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Umweltmikrobiologie

Mikrobiologie und Biotechnologie Universität Ulm

Dr. Frank Bengelsdorf

Sommersemester 2018

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1 Lernziele In diesem Praktikum werden Umweltproben mikrobiologisch, molekularbiologisch und (bio)-chemisch untersucht. Die Methoden und Standorte sind u.a.: Anreicherungen von Staphylococcen, Milchsäurebakterien und antibiotikaproduzierenden Streptomyceten. Es werden folgende Biotope beprobt: Abwasser: Darin werden multiresistente Keime nachgewiesen. Aus ihrer DNA wird mit Hilfe der PCR das Integron-System als ein Multiresistenzsystem analysiert. Das Integron-Amplifikat wird in einer RFLP (restriction fragment length polymorphism) genauer untersucht. Gewässer: Mikrobiologische und chemische Analyse von Gewässern rund um den Universitätscampus Bestimmung der chemischen Parameter: pH, Leitfähigkeit, Sauerstoff sowie die mikrobiologische Qualität dieser Oberflächengewässer nach der MPN-Methode. Milch: Sie analysieren den Keimgehalt verschiedener Milchproben. Außerdem lernen Sie ein Verfahren kennen, mit dem biozide Stoffe (z.B. Antibiotika) in der Milch nachgewiesen werden. Luft: Mit einem Luftkeimsammler werden Luftproben im Bereich der Belebungsbecken des städtischen Klärwerks und anderer Probenstellen genommen, u.a. im Universitätsbereich. Die benutzte Technik entspricht den vorgeschriebenen Methoden der Industrie zur mikrobiologischen Kontrolle ihrer Räumlichkeiten. Eigene Haut/Lebensmittel: Staphylokokken aus der Nase. Das Isolat wird auf Virulenzfaktoren wie "Koagulase" molekularbiologisch und auf Protein A immunologisch analysiert. Außerdem Hefen und Pilze, u.a. Edelschimmel von Käsesorten und ein Test auf Candida albicans aus dem Mund. Gewürze: Keimbelastung bzw. ihre antibiotische Wirksamkeit gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien. Exkursionen: Durch Besuch eines Trinkwasserwerkes (Landeswasserversorgung, Langenau) und einer Kläranlage (städtisches Klärwerk Ulm) vertiefen Sie ihr Verständnis für die Wasserkreisläufe, von denen unsere Existenz essentiell abhängt. Ein Protokoll ist spätestens 8 Tage nach Ende des Praktikums als pdf-Dokument an mich (frank.bengelsdorf@uni-ulm.de) zu schicken. Weitere Hinweise zum Protokoll stehen in dem gesonderten Dokument.

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2 Versuche Ein wichtiges mikrobiologisches Qualitätskriterium ist die Gesamtkeimzahl. Darunter werden alle lebensfähigen Keime (KBE = Koloniebildende Einheit, auch CFU) verstanden, die auf einem komplexen Nährboden züchtbar sind. Es wird jedoch geschätzt, dass nur etwa 1 % aller Keime aus natürlichen Standorten überhaupt gezüchtet werden können. 2.1 Anreicherung von Staphylokokken Staphylococcus epidermidis ist ein Leitkeim unserer Hautflora: Nase, Achseln, Leistengegend, Zehenzwischenraum. Daneben kommt Staphylococcus aureus bei etwa 30 % der Bevölkerung vor. In etwa 10-30 % der S. aureus-Fälle kann es sich dabei um pathogene Arten handeln, die diverse Pathogenitätsmechanismen ausbilden. Bekannt ist der MRSA (Methicilin resistente S. aureus), dessen Stämme häufig auch multiresistent sind. Die nationale Fachkompetenz zu Staphylokokken ist im Nationalen Referenzzentrum in Wernigerode/Harz zusammengefasst. In diesem Versuchsabschnitt werden Staphylokokken angereichert und auf einige ihrer möglichen Virulenzfaktoren getestet. 1. Bereiten Sie den Vogel-Johnson-Agar vor. Typische Zusammensetzung (g/Liter): Pepton aus Casein: 10, Hefeextrakt: 5, D(-)-Mannit 10, K2HPO4: 5, Lithiumchlorid: 5, Phenolrot (pH-Indikator): 0,025, Glycin: 10, Agar: 15.

Nach dem Autoklavieren werden 20 ml einer sterilen Kaliumtelluritlösung 1 g/100 ml pro Liter Nähragar zugegeben. Wirkungsweise: Mit diesem Medium werden Koagulase- und Mannit-positive Stämme isoliert. Gelbe Zonen um die Kolonien zeigen die Verwertung des Mannit an: der pH-Indikator Phenolrot schlägt wegen der Bildung von Acetat + CO2 unter aeroben und Lactat unter anaeroben Bedingungen um. Schwarze Kolonien rühren überwiegend von Staphylococcus aureus her, der Tellurit zu metallischem Tellur reduziert. Tellurit, Lithiumchlorid und die hohe Glycinkonzentration hemmen die Begleitflora wenigstens in einer Anfangsphase (37 °C, 24 h).

2. Streichen Sie mit einem sterilen Q-Tipp aus der eigenen Nase und anderen Hautpartien bzw. von kontaminierten Lebensmitteln auf 4-fach sektorierte Vogel-Johnson Agarplatten aus: 2 Sektoren für Eigenisolate und zwei für die beiden Referenz-Stämme. 3. Bebrüten Sie die Agarplatten bei 37 °C für 1-2 Tage. 4. Notieren (fotografieren) Sie die Beobachtung: Bei Farbumschlag nach gelb in der Nähe einer Kolonie sollten Mannit-Verwerter vorhanden sein. Enthält ein solcher Hof eine schwarze Kolonie, so kann Staphylococcus aureus vorliegen. Grauschwarze Kolonien können überwiegend aus Staphylococcus epidermidis bestehen.

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5. Führen Sie auf gleichem sektorierten Nähragar Reinigungsausstriche durch. 6. Streichen Sie eine Kolonie der vermuteten Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis Kulturen auf einer sektorierten Blutagarplatte aus; 4 Sektoren: 2 für Eigenisolate und zwei für die beiden Referenz-Stämme. Im Fall von Hämolysehöfen um die Kolonien muss an pathogene Eigenschaften des Isolates gedacht werden. 7. Differenzieren Sie ihre Isolate nachfolgendem Schema. Beginnen Sie mit einem mikroskopischen Präparat; es sollten Kokken erkennbar sein. Katalase-Test: tropfen Sie auf eine Kolonie bzw. einer nicht bewachsenen Agarfläche einen Tropfen 3%-iges H2O2 auf. Gasbildung in weniger als 1 min Inkubationszeit ist Zeichen einer Katalase-positiven Reaktion.

Abbildung 2.1: Differenzierungsschema für Staphylokokken. Katalase wird mit 3 % H2O2 auf einer Kolonie bzw. einer unbewachsenen Agaroberfläche getestet. Säurebildung wird durch Umschlag des pH-Indikators Phenolrot nach gelb angezeigt. Koagulase wird einem Testkit (Pastorex Staph Plus, BioRad) geprüft. 2.1 Biochemische Teste auf Staphylokokken Virulenzfaktoren Staphylococcus aureus bildet verschiedene Virulenzfaktoren, u.a. Koagulase, Protein A, Toxine (β-Hämolyse, siehe Kapitel 2.2 Punkt 6), Multiresistenz gegen Antibiotika, extrazelluläre thermostabile Nuclease, etc. Wir werden einige Gene dieser Virulenzfaktoren bei den Eigenisolaten mit der PCR bzw. durch biochemische Testverfahren überprüfen. Es wird bei diesen Untersuchungen der Referenzstamm Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA252) mitgeführt. Koagulase ist ein Protein, dass bei Staphylococcus aureus vorkommt und Thrombin zu Staphthrombin umsetzt. Staphthrombin aktiviert dann Fibrinogen zu Fibrin. Dieses Fibrin lagert sich auf den Zelloberflächen ab, wodurch Staphylococcus für unser Immunsystem maskiert wird. Koagulase ist also ein Virulenzfaktor, der frei im Medium oder als zellgebundener clumping factor (CF) vorkommt.

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Abbildung 2.2: Durch Staphylokokken-Koagulase ausgelöste Reaktionen im Plasma. Protein A ist ein Oberflächen-Protein, das an den Fc-Teil der IgG Antikörper bindet. Dadurch richten sich die Antikörper in der "falschen" Orientierung auf der Bakterienoberfläche aus, die ungünstig für deren Opsonierung ist. Wird die Oberfläche des Bakteriums wie in der Koagulase-Reaktion mit körpereigenen Proteinen beladen, so wird eine Abwehr körperfremder Zellen/Substanzen erschwert. Der Nachweis von Koagulase, Protein A und einem Staphylokokken-typischen Oberflächen Antigen erfolgt mit dem Pastorex Staph Plus (oder alternativ mit Slidex Staph Plus Kit). Auf zwei Felder der Vorlagen werden jeweils ein Tropfen (ca. 20 µl) Reagenz R1 und Reagenz R2 aufgetragen. Dann wird Koloniematerial von Staphylococcus aureus bzw. Staphylococcus epidermidis von einer LB-Agarplatte mit den mitgelieferten Plastikstäbchen entnommen und in die Reagenzlösungen für 10 sec eingerieben (Achtung: gute Verteilung des Zellmaterials in der Lösung!). Nach etwa 20-30 sec wird das Ergebnis der Reaktion abgelesen: Verklumpung (= positiv) bzw. homogene Suspension = negativ. Aufgabe: Führen Sie den Test durch, beschreiben (fotografieren) Sie das Ergebnis und interpretieren Sie ihr Resultat. 2.3 Biochemischer Nachweise der thermostabilen Nuklease Zur Bestätigung des Stammes Staphylococcus aureus und zur Abgrenzung dieses Isolates gegenüber Staphylococcus epidermidis werden jeweils einzelne Kolonien dieser beiden Stämme in einem kurzen Ausstrich auf einer sektorierten DNase-Testagarplatte (8 Sektoren auf einer heipha, 2070e) ausgestrichen. Der Ausstrich wird 18-24 h bei 37 °C bebrütet. Anschließend wird diese Agarplatte mit 1 ml 2 N HCl überschichtet. Nach wenigen Minuten (< 10 min) erscheint um Staphylococcus aureus ein heller Hof (= Nuklease positiv), während bei Staphylococcus epidermidis der Agar trüb bleibt (= Nuklease negativ). Achtung: HCl kann beim Verspritzen auf die Kleidung Löcher verursachen. Auswertung: Photographien Sie das Ergebnis dieses Plattentestes und stellen Sie alle geprüften Kriterien in einer Tabelle zusammen, die für die Isolierung eines Staphylococcus aureus Stammes sprechen. 2.4 Multiresistenz des Staphylokokken-Isolates Ziel ist es, die Antibiotika-Resistenz des eigenen Staphylococcus-Isolates zu überprüfen. Dazu wird folgender Versuch durchgeführt:

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Verfahren (siehe auch Versuch 2.2 bzw. 2.3)

1. Suspendieren Sie eine Kolonie aus der Staphylococcus-Anreicherung in 1 ml steriler 0,9%-igen NaCl-Lösung.

2. Streichen Sie 2 x 100 µl dieser Suspension mit dem Drigalskispatel auf jeweils einer Antibiotika-freien LB-Agarplatte aus.

3. Legen Sie den Antibiotika-Testring (Mast Diagonstics Mastring M43 bzw. den Oxacillin Teststreifen) auf jeweils eine Agarplatte. Pressen Sie den Testring und den Teststreifen leicht mit einer sterilen Pinzette auf die Agaroberfläche und inkubieren Sie die Agarplatten bei 37 °C über Nacht im Brutschrank. Bezeichnung der Antibiotika auf dem Testring siehe 4.3 "Analyse Antibiotika-resistenter Keime im Abwasser".

4. Messen und fotografieren (Fotodok) Sie die Hemmhofdurchmesser um die einzelnen Testantibiotika. Erstellen Sie eine Messwert-Tabelle!

2.5 Molekularbiologischer Nachweis von Staphylokokken-Virulenzfaktoren durch Kolonie-PCR Auf der Haut kommen verschiedene Staphylokokken vor, u.a. der opportunistische S. aureus und der Leitkeim S. epidermidis. Hier wird eine Auswahl von Genen nachgewiesen, die für Virulenzfaktoren in Staphylococcus aureus kodieren. Der Nachweis solcher Gene durch PCR sagt allerdings nichts zur Expression dieser Faktoren. Umgekehrt ist eine kontrollierte negative Reaktion ein Indiz für das Fehlen dieser Virulenzfaktoren im eigenen Isolat. Material und Methode: Es werden 1-2 Kolonien Staphylococcus aureus bzw. Staphylococcus epidermidis getrennt mit gelben Pipettenspitzen von der Vogel-Johnson-Agarplatte in jeweils ein 2 ml Eppendorf Tube gefüllt mit 0,1 mm Glas beads und 100 µl TER-Lysispuffer (wird gestellt) suspendiert. Diese Eppendorfreaktionsgefäße werden für 10 min bei 95°C im Heizblock inkubiert und dann auf Eis abgekühlt. Dann werden die Gram-positiven Zellen im Ribolyser (6500, 2 x 45 sec) aufgeschlossen und anschließend die Zelltrümmer zentrifugiert (5 min, 13.000 x g) und der DNA-haltige Überstand zur PCR verwendet. Als Referenz für diese PCR-Untersuchungen dient genomische DNA aus Staphylococcus aureus MRSA 252 (ATCC 43300, wird gestellt) bzw. aus Staphylococcus epidermidis (selbst zu isolieren). TER-Lysispuffer zum Zellaufschluss (wird gestellt): 1 % Triton X 100

0,5 % Tween 20 10 mM Tris-HCl pH 8,0 1 mM EDTA

Ansatz des Lysispuffers (TER-Puffer):

0,5 ml Tris-EDTA-Puffer pH 8,0 (100 x) (z. B. TE- Puffer) 0,5 ml Triton X 100 (z.B. Sigma, Best.-Nr. T8787) 0, 25 ml Tween 20 (z. B. Sigma, Best.-Nr. P9416

ad 50 ml autoklaviertes Aqua dest. Die Eigenisolate werden über Abstriche mit einem Q-tip aus der Nase, dem Mund

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(Zahntaschen und Zunge) auf Vogel-Johnson-Agar erhalten. Staphylococcus aureus Kolonien zeigen auf diesem Medium einen gelben Rand (pH-Indikator zeigt Mannitverwertung, siehe 2.2). Dann werden mit dem DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702) eine Multiplex-PCR auf drei Virulenzgene im 20 µl Ansatz durchgeführt: 7 µl H2O, 1 µl fw-Primer, 1 µl rv- Primer, 1 µl template DNA (Überstand) und 10 µl 2x DreamTaq Mastermix. PCR-Bedingungen: Denaturierung: 5 min 95°C 35 Zyklen mit 30 sec 95°C, 30 sec annealing bei 52 °C und 60 sec Polymerisation bei 72°C. Abschließend wird 5 min bei 72°C vervollständigt. Methicillinresistenz (mecA) mec_fw: 5'-AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG C-3´ mec_rev: 5'-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C-3´ Produktlänge: 533 Bp Koagulase (coa): coa_fw: 5`-ATA GAG ATG CTG GTA CAG G-3´ coa_rv: 5´-GCT TCC GAT TGT TCG ATG C-3´ Produktlänge: Stamm-variabel von 500 bis 900 Bp thermostabile, S. aureus spezifische Nuclease (nucI; EC 3.1.31.1) nuc_fw:_285: 5´-AGCGATTGATGGTGATACGG-3´ nuc-rev_507: 5´-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3´ Produktlänge: 223 Bp Die PCR-Produkte (10 µl) werden in einer 2%-igen Agarosegelelektrophorese mit 4 µl der 50 Bp-Ladder (siehe Anhang 10.8) und mit Ethidiumbromid gefärbt. Das Ergebnis wird fotographiert und mit der Voraussage verglichen. 2.5.1 Nachweis und Identifizierung der Staphylokokken durch PCR ihres 16S rRNA Gens Isolierung chromosomaler DNA aus Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA252, wird gestellt) bzw. aus Staphylococcus epidermidis und aus einem Eigenisolat. Dazu wird das Verfahren zur Isolierung von chromosomaler DNA unter Punkt 2.5 verwendet. Als Primer zum Nachweis des 16S rRNA Gens werden die "universellen EUB-Primer" eingesetzt: Material und Methoden:

universal EUB primer: 27f und 1492r (Mit diesen Primern können sehr viele Bakterien in gleicher Weise bestimmt werden.) 27f: 5´-AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG-3´ 1492r: 5´-GG(CT) TAC CTT GTT ACG ACT T-3´

PCR-Gerät

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0,8%-iges Agarosegel in 1x TAE-Puffer 1 kB Ladder (Fermentas)

Zur eindeutigen molekularbiologischen Identifizierung wird ein Staphylococcus epidermidis Isolat aus dem Versuch 2.2 in 5 ml LB-Röhrchen über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Als Kontrollen dienen E. coli und B. subtilis, welche auch über Nacht kultiviert werden. Ein ml dieser Kulturen werden zentrifugiert (3 min, 13000 g), der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 50 µl Wasser aufgenommen und bei 95 °C für 15 min inkubiert, um die chromosomale DNA freizusetzen. Dann wird auf Eis abgekühlt (2 min) und zentrifugiert (3 min, 13000 g). Der Überstand mit der chromosomalen DNA wird in ein steriles Eppendorfreaktionsgefäß überführen. PCR-Reaktion im Gesamtvolumen von 20 µl: siehe 2.5 PCR-Bedingungen: siehe 2.5 Die PCR-Amplifikate werden in einem 0,8 %-igen Agarosegel analysiert. Als Längenstandard wird die "1 kB DNA Ladder" (Fermentas, siehe Anhang 10.8) benutzt. Aus dem 20 µl PCR-Ansatz werden 5 µl unverdaut und jeweils 5 µl mit EcoRI bzw. HindIII in 30 min bei 37 °C verdaut und auf das Agarosegel aufgetragen. Das Agaraosegel wird in Ethidiumbromid gefärbt und auf der Fotodok abgelichtet. Mit den Verdauen durch die beiden Restriktionsendonukleasen wird eine so genannte RFLP = restriction fragment length polymorphism, durchgeführt. Durch eine solche Analyse wird die Identifizierung des Eigenisolates als S. epidermidis oder S. aureus zusätzlich bestätigt. Tabelle: Fragmentlängen nach RFLP-Analyse der 16S rRNA-Produkte

Staphylococcus Bacillus subtilis E. coli EcoRI 682/800 682/800 682/800 HindIII 1128/426 - 640/890

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3 Keimgehalt von Milchproben

Abbildung 3.1: Übersicht über die Versuche mit Milchproben 1. Setzen Sie Chinablau-Lactose Medium an.

Typische Zusammensetzung des Chinablau-Lactose Mediums (g/Liter): Pepton 5, Fleischextrakt 3, Lactose 10, Natriumchlorid 5, Chinablau 0,375, Agar 12, pH 7 Wirkungsweise: Chinablau-Lactose ist ein hemmstofffreier Standardnährboden zur Differenzierung von Bakterien aus Milch. Der pH-Indikator differenziert zwischen Lactose-positiven und negativen Keimen. Daher kann dieser Nährboden zum Nachweis von Streptokokken und Staphylokokken aber auch für den Nachweis von Keimen der Coli-Aerogenes Gruppe verwendet werden. Große, blaue Kolonien (= Lactose-positiv): E. coli und andere Coliforme, kleine Kolonien: Streptokokken und Staphylokokken (mikroskopisches Präparat zur Kontrolle!) Farblose Kolonien (= Lactose-negativ): Salmonella, Serratia, Proteus

2. Setzen Sie EMB Agar an.

Typische Zusammensetzung des EMB-Agars (g/Liter): Pepton 10, Lactose 10, Dikaliumhydrogenphosphat 2, Eosin G 0,4, Methylenblau 0,065, Agar 15, pH 6,8 Nach dem Autoklavieren abkühlen auf 50 -60 °C und dann zur Oxidation des Methylenblaus schütteln. Das Präzipitat sollte homogen verteilt sein. Lichtgeschützte Lagerung. Wirkungsweise: Eosin und Methylenbau hemmen Gram-positive Keime. Beide Farbstoffe bilden bei saurem pH-Wert ein Präzipitat. Mit diesem Agar ist bei Zusatz von Tetracyclin und 10 %-iger CO2-Atmosphäre in 1-2 Tage bei 37 °C auch der Nachweis der Hefen Candida albicans möglich. E. coli bildet metallisch grüne Kolonien. Sektorieren Sie eine EMB-Agarplatte und streichen Sie auf einen Sektor E. coli auf den anderen Sektor Bacillus subtilis als Referenzkulturen aus.

3. Setzen Sie 2 LB-Agarplatten für die Gesamtkeimzahlbestimmung an. 4. Es werden jeweils 100 µl unverdünnte und 10-2 verdünnte Rohmilch vom Bauern

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und Handels- milch auf jeweils einer Chinablau-Lactose Agarplatte bzw. auf einer EMB-Agarplatte mit dem Drigalski-Spatel ausgestrichen. Die Verdünnung: mit steriler Pipette werden 100 µl Milch auf 10 ml sterile physiologische Kochsalzlösung pipettiert und mit dem Vortexer gemischt.

5. Bebrüten der Agarplatten bei 37 °C für 1-2 Tage. 6. Notieren (fotografieren) Sie die Beobachtung: Die Anzahl der Kolonien auf

Chinablau-Lactose Agar gibt einen Hinweis auf die Keimbelastung der Milchprobe. Metallisch grüne Kolonien auf EMB-Agar sprechen für E. coli bzw. für Enterobakterien und damit für eine fäkale Verunreinigung der Milchprobe.

3.1 Rückstandsanalytik auf Antibiotika in Milchproben Hierzu verwenden Sie den Delvo-Test, eine Fertigkultur mit Geobacillus stearothermophilus als Testkeim. Dieser Test ist für die schnelle und empfindliche Routinebeprobung in der Milchwirtschaft entwickelt worden. Er schützt die Starterkulturen in den Molkereien und den Verbraucher vor unerwünschten Antibiotikarückständen. Der Test kann auch zur Beproben anderer Flüssigkeiten außer Milch auf Hemmstoffe (Antibiotika, Reinigungsmittel, etc.) genutzt werden! Material: Delvo-Test SP-NT von DSM zu beziehen über Milku Tierhygiene, Bovenden-Lenglern. Verschiedene Milchproben mit und ohne Antibiotikum. Verfahren:

1. Durchstechen Sie die Alufolie der Teströhrchen mit einem kleinen Loch und geben Sie 0,2 ml Milch ins Probenröhrchen. Sie erhalten verschiedene Milchproben, von denen eine mit Antibiotika belastet ist. Beschriften Sie die Teströhrchen mit den Codes dieser Milchproben.

2. Inkubieren Sie die Ansätze bei 64 °C für 3 Stunden im Wasserbad oder im

Heizblock.

3. Notieren (fotografieren) Sie den Testansatz vor und nach der Inkubation. Interpretationshilfe: Wenn ein Umschlag des pH-Indikators Bromcresol von blau nach gelb stattfindet, dann konnte Geobacillus stearothermophilus wachsen und Säuren bilden; er wurde also nicht durch Antibiotika gehemmt. Wenn sein Wachstum z.B. durch Antibiotika oder andere Hemmstoffe (wie Reinigungsmittel, Detergenzien) gehemmt wurde, dann schlägt der Indikator nicht um. Der thermophile Testorganismus bietet einen wichtigen Vorteil für die Praxis: mesophile Verunreinigungen (z.B. Streptokokken der Haut) werden bei der Inkubationstemperatur inaktiviert. Daher werden lebensfähige Kontaminationen und somit falsch-positive Ergebnisse vermieden.

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3.2 Gewürze, ihr Keimgehalt und ihre antibiotische Wirkung

Abbildung 3.2.1: Übersicht zu den Verfahrensschritten der mikrobiologischen Gewürz-Analyse. Problem: Gewürze können nicht autoklaviert werden, weil durch diese Hitzebehandlung die Geschmacksstoffe eliminiert würden. Da die Gewürze vermutlich in einem ländlichen Gebiet gewachsen sind, kann ihre Oberfläche kontaminiert sein. Methode:

1. Sie haben verschiedene Gewürzproben (Pfeffer, Knoblauch, Thymian, Curry, Teebaumöl, Zwiebel / Zwiebelextrakt, etc.)

2. Streichen Sie 100 µl E. coli bzw. Bacillus subtilis auf LB-Agarplatten mit dem Drigalskispatel aus. (Im Fall von Thymian und Knoblauch auch auf Sabouraud-Agar)

3. Sektorieren und beschriften Sie diese Agarplatten entsprechend der Anzahl der zu testenden Gewürze.

4. Geben Sie die Gewürze mit einer sterilen Pinzette oder einer sterilen Pipettenspitze auf die gekennzeichneten Sektoren der Agarplatten.

5. Inkubieren Sie die Kulturen bei 30 °C für 2-3 Tage. 6. Notieren (fotografieren) Sie die Beobachtungen. Interpretieren Sie die

Ergebnisse anhand der Gramreaktion beider Testorganismen.

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4 Chemische und mikrobiologische Wasserparameter Aus Proben der Oberflächenwässer werden mit Elektroden die Temperatur, der pH-Wert, der Sauerstoffgehalt und die Leitfähigkeit gemessen. Diese Werte werden in eine Tabelle eingetragen (siehe auch den Anhang). Es werden verschiedene Gewässer rund um den Universitätscampus und die Donau beprobt. Außerdem der Zu- und Auslauf des städtischen Klärwerks Steinhäule in Neu-Ulm. Im Klärwerk wird die Sauerstoffzehrung im Belebtschlammbecken ermittelt, in dem eine Probe entnommen wird und im Plastikbecher sofort der O2-Verbrauch bestimmt wird.

Proben- name

Temp. (°C)

pH O2 (mg/l)

Leitfähig- keit (µS/cm)

MPN/ml

Gesamt KBE/ml

E. coli Coliforme Donau Farntal Pfütze KW Zulauf Belebtbecken NK-Becken Augendusche Trinkwasser

Das Leitfähigkeitsmessgerät wird mit 0-10 mM NaCl kalibriert. Es werden die NaCl-Konzentrationen gegen die gemessenen Leitfähigkeiten in einer Graphik aufgetragen. Die Messergebnisse der Gewässerproben werden dann als NaCl-Äquivalent angegeben. Aufgaben: Erstellen Sie mit NaCl-Lösungen aus jeweils 30 ml demin. Wasser eine Kalibierkurve zur Leitfähigkeit in µS/cm: 10 mM; 5 mM; 2,5 mM; 0,5 mM; 0,05 mM; 0,005 mM: Von jeder Messprobe liegen mehr als 20 ml im 50 ml-Plastikbecher vor.

1. Berechnen Sie die NaCl-Äquivalente in mM NaCl in den Gewässerproben! 2. Messen Sie auch das Trinkwasser der Universitäts-internen Hausleitung und

weiterer Probe- stellen: Teichwasser, etc. 3. Komplettieren Sie mit allen Messergebnissen die obige Tabelle für Ihr Protokoll. 4. Da aus Zeitgründen keine Phosphatbestimmung durchgeführt werden kann,

werden wir den aktuellen Wert aus dem Klärwerk Steinhäule zur Grundlage einer Rechnung verwenden. Wir werden die Produktion von Biomasse und die Sauerstoffzehrung in einem Gewässer abschätzen, in das eine bestimmten Phosphatmenge eingeleitet wird.

4.1 Gesamtkeimzahl

Die mikrobiologischen Proben werden mit sterilen 1L-Schottglas-Flaschen genommen und aufgearbeitet. Die Flaschen werden in einem Auslegerarm mit sterilen Gummistopfen verschlossen, in denen eine Öse eingeschraubt ist. In diese Öse wird ein Neylonfaden mit Karabinerhaken eingesetzt, so dass der Stopfen aus der Flasche

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gezogen werden kann, wenn die Flasche 20 cm tief unter der Wasseroberfläche positioniert ist. Proben dürfen wegen der veränderten Biologie an der Wasseroberfläche (Kahmhaut!) nicht direkt aus diesem Gewässerbereich entnommen werden. Die Keimzahlen werden nach dem MPN-Verfahren ermittelt, wie in Versuch 4.2 beschrieben. Als Referenzwerte können die Keimzahlen für Badewasser (Anhang 10.6) und aus der Trinkwasserverordnung (Versuchsvorbesprechung) verwendet werden. Material und Methode CASO-Agar ist ein komplexer Nährboden, der in Abhängigkeit seiner Natriumchloridkonzentration vielen Bakterien das Wachstum ermöglicht. Typische Zusammensetzung des CASO-Agar (auch Tryptic Soy Agar, TSA): 15 g Caseinpepton, 5 g Sojamehlpepton, 5 g/L Natriumchlorid, pH 7,3 ± 0,2. Gesamtkeimzahlen sollen aus folgenden Proben bestimmt werden: Abwasser aus dem Nachklärbecken, Flusswasser, Teichwasser und Augendusche. Im Fall der Augendusche werden mit einem Q-Tipp Proben von den Oberflächen des Duschkopfes und des zuführenden Schlauches genommen und in 1 ml 0,9%-ige NaCl ausgewaschen. Dazu werden 100 µl unverdünnte Probe sowie im Fall von Abwasser und Flusswasser aus einer- Vorverdünnug (Tabelle in 4.2) ausgestrichen. Die Agarplatten werden bei 30 °C bis zu drei Tagen bebrütet. Achtung: Schutz vor Austrocknung durch versiegeln der Agarplatten mit Para- film. Auswertung: Zusammen mit den Ergebnissen der MPN-Bestimmung (4.2) in einer Tabelle. Zur Vorlage siehe Anhang 10.5.

4.2 Keimzahlbestimmung durch MPN Das MPN-Verfahren (most probabale number, ISO 9308-2:2012) ist eine statistische Methode zur Keimzahlbestimmung. Wir wenden diese Methode an zur Titerbestimmung von E. coli und Coliformen Keimen in Oberflächenwässern. Dazu werden von einer Wasserprobe 1 ml, 0,1 ml. bzw. 0,01 ml Probe in jeweils 3 Röhrchen beimpft. Nach der Bebrütung wird auf folgende drei Parameter geprüft: Trübung (= Wachstum) Gasbildung (im Durhamröhrchen) Fluoreszenz (nach Anregung bei 256 nm). Material

• McCrady Tabelle zur Auswertung (siehe Anhang 10.10) • Inkubator bei 36 °C • 10 sterile Reagenzgläser gefüllt mit 10 ml MUG-Laurylsulaftmedium (4-

Methylumbelliferyl-β-D- glucuronid) und jeweils versehen mit einem

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Durhamröhrchen. Wirkungsweise: Spaltung des MUG durch die β-Glucuronidase (EC 3.2.1.31) liefert das fluoreszierende 4-Methylumbelliferon. Laurylsulfat (SDS) ist ein Detergenz, dass Wachstum der Begleitkeime hemmt. Ein unbeimpftes Röhrchen zur Kontrolle auf die Fluoreszenz zurückhalten!

Abbildung 4.2.1.: MUG-Reaktion der β-Glucuronidase (E. coli spezifisch) Durchführung Von einer Wasserprobe (Flusswasser; Klärwerksablauf in den Vorfluter, etc.) werden nachfolgender Tabelle Vorverdünnung in 0,9 % NaCl-Lösung angelegt. Diese Vorverdünnungen richten sich nach der Wetterlage an den Vortagen und dem Wasserstand der Gewässer. Aus den Verdünnungen werden dreimal 1 ml, 0,1 ml und 0,01 ml Probe in jeweils 10 ml MUG-Laurylsulfatmedium pipettiert. Damit erhalten Sie 3 x 3 Ansätze pro Probe. Achten Sie auf die korrekte Beschriftung der Teströhrchen: Probe, Verdünnungsstufe, Gruppen-Nummer. Tabelle 4.2.1: Probenstellen und empfohlene Verdünnungen Probe 1. Verdünnung 2. Verdünnung KW-Zulauf 10-6 10-9 Belebtbecken 10-6 10-9 Nachklärbecken unverd. 10-3 Pfütze unverd 10-3 Farntal 10-3 10-6 Donau 10-3 10-6 Uni-Teich unverd 10-3 Die beimpften Röhrchen und ein nicht beimpftes Röhrchen zur Kontrolle der Fluoreszenz werden im Ständer stehend bei 36 ± 1 °C für 19 ± 1 h bebrütet. Anschließend werden diese Röhrchen bei Tageslicht und bei Anregung der Fluoreszenz mit Licht der Wellenlänge 256 nm begutachtet:

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Abbildung 4.2.2.: Links: nicht bebrütete Reagenzgläser mit MUG-Laurylsulfat und Durhamröhchen. Mitte und rechts Trübung (= Wachstum) und Gasbildung im Durhamröhrchen. Rechts: Auswertung unter UV-Licht: die drei linken Röhrchen zeigen Fluoreszenz = sie enthalten E. coli, die beiden nicht fluoreszierenden Röhrchen enthalten lediglich Coliforme Keime. Achtung: Zur Kontrolle der Fluoreszenz wird ein nicht beimpftes Röhrchen mitgeführt. Dabei könnten z.B. folgende Befunde erhalten werden, die mit 1 = bewachsen und 0 = unbewachsen klassifiziert werden. Sie erhalten also für jede Verdünnungsstufe bestehend aus drei Röhrchen einen Code.

Abbildung 4.2.3: Auswertung im MPN-Verfahren. Der Code im dargestellten Schema ist 3,2,2. Er steht laut McCrady Tabelle (siehe Anhang 10.10) für 21,0 Keime pro ml Probe. Aufgabe: Bestimmen Sie über den Code die MPN der verschiedenen Gewässerproben. Dokumentieren Sie das Ergebnis durch Fotographien bei Tageslicht und nach Anregung der Fluoreszenz bei 254 nm. Erstellen Sie mit den Ergebnissen aus 4.1 eine gemeinsame Tabelle (Anhang 10.5), die von der Tabelle oben abgeleitet ist. Diskutieren Sie den Anteil Coliformer Keime an der Gesamtkeimzahl! 4.3 Analyse Antibiotika-resistenter Keime im Abwasser Achtung: bei diesem Experiment ist mikrobiologisch korrektes Arbeiten unbedingt erforderlich. Abwasser kann humanpathogene Viren und pathogene Keime enthalten. Sie halten sich unbedingt an die Anweisungen! In diesem Experiment analysieren Sie physiologisch sowie molekularbiologisch auf zwei Wegen multiresistente Keime:

1. Das Wachstum multiresistenter Keime auf Agarplatten in Gegenwart von drei Antibiotika: Ampicillin, Chlormaphenicol und Tetracyclin. Diese drei Antibiotika stehen für drei unterschiedliche Resistenzmechanismen. Außerdem wird ein

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Antibiogramm erstellt. 2. Molekularbiologischer Nachweis: Sie isolieren durch eine Hitzebehandlung

chromosomale (und Plasmid-) DNA aus den Isolaten. Diese DNA dient als Vorlage für PCR-Reaktionen auf das Integron-System.

Abbildung 4.3.1: Experimentelle Verfahrensschritte der Antibiotika-Resistenzanalyse

1. Bereiten Sie CASO-Agarplatten vor. Nach dem Autoklavieren wird das Medium auf etwa 45 45 °C abgekühlt. Dann wird dem Agar 100 µg/ml Ampicillin, 10 µg/ml Tetracyclin und 30 µg/ml Chloramphenicol zugesetzt. Mischen Sie die Lösung gut. Fertige Agarplatten werden bei 4 °C im Kühlschrank (dunkel!) bis zum Gebrauch gelagert.

2. Streichen Sie jeweils 100 µl der Probe auf dieser Antibiotika-haltigen und einer AB-freien CASO-Agarplatte aus. Inkubieren Sie diese Agarplatten bei 37 °C für 1 Tag.

3. Probenstellen: KW-Zulauf, Belebtschlamm, Nachklärbecken, Weihung eine Gruppe pro Probenstelle: Verdünnungen der Tabelle 4.2.1 berücksichtigen!

4. Auf eine Antibiotika-freie Agarplatte wird ein Antibiotika-Testring aufgelegt (Antibiogramm) Für die Antibiotika und ihre Konzentrationen siehe Tabelle unten. Drücken Sie die AB-haltigen Plättchen mit einer sterilen Pinzette leicht auf die Agaroberfläche.

5. Inkubieren Sie diese Ansätze für 1-2 Tage bei 37 °C.

Antibiotikatestringe Mast Diagnostica Antibiotika Kürzel Beladung in µg Ampicillin Cefalotin Colistinsulfat Gentamicin Streptomycin Sulfatriad Tetracyclin Cotrimoxazol

AP CP CO GM S ST T TS

10 5 25 10 10 200 25 25

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Auswertung: Messen Sie die Hemmhofdurchmesser und zählen Sie die Kolonien (= Resistenten) innerhalb dieser Hemmhöfe. Photographien Sie das Ergebnis! 2. Verfahren, molekularbiologischer Nachweis: Zentrifugieren Sie 0,5 ml Belebtschlamm (1 min, 5000 g) und waschen Sie den Niederschlag 5-mal in 1 ml PBS und dann in Wasser. Geben Sie 100 µl Wasser zu diesem Niederschlag und inkubieren Sie diese Proben für 10 min bei 95 °C (Hitzeaufschluss). Anschließend wird die Probe für 5 min auf Eis gekühlt und dann zentrifugiert (1 min, 13000 g). Der Überstand wird in ein frisches steriles Eppendorfgefäß überführt; er enthält die chromosomale (und Plasmid-) DNA insbesondere aus Gram-negativen Bakterien. Diese DNA wird mit der PCR auf das Integron-System untersucht (Kapitel 4.4).

4.4 Nachweis des Integron-Sstems durch die PCR-Methode Die Integrase, eine Rekombinase, ist die charakteristische Grundlage eines sehr erfolgreichen mehrfachen Antibiotika-Resistenzmechanismus bei vielen Proteobakterien. Bei Nachweis des kodierenden Gens kann also von einer mehrfachen Antibiotikaresistenz in der untersuchten Bakterienkultur ausgegangen werden. Im Anhang finden Sie detaillierte Hinweise zum kodierenden Gen aus Pseudomonas aeruginosa, den Positionen der verwendeten Primer und der Amplifikat- Fragmente nach Resitriktionsverdau (9.1). Material DNA-Probe aus Versuch 4.3 (oder einer Kolonie aus dem Hemmhof, nach 10 min Vorinkubation im PCR-Ansatz bei 95 °C) Eppendorfzentrifuge und sterile Eppendorfgefäße DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702) steriles Wasser PCR-Gerät PCR-Primer: int1.F: 5´-GGGTCAAGGATCTGGATTTCG-3´ int1.R: 5´-ACATGCGTGTAAATCATCGTCG-3´ Produktlänge: 484 Bp PCR-Reaktion im Gesamtvolumen von 20 µl:

1-3 µl template DNA (aus Versuch 4.3) 10 µl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702) 1 µl (10 pmol) Primer int1.F 1µl (10 pmol) Primer int.R steriles Wasser ad 20 µl

PCR-Temperaturprogramm:

Denaturierung: 94,0 °C 1 min 35 Zyklen:

- 94,0 °C 1 min - 54,0 °C 30 sec - 72,0 °C 2,5 min

Komplettierung: 72 °C, 10 min

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4.4.1 Analyse der PCR-Produkte:

1. 2%-ige Agarose in 1x TAE-Puffer; 10 V/cm. Färbung: Ethidiumbromid-Alternative GelRed, wobei ein Volumen Probe und ein Volumen Ladder jeweils mit einem Volumen 1:3000 im Wasser verdünnten GelRed vor dem Auftrag auf das Agarosegel gemischt werden. Aufgetragen werden 7 µl PCR-Amplifikat mit 6x loading dye.

2. Da die PCR-Amplifikate des Integron-Gens aus sehr vielen Enterobakterien

etwa 484 Bp lang sind, kann die einfache Fragmentlängenbestimmung in der Agarosegelelektrophorese nicht für eine sichere Identifizierung verwendet werden. Eine eindeutige Bestimmung wird erst möglich durch Klonierung mit anschließender Nukleotidsequenzierung. Da dieser Ansatz für Reihenuntersuchungen teuer und aufwändig ist, wird ersatzweise das Restriktionsfragmente-Muster (RFLP) nach Verdau mit Restrikionsenzymen ausgewertet. Die Längen aller Teilfragmente aus den einzelnen Verdauen addieren sich jeweils auf ca. 484 Bp.

Eine Voraussage zum Bandenmuster nach Behandlung mit verschiedenen Restriktionsenzymen (siehe Anhang 10.1) kann mit dem im Internet frei verfügbaren Programm NEBcutter (http:// tools.neb.com/NEBcutter2/index.php) und z.B. der Nukleotidsequenz (DQ219465, siehe Anhang 10.1) für die class I-Integrase aus Pseudomonas aeruginosa vorausgesagt werden. 4.4.2 Ansatz für den Restriktionsverdau des Integron-PCR-Amplifikats

• 10 µl des PCR-Ansatzes (mit Integron-Amplifikat) • 7 µl steriles Reinstwasser • 2 µl RE-Puffer • 1 µl von PvuII bzw. BglI Gesamtvolumen des Ansatzes: 20 µl Inkubation bei 37°C für 30-40 min.

Mischen Sie 10 µl dieses Verdaus mit 2 µl loading dye und tragen Sie diese Probe auf ein 2%- iges Agarosegel auf. Tragen Sie zur Kontrolle vom unverdauten PCR-Produkt ebenfalls 5 µl auf. Zur Längenbestimmung der Fragmente wird der 50 Bp-Marker (Anhang 10.8) in einer Spur aufgetragen. Entwickeln Sie das Agarosegel bei 120 V für ca. 30-45 min. Färben Sie das Agarosegel im Ethidiumbromidbad (Handschuh) und dokumentieren Sie mit der Fotodok das Ergebnis. Auswertung: Das Ergebnis wird im Vergleich zu den vorausgesagten Fragmenten (siehe Anhang 10.1) interpretiert.

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5 Phagennachweis Phagen sind Viren der Bakterien. Sie nutzen als molekulare Parasiten den Stoffwechsel ihres Wirtes, um neue Phagen zu produzieren. Bei der Phagenfreisetzung wird die Wirtszelle häufig lysiert (lysogener Zyklus), und die freigesetzten Phagenpartikel infizieren benachbarte Wirtszellen. Durch diesen Vorgang entsteht ein Phagenhof = Plaque. Je nach Art des lytischen Phagen werden große oder kleinere Plaques gebildet. Hier werden Sie E. coli-Phagen aus dem Abwasser nachweisen, da gerade im Abwasser viele E. coli (Enterobakterium) vorkommen (siehe 4.2) und damit auch viele seiner Phagen zu erwarten sind.

Abbildung 5.1: Übersicht zum Ablauf des Phagennachweises. Material:

• Phagenwirtsstamm: E. coli DSM 613 auf LB Medium mit 10 mM Arabinose • 4 Unterplatten aus LB-Agar + 10 mM Arabinose (aus 2.1) als Nähragar • frisches Abwasser aus dem KW-Zulauf. Vorsicht: es können human

pathogene Viren vorkommen! • Sterilfilter: 0,45 µm Poren • Verdünnungsreihe in drei kleinen Reagenzgläsern: jeweils 5 ml steriles 0,9%-

iges NaCl Zugabe von 50 µl Phagensuspension (= 10-2), mischen • steriler Weichagar: 8 g Agar/Liter LB-Medium + 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 und

10 mM Arabinose; davon 3 ml pro Probe im kleinen Reagenzglas bei 45-47 °C im Wasserbad flüssighalten.

• Phagensuspension: jeweils unverdünntes Sterilfiltrat (0,45 µm), 10-2 bis 10-6 Verdünnung in steriler 0.9%-iger NaCl-Lösung.

Verfahren: Lassen Sie die frische Abwasserprobe kurz stehen, um Grobbestandteile zu sedimentieren. Der Überstand wird durch ein 0,45 µm Filter sterilfiltriert. Das Permeat wird in einem sterilen 1 ml Eppendorfreaktionsgefäß aufgefangen. Aus dieser unverdünnten Phagensuspension wird in einer 10-2-Verdünnung (50 µl/5

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ml) in steriler 0,9%-iger NaCl Lösung Subkulturen angelegt. Daraus werden 0,1 ml zusammen mit 0,2 ml Wirtsbakterien (E. coli DSM 613) in die Weichagarröhrchen pipettiert. Diese Röhrchen werden durch Rollen zwischen den Händen gut gemischt und dann sofort auf die Nähragar- platten gegossen. Durch leichtes Schwenken sollte der Weichagar möglichst gleichmäßig auf deren Oberfläche verteilt werden. Nach dem Erstarren des Weichagars werden die Agarplatten dann stehend im Brutschrank bei 37 °C für 1-2 Tage inkubiert. Je nach Phagentiter in der unverdünnten Phagensuspension sollten in einigen der Verdünnungsstufen einzelne Plaques erkennbar sein, die sich in ihrem Durchmesser unterscheiden. Es handelt sich um verschiedene E. coli-Phagen. Beschreiben und fotografieren Sie diese Agarplatten. Berechnen Sie aus den Plaques/ Agarplatte den E. coli-Phagentiter für jede Plaque-Morphologie in der unverdünnten Suspension. 6 Quantifizieren von Luftkeimen In vielen Bereichen der Pharma- und Lebensmittelindustrie, Krankenhäuser, etc. ist die Überwachung von Luftkeimen (Bakterien und Pilze) ein wichtiger Parameter der mikrobiologischen Qualitätskontrolle. Hier lernen Sie mit einem professionellen Gerät (Merck MAS-100) solche bakteriellen Luftkeime zu quantifizieren, genau wie es auch in der mikrobiologischen Qualitätskontrolle geschieht. Für den Nachweis von Bakterien verwenden wir CASO-Agar, für den Nachweis von Pilzen wird Sabouraud-Agar eingelegt. Die Agarplatten sollten mit 25-28 ml Medium befüllt sein, um die Luftführung nicht zu verfälschen.

1. Desinfizieren Sie den Lochdeckel innen und außen mit 80 %-igem Ethanol. 2. Setzen Sie eine Agarplatte (CASO oder Sabouraud) ein. 3. Schließen Sie den Deckel mit der Lochblende Befestigen Sie den Lufkeimsammler auf einem Stativ Lassen Sie das Gerät 100 L Luft ansaugen. 4. Entnehmen Sie die Agarplatte und verschließen Sie sie mit Parafilm

5. Inkubieren Sie die Agarplatte für 2-4 Tage bei 30 °C für Bakterien bzw. bei RT für Pilze. Quantifizieren und fotographieren Sie täglich die Kolonien.

6. Berechnen Sie die Keimzahl/m3 Luft unter zur Hilfenahme der Korrekturtabelle nach Feller (siehe Anhang 10.9)

Der erhaltene Wert muss mit Faktor 10 multipliziert werden, um das Luftsammelvolumen von 100 L Luft auf 1 m3 umzurechnen.

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Bedienung des Merck MAS-100

Abbildung 6.1: Luftkeimsammler im geschlossenen (links) und geöffneten Zustand (Mitte) sowie ein Schema zur Luftführung (rechts). Nach dem Starten des Gerätes leuchtet eine grüne LED-Lampe auf der Bedienfläche auf. Für 100 L benötigt der MAS-100 etwa eine Minute. Das Gerät ist Volumen- und nicht Zeit-gesteuert! Achtung: Entfernen Sie sich um mindestens 2 m nach dem Start des air samplers vom Gerät, um eine Kontamination durch den Probennehmer zu vermeiden. Wenn das Gerät ausgelaufen ist leuchtet eine rote LED-Lampe auf der Bedienfläche auf. Aufgabe: Inkubieren Sie die Agarmedien für drei Tage bei 30 °C. Notieren und fotographieren Sie täglich die Anzahl der sichtbaren Kolonien, ihre Größe und Koloniemorphologie. Erstellen Sie zu diesen Werten eine Tabelle, in der die Anzahl der Kolonien, ihr Kolonietyp und ihre Gram- Reaktion in der KOH-Methode (siehe unten) zusammengefasst sind. Am dritten Tag führen Sie von representativen Kolonietypen eine schnelle Gram-Reaktion mit 10%-iger KOH durch. Dazu entnehmen Sie mit einer gelben Pipettenspitze eine Kolonie und verreiben diese in 20 µl 10 % KOH. Nach etwa 20-30 Sekunden versuchen Sie durch vorsichtiges Anheben der Pipettenspitze (ca. 1 cm Höhe), ob "Fäden" gezogen werden können. Für den Fall, dass ein farbloser Faden sichtbar ist, sind die Zellen Gram-negativ. Nutzen Sie von ihren Anreicherungen Referenzmaterial: E. coli als Gram-negatives, Bacillus als Gram-positives Beispiel. Erklärung: Gram-negative Zellwände bestehen aus wenigen Mureinschichten, die unter diesen chemischen Bedingungen rasch hydrolysiert werden. Dadurch wird die polymere genomische DNA der Zellen freigesetzt, die als "Faden" zu sehen ist.

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7 Pilze - Nachweise und Bestimmungen Eukaryotische Pilze spielen in der Natur eine wichtige Rolle beim Abbau organischer Verbindungen (Saprophyten), in der Synthese von biotechnologisch interessanten Produkten (Antibiotika, Enzyme) und durch Bildung von Mykotoxinen (Aflatoxine, etc.). Außerdem sind Pilze als Pathogene von Bedeutung für Menschen und Tiere. Unter diesen Gesichtspunkten beachtenswerte Pilz- Gattungen sind Candida, Aspergillus und Fusarium. Sie wachsen in einem weiten aW-Bereich, d.h. sie kommen an feuchten, aber auch vergleichsweise trockenen Standorten vor. "Trockenheit" kann z.B. chemisch durch hohe Konzentrationen an Zuckern erzeugt werden. Dies ist ein Grund dafür, dass Marmelade "schimmelt" und kaum Bakterienwachstum aufweist.

Abbildung 7.1: Übersicht zu den Versuchen mit Pilzen

7.1 Candida albicans Candida albicans ist ein einzelliger Pilz (Hefe), der fakultativ pathogen ist (S2) und bei 30-50 % der Menschen opportunistisch auf Schleimhäuten z.B. im Mund und in der Vagina vorkommt. Diese Hefe kann die Candidose (Soor) verursachen. Es wird auch ein Zusammenhang mit Karies diskutiert. Nehmen Sie einen Abstrich mit dem Q-Tipp von Zähnen, Zahnfleischtaschen, Zunge, etc. und streichen Sie ihn auf Sabouraud-Nährboden (g/L) aus: Caseinpepton (pankreatisch) 5, Fleischpepton (peptisch verdaut) 5, Glucose 20,0, pH 5,7 ± 0,2. Für Agarplatten wird dem Medium 15 g/L zugesetzt. Agarplatten werden in 4 Sektoren eingeteilt, um mehrere Hautpartien testen zu können. Bebrütet wird 1-2 Tage bei 37°C. Kleine weiße Kolonien sprechen für Candida. Im mikroskopischen Präparat sollten einzelne Hefezellen bzw. Diplokokken-ähnliche große Zellen (ca. 5-10 µm) erkennbar sein. Als alternatives Medium kann Kartoffelextrakt-Glucose Agar (g/L) verwendet werden: Kartoffelextrat 4, Glucose 20, Agar 15, pH 5,6. Dieser Agar kann nach dem Autoklavieren und abkühlen auf 50 °C mit 1 ml steriler 10%-iger Milchsäure oder 1,4 ml Weinsäure pro 100 ml Medium auf pH 3,5 gesenkt werden. Durch diesen sauren

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pH-Wert wird bakterielles Wachstum unterdrückt. Nachweis durch PCR: Es wird maximal die Hälfte einer Kolonie mit einer sterilen gelben Pipettenspitze entnommen und direkt in den PCR-Ansatz eingerührt/pipettiert. Der Ansatz wird 10 min bei 95 °C inkubiert. Anschließend werden die Primer und die DreamTaq Polymerase zugegeben sowie die PCR-Zyklen gestartet. Im 18S rRNA Gen der Eukaryoten können mit den folgenden Primern Amplifikate bei Pilzen, nicht aber beim Menschen, Maus oder Bakterien erhalten werden:

FF1: 5′-GTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAC-3′ FR1: 5′-CTCTCAATCTGTCAATCCTTATT-3′ Die Länge des Amplifikats über die V4 und V5 variablen Regionen ist 630 Bp. Andere Primer sind gegen die ITS Bereiche (internal transcribed spacer) im Genom dieser Pilze gerichtet. Dieser Bereich überspannt die 5.8S rRNA und wird als nützlich für die Identifizierung von Pilzen auf der Spezies-Ebene angesehen. Sequenzinformationen für Candida gibt es unter: http://www.candidagenome.org.

Abbildung 7.1: Organisation des Genclusters für die Kodierung der eukaryotischen ribosomalen Pilz-RNA. Die ITS (intergenic transcribed spacers) oder das 18S rRNA Gen dienen der Primer- Hybridisierung. ETS = external transcribed spacers. In der Regel existieren 100-200 solcher Cluster-Kopien in einem Pilz-Genom.

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PCR-Reaktion im Gesamtvolumen von 20 µl: template DNA: ≤ 50 % einer Candida-Kolonie 10 µl DreamTaq Green PCR Master Mix (2x) (Fermentas EP0702) 8 µl steriles Wasser Inkubation für 15 min bei 95 °C, dann: 1 µl (10 pmol) FF1 primer 1 µl (10 pmol) FR1 primer

PCR-Temperaturprogramm: anfängliche Denaturierung: 95°C für 3 min, dann 38 Zyklen:

- 94°C 1 min - 52°C 60 sec - 72°C 2 min

Komplettierung/Elongation: 72 °C, 10 min Analyse der PCR-Produkte: 2%-ige Agarose in 1x TAE-Puffer; 10 V/cm. Färbung: Ethidiumbromidbad (1 µg EtBr/ml TAE-Puffer) Aufgetragen werden 7 µl PCR-Amplifikat mit 6x Auftragepuffer Zur Kontrolle wird Saccharomyces cerevisiae ebenfalls in einer Kolonie-PCR unter Verwendung dieser Primer untersucht. Aufgabe: Fassen Sie insbesondere die Ergebnisse zur eigenen Candida-Anreicherung zusammen: (1.) Erscheinungsform auf Agarplatten, (2.) Größe der Zellen und ihre Form im mikroskopischen Präparat (3.) Ergebnisse der PCR auf Hefen.

8.2 Isolierung von Pilzen aus natürlichen Standorten 8.2.1 Lebensmittel: Saccharomyces cerevisiae, die Bäckerhefe, wird aus einem Lyophilisat aktiviert und auf Sabouraud-Agarplatte ausgestrichen. Außerdem werden diese Zellen wie Candida aufgeschlossen (Kapitel 7.1), DNA isoliert und anschließend eine PCR durchgeführt mit dem Pilz-spezifischen Primern. Ein wenig Pilzkultur von Lebensmitteln (z.B. Käse wie Brie/Camembert und Roquefort) wird auf eine Sabouraud-Agarplatte ausgebracht und für 3-5 Tage bei RT inkubiert. Achtung: die Agarplatte wird mit dem Boden nach unten inkubiert! Diese Anreicherung hat den Vorteil, dass keine pathogenen Pilze gezüchtet werden. Vom auswachsenden Myzel wird ein mikroskopisches Präparat angelegt (siehe unten). Auf Camembert ist Penicillium camemberti und auf Roquefort der Blauschimmel Penicillium roqueforti zu erwarten. 8.2.2 Mikroskopische Präparate vom Pilzmyzel Pilzmyzelien zeichnen sich häufig durch eine hydrophobe Oberfläche aus, wodurch es schwierig wird, ein mikroskopisches Präparat in der sonst gewohnten wässerigen Umgebung anzufertigen. Außerdem wird die Anordnung der Conidiosporen durch

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mechanische Belastung sehr schnell zerstört. Conidiosporen sind wichtige Bestimmungsmerkmale für die Bestimmung der Pilzart. Verfahren: Mit einem durchsichtigen Tesaband wird vorsichtig auf die Oberfläche einer Pilzkolonie gedrückt. Dieses Tesaband wird dann auf einen Objektträger geklebt, auf dem 50 µl Lactophenolbau (gebrauchsfertige Lösung, Roth 3097.1) aufgetragen worden sind. Bei 40-facher Vergrößerung sind dann die Pilzstrukturen blau angefärbt. Aufgabe: Legen Sie ein wässeriges mikroskopisches Präparat von Saccharomyces cerevisiae an (z.B. aus dem Brennstoffzellen-Versuch 7). Messen Sie die Zellen mit dem Okularmikrometer aus und notieren Sie die Zellgrößen im Vergleich zu E. coli und Bacillus subtilis. Messen Sie auch den Zelldurchmesser der Fadenpilze (von Käsepräparaten) und deren Conidiosporen. 8.2.3 Tierbürsten: Auf eine Sabouraud-Agarplatte wird ein Abklatsch von einer Pflegebürste des privaten Tieres (Hund, Katze, etc.) abgedrückt. Die Deckel der Agarplatten werden mit Parafilm verschlossen. Auch diese Agarplatten werden für 3-5 Tage bei RT bzw. bei 30 °C inkubiert. Aufgabe: Ein Foto der Agarplatte von oben und von unten belegt die Vielfalt der Pilze. Im mikroskopischen Präparat könnte über Conidiosporen eine Identifizierung der Pilzarten erfolgen.

9 Exkursionen Wir werden zwei Exkursionen durchführen, eine zu Beginn des Praktikums ins städtische Klärwerk und zu den Probestellen an den Gewässern sowie eine weitere zur Landeswasserversorgung (LWV) in Langenau. Zu beiden Exkursionen wird jeweils mindestens eine DIN A4 Seite an Daten protokolliert.

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9 Anhang 9.1 Pseudomonas aeruginosa Integrase-Gen (1014 bp, 61% GC) Zugriffsnummer in der NCBI-Datenbank: U12338 atgaaaaccgccactgcgccgttaccaccgctgcgttcggtcaaggttctggaccagttgcgtgagcgcatacgctacttgcattacagtttacgaaccgaacaggcttatgtcaactgggttcgtgccttcatccgtttccacggtgtg cgtcacccggcaaccttgggcagcagcgaagtcgaggcat ttctgtcctg gctggcgaacgagcgcaagg tttcggtctc cacgcatcgt caggcattgg cggccttgct gttcttctac ggcaaggtgc tgtgcacgga tctgccctgg cttcaggaga tcggaagacc tcggccgtcg cggcgcttgc cggtggtgct gaccccggat gaagtggttc gcatcctcgg ttttctggaa ggcgagcatc gtttgttcgc ccagcttctg tatggaacgg gcatgcggat cagtgagggt ttgcaactgc gggtcaagga tctggatttc gatcacggca cgatcatcgt gcgggagggc aagggctcca aggatcgggc cttgatgtta cccgagagct tggcacccac gctgcgcgag cagctgtcgc gtgcacgggc atggtggctg aaggaccagg ccgagggccg cagcggcgtt gcgcttcccg acgcccttga gcggaagtat ccgcgcgccg ggcattcctg gccgtggttc tgggtttttg cgcagcacac gcattcgacc gatccacgga gcggtgtcgt gcgtcgccat cacatgtatg accagacctt tcagcgcgcc ttcaaacgtg ccgtagaaca agcaggcatc acgaagcccg ccacaccgca caccctccgc cactcgttcg cgacggcctt gctccgcagc ggttacgaca ttcgaaccgt gcaggatctg ctcggccatt ccgacgtctc tacgacgatg atttacacgc atgtgctgaa agttggcggt gccggagtgc gctcaccgct tgatgcgctg ccgcccctca ctagtgagag gtag Primer intI.F : 5´-GGGTCAAGGATCTGGATTTCG-3´ Primer intI.R: 5´- ACATGCGTGTAAATCATCGTCG-3` = 3´-cgacgatg atttacacgc atgt-5´ PCR Amplifikat-Länge: 484 bp (63% GC) Schnitte von Restriktionsendonukleasen im PCR Amplifikat für die RFLP:

Restriktions- endonuklease

Schnitt bei (Bp)

PvuII 113 BglI 163

Voraussagen zu Mustern von Restriktionsverdauen des Integrase-Amplifikates

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Abbildung 9.1: Restriktionsverdau des Integrase-Gen-Amplifikates durch die PCR mit den Int-Primern. Auftrennung des Verdaus im 2 %-igen Agarosegel. Links: PvuII Verdau; rechts mit BglI Verdau.

9.2 Übersicht zu Experimenten Die Zahlen in Klammern verweisen auf die Kapitel!

28

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9.3 Tabelle chemische Wasserparameter

Parameter Temperatur (°C)

O2 (mg/l)

Leitfähigkeit (µS/cm)

pH Phosphat (µM)

Proben- name

9.4 Tabelle mikrobiologischer Wasserparameter

Parameter Gesamt- keime (ml)

Coliforme (MPN/ml)

E. coli (MPN/ml)

Proben- name

9.5 Tabellen Badewasserqualitäten und mikrobiologische Grenzwerte für Trinkwasser

Trinkwasser (Probevolumen: 100 ml) Gesamtkeime: 100 cfu/ml E. coli, Coliforme und Enterokokken dürfen in 100 ml nicht nachweisbar sein.

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9.6 Antibiotika

Tabelle: Wirkstofftest auf das Staphylococcus-Isolat

Wirkstoff CAS-Nr. Strukturformel Amoxicillin 26787-78-0

(Amoxicillin +) Clavulansäure

58001-44-8

Cephalexin 15686-71-2

Ciprofloxacin 85721-33-1

Doxycyclin 564-25-0

Norfloxacin 70458-96-7

Ofloxacin 82419-36-1

Roxithromycin 80214-83-1

Sulfamethoxazol 723-46-6

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Antibiotika-Testringe zur Erstellung von Antibiogrammen bei Gram-negativen und Gram- positiven Keimen

M14 (Gram-negativ) Ampicillin AP 10 Grey Cefalotin CP 5 Primrose Colistinsulfat CO 25 White Gentamicin GM 10 Salmon Streptomycin S 10 White Sulfatriad ST 200 Mauve Tetracyclin T 25 Brown Cotrimoxazol TS 25 White M43 (Gram-positiv) Penicillin G PG 1 Unit Pink Clindamicin CD 2 White Gentamicin GM 10 Salmon Fusidinsäure FC 10 Dark Green Erythromycin E 5 Red Trimetoprim TM 1,25 White Sulphmethoxazole

SMX 25 Mauve Tetracyclin T 10 Brown

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9.7 Standards für Agarosegelelektrophoresen

Abbildung: Längenstandards für Agarosegelelektrophoresen, Links: 1 kB Ladder; rechts: 50 Bp-Ladder

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9. 8 McCrady Tabelle

Statistische Auswertung von Wasserproben nach der MPN-Methode.