OIV-OENO 414-2011

Beglaubigte Ausfhrung Porto, den 24. Juni 2011

Der Generaldirektor der OIV Sekretr der Generalversammlung

Federico CASTELLUCCI

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RESOLUTION OIV-OENO 414-2011

QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER HEFEN BRETTANOMYCES BRUXELLENSIS MITTELS RTq-PCR (QUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR)

DIE GENERALVERSAMMLUNG,

in Anbetracht von Artikel 2 Absatz 2 Ziffer iv des bereinkommens vom 3. April 2001 zur Grndung der Internationalen Organisation fr Rebe und Wein, nach Kenntnisnahme der Arbeiten der Sachverstndigengruppe Mikrobiologie und der Unterkommission Analysemethoden, auf Vorschlag der Sachverstndigengruppe Mikrobiologie und der Unterkommission Analysemethoden,

BESCHLIESST, auf Vorschlag der Kommission nologie folgende Methode Typ IV Methode in Abschnitt 4 der Sammlung internationaler Analysemethoden fr Wein und Most einzufgen:

Quantitative Bestimmung von Brettanomyces bruxellensis Hefen mittels RTq-PCR

Typ IV Methode Warnhinweise Phenol: Alle Stufen der Handhabung von Phenol sind unter der Abzugshaube und mit Handschuhen auszufhren. Mit Phenol kontaminierte Rckstnde sind in geeigneten Behltern aufzufangen. SYBR Green: die Mutagenitt von SYBR Green ist nicht gleich null, jedoch wesentlich geringer als die von Ethidiumbromid. Vorsichtsmanahmen sind dennoch zu bercksichtigen. 1. Anwendungsbereich Die beschriebene Methode dient der quantitativen Bestimmung von Brettanomyces bruxellensis Hefen in Fassweinen oder in Flaschenweinen mittels quantitativer Echtzeit Polymerase-Kettenreaktion (RTq-PCR). Die Analyse von Weinen whrend der alkoholischen Grung und von Mosten ist bisher nicht validiert.

2. Definition Bei den mit dieser Methode quantitativ bestimmten Mikroorganismen handelt es sich um Brettanomyces bruxellensis-Hefen, die eine Kopie des Zielgens besitzen.




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3. Prinzip Das Prinzip besteht darin, einen durch zwei Primer flankierten Zielabschnitt der DNA (Desoxyribonukleinsure) durch eine wiederholte, enzymatische Reaktion zu amplifizieren. Das Verfahren erfordert die Aneinanderreihung zahlreicher Zyklen mit drei Etappen:

- DNA-Denaturierung durch Hitze - Hybridisierung der Primer - Polymerisierung mittels Taq- (Thermophilus aquaticus) Polymerase

Anders als die klassische PCR ermglicht die RTq-PCR dank der Verwendung eines Fluorophors die Quantifizierung der amplifizierten DNA.

Bisher sind zwei artspezifische Regionen als Zielsequenzen verwendet worden. Es handelt sich um das fr rRNA (ribosomale Ribonukleinsure) codierende Gen 26S und um das Gen RAD4 [2, 3]. Wie bei der FISH-Methode handelt es sich somit um eine spezifische, jedoch weitaus wirtschaftlichere Technik fr den Nachweis von Brettanomyces bruxellensis.

Die Besonderheit der RTq-PCR liegt in der Messung der Fluoreszenz bei jedem Amplifizierungszyklus, die mit der Amplifizierung der DNA exponentiell zunimmt. Zahlreiche Fluoreszenztechniken sind fr diese Anwendung entwickelt worden. Vorliegend wird das Fluorophor SYBR Green verwendet.

Fluorophor SYBR Green Die Substanz fluoresziert stark, whrend sie sich auf nicht spezifische Weise zwischen den Nucleotiden in der Doppelstrang-DNA einfgt. Im freien Zustand weist sie dagegen nur eine schwache Fluoreszenz auf. Dank dieser Technologie kann nach Abschluss der Amplifizierung eine Schmelzkurve erzeugt werden, um die Spezifizitt der Reaktion zu besttigen.

Interne Prfung Zur berprfung der DNA-Extraktion und - der Amplifizierungsschritte wird ein interner Standard bei der Methode mitgefhrt (Lip4,Yarrowia lipolytica).

4. Reagenzien und Produkte Alle Verbrauchsmaterialien aus Kunststoff mssen vor der Untersuchung zur Zerstrung der DNAsen (Desoxyribonukleasen) autoklaviert werden ebenso wie die Pufferlsungen Tris-HCl, TE (Tris EDTA, Ethylendiamintetraessigsure), Ammoniumacetat und ultrareines Wasser (18 M). Alle wssrigen Lsungen werden mit ultrareinem -Wasser (18 M) hergestellt. Einige Lsungen werden im Autoklav sterilisiert (durch die Bezeichnung autoklaviert gekennzeichnet). Fr die Herstellung von Lsungen, die nicht autoklaviert werden, wird vorzugsweise steriles ,ultrareines Wasser (18 M) benutzt. Das Arbeiten unter sterilen Bedingungen ist danach nicht erforderlich.

PVPP (z.B. ISP Polyclar Super R oder Sigma P6755-100G), Lsungen bei Raumtemperatur: Puffer Tris-HCl 10 mM pH 8, Lsung I (Tris-

HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, SDS 1 % (Natriumdodecylsulfat), Triton X-100 2 %), TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) autoklaviert, Ammoniumacetat 4M, Ethanol absolut,




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Sterilisiertes, ultrareines Wasser (18 M) (20 ml) fr jede RTq-PCR-Platte autoklavieren,

Lsungen bei 4 C : gesttigtes Phenol pH 8: Chloroform: IAA (Isoamylalkohol:24:25:1) und RNase (Ribonuklease) 1 g/L

Suspension bei -20 C: interne Kontrolle, SYBR Green (z.B. Mix iQ SYBR Green supermix, Bio-rad 170-8884), Primer 4 M Brett rad3, Brett rad4, YAL-F und YAL-R.

Wasserbad bei 37 C Alle Stufen der Handhabung von Phenol mssen unter der Abzugshaube und mit Handschuhen ausgefhrt werden. Mit Phenol kontaminierte Rckstnde mssen in geeigneten Behltern aufgefangen werden.

ChemikalienRTq- PCR Hersteller CAS-Nr. 4.1 Ammoniumacetat 98% 631-61-8

4.2 Phenol: Chloroform: IAA 24:25:1 Ultra 136112-00-0

4.3 Proteinase K 1215U/mg Proteine

(16,6 ng/mL) 39450-01-6

4.4 SDS 99% Ultra 151-21-3

4.5 Tris Base 99,8% Ultra 77-86-1

4.6 BSA MB Grade Molecular biology

grade 9048-46-8

4.7 Gesttigtes Phenol pH 8 108-95-2

4.8 PVP 360 kDa 9003-39-8

4.9 RNase A 70 U/mg in Lsung 9001-99-4

4.10 TE pH 8

ultra Tris : 77-86-1

EDTA : 60-00-4

4.11 Primer 25 nmol -

5. Gerte

Kunststoff-Verbrauchsartikel: Mikro-Schraubrhrchen, 2 ml, Mikrorhrchen 1,5 und 1,7 ml, Pipettenspitzen wei (10 L), gelb (200 L) und blau (1000 L) fr Mikropipetten P20, P200, P1000, P5000, 96 Well PCR-Microplatten, optische Folie, ungepuderte Handschuhe

Glasperlen ( 500 m)




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Flasche (20 ml) autoklaviert (fr sterilisiertes, ultrareines Wasser [18 M] fr jede RTq-PCR-Platte)

Zentrifugenrhrchen 15 und 50 ml. Gerte:

automatische Pipetten (P20, P200, P1000, P5000) Zentrifuge fr Mikrorhrchen automatisches Schttelgert zur Zerstrung der Zellen (z.B. GnieDisruptor) Thermocycler mit Spektrofluometer gekuppelt (optisches Nachweissystem der bei den real-time PCR-Reaktionen erzeugten Fluoreszenz) Magnetrhrer Stoppuhr Trockenbad, 37 C Autoklav Messbecher 100 ml Messbecher 50 ml Messbecher 10 ml Becherglser 100 ml Becherglser 50 ml Becherglser 10 ml 1,7-ml-Mikrorhrchen Magnetrhrstbchen

6. Probenahme (Probenvorbereitung)

6.1 Auszhlung der Proben: Die Proben werden entweder direkt den zu analysierenden Flaschen oder den zuvor sterilisierten Entnahmeflaschen entnommen. Mit den getesteten Hefen (darunter K1 und L2056) wurde keine Strung der Methode festgestellt, wenn die Hefepopulationen kleiner oder gleich 5106 UFC/ml (Kolonien bildende Einheiten) ist. Darber hinaus keine Angaben, somit sollten Messungen whrend der alkoholischen Grung von Weinen vermieden werden.

NB: Erfolgt die Auszhlung der Hefen anhand klassischer mikrobiologischer Analysemethoden (Wachstum in agarnutritivem Milieu, optische Dichte), werden die Ergebnisse in UFC/mL (Kolonien bildende Einheiten) ausgedrckt. Wird die Auszhlung hingegen mit qPCR-Analyse durchgefhrt, sind die Ergebnisse in UG/mL (genetische Einheiten) angegeben.

6.2 Herstellung des internen Standards Yarrowia-Kultur in Flssig-YPD (Hefe-Dextrose-Pepton) bei 28 C bis zu einer E600 (Extinktion bei 600 nm) von 1 (etwa 48 Std.) anzchten.

Nach Bestimmung der E600nm eine Lsung von 1,0106 UFC/ml in physiologischer Lsung Kochsalzlsung (E = 1 E ^= 1,0107 UFC/ml) herstellen. (CFU = Kolonie bildende Einheit)

110 L der Kultur von 1,0106 UFC/ml in ein 1,7 ml-Mikrorhrchen pipettieren und 110 L 40 %iges Glycerol hinzugeben, um eine Population von 5,0105 UFC/ml zu erhalten.




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Mischen und bei -80 C aufbewahren. Der Inhalt eines Rhrchens reicht fr 5 Weinproben.

Eine parallele Zhlung durchfhren, um den Titer der Suspension zu prfen.

6.3 Herstellung der Lsungen

100 ml Tris-HCl pH 8 10 mM: 0,121 g Tris-Base abwiegen (z.B. Trizma Base) und in 80 ml ultrareinem Wasser (18 M) auflsen. Den pH-Wert mit HCl einstellen. Das Volumen auf 100 ml auffllen. Autoklavieren.

100 ml TE: 0,121 g Tris-Base wiegen und in 80 ml Wasser lsen. Den pH-Wert mit HCl einstellen. 37,2 mg EDTA hinzugeben. Den pH-Wert auf 8 einstellen (zur Auflsung von EDTA), dann auf 100 ml auffllen. Autoklavieren.

100 ml Lsung I: 50 ml TE 2x zubereiten und 10 ml NACl 1M , 10 ml SDS 10 % (unter leichter Erwrmung lsen) und 2 g Triton X100 hinzugeben, auf 100 ml auffllen.

Ammoniumacetat 4M: 15,4 g Ammoniumacetat qsp (ausreichende Menge fr) 50 ml in ultrareinem Wasser (18 M) auflsen.

100 ml Phenol / Chloroform / IAA (25 :24 :1) : ausgehend von 50 ml gesttigtem Phenol mit Puffer TE pH 8 48 ml Chloroform und 2 ml Isoamylalkohol hinzugeben. Bei 4 C aufbewahren.

RNAse A 1g/L: die RNase A 70 U/mg mit ultrareinem Wasser (18 M) zu einer Lsung verdnnen (z.B. Sigma, R4642-50MG, bei -20 C aufbewahrt). Die Konzentration der gelagerten RNase ist auf dem Rhrchen und dem Spezifikationsblatt der Charge angegeben. Die verdnnte Lsung darf bei 4 C hchstens 3 Wochen aufbewahrt werden.

Brett-Primer 4 M: ausgehend von vorrtigen Primer-Lsungen (Lieferantenrhrchen) zu 100 M, eine Mischung von 4 M Brett rad3 (GTTCACACAATCCCCTCGATCAAC) und 4 M Brett rad4 (TGCCAACTGCCGAATGTTCTC) qs 1 ml mit ultrareinem Wasser (18 M)) herstellen. Kann 1 Jahr bei -20 C aufbewahrt werden.

YAL-Primer 4 M: ausgehend von vorrtigen Primer-Lsungen (Originalpackung des Herstellers) zu 100 M, eine Mischung von 4 M YAL-F (ACGCATCTGATCCCTACCAAGG) und 4 M YAL-R (CATCCTGTCGCTCTTCCAGGTT) qs 1 ml mit ultrareinem Wasser (18 M)) zubereiten. Aufbewahrung 1 Jahr bei -20 C.

7. Vorgehensweise Zu analysierende Probe: Das Reagenzglas oder die Flasche schtteln, um den Inhalt zu homogenisieren.

Verkorkte Flasche: Den Flaschenhals mit 70 %igem Alkohol desinfizieren und unter der Flamme mithilfe eines Korkenziehers, der mit 70 %igem Alkohol desinfiziert wurde, entkorken.

Eine Weinprobe von 15-20 ml in ein steriles 30 ml-Einweg-Reagenzglas aus Kunststoff umfllen.

Die Arbeitsschritte, bei denen die Untersuchung unterbrochen werden kann, sind durch * (maximale Unterbrechungsdauer, T) gekennzeichnet.




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7.1 Aufschluss der Zellen

Die nachfolgenden Schritte zweifach ansetzen

Die Handhabung muss unter einer fr mikrobiologische Sicherheit ausgelegten Vitrine ausgefhrt werden.

- 1 ml Wein in ein 2 ml-Schraub-Mikrorhrchen aufnehmen - 20 L interne Kontrolllsung mit 5,0105 UFC/ml hinzugeben - 30 s (Sekunden) lang bei 9300 g zentrifugieren - berstand durch vorsichtiges Wenden beseitigen - das Sediment in 1 ml Tris-HCl 10 mM ph 8 aufnehmen - 30 s lang bei 9300 g zentrifugieren und den berstand beseitigen - kurz auf dem Vortex schtteln, um das Sediment in der Restflssigkeit zu

suspendieren *(3 Monate, -20 C).

Ein Reagenzglas wird zur Extraktion der DNA verwendet, das andere wird bei -20 C bis zum Erhalten validierter Resultate aufbewahrt.

7.2 Extraktion der DNA

Ausgehend von frischem oder tiefgefrorenem Sediment. Es sollten nicht mehr als maximal 24 Proben parallel behandelt werden.

- PVPP hinzugeben (1 % Endanteil m/v) pro Wgung - 0,3 g Glasperlen 200-500 m hinzugeben - 200 L der Lsung I hinzugeben - 200 L Phenol :Chloroform :IAA (24 :25 :1) hinzugeben - mit dem automatischen Rttelgert (z.B. Genie Disruptor) 4x80s aufbrechen,

(- 20 C), etwa 80 s zwischen jeder Rttelphase khlen - 200 L TE hinzugeben - 5 min (Minuten) bei 15.700 g zentrifugieren - vorsichtig 400 L der oberen wssrigen Phase in ein 1,7-ml-Mikrorhrchen

aufnehmen. Sollen die beiden Phasen gemischt werden, die Zentrifugation wiederholen.

- 1 ml Ethanol absolut hinzugeben, Reagenzglas 4-5 Mal zum Vermischen drehen * (einige Stunden, Raum-T)

- 5 min lang bei 15.700 g zentrifugieren und den berstand durch Strzen beseitigen

- das Sediment in 400 L TE und 30 L RNAse zu 1 g/L wiederaufnehmen - die Lsung bei 37 C 5 min lang inkubieren (danach auf 48 C einstellen) - 10 L Ammoniumacetat 4M + 1 ml Ethanol absolut hinzugeben; durch Drehen

mischen - 5 min bei 15.700 g zentrifugieren - Den berstand abgieen, die letzten Tropfen mit Filterpapier abwischen. - das Sediment (offenes Reagenzglas im Trockenbad bei 48 C, etwa 1 Std.)

trocknen lassen




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- dem Sediment 25 L TE zugeben, auf dem Vortex schtteln und 1 bis 18 Std. bei 4 C ruhen lassen (frdert die Lslichkeit der DNA). Mit automatischem Rttelgert homogenisieren * (einige Wochen, -20 C)

7.3 RTq-PCR

Fr jede Weinprobe 2 Kavitten mit den Brett rad3/4-Primern und 2 interne Kontrollmulden mit den YAL-Primern vorsehen. Fr jede Platte als letzte Prfung fr jedes Primer-Paar eine Negativ-Kontrolle mit TE vorsehen. Ebenfalls eine Positiv-Kontrolle mit dem verfgbaren DNA von Brettanomyces bruxellensis bei -20 C vornehmen. Zur Vorbereitung der Positiv-Kontrolle gibt man 5L Basislsung (4,5 UG/ml) bis auf ein Reaktionsvolumen von 25 L.

Programm der PCR-Amplifizierung:

Anzahl der Zyklen

Zeit (trocken) Temperatur (C)

1 180 95 40 30 95

10 64,6 Die Fusionskurve wird ab 90C bestimmt, wobei die Temperatur alle 10 Sekunden um 0,5C verringert wird.

Anz. Brett-Kavitten = Anz. YAL-Kavitten = 2 x Anz. Proben + 2

In der untenstehenden Tabelle sind je nach Anzahl der Proben die Anzahl der Wells und die Menge jedes Bestandteils der Mischung angegeben.

Probennummer Nummer der

Kavitt Wasser 18 M (L)

iQ SYBR Green supermix (L)

Primer-Mischung 4 M (L)

1 4 26,3 65,6 13,1

2 6 36,8 91,9 18,4

3 8 47,3 118,1 23,6

4 10 57,8 144,4 28,9

5 12 68,3 170,6 34,1

6 14 78,8 196,9 39,4

7 16 89,3 223,1 44,6

8 18 99,8 249,4 49,9

9 20 110,3 275,6 55,1

10 22 120,8 301,9 60,4

11 24 131,3 328,1 65,6

12 26 141,8 354,4 70,9




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13 28 152,3 380,6 76,1

14 30 162,8 406,9 81,4

15 32 173,3 433,1 86,6

16 34 183,8 459,4 91,9

17 36 194,3 485,6 97,1

18 38 204,8 511,9 102,4

19 40 215,3 538,1 107,6

20 42 225,8 564,4 112,9

21 44 236,3 590,6 118,1

22 46 246,8 616,9 123,4

23 48 257,3 643,1 128,6

- Die Brett-Primer 4 M und die YAL-Primer 4 M aus dem Gefrierschrank nehmen. - SYBR Green herausnehmen (4 C bei verwendetem Reagenzglas, andernfalls -20

C). - Eine Brett-Mischung und eine YAL-Mischung gem der untenstehenden Tabelle je

nach Anzahl der Proben herstellen. - Auf den Boden jeder Kavitt 20 L der Mischung pipettieren. - 5 L der mit dem automatischen Rttelgert homogenisierten DNA-Lsung oder 5

L Wasser fr die negativen Kontrollen hinzugeben. - Die optische Folie einstellen und die Platte einladen.

7.4 Ergebnisablesung

- Die Platte herausnehmen und direkt in den Beutel fr die Entsorgung geben

(nicht ffnen) - Die Grundlinie auf 100 setzen - Der Reihe nach ausfhren:

o Negativ-Vergleichsproben, die kein Signal auslsen drfen. Wird ein Ct-Wert (Schwellenwert-Zyklus) < 37 beobachtet, muss der Vorgang wiederholt werden, wobei alle Lsungen zu ndern sind,

o positive Brettanomyces-Kontrolle: der Ct-Wert muss bei 25 liegen, bei einer Schmelztemperatur von 82,5 C ( 0,5 C),

o interne YAL-Kontrollen: Wenn ein Ct-Wert erhalten wird, die Schmelztemperatur (Tm) des Produkts prfen (84 C 0,5 C). Bei Nicht-Konformitt kann die Abwesenheit des Brettanomyces-Signals nicht interpretiert werden.

o Proben: Tm des Brettanomyces bruxellensis - Produkts prfen (82 C 0,5 C). Nur wenn Tm akzeptierbar ist, den exponentiellen Verlauf der Amplifizierung prfen. Dann die Ct-Werte ermitteln und auf der Eichgeraden eintragen.




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NB: Der Ct (engl. Cycle Threshold fr Schwellenwert-Zyklus) steht fr die Zeit, die die Fluoreszenz der Zielsequenz zur Erreichung eines Schwellenwertes bentigt. Es handelt sich somit um die minimale Anzahl der PCR-Zyklen, an dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant ber die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt..

8. Berechnung des Resultats 14 Weine (3 Weiweine, 2 Rosweine und 9 Rotweine), deren Gehalt an phenolischen Verbindungen stark variierte) wurden mit fnf Brettanomyces bruxellensis-Stmmen in Konzentrationen von 3,1105 bis 3 CFU/ml beimpft. Die DNA wurde anschlieend mit PVPP 1% extrahiert. Es wurde eine Eichgerade anhand aller Ergebnisse erstellt, die fr die verschiedenen Weine- und die Standards erzielt wurden. Die Resultate werden ausgehend von der Eichgeraden in UG/ml (genetische Einheit pro ml) ausgedrckt. Log UG = log (2,03)Ct + 12,34

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

Ct

logU

G

log (UG) = -log (2,03)*Ct + 12,3

I = 1,2logI > 1,2log

I > 1,2log

(Imax =1,6log)

9. Eigenschaften der Methode : laborinterne Validierungsparameter

9.1 Linearitt, Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit [4]

Die Sechspunkt-Eichkurve wurde im Bereich von 0 bis 2105 CFU (KBE)/ml des Stammes L0211 in Wein mit vier Wiederholungen vorbereitet. Dieser Populationsbereich wurde gem den blichen Brettanomyces bruxellensis -Konzentrationen in Wein gewhlt. Das Verhltnis zwischen dem gemessenen Wert von log GU zum theoretischen Wert von log GU wurde durch eine einfache Regressionsanalyse beschrieben. Die Regressionsparameter, die Steigung und das konstante Glied wurden, wie in nachfolgender Tabelle zusammengefasst, ermittelt. Das Regressionsmodell wurde mit

Standardkurve




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einem Irrtumsrisiko von =1% angenommen und der gewhlte Linearittsbereich validiert, da kein Modellfehler nachzuweisen war. Die Genauigkeit der Methode wurde mit der bei Anwendung der klassischen Zellkulturmethode erzielten Genauigkeit verglichen. Drei Laboranten bereiteten die aus einem Wein extrahierte DNA vor, der mit dem Stamm L0211 in zwei Konzentrationen (1,9104 KBE/ml (hoch) oder 1,9102 KBE/ml (niedrig)) beimpft wurde. Fr jeden DNA-Extrakt wurde die PCR viermal wiederholt. Die Standardabweichung der Wiederholbarkeit und der Reproduzierbarkeit, Sr und SR, wurden anhand der log GU Werte fr beide Konzentrationen berechnet (nachfolgende Tabelle). Bei Anwendung der RTq-PCR-Methode fielen die Werte fr Sr und SR im unteren Populationsbereich hnlich aus, bei einer hheren Population hingegen war SR grer als Sr. Beide Standardabweichungen waren doppelt so hoch wie die mit der klassischen mikrobiologischen Methode erzielten Werte. Dieser Effekt wurde der erhhten Anzahl an Arbeitsschritten bei der RTq-PCR-Methode zugeschrieben. Tabelle Validierungsparameter fr die qPCR-Methode zur Auszhlung von Brettanomyces in Wein Parameter Werte Regressionsgleichung Bereich (KBE/mL) 0-2105 Steigung (SD) 0,957 (0,044) Konstantes Glied (SD) -0,049 (0,142) Regressionsmodell Fobs > F (1,18): lineares Modell akzeptiert Modellfehler Fobs < F (4,18): kein Modellfehler Genauigkeit Sr RTq-PCR (niedrig/hoch) 0,26/0,25 Sr microbio (niedrig/hoch) 0,17/0,04 SR RTq-PCR (niedrig/hoch) 0,29/0,41 SR microbio (niedrig/hoch) 0,17/0,04 Richtigkeit Mittelwert 43 Proben (D) 2,39 (qPCR)/2,25 (microbio) SR D 1,18 bereinstimmungstest W=D/SR D 0,11 < 3 annehmbare Richtigkeit




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9.2 Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen (LD und LQ) [4]

LD und LQ geben die Empfindlichkeit der Methode an. LD ist die niedrigste Population, die von der Methode nachgewiesen werden kann; LQ ist die niedrigste Population, die przise quantifiziert werden kann. Bei der Lebensmittelanalyse werden diese Parameter ber das Hintergrundrauschen berechnet. Bei der RTq-PCR-Methode ist jedoch kein Rauschen vorhanden. Deshalb haben wir andere Anstze fr die Abschtzung der Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen gewhlt. Die erste Methode sttzt sich auf die Steigung, das konstante Glied und den Standardfehler des konstanten Glieds, die von Versuchen zur Linearittsvalidierung geliefert werden. Mit dieser Methode wurden die Werte fr LD und LQ mit 3 und 31 GU/ml bestimmt. In einem zweiten Ansatz wurde LD anhand der Populationsgre ermittelt, wobei bei 10 unabhngigen Messungen ein negatives Ergebnis erzielt wurde. Die Analyse unserer Datenerhebung an 14 mit 5 Stmmen beimpften Weinen zeigte, dass 96% der Proben (48/50) mit einer Konzentration von 101 bis 250 KBE/ml positive Signale ergaben, wohingegen 83% (49/59) positiv ausfielen, wenn die Konzentration im Bereich von 26 bis 100 KBE/ml lag und 65% (44/68) bei einer Konzentration im Bereich von 5 bis 25 KBE/ml. Die anhand dieser Methode abgeschtzte Nachweisgrenze wrde demnach im Bereich von 26 bis 100 KBE/ml liegen. Durch die systematische Wiederholung der einzelnen PCR-Untersuchungen wurde anhand der Wahrscheinlichkeitsberechnung (1-p)2 ein LD von 5 KBE/ml besttigt. Bei 5 KBE/ml ergaben 88% der Proben ein positives Ergebnis. Dieser Wert stieg bei 25 KBE/ml auf 97%.

10. Literatur 1. Phister T.G., Mills D.A., 2003. Real-time PCR assay for detection and enumeration of

Dekkera bruxellensis in wine. Applied and Environmental Microbiology, 69: 7430-7434.

2. Cocolin L., Rantsiou K., Iacumin L., Zironi R., Comi G., 2003. Molecular detection and identification of Brettanomyces/Dekkera bruxellensis Brettanomyces/Dekkera anomalus in spoiled wines. Applied and Environmental Microbiology, 70: 1347-1355.

3. Ibeas J.I., Lozano I., Perdigones F., Jimenez J., 1996. Detection of Dekkera-Brettanomyces strains in sherry by a nested PCR method. Applied and Environmental Microbiology, 62: 998-1003.

4. Tessonnire H., Vidal S., Barnavon L., Alexandre H., Remize F., 2008. Design and performance testing of a real-time PCR assay for sensitive and reliable direct quantification of Brettanomyces in wine. International Journal of Food Microbiology, 129: 237-243.

CAS-Nr.HerstellerChemikalienRTq- PCRAnz. Brett-Kavitten = Anz. YAL-Kavitten = 2 x Anz. Proben + 2

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