Z Lebensm Unters Forsch (1982) 175:169-171

Zeitschrift far Lebensmittel-

Untersuchung und-F.omchung © L F. Bergmann Verlag 1982

Quantitative Bestimmung von Trichothecenen* HT-2 Toxin in verschimmelten pflanzlichen Nahrungsmitteln

Rainer Schmidt**, Elena Ziegenhagen und Klaus Dose

Institut fiir Biochemie der Johannes Gutenberg-Universit~it, Johann-Joachim-Becher-Weg 30, D-6500 Mainz, Bundesrepublik Deutschland

Quantitative Determination of Trichothecenes HT-2 Toxin in Moldy Cereal Grains and Vegetable Foods

Summary. The analysis of HT-2 toxin in moldy rice, maize, oats, wheat, rye, and peas is described. For ex- traction a mixture of 9 parts (volume) acetonitrile and one part of aqueous 4% KC1 was used. Some of the extracts had to be prepurified using a Sep-Pak C18 car- tridge. The final quantitation of the mycotoxin was achieved by two-dimensional thin-layer chromatogra- phy (TLC) and measurement of the fluorescence of the spots on H2SO4-treated TLC plates. Experiments with added toxin yielded a mean recovery of 88% (coeffi- cient of variation 7).

Zusammenfassung. Es wird ein Verfahren zur quantita- tiven Bestimmung von HT-2 Toxin in verschimmeltem Reis, Mais, Weizen, Hafer, Roggen bzw. Erbsen be- schrieben. Extrahiert wurde mit einer Mischung yon 9 Teilen (Volumen) Acetonitril und einem Teil wfigriger 4%iger KC1-L6sung. Die Extrakte muBten teilweise chromatographisch vorgereinigt werden. Die terminale Bestimmung erfolgte nach zweidimensionaler d/inn- schichtchromatographischer Trennung durch Fluores- cenzintensit/itsmessung der mit H2SO4 behandelten DC-Platten. Versuche mit zugesetztem HT-2 Toxin er- gaben eine Wiederfindung yon 88 % (Variationskoeffi- zient 7).

Einffihrung

Der Befall yon Nahrungs- und Futtermitteln mit Schimmelpilzen stellt fiir Menschen und Tiere eine Ge-

* Diese Arbeit wurde dutch Mittel des Bundesministeriums fiir Ju- gend, Familie und Gesundheit gef6rdert (412-6080-3/19)

* * Teil der Inauguraldissertation von R. Schrnidt zur Erlangung des Grades eines Dr. rer. nat. an der J. Gutenberg-Universit/it, Mainz Sonderdruckfragen an: Prof. Dr. K. Dose (Adresse siehe oben)

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Trichothecene R 1 R 2 R 3 R 4

AcetyI-T-2 toxin CH3CO0 CH3CO0 CH3CO0 OCOCH2CH(CH3) 2

T-2 toxin OH CH3CO0 CH3C00 OCOCHzCH(CH3) 2

HT-2 toxin OH OH CH3CO0 OCOCHzCH(CH3] z

Neosolanio[ OH CH3CO0 CH3COO OH

Abb. 1. Strukturformeln einiger natfirlich vorkommender Tricho- thecene

Tabelle 1. Vergleich der Toxizit~it verschiedener Trichothecene

Toxin LDs0-Werte LC-Werte far M~use [5] im Brine Shrimp-Test [4]

T-2 Toxin 5,2 mg/kg i.p. 9,2 ng/disc HT-2 Toxin 9,0 mg/kg i.p. 30,1 ng/disc Diacetoxyscirpenol 23,0 mg/kg i.p. 26,3 ng/disc

fahr dar, weil Schimmelpilze in der Lage sind, toxische Stoffe zu produzieren. Neber[ Aspergillen und Penicilli- en sind in unserem klimatischen Gebiet auf verschim- melten Proben Mufig Fusarien anzutreffen [1, 2], die als toxikologisch wirksame Substanzen Trichothecene bilden k6nnen (Abb. 1). Wegen ihrer hohen Toxizit/it hat man sich in vielen analytischen Arbeiten mit der Bestimmung yon T-2 Toxin und Diacetoxyscirpenol besch/iftigt. Da die toxinproduzierenden Pilze in Ab- h/ingigkeit von den Kulturbedingungen in verschiede-

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170 R. Schmidt et al.: Bestimmung von Trichothecenen HT-2 Toxin in Nahrungsmitteln

Tabelle2. Chromatographie von Trichothecenen auf aktivierten Kieselgel-Dfinnschicht-Platten in verschiedenen Fliegmittelsyste- men

System Volumen- Rf-Werte teile

HT-2 Toxin T-2 Toxin Acetyl-T-2 Toxin

Methanol 1 0,61 0,68 0,70 Ethylacetat 4 Aceton 4

Dichlormethan 15 0,07 0,48 0,78 Ether 5 Essigs/iure 1

Benzol 1 0,36 0,58 0,63 Aceton 1

Benzol 3 0,20 0,47 0,62 Aceton 2

Benzol 7 0,15 0,41 0,59 Aceton 3

Chloroform 8 0,70 0,82 0,88 Methanol 2

Chloroform 8,5 0,58 0,74 0,82 Methanol 1,5

nem Umfang toxische Stoffwechselprodukte bilden k6nnen, braucht man ein m6glichst vollst/indiges Bild fiber Anzahl und Menge dieser Metaboliten. HT-2 To- xin, das eine vergleichbar hohe Toxizitfit [3, 4] hat (Ta- belle 1), wurde z. B. bisher kaum untersucht [5], weil ei- ne fiir photometrische Bestimmungen geeignete dfinn- schicht-chromatographische Trennung Schwierigkei- ten bereitet. Aufgrund seiner Polarit/it war bei einer eindimensionalen Dfinnschicht-Chromatographie (DC) HT-2 Toxin stets yon st6renden Substanzen fiberlagert. Deshalb haben wir ein Trennverfahren er- arbeitet, das die Bestimmung yon HT-2 Toxin in ver- schiedenen Nahrungsmitteln (Reis, Mais, Hafer, Wei- zen, Roggen und Erbsen) mit Hilfe der DC gestattet.

Material und Methoden

A. Geriite

Waring Blendor (Waring Products Division, New Hartford, CT, USA), Rotavapor (Bfichi), Selecta-Faltenfilter 150 mm und 270 mm (Schleicher u. Schiill 595 g~), DC-Kammern (Desaga), DC-Fertig- platten Kieselgel 60, 20 x 20, Schichtdicke 0,25 mm (Merck, 5721), Einmal-Mikropipetten 1-5 gl (Brand, 708707), Trockenschrank, Min UVis UV-Lampe (Desaga), Spektralphotometer PMQ 3 (Hg-Lam- pe) (Zeiss), Potentiometerschreiber (Servogor), Sep-Pak (C1 s-Kartu- schen (Waters Assoc., Milford, MA, USA), 10 ml Luer Lock Spritze (Hamilton).

B. Chemikalien

Malzextrakt-Agar (Merck 5398), Tween 80 (Merck 822187), HT-2 Toxin (Makor Chem. Jerusalem, Israel 0763), Acetonitril (Merck 3),

n-Hexan (Merck 4367), Kaliumchlorid (Merck 4936), Natriumsulfat (Merck 6643), Dichlormethan (Merck 6050), Chloroform (Merck 2445), Methanol (Merck 6009), Benzol (Merck 1783), Aceton (Roth 5025), 4-(p-Nitrobenzyl)pyridin (Fluka 73210), Tetraethylenpenta- rain (EGA T 1150-9).

C. Mykotoxinbildung

HT-2 Toxinproduzent: Fusarium sporotrichioides (Sp.941)1. Den Pilz auf Schragr6hrchen mit Malzextrakt-Agar anziichten. Nachdem die Kulturen voll entwickelt waren (ca. 10 Tage), die Sporen mit 0,2%iger w/igriger Tween-80 L/Ssung abschwemmen. In 500-ml-Er- lenmeyerkolben jeweils 50 g der Nghrsubstrate (Reis, Mais, Hafer, Weizen, Roggen und Erbsen) mit 50 ml dest. Wasser versetzen und 15 min bei 121 °C und 2 bar autoklavieren. Nach dem Abkiihlen die Kolben mit jeweils 1 ml der Sporensuspension animpfen und bei Raumtemperatur (22-25 °C) etwa 3 Tage bebrfiten.

D. Herstellung und Reinigung der Extrakte

50 g der getrockneten Probe in einem Waring Blendor in Gegenwart yon 180 ml Acetonitril und 20 ml w/iBriger, 4%iger KC1-L6sung 1 min homogenisieren. Nach Absetzen der D/impfe (2 rain) den Ex- trakt filtrieren. 100 ml des Filtrates in einem 250-ml-Scheidetfichter zweimal mit je 50 ml n-Hexan ausschtitteln, das verworfen wurde. Anschliegend zweimal mitje 50 ml Dichlormethan ausschfitteln. Die Dichlormethan-Acetonitril-Phase mit Natriumsulfat trocknen, ill- trieren und am Rotationsverdampfer bei 40 °C unter Wasserstrahl- pumpenvakuum eindampfen. Den Rfickstand in einem m6glichst kleinen Volumen von Dichlormethan wieder 16sen.

Wenn bei Extrakten einiger verschimmelter Nahrungsmittel eine weitere Reinigung vor der DC notwendig war, obige L6sung anf eine Sep-Pak-Cls-Kartusche aufgeben. Das Dichlormethan dann mit Hilfe eiues FSns verdampfen. Die Kartusche zun/ichst mit 20 ml Me- thanol/Wasser (5+95) und dann mit 20 ml Methanol/Wasser (40+ 60) eluieren. Die erste Fraktion enth~ilt Substanzen, die polarer als HT-2 Toxin sind, wghrend HT-2 Toxin mit dem zweiten L6sungs- mittel eluiert wird. Das Methanol-Wasser-Gemisch anschliel3end abdestillieren und den Riickstand wieder in Dichlormethan aufneh- m e n .

E. Diinnschichtchromatographie

Rf-Werte yon HT-Toxin, 7"-2 Toxin und Aeetyl-T-2 Toxin. Zur Opti- mierung der Trennmethoden zun~ichst die RcWerte yon HT-2 To- xin, T-2 Toxin und Acetyl-T-2 Toxin (eigene Isolierung) [7] auf bei 150 °C (1 Std) aktivierten Kieselgel-DC-Platten bestimmen (Tabel- le 2). Um die Trichothecene sichtbar zu machen, die DC-Platten im AnschluB an die Chromatographic entweder mit 25%iger H2SO, be- spriihen und 10 rain anf 110 °C erhitzen (wodurch griingelb fluores- cierende Derivate erzeugt werden [8]), oder mit 4-(p-Nitrobenzyl)py- ridin (NBP) behandeln, wodurch ein blaues Kupplungsprodukt ent- steht [9].

Bestimmung des Toxingehaltes. HT-2 Toxinmengen von 100, 300, 500 und 700 ng sowie aliquote Teile der Extrakte auf derselben (ak- tivierten) Kieselgel-DC-Platte entsprechend einer friiheren Vor- schrift auftragen [6]. AnschlieBend zweidimensional in den Fliegmit- telsystemen Chloroform/Methanol (8,5+1,5) und Benzol/Aceton (7 + 3) chromatographieren. Die Platte mit Schwefels~ure behandeln und dann die Fluorescenzintensit~it der Flecken messen (Anregung bei 2 = 365 nm, Emissionsmessung oberhalb 390 urn) [8]. Die Peak- fl~ichen der Eichsubstanzen ergeben bei Auftragung gegen die HT-2 Toxinmenge eine Eichkurve (ira Bereich von 100-700 ng eine Gera- de), aus der man graphisch den Gehalt an HT-2 Toxin des untersuch- ten Extraktes ermitteln kann.

1 Dieser Schimmelpilz wurde uns freundlicherweise yon Prof. Dr. Leistner vonder BAF Kulmbach fiberlassen

R. Schmidt et al.: Bestimmung yon Trichothecenen HT-2 Toxin in Nahrungsmitteln 171

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Abb. 2. Zwei-dimensionale DC eines Extraktes von verschimmeltem Reis; A HT-2 Toxin, B T-2 Toxin, C Acetyl-T-2 Toxin, D Neosola- niol. Auch die senkrecht schraffierteu Flecken zwischen D und B zei- gen Trichothecen-Verhalten

E r g e b n i s s e und D i s k u s s i o n

Bei der Messung der R~-Werte zeigte sich, dab eine Er- h6hung der Polaritfit (bei den hier untersuchten Tri- chothecenen die Zahl der Hydroxylgruppen) zu einer Abnahme des Rf-Wertes fiihrt. Bei den Ziichtungsver- suchen wurde schon 2 Tage nach dem Beimpfen deut- liches Pilzwachstum und nach 3 Tagen erhebliche My- kotoxinmengen (HT-2 Toxin 4 p p m ) festgestellt. Durch DC liel3en sich mit Hilfe der verwendeten Fliel3- mittel neben HT-2 Toxin auch T-2 Toxin, Acetyl-T-2 Toxin [7] und Neosolaniol identifizieren. Zum Erzielen guter DC-Trennungen als Voraussetzung fiir eine feh- lerfreie quantitative Analyse ist es notwendig, die Plat- ten vor der Chromatographie 1 Std bei 150 °C im Trockenschrank zu aktivieren, da es sonst zu einer teil- weisen Uberlagerung yon Neosolaniol und HT-2 To- xin kommen kann. In Abbildung 2 ist das Chromato- gramm eines Reisextraktes dargestellt. Neben den identifizierten Substanzen A - D (s. die entsprechende Abbildungslegende) sind noch zwei grfin-gelb fluores- cierende Substanzen mit der Charakteristik yon Tri- chothecenen zu erkennen. Alle senkrecht schraffierten

Tabelle 3. Wiederfindung von HT-2 Toxin nach Zugabe zu auto- klaviertem Reis

Probe Wiederfindung a in %

1 90 2 95,5 3 86,5 4 87,5 5 81,5

a Mittelwert aus jeweils 2 Bestimmungen nach DC-Trennung und Fluorescenzintensit~itsmessung

Flecken zeigen positive Reaktion mit NBP. Wegen feh- lender Vergleichssubstanzen konnten diese beiden ver- muteten Trichothecene bisher noch nicht identifiziert werden.

Ohne Vorreinigung liel3 sich HT-2 Toxin in Reis- und Erbsenextrakten bestimmen. Fiir die anderen pflanzlichen Nahrungsmittel war die beschriebene Vortrennung notwendig. Die hier angegebene Analy- senmethode wurde u.a. fiberpriift, indem HT-2 Toxin (100 gg) mehrmals (5 Wiederfindungen) zu autokla- viertem Reis zugesetzt und ansehlieBend wieder be- stimmt wurde (Tabelle 3). Die Wiederfindungen waren besser als 80% bei einem Mittelwert yon 88_+ 7%.

Danksagung. Frau A. Bieger danken wir fiir die Betreuung des mi- krobiologischen Teils der Arbeit.

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Eingegangen am 19. April 1982