankung ist multifaktoriell bedingt, wobei ein Kontakt mit chronischen Noxen wie

Nikotin oder Alkohol, eine berufliche Exposition gegenüber Asbest [Westhofen M.,

2001] aber auch präkanzeröse Veränderungen wie die Leukoplakie die Ausbildung

eines Kehlkopfkarzinoms begünstigen. Histologisch handelt es sich in der Mehrzahl

der Fälle um verhornende Plattenepithelkarzinome. Das wesentliche Symptom ist

eine anhaltende Heiserkeit, die über Wochen besteht. Daneben kommt es zu Husten,

Globusgefühl und in späteren Stadien zu Schluckbeschwerden. Aufgrund der

Lokalisation werden supraglottische, glottische, subglottische und

Hypopharynxkarzinome unterschieden. Wird ein Larynxkarzinom nicht behandelt,

führt es meist innerhalb von 12 bis 16 Monaten zum Tod [Werda, 1994].

Bei der Trachea unterscheidet man zwischen entzündlichen, traumatischen und

tumorösen Erkrankungen.

Entzündungen

Chronische Tracheobronchitis:

Bei der chronischen Tracheobronchitis ist häufig eine gemeinsame Beteiligung von

Larynx und Tracheobronchialsystem zu beobachten. In diesem Fall stellt Heiserkeit

das Hauptsymptom dar. Ist nur die Trachea betroffen, kommt es zu Reizhusten sowie

zum Auswurf eines schleimigen und meist farblosen Sekrets [Naumann & Scherer,

1998].

Einleitung 11

Tracheitis:

Die durch virale oder bakterielle Infektionen hervorgerufene Entzündung der

Luftröhrenschleimhaut ist durch weiße bis rötliche Schleimbeläge sowie eventuell

durch Eiter gekennzeichnet.

Als traumatische Erkrankung der Trachea ist die Trachealstenose anzusehen. Dabei

kommt es zu Vernarbungen der Luftröhrenwände, die angeboren oder erworben sein

können. Die Tracheomalazie kann – angeboren durch eine Erweichung der

Knorpelringe oder aber auch erworben durch Druck von außen, z.B. bei einer großen

Struma oder nach Tracheotomie – zu einer weichen Trachealstenose führen. Durch

Verletzungen oder nach Langzeitbeatmung entsteht meist eine starre

Trachealstenose. Die Atemnot entwickelt sich in der Mehrzahl der Fälle langsam,

kann aber auch akut lebensbedrohlich werden [Beck, 1997].

Bei den tumorösen Erkrankungen der Trachea unterscheidet man zwischen denen,

die als Primärtumor in der Trachea selber entstehen – dazu gehören Adenome,

Fibrome, Lipome und Karzinome – und denen, die von umliegenden

Gewebestrukturen in die Trachea einwachsen. Dies können Tumoren des

Ösophagus, der Schilddrüse oder des Mediastinums sein. Neben zunehmender

Atemnot findet man gelegentlich blutiges Sputum [Beck, 1997].

1.2 Neuropeptide

Neuropeptide sind Botenstoffe, die funktionell eine Zwischenstellung unter reinen

Hormonen und Neurotransmittern einnehmen. Ihre Wirkung ist durch die Vermittlung

langsamer, aber lang anhaltender endo- und parakriner Effekte gekennzeichnet. Da

sie jedoch lediglich einen unterstützenden oder hemmenden Einfluss auf andere

Transmitter ausüben, ohne eine eigenständige Reaktion hervorzurufen, werden sie

auch als Neuromodulatoren bezeichnet. Mehrere Neuropeptide können gleichzeitig

im selben Axonterminal kolokalisiert sein, zum Beispiel Substanz P und Calcitonin

gene-related peptide. Alle Neurotransmitter mit Ausnahme von Acetylcholin setzen

sich aus Aminosäuren, Derivaten von Aminosäuren oder Polypeptiden zusammen.

Nach der Biosynthese im Cytosol von Nervenzellen werden sie mit Hilfe eigener

Transportsysteme in spezifische, synaptische Vesikel aufgenommen. Der Transport

verläuft im Sinne eines sekundär aktiven Transmitter-Protonen-Antiportes, dessen

benötigter Protonengradient durch ATPasen aufgebaut wird. Nach Freisetzung der

Einleitung 12

Substanzen erfolgt an der postsynaptischen Membran die Bindung an bestimmte

Rezeptoren. Diese stellen überwiegend ligandenregulierte Ionenkanäle dar. Sobald

der Transmitter an den Rezeptor gebunden hat, wird er inaktiviert und danach

entweder auf enzymatischem Weg abgebaut oder mit Hilfe eines natriumabhängigen

Transportes in den präsynaptischen Bereich recycled. Neuropeptide kommen nicht

nur im Zentralnervensystem sondern auch im peripheren autonomen Nervensystem

vor. Dieses System wurde in einen extrinsischen und einen intrinsischen Teil

untergliedert, die beide den Gastrointestinaltrakt innervieren. Das extrinsische

System ist dadurch gekennzeichnet, dass die Neurone außerhalb des

Gastrointestinaltraktes lokalisiert sind: parasympathische Fasern erreichen entweder

auf direktem Weg oder über die prävertebralen Ganglien ihren Wirkungsort.

Sympathische Fasern ziehen zu den paravertebralen Ganglien oder verlassen als

Nervi splanchnici das Rückenmark. Beim intrinsic System liegen die Ganglien in

Form des Plexus myentericus und Plexus submucosus zwischen den

Muskelschichten beziehungsweise in der Submukosa, also innerhalb des

Verdauungstraktes. Beide Anteile des peripheren Nervensystems enthalten

peptiderge Überträgerstoffe, so dass von einem eigenständigen peptidergen

Nervensystem gesprochen werden kann. Während das intrinsische System VIP, SP,

CGRP und Bombesin enthält, konnten im extrinsischen System VIP und SP im

parasympathischen und sympathischen Anteil, Bombesin nur im sympathischen

Anteil und CGRP gar nicht nachgewiesen werden [Schusdziarra, 1985]. Zur

Freisetzung von Neuropeptiden kommt es vor allem bei hohen

Entladungsfrequenzen und bei gruppierten Entladungen der Neurone. Ihre Aufgabe

besteht in der Verstärkung oder Verminderung der Wirkung klassischer Transmitter

und der Aufrechterhaltung tonischer Effektorantworten bei langanhaltender

neuronaler Aktivierung. So spielen sie unter anderem eine Rolle bei der Nozizeption,

kardiovaskulärer Regulation, Drüsensekretion, Inflammation und bei der

neuroendokrinen Steuerung.

1.2.1 Vasoaktives intestinales Polypeptid

Das vasoaktive intestinale Polypeptid (VIP) wurde erstmals als vasodilatativ

wirkendes Peptid aus dem Darm isoliert. Es besteht aus 28 Aminosäuren mit

folgender Sequenz: His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Thy-Thr-Arg-Leu-Glu-Lys-

Glu-Met-Ala-Val-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Ser-Ile-Leu-Asn.

Einleitung 13

Obwohl ursprünglich als typisches „gastrointestinales Hormon“ kategorisiert, ist sein

Vorkommen mittlerweile sowohl im peripheren als auch im zentralen Nervensystem

gesichert. Gemeinsam mit Sekretin, Glukagon, GIP (gastric inhibitory peptide) und

PACAP (pituitary adenylate cyclase activating peptide) gehört es zur Sekretin-

Gruppe, die durch eine identische Aminosäuresequenz innerhalb der jeweiligen

Peptidketten gekennzeichnet ist. Nach der Synthese in Nervenendigungen und der

Freisetzung aus den synaptischen Vesikeln erfolgt die intrazelluläre

Wirkungsvermittlung über die Stimulation des Adenylatcyclasesystems [Said, 1987]

und der nachfolgenden Aktivierung einer cAMP-abhängigen Proteinkinase.

Zu den Hauptwirkungen von VIP gehört die Modulation der Magen-Darm-Motorik:

zusammen mit Stickstoffmonoxid (NO) führt VIP zu einer Hemmung der glatten

Muskulatur und damit insbesondere zu einer Relaxation des Magens und zur

Erschlaffung der Circulärmuskulatur des Darms. Auf die peristaltische Welle übt VIP

ebenso wie NO und ATP einen hemmenden Einfluss aus.

Während es in Darm, Pankreas und Leber unter VIP zu einer Stimulation der

Sekretion kommt, wird die HCl-Sekretion im Magen inhibiert.

Weiterhin stellt VIP einen starken Vasodilatator dar, was bezogen auf den

Verdauungstrakt mit einer Erhöhung der Darmdurchblutung verbunden ist.

In den synaptischen Vesikeln findet man das Neuropeptid häufig kolokalisiert mit

Acetylcholin, zum Beispiel in den cholinergen Neuronen zu Schweißdrüsen, zu

Speicheldrüsen und zu den Rankenarterien des erektilen Gewebes der

Genitalorgane.

Im menschlichen Kehlkopf konnte das vasoaktive intestinale Polypeptid bereits

nachgewiesen werden [Basterra et al., 1989; Hauser-Kronberger et al., 1993].

1.2.2 Substanz P

1931 entdeckten Euler und Gaddum eine Substanz in Extrakten von Gehirn und

Eingeweiden von Pferden, die nach i.v.-Applikation bei Kaninchen eine transiente

Hypotension hervorrief. Später testete man diese Substanz an isolierten

Eingeweiden und stellte fest, dass sie Acetylcholin-ähnliche Kontraktionen

verursachte, die durch ACh-Antagonisten nicht blockierbar waren. Den aktiven Teil

dieses Extraktes nannte man Substanz P, ein Neuropeptid aus 11 Aminosäuren

(Sequenz: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met; [Chang et al., 1971]).

Einleitung 14

Substanz P entsteht nach enzymatischer Abspaltung aus inaktiven Vorstufen – den

Preprotachykininen – im Soma der Zelle [Nawa et al., 1983] und wird über

axoplasmatische Mechanismen zu den Nervenendigungen transportiert [Keen et al.,

1982]. Zusammen mit Neurokinin A und Neurokinin B stellt es die Gruppe der

Tachykinine dar, die durch eine identische Aminosäuresequenz am Carboxy-

terminalen Ende definiert sind und an Neurokinin-Rezeptoren binden. Die

intrazelluläre Wirkungsvermittlung erfolgt über eine Phospholipase-C-Aktivierung.

Neben der Verbreitung in den sensiblen C-Fasern des ZNS und PNS konnte

Substanz P auch im Gastrointestinaltrakt, in Endothelzellen sowie in Eosinophilen

nachgewiesen werden [Hua et al., 1985; Lundberg & Saria, 1987; Loesch et al.,

1993; Stones et al., 1995; Cioni et al., 1998].

Die Freisetzung des Transmitters aus den Nervenendigungen erfolgt als Reaktion auf

exzitatorische, mechanische, chemische und entzündliche Reize. Wie viele andere

Neuropeptide spielt Substanz P bei der Schmerzleitung über sensible Fasern eine

Rolle und begünstigt zudem entzündungsfördernde Gefäßreaktionen wie

Plasmaextravasation oder Histaminfreisetzung mit anschließender Vasodilatation

[Goetzl et al., 1985; Maggi & Meli, 1987; Holzer, 1988].

Im Intestinaltrakt führt Substanz P zu einer Zunahme der intestinalen Motilität.

Im ZNS beeinflusst der Neurotransmitter inhibitorische Neurone. Im Gegensatz zu

dem dort dominierenden Transmitter GABA tritt die Wirkung der Neuropeptide

langsamer ein und ist überdies abhängig von der Frequenz eintreffender

Aktionspotentiale. Substanz P übernimmt neben nozizeptiven auch barorezeptive

und chemorezeptive Funktionen [von Euler & Pernow, 1954; Nagashima et al., 1989;

Chen et al., 1990].

Weitere Studien zeigen, dass SP wesentlich die Sekretion unterschiedlichster

Substanzen fördert: so stimuliert es beispielsweise die Sekretion von TNF-α, IL-1

und IL-6 aus peripheren Monozyten [Lotz et al., 1988]. In der Trachea trägt Substanz

P zur Sekretion des Trachealschleims bei, indem es sowohl die Sekretion seröser

Zellen steigert als auch an den Ausführungsgängen der Drüsen zur Kontraktion

myoepithelialer Zellen führt [Richardson & Webber, 1987].

1.2.3 Calcitonin gene-related peptide

Calcitonin gene-related peptide (CGRP) ist ein Neuropeptid, bestehend aus 37

Aminosäuren (Sequenz: Arg-Ala-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Thr-His-Arg-Leu-Ala-

Einleitung 15

Gly-Leu-Leu-Ser-Arg-Ser-Gly-Gly-Met-Val-Lys-Ser-Asn-Phe-Val-Pro-Thr-Asn-Val-

Gly-Ser-Lys-Ala), welches im Hypothalamus durch alternierendes Spleißen der

Calcitoningen-mRNA entsteht [Rosenfeld et al., 1981; Amara et al., 1982; Dockray,

1987].

Die Wirkung von CGRP wird über G-Protein gekoppelte Rezeptoren vermittelt.

Obwohl es auch in der Schilddrüse existiert, konnte nachgewiesen werden, dass

CGRP in wesentlich höheren Konzentrationen im ZNS vorhanden ist. Dort vor allem

im Hypothalamus, dem limbischen System, der Hypophyse, in den Perikarya des

Ganglion trigeminale, in den Axonen der C- und Aδ-Fasern und in den

Hirnnervenkernen [Gibson et al., 1984; Unger et al., 1991; Levine et al., 1993; van

Rossum et al., 1997].

Daneben tritt dieses Neuropeptid auch in Herz, Lungen, Gastrointestinaltrakt sowie

im peripheren Nervensystem – oft im Verbund mit der glatten Muskulatur von

Blutgefäßen – auf.

Durch Akkumulation von cAMP wirkt CGRP als starker, lang anhaltender peripherer

und zerebraler Vasodilatator [Brain et al., 1985; Edwards et al., 1991]. So bewirkt es

im peripheren Nervensystem eine Tachykardie mit Senkung des Blutdrucks [Sigrist et

al., 1986].

Injiziert man CGRP jedoch in das Ventrikelsystem, kommt es sowohl zu einem

Anstieg des Noradrenalinspiegels im Plasma als auch zu einer Tachykardie mit

Blutdruckzunahme.

Überdies kann man unter CGRP-Einfluss einen Abfall der Magensäure- und

Pepsinsekretion beobachten. Weiterhin spielt der Transmitter eine Rolle bei der

Hunger-Sättigungs-Regulation sowie bei der Regulation von Hormonen der

Thalamus-Hypophysen-Achse [Tannenbaum & Goltzman, 1985; Molina et al., 1990].

Im Hinblick auf die Kolokalisation mit anderen peptidergen Überträgerstoffen konnte

nachgewiesen werden, dass CGRP zusammen mit Tachykininen zu finden ist und

besonders auf Substanz P wirkungsverstärkende Effekte ausübt [Domeij et al., 1991;

Hauser-Kronberger et al., 1993; Luts et al., 1993; Smet et al., 1997; Nishi et al.,

2000]. So beeinflusst es bei Entzündungsmechanismen die Ödembildung in der Haut

von Ratten, indem es die permeable Wirkung von Substanz P verstärkt [Newbold &

Brain, 1993].

Einleitung 16

1.2.4 Bombesin

Im menschlichen Organismus konnte das Gastrin-releasing-peptide (GRP) als

humanes Äquivalent zum Peptid Bombesin nachgewiesen werden, welches in der

Haut von Amphibien der Familie Discoglossidae, Bombina Bombina und Bombina

variegata variegata zu finden ist [Anastasi et al., 1971; Dockray, 1987]. Es handelt

sich dabei um ein Peptid aus 14 Aminosäuren mit folgender Sequenz: Pyr-Gln-Arg-

Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met.

Hauptsyntheseorte dieses Peptids sind die im Antrum des Magens sowie in den

oberen Dünndarmabschnitten vorhandenen G-Zellen. Strukturell besteht eine enge

Verwandtschaft zum Cholezystokinin (CCK) mit Wirkungsvermittlung über den CCK-

B-Rezeptor. Die Kontrolle der Synthese und Sekretion von Bombesin erfolgt

hauptsächlich über Aminosäuren und Proteine im Magenlumen. So erfolgt eine

Stimulierung durch Nährstoffe, Magendehnung und Vagusreiz, wohingegen ein

luminaler pH<3, VIP sowie Somatostatin aus benachbarten Zellen zu einer

Synthesehemmung führen.

Bereits 1971 zeigten Anastasi et al. in Tierexperimenten eine große Anzahl

pharmakologischer Effekte, die durch Bombesin an verschiedenen Spezies

hervorgerufen wurden: Hypertension, Uterus-, Colon- und Ileumstimulation, erhöhte

Sekretion der Belegzellen im Magen, gesteigerter Transport von Chloridionen von

der serösen zur mukösen Seite der Magenmukosa, Gallenblasenkontraktion,

hyperglykämische Reaktionen sowie erhöhte Insulinspiegel im peripheren Blut.

Nach Aktivierung der Phospolipase C stimuliert Bombesin besonders im

Pankreasgewebe die Enzymsekretion von Acinuszellen über eine Mobilisierung

intrazellulärer Calciumspeicher. Im Jahre 1973 schrieben Impicciatore und Bertaccini

dem Neuropeptid eine hochpotente spasmogene Wirkung zu, die nicht durch

Antagonisten gegen bekannte Bronchokonstriktoren blockierbar ist. Daraus

schlossen sie, dass Bombesin entweder auf direktem Weg die Atemmuskulatur

beeinflusst oder die Freisetzung anderer spasmogener Substanzen fördert.

In den letzten Jahren zeigte sich, dass Bombesin überdies an Reparaturvorgängen

beteiligt ist, indem es die Proliferation und Chemotaxis von Wachstumsfaktoren wie

3T3- und IMR-90-Fibroblasten sowie EGF fördert [Yule & White, 1999; Lunn et al.,

2000].

Material 17

2 Material

2.1 Erstellung der Paraffinschnitte

Schnitte von 4 µm Dicke mit dem Mikrotom von LEICA „RM 2145“ mit Hilfe des

Messers „Shandon Mikrotome Blades MB35 by Kai 35°/80mm“.

Silanisieren der Objektträger: 5-10 Minuten in 70%igen Alkohol

trocknen lassen

5 Minuten in Aceton-Silan Mischung (9:1)

3 x 3 Minuten in Aceton

3 x 3 Minuten in Aqua dest.

24 Stunden im Brutschrank bei 37°C

2.2 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode

Xylol

absteigende Alkoholreihe: 100%, 96%, 70%

116 ml Methanol + 4 ml H2O2

PBS: 9,55 g PBS auf 1000 ml Aqua

BSA: 1 ml 10%iges BSA auf 9 ml PBS

Primärantikörper:

VIP: polyklonal, Rabbit Anti VIP, von Serotec, BatchNo: 210498, PEPA 41

Substanz P: polyklonal, Rabbit Anti Human Substance P, von Serotec, BatchNo:

060298, PEPA 40

CGRP: polyklonal, Rabbit Anti CGRP, von Serotec, BatchNo: 251198, PEPA 27

Bombesin: polyklonal, Rabbit Anti Bombesin, von Serotec, BatchNo: 181298,

PEPA 23

Protein S-100: polyklonal, Rabbit Anti Cow S-100, von DAKO A/S, Denmark,

CodeNo: Z 0311, Lot/Ch.-B.: 017(201)

Material 18

Sekundärantikörper:

Goat Anti-Rabbit Immunglobulin Biotin, polyklonal, von DAKO A/S, Denmark,

CodeNo: E 0432

Tertiärantikörper:

Streptavidin-Biotin-Complex, “Victor” Laboratories, “Elite”, Vectastain ABC

Färbelösung: 0,6 g Trishydroxymethylaminomethan

+ 100 ml Aqua dest.

mit 1 N HCl auf pH 7,6

+ 6 Tabletten 3,3´-Diaminobenzidin, DAB von Sigma, Lot 119 H

8202

+ 48 µl H2O2

Hämalaun

aufsteigende Alkoholreihe: 70%, 96%, 100%

Xylol

Vitro-Clud

Deckgläser

Geräte zur Immunhistochemie:

Objektträgerhalter

Küvetten

Eppendorf-Pipetten

Immunhistokammern

2.3 Fotodokumentation

Kamera: Olympus BH2, Olympus-Mikrofotographie-System

Film: Epy 64T von Kodak

Vergrößerung: x 500

Methoden 19

3 Methoden

3.1 Auswahl der Präparate

Insgesamt wurden 25 Trachea- und 10 Stimmlippenpräparate untersucht. Alle 25

Gewebeproben aus der Trachea sowie 6 Proben der Stimmlippen wurden von

Patienten gewonnen, die sich aufgrund eines Larynxkarzinoms in der Hals-, Nasen-,

Ohrenklinik der RWTH Aachen einer Laryngektomie unterzogen. Die Entnahme

eines geringen Teils der proximalen Trachea diente bei diesen Operationen der

Exzision im Gesunden und stellte somit den unteren Absetzungsrand des

entnommenen Gewebes dar; der Larynx wurde komplett entfernt. Sowohl durch die

makroskopische Beurteilung als auch durch die histologische Befundkontrolle konnte

in allen Fällen gesichert werden, dass die verwerteten Stimmlippen- und

Tracheaanteile vollständig frei von Tumorzellen waren.

Die vier anderen Proben wurden im Rahmen klinischer Sektionen in der Pathologie

der RWTH Aachen zur Verfügung gestellt. In diesen vier Fällen wurde den jeweiligen

Leichen, die nachweislich nicht an einer Erkrankung des Kehlkopfes gestorben sind,

eine Probe der gesunden Stimmlippe entnommen.

Von den insgesamt 25 Tracheapräparaten konnte im Nachhinein anhand der

vorliegenden schriftlichen Befunde erhoben werden, dass es sich in 11 Fällen (44%)

um Gewebeproben von Patienten handelte, die eine positive Raucheranamnese

aufwiesen. 2 Patienten (8%) waren Nichtraucher; bei den restlichen 12 Patienten

(48%) fehlten jegliche Angaben bezüglich eines Nikotinkonsums.

Von den 10 Stimmlippenpräparaten konnten 3 Gewebeproben (30%) zu Rauchern

zurückverfolgt werden. Bei den anderen 7 Patienten (70%) lag keine schriftliche

Dokumentation hierüber vor.

Da 4 Neuropeptide hinsichtlich ihrer Expression und Verteilung in 35 verschiedenen

Präparaten untersucht wurden, sind insgesamt 140 Schnitte angefertigt worden.

Dabei wurden folgende Ausschlusskriterien berücksichtigt:

1. tumoröses Gewebe

2. zu kleine Gewebeanteile, die aus histologischer Sicht nicht zur Beurteilung

ausreichten

Methoden 20

3. floride Entzündungen

4. Dysplasien

3.2 Fixierung und Einbettung

Nach der Gewebeentnahme wurden die Präparate für 12 bis 24 Stunden in 4%ig

gepuffertes Formaldehyd gegeben, welches das Gewebe mit einer Geschwindigkeit

von 1 mm/h penetriert. Die Pufferung verhindert die Entstehung eines sauren Milieus,

das sich aufgrund der langsamen Oxidation von Formaldehyd zu Ameisensäure

einstellen würde. Das Fixativ dient dazu, die Gewebebestandteile zu immobilisieren

sowie eine ausreichende Gewebefestigkeit für den Schneidevorgang zu

gewährleisten. Diese Eigenschaften resultieren aus der von Formaldehyd

hervorgerufenen Quervernetzungen, die auf einer Reaktion mit Aminogruppen von

Proteinen basieren. Anschließend erfolgte in speziell dafür vorgesehenen Kapseln

die Einbettung in Paraffin, einem komplexen Kohlenwasserstoff, der das Herstellen

größerer Schnittserien ermöglichte. Da das Paraffingemisch bei 56°C bis 58°C

schmilzt, wurden die Proben in flüssigem Paraffin inkubiert und damit übergossen,

um das Eindringen des Paraffins auch in der Tiefe des Gewebes zu gewährleisten.

Bei Raumtemperatur lag nach dem Abkühlen ein relativ fester Block vor, der mit Hilfe

des Mikrotoms weiter bearbeitet werden konnte.

3.3 Erstellung der Paraffinschnitte

Von jedem Paraffinblock wurden am Mikrotom Schnitte von 4 µm Dicke erstellt, von

denen je nach Größe des Präparates ein bis drei Schnitte auf einen silanisierten

Objektträger im Wasserbad aufgezogen wurden. Anschließend verblieben die

Objektträger für mindestens 24 Stunden in einem Brutschrank bei 37°C.

3.4 Immunhistochemie an den Paraffinschnitten nach der Avidin-Biotin-Methode

Zu Beginn der Untersuchung wurde der mattierte Rand der Objektträger sowohl mit

der Herkunft des Gewebes als auch mit dem Typ des darauf zu inkubierenden

Primärantikörpers beschriftet und, je nach Primärantikörper sortiert, in die dafür

vorgesehenen Objektträgerhalter geordnet. Zum Entparaffinieren der Objektträger

Methoden 21

wurden diese nun für 10 Minuten in Xylol getaucht. Die sich daran anschließende

absteigende Alkoholreihe mit 100%igem, 96%igem und 70%igem Alkohol – jeweils 5

Minuten – diente der Xylolentfernung und wurde nach der ersten Alkoholstufe

lediglich für 5 Minuten von einem Aqua-H2O2-Gemisch zur Hemmung der endogenen

Peroxidase unterbrochen. Dann wurden die Objektträger zweimal mit Aqua dest.

gespült und anschließend in eine Küvette mit phospate-buffered-saline (= PBS; pH

7,5) gestellt.

Zum Auftragen der Antikörper wurden maximal 60 Objektträger in sogenannten

Immunhistokammern untergebracht.

Nun erfolgte die Inkubation mit den Primärantikörpern, deren jeweilige Verdünnung

mit Hilfe von 1%igem Bovinen-Serum-Albumin (= BSA) vorher hergestellt werden

musste. Das BSA diente der Hemmung des Hintergrundgewebes. Es wurde mit

folgenden Verdünnungen gearbeitet:

VIP 1:100 (Neuropeptid)

Substanz P 1:100 (Neuropeptid)

CGRP 1:100 (Neuropeptid)

Bombesin 1:100 (Neuropeptid)

Protein S-100 1:500 (Marker zur Sichtbarmachung von Nervenfaszikeln

und Ganglienzellen)

Mit einer Eppendorf-Pipette wurden jeweils 0,1 ml der Primärantikörperlösung auf die

Objektträger aufgebracht, wobei auch die Positivkontrollen (Material aus der

Duodenalschleimhaut), nicht jedoch die Negativkontrollen benetzt wurden. Die

Inkubation erfolgte nun bei geschlossener Immunhistokammer für eine Stunde.

Danach wurde zweimal mit PBS gespült.

Der polyklonale Sekundärantikörper Goat Anti-Rabbit-Immunglobulin Biotin (Fa.

DAKO, Denmark) wurde mit BSA auf eine Verdünnung von 1:500 gebracht. 0,1 ml

der Sekundärantikörperlösung wurde auf alle Objektträger – inklusive der

Negativkontrollen – pipettiert, diese bei geschlossener Kammer für 30 Minuten ruhen

gelassen und dann wieder zweimal mit PBS gespült.

Methoden 22

Während dieser Zeit wurde der Tertiärantikörper in einer Konzentration von 1:50

hergestellt. Dazu verwendeten wir den Avidin-Biotin-Enzym-Komplex (ABC-

Methode). Es handelte sich dabei um eine sensitive, indirekte Nachweismethode, die

auf der hohen Bindungsaffinität von Avidin, einem Hühnereiweiß-Glykoprotein, zum

Biotin (Vitamin H) beruhte. Der Komplex wurde über den biotinylierten

Sekundärantikörper an den Primärantikörper gekoppelt. Nach Aufbringen des

Tertiärantikörpers und einer 30- minütigen Inkubation mit anschließender zweimaliger

PBS-Spülung wurden die Objektträger wieder in den Objektträgerhalter geordnet und

in eine mit PBS gefüllte Küvette gestellt.

Die Antigen-Antikörper-Komplexe konnten mit Hilfe einer Färbung sichtbar gemacht

werden. Dazu wurden 0,6 g TRIS-Puffer in 100 ml Aqua dest. auf einen pH-Wert von

7,6 gebracht und mit 3,3´- Diaminobenzidin gut vermischt. Nach Zusatz von 48 µl

H2O2 zur Hemmung der unspezifischen Peroxidase wurde das PBS aus den

Küvetten abgegossen und diese mit der Diaminobenzidinlösung gefüllt. Die

Objektträger wurden nun für 2 Minuten in Lösung gebracht und anschließend mit

Aqua dest. gespült. Danach erfolgte für ca. 15 Sekunden die Gegenfärbung mit

Hämalaun, gefolgt von einer Spülung mit Aqua dest..

Zur Entwässerung der gefärbten Schnitte wurden die Objektträger nun in eine

aufsteigende Alkoholreihe gebracht: 2 Minuten in 70%igem, 2 Minuten in 96%igem

und 4 Minuten in 100%igem Alkohol. Abschließend wurden die Objektträger kurz in

Xylol gestellt und mit Hilfe von Vitro-Clud eingedeckelt.

Die fertigen Präparate wurden mit einem Lichtmikroskop in 500facher Vergrößerung

untersucht und dann zur Dokumentation mit einem Farbfilm (Epy 64T von Kodak)

umgehend fotografiert (Olympus BH2, Olympus-Mikrofotographie-System).

Methoden 23

Abbildung 3.1: Immunhistochemie nach der ABC-Methode. Der Avidin-Biotin-Enzym-Komplex

bindet über einen biotinylierten Sekundärantikörper an den Primärantikörper.

Primärantikörper

Biotinylierter Sekundärantikörper

Primärantikörper


Primärantikörper


Avidin-Biotin-Enzym-KomplexAvidin-Biotin-Enzym-KomplexAvidin-Biotin-Enzym-Komplex

3.5 Positivkontrollen / Negativkontrollen

Als Positivkontrolle diente Dünndarmgewebe, welches mit Antikörpern gegen die

erwähnten Transmitter immunhistochemisch gefärbt wurde.

Die negative Kontrolle führten wir mit Proben aus der Trachea durch.

Zur Sichtbarmachung von nervalen Strukturen innerhalb der jeweiligen Gewebe

benutzten wir den Marker Protein S-100 (DAKO, Denmark).

Methoden 24

Abbildung 3.2: Protein S-100; Stimmlippe; Vergrößerung: 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. Nervenfaszikel (Pfeilmarkierung) im Stroma des

Stimmlippengewebes.

3.6 Bewertungskriterien

Die lichtmikroskopische Auswertung von Expression und Verteilung der einzelnen

Antikörperfärbungen erfolgte im Hinblick auf die folgenden histologischen Strukturen:

Epithel; ggf. Flimmersaum; ggf. Basalmembran

Stroma und Blutgefäße

seröse Drüsen

muköse Drüsen

ggf. angeschnittene Ausführungsgänge

Nervenfaszikel

Um dabei eine einheitliche Beurteilung zu erzielen, wurde ein semiquantitatives

Bewertungsschema herangezogen, welches die unterschiedliche Intensität der

Methoden 25

Braunfärbung der untersuchten Gewebestrukturen in Form einer Plus-

/Minusabstufung darstellt. Somit wurde ein direkter Vergleich der Ergebnisse

zwischen Trachea- und Larynxgewebe möglich.

Definition der Plus-/Minusabstufung:

- keine Expression, d.h. keine braungefärbten Strukturen

+/- Expression in weniger als 50% des Gewebes

+ geringe Expression

++ mäßige Expression

+++ starke Expression

++++ sehr starke Expression

Ergebnisse 26

4 Ergebnisse

4.1 Patientendaten

4.1.1 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Larynx

on den 10 entnommenen Stimmlippenpräparaten handelte es sich in 8 Fällen um

die Gewebeproben männlicher, in 2 Fällen um Proben weiblicher Patienten. Das

2 2

4

2

0

1

2

3

4

Anzahl der Patienten

40-49 50-59 60-69 70-79Alter der Patienten

Abbildung 4.1: Altersverteilung – Larynx

V

Alter variierte zwischen 40 und 77 Jahren und betrug im Mittel 60,6 Jahre.

Ergebnisse 27

4.1.2 Altersverteilung und Geschlecht der Patienten – Trachea

ie 25 Tracheapräparate stammten von Patienten, die zwischen 40 und 76 Jahren

alt waren; der Altersdurchschnitt betrug 60,08 Jahre. Es handelte sich in 23 Fällen

2

10 10

3

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Anzahl der Patienten

40 - 49 50 - 59 60 - 69 70 - 79

Alter der Patienten

Abbildung 4.2: Altersverteilung – Trachea

D

um Gewebeproben männlicher und in 2 Fällen um Proben weiblicher Patienten.

Ergebnisse 28

4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Larynxpräparate


00fach; Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun.

VIP-haltige seröse Drüsen (Pfeilmarkierung) im Verband mit mukösen Drüsen,

Sowohl innerhalb der Epithelzellen als auch in der Basalmembran wurde das

Neuropeptid Vasoaktives intestinales Polypeptid nur gering exprimiert (+). Der

inem Verband von Drüsenzellnestern liegen und

n nach

llen 10 untersuchten Gewebeproben aus Stimmlippen einheitlich zu einem

Muköse Drüse

Seröse Drüse

Fibrozyt

Muköse Drüse

Seröse Drüse

Fibrozyt

Abbildung 4.3: VIP; Stimmlippe; Vergrößerung 5

die VIP-negativ sind. Im Stroma Fibrozyten mit geringer Neuropeptidexpression.

Flimmersaum enthielt kein VIP (-).

Die Neuropeptidexpression in Fibrozyten und Blutgefäßen fiel gering aus (+).

Die serösen Drüsen, die meist in e

immer gemeinsam mit mukösen Drüsenanteilen vorhanden sind, zeigte

immunhistochemischer Färbung eine mäßige Expression von Vasoaktivem

intestinalen Polypeptid (++). Dagegen enthielten die mukösen Drüsenanteile kein VIP

(-).

Die Untersuchungen bezüglich der Exprimierung von VIP in Nervenfaszikeln führten

in a

Ergebnisse 29

negativen Ergebnis. Weder die zwischen der Muskulatur gelegenen Nervenfasern

noch diejenigen entlang der Blutgefäße oder innerhalb der Drüsenzellnester

demonstrierten einen Gehalt an VIP (-).

Ergebnisse 30

4.2.2 Substanz P

bstanz P; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach, Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. Mit Pfeilen dargestellt die serösen Drüsen eines

Substanz P wurde im Epithel in einer mäßigen Konzentration exprimiert (++). Der

Flimmersaum und die Basalmembran zeigten einen geringen Gehalt an Substanz P

en durch den Neurotransmitter ebenfalls mäßig angefärbt (++).

Muköse Drüse

Seröse Drüse

AusführungsgangCytoplasma

Muköse Drüse

Seröse Drüse

AusführungsgangCytoplasma

Abbildung 4.4: Su

Ausführungsganges, die in mäßiger Konzentration Substanz P exprimierten.

Unten eine muköse Drüse ohne Substanz P. Das Cytoplasma mit mäßiger

Neuropeptidexpression.

(+).

Die im Stroma des Stimmlippengewebes liegenden Fibrozyten und Blutgefässe

wurd

Die serösen Drüsen zeigten einen mäßigen Gehalt an Substanz P (++); muköse

Drüsenanteile enthielten kein Substanz P (-).

Die Nervenfaszikel im Stimmlippengewebe, die auf Substanz P untersucht wurden,

zeigten keinerlei Reaktionen (-).

Ergebnisse 31


Abbildung 4.5: CGRP; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

braun angefärbtes und somit nicht CGRP-haltiges

Feld muköser Drüsen, unten ein mäßig braun gefärbtes seröses Drüsenfeld.

Nach immunhisto

Neuropeptids Cal n des Epithels (++)

nachgewiesen werden. Etwas geringer (+) wurde es im Flimmersaum und in der

Basalmembran exprimiert.

Der Gehalt an CGRP in den Fibrozyten war stark (+++), derjenige in den Blutgefäßen

mäßig (++).

Während die mukösen Drüsenanteile einheitlich kein CGRP enthielten (-), konnte in

mäßiger Expression (++) dieses Neuropeptid in den serösen Drüsen nachgewiesen

werden.

Die im Präparat enthaltenen Nervenfaszikel wurden durch die Färbung mit CGRP

gering dargestellt (+).

Muköses Drüsenfeld

Seröses Drüsenfeld

Fibrozyten



Fibrozyten

Hämalaun. Oben ein nicht

Dazwischen Fibrozyten mit hohem Gehalt an CGRP.

chemischer Färbung konnte eine mäßige Expression des

citonin gene-related peptide in den Zelle

Ergebnisse 32

4.2.4 Bombesin

Abbildung 4.6: Bombesin; Stimmlippe; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. Dargestellt sind muköse Drüsenfelder ohne Bombesingehalt. Rechts

ein Ausführungsgang mit stark angefärbten serösen Drüsen. In den Fibrozyten

wurde Bombesin sehr stark exprimiert.

Innerhalb des Epithels wurde Bombesin mäßig (++) exprimiert. Der Flimmersaum

enthielt wenig Bombesin (+). Eine sehr starke Expression des Neuropeptids (++++)

konnte in der Basalmembran nachgewiesen werden.

Innerhalb des umgebenden Stromas zeigten die Fibrozyten einen sehr hohen

Bombesingehalt an (++++), in den Blutgefäßen wurde eine starke Expression

festgestellt (+++).

Während die serösen Drüsen Bombesin in mäßiger Konzentration enthielten (++),

zeigten die mukösen Drüsen keinerlei Gehalt an (-).

Die angeschnittenen Nervenfaszikel exprimierten den Transmitter gering (+).

Ausführungsgang


Fibrozyten

Ausführungsgang


Fibrozyten

Ergebnisse 33

4.3 Ergebnisse der immunhistochemischen Färbung der Tracheapräparate


Abbildung 4.7:

Pfeilen dargestellt sind seröse Drüsen, die im Gegensatz zu den abgebildeten

färbung im Sinne einer mäßigen VIP-

Expression aufzeigen.

Im Epithel wurde das Neuropeptid VIP sowohl im Cytoplasma der Zellen als auch in

der Basalmembran gering exprimiert (+). Der Flimmersaum enthielt kein VIP (-).

Im Stroma konnte der Transmitter gering in den Fibrozyten gefunden werden (+); die

Blutgefäße enthielten mäßig VIP (++).

Eine mäßige VIP-Expression zeigte sich in den serösen Anteilen der Drüsen (++).

Die mukösen Drüsen führten beim Antikörpernachweis zu einem negativen Ergebnis

(-).

Nervenfaszikel enthielten kein VIP (-).

VIP; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Mit

mukösen Drüsen eine deutliche Braun

Ergebnisse 34

4.3.2 Substanz P

Abbildung 4.8: Substanz P; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. Nicht angefärbte muköse Drüsenanteile neben Fibrozyten mit

mäßiger Substanz-P-Expression (Pfeile). Ebenso gelang ein mäßiger Nachweis

Arteriole

Muköse Drüse

Arteriole

Muköse Drüse

in Blutgefäßen.

Die Untersuchung zur Expression von Substanz P in der Trachea führte im

Ergebnis (+). Der F

Die Fibrozyten und Blutgefäße wiesen ebenfalls eine mäßige Expression auf (++).

In allen untersuchten Präparaten gelang ein geringer Nachweis von Substanz P in

rten

ion auf den Transmitter (-).

Cytoplasma der Epithelzellen und in der Basalmembran zu einem gering positiven

limmersaum zeigte eine mäßige Expression (++).

den serösen Drüsen nur in weniger als 50% der Fälle (+/-), d.h. mehr als die Hälfte

der Drüsen zeigten ein negatives Ergebnis. Die mukösen Drüsenanteile exprimie

einheitlich kein Substanz P (-).

Die Nervenfaszikel zeigten keine Reakt

Ergebnisse 35


RP; Trachea; Vergrößerung 500fach. Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun.

Dargestellt sind Nervenfaszikel mit sehr hoher Expression von CGRP (Pfeile),

sowie Anteile von mukösen Drüsen, die einen mäßigen Gehalt an CGRP

Im Hinblick auf da

Basalmembran zu Expression (+) von Calcitonin gene-related peptide.

ng

Arteriole

Muköse Drüse

Arteriole

Muköse Drüse

Abbildung 4.9: CG

aufweisen. Rechts oben eine Arteriole mit mäßiger CGRP-Expression.

s Tracheaepithel kam es innerhalb des Cytoplasmas und in der

einer geringen

Im Flimmersaum gelang ein mäßiger Nachweis des Neurotransmitters (++).

Starke Expressionen von CGRP konnten in den Fibrozyten festgestellt werden (+++),

mäßige Expressionen innerhalb von Blutgefäßen (++).

Während seröse Drüsen in weniger als 50% der Fälle CGRP aufwiesen (+/-), gela

der Nachweis einer zumindest mäßigen Expression in den mukösen Anteilen der

Drüsen (++).

Die Nervenfaszikel in den jeweiligen Präparaten enthielten sehr starke Anteile von

CGRP (++++).

Ergebnisse 36

4.3.4 Bombesin

Abbildung 4.10: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun. Die Pfeile deuten auf Nervenfaszikel mit hoher Bombesin-

Drüsenfeld enthält kein Bombesin. Die Fibrozyten

zeigen einen hohen Transmittergehalt.

Innerhalb des Epithels kam es zu einer unterschiedlichen Bombesinexpression: das

Cytoplasma enth

Transmitter nur in ession

konnte in der Basalmembran festgestellt werden (++++).

Die Expression von Bombesin in den Fibrozyten war stark (+++), diejenige in

Blutgefäßen mäßig (++) ausgeprägt.

Im Hinblick auf die in den Präparaten befindlichen Drüsenzellnester zeigten die

serösen Drüsen einen mäßigen Gehalt an Bombesin (++). Die mukösen Drüsen

reagierten nicht auf die Antikörperfärbung (-).

Die Untersuchung wies innerhalb der Nervenfaszikel eine starke Expression von

Bombesin (+++) nach.


Ausführungsgang

Fibrozyten


Ausführungsgang

Fibrozyten

Expression. Das muköse

ielt wenig Bombesin (+); der Flimmersaum exprimierte den

weniger als 50% der Fälle (+/-); eine sehr starke Expr

Ergebnisse 37

Abbildung 4.11: Bombesin; Trachea; Vergrößerung 500fach; Färbung: Diaminobenzidin-

Hämalaun: Die Pfeile zeigen auf die intensiv braun angefärbte Lamina propria;

in Zeichen für eine sehr starke Expression von Bombesin innerhalb der

Basalmembran.

Flimmersaum

Lamina propria

Flimmersaum

Lamina propria

e

Ergebnisse 38

4.4 Ergebnis der Positivkontrollen

Abbildung 4.12:

eile) als Zeichen einer VIP-Expression in der

Duodenalschleimhaut.

Die Positivkontrollen mit Gewebe aus der Duodenalschleimhaut reagierten auf die

Neuropeptide Vasoaktives intestinales Polypeptid, Substanz P, Calcitonin gene-

related peptide und Bombesin positiv. Stellvertretend für alle Positivkontrollen ist in

der vorliegenden Abbildung das Färbeergebnis mit dem Primärantikörper VIP

dargestellt.

Becherzelle

Dünndarmkrypte

Becherzelle

Dünndarmkrypte

Positivkontrolle mit VIP; Duodenalschleimhaut; Vergrößerung 500fach;

Färbung: Diaminobenzidin-Hämalaun. Braungefärbte Epithelzellen und

Fibrozyten (Pf

Ergebnisse 39

4.5 Ergebnis der Negativkontrollen

P; Trachea; Vergrößerung 500fach, Färbung:

Diaminobenzidin-Hämalaun. Keine Braunfärbung im Sinne eine Substanz-P-

Die Tracheaprä

immunhistochemischen Färbevorgang ohne das Auftragen des Primärantikörpers –

hier Substanz P – unterzogen wurden, zeigten einheitlich eine reine Gegenfärbung

Abbildung 4.13: Negativkontrolle ohne Substanz





Expression sichtbar.

parate, die im Rahmen der Negativkontrolle dem

mit Hämalaun.

Ergebnisse 40

4.6 Tabellarische Ergebnisübersicht

4.6.1 Larynx

der Neuropeptide an unterschiedlichen

histologischen Strukturen des Larynx. Drüsen waren nur in Einzelfällen

nachweisbar. n = 10 Stimmlippenpräparate.

Die vier untersuch

Larynx nachgewiesen werden, jedoch mit unterschiedlichen Intensitäten bezogen auf

Der Flimmersaum enthielt kein VIP, jedoch in geringem Maße Substanz P, CGRP

und Bombesin.

Die Expressionen in der Basalmembran waren bei Bombesin sehr stark, bei den

restlichen Transmittern gering.

Fibrozyten und Blutgefäße reagierten auf die Neuropeptide in folgender

aufsteigender Intensität: VIP < Substanz P < CGRP < Bombesin.

Alle vier Transmitter wurden in den serösen Drüsen mäßig exprimiert.

Tabelle 4.1: Intensität der Immunreaktionen

Legende:Cytopl.: CytoplasmaFs.: FlimmersaumBs.: Basalmembran

NervCytopl. Fs. Bs. Fibrocyt. Blg. Serös Mukös

VIP + - + + + ++ - -

SP ++ + + ++ ++ ++ - -

CGRP ++ + + +++ ++ ++ - +

BN ++ + ++++ ++++ +++ ++ - +

Epithelzellen Stroma Drüsen

Fibrocyt.: FibrozytenBlg.: Blutgefäße



VIP + - + + + ++ - -

SP ++ + + ++ ++ ++ - -

CGRP ++ + + +++ ++ ++ - +

BN ++ + ++++ ++++ +++ ++ - +

Epithelzellen Stroma Drüsen


ten Transmitter VIP, Substanz P, CGRP und Bombesin konnten im

die einzelnen histologischen Strukturen:

Im Cytoplasma der Epithelzellen wurden geringe Expressionen durch VIP, mäßige

Expressionen durch die drei anderen Peptide erzielt.

Ergebnisse 41

Die mukösen Drüsen reagierten nicht auf die immunhistochemischen Färbungen.

Nervenfaszikel exprimierten nur CGRP und Bombesin.

Ergebnisse 42

4.6.2 Trachea

Tabelle 4.2: Intensität der Immunreaktionen der Neuropeptide an unterschiedlichen

histologischen Strukturen der Trachea. n = 25 Tracheapräparate.

In der Trachea wurden VIP, Substanz P, CGRP und Bombesin von den jeweiligen

histologischen Strukturen in unterschiedlichem Maße exprimiert:

Alle untersuchten Transmitter wurden vom Cytoplasma der Epithelzellen in geringer

Menge exprimiert.

Während im Flimmersaum VIP überhaupt nicht und Bombesin nur in weniger als

50% der Fälle gefunden werden konnte, gelang ein mäßiger Nachweis von Substanz

P und CGRP.

Die Basalmembran enthielt auffällig viel Bombesin (sehr starke Expression),

hingegen nur gering VIP, Substanz P und CGRP.




VIP + - + + ++ ++ - -

SP + ++ + ++ ++ +/- - -

CGRP + ++ + +++ ++ +/- ++ +++

BN + +/- ++++ +++ ++ ++ - ++++

DrüsenEpithelzellen StromaEpithelzellen Stroma




VIP + - + + ++ ++ - -

SP + ++ + ++ ++ +/- - -

CGRP + ++ + +++ ++ +/- ++ +++

BN + +/- ++++ +++ ++ ++ - ++++

Drüsen

Von den Fibrozyten wurden die Neuropeptide in folgender Intensitätszunahme

exprimiert: VIP < Substanz P < CGRP = Bombesin.

Alle in den Präparaten befindlichen Blutgefäße enthielten die vier Peptide in mäßiger

Konzentration.

Ergebnisse 43

Während bezogen auf die serösen Drüsen bei Substanz P und CGRP nur ein

Nachweis in 50% der Fälle gelang, kam es bei VIP und Bombesin zu mäßigen

Reaktionen.

Bis auf CGRP, welches von den mukösen Drüsen mäßig exprimiert wurde, führten

die Untersuchungen der drei anderen Neuropeptide an dieser histologischen Struktur

zu negativen Ergebnissen.

Während VIP und Substanz P in Nervenfaszikeln nicht gefunden werden konnten,

kam es dort zu starken CGRP- und sehr starken Bombesinexpressionen.

Diskussion 44

5 Diskussion

der Vergangenheit zahlreiche Studien zur Untersuchung von

1983; Hisa et al., 1992; Hauser-Kronberger et al., 1992,

1993, 1994, 1997], gibt es bis heute nur ganz wenige Untersuchungen zur

Dies kann

unter anderem damit zusammenhängen, dass seltener Eingriffe an der Trachea

vorgenommen werden. So wurden auch in der vorliegenden Untersuchung die

Proben der Trachea vorwiegend im Rahmen von Larynxresektionen bei

diagnostiziertem Larynxkarzinom gewonnen. Obwohl die trachealen

Absetzungsränder in allen Fällen histologisch unauffällig waren, können

Veränderungen auf molekularer Ebene nicht sicher ausgeschlossen werden. Ob

derartige, mögliche Veränderungen die vorliegenden Untersuchungsergebnisse

beeinflusst haben, bleibt daher offen.

Sowohl in den 10 Stimmlippen- als auch in den 25 Tracheapräparaten konnten die

vier untersuchten Neuropeptide Vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP), Substanz

P (SP), Calcitonin gene-related peptide (CGRP) und Bombesin (BN) nachgewiesen

werden. In diesem Punkt stimmen die erzielten Ergebnisse mit den vorhandenen

Mitteilungen überein [Albegger et al., 1991; Domeij et al, 1991; Hauser-Kronberger et

al., 1993; Luts et al., 1993; Nishi et al., 2000].

Die vorliegende Untersuchung zeigte, dass nicht alle Peptide gleich stark in den

untersuchten Geweben exprimiert wurden. Die Ergebnisse der Stimmlippen- und

Tracheapräparate zeigten übereinstimmend, dass die Expressionsintensität von VIP

am schwächsten war, gefolgt von Substanz P über CGRP bis hin zu Bombesin als

dem am stärksten vertretenen Neuropeptid. Hauser-Kronberger et al., 1994, wiesen

im Gegensatz dazu bei VIP die höchsten Gewebskonzentrationen und bei SP und

CGRP wesentlich geringere Konzentrationen nach. Ghatei et al., 1983, untersuchten

das Vorhandensein von VIP und Bombesin in der fetalen Lunge und kamen zu

eindeutig höheren Gewebskonzentrationen von Bombesin als VIP, was mit den

vorliegenden Ergebnissen übereinstimmt. Diese zunächst widersprüchlich

erscheinenden Ergebnisse können darauf zurückzuführen sein, das frühere Studien

Während in

Neuropeptiden in unterschiedlichen Regionen des respiratorischen Systems

verschiedener Tierarten als auch des Menschen durchgeführt wurden [u.a. Anastasi

et al., 1971; Ghatei et al.,

Neuropeptidsituation in der menschlichen Trachea [Uddman & Sundler, 1979; Ghatei

et al., 1983; Yeger et al., 1996; Berisha et al., 2002; Yang et al., 2002].

Diskussion 45

fast ausschließlich mit der Immunogold-Silver-Staining-Technik oder mit

radioimmunologischen Techniken durchgeführt wurden. Im Gegensatz dazu wurde in

die konzentrierte, meist 35%ige Lösung dieser

die Entparaffinierung mit Xylol sowie

der vorliegenden Untersuchung mit der Avidin-Biotin-Methode gearbeitet. Diese

sensitive, indirekte Nachweismethode basiert auf der Bindung des Avidins zum

Biotin. Da einige Organe des menschlichen Körpers eigenes, endogenes Biotin

synthetisieren, kann durch die Bindung des Avidins an dieses endogene Biotin eine

Kreuzreaktion im Sinne einer unspezifischen Färbung hervorgerufen werden. Trotz

dieser Gefahr liegt der Vorteil der ABC-Methode im Vergleich zu einer direkten

Nachweismethode – beispielsweise über Fluorochrome – in der höheren Sensitivität.

Außerdem müssen weitere Voraussetzungen erfüllt sein, um Antigene – im

vorliegenden Fall die untersuchten Neuropeptide – mit Hilfe immunhistochemischer

Nachweisverfahren sichtbar zu machen: Der antigene Bereich muss erhalten bleiben;

die antigene Determinante für Antikörper muss gut zugänglich sein; die strukturellen

Details dürfen nicht zerstört sein. Diese drei Bedingungen konnten durch hier

angewandte Faktoren positiv beeinflusst werden. Zum einen wurde zur

Durchführbarkeit der Paraffinschnitttechnik das Gewebe mit Formaldehyd fixiert.

Dabei musste bedacht werden, dass

Substanz zu Ameisensäure oxidiert und somit in kurzer Zeit das

Untersuchungsgewebe zerstören kann. Dementsprechend wurde mit einer

säurefreien Formalinlösung gearbeitet, indem die Ursprungssubstanz mit

Pufferlösungen auf eine 4%ige Verdünnung gebracht wurde. Beeinträchtigungen der

Antigenität im untersuchten Gewebe können darüber hinaus durch die Einbettung mit

flüssigem und daher heißem Paraffin, durch

durch die Entwässerung bei der aufsteigenden Alkoholreihe ausgelöst werden.

Verfälschte Ergebnisse können auch durch unspezifische Hintergrundfärbungen

hervorgerufen werden, die im Verlauf des immunhistochemischen Vorgangs durch

verschiedene Substanzen bedingt sein können. Dies kann durch die bereits

erwähnte Avidin-Biotin-Methode geschehen, aber auch durch Zellen, die die

endogene Peroxidase enthalten, wie zum Beispiel rote und weiße Blutzellen,

Nervenzellen und einige Dünndarmzellen. Um eine unspezifische Färbung zu

vermeiden, werden die Paraffinschnitte vor der Inkubation mit den Primärantikörpern

daher mit einer H2O2-Lösung behandelt. Zusätzlich wurden zur weiteren Sicherung

der Nachweismethode Positiv- und Negativkontrollen durchgeführt. Dabei sollte als

Positivkontrolle ein Gewebe dienen, welches VIP, SP, CGRP und BN gesichert

Diskussion 46

enthält. Da alle vier Peptide nachgewiesene Überträgerstoffe im Gastrointestinaltrakt

darstellen, wurde ein Präparat aus der Duodenalschleimhaut als positives

Kontrollgewebe ausgewählt. Mit Hilfe der ausgelösten positiven Immunantworten

konnten Fehler beim Primärantikörper oder im Nachweissystem in allen Fällen

ausgeschlossen werden. Als Negativkontrolle diente ein Präparat aus der Trachea,

welches anstelle des Primärantikörpers mit Puffer inkubiert wurde und anschließend

dem gleichen immunhistochemischen Verfahren unterlag wie die

Untersuchungsproben. Da dieses Tracheapräparat eine reine Hämalaunfärbung

aufwies, wurde sichergestellt, dass das angewandte Nachweisverfahren nur auf

zuvor aufgetragene Primärantikörper reagiert. Es konnte aber dennoch festgestellt

werden, dass jegliche Störung im Färbeablauf zu Änderungen der Farbintensität und

damit zu Änderungen der Ergebnisse im Präparat führen konnten. Aus diesem Grund

war eine reibungslose Abfolge der immunhistochemischen Untersuchung von größter

Bedeutung.

Abgesehen von der Frage, ob die untersuchten Neuropeptide überhaupt in der

Trachea und im Larynx nachweisbar waren, interessierte auch die jeweilige

Expressionsverteilung im Hinblick auf die einzelnen histologischen Strukturen. Dabei

lag ein besonderes Augenmerk auf dem Epithel mit Epithelzellen, Flimmersaum und

Basalmembran, auf die im Stroma eingebetteten Fibrozyten und Blutgefäße, auf die

Drüsenzellnester mit ihren serösen und mukösen Anteilen sowie natürlich auf die im

Präparat vorhandenen Nervenfaszikel. Es konnten alle vier Peptide im Epithel

nachgewiesen werden, VIP jedoch als einziges nicht im Flimmersaum. Es ist daher

davon auszugehen, dass insbesondere SP, CGRP und Bombesin für eine normale

Beweglichkeit des Flimmerepithels mitverantworlich sind und so den Transport von

Abfallpartikeln aus dem luftleitenden System in Richtung Pharynx unterstützen.

Daraus kann geschlossen werden, dass Erkrankungen wie die chronische Bronchitis

oder Asthma, bei denen es unter anderem zu Verklebungen des Flimmersaums und

damit zur Anhäufung von Fremdkörpern oder Schmutzpartikeln in Larynx und

Trachea kommt, auch durch eine verminderte Expression der erwähnten

Neuropeptide in ihrer Entstehung begünstigt werden können. Bei der Beurteilung der

Epithelfärbung fiel zudem besonders ins Auge, dass Bombesin sowohl im Larynx als

auch in der Trachea vorwiegend in der Basalmembran vorgefunden wurde. Damit

war es erstmalig gelungen, Bombesin in der menschlichen Trachea nachzuweisen.

Aus anderen Studien ist bekannt, dass Bombesin eine Rolle bei der Proliferation und

Diskussion 47

Chemotaxis einiger Wachstumsfaktoren spielt [Yule et al., 1999; Lunn et al., 2000].

Überdies trägt es zur Regeneration von Gewebestrukturen bei [Ghatei et al., 1983;

Said, 1987]. Da in der vorliegenden Untersuchung mit gesundem Stimmlippen- und

Tracheamaterial gearbeitet wurde, kann aufgrund der auffallenden Expression dieses

Transmitters von einem intakten Reparaturmechanismus in den jeweiligen

Präparaten ausgegangen werden. Andere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe

an chronisch hyperplastischem Stimmlippengewebe hatten in der Basalmembran

eine geringere Expression von Bombesin vorgefunden, was die krankhaften

Veränderungen erklären könnte. In diesem Sinne wäre es denkbar, dass proliferative

Erkrankungen, sowohl benigner als auch maligner Art, durch eine alterierte

Expression von Bombesin beeinflusst werden könnten.

Ebenso wie im Epithel konnte auch im Stroma eine Dominanz von SP, CGRP und

Bombesin im Gegensatz zu VIP beobachtet werden. Hier interessierte vor allem die

intra- und perivaskuläre Expression, da alle vier Neuropeptide eine Vasodilatation

verursachen [Widdicombe, 1991]. Durch diese Vasodilatation könnten entzündliche

Krankheitsprozesse oder aber über eine Durchblutungszunahme hervorgerufene

Ödembildungen – wie es zum Beispiel beim Asthma, beim Reinke-Ödem oder der

chronischen Laryngitis der Fall ist – in ihrer Entstehung weiter unterhalten werden.

Überdies könnten wie bei Knipping et al., 2003, besonders die im periglandulären

Gewebe lokalisierten Blutgefäße über eine Durchblutungssteigerung die

Sekretproduktion der seromukösen Drüsen verstärken.

In den serösen Drüsen konnten im Larynx alle untersuchten Neuropeptide, in der

Trachea jedoch vor allem VIP und Bombesin in hoher Konzentration gefunden

werden. Ein Nachweis in mukösen Drüsenanteilen gelang in der Trachea lediglich für

das Neuropeptid CGRP, im Larynx hingegen überhaupt nicht. Aus früheren Studien

ist bekannt, dass VIP, SP, CGRP und Bombesin an Drüsen zu einer Steigerung der

Sekretion führen, SP überdies sogar zu einer myoepithelialen Kontraktion der

Drüsenausführungsgänge [Richardson&Webber, 1987]. Aus den Ergebnissen kann

geschlossen werden, dass die untersuchten Neuropeptide mit Ausnahme von CGRP

einen höheren Einfluss auf die Produktion eines serösen Schleims zu haben

scheinen und damit die Gesamtviskosität des Mukus zwar herabsetzen, letztendlich

dessen Menge aber steigern. Im Hinblick auf Erkrankungen des oberen

Respirationstraktes, die auf einer gesteigerten Schleimproduktion basieren, wie es

Diskussion 48

beispielsweise bei Asthma, chronischer Bronchitis oder Schleimzystenbildungen der

Fall ist, könnten diese Ergebnisse von Bedeutung sein.

Obwohl in vielen früheren Untersuchungen zu Neuropeptiden ein Nachweis von VIP,

Substanz P, CGRP und Bombesin innerhalb von Nervenfaszikeln gelungen ist

[Albegger et al., 1991; Widdicombe, 1991; Hauser-Kronberger et al., 1994; Knipping

et al., 2003], ist dies in der vorliegenden Untersuchung nur bei den Neuropeptiden

CGRP und Bombesin der Fall gewesen. Diese Kontroverse könnte eine Erklärung in

der von uns angewandten ABC-Technik im Gegensatz zu den damals angewandten

IGSS- oder RIA-Techniken finden. Unter Berücksichtigung der ausgesprochen hohen

Neuropeptidexpression in Drüsengebieten, die von Nervenfaszikeln durchzogen

werden, könnte angenommen werden, dass Neuropeptide auch anders als über den

h bei 14 der insgesamt 25

in der Literatur beschriebenen axonalen Weg ihre Zielorgane erreichen. So kann es

sich um das Vorliegen eines autokrinen Loops handeln, der es den Drüsen

ermöglicht, unabhängig von nervalen Transportmechanismen die aktuell benötigte

Menge und Koexistenz von peptidergen Transmittern selber zu produzieren [Wu et

al., 2001; Pernasetti et al., 2001, Benini et al., 2001; Uetani et al., 2001].

Die in der Literatur vielfach beschriebene Kolokalisation von Substanz P und CGRP

konnte bestätigt werden. Somit scheint CGRP die Effekte von Substanz P in

synergistischer Weise zu beeinflussen, so dass cholinerge Wirkungen verstärkt

werden [Luts et al., 1993; Smet et al., 1997; Nishi et al., 2000].

Wie bereits im Methodenteil erwähnt, handelte es sic

untersuchten Präparate um Gewebeproben von Rauchern. Jedoch waren im Hinblick

auf die Expression und Verteilung der Neuropeptide VIP, SP, CGRP und Bombesin

keine Unterschiede erkennbar. Sowohl der Gesamtgehalt der einzelnen

Neuropeptide als auch deren Verteilung in den einzelnen histologischen Strukturen

wich nicht von den Ergebnissen von Nichtrauchern ab. Dennoch wurde in einigen

Mitteilungen ein Einfluss von Nikotin auf die Neuropeptidaktivität beschrieben

[Lundberg et al., 1983; Joos et al., 1986; Lundberg et al., 1991; Kuo et al., 1995]. Da

nahezu alle Patienten zum Zeitpunkt der Datenerhebung verstorben waren, war es

nicht mehr möglich, eine genaue Raucheranamnese zu erheben, die Aufschluss über

die Dauer und das Ausmaß des Nikotinkonsums gegeben hätte. Überdies wäre für

eine bessere Beurteilung dieses Aspektes wahrscheinlich eine höhere Fallzahl nötig

gewesen.

Zusammenfassung 49

6 Zusammenfassung

ene-related

In der vorliegenden Untersuchung wurden die Expression und Verteilung der

Neuropeptide Vasoaktives intestinales Polypeptid, Substanz P, Calcitonin gene-

related peptide und Bombesin in insgesamt 25 menschlichen, gesunden

Gewebeproben der Trachea sowie in 10 Gewebeproben aus der Stimmlippe

untersucht.

Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl im Kehlkopf als auch in der Trachea die vier

untersuchten Neuropeptide vorhanden sind und, dass sich ihre Expression in fast

identischer Weise auf die einzelnen histologischen Gewebestrukturen verteilt.

Demnach finden sich hohe Konzentrationen in den seromukösen Drüsenfeldern, an

Blutgefäßen, sowie im Epithel, niedrige bis keine Konzentrationen dagegen innerhalb

von Nervenfaszikeln, was auf das Vorliegen eines autokrinen

Regulationsmechanismus schließen lässt. Während VIP insgesamt die schwächsten

Gewebekonzentrationen aufwies, waren Substanz P und Calcitonin g

peptide stark und Bombesin sehr stark enthalten.

Klinisch scheinen die vasodilatierenden und hypersekretorischen Effekte der

Transmitter einen Einfluss auf die Entstehung unterschiedlichster inflammatorischer

und allergischer Erkrankungen auszuüben.

Das erstmalig in der gesunden menschlichen Trachea nachgewiesene Neuropeptid

Bombesin hatte einen hohen Expressionsanteil innerhalb der Basalmembran. Da es

unter anderem Regulationsvorgänge im Gewebe sowie Wachstumsfaktoren

beeinflusst, könnte das Ausmaß der Bombesinexpression über eine Modulation der

Reparaturvorgänge vor allem in geschädigter Trachealschleimhaut bedeutsam für

Narbenbildungen und Stenosierungen der Trachea sein. Weiterhin könnte es eine

Rolle bei der Entstehung sowohl benigner als auch maligner Veränderungen in

Larynx und Trachea spielen.

Zur Untermauerung der aufgestellten Thesen bedarf es weiterer Studien an einem

größeren Kollektiv und insbesondere der Untersuchung von Neuropeptiden an

erkranktem Gewebe.

Anhang 50

7 Anhang

Alle untersuchten Präparate wurden entweder im Rahmen von Karzinomresektionen

in der Klinik für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde der RWTH Aachen oder bei

klinischen Sektionen in der Pathologie der RWTH Aachen gewonnen.

Somit gelangten sie als Routinegut in die Materialannahme der pathologischen

Abteilung.

Aus diesem Grund war es in keinem der 35 Fälle nötig, einen eigenen Ethikantrag zu

stellen.

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Abkürzungsverzeichnis 58

9 Abkürzungsverzeichnis

Destilliertes Wasser

ATP Adenosintriphosphat

Bovines-Serum-Albumin

Cholezystokinin

CGRP Calcitonin gene-related peptide

ggf. gegebenenfalls

H2O2 Wasserstoffperoxid

travenös

µl Mikroliter

m Millimeter

mm/h Millimeter pro Stunde

µm Mikrometer

mRNA mikrosomale Ribonukleinsäure

N. Nervus

NANC nonadrenergic noncholinergic

NO Stickstoffmonoxid

A. Arteria

ABC Avidin-Biotin-Komplex

Aqua dest.

BSA

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CCK

EGF epidermal growth factor

g Gramm

GABA Gammaaminobuttersäure

GIP gastric inhibitory peptide

HCl Salzsäure

IGSS Immuno-Gold-Silver-Staining

i.v. in

M. Musculus

ml Milliliter

m

Abkürzungsverzeichnis 59

PACAP pituitary adenylate cyclase activating peptide

PBS phosphate-buffered-saline

ervensystem

he Technische Hochschule

u.a. unter anderem

V. Vena

PNS Peripheres N

RIA Radioimmunoassay

RWTH Rheinisch-Westfälisc

VIP Vasoaktives intestinales Polypeptid

ZNS Zentrales Nervensystem

Danksagung 60

10 Danksagung

Sowohl Herrn Privatdozent Dr. med. E. Di Martino aus der Klinik für Hals-, Nasen-

ilkund nd Halschirurgie der RWTH Aachen als

europathologie

achen eundliche Überlassung des Themas danken.

Sie haben mich nicht nur bei der praktischen Durchführung der Untersuchungen

bei ng der Dissertationsschrift mit wertvollen Hinweisen

Zusätzlich haben sie mir ermöglicht, einen Teil meiner Dissertation beim Deutsch-

Österreichischen Kongress für Hals-, Nasen- und Ohrenheilkunde 2002 in Baden-

aden zu präsentieren.

Herrn Univ.-Prof. Dr. med. Ch. Mittermayer sowie Herrn Univ.-Prof. Dr. med. M.

Westhofen danke ich dafür, dass sie mir für den Zeitraum der Laborarbeiten Zutritt zu

den Arbeitsräumen ihrer jeweiligen Klinik gewährt haben.

Herrn Leon Muys danke ich ganz besonders für die Betreuung im Labor beim

Erlernen der Paraffinschnitt- und immunhistochemischen Färbetechnik.

Frau Dr. med. Cotarello sowie Frau Astrid Knischewsky haben mir bei

verschiedensten Vorgängen in der Pathologie hilfreich zur Seite gestanden.

Mein größter Dank gilt meiner Familie, ohne deren finanzielle und vor allem seelische

Unterstützung sich der Traum vom Medizinstudium und der Dissertation nie erfüllt

hätte. Durch Liebe und Geduld haben sie in schwierigen Phasen immer wieder

erneut meinen Ehrgeiz geweckt, das gesteckte Ziel weiterzuverfolgen. Ich freue mich

sehr, meinen Eltern mit der Erlangung des Doktortitels einen großen Wunsch erfüllt

zu haben.

In großer Liebe bedanke ich mich auch bei meinem Mann Stefan für seine

unermüdliche Motivation und die vielen investierten Stunden, wenn es beim

Abfassen der Arbeit Probleme gab. Besonders in den letzten zwei Jahren habe ich

aus seiner Zuneigung die Kraft geschöpft weiterzumachen.

und Ohrenhe e und Plastische Kopf- u

auch Herrn Oberarzt Dr. med. Bernd Sellhaus aus dem Institut für N

der RWTH A möchte ich für die fr

sondern auch der Abfassu

und konstruktiver Kritik unterstützt.

B

Lebenslauf 61

11 Lebenslauf

Persönliche Angaben: Name: Simone Schön, geb. Kaußen

Geburtsort: Stolberg (Rheinland)

Gemeinschaftsgrundschule Weisweiler

Medizinische Ausbildung:

2. Staatsexamen: 04 / 2002

3. Staatsexamen

ng für Anästhesie und

operative Intensivmedizin, Paracelsus-Krankenhaus Ruit

Geburtsdatum: 28. Dezember 1976

Familienstand: verheiratet, keine Kinder

Konfession: römisch-katholisch

Schulbildung: 1983 – 1987

1987 – 1996 Bischöfliche Liebfrauenschule Eschweiler,

Abschluss: Allgemeine Hochschulreife

10 / 1996 – 04 / 2002 Studium an der Rheinisch-Westfälischen Technischen

Hochschule, Aachen

Ärztliche Vorprüfung: 08 / 1998

1. Staatsexamen: 08 / 1999

04 / 2002 – 03 / 2003 Praktisches Jahr

1. Tertial: Wahlfach Anästhesie, Luisenhospital Aachen

2. Tertial: Chirurgie, Luisenhospital Aachen

3. Tertial: Innere Medizin, Spital Limmattal in Zürich

05 / 2003

07 / 2003 – 08 / 2004 Ärztin im Praktikum in der Abteilung für Anästhesie und

operative Intensivmedizin, Luisenhospital Aachen

09 / 2004 Ärztin im Praktikum in der Abteilu

Lebenslauf 62

Seit 10 / 2004 Assistenzärztin in der Abteilung für Anästhesie und

operative Intensivmedizin, Paracelsus-Krankenhaus Ruit

Expression und Verteilung von VIP, Substanz P, CGRP und...

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Transcript of Expression und Verteilung von VIP, Substanz P, CGRP und...