1

Granulozytenimmunologie und -transfusion

Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin

der Justus Liebig-Universität Gießen

Prof. Dr. med. Ulrich Sachs

JUSTUS - LIEBIG -

UNIVERSITÄT

GIESSEN

FACHBEREICH

MEDIZIN

1.500-1.000/µl mild

1.000-500/µl moderat

<500/µl schwer

CAVE:

•max. 10% des Pools

•nur 2% des Lebenszyklus

Knochenmarkspeicher

Reifungszeit ca. 5-7 d

(ca. 9 x 109/kg KG)

1.63 x 109/kg KG/d Zirkulation

Verweilzeit 8-20 h

(ca. 0.3 x 109/kg KG)

Randspeicher

(ca. 0.4 x 109/kg KG)

Gewebespeicher

Granulozytopenie und Granulozytenpool

Bildungsverminderung

1) Arzneimittel (Alkylanzien; Antimetaboliten)

2) hämatologische Erkrankungen (idiopathisch/zyklisch; Kostmann)

3) Myelofibrose, Knochenmarkkarzinose

4) Alkoholismus/B12- und Folsäuremangel

5) Infektionen (Tbc, AIDS, Virushepatitis, Malaria, EBV, Typhus)

Gesteigerter Abbau

1) antineutrophile Anitkörper

2) Hypersplenismus

3) Autoimmunerkrankungen (M.Felty, RA, SLE)

4) Arzneimittel als Haptene (Methyldopa, Phenylbutazon)

5) M. Wegener

Peripheres Pooling

Ursachen der Neutropenie

2

Neutropenie bei Neugeborenen und Säuglingen

• Plazentainsuffizienz, mütterliche Hypertonie

• Bakterielle Infektion

• Alloimmunneutropenie

• Autoimmunneutropenie

• kongenitale/zyklische Neutropenie (severe chronic neutropenia)

• Kostmann-Syndrom

• ivIG-assoziierte Neutropenie

• Leukämie

Differentialdiagnose bei Neugeborenen/Säuglingen

Granulozytenserologie

Verheugt et al., Br J Haematol 1977

Granulozytenimmunfluoreszenztest (GIFT)

3

Granulozytenimmunfluoreszenztest (GIFT)

Granulozytenagglutinationstest (GAT)

Granulozytenagglutinationstest

GAT = 0

(Inkubation mit AB-Plasma)GAT = 80

(Inkubation mit Anti-HNA-3a)

4

Lymphozyt

Photomultiplier

Lymphozytenimmunfluoreszenztest (LIFT)

Lymphozytenimmunfluoreszenztest

AB-Plasma

Anti-HLA-A2

GIFT GAT LIFT

0 1 2 3 4Reaktionsstärken 0-4:

HLA

Anti-HNA-1b

Auto-Ak

negativ

Serologische Reaktionsmuster (Beispiele)

5

Luminex®-Technologie

nicht verfügbar für HNA-3

Anwendungsbeobachtung:

- HNA-1a und HNA-1b-

Diskriminierung bei vielen

Proben kritisch

- HNA-2-Erkennung

zuverlässig

- Autoantikörper: keine

Erfahrungswerte

Alloimmunreaktionen

Fetus Mutter

Pathomechanismus

6

Von 1016 untersuchten Proben

postpartaler Frauen enthielten …

• 4 (0,4%) Seren HNA-Antikörper

• 248 (24%) Seren HLA-Antikörper

• 49 Seren (4.8%) nicht-zytotoxische HLA-Antikörper

Clay et al., Transfusion 1984

Alloantikörper: Vorkommen

Fallbeispiel

männlicher Säugling, 10 Tage

klinisch: Omphalitis

Milz, Leber, Lymphknotenstatus unauffällig

Thrombozyten 313.000/µl

Erythrozyten 4.5 Mio/µl

Hb 15.1 g/dl

Leukozyten 5000/µl

Differenzierung:

Stabkernige 0*

Segmentkernige 2

Eosinophile 6*

Basophile 0

Lymphozyten 71*

Monozyten 21*

Zielantigene anti-granulozytärer Alloantikörper

HNA alte

Nomenklatur

Gen Protein Antigen-

Häufigkeit

1a NA1

FCGR3BCD16b

(FcgRIIIb)

58

1b NA2 88

1c SH 5

1d 88 (?)

2 NB1CD177

CD177

(NB1)

97

3a 5bSLC44A2 CTL-2

97

3b 3

4a MartITGAM

CD11b

(Mac-1)

99

4b -

5a OndITGAL

CD11a

(LFA-1)

86

5b -

7

24-105: Domäne 1

107-189: Domäne 2

N39

N75

N163

N170

Arg36Ser

Asn65Ser

Asp82Asn

Val106Ile

Aminosäurenaustausch

Oligosaccharid

HNA-1aHNA-1b

HNA-1 auf FcgRIIIb (CD16b)

Ala78Asp

HNA-1c

GIFT GAT LIFT

HLA

HNA-1b??

Das Problem mit der HLA-Immunisierung

S

P

MAIGA

S

8

MAIGA

pos. Kont.

Patient 1

Patient 2

neg. Kont.

pos. Kont.

Patient 1

Patient 2

neg. Kont.

HNA-1b HNA-1a

Patient 1: Anti-HNA-1b; Patient 2: negativ

Genotypisierungsverfahren

HNA-2: multiple Polymorphismen (Kissel et al., 2002)

FCGRB*1

FCGRB*2

FCGRB*3

CTL2*461G

CTL2*461A

ITGAM*230G

ITGAM*230A

ITGAL*2466G

ITGAL*2466C

HNA-1a

HNA-1b, -1d

HNA-1c

HNA-3a

HNA-3b

HNA-4a

HNA-4b

HNA-5a

HNA-5b

Bux et al., 1994

Bux et al., 1997

Greinacher et al., 2010

Sachs et al., 2004

Sachs et al., 2005

• Omphalitis, Staphylodermie

• andere Infektionen (Otitis, Atemwege, Urogenitaltrakt)

• keine Sepsis, keine Todesfälle

• primäre Therapie: Antibiose

• G-CSF wirksam, aber in der Regel nicht erforderlich

• Neutropenie-Dauer: 11 Wochen (3-28 Wochen)

• auch bei Erstgeborenen beschrieben

Lalezari et al., Semin Hematol 1974

Bux et al., Transfus Med 1992

Alloimmunneutropenie: Klinik

9

Autoimmunreaktionen

Fallbeispiel

21 Monate altes Mädchen

klinisch: Stomatitis, zervikale Lymphknotenschwellung

Milz, Leber unauffällig

Thrombozyten 330.000/µl

Erythrozyten 4.8 Mio/µl

Hb 11.8 g/dl

Leukozyten 5300/µl

Differenzierung:

Stabkernige 0*

Segmentkernige 6*

Eosinophile 2

Basophile 0

Lymphozyten 77*

Monozyten 15*

Knochenmark:

linksverschobene Granulopoese

Epidemiologie

• Kinder unter 2 Jahre

• Infektionen meist zwischen dem 1. und 15. Lebensmonat

• Häufigkeit angeblich 1:100.000 (Lyall et al., J Clin Pathol 1992)

• Mädchen (54%) häufiger betroffen als Jungen (46%)

Klinik

• milde bis moderate, wiederkehrende Infektionen der Haut, des

Oropharnynx, selten Pneumonien;

• aber: 10% schwere Infektionen

• intrauterines Auftreten berichtet (Calhoun et al., Pediatrics 2001)

• Knochenmarkbefunde uneinheitlich

Autoimmunneutropenie: Klinik

10

132 Kinder mit Autoimmunneutropenie*

Normalbefund 31%

Normozellulär mit reduzierter Anzahl reifer Neutrophiler 13%

mit Reifungsstopp bei Bandformen 4%

mit Reifungsstopp auf Metamyelozytenniveau 1%

Hyperzellulär mit reduzierter Anzahl reifer Neutrophiler 18%

mit reifen Neutrophilen 26%

mit Reifungsstopp auf Metamyelozytenniveau 1%

mit Reifungsstopp auf Myelozytenniveau 1%

Hypozellulär mit reduzierter Anzahl reifer Neutrophiler 2%

mit reifen Neutrophilen 1%

*Bux et al., Blood 1998

Knochenmarkbefunde bei der Autoimmunneutropenie

Prognose

• Spontanremissionen in 80-95% der Kinder

• Remissionsbeginn nach 7-24 oder 1-38 Monaten

(Ø Krankheitsdauer 12 Monate)

Therapie

Zuwarten, aber …

• kein IgG!

• kein Anti-CD20!

• ggf. Langzeitprophylaxe (Cotrimoxazol)

• ggf. G-CSF (Akuttherapie)

Verlauf

TRALI

11

Transfusions-assoziierte akute Lungeninsuffizienz

1. Akute Lungeninsuffizienz:

- akuter Beginn

- Hypoxämie (FiO2 ≤ 300 mmHg oder

SpO2 < 90% bei Raumluft)

- bilaterale Infiltrate im Röntgen-Thoraxbild

- kein Hinweis auf linksatriale Hypertension

2. kein vorbekanntes ALI

3. während der Transfusion oder binnen 6 Stunden

4. kein zeitlicher Zusammenhang mit einem anderen

Risikofaktor für eine ALI

Kleinman et al, Transfusion 2004 / Wallis & Sachs, Rossi‘s Principles, 2009 / Sachs, Transfus Apher Sci 2007

4h post GFP

Antibody specificity Number of cases Fatalities Blood component

HLA class I 4 0 4 FFP

HLA class I + II 3 1 3 FFP

HLA class II 17 3 17 FFP

HNA-1a 1 0 1 FFP

HNA-2a 1 0 1 FFP

HNA-3a 10 6 7 FFP, 2 RBC, 1 PC

Total 36 10

1Reil et al., Vox Sang 2008; 2Williamson L et al., SHOT 2006

92% of all TRALIs were caused by plasma transfusion

risk per component as calculated from SHOT data2:

plasma, 1:95,000 vs. RBC, 1:1,500,000

Antikörper bei TRALI1

Pathophysiologie

Wallis JP & Sachs UJ, In: Rossi‘s Principles of Transfusion Medicine (2009); Bux J & Sachs UJ, Br J Haematol 2007

*Sachs et al, Blood 2011; **Hofstra et al, Semin Thromb Hemost 2008; Vlaar et al, Blood 2010; Jensen et al, Vox Sang 2010

1

2

HNA/HLA Klasse I

1

2

HLA class II*

6-8 µm 2-15 µm

Arteriole VenulePulmonalkapillare

8 Alv / ~25 Kap

t = 26 sec (Ery < 4 sec)

2

1

Bioaktive Substanzen

12

strength of transfusion-

related mediators

individual

predisposition

mild TRALI

healthy individuals patients at risk

activated primed resting

neutrophils / endothelial cells

A Bsevere TRALI

Bux J & Sachs UJ, Br J Haematol 2007

Das Schwellenmodell der TRALI

Clinical evidence: recipient-related factors

Sachs UJ, Curr Opin Hematol 2011

Risk factor OR Author, year Number of patients with TRALI/ number

of enrolled patients

History of heavy alcoholism 2.7 Gajic, 2007 74/901

(8.2 %)Sepsis 2.6

Liver disease 2.1

End-stage liver disease 31.7 Benson, 2010 22/225

(9.7 %)

Emergency coronary artery

bypass grafting

17.6 Vlaar, 2010 109/2,024

(5.4 %)

Hematologic malignancy 13.1

Massive transfusion 4.5

Mechanical ventilation 3

Sepsis 2.5

Patient age n/a Vlaar, 2011 16/668

(2.4 %)Time on cardiopulmonary bypass n/a

Chronic alcohol abuse 5.9 Toy, 2012 Case-control-study

89 TRALI, 164 control casesFluid balance before transfusion

(increment per L)

1.15

Peak airway pressure >30 cm H20

before transfusion

3.6

Shock before transfusion 4.2

Current smoker 3.4

Liver surgery 6.7

Clinical evidence: transfusion-related factors

Sachs UJ, Transfus Clin Biol 2012

Risk factor OR Author, year

Any high plasma volume components 2.78 Gajic, 2007

Number of units from female donors 1.51

Amount of female plasma (L) 5.09

Amount of female plasma (L) with at least one pregnancy 9.48

Number of HLA class II positive units 3.08

Number of GIFT positive units 4.85

Mean lysoPC 1.61

Number of HLA class I positive units -

Antibody-positive units 14.2 Vlaar, 2011

HLA class II positive units -

HLA class I positive units -

GIFT positive units -

RBC storage time -

PLT storage time -

Lyso PC -

Female plasma 4.5 Toy, 2012

Quantity of cognate anti-HLA class II antibodies 3.2

Volume of GIFT positive blood products 1.71

HLA class I antibodies -

Amount of lysoPC -

RBC storage time -

13

Mechanical ventilation strategies and TRALI

*Vlaar et al, Crit Care Res Pract 2012

10 cm H2O, 110/min (LVT) vs. 18 cm H2O, 50/min; PEEP 2 cm H2O (HVT)*

TRALI-Diagnostik/Labordiagnostik

klinischer Verdacht

(Leitlinien)keine

Diagnostik-

+

Screening

GIFT (IgG, IgM, IgA)

GAT

LIFT

HLA-Klasse I ELISA

HLA-Klasse II ELISA

Spender

frei- +

Differenzierung

MAIGA

HNA-Genotypisierung

HLA-Ak-Differenzierung

HLA-Genotypisierung

Spender gesperrt

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1996 1997 1998 1999 2000 2001 2003 2004 2005 2006

all TRALI cases

TRALI deaths

highly likely/probable TRALI

plasma from male donors

only* (Oct 2003)

Male only-Plasma* (Großbritannien)

*ca. 15% S/D-Plasma

14

Transfusion-related acute lung injury

Funk et al, Vox Sang 2012

Vox Sang, 2009

Recommendations of the ISBT Working Party on Granulocyte Immunobiology for

leucocyte antibody screening in the investigation and prevention of antibody-

mediated transfusion-related acute lung injury.

Bierling P, Bux J, Curtis B, Flesch B, Fung L, Lucas G, Macek M, Muniz-Diaz E,

Porcelijn L, Reil A, Sachs U, Schuller R, Tsuno N, Uhrynowska M, Urbaniak S,

Valentin N, Wikman A, Zupanska B.

screen for HLA class I and HLA class II

screen for granulocyte antibodies (HLA is not a substitute)

screen for HNA-3a

not many laboratories will be able to screen

cost accounting: 28.81 €/donor1

1Sachs UJ et al, Transfus Med 2008

Antikörpersuche als Präventions-Strategie?

TRALI-Prävention

Nicht-immunogenes TRALI

- generelle Leukozytendepletion

- gewaschene Blutprodukte für Risikopatienten

- frische Blutprodukte für Risikopatienten

Immunogenes TRALI

- partieller/genereller Ausschluss von Frauen (Schwangerschaft)

- Screening auf granulozytenreaktive Antikörper

- alternative Präparate (S/D-Plasma)

15

Granulozytentransfusion

zentrale Aufgabe: unspezifische Abwehr von Bakterien und Pilzen

Ausmaß und Dauer der Neutropenie sind proportional zum Infektionsrisiko

(kritischer Wert ca. 1.000/µl)(Bodey et al., Ann Intern Med 1966)

Infektionen durch Versagen der unspezifischen Abwehr bei:

•Chemotherapie maligner Erkrankungen

•Knochenmarkerkrankungen

•Funktionsdefekte neutrophiler Granulozyten

Schwellendosis für die Granulozytentransfusion ca. 2 x 108/kg KG(Dale et al., Blood 1976)

Hintergrund

Pool-GK aus buffy coats

•kein klinischer Erfolg nachweisbar (Baley et al., Pediatrics 1987)

Adhäsion von Granulozyten an Nylon

•schlechte Ausbeute, toxische Effekte (Djerassi et al., J Med 1970)

Granulozytapherese

•bessere Separation und Ausbeute durch

Sedimentationsbeschleuniger (Lowenthal et al., Transfusion 1975)

•favorisiert wird HAES, maximal 500 ml (Strauss et al., Transfusion 1986)

•mindestens 12 Einzelspender

Leukozyten von Spendern mit CML

•effektiv praktikabel und wirksam (Freireich et al., Ann NY Acad Sci 1964)

•organisatorische und biologische (?) Vorbehalte

Techniken der Granulozytengewinnung

16

Granulozytapheresepräparat bei CML

10 l Prozessvolumen

ohne Stimulation 2.0 x 109 2 kg

10 l Prozessvolumen

nach Corticosteroiden (8 mg Dexa p.o.) 2.0 x 1010 20 kg

6.5 l Prozessvolumen

nach G-CSF (5-10 µg/kg KG) 4.0 x 1010 40 kg

7 l Prozessvolumen

nach G-CSF + Dexamethason 6.7 x 1010 67 kg

Loftus et al., J Clin Apheresis 1983; Bux et al., Vox Sang 2003; Stroncek et al., Transfusion 2001

Ertrag Päd.* Erw.*

STOP

STOP

Spenderstimulation vor Granulozytapherese

Metaanalyse [8 Studien prä-G-CSF] (Vamvakas & Pineda, J Clin Apheresis 1997)

Outcome abhängig von:

• Leukozytenkompatibilität

• Dosis

• Dauer der Neutropenie

Adäquate Dosen kompatibler Leukozyten:

• reduzieren das Infektionsrisiko signifikant

• reduzieren Tod und Tod durch Infektion signifikant

Kenndaten der Granulozytapherese-PräparateKlinische Wirksamkeit von Granulozytentransfusionen

17

Präparatevolumen 296 ± 68 ml

Leukozytengehalt 5,27 x 1010 ± 2,41 x 1010

Granulozytengehalt 4,31 x 1010 ± 2,32 x 1010

Thrombozytengehalt 35,6 x 1010/l ±15,1 x 1010/l

Erythrozytengehalt 1,5 x 1012/l ± 2,7 x 1012/l

Zusammensetzung von n=996 Apheresaten

Studie der DGTI*

*n=415 Spender in 14 Zentren; Sachs et al, unpublished

Biologische Wirkung von G-CSF

Drewniak A et al., Haematologica 2008

Nebenwirkungen (Spender)

Studie der DGTI*

*n=415 Spender in 14 Zentren; Sachs et al, unpublished

18

Der Separationserfolg ist abhängig vom Stimulationserfolg.

Mit der Zahl der Spenden innerhalb eines Spendezyklus

steigen Stimulations- und Separationserfolg an.

Stimulations- und Separationserfolg sind abhängig vom

Geschlecht: Frauen spenden eher bessere Präparate als Männer.

Alter und G-CSF-Typ haben keinen Einfluss auf den

Stimulations- und Separationserfolg.

Nebenwirkungen sind abhängig vom Geschlecht:

Frauen haben mehr Nebenwirkungen als Männer.

Nebenwirkungen sind unabhängig vom Stimulations- und

Separationserfolg, vom Alter und von der Anzahl der

Spenden innerhalb eines Spendezyklus.

Studienergebnisse*

*n=415 Spender in 14 Zentren; Sachs et al, unpublished

Autor, Zeitschrift JahrInfekt-

tage

Erfolgs-

rate

Neben-

wirkungen

Hester et al, J Clin Apher 1995 12 (2-36)* *** ***

Dignani et al, Leukemia 1997 -** *** ***

Auffermann et al, Bone Marrow Transplant 1999 -** *** ***

Peters et al, Brit J Haematol 1999 8 (1-28) 70% moderat

Price et al, Blood 2000 -** 42% mild

Lee et al, Leukemia 2001 -** 40% schwer

Illerhaus et al, Ann Hematol 2002 -** 66% keine

Cesaro et al, Support Care Cancer 2003 12 (5-28) 40% mild

Grigull et al, Support Care Cancer 2006 >3*** 75% mild

Sachs et al, Transfusion 2006 6 (3-18) 82% mild

Ofran et al, Vox Sang 2007 12 (1-22) 62% schwer

*Responder: 8 Tage; Non-Responder, 17 Tage; **keine Angabe; ***keine genauere Angabe

Kenndaten der Granulozytapherese-PräparateNicht-randomisierte Studien (G-CSF)

Kenndaten der Granulozytapherese-PräparateKlinische Anwendung I

Ein-Gal et al., Transfusion 2007

Wunddebridement

bei Fasciitis necroticans

(vor Transfusion)

Wunddebridement

bei Fasciitis necroticans

(nach Transfusion)

19

Klinische Anwendung II

1 2 3

1

2

3

4

5

AN

C (

x 1

09/l)

4

2

4

6

8

10

12

14

CR

P (

mg/d

l)Sachs et al., Transfusion 2006

Randomisierte Studien

Studie, Jahr Publikation Patienten

(GTX vs.

Kontrolle)

Granulozyten

(mittlere Dosis,

x1010)

Higby 1975 New Engl J Med 17/19 3,7

Alavi 1977 New Engl J Med 12/19 5

Herzig 1977 New Engl J Med 13/14 0,4/1,7

Vogler 1977 Am J Med 17/13 2,7

Scali 1978 Schw Med Wo 13/12 2,9

Winston 1982 Ann Int Med 48/47 0,5

Klastersky 1983 Schweiz and Wschr 16/23 >1

Bow 1984 Can Med Assoc J 13/11 0,87

Seidel 2008 Bone Marrow Transplant 40/39 >3

Randomisierte Studien

Sterblichkeit1 (alle) 0,64 [0,33-1,26]

Sterblichkeit1 (high dose) 0,37 [0,17-0,82]

Metaanalyse aus Cochrane, 2005

Seidel et al, 2008: Daten extrahiert

1Sterblichkeit Tag 20-22

Infektionskontrolle 0,94 [0,71-1,26]

Sterblichkeit2 1,07 [0,57-2,01]

0,5 21

2Sterblichkeit Tag 28 (Seidel et al, Bone Marrow Transplant 2008)

20

Bewertung

Granulozytentransfusionen sind eine gut verträgliche,

angemessene Therapie bei hämatologischen Erkrankungen mit

persistierendem Fieber in therapie-induzierter Neutropenie.

Leukozytenverträglichkeitsuntersuchungen vor Transfusion

können zu einer Reduktion des Transfusionsrisikos beitragen.

Eine frühe Interventionsstrategie (um Tag 6 der Infektion) führt

vermutlich zu einem besseren Ansprechen als eine spätere

Intervention.

Randomisierte Studien mit einem frühen Interventionsdesign sind

dringend erforderlich, um den klinischen Einsatz von

Granulozytenpräparaten zu prüfen (Eudra-CT 2009-010700-28)

Justus Liebig-Universität Gießen

Fachbereich Humanmedizin

Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin

ulrich.sachs@med.uni-giessen.de