Praktikum Humangenetik WS 2013/14 Ort: Praktikumsraum der Physiologie MAFO Ebene 0 Raum 222 Süd Zeit: 14:15-17:00 gemäß Gruppenverteilungsplan Leitung: Prof. Dr. J.T. Epplen, Prof. Dr. B. Eiben, PD Dr. M. Meins, PD Dr. W. Klein, PD Dr. S. Hoffjan, PD Dr. B. Miterski, Dr. S. Stemmler, Dr. S. Wieczorek, Dr. A. Epplen, Dipl.-Biol. E. Lilienweiss, K. Timmer Vorbemerkung: Zur erfolgreichen Teilnahme am Praktikum ist die Kenntnis dieses Skripts unerlässlich. Dieses Skript kann jedoch kein Lehrbuch ersetzen, und deshalb sollte die Vorbereitung auch mit einem Lehrbuch erfolgen. Dies ist insbesondere zur theoretischen Aufarbeitung der angeführten Lernziele erforderlich, die vor der Praktikumsteilnahme erfolgen muss!

Sicherheitshinweis: Nach Maßgabe der Vorschriften zum Umgang mit Gefahrstoffen im Hochschulbereich (TRGS 451) wird darauf hingewiesen, dass es in diesem Praktikumsteil der "Biologie für Mediziner" unumgänglich ist, mit folgenden Gefahrstoffen umzugehen:

Ethidiumbromid: besondere Gefahr, giftig beim Verschlucken, erbgutschädigend Ablaufplan:

1. Einleitung

Die Humangenetik umfasst neben der genetischen Beratung die beiden großen Bereiche Humanzytogenetik und Molekulargenetik. Die Zytogenetik befasst sich mit Veränderungen menschlicher Chromosomen und den daraus resultierenden Fehlbildungen bzw. Entwicklungsstörungen. In der Molekulargenetik werden Verän-derungen (Mutationen) auf DNA-Sequenzebene als Ursache erblicher Erkrankungen untersucht (Abb. 1).

Abb. 1: Bereiche der Humangenetik

Da auch in der Zytogenetik in zunehmendem Maße molekulargenetische Techniken eingesetzt werden, um das Vorhandensein bestimmter Chromosomenabschnitte, Gene oder DNA-Sequenzen zu überprüfen, spricht man dann von Molekularer Zytogenetik. Im Rahmen dieses Praktikums sollen Grundlagen und die wichtigsten heute verwendeten Untersuchungstechniken für die genannten Bereiche erläutert und anhand von Fallbeispielen verdeutlicht werden, welche Folgen für Anlageträger und deren Angehörige sich aus den erhobenen Befunden ergeben können.

2. Grundlagen Humanzytogenetik

Dass der Mensch 2n = 46 Chromosomen hat, wurde erst 1956 von Tijo und Levan richtig erkannt; bis dahin war man von 48 Chromosomen ausgegangen. Wesentlich zum Erfolg der genannten Forscher trug die Anwendung einer neuen Präparationstechnik bei. Diese beruht darauf, sich teilende Zellen mit einer hypotonen Lösung zu behandeln, um eine bessere räumliche Trennung der Chromosomen zu erzielen. Bald nach Entdeckung der richtigen Chromosomenzahl gelang es, die Trisomie des Chromosoms 21 im Falle des Down-Syndroms zu dokumentieren sowie Mono- und Trisomien der Geschlechts-chromosomen zu entdecken. Weitere Verbesserungen der Präparationstechniken wie z.B. optimierte Zellkulturmedien, die Stimulation der Zellteilungsaktivität durch Phytohämagglutinin (PHA) und die Arretierung der Chromosomen durch Colchizin in der Metaphase folgten und ließen die Gewinnung von zahlreichen, gut analysierbaren Metaphasechromosomen zur Routine werden. Trotz dieser technischen Fortschritte war eine Identifizierung der menschlichen Chromosomen schwierig, denn sie sind zahlreich und klein, und viele von ihnen zeigen eine sehr ähnliche Morphologie. Mit Hilfe der

Zytogenetik

Molekulargenetik

damals bekannten Färbetechniken, bei denen alle Chromosomen homogen angefärbt wurden (siehe Abb. 2a), war nur eine sichere Identifizierung der Chromosomen 1-3, 16-18 und zumeist des Y Chromosoms möglich. Diese Schwierigkeiten wurden erst Anfang der 70er Jahre mit der Entwicklung neuer Färbe- und Differenzierungsmethoden über-wunden, den sog. Banden- oder Bänderungstechniken. Chromosomen, die mit diesen Techniken angefärbt werden, zeigen Muster aus unterschiedlich großen dunklen, hellen oder blass gefärbten Bereichen, den Banden (s. Abb. 2b).

Abb. 2a: Metaphase mit homogen gefärbten menschlichen Chromosomen Abb. 2b: Metaphase mit G-gebänderten menschlichen Chromosomen Das Bandenmuster ist für jedes Chromosom spezifisch; nur homologe, strukturgleiche Chromosomen zeigen ein gleiches Muster. Mit der Anwendung der Bandentechniken hat sich in der Medizin die Chromosomendiagnostik etabliert. Mit ihrer Hilfe kann bei einer Reihe von angeborenen Fehlbildungen und Entwicklungsstörungen die chromosomale Ursache festgestellt oder eine vermutete Ursache ausgeschlossen werden. Damit ist es auch möglich, das Wiederholungsrisiko für Nachkommen zu berechnen sowie eine entsprechende Aufklärung und genetische Beratung anzubieten. Mit Hilfe der pränatalen Diagnostik kann schon vor der Geburt eine Chromosomenanalyse beim Fötus durchgeführt werden.

2.1 Präparation von Metaphasechromosomen des Menschen Zur routinemäßigen Gewinnung von Chromosomen des Menschen sind Lymphozyten des peripheren Bluts das am besten geeignete und am meisten verwendete Ausgangs-material (weitere Gewebe für die Chromosomenanalyse sind in Tabelle 1 aufgeführt). Heparinisiertes Blut wird in Kulturmedium bei 37° C drei Tage lang kultiviert. Dem Kulturmedium wird Phytohämagglutinin (PHA) zugesetzt. PHA ist ein Mitogen und regt T-Lymphozyten, die normalerweise im peripheren Blut keine Teilungsaktivität zeigen, während der Kultur zu wiederholten Zellteilungen an. Etwa 30-90 min vor dem Abbruch der Kultur fügt man Colcemid hinzu. Diese dem pflanzlichen Colchizin ähnliche Verbindung unterbindet die Ausbildung des Spindelapparates der Zellen, so dass die Chromosomen im Metaphasestadium verharren. Dadurch kommt es zu einer Anreicherung der Kulturen mit Lymphozyten, die Metaphasechromosomen enthalten. Zu Beginn des sich dann anschließenden Aufarbeitungsprozesses werden die Zellen mit einem hypotonen Medium (0,56 % KCl) gemischt. Dieses Medium bewirkt ein Anschwellen der Lymphozyten und ein Auseinanderweichen der Metaphase-

2b

2a

chromosomen. Dadurch wird die Wahrscheinlichkeit geringer, dass sich die Chromo-somen einer Zelle beim Auftropfen von Zellsuspension auf einen Objektträger über-lagern und die Karyotypanalyse erschweren. Vor dem Auftropfen der Lymphozyten auf die Objektträger wird die Lymphozytensuspension mit einem Gemisch aus Eisessig und Methanol fixiert.

Tabelle 1: Gewebe, die in der Routinediagnostik eingesetzt werden

Blut postnatale Chromosomenanalyse Hautfibroblasten Nachweis von Chromosomenabberationen, die in

Lymphozyten nicht nachweisbar sind Knochenmark Nachweis leukämieassoziierter Abberationen Amnionzellen; Chorionzotten pränatale Diagnostik Abortgewebe Nachweis chromosomaler Ursachen für die Fehlgeburt

Um das charakteristische Bandenmuster zu erhalten, müssen die Chromosomen mit speziellen Techniken angefärbt werden. Die routinemäßig am häufigsten angewandte Technik ist die G-Banden-Technik (auch GTG-Technik genannt nach: G-bands by Trypsin using Giemsa). Die auf den Objektträgern aufgetropften und angetrockneten Metaphasechromosomen werden zur Erzeugung des Bandenmusters mit Trypsin (ein Enzym, das Eiweiß verdaut) vorbehandelt und dann mit einer Giemsa-Farbstofflösung gefärbt. Diese Technik erzeugt bei Chromosomen im Metaphasestadium etwa 300-600 hell und dunkel gefärbte Banden pro haploidem Chromosomensatz. Die chemischen Reaktionen, durch welche die unterschiedlichen Bandentypen an den Chromosomen entstehen, sind noch nicht vollständig geklärt. Möglicherweise ergeben diejenigen Chromosomenbereiche mit einem hohen Nicht-Histon-Protein Anteil die dunklen G-Banden. Offenbar enthalten diese dunklen G-Banden auch DNA-Sequenzen mit einem relativ hohen Adenin-Thymin Gehalt, während die hellen Banden einen hohen Guanin-Cytosin Gehalt besitzen. In den hellen G-Banden wurden auch deutlich mehr Gene lokalisiert als in den dunklen.

2.2 Charakterisierung der menschlichen Chromosomen Der Karyotyp des Menschen zeigt normalerweise 22 Autosomenpaare (44 Chromosomen) und 2 Geschlechtschromosomen (Gonosomen). Die beiden Geschlechtschromosomen der Frau sind einander homolog und werden als X-Chromosomen bezeichnet; der Mann hat als Gonosomen ein einzelnes X-Chromosom und das für das männliche Geschlecht charakteristische Y-Chromosom. Diese Verteilung der Geschlechtschromosomen bewirkt, dass Söhne ihr X-Chromosom immer von der Mutter und ihr Y-Chromosom vom Vater erhalten. Der Vater vererbt sein X-Chromosom in der Regel nur an seine Töchter. Jedes der 46 Metaphasechromosomen des Menschen wird durch die Zentromer-region (Spindelfaseransatzstelle), die üblicherweise als primäre Einschnürung sichtbar ist und an der die beiden Schwesterchromatiden noch zusammenhängen, in einen mit p bezeichneten kurzen und in einen mit q bezeichneten langen Arm unterteilt. Die Lage der Zentromerregion ist konstant. In der Humanzytogenetik werden die Chromosomen aufgrund der Lage der Zentromerregion in drei Gruppen eingeteilt (s. Abb. 3):

a) metazentrische Chromosomen: Das Zentromer liegt in der Mitte des Chromosoms oder ist der Mitte sehr nahe.

b) submetazentrische Chromosomen: Das Zentromer ist deutlich von der Mitte bzw. dem Ende des Chromosoms entfernt.

c) telozentrische Chromosomen: Das Zentromer befindet sich nahezu am Ende des Chromosoms.

Abb. 3: Eingruppierung der Chromosomen nach Lage des Zentromers 2.3 Erstellung eines Karyogramms

Um eine Chromosomenanalyse bei einem Menschen durchführen zu können, erstellt man ein Karyogramm in Form eines geordnet arrangierten Chromosomensatzes. Dazu wurde früher von einer geeigneten Metaphase eine Fotografie angefertigt, die Chromosomen aus dem Foto ausgeschnitten und in eine Karyogrammvorlage eingeklebt. Heute werden zur Erstellung von Karyogrammen hochauflösende Mikroskope mit digitalen Kameras und Computern gekoppelt. Mit Hilfe einer speziellen Software können Chromosomen am Bildschirm bearbeitet und anschließend in ein Karyogrammvorlage einsortiert werden. Ein Beispiel für ein menschliches Karyogramm ist in Abb. 4 dargestellt.

Abb. 4: Menschliches Karyogramm Nach internationaler Übereinkunft (Denver Convention, Paris Conference, siehe Abb. 5) werden die Chromosomen des Menschen entsprechend ihrer abnehmenden Länge von 1 bis 22 durchnummeriert. Chromosom 1 ist das größte Chromosom, Chromosom 21 das

kleinste (nicht Chromosom 22, wie ursprünglich angenommen). Die Chromosomen 13, 14 und 15 sowie die kleinen Chromosomen 21 und 22 zeichnen sich gegenüber den übrigen Chromosomen jeweils durch die telozentrische Lage der Zentromerregion, durch eine Nukleolus-Organisator-Region (NOR) und einen endständigen Satelliten am kurzen Arm aus. In den NOR Regionen sind die Gene für die ribosomale RNA lokalisiert, ihre Position ist durch eine sekundäre Einschnürung markiert. Als Satelliten werden kleine, endständige (knopfähnliche) Chromosomensegmente bezeichnet, die durch die sekundäre Einschnürung vom Chromosomenkörper abgesetzt sind. Das Y-Chromosom ist ebenfalls telozentrisch, trägt aber weder Satelliten noch ribosomale Gene. Chromosomen mit einer ähnlichen Lage der Zentromerregion und ähnlicher Länge werden in Gruppen zusammengefasst. Insgesamt hat man sieben einzelne mit A bis G bezeichnete Gruppen gebildet. Die Gruppe A enthält die größten Chromosomen; in den nachfolgenden Gruppen nimmt die Größe der Chromosomen ab; in der Gruppe G befinden sich die kleinsten Chromosomen.

Abb. 5: Pariser Nomenklatur (Paris Conference 1971) zur Bezeichnung der Banden

Bei der international gebräuchlichen, formalen Bezeichnung normaler und aberranter Karyotypen geht man folgendermaßen vor: Zuerst wird die Gesamtzahl (2n) der Chromosomen angeführt, dann folgt nach einem Komma die Geschlechtschromoso-menkonstitution. Die genaue Bezeichnung einer eventuellen Aberration steht nach den Geschlechtschromosomen geschrieben und ist von diesen durch ein weiteres Komma getrennt. So lautet die Bezeichnung für einen normalen männlichen Karyotyp 46,XY bzw. 46,XX für einen weiblichen. Ein Junge mit Down-Syndrom (freie Trisomie 21) hat die Karyotypformel 47,XY,+21.

2.4 Chromosomenstörungen Seit der Einführung der neuen Präparations- und Bänderungstechniken ist eine Vielzahl autosomaler und gonosomaler Chromosomenstörungen entdeckt worden. Mehr als 20% aller Konzeptionen beim Menschen haben Chromosomenstörungen. Durch spontane Aborte verringert sich der Anteil der Chromosomendefekte aber auf 0,6% bei Lebendgeburten. Zwei Kategorien von zytogenetisch erkennbaren Aberrationen können grundsätzlich unterschieden werden: numerische und strukturelle Chromosomen-aberrationen.

2.4.1 Numerische Chromosomenabberationen Numerische Chromosomenabberationen zeichnen sich durch eine Veränderung der Anzahl der Chromosomen aus. Dabei können ganze Chromosomensätze zusätzlich vorhanden sein (Polyploidie) bzw. einzelne Chromosomen betroffen sein (Aneuploidie). Die numerischen Chromosomenaberrationen des Menschen haben ihre Hauptursache in der fehlerhaften Verteilung einzelner Chromosomen bei der Keimzellenbildung der Eltern. Diese Fehlverteilungen beruhen in überwiegendem Maße auf der Nicht-Trennung (Non-disjunction) zweier homologer Chromosomen in der 1. Reifeteilung bzw. der Schwesterchromatiden eines Chromosoms in der 2. Reifeteilung. Das Resultat sind Keimzellen, denen das betreffende Chromosom fehlt und solche, die dieses Chromosom zweimal besitzen. Nach der Vereinigung mit einer normalen, haploiden Keimzelle liegt dann im ersten Fall eine Monosomie und im zweiten Fall eine Trisomie dieses Chromosoms vor. Monosomien sind beim Menschen letal, mit der Ausnahme einer Monosomie für das X Chromosom. Neben Aneuploidien der Geschlechtschromosomen werden in der Regel nur die autosomalen Trisomien der Chromosomen 13, 18 und 21 bei lebendgeborenen Kindern gefunden (Tabelle 2).

Tabelle 2: Beispiele für numerische Chromosomenaberrationen:

47,XY,+21 oder 47,XX,+21 Trisomie 21 (Down-Syndrom) 47,XY,+18 oder 47,XX,+18 Trisomie 18 (Edwards-Syndrom) 47,XY,+13 oder 47,XX,+13 Trisomie 13 (Pätau-Syndrom) 45,X Turner-Syndrom 47,XXY Klinefelter-Syndrom

Non-disjunction kann auch in der Mitose während der frühen Zellteilungsstadien des Keims vorkommen. Dies führt zu Karyotypen mit einem chromosomalen Mosaik. Hierbei können sowohl Zelllinien mit normalen als auch mit abberanten Chromoso-menzahlen entstehen. Mit zunehmendem Gebäralter der Mutter nimmt die Häufigkeit numerischer Chromosomenaberrationen zu. Eine Ausnahme scheint das Turner-Syndrom zu sein. Der Zusammenhang zwischen dem Gebäralter der Mutter und der Häufigkeit einer numerischen Chromosomenaberration bei den Kindern ist in Abb. 6 für die freie Trisomie 21 dargestellt.

Abb. 6: Abhängigkeit des Risikos für ein Down-Syndrom vom Alter der Schwangeren.

2.2.2. Strukturelle Chromosomenabberationen Bei den strukturellen Chromosomenabberationen ist die Anzahl der Chromosomen in der Regel unverändert. Allerdings sind bei einzelnen Chromosomen Veränderungen im Chromosomenaufbau nachweisbar. Dies ist an einer Veränderung des Bandenmusters des jeweiligen Chromosoms erkennbar. Strukturelle Abberationen sind durch Bruchereignisse bedingt. Man unterscheidet:

Deletionen: Chromosomenstückverluste Duplikationen: Verdoppelung von Chromosomenabschnitten Inversionen : Umkehr der normalen Aufeinanderfolge von Chromosomenab--

schnitten Insertionen: Ein Stück eines Chromosoms befindet sich innerhalb eines

anderen Chromosoms Translokationen: Umbau von Chromosomenstücken zwischen verschiedenen Chro-

mosomen Zentrische Fusion: Zwei telozentrische Chromosomen fusionieren zu einem

Chromosom (Robertson‘sche Translokation)

Bei Deletionen bzw. Duplikationen kann der beteiligte chromosomale Abschnitt nur einfach bzw. dreifach vorhanden sein. Man bezeichnet dies als partielle Monosomie bzw. Trisomie (partiell, weil nur ein Abschnitt eines Chromosoms und nicht das komplette Chromosom betroffen ist). Derartige Chromosomenaberrationen sind Ursachen verschiedener klinischer Syndrome (z. B. Katzenschrei-Syndrom [5p-], Wolf-Hirschhorn-Syndrom [4p-]). Deletionen können so klein sein, dass sie lichtmikroskopisch nicht sichtbar sind (bei einer durchschnittlichen Bandenauflösung entspricht das einer Größe von weniger als 5-10 Megabasen). Um auch solche Veränderungen zu erfassen, kommen molekularzytogenetische Methoden wie die FISH-Hybridisierung oder Array-Untersuchung (s.u.) zum Einsatz. Bei Inversionen und Translokationen kann die Gesamtmenge des Erbguts unverändert sein, d.h. es sind weder Gene verloren gegangen noch hinzugekommen. Es hat sich „nur“ die Abfolge der Gene verändert. Der Karyotyp wird in diesem Fall als „balanciert“ bezeichnet. So sind Träger einer balancierten Translokation bzw. Inversion häufig symptomfrei (wenn allerdings ein Bruchpunkt innerhalb eines Gens liegt, kann daraus eine monogen vererbte Erkrankung resultieren). Eine balancierte Translokation bei einem Elternteil kann jedoch zu einem unbalancierten Karyotyp beim Kind führen, was eine Fehlgeburt bzw. Fehlbildungen und/oder Behinderungen auslösen kann.

3. Grundlagen der Molekulargenetik

Die Molekulargenetik befasst sich mit Veränderungen auf DNA-Ebene, die im Gegensatz zu den zytogenetischen Veränderungen nicht im Mikroskop darstellbar sind. Ein wesentliches Ziel der molekularen Genetik ist das Verständnis für Erkrankungen, die durch genetische Veränderungen verursacht werden, um darauf aufbauend das diagnostische Vorgehen und therapeutische Strategien zu entwickeln bzw. zu verbessern. Für die molekulargenetischen Analysen wird in der Regel genomische DNA verwendet, die aus peripheren Blutleukozyten gewonnen wird; seltener kommen auch Unter-suchungen z.B. an RNA zum Einsatz. Die Einzelbausteine der Nukleinsäuren (DNA, RNA) sind die Nukleotide (Zucker-Phosphat-basischer Ring, der basische Ring wird oft verkürzt auch einfach Base genannt). Die „Wendeltreppe“ des Doppelhelix-Moleküls der DNA besteht also aus zwei

gegenläufigen Zucker-Phosphat-„Rückgraten" und den basischen Ringen als „Treppenstufen“, die nach innen gerichtet sind. Im DNA-Doppelstrang stehen sich immer 2 komplementäre Basen (Abkürzung = Anfangsbuchstabe) gegenüber, welche über 2 (A-T) bzw. 3 (G-C) stabile H-Brückenbindungen verknüpft sind (s. Abb. 7). Die Komplementarität der Nukleinsäuren wird für die meisten molekularbiologischen Untersuchungsmethoden ausgenutzt (Trennen des Doppelstrangs in die zwei Einzelstränge, Anlagern komplementärer Moleküle an Einzelstränge = Hybridisieren).

Abb. 7: Struktur-Modelle der DNA-Doppelhelix; a) Die beiden ‚Zucker-Phosphat-Rückgrate’ der DNA verlaufen antiparallel; b) Dimensionen der DNA-Doppelhelix; c) Kalottenmodell.

Jeder eukaryontische Organismus besitzt in jeder kernhaltigen Zelle eine bestimmte Menge an Erbgut-DNA. Sie wird Genom genannt. Die jeweiligen Genomgrößen sind charakteristisch für jede Tier- oder Pflanzenart (s. Abb. 8). Während Genome von Prokaryonten oft sehr dicht mit Erbinformationen gepackt sind (z. T. sind sogar Gene bekannt, deren Information sich überlappt), gibt es in den Genomen der meisten Eukaryonten auch große Abschnitte, die keinerlei proteinkodierende Information (keine Gene) für die Entwicklung, das Verhalten und Befinden des Organismus tragen.

Abb. 8: DNA-Gehalte verschiedener Organismen

Das diploide Genom eines Menschen besteht aus ~7 Milliarden Nukleotidpaaren. Davon beinhalten nur ca. 1,1% kodierende Sequenzen, die tatsächlich in Protein umgeschrieben werden, während etwa 99% nicht kodierend sind. Im 2003 veröffentlichten Humangenomprojekt wurde abgeschätzt, dass das menschliche Genom ca. 23.000 Gene enthält. Per Definition (2006) wird unter einem Gen eine „lokalisierbare Region genomischer Sequenz [verstanden], die einer Erb-Einheit entspricht, welche assoziiert ist mir regulatorischen Regionen, transkribierten Regionen und/oder anderen funktionellen Sequenzregionen“. Über die biologische Bedeutung der DNA-Bereiche, in der keine sequenzabhängige Information enthalten ist, herrscht z.Z. noch Unklarheit. Da der Austausch oder Wegfall eines Nukleotids, bzw. die Umlagerung ganzer Sequenzteile innerhalb dieser Regionen, meist nicht zu einer Fehlfunktion innerhalb des Organismus führt und daher toleriert werden kann, zeichnet sich dieser Teil der DNA durch eine wesentlich größere Variabilität aus. Andererseits kann der Austausch einer einzigen Base in der kodierenden Sequenz eines Gens u.U. zum Auftreten einer schweren erblichen Erkrankung führen. Zur Untersuchung von Genen als Grundlage für bestimmte Erkrankungen kommen diverse molekulargenetische Methoden zum Einsatz. Einen hohen Stellenwert nimmt hier die Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) ein, mit der spezifische DNA-Abschnitte millionenfach vervielfältigt werden können und dann für weitere Analyseverfahren zur Verfügung stehen. Des Weiteren werden u.a. die DNA-Sequenzierung, bei der die Abfolge der DNA-Basen bestimmt wird, der Restriktions-verdau von DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen und die Gelelektrophorese eingesetzt. Aufgrund der Weiterentwicklung der Technologien ist es zunehmend möglich, die Sequenzanalyse zahlreicher Gene simultan durchzuführen (sog. next generation sequencing).

3.4 Molekulare Zytogenetik Auch in der Zytogenetik werden in zunehmendem Maße molekulargenetische Tech-niken eingesetzt, um das Vorhandensein bestimmter Chromosomen, Gene oder DNA-Sequenzen zu überprüfen. Eine in der Humanzytgenetik häufig angewendete, diagnostische Testmethode ist die Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH). Das Prinzip dieser Methode besteht darin, eine DNA-Sequenz, die spezifisch für ein be-stimmtes Chromosom oder Gen ist, als Sonde zu verwenden und mit den Metapha-sechromosomen einer zu prüfenden Probe zu hybridisieren. Dabei muss zunächst sowohl die DNA der Sonde als auch der Chromosomenprobe durch Denaturieren in eine einzelsträngige Form überführt werden. Dann erfolgt für die in situ Hybridisierung die Zugabe der Sonden-DNA zu den Chromosomen. Bei Vorliegen komplementärer Stränge in Sonde und Chromosomenprobe bilden sich in den Chromosomen DNA-Doppelstränge (Hybridstränge) aus Sonden- und Proben-DNA. Zum Zweck der Markierung wird die Sonden-DNA mit fluoreszierenden Substanzen versehen. Im Fluoreszenzmikroskop fluoreszieren dann diejenigen Chromosomen oder chromosomale Regionen, an welche die Sonde hybridisiert hat. Die FISH Methode erlaubt es, auch an Interphasekernen nachzuprüfen, ob ein Karyotyp mit einer numerischen Chromosomenaberration vorliegt oder welche DNA-Sequenzen in Tumorgeweben amplifiziert wurden. Voraussetzung ist wieder die Verfügbarkeit einer chromosomen- bzw. tumorspezifischen Sonden-DNA. Bei Trisomie 21 können z.B. unter Verwendung einer Chromosom 21 spezifischen DNA-Sequenz als Sonde in den meisten Interphase-zellen drei fluoreszierende Bereiche nachgewiesen werden.

Eine weitere zunehmend eingesetzte Methode stellt die Chip-basierte Array-Analyse dar, die zum Nachweis bzw. Ausschluss unbalancierter chromosomaler Aberrationen (Deletionen oder Zugewinne) dient, die zu klein sind, um im Lichtmikroskop gesehen zu werden. Das Auflösungsvermögen ist dabei um ein Vielfaches höher als bei der konventionellen Karyotypisierung.

4. Lernziele

Zytogenetik: • Die unterschiedlichen Chromosomenabberationen sollen aufgezählt werden und

das Prinzip ihrer Enstehung erklärt werden können. • Die beim Menschen vorkommenden numerischen Abberationen, die mit dem Le-

ben vereinbar sind, sollen benannt und deren wichtigsten Symptome beschrieben werden können.

• Beispiele von Krankheitsbildern, die durch strukturelle Abberationen verursacht werden, sollten bekannt sein.

• Die Folgen struktureller Abberationen für Anlageträger und deren Angehörige sollen erklärt werden können.

Molekulargenetik: • Der Aufbau der DNA und verschiedene Mutationen auf DNA-Ebene sollen erklärt

werden können. • Das Prinzip der Gelelektrophorese und ihre praktische Umsetzung sollen

vermittelt werden • Es soll ein Einblick in moderne molekulargenetische Techniken gegeben werden • Die Untersuchung und Bedeutung der Faktor V-Leiden Mutation soll erläutert

werden können

5. Versuchsmaterialien und Durchführung der Agarose-Gelelektrophorese

Das zur Verfügung gestellte PCR-Produkt des Faktor V-Gens wird im elektrischen Feld mittels der Agarose-Gelelektrophorese entsprechend der Fragmentlänge nach Restriktionsverdau aufgetrennt. Diese Technik stellt eine essentielle Methode des molekularbiologischen Labors dar, die dort tagtäglich vielfach angewendet wird.

Versuchsmaterialien:

o Feinwaage, (Mini-)Gelkammern mit Gieß-Kämmen, Spannungsquelle (power supply) mit Kabeln, UV-Leuchtschirm (cave: Hornhaut-und Linsenepithelschädigungen, daher sind Schutzvorrichtungen nötig: Plexiglasplatte, Schutzbrille)

o Agarose und Gelelektrophoresepuffer (Herstellung: siehe chemisches Praktikum) o Ethidiumbromid-Färbelösung (cave: kein direkter Kontakt, da potenter mutagener

und kanzerogener Stoff aufgrund der hohen Affinität zur DNA) o DNA-Lösungen o Längenmarker o Gel-Ladepuffer incl. Ladefarbe (Ficoll, Bromphenolblau, Xylencyanol)

Durchführung:

1. Feinwaage: Abwiegen des Agarose-Pulvers für 50 ml eines 1,5-2%igen Gels

2. Agarose suspendieren, lösen (aufkochen); nach Ethidiumbromid-Zugabe auf ~50°C abkühlen lassen

3. Vorbereiten der Kammer (Abdichten, Geltaschen-Kamm einsetzen)

4. Flüssige Agarose-Lösung in Gelkammer gießen (Gel verfestigt sich nach Abkühlen)

5. Gel mit Elektrophorese-Puffer überschichten (1-2 mm über Geloberfläche)

6. Gel-Kamm entfernen

7. Geltaschen mit DNA-Lösungen und Längenmarker beladen

8. Spannung (60-100 Volt) anlegen für ~20 min

9. Spannungsgeber abschalten, Kabel entfernen, Transport zum UV-Leuchtschirm; UV-Belichtung des Gels (cave: UV-Licht), Analyse des Gels: Banden und DNA-Fragmentlängenbestimmung durch Vergleich mit Längenmarkerbanden (pUC19-Plasmid-DNA verdaut mit Restriktionsenzym: 2686 Basenpaare (bp), 501 bp, 489 bp, 404 bp, 331 bp, 242bp, 190 bp, 147 bp, 111 bp, 110 bp, 67 bp, 34 bp, 34 bp, 26bp).

Risiko für Thromboembolie bei Mutation im Faktor V-Gen (Faktor V-Leiden Mutation)

Thrombosen kommen bei ~1:1000 Personen pro Jahr vor. Die Faktor V-Leiden Mutation ist der häufigste genetisch bedingte Defekt, der mit venösen thromboembolischen Erkrankungen assoziiert ist. Faktor V ist an der Gerinnungs-Kaskade beteiligt und kann physiologischerweise durch aktiviertes Protein C (über proteolytische Spaltung des Faktors Va) inaktiviert werden. Die Mutation ‚Leiden’ im Faktor V-Gen ist durch einen Nukleotid-Austausch verursacht, hierdurch kommt es zum Aminosäure-Austausch. Durch diese Veränderung wird die hemmende Aktivität des Proteins C auf den Faktor V herabgesetzt (aktivierte Protein C-Resistenz) und somit das Gleichgewicht zugunsten gerinnungsfördernder Reaktionen verschoben.

Etwa 5 % der westlichen Bevölkerung sind heterozygote Träger eines Faktor V-Leiden Allels, bei diesen Personen ist das individuelle Thromboserisiko bis 10-fach erhöht. Für homozygote Träger der Faktor V-Leiden Mutation ist das Risiko für Thrombosen sogar bis 100-fach erhöht. Umweltfaktoren wie z.B. Rauchen und orale Kontrazeptiva erhöhen zusätzlich das Thromboserisiko für mutations-betroffene Frauen. Eine Kombination der Faktor V-Leiden Mutation mit anderen genetisch bedingten Störungen (z.B. Prothrombin-Polymorphismen) kann das individuelle Thromboserisiko weiter steigern.

Bei folgenden Indikationen ist es auf Wunsch der Risikoperson sinnvoll, auf Faktor V-Leiden Mutation zu testen:

Personen mit erhöhtem Thromboserisiko (positive Familienanamnese für Thromboembolien, zur Abklärung rezidivierender Thrombosen)

Patientinnen mit thromboembolischen Komplikationen während der Schwangerschaft oder unter Einnahme oraler Kontrazeptiva.

Für Untersuchungen auf die Leiden-Mutation im Faktor V Gen wird eine Blutprobe (EDTA-antikoaguliert) benötigt, aus der DNA extrahiert wird. Mittels PCR wird der Bereich des fraglichen Nukleotid-Austauschs im Faktor V Gen vervielfältigt und mit einem Restriktionsenzym gespalten. Der Verdau findet nur statt, wenn das mutierte Allel M vorhanden ist, nicht im Normalfall (N) ohne Mutation. Abbildung 9 zeigt die unterschiedlichen Fragmentgrößen bei einer Kontrollperson (1), einem heterozygoten (2) und einem homozygoten (3) Träger der Faktor V-Leiden Mutation nach Auftrennung durch Gelelektrophorese.

Abb. 9: Agarose-Gelabbildung mit drei verschiedenen DNA Fragmentmustern Literatur Hirsch-Kauffmann, M. und M. Schweiger (2009): Biologie für Mediziner und Naturwissenschaftler (7. Auflage). Georg Thieme Verlag Stuttgart