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KETOGENESE

A. BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

KETOGENESE IN ABHÄNGIGKEIT VOM STOFFWECHSELZUSTAND

Unter Ketogenese versteht man einen Stoffwechselzustand, bei dem aus Acetyl-CoA Acet-

essigsäure und ß-Hydroxybuttersäure in der Leber gebildet und an das Blut abgegeben

werden. Diese beiden Säuren werden als Ketonkörper bezeichnet, zu denen außerdem

Aceton gezählt wird, das durch spontane Decarboxylierung der Acetessigsäure entsteht.

Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure werden über das Blut zu den peripheren Geweben

transportiert, wo sie aufgenommen und über den Zitronensäurezyklus oxidiert werden. Die

Konzentration der Ketonkörper im Blut beträgt normalerweise 80 - 200 µmol/l. Im Hunger (48

Std.) steigt der Ketonkörperspiegel als Folge erhöhten Abbaus von freien Fettsäuren auf Werte

von 600 - 2200 µmol/l an (davon sind 15% Acetessigsäure und 85% ß-Hydroxybuttersäure).

Das Gehirn kann - im Gegensatz zum Muskel - seinen Energiebedarf nicht durch Abbau von

Fettsäuren decken, es fehlt diesem Organ die "langkettige" 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase. Im

Verlauf einer Hungerperiode deckt das Gehirn daher seinen Energiebedarf zu einem immer

größer werdenden Anteil aus der Oxidation der Ketonkörper (Abb. 1). Durch erhöhte

Ketogenese in diesem Stoffwechselzustand (physiologische Ketose) kann der gesteigerte

Bedarf des Gehirns an Ketonkörpern gedeckt werden.

Abb. 1 Energiequellen von Muskel und Gehirn in verschiedenen Stoffwechselsituationen

Stoffwechselzustand zur Deckung des Energiebedarfs

aufgenommene Substanzen

Muskel Gehirn

Nahrungsresorption aus

Magen/Darm

Glucose 50%

Fettsäure 50%

Glucose

Hunger Fettsäuren

(Ketonkörper)

Ketonkörper 40 %

Glucose 60 %

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ROLLE DES CARNITINS, ß-OXIDATION UND HYDROXYMETHYLGLUTARYL-COA-ZYKLUS

Im Hunger werden aus Fettgewebe vermehrt Fettsäuren mobilisiert. Fettsäuren werden über

das Blut zur Leber transportiert. Die Enzyme der ß-Oxidation der Fettsäuren zu Acetyl-CoA

und der Acetessigsäurebildung aus Acetyl-CoA über den Hydroxymethylglutaryl-CoA-Zyklus

sind in der Matrix der Mitochondrien lokalisiert.

Die Aktivierung der Fettsäure zu Acyl-CoA durch die Acyl-CoA-Synthetase (Thiokinase) erfolgt

an den äußeren Mitochondrienmembranen (Abb. 3). Langkettige Acyl-CoA-Derivate, z.B.

Palmityl-CoA, können nur dann in die Matrix der Mitochondrien gelangen, wenn Carnitin (3-

Hydroxy-4-(trimethylamino)-Buttersäure) als Carrier für Fettsäurereste zur Verfügung steht.

Carnitin stimuliert die Oxidation der langkettigen Fettsäuren, da die Aktivität der Carnitin-

Palmityltransferase (Abb. 2) erhöht wird, die die Übertragung des Acylrestes von Coenzym A

auf die OH-Gruppe des Carnitins katalysiert.

Abb. 2 Funktion der Carnitin-Palmityltransferase

In Mitochondrien gibt es eine "äußere" und eine "innere" Acyltransferase. Die "äußere"

Acyltransferase überträgt im Raum zwischen der inneren und äußeren Mitochondrien-

membran Acylreste von Acyl-CoA-Estern auf Carnitin. Die "innere" Acyltransferase katalysiert

die umgekehrte Reaktion an der inneren Mitochondrienmembran (Abb. 3).

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Abb. 3 Aktivierung der Fettsäuren und Transport des Acyl-CoA in die Matrix der

Mitochondrien

Aktivierte Fettsäuren (Acyl-CoA-Thiolester) werden durch sukzessive Abspaltung von Acetyl-

CoA-Molekülen (ß-Oxidation) abgebaut. Z.B. entstehen aus einem Molekül Palmityl-CoA nach

siebenmaligem Durchlauf des ß-Oxidationszyklus acht Moleküle Acetyl-CoA. Aufgrund eines

gesteigerten Abbaus von Fettsäuren entsteht vermehrt aktivierte Essigsäure.

In der Leber kann aktivierte Essigsäure zu 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA)

umgesetzt werden, woraus freie Acetessigsäure abgespalten werden kann. Aus zwei

Molekülen Acetyl-CoA entsteht Acetoacetyl-CoA (Enzym: Acetoacetyl-CoA-Thiolase). Diese

aktivierte Acetessigsäure kondensiert mit einem dritten Molekül Acetyl-CoA zu HMG-CoA

(Enzym: HMG-CoA-Synthase). HMG-CoA-Lyase spaltet HMG-CoA in freie Acetessigsäure

und Acetyl-CoA. In der Bilanz werden also zwei Moleküle Acetyl-CoA zu einem Molekül

Acetessigsäure und zwei Moleküle freiem Coenzym A umgewandelt. Freies Coenzym A steht

zur Aktivierung von Fettsäuren zur Verfügung.

Bilanz des HMG-CoA-Zyklus:

Acetyl-CoA + Acetyl-CoA Acetoacetyl-CoA + CoASH

Acetoacetyl-CoA + Acetyl-CoA HMG-CoA + CoASH

𝐻𝑦𝑑𝑟𝑜𝑥𝑦𝑚𝑒𝑡ℎ𝑦𝑙𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴 → 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑒𝑠𝑠𝑖𝑔𝑠ä𝑢𝑟𝑒 + 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴

𝐴𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴 + 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴 → 𝐴𝑐𝑒𝑡𝑒𝑠𝑠𝑖𝑔𝑠ä𝑢𝑟𝑒 + 2 𝐶𝑜𝐴𝑆𝐻

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TRANSPORT DER KETONKÖRPER UND OXIDATION IM PERIPHEREN GEWEBE

In der Leber wird Acetessigsäure durch ß-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase zum größten Teil

zu ß-Hydroxybuttersäure reduziert:

Acetessigsäure + NADH + H+ ß-Hydroxybuttersäure + NAD+

Beide Ketonkörper gelangen in das Blut und so zum peripheren Gewebe (Abb. 4).

Abb. 4 Übersicht: Bildung, Transport und Abbau der Ketonkörper

Leber FS Acetyl-CoA

-Hydroxy- buttersäure

Acetoacetyl-CoA

Acetessigsäure

Blut FS -Hydroxy- buttersäure

Acetessigsäure

Peripherie

Oxidation

-Hydroxy- buttersäure

Acetyl-CoA

Acetessigsäure

Acetoacetyl-CoA

Im peripheren Gewebe wird ß-Hydroxybuttersäure zu Acetessigsäure reoxidiert und durch

die Succinyl-CoA-Acetoacetyltransferase (Thiophorase) zu Acetoacetyl-CoA aktiviert:

Succinyl-CoA + Acetessigsäure Succinat + Acetoacetyl-CoA

Acetoacetyl-CoA wird durch die C4-spezifische Acetoacetyl-CoA-Thiolase ("kurzkettige"

Thiolase) zu Acetyl-CoA gespalten, das über den Citronensäure-Zyklus vollständig oxidiert

wird:

Acetoacetyl-CoA + CoASH 2 Acetyl-CoA

PHYSIOLOGISCHE UND PATHOLOGISCHE KETOSEN

Im Hunger ist infolge einer gesteigerten Mobilisation der Fettsäuren aus dem peripheren

Fettgewebe der Fettsäurespiegel im Blut erhöht. Daraus folgt ein erhöhter Einstrom der

Fettsäuren in die Leber und eine Beschleunigung der ß-Oxidation. Die Aktivität der Carnitin-

Palmityltransferase ist im Hunger ebenfalls erhöht. Durch eine gesteigerte ß-Oxidation wird

vermehrt Acetyl-CoA bereitgestellt, eine Voraussetzung für die erhöhte Ketogeneserate.

Einige Aminosäuren können direkt zu Acetessigsäure abgebaut werden.

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Andere Faktoren, von denen man annimmt, dass sie im Hunger in der Leber zu erhöhtem

intrazellulären Acetyl-CoA-Spiegel führen, sind verminderte Lipogenese und Hemmung der

Endoxidation des Acetyl-CoA (Hemmung der Citratsynthese).

Von der Hungerketose (physiologische Ketose) abzugrenzen ist die pathologische Ketose.

Dieser Stoffwechselzustand ist ein Symptom des Krankheitsbildes des dekompensierten

Diabetes mellitus und ist charakterisiert durch eine stark gesteigerte Ketogenese bei gleich-

zeitig hohem Blutzuckerspiegel.

ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN

Fettsäuren, Fette;

Fettsäurebiosynthese und -abbau;

Triacylglycerinbiosynthese und Lipolyse;

Wirkung von Hormonen auf den Stoffwechsel des Fettgewebes;

Ketonkörpersynthese und Verwertung;

Fettverdauung und -resorption;

Blutlipide, Hyperlipoproteinämien;

Regulation des Fettstoffwechsels im Hunger;

Phosphatide und Phosphatidbiosynthese;

Cholesterin und Cholesterinbiosynthese.

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B. ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

Isolierte Lebermitochondrien sind zur ß-Oxidation von Fettsäuren zu Acetyl-CoA und

nachfolgender Ketonkörperbildung fähig. Der Einfluss folgender Faktoren auf die

Ketogeneserate soll untersucht werden:

a) Exogen zugesetzte Palmitinsäure;

b) Aktivierung der Fettsäure zu Acyl-CoA;

c) Transport des Acyl-CoA in die Matrix der Mitochondrien;

d) Aktivität des Citronensäure-Zyklus.

Dazu werden die Lebermitochondrien bei 37°C unter Luft inkubiert und nach Reaktionsstopp wird

die gebildete Acetessigsäure als Parameter für die Ketogenese in einem Farbtest bestimmt.

(Acetessigsäure reagiert mit diazotiertem p-Nitroanilin (p-Nitrophenyldiazoniumchlorid) unter

Bildung von N, N-bis-(p-nitrophenyl)-C-acetylformazan). Die Konzentration dieses Farbstoffes ist

der Acetessigsäurekonzentration äquivalent.

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C. VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

Mitbringliste: Kittel, Taschenrechner

KETOGENESE IN ABHÄNGIGKEIT VOM STOFFWECHSELZUSTAND

Lösungen (stehen am Arbeitsplatz)

1. Standard-Medium (pH 7.5)

50 mM Saccharose 17,115 g

5 mM MgCl2 · 6 H2O 1,016 g

2 mM Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) 0,744 g

15 mM KCl 1,118 g

10 mM NaF 0,419 g

50 mM Tris (hydroxymethylaminomethan) 6,05 g

Die angegebenen Mengen in ca. 800 ml Wasser lösen, mit konz. HCl am pH-Meter auf

pH 7.5 einstellen und ad 1 l auffüllen.

(NaF hemmt ein in den Mitochondrien vorhandenes GTP-abhängiges, fettsäure-

aktivierendes System.)

2. 10 mM Palmitinsäure

128 mg Palmitinsäure in 50 ml Ethanol lösen

3. 0,1 M D, L-Carnitin

988,3 mg D, L-Carnitin-Hydrochlorid in ca. 40ml lösen, mit 1 N KOH auf pH 7.5 bringen

und ad 50 ml auffüllen (Messkolben).

4. 0,1 M ATP

551,15 mg Adenosin-5'-triphosphorsäure-Dinatriumsalz in 8ml H2O lösen, mit 1N KOH

auf pH 7.5 bringen und auf 10ml auffüllen.

5. 0,1 M L-Malat

6. Trichloressigsäure (TCA) (30%, Gew./Vol.)

7. 0,5% Natriumnitrit (0,5 g/100 ml H2O; täglich neu ansetzen)

8. 0,05% p-Nitroanilin (giftig) (0,05 g in 100 ml (0,05N) HCl-Lösung durch Erhitzen im

Wasserbad)

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9. 0,2 M Na-Acetat: 2,72 g Natriumacetat/100 ml H2O.

10. Mischung des Diazo-Reagenzes:

6 ml 0,5% NaNO2 und

40 ml 0,05% p-Nitroanilin

Hierbei tritt infolge Diazotierung des Nitroanilins eine Entfärbung ein. Diese abwarten,

dann die Mischung in Eis stellen, 14ml 0,2M Na-Acetat dazugeben und im Eis stehen

lassen. Das fertige Diazo-Reagenz wird während des Versuchs vom Assistenten

ausgegeben.

11. 1 M Na-Acetat: 13,6g Natriumacetat/100 ml H2O

12. 5 N HCl

13. Mitochondriensuspension

Alle unter I aufgeführten Reagenzien stehen fertig vorbereitet am Arbeitsplatz.

Auf jeden Fall wird das Medium, die HCl und der Essigsäureethylester mit der 5ml Pipette

(grün) pipettiert.

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HERSTELLUNG DER REAKTIONSANSÄTZE

1. In sieben 50 ml Erlenmeyerkolben werden folgende Reagenzien pipettiert

(6 Reaktionsansätze und ein Null-Referenzansatz):

PIPETTIERPLAN:

Erlenmeyerkolben Nr. 1 2 3 4 5 6 Null-Ref.

ml Medium (pH 7.5) 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50 3,50

ml Palmitinsäure 0,05 - 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

ml ATP 0,05 0,05 - 0,05 0,05 0,05 0,05

ml D,L-Carnitin 0,05 0,05 0,05 - 0,05 0,05 0,05

ml L-Malat (0,1 M) - - - - 0,05 - -

ml L-Malat (0,02 M) - - - - - 0,05 -

ml Wasser 0,35 0,40 0,40 0,40 0,30 0,30 0,35

ml Lebermitochondrien 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 -

Achtung: Die Mitochondriensuspension soll vor der Verteilung in die einzelnen

Reaktionsansätze kurz geschwenkt werden (vorsichtig über Kopf drehen). Die Mitochondrien

werden als letztes in die Erlenmeyerkolben gegeben (Reaktionsstart).

Nachdem die einzelnen Reaktionsansätze zusammenpipettiert sind, werden diese mit Parafilm

verschlossen, mit der jeweiligen Gruppennummer beschriftet und in einem Wasserbad auf 37

°C erwärmt und 60 Min. unter Schütteln inkubiert.

2. Während der Inkubation sollen folgende Arbeiten durchgeführt werden:

Es werden 16 Eppendorfgefäße beschriftet (Doppelbestimmung Beschriftung mit 1,

1a, 2, 2a, 3, 3a ….): Je ein Paar für die Reaktionsansätze 1-6, ein Paar für die Null-

Referenz (NR) und das letzte Paar für einen Reagenzienleerwert (RL). Jedes Eppi wird

mit 0,1 ml 30% TCA beschickt.

72

3. Behandlung der Reaktionsansätze

Die Bildung der Acetessigsäure wird nach 60 Min. in den einzelnen Reaktionsansätzen

durch Zugabe von Trichloressigsäure gestoppt (TCA-Fällung).

- Von den Ansätzen 1 - 6 wird je 1ml aus den Erlenmeyerkolben in die beiden

vorbereiteten Eppendorfgefäße zu der TCA gegeben und diese dann sofort auf Eis

gestellt (sonst besteht die Gefahr der spontanen, (Decarboxylierung der

Acetessigsäure).

- In den Erlenmeyererkolben des Null-Referenzansatzes wird 1 ml Mitochondrien-

suspension pipettiert, gemischt und sofort je 1ml in die beiden Eppendorfgefäße (7,7a

oder NR) zu der TCA gegeben (Weiterbehandlung wie Ansätze 1 - 6).

- In die beiden Eppendorfgefäße (8,8a oder RL) des Reagenzienleerwerts (Eigenfärbung

des Farbreagenzes) kommen zu der TCA je 1 ml Medium (Weiterbehandlung wie Ansätze

1 - 6).

Die Proben bleiben (zur Fällung des Proteins im Ansatz) 10 Min. auf Eis stehen.

Die gestoppten Reaktionsansätze - alle in Eppendorfgefäßen - werden dann 5 Min. in

der Tischzentrifuge zentrifugiert. In den Überständen wird die gebildete Menge an

Acetessigsäure bestimmt. Dazu werden 500µl jeweils in die vorbereiteten und

beschrifteten Reagenzgläser (Farbtest unter 4.) überführt.

4. Bestimmung der Acetessigsäure durch einen Farbtest

- 16 Ansätze (je zwei Reagenzgläser für Proben 1 - 6, die Null-Referenz und den

Reagenzienleerwert)

1 M Na-Acetat 0,5 ml

Überstand der jeweiligen

Probe nach der TCA-Fällung

0,5 ml

Diazo-Reagenz (Handschuhe!)

UNTER DEM ABZUG ARBEITEN!

3,0 ml

- Die Ansätze werden gemischt und 10 Min. bei 37 °C im Wasserbad geschüttelt. Der

Rest des Überstandes wird im Eisbad aufbewahrt.

73

- Die Reaktion wird durch Zugabe von 1 ml 5M HCl gestoppt; anschließend wird der

gebildete Farbstoff mit 2,5 ml Essigsäureäthylester (Vorsicht, feuergefährlich!)

ausgeschüttelt (hierbei wird der Farbstoff aus der wässrigen in die obere organische

Phase extrahiert): Dazu werden die zwei Phasen in den Ansätzen mit einer

Plastikpasteurpipette durch Aufsaugen und Ausspülen gründlich vermischt, bis die

wässrige Phase völlig entfärbt ist. Nach Trennung der beiden Phasen (ca. 1 Min.) wird

ein Teil des den Farbstoff enthaltenden Essigsäureethylesters (obere Phase)

vorsichtig mit einer Pasteurpipette in eine Küvette überführt und die Extinktion bei

420nm gemessen. Eichung des Photometers gegen den Reagenzienleerwert. Für

die Eichung und alle Messungen wird immer dieselbe Küvette verwendet. Die

Ansätze werden nach ihrer Färbung sortiert und beginnend mit der

schwächsten Färbung gemessen. Jede Probe wird doppelbestimmt.

74

D. AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Es soll berechnet werden, wieviel µmol Acetessigsäure von den Mitochondrien aus 1g Leber

gebildet werden (µmol · h-1 · g Leber-1).

: Extinktionskoeffizient des N, N’-bis-(p-Nitrophenyl)-C-acetyl-formazan ist

420 = 21,4 · 103 (l · mol-1 · cm-1)

Die Extinktion des Reagenzienleerwerts wird gleich Null gesetzt (Eichung mit diesem Wert,

somit wird hier die Eigenfärbung des Diazo-Reagenzes berücksichtigt). Mit Hilfe der Null-

Referenz lässt sich abschätzen, wieviel endogenes Acetoacetat (oder andere Substanzen, die

mit dem Diazo-Reagenz umsetzbar sind) in den Reaktionsansätzen vorhanden war.

Die Menge Acetessigsäure, die in 1h von den Mitochondrien aus 1g Leber gebildet wurde,

berechnet sich wie folgt:

Konzentra- Verdünnungs eingesetzte

tion in der faktor der Leber-

Küvette TCA-Fällung menge

𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 [𝜇𝑚𝑜𝑙

𝑔 ∙ ℎ] 𝑏𝑧𝑤. [

𝑛𝑘𝑎𝑡𝑎𝑙

𝑚𝑔] =

𝐸420

𝜀 ∙ 𝑑∙ 𝑉𝐸𝑠𝑠 ∙

𝑉𝐹ä𝑙𝑙 + 𝑉𝑇𝐶𝐴

𝑉𝐹ä𝑙𝑙

∙𝑉𝑅𝑒𝑎𝑘𝑡

𝑉𝐹𝑎𝑟𝑏𝑡

∙𝐾𝑀𝑖𝑡𝑜

𝑉𝑀𝑖𝑡𝑜

∙1

𝑡

Farbstoffgesamt- Anteil des Reaktions- Normie-

menge im Essig- ansatzes, der letztlich rungsfaktor

säureäthylester im Farbtest eingesetzt auf 1h und

wurde 1g Leber

gebildete Gesamtmenge im Reaktionsansatz

E420 : Extinktion des Messwertes (um den Leerwert korrigiert)

d : Schichtdicke der Messküvette = 1 cm

VEss : Volumen des zur Extraktion eingesetzten Essigsäureäthylesters

VFäll : Volumen, das aus dem Reaktionsansatz in die TCA-Fällung eingesetzt wurde

VTCA : Volumen der TCA in der TCA-Fällung

VFarbtt : Volumen, das aus der TCA-Fällung in den Farbtest eingesetzt wurde (Tab. 2)

VReakt : Volumen des Reaktionsansatzes (Tab. 1)

VMito : Volumen der eingesetzten Mitochondriensuspension

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KMito : "Verdünnungsfaktor" der Mitochondrien: Mitochondrien aus 5 g Leber wurden in

75 ml aufgenommen:

𝐾𝑀𝑖𝑡𝑜 =75 𝑚𝑙

5 𝑔

t : Bezugsgröße Zeit (1h)

Aus den für alle Ansätze konstanten Werten kann durch Einsetzen in die Formel ein Faktor

berechnet werden. Man beachte, dass in l · mol-1 · cm-1 angegeben ist, die Volumina aber

in ml und der resultierende Wert in µmol berechnet werden soll!

Zusammenfassung der Berechnungsformel

𝑬𝟒𝟐𝟎

𝒕 [𝒉] 𝒙 𝟐𝟓, 𝟕 = ⌊

µ𝒎𝒐𝒍

𝒈 𝒙 𝒉⌋

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MESSWERTE UND BERECHNUNGEN:

Reagenzglas-nummer 420nm

Mittelwert der

Extinktionen Mol/(g*h)

1

1a

2

2a

3

3a

4

4a

5

5a

6

6a

7

7a

8

8a