In vitro-Untersuchungen am Dünndarm des Meerschweinchens · Die Nichtopioidanalgetika sind...

Aus der Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie

der Universität Würzburg

Direktor: Professor Dr. med. N. Roewer

Der Einfluss von Paracetamol, Acetylsalicylsäure, Metamizol

und Tramadol auf die Darmperistaltik.

In vitro-Untersuchungen am Dünndarm des

Meerschweinchens

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg

vorgelegt von

Rebecca Weis

aus Steinfeld

Würzburg, Januar 2006

Referent: Herr Prof. Dr. med. Michael Herbert

Korreferent: Herr Prof. Dr. med. Wolfgang Scheppach

Dekan: Herr Prof. Dr. med. Georg Ertl

Tag der mündlichen Prüfung: 12. Juni 2007

Die Promovendin ist Ärztin.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .......................................................................................................1

2 Material und Methoden ............................................................................9

2.1 Versuchsaufbau ............................................................................................... 9

2.2 Versuchsdurchführung ................................................................................. 11

2.3 Substanzen, Konzentrationen, Versuchsreihen .......................................... 13 2.3.1 Paracetamol ..................................................................................................... 14 2.3.1.1 Paracetamol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung ........................................ 14 2.3.1.2 Antagonisierung der Paracetamolwirkung I (Naloxon, Apamin).................... 14 2.3.1.3 Antagonisierung der Paracetamolwirkung II (L-NAME, D-NAME) ............. 15 2.3.1.4 Antagonisierung der Paracetamolwirkung III (Acetylsalicylsäure, ASS)....... 15 2.3.1.5 Antagonisierung der Paracetamolwirkung IV (Serotoninantagonisten).......... 15 2.3.2 Acetylsalicylsäure Konzentrations-Wirkungs-Beziehung............................... 16 2.3.3 Metamizol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung........................................... 16 2.3.4 Tramadol.......................................................................................................... 17 2.3.4.1 Tramadol (Razemat) Konzentrations-Wirkungs-Beziehung........................... 17 2.3.4.2 (+)-Tramadol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung ...................................... 17 2.3.4.3 (-)-Tramadol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung ....................................... 17 2.3.4.4 O-Desmethyltramadol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung ........................ 18 2.3.4.5 Antagonisierung der Tramadolwirkung I (Naloxon)....................................... 18 2.3.4.6 Antagonisierung der Tramadolwirkung II (Serotoninantagonisten) ............... 19 2.3.4.7 Antagonisierung der Tramadolwirkung III (α-Adrenozeptorantagonisten) .... 20

2.4 Auswertung .................................................................................................... 20 2.4.1 Auswertungskriterien ...................................................................................... 20 2.4.2 Auswertungsschema ........................................................................................ 21 2.4.3 Statistik ............................................................................................................ 22

3 Ergebnisse ....................................................................................................23

3.1 Wirkung von Paracetamol auf die Dünndarmperistaltik.......................... 23

3.2 Aufhebung der Paracetamolwirkung durch Vorbehandlung mit Antagonisten der vermuteten Mediatoren .................................................. 27

3.2.1 Blockade von opioidergen Rezeptoren durch Naloxon................................... 27 3.2.2 Blockade von Calcium-abhängigen Kaliumkanälen durch Apamin ............... 31 3.2.3 Blockade der NO-Synthetase durch L-NAME. Vergleich mit dem inaktiven

Enantiomer D-NAME ..................................................................................... 31 3.2.4 Inhibition der Cyclooxygenase COX-1 und COX-2 durch Acetylsalicylsäure31 3.2.5 Blockade von Serotoninrezeptoren durch Methysergid und Tropisetron........ 31

3.3 Wirkung von Acetylsalicylsäure auf die Dünndarmperistaltik ................ 33

3.4 Wirkung von Metamizol auf die Dünndarmperistaltik ............................. 33

3.5 Wirkung von Tramadolrazemat, (+)-Tramadol, (-)-Tramadol und O-Desmethyltramadol auf die Dünndarmperistaltik ..................................... 34

3.5.1 Tramadolrazemat ............................................................................................. 34 3.5.2 (+)-Tramadol ................................................................................................... 35 3.5.3 (-)-Tramadol .................................................................................................... 39 3.5.4 O-Desmethyltramadol ..................................................................................... 42 3.5.5 ED50 (-)-Tramadol, (+)-Tramadol, O-Desmethyltramadol.............................. 44

3.6 Antagonisierung der hemmenden Wirkung des (+)-Tramadols, (-)-Tramadols und O-Desmethyltramadols ................................................. 45 3.6.1 Blockade von Opioidrezeptoren durch Naloxon ............................................. 46 3.6.2 Blockade von Serotoninrezeptoren durch Methysergid und Tropisetron........ 48 3.6.3 Blockade von Adrenozeptoren durch Prazosin und Yohimbin ....................... 50 4 Diskussion.....................................................................................................51

4.1 Acetylsalicylsäure, Metamizol ...................................................................... 53

4.2 Paracetamol.................................................................................................... 55

4.3 Tramadol ........................................................................................................ 59

5 Zusammenfassung.....................................................................................63

6 Literaturverzeichnis .................................................................................65

7 Anhang ..........................................................................................................83

1

1 Einleitung

Die Behandlung von Schmerzen ist eine originäre ärztliche Tätigkeit. Schmerzen treten

akut nach Verletzungen oder Ereignissen auf, die die Integrität des Organismus

schädigen oder zu schädigen drohen, des Weiteren nach operativen Eingriffen, aber

auch bei einer Vielzahl von Erkrankungen ganz unterschiedlicher Genese. Bei

chronischen Schmerzen dagegen besteht meist kein Bezug mehr zu einem auslösenden

Ereignis. Die Intensität von Schmerzen variiert erheblich, sowohl inter- als auch

intraindividuell. Identische experimentelle Schmerzreize werden von Probanden in

einem bisweilen großen Schwankungsbereich als unterschiedlich schmerzhaft eingestuft

(Chatrian et al. 1982, Fernandes et al. 1982, Chery-Croze 1983a,b, Strian et al. 1989,

Ohrbach und Gale 1989). Noch größer ist die Variabilität der Intensität postoperativer

Schmerzen, auch nach identischen Operationen. Systematische Untersuchungen mit

einem patientenkontrollierten Analgesieregime (patient controlled analgesia, PCA)

zeigten, dass Stärke und Dauer postoperativer Schmerzen bei unterschiedlichen

Patienten, z.B. nach einer Magenresektion, Knie- oder Hüftendoprothetik ganz

erheblich differieren (Lehmann et al. 1985, 1986a,b, 1990a,b). Aber auch

intraindividuell ist die Intensität empfundener Schmerzen von einer Vielzahl von

Variablen abhängig, wie der gegenwärtigen Stimmungs- und Gemütslage, Stress sowie

endogen freigesetzten Mediatoren, wie z.B. Endorphinen, Endocannabinoiden und

Corticotropin releasing factor (CRF). Stress kann auf der einen Seite die

Schmerzschwelle anheben (Mousa et al. 1981, Willer 1981, Jorum 1988a), während

andererseits wiederholter oder länger andauernder Stress die Schmerzschwelle absenkt

(da Silva Torres et al. 2003, Vidal und Jacob 1982, 1986, Jorum 1988a,b, Khasar et al.

2005) und die Schmerzempfindung verstärkt (Davis et al. 2001, Naranjo et al. 2002).

Die Stressmediatoren CRF und Endocannabinoide können unter Umständen Schmerzen

nahezu vollständig unterdrücken (Hargreaves et al. 1987, Lariviere und Melzack 2000,

Hohmann et al. 2005).

Die rasche und effiziente Linderung von Schmerzen ist aus mehreren Gründen von

großer Bedeutung. Zum einen trägt die Schmerzreduktion zum subjektiven

Wohlbefinden bei. Zum anderen ermöglicht eine adäquate Schmerztherapie

2

beispielsweise in der peri- bzw. postoperativen Phase die frühe Mobilisation des

Patienten und vermindert somit das Thromboserisiko, reduziert das perioperative

Stressempfinden, das unter anderem zur Immunsuppression durch erhöhte endogene

Freisetzung von Glukokortikoiden führen kann und verhindert pulmonale

Dysfunktionen aufgrund unzureichender Ventilation (Eriksson et al. 1996,

Michaloliakou et al. 1996, Kehlet 1997, Kehlet et al. 1999, Meissel 2002). Die Wahl

des Analgetikums richtet sich in erster Linie nach der Intensität der Schmerzen,

berücksichtigt aber auch Nebenwirkungen der jeweiligen Substanz, die die Anwendung

bei Patienten mit Begleiterkrankungen limitieren oder kontraindizieren.

Standardmedikation für starke Schmerzen sind Opioide, die bei den meisten

Schmerzformen zuverlässig analgetisch wirken. Allerdings rufen Opioide bisweilen

auch erhebliche Nebenwirkungen hervor, z.B. eine Beeinträchtigung der Magen-Darm-

Motilität, zentrale Atemdepression, Sedierung und Gefahr der Sucht- und

Abhängigkeitsentwicklung. Für die Behandlung von Schmerzen geringerer und

mittlerer Intensität sind in der Regel Nichtopioidanalgetika und bei mittlerer bis starker

Schmerzintensität das „atypische“ Opioidanalgetikum Tramadol gut und zuverlässig

geeignet.

Die Behandlung akuter und chronischer Schmerzen mit Opioiden führt immer zu einer

Beeinträchtigung der Magen-Darm-Motilität (De Luca und Coupar 1996, Kurz und

Sessler 2003). Diese äußert sich klinisch in Völlegefühl, Blähung, Obstipation, Übelkeit

und Erbrechen und führt zu einer Retention des Darminhalts (Livingstone und Passaro

1990). In der postoperativen Phase ist jedoch eine verminderte Magen-Darm-Tätigkeit

nicht nur durch die verabreichten Opioide bedingt, sondern auch Folge des

chirurgischen Eingriffs. Der sogenannte postoperative Ileus tritt immer nach

Laparotomien, insbesondere nach Manipulationen am Darm auf, aber auch nach

thorakalen, orthopädischen und neurochirurgischen Operationen (Holte und Kehlet

2000). Er betrifft alle Abschnitte des Magen-Darm-Trakts, wobei das Kolon am

stärksten und längsten betroffen ist. Die Paralyse, die sich in der Regel spontan

zurückbildet, hält im Magen 12-24 h an, im Dünndarm durchschnittlich 24 h und im

Dickdarm 48-72 h (Livingstone und Passaro 1990). Eine mehrere Tage anhaltende

Darmatonie führt zu einer endoluminalen bakteriellen Überwucherung, zum Verlust der

Mukosabarriere und zur konsekutiven Translokation von Bakterien und Endotoxinen

3

aus dem Darmlumen in den Blutkreislauf. Dies kann unter ungünstigsten Umständen

zur Sepsis führen und im Multiorganversagen enden (Ogilvy und Smith 1995). Die

Aufhebung des postoperativen Ileus und Rückkehr der Kolonmotilität ist meist am

Absetzen von Stuhl zu verifizieren.

Der postoperative Ileus wird in seiner Dauer und Intensität nicht nur durch Opioide,

sondern auch durch andere in der perioperativen Phase verabreichte Medikamente

verstärkt, z.B. Barbiturate, Benzodiazepine und Clonidin (Berg et al. 2001, Herbert et

al. 2002a,b,c,d).

Um das Ausmaß der durch Opioide induzierten Motilitätshemmung so gering wie

möglich zu halten, wird in neuen multimodalen Konzepten der postoperativen

Schmerztherapie partiell auf Opioide verzichtet und auf andere Analgetika, Adjuvantien

oder supplementierende Verfahren zurückgegriffen (Kehlet 1997, Kehlet et al. 1999,

White 2002). Dies wären Regionalanästhesieverfahren unter Verwendung von

Lokalanästhetika und/oder die intravenöse Applikation von Nichtopioidanalgetika

(Kehlet 1997, Kehlet et al. 1999, White 2002). Im Gegensatz zur Therapie chronischer

Schmerzen wird beim postoperativen Schmerz häufig ein abgestuftes, deeskalierendes

Vorgehen empfohlen, bei dem zunächst stark wirksame Analgetika zum Einsatz

kommen, die dann, der verbliebenen Schmerzintensität angepasst, durch schwächer

wirksame Substanzen ersetzt werden (Meissel 2002).

Die Nichtopioidanalgetika sind Substanzen unterschiedlicher chemischer Struktur mit

jedoch ähnlichem Wirkspektrum. Sie werden in zwei Gruppen unterteilt, zum einen auf

Grund ihrer analgetischen, antipyretischen und antiphlogistischen Wirkung in die

Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika (NSAIDs, nonsteroidal anti-inflammatory

drugs), zum anderen in die Gruppe der nichtsauren antipyretischen Analgetika. Letztere

wirken nicht entzündungshemmend und sind schwach basisch oder neutral. Klinisch

häufig angewandte Substanzen sind Acetylsalicylsäure (Gruppe der NSAIDs),

Metamizol und Paracetamol (Gruppe der nichtsauren antipyretischen Analgetika).

4

Zum besseren Verständnis der in dieser Arbeit durchgeführten pharmakologischen

Interventionen werden nachfolgend die Charakteristika und Wirkmechanismen der

untersuchten Analgetika kurz beschrieben.

Acetylsalicylsäure. Die Acetylsalicylsäure ist eines der bekanntesten und am

häufigsten eingesetzten Analgetika aus der Gruppe der NSAIDs zur Therapie leichter

bis mittelstarker Schmerzen (Edwards et al. 1999, 2003a). Die Acetylsalicylsäure

hemmt die Cyclooxygenase 1 und 2 (COX-1, COX-2) und damit die Synthese von

Prostaglandinen (Übersicht Burian und Geisslinger 2005). Die COX-2 ist durch

verschiedene Faktoren, u.a. Zytokine, schnell induzierbar und wird bei Entzündungen,

Schmerzreaktionen und anderen Gewebeschädigungen verstärkt exprimiert (Herschman

1996, Smith und DeWitt 1996). Die antiphlogistische, analgetische und antipyretische

Wirkung der Acetylsalicylsäure wird hauptsächlich durch Hemmung der COX-2

vermittelt (Amann und Peskar 2002). Die COX-1 bewirkt als konstitutiv exprimiertes

Enzym die Synthese von Prostaglandinen u.a. im Magen, in Thrombozyten und in der

Niere. Demzufolge verursacht eine Hemmung der COX-1 u.a. eine

Thrombozytenaggregationshemmung (Roth und Calverley 1994), die bei der Therapie

des Myokardinfarkts oder der generalisierten arteriellen Verschlusskrankheit erwünscht

ist, aber eine Kontraindikation für die Anwendung der Acetylsalicylsäure als

Analgetikum in der perioperativen Phase darstellt, da Blutungen auftreten oder verstärkt

werden können. Weitere, zum Teil bedrohliche Nebenwirkungen der Acetylsalicylsäure

sind Erosionen im Gastrointestinaltrakt bis hin zu Ulzerationen, Perforationen und

akuten Blutungen (Roth und Calverley 1994). Bei Asthmatikern kann durch

Acetylsalicylsäure ein Asthmaanfall ausgelöst werden, da durch die Hemmung der

Cyclooxygenase und das damit vermehrte Substratangebot an die Lipoxygenase

alternativ mehr bronchokonstriktorisch wirksame Leukotriene gebildet werden.

Forschungsergebnisse der vergangenen Jahre haben gezeigt, dass die COX-2 in einigen

Organen wie Rückenmark, Niere oder Uterus ebenfalls konstitutiv exprimiert wird

(Harris et al. 1994, Topper et al. 1996, Yamagata et al. 1993), wodurch weitere, hier

nicht detailliert beschriebene (Neben-)Wirkungen auftreten. Ein entscheidender Vorteil

der Acetylsalicylsäure ist aber, dass im Gegensatz zu den Opioiden keine

unerwünschten Wirkungen im Zentralnervensystem wie Atemdepression oder physische

Abhängigkeit auftreten.

5

Paracetamol. Das Anilinderivat Paracetamol (= Acetaminophen) zeichnet sich durch

eine gute antipyretische und analgetische Wirkung aus (Delbos und Boccard 1995, De

Craen et al. 1996, Moore et al. 1997, 2003, Rømsing et al. 2002, Hyllested et al. 2002),

im Gegensatz zu den NSAIDs fehlt aber die antiphlogistische Wirkung. Wie die

analgetische Wirkung von Paracetamol zustande kommt, ist nicht sicher bekannt, wobei

davon ausgegangen wird, dass diese auf spinalen und supraspinalen Mechanismen

basiert (Piletta et al. 1991, Bannwarth et al. 1992, Pini et al. 1996, Muth-Selbach et al.

1999, Courade et al. 2001a,b, Roca-Vinardell et al. 2003). Serotonin ist ein endogener

Transmitter, der zur antinozizeptiven Wirkung im Zentralnervensystem beiträgt. Eine

Entleerung von Serotonin aus seinen Speichern durch p-Chlorophenylalanin reduziert

den antinozizeptiven Effekt von intraperitoneal appliziertem Paracetamol im Hot plate-

und Formalintest bei der Ratte (Pini et al. 1996), ebenso wie ein Funktionsverlust der

serotoninergen Bahnen durch 5,6-Dihydroxytryptamin (Tjølsen et al. 1991). Außerdem

verhindert der 5-HT3-Antagonist Tropisetron die antinozizeptive Wirkung von

Paracetamol im Paw pressure-Test (Pélissier et al. 1996). Die Bedeutung des Serotonins

wird dadurch unterstrichen, dass Paracetamol den Serotoninspiegel im Rattengehirn

anhebt (Pini et al. 1996, Courade et al. 2001a,b), Serotonin auf spinaler Ebene im Paw

pressure-Test antinozizeptiv wirkt (Bardin et al. 1997) und 5-HT1A- und 5-HT1B-

Autorezeptoren die antinozizeptive Wirkung des Paracetamols modulieren (Roca-

Vinardell et al. 2003).

Paracetamol hat nahezu keine Wirkung auf die COX-1 und COX-2 (Chandrasekharan et

al. 2002), was die fehlende antiphlogistische Wirkung, die nicht beeinträchtigte

Thrombozytenfunktion und die fehlenden gastrointestinalen Nebenwirkungen erklärt.

Die Entdeckung einer COX-3 beim Hund und beim Menschen hat neue Aspekte im

Verständnis der Paracetamolwirkung eröffnet (Chandrasekharan et al. 2002). Die COX-

3 in neuronalem Gewebe, im Herzen und in der Aorta wird geringfügig durch

Paracetamol und Metamizol gehemmt. Die Hauptnebenwirkung von Paracetamol ist

dessen Hepatotoxizität, die bei Dosen über 10 g pro Tag zu schweren, meist tödlich

verlaufenden Leberzellnekrosen führt (Prescott et al. 1971, Hamlyn et al. 1977).

Metamizol. Das Pyrazolonderivat Metamizol (=Novaminsulfon, Noramidopyrin-

methansulfonat, Dipyrone) ist auch bei starken Schmerzen, z.B. Tumorschmerz,

postoperativem Schmerz und infolge einer zusätzlichen spasmolytischen Wirkung bei

6

Kolikschmerzen gut wirksam (Rodriguez et al. 1994, Planas et al. 1998, Avellaneda et

al. 2000, Rawal et al. 2001, Meissel 2002, Edwards et al. 2003). Die antipyretische

Wirkung ist ebenfalls gut. Nach oraler Gabe wird die Substanz im Gastrointestinaltrakt

rasch hydrolytisch gespalten und das entstandene 4-Methylaminophenazon/-antipyrin

vollständig resorbiert (Volz und Kellner 1980). Der Mechanismus der Analgesie durch

Metamizol ist nur lückenhaft bekannt. Sowohl periphere, spinale als auch supraspinale

Wirkorte werden diskutiert (Lorenzetti und Ferreira 1985, Neugebauer et al. 1994,

Lopez-Munoz et al. 1994, Tracey und Walker 1995, Tortorici et al. 1994, 1996,

Vanegas et al. 1997, Beirith et al. 1998, Cohen et al. 1998, Aguirre-Banuelos und

Granados-Soto 1999), zudem scheint ein Zusammenhang zur Konzentration der

Metabolite 4-Methylaminoantipyrin und 4-Aminoantipyrin zu bestehen (Levy et al.

1995, Cohen et al. 1998). Metamizol ist gut verträglich und ruft keine gastrointestinalen

Nebenwirkungen hervor, obgleich es die Synthese von Prostaglandin E2 und E1 (PGE2

und PGE1), gemessen an der Ausscheidung des Hauptmetaboliten im Urin, beim

Menschen hemmt (Frölich 1986). Außerdem wird die PGE2-Konzentration des

Magensafts signifikant vermindert. Wie dieser Umstand einer gehemmten PGE2-

Synthese mit fehlenden Nebenwirkungen im Magen vereinbar ist, bleibt gegenwärtig

unklar. Wie erwähnt hemmt Metamizol die COX-3 (Chandrasekharan et al. 2002) und

es interagiert mit ATP-sensitiven Kaliumkanälen (Alves und Duarte 2002).

Zwei Nebenwirkungen führen gelegentlich zu Vorbehalten gegebenüber Metamizol. Bei

(rascher) intravenöser Injektion kann die Substanz einen ausgeprägten Blutdruckabfall

hervorrufen (Forth 1986) und nach Anwendung von Metamizol werden Leukopenien

und äußerst selten Agranulozytosen beschrieben (Pisciotta 1978, Levy 1986a, Heit

1986, The International Agranulocytosis and Aplastic Anemia Study 1986), wobei der

kausale Zusammenhang zwischen Metamizol und akuter Agranulozytose als umstritten

gilt (Levy 1986a, Miescher 1986).

Tramadol. In Deutschland steht seit etwa 25 Jahren Tramadol, ein synthetisches 4-

Phenylpiperidinanalogon des Codeins für die Therapie mittelstarker bis starker

Schmerzen zur Verfügung (Lee et al. 1993). Tramadol wird im Hinblick auf seinen

Wirkmechanismus (s.u.) von Raffa et al. (1992) als „atypisches“ Opioid bezeichnet.

Seine Wirksamkeit wurde für die Behandlung von Schmerzen postoperativer (Coetzee

und van Loggerenberg 1998, Jeffrey et al. 1999, Scott und Perry 2000, Silvasti et al.

7

2000, Torres et al. 2001, Engelhardt et al. 2003, Erolcay und Yuceyar 2003, Stamer et

al. 2003, Bourne 2004), neuropathischer (Harati et al. 1998, Sindrup et al. 1999,

Boureau et al. 2003) und entzündlicher Genese (Wilder-Smith et al. 2001, Adler et al.

2002, Malonne et al. 2004) sowie bei der chronischen Pankreatitis nachgewiesen

(Wilder-Smith et al. 1999). In Abhängigkeit von der Genese der Schmerzen wird die

analgetische Potenz von Tramadol im Vergleich zu der des Morphins als vergleichbar

(Coetzee und van Loggerenberg 1998, Wilder-Smith et al. 1999, Scott und Perry 2000,

Silvasti et al. 2000, Engelhardt et al. 2003) oder überlegen eingestuft (Wilder-Smith et

al. 1999).

Tramadol wirkt als Opiatagonist mit einer Selektivität zum µ-Rezeptor und einer nur

schwachen Bindung an κ- and δ-Rezeptoren (Bamigbade und Langford 1998). Die

Metabolisierung von Tramadol erfolgt in der Leber, wobei nur der Hauptmetabolit O-

Desmethyltramadol pharmakologisch aktiv ist, dieser aber eine etwa 200-fach stärkere

Affinität zum Opioidrezeptor besitzt als die Ausgangssubstanz (Lee et al. 1993). Die

analgetische und antinozizeptive Wirkung des Tramadols wird nur zu etwa 30% durch

den Opioidantagonisten Naloxon aufgehoben, was nahe legt, dass andere,

nichtopioiderge Mechanismen zur Analgesie mitbeitragen (Raffa et al. 1992, Lee et al.

1993, Dayer et al. 1994, Bamigbade und Langford 1998). So wirkt Tramadol in der

gleichen Konzentration, in der es an Opioidrezeptoren bindet, auch auf das

monoaminerge System, in dem es die Wiederaufnahme von Noradrenalin und Serotonin

(5-HT) hemmt (Driessen et al. 1993, Desmeulen et al. 1996, Bamigbade et al. 1997,

Bamigbade und Langford 1998). Im klinisch verwendeten razemischen Gemisch von

Tramadol tragen die (+)- und (-)-Enantiomere auf unterschiedliche Weise zur Analgesie

bei. Das (+)-Enantiomer ist vierfach stärker analgetisch wirksam als das (-)-Enantiomer

(Bamigbade et al. 1997), hat eine höhere Affinität zum µ-Rezeptor, ist ein starker

Inhibitor der 5-HT-Wiederaufnahme und setzt im Gegensatz zum (-)-Enantiomer

Serotonin frei, wohingegen das (-)-Enantiomer ein stärkerer Inhibitor der Noradrenalin-

Wiederaufnahme ist (Reimann und Hennies 1994, Matthiesen et al. 1998, Halfpenny et

al. 1999).

In der vorliegenden Arbeit wird untersucht, ob die nichtopioidergen Analgetika

Paracetamol, Acetylsalicylsäure, Metamizol und das „atypische“ Opioid Tramadol die

Dünndarmmotilität hemmen und über welche endogenen Mechanismen die

8

Peristaltikhemmung vermittelt wird. Diese Untersuchungen werden in vitro am

Meerschweinchenileum und -jejunum durchgeführt. An diesem Modell wurden bereits

eine Vielzahl von Pharmaka und Mediatoren hinsichtlich einer hemmenden Wirkung

auf die Darmmotilität untersucht (Holzer et al. 1995, 1998, Holzer 1997, Shahbazian et

al. 2002a,b, Herbert et al. 2002a,b,c,d, Gharzouli und Holzer 2004, Fruhwald et al.

2000, 2004).

9

2 Material und Methoden

2.1 Versuchsaufbau

Zur Untersuchung der Dünndarmperistaltik wurden Darmsegmente erwachsener

männlicher und weiblicher Meerschweinchen (BFA-Stamm, Lieferant Charles River

Wiga, Sulzfeld) verwendet. Das Gewicht der Tiere lag zwischen 320 g und 510 g.

Die Tiere wurden durch einen Genickschlag betäubt und anschließend durch Ausbluten

aus den Carotiden getötet. Nach Eröffnen des Peritoneums wurde der ileozäkale

Übergang aufgesucht, circa zehn Zentimeter proximal davon eine Fadenmarkierung

angebracht, Ileum und Jejunum in toto vom Mesenterium abpräpariert und anschließend

entnommen. Diese Markierung des aboralen Endes diente zur korrekten Platzierung des

Segments im Organbad, so dass eine von oral nach aboral gerichtete endoluminale

Perfusion erfolgen konnte.

Nach der Entnahme wurde der Darm in 6 Segmente von 8 bis 10 cm Länge unterteilt

und bis zur endgültigen Verwendung in oxygenierter Tyrodelösung (begast mit

Carbogen, 95 % O2 und 5 % CO2 ) bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Die

Tyrodelösung enthielt NaCl 136,9 mM, KCl 2,7 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1,0 mM,

NaHCO3 11,9 mM, NaH2PO4 0,4 mM, und Glucose 5,6 mM.

Die Darmsegmente wurden in der Versuchsvorrichtung (Abb. 1) so angeordnet, dass

das orale Darmende an eine Zuleitung angeschlossen wurde, über die eine

pumpengesteuerte endoluminale Perfusion mit vorgewärmter Tyrodelösung (37 oC)

erfolgte. Das aborale Ende wurde mit einem Y-förmigen Abflussstück verbunden,

dessen einer Arm zu einem Druckaufnehmer zur Registrierung des intraluminalen

Drucks führte, während der zweite Arm an einem senkrecht stehenden Abflussröhrchen

4 cm oberhalb des Flüssigkeitsspiegels des Organbades endete.

10

Abb. 1: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus: Aus einem Vorratsgefäß (1) wird Tyrodelösung über eine Rollerpumpe (2) angesaugt und über eine Zuleitung (3) in das Darmsegment (4), das sich in einem Bad mit 30 µl Tyrodelösung befindet, geleitet. Der Abfluss erfolgt über ein Röhrchen (5), das 4 cm über dem Badniveau endet. Ein zweiter Arm (6) führt zu einem Druckaufnehmer.

Die konstante Perfusion (0,5 ml/min) des Darmsegments mit Tyrodelösung gegen den

Widerstand von 400 Pa (entspricht dem ∆P von 4 cm Wassersäule) führte zu einer

allmählichen Füllung des Lumens und einem Anstieg des intraluminalen Drucks (=

präparatorische Phase, siehe Abb. 2). Bei Überschreitung eines bestimmten

Schwellenwertes (peristaltic pressure threshold, PPT) wurde eine Peristaltikwelle

ausgelöst und der Darminhalt durch die von oral nach aboral fortlaufende Kontraktion

der Ringmuskulatur und Verkürzung der Längsmuskulatur ausgeworfen. Die

Messsignale der intraluminalen Druckänderungen wurden über einen Analog/Digital-

Wandler (Combitrans, Fa. Braun) in einen PC und einen 6-Kanal-Schreiber (Multi-Pen

Recorder, Fa. Rikadenki) geleitet. Die peristaltische Kontraktion ist in der Registrierung

als spikeförmiger Druckanstieg zu identifizieren (= Entleerungsphase, siehe Abb. 2).

Die verwendete Apparatur erlaubte die gleichzeitige Versuchsdurchführung an fünf

Darmsegmenten. Alle Organbäder waren silanisiert und in den Untersuchungen

standardisiert mit 30 ml Tyrodelösung gefüllt.

1

Pumpe Tyrode

2

3

4

5

6

Druck-aufnehmer

11

Intr

alum

inal

er D

ruck

(Pa)

Abb. 2: Schematische Darstellung intraluminaler Druckänderungen während peristaltischer

Kontraktionen. In der präparatorischen Phase (A) füllt sich das intestinale Lumen kontinuierlich mit

Tyrodelösung und der intraluminale Druck nimmt linear bis zum Schwellenwert zur Auslösung

peristaltischer Kontraktionen (PPT, peristaltic pressure threshold) zu. Durch eine peristaltische

Kontraktion steigt der intraluminale Druck spikeartig an, das Lumen entleert sich (B, Entleerungsphase)

und der intraluminale Druck kehrt auf den Ausgangswert zurück.

2.2 Versuchsdurchführung

Nach Einsetzen des Darmsegments in das Organbad folgte eine dreißigminütige

Äquilibrierungsphase, in der der Darm zunächst für 10 Minuten völlig unbeeinflusst

gelassen und nicht mit Tyrodelösung perfundiert wurde. Das senkrechte

Abflussröhrchen befand sich zu dieser Zeit auf dem Niveau des Organbades (∆P = 0 Pa,

kein Druckgradient). Anschließend wurde der Darm mehrfach vorsichtig durchgespült,

um verbliebenen Darminhalt und Luftblasen zu entfernen. Zwanzig Minuten nach

Beginn der intraluminalen Perfusion wurde die Tyrodelösung im Organbad erneuert und

das Abflussröhrchen um 4 cm angehoben (∆P = 400 Pa), so dass durch die permanente

Infusion der Tyrodelösung der intraluminale Druck bis zum Erreichen der PPT anstieg

und peristaltische Kontraktionen ausgelöst werden konnten.

Zu diesem Zeitpunkt wurde die online-Registrierung am Flachbettschreiber (Multi-Pen

Recorder, Fa. Rikadenki) und im PC gestartet. In den nachfolgenden dreißig Minuten

PPT

A B

12

konnte das Darmsegment an die veränderten Druckverhältnisse adaptieren und

regelmäßige Peristaltik entwickeln. Geordnete Peristaltik lag dann vor, wenn sich

aufeinanderfolgende Kontraktionen nicht in der Frequenz, der Höhe des

Schwellenwertes (PPT) und im nach Entleerung des Segmentes verbleibenden

intraluminalen Druck unterschieden. Nach fünf derartigen Kontraktionen (= Vorlauf)

wurden die zu prüfenden Substanzen in das Organbad gegeben, wobei die zugegebene

Menge maximal 1 % des Badvolumens betrug. Die entsprechenden Lösungsmittel der

verwendeten Pharmaka wurden in separaten Versuchsreihen getestet, um eine

Eigenwirkung auf die Peristaltik auszuschließen bzw. zu charakterisieren.

Je Substanz und Konzentrationsstufe wurden sechs bis acht Segmente aus

unterschiedlichen Dünndarmregionen von sechs bis acht Meerschweinchen untersucht.

Am Ende des Beobachtungszeitraums wurde die Perfusion gestoppt und eine

Kalibrierung durchgeführt, die die Umrechnung der graphisch registrierten und in

Millimeter gemessenen Werte einer Peristaltikwelle in Druckwerte (in Pa) ermöglichte.

Dazu wurde als Nullwert der Druck im Organbad auf Dünndarmniveau festgelegt, als

zweiter Referenzpunkt diente der Druck der Wassersäule 4 cm über dem Niveau des

Darmsegments im Organbad (entspricht 400 Pa).

13

2.3 Substanzen, Konzentrationen, Versuchsreihen

Nachfolgende, in Tabelle 1 aufgeführte Substanzen wurden in den Untersuchungen

eingesetzt. Genannt sind jeweils der Name der Substanz, die Bezugsquelle (Anschrift

im Anhang), Funktion bzw. pharmakologische Eigenschaften der Substanz und

getestete Konzentrationen. Die Lösungsmittel der Substanzen sind im Anhang

aufgeführt, weitere Verdünnungsstufen wurden mit Tyrodelösung hergestellt.

Tabelle 1

Name

Lieferant

Funktion der Substanz

getestete Konzentrationen

Acetylsalicylsäure Fa. Sigma Analgetikum 100-300 µM

Apamin Fa. Sigma Antag. am Ca++-abhängigen K+-Kanal

0,5 µM

Metamizol Fa. Sigma Analgetikum 10-100 µM

Methysergid Fa. Sigma Antag. am 5-HT-Rezeptor 1 µM

Naloxon Fa. Tocris Antag. am Opioidrezeptor 0,5 µM

D-NAME Fa. Bachem NO-Synthetaseinhibitor (inaktiv) 300 µM

L-NAME Fa. Bachem NO-Synthetaseinhibitor 300 µM

Paracetamol Fa. Sigma Analgetikum 0,01-100 µM

Prazosin Fa. Sigma Antag. am α1-Adrenozeptor 1 µM

Tramadol

- Razemat

- (+)-, (-)-Tramadol

- O-Desmethyltramadol

Fa. Grünenthal Analgetikum

1-100 µM

1-100 µM

0,1-100 µM

Tropisetron Fa. Sigma Antag. am 5-HT3-Rezeptor 1 µM

Yohimbin

Fa. Tocris Antag. am α2-Adrenozeptor 1 µM

D-, L-NAME: D-, L-Nitroargininemethylester (D-NAME inaktives Enantiomer)

O-Desmethyltramadol: Hauptmetabolit von Tramadol

14

Versuchsreihen

2.3.1 Paracetamol

2.3.1.1 Paracetamol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung

10 min 60 min

Vorlauf Lösungsmittel von Paracetamol n=6

Vorlauf Paracetamol 0,01 µM n=6

0,1 µM n=6

1 µM n=6

3 µM n=6

10 µM n=6

30 µM n=6

100 µM n=6

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurde bei je 6 Darmsegmenten entweder das

Lösungsmittel oder Paracetamol (in den oben genannten Konzentrationen) in das

Organbad gegeben. Nach Substanzzugabe wurde die Peristaltik über einen Zeitraum

von 60 min registriert.

2.3.1.2 Antagonisierung der Paracetamolwirkung I (Naloxon, Apamin)

10 min 20 min 60 min

Vorlauf Tyrodelösung 3 µM Paracetamol n=8

Vorlauf 0,5 µM Naloxon 3 µM Paracetamol n=8

Vorlauf 0,5 µM Apamin 3 µM Paracetamol n=8

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurden je 8 Darmsegmente für 20 min entweder mit

Tyrodelösung (Kontrolle), 0,5 µM Naloxon oder 0,5 µM Apamin vorbehandelt und

dann jeweils 3 µM Paracetamol zugegeben. Nach Paracetamolzugabe wurde die

Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

15

2.3.1.3 Antagonisierung der Paracetamolwirkung II (L-NAME, D-NAME)


Vorlauf 300 µM L-NAME 3 µM Paracetamol n=6

Vorlauf 300 µM D-NAME 3 µM Paracetamol n=6

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurden je 6 Darmsegmente für 20 min mit 300 µM

L- bzw. D- NAME vorbehandelt und dann 3 µM Paracetamol zugegeben. Nach

Paracetamolzugabe wurde die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.1.4 Antagonisierung der Paracetamolwirkung III (Acetylsalicylsäure, ASS)


Vorlauf Lösungsmittel von ASS 3 µM Paracetamol n=8

Vorlauf 100 µM ASS 3 µM Paracetamol n=8


dem Lösungsmittel der Acetylsalicylsäure oder 100 µM Acetylsalicylsäure

vorbehandelt und dann 3 µM Paracetamol zugegeben. Nach Paracetamolzugabe wurde

die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.1.5 Antagonisierung der Paracetamolwirkung IV (Serotoninantagonisten)


Vorlauf Lösungsmittel 3 µM Paracetamol n=6

Vorlauf 1 µM Methysergid

+ 1 µM Tropisetron

3 µM Paracetamol n=6


+ 1 µM Tropisetron

+ 0,5 µM Naloxon

3 µM Paracetamol n=6


+ 1 µM Tropisetron

Tyrodelösung n=6

16


dem Lösungsmittel, der Kombination der Serotoninantagonisten 1 µM Methysergid plus

1 µM Tropisetron oder der Kombination der Serotoninantagonisten (1 µM Methysergid,

1 µM Tropisetron) plus 0,5 µM Naloxon vorbehandelt und dann jeweils 3 µM

Paracetamol zugegeben. In einem Kontrollexperiment wurden nur die

Serotoninantagonisten (1 µM Methysergid, 1 µM Tropisetron) gefolgt von

Tyrodelösung verabreicht. Nach der letzten Substanzzugabe wurde die Peristaltik

jeweils über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.2 Acetylsalicylsäure Konzentrations-Wirkungs-Beziehung

10 min 60 min

Vorlauf Lösungsmittel von Acetylsalicylsäure n=6

Vorlauf Acetylsalicylsäure 100 µM n=6

300 µM n=6

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurde bei je 6 Darmsegmenten das Lösungsmittel,

100 µM oder 300 µM Acetylsalicylsäure in das Organbad gegeben. Nach

Substanzzugabe wurde die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.3 Metamizol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurde bei je 6 Darmsegmenten das Lösungsmittel,

10 µM oder 100 µM Metamizol in das Organbad gegeben. Nach Substanzzugabe wurde

die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

10 min 60 min

Vorlauf Lösungsmittel von Metamizol n=6

Vorlauf Metamizol 10 µM n=6

100 µM n=6

17

2.3.4 Tramadol

2.3.4.1 Tramadol (Razemat) Konzentrations-Wirkungs-Beziehung

10 min je 20 min

Vorlauf Tramadolrazemat 1-10-30-100 µM n=6

In orientierenden Experimenten wurde nach zehnminütiger Vorlaufphase je 6

Darmsegmenten im Abstand von 20 min kumulativ 1, 10, 30 und 100 µM razemisches

Tramadol zugegeben.

2.3.4.2 (+)-Tramadol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurde bei je 6 Darmsegmenten (+)-Tramadol (in den

oben genannten Konzentrationen) in das Organbad gegeben. Nach Substanzzugabe

wurde die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.4.3 (-)-Tramadol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung

10 min 60 min

Vorlauf (-)-Tramadol 1 µM n=6

10 µM n=6

30 µM n=6

100 µM n=6

10 min 60 min

Vorlauf (+)-Tramadol 1 µM n=6

10 µM n=6

30 µM n=6

100 µM n=6

18

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurde bei je 6 Darmsegmenten (-)-Tramadol (in den

oben genannten Konzentrationen) in das Organbad gegeben. Nach Substanzzugabe

wurde die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.4.4 O-Desmethyltramadol Konzentrations-Wirkungs-Beziehung

10 min 60 min

Vorlauf O-Desmethyltramadol 0,1 µM n=6

1 µM n=6

10 µM n=6

30 µM n=6

100 µM n=6

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurde bei je 6 Darmsegmenten O-

Desmethyltramadol (in den oben genannten Konzentrationen) in das Organbad gegeben.

Nach Substanzzugabe wurde die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.4.5 Antagonisierung der Tramadolwirkung I (Naloxon)


Vorlauf Tyrodelösung 100 µM (+)-Tramadol n=6

Vorlauf 0,5 µM Naloxon 100 µM (+)-Tramadol n=6

Vorlauf Tyrodelösung 100 µM (-)-Tramadol n=6

Vorlauf 0,5 µM Naloxon 100 µM (-)-Tramadol n=6

Vorlauf Tyrodelösung 100 µM O-Desmethyltram. n=6

Vorlauf 0,5 µM Naloxon 100 µM O-Desmethyltram. n=6


Tyrodelösung (Kontrolle) oder 0,5 µM Naloxon vorbehandelt und dann 100 µM

19

(+)-Tramadol, (-)-Tramadol oder O-Desmethyltramadol hinzugegeben. Nach

Tramadolzugabe wurde die Peristaltik über einen Zeitraum von 60 min registriert.

2.3.4.6 Antagonisierung der Tramadolwirkung II (Serotoninantagonisten)




+ 1 µM Tropisetron

30 µM (+)-Tramadol n=6



+ 1 µM Tropisetron

30 µM (-)-Tramadol n=8



+ 1 µM Tropisetron

10 µM O-Desmethyltram. n=6

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurden je 6 bzw. 8 Darmsegmente für 20 min

entweder mit Tyrodelösung (Kontrolle) oder der Kombination der Serotonin-

antagonisten 1 µM Methysergid plus 1 µM Tropisetron vorbehandelt und dann 30 µM

(+)-Tramadol, (-)-Tramadol oder 10 µM O-Desmethyltramadol hinzugegeben. Nach


20

2.3.4.7 Antagonisierung der Tramadolwirkung III (α-Adrenozeptorantagonisten)



Vorlauf 1 µM Prazosin

+ 1 µM Yohimbin

30 µM (+)-Tramadol n=6



+ 1 µM Yohimbin

30 µM (-)-Tramadol n=6



+ 1 µM Yohimbin

10 µM O-Desmethyltram. n=7

Nach zehnminütiger Vorlaufphase wurden je 6 bzw. 7 Darmsegmente für 20 min

entweder mit Tyrodelösung (Kontrolle) oder der Kombination der α-Adrenozeptor-

antagonisten 1 µM Prazosin plus 1 µM Yohimbin vorbehandelt und dann 30 µM (+)-

Tramadol, (-)-Tramadol oder 10 µM O-Desmethyltramadol hinzugegeben. Nach


2.4 Auswertung

2.4.1 Auswertungskriterien

Wie beschrieben, gliedert sich eine peristaltische Kontraktion in die präparatorische

Phase, in der sich das Segment langsam füllt und der intraluminale Druck allmählich

steigt, und in die Entleerungsphase (Abb. 2).

Die Druckschwelle PPT zur Auslösung der peristaltischen Kontraktionen ist der

quantitative Parameter zur Beurteilung der Wirkung einer Substanz auf die Peristaltik.

Die PPT wurde an den Registrierungen am Flachbettschreiber ausgemessen und mittels

des Kalibrierungsfaktors in Pascal (Pa) umgerechnet.

21

Eine Stimulation der Peristaltik ist an einem Absinken, eine Inhibition hingegen an

einem Ansteigen der PPT zu erkennen (Herbert et al. 2002b).

2.4.2 Auswertungsschema

Zur statistischen Aufarbeitung der Messparameter wurde nach Substanzzugabe die PPT

der jeweils letzten kompletten Kontraktion in aufeinander folgenden

Fünfminutenintervallen (0-5 min, 5-10 min, 10-15 min, ...) bestimmt. Im Vorlauf vor

Substanzzugabe wurde die PPT bei der letzten und der fünftletzten Kontraktion

ausgemessen, daraus der Mittelwert gebildet und dieser als Ausgangsniveau festgelegt.

Zur Berechnung der durch die Substanz hervorgerufenen Schwellenänderung (∆PPT)

wurde dieser Ausgangswert von den PPT-Werten nach Substanzzugabe abgezogen.

Analog wurde in Versuchen mit konsekutiver Gabe von zwei Substanzen (z.B.

Antagonisierungsversuche) die Wirkung der zweiten Substanz gegen die der ersten

Substanz mit der ∆PPT abgegrenzt. Die PPT der letzten Kontraktion nach Zugabe der

ersten Substanz wurde von der PPT nach Zugabe der zweiten Substanz subtrahiert.

Komplette Hemmung

Als qualitativer Parameter wurde eine komplette Hemmung definiert durch das Fehlen

von propulsiver Peristaltik. Hierbei war der intraluminale Druck 400 Pa und der Darm

dilatiert. Auch intraluminale Druckschwankungen geringer Amplitude bei einem

dilatierten Darm wurden als komplette Hemmung gewertet, da sie durch

Wandbewegungen in einem Darmabschnitt hervorgerufen wurden und nicht zum

Flüssigkeitsauswurf führten.

Spontanaktivität

Nach kompletter Hemmung wiedereinsetzende Kontraktionen des Darms wurden

qualitativ als Spontanaktivität bezeichnet, wenn diese Kontraktionen registrierbar waren

und eine Kontraktionsamplitude größer 200 Pa hatten, aber keine präparatorische Phase

bzw. PPT aufwiesen und zu keinem Auswurf von Darminhalt führten.

22

Recovery

Stellten sich nach kompletter Hemmung regelhafte, peristaltische Kontraktionen ein,

deren PPT sich maximal um 20 Pa von der Druckschwelle vor Eintritt der Hemmung

unterschied, wo wurde dies als Recovery bezeichnet.

2.4.3 Statistik

Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit dem Programm Sigmastat 32

(Fa. SPSS Inc., Erkrath). Die PPT-Werte wurden mit dem Kolmogoroff-Smirnow-Test

auf Normalverteilung geprüft. Die Ergebnisse wurden als Mittelwerte ± Standardfehler

des Mittelwertes (SEM, standard error of the mean) dargestellt. Die statistische Prüfung

auf signifikante Unterschiede erfolgte bei multiplen Vergleichen mittels ANOVA

(analysis of variance) und post hoc Student-Newman-Keuls-Test, bei Vergleich zweier

Gruppen mit dem Student-t-Test auf dem Signifikanzniveau p<0,05.

Die Ergebnisse der Versuchsreihen wurden als Mittelwertskurven oder Balken-

diagramme mit zugehörigem Standardfehler dargestellt (Programm Sigmaplot 8.0, Fa.

SPSS Inc.).

Berechnung der ED50

Aus den Daten der Versuchsreihen zur Konzentrations-Wirkungs-Beziehung wurde mit

der Methode nach Tallarida und Murray (1987) für jedes Analgetikum die

halbmaximale Wirkkonzentration ED50 errechnet.

23

3 Ergebnisse

3.1 Wirkung von Paracetamol auf die Dünndarmperistaltik

Während die Zugabe des Lösungsmittels (Tyrodelösung) zum Organbad die Peristaltik

nicht beeinflusste (Abb. 3 A), stieg die PPT nach Paracetamol konzentrationsabhängig

an (Abb. 3 B, C). Nach 1 bzw. 3 µM Paracetamol betrug die PPT-Zunahme im Mittel

46,6 ± 8,7 Pa bzw. 74,7 ± 17,4 Pa. In der Konzentration von 10 µM führte Paracetamol

bei vier von sechs Segmenten nach 5,7 ± 1,0 min zu einer kompletten Hemmung der

Peristaltik. In diesen vier Segmenten trat 9,3 ± 3,4 min nach eingetretener Hemmung

Spontanaktivität auf, in einem Segment kehrte nach 25 Minuten auch geregelte

Peristaltik zurück (Recovery, Abb. 3 C). Durch 100 µM Paracetamol wurden alle sechs

Segmente nach 5,7 ± 1,0 min komplett gehemmt, nach weiteren 17,1 ± 3,3 min kam es

in allen Darmsegmenten zu spontanen Wandbewegungen und eine Rückkehr geordneter

Peristaltik wurde in drei Segmenten nach 34,1 ± 3,6 min beobachtet. In diesen

Segmenten war allerdings die PPT im Vergleich zum Vorlauf vor Substanzzugabe

deutlich erhöht (Abb. 3 D, E).

Der Zeitverlauf des PPT-Anstiegs während der Registrierphase (60 min) in

Abhängigkeit von der Paracetamolkonzentration ist in Abb. 4, die Konzentrations-

Wirkungs-Beziehung in Abb. 5 dargestellt. Mit 6,0 µM Paracetamol konnte 50 % des

Maximaleffekts erzielt werden (= ED50).

24

100

Pa

4 min

1 µM Paracetamol

B

100

Pa

3 min

10 µM Paracetamol

C

Lösungmittel

100

Pa

5 min

A

25

100

Pa

3 min

100 µM Paracetamol

D

100

Pa

4 min

100 µM Paracetamol

E

Abb. 3 A-E: Originalregistrierungen intraluminaler Druckänderungen während peristaltischer

Kontraktionen unter der Wirkung von Paracetamol.

Nach gleichmäßigen Kontraktionen erfolgt die Applikation (Pfeil) von (A) dem Lösungsmittel

(Tyrodelösung) oder Paracetamol 1 µM (B), 10 µM (C), 100 µM (D, E). Die waagrechten Pfeilspitzen

markieren die intraluminale Druckschwelle (PPT) zur Auslösung einer peristaltischen Kontraktion (B-D).

26

Zeitintervall (min)

0 10 20 30 40 50 60

Ans

tieg

der P

PT

(Pa)

0

50

100

150

200

250

300

350

Lösungsmittel1 µM Paracetamol 3 µM Paracetamol 10 µM Paracetamol100 µM Paracetamol

Abb. 4: Zeitverlauf und Konzentrations-Wirkungs-Beziehung des Anstiegs der PPT (peristaltic

pressure threshold = intraluminale Druckschwelle zur Auslösung peristaltischer Kontraktionen, in Pa)

über einen Zeitraum von 60 min nach Applikation (Pfeil) des Lösungsmittels (Tyrodelösung) und 1-100

µM Paracetamol. Die Symbole repräsentieren die Mittelwerte des PPT-Anstiegs mit dazugehörigem

Standardfehler (SEM, standard error of the mean) aus n=6 Darmsegmenten. Sind keine Fehlerbalken

sichtbar (Lösungsmittel), so überdeckt das Symbol die Höhe des Standardfehlers.

27

Paracetamol (log µM)

Ans

tieg

der P

PT (%

)

0

20

40

60

80

100

0.01 0.1 1 3 10 100

Abb. 5: Konzentrations-

Wirkungs-Kurve des

Anstiegs der PPT nach

0,01-100 µM Paracetamol

in Prozent (%) des

maximal möglichen

Anstiegs der PPT. Die

Symbole repräsentieren die

Mittelwerte des PPT-

Anstiegs über den

Messzeitraum von 60 min

mit dazugehörigem

Standardfehler (SEM,

standard error of the mean)

aus n=6 Darmsegmenten.

Sind keine Fehlerbalken

sichtbar (0,01 µM), so

überdeckt das Symbol die

Höhe des Standardfehlers.

3.2 Aufhebung der Paracetamolwirkung durch Vorbehandlung mit

Antagonisten der vermuteten Mediatoren

Um die Mechanismen der durch Paracetamol verursachten Hemmung aufzuklären,

wurden die Segmente 20 Minuten vor der Zugabe von Paracetamol in submaximaler

Wirkkonzentration (3 µM) mit selektiven Antagonisten der vermuteten Mediatoren

vorbehandelt.

3.2.1 Blockade von opioidergen Rezeptoren durch Naloxon

Die Vorbehandlung mit dem Opioidrezeptorantagonisten Naloxon (0,5 µM) führte

zunächst zu einem Absinken der Schwelle um etwa 10 Pa (Tab. 2) und zu einem

Frequenzanstieg peristaltischer Kontraktionen (Abb. 6 B). Im Gegensatz zur

Vorbehandlung mit dem Lösungsmittel (Tyrodelösung, Abb 6 A) trat nach

28

Naloxonvorbehandlung kein PPT-Anstieg durch 3 µM Paracetamol auf. Der

Unterschied im PPT-Anstieg nach Naloxonvorbehandlung (48,7 ± 11,4 Pa) vs. der

Kontrollgruppe (Lösungsmittel, 92,6 ± 18,2 Pa) war signifikant (Abb. 7 A).

Tabelle 2: Anstieg der PPT nach Vorbehandlung mit Tyrodelösung bzw. verschiedenen Antagonisten (∆t = 20 min)

Daten entsprechen dem Mittelwert ± SEM

∆ PPT (Pa)

Lösungsmittel (Tyrodelösung) n=22 1,5 ± 6,6

Naloxon (0,5 µM) n=8 -13,9 ± 3,1

Apamin (0,5 µM) n=8 -1,3 ± 1,7

L-NAME n=6 -10,4 ± 4,4

D-NAME n=6 2,5 ± 0,8

Acetylsalicylsäure (100 µM) n=8 7,5 ± 1,7

5-HT-Antagonisten

(1 µM Methysergid + 1 µM Tropisetron)

n=6 15,9 ± 3,9

5-HT-Antagonisten

(1 µM Methysergid + 1 µM Tropisetron)

+ 0,5 µM Naloxon

n=6 0,7 ± 1,5

29

10

0 P

a

4 min

Lösungsmittel 3 µM Paracetamol

A

100

Pa

4 min

0.5 µM Naloxon

B

3 µM Paracetamol

Abb. 6 A, B: Originalregistrierung der Aufhebung der Paracetamolwirkung durch Naloxon.

(A) Nach Vorbehandlung mit dem Lösungsmittel (Tyrodelösung) kommt es durch 3 µM Paracetamol

zum Anstieg der PPT, der nach Vorbehandlung mit 0,5 µM Naloxon (B) aufgehoben ist. Durch die

Wirkung von Naloxon kommt es zu einem Frequenzanstieg peristaltischer Kontraktionen (B).

30

1 2 3 4 5 6 7

Anst

ieg

der P

PT (P

a)

0

50

100

150

5-HT-Antag+ Naloxon

3 µMParacet

ED

LM

3 µMParacet

5-HT-Antag

3 µMParacet

5-HT-Antag

Vehicle

0 2 4 6 8 10

Incr

ease

in P

PT

(Pa)

0

50

100

150

LM

3 µMParacet

0.5 µMApamin

3 µMParacet

0.5 µMNaloxon

3 µMParacet

300 µML-NAME

3 µMParacet

* *

300 µMD-NAME

3 µMParacet

100 µMASS

3 µMParacet

LM

3 µMParacet

A CB

Abb. 7 A-E: Wirkung von

Apamin, Naloxon, L-

NAME, Acetylsalicylsäure

und Serotoninantagonisten

auf den Anstieg der PPT

durch Paracetamol. Die

Säulen repräsentieren den

mittleren PPT-Anstieg (Pa),

die Fehlerbalken den



aus n=6 Darmsegmenten

durch Paracetamol. Während

der Anstieg der PPT durch 3

µM Paracetamol (Paracet)

nach Vorbehandlung mit

(A) 0,5 µM Apamin und 0,5 µM Naloxon im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert ist, hat

(B) die Vorbehandlung mit L-NAME im Vergleich zu D-NAME keine derartige Wirkung.

(C) Acetylsalicylsäure (ASS, 100 µM) und (D) die Kombination der Serotoninantagonisten 1 µM

Methysergid plus 1 µM Tropisetron (5-HT-Antag) sowie die Kombination dieser 5-HT-Antagonisten mit

0,05 µM Naloxon heben im Vergleich zur Vorbehandlung mit dem jeweiligen Lösungsmittel (LM) die

Wirkung von 3 µM Paracetamol nicht auf. (E) Die 5-HT-Antagonisten haben gefolgt vom Lösungsmittel

Tyrodelösung keine nennenswerte Eigenwirkung auf die PPT. Die Signifikanzprüfung (*) erfolgte mittels

ANOVA und post hoc Student-Newman-Keuls-Test oder Student t-Test auf dem Niveau von p<0,05.

31

3.2.2 Blockade von Calcium-abhängigen Kaliumkanälen durch Apamin

Nach Blockade von Calcium-abhängigen Kaliumkanälen geringer Leitfähigkeit mit

0,5 µM Apamin war die Zunahme der PPT durch 3 µM Paracetamol (41,3 ± 8,7 Pa)

signifikant geringer (p= 0,03) als in der Kontrollgruppe (92,6 ± 18,2 Pa, Abb. 7 A).

3.2.3 Blockade der NO-Synthetase durch L-NAME. Vergleich mit dem inaktiven

Enantiomer D-NAME

Die Blockade der Stickstoffmonoxidsynthetase mit 300 µM L-NAME hatte im

Vergleich zur Vorbehandlung mit dem inaktiven Enantiomer D-NAME per se keine

Auswirkung auf die Peristaltik und die PPT (s. Tab. 2) und zudem keinen Effekt auf den

durch Paracetamol (3 µM) hervorgerufenen Schwellenanstieg (64,4 ± 8,5 Pa bzw. 69,9

± 17,2 Pa, Abb. 7 B).

3.2.4 Inhibition der Cyclooxygenase COX-1 und COX-2 durch Acetylsalicylsäure

Zur Klärung der Frage, ob Syntheseprodukte der Cyclooxygenase COX-1 und COX-2

zur Hemmwirkung des Paracetamols betragen, wurden Darmsegmente mit 100 µM

Acetylsalicylsäure vorbehandelt. Diese Zugabe beeinflusste weder per se die Peristaltik

(s. Tab. 2), noch die Erhöhung der PPT durch 3 µM Paracetamol (Kontrollgruppe: 108,6

± 18,5 Pa; Acetylsalicylsäuregruppe: 109,1 ± 11.5 Pa, Abb. 7 C).

3.2.5 Blockade von Serotoninrezeptoren durch Methysergid und Tropisetron

Die zwanzigminütige Vorbehandlung mit 1 µM Methysergid und 1 µM Tropisetron

führte zu einem stärkeren Anstieg der PPT durch 3 µM Paracetamol als in der

Kontrollgruppe (153,6 ± 24,7 Pa vs. 114,6 ± 30,7 Pa nach Vorbehandlung mit

Tyrodelösung, Abb. 7 D). Nach der Blockade der Serotoninrezeptoren bewirkte

Paracetamol in vier von sechs Segmenten nach 8,3 ± 1,4 min eine komplette Hemmung,

32

in drei dieser Segmente kehrte nach 8,3 ± 2,0 min Spontanaktivität zurück. Ein Segment

war während des gesamten Beobachtungszeitraums von 60 Minuten komplett gehemmt.

In der mit Tyrodelösung vorbehandelten Kontrollgruppe trat hingegen in nur einem

Segment 2,7 min nach Paracetamolapplikation eine komplette Hemmung auf, die über

60 min andauerte. In einem weiteren Kontrollexperiment wurde gezeigt, dass die beiden

Serotoninantagonisten gefolgt von Tyrodelösung per se die PPT nicht veränderten

(Abb. 7 E, vgl. Tab. 2).

Die Kombination aus 1 µM Methysergid, 1 µM Tropisetron und dem Opiatantagonisten

Naloxon (0,5 µM) bewirkte einen schwächeren Anstieg der PPT durch Paracetamol

(101,5 ± 10,5 Pa) als nach Vorbehandlung mit den beiden Serotoninantagonisten (Abb.

7 D). Zwei von sechs Segmente waren vier min komplett gehemmt, danach kehrte

geordnete Peristaltik zurück.

33

3.3 Wirkung von Acetylsalicylsäure auf die Dünndarmperistaltik

Acetylsalicylsäure wurde den Organbädern in 100 µM und 300 µM Konzentration

zugefügt und gegen die alleinige Gabe von Tyrodelösung verglichen. Dabei zeigte sich,

dass weder die Tyrodelösung noch 100 µM und 300 µM Acetylsalicylsäure einen

Einfluss auf die PPT hatten (Tab. 3).

∆PPT (Pa) ∆PPT (Pa)

Lösungsmittel ASS 7,7 ± 2,5 Lösungsmittel Metamizol 3,9 ± 1,2

100 µM ASS 7,6 ± 4,4 10 µM Metamizol 6,6 ± 1,5

300 µM ASS 4,3 ± 2,7 100 µM Metamizol 18,1 ± 2,5

Tabelle 3: Durch Acetylsalicylsäure und Metamizol verursachte Änderungen der PPT (Pa).

Angegeben sind Mittelwerte des PPT-Anstiegs über einen Zeitraum von 60 Minuten aus n=6

Darmsegmenten mit dazugehörigem Standardfehler (SEM, standard error of the mean).

3.4 Wirkung von Metamizol auf die Dünndarmperistaltik

Metamizol (10 µM, 100 µM) hatte ebenso wie das Lösungsmittel (Tyrodelösung)

keinen Effekt auf die PPT (Tab. 3).

34

3.5 Wirkung von Tramadolrazemat, (+)-Tramadol, (-)-Tramadol und

O-Desmethyltramadol auf die Dünndarmperistaltik

In den nachfolgenden Experimenten wurde die Wirkung von handelsüblichem

Tramadol (Razemat), dessen (+)- und (-)-Enantiomeren sowie dem Hauptmetaboliten

O-Desmethyltramadol auf die Darmmotilität des Meerschweinchens untersucht.

3.5.1 Tramadolrazemat

Razemisches Tramadol wurde dem Organbad kumulativ in Konzentrationen von 1, 10,

30 und 100 µM im Abstand von jeweils 20 Minuten zugegeben. Es zeigte sich ein

konzentrationsabhängiger Anstieg der PPT ab 10 µM (Abb. 8). Durch 100 µM

Tramadol kam die Peristaltik in 5 von 6 Segmenten nach 4,9 ± 1,0 min völlig zum

Erliegen. Bei drei der gehemmten Segmente traten nach 5,9 ± 1,1 min spontane

Wandbewegungen ohne propulsiven Auswurf von Darminhalt auf. Die Konzentrations-

Wirkungs-Beziehung ist in Abb. 9 wiedergegeben, die ED50 betrug 65,6 µM.

100

Pa

6 min

Tramadolrazemat (µM)

1 10 30 100

Abb. 8: Originalregistrierung intraluminaler Druckänderungen während peristaltischer

Kontraktionen unter kumulativer Zugabe von razemischem Tramadol.

Nach gleichmäßigen Kontraktionen wird dem Organbad kumulativ 1, 10, 30 und 100 µM razemisches

Tramadol zugegeben. Nach 10 µM und 30 µM Tramadol kommt es zu einem konzentrationsabhängigen

Anstieg der intraluminalen Druckschwelle zur Auslösung der Peristaltik. Nach 100 µM Tramadol erlischt

die Peristaltik komplett.

35

Tramadolrazemat (µM)

Ans

tieg

der P

PT (%

)

0

20

40

60

80

100

1 10 10030

Abb. 9: : Konzentrations-

Wirkungs-Kurve des

Anstiegs der PPT nach 1-

100 µM Tramadolrazemat.

Die Symbole repräsentieren

die Mittelwerte des PPT-

Anstiegs mit dazugehörigem



aus n=6 Darmsegmenten.

Sind keine Fehlerbalken

sichtbar (1 µM), so über-

deckt das Symbol die Höhe

des Standardfehlers.

3.5.2 (+)-Tramadol

Der Effekt des (+)-Enantiomers wurde in Konzentrationen von 1, 10, 30 und 100 µM

über einen Zeitraum von 60 Minuten an jeweils sechs Segmenten untersucht.

Während 1 µM (+)-Tramadol keinen Einfluss auf die PPT hatte (Abb. 10 A, 11), rief

10 µM (+)-Tramadol einen transienten Anstieg der PPT hervor (Abb. 10 B), die mittlere

Änderung des Schwellenwertes über 60 Minuten betrug 22,4 ± 9,5 Pa.

Die nächsthöhere Konzentration 30 µM (+)-Tramadol führte in zwei Segmenten nach

8,3 ± 4,1 min zu einer kompletten Hemmung, die 9,7 ± 0,4 min andauerte und der

regelhafte Peristaltik, mit jedoch höheren Schwellenwerten als im Vorlauf, folgte (Abb.

10 C, 11).

Nach 100 µM (+)-Tramadol trat innerhalb von 11,2 ± 4,3 min in allen Segmenten eine

komplette Hemmung auf, zum Teil intermittierend (Abb. 10 D) oder während des

gesamten Beobachtungszeitraums andauernd (Abb. 10 E).

35

36

100

Pa

4 min

1 µM (+) Tramadol

A

100

Pa

4 min

10 µM (+) Tramadol

B

100

Pa

4 min

30 µM (+) Tramadol

C

37

100

Pa

4 min

100 µM (+) Tramadol

D

100

Pa

4 min

100 µM (+) Tramadol

E

Abb. 10 A-E: Originalregistrierungen intraluminaler Druckänderungen während peristaltischer

Kontraktionen nach Applikation von (+)-Tramadol.

Nach gleichmäßigen Kontraktionen wird dem Organbad (A) 1 µM, (B) 10 µM, (C) 30 µM und (D, E)

100 µM (+)-Tramadol zugegeben. (B) 10 µM (+)-Tramadol bewirkt einen transienten Anstieg der

intraluminalen Druckschwelle zur Auslösung der Peristaltik, (C) 30 µM (+)-Tramadol eine

vorübergehende Hemmung mit nachfolgend erhöhten Schwellen und 100 µM (+)-Tramadol eine

intermittierende Hemmung (D) oder einen Stillstand der Peristaltik mit raschen intraluminalen

Druckänderungen niedriger Amplitude (E).

38

Zeitintervall (min)

0 10 20 30 40 50 60

Anst

ieg

der P

PT

(Pa)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

1 µM (+)-Tramadol10 µM (+)-Tramadol30 µM (+)-Tramadol100 µM (+)-Tramadol

Abb. 11: Zeitverlauf und Konzentrations-Wirkungs-Beziehung des Anstiegs der PPT (peristaltic

pressure threshold = intraluminale Druckschwelle zur Auslösung peristaltischer Kontraktionen, in Pa)

nach Applikation (Pfeil) von 1-100 µM (+)-Tramadol. Nach Substanzgabe erfolgte die Registrierung über

einen Zeitraum von 60 min. Die Symbole repräsentieren die Mittelwerte des PPT-Anstiegs mit

dazugehörigem Standardfehler (SEM, standard error of the mean) aus n=6 Darmsegmenten. Sind keine

Fehlerbalken sichtbar (1 µM), dann überdeckt das Symbol die Höhe des Standardfehlers.

39

3.5.3 (-)-Tramadol

Das (-)-Enantiomer ruft qualitativ und quantitativ ähnliche Veränderungen der PPT

hervor wie das (+)-Enantiomer. Die Zugabe von 1 µM und 10 µM (-)-Tramadol hatte

keinen Einfluss auf die Peristaltik, der Schwellenwert stieg nicht an (Abb. 13); 30 µM

(-)-Tramadol bewirkte einen mittleren Schwellenanstieg von 77,1 ± 20,9 Pa (Abb. 12 A,

13) und führte in einem Segment nach 7,6 min zu einer kompletten Hemmung (Abb. 12

B), nach 4 min kehrte regelmäßige Peristaltik zurück.

Die höchste Konzentration von 100 µM hemmte in allen sechs Segmenten die

Darmmotilität und nach durchschnittlich 5,3 ± 0,8 min kam die Peristaltik zum Erliegen

(Abb. 12 C). In fünf Segmenten trat nach 9,2 ± 3,0 min Spontanaktivität auf, zum Teil

wiederholten sich auch Phasen kompletter Hemmung.

40

100

Pa

4 min

30 µM (-) Tramadol

A10

0 P

a

4 min

30 µM (-) Tramadol

B

100

Pa

6 min

100 µM (-) Tramadol

C

Abb. 12 A-C: Originalregistrierungen intraluminaler Druckänderungen während peristaltischer

Kontraktionen nach Applikation von (-)-Tramadol.

Nach gleichmäßigen Kontraktionen wird dem Organbad (A, B) 30 µM und (C) 100 µM (-)-Tramadol

zugegeben. (-)-Tramadol bewirkt in der Badkonzentration von 30 µM (A) einen transienten Anstieg der

intraluminalen Druckschwelle zur Auslösung der Peristaltik oder (B) eine vorübergehende Hemmung mit

nachfolgend erhöhten Schwellen und schnellerer Kontraktionsfrequenz. (C) Nach 100 µM (-)-Tramadol

tritt intermittierend ein kompletter Stillstand der Peristaltik ein.

41

Zeitintervall (min)

0 10 20 30 40 50 60

Anst

ieg

der P

PT (P

a)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

1 µM (-)-Tramadol10 µM (-)-Tramadol30 µM (-)-Tramadol100 µM (-)-Tramadol

Abb. 13: Zeitverlauf und Konzentrations-Wirkungs-Beziehung des Anstiegs der PPT (Pa) nach

Applikation (Pfeil) von 1-100 µM (-)-Tramadol. Nach Substanzgabe erfolgte die Registrierung über einen

Zeitraum von 60 min. Die Symbole repräsentieren die Mittelwerte des PPT-Anstiegs mit dazugehörigem

Standardfehler (SEM, standard error of the mean) aus n=6 Darmsegmenten. Sind keine Fehlerbalken

sichtbar (1 und 10 µM), dann überdeckt das Symbol die Höhe des Standardfehlers.

42

3.5.4 O-Desmethyltramadol

Der Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol wurde in Konzentrationen von 0,1, 1, 10 , 30

und 100 µM zugegeben. In niedrigen Konzentrationen von 0,1 µM und 1 µM war keine

Änderung des Schwellenwertes zu registrieren (Abb. 15), 10 µM O-Desmethyltramadol

führte bei einem Segment nach 22 min zu einer kompletten Hemmung, die sich nach

18,3 min spontan löste und nach weiteren 1,5 min kehrte geregelte Peristaltik zurück.

Im Mittel betrug der Schwellenanstieg 91,8 ± 32,8 Pa (Abb. 15).

Die Zugabe von 30 µM O-Desmethyltramadol ließ die PPT in den ersten 20 Minuten

durchschnittlich um 239,1 ± 51,9 Pa ansteigen und hemmte in drei von sechs

Segmenten die Darmperistaltik nach 3,6 ± 1,0 min. In einem dieser Segmente trat nach

27 min Spontanaktivität auf (Abb. 14 A).

Durch 100 µM O-Desmethyltramadol kam die Peristaltik in allen sechs Segmenten nach

weniger als vier Minuten völlig zum Erliegen (Abb. 14 B, C). Diese Hemmung

überdauerte den gesamten Beobachtungszeitraum von 60 min, gelegentlich konnten

niedrigamplitudige intraluminale Druckänderungen registriert werden (Abb. 14 C).

43

100

Pa

6 min

30 µM O-Desmethyltramadol

A10

0 P

a

4 min


B

100

Pa

4 min


C

Abb. 14 A-C: Originalregistrierungen intraluminaler Druckänderungen während peristaltischer

Kontraktionen nach Applikation von O-Desmethyltramadol.

(A) 30 µM O-Desmethyltramadol induzierte eine vorübergehende komplette Hemmung der Peristaltik

mit vereinzelten nichtperistaltischen Kontraktionen. 100 µM O-Desmethyltramadol ruft (B) eine

komplette, anhaltende Hemmung der Peristaltik hervor, bei der (C) niedrigamplitudige

Druckschwankungen auftreten können.

44

Zeitintervall (min)

0 10 20 30 40 50 60

Ans

tieg

der P

PT

(Pa)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0.1 µM O-Desmethyltramadol1 µM O-Desmethyltramadol10 µM O-Desmethyltramadol 30 µM O-Desmethyltramadol100 µM O-Desmethyltramadol

Abb. 15: Zeitverlauf und Konzentrations-Wirkungs-Beziehung des Anstiegs der PPT (Pa) nach

Applikation (Pfeil) von 0,1-100 µM O-Desmethyltramadol. Nach Substanzgabe erfolgte die Registrierung

über einen Zeitraum von 60 min. Die Symbole repräsentieren die Mittelwerte des PPT-Anstiegs mit


Fehlerbalken sichtbar (0,1, 1, 100 µM), dann überdeckt das Symbol die Höhe des Standardfehlers.

3.5.5 ED50 (-)-Tramadol, (+)-Tramadol, O-Desmethyltramadol

Die (+)- und (-)-Enantiomere sowie das O-Desmethyltramadol unterscheiden sich

quantitativ in der Hemmwirkung auf die Peristaltik (Abb. 16). Am schwächsten

wirksam ist das (-)-Enantiomer (ED50 = 73 µM), während der Metabolit O-Desmethyl-

tramadol bereits in einer Konzentration von 13,6 µM 50 % des maximal möglichen

45

Effekts erzielt. Mit einer ED50 von 53 µM liegt (+)-Tramadol in der Wirksamkeit

zwischen den beiden anderen Formen.

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Ans

tieg

der P

PT (%

)

0

20

40

60

80

100

o

LM (-) Tramadol (+) Tramadol O-Desmethyl- tramadol

1 10 10030 1 10 30 100 0.1 1 10 30 100

Konzentration (µM)

Abb. 16: Konzentrations-Wirkungs-Kurve des Anstiegs der PPT nach (-)-Tramadol, (+)-Tramadol

und O-Desmethyltramadol. Die Symbole repräsentieren die Mittelwerte des PPT-Anstiegs mit


Fehlerbalken sichtbar, so überdeckt das Symbol die Höhe des Standardfehlers. Zum Vergleich ist der

Anstieg der PPT durch das Lösungsmittel (LM) aufgeführt.

3.6 Antagonisierung der hemmenden Wirkung des (+)-Tramadols,

(-)-Tramadols und O-Desmethyltramadols

Analog zu den Versuchen zur Aufhebung der Paracetamolwirkung wurden Segmente

mit Antagonisten der vermuteten Mediatoren vorbehandelt, bevor (+)-Tramadol, (-)-

Tramadol oder O-Desmethyltramadol hinzugegeben wurde.

46

3.6.1 Blockade von Opioidrezeptoren durch Naloxon

Zur Blockade von opioidergen Rezeptoren wurde 0,5 µM Naloxon 20 min vor

Tramadol ins Bad gegeben.

In der Kontrollgruppe (Vorbehandlung mit Tyrodelösung) bewirkten 100 µM (+)-

Tramadol, (-)-Tramadol oder O-Desmethyltramadol eine ausgeprägte Hemmung der

Peristaltik mit nahezu maximalem PPT-Anstieg (Abb. 18). Nach 100 µM (+)-Tramadol

waren 6 Segmente komplett gehemmt, die durchschnittliche PPT-Zunahme betrug 309,9

± 12,7 Pa. Nach 100 µM (-)-Tramadol erlosch die Peristaltik bei 4 Segmente komplett,

der PPT-Anstieg war 194,0 ± 40,4 Pa. Die stärkste Hemmwirkung trat nach 100 µM O-

Desmethyltramadol auf, die Peristaltik aller Segmente war gehemmt, die PPT-Zunahme

betrug 316,7 ± 23,2 Pa. Durch die Vorbehandlung mit Naloxon trat weder nach O-

Desmethyltramadol (Abb. 17 B), noch (+)-Tramadol eine komplette Hemmung auf, nur

nach (-)-Tramadol war bei einem Segment die Peristaltik für 7,2 min gehemmt. Der

durchschnittliche PPT-Anstieg betrug bei (+)-Tramadol in der mit Naloxon

vorbehandelten Gruppe 62,5 ± 14,1 Pa und war um 80 % geringer als in den

Kontrollexperimenten, die entsprechenden PPT-Werte waren für (-)-Tramadol 60,3 ±

12,7 Pa (70 % Reduktion) und O-Desmethyltramadol 31,3 ± 9,9 Pa (90 % Reduktion,

Abb. 18).

Die Vorbehandlung mit Tyrodelösung hatte keinen Einfluß auf die PPT, durch Naloxon

sank diese um 10,4 Pa ab (s. Tab. 4).

Tabelle 4: Anstieg der PPT nach Vorbehandlung mit Tyrodelösung bzw. verschiedenen Antagonisten (∆t = 20 min)

∆ PPT (Pa)

Lösungsmittel (Tyrodelösung) n=54 0,3 ± 1,9

Naloxon (0,5 µM) n=18 -10,4 ± 1,6

5-HT-Antagonisten n=18 13,4 ± 2,5

Adrenozeptorantagonisten

(1 µM Yohimbin + 1 µM Prazosin)

n=18 3,0 ± 2,0

Die Daten entsprechend dem Mittelwert ± SEM

47

100

Pa

5 min

Lösungsmittel

A


100

Pa

4 min

0.5 µM Naloxon

B


Abb. 17 A, B: Originalregistrierung der Aufhebung der hemmenden Wirkung von O-Desmethyl-

tramadol durch Naloxon. (A) Nach Vorbehandlung mit dem Lösungsmittel (Tyrodelösung) kommt es

durch 100 µM O-Desmethyltramadol zur kompletten Hemmung der Peristaltik, während dieselbe Dosis

nach Vorbehandlung mit 0,5 µM Naloxon (B) nur sehr geringe Änderungen des Schwellenwertes

hervorruft. Durch die Wirkung des Naloxons kommt es zu einem Frequenzanstieg peristaltischer

Kontraktionen (B).

48

0 2 4 6 8

Ans

tieg

der P

PT (P

a)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0.5 µMLM Nalox

0.5 µMLM Nalox

0.5 µMLM Nalox

(-) Tramadol 100 µM

(+) Tramadol 100 µM

O-Desmethyl- tramadol 100 µM

* * *

Abb. 18: Verminderung der Wirkung von je 100 µM (-)-Tramadol, (+)-Tramadol und O-

Desmethyltramadol auf den Anstieg der PPT durch 0,5 µM Naloxon. Die Säulen repräsentieren den

mittleren PPT-Anstieg (Pa) durch (-)-Tramadol, (+)-Tramadol und O-Desmethyltramadol nach

Vorbehandlung mit dem Lösungsmittel (LM) und 0,5 µM Naloxon (Nalox), die Fehlerbalken den

Standardfehler (SEM, standard error of the mean, n=6). Die Signifikanzprüfung (*) erfolgte mittels

Student-t-Test auf dem Niveau von p < 0,05.

3.6.2 Blockade von Serotoninrezeptoren durch Methysergid und Tropisetron

In einer weiteren Serie von Experimenten wurden die Segmente mit einer Kombination

aus 1 µM Methysergid und 1 µM Tropisetron behandelt, bevor nach 20 min je 30 µM

(+)-Tramadol, (-)-Tramadol oder 10 µM O-Desmethyltramadol zugegeben und

Änderungen des Schwellenwertes über 60 min beobachtet wurden. Die 5-HT-

Antagonisten verursachten per se nur einen ganz geringen Anstieg der PPT (Tab. 4).

Die Serotoninantagonisten Methysergid und Tropisetron hatten keinen signifikanten

Effekt auf den Schwellenstieg durch (+)-Tramadol, (-)-Tramadol oder O-

Desmethyltramadol (Abb. 19).

49

0 2 4 6 8

Ans

tieg

der P

PT (P

a)

0

50

100

150

200

250

5-HT- LM Antagon

5-HT- LM Antagon

5-HT- LM Antagon

(-)-Tramadol 30 µM

(+)-Tramadol 30 µM


Abb. 19: Wirkung von Serotoninantagonisten auf den Anstieg der PPT durch je 30 µM (-)-Trama-

dol, (+)-Tramadol und 10 µM O-Desmethyltramadol. Die Säulen repräsentieren den mittleren PPT-

Anstieg (Pa), die Fehlerbalken den Standardfehler (SEM, standard error of the mean) durch (-)-Tramadol

(n=8), (+)-Tramadol (n=6) und O-Desmethyltramadol (n=6) nach Vorbehandlung mit dem Lösungsmittel

(LM) oder der Kombination aus 1 µM Methysergid und 1 µM Tropisetron (5-HT-Antagon).

50

3.6.3 Blockade von Adrenozeptoren durch Prazosin und Yohimbin

Die Vorbehandlung der Darmsegmente mit 1 µM Prazosin und 1 µM Yohimbin

reduzierte signifikant den PPT-Anstieg durch 30 µM (-)-Tramadol (31 ± 8 Pa vs. 114 ±

34 Pa nach Vorbehandlung mit Tyrodelösung) und durch 30 µM (+)-Tramadol (32 ± 17

Pa vs. 132 ± 39 Pa nach Vorbehandlung mit Tyrodelösung). Hingegen führte die

Vorbehandlung mit den Adrenozeptorantagonisten zu einem leichten Anstieg der PPT

durch 10 µM O-Desmethyltramadol (139,7 ± 20 Pa vs. 96,7 ± 32 Pa nach

Vorbehandlung mit Tyrodelösung), der jedoch nicht signifikant war.

0 2 4 6 8

Ans

tieg

der P

PT (P

a)

0

50

100

150

200

250

Adreno LM Antagon

Adreno LM Antagon

Adreno LM Antagon

(-)-Tramadol 30 µM

(+)-Tramadol 30 µM


* *

Abb. 20: Wirkung von Adrenozeptorantagonisten auf den Anstieg der PPT durch je 30 µM (-)-

Tramadol, (+)-Tramadol und 10 µM O-Desmethyltramadol. Die Säulen repräsentieren den mittleren

PPT-Anstieg (Pa), die Fehlerbalken den Standardfehler (SEM, standard error of the mean) durch (-)-

Tramadol (n=6), (+)-Tramadol (n=6) und O-Desmethyltramadol (n=7) nach Vorbehandlung mit dem

Lösungsmittel (LM) und der Kombination (Adreno Antagon) aus 1 µM Prazosin (α1-Adrenozeptor-

antagonist) und 1 µM Yohimbin (α2-Adrenozeptorantagonist).

51

4 Diskussion

Diese Untersuchungen zeigen erstmals, dass das nichtopioiderge Analgetikum

Paracetamol die Motilität des Dünndarms konzentrationsabhängig vorübergehend

hemmt, während Acetylsalicylsäure und Metamizol keinen derartigen Effekt zeigen.

Auch das partiell opioiderge, aber nicht der Betäubungsmittelverordnung unterliegende

Analgetikum Tramadol hemmt die propulsive Dünndarmperistaltik.

Die Untersuchungen wurden an einem bereits in vielen Versuchsreihen etablierten in

vitro-Versuchsaufbau an isolierten Dünndarmsegmenten durchgeführt (Holzer et al.

1995, 1998, Holzer 1997, Shahbazian et al. 2002a,b, Herbert et al. 2002a,b,c,d,

Gharzouli und Holzer 2004, Fruhwald et al. 2000, 2004), die keine neuronale

Verbindungen zu übergeordneten präganglionären, spinalen oder supraspinalen

Regulationszentren hatten. Demzufolge beruhen alle durch Pharmaka hervorgerufenen

Veränderungen der Peristaltik auf peripheren, enterischen Mechanismen. Der Vorteil

des verwendeten in vitro-Versuchsaufbaus ist, dass in den Dünndarmsegmenten

koordiniert von oral nach aboral verlaufende Peristaltik ausgelöst werden kann und

nicht, wie beispielsweise mit der Präparation aus Längsmuskulatur und daran haftendem

Plexus myentericus (longitudinal muscle-myenteric plexus preparation, LMMP), nur

Änderungen der muskulären Kontraktionskraft zu messen sind (Sinsky und Donnerer

1998, Begg et al. 2002, Geber et al. 2005). In den Peristaltikexperimenten wird das

Darmlumen kontinuierlich perfundiert und langsam gegen einen geringen Widerstand

von 400 Pa gefüllt. Hierbei steigt der intraluminale Druck gegen die Darmwand bis zu

einem Schwellenwert (PPT) an, ab dem eine peristaltische Kontraktionswelle ausgelöst

wird. Diese Schwelle zur Auslösung der Peristaltik ist der Parameter zur

Quantifizierung eines Pharmakoneffekts auf die Darmmotilität, da diese PPT unter dem

Einfluss einer inhibitorisch wirksamen Substanz konzentrationsabhängig ansteigt bis

überhaupt keine Peristaltik mehr auslösbar ist. Der Darm ist im Organbad dann völlig

schlaff und maximal distendiert. Demzufolge beschreibt ein Anstieg der PPT die

herabgesetzte Sensitivität der rezeptiven und transduktiven enterischen Strukturen und

Mechanismen zur Auslösung einer koordinierten Kontraktion von Ring- und

Längsmuskulatur. Die mit der Präparation gemessenen Änderungen der intraluminalen

Druckwerte (PPTs) lassen aber keinen Rückschluss darüber zu, ob primär die

52

Empfindlichkeit und Effektivität der intestinalen Schrittmacherzellen (Interstitial Cells

of Cajal, ICCs) und/oder der Neurone des Plexus myentericus, z.B. der die

peristaltische Kontraktion koordinierende, aszendierend exzitatorische oder

deszendierend inhibitorische Reflexbogen beeinträchtigt wurde (Waterman und Costa

1994, Waterman et al. 1994, Sanders 1996, Holzer et al. 1997, Huizinga et al. 2000,

Ward et al. 2000).

Eine Eigenschaft dieser in vitro-Versuchsanordnung ist die enorme Sensitivität, mit der

die die Peristaltik auslösenden intraluminalen Druckänderungen detektiert werden. Ein

Anstieg der PPT von beispielsweise 20 Pa entspricht einem Druckgradienten von

lediglich 2 mm Wassersäule. Frühere systematische Untersuchungen haben ebenso wie

die Kontrollexperimente der vorliegenden Arbeit bestätigt, dass die PPT einzelner

Darmsegmente unter Ruhebedingungen und nach Zugabe von Tyrodelösung

(Kontrollexperiment) über mehr als 2 Stunden nahezu konstant bleibt und spontane

Änderungen der PPT bis zu 10-20 Pa betragen können. Demzufolge werden ungeachtet

einer statistischen Signifikanzprüfung die durch Substanzen hervorgerufenen Anstiege

der PPT von bis zu 20 Pa als zufällige und unspezifische Änderungen gewertet.

Alle Testsubstanzen wurden den Darmsegmenten extraserosal in die Tyrodelösung des

Organbads zupipettiert. Von in vitro-Substanzkonzentrationen, die Veränderungen der

PPT bzw. der Peristaltik hervorrufen, kann nur eingeschränkt auf korrespondierende in

vivo-Konzentrationen von Pharmaka beim Menschen geschlossen werden. Weitere in

vivo-Determinanten, die bei in vitro-Untersuchungen keine Berücksichtigung finden,

aber die Pharmakonwirksamkeit entscheidend beeinflussen, sind das

Verteilungsvolumen und die Proteinbindung einer Substanz sowie deren

Metabolisierung, Inaktivierung und Elimination. Hierauf wird an späterer Stelle bei der

Interpretation klinisch üblicher Dosierungen resp. der daraus resultierenden

Konzentrationen beim Patienten Bezug genommen. Wesentliche Vorteile von in vitro-

Untersuchungen sind die Konstanz der Organbadparameter, wie Oxygenierung,

Temperatur der Badlösung etc. und dass in vivo auftretende Änderungen der lokalen,

regionalen oder systemischen Durchblutung das in vitro-Ergebnis nicht tangieren.

53

Bei der Interpretation der am Meerschweinchendünndarm in vitro gewonnenen

Erkenntnisse ist immer zu bedenken, dass die Untersuchungen nicht an menschlichen

Dünndarmsegmenten, sondern an denen des Meerschweinchens durchgeführt wurden.

Somit wären bei diskrepanten Befunden zwischen in vitro-Ergebnissen und klinischen

Beobachtungen am Menschen hypothetisch Speziesunterschiede zu diskutieren,

wenngleich es nach bisherigen Erkenntnissen gute Übereinstimmungen des enterischen

Nervensystems und der Regulation der intestinalen Motilität bei Meerschweinchen und

Menschen gibt (Holzer et al. 2003, Fruhwald et al. 2004).

4.1 Acetylsalicylsäure, Metamizol

Acetylsalicylsäure und Metamizol haben keinen Einfluß auf die Peristaltik des

Dünndarms in vitro. Die höchste getestete Acetylsalicylsäurekonzentration im

Organbad (300 µM) war ausreichend, um die COX-1 und COX-2 zu hemmen. Die IC50

zur Blockade der COX-1 und COX-2 Isoenzyme liegt zwischen 2-20 µM (Warner et al.

1999). Unter klinischen Bedingungen kann die Acetylsalicylsäure in Konzentrationen

von 100 µM vorkommen (Amann und Peskar 2002). Teils am gleichen in vitro-Modell

durchgeführte Untersuchungen hatten gezeigt, dass auch Salicylate, nichtselektive

COX-1/COX-2 Inhibitoren, wie Flurbiprofen und Piroxicam sowie selektive Inhibitoren

der COX-1 und COX-2 (SC-560 bzw. NS-398) keine nennenswerte Wirkung auf die

Darmmotilität haben (Shahbazian et al. 2001, Amann und Peskar 2002). Es gibt bisher

nur eine in vivo-Untersuchung, in der die Acetylsalicylsäure eine Verzögerung der

Magenentleerung bewirkte (Kechagias et al. 1997). Insgesamt scheint somit die

Blockade der COX-1 und COX-2 Isoenzyme keine Auswirkung auf die Peristaltik des

Dünndarms zu haben. Die von anderen Autoren berichtete Hemmwirkung des

Indomethacins auf die Motilität von Dünn- und Dickdarm ist wahrscheinlich eine

Ausnahme und substanzspezifische Wirkung, die auf nichtpropulsiven Kontraktionen

der Ringmuskulatur beruht, deren Ursachen offensichtlich komplexer Natur, aber

unabhängig von COX, L-type Calciumkanälen, ATP-sensitiven Kaliumkanälen und

Phosphodiesterase Typ IV sind (Bennett et al. 1976, Bruch et al. 1978, Maggi et al.

1994, Shahbazian et al. 2001).

54

Das Pyrazolonderivat Metamizol beeinflusst weder in den hier vorgestellten in vitro-

Untersuchungen, noch in vivo die Darmmotilität. Bei Untersuchungen an der Ratte war

in vivo die intestinale Transitzeit durch Metamizol nicht verlängert und die

obstipierende Wirkung von Morphin wurde nicht verstärkt (Rupp et al. 1987,

Hernandez-Delgadillo et al. 2002), wobei die Magenentleerung durch Metamizol bei der

Ratte verzögert ist (Rupp et al. 1987). Beim Menschen gibt es bisher keine Hinweise

auf eine motilitätshemmende Wirkung des Metamizols. Im Gegenteil wird Metamizol

bevorzugt bei kolik- und tenesmenartigen Schmerzen im Gastrointestinal- und

Urogenitaltrakt eingesetzt, wo es eine besonders gute analgetische und spasmolytische

Wirkstärke und –qualität entwickelt (Stankov et al. 1995, Edwards et al. 2003b). Der

genaue analgetische Wirkmechanismus des Metamizols ist nur lückenhaft bekannt,

diskutiert werden sowohl periphere, spinale als auch supraspinale Wirkorte und -

mechanismen (Lorenzetti und Ferreira 1985, Neugebauer et al. 1994, Lopez-Munoz et

al. 1994, Tortorici et al. 1994, 1996, Vanegas et al. 1997, Cohen et al. 1998). Nach der

Entdeckung der COX-3, die u.a. in geringem Maße auch durch Metamizol gehemmt

wird (Chandrasekharan et al. 2002), öffneten sich neue Erklärungswege für die Wirkung

des Metamizols, die jedoch mittlerweile sehr kritisch diskutiert werden. Wie im Kapitel

4.2 erörtert, wird das Konzept der COX-3 beim Menschen in Frage gestellt (Kis et al.

2005). Die hypothetische Erwägung, dass das in unseren in vitro-Untersuchungen

extraserosal in das Organbad applizierte Metamizol a priori keine Wirkung auf die

Darmmotilität entfalten kann, da nur der durch Hydrolyse am Bürstensaum des

Dünndarms entstandene Metabolit 4-Methylaminoantipyrine pharmakologisch, z.B.

analgetisch wirksam sei (Ergün et al. 2004, Ergün 2005), ist im ersten Moment nicht

ganz von der Hand zu weisen, denn nach oraler Gabe von 1 g Metamizol erreicht der

Metabolit 4-Methylaminoantipyrine im Plasma bzw. im zentralen Nervensystem

Konzentrationen von 104 µM und 86 µM (Cohen et al. 1998). Auf der anderen Seite

kann der Metabolit 4-Methylaminoantipyrine nicht der einzige Wirkmechanismus von

Metamizol sein, denn auch oder gerade nach intravenöser Applikation unter Umgehung

einer intestinalen Passage resp. endoluminalen Metabolisierung am Bürstensaum hat

Metamizol beim Menschen eine hervorragende analgetische Wirkung und ruft zudem

sehr schnell einen meist ausgeprägten Blutdruckabfall durch Vasodilatation hervor

(Forth 1986). Es kann somit nicht sein, dass man, wie von Erdün (2005) konstatiert

wird, mehr als 1 Stunde, d.h. länger als in den vorliegenden Untersuchungen für die

55

Metabolisierung von Metamizol zu 4-Methylaminoantipyrine veranschlagen muss, bis

die volle Wirkung von Metamizol klinisch evident sein kann. Auch wenn viele Fragen

hinsichtlich des analgetischen Wirkmechanismus weiterhin offen und ungeklärt sind,

bleibt festzuhalten, dass in Einklang mit der klinischen Beobachtung Metamizol

offensichtlich keine inhibitorische Wirkung auf die Darmmotilität hat.

4.2 Paracetamol

In den vorliegenden Untersuchungen führte Paracetamol zu einem

konzentrationsabhängigen Anstieg des Schwellenwertes zur Auslösung peristaltischer

Kontraktionen. Bei hohen Konzentrationen (100 µM) kam es zur vorübergehenden

kompletten Hemmung der Darmmotilität mit anschließender Restitutio meist normaler

Peristaltik. In der Literatur finden sich bisher keine Hinweise auf eine

motilitätshemmende Wirkung des Paracetamols. Bei Mäusen, denen 30 Minuten vor der

oralen Gabe einer Kohlemahlzeit Paracetamol subkutan verabreicht wurde, beobachtete

man keine Veränderung der Dünndarmtransitzeit (Wong und Wai 1981).

Beim Menschen gibt es ebenfalls keine klinischen Hinweise, dass die Magen- oder

Darmmotilität durch Paracetamol nennenswert gehemmt wird. Zum einen ist, wie

bereits erwähnt, der in vitro-Versuchsaufbau außerordentlich sensitiv auch für

geringfügige Veränderungen der Peristaltik, die sich unter in vivo-Bedingungen beim

Menschen möglicherweise nicht bemerkbar machen. Zum anderen stellt sich die Frage,

ob die hemmend wirksame in vitro-Konzentration größenordnungsmäßig den in vivo

erreichbaren Konzentrationen entsprechen und durch die Applikation klinisch

gebräuchlicher Darreichungsformen und –dosierungen zu erreichen sind. Nach

intravenöser Injektion von 2 g Propacetamol, der wasserlöslichen und rasch

hydrolysierbaren Vorstufe von Paracetamol, werden nach 30 min Plasmaspiegel von

11 µg/ml (76 µM) und nach 60 min noch 8 µg/ml (54 µM) erreicht (Bannwarth et al.

1992). Diese 2 g Propacetamol setzen 1 g Paracetamol frei, eine Menge, die der in

Deutschland seit kurzem verfügbaren Darreichungsform von 1 g Perfalgan

(Paracetamol) zur intravenösen Anwendung entspricht (Granry et al. 1997; Bannwarth

et al. 1992). Da die Proteinbindung von Paracetamol zwar geringfügig variabel, aber im

Vergleich z.B. zur der der Acetylsalicylsäure zu vernachlässigen ist (Bannwarth et al.

56

1992), entsprechen die in vivo erreichbaren Konzentrationen denen, die in vitro

motilitätshemmend wirken. Nach rektaler Applikation ist die Resorption von

Paracetamol zwar verzögert und interindividuell variabel, die maximale

Plasmakonzentration liegt nach 2,3 – 4,8 h im Mittel zwischen 66 µM und 141 µM

(Montgomery et al. 1995, Anderson et al. 1999, Hansen et al. 1999, Hahn et al. 2000).

Nach oraler Gabe von 1 g Paracetamol, gelöst in 700 ml Flüssigkeit, ist die lokale,

intraluminale Konzentration direkt an der Darmwand noch höher und wird in der

Größenordnung von 10 mM angegeben (Feierman 2000). Somit ist die in dieser in

vitro-Untersuchung hemmend wirksame Badkonzentration von 100 µM Paracetamol in

dem Bereich, der nach intravenöser oder rektaler Applikation und insbesondere nach

oraler Gabe von Paracetamol beim Patienten erreicht werden kann (Bannwarth et al.

1992, Nielsen et al. 1992, Montgomery et al. 1995, Anderson et al. 1999, Hansen et al.

1999, Hahn et al. 2000, Feierman 2000). Bemerkenswert ist aber nochmals, dass dies

klinisch bisher nicht zu einem Problem wurde. Es wird im Gegenteil davon

ausgegangen, dass Paracetamol beispielsweise die Magenentleerung nicht beeinflusst.

Denn das Prinzip des Paracetamoltests zur Bestimmung der Magenentleerungszeit

beruht auf der Annahme, dass Paracetamol im Magen nicht resorbiert wird, dessen

Entleerung nicht behindert und nach der Passage durch den Pylorus im Dünndarm sehr

rasch aufgenommen wird (Heading et al. 1973, Clements 1978, Medhus et al. 2001,

Willems et al. 2001). Da die Magenentleerung den Transport des Paracetamols zum Ort

seiner Resorption im oberen Dünndarm determiniert, wird angenommen, dass die

Geschwindigkeit, mit der Paracetamol im Blut erscheint, die Geschwindigkeit der

Magenentleerung widerspiegelt. Dass Paracetamol die Magenentleerung nicht

beeinflusst, wurde jedoch nie stichhaltig nachgewiesen. Es gibt eine Untersuchung, die

zeigt, dass das intragastrale Flüssigkeitsvolumen bei Kindern, die 90 min vor einem

operativen Eingriff 40 mg/kg Paracetamol entweder oral als Saft oder rektal als

Suppositorium erhielten, nicht unterschiedlich war (Anderson et al. 1999). In dieser

Studie fehlt allerdings eine Kontrollgruppe von Kindern, die kein Paracetamol erhalten

haben, was einen oder keinen inhibitorischen Effekt des Paracetamols hätte aufdecken

können.

Außer dem Nachweis der Beeinflussung der Peristaltik durch Paracetamol interessierte

der Mechanismus, über den die Hemmung vermittelt wird. Obgleich der Weg der

57

analgetischen und antipyretischen Wirkung des Paracetamols nachwievor nicht

zweifelsfrei geklärt ist, wurde untersucht, ob analoge Mediatoren und

Transmissionspfade auch für den Effekt am Dünndarm verantwortlich sind. Die Frage

war, ob Paracetamol endogene inhibitorische Mechanismen verstärkt.

Im Dünndarm gibt es zwei Wege der „nicht-adrenergen nicht-cholinergen“ (NANC)

Übertragung zwischen den inhibitorisch wirkenden enterischen Motoneuronen und der

glatten Muskelzelle (Costa et al. 1986). Ein Mechanismus beruht auf den sog. fast

inhibitory junction potentials, die durch Apamin blockiert und durch ATP oder andere

Purine aktiviert werden können (Crist et al. 1992, Heinemann et al. 1999). Apamin

blockiert hierbei die Leitfähigkeit von langsam leitenden Ca2+-aktivierten

Kaliumkanälen (Costa et al. 1986). Ein anderer inhibitorischer, apamininsensitiver

Mechanismus beruht auf sog. slow inhibitory junction potentials, die Vasoactive

intestinal peptide (VIP) und Stickstoffmonoxid (NO) als Transmitter nutzen (Crist et al.

1992). Beide Wege bedingen eine Hyperpolarisation und nachfolgende Unerregbarkeit

der Zellmembran. Die motilitätshemmende Wirkung des Paracetamols am Darm ließ

sich durch Vorbehandlung mit Naloxon und Apamin signifikant reduzieren, was zeigt,

dass endogene opioiderge Mechanismen und eine Aktivierung von Ca2+-abhängigen

Kaliumkanälen zur Hemmung beitragen. Die Antagonisierung der Paracetamolwirkung

durch Naloxon bedeutet aber nicht, dass Paracetamol an Opioidrezeptoren bindet,

sondern dass es, ähnlich anderer Nichtopioidsubstanzen, wie Clonidin, Midazolam,

Propofol, Barbiturate, zu einer wahrscheinlich substanzunspezifischen Aktivierung

inhibitorischer opioiderger Neurone im Plexus myentericus kommt (Berg et al. 2001,

Herbert et al. 2002a,b,c,d) die dann die Hemmung der Peristaltik vermitteln. Eine

unwahrscheinliche, wenn auch nicht ganz auszuschließende Erklärung wäre, dass

Naloxon durch seine properistaltische Eigenwirkung die Hemmung durch Paracetamol

aufhebt. Naloxon bedingt in den hier gezeigten Untersuchungen einen leichten

Frequenzanstieg der peristaltischen Kontraktionen, der allerdings zu gering sein dürfte,

um die Hemmwirkung des Paracetamols auszugleichen.

Wie erwähnt, bedient sich ein anderer inhibitorischer Mechanismus im enterischen

Nervensystem des Stickstoffmonoxids (NO) als endogenem Transmitter (Crist et al.

1992). Dieser Weg trägt aber nicht zur Hemmwirkung des Paracetamols auf die

58

Darmmotilität bei, da die Blockade der NO-Synthetase durch L-NAME die

Paracetamolwirkung nicht abschwächt. Als Kontrolle diente hierbei eine

Vorbehandlung mit dem inaktiven Enantiomer D-NAME.

An der analgetischen Wirkung des Paracetamols sind im Zentralnervensystem und auf

spinaler Ebene serotoninerge Mechanismen beteiligt (Pini et al. 1996, Courade et al.

2001a,b). Serotonin ist im Gastrointestinaltrakt ein exzitatorischer Transmitter, der eine

überwiegend propulsive Wirkung über 5-HT3- und 5-HT4-Rezeptoren auf die Motilität

hat (Craig und Clarke 1990, 1991, Foxx-Orenstein et al. 1996, Grider et al. 1998,

Johanson 2004, Johanson et al. 2004, Degen et al. 2005). Die Blockade der

Serotoninrezeptoren in der Dünndarmwand durch die Kombination von Tropisetron und

Methysergid reduziert die stimulatorische Wirkung des enterischen Serotonins und

verstärkt in unseren Untersuchungen in geringem Maße die Inhibition durch

Paracetamol. Reduziert man wiederum die endogene basale Hemmung der enterischen

opioidergen Neurone mittels Naloxon, so verstärken die Serotoninrezeptorantagonisten

nicht die Wirkung des Paracetamols. Serotoninrezeptorantagonisten haben in der

verwendeten Konzentration per se keine inhibitorische Wirkung auf die PPT.

Da Paracetamol die COX-1 und COX-2 nach bisherigem Wissenstand in nur geringem

Maße inhibitiert, war lange hypothetisch eine „brain specific“-COX postuliert worden,

die durch eine entsprechende Prostaglandinsynthese im Gehirn Fieber und Schmerzen

hervorruft (Botting 2000). Die Entdeckung der COX-3 als paracetamolsensitive Isoform

beim Hund schien den bisher unbekannten Wirkmechanismus von Paracetamol

aufzuzeigen (Chandrasekharan 2002). Mittlerweile gibt es neue Daten und eine kritische

Reevaluation bisheriger Ergebnisse, die offenlegen, dass die COX-3 beim Menschen

wie bei der Ratte ganz andere Proteine kodiert als COX-1 und COX-2 und zudem keine

COX-Aktivität besitzt, so dass die COX-3 nicht an der Genese von Schmerz und Fieber

beteiligt sein kann und beim Menschen auch nicht das Target für Paracetamol darstellt

(Graham und Scott 2005, Kis et al. 2005). Vielmehr scheint Paracetamol die COX-2 zu

inhibieren und auf diesem Wege den therapeutischen Effekt zu entfalten (Graham und

Scott 2005, Kis et al. 2005).

59

Zusammenfassend ist ein inhibitorischer Effekt von Paracetamol auf die

Dünndarmperistaltik in vitro detektierbar, der aber klinisch möglicherweise kein

Korrelat hat oder, da gering ausgeprägt, bisher nicht aufgefallen ist. Es sollte jedoch

bedacht werden, dass die Erfahrungen mit intravenös applizierbarem und dadurch

schnell anflutendem Paracetamol bisher vergleichsweise gering sind und dass, wenn

Paracetamol postoperativ zur Reduzierung des Opioidverbrauchs verabreicht wird

(Delbos und Boccard 1995, Anderson et al. 1996, Granry et al. 1997, Peduto et al. 1998,

Cobby et al. 1999, Hernandez-Palazon et al. 2001, Lahtinen et al. 2002), dies unter

Umständen die hemmende Wirkung der Opioide auf die Darmmotilität verstärken

könnte.

4.3 Tramadol

Tramadolrazemat hemmt konzentrationsabhängig die Dünndarmperistaltik, die

inhibitorische Potenz ist jedoch deutlich geringer als die der klassischen Opioide, deren

ED50 im gleichen in vitro-Modell im nanomolaren Konzentrationsbereich liegt

(Shahbazian et al. 2002b, Fruhwald et al. 2002). Die ED50 von Codein, von dem sich

Tramadol ableitet, beträgt mit 21 µM etwa ein Drittel der ED50 des razemischen

Tramadols (66 µM) (Shahbazian et al. 2002). Bei der Anwendung am Menschen hat

Tramadol nur einen geringen Einfluss auf die Magen-Darm-Motilität (Wilder-Smith

und Bettiga 1997), die Passage im oberen Gastrointestinaltrakt ist nicht und die

Kolontransitzeit nur wenig verlangsamt. Im direkten Vergleich der inhibitorischen

Wirkung des Morphins mit der des Tramadols in der postoperativen Phase nach

abdominalchirurgischen Eingriffen verursacht Tramadol eine geringere Verzögerung

der Magenentleerung und der Dünndarmtransitzeit als Morphin (Wilder-Smith et al.

1999b). Auch bei Patienten mit chronischer Pankreatitis war die orozökale Transitzeit

nach Gabe von Morphin im Gegensatz zum Tramadol verlängert (Wilder-Smith et al.

1999a) Diese Untersuchung lässt allerdings keine Aussage darüber zu, ob die

Darmmotilität durch Tramadol unbeeinflusst bleibt, denn es gibt keine Kontrollgruppe

ohne Analgetika- resp. Tramadolgabe. In randomisierten, doppelblind durchgeführten,

Plazebo-kontrollierten Studien bei Patienten mit diabetischer Neuropathie bzw.

Polyneuropathie war ein obstipierender Effekt von Tramadol zu erkennen (Harati et al.

60

1998, Sindrup et al. 1999). Die Patienten hatten im Vergleich zu Plazebo einen guten

analgetischen Benefit mit 210 mg bzw. 200-400 mg Tramadol am Tag, aber auch mehr

Nebenwirkungen, u.a. signifikant mehr Verstopfung. Ingesamt ist aber u.a. in

Langzeitstudien die Obstipationsrate durch Tramadol deutlich geringer als nach

Morphingabe (Osipova et al. 1991, Wilder-Smith et al. 1994) und in der umfassenden

Erhebung von „postmarketing surveillance studies“ der Jahre 1977-1993 ist die

Obstipation nicht unter den vierzehn häufigsten Nebenwirkungen von Tramadol zu

finden (Cossmann et al. 1997).

Auch beim Tramadol stellt sich die Frage, ob die in vitro getesteten und inhibitorisch

wirksamen Konzentrationen in einer Beziehung zu in vivo erreichbaren Konzentrationen

stehen. Systematische pharmakokinetische Untersuchungen zeigten, dass es große

interindividuelle Unterschiede in der Plasmakonzentration von Tramadol, den beiden

Enantiomeren und dem Metaboliten O-Desmethyltramadol gibt (Grond et al. 1999). Die

Plasmaproteinbindung ist beim Tramadol mit 20 % gering und nicht der Grund für diese

Heterogenität der Plasmaspiegel (Lee et al. 1993, Lintz et al. 1986). Je nachdem, ob

Tramadol intravenös, oral, intramuskulär oder rektal verabreicht wird, sind

unterschiedliche Konzentrationen und Zeitverläufe zu erwarten. Nach intravenöser und

oraler Gabe liegen über einen Zeitraum von bis zu 24 Stunden höhere Plasmaspiegel

von (+)-Tramadol als von (-)-Tramadol vor (Campanero et al. 1999, Ceccato et al. 2000,

Liu et al. 2001). Zum anderen gibt es Unterschiede in der Resorption, das (+)-Tramadol

wird besser resorbiert als (-)-Tramadol, aber umgekehrt (+)-Tramadol langsamer

eliminiert (Liu et al. 2001). Je nachdem, ob in den Arbeiten nach der Resorption die

maximale Konzentration Cmax oder im Hinblick auf die analgetische Wirksamkeit die

minimal effektive Konzentration bestimmt wurde, unterscheiden sich die

Plasmakonzentrationen erheblich (Details siehe Grond und Sablotzki 2004). So

erstreckt sich der Bereich der minimal effektiven Konzentration je nach Probanden-

oder Patientenkollektiv zwischen 20 und 2169 µg/l (entsprechend einer Konzentration

von etwa 0,1-10 µM Tramadol) (Hackl et al. 1986, Lehmann et al. 1990, Grond et al.

1999). Unter Berücksichtigung der eingangs gemachten Einschränkungen zum

Vergleich von in vitro- mit in vivo-Konzentrationen liegt die in vitro hemmend

wirksame Konzentration von 100 µM wahrscheinlich über dem therapeutisch

erreichbaren Spiegel.

61

Die Hemmwirkung von (+)-Tramadol auf die Dünndarmperistaltik ist größer als die von

(-)-Tramadol, aber deutlich geringer als die des O-Desmethyltramadols. Dies steht in

Einklang mit der analgetischen Wirkung, die ebenfalls beim (+)-Tramadol größer als

beim (-)-Tramadol ist, bei beiden aber deutlich geringer ausfällt als beim O-

Desmethyltramadol (Übersicht bei Grond und Sablotzki 2004). Die analgetische

Wirkung der Tramadolenantiomere wird durch opioiderge, serotoninerge und adrenerge

Transmissionswege vermittelt. Der Metabolit O-Desmethyltramadol bindet hingegen

nur an µ-Opioidrezeptoren und wirkt nicht über Serotonin und Noradrenalin (Grond und

Sablotzki 2004). Das (+)-Tramadol hat eine zweifach höhere Affinität zum µ-

Opioidrezeptor als (-)-Tramadol (Raffa et al. 1992, 1993) und hemmt die

Serotoninwiederaufnahme im synaptischen Spalt etwa vierfach stärker als (-)-Tramadol

(Driessen und Reimann 1992). Nur (+)-Tramadol setzt zusätzlich noch Serotonin frei

(Bamigbade et al. 1997), wohingegen das (-)-Tramadol die Noradrenalinwieder-

aufnahme wesentlich stärker hemmt als (+)-Tramadol (Driessen et al. 1993, Halfpenny

et al. 1999). Die Hemmwirkung des (+)-Tramadols, (-)-Tramadols und O-Desmethyl-

tramadols auf die Peristaltik wird durch Naloxon um 80 %, 70 % bzw. 90 % reduziert,

wohingegen die Reduktion der analgetischen Wirkung durch Naloxon nur 30 % beträgt

(Dayer et al. 1994). Somit wird der überwiegende Anteil der Hemmwirkung des

Tramadols auf die Peristaltik über opioiderge Mechanismen vermittelt. Serotonin

scheint am Darm nicht an der Motilitätshemmung durch Tramadol beteiligt zu sein, da

die Serotoninrezeptorantagonisten Tropisetron und Methysergid weder die Wirkung des

(+)-Tramadols, (-)-Tramadols noch des O-Desmethyltramadols beeinflußten.

Hingegen reduzierte die Blockade der Adrenozeptoren durch Yohimbin und Prazosin

signifikant gleichermaßen die Hemmwirkung von (+)- und (-)-Tramadol, was zeigt,

dass Noradrenalin ebenfalls in beträchtlichem Maße bei beiden Enantiomeren zur

Hemmung beiträgt. Die Adrenozeptorantagonisten hatten jedoch keinen Effekt auf die

Wirkung des O-Desmethyltramadol gezeigt, das demzufolge am Darm wie bei der

analgetischen Wirkung nur über opioiderge Wege wirkt.

Neueste in vitro-Untersuchungen zeigten, dass Tramadol auch mit anderen

Rezeptorsystemen interagiert, so z.B. mit in Xenopus laevis-Oozyten exprimierten

muskarinergen und nikotinergen Acetylcholinrezeptoren, deren Funktion bei klinisch

relevanten Dosierungen supprimiert wird (Nakamura et al. 2005, Shiraishi et al. 2001,

62

2002). Ferner inhibiert Tramadol ebenfalls an Xenopus-Oozyten, allerdings nur in hoher

Konzentration (100 µM) GABAA- und NMDA-Rezeptoren (Hara et al. 2005).

Interaktionen mit letztgenannten Rezeptortypen wurden in den Untersuchungen am

Dünndarm bisher noch nicht berücksichtigt, da zum gegenwärtigen Zeitpunkt unklar ist,

ob diesen Rezeptorinteraktionen überhaupt eine (patho-)physiologische Bedeutung

zukommt.

63

5 Zusammenfassung

Eine schwerwiegende Nebenwirkung aller Opioide in der Therapie akuter und

chronischer Schmerzen ist die Hemmung der Darmmotilität. In der vorliegenden Arbeit

wird die Wirkung der nichtopioidergen Analgetika Paracetamol, Metamizol,

Acetylsalicylsäure und des partiell opioidergen Tramadols auf die Darmperistaltik

untersucht. Die Experimente wurden an Dünndarmsegmenten des Meerschweinchens in

vitro durchgeführt, die kontinuierlich perfundiert und gegen einen geringen Widerstand

endoluminal mit Tyrodelösung gefüllt wurden. In dieser Versuchsvorrichtung wird in

den Darmsegmenten ab einem bestimmten intraluminalen Druck (peristaltic pressure

threshold, PPT) eine von oral nach aboral verlaufende peristaltische Kontraktionswelle

ausgelöst und der Darminhalt ausgeworfen. Unter dem Einfluß einer inhibitorischen

Substanz auf die Peristaltik steigt die PPT an, bis überhaupt keine Peristaltik mehr

ausgelöst werden kann. Die Pharmaka wurden extraserosal in das Organbad zugegeben.

Ein wesentliches Ergebnis der Arbeit ist, dass Paracetamol die Dünndarmperistaltik

konzentrationsabhängig vorübergehend hemmt. Durch Vorbehandlung mit

Antagonisten und Inhibitoren der vermuteten Signaltransduktionswege wurden die

Mechanismen der Hemmung untersucht. Durch Naloxon und Apamin konnte die

hemmende Wirkung von Paracetamol reduziert werden, was zeigt, dass enterische

opioiderge Transduktionswege sowie eine Aktivierung von small conductance Ca2+-

activated Kaliumkanälen beteiligt sind. Enterisches Stickstoffmonoxid (NO), die

Cyclooxygenase und Serotonin spielen dabei als Transduktionsmechanismen keine

Rolle.

Metamizol und Acetylsalicylsäure haben keinen hemmenden Einfluß auf die

Dünndarmperistaltik.

Razemisches Tramadol, die beiden Enantiomere (+)- und (-)-Tramadol sowie der

Hauptmetabolit O-Desmethyltramadol hemmen konzentrationsabhängig die

Darmmotilität; hierbei wirkt (+)-Tramadol stärker als (-)-Tramadol, beide aber deutlich

geringer als O-Desmethyltramadol. Die Wirkung von (+)-Tramadol, (-)-Tramadol und

O-Desmethyltramadol lässt sich durch Naloxon nahezu vollständig aufheben. Die

Kombination der Serotoninantagonisten Methysergid und Tropisetron hat keinen Effekt

auf die Hemmwirkung aller drei Tramadolformen. Die Vorbehandlung mit den

Adrenozeptorantagonisten Yohimbin und Prazosin reduzierte die Wirkung von (+)- und

64

(-)-Tramadol, nicht jedoch von O-Desmethyltramadol. Demzufolge sind an der

Wirkung von (+)- und (-)-Tramadol opioiderge und adrenerge Mechanismen beteiligt,

die Wirkung von O-Desmethyltramadol wird durch Bindung an Opiatrezeptoren

vermittelt.

Insgesamt zeigten die Untersuchungen, dass auch das nichtopioiderge Analgetikum

Paracetamol sowie das partiell opioiderge Tramadol die Dünndarmperistaltik

beeinflussen, wohingegen Metamizol und die Acetylsalicylsäure keine derartige

Wirkung haben.

65

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7 Anhang Anschrift der Bezugsquellen Fa. Bachem Distribution Services GmbH Hegenheimer Str.5 79576 Weil am Rhein Fa. Grünenthal GmbH 52099 Aachen Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH Eschenstrasse 5 82024 Taufkirchen Fa. Tocris Cooksen Biotrend Chemikalien GmbH Im Technologiezentrum Köln Eupener Strasse 157 50933 Köln Fa. Charles River Laboratories Germany GmbH Sandhofer Weg 7 97633 Sulzfeld Lösungsmittel für Acetylsalicylsäure Aqua dest. Apamin Aqua dest. Metamizol Aqua dest. Methysergid Aqua dest. Naloxon Aqua dest. D-NAME Aqua dest. L-NAME Aqua dest. Paracetamol Äthanol Prazosin Äthanol Tramadolrazemat Aqua dest. (+)-, (-)-Tramadol Aqua dest. O-Desmethyltramadol Aqua dest. Tropisetron Aqua dest. Yohimbin DMSO

Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Herrn Professor Dr. M.

Herbert für die interessante Themenstellung und besonders für seine unermüdliche und

überaus engagierte Betreuung bedanken. Die vielen wertvollen Anregungen, die stete

Unterstützung und die immer geduldige und freundschaftliche Zusammenarbeit haben

mir bei der Erstellung der vorliegenden Arbeit sehr geholfen. Seinem Engagement

verdanke ich die Möglichkeit, die Ergebnisse dieser Arbeit national und international

präsentieren und publizieren zu können.

Mein Dank gilt auch Herrn Professor Dr. P. Holzer aus Graz, der stets ein kompetenter

und hilfsbereiter Ansprechpartner für pharmakologische und andere Fragen war und mir

Einblick in die Arbeit am Pharmakologischen Institut der Universität Graz gewährte.

Herzlichen Dank außerdem Herrn Professor Dr. W. Scheppach für die Erstellung des

Korreferates.

Vielen Dank auch an Christian Fahr, Kerstin Hoppe und Theresia Hoh für die gute

Zusammenarbeit, die auch im „Schichtbetrieb“ reibungsloses Arbeiten im Labor

ermöglichte.

Bei meinen Eltern möchte ich mich ganz besonders herzlich bedanken für die jahrelange

uneingeschränkte, liebevolle und vielseitige Unterstützung während meines Studiums,

ohne die diese Arbeit so nicht möglich gewesen wäre.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Rebecca Martina Weis Geburtsdatum/-ort 14.10.1978 in Würzburg Familienstand ledig Staatsangehörigkeit deutsch Schulausbildung

09/1985 - 07/1989 Grundschule Steinfeld 09/1989 - 06/1998 Franz-Ludwig-von-Erthal-Gymnasium, Lohr am Main

Abschluss mit dem Abitur Studium

11/1998 - 05/2005 Studium der Humanmedizin an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

09/2000 Ärztliche Vorprüfung 09/2001 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 03/2004 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung 05/2005 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

10/2005 – 03/2006 Promotionsstudium Humanmedizin an der Julius-Maximilians-Universität Würzburg

Praktisches Jahr

Innere Medizin Med. Klinik der Universität Würzburg (04/2004 - 07/2004) Chirurgie Kantonsspital Liestal, Schweiz (08/2004 - 11/2004) Gynäkologie Universitätsfrauenklinik Würzburg (12/2004 - 03/2005) Dissertation

Promotionsarbeit: „Der Einfluss von Paracetamol, Acetylsalicylsäure, Metamizol und Tramadol auf die Dünndarmperistaltik. In vitro-Untersuchungen am Dünndarm des Meerschweinchens“ (Professor M. Herbert, Klinik und Poliklinik für Anästhesiologie der Universität Würzburg) Berufliche Tätigkeit

Ab 02/2006 Assistenzärztin in der Frauenklinik des St. Marienkrankenhaus Siegen

Steinfeld, im Januar 2006

In vitro-Untersuchungen am Dünndarm des Meerschweinchens · Die Nichtopioidanalgetika sind...

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