STED-Nanoskopie:Durchbrechens der Beugungsgrenze

Anleitung zu F68

30. November 2015

Inhaltsverzeichnis

I. Grundlagen 1

1. Atom- & Molekülphysik 2

2. Optik 4

3. STED 5

4. Fragen zu den Grundlagen 10

II. Durchführung 11

5. Software 12

6. Justage des Setups 13

7. Aufgaben 18

III. Auswertung 26

8. Pflichtaufgaben 27

IV. Anhang 29

A. Berechnung der STED Auflösung 30

B. Hinweise zur Darstellung mikroskopischer Bilder 34

Teil I.Grundlagen

1

1 ATOM- & MOLEKÜLPHYSIK

Der Grundlagenteil dieser Anleitung führt kurz die wichtigsten Begriffe ein, die zum Verständ-nis von STED-Mikroskopie und des Versuchsaufbaus notwendig sind. Dabei wird zunächst aufdie Atom- und Molekülphysik eingegangen, dann auf Optik und beugungsbegrenzte Mikrosko-pie und zuletzt auf STED.

1. Atom- & Molekülphysik1.1. Stimulierte EmissionEin System mit diskreten elektronischen Niveaus kann auf drei verschiedene Arten mit einemLichtfeld wechselwirken. Betrachten wir ein Atom (oder Molekül) mit den zwei EnergieniveausEi und Ek (Ei < Ek), so kann der Übergang des Elektrons von Ek nach Ei zunächst durchspontane Emission eines Photons der Energie Eν = Ek−Ei stattfinden. Die WahrscheinlichkeitW spki für diesen Prozess ist von einem äußeren Strahlungsfeld unabhängig und ist durch den

Einsteinkoeffizienten Aki gegeben:W spki = Aki . (1)

Für den Übergang vom tieferen ins höhere Niveau hingegen ist Energie notwendig, die voneinem Strahlungsfeld geliefert werden kann. Die Wahrscheinlichkeit Wik für diese Absorptioneines Photons der Energie Eν ist dann gegeben durch

Wik = Bik · u(ν) (2)

und somit abhängig von der Energiedichte u(ν) des Strahlungsfeldes bei der entsprechenden Fre-quenz.

Ei

Ek

Anregung StimulierteEmission

SpontaneEmission

Abbildung 1: Lichtinteraktion mit einem 2-Niveausystem

Um die Planck’sche Strah-lungsformel herleiten zu kön-nen, postulierte Einstein 1916,dass die Anwesenheit einesStrahlungsfeldes nicht nurzur Absorption führen, son-dern auch der Übergang vonEk nach Ei vom Strahlungs-feld induziert werden kann.Dabei wird vom Systemein Photon emittiert, sodasssich die Anzahl der Pho-tonen im Strahlungsfeld er-höht. Diese induzierte oderstimulierte Emission hat dieWahrscheinlichkeit

Wki = Bki · u(ν). (3)Dieser letzte Prozess ist bekanntermaßen der Mechanismus zur Erzeugung von Laserlicht. Erwird hier jedoch eingeführt, weil er auch die Umgehung der Beugungsgrenze in der Lichtmikro-skopie ermöglicht.

2

1.2 Fluoreszenz & Phosphoreszenz 1 ATOM- & MOLEKÜLPHYSIK

1.2. Fluoreszenz & PhosphoreszenzFluoreszenz ist ein Prozess der Photolumineszenz. Ein Mehrniveausystem wird durch Photonenin einen energetisch höheren Zustand angeregt und zerfällt kurz danach spontan durch Emissionvon Licht, wobei die Zerfallswahrscheinlichkeit exponentiell von der Zeit abhängt.Dabei spricht man von resonanter Fluoreszenz, wenn der angeregte Energiezustand wiedergenau in den Ausgangszustand zerfällt. In komplexen Molekülen, wie organischen Farbstoffen,ist die Wahrscheinlichkeit für resonante Fluoreszenz jedoch sehr gering (s.u.).Phosphoreszenz ist ebenfalls ein lumineszenter Prozess und wird von der Fluoreszenz auf

Grund der unterschiedlichen Zeitskalen der Prozesse unterschieden. Während fluoreszente Zu-stände Lebensdauern im Bereich von Nanosekunden (10−9 s) haben, dauert phosphoreszentesAbklingen 10−6 s bis 102 s. Der Grund für diese langen Lebensdauern ist, dass der entsprechendeÜbergang nach Spin-Auswahlregeln verboten ist.

1.3. Organische FarbstoffmoleküleDa biologische Proben für sichtbares Licht im wesentlichen transparent sind, werden bei derFluoreszenzmikroskopie die zu beobachtenden Regionen der Probe mit fluoreszenten Farbstoffenangefärbt (labeling). Da die Elektronenniveaus der Farbstoffmoleküle zusätzlich Schwingungs-zustände besitzen, kommt es wegen des Franck-Condon-Prinzips nicht zu resonanter Fluores-zenz. Dies wirkt sich in einer Rotverschiebung des Emmissionssprektrums im Vergleich zumAnregungs- (Absorptions-) Spektrum des Moleküls aus (Stokes-Verschiebung). Diese spektraleVerschiebung ist eine essentielle Voraussetzung für die Erweiterung der Fluoreszenzmikrosko-pie zur STED-Mikroskopie. Abbildung 2 zeigt ein gebräuchliches Farbstoffmolekül und seineSpektren.

Abbildung 2: Strukturformel und Spektren eines typischen Fluoreszenzfarbstoffes, ATTO565.http://www.atto-tec.com/uploads/media/Katalog.pdf

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2 OPTIK

2. Optik2.1. BasicsDer entscheidende Teil des Versuchaufbaus besteht aus optischen Komponenten. Deshalb wer-den sowohl theoretische als auch im Optimalfall praktische Kenntnisse (F85 - F87) der Optikfür den Versuch vorausgesetzt; folgende Begriffe sollten prinzipiell bekannt sein (zur Lektüresei verwiesen auf: [BEAS07], [Dem10]):

• Geometrische Optik:Lichtbrechung, Linsengleichung, Abbildung durch Linsensysteme, NA, Linsenfehler, Ver-wendung von Spiegeln und Linsen zur Manipulation von Laserstrahlen

• Polarisationsoptik:Polarisierende Strahlteiler, Verzögerungsplatten (λ/2, λ/4) zur Manipulation der Polari-sation

• Laseroptik:Diodenlaser, Eigenschaften und Kenngrößen gepulster Laser, spektrale Eigenschaften

• Detektoren:Photodiode, Avalanche Photodiode (APD), Photomultiplier Tube (PMT)

2.2. KonfokalmikroskopKonfokale Mikroskope (KM), ermöglichen die besten beugungsbegrenzten lichtmikroskopischenAuflösungen. Gleichzeitig kann ein KM zu einem STED Mikroskop erweitert werden, wie spätergezeigt wird. Aus diesem Grund soll hier kurz das Prinzip eines KM erklärt werden.

Beleuchtung Zur Beleuchtung wird in einem Konfokalmikroskop ein Laser verwendet, da ersich ideal fokussieren lässt und eine hohe spektrale Leistungsdichte ermöglicht. Das entschei-dende element des Mikroskps ist das Objektiv, das mit seiner hohen numerischen Apertur (NA)den Laserstrahl maximal in der Probe bündelt und zudem möglichst viel des zurückgestrahltenLichtes aufsammelt.

Scanning Um das vollständige Bild zu erhalten, wird die Probe Punkt für Punkt abgerastert.Dafür gibt es zwei Möglichkeiten: Beim stage scanning wird die gesamte Probe über den ortsfe-sten Strahl bewegt. Das in diesem Versuch zur Anwendung kommende beam scanning hingegenbenutzt mehrere motorisierte Spiegel, um den Strahl über die ortsfeste Probe wandern zu lassen.Wichtig für die spätere Anwendung mit STED ist, dass die relative Genauigkeit der Positiondes Laserstrahls (wenige nm) weitaus besser sein muss, als seine laterale Ausdehnung (wenige100nm).

Detektion Um das Fluoreszenzsignal auf einen feststehenden Detektor lenken zu können,muss dieses Licht in entegegengesetzter Richtung zum Anregungslicht durch den Scanner lau-fen (descanning). Da das zu detektierende Signal antiparallel zum Anregungslicht läuft, musses aus dem Strahlengang desselben separiert werden. Dies geschieht aufgrund der unterschied-lichen spektralen Eigenschaften von Absorption und Emission (siehe Abbildung 2) mit einem

4

2.3 Beugungsbegrenzte Auflösung 3 STED

Emission

Linse

Strahlteiler

Anregung

Detektor

Blende Objektiv

Scanner Fokalebene

3D Probe

Spiegel

Abbildung 3: Funktionsschema eines KM. Aufgrund der starken Fokussierung und der Konfoka-lisierung wird quasi nur Fluoreszenz aus der Fokalebene detektiert.

dichroitischen Strahlteiler (bzw. mit einem Bandpass Filter). Dann kann es in einem effizientenPhotonendetektor (APD oder PMT) nachgewiesen werden.Beim Konfokalisieren des Detektionslichtes wird der Beleuchtungsfokus auf eine Lochblende

vor dem Detektor abgebildet; das Licht außerhalb des Fokuspunktes wird ausgeblendet. Manerreicht so eine besonders hohe Tiefendiskrimnierung und erhöhte axiale Auflösung. Darausergibt sich ein besonders kontrastreiches Bild mit verbessertem Signal- zu Rauschverhältnis(SNR). Abbildung 3 skizziert den Strahlverlauf.

2.3. Beugungsbegrenzte AuflösungLange Zeit galt es als unumstößliche Tatstache, dass es aufgrund der Beugung von Licht einenminimalen Abstand ∆x gibt, den zwei Objekte haben müssen, um sie noch als getrennte Ob-jekte identifizieren zu können.Zuerst wurde dieser Sachverhalt der Wellenoptik 1873 von Ernst Abbe beschrieben. Eine Her-leitung, die seiner Argumentation folgt, findet sich beispielsweise in [LLT97]. Das bekannteErgebnis lautet

d =λ

2n sinα, (4)

wobei λ die verwendete Wellenlänge, n der Brechungsindex und α der halbe Öffnungswinkeldes abbildenden Systems ist (n sinα = NA).Diese Limit gilt genauso in die umgekehrte Richtung: Der Fokus eines Laserstrahls kann nichtkleiner sein als durch obige Formel gegeben.

3. STEDDie im vorigen Abschnitt vorgestellte beugungsbedingte Auflösungsgrenze galt lange als un-überwindbar. Allerdings ist die Auflösung eines Mikroskops nicht notwendigerweise durch dieGröße des Laserspots begrenzt. Wird etwa dafür gesorgt, dass nur ein Teil der Objekte imbeleuchteten Volumen ein Antwortsignal liefert, so rückt die (nach wie vor beugungsbegrenzte)Größe des Beleuchtungsspots in den Hintergrund.

5

3.1 Das STED-Prinzip 3 STED

Das Schalten zwischen quantenmechanischen Zuständen, die entweder fluoreszieren können(AN - Zustand) oder nicht (AUS - Zustand), liefert eine Möglichkeit um Lichtmikroskope jen-seits der Beugungsgrenze zu betreiben. Mittlerweile gibt es mehrere Verfahren, um diese hoch-auflösende Mikroskopie (Nanoskopie) zu realisieren. STimulated Emission Depletion (STED)Mikroskopie war dabei die erste Technik, weitere firmieren z.B. unter PALM, STORM und GS-DIM. Diese Methoden nutzen andere Versuchsanordnungen als STED, beruhen jedoch ebenfallsdarauf, dass immer nur ein Teil aller beleuchteten Moleküle AN ist.Im Folgenden wird das Prinzip von STED und seine praktische Umsetzung im Versuch er-

läutert. Der interessierte Leser sei für weiterführende Lektüre zu STED und den anderen hoch-auflösenden Techniken auf [Hel09] verwiesen.

3.1. Das STED-PrinzipEin STED-Mikroskop baut im technisch einfachsten Fall direkt auf einem Konfokalmikroskopauf. Um nun ein STED-Mikroskop zu realisieren, wird die Probe zusätzlich zum Anregungs-strahl mit einem rotverschobenen Laserstrahl (dem namesgebende STED-Laser) beleuchtet.Dieser kann durch stimulierte Emission die angeregten Farbstoffmoleküle zurück in den AUS-Zustand überführen. Die Auflösung kann nun erhöht werden, indem die angeregten Fluorophorein den äußeren Bereichen des Anregungsspots gezielt ausgeschaltet werden. Um dies zu errei-chen wird das Intensitätsprofil des STED-Lasers so gestaltet, dass es in der Mitte des Strahlseine Intensitätsnullstelle aufweist (Torusform bzw. Donut). Wird die Probe auf diese Art ab-gerastert, entsteht ein hochaufgelöstes Bild (siehe Abbildung 4).

3.2. Sättigungsintensität und Auflösung

Abbildung 5: Ausschaltkurve

Das Ausschalten durch stimulierte Emission ist ein sto-chastischer Vorgang: Die Wahrscheinlichkeit η, dassein Fluoreszenzmolekül angeschaltet bleibt, sinkt ex-ponentiell mit der eingestrahlten STED-Intensität: η =exp(− ln(2)I/Is). Die Sättigungsintensität Is gibt da-bei die Intensität an, bei der die Hälfte der angeregtenFluoreszenz gelöscht wird.Der Bereich um die Nullstelle des STED-Donuts kannin erster Ordnung quadratisch genähert werden: I =I x2/(d/2)2 . Der Proportionalitätsfaktor I kann empi-risch bzw. aus einer Simulation gewonnen werden, zeigtaber schon die Abhängigkeit von der Beugungsgrenzed. Somit ist η eine Gaußglocke in x:

ηSTED(x) = e− ln(2)I/Is = e− ln(2)I/Is ·x2/(d/2)2 . (5)

Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Fluorophor überhaupt durch den Anregungslaser angeregtwurde, ist ηan(x) = exp(ln(2)x2/(d/2)2) . Auch hier spiegelt sich das Beugungslimit in derHalbwertsbreite d wider (vgl. Formel 4 ). Insgesamt ergibt sich

η(x) = ηan(x) · ηSTED(x) = e− ln(2)(1+I/Is)x2/(d/2)2 (6)

6

3.2 Sättigungsintensität und Auflösung 3 STED

Anregung Fluoreszenz

Scan

ning

a)

d)c)

b)

Pixel(Zeile,Spalte)

Anregung& STED Fluoreszenz

(2,2)

(2,3)

(2,4)

2

3

2

1

0

2

beugungsbegrenzt, ohne STED mit STED

Anregung Fluoreszenz STED

Vibrationsrelaxation

10 s-15 10 s-9

10 s-12

10 s-12

S0

S1

10 s-15

Bildaufbau Bildaufbau

. . .

. . .

Abbildung 4: a) Abrastern einer Probe mit einem KM. Die erste Zeile ist bereits vollständigabgerastert. Das im jeweiligen Pixel gespeicherte Signal ist in etwa proportional zur Anzahl derfluoreszierenden Moleküle, was durch die blaue Zahl angedeutet werden soll. b) Die gleiche Probewird mit STED abgerastert. Dort, wo Anregungsstrahl und STED-Strahl gleichzeitig wirken,wird ein angeregter Farbstoff wieder AUS geschaltet und trägt nicht zum Signal bei. c) BeiSTED beteiligte Energieniveaus mit Zeitskalen der einzelnen Übergänge. d) Konfokale und STEDAufnahme vom gleichen Bildfeld. Die Probe besteht aus fluoreszierenden Beads, Maßstab 500 nm

Die Halbwertsbreite ∆x = d/√

1 + I/Is dieser Gaußglocke ist ein gebräuchliches Maß für dieAuflösung. Ausgeschrieben lautet die so gewonnene erweiterte Abbe’schen Formel:

∆x ≈ λ

2NA· 1√

1 + Imax/Is(7)

Hier ist Imax die maximale STED-Intensität im Fokus. Eine formale Herleitung dieser Formelanhand von Ratengleichungen ist im Anhang A aufgeführt.

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3.3 Strahlformung 3 STED

3.3. StrahlformungEine wichtige Voraussetzung für hohe Auflösungen im STED-Mikroskop ist, den STED-Laserzu einem möglichst perfekten Donut zu formen, währen der Anregungslaser ein maximal fokus-siertes Gaußprofil aufweist. Dazu werden die Laserstrahlen zumeist in der Pupillenebene (odereiner dazu äquivalenten Ebene) vor dem Fokussieren durch das Objektiv manipuliert.In vielen Aufbauten wird die Donutform des STED-Strahls vor dem Mikroskop durch reine

Phasenmodulation über eine Phasenschnecke erzeugt. Da Anregungs- und STED-Strahl hierbeinicht den kompletten Strahlengang teilen, liegen beide im Fokus des Mikroskops nicht auto-matisch übereinander. Schon kleine Drifts sorgen dafür, dass sich der STED-Donut nicht mehrüber dem Anregungsspot befindet - häufige und zeitraubende Justage der beiden Strahlen istnotwendig.Mittlerweile gibt es auch die Möglichkeit, die Strahlen zuerst zu überlagern und sie in eine

Monomoden-Glasfaser (single mode fiber) einzukoppeln. Erst nach der Auskopplung aus derFaser wird der Donut des STED-Strahls zu erzeugt, während der Anregungsstrahl ein Intensi-tätsprofil mit zentralem Maximum beibehält [Reu10]. Die Faser transmittiert nur die zentraleGaußmode TEM00 des Laserlichts und beide Strahlen verlassen sie perfekt überlagert undals Gauß-Strahl. So wirken sich alle Drifts auf beide Strahlen gleichermaßen aus - sie liegenimmer perfekt übereinander. Da dieser Ansatz stabiler und einfacher umzusetzen ist, wird ereasySTED genannt. Im Praktikum wird ein easySTED Mikroskop eingesetzt.

easySTED-Phasenplatte

Strahlpro�lPolarisation

+ i + i

segmentierte Phasenplatte

zirkulare Polarisation

optische Achse

resultierende Verteilunghinter SWP

Fokussie

rung

+ i Feld im Fokus

Intensitätim Fokus

Abbildung 6: Schematische Darstellung der verwendeten Phasenplatte zur Erzeugung des torus-förmigen Strahlprofils.

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3.4 Time Gated STED 3 STED

Das Kernelement eines easySTED-Aufbaus ist die sogenannte segmentierte Phasenplatte (seg-mented waveplate - SWP). Sie ermöglicht durch ihre Wellenlängenabhängigkeit, dass der Strahlder Wellenlänge λSTED im Fokus zu einem Donut geformt wird, während die Wellenlänge λexein annähernd unverändertes (gauß’sches) Profil beibehält. Diese SWP ist in Abbildung 6 dar-gestellt. Sie besteht aus vier doppelbrechenden Kristallen in verschiedenen Winkelstellungen,die für die Wellenlänge λSTED als λ/2-Plättchen wirken. Die einzelnen Segmente sorgen da-für, dass gegenüberliegende Teile des Strahls antiparallel zueinander polarisiert werden. BeimFokussieren durch das Objektiv erhält man deshalb im Zentrum destruktive Interferenz derTeilstrahlen.

3.4. Time Gated STED

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1x 10−8

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

t [s]

Fluo

resz

enz

[A.U

.]

Anregung

STED

Signal ohne STED

Signal mit STED

Gate

Signal mit Gate

30nm

36nm

Abbildung 7: Links: Schema zum Signalverlauf mit Gating. Fluoreszenz aus dem Zentrum desDonuts (’Signal ohne STED’) wird nicht stimuliert ausgeschaltet und zerfällt mit der natürlichenLebensdauer. Flurophore aus dem Randbereich wechseln durch stimulierte Emission deutlichschneller in den Grundzustand (’Signal mit STED’): Ohne Gating wäre dies als beugungsbegrenz-ter Hintergrund sichtbar. Rechts: Simulierte PSFs mit einem STED-Puls der Länge T = 2 ns undden entsprechenden Halbwertsbreiten. Oben ohne Gating, unten mit einem Gate, das nach 1.5 nsbeginnt.

Der angeregte Zustand eines Farbstoffmoleküls geht typischerweise mit einer Lebensdauer vonτfl ≈ 3 ns durch spontane Emission in den Grundzustand über. Werden angeregte Farbstoffmo-leküle mit einem STED-Laser (innerhalb des Emissionsspektrums) bestrahlt, können sie auchdurch stimulierte Emission in den Grundzustand zurückkehren (vgl. Abschnitt 1.1). WelcherProzess dominiert, hängt von der Pulsenergie des STED-Lasers ab. Ein effektiver STED-Effektkann nur beobachtet werden, falls der STED-Laser ausreichend viele Photonen innerhalb einesZeitintervalls liefert, das im Vergleich zu τfl klein ist.Im Optimalfall sind Anregungs- und STED-Puls kurz verglichen mit τfl. Für den Anregungs-

laser ist das im Versuch mit einer Länge von unter 100 ps der Fall. Der STED-Laser hingegenhat eine Pulslänge von ca. 1.5 ns. Deshalb werden während des Ausschaltvorgangs noch aus

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4 FRAGEN ZU DEN GRUNDLAGEN

dem gesamten angeregten Bereich emittierte Photonen detektiert. Dieser beugungsbegenzte Hin-tergrund verschlechtert die erreichbare Auflösung, wie in Abbildung 7 verdeutlicht wird. Umdiesen Effekt zu umgehen wird das sogenannte (Detektions) Time Gating verwendet. Hier-bei werden bei der Signalauslese nur Photonen berücksichtigt, die innerhalb eines bestimmtenZeitfensters (Time Gate) ankommen. Wird dieses Zeitfenster zeitlich hinter den STED-Pulsgeschoben, ist sichergestellt, dass kein Signal aus dem ’noch nicht ausgeschalteten’ Bereich zumBild beiträgt. Den Vorteil, den das Time Gating bringt, muss man gegen das bis zum GateStartpunkt emittierte (nutzbare) Signal eintauschen.

4. Fragen zu den Grundlagen• Was ist Fotobleichen von Fluoreszenzfarbstoffen und worauf beruht es?

• Wie ist die Punktantwort (PSF) eines abbildenden optischen Systems definiert?

• Wodurch wird bei einem KM die Auflösung (lateral und axial) bestimmt?

• Wann und warum werden Immersionsobjektive verwendet (Wasser n ≈ 1.3, Öl n ≈ 1.5)?

• Das Auflösungsvermögen eines KM kann man (im Prinzip) mit Hilfe von Streuung ankleinen Goldkügelchen (Goldbeads, ∅ ≈ 20 nm) bestimmen. Funktioniert das auch beiSTED? Warum nicht?

• Vervollständigen Sie die schematische Abbildung 3 eines KM zu einem easySTED Aufbau.

• Erklären Sie die Funktionsweise der easySTED Phasenplatte

• Wie funktioniert eine Avalanche-Photodiode und welche Parallelen bestehen zu einemPhotomultiplier?

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Teil II.Durchführung

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5 SOFTWARE

Bitte beachten Sie bei der Durchführung des Versuches, dass der Aufbau auch zurForschung verwendet wird. Die Komponenten sind zum Teil sehr teuer und empfind-lich. Benutzen Sie nur Geräte, die Sie kennen und bedienen können. Insbesondere dieOptiken (v. a. das Objektiv) bedürfen äußerst sorgsamer Handhabung. Vielen Dank!

Abbildung 8: Aufbau. 1. Galvanometernetzteil 2. Kamera 3. Hilfsfaser 4. Powermeter 5. Mikro-skopstativ und Probentisch 6. Strahlführung zum Objekt und Detektor 7. Laser und -einkopplung

5. SoftwareBei der Durchführung des Versuches kommt Software zum Einsatz, die speziell für die Verwen-dung und Simulation des STED-Mikroskops entwickelt wurde. Beide Programme werden in derArbeitsgruppe im täglichen Betrieb verwendet. Sie sind daher sehr umfangreich und können aufden ersten Blick unübersichtlich erscheinen. Am Praktikumssetup liegen jedoch Bedienhilfenaus, in denen die für Sie nötigen Funktionen beschrieben werden. Lassen Sie sich die Programmeaußerdem von Ihrem Betreuer erklären bzw. wenden Sie sich bei Fragen an ihn.

Quad-Scanner

Zur Experimentsteuerung kommt das LabView-Programm QUAD-Scanner zum Einsatz. Essteuert über eine FPGA-Karte die Laser und den Strahlscanner. Es nimmt die Signale der

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6 JUSTAGE DES SETUPS

APD bzw. der PMT entgegen und erlaubt die Aufbereitung und die Anzeige der Rohdaten.

PSF-Rechner

Zur Simulation von point spread functions und auch des gesamten STED-Prozesses steht dasProgramm PSF-Rechner zur Verfügung. Es berechnet die vektoriellen (elektromagnetischen)Lichtfelder in der Umgebung der Fokusebene. Da in der Mikroskopie hohe numerische Aperturenauftreten, sind die gebräuchlichen skalaren Näherungen der Lichtfeld-Berechnung nicht mehrausreichend.

6. Justage des SetupsACHTUNG: Bitte beachten Sie während der gesamten Durchführung des Versuchs die Grund-regeln der Lasersicherheit. Legen Sie reflektierende Elemente wie Uhren oder Schmuck ab, wennSie am Aufbau arbeiten. Vergewissern Sie sich stets über den Status der Laser und sprechen Siesich mit Ihrem Partner ab, bevor Sie Ihren Kopf auf Strahlhöhe bringen. Sie gefährden sonstnicht nur sich selbst, sondern auch Ihren Partner.

Der gesamte optische Aufbau ist zu Beginn des Praktikums bereits justiert. Bis auf dasEinkoppeln des STED-Lasers in die Faser ist die Justage nicht Aufgabe des Praktikums. Deroptische Aufbau zwischen Faser und dem Mikroskopstativ (Abbbildung 11) ist extrem justage-empfindlich. Eine geringe unkontrollierte Verstellung macht meistens eine gesamte Feinjustagenotwendig, was den Ablauf des Praktikums erheblich verzögern kann. Ändern Sie deshalb bittekeine Einstellungen in diesem Teil des Aufbaus, ohne mit Ihrem Betreuer gesprochen zu haben.

6.1. Faserkopplung

Abbildung 9: DirekteLaseransteuerung, oh-ne Scanning

Das Lasersystem (siehe Abbildung 10) besteht aus einem Anregungs-laser und zwei STED-Lasern. Beim Anregungslaser handelt es sich umeinen Halbleiterlaser, der Picosekundenpulse bei 560 nm emittiert. AlsSTED-Laser kommen zwei DVD-Laserdioden (660 nm) zum Einsatz,die ebenfalls gepulst betrieben werden und über einen polarisierendenStrahlteilerwürfel kombiniert werden. Alle Laser werden zusammen ineine Faser gekoppelt, wie im Abschnitt 3.3 zu easySTED erläutert.

Grobjustage

Der Anregungslaser und einer der STED-Laser sind zu Beginn schonin die Faser gekoppelt. Ihre erste Aufgabe ist es den zweiten STED-Laser ebenfalls in die Faser zu koppeln. Machen Sie sich zunächst mitder Laserdirektansteuerung (Abbildung 9) der QUAD-Scanner-Softwarevertraut und schalten Sie den entsprechenden Laser an. Bringen Sie denlosen Spiegelhalter in eine Position, in der Laserstrahl möglichst in rech-tem Winkel zum Faserkoppler gespiegelt wird. Achten Sie darauf, dassder Strahl mittig den Spiegel und den polarisierenden Strahlteiler trifft.

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6.1 Faserkopplung 6 JUSTAGE DES SETUPS

Abbildung 10: Laser und Einkopplung. 1. Die STED-Laser 2. Spektralfilter zum Abschwächen 3.Anregungslaser 4. Polarisierender (oben) und dichroitischer (unten) Strahlteiler. 5. Faserkoppler

Schrauben Sie ihn mit der Pratze auf dem optischen Tisch fest. Die Schraube sollte sehr festsitzen (bitte mitdenken: nach fest kommt ab!).Um möglichst viel Licht durch die Faser zu transmittieren (theoretisch möglich sind bis zu

70%), müssen Auftreffort und -winkel sehr präzise mit der Orientierung des Faserkerns überein-stimmen. Um alle Freiheitsgrade einstellen zu können, steht mit den beiden optomechanischenHaltern für Ort und Winkel in horizontaler und vertikaler Richtung je eine Schraube zur Ver-fügung (insgesamt 4). Da die beiden Parameter nicht nacheinander separat eingestellt werdenkönnen, kommt später das iterative Beam-walking zur Anwendung.Schrauben Sie zunächst die Faser vom Koppler ab und zielen Sie mit den Justageschrauben

des Laserhalters und des gerade angeschraubten Spiegelhalters auf das Zentrum des Faserkopp-lers, bis der Strahl möglichst symmetrisch (in Lage und Winkel) austritt. Dann nehmen Sieeinen (alten) Spiegel, drücken ihn plan gegen den Faserkoppler (Laserschutz beachten!!) undrichten den reflektierten Strahl mit den Schrauben des Spiegelhalters auf den Laser aus 1. Wie-derholen Sie die Schritte bis per Augenmaß sowohl der Strahl am Faserkoppler, als auch derreflektierte Strahl am Laser zentrisch auftrifft.Schrauben Sie nun die Hilfsfaser ein und überprüfen Sie (Faserende dicht an eine weiße

Fläche halten), ob bereits Licht durch die Faser gelangt. Falls dies nicht der Fall ist, sollte essich durch geringfügige Änderungen an einer Schraube erreichen lassen. Andernfalls sollte der

1Einen Laserstrahl in seine Laserquelle zu reflektieren ist nur bei unempfindlichen Lasern (wie den hier ein-gesetzten Halbleiterlasern) zu empfehlen. Viele Lasertypen können durch einen solchen externen Resonatorzerstört werden

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6.2 Beleuchtungsstrahlengang 6 JUSTAGE DES SETUPS

Strahl erneut bei abgeschraubter Faser zentriert werden.Geht Licht durch die Faser, suchen Sie eine möglichst helle Einstellung mit Hilfe der vier

Schrauben. Nach diesem Schritt sollte die Kopplungseffizienz (Messung der Leistung vor undhinter der Faser) schon mindestens einige Prozent betragen.

Feinjustage

Entfernen Sie nun die Hilfsfaser und verwenden Sie ab sofort die Faser, die zum Mikroskopstativführt. Stellen Sie das Powermeter so auf, dass der Messkopf vor dem Scanner steht (Vorsicht,möglichst keine anderen Komponenten des Aufbaus dabei berühren) und optimieren Sie dieLasereinkopplung. Lassen Sie sich dazu nochmals erklären, wie sie möglichst effizient das Beam-walking betreiben. Die Transmissionseffizienz des Laserlichts durch die Faser sollte mindestens50% − 60% betragen. Optimieren Sie zum Abschluss alle Lasereinkopplungen der Reihe nach,beginnend mit dem grünen Laser (Wellenlänge am Powermeter ändern). Nach dem grünenLaser optimieren Sie den bereits voreingestellten STED Laser und danach den von Ihnen selbstaufgebauten Strahlweg (warum diese Reihenfolge?).

6.2. BeleuchtungsstrahlengangIn diesem und im nächsten Abschnitt wird der Aufbau zwischen Faser und Mikroskop be-schrieben (s. Abb. 11). Justieren Sie bitte nicht ohne Absprache nach. Verwenden Sie zumNachvollziehen des Strahlengangs im Folgenden den grünen Laser.Hinter der Faser befinden sich zunächst zwei Spiegel, mit denen der Laserstrahl (durch Beam-

walking), auf die Achse des Scanners ausgerichtet werden kannn. Dann folgt ein doppelterBandpass Filter, der die Beleuchtung von der Detektion trennt. Der Strahlscanner ist um diePosition des Mikroskop-Zwischenbildes herum am Sideport des Stativs angeflanscht. Durch diezwei Galvanometerspiegelpaare kann der Laserstrahl durch das Zwischenbild bewegt werden.So lässt sich jeder Punkt in der Probenebene adressieren.

Abbildung 11: Strahlengang vor Stativ und Detektor. 1. Objekttisch 2. Sperrfilter 3. Detektor(APD) 4. Strahlscanner 5. Multibandpass 6. Faserauskoppler. Anregung: grün, STED-Lich: rot,Fluoreszenzlicht: orange

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6.3 Auflegen von Proben und Fokussuche 6 JUSTAGE DES SETUPS

6.3. Auflegen von Proben und FokussucheAuflegen der Probe Im weiteren Verlauf des Versuchs werden Sie mehrfach die Probe wech-seln und den Fokus suchen müssen. Vor dem Auflegen sollten Sie gegebenenfalls vom Objektivund dem Deckglas der Probe mit einem Labortuch (vorsichtig!) altes Immersionsöl entfernen.Bringen Sie nun einen kleinen Tropfen neues Öl auf die Mitte des Objektivs auf und legen Siedie Probe vorsichtig in die passende Aussparung des Probentischs.

Fokussuche Aufgrund der hohen Apertur und der Konfokalisierung wird nur Licht aus derunmittelbaren Umgebung (wenige 100 nm) der Fokusebene detektiert. Zwar ist das absoluterwünscht, erschwert aber erst einmal die hier sehr dünne Schicht von Beads in die Fokusebenezu bekommen. Um die Suche schon in der Nähe des Fokusses zu starten, drehen Sie mit denProbentischschrauben die Probe soweit in Richtung Objektiv, bis sich der Ölfleck, der vonoben zwischen Deckglas und Objektiv sichtbar ist (s. Abb. 12), nicht mehr weiter vergrößert.Dann liegt die Probe auf dem Objektiv auf. Achtung: nicht noch weiter runter drehen, sonst

Abbildung 12: Deckglas auf Objektiv

zerstören Sie die Probe! Von dieser Position aus finden Sie die korrekte Fokuslage grob einehalbe ’Schraubenumdrehung’ weiter oben.

6.4. DetektionsstrahlengangNun sollen Sie überprüfen, ob das emittierte Signal sauber auf den Detektor abgebildet wird.Legen Sie die Probe ’Goldbeads 1:5’ auf. Drehen Sie die Probe so, dass das verspiegelte Viertelbeleuchtet wird. Der Reflex dieses Spiegels kann verwendet werden um den Detektionsstrahlen-gang zu visualisieren. Decken Sie mit einem Papier das Loch ab, durch das der Detektionsstrahlin die abgedunkelte Detektorbox fällt und ziehen Sie den Netzversorgungsstecker aus der APDum diese vor zu viel Licht zu schützen. Aktivieren Sie den grünen Laser (s. Abb. 9) und suchenSie mit den senkrechten Schrauben am Objekttisch den Fokus. Um dem Fokus nahe zu sein,muss der reflektierte Strahl auf dem Papier vor der Detektorbox möglichst fokussiert sein.Verwenden Sie zunächst den xzt-Scanmodus (siehe Abbildung 13 und aktivieren Sie den grü-

nen Laser. Starten Sie den Prescan-Modus (vgl. Hauptfenster in Abb. 17). Durch das Scannen

16

6.4 Detektionsstrahlengang 6 JUSTAGE DES SETUPS

sehen Sie seine Größe schwanken (woher kommt der zweite Punkt auf dem Papier?). NehmenSie den Deckel der Detektorbox ab und klappen Sie den Sperrfilter aus dem Strahlengang(Abbildung 11).

Abbildung 13: Scanmodi

Schieben Sie das Karbonröhrchen vor dem Detektor zurück, umdas Auftreffen des Strahls auf dem Detektor zu kontrollieren. DieDetektorfläche mit einem Durchmesser von 100 µm dient in diesemAufbau als Pinhole der Detektion. Sollte der Strahl nicht treffen,informieren Sie Ihren Betreuer.Stoppen Sie den Scan, bringen Sie alles wieder in Ausgangsstel-

lung (außer den Sperrfilter). Regeln Sie mit dem Clean-up Filterdie Intensität des grünen Lasers so weit herunter, dass Sie es mitdem Auge gerade noch sehen und versorgen Sie die APD mit Strom.Starten Sie den Scan. Nun sollte der Spiegel als horizontahorizon-taler Strichler Strich sichtbar werden. Justieren Sie ggf. den Fokusnach oder passen Sie die Helligkeit an. Stellen Sie den Fokus mit Hil-fe des Schiebereglers genau auf die Mitte des Bildfeldes. Die QUAD

Scanner Software gibt Ihnen einen ungefähren Wert für die Halbwertsbreite des Spiegellinie an(unter y- Richtung, siehe Abbildung 17). Liegt dieser zwischen 600 nm und 800 nm, und zeigensich außerdem keine ausgeprägten oder asymmetrischen Nebenmaxima, so ist die Detektiongut eingestellt und das Mikroskop kann verwendet werden. Ansonsten informieren Sie IhrenBetreuer, damit er die Detektion mit Ihnen feinjustiert.

17

7 AUFGABEN

7. Aufgaben7.1. Aufnahme von GoldbeadsUm das fertig justierte abbildende System zu charakterisieren, muss ein Bild der lateralen (x-y-Objektebene) und der axialen (x-z-, bzw. y-z- Ebenen) Punktantwort (PSF) aufgenommenwerden. Dazu eignen sich streuende Objekte wie z.B. Goldkügelchen, sog. Goldbeads. SolcheBeads befinden Sich auch in der Probe mit der der Detektionsstrahlengang überprüft wurde.Stellen Sie eine Stelle neben dem Spiegel auf der Goldbead-Probe scharf. Nehmen Sie mit einemxyt-Scan und einem xzt-Scan die Umgebung eines Goldbeads unter Beleuchtung mit 560 nmauf. Blaue Pixel im Bild deuten auf einen übersättigten Detektor hin - die Intensität sollte indem Fall noch weiter reduziert werden.

7.2. Aufnahme von fluoreszierenden Beads und NA

Abbildung 14: Dasverwendete Objektiv.

Um das Mikroskop nun in seiner Funktion als Fluoreszenzmikroskop zutesten, soll eine Probe von 200 nm großen Kügelchen, die mit einem fluo-reszierenden Farbstoff gefüllt sind, betrachtet werden. Tauschen Sie dazudie Goldbeadprobe gegen eine Probe mit 200 nm großen fluoreszentenBeads aus. Klappen Sie den Sperrfilter, welcher nur Licht der Wellenlän-ge λ = 595 nm±25 nm transmittiert, zurück in den Detektionsstrahlen-gang. Durch ihn kann kein störender Linsenreflex der Beleuchtung in denDetektor gelangen. Stellen Sie durch einen xzt-Scan den Fokus grob ein.Die Auflösung eines Lichtmikroskops ist (in skalarer Näherung) inversproportional zur Numerischen Apertur des Systems (vgl. (4)). DurchVergrößerung/Verkleinerung der Blende des Mikroskops kann die Nu-merische Apertur in einem Bereich von 1.4 bis 0.7 durchvariiert werden.Voraussetzung hierfür ist jedoch, dass das Objektiv voll ausgeleuchtetwird. Nehmen Sie von der aufliegenden Probe jeweils ein Bild mit mi-nimaler und maximaler Apertur auf. Die Blende im Objektiv lässt sichmit Hilfe des geriffelten Rings (Abbildung 14 ) verändern, der minimaleWert liegt beim Stop dieses Rings, für den maximalen Wert muss er etwaeine halbe Umdrehung gegen den Uhrzeigersinn (Blickrichtung in Laserstrahlrichtung) gedrehtwerden.

7.3. Manipulation der PhasenplatteDie Phasenplatte erzeugt die torusförmige STED-Intensitätsverteilung und ist somit essentiellfür die Auflösungsverbesserung, die mit dem System erreicht werden kann. In dieser Aufgabesoll Ihre Wirkungsweise durch Manipulation der Polarisation von Teilstrahlen untersucht wer-den. Dazu wird der STED-Strahl auf eine CCD Kamera fokussiert, wofür eine vormontierteOptik bereitsteht (Abbildung 15). Drehen Sie den Revolver des Mikroskopstativs so, dass diePhasenplattenhalterung mit der Aufschrift 660 nm oben ist und schrauben Sie den Messing-halter anstelle des Objektivs auf die Phasenplattenhalterung. Setzen Sie das Gestänge mit derKamera auf den Messinghalter. Vorsicht: überprüfen Sie zuerst, dass die Kamera fest auf demGestänge sitzt und kein Loses Teil auf den Aufbau fallen kann! Benutzen Sie zunächst keinenPolfilter. Stellen Sie den Strahlscanner auf die Mitte des Bildfelds ein und schalten Sie einen

18

7.4 Gating und Pulstiming 7 AUFGABEN

Abbildung 15: Vorrichtung zur Charakterisierung der Phasenpalatte. (1), (2), (4): Linsen zurFokussierung des Strahls auf der CCD Kamera (5). (1) verfügt über eine Feinverstellung desFokusses. (2) kann lateral verschoben werden um das Bild zu zentrieren. Am unteren Bildrandsind der Messinghalter für das Gestänge und der Polfilter zu sehen. Letzterer kann in den Halter(3) eingesetzt werden.

der roten Laser an. Schauen Sie sich das Bild mit dem Programm IC Capture an und suchenSie den Fokus. Dabei erscheint der Donut deutlich erkennbar, aber als sehr kleine Struktur aufder Kamera. Achten Sie darauf, dass die Kamera nicht übersättigt ist und reduzieren Sie ggf.die Lichtleistung noch weiter. Speichern Sie ein Bild des torusförmigen Strahlprofils ab.Setzen Sie dann den Polfilter vor die Kamera. Welche Funktion hat er und welchen Effekt

erwarten Sie dementsprechend bei Verwendung an dieser Stelle? Schalten Sie einen der STED-Laser an und betrachten Sie die resultierende Intensitätsverteilung. Drehen Sie den Filter undspeichern Sie zwei Bilder, wobei Sie den Polfilter zwischendurch um 90◦ drehen. Benutzen Sienun den anderen STED Laser und schauen Sie schließlich die Intensitätsverteilung beider Laserzusammen an. Sollten Sie während dieses Versuchsteils eine Asymmetrie im Intensitätsmusterder STED Strahlen feststellen, informieren Sie Ihren Betreuer. Dies deutet auf eine Dejustagehin, die es später erschwert gute STED Aufnahmen zu machen.Schalten Sie nun nur den grünen Laser an und entfernen Sie den Polfilter. Evtl. müssen Sie

den Fokus neu einstellen. Speichern Sie auch hier ein Bild ab.

7.4. Gating und PulstimingGating In der Tabelle mit der Überschrift Detector channels (siehe Abbildung 16) imQUAD-scanner-Programm können Sie die Time Gating Einstellungen vornehmen. Sie können

19

7.4 Gating und Pulstiming 7 AUFGABEN

Abbildung 16: Konfiguration der Laser und Detektionskanäle. In diesem Beispiel wird die volleRepetitionsrate genutzt (die oberen ’pulse’ Matrizen sind vollständig aktiviert). Nur ein Detek-tionskanal ist aktiv (line 0, dabei sind der Anregungslaser (560 ) und ein STED-Laser (660 )aktiv.

(bei jedem der maximal vier Detektionskanäle) ein Zeitfenster (Gate) auswählen, während demdas Detektorsignal ausgelesen werden soll. In der Tabelle können Sie Startzeitpunkt (ns delay)und die Länge des Gating-Zeitfensters (ns gate) einstellen. Beachten Sie, dass die vier Kanäleleicht unterschiedliche Signallaufzeiten aufweisen können und der Startzeitpunkt dementspre-chend für alle Kanäle einzeln kalibriert werden sollte. Dazu stellen Sie zum Beispiel auf eineGoldbead-Probe oder einen Spiegel scharf, beleuchten mit dem grünen Anregungslaser undverschieben für jeden Kanal den Startzeitpunkt des Gates so lange(in welche Richtung?), biskein Signal mehr detektiert wird. Die Gate-Länge sollte einige Nanosekunden betragen. Wirddie Länge auf den speziellen Wert 0 gesetzt, wird das Gating deaktiviert und die ganze Zeitdetektiert. Diese Einstellung wird im folgenden Abschnitt benötigt.

Pulstiming Die zeitliche Abfolge des Anregungs- und STED-Pulses muss für einen möglichstguten STED-Effekt sehr genau eingestellt sein. Vergegenwärtigen Sie sich nochmals, warum derSTED-Puls weder zu spät, noch zu früh kommen darf. Die Pulse sind zu Praktikumsbeginn bisauf wenige Nanosekunden so eingestellt, dass Sie in etwa gleichzeitig starten. Ihre Aufgabe ist esnun, diese Einstellung zu optimieren. Dieser Schritt ist notwendig, weil die elektronischen Trig-gersignale, die die Pulse auslösen, täglichen Schwankungen von einigen hundert Pikosekundenunterliegen können.Ein möglichst guter STED-Effekt ist erreicht, wenn die angeregten Fluorophore durch das

STED-Licht möglichst effizient per stimulierter Emission zurück in den Grundzustand (AUS-)geschaltet werden. Werden etwa fluoreszente Beads erst angeregt und direkt darauf durch dasSTED-Licht wieder ausgeschaltet, ist das Timing genau dann am besten, wenn das entstehendeBeadbild möglichst dunkel ist (wieviel dunkler sollte es in diesem Aufbau etwa werden können?).Dazu Schrauben Sie das Objektiv auf ein Auge des Objektivrevolvers, das keine Phaseplatten-halterung trägt (was ändert sich, wenn die Laserstrahlen die Phasenplatte nicht durchlaufen?),schrauben den Probentisch wieder an (so, dass er nicht wackelt, aber nicht zu fest) und legendie fluoreszente Probe mit den 200 nm großen Beads auf (Öl nicht vergessen).

20

7.5 Messung der Sättigungsintensität 7 AUFGABEN

Das Verschieben der Lasertimings geschieht in der Matrix Laser channels im Quad-Scanner(s. Abb. 16) in der Zeile ns delay. Wie dort zu sehen, soll zunächst der Anregungslaser undeiner der STED-Laser, sowie ein Detektionskanal (z.B. line 0) aktiviert sein. Sind die fluo-reszenten Beads im Fokus, wird nun das Timing des STED-Lasers verschoben, bis das Bildmöglichst dunkel wird. Am einfachsten wird im prescan-Modus der Cursor in das Feld ns delaygesetzt und mit den Pfeiltasten oder dem Scrollrad der Maus verschoben. Anschließend wirddieses Prozedere mit dem zweiten STED-Laser wiederholt. Sind die (relativen) Einstellung derbeiden STED-Laser gefunden, können auch beide gemeinsam über das Feld common delay (kei-ne negativen Werte möglich) gegen den Anregungslaser verschoben werden. Notieren Sie diegefundenen Werte für die Laser Delays unbedingt, denn bei einem Neustart des Programmswerden die Default-Werte wiederhergestellt.

7.5. Messung der SättigungsintensitätDie Sättigungsintensität Is ist ein Maß dafür, wie viel STED-Intensität benötigt wird um ange-regte Fluorophore mit fünfzigprozentiger Wahrscheinlichkeit ’auszuschalten’ (s. Abschnitt 3.2).Sie ist definiert als

Is = hν · ln(2)/σstT (8)mit der Photonenenergie hν und der STED-Pulsdauer T (siehe Anhang 18). Somit ist sie vomverwendeten STED-System abhängig. Wie in Gleichung 7 gezeigt wurde, kann man bei bekann-ter Sättigungsintensität die erreichbare Auflösung abschätzen. Diese Größe sollen Sie nun mitHilfe des exponentiellen Abklingens der Fluoreszenz bei verschiedenen STED-Laserleistungenbestimmen (vgl. Abb. 5 in Abschnitt 3.2). Auch hier verwenden Sie die Probe mit den 200 nmgroßen fluoreszenten Beads.Da die Messung nicht durch ’frühe’ Photonen aus dem beugungsbegrenzten Hintergrund (vgl.

Abschnitt 3.4) verfälscht werden soll, stellen Sie ein Gate ein, das eine Detektion erst nach demEnde des STED-Pulses zulässt, also etwa einen Wert von 1.5 im Feld ns delay.Messen Sie als erstes die Anregungsleistung. Zu starke Anregung kann die Messung verfäl-

schen und später auch die Auflösung verschlechtern. Eine Pulsenergie des Anregungslaser vonetwa 0.5 pJ vor dem Scanner reicht aus. Überlegen Sie sich nun geeignete Messpunkte, um denexponentiellen Abfall der Bead-Helligkeit möglichst gut einzufangen. Da alle Beads etwas unter-schiedlich hell sind, ist es zweckmäßig, den Quotienten der Helligkeit mit und ohne STED-Lichtfür alle Beads separat zu bilden und anschließend über mehrere Beads zu mitteln.Beispielhaft sind in Abb. 18 nur die Anregung als Referenz in line 0 und Anregung sowie

STED für die restlichen drei Detektionskanäle in line 1 verwendet um für jeden Bead schnellerStatistik zu gewinnen. Dazu sollte das Timing der einzelnen Kanäle wie beschrieben kalibriertsein.Die ’Helligkeit’ der Beads kann im Quad-Scanner links im Reiter view und dann measure

ermittelt werden (vgl. Abbildung 17). Dazu wird das grüne Kreuz im Display auf den zu vermes-senden Bead zentriert. Anschließend wird das blau gestrichelte Quadrat im Display so gewählt,dass es den Bead gerade umschließt. Ein Klick auf grab center startet den zweidimensionalenGaußfit. Der Parameter FWHM gibt die Halbwertsbreite an, der Parameter amp ist ein Maß fürdie Helligkeit des Beads.Beginnen Sie die Messung der Sättigungskurve, indem Sie ein eher kleines Bildfeld mit einigen

Beads auswählen und darin die Fluoreszenz mit und ohne aktiviertem STED-Laser (warum istein STED-Laser in diesem Fall ausreichend?) messen. Notieren sie ebenfalls die Halbwertsbreite

21

7.5 Messung der Sättigungsintensität 7 AUFGABEN

Abbildung 17: Messwertanzeige in der Software. Rot umrandet und vergrößert sind die Werte fürden zweidimensionalen Gaußfit. Wichtig sind die Werte für die Halbwertsbreite FWHM und unddie Amplitude amp.

(FWHM) (wozu?). Ändern Sie mit dem Clean Up-Filter vor der Faser die STED-Leistung, messendiese erneut um dann wieder die Fluoreszenzlevels zu messen. Legen Sie eine Messreihe mit7-10 verschiedenen Leistungswerten an.Achten Sie auf eine ausreichend hohe Helligkeit und wechseln Sie ggfs. den Bildausschnit,

damit Photobleichen die Messung nicht verfälscht. Überprüfen Sie regelmäßig den Fokus!Es hat sich bewährt, die Konsistenz der Messwerte durch eine grobe Auswertung (z.B. in

Excel) zu überprüfen, bevor Sie mit den nächsten Versuchsteil fortfahren: Passen die Messwertein etwa auf zu einem exponentiellen Abfall gemäß Abb. 18? Andernfalls ist eine Fehlersucheund erneute Messung ratsam.

Checkliste

� Anregungsleistung eingestellt?

� STED-Leistung für 7-10 sinnvoll gewählte Messpunkte eingestellt?

� Für jeden Leistungswert an mehreren Beads Amplitude und Halbwertsbreite vermessen?

� War die Probe immer im Fokus?

� Quotient der Amplituden mit und ohne STED gebildet und grobe Auswertung geplottet?

22

7.6 Optional: Herstellung von fluoreszenten Proben 7 AUFGABEN

Abbildung 18: beispielhafte Laser- und Detektionskonfiguration um gleichzeitig ein beugungsbe-grenztes und drei Bilder mit STED aufzunehmen.

7.6. Optional: Herstellung von fluoreszenten ProbenStellen Sie eine Probe von Red Fluorescent oder Nile-Red Beads her. Insbesondere Proben mitkleineren fluoreszenten Beads neigen zum Auslaufen (weshalb tritt das vor allem bei kleinerenBeads auf?). Der enthaltene Farbstoff verteilt sich in der Probe und senkt den Kontrast. Deshalbsind frische Proben vor allem für die folgend Aufgabe wichtig. Lassen Sie sich das Prozederevon ihrem Betreuer zeigen.Eine technische Probe mit fluoreszenten Beads wird wie folgt hergestellt:

1. Probenplättchen mit Ethanol reinigen

2. Mit 200 µl Poly-L-Lysin beschichten und 5-10 Minuten inkubieren lassen

3. Mit destilliertem Wasser waschen

4. Bead-Lösung im gewünschten Mischungsverhältnis mit dest. Wasser (1:40 000) herstellen

5. 200 µl Bead-Lösung auf Probenplättchen aufbringen und 10 Minuten inkubieren lassen

6. Mit destilliertem Wasser waschen und mit Druckluft trocknen

7. Mit 20 µl Mowiol oder TDE mit einbetten

8. Probe mit Nagellack versiegeln und beschriften

7.7. Time Gated STEDNun soll das volle Potential des Mikroskops ausgeschöpft werden. Sie werden die Auflösungsver-besserung durch STED zuerst an einer technischen Probe mit farbstoffgefüllten Beads untersu-chen. Verwenden Sie eine Probe mit geringerer Dichte als zur Messung der Sättigungsintensität(z.B. red fluorescent beads, ø 40 nm, 1:40.000). Die kleineren Beads beinhalten viel weniger

23

7.8 Mikroskopie einer biologischen Probe 7 AUFGABEN

Farbstoff (wieviel weniger?) und sind entsprechend dunkler. Deshalb sollte die Anregungslei-stung entsprechend angepasst und verschiedene Werte getestet werden.Bestimmen Sie als erstes gute Parameter für das Time-Gating. Verwenden Sie dazu verschie-

dene Detektionskanäle, mit unterschiedlichen Gating-Einstellungen. Bevor Sie allerdings dieSTED-Laser jeweils aktivieren, stellen Sie immer sicher, dass Sie sich im Fokus befinden. Ma-chen Sie dazu mit ’PreScan’ Aufnahmen mit großer Pixelgröße und kurzer Pixelverweildauer(Dwell Time) (z.B. 20 µs, 100 nm) , die Sie im Kasten pixel size in Abb. 17 einstellen können.Suchen Sie mit dem z-Regler den Fokus. Danach stellen Sie für eine große Photonenausbeuteeinige 100 µs Dwell Time und eine geeignete Pixelgröße für die STED-Aufnahme ein. Die ge-eignete Pixelgröße hängt von der anvisierten Auflösung ∆x ab, Stichwort undersampling, alsFaustregel gilt höchstens ∆x/2. Wählen Sie einen Kanal aus, der das beugungsbegrenzte Bildaufnimmt und machen Sie mit den anderen Kanälen STED-Aufnahmen mit Gating. SpeichernSie die Aufnahmen von mindestens zwei Bildfeldern ab, bei denen der Gating-Effekt gut sicht-bar war. Durch speichern im ’save’ Tab werden übrigens automatisch Bilder von allen aktivenKanälen abgespeichert.Führen Sie nun eine Messreihe durch, bei der am Ende die Auflösung in Abhängigkeit der

STED-Leistung dargestellt werden soll. Gehen Sie vor wie in 7.5. Für die beste Auflösung mussmöglichst viel STED-Leistung zur Verfügung stellen. Überprüfen Sie deshalb die Effizienz derFaserkopplung beider STED-Laser und koppeln sie ggfs. nach.

Checkliste

� Kleine fluoreszente Beads aufgelegt?

� Beste Gating-Einstellung gefunden?

� Beste Anregungsleistung eingestellt?

� Pixelgröße passend gewählt?

� Counts pro Pixel hoch genug? Dwell Time passend gewählt?

� Volle STED-Leistung verfügbar (Einkoppeleffizienz überprüft)?

� Probe genau im Fokus (wichtig!)?

� Messreihe: Auflösung vs. STED-Leistung mit genügend Messpunkten und Statistik?

� Bild mit höchster Auflösung abgespeichert?

7.8. Mikroskopie einer biologischen ProbeNun soll noch die Anwendbarkeit von STED auf biologische Proben demonstriert werden. Stel-len Sie auf jeden Fall unmittelbar vor der Messung der biologischen Probe sicher, dass IhreTiming- und Gating-Einstellungen optimal sind. Benutzen Sie dazu eine Bead-Probe. LegenSie eine biologische Probe auf, die Sie von Ihrem Betreuer erhalten. Lassen Sie sich zeigen, wieSie die Probe mit der Quecksilberdampflampe beleuchten und durch das Okular betrachtenkönnen. Dies ist von Vorteil, da durch das Okular schneller ein viel größeres Bildfeld sichtbarist als beim Scannen. Das erleichtert die Suche nach interessanten Strukturen und nach dem

24

7.8 Mikroskopie einer biologischen Probe 7 AUFGABEN

Fokus ungemein. Schieben Sie den Teil der Probe, den Sie mit STED betrachten wollen in dieMitte des Bildfeldes und schalten Sie auf Scannen um. Gehen Sie nun wie gewohnt vor umSTED Aufnahmen zu machen und speichern Sie einige gelungene Bilder ab.

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Teil III.Auswertung

26

8 PFLICHTAUFGABEN

8. PflichtaufgabenDie wichtigste Kenngröße bei der Auswertung Ihrer Mikroskopiedaten ist die Auflösung (∆x).Die erreichbare Auflösung kann definiert werden als die kleinste gemessene Halbwertsbreite(FWHM ) eines Testobjekts (hier fluoreszente Beads). Da die Ausdehnung des Testobjekts diegemessene Halbwertbreite vergrößert, sollte die Größe des Testobjekts idealerweise deutlichkleiner sein als die optische Auflösung des Mikroskops. Andernfalls muss die Objektgröße durchEntfaltung von der gemessenen FWHM herausgerechnet werden. Weitere wichtige Größen inder Mikroskopie sind das Signal-zu-Rausch-Verhältnis sowie der Kontrast. Achten Sie bei derAuswertung auch auf diese Größen und diskutieren Sie Fälle, in denen Ihrer Meinung nach dieAussagekraft des Bildes von diesen Werten beeinflusst wird.

8.1. Bestimmung der SättigungsintensitätAus der Messung der Leistung des STED-Strahls kann bei bekanntem Strahlprofil die maximaleSTED-Intensität Imax bestimmt werden.Zuvor muss jedoch die Leistung eines einzelnen Laserpulses, PPuls, berechnet werden. Ge-messen wurde die Durchschnittsleistung Pø. Diese hängt über die Repetitionsrate des Lasers,νL = 10 MHz, mit der Pulsenergie über die Beziehung EPuls = Pø/νL zusammen. Deshalbergibt sich mit der Pulsdauer T 2

PPuls =EPuls

T=

P

νL · T(9)

Ohne Manipulation durch die Phasenplatte ist das Strahlprofil im Fokus des Objektivs gegebendurch eine Gaußkurve

I(r) = Imax e−r2

b2 (10)

mit b2 ≈ 2

17

λ2

NA2 . Die Leistung PPuls ist gegeben durch

PPuls =

ˆI(r) dA , (11)

womit Sie unter Verwendung von Gleichung 9 die maximale Intensität Imax bestimmen können.Weiterhin gilt für die Restfluoreszenz bei STED Bestrahlung

Ifl(Imax)/I0,f l = η(Imax) = e−ln(2) Imax/Is (12)

im Vergleich zu der Fluoreszenz I0,f l ohne angeschalteten STED-Laser. vgl. Abschnitt 3.2. Er-klären Sie warum Sie bei dieser Messung schon ein bestimmtes Gate eingestellt haben. Die Grö-ßen Ifl und Ifl,0 wurden indirekt aus den Amplituden eines Gaußfits als Maß für die Helligkeitder fluoreszenten Beads bestimmt. Plotten Sie die Fluoreszenzunterdrückung η in Abhängigkeitvon Imax und bestimmen Sie mit einem Fit den Parameter Is.

2Dabei wird vereinfachend ein Rechteckspuls der Breite T angenommen.

27

8.2 Die beugungsbegrenzte PSF 8 PFLICHTAUFGABEN

8.2. Die beugungsbegrenzte PSFBestimmen Sie theoretische Auflösungen, die sich nach der der Abbe’schen Auflösungsgrenze∆xAbbe = λ/(2NA) und der Auflösung des konfokalen Mikroskops ∆xkonf. ∼= 0.4 · λ/NA.Vergleichen Sie diese Werte mit den experimentell bestimmten Werten.

8.3. Bestimmung der AuflösungBerechnen Sie die maximal zu erwartende Auflösung anhand von (7) und mit Hilfe des Wertesfür die Sättigungsintensität Is. Messen Sie außerdem in Ihrem Bild mit der besten Auflösungdie FWHM eines Beads, indem Sie die FWHM eines zweidimensionalen Gaußfits bestimmenund eine Gaußkurve an das Linienprofil fitten. Aus dem Fit erhalten Sie die Breite (beachtenSie FWHM 6= σ). Dieses Bild und den Fit geben Sie bitte extra ab, damit Sie beim F68 STEDResolution Ranking eingetragen werden können. Stellen Sie sicher, dass der gemessene Beaddeutlich aus dem Rauschen heraustritt - einige wenige Counts in den hellsten Pixeln ist nichtunbedingt vertrauenswürdig!Tragen Sie sowohl die gemessenen Auflösungen ∆xexp, als auch die mit der gemessenen Sätti-

gungsintensität zu erwartenden Auflösungen ∆xtheo über Imax auf. Beachten Sie, dass bei dieserAufgabe ein anderes Strahlprofil benutzt wurde, die Intensitätswerte entsprechen also bei glei-chen Leistungen nicht denen aus der vorigen Aufgabe. Das STED-Strahlprofil kann genähertwerden durch

I(x) = Imaxx2

a2e1−x

2/a2 (13)

mit a2 ≈ 15λ2/NA2. Vergleichen Sie die beiden Kurven für Theorie und Experiment. Nen-

nen Sie mögliche Gründe für Abweichungen. Welche Auflösungsverbesserung im Vergleich zurbeugungsbegrenzten Aufnahme haben Sie erreicht?Aus den Messwerten für die Laserleistung soll Is erneut berechnet werden. Vergleichen Sie

die Werte aus der Rechnung und Experiment für (höchste) Auflösung und Sättigungsintensitätund diskutieren Sie die Ergebnisse.

Checkliste� Theoretische (beugungsbegrenzte) Auflösung berechnet? Vergleich mit Praxis?

� Am Powermeter gemessene Leistung in Imax umgerechnet (für Donut und Gaußstrahl)?

� Fluoreszenzunterdrückung η gegen Imax aufgetragen?

� Sättingungsintensität als Fitparameter bestimmt?

� Beste Auflösung (2d oder 1d Gaußfit)? Vergleich mit Theorie?

� Auflösung in Abhängigkeit von Imax aufgetragen?

� Aus Fit an dem Wurzelgesetz Is erneut ermittelt?

� Wurzelgesetz mit Is aus erstem Versuchsteil zum Vergleich aufgetragen?

� Kritische Diskussion zu Messfehlern und Belastbarkeit der Ergebnisse (insbes. hinsichtlichKontrast-/Rauschverhältnisse)

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Teil IV.Anhang

29

A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG

A. Berechnung der STED AuflösungA.1. Gepulster BetriebDie Anzahl an Molekülen im Grundzustand E0 sei N0 und die Anzahl an Molekülen im an-geregten Zustand E1 sein N1. Vor Beginn der Messung ist N1 vernachlässigbar klein und dieTeilchen im Grundzustand werden durch einen Lichtpuls angeregt. Nach diesem Lichtpuls er-folgt keine weitere Anregung. Das Strahlprofil der Anregung im Fokus erscheint in der lateralenObjektebene (x-y-Ebene) gaußförmig mit Maximum in (0, 0). Aufgrund der Radialsymmetriedes Problems wird die Ortsabhängigkeit nur eindimensional entlang der x-Richtung untersucht.Damit ergibt sich zum Zeitpunkt t = 0 folgende Ortsabhängigkeit des angeregten Zustandes:

N1(t = 0, x) = A · e−x2

b2 , A, b > 0 (14)

Zum Zeitpunkt t = 0 wird instantan ein Laserstrahl mit einer Wellenlänge zur stimuliertenEmission eingeschaltet, der eine konstante Leistung bis zur Zeit t = T liefert (Rechteckpuls).Für dN1

dtgilt:

∂N1(t, x)

∂t= −N1(t, x)

1

τsp−N1(t, x)σst

ISTED(x)

hν(15)

Mit der Fluoreszenzlebensdauer τsp, der Intensität des STED Strahls ISTED und dem Wir-kungsquerschnitt für die stimulierte Emission σst. Dies ist eine gewöhnliche lineare Differenti-algleichung erster Ordnung mit der Lösung

N1(t, x) = N1(t = 0, x) · e−t·(1τsp

+σstISTED(x)

hν). (16)

Nach der Zeit t = T endet die Bestrahlung mit STED wieder instantan und das Fluoreszenzlichtdes übrig gebliebenen fluoreszierenden Spots wird detektiert. Dieser Spot ergibt sich also durchfluoreszentes Zerfallen aller bis t = T noch in N1 verbliebenen Moleküle:

N1(t = T, x) = A · e−x2

b2 · e−T ·(1τsp

+σstISTED(x)

hν) (17)

= A · e−Tτsp · e−

x2

b2 · e−ln(2)ISTED(x)

Isat . (18)

Hier wurde die Sättigungintensität Isat = hν ln(2)T σst

als der Wert eingeführt, bei dem die Restfluo-reszenz nach dem STED Prozess auf die Hälfte zurückgegangen ist. Der Vergleichswert ist dannder Wert für ISTED = 0, ebenfalls zur Zeit t = T , es handelt sich also um den Fall mit Gating.Es sei außerdem darauf hingewiesen, dass die Sättigungsintensität nicht nur ein Parameter desFarbstoffes ist, sondern der Kombination aus Farbstoff und STED Laser. Die Ortsabhängigkeitvon ISTED(x) im Fokus ist näherungsweise gegeben durch

ISTED(x) = Imaxx2

a2e1−

x2

a2 (19)

Imax =PSTEDe π a2

(20)

Wobei PSTED die instantane Leistung des STED-Pulses darstellt, nicht zu verwechseln mit dergemessenen Durchschnittsleistung Pavg. Aus der genauen vektoriellen Rechnung (simuliert mit

30

A.1 Gepulster Betrieb A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG

dem PSF-Rechner, basierend auf [Wol59, WR59]) ergibt sich für die Parameter a und b in guterNäherung:

a2 ≈ 1

5

λ2

NA2, b2 ≈ 2

17

λ2

NA2(21)

Da nur eine kleine Umgebung um x = 0 von Interesse ist, kann ISTED durch folgende Entwick-lung genähert werden:

ISTED(x) ≈ Imaxe

a2x2 (22)

Es ergibt sich damitN1(t = T, x) = A · e−

Tτsp · e−x

2 ( 1b2

+e·ln(2)a2

ImaxIsat

) (23)Für die Halbwertsbreite (FWHM) ∆x gilt

N1(t = T, x =∆x

2) =

N1(t = T, x = 0)

2(24)

Und damit

∆x =2√ln(2)√

1b2

+ e·ln(2)a2

ImaxIsat

(25)

≈ 2

√2 ln(2)

17

λ

NA

1√1 + Imax

Isat

, (26)

denn b2 ≈ a2

e·ln(2)3. Mit 2

√2 ln(2)17≈ 0.57 ergibt sich schließlich

∆x ≈ 0.57λ

NA√

1 + ImaxISat

. (27)

Dieses Ergebnis lässt sich unter Verwendung der Pulsenergie ESTED umformulieren, womit esvom verwendeten STED Laser unabhängig wird. Die Pulsenergie ergibt sich durch zeitlicheIntegration eines Laserpulses, was mit Hilfe von (20) zu

ESTED =

ˆ T

0

PSTED(t) = Imax T πa2e (28)

wird. Setzt man dies in (25) ein, so ergibt sich

∆x =2√ln(2)πa2√

πa4

b2+ ESTED

hνσst

=2√ln(2)πa2√

17π50

(λNA

)2+ ESTED

hνσst

. (29)

Wegen 17π50≈ 1 und 2

√πln(2)/5 ≈ 0.59 wird daraus

∆x ≈ 0.59λ

NA√

1 + ESTEDhν

σst(λ/NA)2

. (30)

3Dies ist eine etwas grobe Näherung, bedenken Sie beim Nachvollziehen jedoch auch, dass die Wellenlängen λin a und b eigentich nicht gleich sind.

31

A.2 Dauerstrichbetrieb A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG

Im für STED interessanten Fall, bei dem der Radikant im Nenner � 1 wird, kann man darausden Ausdruck

∆x ≈ 0.59λ2

NA2√NSTEDσst

(31)

gewinnen, bei dem NSTED = ESTED/hν die Anzahl der Photonen im STED Puls ist. Man siehtin (31), dass die Auflösung nunmehr quadratisch von der Wellenlänge und der NumerischenApertur NA abhängt. Außerdem hängt sie nur noch von der Pulsenergie und dem Wirkungs-querschnitt der stimulierten Emission ab, nicht mehr von der Pulslänge.

A.2. DauerstrichbetriebIm Dauerstrichbetrieb des Lasers des Mikroskops kann die Auflösung wie folgt berechnet wer-den. Dabei wird ein 4-Niveau-System (Energieniveaus siehe Abbildung 4 c)) als Modellsystemverwendet:

Die Anzahl an Teilchen im Grundzustand sei N0, die Anzahl an Teilchen im angeregten Zu-stand sei N1 und die Gesamtanzahl an Teilchen sei N = N0 + N1. Letztere Gleichung kannangenommen werden, da die Zeitskala der Zerfälle durch strahlungslose Relaxion der Vibrati-onszustände sehr klein ist gegenüber dem Zerfall aus dem angeregten Zustand.Des Weiteren seiWex = σexIex/hνex die Wahrscheinlichkeit für die Anregung aus dem Grundzu-stand undWSTED = σstISTED/hνSTED die Wahrscheinlichkeit für die stimulierte Emission. DerZerfall aus dem angeregten Zustand ist außerdem über spontane Emission oder nichtstrahlendeProzesse möglich. Die Zerfallskonstante dafür sei τ2 mit 1

τ2= 1

τsp+ 1

τnr(τsp: Spontaner Zerfall,

τnr: Nichtstrahlende Prozesse) Es gilt dann:

∂N1(x, t)

∂t= Wex(x)N0(x, t)−WSTED(x)N1(x, t)−

1

τ2N1(x, t) (32)

∂N1(x, t)

∂t= Wex(x)(N(x, t)−N1(x, t))−WSTED(x)N1(x, t)−

1

τ2N1(x, t) (33)

Für das stationäre Gleichgewicht mit ∂N1

∂t= 0 folgt

N1(x) =Wex(x)N(x)

Wex(x) +WSTED(x) + 1τ2

=σex Iex(x)N(x)

σex Iex(x) + σst ISTED(x) + 1τ2

(34)

N1(x) =σex Iex(x)N(x)

1 + σst ISTED(x)σex Iex(x)

+ 1τ2 σex Iex(x)

(35)

Die Ortsabhängigkeiten der Funktionen für Iex und ISTED sind bei eindimensionaler Betrach-tung wieder gegeben durch

Iex(x) = Imaxex e−x2

b2 (36)

ISTED(x) = ImaxSTED

x2

a2e1−

x2

a2 (37)

ImaxSTED =PSTEDe π a2

(38)

a2 ≈ 1

5

λ2

NA2, b2 ≈ 2

17

λ2

NA2(39)

32

A.2 Dauerstrichbetrieb A BERECHNUNG DER STED AUFLÖSUNG

Wobei die Parameter a und b analog zu (21) bestimmt wurden. Betrachtet man nun einenkleinen Bereich um x ≈ 0, so kann man Iex und ISTED annähern durch

Iex(x) ≈ Imaxex , ISTED(x) = ImaxSTED

e

a2x2 (40)

Das Signal der Fluoreszenz ist proportional zu N1(x), deshalb ist die Auflösung durch dieHalbwertsbreite von N1(x) gegeben. Es gilt

N1(x) =N

1 + 1τ2 σex Imaxex

1

1 +σst ImaxSTED

a2 (σex Imaxex + 1τ2

)x2

=N

1 + 1τ2 σex Imaxex

1

1 + αx2(41)

α :=σSTED ImaxSTED

σex Imaxex a2 (1 + 1τ2 σex Iex

)(42)

Das Profil von N1(x) in naher Umgebung von x ≈ 0 ist also durch eine Lorenz-Kurve gegeben,wohingegen die Verteilung beim gepulsten Betrieb einer Gaußverteilung (23) entspricht. DieHalbwertsbreite ∆x (FWHM) errechnet sich daher zu

∆x = 21√α

=2λ√5NA

√σex Imaxex + 1

τ2√σSTED ImaxSTED

= 0, 89λ

NA

1√ImaxSTED

ISat

√τ2 σex Imaxex + 1 (43)

Anmerkung: (43) gilt nur für σST ISTEDσex Iex

� 1, da für kleine STED-Intensitäten die Taylornähe-rung von Iex in (40) ungenügend genau ist.

33

B HINWEISE ZUR DARSTELLUNG MIKROSKOPISCHER BILDER

B. Hinweise zur Darstellung mikroskopischer Bilder• Für einfarbige Bilder wird typischerweise die ’fire’ (Imspector: ’fire’, Matlab: ’hot’, ImageJ:

’redhot’) colormap benutzt, wie es auch in der QUAD Scanner Software standardmäßigder Fall ist.

• passen Sie die look up table (LUT) der colormap ggf. an um die für Sie interessantenBereiche im Bild kontrastreich darzustellen.

• Lassen Sie die LUT neben dem Bild anzeigen, damit offensichtlich ist, wie viele PhotonenSie gesammelt haben.

• Verwenden Sie scale bars (’Maßstabsbalken’) um dem Betrachter direkt eine Vorstellungder Größenskala zu vermitteln.

• Um die Auflösungsverbesserung durch STED zu verdeutlichen stellen Sie ein beugungs-begrenztes und ein STED Bild vom selben Bildausschnitt direkt nebeneinander.

• Besonders bei Bildern von biologischen Proben macht es sich gut, ein Übersichtsbild zuzeigen, in dem beispielsweise eine ganze Zelle zu sehen ist, und einen Ausschnitt daraus,in dem die erzielte Auflösung besonders gut zur Geltung kommt. Machen Sie dann auchauf der Übersicht kenntlich, welchen Bildbereich Sie vergrößert darstellen

• Um die Auflösung, die Sie erreicht haben nachzuweisen, kann außerdem ein Linienprofilverwendet werden, an dem die FWHM einer Struktur abgelesen werden kann, oder siewird gar über einen Fit an das Profil bestimmt.

Nicht alle diese Tipps müssen bei jedem Bild berücksichtigt werden, je nach gewünschterAussage. Wie ein Bild für die Auswertung aussehen kann zeigt Abbildung 19.

Abbildung 19: Fig. 3 aus ’Rankin, B. R., S. W. Hell: STED microscopy with a MHz pulsedstimulated-Raman-scattering source Opt. Express 17, 15679-15684’. Diese Bilder enthalten zwarkeine typischen scalebars, als Größenskala dienen jedoch die Ausschnittsquadrate, bei denen dieSeitenlängen angegeben sind.

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