Dünnschichtchromatographie

Dr. Johanna Liebl

PB III/Seminar DC

Chromatographie - Prinzip

physikalisch-chemische Trennmethoden

Prinzip: Verteilung von Substanzen zwischen einer ruhenden (stationären) und einer sich an dieser vorbei-bewegenden (mobilen) Phase.

diese Phasen sind nicht miteinander mischbar

Trennmechanismen:- Adsorption- Verteilung- Siebwirkung - Ionenaustausch- Bioaffinität

Dünnschichtchromatographie (DC)

Def.: Trennung von Vielstoffgemischen mit Hilfe einer festenstationären Dünnschichtphase, an der eine flüssige mobilePhase vorbeigeführt wird.

inneres Chromatogramm

Trennung beruht auf den phys.-chem. Vorgängen der:• Adsorption (Feststoff als stationäre Phase) und• Verteilung (Flüssigkeit als stationäre Phase)

Bei der Trennung an Kieselgel mit unpolarenFließmitteln überwiegt die Adsorption.

Konkurrenz der Probenmoleküle mit der mobilen Phase um die Besetzung der aktiven Stellen der stationären Phase.

Mögl. Wechselwirkungen zwischen den Phasen (Bsp.)

- Wasserstoffbrückenbindungen- Dipol-Dipol-Wechselwirkungen- van der Waals`sche Kräfte

Adsorption

Anreicherung eines gelösten Stoffes an der Oberfläche eines Feststoffes.

reversibel, Desorption

Cs = Konzentration von Stoff X in der stationären PhaseCm = Konzentration von Stoff X in der mobilen PhaseCoo = Sättigungskonzentration der stationären Phase

Adsorptionsisotherme(T = const.)

Adsorption

Verteilungskoeffizient:

CsK =

Cm

gilt nur für die jeweiligeSorbens/Fließmittel Kombination!!

Je größer die Unterschiede zwischen den Adsorptions-, bzw. Verteilungskoeffizienten der Substanzen sind, desto besser lassen sie sich trennen!

Adsorptionsisotherme

• Aluminiumoxid• Cellulose• Polyamid

• Kieselgel

chemisch modifiziertes (silanisiertes) Kieselgel (Reversed Phase DC)

Si

R

R

R

OH + Si

Cl CH3

CH3Cl

2Si

Si

O

O

Si

CH3

CH3

-HCl

OSi

OSi

O

OH

OH

N

R

R

H

Sorbentien

Sorbentien werden auf einen Träger (z.B. Alufolie, Glasplatte) aufgetragenSchichtdicke zwischen 0,2 mm (analytische DC) und 1-2 mm (präparative DC)

Wichtiges Kriterium für die Trennleistung

Menge der angelagerten Substanzen und Festigkeit der Bindungsind abhängig von der Stärke und der Zahl der aktiven Zentren

Höhere AktivitätStärkeres Rückhaltevermögen

Geringere Laufstrecken

Verringerung der Zahl der aktiven Zentren durch Desaktivatoren,z.B. durch H2O (Luftfeuchtigkeit)

Kennzeichnung von Kieselgel-Fertigplatten

G: 13% Gipszusatz H: ohne BindemittelF254: Zusatz eines Fluoreszenzindikators

Zahl vor G oder H: Porendurchmesser in Angström (meist 60)

Aktivität eines Sorbens

Verschiedene Fließmittel führen bei derselben Substanz zu unterschiedlichen Laufstrecken.Bsp: Die Laufstrecke polarer Substanzen auf polaren Sorbentien

nimmt mit steigender Polarität des Fließmittels zu.

Die Eluotrope Reihe:Empirische Ermittlung der Elutionskraft verschiedener Fließmittel für ein bestimmtes Sorbens.

Die Elutionskraft kann auchals Zahlenwert (E0) angegeben werden. Pentan ist dabei Bezugspunkt (Eo= 0)

Bsp: Chloroform Eo = 0,4Methanol Eo = 0,95

Fließmittel

Höhere Trennschärfe durch „Einstellen“ der Elutionskraft, bzw. des Verteilungskoeffizienten

Es kann beim Aufsteigen zur Adsorption einzelner Bestandteiledes Fließmittels an das Sorbens kommen:

Veränderung der Zusammensetzung der mobilen Phase während des chromatographischen ProzessesBei vollständiger Adsorption einerKomponente Ausbildung einer „ß-Front“Substanzen reichern sich oft alscharakteristische bandförmige Fleckeim Bereich der ß-Front an.

Die Wahl des richtigen Fließmittels ist Erfahrungssache odermuss durch „ausprobieren“ ermittelt werden !

Fließmittelgemische

Kammersättigung:Sättigung des Kammerraumes oberhalb der Flüssigkeit mit Lösungs-mitteldämpfen

Folge:

Gleichgewicht zwischen den Lösungsmitteldämpfen und der mobilen Phase auf der Platte während der Entwicklung.

Erhöhung der Fließgeschwindigkeit durch Vorbeladen der Schicht mit Fließmittel

bessere Reproduzierbarkeit der Trennergebnisse

Kammersättigung

Bei Verzicht auf Kammersättigung verdampft während der Trennung v.a. im Bereich der Laufmittelfront ständig Fließmittel von der Platte

Es wird mehr Laufmittel für eine bestimmte Strecke benötigt.

Die Laufstrecken für die einzelnen Substanzen werden länger.

Fließmittelgemische leichter flüchtige Komponenten verdampfen schneller veränderte Zusammensetzung der mobilen Phase

a) Detektion farbiger Substanzen bei Tageslicht

b) UV- Licht 365 nm -> Eigenfluoreszenz

Flavonoide: je nach Struktur gelbe, grüne oder blaue Fluoreszenz

c) UV- Licht 254 nm -> Fluoreszenzlöschung auf F 254 – Platten

Flavonoide

d) Sprühreagenzienuniversellspezifisch, z.B. Vanilin-Schwefelsäure, Dragendorffs Reagens

Detektion

Rf =Abstand Substanzfleck-Startlinie

Abstand Fließmittelfront-Startlinie

Rf-Werte abhängig von äußeren Bedingungen, z.B.:

- Aktivität des Sorbens- Rel. Luftfeuchtigkeit- Temperatur- Kammersättigung

Verwendung von Vergleichssubstanzen

Auswertung über Rf-Wert

20 cm

20 c

mVorbereitung der DC Platte

20 cm

20 c

m

10 cm

10 c

m

Platte sinnvoll einteilen!

Vorbereitung der DC Platte

Abstand halten!

1,5 cm

Vorbereitung der DC Platte

Vorbereitung der DC Platte

Proben bandenförmig auftragen

stationäre Phase nicht beschädigen

Trocknen lassen

Vorbereitung der DC Platte

KEIN Filterpapier!

Auftragebereich nicht in Fließmittel eintauchen!

Kammer nicht öffnen!

Fließmittel nicht aufheben!

Entwicklung

Platte nicht tropfnass sprühen oder zu heiß fönen!

Detektion

Viel Erfolg im Praktikum!