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Polymerase chain reaction法 を用 い た 患 者 検 体 か らのAspergillus

fumigatus rDNA検 出 に よ る肺 ア スペ ル ギ ル ス 症 の 診 断

天理ようつ相談所医学研究所,*同 臨床病理部

大 峠 和 彦 宮 西 節子 相 原 雅典*松 尾 収二*

(平成8年11月8日 受付)

(平成9年3月6日 受理)

Key words : aspergillosis, Aspergillus fumigatus, PCR

要 旨

Aspergillus fumigatusに 特 異的 な26S rDNA/intergenic spacer領 域 の塩 基配 列 か ら設 定 した プライ

マー を用 い,polymerase chain reaction(PCR)法 に よるアスペ ル ギル ス症 の診 断 を試 みた.

PCR法 の基 礎実 験 で は最 少検 出感 度 は1pgで あ り,A.fumigatusの み を特 異 的 に増 幅 した.

本 法 の臨床 的意 義 を検 討 す る 目的 で,肺 アスペ ルギル ス症13症 例(18検 体)お よび非 アスペ ル ギル ス

症24症 例(36検 体)を 対象 として培 養法,ア スペ ルギ ルス抗 原 お よび抗体検 査 の成績 と比 較検 討 した.

その結果,肺 ア スペ ルギ ルス症13症 例 中8例 がPCR法 陽性 とな り,培 養 法陽性(A.fumigatus)6症 例,

抗 原陽 性2症 例 お よび抗 体 陽性6症 例 に比 べ高 い診 断 感度 を示 した.ア スペ ル ギル ス症 で あ りな が ら

PCR法 陰性 とな った5症 例 の内訳 は,2例 がA.fumigatus以 外 の アスペ ル ギル ス症,2例 が抗 体 の み陽

性,残 り1例 が抗 原 陽性 で あった.

非 ア スペ ル ギル ス症24症 例 中PCR法 陽性 とな った の は2症 例 で あ り,そ の 内訳 は1例 が 培 養 でA.

fumigatusが 検 出 され た誰 気管 支 炎例,他 の1例 が大葉 性肺 炎例 で あ った.本 法 はA.fumigatus症 を

特 異 的 に診 断 し,培 養法,抗 原 お よび抗体検 査 との成 績 の比較 におい て も有 用性 が確 か め られ た.

序 文

アスペルギルス症 は深在性真菌症のうちカンジ

ダ症に次いで多 く,主 にA.fumigatusに より惹起

され,罹 患臓器の大部分が呼吸器系 という特徴を

有する1).近 年カンジダ症が減少傾向にあるにも

かかわ らずアスペルギルス症は増加傾向にあり,

重篤例が多 く注目されている1).ア スペルギルス

症の診断法 としては,培 養法,抗 原および抗体検

査な どが用いられているが,い ずれ も満足できる

診断感度 はなく,感 度 ・特異性 に優れた診断法の

開発が求められている.

PCR法 はSpreadburyら2)3)がA.fumigatusの

検 出成績 を報告 して以来,新 しい診断法 として注

目 を集 め て い る4)～9).われ わ れ は,Spreadburyら

の 方 法 に 準 じ,PCR法 に よ る ア ス ペ ル ギ ル ス

DNA検 出 の検 討 を行 う と と も に,本 法 の診 断 に

お け る有 用性 に つ い て評 価 した.

材 料 お よ び方 法

1. 使 用 菌 株

PCR法 の特 異 性 を確 認 す るた め に,Table1に

示 し た ご と くA.fumigatusTH941001(AT-

CC1022)を は じ め とす るAspergillus属4菌 種8

菌 株,Penicillium属,Mucor属,Candida属,

Cryptococcus属 よ り各1菌 種1株,そ の 他7菌 属

7菌 種 の細 菌 とCytomegalovirus(Towne株)を

用 い た.

2.対 象 と した 臨 床 材 料

臨 床 材 料 は,1993年10月 よ り1995年2月 の17カ

月 間 に,画 像 上 明 瞭 な 菌 球 像 あ るい は浸 潤 影 像 を

別刷請求先:(〒632)奈 良県天理市三島町200

天理 ようつ相談所医学研究所

大峠 和彦

平成9年6月20日

508 大峠 和彦 他

Table 1 Microrganisms used in this studies

*:DNA was a kind gift from Claire Spreadbury, Birmingham Unibversity Medical

School

呈 し,臨 床 医 が ア スペ ル ギ ル ス 症 と診 断 した13症

例(18検 体).こ の う ち5症 例 は病 理 組 織 学 的 に診

断 され た.ま た,非 ア ス ペ ル ギ ル ス症 は24症 例(36

検 体)を 用 い た.材 料 の 内訳 は喀 痰28,気 管 支 洗

浄 液(BALF)9,胸 水7,切 除 肺 組 織4,そ の 他

6検 体 で あ っ た.

3. DNA抽 出

試 料 を トリス緩 衝 液(10mM Tris-HCl pH7.5,

0.1M NaCl,1mM EDTA)に て 洗 浄 し,沈 渣 を

液 体 窒 素 に10秒 間 浸 し て凍 結,ガ ラ ス ビー ズ を加

え,30秒 間 ミキ サ ー に て混 和 した.再 度,凍 結 融

解 し,0.3～1mlの 抽 出用 緩 衝 液(10mM Tris-HCl

pH8.0,1mM EDTA,1%Triton X-100)と100

μgの プ ロ テ ナ ー ゼーKを 加 え65℃2時 間 消 化 を行

い,フ ェ ノ ー ル 抽 出 した.な お,A.fumrgatusの

DNAは 当 院 で 抽 出 した も の の 他 にSpreadbury

よ り分 与 を受 け た もの も使 用 した.

4. PCRの 条 件

プ ラ イ マ ー はSpreadburyら が デ ザ イ ン し た

A.fumigatusの26S rDNA/intergenic spacer領

域 を特 異 的 に増 幅 す るた めAf1お よ びAf2を 用 い

た2)3).PCR反 応 液 は,10mM Tris-HCl pH9.0,

50mM KCl,0.1%Triton X-100,1.5mM MgCl2,

dNTP各200μM,1μM各 プ ラ イ マ ー,15%(vol/

vol)グ リセ ロ ー ル,1.25U/tube Taqポ リメ ラ ー

ゼ(TOYOBO),お よ びDNAを 加 え蒸 留 水 にて

50μlに 調 整 した.サ ー マ ル サ イ ク ラー は ジ ー ン ア

ン プPCR system9600-R(Roche)を 使 用 し,熱

変 性94℃40秒,ア ニ ー リン グ56℃1分20秒,伸 長

反 応72℃2分 を35回 と した.PCR産 物 は2%ア ガ

ロー ス ゲ ル に よ り電 気 泳 動 後,エ チ ジ ウ ム ブ ロマ

イ ド染 色 し401bpの 特 異 バ ン ドを検 出 した.

5. ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン

PCR産 物 を ナ イ ロ ン メ ンブ ラ ン(Gene Screen

Plus;DUPON)に サ ザ ン プ ロ ツテ ィ ン グ し,[α-32

P]dCTP標 識 イ ン タ ー ナ ル プ ロ ー ブ(181bp

intergenic spacerDNA断 片)を 用 い て42℃18時

間 ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン を行 っ た.オ ー トラ ジ

オ グ ラ フ ィー は-80℃ で4時 間 か ら1昼 夜 行 っ

た.

6. 免 疫 学 的 検 査

抗 原 検 査 は抗 ガ ラ ク トマ ンナ ン モ ノ ク ロ ー ナ ル

抗 体 感 作 ラ テ ッ クス 粒 子 を用 い た 凝 集 反 応 に よ る

PASTOREX ASPERGILLUS(R)(日 本 サ ノ

フ ィ),抗 体 検 査 は菌 体 成 分 抗 原 と培 養 濾 液 抗 原 を

用 い た オ ク テ ル ロ ニ ー 法 に よ るAspergillus

感染症学雑誌 第71巻 第6号

PCR法 を用いたアスペルギルス症の診 断 509

Immunodiffusion System(R)(Mercia diagnos-

tics)に て 行 っ た.

成 績

1. PCR法 の 感 度・ 特 異 性

Spreadburyが デ ザ イ ン し た プ ラ イ マ ー を 用 い

たPCR法 の 最 少 検 出DNA量 は,電 気 泳 動 で は1

pg,ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン で は100fgで あ り

(Fig.1),A.fumigatusに 特 異 的 と さ れ る401bp

Fig. 1 Sensitivity of the detection of diluted A. fumigatus DNA by PCR with

primers Af1 and Af2. Reaction products were analysed by gel electorophoresis

(A) and by Southern hybridization with 181-bp internal fragment (B).

Lanes : M ; size marker (ƒÓ •~ 174/Hae III digest), 1 to 6 ; ing, 100pg, 10pg, 1pg,

100fg, 10fg, respectively.

A B

Fig. 2 Specifity of the PCR. DNAs from various organisms used as targets.

Ethidium bromide-stained agarose gel (A) and Southern hybridization (B).

lanes : M ; size maker (ƒÓ•~174/Hae III digest), 1 ; A. fumigants (ATCC1022),

2 ; P. notatum, 3 ; A. focus, 4 ; A. niger, 5 ; A. terreus, 6 ; C. albicans, 7 ; C.

neoformans, 8 ; Mucor spp., 9 ; M. tuberculosis, 10 ; P. aeruginosa, 11 ; H.

influenzae, 12 ; E. coli, 13 ; Human, 14 ; A. fumigants (11237), 15 ; A. fumigates

(TH942001), 16 ; S. aureus, 17 ; E. faecalis, 18 ; S. pneumoniae, 19 ;

Cytomegalovirus, N ; no DNA (control).

A

B

平成9年6月20日

510 大峠 和彦 他

の 遺 伝 子 断 片 の み を増 幅 した.ま た イ ン タ ー ナ ル

プ ロ ー ブ を用 い たハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ンに お い

て もA.fumigatusに の み 特 異 的 にハ イ ブ リダ イ

ズ し,A.fumigatus以 外 のAspergillus属 を含 め

他 の 真 菌,細 菌 お よび ウ イル ス と は反 応 しな か っ

た(Fig.2).

2. 臨 床 材 料 の検 査 結 果

Table2にPCRお よび 従 来 法 に よ る検 査 結 果

を示 した.肺 ア スペ ル ギ ル ス症13症 例 中8症 例 が

PCR法 で 陽 性 を 示 し,こ れ を菌 球 形 成 型(6症 例)

と非 菌 球 形 成 型(7症 例)に 分 け る と,そ れ ぞ れ

4例 が 陽性 と な っ た.他 方,従 来 法 で は培 養 に よ

り6例,抗 原検 査 に よ り2例,抗 体 検 査 に よ り6

例 が 陽 性 を示 した.ま た,切 除 肺 を検 査 材 料 と し

た3例(症 例No.1,2,4,No.2は パ ラ フ ィ ン切

片)は 全例がPCR法 陽性であった.

肺 アスペルギルス症のうちPCR法 陰性 は菌球

形成型2例,非 菌球形成型3例 の合計5例 であっ

た.菌 球形成型2例 のうち1例(No.5)は 抗体陽

性,他 の1例(No.6)は 培養法陽性であり,非 菌

球形成型3例 中1例(No.13)は 抗体のみが陽性

で,2例(No.11,12)は 培養法にてそれぞれA.

flavus,A.nigerを 検出した.抗 体のみが陽性 を示

したNo.5は 軽快時の検査であ り,No.13は 左肺

上葉に空洞 を認めイ トリゾール投与,ア ムホテ リ

シンB洞 内注入により縮小 していた.No.6は 肺

結核症例で2度 のPCR法 はいずれ も陰性であっ

たが,こ の間に培養ではA.fumigatusが1度 検出

された.

非アスペルギルス症は24症 例中2例(喀 痰)に

Table 2 Evaluation of PCR in aspergillosis with and without fungus ball

CHD : Congenital heart disease, Tb : Tuberculosis, IP : Interstitial pneumonia , MM : Multiplemyeloma, BALF : Bronchoalveolar lavage fluid, ND : Not done

Table 3 Clinical examination of two patients with PCR positive among 24 without

Aspergillosis

ND : Not done

感染症学雑誌 第71巻 第6号

PCR法 を用いたアスペ ルギルス症 の診断 511

おいてPCR法 陽性であった(Table3).こ のうち

1例(No.1)は ステロイド投与中の慢性関節 リウ

マチ患者に生じた急性気管支炎例で,経 過中に1

度培養にてA.fumigatusを 検出したが,一 般抗生

剤で軽快 した症例であった.残 りの1例(No.2)

は再生不良性貧血を基礎疾患にもち,大 葉性肺炎

を発症 した症例で硫酸ア ミカシン,イ ミペネム ・

シラスタチ ンナ トリウム,ST合 剤,フ ルコナゾー

ルの投与 およびアムホテ リシンB吸 入が行われ

軽快 した症例であった.

考 察

多数の臨床材料 を用いたPCR法 の評価 は少な

く,Spreadburyら は22症 例の結果 より培養法 と

の一致率93%2)と,ま た,Tangら は51症例の気管

支肺胞洗浄液を材料 とし,A.fumigatus,A.flavzas

を増幅するPCR法 にて感度100%,特 異度94.4%

と良好な結果を報告 している6).われわれは,培 養

や抗原および抗体検査 に比べ より診断感度の高い

アスペルギルス症の診断法を検討することを目的

として,検 出頻度の高いA.fumigatus1)2)に 特異的

なPCR法 を確立するため,Spreadburyら の方法

を採 用 し,検 討 した.そ の 結 果,本 法 はA.

fumigatus症 を特異的に診断 し,か つ1pgのDNA

が検出でき,喀 痰をはじめパラフィン切片などに

も適用可能であった.

従来か ら用いられている診断法 との比較では,

肺アスペルギルス症 と診断された13例 のうち培養

および抗体検査では各々6例 が,抗 体検査では2

例が陽性であったが,PCR法 では8例 が陽性を示

し,本 法の有用性が確かめられた.ア スペルギル

ス症で本法が陰性 となった5症 例について,3症

例(No.5,6,13)は 検査の時期,材 料の適否,

PCRを 抑制する物質 による感度の低下6),あ るい

はA.fumigatus以 外 によるアスペルギルス感染

などの可能性が考えられた.残 りの2症 例(No.

11,12)は,培 養法にてA.flaous,A.nigerを 検

出 してお り,こ れが起炎菌 と考えられた.こ の2

例(No.11,12)と 軽快時の検査であった症例No.

5を除けぼPCR法 によるA.fumigatus感 染症 の

診断感度 は10例 中8例 とかな り高い結果 を得た.

非 アスペ ルギルス症24症 例 でPCR法 陽性 で

あ っ た2症 例(Table3)は 臨 床 的 に は ア スペ ル ギ

ル ス 症 へ の進 展 は認 め な か っ た.し か し,症 例No.

1に つ い て は培 養 法 も陽 性 で あ り,少 な く と も材 料

中 にA.fumigatusは 存 在 した もの と考 え られ た.

この こ とか ら ア ス ペ ル ギ ル ス 症 の 診 断 に はPCR

法 の 結 果 に他 の検 査 所 見 お よび 臨 床 所 見 を加 味 す

る必 要 が あ る.

本 邦 に お け る ア スペ ル ギ ル ス 症 のPCR法 を用

い た診 断 につ い て は,中 村 らはA.fumigatusに 特

異 的 な18S rDNAを タ ー ゲ ッ トにnested PCR法

を行 い,ア ス ペ ル ギ ル ス 症9症 例 につ い て全 例 陽

性 で あ っ た と報 告 して い る5).し か し,初 回PCR

で の検 出 は 抗 体 検 査,培 養 法 に比 べ 低 く,nested

PCR法 の 結 果 の み で 陽 性 と して い る た め,ハ イ ブ

リダ イ ゼ ー シ ョン に よ り特 異 性 を確 認 す る必 要 性

が あ る と 思 わ れ る.ま た,Makimuraら も18S

rDNAを 用 いAspergillus属 とPenicillium属 に

特 異 的 なPCR法 を報 告 して い るが8),臨 床 材 料 で

の 成 績 に つ い て は3症 例 しか 述 べ られ て な く,さ

ら に臨 床 的 検 討 が 待 た れ る.今 回,我 々 が 提 示 し

たPCR法 は,臨 床 材 料 の 評 価 か らみ て 日常 診 療

に十 分 適 応 可 能 な 方 法 で あ る と考 え る.

謝辞:本 研究の実施 に当た りA.fumigatus H237株 の

DNAお よびIGSプ'ロ ーブ作成のためのプライマー を分与

下 さい ま した,英 国バー ミンガム大 学,Department of

InfectionのClaire Spreadbury博 士 に深謝 します.な お本

論 旨は第69回 日本感染症学会総会 に発表 した.

文 献

1) 久 米 光: 内臓 真 菌症 の疫 学. 螺 良 英郎 監, 久 米

光 編, 内臓 真 菌 症対 策 マニ ュアル, か まわ ぬ書 房,

東 京, 1994; 159-170.

2) Spreadbury C, Holden D, Brown AA, Bainbrid-

ge B, Cohen J : Detection of Aspergillusfumigatus by polymerase chain reaction. J ClinMicrobiol 1993 ; 31 : 615-621.

3) Spreadbury C, Holden D, Brown AA, Bainbrid-

ge B, Cohen J : Detection of Aspergillusfumigatus by polymerase chain reaction (Erra-tum). J Clin Microbiol 1994 ; 32 : 2039.

4) Reddy LV, Kumar A, Kurup VP : Specificamplification of Aspergillus fumigatus DNA by

polymerase chain reaction. Mol Cell Probes1993 ; 7 : 121-126.

5) 中村秀範, 柴田陽光, 工藤幸晴, 斉藤重雄, 木村

久男, 友池仁暢: PCR法 によるアスペル ギルス症

平成9年6月20日

512 大峠 和彦 他

のDNA診 断. 臨 床 病 理1994; 42: 676-681.

6) Tang CM, Holden DW, Brown AA, Cohen J :The detection of Aspergillus spp. by the

polymerase chain reaction and its evaluation inbronchoalveolar lavage fluid. Am Rev Respir

Dis 1993 ; 148 : 1313-1317.7) Makimura K, Murayama SY, Yamaguchi H :

Detection of a wide range of medically impor-

tant fungi by the polymerase chain reaction. JMed Microbiol. 1994 ; 40 : 358-364.

8) Makimura K, Murayama SY, Yamaguchi H :Specific detection of Aspergillus and Penicil -lium species from respiratory specimens by

polymerase chain reaction (PCR). Jpn J MedSci Biol 1994 ; 47 : 141-156.

9) Melchers WJ, Verweij PE, van den Hurk P et

al. : General primer-mediated PCR for detec-tion of Aspergillus species. J Clin Microbiol1994 ; 32 : 1710-1717

Significance of Aspergillus fumigatus rDNA Detected by Polymerase Chain

Reaction in Diagnosis of Pulmonary Aspergillosis

Kazuhiko OHGOE & Setsuko MIYANISHIDepartment of Medical Research, Tenri Hospital

Masanori AIHARA & Shuji MATSUODepartment of Clinical Pathology, Tenri Hospital

We have studied the clinical significance of Aspergillus fumigatus rDNA detected by

polymerase chain reaction (PCR) for diagnosing aspergillosis. For this purpose, a specific andsensitive PCR assay was developed to amplify the 26S rDNA/intergenic spacer region of A .fumigatus.

Control experiments showed that the set of primers used was capable of amplifying A .fumigatus DNA specifically and that the DNA amount of detection limit was 1 pg.

Eighteen samples from 13 patients with aspergillosis and 36 samples from 24 patients without

aspergillosis were tested by means of PCR, culture, latex agglutination test for galactomannanantigen and double gel diffusion assay for precipitation of antibodies to A . fumigatus.

PCR showed positive test in 8 among 13 patients with pulmonary aspergillosis . On the otherhand, culture of samples detected A. fumigatus in 6 patients . Galactomannan antigen andantibodies specific to A. fumigatus were positive in 2 and 6 patients respectively . These resultsindicated that PCR is the most sensitive among these 4 methods .

Five patients showed negative PCR test despite of having pulmonary aspergillosis . Two ofthese patients were proved to have aspergillosis caused by A. flavus and A. niger . On the otherhand, galactomannan antigen and A. fumigatus antibody were positive in one and 2 patients ,respectively.

PCR was positive in 2 out of 24 patients diagnosed as not having aspergillosis: one patienthad diagnosis of acute bronchitis, but she showed positive culture of A . fumigatus. The other

patient had diagnosis of lobar pneumonia, because any pathogens were not detected before PCRassay.

The PCR assay we developed is a useful method for diagnosing aspergillosis caused by A .fumigatus as compared with other conventional methods.

感染症学雑誌 第71巻 第6号