OCORRÊNCIA DE GENES RESISTENTES À VANCOMICINA C1, C3 …€¦ · 2a Conferência Internacional...

2a Conferência Internacional Virtual sobre Qualidade de Carne Suína5 de Novembro a 6 de Dezembro de 2001 — Concórdia, SC, Brasil

OCORRÊNCIA DE GENES RESISTENTES ÀVANCOMICINA VAN A, VAN B, VAN C1, VAN C2 ANDVAN C3 EM ENTEROCOCOS ISOLADOS DE AVES E

SUÍNOS

Lemcke, R.1 M. Bülte2

1Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Fachbereich TiermedizinBlücherstraße 34, 56073 Koblenz, Alemanha

Tel: 0261/404050, Fax: 0261/4040598e-mail: [email protected]

2Institute of Veterinary Food Science, Faculty of Veterinary MedicineJustus-Liebig University Giessen, Frankfurterstr. 92, 35392 Giessen, Alemanha

Tel: 0641/9938251, Fax: 0641/9938259e-mail: [email protected]

Resumo

Suspeita-se que o uso da avorparcina como antibióticos alimentar para animaiscontribui para o desenvolvimento de resistência cruzada contra vancomicina eteicoplanina (KLARE et al., 1995; WITTE et al., 1995). Depois do isolamento deenterococos em carne de aves e de suínos por cultivo em ágar CATC (Citrato AzidaTween Carbonato) e o screening de resistência à vancomicina em ágar ColumbiaCNA agar (Colistin Nalidixic Acid agar, suplementado com 5% de sangue ovinoe 5mg de vancomicina/l, GREEN et al., 1990) a reação em cadeia da polimerase(PCR) foi usada para a detecção de genes de resistência à vanA („alto nível",ARTHUR e COURVALIN, 1993; KLARE et al., 1995), vanB („nível moderadamentealto", QUINTILIANI et al., 1992), vanC1, vanC2, e, respectivamente, vanC3 („baixonível", SATAKE et al., 1997; CLARK et al., 1998).

Dos isolados 1643 E.- de 115 amostras de carne de aves e 50 de carnesuína, 420 isolados foram identificados como as vancomicina-resistentes, 202 dosquais apresentaram o vanA; um isolado, vanA e vanC1; 38 isolados vanC1; 14isolados vanC2; 9 com vanC1 e vanC3 e 156 isolados sem estes genes. O genevanB não foi encontrado nestes isolados. Comparando os isolados de alimentosvanA-positivos com os de diferentes fontes humanas por meio de eletroforeseem gel em campo pulsátil (PFGE), foi claramente demonstrado que eles nãodemonstram fingerprints homólogos de acordo com a fonte de origem. Portanto, éimprovável que haja uma relação genética próxima entre isolados de alimentos deorigem animal e humanos.

Palavras-chave: vanR genes de enterococos vancomicina/teicoplanina-resistentes, , avoparcina, aves, suínos, reação em cadeia da polimerase (PCR),eletroforese em gel em campo pulsátil (PFGE).

136


1 Introdução

Enterococos (E.) spp. resistentes à vancomicina causam cada vez mais infecçõeshospitalares em seres humanos, p. ex., do trato urinário e de feridas, bacteremia eendocardite, desde 1990 (FRAIMOW et al., 1994; GREEN et al., 1990; KLARE et al.,1995).

O uso do antibiótico glicopeptídeo avoparcina (produzido pelo Streptomycescandidus) como aditivo alimentar (chamado "promotor de crescimento") na criaçãocomercial de animais (suínos, aves, bovinos e bezerros) está proibido na Alemanhadesde janeiro de 1996, e na UE desde abril de 1997. Suspeita-se que o usoda avoparcina contribua para o desenvolvimento de resistência cruzada contraantibióticos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina) em espécies de Enterococcus(E.), um dos mais importantes patógenos de infecção hospitalar em seres humanos(WOODFORD et al., 1995). A pergunta a ser feita é se o uso ou não de avoparcinapara animais produtores de alimentos causa resistência à vancomicina em cepas deenterococos (VRE) como causa de infecções intratáveis em humanos. Isto parecepossível, pois a contaminação fecal de carcaças com estas cepas poderia ser causadapor má higiene ao abate. Portanto, os alimentos de origem animal poderiam serum vetor destas cepas. A resistência à vancomicina (van) é codificada por váriosgenes(vanA, vanB, vanC1, vanC2, vanC3, vanD e vanE, ARTHUR e COURVALIN,1993; QUINTILIANI et al., 1992; CLARK et al., 1998; SATAKE et al., 1997; PERICHONet al. 1997; COURVALIN, 1999; FINES et al., 1999). Especialmente, o gene vanAé o mais preocupante, pois media a resistência de "alto nível". A resistência estálocalizada no transposon Tn1546 em um plasmídeo conjugado (KLARE et al., 1997).

• O objetivo de nossa pesquisa foi:

– estimar a ocorrência de enterococos resistente à vancomicina (VRE) emcarne de aves e de suínos em Giessen de janeiro de 1996 a agosto de1997,

– pesquisar os genes vanA, vanB, vanC1, vanC2 e vanC3 através de reaçãoem cadeia da polimerase (PCR) e

– comparar o gene vanA-positivo em isolados de alimentos com o vanA-positivo em isolados de origem humana por meio de eletroforese em gelem campo pulsátil (PFGE), que pode ser usado como procedimento defingerprinting de DNA para diferenciação intra-específica.

2 Material e Métodos

2.1 Pesquisas microbiológicas

1643 cepas de E. de 115 amostras de carne de aves da Alemanha, Holanda,França e Hungria, 50 amostras de carne suína da Alemanha e isolados de origemhumana foram isolados em ágar CATC (Citrato Azida Tween Carbonato) segundo ométodo § 35 (L 06.00-32) do „Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz" (LMBG)da Alemanha

137


Depois do isolamento e da confirmação bioquímica, todos os isolados foramsubmetidos a screening para verificar a resistência à vancomicina em ágar ColumbiaCNA (Colistina Ácido Nalidíxico, suplementado com 5% de sangue ovino e 5mgvancomicina/l; GREEN et al., 1990).

2.2 Pesquisas moleculares

Todas as cepas identificadas como VRE foram testadas com primers especiaisem reação em cadeia da polimerase (PCR) para os genes resistentes vanA, vanB,vanC1, vanC2 e vanC3 (LEMCKE et al., 2000). A Tabela 1 mostra as seqüênciasusadas de oligonucleotídeos para a amplificação dos fragmentos internos de pares debases típicos de genes van.

Tabela 1 — Seqüências de oligonucleotídeos para a amplificação dos genes van

Gene Amplicon Acrônio Seqüências de oligonucleotídeos (5’-3’) Referênciasdo Primer

VanA 377 bp1 VanA I: TCT gCA ATA gAg ATA gCC gC KLARE, 1995VanA II: GG AgT AgC TAT CCC AgC ATT

VanB 529 bp VanB I: gCT CCg CAg CCT gCA Tgg ACA FRAIMOW, 1994VanB II: ACg ATg CCg CCA TCC TCC TgC

VanC1 796 bp VanC1 I: gAA AgA CAA CAg gAA gAC CgC CLARK, 1998VanC1 II: TCg CAT CAC AAg CAC CAA TC

VanC2 484 bp VanC2 I: Cgg ggA AgA Tgg CAg TAT SATAKE, 1997VanC2 II: CgC Agg gAC ggT gAT TTT

VanC3 224 bp VanC3 I: gCC TTT ACT TAT TgT TCC CLARK, 1998VanC3 II: gCT TgT TCT TTg ACC TTA

(Primers foram sintetizados por TIB MOL BIOL Syntheselabor, Berlim, Alemanha.1 pares de bases (bp)

Para comparar as 203 cepas vanA-positivas de E. de alimentos com 82 isoladosde diferentes fontes humanas, usamos o PFGE (endonuclease de restrição SmaI)segundo EISENACH et al. (1992) e KLARE et al. (1997). Os resultados do PFGEforam analisados com o software Gel Compar 4.0 (Fa. Applied Maths, Bélgica).

3 Resultados

No total, foram isolados 1643 isolados de E. de alimentos de origem animal em50 amostras de carne suína e de 115 amostras de carne de ave. 420 isolados deE. foram identificados como resistentes à vancomicina usando o ágar Columbia CNAsuplementado com vancomicina. O gene vanA foi detectado apenas em amostras decarne de ave, mas não em amostras de carne suína. Por exemplo, os resultadoscorrespondentes são apresentados na Figura 1. As Tabelas 2 e 3 descrevem osresultados correspondentes às amostras de alimentos de origem animal, as Tabelas 4e 5, os dados relevantes dos isolados. O gene vanA foi encontrado em 202 isolados

138


(31 cepas de E. faecalis, 127 de E. faecium, 34 de E. durans e 10 de E. hiraes), osgenes vanA e o vanC1 foram encontrados em um isolado de E. gallinarum unicamenteem 50 amostras de carne de ave (43,5%). A especificidade do amplicon típico do genevanA foi verificado com a endonuclease de restrição do Clostridium formioaceticum(CfoI). Este gene de resistência também foi detectado em nossas cepas clínicas enossas 5 cepas de coleta.

Tabela 2 — Ocorrência de enterococos resisten-tes à vancomicina em 50 amostrasde carne suína e em 115 de carnede aves

Origem Alimento Número (%)(carne) Amostras VRE-pos.1

Alemanha Suínos 50 24 ( 48,0)Aves 61 44 ( 72,1)

Holanda Aves 43 33 ( 76,7)França Aves 10 10 (100,0)Hungria Aves 1 1 (100,0)

Suínos 50 24 ( 48,0)in total Aves 115 87 ( 75,7)

Total 165 111 ( 67,3)1 amostras com enterococos resistentes à vancomicina

(VRE) por meio de ágar Columbia CNA, suplementadocom 5mg vancomicina/l

Com exceção destes VRE de "alto nível", não conseguimos detectar amostras como gene vanB.

Detectamos enterococos vanC-positivos em carne suína da Alemanha. 5 isoladostinham o gene vanC1- (E. gallinarum); um isolado, o vanC2-(E. casseliflavus) e 7isolados, o vanC2- e o vanC3 (E. casseliflavus)..

Os resultados da detecção dos genes vanC genes estão descritos na Figura 2.Usando o PFGE, 203 enterococos vanA-positivos de carne de aves e 82

enterococos vanA-positivos de humanos foram examinados com uma técnica dediferenciação intra-específica. Foi demonstrado que os padrões de genes das cepasde E. de alimentos de origem animal são completamente diferentes dos isoladoshumanos.

Por exemplo, os resultados de PFGE com três isolados clínicos (faixa 1-3) e 14isolados de carne aves (faixas 4-17) são apresentados na Figura 3. A Figura 4 mostraum dendrograma de alguns isolados.

4 Discussão

Com a detecção presumida de cepas de E. resistentes à vancomicina em ágarColumbia CNA suplementado com vancomicina, seguido de PCR, podemos fazer umaafirmação definitiva sobre a incidência de cepas de E. de "alto nível" de resistência

139


Tabela 3 — Distribuição de diferentes genes resistentes à vancomicina em carne suínae de aves(carne) vanA-VRE VRE van

1 +C12 +C23 +C1,24 +C1,2,35 C16 C27 C2+C38

Alemanha Suínos 0 (0,0) 1 (2,0) 1 (2,0) 3 (6,0)Aves 14 (23,0) 6 (9,8) 0 (0,0) 2 (3,3) 6 (9,8) 5 (8,2) 0 (0,0)

Holanda Aves 13 (30,2) 3 (7,0) 2 (4,7) 1 (2,3) 0 (0,0) 6 (14,0) 2 (4,7) 0 (0,0)França Aves 9 (90,0) 0 (0,0)Hungria Aves 0 (0,0)

Suínos 0 (0,0) 1 (2,0) 1 (2,0) 3 (6,0)in total Aves 36 (31,3) 9 (7,8) 2 (1,7) 1 (0,9) 2 (1,7) 12 (10,4) 7 (6,1) 0 (0,0)

Total 36 (21,8) 9 (5,5) 2 (1,2) 1 (0,6) 2 (1,2) 13 (7,9) 8 (4,8) 3 (1,8)1 amostras com enterococos resistentes à vancomicina com gene vanA (VRE);2 amostras com VRE com genes vanA e vanC1;3 amostras com VRE com genes vanA e vanC2;4 amostras com VRE com genes vanC1 e vanC2;5 amostras com VRE com genes vanC1, vanC2 e vanC3 VRE.6 amostras com VRE com gene vanC1;7 amostras com VRE com gene vanC2;8 amostras com VRE com genes vanC2 e vanC3 gene.

Tabela 4 — Distribuição de genes vanA em diferentes espécies de enterococosde carne suína e de aves

E. spp. Alimento número (%)(carne) Isolados VRE-pos.1 vanA-VRE2 vanA+C1-VRE3

E. faecium Aves 546 160 127 0Suínos 238 24 0 0

E. faecalis Aves 511 105 31 0Suínos 242 25 0 0

E. gallinarum Aves 34 34 0 1Suínos 5 5 0 0

E. casseliflavus Aves 14 14 0 0Suínos 8 8 0 0

E. flavescens Aves 1 1 0 0E. durans Aves 34 34 34 0E. hirae Aves 10 10 10 0

Aves 1150 358 202 1in total Suínos 493 62 0 0

Total 1643 420 202 11 enterococos resistentes á vancomicina (VRE) por meio de ágar Columbia CNA, suplementado

com 5mg vancomicina/;2 VRE, com gene vanA;3 VRE, com genes vanA e vanC1

140


Tabela 5 — Distribuição de genes vanA em enterococos de carne suína e deaves

E. spp. Alimento Número(carne de) vanC1-VRE1 vanC2-VRE2 vanC2+C3-VRE3

E. gallinarum Aves 33 0 0Suínos 5 0 0

E. casseliflavus Aves 0 13 1Suínos 0 1 7

E. flavescens Aves 0 0 1Suínos 33 13 2

in total Suínos 5 1 7Total 38 14 9

1 VRE, com gene vanC1;2 VRE, vanC2 gene positive;3 VRE, com genes vanC2 e vanC3

bp:

587

540504458434

267234213192

124104 89 64

A

B

C

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 B M

A: 377bp (vanA gene); B: 274 bp (fragmento A); C:103 bp (fragmento B)

1: E. faecium, ATCC 6057, controle negativo; 2: E. faecium, aves, FRG, controlpositivo; 4,8: E. faeciu aves, FRG; 6, 12: E. faecalis, aves, NL; 10, 14: E. hirae, aves,NL; 16: E. faeciu , isolado clínico, FRG 3,5,7,9,11,13,15,17: amplificação e restrição;B: branco; M: marcador V (Boehringer).

Figura 1 — PCR amplificado vanA gene de isolados de Enterococcus de diferentesfontes

141


marker VI

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 B M

21761766

12301033

653

517 453 394

298

234

154

A

B

C

A: 796 bp (gene vanC1); B: 484 bp (gene vanC2); C: 224 bp (gene vanC3)

1,2: E. gallinarum, aves, FRG; 3: E. faecium, ATCC 6057, controle negativo; 4: E. casseliflavu ,aves, NL; 6,7: E. casseliflavus, aves, FRG; 5,8: E. casseliflavu , suíno, FRG; 9: E. gallinarum, BA4174, controle positivo vanC1; 10: E. casseliflavu , ATCC 25788, controle positivo vanC2; 11: E.flavescens, CCM 439, controle positivo vanC3; B: branco; M: marcador VI , (Boehringer)

Figura 2 — PCR amplificado vanA gene de isolados de Enterococcus de diferentesfontes

142


MI MII 1 2 3 4 5 6 7 8 MI MII 9 10 11 12 13 14 15 16 17MI MII 1 2 3 4 5 6 7 8 MI MII 9 10 11 12 13 14 15 16 17

1-3: E. faecium, clinical isolates, FRG; 4+8: E. faecium, poultry, FRG; 5+7: E. hirae,poultry, NL; 6: E. durans, poultry, NL; 9,10+16,17: E. faecium, poultry, F; 11-14: E.faecium, poultry, FRG; 15: E. faecalis, poultry, F; M I: marker (0,1 - 200 kb, Fa. Sigma);M II: marker (50 - 1000 kb, Sigma).

1-3: E. faeciu , isolados clínicos, FRG; 4+8: E. faeciu , aves, FRG; 5+7: E. hirae,aves, NL; 6: E. durans, aves, NL; 9,10+16,17: E. faeciu , aves, F; 11-14: E. faeciu ,aves, FRG; 15: E. faecalis, aves, F; M I: marcador (0,1 - 200 kb, Fa. Sigma); M II:marcador (50 - 1000 kb, Sigma).

Figura 3 — Perfis de PFGE de enterococos resistentes vanA selecionados (VRE)

100% 9080706050

E. faecalis

E. durans

E. hirae

E. faecium

Isolado clínico, FRG

Isolado clínico, FRG

aves, NL

aves, FRG

aves, F

Figura 4 — Dendograma genético de fingesprintings de PFGE de 11 isolados vanApositivos de Enterococcus

143


à vancomicina (VRE) em carne de aves e de suínos. A maior taxa de detecçãode enterococos resistentes vanA em carne de aves também foi descrita por outrosautores (KLARE et al., 1995; WITTE et al., 1995). Em contraste com estes autores,não encontramos a cepa vanA-positiva em carne suína, apenas resistência de "baixonível" em amostras 20 (49%) deste alimento. Embora a avoparcina tenha sido proibidadurante este tempo, oVRE pode ser isolado da carne de aves da Alemanha.

Neste contexto, é interessante que a taxa de isolados de E. com alto nívelde resistência à vancomicina de carne de aves da Holanda (não há proibição àavorparcina) seja 8% maior que na Alemanha. Como cepas de E. faecium e E. faecalissobrevivem a 60oC por 30 min, suspeita-se que também a carne aquecida seja umafonte potencial de microorganismos resistentes á vancomicina.

Os resultados de nossas pesquisas com o método de fingerprinting DNA debase molecular para a diferenciação intra speciem e inter speciem usando a técnicarápida e reproduzível de PFGE separam claramente o VRE da carne de aves dosisolados humanos. Outros autores também usaram PFGE para as mesmas pesquisas,comparando isolados humanos de cepas de animais. Encontraram padrões defragmentos praticamente idênticos (KLARE et al., 1995; WITTE et al., 1995). Aquestão da identificação por clonagem deve ser discutida com cuidado, porqueos isolados pesquisados demonstraram padrões de fragmentos similares, mas nãoidênticos (KLUYTMANS et al., 1995).

Além disso, detectamos diferentes perfis de PFGE em cepas de E., dependendode sua origem. Os perfis de PFGE de carne de aves da Holanda eram diferentesdos da Alemanha. Há evidência do aumento de cepas endêmicas. São necessáriasmais pesquisas para fazer comentários conclusivos. Deve-se manter em mente que osexperimentos in vitro demonstraram que o gene de resistência vanA, localizado em umtransposon em um plasmídeo conjugado (NOBLE et al., 1992), pode ser transferidoao Staphylococcus aureus e outros microorganismos. De acordo com isso, as futurasinvestigações devem se concentrar também na detecção do Staphylococcus aureusresistente à vancomicina em alimentos de origem animal.

Como a avoparcina não é usada nos EUA e os enterococos resistentes àvancomicina se tornaram patógenos hospitalares importantes, pode-se suspeitar queo desenvolvimento de resistência cruzada à vancomicina e à teicoplanina é causadapreponderantemente por uma má utilização destes glicopeptídeos em hospitais.

5 Conclusões

1. O ágar Columbia CNA, suplementado com 5% de sangue ovino e 5mg devancomicina/l, é adequado para detectar presumíveis Enterococcus resistentes àvancomicina (VRE) em carne de aves e de suínos, incluindo as cepas vanA-negativas.

2. VRE são encontrados regularmente em carne de aves. Caracterizam-se porterem o gene resistência de "alto nível" vanA e o gene resistência de "baixo nível"vanC.

3. Os VRE de "baixo nível" são encontrados regularmente em carne suína.Caracterizam-se por terem gene resistência de "baixo nível" vanC.

4. A eletroforese em gel em campo pulsátil (PFGE) é um método preciso ereproduzível para a diferenciação intra e inter speciem de enterococos. Os resultados

144


da PFGE podem ser analisados pelo software Gel Compar 4.0 de forma rápida eprecisa.

5. Os resultados de fingerprinting de DNA por meio PFGE não indicam umarelação genética próxima entre isolados de alimentos de origem animal e os isoladoshumanos.

6 Referências Bibliográficas

ARTHUR, M., COURVALIN, P., 1993. Genetics and mechanism of glycopeptideresistanceenterococci, Antimicrob. Agents Chemother. 37, 1563-1571.

CLARK, N., TEIXEIRA, L., FACKLAM, R., TENOVER, F., 1998. Detection anddifferentiation of vanC1, vanC2 and vanC3 glycopeptide resistance genes inenterococci, J. Clin. Microbiol. 36, 2294-2297.

COURVALIN, P., 1999. Personal information.EISENACH, K., 1992. Chromosomal restriction fragment analysis by pulsed field

gel electro- phoresis, In: Isenberg, H., (Ed.). Clinical Microbiology ProceduresHandbook. 10.5.c.1- 10.5.c.11.

FINES, M., PERICHON, B., REYNOLDS, P., SAHM, D., COURVALIN, P., 1999. vanE,a new type of acquired glycopeptide resistance in Enterococcus faecalis BM 4405,Antimicrob. Agents Chemother. 43, 2161-2164.

FRAIMOW, H., JUNGKIND, D., LANDER, D., DELSO, D., DEAN, J., 1994. Urinarytract infection with an Enterococcus faecalis isolate that requires vancomycin forgrowth, Ann. Intern. Med. 121, 22-26.

GREEN, M., WADOWSKI, R., BARBADORA, K., 1990. Recovery of vancomycin-resistant gram-positive cocci from children, J. Clin. Microbiol. 28, 484-488.

KLARE, I., HEIER, H., CLAUS, H., REISSBRODT, R., WITTE W., 1995. vanA-mediated high-level glycopeptide resistance in Enterococcus faecium from animalhusbandry, FEMS Microbiol. Lett. 125, 165-172.

KLARE, I., WITTE, W., 1997. Glykopeptidresistente Enterokokken. Zur Situation inDeutschland, Hyg. u. Mikrobiol. 2, 31-38.

KLUYTMANS, J., van LEEUWEN, W., GOESSENS, W., HOLLIS, R., MESSER, S.,HERWALDT, L., BRUINING, H., HECK, M., ROST, J., van LEEUWEN, N., vanBELKUM, A., VERBRUGH, H., 1995. Food- initiated outbreak of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus analyzed by pheno- and genotyping, J. Clin.Microbiol. 33, 1121-1128.

LEMCKE, R., BÜLTE, M., 2000. Occurrence of the vancomycin-resistant genes vanA,vanB, vanC1, vanC2 and vanC3 in Enterococcus strains isolated from poultry andpork. Int. J. Food Microbiol. 60, 185-194.

NOBLE, W., VIRANI, Z., CREE, R., 1992. Co-transfer of vancomycin resistancegenes from Enterococcus faecalis NCTC 12201 to Staphylococcus aureus, FEMS.Microbiol. Lett. 93, 195-198.

PERICHON, B., REYNOLDS, P., COURVALIN, P., 1997. vanD-type glycopeptide-resistant Enterococcus faecium BM4339, Antimicrob. Agents chemother. 41,2016-2018.

QUINTILIANI, R., EVERS, S., COURVALIN, P., 1992. The vanB gene confers variouslevels of self-transferable resistance to vancomycin in enterococci, J. Inf. Dis. 167,1220-1223.

SATAKE, S., CLARK, N., RIMLAND, D., NOLTE, F., TENOVER, F., 1997. Detectionof vancomycin resistant enterococci in faecal samples by PCR, J. Clin. Microbiol.35, 2325-2330.

WITTE, W., KLARE, I., 1995. Glycopeptide resistant Enterococcus faecium outsidehospitals, A commentary, Microb. Drug. Res. 1, 259-263.

WOODFORD, N., JOHNSON, A., MORRISON, D., SPELLER, D., 1995. Currentperspectives on glycopeptide resistance, Clin. Microbiol. Rev. 8, 585-615.

145

OCORRÊNCIA DE GENES RESISTENTES À VANCOMICINA C1, C3 …€¦ · 2a Conferência Internacional...

Documents

Transcript of OCORRÊNCIA DE GENES RESISTENTES À VANCOMICINA C1, C3 …€¦ · 2a Conferência Internacional...