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Aus dem

INSTITUT FUR VIROLOGIE

der TIERARZTLICHEN HOCHSCHULE HANNOVER

Untersuchung der Bedeutung derSialinsaure-bindenden Aktivitat fur die

Enteropathogenitat des Virus der ubertragbarenGastroenteritis der Schweine

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinarmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierarztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Christel Elisabeth Schwegmann-Weßels, geb. Schwegmann

aus Lingen (Ems)

Hannover 2002

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Georg Herrler

1. Gutachter: Prof. Dr. Herrler

2. Gutachter: PD Dr. Fischer

Tag der mundlichen Prufung: 30.05.2002

Meinen Eltern und

meinem Mann Peter

So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig,

man muss sie fur fertig erklaren,

wenn man nach Zeit und Umstanden

das moglichste getan hat.

(J. W. Goethe, Italienische Reise, 16. Marz 1787)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 17

1.1 Coronaviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.1.1 Taxonomie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.1.2 Strukturproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.1.2.1 N-Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.1.2.2 M-Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

1.1.2.3 E-Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

1.1.2.4 S-Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.1.2.5 HE-Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

1.2 Das Virus der ubertragbaren Gastroenteritis (TGEV) . . . . . . . . . . . . 26

1.2.1 Pathogenitat und Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

1.2.2 Eigenschaften des S-Proteins von TGEV . . . . . . . . . . . . . . . 29

1.2.2.1 Epitope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

1.2.2.2 Bindungsaktivitaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

1.2.2.3 Tropismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

1.3 Escherichia coli F5/K99 (E. coli F5/K99) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

1.4 Virusrezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2 Zielsetzung 39

3 Material 41

3.1 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.2 Zellkulturmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.3 Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

3.4 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.5 Erythrozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.6 Darmmaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.7 Enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.8 Antikorper . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.9 Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.10 Substrate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.11 Chemikalien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.12 Puffer und Losungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4 Methoden 53

4.1 Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.1.1 Passagierung von ST-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.1.2 Passagierung von LLC-PK1-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.2 Bakterien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.2.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.2.2 Fimbrientest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.3 Virusanzucht . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.4 Plaquetest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.5 Virusreinigung mittels Dichtegradientenzentrifugation . . . . . . . . . . . . 56

4.6 Isolierung des S-Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

4.7 Erythrozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.7.1 Isolierung aus Vollblut . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.7.2 Fixierung von Erythrozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.7.3 Hamagglutinationstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.7.4 Hamagglutinationsinhibition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.8 Desialylierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.8.1 Desialylierung von Viren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.8.2 Desialylierung von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.8.3 Desialylierung von Muzinen, MP und BSMV . . . . . . . . . . . . . 59

4.8.4 Desialylierung von immobilisierten Muzinen . . . . . . . . . . . . . 60

4.8.5 Desialylierung von Zelllysaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.8.6 Desialylierung von Erythrozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.9 Membranproteinisolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.10 Fallung von Oberflachenproteinen und Glykoproteinen . . . . . . . . . . . 61

4.10.1 Biotinylierung und Streptavidinfallung von Oberflachenproteinen . . 61

4.10.2 Fallung von Glykoproteinen mit immobilisiertem WGA . . . . . . . 62

4.11 Muzine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

4.11.1 Isolierung von Darmmuzinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

4.11.2 Reinigung der extrazellularen Muzine . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.11.3 Kohlenhydratbestimmung mittels PAS-Farbung . . . . . . . . . . . 63

4.12 Burstensaummembranvesikel (BSMV) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.12.1 Herstellung von BSMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.12.1.1 Darm von Absetzferkeln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

4.12.1.2 Darm von Saugferkeln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.12.2 Enzymbestimmungen von BSMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.12.2.1 Bestimmung der Aktivitat der AP . . . . . . . . . . . . . 65

4.12.2.2 Bestimmung der Aktivitat der Na/K-ATPase . . . . . . . 66

4.13 Proteinbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

4.13.1 Proteinbestimmung nach Bradford . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

4.13.2 BCA-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

4.13.3 Messung bei 280 nm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4.14 Analyse von Sialinsauren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4.15 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4.16 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.16.1 Coomassie-Farbung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.16.2 Silberfarbung zur Detektion von Glykoproteinen . . . . . . . . . . . 69

4.17 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.18 Immunchemische Detektion von Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.19 Untersuchung der Virusbindung an Sialoglykokonjugate . . . . . . . . . . . 70

4.19.1 ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.19.2 Virusbindung in Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

4.19.3 Virusbindung auf Nitrozellulose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

4.19.4 Virusbindungstest mittels Immunfluoreszenz . . . . . . . . . . . . . 72

4.20 Analyse von Glykoproteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.20.1 Triton X-114-Phasenseparierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

4.20.2 Glykoproteindetektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.20.2.1 Kohlenhydraterkennung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.20.2.2 Selektive Sialinsaureerkennung . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.20.3 Analyse von Glykoproteinen mit Lektinen . . . . . . . . . . . . . . 75

4.20.3.1 Lektintest auf dem Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.20.3.2 Fallung von BSMV mit Lektinen . . . . . . . . . . . . . . 75

5 Ergebnisse 77

5.1 Vergleich der Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV und E. coli F5 . . . 77

5.1.1 Interaktion mit Erythrozyten verschiedener Tierarten . . . . . . . . 77

5.1.2 Neuraminidase-Sensitivitat der Erythrozytenrezeptoren . . . . . . . 79

5.1.3 Untersuchung der Hamagglutinationshemmung . . . . . . . . . . . . 80

5.1.3.1 Praparation intestinaler Muzine . . . . . . . . . . . . . . . 80

5.1.3.2 Analyse des Sialinsauregehalts der Inhibitoren . . . . . . . 81

5.1.3.3 Hemmung der Hamagglutination . . . . . . . . . . . . . . 82

5.2 Bindung von TGEV an Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

5.3 Untersuchung von Zelloberflachenproteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.3.1 Bindung an Membranproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.3.2 Bindung an Zelloberflachenproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

5.3.3 Darstellung der Zelloberflachenproteine . . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.3.4 Sialinsaureabhangigkeit der Bindung von TGEV . . . . . . . . . . . 92

5.4 Charakterisierung des Sialoglykoproteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93


5.4.2 Prazipitation mit WGA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.5 Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.5.1 Bindung von TGEV an immobilisierte Darmmuzine . . . . . . . . . 97

5.5.2 Bedeutung der Sialinsauren fur die Bindung . . . . . . . . . . . . . 99

5.5.3 Vergleich der Muzinbindung von TGEV mit Mutanten . . . . . . . 99

5.5.4 Interaktion von TGEV mit einem hochmolekularen Protein . . . . . 101

5.6 Untersuchung von Burstensaummembranen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

5.6.1 Praparation von Burstensaummembranvesikeln . . . . . . . . . . . 102

5.6.2 Analyse des Sialinsauregehalts der BSMV . . . . . . . . . . . . . . 103

5.6.3 Bindung an Proteine aus BSMV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

5.7 Charakterisierung des BSMV-Proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107


5.7.2 Charakterisierung des Kohlenhydratanteils . . . . . . . . . . . . . . 108

5.7.2.1 Nachweis der Kohlenhydrate und Sialinsauren . . . . . . . 108

5.7.2.2 Charakterisierung der Kohlenhydratreste mit Lektinen . . 109

5.8 Interaktion von TGEV mit Darmepithel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6 Diskussion 117

6.1 Bedeutung der Desialylierung von TGEV fur die Interaktion mit Sialogly-

kokonjugaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

6.2 Bewertung des Vergleichs von TGEV mit E. coli F5 . . . . . . . . . . . . . 120

6.3 Interaktion von TGEV mit Zellkulturzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.4 Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen und mit Darmepithel . . 124

6.5 Bedeutung der Sialinsaure-bindenden Aktivitat fur die Enteropathogenitat

von TGEV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

7 Zusammenfassung 135

8 Summary 137

Literaturverzeichnis 139

Abbildungsverzeichnis 161

Tabellenverzeichnis 163

Abkurzungsverzeichnis

ABTS 2,2’-Azino-di-[3-ethylbenzthiazolinsulfonat(6)]

a.E. absorbierende Einheiten

AP Alkalische Phosphatase

APN Aminopeptidase N

APS Ammoniumpersulfat

AS Aminosaure

ATCC”American Tissue Culture Collection“

ATP Adenosintriphosphat

BCA Bicinchonininsaure

BCoV Bovines Coronavirus

BSA Bovines Serumalbumin

BSMV Burstensaummembranvesikel

C Cystein

CCoV Coronavirus der Hunde

CCR Chemokinrezeptor

CD”cluster of differentiation“

CEA carcinoembryonales Antigen

cpE zytopathischer Effekt

D Asparaginsaure

DFP Diisopropylfluorophosphat

DIG Digoxigenin

DMB 4,5-Methylendioxy-1,2-phenylendiamin × 2 H2O

DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium

DNA Desoxyribonukleinsaure

DTT Dithiothreitol

E Extinktion

ECL Enzym-Chemolumineszenz

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamin-tetraessigsaure

EGTA Ethylenglykol-bis(β-Aminoethylether)N,N,N’,N’-Tetraessigsaure

ELISA”enzyme-linked immuno sorbent assay“

E-Protein Envelope-Protein

ETEC enterotoxinogene E. coli

F Phenylalanin

F5 Fimbrientyp 5

FCoV Felines Coronavirus

FIPV Virus der felinen infektiosen Peritonitis

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FKS Fetales Kalberserum

G Glycin

gp/g Glykoprotein

HA Hamagglutination

HAD hamagglutinationsdefizient

hAPN humane Aminopeptidase N

HAU hamagglutinierende Einheiten

HCoV Humanes Coronavirus

HE Hamagglutinin-Esterase

HEF Hamagglutinin-Esterase-Fusions-Protein

HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-(2-Ethansulfonsaure)

HEV Hamagglutinierendes Enzephalomyelitis Virus

HIU hamagglutinationsinhibierende Einheiten

HIV Humanes Immundefizienzvirus

H2O Reinstwasser

HPLC Hochdruck-Flussigkeitschromatographie

HRP Peroxidase aus Meerrettich

HSV Herpes-simplex-Virus

IBV Virus der aviaren infektiosen Bronchitis

ICAM”intercellular adhesion molecule“

ICTV internationales Komitee fur Virus-Taxonomie

Ig Immunglobulin

IP isoelektrischer Punkt

kDa Kilo-Dalton

L Leucin

MAA Maackia amurensis Agglutinin

MAD Madrid

mAk monoklonaler Antikorper

MES 2(N-Morpholino)ethansulfonsaure

MHV Maus-Hepatitis-Virus

m.o.i.”multiplicity of infection“

MP Zellmembranen/Membranproteine

M-Protein Membran-Protein

mRNA”messenger RNA“

-NA neuraminidasebehandelt

Neu5Ac N-Acetylneuraminsaure

Neu5,9Ac2 N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsaure

Neu5Gc N-Glykolylneuraminsaure

Neu5Gc-GM3 N-Glykolylneuraminyl-neolaktotetraosyl-ceramid

NHS N-Hydroxysuccinimid

N-Protein Nukleokapsid-Protein

OG n-Oktyl-β-D-Glukopyranosid/Oktylglukosid

ORF offener Leserahmen

P Prolin

PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese

pAPN porzine Aminopeptidase N

PAR Paris

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlosung

PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium

PEDV Virus der epidemischen Diarrhoe

PFU Plaque-bildende Einheiten

PK”porcine kidney“

PNA Peanut Agglutinin

PRCoV Porzines respiratorisches Coronavirus

PSM Muzine aus der Glandula submandibularis des Schweines

PTV”Purdue-type virus“ (fruher: NEB72)

PUR Purdue

PVDF Polyvinylidendifluorid

PVR Poliovirus-Rezeptor

R Arginin

RNA Ribonukleinsaure

RT Raumtemperatur

RtCoV”rabbit coronavirus“

S Serin

SDS Natriumdodecylsulfat

SNA Sambucus nigra Agglutinin

S-Protein Spike-/Surface-Protein

ST”swine testicular“

TBS TRIS-gepufferte Kochsalzlosung

TCoV Coronavirus des Truthahns

TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin

TGE ubertragbare/transmissible Gastroenteritis

TGEV Virus der ubertragbaren Gastroenteritis

TiHo Tierarztliche Hochschule

TRIS Tris-Hydroxymethylaminomethan

VCNA Neuraminidase aus Vibrio cholerae

WGA Weizenkeimagglutinin (Wheat Germ Agglutinin)

w/o”without“

1. Einleitung

1.1 Coronaviren

1.1.1 Taxonomie

Das Virus der ubertragbaren Gastroenteritis der Schweine (TGEV) gehort zur Familie

der Coronaviridae, Genus Coronavirus. Diese Virusfamilie wurde 1975 durch das interna-

tionale Komitee fur Virus-Taxonomie (ICTV) eingefuhrt (Tyrrell et al., 1975). Bereits

1968 wurden Coronaviren aufgrund ihres charakteristischen Erscheinungsbildes im Elek-

tronenmikroskop als eigenstandige Virusgruppe definiert (Tyrrell et al., 1968).

Der Familie der Coronaviridae werden zwei Genera, Coronavirus und Torovirus, zuge-

ordnet (Pringle, 1992). Diese Zuordnung erfolgte aufgrund der Ahnlichkeiten in der

Organisation und Expression der Genome und in der Struktur der Genprodukte dieser

Viren. Im August 1996 wurde die Familie der Coronaviridae mit der Familie der Arte-

riviridae durch das ICTV zu der zweiten viralen Ordnung, den Nidovirales zusammen-

gefasst (Cavanagh et al., 1997; Enjuanes et al., 2000). Die Familien dieser Ordnung

enthalten umhullte Viren mit einem unsegmentierten einzelstrangigen RNA-Genom posi-

tiver Polaritat. Der Name”Nido“ (lat., deutsch: Nest) bezieht sich auf den einzigartigen

Transkriptions- und Replikationsmechanismus dieser Virusfamilien. Wahrend der Infekti-

on entsteht in der Zelle ein 3’ coterminales”nested set“ von bis zu 8 mRNAs, von denen

nur das Gen am 5’-Ende der jeweiligen mRNA translatiert wird (Ubersicht s. van der

Most und Spaan, 1995; de Vries et al., 1997).

Bei den Coronaviren handelt es sich um umhullte, pleomorphe, haufig spharische Partikel

17

18 1. Einleitung

mit einem Großendurchmesser von 60 bis 220 nm. Sie tragen charakteristische ca. 20 nm

lange keulenformige Oberflachenprojektionen, die die Viruspartikel im Elektronenmikros-

kop wie von einem Strahlenkranz (lat. Corona) umgeben erscheinen lassen (Siddell et al.,

1983). Diese Oberflachenprojektionen werden von dem Spike- bzw. Surface-Protein (S-

Protein) gebildet. Das positiv-strangige, nichtsegmentierte RNA-Genom besteht aus ca.

30000 Nukleotiden und beinhaltet ein ungewohnlich großes RNA-Polymerase-Gen (20000

Nukleotide), ein großes Oberflachenglykoprotein(S-Protein)-Gen, ein integrales Membran-

Protein(M-Protein)-Gen und ein Nukleokapsid-Protein(N-Protein)-Gen. Diese Gene sind

in der oben beschriebenen Reihenfolge im Genom angeordnet (5’ → 3’ Richtung), konnen

aber von zusatzlichen Genen, die fur weitere Struktur- oder Nichtstrukturproteine kodie-

ren, unterbrochen sein (Siddell, 1995a). Die RNA tragt ein Cap, ist polyadenyliert und

bildet zusammen mit dem N-Protein das Nukleokapsid (Lai und Cavanagh, 1997). Die

Morphologie des Nukleokapsids wurde als helikal beschrieben (Macnaughton et al.,

1978), es gibt jedoch auch Arbeitsgruppen, die eine ikosaedrische Struktur diskutieren

(Risco et al., 1996). In die das Nukleokapsid umgebende Virusmembran sind die viralen

Glykoproteine, das S-Protein, das M-Protein und das nur bei Viren der Serogruppe II vor-

kommende Hamagglutinin-Esterase(HE)-Protein eingelagert. Ein weiteres Strukturprote-

in ist das unglykosylierte Envelope-Protein (E-Protein), welches in der Virusmembran in

geringer Kopienzahl vorkommt (s. Abb. 1.1). Die Virusreifung findet an den intrazellularen

Membranen des intermediaren Kompartiments zwischen Endoplasmatischem Retikulum

und Golgi-Apparat statt.

Aufgrund serologischer und phylogenetischer Untersuchungen des Verwandschaftsgrades

werden die Coronaviren in drei Gruppen unterteilt (Tabelle 1.1). Bei dem porzinen respi-

ratorischen Coronavirus (PRCoV) und dem felinen Coronavirus (FCoV) handelt es sich

allerdings eher um Varianten des transmissiblen Gastroenteritisvirus (TGEV) bzw. des

Virus der felinen infektiosen Peritonitis (FIPV) als um eigene Coronavirusspezies. Die

meisten Coronaviren infizieren die Epithelien des Respirations- und/oder des Gastroin-

testinaltraktes von Saugetieren, Vogeln oder dem Menschen. Eine Ubersicht uber die von

Coronaviren verursachten Erkrankungen bei den jeweiligen naturlichen Wirten gibt Ta-

belle 1.2.

1.1. Coronaviren 19

N

S

M

RNA

Membran

CAP

AA

A

E

HE

Gruppe IGruppe III

Gruppe II

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung eines Coronaviruspartikels. S=Spike-Protein,

M= Membran-Protein, E= Envelope-Protein, HE=Hamagglutinin-Esterase, N =Nukleokapsid-

Protein. Die rechte Seite des Schemas zeigt die Viren der Serogruppe II, die als zusatzliches Struk-

turprotein das HE-Protein besitzen.

Gruppe I Gruppe II Gruppe III

HCoV-229E HCoV-OC43 IBV

TGEV MHV

PRCoV BCoV

PEDV HEV

CCoV TCoV

FIPV RtCoV

FCoV

Tabelle 1.1: Serologische und phylogenetische Verwandschaft der Coronaviren. RtCoV steht fur

”rabbit coronavirus“. Die Bedeutung der ubrigen Abkurzungen ist in Tabelle 1.2 aufgefuhrt.

20 1. Einleitung

Virus Acronym Wirt Erkrankung

Gruppe I

Virus der ubertragbaren

Gastroenteritis

TGEV Schwein Enteritis

Porzines respiratorisches

Coronavirus

PRCoV Schwein Milde Entzundungen des

Respirationstraktes,

Pneumonie moglich

Virus der epidemischen

Diarrhoe

PEDV Schwein Enteritis

Virus der felinen

infektiosen Peritonitis

FIPV Katze Peritonitis, perivasculare

pyogranulomatose

Entzundung, exsudative

fibrinose Serositis

Felines Coronavirus FCoV Katze Enteritis

Coronavirus der Hunde CCoV Hund Enteritis

Humanes Coronavirus

(229E)

HCoV-229E Mensch Erkaltungserkrankung der

oberen Atemwege

Gruppe II

Hamagglutinierendes

Enzephalomyelitis Virus

HEV Schwein Erbrechen, neurologische

Symptome,

Enzephalomyelitis

Bovines Coronavirus BCoV Rind Enteritis

Humanes Coronavirus

(OC43)

HCoV-OC43 Mensch Erkaltungserkrankung der

oberen Atemwege

Maus-Hepatitis-Virus MHV Maus Enzephalomyelitis,

Hepatitis, Enteritis

Coronavirus des Truthahns TCoV Truthahn Enteritis

Gruppe III

Virus der aviaren

infektiosen Bronchitis

IBV Geflugel Bronchitis, Nephritis,

Gonaditis

Tabelle 1.2: Ubersicht uber die von Coronaviren verursachten Erkrankungen bei Tier und Mensch.

1.1. Coronaviren 21

1.1.2 Strukturproteine

1.1.2.1 N-Protein

Die N-Proteine der Coronaviren sind 377 bis 455 Aminosauren lang mit einem Molekular-

gewicht von 45 bis 63 kDa. Mit einem Isoelektrischen Punkt (IP) von 10,3 bis 10,7 sind

N-Proteine stark basisch aufgrund eines hohen Gehaltes an Lysin- und Argininresten. Im

Gegensatz dazu steht ein saurer Abschnitt von 45 Aminosauren am Carboxylende mit

einem IP von 4,3 bis 5,5. N-Proteine besitzen viele Serinreste (7–11%), die posttransla-

tional phosphoryliert werden (Laude und Masters, 1995). Trotz dieser Ahnlichkeiten

sind die N-Proteine der Coronavirusspezies untereinander nur begrenzt homolog (Lapps

et al., 1987). Basierend auf dem Vergleich der Aminosauresequenzen konnten 3 struktu-

relle Domanen des N-Proteins identifiziert werden (Parker und Masters, 1990). Von

diesen Domanen stellt Domane II die potenzielle RNA-Bindungsstelle dar (Masters,

1992; Nelson und Stohlman, 1993). Das N-Protein kann sowohl RNA von Coronaviren

als auch andere RNA binden (Stohlman et al., 1988; Masters, 1992), scheint jedoch

virale RNA effizienter zu binden als nicht-virale RNA (Cologna et al., 2000). Die mogli-

che Funktion der Domanen I und III ist nicht bekannt, jedoch wurde in Domane III des

N-Proteins aller drei Coronavirusgruppen vor kurzem ein Nucleolus-Lokalisationssignal

(NuLS) identifiziert (Hiscox et al., 2001; Wurm et al., 2001).

Dem N-Protein der Coronaviren werden mehrere Funktionen wahrend des viralen Lebens-

zyklus zugeschrieben (Laude und Masters, 1995). Zum einen formt es mit der genomi-

schen RNA den Ribonukleoproteinkomplex (Davies et al., 1981), zum anderen bildet es

gemeinsam mit dem Membranprotein (M-Protein) das innere Core (Risco et al., 1996;

Escors et al., 2001b). Es wurde gezeigt, dass das N-Protein mit der leader RNA, die im

5’-Bereich der genomischen RNA lokalisiert ist, assoziiert ist (Baric et al., 1988; Nelson

et al., 2000). Ebenso wurde gezeigt, dass das N-Protein an RNA-Sequenzen im 3’-Bereich

des Genoms bindet (Zhou et al., 1996). Da die erwahnten RNA-Regionen an der Synthese

coronaviraler RNA beteiligt sind, wird postuliert, dass das N-Protein eine Rolle in der

Replikation genomischer RNA (Compton et al., 1987; Chang und Brian, 1996), in der

Transkription subgenomischer RNAs (Baric et al., 1988; Stohlman et al., 1988) und

in der Tranlation subgenomischer RNAs (Tahara et al., 1994) spielt. Bei den Arterivi-

22 1. Einleitung

ren wurde jedoch gezeigt, dass Replikation und Transkription auch in Abwesenheit des

N-Proteins stattfinden konnen (Molenkamp et al., 2000).

1.1.2.2 M-Protein

Bei den M-Proteinen handelt es sich um Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von

20 bis 38 kDa (Ubersicht s. Rottier, 1995). Das M-Protein eines Coronavirus tragt ent-

weder N- oder O-glykosidisch gebundene Oligosaccharide. So kommen z.B. bei TGEV,

FIPV, CCoV, IBV und HCoV-229E nur N-glykosidisch gebundene Zuckerseitenketten

vor, bei BCoV, MHV und HCoV-OC43 ist das M-Protein hingegen O-glykosyliert. Das

M-Protein enthalt 44–51% hydrophobe Aminosauren. Allen M-Proteinen der Coronavi-

ren ist gemeinsam, dass sie drei hydrophobe Domanen alternierend zu kurzen hydrophilen

Regionen besitzen. Mit diesen hydrophoben Regionen durchspannt das Protein die Virus-

membran (Laude et al., 1990). Am N-Terminus befindet sich ein hydrophiler Bereich, der

die glykosylierte Ektodomane des M-Proteins bildet. Die carboxyterminale Halfte aller M-

Proteine ist amphiphil mit einer hydrophilen Domane am carboxyterminalen Ende. Mit

dem amphiphilen Bereich ist das Protein moglicherweise mit der Innenseite der Virusmem-

bran assoziiert (Rottier et al., 1986; Laude et al., 1987, 1990). Neuere Untersuchungen

mit monoklonalen Antikorpern, die spezifisch gegen den C-Terminus des M-Proteins von

TGEV gerichtet sind, zeigen, dass es zusatzlich zur Nexo-Cendo-Topologie (N-Terminus

nach außen, C-Terminus ins Virusinnere gerichtet) auch eine Nexo-Cexo-Topologie (N-

und C-Terminus nach außen gerichtet) des M-Proteins in der Virusmembran gibt (Risco

et al., 1995; Escors et al., 2001a). In der Nexo-Cendo-Topologie scheint das M-Protein

eine wichtige Rolle im Assembly des Nukleokapsids zu spielen (Narayanan et al., 2000;

Escors et al., 2001b). Die Funktion des M-Proteins in der Nexo-Cexo-Topologie ist noch

nicht bekannt.

Das M-Protein ist das einzige virale Genprodukt, das bei seinem Transport an intrazel-

lularen Membranen zuruckgehalten wird. In infizierten Zellen akkumuliert das Protein

an den Membranen des Endoplasmatischen Retikulums und des Intermediaren Kompar-

timents und wird nicht bis zur Plasmamembran transportiert. Auch einzeln exprimier-

tes M-Protein gelangt nur bis zum Trans-Golgi-Network (Klumperman et al., 1994;

Krijnse-Locker et al., 1994, 1995). Die Lokalisation des M-Proteins in virusinfizierten

1.1. Coronaviren 23

Zellen weist darauf hin, dass das M-Protein eine wichtige Funktion fur die Virusreifung

besitzt. Coexpressionsstudien mit M- und E-Protein zeigten, dass diese zwei Proteine

ausreichend sind fur die Bildung von”virus-like particles“ (Bos et al., 1996; Vennema

et al., 1996; Kim et al., 1997). In virusinfizierten Zellen interagiert das M-Protein mit

dem S-Protein und dem HE-Protein (Opstelten et al., 1995; Nguyen und Hogue,

1997). Diese Oberflachenproteine assoziieren mit dem M-Protein in großen heteromeren

Komplexen, wodurch sie im Kompartiment der Virussreifung zuruckgehalten werden.

1.1.2.3 E-Protein

Das Gen des kleinen Envelope-Proteins ist im Virusgenom aller Coronavirusspezies strom-

aufwarts des M-Protein-Gens zu finden. Das Gen kodiert Polypeptide mit einem vorher-

sagbaren Molekulargewicht von 9,1 bis 12,4 kDa (Siddell, 1995b). Im Viruspartikel

konnte das E-Protein zu Beginn der 90er Jahre bei IBV (Liu und Inglis, 1991), bei

TGEV (Godet et al., 1992) und bei MHV (Yu et al., 1994) als integrales Membran-

protein nachgewiesen werden. Fur TGEV konnte gezeigt werden, dass das E-Protein in

Cexo-Nendo-Konfiguration vorliegt. Monoklonale Antikorper, die spezifisch Epitope des

C-Terminus erkennen, ergaben in fixierten, TGEV-infizierten ST-Zellen ein positives Si-

gnal bei der Oberflachenimmunfluoreszenz-Analyse (Godet et al., 1992). Fur das E-

Protein von MHV wurde gezeigt, dass es posttranslational acyliert wird (Yu et al., 1994).

Das E-Protein kommt im Viruspartikel generell nur in geringer Kopienzahl vor (z.B. bei

TGEV 20 Molekule pro Partikel (Godet et al., 1992)).

Das E-Protein spielt eine essentielle Rolle bei der Virusreifung. Die Coexpression von M-

und E-Protein ist fur die Bildung von”virus-like particles“ notwendig und ausreichend

(Vennema et al., 1996). Es wird vermutet, dass das E-Protein die spharische Morphologie

und die Abschnurung der Partikel bestimmt. Die Schlusselrolle des E-Proteins fur die

Virusreifung konnte ebenfalls durch die Erstellung und Untersuchung von Virusmutanten

durch gezielte Rekombination gezeigt werden (Fischer et al., 1998).

24 1. Einleitung

1.1.2.4 S-Protein

Das Surface- oder Spike-Protein (S-Protein) bildet die charakteristischen 20 nm langen,

keulenformigen Oberflachenprojektionen, denen die Coronaviren ihren Namen verdanken.

Das S-Protein besitzt bei der Neusynthese eine N-terminale Signalsequenz. Nahe dem hy-

drophilen C-Terminus befindet sich eine hydrophobe Region, mit der das Protein in der

Lipidmembran der Viruspartikel verankert ist. Die Ektodomane stellt den Hauptteil des

Proteins dar. Die Große des Polypeptids variiert je nach Coronavirusspezies zwischen 1160

Aminosauren (IBV) und 1452 Aminosauren (FIPV). Das Molekulargewicht von ungespal-

tenem S-Protein liegt zwischen 170 und 220 kDa. Die S-Proteine der Coronaviren besitzen

eine große Zahl potentieller N-Glykosylierungsstellen (bis zu 35), von denen die meisten

auch genutzt zu werden scheinen. Abhangig von Virustyp und -stamm und von der infizier-

ten Zielzelle werden die S-Proteine der Coronaviren zu unterschiedlichen Graden in eine

S1- und eine S2-Untereinheit gespalten. Gespaltenes S wurde nie bei TGEV und FIPV be-

obachtet, hingegen kamen die S-Proteine bei IBV-Stammen von Huhnerembryonen oder

Huhnernierenzellen uberwiegend in gespaltener Form vor. Bei MHV variiert der Grad

der Spaltung je nach Wirtszelltyp von 0–100%. Die S2-Untereinheit stellt den Teil des

S-Proteins dar, der in der Virusmembran verankert ist, und besitzt innerhalb der Virusfa-

milie die hochste Konservierung bezuglich der Aminosauresequenzen (fur eine Ubersicht

s. Cavanagh, 1995). Analysen der Aminosauresequenzen von S-Proteinen verschiede-

ner Coronavirusspezies haben die Anwesenheit von zwei Regionen mit”heptad repeats“

in der S2-Untereinheit ergeben, die auf eine α-helikale”coiled-coil“ Struktur hinweisen

(de Groot et al., 1987; Rasschaert und Laude, 1987). Daher wird das S-Protein als

Multimer, moglicherweise Homotrimer, angesehen, wobei die S2-Untereinheit einen Stiel

mit einer dem Influenza-Hamagglutinin-Trimer ahnlichen Struktur bildet (Laude et al.,

1990; Cavanagh, 1995). Es wurde gezeigt, dass die S-Protein-Monomere erst nach Erhalt

ihrer Konformation zu stabilen Trimeren zusammengelagert werden. Die Trimerbildung

findet jedoch vor den letzten Glykosylierungsschritten im Golgi-Apparat statt (Delmas

und Laude, 1990). Im Gegensatz zur S2-Untereinheit zeigen die S1-Untereinheiten der

Coronaviren wenig Aminosaureidentitat. Selbst innerhalb einer Spezies wie z.B. IBV sind

die S1-Untereinheiten der verschiedenen Stamme sehr heterogen. Die S1-Untereinheit be-

sitzt ein hydrophobes Profil und bildet den globularen Kopf des Virusspikes.

1.1. Coronaviren 25

Dem S-Protein kommt in der Anfangsphase der Infektion eine entscheidende Bedeutung

zu, denn es vermittelt die Bindung des Virions an den zellularen Rezeptor und die an-

schließende Fusion der viralen Lipidhulle mit der Zellmembran. Fur die Fusion scheint

das S-Protein alleine ausreichend zu sein (Vennema et al., 1990). Viele Coronaviren fu-

sionieren mit der Plasmamembran der Wirtszelle bei einem pH-Wert von 7 oder hoher.

Fur TGEV wurde aber gezeigt, dass die Infektion nach rezeptorvermittelter Endozytose

und nachfolgender saureabhangiger Fusion mit einem intrazellularen Kompartiment statt-

findet (Hansen et al., 1998). Auch fur bestimmte IBV-Stamme wurde der Eintritt des

Virions in die Zelle durch Endozytose beschrieben.

Das S-Protein induziert uberwiegend die Bildung neutralisierender Antikorper im Ver-

lauf einer Infektion. Die antigenen Epitope der Coronaviren befinden sich vor allem im

aminoterminalen Bereich (S1-Untereinheit) des S-Proteins (Delmas et al., 1990).

1.1.2.5 HE-Protein

Die Coronaviren der Gruppe II besitzen ein zusatzliches Oberflachenprotein, die Ham-

agglutinin-Esterase (HE), die als rezeptorzerstorendes Enzym wirkt (fur eine Ubersicht

s. Brian et al., 1995). Im Elektronenmikroskop ist bei den Coronaviren der Gruppe II

ein zweiter Ring kurzerer Spikes zu sehen, der vom HE-Protein gebildet wird. Das Gen

des HE-Proteins befindet sich auf der 5’ Seite des S-Protein-Gens. Das HE-Protein ist ein

N-glykosyliertes Typ I-Membranprotein, welches als uber Disulfidbrucken verbundenes

Homodimer vorkommt. Ein Monomer hat ein Molekulargewicht von 60–65 kDa, das Dimer

von 130–140 kDa.

Eine Hauptfunktion des HE-Proteins ist seine Enzymaktivitat in Form einer 9-O-Acetyl-

esterase wie sie auch bei Influenza-C-Viren vorkommt (Vlasak et al., 1988a,b). Das

HE-Protein zeigt betrachtliche Homologie zum HEF-Protein des Influenza-C-Virus (30%

Homologie auf Aminosaureebene) und weist in seiner Aminosauresequenz ein F-G-D-S-

Motiv auf, welches identisch mit dem katalytischen Zentrum der Acetylesterase des HEF-

Proteins bei Influenza-C ist. Bei dieser Esterase handelt es sich um eine klassische Serines-

terase, die durch DFP (Diisopropylfluorophosphat) gehemmt wird. Eine solche Hemmung

der Enzymaktivitat wirkt auch inhibierend auf die Virusvermehrung, was vermuten ließ,

26 1. Einleitung

dass eine aktive virale Esterase essentiell fur den Viruseintritt in die Zelle ist (Vlasak

et al., 1988a).

Dem HE-Protein wurde zusatzlich eine Hamagglutinationsaktivitat uber die Bindung an

N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsaure (Neu5,9Ac2) zugeschrieben. Das HE-Protein wurde

aus diesem Grund als Bindungsprotein zur Initiation einer Infektion diskutiert (Vlasak

et al., 1988b). Es wurde jedoch gezeigt, dass das S-Protein von BCoV und HCoV-OC43

eine hohere Bindungsaktivitat fur Neu5,9Ac2 besitzt und damit das effizientere Hamag-

glutinin ist (Schultze et al., 1991a,b; Schultze und Herrler, 1992; Kunkel und

Herrler, 1993). Die Funktion des HE-Proteins scheint somit vor allem darin zu be-

stehen, die Virusoberflache als rezeptorzerstorendes Enzym frei von Glykokonjugaten zu

halten. Die Funktion der Bindung (S-Protein) und der rezeptorzerstorenden Aktivitat

(HE-Protein) scheinen sich somit bei den Coronaviren der Gruppe II wie bei Influenza-

A-Viren (Hamagglutinin, Neuraminidase) auf zwei Proteine zu verteilen.

1.2 Das Virus der ubertragbaren Gastroenteritis

(TGEV)

1.2.1 Pathogenitat und Epidemiologie

Falle der ubertragbaren Gastroenteritis der Schweine wurden vermutlich bereits in den

30er Jahren beobachtet (Smith, 1956). Die virale Atiologie der transmissiblen Gastro-

enteritis (TGE) wurde 1946 durch einen Bericht von Doyle und Hutchings (1946) in

den Vereinigten Staaten bestatigt. Sie konnten zeigen, dass ein filtrierbares Agens auf

Schweine ubertragen werden konnte und daraufhin eine haufig fatale Gastroenteritis her-

vorrief. In den folgenden Jahrzehnten wurde die TGE in allen Kontinenten beschrieben.

Von Bedeutung wurde die ubertragbare Gastroenteritis fur die Schweineindustrie mit ih-

rer Intensivierung (Woode, 1969). Den Kriterien der Familie der Coronaviridae folgend

(Tyrrell et al., 1968) wurde TGEV von Tajima (1970) in die Gruppe der Coronaviren

eingeordnet.

Bis in die 70er Jahre traten TGEV-Infektionen in den Vereinigten Staaten und in Europa

1.2. Das Virus der ubertragbaren Gastroenteritis (TGEV) 27

vor allem im Winter als akute Epizootien in Aufzuchtbetrieben auf. Nach einem Aus-

bruch der TGE hielt die Immunitat der Herde ca. 2 bis 3 Jahre an, bis es dann durch

Einschleppung des Virus zu einem neuen Ausbruch kam. Durch die Intensivierung der

Schweinezucht wandelte sich das Bild der TGEV-Infektion zu einer Enzootie vor allem

in großen Zuchtbetrieben, in denen das Virus nach einem Erstausbruch in Absetzferkeln

persistierte. In Europa und in den Vereinigten Staaten ist das Auftreten der ubertragba-

ren Gastroenteritis rucklaufig (Enjuanes und van der Zeijst, 1995). Es gibt jedoch

auch Berichte von schweren TGE-Ausbruchen in den 90er Jahren. So starben z.B. 1996

bei einem schweren Ausbruch in England 750 Ferkel und 5 Sauen (Jones und Paton,

1996; McGoldrick et al., 1999).

TGEV ist ein typisch enteropathogener Vertreter der Coronaviren, kann aber auch im Res-

pirationstrakt und in der Milchdruse laktierender Sauen replizieren. Das Virus wird mit

infektiosem Material z.B. den Faces oder der Sauenmilch auf oralem Wege aufgenommen.

Es erreicht uber die Magen-Darm-Passage den Dunndarm und infiziert die Epithelzellen

im apikalen Bereich der Zotten von Jejunum und Ileum. Das Virus breitet sich uber den

Villus auf die weiter abwarts liegenden Epithelzellen aus, wurde aber nie in den Zellen an

der Zottenbasis und in den Zellen der Krypten gefunden (Garwes, 1995). Die infizierten

Epithelzellen losen sich vom Villus ab und werden von neuen Zellen aus den Krypten

ersetzt. Dieser Vorgang beendet die Infektion nach ca. 5–7 Tagen. Die neuen Zellen wer-

den nicht infiziert. Durch die Ablosung der Epithelzellen kommt es zur Villusatrophie

und dadurch bedingt zu einer wassrigen Diarrhoe (Hooper und Haelterman, 1969;

Pensaert et al., 1970). Epizootische Ausbruche der ubertragbaren Gastroenteritis be-

treffen Schweine aller Altersgruppen und breiten sich in 2–3 Tagen auf die gesamte Herde

aus. Der Schweregrad der Erkrankung ist jedoch je nach Alter der Tiere unterschiedlich.

Bei Saugferkeln bis zum Alter von zwei Wochen kommt es haufig zu Erbrechen und wass-

riger Diarrhoe, die zu Dehydratation, starkem Gewichtsverlust und Tod in 2 bis 5 Tagen

fuhren. Die Mortalitatsrate in dieser Altersgruppe liegt bei bis zu 100%. Bei Absetzferkeln

(3–8 Wochen alt) betragt die Mortalitatsrate weniger als 10–20%. Es kommt jedoch zu

Wachstumsverzogerungen und somit zu wirtschaftlichen Verlusten. Erwachsene Tiere ent-

wickeln ebenfalls einen wassrigen Durchfall, der 2–4 Tage anhalt, aber die Mortalitatsrate

in dieser Altersgruppe liegt unter 5%.

28 1. Einleitung

Die Empfanglichkeit fur eine TGEV-Infektion setzt sich aus unterschiedlichen Faktoren

zusammen: Alter der Tiere, Umweltbedingungen, Virusdosis und Virulenz des jeweiligen

Virusstammes. Auch die Moglichkeit zur Kolostrumaufnahme scheint bei neugeborenen

Ferkeln die Empfanglichkeit gegenuber einer TGEV-Infektion zu beeinflussen. So konn-

te gezeigt werden, dass Neugeborene, die kein Kolostrum erhielten, nach einer Infektion

mit TGEV (PUR46-MAD) starben (100% Mortalitat). Ihre Wurfgeschwister, die fur 7 h

Zugang zum Kolostrum hatten, zeigten hingegen keinerlei Krankheitszeichen. In welcher

Weise die Kolostrumaufnahme die Empfanglichkeit fur eine TGEV-Infektion beeinflusst,

ob z.B. dadurch die Epithelzelldifferenzierung verandert ist oder ob Inhaltsstoffe des Ko-

lostrums mit den Virionen interagieren, ist noch nicht bekannt (Enjuanes und van der

Zeijst, 1995). Als Ursache fur den Schweregrad des Krankheitsverlaufs epizootischer

TGE-Ausbruche bei Saugferkeln wurden ebenfalls unterschiedliche Faktoren diskutiert:

eine geringe Enterozytenerneuerungsrate bei neugeborenen Ferkeln (Moon, 1973); das

Vorkommen von Enterozyten fetalen Ursprungs auf dem Villus, welche durch ihr tubulo-

vakuolares System die Virusreplikation erleichtern (Wagner et al., 1973); die fehlende

Aktivitat von naturlichen Killerzellen in den intraepithelialen Lymphozyten neugebore-

ner Ferkel (Cepica und Derbyshire, 1984) sowie das Vorkommen eines zusatzlichen

Rezeptors auf den Zotten Neugeborener (Weingartl und Derbyshire, 1993).

Wahrend der serologischen Routineuberwachung von Schweinebestanden in Großbritan-

nien, Belgien, den Niederlanden und Frankreich vermerkte man Mitte der 80er Jahre eine

Erhohung der Anzahl an Schweinebestanden, die Antikorper gegen TGEV besaßen. Dieser

Anstieg korrelierte nicht mit einer Erhohung der Erkrankungsrate an TGE. 1986 konnte

schließlich eine TGEV-Variante, das porzine respiratorische Coronavirus (PRCoV), aus

dem Respirationstrakt infizierter Schweine in Belgien isoliert werden (Pensaert et al.,

1986). Diese Variante replizierte mit hoher Effizienz im Respirationstrakt, jedoch nicht

oder nur in geringem Ausmaß im Gastrointestinaltrakt von Schweinen (Cox et al., 1990).

Die meisten Beobachter registrierten in Verbindung mit einer PRCoV-Infektion nur we-

nige oder keine Anzeichen einer respiratorischen Erkrankung (Enjuanes und van der

Zeijst, 1995). Serologische Untersuchungen ergaben, dass TGEV und PRCoV nahe ver-

wandt sind (Callebaut et al., 1988; Sanchez et al., 1992). Aus diesem Grund wird

PRCoV auch als TGEV-Variante und nicht als eigene Coronavirusspezies betrachtet. Da

das porzine respiratorische Coronavirus aerogen ubertragen wird, besitzt es eine hohe


Ausbreitungsrate. So waren bis Ende der 80er Jahre fast alle Schweinebestande in Belgien

infiziert (Pensaert und Cox, 1989). Diese Ausbreitung von PRCoV wird als Grund

fur den Ruckgang der TGEV-Infektionen angesehen. So wirkt eine PRCoV-Infektion

aufgrund der serologischen Verwandtschaft haufig als naturlicher Impfschutz gegen eine

TGEV-Infektion. Die Analyse der Sequenzen beider Viren ergab eine Homologie von 96%.

Die Hauptunterschiede in der Sequenz bestehen in drei Deletionen des PRCoV-Genoms

(Rasschaert et al., 1990; Wesley et al., 1991; Sanchez et al., 1992). Durch zwei der

Deletionen wird der ORF3a, der fur ein Nicht-Strukturprotein unbekannter Funktion ko-

diert, in ein Pseudogen verwandelt. Die dritte Deletion betrifft das Gen des S-Proteins.

Durch eine Deletion von 672 Nukleotiden (224 Aminosauren) bei europaischen Isolaten

bzw. 681 Nukleotiden (227 Aminosauren) bei nordamerikanischen Isolaten besitzt PRCoV

ein in seinem aminoterminalen Bereich stark verkurztes S-Protein.

1.2.2 Eigenschaften des S-Proteins von TGEV

Das Gen des S-Proteins von TGEV kodiert ein Polypeptid mit einer Lange von 1447 Ami-

nosauren. Nach Abspaltung des Signalpeptids (16 Aminsauren) im Endoplasmatischen Re-

tikulum werden an die meisten 32 potentiellen N-Glykosylierungsstellen Mannose-reiche

Kohlenhydratketten angehangt. Nach einem zusatzlichen Glykosylierungsschritt im Golgi-

Apparat wird das reife S-Protein (220 kDa) in die Viruspartikel eingebaut (Laude et al.,

1990). Die Spikes auf der Oberflache des Virions werden durch Homotrimere des S-Proteins

gebildet. Diese Trimere bilden sich, bevor die komplexen Glykosylierungsschritte ablaufen

(Delmas und Laude, 1990). Eine proteolytische Spaltung des S-Proteins in eine S1- und

eine S2-Untereinheit findet nicht statt.

1.2.2.1 Epitope

Die Antigen-Struktur des S-Proteins wurde von den Arbeitsgruppen Laude in Frankreich

und Enjuanes in Spanien mit Hilfe von monoklonalen Antikorpern eingehend untersucht.

Beschrieben wurden vier Epitope, die alle im aminoterminalen Bereich des S-Proteins

liegen (Delmas et al., 1986; Jimenez et al., 1986; Correa et al., 1988). Durch die

Isolierung von Escape-Mutanten wurden die an der Bildung der Epitope beteiligten Ami-

30 1. Einleitung

D 224

COOH

COOH

C B

D

D

C

A

A-B

NH2

NH2

PRCoV

TGEV-PUR46 Madrid

TGEV-PUR115 Paris

5051

97144

163165

385

383384

538 (Aa)543 (Ac)586 (Aa/b)591 (Ab)

549586

4 229

Abbildung 1.2: Schematische Darstellung der Epitope des S-Proteins von TGEV (Madrid) nach

Gebauer et al. (1991) und TGEV (Paris) nach Delmas et al. (1990). Die Zahlen unter den

einzelnen Epitopen bezeichnen die Positionen der an der Epitopbildung beteiligten Aminosaur-

en. Vergleichend ist das S-Protein von PRCoV mit seiner Deletion im aminoterminalen Bereich

dargestellt.

nosauren identifiziert (Correa et al., 1990; Delmas et al., 1990; Gebauer et al., 1991).

Bezeichnung und Lage der Epitope sind in Abbildung 1.2 dargestellt.

Das von der Arbeitsgruppe Enjuanes zusatzlich gefundene Epitop C ist nicht auf der

Oberflache nativer Virionen exponiert. Innerhalb der TGEV-Stamme sind die Epitope A

und B (nach Enjuanes) bzw. A/B und D (nach Laude) stark konserviert. Das Epitop A

(nach Enjuanes) bzw. A/B (nach Laude) ist der Hauptverursacher der Bildung neutra-

lisierender Antikorper. Monoklonale Antikorper gegen dieses Epitop reagieren ebenfalls

mit FIPV. Ein Vergleich der Aminosauresequenzen beider Viren im Bereich dieses Epi-

tops ergab eine Homologie von 92%. Im Bereich des Epitops D (nach Laude) bzw. B

(nach Enjuanes) lag hingegen nur eine Homologie von 25% zwischen TGEV und FIPV

vor (Delmas et al., 1990). Die korrekte Faltung der Epitope A und B (nach Enjuanes)

bzw. A/B und D (nach Laude) ist abhangig von der Glykosylierung. Nach vollstandigem

Zusammenbau des Virions ist der Kohlenhydratanteil nicht bedeutsam fur die Antigenitat

der Epitope (Gebauer et al., 1991).


1.2.2.2 Bindungsaktivitaten

Das S-Protein von TGEV besitzt zwei Bindungsaktivitaten. Mit einer Bindungsstelle

im Bereich zwischen Aminosaure 522 und 744 wird der zellulare Rezeptor, die porzine

Aminopeptidase N (pAPN) erkannt (Delmas et al., 1992; Godet et al., 1994). Eine

zweite Bindungsaktivitat erlaubt es TGEV Erythrozyten zu agglutinieren (Noda et al.,

1987, 1988). Die Hamagglutinationsaktivitat des Virus wird durch die Bindung an Sia-

linsauren verursacht (Schultze et al., 1993). Genauere Untersuchungen zeigten, dass

N-Glykolylneuraminsaure (Neu5Gc) der haufig vorkommenden N-Acetylneuraminsaure

(Neu5Ac) vorgezogen wird (Schultze et al., 1995, 1996). Die Sialinsaurebindungsstel-

le befindet sich im Bereich des Epitops B (nach Enjuanes) bzw. D (nach Laude) des

S-Proteins von TGEV (Schultze et al., 1996).

PRCoV besitzt wie TGEV die Eigenschaft an pAPN zu binden (Delmas et al., 1993).

Eine Hamagglutinationsaktivitat und damit Sialinsaurebindungsaktivitat besitzt das por-

zine respiratorische Coronavirus jedoch nicht, da die Bindungsstelle fur Sialinsauren in

dem bei PRCoV deletierten Bereich liegt (Schultze et al., 1996). Die S-Proteine von

TGEV und PRCoV sind zum Vergleich schematisch in Abbildung 1.2 dargestellt.

Die Sialinsaurebindungsaktivitat des transmissiblen Gastroenteritisvirus bewirkt, dass in

Zellkultur wachsendes Virus mit Hamagglutinationsinhibitoren zellularen Ursprungs um-

geben wird. Dieser Maskierung der Sialinsaurebindungsaktivitat kann durch Neuraminida-

sebehandlung entweder der Zellen vor der Infektion oder der Virionen nach der Virusernte

entgegengewirkt werden (Krempl et al., 1997). Eine nahere Analyse der Sialinsaure-

bindungseigenschaft von TGEV mit Hilfe von hamagglutinationsdefizienten Mutanten

(HAD-Mutanten) zeigte, dass das Virus durch die Bindung an zellulare Sialoglykokon-

jugate eine erhohte Resistenz gegenuber dem Detergenz Oktylglukosid besitzt (Krempl

et al., 2000). Da Epitop-D-Mutanten, die keine Hamagglutinationsaktivitat zeigten, auch

eine stark reduzierte Enteropathogenitat aufwiesen, wird vermutet, dass die Sialinsaure-

bindungsaktivitat von TGEV einen Pathogenitatsfaktor darstellt (Bernard und Laude,

1995; Krempl et al., 1997). Eine Ubersicht uber einige der Epitop-D-Mutanten und ihre

Eigenschaften gibt Tabelle 1.3.

32 1. Einleitung

Mutante AS-Austausch AS-Position Entero- Infektiositat HA-Aktivitat

pathogenitat (PFU/ml) (HAU/ml)

m5 C - F 155 − 3,3 × 108 < 2

m6 P - L 145 − 2,5 × 108 < 2

m8 C - R 147 − 8,9 × 108 < 2

m9 S - P 149 + 6,0 × 108 512

m10 4 AS deletiert 146–149 − 5,0 × 108 < 2

PUR115 - - - - - - ++ 5,7 × 108 256

Tabelle 1.3: Ubersicht uber einige charakteristische Eigenschaften der Epitop-D-Mutanten. Als

Vergleich wurde das Wildtypvirus TGEV PUR115 mit in die Tabelle aufgenommen. Die Entero-

pathogenitat wird nach der Mortalitatsrate angegeben: − = 0 von 3, + = 2 von 3, ++ = 3 von 3

infizierten Tieren tot. Ubersichtsauszug aus Krempl et al. (1997).

1.2.2.3 Tropismus

Das S-Protein von TGEV determiniert den Tropismus der einzelnen Stamme und Vari-

anten (Sanchez et al., 1999). So zeigt im Gegensatz zu TGEV PRCoV keine Enteropa-

thogenitat mehr, sondern einen Tropismus fur den Respirationstrakt (Cox et al., 1990).

TGEV und PRCoV weisen eine Sequenzhomologie von 96% auf; der Unterschied zwischen

den beiden Virusgenomen liegt im Fehlen des ORF3a und in einer Deletion von 224 Ami-

nosauren am aminoterminalen Ende des S-Proteins (Rasschaert et al., 1990; Wesley

et al., 1991; Sanchez et al., 1992). Der ORF3a scheint keine Bedeutung fur die Entero-

pathogenitat von TGEV zu haben, da auch virulente TGE-Viren mit einem deletierten

ORF3a isoliert wurden (McGoldrick et al., 1999). Der bei PRCoV deletierte Bereich

des S-Proteins spielt jedoch eine wichtige Rolle fur die Enteropathogenitat des transmissi-

blen Gastronenteritis-Virus. Die Infektion von Ferkeln mit Epitop-D-Mutanten zeigte eine

stark reduzierte Enteropathogenitat. In der Epitop-D-Region des S-Proteins befindet sich

somit vermutlich eine bedeutende Determinante fur die Pathogenese der TGEV-Infektion

(Bernard und Laude, 1995). Auch Ballesteros et al. (1995, 1997) konnten durch

Erstellung von rekombinanten Viren zwischen PUR46-MAD (infiziert Darm- und Respira-

tionstrakt) und dem PTV-Stamm (infiziert nur den Respirationstrakt) von TGEV zeigen,

dass eine Domane im Bereich der Aminosaure 219 des S-Proteins einen Faktor darstellt,

der fur den Enterotropismus von TGEV essentiell ist. In dieser Region des S-Proteins be-

1.3. Escherichia coli F5/K99 (E. coli F5/K99) 33

findet sich die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV, so dass eine Korrelation zwischen

der Enteropathogenitat und der Sialinsaurebindungsaktivitat postuliert wurde (Krempl

et al., 1997).

1.3 Escherichia coli F5/K99 (E. coli F5/K99)

Die durch enterotoxinogene E. coli (ETEC) verursachten Diarrhoen zahlen zu den wich-

tigsten Infektionskrankheiten bei Absetz- und Saugferkeln. Die Erkrankungen werden

durch E. coli -Stamme verschiedener Serogruppen hervorgerufen, die den Darm des Tieres

besiedeln und durch Toxinfreisetzung den Wirtsorganismus schadigen. Fur die Besiedelung

des Darms sind spezielle Adhasionsmechanismen verantwortlich. Die Bakterien besitzen

auf ihrer Oberflache Fimbrien, die das Haften an der Darmschleimhaut ermoglichen und

somit den Abtransport mit dem Darminhalt verhindern. Bei porzinen ETEC-Stammen

sind verschiedene Fimbrien-Typen beschrieben, die aus Protein bestehen und sich mor-

phologisch und antigenetisch voneinander unterscheiden (fur eine Ubersicht s. Stamm

und Sorg (1993)). Die Fimbrien dienen den Bakterienzellen als Kolonisationsfaktor, da

sie mit ihnen an spezifische Rezeptoren auf der Darmschleimhaut binden und somit den

Darm kolonisieren konnen.

Epidemiologische Untersuchungen in Spanien ergaben, dass das Vorhandensein von F5-

Fimbrien statistisch mit Durchfallerkrankungen von Ferkeln, die junger als 15 Tage waren,

assoziiert war (Garabal et al., 1997). Bei Kalbern und Lammern ist E. coli F5 ein

haufiger Vertreter der enterotoxinogenen E. coli -Stamme (Guinee et al., 1976). Kalber

und Lammer sind nur bis zum zweiten Lebenstag empfanglich fur eine Infektion mit dem

Bakterium; bei Ferkeln konnten nach dem Absetzen keine enterotoxinogenen E. coli F5

mehr bei Durchfallerkrankungen nachgewiesen werden (Gaastra und de Graaf, 1982).

Fimbrien besitzen die Eigenschaft Erythrozyten zu agglutinieren. Bei E. coli F5 geschieht

dies uber die Bindung an Sialinsauren von Zelloberflachenkomponenten. Durch diese Sia-

linsaurebindungseigenschaft konnen die Bakterien auch an Sialoglykokonjugate im Darm

binden und so diesen kolonisieren (Gaastra und de Graaf, 1982). E. coli F5 bevorzugt

Neu5Gc als Rezeptordeterminante auf der Erythrozytenoberflache (Lindahl et al., 1987;

Ono et al., 1989). Rezeptoren fur F5 wurden einerseits als Glykolipide, andererseits als

34 1. Einleitung

Glykoproteine beschrieben. So isolierten Teneberg et al. (1990) selektiv Glykolipide aus

dem Dunndarm neugeborener und erwachsener Schweine und identifizierten als rezep-

toraktives Glykolipid Neu5Gc-GM3 (N-Glykolylneuraminyl-neolaktotetraosyl-ceramid),

welches nur bei der Gruppe der Neugeborenen vorkam. Andere Arbeitsgruppen beschrie-

ben die Bindung der F5-Fimbrien an Muzine auf der Darmschleimhaut des Ferkeldunn-

darms oder die Reduzierung der Adhasion von E. coli F5 an das Darmepithel durch

Kohlenhydratanteile von Glykoproteinen aus Rinderseren (Lindahl und Carlstedt,

1990; Mouricout et al., 1990). Zusatzlich konnte nachgewiesen werden, dass das Auf-

treten von adhasiven und nicht-adhasiven Phanotypen bei der Infektion mit E. coli F5

mit dem Gehalt bestimmter Sialoglykolipide korreliert (Seignole et al., 1991).

1.4 Virusrezeptoren

Viren besitzen keinen eigenen Stoffwechselapparat und sind somit außerhalb lebender

Zellen nicht vermehrungsfahig. Um sich vermehren zu konnen, nutzen Viren die Synthe-

semaschinerie von Zellen und funktionieren sie fur ihre Zwecke um. Die Infektion einer

Zelle beginnt mit der Anlagerung der Viruspartikel an die Plasmamembran. In diesem

ersten Schritt binden die Virionen uber virale Oberflachenproteine an Molekule auf der

Zellmembran, die in diesem Zusammenhang als Virusrezeptoren bezeichnet werden. Die

Bindung an die Zelle ist notwendig, um in einem zweiten Schritt die Plasmamembran

penetrieren und damit die virale Erbinformation in die Zelle einschleusen zu konnen. Bei

behullten Viren ist hierzu die Fusion der Virusmembran mit der Plasmamembran bzw.

nach Endozytose mit der Endosomenmembran notwendig.

Das Vorkommen eines viralen Rezeptors kann den Tropismus und die Pathogenitat von

Viren bestimmen. Als Rezeptoren konnen sowohl Proteine und Lipide als auch Kohlen-

hydrate dienen. Eine beispielhafte Ubersicht uber bekannte Virusrezeptoren gibt Tabelle

1.4. Viele Viren erkennen mehr als einen Rezeptor oder benotigen zusatzlich zu ihrem

zellularen Rezeptor weitere Faktoren zur Etablierung einer Infektion in vivo. So sind z.B.

bei der Infektion von HIV-1 neben CD4 auch Proteine aus der Chemokinrezeptorfamilie

beteiligt (Lapham et al., 1996; Trkola et al., 1996; Wu et al., 1996). Die Bindung

an CD4 bewirkt eine Konformationsanderung des HIV-Spikeproteins (gp120), wodurch

1.4. Virusrezeptoren 35

die Bindung an den Corezeptor aus der Chemokinfamilie (CCR5) ermoglicht wird. Diese

zweite Interaktion bewirkt bei dem Transmembranprotein gp41 die Umwandlung in eine

fusionsaktive Konformation. Erst dann lauft die Fusion zwischen Virus- und Zellmembran

ab.

Der erste Virusrezeptor, der identifiziert wurde, war N-Acetylneuraminsaure (Neu5Ac),

die von Influenza-A- und -B-Viren sowie von einigen Paramyxoviren erkannt wird (Klenk

et al., 1955; Gottschalk, 1958). Dieses Beispiel fur einen Kohlenhydratrezeptor ist auf-

grund der jahrzehntelangen Forschungen gut charakterisiert. Neu5Ac bindet uber Wasser-

stoffbrucken und van-der-Waals-Krafte in einer Rezeptortasche, die sich im globularen Teil

des Influenza-Hamagglutinins befindet (Weis et al., 1988). Verschiedene Influenzastamme

haben eine Praferenz fur die α2,3- bzw. α2,6-gebundene Form der Sialinsaure (Rogers

und Paulson, 1983). Eine andere Sialinsaure, die N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsaure

(Neu5,9Ac2), wird z.B. von Influenza-C-Viren als Rezeptordeterminante erkannt (Rogers

et al., 1986). Inzwischen kennt man sowohl einige umhullte als auch nicht-umhullte Vi-

ren, die Sialinsauren als Rezeptordeterminante fur die Einleitung einer Infektion nutzen

(Tab. 1.4). Unter diesen Viren besitzen die umhullten Viren i.d.R. zusatzlich ein rezep-

torzerstorendes Enzym. Bei Influenza-A- und -B-Viren sowie Paramyxoviren handelt es

sich hierbei um eine Neuraminidase, die die Sialinsaure von der Galaktose abspaltet. Die

Viren, die Neu5,9Ac2 als Rezeptordeterminante nutzen, besitzen eine 9-O-Acetylesterase,

die die Acetylgruppe am C9 hydrolysiert.

Bei den Coronaviren sind bisher fur einige Vertreter Proteinrezeptoren entdeckt worden.

Andere Coronaviren nutzen Sialinsauren als Rezeptordeterminante. Fur die meisten Ver-

treter der Serogruppe I wurde Aminopeptidase N (APN), eine Metalloprotease, die auf der

Oberflache von Enterozyten, Lungenfibroblasten und Nierenepithelzellen vorkommt, als

Rezeptor identifiziert (Delmas et al., 1992; Yeager et al., 1992; Tresnan et al., 1996;

Benbacer et al., 1997). Die Bindung an Aminopeptidase N scheint die Speziesspezifitat

der Viren zu determinieren (Delmas et al., 1994). Bei TGEV (Delmas et al., 1992) und

HCoV-229E (Yeager et al., 1992), fur die als erstes die Bindung an APN gezeigt wurde,

liegt die Bindungsstelle in unterschiedlichen Domanen des Enzyms. Fur die Bindung von

TGEV ist die Region zwischen Aminosaure 717 und 813 von APN essentiell (Delmas

et al., 1994). Hingegen ist bei der HCoV-229E-Infektion ein Bereich zwischen Aminosaure

36 1. Einleitung

Tabelle 1.4: Ubersicht uber bekannte Virusrezeptoren (Beispiele).

Virus Rezeptor/-determinante

Coronaviridae

Virus der ubertragbaren Gastroenteritis porzine APN (Delmas et al., 1992)

Porzines respiratorisches Coronavirus porzine APN (Delmas et al., 1993)

Virus der felinen infektiosen Peritonitis feline APN (Tresnan et al., 1996)

Coronavirus der Hunde canine APN (Benbacer et al., 1997)

Humanes Coronavirus (229E) humane APN (Yeager et al., 1992)

Maus-Hepatitis-Virus carcinoembryonales Antigen (Williams

et al., 1991)

Bovines Coronavirus Neu5,9Ac2 (Vlasak et al., 1988b;

Schultze und Herrler, 1992)

Humanes Coronavirus (OC43) Neu5,9Ac2 (Vlasak et al., 1988b;

Krempl et al., 1995)

Herpesviridae

Epstein-Barr-Virus CD21 (Fingeroth et al., 1984; Frade

et al., 1985; Nemerow et al., 1985)

Humanes Zytomegalievirus Heparansulfat (Compton et al., 1993)

Herpes-simplex-Virus Heparansulfat (WuDunn und Spear,

1989)

Orthomyxoviridae

Influenza-A-, -B-Viren Neu5Ac (Klenk et al., 1955;

Gottschalk, 1958)

Influenza-C-Virus Neu5,9Ac2 (Rogers et al., 1986)

Paramyxoviridae

Masernvirus CD46 (Naniche et al., 1993; Dorig

et al., 1993)

Sendaivirus Neu5Ac (Paulson et al., 1979)

Fortsetzung nachste Seite...

1.4. Virusrezeptoren 37

... Fortsetzung von letzter Seite

Virus Rezeptor/-determinante

Picornaviridae

Poliovirus PVR (Mendelsohn et al., 1989)

CD44 (Shepley und Racaniello,

1994)

Rhinovirus ICAM-1 (Greve et al., 1989; Staunton

et al., 1989; Tomassini et al., 1989)

Enzephalomyokarditis-Virus Neu5Ac (Burness und Pardoe, 1981)

Papovaviridae

Polyomavirus Neu5Ac (Fried et al., 1981)

Retroviridae

HIV-1 CD4 (Dalgleish et al., 1984;

Klatzmann et al., 1984)

CXCR4 (T-Zell-trope Stamme) (Berson

et al., 1996; Feng et al., 1996)

CCR5 (Makrophagen und TH-Zell-trope

Stamme) (Alkhatib et al., 1996; Choe

et al., 1996; Deng et al., 1996; Doranz

et al., 1996; Dragic et al., 1996)

Mause-Leukamie-Virus basischer Aminosauretransporter

(Albritton et al., 1989)

Phosphattransporter (O’Hara et al.,

1990)

260 und 353 in der Nahe des katalytischen Zentrums von hAPN von Bedeutung (Yeager

et al., 1992; Kolb et al., 1996). FIPV und CCoV erkennen Domanen, die dem von TGEV

genutzten Bereich auf dem Enzym entsprechen (Tresnan et al., 1996; Benbacer et al.,

1997). Die feline Aminopeptidase N wird nicht nur von FIPV und FCoV, sondern auch

von CCoV, TGEV und HCoV-229E erkannt. Die felinen und caninen Coronaviren erken-

nen jedoch die porzine und humane Form der Aminopeptidase nicht (Tresnan et al.,

1996; Benbacer et al., 1997). So konnen Katzen z.B. mit TGEV infiziert werden; der

38 1. Einleitung

Verlauf ist jedoch asymptomatisch (Reynolds und Garwes, 1979).

Die Maus-Hepatitis-Viren (MHV) als Vertreter der Serogruppe II der Coronaviren nut-

zen Glykoproteine aus der Familie der carcinoembryonalen Antigene (CEA), die der

Immunglobulin-Superfamilie zugeordnet werden, als Rezeptoren (Dveksler et al., 1991;

Williams et al., 1991; Dveksler et al., 1993b). Dieses von MHV genutzte CEA-Gly-

koprotein befindet sich auf Zelloberflachen von Leber, Dunn- und Dickdarm. Diese Or-

gane stellen Ziele der MHV-Replikation dar. Das Virus bindet an die aminoterminale

Immunglobulin-artige Domane seines Rezeptors (Dveksler et al., 1993a). Zusatzlich

erkennen einige MHV, die ein HE-Protein besitzen, Neu5,9Ac2. Diese zusatzliche Re-

zeptordeterminante ist aber fur die Virulenz zumindest in Zellkultur nicht notwendig

(Gagneten et al., 1995).

Die Coronaviren BCoV, HEV und HCoV-OC43 nutzen Neu5,9Ac2 als Rezeptordetermi-

nante (Vlasak et al., 1988b; Schultze et al., 1990, 1991a; Schultze und Herrler,

1992). Entsprechend besitzen sie mit ihrem HE-Protein ein rezeptorzerstorendes Enzym,

die 9-O-Acetylesterase (Vlasak et al., 1988a; Schultze et al., 1991b).

2. Zielsetzung

Das ubertragbare Gastroenteritis-Virus der Schweine (TGEV) ist ein typisch enteropatho-

genes Coronavirus. Das S-Protein von TGEV besitzt zwei Bindungsaktivitaten. Die eine

vermittelt die Bindung an den zellularen Rezeptor, porzine Aminopeptidase N (pAPN),

der fur die Infektion in Zellkultur unerlasslich ist. Bei der zweiten Bindungsaktivitat

handelt es sich um eine Sialinsaure-bindende Aktivitat. Virusvarianten wie das porzine

respiratorische Coronavirus (PRCoV) und bestimmte Mutanten besitzen die Bindungs-

aktivitat an pAPN, binden jedoch nicht an Sialinsauren. Diese Varianten und Mutanten

konnen Zellkulturen effizient infizieren, haben aber in vivo ihre Enteropathogenitat verlo-

ren. Aus diesem Grund wird vermutet, dass die Sialinsaurebindungsaktivitat eine wichtige

Rolle fur die Enteropathogenitat von TGEV spielt. Die Sialinsaurebindungsstelle auf dem

S-Protein von TGEV wurde bereits naher charakterisiert. Uber die Bindungspartner auf

zellularer Ebene — in Zellkultur und im Darmtrakt der Schweine — ist jedoch bisher

noch nichts bekannt.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch die Untersuchung der Interaktion von TGEV

mit intestinalen Sialoglykokonjugaten wie Muzinen und Oberflachenkomponenten von

Darmepithelzellen, die Bedeutung der Sialinsaurebindungsaktivitat fur die Enteropatho-

genitat von TGEV besser zu verstehen. TGEV eignet sich gut als Modell fur die Unter-

suchung molekularer Mechanismen, die zur virusbedingten Gastroenteritis fuhren, da es

Mutanten und Varianten gibt, bei denen die Enteropathogenitat verloren gegangen ist.

Durch vergleichende Untersuchungen ist es so moglich, die Faktoren, die fur den Entero-

tropismus des Virus von Bedeutung sind, zu erkennen und zu analysieren.

Nahere Informationen uber die Bindungspartner, die TGEV uber seine Sialinsaurebin-

dungsaktivitat erkennen kann, sollten uber drei Ansatze gewonnen werden:

39

40 2. Zielsetzung

1. Der Vergleich von TGEV und E. coli F5 sollte Anhaltspunkte liefern, ob die beiden

Krankheitserreger gleiche oder unterschiedliche Bindungspartner im Darm erken-

nen. E. coli F5 wurde fur den Vergleich ausgewahlt, da dieses Bakterium Sialo-

glykokonjugate des Darmtrakts zur Kolonisation nutzt, also wie TGEV uber eine

Sialinsaurebindungsaktivitat verfugt.

2. Die Untersuchung der Interaktion von TGEV mit Zellkulturzellen sollte klaren, ob

es neben pAPN noch andere Strukturen gibt, die uber die Sialinsaurebindungsak-

tivitat von TGEV erkannt und fur die Bindung an Zellen genutzt werden konnen.

Bei diesem Ansatz sollten die Mutanten HAD3 und m10, die nicht an Sialinsauren

binden konnen, vergleichend eingesetzt werden. Die bei der Untersuchung der Zell-

kulturzellen erarbeiteten Methoden sollten auf die weiterfuhrenden Untersuchungen

mit Komponenten des Dunndarms ubertragen werden.

3. Intestinale Muzine und Oberflachenstrukturen des Darmepithels sollten auf poten-

tielle Bindungspartner fur TGEV untersucht werden. Durch den Vergleich mit den

Mutanten HAD3 und m10 sollten die Strukturen, die TGEV aufgrund seiner Sia-

linsaurebindungsaktivitat erkennt, gefunden werden.

Mit diesen drei Ansatzen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Bedeutung der Sialinsaure-

bindenden Aktivitat fur die Enteropathogenitat des Virus der ubertragbaren Gastroente-

ritis der Schweine naher untersucht.

3. Material

3.1 Zelllinien

ST-Zellen (swine testicular): isoliert aus dem trypsinierten Hoden eines Schweinefoten

(80–90 d alt) (McClurkin und Norman, 1966).

LLC-PK1-Zellen: Schweinenierenzellen (Ref.: ATCC CRL-1392, 1994).

3.2 Zellkulturmedien

Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) mit

4500 mg/l Glucose, Pyridoxin und Glutamax-I

GIBCO BRL Life Technologies

PBS Dulbecco’s w/o Calcium und Magnesium GIBCO BRL Life Technologies

Fetales Kalberserum (FKS), auf Mykoplasmen

und Viren untersucht

GIBCO BRL Life Technologies

Trypsin-EDTA-Losung GIBCO BRL Life Technologies

Penicillin-Streptomycin Antibiotikalosung GIBCO BRL Life Technologies

3.3 Viren

TGEV PURDUE 46-MAD: Das Ausgangsisolat wurde 1946 an der Purdue Universitat

in Indiana gewonnen (Doyle und Hutchings, 1946; Bohl, 1972). Die verwendeten

Virusstocks wurden seit Isolierung 115-mal in Dr. Bohls, 9-mal in Dr. Enjuanes (Sanchez

et al., 1990, 1992), 2-mal in Dr. Herrlers Labor in Marburg (Krempl, 1998) und 2-mal

in unserem Labor in ST-Zellen passagiert. Die letzte Plaque-Reinigung liegt 7 bzw. 8

41

42 3. Material

Passagen zuruck (Bezeichnung: C1P7 bzw. C1P8).

HAD-Mutanten: Diese Mutanten wurden als hamagglutinationsdefiziente Mutanten von

Dr. Krempl in Dr. Herrlers Labor aus PUR 46-MAD isoliert (Krempl et al., 1998,

2000). In dieser Arbeit wurde die HAD3-Mutante verwendet (L → P, Position 209 des

S-Proteins).

Epitop-D-Mutanten: Die Mutanten wurden als Escape-Mutanten mit dem monoklonalen

Antikorper 40.1 (Epitop D) aus PUR 115-PAR isoliert (Delmas et al., 1986; Bernard

und Laude, 1995). In dieser Arbeit wurde die von Dr. Laude zur Verfugung gestellte

Mutante PUR 115-PAR m10 verwendet (4 AS deletiert, Position 146–149 des S-Proteins).

Die verwendeten Mutanten HAD3 und m10 wurden aufgrund ihrer hohen Infektiositat in

Zellkultur bei nicht vorliegender Hamagglutinationsaktivitat ausgewahlt. Sie wurden in

unserem Labor 2-mal in ST-Zellen passagiert.

3.4 Bakterien

E. coli F5/K99 2 Feldstamme aus Kalbern: A 408/86 (F5), A 131/95 (O9:K35, F5) zur

Verfugung gestellt von Dr. Amtsberg, Institut fur Mikrobiologie der TiHo Hannover.

3.5 Erythrozyten

Huhnererythrozyten Geflugelklinik, TiHo Hannover

Rindererythrozyten Klinik fur Reproduktionsmedizin,

TiHo Hannover

Pferdeerythrozyten Klinik fur Reproduktionsmedizin,

TiHo Hannover

Schweineerythrozyten Klinik fur Reproduktionsmedizin,

TiHo Hannover

3.6. Darmmaterial 43

3.6 Darmmaterial

Darmmuzinisolierung: Jejunum aus 2 Saugferkeln, 12 und 14 Tage alt, und 2 Absetzfer-

keln, 10 und 15 Wochen alt.

Burstensaummembranvesikel-Praparation: Jejunum aus 2 Saugferkeln, 1 Tag alt, 2 Saug-

ferkeln, 3 Tage alt, 2 Absetzferkeln, 12 Wochen alt, 2 Absetzferkeln, 6–8 Wochen alt.

Darmschnitte: Jejunum eines Saugferkels, 3 Tage alt.

Schweinerasse (wo bekannt): Muttersau F1 Deutsche Landrasse × Deutsches Edelschwein,

Eber F1 Hampshire × Pietrain.

3.7 Enzyme

Acylneuraminyl-Hydrolase (Neuraminidase) aus

Vibrio cholerae

DADE Behring

Streptavidin-Peroxidase(HRP)-Komplex Amersham/Pharmacia

3.8 Antikorper

Monoklonaler Antikorper gegen TGEV (S-Protein, Epitop A.c) 6A.C3 von L. Enjuanes,

Madrid. Monoklonaler Antikorper gegen porzine Aminopeptidase N G43 (Delmas et al.,

1992) von H. Laude, Jouys-en-Josas. Die verwendeten monoklonalen Antikorper stammten

aus Mausen und lagen als Zellkulturuberstand vor.

Anti-Maus-Immunglobuline vom Schaf,

biotinyliert

Amersham/Pharmacia

Anti-Maus-Immunglobuline vom Schaf,

FITC-gekoppelt

Amersham/Pharmacia

Anti-Maus-Immunglobuline vom Kaninchen,

HRP-gekoppelt

DAKO

Anti-Maus-Immunglobuline aus der Ziege,

HRP-gekoppelt

Institut fur Virologie, TiHo

44 3. Material

Monovalentes diagnostisches Kalberkoliruhrserum

K99 (F5)

BgVV

3.9 Kits

Silver Stain Kit BIO-RAD

DIG Glykan Differentiation Kit Roche

ECL glycoprotein detection module Amersham/Pharmacia

BCA-Protein-Assay Pierce

BIO-RAD Protein-Assay BIO-RAD

3.10 Substrate

ABTS Losung Roche

BM Chemoluminescence Blotting Substrate

(POD)

Roche

Super Signalr West Dura Extended Duration

Substrate

Pierce

3.11 Chemikalien

Acetonitril, isocratic grade fur

Flussigkeitschromatographie

Merck

Acrylamidlosung 30%”rotiphoreser Gel 30“ Roth

Aminocapronsaure Sigma

Ammoniumpersulfat (APS) BIO-RAD

Blocking-Reagenz Roche

Bovines Serumalbumin Sigma

Casaminoacids Difco

Complete, Proteaseinhibitorcocktail Roche

Coomassie-Brilliantblau Merck

1,4-Dithiotreitol (DTT) Roth

3.11. Chemikalien 45

Essigsaure Roth

Ethanol Merck

Glucose Roth

Glutaraldehyd Sigma

Glycerin Roth

Glycin Roth

Leupeptin Roche

2-Mercaptoethanol Fluka

Methanol Roth

4,5-Methylendioxy-1,2-phenylendiamin × 2 H2O

(DMB)

Fluka

Muzin aus der Glandula submandibularis des

Schweines

R. Schauer, Kiel

N-Acetylneuraminsaure Sigma

Natriumacetat Merck

Natriumdesoxycholat Roth

Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth

Neutralrot Merck

N-Glykolylneuraminsaure Sigma

2(N-Morpholino)ethansulfonsaure (MES) Sigma

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth

n-Oktyl-β-D-Glukopyranosid (OG) Sigma

Nonidetr P40 (4-Nonylphenolpolyethylenglykol) Roche

Paraformaldehyd Fluka

PefablockrSC

(4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid,

Hydrochlorid)

Roche

Pepstatin Roche

PolyViteX bioMerieux

Proteinmarker (Rainbow) Amersham/Pharmacia

Saccharose Roth

Salzsaure Roth

46 3. Material

Sea Plaquer Agarose FMC Bio Products

Streptavidin-Agarose Pierce

Sulfo-NHS-Biotin Pierce

Tris-Hydroxymethylaminomethan (TRIS) Roth

Triton X-114 (Octylphenolpolyethylenglycolether) Serva

Tween 20 Roth

WGA-Agarose (Wheat Germ Agglutinin) Sigma

Alle nicht weiter aufgefuhrten Chemikalien waren ebenfalls vom Reinheitsgrad p.A. oder

gleichwertiger Qualitat und stammten von den bereits erwahnten Firmen.

3.12 Puffer und Losungen

10fach Laufpuffer SDS 10 g

fur Polyacrylamidgele: TRIS 30 g

Glycin 144 g

mit H2O auf 1 l auffullen

Sammelgellosung H2O 3,4 ml

fur Polyacrylamidgele TRIS-HCl 1 M pH 6,8 0,63 ml

(5 ml Ansatz): Acrylamidlosung 30% 0,83 ml

SDS 10% (in H2O) 50 µl

APS 10% (in H2O) 50 µl

TEMED 10 µl

Trenngellosung (8%) H2O 4,6 ml

fur Polyacrylamidgele TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5 ml


SDS 10% (in H2O) 100 µl

APS 10% (in H2O) 100 µl

TEMED 24 µl

3.12. Puffer und Losungen 47

Trenngellosung (10%) H2O 4,0 ml

fur Polyacrylamidgele TRIS-HCl 1,5 M pH 8,8 2,5 ml


SDS 10% (in H2O) 100 µl

APS 10% (in H2O) 100 µl

TEMED 16 µl

Probenpuffer 2fach: TRIS-HCl pH 6,8 100 mM

SDS 4%

Glycerin 20%

Bromphenolblau 0,02%

(DTT 200 mM)

Coomassie-Farbelosung: Coomassie-Brilliantblau 0,5 g

Ethanol 200 ml

Essigsaure (konz.) 50 ml

H2O 250 ml

Entfarbelosung/ Ethanol 400 ml

Fixierlosung Essigsaure (konz.) 100 ml

fur Proteingele: H2O 500 ml

Anodenpuffer I (pH 9,0): TRIS 1 M 300 ml

Ethanol 200 ml

H2O 500 ml

mit HCl auf pH 9,0 einstellen

Anodenpuffer II (pH 7,4): TRIS 1 M 25 ml

Ethanol 200 ml

H2O 770 ml


48 3. Material

Kathodenpuffer (pH 9,0): Aminocapronsaure 5,25 mg

TRIS 1M 25 ml

Ethanol 200 ml

H2O 770 ml


NP40-Lysispuffer Natriumdesoxycholat 0,5%

(pH 7,5): TBS pH 7,5 50 ml

Nonidetr P40 1%

bei Bedarf Complete 1 Tabl.

Phosphat-gepufferte NaCl 8 g

Kochsalzlosung KCl 0,2 g

pH 7,5 (PBS): Na2HPO4 1,15 g

MgCl2 × 6H2O 0,1 g

KH2PO4 0,2 g

CaCl2 × 2H2O 0,13 g


PBS ohne Calcium NaCl 8 g

und Magnesium KCl 0,2 g

pH 7,5 (PBSM): Na2HPO4 1,15 g

KH2PO4 0,2 g


PBSM/0,1% Tween: PBSM 2 l

Tween-20 2 ml

PBSM/0,05% Tween: PBSM 2 l

Tween-20 1 ml


TRIS-gepufferte TRIS 0,05 M

Kochsalzlosung NaCl 0,15 M

pH 7,5 (TBS): mit HCl auf pH 7,5 einstellen

TRIS-Puffer: TRIS-HCl pH 7,4 10 mM

Pepstatin 1 µM

Leupeptin 1 µM

PefablockrSC 1 mM

DIG Glycan TBS pH 7,5

Differentiation Kit MgCl2 1 mM

Puffer 1 (pH 7,5): MnCl2 1 mM

CaCl2 1 mM

DIG Glycan TRIS 0,1 M

Differentiation Kit MgCl2 0,05 M

Puffer 2 (pH 9,5): NaCl 0,1 M


MES-Puffer (pH 6,5): MES 0,05 M

NaCl 0,1 M

CaCl2 0,02 M

mit 1 M NaOH auf pH 6,5 einstellen

Natriumacetat-Puffer, Natriumacetat 0,2 M

einfach (pH 5,5): mit Essigsaure auf pH 5,5 einstellen

Natriumacetat-Puffer Natriumacetat 0,05 M

(pH 5,5): NaCl 0,154 M

CaCl2 0,009 M

mit Essigsaure auf pH 5,5 einstellen

50 3. Material

DMB-Reagenz: 4,5-Methylendioxy- 7 mM

1,2-phenylendiamin × 2 H2O

Essigsaure 1,4 M

2-Mercaptoethanol 0,75 M

Natriumhydrogensulfit 18 mM

Minca-Medium: KH2PO4 1,36 g

Na2HPO4 × 2 H2O 10,1 g

Salzlosung 1 ml

Casaminoacids 1 g



autoklavieren, abkuhlen auf 54◦C

Glucose 1 g

PolyViteX 1 Ampulle

steril dazufiltrieren

Salzlosung: MgSO4 × 7 H2O 10 g

MnCl2 × 4 H2O 1 g

FeCl3 × 6 H2O 0,135 g

CaCl2 × 2 H2O 0,4 g


Isolationspuffer Hanks Balanced Salt Solution

zur Gewinnung extrazellularer w/o Ca/Mg 500 ml

Darmmuzinfraktionen: Penicillin/Streptomycin 5 ml

Gentamicin 0,5 ml

Fungizone 0,125 ml

Natriumpyruvat 1 ml

L-Glutamin 5 ml

Dithiothreitol 200 mg

HEPES 1 M 12,5 ml


Bradford-Reagenz, konz.: Coomassie-Brilliantblau 100 mg

Ethanol, 97% 50 ml

Phosphorsaure, 85% 100 ml

Bradford-Gebrauchslosung: Konzentrat 3 ml

H2O 17 ml

Schiff-Reagenz: Fuchsin (basisch)in H2O 1%

HCl 1 M 20%

Aktivkohle 0,5%

Aktivkohle 2-mal abfiltrieren

Schiff-Reagenz, entfarbt: Natriummetabisulfit 100 mg

Schiff-Reagenz 6 ml

Perjodessigsaure: Perjodsaure 10 mg

Essigsaure, 7% 10 ml

Burstensaummembranvesikel Mannit 300 mM

(BSMV) Praparationspuffer 1: TRIS 12 mM

EGTA 5 mM

mit HCl auf pH 7,4/4◦C einstellen

BSMV Mannit 60 mM

Praparationspuffer 2: TRIS 12 mM

EGTA 5 mM

mit HCl auf pH 7,4/4◦C einstellen

BSMV Mannit 100 mM

Praparationspuffer A: HEPES 10 mM

mit TRIS auf pH 7,4/4◦C einstellen

52 3. Material

BSMV Mannit 100 mM

Praparationspuffer B: HEPES 10 mM

MgSO4 × 7 H2O 0,1 mM


BSMV Mannit 100 mM

Vesikelpuffer: KCl 100 mM

HEPES 10 mM


Alkalische Phosphatase-Puffer: Diethanolamin 1,02 M

MgCl2 × 6 H2O 0,51 M


Na-Nitrophenylphosphat 10 mM

Assaymix (2fach konz.): MgCl2 × 6 H2O 10 mM

NaCl 200 mM

KCl 20 mM

TRIS 200 mM


Assaymix-Puffer (f. 40 Proben): Assaymix 10 ml

H2O 8 ml

ATP 20 mM pH 7,4 (TRIS) 2 ml

EDTA 100 mM PH 7,4 (NaOH) 0,6 ml

(Ouabain 0,5%)

Farbreagenz: Schwefelsaure 1,15 M 100 ml

Ammoniumheptamolybdat 1,1 g

FeSO4 × 7 H2O 4 g

Trichloressigsaure, 5% 50 ml

4. Methoden

4.1 Zellkulturen

4.1.1 Passagierung von ST-Zellen

ST-Zellen wurden in DMEM, welches mit 10% FKS und Antibiotikalosung versetzt war,

kultiviert. Die Passagierung erfolgte im Drei- bzw. Viertagesrhythmus in 75 cm2-Zell-

kulturflaschen (Costar). Der adharente Zellrasen wurde nach zweimaligem Waschen mit

PBS Dulbecco’s (ohne Calcium und Magnesium) mit 1 ml Trypsin/EDTA-Losung bei

RT inkubiert. Nach ca. 1 min wurde die uberschussige Trypsinlosung abgeschuttet und

die Zellen bis zur Ablosung vom Flaschenboden bei 37◦C im Brutschrank inkubiert (ca.

10 min). Die Zellsuspension wurde in 10 ml DMEM/10% FKS resuspendiert und 1 ml

bzw. 0,75 ml davon wurden mit 20 ml neuem Kultivierungsmedium weitergefuhrt (1:10

bzw. 1:15 verdunnt).

4.1.2 Passagierung von LLC-PK1-Zellen

Die Passagierung dieser adharent wachsenden Nierenzelllinie erfolgte analog zu den ST-

Zellen. Die LLC-PK1-Zellen wurden in einer 1:20 Verdunnung weitergefuhrt.

Beide Zelllinien wurden in einem 37◦C Brutschrank mit 5% CO2 Begasung kultiviert.

53

54 4. Methoden

4.2 Bakterien

4.2.1 Kultivierung

E. coli F5 (K99) wurde auf Minca-Agar kultiviert, um die Fimbrienausbildung zu erhalten

(Mouricout et al., 1990). In regelmaßigen Abstanden (3–4 Wochen) wurden Subkulturen

erstellt (ca. 18 h, 37◦C), die bei 4◦C gelagert wurden. Zur Herstellung einer Flussigkul-

tur wurden 3–5 ml Minca-Medium mit 1–2 Kolonien angeimpft und bei 37◦C fur 18 h

geschuttelt. Die Bakterien wurden bei 3000 × g, 15 min, 4◦C pelletiert und zweimal mit

PBS/1% Mannose gewaschen. Zur weiteren Verwendung, z.B. fur Hamagglutinationstests,

wurden die Bakterien in PBS/1% Mannose bei 4◦C aufbewahrt.

4.2.2 Fimbrientest

Auf einen Objekttrager wurde ein Tropfen Kalberkoliruhrserum F5 (K99) gegeben, und

mit einer Ose eine Bakterienkolonie nach und nach mit dem Tropfen verstrichen. Als Kon-

trolle diente ein Tropfen physiologische Kochsalzlosung, die ebenfalls mit einer Kolonie

vermischt wurde. Die Vermischung mit dem Kalberkoliruhrserum bewirkte eine Aggluti-

nation mit den Bakterienfimbrien und zeigte somit durch weiße Klumpchenbildung ein

positives Testergebnis an.

4.3 Virusanzucht

Zur Herstellung von Virusstocks wurden zu einem dichten Monolayer (75 cm2 Zellkultur-

flasche) gewachsene ST-Zellen zweimal mit PBS gewaschen und mit Stockvirus in einer

m.o.i. von 1 PFU/Zelle in 3 ml DMEM fur 1 h bei 37◦C inkubiert. Anschließend wurden

12 ml DMEM hinzugefugt, und die Zellen im CO2-begasten Brutschrank bei 37◦C inku-

biert. Die Virusernte erfolgte nach 20–24 h, sobald ein deutlicher cpE zu erkennen war.

Zur Virusernte wurde der virushaltige Zellkulturuberstand abgenommen, mit 1% FKS

versetzt, und die Zelltrummer durch eine Zentrifugation bei 1900 × g fur 10 min bei 4◦C

entfernt. Der Uberstand wurde in sterile Polyethylenrohrchen (1,8 ml, Greiner) a 1 ml

4.4. Plaquetest 55

aliquotiert, in flussigem Stickstoff schockgefroren und bei −80◦C gelagert. Der Virustiter

des Stocks wurde von einem Aliquot mittels Plaquetest bestimmt (ca. 108 PFU/ml). Die

Virusanzucht erfolgte fur alle TGEV-Isolate nach dem oben beschriebenen Vorgang.

4.4 Plaquetest

Der Plaquetest dient zur Quantifizierung der infektiosen Viruspartikel einer Suspension.

Durch das halbfeste Agarmediumgemisch wird die Ausbreitung der Viren durch Diffusion

verhindert, und die infektiosen Partikel konnen sich nur von Zelle zu Zelle ausbreiten.

Dadurch entsteht ein sogenannter”Plaque“ im Zellrasen, gebildet von virusinfizierten

Zellen. Diese Lasion wird durch Farbung sichtbar gemacht.

Zur Bestimmung des Virustiters mittels Plaque-Test wurde von der Virussuspension ei-

ne Verdunnung in 10er Schritten in PBS angelegt. Mit den verschiedenen Verdunnungen

wurden zu einem dichten Monolayer gewachsene ST-Zellen nach zweimaligem Waschen in-

fiziert. Lagen die Zellen in 60 mm Zellkulturschalen vor, wurden 500 µl Inokulum verwen-

det; bei 35 mm Schalen wurde ein Volumen von 300 µl eingesetzt. Nach einer Inkubation

von 1 h bei 37◦C wurde das Inokulum entfernt, die Zellen zweimal mit PBS gewaschen

und mit 0,8%iger Sea-Plaquer-Agarose (44◦C) in DMEM/2% FKS uberschichtet (5 bzw.

3 ml). Nach Erhartung des Agarosemediumgemisches bei Raumtemperatur (RT), wurde

der Ansatz bei 37◦C unter CO2 Begasung inkubiert. Nach zwei Tagen wurde zur Dar-

stellung der”Plaques“ der Agar mit 0,8%iger Sea-Plaquer-Agarose/0,0125% Neutralrot

uberschichtet (2 bzw. 1 ml). Nach Erkalten des Gemisches bei RT wurden die Schalen

uber Nacht bei 37◦C inkubiert, so dass das Neutralrot durch die Agarschicht diffundie-

ren und die intakten Zellen rot anfarben konnte. Die virusinfizierten Zellen bildeten die

ungefarbten”Plaques“ im Zellrasen, die fur die Titerbestimmung gezahlt wurden. Der

Virustiter wurde in Plaque-Forming-Units (Plaque-bildende Einheiten) pro ml (PFU/ml)

angegeben.

56 4. Methoden

4.5 Virusreinigung mittels Dichtegradientenzentrifu-

gation

ST-Zellmonolayer in 145 mm Zellkulturschalen (Greiner) wurden mit einer m.o.i. von 1

bzw. 0,1 PFU/Zelle infiziert. Nach ein bzw. zwei Tagen wurde der Virus-haltige Zellkul-

turuberstand geerntet und bei 1900 × g fur 10 min bei 4◦C zur Entfernung der Zell-

trummer zentrifugiert. Die Viruspartikel wurden aus dem Uberstand durch Ultrazentrifu-

gation bei 120000 × g uber 1 h bei 4◦C sedimentiert. Der Uberstand wurde verworfen, und

das Sediment in PBSM resuspendiert. Nach Bedarf wurden die resuspendierten Viruspar-

tikel bzw. ein Aliquot mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae, wie unter 4.8 beschrieben,

behandelt. Zur Reinigung wurde die Virussuspension uber einen kontinuierlichen Saccha-

rosegradienten (20–50% w/w) geschichtet. Dem Gradienten war ein 0,5 ml Kissen aus

60%iger Saccharose unterschichtet. Nach einer Zentrifugation von 3 h bei 150000 × g und

4◦C wurde die sichtbare Virusbande mit einer 1 ml Spritze (Kanule 1,2 × 40) abgenom-

men. Nach Verdunnung mit PBSM wurden die Viruspartikel bei 150000 × g (1 h, 4◦C)

pelletiert, in ein geringes Volumen PBSM aufgenommen, aliquotiert und bei −20◦C zur

Aufbewahrung eingefroren. Zur Analyse der gereinigten Viren wurden eine SDS-PAGE

mit Coomassie-Farbung des Gels, ein Hamagglutinationstest und die Proteinkonzentrati-

onsbestimmung durch Messung im Photometer bei 280 nm durchgefuhrt.

4.6 Isolierung des S-Proteins

Gereinigtes und neuraminidasebehandeltes TGEV wurde in 400 µl PBSM mit 1% OG

resuspendiert und fur 10 min bei RT inkubiert. M-Protein und RNP-Komplex wurden

durch eine 30-minutige Zentrifugation (16000 × g, 4◦C) pelletiert und der Uberstand auf

einen Saccharosegradienten (10–30% w/w, 0,5 ml Kissen aus 60% Saccharose) in PBS/1%

OG geschichtet. Nach Zentrifugation fur 18 h bei 214000 × g, 4◦C wurden durch Anste-

chen des Zentrifugenrohrchenbodens 0,5 ml Aliquots gesammelt und in der SDS-PAGE

mit anschließender Silberfarbung auf ihren Gehalt an S-Protein untersucht. Als weitere

Kontrolle wurde ein Hamagglutinationstest durchgefuhrt, da neuramindidasebehandeltes

S-Protein eine hohe Hamagglutinationsaktivitat aufweist.

4.7. Erythrozyten 57

Fur die weitere Verwendung, z.B. in Bindungstests, wurden die S-Protein-haltigen Fraktio-

nen vereinigt und gegen H2O:PBS (4:1) dialysiert. Die dialysierte Probe wurde in Aliquots

bei −20◦C aufbewahrt.

4.7 Erythrozyten

4.7.1 Isolierung aus Vollblut

Zur Isolierung der Erythrozyten wurde mit EDTA versetztes Vollblut der entsprechen-

den Tierart bei 2000 × g fur 10 min bei 4◦C zentrifugiert. Das Plasma und die Leu-

kozytenschicht wurden abgesaugt, und die sedimentierten Erythrozyten in 0,9% NaCl-

Losung resuspendiert. Nach erneutem Zentrifugieren und zweimaliger Wiederholung die-

ses Waschvorgangs wurden die Erythrozyten als 10%ige Suspension in physiologischer

Kochsalzlosung bei 4◦C aufbewahrt.

Huhnererythrozyten wurden i.d.R. als frische Suspension verwendet. Die Erythrozyten

der anderen Tierarten wurden nach der Isolierung einem Fixationsvorgang zur Haltbar-

machung unterzogen.

4.7.2 Fixierung von Erythrozyten

Einer 10%igen Erythrozytensuspension wurde zur Haltbarmachung 25%iges Glutaralde-

hyd tropfenweise unter Schwenken bis zu einer Endkonzentration von 1% hinzugefugt.

Diese Suspension wurde uber Nacht bei 4◦C kontinuierlich geruhrt. Am nachsten Tag

wurde zur Inaktivierung des uberschussigen Glutaraldehyds 0,1 M Glycin eingewogen,

und die Suspension erneut uber Nacht bei 4◦C geruhrt. Anschließend wurde sie viermal

wie unter 4.7.1 beschrieben gewaschen und als 10%ige Erythrozytensuspension in 0,9 %

NaCl-Losung bei 4◦C aufbewahrt.

Als Kontrolle fur die Vollstandigkeit der Fixierung wurde eine Inkubation mit H2O (Reinst-

wasser) durchgefuhrt, wobei die Erythrozyten nicht lysiert werden durften.

58 4. Methoden

4.7.3 Hamagglutinationstest

Viren und Bakterien, die eine Sialinsaurebindungseigenschaft besitzen, konnen aufgrund

dieser Fahigkeit auch an Erythrozyten binden. Durch die polyvalente Adsorptionsmoglich-

keit der Viruspartikel (Bakterienzellen)kommt es bei entsprechend hoher Partikelkonzen-

tration zum Quervernetzen der Erythrozyten, so dass diese sich nicht mehr am Boden

eines Napfes als Sediment absetzen konnen. Der Hamagglutinationstest dient somit zur

qualitativen Bestimmung der Sialinsaurebindungsaktivitat eines Virus/ eines Bakteriums

und kann daruberhinaus bei Viren mit sialinsaurebindenden Eigenschaften zur Quantifi-

zierung der relativen Virusmenge einer Suspension dienen.

Hamagglutinationstests wurden in Mikrotiterplatten mit U-formigen Vertiefungen (Grei-

ner) durchgefuhrt. Von der zu testenden Virussuspension (Bakteriensuspension) wurde

eine Verdunnungsreihe in Zweierpotenzen in PBSM angelegt (50 µl/Vertiefung). Zu jeder

Verdunnungstufe wurde das gleiche Volumen einer 0,5%igen Erythrozytensuspension ge-

geben. Nach Inkubation von ca. 1 h bei 4◦C (bei fixierten Erythrozyten ca. 3 h)war eine

Agglutination durch gleichmassige Verteilung der Erythrozyten zu sehen. Nicht aggluti-

nierte Erythrozyten sedimentierten als scharf umrissener Knopf am Boden der Vertiefung.

Der in Hamagglutinationseinheiten/ml (HAU/ml, haemagglutinating units/ml) angege-

bene Titer stellt den reziproken Wert der hochsten Verdunnungsstufe dar, die noch eine

Agglutination erkennen lasst.

4.7.4 Hamagglutinationsinhibition

Die Agglutination von Erythrozyten durch Viruspartikel (Bakterienzellen) kann durch

bestimmte Substanzen gehemmt werden.

Von den Inhibitorsubstanzen wurde eine Verdunnungsreihe in Zweierpotenzen in PBSM

hergestellt (25 µl/Vertiefung, Mikrotiterplatten wie in 4.7.3). Zu jeder Verdunnungsstufe

wurde das gleiche Volumen einer Virussuspension (Bakteriensuspension) mit 8 HAU/ml

gegeben. Anschließend wurden zu jeder Vertiefung 50 µl einer 0,5%igen Erythrozytensus-

pension hinzugefugt. Nach einer Inkubation von ca. 2 h bei 4◦C ließ sich die Hemmung

der Agglutination als am Boden der Vertiefung sedimentierte Erythrozyten in Form ei-

4.8. Desialylierung 59

nes Knopfes ablesen. Der reziproke Wert der hochsten Hemmstoffverdunnung, die eine

Hamagglutination verhindert, wird als Hemmtiter der entsprechenden Substanz bezeich-

net und in hamagglutinationshemmenden Einheiten/ml (HIU/ml, haemagglutination in-

hibiting units/ml) angegeben.

4.8 Desialylierung

4.8.1 Desialylierung von Viren

Sedimentiertes und in PBSM resuspendiertes Virus wurde mit Neuraminidase aus Vibrio

cholerae (VCNA, 1 U/ml) in einer Endkonzentration von 50 mU/ml versetzt, fur 30 min

bei 37◦C inkubiert und anschließend auf Eis gekuhlt. Die so behandelten konzentrierten

Viruspartikel wurden, wie in 4.5 beschrieben, uber einen Saccharosegradienten gereinigt.

4.8.2 Desialylierung von Zellen

Zu einem konfluenten Monolayer gewachsene ST- bzw. LLC-PK1-Zellen wurden dreimal

mit PBS gewaschen und mit VCNA (1 U/ml) fur 1 h bei 37◦C inkubiert. Es wurde eine

Enzymaktivitat von 250 mU/ml MES-Puffer verwendet. Die entsprechenden Kontrollzel-

len wurden in gleicher Weise jedoch mit MES-Puffer allein behandelt. Nach der Inkubation

wurden die Zellen zwei- bzw. dreimal mit PBS gewaschen und fur die jeweiligen Experi-

mente benutzt.

4.8.3 Desialylierung von Muzinen, Zellmembranen (MP) und

Burstensaummembranvesikeln (BSMV)

Muzine wurden bei einer Konzentration von 1 mg/ml (Muzinkonzentration), MP und

BSMV bei einer Proteinkonzentration von 4 mg/ml 1:2 mit VCNA (1 U/ml) versetzt.

Die Kontrollproben wurden statt mit VCNA mit Natriumacetat-Puffer, in dem auch die

Neuraminidase gelost vorliegt, behandelt. Nach einer Inkubation von 1 h bei 37◦C unter

Schutteln wurde SDS-Probenpuffer (2fach) zu den Proben gegeben. Diese wurden fur

60 4. Methoden

5 min bei 96◦C erhitzt und fur die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

verwendet.

4.8.4 Desialylierung von immobilisierten Muzinen

Auf Mikrotiterplatten (Maxisorpr, Nunc) immobilisierte Muzine wurden zwecks Desia-

lylierung mit VCNA (1 U/ml) in einer Konzentration von 50 mU/Napf fur 1 h bei 37◦C

inkubiert. Als Kontrolle diente die Inkubation mit Natriumacetat-Puffer. Anschließend

wurden die Platten fur einen indirekten ELISA zur Detektion der Virusbindung an Mu-

zine verwendet (4.19.1).

4.8.5 Desialylierung von Zelllysaten

Zellen wurden, wie unter 4.10.1 beschrieben, lysiert und mit Streptavidin- oder WGA-

Agarose prazipitiert. Zu den Agarosepellets (100 µl) wurden nach dreimaligem Waschen

50 µl VCNA (1 U/ml) in Natriumacetatpuffer mit Proteaseinhibitoren (1 µM Pepsta-

tin, 1 µM Leupeptin, 1 mM PefablockrSC) hinzugegeben und die Pellets fur 1 h bei

37◦C geschuttelt. Die Kontrolllysate wurden ohne VCNA, nur in Natriumacetatpuffer

mit Proteaseinhibitoren inkubiert. Anschließend wurden die Proteine durch die zusatzli-

che Zugabe von je 50 µl Probenpuffer (2fach) fur 10 min bei 96◦C eluiert.

4.8.6 Desialylierung von Erythrozyten

Pro Ansatz wurden 0,5 ml einer 10%igen Rindererythrozytensuspension (fixiert, siehe

4.7.2) verwendet. Die bei 1400 × g, 3 min, RT sedimentierten Erythrozyten (ca. 50 µl)

wurden im 10fachen Volumen MES-Puffer (450 µl), dem die gewunschte Aktivitat an

VCNA (1 U/ml) bereits zugesetzt worden war, resuspendiert und fur 30 min bei 37◦C

geschwenkt. Um die Neuraminidase wieder zu entfernen, wurden die Erythrozyten bei

1400 × g abzentrifugiert und zweimal mit PBSM/1% BSA gewaschen. Von den desialy-

lierten Erythrozyten wurde eine 1%ige Suspension in PBSM hergestellt, die fur Hamag-

glutinationstests (4.7.3) verwendet wurde.

4.9. Membranproteinisolierung 61

4.9 Membranproteinisolierung

Aus der Plasmamembran von ST- und LLC-PK1-Zellen sollten Membranproteine isoliert

werden, um sie im Virusbindungstest einzusetzen.

In 145 mm Zellkulturschalen zu einem dichten Monolayer gewachsene Zellen wurden zwei-

mal mit PBSM gewaschen und in je 10 ml PBSM mit einem Zellschaber abgelost. Die

Zellen wurden bei 1400 × g pelletiert und das Pellet in 1 ml PBSM resuspendiert. Das

20fache Volumen an TRIS-Puffer wurde vorgelegt und die Zellsuspension tropfenweise un-

ter Schwenken hinzugefugt. Nach einer Inkubation von 20 min wurde die Zellsuspension

zwanzigmal im Dounce-Homogenisator geschert. Die Kerne wurden bei 500 × g, 5 min

pelletiert und der Uberstand vorsichtig abpipettiert. Das Kernsediment wurde in TRIS-

Puffer resuspendiert und ein weiteres Mal bei 500 × g zentrifugiert. Der Uberstand wurde

mit dem ersten Uberstand vereinigt und bei 100000 × g, 1 h sedimentiert. Das Pellet,

welches die Membranfraktion darstellt, wurde in 200 µl Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0)

aufgenommen und bei −20◦C aufbewahrt. Alle Schritte wahrend der Praparation wurden

auf Eis bzw. bei 4◦C durchgefuhrt. Von einem Aliquot wurde die Proteinkonzentration

mit dem BCA-Protein-Assay bestimmt.

4.10 Fallung von Oberflachenproteinen und Glyko-

proteinen

4.10.1 Biotinylierung und Streptavidinfallung von Oberflachen-

proteinen

Konfluente, auf 94 mm Zellkulturschalen gewachsene Zellrasen wurden dreimal mit kaltem

PBS gewaschen. Die Markierung der Oberflachenproteine erfolgte durch Inkubation der

Zellen mit 3 ml Sulfo-NHS-Biotin (0,5 mg/ml PBS) fur 30 min bei 4◦C. Zur Inaktivierung

uberschussigen Biotins wurden die Zellen anschließend mit 10 ml PBS/0,1 M Glycin

gewaschen und fur 15 min bei 4◦C mit diesem Puffer inkubiert.

Zur Fallung der biotinmarkierten Oberflachenproteine wurden die Zellen erneut mit kal-

62 4. Methoden

tem PBS gewaschen und in 10 ml PBS mit einem Zellschaber abgeschabt. Nach Zen-

trifugation (693 × g, 5 min, 4◦C) wurde das Zellpellet in 1 ml NP40-Lysispuffer mit

dem Proteaseinhibitorcocktail Complete resuspendiert und fur 15 min auf Eis inkubiert.

Unlosliche Zellbestandteile wurden durch eine Zentrifugation bei 16000 × g (30 min, 4◦C)

entfernt. Das Zelllysat wurde mit 100 µl 50%iger Streptavidin-Agarose (dreimal mit NP40-

Lysispuffer vorgewaschen) uber Nacht bei 4◦C unter Schutteln inkubiert. Am nachsten

Tag wurde die Streptavidin-Agarose pelletiert (16000 × g, 3 min, 4◦C) und dreimal mit

NP40-Lysispuffer gewaschen. Es folgte die Desialylierung eines Teils der Pellets wie unter

4.8.5 beschrieben. Die Proteine wurden durch Erhitzen der Pellets in SDS-Probenpuffer

(zweifach) bei 96◦C fur 10 min eluiert. Die Agarose wurde sedimentiert (16000 × g, 5 min,

RT) und der Uberstand mit den eluierten Oberflachenproteinen bis zur weiteren Verwen-

dung bei −20◦C aufbewahrt. Fur reduzierende Bedingungen wurde den Eluaten 100 mM

DTT zugesetzt und diese erneut bei 96◦C fur 5 min erhitzt.

4.10.2 Fallung von Glykoproteinen mit immobilisiertem Wei-

zenkeimagglutinin (WGA)

Dicht gewachsene Zellmonolayer wurden dreimal mit kaltem PBS gewaschen, wie unter

4.10.1 beschrieben, lysiert und mit 100 µl 50%iger WGA-Agarose gefallt. Die folgenden

Schritte erfolgten analog zu 4.10.1.

4.11 Muzine

4.11.1 Isolierung von Darmmuzinen

Darmstucke aus dem mittleren Jejunum 12–14 Tage alter Saug- bzw. 10–15 Wochen alter

Absetzferkel (frischtot entnommen, mit physiologischer Kochsalzlosung gespult und in

flussigem Stickstoff eingefroren; Lagerung bei −80◦C) wurden aufgetaut, gewogen (15–

20 g) und in kleine Stucke geschnitten. Diese Stucke wurden in ca. 50 ml Isolationspuffer

gegeben und 20 min bei 37◦C im Wasserbad inkubiert. Alle 5 min wurde unter kraftigem

Schutteln die extrazellulare Muzinschicht abgelost. Anschließend wurde die Suspension

4.11. Muzine 63

durch ein Sieb gegeben und der schleimhaltige Uberstand in einem Becherglas aufgefangen.

Dieser Schritt wurde mit dem im Sieb verbliebenen Darmgewebe mit 50 ml Isolationspuffer

noch einmal wiederholt. Nach Abspulen der aufgefangen Gewebestucke mit 50 ml PBSM

wurde der Uberstand zur Entfernung grober Stucke bei 2000× g, 15 min, 4◦C zentrifugiert.

4.11.2 Reinigung der extrazellularen Muzine

Zur Reinigung der Muzine wurden grobe Partikel durch Zentrifugation bei 14000 × g,

15 min, 4◦C entfernt. Die gewonnenen Proben wurden nun uber eine Membran mit ei-

ner Molekulausschlussgroße von 30 kD auf ein Volumen von ca. 4–8 ml eingeengt (bei

Gewebestucken von 15–20 g). Die so konzentrierten Proben wurden auf ein Sepharo-

se 4B-Chromatographie-Gel gegeben (Saule: 61 × 2,7 cm) und die Proteine ihrer Mo-

lekulgroße entsprechend aufgetrennt. Von den einzelnen Fraktionen (je 7,5 ml) wurde der

Kohlenhydrat- und Proteingehalt bestimmt und anhand dessen ermittelt, welche Fraktio-

nen als Muzinfraktionen definiert werden konnten. Diese wurden vereinigt, konzentriert,

gegen H2O dialysiert und lyophilisiert.

4.11.3 Kohlenhydratbestimmung mittels PAS-Farbung

Die Kohlenhydratbestimmung der Fraktionen erfolgte in Mikrotiterplatten (Greiner) mit

H2O als Leerwert. Es wurden pro Vertiefung 150 µl Probe bzw. H2O vorgelegt, und

jeweils 50 µl Perjodessigsaure hinzugefugt. Die Platte wurde in den Brutschrank (37◦C)

gestellt, bis das mit Natriummetabisulfit versetzte Schiff-Reagenz entfarbt war. Von dem

entfarbten Schiff-Reagenz wurden je 50 µl zu jeder Vertiefung gegeben und die Platte

30 min bei RT abgedeckt stehen gelassen. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlange

von 550 nm gemessen. Die Multiplikation mit vorher berechneten Umrechnungsfaktoren

ergab die Kohlenhydratkonzentration der einzelnen Fraktionen.

64 4. Methoden

4.12 Burstensaummembranvesikel (BSMV)

4.12.1 Herstellung von BSMV

4.12.1.1 Darm von Absetzferkeln

Die Darmproben wurden von Dr. Schroder, Institut fur Physiologie, zur Verfugung ge-

stellt. Alle Schritte der Praparation von BSMV erfolgten auf Eis bzw. bei 4◦C. Der ge-

frorene Darm (Absetzferkel, mittleres Jejunum) wurde gewogen, mit der gleichen Menge

an Praparationspuffer 1 (isoton) ubergossen und auf Eis aufgetaut. Durch 10-minutiges

Schutteln im”Sinusquirl“ wurden die Enterozyten von der Darmwand gelost. Die Suspen-

sion mit gequirltem Darm wurde durch ein Sieb geseiht und mit der 4fachen Menge an

H2O (bezogen auf das Volumen des Praparationspuffers 1) nachgespult. Die Zellverbande

wurden in einem Standmixer (zweimal fur 1,5 min, hochste Stufe) weiter aufgeschlossen.

Anschließend wurde die Enterozytensuspension 2 min stehen gelassen, um den entstan-

denen Schaum absaugen zu konnen. Zur Enzym- und Proteinbestimmung wurden Kon-

trollproben P1 (4 × 250 µl, −20◦C) entnommen. Um die apikalen von den basolateralen

Enterozytenmembranen zu trennen, wurden letztere mit 10 mM MgCl2 gefallt. Hierzu

wurde 1 M MgCl2 dem Homogenat bis zu einer Endkonzentration von 10 mM tropfenwei-

se unter Ruhren zugefugt und fur 15 min auf Eis inkubiert. Durch eine Zentrifugation bei

5019 × g fur 18 min wurden die basolateralen Membranen sedimentiert. Aus dem Uber-

stand wurden nachfolgend die apikalen Membranen pelletiert (14740 × g, 40 min). Nach

Aufschwemmen der Pellets in 35 ml Praparationspuffer 2 und 10maligem Homogenisieren

im Potter erfolgte eine zweite Fallung mit 10 mM MgCl2. Es folgten die zwei Zentrifu-

gationsschritte, und die Pellets wurden in insgesamt 35 ml Vesikelpuffer aufgeschwemmt.

Durch erneutes Scheren im Potter wurden die Vesikel weiter homogenisiert. Die apikalen

Membranvesikel sedimentierten bei einer Zentrifugation von 19950 × g fur 45 min, und

das Pellet wurde in 1–3 ml Vesikelpuffer resuspendiert. Zum weiteren Homogenisieren

wurden die Membranen mit der Insulinspritze (Kanule: 0,45 × 23) mehrmals aufgezogen

(10–20-mal). Abschließend wurden Kontrollproben P2 (3 × 100 µl) fur die Enzym- und

Proteinbestimmung entnommen. Die BSMV wurden in flussigem Stickstoff eingefroren

und bei −80◦C gelagert.

4.12. Burstensaummembranvesikel (BSMV) 65

4.12.1.2 Darm von Saugferkeln

Die Herstellung von BSMV aus dem Jejunum von Saugferkeln erfolgte prinzipiell wie unter

4.12.1.1 beschrieben. Die bereits von der Serosa abgeschabte Mukosa wurde gewogen, mit

150 ml Praparationspuffer A versetzt und zweimal fur 1 min im Standmixer homogenisiert.

Die weiteren Schritte sind bis zur Zentrifugation mit 4.12.1.1 identisch. Die erste Zentrifu-

gation erfolgte bei 3687 × g, die apikalen Membranen wurden bei 16000 × g pelletiert und

anschließend in Praparationspuffer B aufgeschwemmt. Nach der zweiten Fallung wurde

die Suspension fur 10 min bei 3293 × g zentrifugiert. Die apikalen Membranen wurden aus

dem Uberstand bei 26430 × g, 30 min sedimentiert. Der letzte Zentrifugationsschritt nach

der Resuspendierung im Vesikelpuffer und dem Pottern wurde bei 31300× g durchgefuhrt.

4.12.2 Enzymbestimmungen von BSMV

Die Alkalische Phosphatase ist ein spezifisches Enzym der Burstensaummembran (Leit-

enzym), wahrend die Na/K-ATPase ein Leitenzym der basolateralen Membran ist. Bei

der BSMV-Praparation wurde eine Kontrollprobe (P1) vor der Fallung und Differential-

zentrifugation entnommen und eine Kontrollprobe der Vesikel (P2). Um den Gehalt der

Vesikel an Burstensaummembranen bzw. deren Anreicherung zu bestimmen, wurden die

Konzentrationen der beiden Leitenzyme in den entnommenen Kontrollproben bestimmt

(bezogen auf die Proteinkonzentration). Die Anreicherung ergab sich aus dem Verhaltnis

Enzymaktivitat/Proteinmenge von P2 zu P1.

Enzymaktivitat [U/l]

Proteingehalt [g/l]= U/g Protein

Anreicherung =U/g Protein P2

U/g Protein P1

4.12.2.1 Bestimmung der Aktivitat der Alkalischen Phosphatase (AP)

Die Alkalische Phosphatase spaltet p-Nitrophenylphosphat hydrolytisch in p-Nitrophenol

und Phosphat. Die entstehende Menge an p-Nitrophenol ist proportional zur Phosphata-

seaktivitat und kann aufgrund ihrer gelben Farbe photometrisch bestimmt werden.

66 4. Methoden

Je 50 µl Probe wurden mit 3 ml AP-Puffer/Na-Nitrophenylphosphat gemischt und sofort

im Photometer bei 405 nm gemessen. Die Extinktion wurde nach 1, 2 und 3 min abgelesen.

Die Messung erfolgte gegen Luft als Leerwert. Die Berechnung erfolgte nach folgender

Formel:

AP-Aktivitat [U/l] = 3300×∆E/min× Verdunnung

4.12.2.2 Bestimmung der Aktivitat der Na/K-ATPase

Die Aktivitat der Na/K-ATPase wird photometrisch als Differenz der ATPase-Aktivitat

mit und ohne Ouabainzusatz gemessen. Ouabain hemmt spezifisch die Na/K-ATPase.

Durch die ATPase-Aktivitat wird anorganisches Phosphat frei, welches in saurer Losung

mit Molybdat Phosphomolybdansaure bildet, die zu Molybdanblau reduziert wird. Die

Extinktion dieses blauen Farbkomplexes kann bei 690 nm gemessen werden.

0,5 ml Assaymix-Puffer wurden mit und ohne Ouabainzusatz fur 5 min bei 37◦C im Was-

serbad inkubiert. Es wurden jeweils 20 µl Probe bzw. H2O als Leerwert hinzugegeben

und das Gemisch 30 min bei 37◦C inkubiert. Die Reaktion wurde mit je 1,5 ml Farbrea-

genz gestoppt. Nach einer weiteren Inkubationszeit von 30 min, RT wurde die Extinktion

bei 690 nm gegen den Leerwert gemessen. Die Berechnung der Na/K-ATPase-Aktivitat

erfolgte nach der Formel:

∆E = Mittelwert E ohne Ouabainzusatz−Mittelwert E mit Ouabainzusatz

Na/K-ATPase-Aktivitat [U/l] = ∆E× 862

4.13 Proteinbestimmung

4.13.1 Proteinbestimmung nach Bradford

Durch die Bindung von Coomassie-Brilliantblau an Proteine verschiebt sich das Absorp-

tionsmaximum des Farbstoffs (465 nm ohne Protein, 595 nm mit Protein). Die Zunahme

der Absorption bei 595 nm ist ein Maß fur die Proteinkonzentration der Losung.

4.13. Proteinbestimmung 67

Die Proteinbestimmung der gelfiltrierten Fraktionen der Muzinreinigung erfolgte in Mi-

krotiterplatten (Greiner). Als Leerwert diente H2O. Es wurden je 50 µl Probe bzw. H2O

pro Vertiefung vorgelegt und mit 200 µl Bradford-Gebrauchslosung (s. Material 3.12) ver-

setzt. Nach 10-minutiger Inkubation bei RT (abgedeckt) wurde die Extinktion bei 580 nm

gemessen. Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe von Umrechnungsfaktoren bestimmt.

Zur Proteinbestimmung der BSMV wurde ebenfalls der Bradford-Test verwendet, hier

jedoch in Form des kauflichen BIO-RAD Protein-Assays. Um alle Proteinbindungsstellen

der BSMV zuganglich zu machen, wurde oberflachenaktives Saponin zugegeben. 50 µl

Probe bzw. BIO-RAD Proteinstandard (Bovines Plasma-Gamma-Globulin) wurden mit

50 µl Saponin (1%) versetzt und fur 20 min bei RT inkubiert. Zu dem Gemisch wurden je

2,5 ml verdunntes BIO-RAD-Farbstoffkonzentrat hinzugefugt. Es folgte eine Inkubation

von 10 min bei RT. Zur anschließenden Messung im Photometer wurden die Proben in

Kuvetten umgefullt. Die Proteinkonzentration der Proben wurde mit Hilfe der Standards

berechnet.

4.13.2 BCA-Test

Zur Bestimmung des Proteingehalts von praparierten Zellmembranen wurde der BCA-

Assay von Pierce nach den Angaben der Herstellers verwendet.

Die Proteine bilden bei diesem Test in alkalischer Losung einen Komplex mit Cu2+-Ionen

(Biuret-Reaktion). Die Cu2+-Ionen werden zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonin-

insaure (BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.

Der Test wurde in Mikrotiterplatten (Greiner) durchgefuhrt. Je 10 µl der Proben, der

Standards (BSA) und des Leerwerts (H2O) wurden in die Vertiefungen gegeben und mit

200 µl des Substrats gemischt. Nach einer Inkubation von 30 min bei 37◦C wurde die

Extinktion bei 570 nm im Photometer gemessen. Die Proteinkonzentration wurde mit

Hilfe der Standards berechnet.

68 4. Methoden

4.13.3 Messung bei 280 nm

Die Proteinkonzentration der gereinigten Viren wurde durch Messung der Extinktion bei

einer Wellenlange von 280 nm (UV-Absorption) bestimmt. Zur Berechnung diente eine

Eichgerade, die mit Transferrin erstellt wurde.

4.14 Analyse von Sialinsauren

Losungen der Glykokonjugate in H2O (i.d.R. 1 mg/ml) wurden 1:2 mit 0,2 M HCl ver-

setzt. Durch eine Inkubation uber 50 min bei 80◦C wurden die Sialinsauren hydroly-

siert (Schauer, 1987). Die freigesetzten Sialinsauren wurden mit einer fluoreszieren-

den Verbindung derivatisiert, indem 50 µl des Hydrolysats mit dem gleichen Volumen

DMB-Reagenz fur 150 min bei 65◦C im Dunkeln inkubiert wurden (Hara et al., 1989).

Als Referenzsubstanzen dienten N-Acetyl- und N-Glykolylneuraminsaure der Firma Sig-

ma. Diese Sialinsauren wurden ebenfalls mit DMB-Reagenz (1 µl/50 µl) derivatisiert.

Die Auftrennung der Sialinsaurederivate erfolgte auf einer C-18”Reversed Phase“-Saule

(4 × 250 mm, Kornung 4 µm, Porengrosse 100 A, Merck) mit Acetonitril/Methanol/H2O

(9:7:84, v/v/v) als mobile Phase. Es wurden 20 µl des Derivats aufgetragen und bei einer

Flussrate von 1 ml/min isokratisch innerhalb von 15 min eluiert (L-6200A HPLC-Pumpe,

Merck). Die Detektion erfolgte uber einen Fluoreszenzdetektor (F-1050, Merck) bei ei-

ner Anregungswellenlange von 375 nm und einer Emissionswellenlange von 445 nm. Die

Daten wurden mit Hilfe eines elektronischen Datenverarbeitungssystems (D-6000 HPLC

Manager, Merck) gespeichert und ausgewertet.

4.15 SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Proteine wurden mit Hilfe der diskontinuierlichen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-

gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt (Laemmli, 1970). Die Trenngele besaßen

die Maße 50 × 80 × 0,75 mm und eine Acrylamidkonzentration von 8 oder 10%. Die Auf-

trennung der Proteine erfolgte bei konstant 150 V in Miniproteingel-Kammern der Firma

Keutz. Die Elektrophorese wurde, wenn nicht anders angegeben, unter nicht-reduzierenden

4.16. Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen 69

Bedingungen durchgefuhrt. Als Marker wurden vorgefarbte Proteine mit Molekularge-

wichten zwischen 14,3 und 220 kDa verwendet. Die aufgetrennten Proteine wurden ent-

weder im Gel gefarbt oder auf Nitrozellulose transferiert.

4.16 Detektion von Proteinen in Polyacrylamidgelen

4.16.1 Coomassie-Farbung

Der Farbstoff Coomassie-Brilliantblau bindet an Proteine, die im Gel auf diese Weise

sichtbar gemacht werden konnen. Die Gele wurden zu diesem Zweck 30 min in Coomassie-

Farbelosung geschwenkt und solange in Entfarbelosung inkubiert (ca. 1 h) bis der Hin-

tergrund entfarbt und die Proteinbanden gut sichtbar waren. Nach Wasserung der Gele

konnten diese uber Nacht zwischen zwei Zellophanfolien gespannt und getrocknet werden.

4.16.2 Silberfarbung zur Detektion von Glykoproteinen

Die Coomassie-Farbung von Gelen ist fur Proteinmengen unter 1 µg/Bande sowie fur

reich sialylierte Proteine ungeeignet. Daher wurde fur geringere Proteinmengen und vor

allem fur den Nachweis von Sialoglykoproteinen im Gel eine Silberfarbung durchgefuhrt

(Dzandu et al., 1984; Merril et al., 1979, 1981). Zu diesem Zweck wurde das Silver

Stain Kit der Firma BIO-RAD, das speziell zur selektiven Farbung von Glykoproteinen

im Handel ist, verwendet. Die Anwendung erfolgte entsprechend den Anweisungen des

Herstellers.

4.17 Western Blot

Die Elution der durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine mit anschließender Immobili-

sierung auf Nitrozellulose erfolgte im”Semi-Dry-Blot“ nach Kyhse-Anderson (1984)

mit modifizierten pH-Werten der Anodenpuffer (von pH 10,4 auf pH 9,0 bzw. auf pH 7,4).

Der Transfer erfolgte bei konstanter Stromstarke von 0,8 mA/cm2 uber einen Zeitraum

70 4. Methoden

von 75 min. Anschließend wurden noch freie Bindungsstellen auf der Membran durch

Inkubation mit”Blocking Reagenz“ (0,5% in PBSM) uber Nacht bei 4◦C abgesattigt.

4.18 Immunchemische Detektion von Proteinen

Auf Nitrozellulosemembranen immobilisierte Proteine wurden in einem indirekten immu-

nologischen Nachweis mit spezifischen monoklonalen Antikorpern detektiert. Alle Inku-

bationsschritte wurden bei 4◦C uber 1 h durchgefuhrt. Nach dem Blockierschritt (siehe

4.17) und nach jedem Inkubationsschritt wurde die Membran dreimal fur je 10 min mit

PBSM/0,1% Tween gewaschen. Es wurden 500 µl einer Verdunnung des entsprechenden

monoklonalen Antikorpers (in PBSM/0,05% Tween) pro Membran (6 cm × 8 cm) ein-

gesetzt. Dabei wurde die Antikorperlosung auf die Membran getraufelt und als dunner

Flussigkeitsfilm auf der Nitrozellulose verteilt, indem diese mit einem Stuck Parafilm

bedeckt wurde. Anschließend folgte eine Inkubation mit 10 ml Peroxidase-gekoppelten

Anti-Maus-Immunglobulinen (1:5000 bzw. 1:2000 in PBSM/0,05% Tween). Die gebun-

dene Peroxidase konnte mit BM Chemoluminescence Blotting Substrate (Roche) bzw.

Super Signalr (Pierce), beides auf Chemolumineszenz basierende Nachweissysteme, auf

Rontgenfilmen dargestellt werden.

4.19 Untersuchung der Virusbindung an Sialoglyko-

konjugate

4.19.1 ELISA

Die Bindung von TGEV bzw. TGEV-Mutanten an isolierte Darmmuzine (4.11) und an

Muzine aus der Glandula submandibularis des Schweines wurde untersucht, indem die

Viruspartikel mit den immobilisierten Testsubstanzen inkubiert und anschließend immu-

nologisch nachgewiesen wurden.

Die Muzine wurden auf Mikrotiterplatten (Maxisorpr, Nunc) uber Nacht bei 4◦C im-

mobilisiert (je 50 µl der entsprechenden Verdunnung in PBSM). Durch Ausschlagen der

4.19. Untersuchung der Virusbindung an Sialoglykokonjugate 71

Platten wurden die Losungen entfernt und noch freie Bindungsstellen mit”Blocking Rea-

genz“ abgesattigt (200 µl/Napf, 2 h, 4◦C). Nach der Absattigung und zwischen jedem

Inkubationsschritt wurden die Platten dreimal mit PBSM/0,05% Tween gewaschen. Die

Muzine jedes Napfes wurden mit je 50 µl einer Virussuspension (1 µg Protein/Napf) fur

1 h bei 4◦C inkubiert. Es wurden gereinigtes TGEV und die gereinigten TGEV-Mutanten

HAD3 und m10 verwendet. Der Nachweis gebundener Viren erfolgte indirekt mit einem

gegen das S-Protein gerichteten monoklonalen Antikorper (mAk 6A.C3, 1:50 in PBSM,

50 µl/Napf, 1 h, 4◦C) und HRP-gekoppelten Anti-Maus-Immunglobulinen vom Kaninchen

(DAKO, 1:1000 in PBSM, 50 µl/Napf, 1 h, 4◦C). Die Enzymreaktion wurde mit dem Zu-

satz von je 50 µl ABTS-Losung (Roche) gestartet und nach einigen Minuten (ca. 5 min)

mit dem gleichen Volumen einer 1%igen SDS-Losung gestoppt. Die Extinktion des Tests

wurde in einem ELISA-Messgerat bei einer Wellenlange von 405 nm bestimmt.

Zur Bestimmung des Grades der sialinsaurebedingten Bindung der Viruspartikel an die

Muzine wurden diese vor dem Virusinkubationsschritt mit Neuraminidase aus Vibrio cho-

lerae behandelt (siehe 4.8.4).

4.19.2 Virusbindung in Zellkultur

In Mikrotiterplatten (Greiner) gewachsene ST- bzw. LLC-PK1-Monolayer wurden, wie

unter 4.8.2 beschrieben, desialyliert bzw. mit MES-Puffer inkubiert. Nach dreimaligem

Waschen mit PBS wurden die Zellen mit gereinigtem TGEV oder TGEV-Mutanten fur

1 h bei 4◦C inkubiert (11 µg/Napf in PBS). Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS

wurden die Zellen durch eine Behandlung mit 3% Paraformaldehyd fur 20 min bei Raum-

temperatur fixiert. Uberschussiges Paraformaldehyd wurde durch Waschen und 5-minuti-

ge Inkubation mit 0,1 M Glycin in PBSM inaktiviert. Zum Nachweis der gebundenen

Virusmenge folgten eine Inkubation mit dem gegen das S-Protein gerichteten mAk 6A.C3

(1:50 in PBSM, 1 h, 4◦C) und dann eine Inkubation mit Peroxidase-gekoppelten Anti-

Maus-Immunglobulinen vom Kaninchen (DAKO, 1:1000 in PBSM, 1 h, 4◦C). Zwischen

allen Inkubationsschritten wurden die Platten dreimal mit PBSM gewaschen. Der Nach-

weis des gebundenen Enzyms und damit indirekt des gebundenen Virus erfolgte, wie in

4.19.1 beschrieben. Die Reaktion mit der ABTS-Losung wurde nach 5 min mit 1% SDS

gestoppt und die Extinktion bei 405 nm im Photometer gemessen.

72 4. Methoden

4.19.3 Virusbindung auf Nitrozellulose

Proteine von Membranpraparationen, Zelllysaten, Muzinen und BSMV wurden nach der

Auftrennung durch eine SDS-PAGE auf Nitrozellulose geblottet. Nach Absattigung un-

spezifischer Bindungsstellen durch die Inkubation mit”Blocking-Reagenz“ (uber Nacht,

4◦C) wurde die Membran mit gereinigtem TGEV, HAD3 oder m10 (ca. 8 µg Protein/Blot,

Parafilm) fur 1 h bei 4◦C inkubiert. Die Detektion der gebundenen Viruspartikel erfolg-

te immunologisch uber den oben erwahnten mAk 6A.C3 (1:300 in PBSM/0,05% Tween,

Parafilm, 1 h, 4◦C) und im Fall der Membranproteine und Zelllysate uber HRP-gekoppelte

Anti-Maus-Immunglobuline aus der Ziege bzw. aus dem Kaninchen (1:5000 bzw. 1:2000

in 10 ml PBSM/0,05% Tween, 1 h, 4◦C). Handelte es sich bei den Ausgangssubstanzen

um Muzine bzw. BSMV wurde die Membran nach der Inkubation mit dem monoklo-

nalen Antikorper gegen das virale S-Protein mit biotinylierten polyklonalen Anti-Maus-

Immunglobulinen vom Schaf (1:1000 in 10 ml PBSM/0,05% Tween/Membran, 1 h, 4◦C)

und mit Streptavidin-Peroxidase (1:5000 in 10 ml PBSM/0,05% Tween/Membran, 1 h,

4◦C) inkubiert. Zwischen allen Schritten wurde die Membran dreimal fur 10 min mit

PBSM/0,1% Tween gewaschen. Die Detektion gebundener Peroxidase erfolgte wie unter

4.18 beschrieben uber Chemolumineszenz.

4.19.4 Virusbindungstest mittels Immunfluoreszenz

Von frisch entnommenen und in Isopenthan/flussigem Stickstoff eingefrorenen Jejunum-

proben wurden Kryoschnitte (ca. 7 µm dick) angefertigt. Mit 3% Paraformaldehyd (20 min,

RT) wurde das Gewebe fixiert. Uberschussiges Paraformaldehyd wurde durch Inkubati-

on mit 0,1 M Glycin/PBSM inaktiviert. Zur Klarung, ob und wo TGEV bzw. TGEV-

Mutanten am Darmepithel binden, wurden die Schnitte mit den gereinigten Viren in

konzentrierter Form (ca. 6 µg/µl, ca. 15 µl/Schnitt unter Parafilm) fur 1 h bei 4◦C inku-

biert. Die Detektion der gebundenen Viren erfolgte durch nachfolgende Inkubation mit

dem mAk gegen das S-Protein (6A.C3, 1:50 in PBSM, 50 µl unter Parafilm) und FITC-

gekoppelten Anti-Maus-Immunglobulinen aus dem Schaf (Amersham, 1:200 in PBSM,

50 µl unter Parafilm). Zwischen allen Inkubationsschritten wurden die Gewebeschnitte

jeweils dreimal mit PBSM gewaschen. Vor dem Eindeckeln der Proben mit Mowiol wur-

4.20. Analyse von Glykoproteinen 73

den diese mit H2O gewaschen, um Salzreste zu entfernen.

Die Auswertung der Virusbindung erfolgte durch Betrachtung der Gewebeschnitte mit Hil-

fe eines Fluoreszenzmikroskops (Anregungslicht 450–490 nm, Emissionslicht 520–560 nm)

bei verschiedenen Vergroßerungen. Zum Vergleich wurden die Darmschnitte im Durchlicht

betrachtet.

4.20 Analyse von Glykoproteinen

4.20.1 Triton X-114-Phasenseparierung

Die Oberflachenproteine konfluenter ST- bzw. LLC-PK1-Zellen wurden mit Biotin mar-

kiert (siehe 4.10.1) und die Zellen in 1 ml TBSE (TBS/1 mM EDTA), 1% Triton X-114

lysiert. Nach einer Inkubation von 1 h auf Eis wurde unlosliches Zellmaterial durch Zen-

trifugation entfernt (14000 × g, 10 min, 4◦C). Der Uberstand wurde fur 10 min bei 37◦C

inkubiert. Bei dieser Temperatur wird die kritische Micellenkonzentration uberschritten,

so dass sich eine wassrige Phase und eine Detergenzphase bilden, die durch Zentrifuga-

tion (1000 × g, 5 min, RT) voneinander getrennt werden konnen (Lisanti et al., 1988).

Die Detergenzphase (ca. 100 µl) wurde mit 900 µl TBSE, 0,06% Triton X-114, die obere

wassrige Phase (ca. 900 µl) mit 100 µl 10% Triton X-114 extrahiert. Die Proben wur-

den fur 5 min auf Eis gestellt, zentrifugiert (s.o.) und erneut einer temperaturinduzierten

Phasentrennung unterworfen. Die beiden extrahierten Phasen wurden anschließend mit

TBS auf 1 ml verdunnt und mit WGA- oder Streptavidin-Agarose gefallt (siehe 4.10.2

bzw. 4.10.1). Die gefallten Proteine wurde durch eine SDS-PAGE aufgetrennt und zur Un-

tersuchung hinsichtlich Virusbindung auf Nitrozellulose geblottet. Alternativ wurde das

Polyacrylamidgel einer Silberfarbung unterzogen.

74 4. Methoden

4.20.2 Glykoproteindetektion

4.20.2.1 Kohlenhydraterkennung

BSMV-Proben (mit und ohne vorherige Desialylierung, siehe 4.8.3) wurden elektropho-

retisch aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran geblottet. Nach einem 10-minutigen

Waschschritt mit PBSM wurden die Kohlenhydratgruppen der Proteine mit 10 mM Na-

triummetaperjodat (in 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 5,5, 20 min, RT, im Dunkeln)

oxidiert. Durch eine anschließende Inkubation mit 0,125 mM Biotinhydrazid (in 100 mM

Natriumacetat-Puffer, 30 min, RT) wurden die Glykoproteine im Bereich ihrer oxidier-

ten Kohlenhydratreste markiert. An dieser Stelle folgte die Inkubation mit”Blocking-

Reagenz“ (4◦C, uber Nacht), um uberschussige Bindungsstellen der Membran abzusatti-

gen. Durch Schwenken in Streptavidin-Peroxidase (1:6000 in PBSM, 30 min) konnten

uber die Enzymreaktion mittels Chemolumineszenz die Kohlenhydrate im Rontgenfilm

sichtbar gemacht werden (4.17). Zwischen allen Inkubationsschritten wurde die Membran

dreimal fur 10 min in PBSM gewaschen. Es wurde das ECL glycoprotein detection module

(Amersham) verwendet.

4.20.2.2 Selektive Sialinsaureerkennung

Zur exklusiven Markierung der Sialinsaurereste wurde ebenfalls das Kit von Amersham

verwendet. Die 10-minutige Inkubation der Membran in PBSM erfolgte hier auf Eis. Der

Oxidationsschritt mit 1 mM Natriummetaperjodat (in 100 mM Natriumacetat-Puffer,

20 min) wurde ebenso wie der anschließende Waschschritt (dreimal PBSM fur 10 min)

auf Eis durchgefuhrt. Die oxidierten Sialinsaurereste wurden durch eine Inkubation mit

5 mM Biotinhydrazid (in 100 mM Natriumacetat-Puffer, 30 min, RT) markiert. Nach

dem Blocken wurde die Membran mit Streptavidin-Peroxidase (1:1000 in PBSM, 30 min)

inkubiert. Zwischen allen Inkubationen wurde mit PBSM gewaschen (dreimal 10 min).

Die Detektion erfolgte ebenfalls mittels Chemolumineszenz (4.17, 4.20.2.1).

4.20. Analyse von Glykoproteinen 75

4.20.3 Analyse von Glykoproteinen mit Lektinen

4.20.3.1 Lektintest auf dem Blot

Zur naheren Charakterisierung der Kohlenhydratgruppen wurden in der SDS-PAGE auf-

getrennte und auf Nitrozellulose transferierte BSMV mit Lektinen inkubiert. Hierzu wurde

das DIG Glycan Differentiation Kit der Firma Roche verwendet. Nach Absattigung der

Membranbindungsstellen in Blockierungslosung wurden die Membranen zweimal mit TBS

und einmal mit Puffer 1 gewaschen (je 10 min). Es folgte eine Inkubation mit Digoxigenin-

markierten Lektinen nach den Anweisungen des Herstellers in Puffer 1. Fur die Untersu-

chung wurden die Lektine MAA (Maackia amurensis Agglutinin), SNA (Sambucus nigra

Agglutinin) und PNA (Peanut Agglutinin) verwendet. Nach dreimaligem Waschen (TBS,

je 10 min) wurden die Membranen mit AP-gekoppelten Anti-Digoxigenin-Fab-Fragmenten

inkubiert (1:1000 in TBS, 1 h, RT). Die Detektion erfolgte nach einem weiteren Wasch-

schritt uber die Zugabe einer Losung aus Nitroblautetrazoliumchlorid/X-phosphat. Die

Reaktion wurde nach einigen Minuten mit H2O gestoppt. Das Vorhandensein der jewei-

ligen Zucker war durch Graufarbung der Membranen an den entsprechenden Stellen zu

erkennen.

4.20.3.2 Fallung von BSMV mit Lektinen

Zellen wurden wie unter 4.10.2 beschrieben zur Glykoproteinanalyse mit WGA-Agarose

gefallt.

Die Fallung von BSMV mit Lektinen erfolgte auf ahnliche Weise. Hierzu wurden die

BSMV nach Inkubation mit VCNA bzw. Natriumacetat-Puffer (siehe 4.8.3) in NP40-

Lysispuffer unter Zusatz von 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 und 1 mM Mn2Cl aufgenom-

men. Nach einer Lyse von 15 min auf Eis wurden die Proben fur 30 min bei 16000 × g

und 4◦C zentrifugiert. Die so von Zelltrummern befreiten Uberstande wurden auf gewa-

schene WGA-, PNA- oder Jacalin-Agarose gegeben und uber Nacht bei 4◦C geschuttelt.

Die uber ihre jeweiligen Zucker gebundenen Glykoproteine wurden mit SDS-Probenpuffer

(zweifach) eluiert (10 min, 96◦C). Die Proben wurden fur Virusbindungstests auf Nitro-

zellulose verwendet.

5. Ergebnisse

5.1 Vergleich der Sialinsaurebindungsaktivitat von

TGEV und E. coli F5

Die Fimbrien von E. coli F5 besitzen wie TGEV eine Sialinsaurebindungseigenschaft.

Aufgrund dieser Eigenschaft konnen sie an intestinale Sialoglykokonjugate binden, und

E. coli kann auf diese Weise den Darm kolonisieren (Gaastra und de Graaf, 1982).

TGEV agglutiniert bevorzugt Erythrozyten, die Neu5Gc auf ihrer Oberflache prasentieren

(Schultze et al., 1996). Auch E. coli F5 bevorzugt Neu5Gc als Rezeptordeterminante auf

der Erythrozytenoberflache (Lindahl et al., 1987; Ono et al., 1989). Im Schweinedarm

scheint E. coli F5 ebenfalls bevorzugt an Neu5Gc als Sialinsaure bestimmter Glykolipide

zu binden (Teneberg et al., 1990, 1994).

Zur Bindung von E. coli F5 an Sialoglykokonjugate des Darmes sind bereits einige Un-

tersuchungen von verschiedenen Arbeitsgruppen durchgefuhrt worden (s. Einleitung 1.3).

Der Vergleich der Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV und E. coli F5 sollte klaren,

ob die beiden Krankheitserreger die gleichen Sialoglykokonjugate erkennen und somit die

gleichen Rezeptoren fur eine Darminfektion benutzen.

5.1.1 Interaktion mit Erythrozyten verschiedener Tierarten

Eine einfache Moglichkeit, die Sialinsaurebindungsaktivitat verschiedener Erreger zu ver-

gleichen, ist ein Hamagglutinationstest. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen

TGEV und E. coli F5 in der Bevorzugung bestimmter Sialinsauretypen zu erkennen, wur-

77

78 5. Ergebnisse

den Erythrozyten von verschiedenen Tierarten vergleichend eingesetzt.

ST-Zellen wurden mit TGEV, Stamm PURDUE 46 (PUR46), infiziert. Die im Zellkul-

turuberstand enthaltenen Virionen wurden durch Sedimentation konzentriert. Um eine

optimale Hamagglutinationsaktivitat zu erhalten, wurden die Viruspartikel mit Neurami-

nidase aus Vibrio cholerae desialyliert (TGEV-NA) und uber einen Saccharosegradienten

gereinigt. E. coli F5 wurde uber Nacht in Minca-Medium kultiviert, wodurch die Fimbri-

enausbildung gewahrleistet wurde. Anschließend wurden die Bakterien mit PBS/1% Man-

nose gewaschen und im gleichen Puffer resuspendiert. Um die Hamagglutinationsaktivitat

vergleichen zu konnen, wurden die beiden Erreger in einer Konzentration eingesetzt, die

bei Pferdeerythrozyten einen ubereinstimmenden Hamagglutinationstiter ergab.

Erythrozyten Hamagglutinationstiter

(Tierart) (HAU/ml)

TGEV-NA E. coli F5

Huhn 128 ≤2

Rind 64 32

Pferd 128 128

Schwein 256 64

Tabelle 5.1: Vergleich der Hamagglutinationsaktivitat von TGEV und E. coli F5. Es wurden

Erythrozyten verschiedener Tierarten eingesetzt.

Wie in Tabelle 5.1 zu sehen ist, konnte E. coli F5 Pferde-, Schweine- und Rindererythro-

zyten agglutinieren. Huhnererythrozyten wurden dagegen nur geringgradig, meist aber

nicht agglutiniert. Neu5Gc ist der Sialinsauretyp, der mehr als 90% der Sialinsauren auf

der Oberflache von Pferde-, Schweine- und Rindererythrozyten ausmacht (Reuter et al.,

1988). Auf Huhnererythrozyten kommt hingegen keine Neu5Gc, sondern uberwiegend

Neu5Ac vor. Das Hamagglutinationsverhalten von E. coli F5 stimmte somit mit fruhe-

ren Berichten uberein, dass dieser Erreger spezifisch Neu5Gc erkennt (Ono et al., 1989;

Teneberg et al., 1990). TGEV-NA konnte, im Gegensatz zu E. coli F5, Erythrozyten

aller verwendeten Spezies agglutinieren. Die Bindung an bestimmte Sialinsauretypen wie

Neu5Gc ist somit bei desialyliertem TGEV weniger spezifisch als bei E. coli F5.

5.1. Vergleich der Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV und E. coli F5 79

5.1.2 Neuraminidase-Sensitivitat der Erythrozytenrezeptoren

Die Rezeptoren fur TGEV und E. coli F5 auf der Erythrozytenoberflache wurden be-

zuglich ihrer Sensitivitat gegenuber enzymatischer Inaktivierung analysiert. Zu diesem

Zweck wurden Rindererythrozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen an Neuramini-

dase aus Vibrio cholerae (VCNA) behandelt. Die gewaschenen Erythrozyten wurden in

1%iger Losung in PBS fur Hamagglutinationstests mit TGEV und E. coli F5 verwen-

det. Die beiden Erreger wurden in einer Konzentration eingesetzt, die bei Inkubation mit

nicht neuraminidasebehandelten Rindererythrozyten einen Hamagglutinationstiter von

32 HAU/ml ergab.

Wie in Abbildung 5.1 zu sehen ist, wurden Rindererythrozyten nach einer VCNA-Be-

handlung mit einer Konzentration von ca. 20 mU/ml resistent gegen eine Agglutination

durch E. coli F5. Diese Enzymkonzentration bewirkte bei TGEV-NA keinerlei Ruckgang

des Hamagglutinationstiters. Erst eine Endkonzentration von fast 3 U/ml verhinderte eine

Agglutination der Rindererythrozyten durch TGEV-NA.

<2

5

10

15

20

25

30

35

0.1 1 10 100 1000 10000

Neuraminidase [mU/ml]

Häm

ag

glu

tin

ati

on

sti

ter

[lo

g2H

AU

/ml]

TGEV-NA

E. coli F5

Abbildung 5.1: Vergleich der Neuraminidase-Sensitivitat von Erythrozytenrezeptoren fur TGEV

und E. coli F5. Rindererythrozyten wurden mit steigenden Konzentrationen an Neuraminidase

aus Vibrio cholerae inkubiert. Anschließend wurde ein Hamagglutinationstest mit TGEV-NA und

E. coli F5 durchgefuhrt. Der Hamagglutinationstiter ohne Neuraminidasebehandlung der Erythro-

zyten betrug 32 HAU/ml.

80 5. Ergebnisse

Dieser große Unterschied in der Neuraminidase-Sensitivitat der Erythrozytenrezeptoren

beider Erreger deutet darauf hin, dass TGEV und E. coli F5 verschiedene Rezeptoren

zur Bindung an Erythrozyten nutzen. Es konnte aber auch sein, dass E. coli F5 eine

wesentlich hohere Anzahl von Sialinsaureresten auf der Erythrozytenoberflache benotigt,

um uberhaupt eine Hamagglutinationsreaktion hervorrufen zu konnen.

5.1.3 Untersuchung der Hamagglutinationshemmung durch

Muzine und Glykolipide

Um nahere Informationen uber die Sialinsaurebindungsaktivitaten von TGEV und E. co-

li F5 zu erhalten, wurde ihre Sensitivitat gegenuber Hamagglutinationsinhibitoren ge-

testet. Die Agglutination von Erythrozyten kann durch bestimmte Substanzen gehemmt

werden. Die Starke der Hemmung gibt einen Hinweis, wie effizient der betreffende Bin-

dungspartner mit dem viralen bzw. bakteriellen Erreger interagieren kann.

Intestinale Muzine sind hoch sialylierte Glykokonjugate und somit potentielle Liganden

fur Mikroorganismen wie TGEV und E. coli F5, die uber die Magen-Darm-Passage in den

Organismus eindringen. Da die Infektionen mit beiden Erregern v.a. Ferkel, die junger

als 15 Tage sind, betreffen, wurden Muzine aus zwei unterschiedlichen Altersgruppen

gewonnen (ca. 14 Tage und ca. 10 bis 15 Wochen alte Tiere). So konnten durch den

Vergleich der Bindung an diese Muzine mogliche altersbedingte Unterschiede erkannt

werden.

E. coli F5 besitzt eine Affinitat fur Ganglioside, die auf den Enterozyten junger Schwei-

ne exprimiert werden (Teneberg et al., 1990). Aus diesem Grund wurden neben den

Muzinen zwei verschiedene Gangliosidtypen, Rinderhirnganglioside und Hamatosid aus

Pferdeerythrozyten, auf ihre Hemmaktivitat untersucht.

5.1.3.1 Praparation intestinaler Muzine

Muzine wurden aus dem Jejunum 12–14 Tage alter Saug- und 10–15 Wochen alter Ab-

setzferkel isoliert und anschließend gelfiltriert (s. Methodenteil 4.11). Nach Bestimmung

des Protein- und Kohlenhydratgehalts konnten aus den gesammelten Fraktionen diejeni-


gen bestimmt werden, die einen hohen Kohlenhydratanteil besaßen und somit die Muzine

beinhalteten. Die Muzinfraktionen wurden vereinigt und lyophilisiert.

5.1.3.2 Analyse des Sialinsauregehalts der Inhibitoren

Zur qualitativen und quantitativen Bestimmung des Sialinsauregehalts der Inhibitoren

wurden je 0,5 mg der Muzine und je 0,1 mg der Glykolipide in 1 ml H2O gelost und, wie

unter 4.14 beschrieben, behandelt. Die Analyse erfolgte mittels HPLC. Um den Gehalt

an Neu5Gc und Neu5Ac quantifizieren zu konnen, wurden mit unterschiedlichen Kon-

zentrationen der Referenzsubstanzen (von 0,5 µg/ml bis 500 µg/ml) Eichgeraden erstellt.

Anhand der Steigung der Geraden konnte die Konstante zur Berechnung der Sialinsaure-

menge bestimmt werden. Der Gehalt Gx an N-Glykolyl- bzw. N-Acetylneuraminsaure

berechnete sich nach folgenden Formeln:

GNeu5Gc [µg/20µl] =F

56558884bzw. GNeu5Ac [µg/20µl] =

F

52348368,

wobei F die Flache unter dem zu der jeweiligen Sialinsaure gehorenden HPLC-Peak ist.

Den Gehalt in µg/mg erhalt man unter Berucksichtigung der Anfangskonzentrationen der

Proben und der durch die Hydrolyse und Derivatisierung bedingten Verdunnungsschritte

(s. 4.14).

Der Gehalt der intestinalen Muzine an Neu5Gc und Neu5Ac ist in Abbildung 5.2 dar-

gestellt. Alle vier Proben enthielten beide Typen von Sialinsauren, jedoch in einem un-

terschiedlichen Verhaltnis und in unterschiedlichen Mengen. Der Gehalt an Neu5Gc und

Neu5Ac der Muzine aus dem Saugferkel A stimmte annahernd mit dem Gehalt der Muzi-

ne aus Absetzferkel D uberein. Die intestinalen Muzine des Saugferkels B besaßen zu fast

gleichen Teilen Neu5Gc und Neu5Ac. Der Gesamtsialinsauregehalt betrug jedoch mehr

als das Vierfache der Muzine von Tier A und D. Die Muzine des Absetzferkels C hingegen

unterschieden sich von den anderen Muzinen v.a. durch einen 10fach hoheren Gehalt an

Neu5Ac im Vergleich zu Neu5Gc. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass es eine Variati-

on in der Verteilung und Menge an Neu5Gc und Neu5Ac in Darmmuzinen gibt und somit

keine klaren Unterschiede zwischen den Proben von Saug- und Absetzferkeln bestehen.

Da die Inhibitoren bei der Hamagglutinationshemmung auf einen ubereinstimmenden Sia-

linsauregehalt eingestellt werden sollten, wurde auch von den Rinderhirngangliosiden und

82 5. Ergebnisse

0

1

2

3

4

5

6

7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Saugferkel (14 Tage)

Neu5Gc-Gehalt: 12,5 µg/mg Muzin

Neu5Ac-Gehalt: 7,5 µg/mg Muzin

Gesamt-Gehalt: 20,0 µg/mg Muzin

(Neu5Gc+Neu5Ac)

Neu5GcNeu5Ac

A

0

1

2

3

4

5

6

7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Saugferkel (12 Tage)




(Neu5Gc+Neu5Ac)

Neu5GcNeu5Ac B

0

1

2

3

4

5

6

7 9 11 13 15

Zeit [min]

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Absetzferkel (10 Wochen)




(Neu5Gc+Neu5Ac)Neu5Gc

Neu5AcC

0

1

2

3

4

5

6

7 9 11 13 15

Zeit [min]

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Absetzferkel (15 Wochen)




(Neu5Gc+Neu5Ac)

Neu5GcNeu5Ac

D

Abbildung 5.2: Mittels HPLC ermittelter Sialinsauregehalt intestinaler Muzine, die aus Saug-

bzw. Absetzferkeln isoliert worden waren. Der Gehalt an Neu5Gc und Neu5Ac wurde mit Hilfe

von Eichgeraden und den aus ihnen berechneten Formeln bestimmt.

dem Hamatosid eine Sialinsaureanalyse mittels HPLC durchgefuhrt. Rinderhirngangliosi-

de besaßen 8,8 µg Neu5Gc und 131,2 µg Neu5Ac pro mg Gangliosid. Das entspricht einem

Gesamtsialinsauregehalt (Neu5Gc + Neu5Ac) von 140 µg/mg. Das Hamatosid hatte einen

Neu5Gc-Gehalt von 296 µg/mg. Das Vorkommen von NeuAc konnte in der Untersuchung

nicht eindeutig festgestellt werden.

5.1.3.3 Hemmung der Hamagglutination

TGEV-NA und E. coli F5 wurden mit den intestinalen Muzinen, Rinderhirngangliosi-

den und Hamatosiden inkubiert. Durch anschließende Zugabe von Rindererythrozyten

konnte die Starke der Bindung der Glykokonjugate an die Sialinsaurebindungsstellen der

Erreger anhand des Hemmtiters der jeweiligen Substanz abgelesen werden. Die verwende-

ten Substanzen wurden auf einen Gesamtsialinsauregehalt (Neu5Gc, Neu5Ac) von 10 µg

Sialinsaure pro ml PBSM eingestellt und in dieser Konzentration fur den Test verwendet.

Alle vier Muzinproben hemmten die Hamagglutination durch TGEV-NA mit einem Ti-

ter von 64 HIU/ml (s. Tab. 5.2). Bei E. coli F5 waren die Hamagglutinationshemmti-


Hamagglutinationshemmtiter

(HIU/ml)

TGEV-NA E. coli F5

intestinale Muzine

Saugferkel A 64 16

Saugferkel B 64 8

Absetzferkel C 64 8

Absetzferkel D 64 32

Glykolipide

Rinderhirnganglioside <2 16

Hamatosid <2 8

Tabelle 5.2: Vergleich von porzinen intestinalen Muzinen und Glykolipiden bezuglich ihrer Fahig-

keit, die Agglutination von Rindererythrozyten durch TGEV und E. coli F5 zu hemmen.

ter 2 bis 8fach niedriger. Anders verhielten sich die Ganglioside in ihrer Hemmung. Die

Hamagglutination durch E. coli F5 wurde bis zu einem Titer von 16 HIU/ml gehemmt.

Bei TGEV-NA war es den Glykolipiden dagegen nicht moglich, die Hamagglutination zu

hemmen.

Dieses Ergebnis zeigt, dass TGEV-NA Muzinen gegenuber sensitiver ist als E. coli F5. Bei

Gangliosiden dagegen ist E. coli F5 sensitiver als das Virus. Vergleicht man die Aktivitat

der intestinalen Muzine mit der Aktivitat der Glykolipide bezuglich der Hemmung der

TGEV-NA-bedingten Hamagglutination, scheinen Muzine im Gegensatz zu Glykolipiden

potentere Inhibitoren und damit moglicherweise auch Bindungspartner bei Infektionen zu

sein. In der Hemmung der Hamagglutination ist bei TGEV-NA kein Unterschied zwischen

den Muzinen aus den zwei Altersgruppen zu erkennen. Da der mittels HPLC-Analyse

bestimmte Gesamtsialinsauregehalt aller eingesetzten Hemmsubstanzen ubereinstimmte,

hatte nur durch das unterschiedliche Verhaltnis an Neu5Gc zu Neu5Ac oder durch zusatz-

liche sich unterscheidende Oberflachenstrukturen ein Unterschied in der Hemmaktivitat

der Muzine auftreten konnen. Die im Hamagglutinationshemmtest gemessene Interaktion

mit Muzinen erklart nicht, warum die TGEV-Infektion bei Saugferkeln soviel schwerer

verlauft als bei alteren Tieren.

Die vergleichenden Untersuchungen von TGEV und E. coli F5 zeigen, dass sich diese bei-

84 5. Ergebnisse

den Krankheitserreger in der Spezifitat ihrer Sialinsaurebindungsaktivitat unterscheiden.

Somit ist es wahrscheinlich, dass die beiden Mikroorganismen auch im Tier verschiede-

ne Sialoglykokonjugate als Liganden nutzen, um eine intestinale Infektion zu etablieren.

Falls Sialoglykokonjugate auf der Oberflache der Enterozyten an der Replikation bzw.

Pathogenitat von TGEV beteiligt sein sollten, spricht dieses Ergebnis dafur, dass eher

Glykoproteine als Glykolipide Bindungspartner fur das Virus darstellen.

5.2 Bindung von TGEV an Zellkulturen

Porzine Aminopeptidase N (pAPN) ist als Rezeptor fur die Infektion von Zellkulturen

durch TGEV unerlasslich (Delmas et al., 1992). Die Sialinsaurebindungsaktivitat wird

hingegen fur das Wachstum in Zellkultur nicht benotigt. Mutanten und Varianten, die

keine Sialinsaurebindungsaktivitat besitzen, konnen zu gleichen Titern in Zellkultur re-

plizieren wie das Wildtypvirus (Krempl et al., 1997, 2000). Da die Sialinsaurebindungs-

aktivitat somit scheinbar keinen Einfluss auf die Infektiositat der Virionen in Zellkultur

hat, wurde genauer untersucht, ob auch die Bindung an die Zelloberflache nur durch

die Interaktion mit pAPN erfolgt oder ob die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV

ebenfalls zur Bindung an Zellkulturzellen beitragt.

Zu diesem Zweck wurden in Mikrotiterplatten ausgesate ST- und LLC-PK1-Zellen mit ge-

reinigtem Virus bei 4◦C inkubiert. Nachdem nicht gebundene Viruspartikel durch Waschen

mit PBS von der Zelloberflache entfernt worden waren, wurden die Zellen mit Paraformal-

dehyd fixiert. Gebundene Virionen wurden mit Hilfe eines gegen das S-Protein gerichteten

monoklonalen Antikorpers und eines enzymgebundenen Zweitantikorpers nachgewiesen.

Um die Sialinsaurebindungsstellen auf den S-Proteinen der Virionen von Faktoren zel-

lularen Ursprungs zu demaskieren, wurden die Viruspartikel vor ihrer Saccharosereinigung

desialyliert (TGEV-NA). Vergleichend wurden nicht desialylierte Virionen eingesetzt. Ne-

ben TGEV-PUR46 wurde die Bindung von zwei Mutanten getestet. Eingesetzt wurden die

Mutante HAD3, die mit Hinblick auf ihre Hamagglutinationsdefizienz von Krempl et al.

(2000) selektiert worden war, und die Epitop D-Mutante m10, die als Escape-Mutante

mit dem monoklonalen Antikorper 40.1 (Epitop D) aus PUR 115-PAR isoliert worden

war (Delmas et al., 1986). Beide Mutanten binden nicht an Sialinsauren, was sich in

5.2. Bindung von TGEV an Zellkulturen 85

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

TGEV

- NA

TGEV HAD3

- NA

HAD3 m10

- NA

m10

DE

40

5

ST

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

TGEV

- NA

TGEV HAD3

- NA

HAD3 m10

- NA

m10

DE

40

5

LLC-PK1

Abbildung 5.3: Interaktion von TGEV sowie der Mutanten HAD3 und m10 mit ST- und LLC-

PK1-Zellen. Die Viren wurden in desialylierter (-NA) und in unbehandelter Form eingesetzt. Die

weißen Saulen stehen fur die nicht desialylierten Zellen. Die grauen Saulen reprasentieren die

mit 25 mU Neuraminidase fur 1 h bei 37◦C behandelten Zellen. Die Starke der Bindung wurde

immunologisch mit Hilfe eines enzymgebundenen Zweitantikorpers gemessen und ist in Extinkti-

onseinheiten angegeben.

der fehlenden Hamagglutinationsaktivitat dieser Viren ausdruckt (Krempl et al., 1997,

2000). Um zusatzlich zum Vergleich des Wildtypvirus mit sialinsaurebindungsdefizienten

Mutanten einen weiteren Beweis der sialinsaurebedingten Bindung an die Oberflache der

Zellkulturzellen zu bekommen, wurden die Zellen vor der Inkubation mit Virus fur 1 h

bei 37◦C mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae desialyliert. Kontrollzellen wurden an-

stelle des Enzyms mit MES-Puffer inkubiert. Unterschiede in der Virusbindung zwischen

diesen so vorbehandelten Zellen beruhen somit auf einer Bindung an Sialinsauren auf der

Zelloberflache.

Wie in Abbildung 5.3 zu sehen ist, gab es eine messbare Bindung von TGEV an ST- und

LLC-PK1-Zellen (weiße Saulen). Wurde der Test mit desialylierten Virionen durchgefuhrt

(TGEV-NA), stieg die Menge gebundener Viruspartikel um etwa das Sechsfache an.

Die Behandlung der Virionen mit Neuraminidase entfernt Sialoglykokonjugate von der Vi-

rusoberflache, die sich im Laufe der Infektion dort ansammeln. Diese Sialoglykokonjugate

stammen von der Zelloberflache der infizierten Zellen und bewirken, dass zu einem spaten

Zeitpunkt geerntetes TGEV keine Hamagglutinationsaktivitat mehr besitzt. Nur in sehr

hohen Viruskonzentrationen ist noch eine Hamagglutinationsaktivitat nachweisbar. Der

quantitative Unterschied in der Bindung von TGEV und TGEV-NA an die Zelloberflachen

ist dadurch bedingt, dass bei unbehandeltem Virus (TGEV) die Bindungsstellen fur Sia-

linsaure auf dem S-Protein durch Inhibitoren besetzt sind und somit nicht mit den Zellen

86 5. Ergebnisse

des Testansatzes interagieren konnen. Die niedrigen Bindungswerte des unbehandelten

TGEV stimmen mit den Bindungswerten der sialinsaurebindungsdefizienten Mutanten

uberein. Bei den Mutanten unterschieden sich die niedrigen Werte an gebundenen Virio-

nen (HAD3 und m10) kaum von denen, die mit desialylierten Virionen (HAD3-NA und

m10-NA) erzielt wurden. Die Bindung der Mutanten an die Zelloberflache war ebenso wie

die TGEV-Bindung mit Werten < 0,1 deutlich geringer als die mit TGEV-NA erzielte

Bindung (> 0,4). Eine weitere Bestatigung fur die Bedeutung der Sialinsaurebindungsak-

tivitat von TGEV fur die Bindung an Zellen lieferte die Reduktion der Bindung durch die

vorherige Desialylierung der Zellen. Die Menge an gebundenem TGEV-NA nahm nach

enzymatischer Entfernung der Sialinsauren von der Zelloberflache bei ST-Zellen um mehr

als das Vierfache und bei LLCPK-1-Zellen fast um das Sechsfache ab (graue Saulen). Bei

TGEV, welches nicht neuraminidasebehandelt war, kam es nur zu einer geringen Abnahme

der Bindung. Die Mutanten ließen keinerlei Abnahme ihrer Bindung an Zellen erkennen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass bei hamagglutinationsaktivem TGEV die Sialinsaurebin-

dungsaktivitat effizient zur Bindung an Zellen in Zellkultur beitragt.

5.3 Untersuchung von Zelloberflachenproteinen

5.3.1 Bindung an Membranproteine

Die Bindung von TGEV an Sialoglykokonjugate von ST- und LLC-PK1-Zellen wurde

naher untersucht. Da der Vergleich der Sialinsaurebindungsaktivitaten von TGEV und

E. coli F5 darauf hinwies, dass Glykoproteine im Gegensatz zu Glykolipiden die potenteren

Bindungspartner fur TGEV darstellen, wurden Membranproteine von ST- und LLC-PK1-

Zellen untersucht.

Membranproteine wurden, wie unter 4.9 beschrieben, aus den Zellen isoliert. Um spezifi-

sche Proteine als Bindungspartner identifizieren zu konnen, wurden die Membranproteine

(20 µg/Spur) in einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und anschlie-

ßend auf Nitrozellulose geblottet. Nachdem die freien Bindungsstellen auf der Nitrozel-

lulose uber Nacht mit”Blocking Reagenz“ abgesattigt worden waren, erfolgte eine Inku-

bation mit desialyliertem gereinigten Virus (TGEV-NA bzw. m10-NA) fur 1 h bei 4◦C.

5.3. Untersuchung von Zelloberflachenproteinen 87

VCNA+_ _

+

a a b b

TGEV-NA

__++

aa bb

m10-NA

__++

aa bb

antiAPN

220

97

[kDa]

pAPN

Abbildung 5.4: Bindung von desialyliertem TGEV (TGEV-NA) und der Mutante m10 (m10-NA)

an Membranproteine aus ST- (a) und LLC-PK1-Zellen (b). Die Membranproteine wurden vor der

elektrophoretischen Auftrennung mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae (VCNA, +) desialyliert

bzw. mit Natriumacetat-Puffer behandelt (−, s. auch unter Methoden 4.8.3). Auf der rechten

Seite ist der immunchemische Nachweis der zellularen pAPN dargestellt. Die beiden Striche ganz

links kennzeichnen die Position zweier Markerproteine mit den Angaben der Molekulargewichte

in kDa. Der untere Pfeil weist auf die pAPN-Bande hin, der obere Pfeil markiert eine zusatzliche

hochmolekulare Proteinbande, die von TGEV-NA erkannt wurde.

Gebundene Viruspartikel wurden, wie unter 4.19.3 beschrieben, immunchemisch nachge-

wiesen. Zur Unterscheidung des zellularen Rezeptors porzine Aminopeptidase N (pAPN)

von moglichen anderen Bindungspartnern wurde parallel ein Western Blot mit nachfolgen-

der immunchemischer Detektion von pAPN durchgefuhrt (s. auch 4.18). Als monoklonaler

Antikorper (mAk) wurde bei diesem Nachweis der gegen pAPN gerichtete aus der Maus

stammende mAk G43 verwendet.

Abbildung 5.4 zeigt die Proteinbanden, an die die Viren bzw. der gegen pAPN gerich-

tete mAk G43 gebunden haben. Der gegen den zellularen Rezeptor pAPN gerichtete

mAk G43 erkannte eine Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 150 kDa. An diese

Bande konnten sowohl desialylierte TGEV- als auch desialylierte m10-Virionen binden.

Von TGEV-NA wurde jedoch im Gegensatz zu m10-NA noch eine weitere Proteinban-

de erkannt. Sowohl ST- (a) als auch LLC-PK1-Zellen (b) besaßen dieses hochmolekulare

Protein, das von TGEV-NA bei beiden Zellarten annahernd gleich stark gebunden wurde.

Anders als das hochmolekulare Protein wurde der zellulare Rezeptor pAPN sowohl von

TGEV-NA als auch von m10-NA erkannt. Die Bindung der Viren an pAPN fuhrte bei

ST-Zellen zu einem starkeren Signal als bei LLC-PK1-Zellen.

Wurden die Membranproteine vor der elektrophoretischen Auftrennung mit Neuramini-

88 5. Ergebnisse

dase aus Vibrio cholerae, wie unter 4.8.3 beschrieben, behandelt (+ VCNA), kam es zu

einer starken Verringerung bis zu volligem Verlust der Virusbindung an das hochmoleku-

lare Protein. Es handelt sich somit bei der Bindung von TGEV-NA an die hochmolekulare

Proteinbande um eine sialinsaureabhangige Bindung. Wie die Inkubation mit dem mAk

G43 zeigte, stellt das hochmolekulare Protein keine Form der pAPN, sondern einen zweiten

Bindungspartner von TGEV dar. Auch die Tatsache, dass dieses zusatzliche Protein nicht

von m10-NA erkannt wird, belegt die Bedeutung der Sialinsaurebindungsaktivitat von

TGEV fur die Erkennung eines zweiten Proteins neben dem zellularen Rezeptor pAPN.

Die Bindung an pAPN wurde durch die Neuraminidasebehandlung der Membranproteine

nicht beseitigt. Die Effizienz der Neuraminidasebehandlung außerte sich in einem etwas

veranderten elektrophoretischen Laufverhalten der pAPN-Bande.

Der Sialinsauregehalt der Membranproteine wurde in einer HPLC-Analyse untersucht. Die

Proteine enthielten relativ viel Neu5Ac (13,5 µg/mg Protein), jedoch nur wenig Neu5Gc

(0,5 µg/mg Protein).

5.3.2 Bindung an Zelloberflachenproteine

Da die unter 4.9 beschriebene Praparation von Membranproteinen aus Zellkulturen keine

absolut reinen Plasmamembranen liefert und somit auch intrazellulare Strukturen enthal-

ten sein konnen, sollte ein zweiter Versuchsansatz die Lokalisation des Bindungspartners

von TGEV auf der Zelloberflache bestatigen.

ST- und LLC-PK1-Zellen wurden mit dem nicht membrangangigen Sulfo-NHS-Biotin

markiert und anschließend lysiert (s. Methodenteil 4.10.1). Die biotinylierten Oberflachen-

proteine wurden mit Streptavidin-Agarose aus den Zelllysaten gefallt, elektrophoretisch

aufgetrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Die Bindungstests mit desialylierten Viren

erfolgten in der gleichen Art und Weise wie bei der Untersuchung der Bindung an Mem-

branproteine (5.3.1). Zusatzlich zu TGEV-NA und m10-NA wurde die hamagglutinati-

onsdefiziente Mutante HAD3 in desialylierter gereinigter Form (HAD3-NA) eingesetzt.

Abbildung 5.5 (obere Reihe) zeigt die Bindung der Viren an Oberflachenproteine von

ST- (a) und LLC-PK1-Zellen (b). Die Proteine wurden zusatzlich unter reduzierenden

Bedingungen (+DTT, untere Reihe) aufgetrennt, um daraus resultierende Unterschiede


__++ VCNA

a a b b

TGEV-NA

aa bb

HAD3-NA

__++

aa bb

m10-NA

220

97

[kDa]

pAPN

+_ _

+

__++ VCNA

a a b b

TGEV-NA

aa bb

HAD3-NA

__++

aa bb

m10-NA

220

97

[kDa]

+_ _

+

+DTT

Abbildung 5.5: Bindung von TGEV-NA, HAD3-NA und m10-NA an Oberflachenproteine von

ST- (a) und LLC-PK1-Zellen (b). Die Zelllysate wurden vor der elektrophoretischen Auftren-

nung der Proteine mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae (VCNA, +) desialyliert bzw. mit

Natriumacetat-Puffer behandelt (−, s. auch unter Methoden 4.8.5). In der unteren Reihe ist die

Bindung der Viren an Zelloberflachenproteine, die unter reduzierenden Bedingungen (+DTT) auf-

getrennt wurden, dargestellt.

in der Bindung erkennen zu konnen. TGEV-NA und die beiden Mutanten banden an

ein Protein, welches in der Position von pAPN lief. Die pAPN-Bande wurde auch in

diesem Versuchsansatz in ST-Zellen besser erkannt als in LLC-PK1-Zellen. Da auch der

immunchemische Nachweis des zellularen Rezeptors pAPN mit dem mAk G43 bei ST-

Zellen starker ausfiel als bei LLC-PK1-Zellen, tragen letztere vermutlich weniger pAPN

auf ihrer Oberflache. Auch in diesem Versuch erkannte TGEV-NA im Gegensatz zu den

Mutanten eine zusatzliche hochmolekulare Proteinbande. Die Bindung an diese Bande

verschwand nach VCNA-Behandlung der Zelllysate, was die Bedeutung der Sialinsauren

dieses Bindungspartners fur die Erkennung unterstreicht.

Die Viren banden unter reduzierenden Bedingungen nicht an pAPN (Abb. 5.5, untere

Reihe), was darauf hinweist, dass die Konformation der mit den Viren interagierenden

90 5. Ergebnisse

pAPN-Domane und nicht eine lineare Aminosaurekette fur die Interaktion wichtig ist.

Das hochmolekulare Protein konnte hingegen auch nach Auftrennung unter reduzieren-

den Bedingungen von TGEV-NA gebunden werden. Der zusatzliche Bindungspartner von

TGEV-NA ist somit ein Zelloberflachenprotein und wird uber Sialinsaurereste vom Virus

erkannt.

Um herauszufinden, ob isoliertes S-Protein aus gereinigtem TGEV-NA das gleiche Bin-

dungsverhalten wie die Virionen selbst aufweist, wurde das S-Protein mit Detergenzien,

wie unter 4.6 beschrieben, aus der Virusmembran gelost und uber einen Saccharosegra-

dienten gereinigt. In einem Bindungstest mit Zelloberflachenproteinen aus ST-Zellen ver-

hielt sich isoliertes S-Protein wie vollstandige Viruspartikel. Wie in Abbildung 5.6 zu

sehen ist, erkannte aus TGEV-NA isoliertes S-Protein eine hochmolekulare Bande und

eine Bande mit einem Molekulargewicht von ca. 150 kDa (linkes Bild). Die Identifizierung

dieser kleineren Bande als pAPN mittels mAk G43 ist nochmal in der Mitte der Abbil-

dung dargestellt. Auch die Interaktion des isolierten S-Proteins mit dem hochmolekularen

Zelloberflachenprotein beruht auf Sialinsaureerkennung, wie das Verschwinden der Bande

nach vorheriger Desialylierung der aufgetragenen Zelllysate beweist.

_+ VCNA

TGEV-NAS-Protein antiAPN

_+

Kontrolle

220

97

[kDa]

pAPN

+_

Abbildung 5.6: Bindung des aus TGEV-NA isolierten S-Proteins an Oberflachenproteine von

ST-Zellen. Das mittlere Bild zeigt den Nachweis von pAPN durch mAk G43. Auf der rechten Seite

ist zur Kontrolle eine Inkubation der Membran mit den im Bindungstest verwendeten Antikorpern

dargestellt.

Die Desialylierung der Virionen war bei der Bindung stets von entscheidender Bedeutung.

Wie in Abbildung 5.7 zu sehen ist, erkannte das nicht neuraminidasebehandelte TGEV,

wenn es in der gleichen Proteinkonzentration wie die anderen Virionen (8 µg/Blot) einge-

setzt wurde, weder die hochmolekulare Proteinbande noch die pAPN-Bande (linkes Bild).

Erst bei einer 10fach hoheren Konzentration von 80 µg/Blot wurde eine schwache pAPN-


TGEV

_+ VCNA

HAD3

_+

m10

220

97

[kDa]

pAPN

+_

TGEV10x

_+

Abbildung 5.7: Bindung nicht desialylierter Viren an Oberflachenproteine von ST-Zellen. Der

Pfeil gibt die Position der pAPN-Bande an. Uber den Bildern ist angegeben mit welchen Virionen

der Bindungstest durchgefuhrt wurde.

Bande von TGEV erkannt. Dies spricht dafur, dass die Viruspartikel ohne Neuraminida-

sebehandlung nicht ausreichend mit den auf der Nitrozellulose immobilisierten Proteinen

interagieren konnen. Eine mogliche Ursache konnte sein, dass die Viren uber gebundene

Sialoglykokonjugate zur Bildung großer Virusaggregate neigen.

Die Mutanten HAD3 und m10 verhielten sich ohne vorherige Neuraminidasebehandlung

genauso wie in desialyliertem Zustand. Der zellulare Rezeptor pAPN wurde bei 150 kDa

von beiden Mutanten gut erkannt. Dies bestatigt, dass sie keinerlei Sialinsaurebindungsak-

tivitat besitzen und somit auch nicht uber Sialoglykokonjugate aneinander binden konnen,

was wie bei TGEV ihre Bindung an pAPN behindern wurde.

5.3.3 Darstellung der Zelloberflachenproteine

Zusatzlich zu den Bindungstests wurden die Zelloberflachenproteine noch mit anderen

Nachweisverfahren dargestellt (Abb. 5.8). Die Oberflachenproteine von ST-Zellen ließen

sich mit den drei Methoden in unterschiedlicher Anzahl und Starke nachweisen. Das hoch-

molekulare Oberflachenprotein, welches von TGEV-NA uber Sialinsaurebindung erkannt

wird, wurde bei der Inkubation der auf der Nitrozellulosemembran immobilisierten bioti-

nylierten Oberflachenproteine mit Streptavidin-Peroxidase nicht gefunden (Abb. 5.8, A,

oberer Pfeil). Moglicherweise ist die Biotinylierung dieses Proteins nicht sehr effektiv, so

dass ein Nachweis durch Streptavidin-Peroxidase bei dieser Proteinkonzentration nicht

moglich war. Das biotinylierte Protein konnte jedoch offensichtlich in fur den Virusbin-

92 5. Ergebnisse

VCNA_

+

B

_+

CA

220

97

[kDa]

pAPN

46

66

Abbildung 5.8: Darstellung der Oberflachenproteine von ST-Zellen mit verschiedenen Nachweis-

verfahren. A = Nachweis biotinylierter Oberflachenproteine mit Streptavidin-Peroxidase; B = Sil-

berfarbung der Oberflachenproteine; C = Coomassiefarbung aller Zellproteine. Zum Vergleich sind

links die Positionen der Bindungspartner von TGEV mit Pfeilen markiert.

dungsnachweis ausreichender Menge von Streptavidin-Agarose gefallt werden (s. 5.3.2).

Auch im Coomassie-Gel (Abb. 5.8, C) ließ sich die hochmolekulare Proteinbande nicht

darstellen. Bei der Coomassie-Farbung mussen die Proteine in einer Mindestkonzentration

von 1 µg/Bande vorliegen. Stark glykosylierte Proteine sind auch in hoheren Konzentratio-

nen nicht oder nur schwer nachweisbar. Das hochmolekulare Protein kam somit entweder

in zu geringer Menge in der aufgetragenen Probe vor oder ließ sich aufgrund eines hohen

Kohlenhydratanteils nicht anfarben.

Wurde eine fur Glykoproteine spezifische Silberfarbung der mit Streptavidin-Agarose

gefallten Zelloberflachenproteine durchgefuhrt (Abb. 5.8, B), konnte man eine hochmole-

kulare Proteinbande erkennen, die nach VCNA-Behandlung des Zelllysats etwas schwacher

wurde. Bei dieser hochmolekularen Bande handelt es sich wahrscheinlich um den zusatz-

lichen Bindungspartner von TGEV.

5.3.4 Sialinsaureabhangigkeit der Bindung von TGEV

Wie die vorherigen Untersuchungen schon gezeigt haben, war fur die Erkennung des hoch-

molekularen Proteins durch TGEV-NA das Vorhandensein von Sialinsaureresten auf dem

Bindungspartner essentiell. Wurden die Zelllysate vor der SDS-PAGE, wie unter 4.8.5

5.4. Charakterisierung des Sialoglykoproteins 93

+_ _

+ VCNA

1 1 2 2TGEV-NA

220

97

[kDa]

pAPN

Abbildung 5.9: Sialinsaureabhangigkeit der Bindung von TGEV-NA an ST-Zellen. Die von

TGEV-NA gebundene hochmolekulare Proteinbande (oberer Pfeil) wurde nach Neuraminidase-

behandlung des Zellrasens (1, + VCNA) bzw. der Zelllysate (2, + VCNA) nicht mehr erkannt.

beschrieben, desialyliert, konnte TGEV-NA nicht mehr an das hochmolekulare Protein

binden (s. Abb. 5.5).

Vergleichend wurde getestet, ob eine Desialylierung der intakten Zellmonolayer den glei-

chen Effekt auf die Virusbindung hat. ST-Zellen wurden mit Neuraminidase aus Vibrio

cholerae in einer Konzentration von 250 mU/ml MES-Puffer fur 1 h bei 37◦C inkubiert.

Dies entsprach einer Enzymaktivitat von 11 mU/cm2 Zellrasen. Die Kontrollzellen wur-

den mit MES-Puffer ohne Enzymzusatz behandelt. Es folgte nach einem Waschschritt mit

PBS die Biotin-Markierung der Zelloberflachenproteine. Alle weiteren Schritte wurden wie

ublich durchgefuhrt (s. Methodenteil 4.10.1).

Wie in Abbildung 5.9 zu sehen ist, verschwand die hochmolekulare Proteinbande, die von

TGEV-NA bei nicht enzymatisch behandelten ST-Zellen erkannt wurde, nach vorheriger

Desialylierung des Zellrasens (1). Somit verhielt sich das Virus in seiner Erkennung des

hochmolekularen Zelloberflachenproteins uber Sialinsaurereste bei desialyliertem Zellra-

sen ebenso wie bei desialylierten Zelllysaten (2).

5.4 Charakterisierung des Sialoglykoproteins

TGEV erkennt aufgrund seiner Sialinsaurebindungsaktivitat ein hochmolekulares Protein

auf der Oberflache von ST- und LLC-PK1-Zellen. Dieses Protein, bei dem es sich —

wie die vorhandenen Sialinsaurereste zeigen — um ein Sialoglykoprotein handelt, wurde

durch weitere Untersuchungen naher charakterisiert. Zum einen wurde die Assoziation

94 5. Ergebnisse

des Proteins zur Zellmembran untersucht. Zum anderen sollte festgestellt werden, ob es

sich bei diesem Protein um das einzige Sialoglykoprotein des Zelllysats handelt, das von

TGEV erkannt wird.


Die Assoziation des hochmolekularen Proteins mit der Plasmamembran wurde mit Hil-

fe einer Triton X-114-Phasenseparierung untersucht (s. Methoden 4.20.1). Proteine von

ST- und LLC-PK1-Zellen wurden mit Triton X-114 extrahiert. Nach einer Phasensepa-

rierung wurden die biotinylierten Oberflachenproteine mit Streptavidin-Agarose aus der

Detergenz- und aus der wassrigen Phase prazipitiert und mit der fur Glykoproteine spezi-

fischen Silberfarbung im SDS-Gel dargestellt (s. Abb. 5.10, A). Parallel wurde ein Ansatz

mit unmarkierten Zellproteinen durchgefuhrt. In diesem Ansatz wurden die Glykopro-

teine der beiden Phasen mit immobilisiertem Weizenkeimagglutinin (WGA) gefallt und

ebenfalls nach elektrophoretischer Auftrennung im SDS-Gel gefarbt (s. Abb. 5.10, B).

Das hochmolekulare Protein wurde bei beiden Ansatzen uberwiegend in der wassrigen

Phase (w) detektiert. Die Bande war bei der WGA-Fallung starker ausgepragt, da dort

auch die intrazellularen Glykoproteine nachgewiesen wurden. Neben der Silberfarbung

w

a a b bA

aa bbB

aa bbC

220

97

[kDa]

wwwwwd d dddd

Abbildung 5.10: Charakterisierung der Assoziation des Sialoglykoproteins mit der Plasmamem-

bran mittels Triton X-114-Phasenseparierung. Detergenz- (d) und wassrige Phase (w) von ST-

(a) und LLC-PK1-Zellen (b) wurden nach Streptavidinfallung (A) bzw. WGA-Fallung (B) im Sil-

bergel dargestellt. Ein Bindungstest mit WGA-gefallten Proteinen und aus TGEV-NA isoliertem

S-Protein ist auf der rechten Seite(C) dargestellt.

wurde das Protein nach WGA-Fallung in einem Bindungstest mit aus TGEV-NA iso-

liertem S-Protein nachgewiesen. Wie in Abbildung 5.10 (C) zu sehen ist, befand sich

5.4. Charakterisierung des Sialoglykoproteins 95

das Glykoprotein eindeutig in der wassrigen Phase. Dieses Verhalten zeigt, dass es sich

bei dem hochmolekularen Sialoglykoprotein eher um ein membranassoziiertes als um ein

Transmembranprotein handelt.

5.4.2 Prazipitation mit WGA

Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass unter den biotinylierten Oberflachenproteinen von

ST- und LLC-PK1-Zellen die hochmolekulare Bande das Hauptsialoglykoprotein, das von

TGEV erkannt wird, darstellt. Um herauszufinden, ob das auch fur die Gesamtheit der

zellularen Sialoglykoproteine gilt, wurden die Zellen lysiert und mit immobilisiertem Wei-

zenkeimagglutinin (WGA) gefallt. WGA ist ein Lektin, welches an N-Acetylglukosamin

und an Sialinsauregruppen bindet (Gallagher et al., 1985).

Wie in Abbildung 5.11 zu erkennen ist, band TGEV sowohl bei ST- (a) als auch bei

LLC-PK1-Zellen (b) bevorzugt an die hochmolekulare Proteinbande. Nach Behandlung

der Zelllysate mit Neuraminidase (+ VCNA) verschwand nur diese Bande, was bestatigt,

dass es sich um ein sialyliertes Makromolekul handelt und dass die Erkennung durch

TGEV uber Sialinsaurereste vermittelt wird.

+_ _

+ VCNA

a a b b

TGEV-NA

220

97

[kDa]

+DTT

Abbildung 5.11: Spezifische Bindung von TGEV an das hochmolekulare Sialoglykoprotein. Aus

Lysaten von ST- (a) und LLC-PK1-Zellen (b) wurden die Glykoproteine mit WGA gefallt und

unter reduzierenden Bedingungen (+DTT) in der SDS-PAGE aufgetrennt. Anschließend wurde

ein Bindungstest mit desialylierten TGE-Virionen (TGEV-NA) durchgefuhrt.

Der zellulare Rezeptor pAPN ist in dieser Abbildung nicht zu erkennen, da die Elektro-

phorese unter reduzierenden Bedingungen durchgefuhrt wurde. Unter nicht reduzierenden

Bedingungen band TGEV auch an pAPN, wie in Abbildung 5.10 (C) gezeigt ist. Bei pAPN

96 5. Ergebnisse

handelt es sich somit auch um ein Glykoprotein und, wie das veranderte Laufverhalten der

pAPN-Bande nach VCNA-Behandlung der Zelllysate in den vorherigen Versuchen gezeigt

hat, ist auch dieses Protein sialyliert. Die Bindung von TGEV an pAPN erfolgt jedoch

nicht uber Sialinsaurereste, sondern uber Interaktion mit einer Aminosauredomane, da

eine VCNA-Behandlung keine Abnahme der Bindung von TGEV an die pAPN-Bande

erkennen ließ.

5.5 Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen

Die Bindung an den zellularen Rezeptor pAPN ist die Voraussetzung fur eine TGEV-

Infektion. Zusatzlich existieren aber vermutlich Faktoren, die die Enteropathogenitat von

TGEV bedingen. Die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV scheint solch einen Patho-

genitatsfaktor darzustellen, da Varianten wie PRCoV und Mutanten wie die Epitop-D-

Mutanten, die keine oder nur eine stark reduzierte Enteropathogenitat aufweisen, ihre

Sialinsaurebindungsaktivitat verloren haben (Krempl et al., 1997).

Nachdem durch die Bindungstests mit TGEV und den Mutanten HAD3 und m10 in

Zellkultur bereits ein hochmolekulares Sialoglykoprotein als zweiter Bindungspartner fur

TGEV gefunden wurde, sollte auch die Interaktion von TGEV mit Komponenten des

Dunndarms wie extrazellularen Muzinen und Darmepithel getestet werden. Durch die

vergleichende Untersuchung von TGEV und E. coli F5 wurde bereits festgestellt, dass

Muzine Bindungspartner fur TGEV sein konnen (s. Abschnitt 5.1.3). In Abschnitt 5.1.3.2

ist die Charakterisierung des Sialinsauregehalts von aus vier Ferkeln unterschiedlichen

Alters isolierten intestinalen Muzinen (A–D) beschrieben. Die Interaktion von TGEV mit

diesen Muzinen wurde naher untersucht. Vergleichend wurden Muzine aus der Glandula

submandibularis des Schweines (PSM) mit in die Untersuchung einbezogen. Diese Muzine

zeigten bereits in fruheren Untersuchungen eine gute Bindung an desialyliertes TGEV

(Krempl et al., 2000). Der Sialinsauregehalt von PSM wurde ebenfalls mittels HPLC,

wie in Abschnitt 5.1.3.2 beschrieben, analysiert. Abbildung 5.12 zeigt, dass etwa 20-mal

mehr Neu5Gc als Neu5Ac in der Probe enthalten waren.

5.5. Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen 97

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

5 7 9 11 13 15

Zeit [min]

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

PSM

Neu5Ac

Neu5Gc

Abbildung 5.12: HPLC-Analyse der Sialinsauren der Muzine aus der Glandula submandibularis

des Schweines (PSM). Die Peaks fur N-Glykolylneuraminsaure (Neu5Gc) und N-Acetylneuramin-

saure (Neu5Ac) sind gekennzeichnet.

5.5.1 Bindung von TGEV an immobilisierte Darmmuzine

Die Bindung von TGEV an isolierte Darmmuzine (A–D) und an Muzine aus der Glandula

submandibularis des Schweines (PSM) wurde untersucht, indem die gereinigten Viruspar-

tikel mit den immobilisierten Testsubstanzen inkubiert und anschließend immunologisch

nachgewiesen wurden (s. unter Methoden 4.19.1). Ein ELISA ist im Vergleich zum Hamag-

glutinationstest eine wesentlich sensitivere Methode, um die Bindung an Substanzen zu

bestimmen. Die TGE-Virionen wurden, um eine optimale Sialinsaurebindungsaktivitat zu

erhalten, wie in den vorherigen Versuchen vor der Virusreinigung mit VCNA behandelt.

Nachdem die Proteinkonzentration der Viruspraparation bestimmt worden war, wurden

abnehmende Mengen von viralem Protein mit je 2,5 µg Muzin (50 µg/ml PBSM) inku-

biert. Gebundenes Virus wurde mit dem mAk 6A.C3 und Peroxidase-konjugierten Anti-

Maus-Immunglobulinen detektiert.

TGEV band mit hoher Affinitat an vier der funf getesteten Muzine (s. Abb. 5.13, linkes

Bild). Muzine von Tier C, die aus dem Jejunum eines Absetzferkels isoliert worden waren,

wurden von TGEV nicht erkannt. Bei den ubrigen Muzinen war selbst bei einer Menge

von 62 ng viralem Protein eine positive Reaktion im ELISA zu erkennen. Bis zur hochsten

98 5. Ergebnisse

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

1000 500 250 125 62 31 16

virales Protein [ng]

DE

40

5

Muzin A

Muzin B

Muzin C

Muzin D

PSM

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

1000 500 250 125 62 31 16 8

Muzinkonzentration [µg/ml]

DE

40

5

Abbildung 5.13: Interaktion von TGEV mit immobilisierten Muzinen. Auf der linken Seite ist

die Bindung abnehmender Mengen viralen Proteins an 2,5 µg Muzin pro Vertiefung dargestellt.

Das rechte Bild zeigt die Bindung von 1 µg viralen Proteins an abnehmende Muzinkonzentrationen.

Die gebundene Enzymmenge wurde anhand der Absorption des Substrats bei 405 nm gemessen.

eingesetzten Menge von 1 µg TGEV-Protein pro Vertiefung stieg die messbare Bindung

stetig an. Um in den folgenden Versuchen eindeutige Ergebnisse zu bekommen, wurden

somit bei allen ELISAs Viruskonzentrationen von 1 µg/Vertiefung eingesetzt.

Da Darmmuzine aus einem der Tiere nicht von TGEV gebunden wurden, wurde eine

großere Spanne an unterschiedlichen Muzinkonzentrationen auf Virusbindung getestet

(1000 µg/ml bis 8 µg/ml). Dadurch sollte ausgeschlossen werden, dass die nicht vorhan-

dene Bindung durch eine zu geringe Menge immobilisierten Muzins bedingt ist. Wie in

Abbildung 5.13 auf der rechten Seite zu sehen ist, wurden Muzine des Absetzferkels C in

keiner der eingesetzten Konzentrationen von TGEV erkannt. Die anderen Muzine hinge-

gen wurden sowohl bei einer Konzentration von 1000 µg/ml als auch bei einer Konzen-

tration von 8 µg/ml unverandert gut erkannt.

Ein Grund fur die fehlende Bindung von TGEV an Muzine des Tieres C konnte die Sia-

linsaurezusammensetzung der Muzine sein. Wie in Abbildung 5.2 (C) zu sehen ist, besitzen

diese Muzine zwar eine relativ große Gesamtmenge an Sialinsauren pro mg Muzin, diese

Sialinsauren kommen jedoch zu ca. 90% in Form der N-Acetylneuraminsaure (Neu5Ac)

vor. Da TGEV bevorzugt an Neu5Gc bindet (Schultze et al., 1995, 1996), konnte dieses

Bindungsverhalten die fehlende Interaktion mit diesen Muzinen erklaren. Die Muzine der

Saugferkel A und B wurden von TGEV gerringgradig besser erkannt als die des Absetzfer-

kels D und PSM. Welche Komponenten diese bessere Erkennung bedingten, war unklar,

da die Muzine der Ferkel A und D in ihrem Gehalt an Neu5Gc und Neu5Ac fast identisch

waren.


0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

DE

40

5

A B C D PSM

Abbildung 5.14: Sialinsaureabhangigkeit der Bindung von TGEV an intestinale Muzine. Die

weißen Saulen stellen die nicht enzymatisch behandelten Muzine dar. Die grauen Saulen reprasen-

tieren die mit 50 mU VCNA fur 1 h bei 37◦C behandelten Muzine. TGE-Virionen wurden wie

ublich in desialylierter gereinigter Form in einer Proteinmenge von 1 µg eingesetzt.

5.5.2 Bedeutung der Sialinsauren fur die Bindung

Es wurde untersucht, ob die nachgewiesene Interaktion von TGEV mit drei der vier

Darmmuzine und mit PSM tatsachlich durch die Sialinsaurebindungsaktivitat des Virus

verursacht wird. Daher wurden die Muzine vor der Virusinkubation mit 50 mU VCNA fur

1 h bei 37◦C desialyliert. Als Kontrolle diente die Inkubation mit Natriumacetatpuffer.

Wie in Abbildung 5.14 dargestellt ist, verschwand die Bindung von TGEV nach VCNA-

Behandlung der Muzine. Somit wurden die Muzine ausschließlich uber ihre Sialinsauren

von TGEV erkannt. Die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV ist also essentiell fur die

Interaktion mit Darmmuzinen.

5.5.3 Vergleich der Muzinbindung von TGEV mit Mutanten

Als weiterer Beleg fur die Bedeutung der Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV bezug-

lich der Interaktion mit Muzinen aus dem Jejunum von Schweinen diente eine vergleichen-

de Untersuchung mit den Mutanten HAD3 und m10. Es wurde eine Muzinkonzentration

von je 50 µg/ml d.h. 2,5 µg/Vertiefung eingesetzt. Die Menge an viralem Protein betrug

100 5. Ergebnisse

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6D

E4

05

A B C D PSM

TGEV-NA

HAD3-NA

m10-NA

TGEV

Abbildung 5.15: Bindung von TGEV, HAD3 und m10 an intestinale Muzine und PSM. Die Viren

wurden wie ublich in desialylierter Form (-NA) eingesetzt. TGEV wurde erganzend ohne vorherige

VCNA-Behandlung verwendet. Die Proteinkonzentration der Virionen betrug 1 µg/Vertiefung.

1 µg/Vertiefung. Die Viren wurden in desialylierter Form eingesetzt (-NA), zusatzlich

wurde nicht desialyliertes TGEV getestet.

HAD3 und m10 banden im Gegensatz zu desialyliertem TGEV (TGEV-NA) nicht an in-

testinale Muzine und PSM (Abb. 5.15). Auch TGEV, welches nicht von zellularen Sialo-

glykokonjugaten auf seiner Oberflache befreit worden war, konnte kaum mit den Muzinen

interagieren. Muzin C konnte von keinem der Viren gebunden werden.

Der Vergleich mit den Mutanten belegt somit ebenfalls, dass die Bindung von TGEV an

drei der vier isolierten Darmmuzine und an PSM sialinsaureabhangig ist. Aufgrund ihrer

fehlenden Sialinsaurebindungsaktivitat konnten die Mutanten die Muzine nicht binden.

Unbehandeltes TGEV war fur eine Bindung an Sialinsauregruppen der Muzine bereits

zu beladen mit zellularen Sialoglykokonjugaten. Bedeutend hohere Viruskonzentrationen

konnten moglicherweise auch hier eine Bindung an Muzine ermoglichen.


5.5.4 Interaktion von TGEV mit einem hochmolekularen

Protein

Die Bindung von TGEV an bestimmte Darmmuzine und PSM wurde naher untersucht.

Zu diesem Zweck wurden die Muzine in einer Konzentration von 1 mg/ml 1:2 mit VCNA

(1 U/ml) bzw. Natriumacetat-Puffer versetzt (s. auch unter Methoden 4.8.3). Nach einer

Inkubationszeit von 1 h bei 37◦C wurden die Proben 1:2 mit SDS-Probenpuffer verdunnt

und aufgekocht. Bei der folgenden SDS-PAGE wurden 5 µg Muzin pro Spur aufgetrennt.

Nach dem Blotten der Proteine auf Nitrozellulose wurde ein Bindungstest mit desialylier-

tem TGEV durchgefuhrt (s. Methoden 4.19.3).

Bei einer aufgetragenen Muzinmenge von 5 µg/Spur konnten nur bei den Muzinen des

Saugferkels B und PSM Proteinbanden im Virusbindungstest detektiert werden. Die

Interaktion von TGEV mit diesen Proteinbanden verschwand nach vorheriger VCNA-

Behandlung der Muzine (Abb. 5.16). Es wurden bei beiden Muzinarten zwei hochmole-

+_ _

+ VCNA

B PSM

TGEV-NA

220

97

[kDa]

Abbildung 5.16: Bindung von desialyliertem TGEV (TGEV-NA) an Muzine des Ferkels B und

PSM. Die Muzine wurden in einer SDS-PAGE mit und ohne vorherige Neuraminidasebehandlung

aufgetrennt (+/− VCNA). Die Pfeile in der linken Spalte kennzeichnen die Proteinbanden, die von

TGEV-NA gebunden wurden.

kulare Proteinbanden von TGEV erkannt. Diese sind in der Abbildung 5.16 bei Muzinen

des Saugferkels B besonders gut zu erkennen. Bei diesen beiden Proteinbanden konnte es

sich um das gleiche Protein in unterschiedlicher Glykosylierung handeln. In jedem Fall

handelte es sich in beiden Fallen um eine sialinsaureabhangige Bindung durch TGEV.

Das Protein, das TGEV in Muzinen uber seine Sialinsaurebindungsaktivitat erkennt, ist

somit ein Sialoglykoprotein.

102 5. Ergebnisse

5.6 Untersuchung von Burstensaummembranen

Wie die vorherigen Ergebnisse gezeigt haben, kann TGEV mit extrazellularen Darmmu-

zinen interagieren. Dies schließt die Anwesenheit eines zweiten Rezeptors neben pAPN

auf Zellen des Darmepithels aber nicht aus. Daher wurden Burstensaummembranen aus

Schweinedunndarm mit in die Untersuchungen einbezogen und auf ihre Interaktion mit

TGEV getestet.

5.6.1 Praparation von Burstensaummembranvesikeln

Burstensaummembranvesikel (BSMV) wurden aus dem Jejunum von vier Saug- und vier

Absetzferkeln prapariert (s. Methoden 4.12.1). Zur Kontrolle des Praparationserfolgs wur-

den die Aktivitaten der Alkalischen Phosphatase (AP), als Leitenzym fur die apikale Mem-

bran, und der Na/K-ATPase, als Leitenzym fur die basolaterale Membran, bestimmt und

auf die Proteinkonzentrationen der Praparationen bezogen (Berechnung s. 4.12.2). Die An-

reicherung beider Enzyme in den hergestellten BSMV zeigt Tabelle 5.3. Die Burstensaum-

membranen wurden in allen acht Praparationen angereichert, jedoch in unterschiedlichem

Maße. Wie in der Tabelle zu erkennen ist, gab es z.B. bei den BSMV von einem Saugferkel

AP (a) Na/K-ATPase (b) Verhaltnis a/b

Absetzferkel A1 4,2 1,4 3,0




Saugferkel S1 7,7 0,7 11,0




Tabelle 5.3: Anreicherungen der beiden Leitenzyme AP und N/K-ATPase durch die BSMV-

Praparation. Es sind die Werte der Membranen aus dem Darmepithel von vier Absetzferkeln (A1–

A4) und vier Saugferkeln (S1–S4) angegeben (Berechnung der Werte s. 4.12.2). Die rechte Spalte

zeigt das Verhaltnis der beiden Anreicherungen zueinander.

5.6. Untersuchung von Burstensaummembranen 103

nur etwas mehr als doppelt so viele apikale Membranen wie basolaterale Membranen (S3).

Bei einem anderen Saugferkel (S1) hingegen reicherten sich die Burstensaummembranen

gut an und waren 11-mal starker vertreten als die basolateralen Membranen (gemessen an

den Enzymaktivitaten). Fur die folgenden Versuche wurden trotz der unterschiedlichen

Anreicherungen alle acht Praparationen verwendet.

5.6.2 Analyse des Sialinsauregehalts der BSMV

Der Sialinsauregehalt der BSMV wurde wie auch in den vorherigen Versuchen mittels

HPLC bestimmt. Die BSMV wurden in einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml einge-

setzt. Der Gehalt an Neu5Gc und Neu5Ac ist in den Kurven in Abbildung 5.17 dargestellt.

Alle Proben besaßen einen hoheren Neu5Gc- als Neu5Ac-Gehalt. Die BSMV aus Saug-

ferkeln zeichneten sich durch einen insgesamt hoheren Sialinsauregehalt aus als die der

Absetzferkel (3–5-mal hoher). Der Gehalt an Neu5Gc war bei den Saugferkeln (S3, S4),

die einen Tag alt waren, hoher als bei den drei Tage alten Saugferkeln (S1, S2). Die Proben

der Absetzferkel A1 und A2 (12 Wochen) enthielten mehr Neu5Gc und Neu5Ac als die

der Absetzferkel A3 und A4 (6–8 Wochen).

5.6.3 Bindung an Proteine aus BSMV

Zur Untersuchung der Bindung von TGEV an Proteine aus den Burstensaummembranen

wurden die BSMV in einer Proteinkonzentration von 4 mg/ml 1:2 mit Neuraminidase

aus Vibrio cholerae (VCNA, 1 U/ml) versetzt und fur 1 h bei 37◦C desialyliert. Die

Kontrollproben wurden statt mit VCNA mit Natriumacetat-Puffer behandelt (Metho-

den 4.8.3). Anschließend wurden die Burstensaummembranen 1:2 mit SDS-Probenpuffer

versetzt und bei 96◦C fur 5 min denaturiert. Die Proteine wurden in einer SDS-PAGE

aufgetrennt (20 µg/Spur) und auf Nitrozellulose geblottet. Nach der Absattigung mit

”Blocking Reagenz“ wurde die Virusbindung, wie unter 4.19.3 beschrieben, untersucht.

Wie in Abbildung 5.18 (a) zu erkennen ist, wurde von TGEV-NA eine Bande auf der

Hohe von 150 kDa in allen Proben erkannt. Bei dieser Bande handelte es sich um pAPN,

was in Abbildung 5.18 (c) durch Interaktion mit dem mAk G43 gegen pAPN gezeigt ist.

104 5. Ergebnisse

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

A1

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

A2

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

A3

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

A4

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

S1

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

S2

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Zeit [min]

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

S3

0

1

2

3

4

5

6

5 7 9 11 13 15

Zeit [min]

Flu

ore

szen

z[1

05

a.E

.]

Neu5Gc

Neu5Ac

S4

Abbildung 5.17: Mittels HPLC ermittelter Sialinsauregehalt der BSMV-Praparationen aus dem

Jejunum von Absetzferkeln (A1–A4) und Saugferkeln (S1–S4). Die Peaks fur Neu5Gc und Neu5Ac

sind gekennzeichnet.

Zusatzlich erschien bei den Saugferkeln S3 und S4 eine Bande bei 220 kDa sowohl bei

der Interaktion mit TGEV-NA (a) als auch bei der Inkubation mit mAk G43 (c). Wie

Abbildung 5.18 (d) zeigt, waren diese Banden sowie einige unterhalb des Vergleichspro-

teins von 97 kDa bei den Absetzferkeln durch unspezifische Interaktionen mit den Zweit-

5.6. Untersuchung von Burstensaummembranen 105

VCNA+_ _

+

S1 S2

__++

S4S3

__++

220

97

[kDa]

pAPN

A1

__++

A4A3A2

(a)

VCNA+_ _

+

S1 S2

__++

S4S3

__++

220

97

A1

__++

A4A3A2

(b)

+DTT

VCNA+_ _

+

S1 S2

__++

S4S3

__++

220

97

pAPN

A1

__++

A4A3A2

(c)

VCNA+_ _

+

S1 S2

__++

S4S3

__++

220

97

A1

__++

A4A3A2

(d)

Abbildung 5.18: SDS-PAGE von Proteinen aus BSMV, die aus dem Jejunum von Saugferkeln

(S1–S4) und Absetzferkeln (A1–A4) hergestellt worden waren. Unter nicht reduzierenden (a) und

unter reduzierenden (b) Bedingungen aufgetrennte Proteine der Burstensaummembranen wurden

auf ihre Bindung an desialylierte TGE-Virionen (TGEV-NA) untersucht. Die Pfeile auf der linken

Seite kennzeichnen die pAPN-Bande und eine Proteinbande mit einem Molekulargewicht von uber

220 kDa, die von TGEV-NA erkannt wurden. Parallel ist der Nachweis der pAPN-Bande mit dem

mAk G43 (c) und die Inkubation der Nitrozellulose mit den verwendeten Zweitantikorpern (d)

dargestellt.

106 5. Ergebnisse

antikorpern (biotinylierte Anti-Maus-Immunglobuline, Streptavidin-Peroxidase) bedingt.

Spezifisch von TGEV-NA wurde jedoch eine Bande uber dem 220 kDa-Vergleichsprotein

bei allen vier Saugferkelproben und zwei der vier Absetzferkelproben (A1 und A2) erkannt.

Auch wenn die SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen (+DTT) durchgefuhrt wur-

de (Abb. 5.18 b), wurden die hochmolekularen Banden von TGEV-NA gebunden. Wie

bei (b) gut zu erkennen ist, verhielten sich die von TGEV-NA gebundenen Proteinbanden

etwas heterogen. Bei S1, S2 und A2 schienen Doppelbanden in etwas unterschiedlicher

Große vorzuliegen; S3 und S4 wiesen jeweils nur einen Vertreter aus dieser Doppelban-

de auf. Moglicherweise handelt es sich bei diesen Proteinbanden um das gleiche Protein,

welches aber in unterschiedlich glykosylierter Form vorliegt.

Erfolgte die Auftrennung der BSMV-Proteine in desialylierter Form, wurden die hoch-

molekularen Proteinbanden nicht mehr bzw. kaum von TGEV-NA erkannt (VCNA, +).

Die Interaktion mit den hochmolekularen Proteinbanden begrundete sich somit auf die

Bindung von TGEV-NA an Sialinsauregruppen des Proteins. Die Sialinsaurebindungs-

aktivitat von TGEV bewirkt also auch in BSMV eine Interaktion mit hochmolekularen

Sialoglykoproteinen.

Die Virusbindungstests wurden ebenfalls mit den Mutanten HAD3 und m10 in desialylier-

ter und nicht desialylierter Form sowie mit unbehandelten TGE-Virionen durchgefuhrt.

In Abbildung 5.19 sind beispielhaft die Interaktionen von HAD3, m10 und TGEV mit

den Proteinen der Burstensaummembranen von Saugferkel S1 und Absetzferkel A1 dar-

gestellt. HAD3 und m10 banden an die pAPN-Bande. HAD3 erkannte keine zusatzlichen

Proteine. Die bei m10 sichtbare dunne 220 kDa-Bande trat nur bei dieser Mutante auf.

Worum es sich bei dieser Bande handelt, ist nicht bekannt. Die Mutanten verhielten sich in

desialylierter Form identisch. Nicht desialyliertes TGEV konnte in der eingesetzten Prote-

inkonzentration wie auch schon bei der Untersuchung der Bindung an Oberflachenproteine

von Zellkulturzellen (5.3.2) keine Proteinbanden binden. Da das spezifische Bindungsmus-

ter in den Proben aller acht Ferkel ubereinstimmte, wurde die Darstellung exemplarisch

auf S1 und A1 beschrankt. Die Mutanten konnten aufgrund ihrer fehlenden Sialinsaure-

bindungsaktivitat nicht an das hochmolekulare von TGEV-NA erkannte Protein binden.

5.7. Charakterisierung des BSMV-Proteins 107

VCNA+_ _

+

S1 A1

__++

A1S1

__++

220

97

[kDa]

pAPN

S1 A1

HAD3 m10 TGEV

Abbildung 5.19: Bindung von HAD3, m10 und TGEV (nicht neuraminidasebehandelt) an

BSMV-Proteine von Saugferkel S1 und Absetzferkel A1. Die Lokalisation der pAPN-Bande ist

mit einem Pfeil gekennzeichnet.

5.7 Charakterisierung des BSMV-Proteins

TGEV (desialyliert) erkennt aufgrund seiner Sialinsaurebindungsaktivitat ein hochmo-

lekulares Protein in BSMV-Praparationen von Saug- und Absetzferkeln. Dieses Protein

wurde durch weitere Untersuchungen naher charakterisiert. Die Assoziation des Proteins

zur Zellmembran und sein Kohlenhydratanteil wurden untersucht.


Die Assoziation des hochmolekularen Proteins zur Burstensaummembran wurde mit Hilfe

einer Triton X-114-Phasenseparierung untersucht (s. Methoden 4.20.1). Die Proteine der

Burstensaummembranen wurden mit Triton X-114 extrahiert. Nach einer Phasenseparie-

rung wurden die Proteine mit WGA aus der Detergenzphase und der wassrigen Phase

gefallt und nach einer SDS-PAGE fur einen Virusbindungstest mit TGEV-NA auf Ni-

trozellulose geblottet. Das hochmolekulare Protein wurde ausschließlich in der wassrigen

Phase (w) von TGEV erkannt (Abb. 5.20). Es handelt sich somit vermutlich bei dem

hochmolekularen BSMV-Protein um ein membranassoziiertes Protein und nicht um ein

Transmembranprotein.

108 5. Ergebnisse

w

S1 S2 A2A1

220

[kDa]

wwwd ddd

Abbildung 5.20: Charakterisierung der Assoziation des BSMV-Proteins mit der Burstensaum-

membran mittels Triton X-114-Phasenseparierung. Detergenz- (d) und wassrige Phase (w) der

BSMV-Proteine von den Ferkeln S1 und S2 bzw. A1 und A2 wurden nach WGA-Fallung fur einen

Bindungstest mit TGEV-NA durch SDS-PAGE aufgetrennt.

5.7.2 Charakterisierung des Kohlenhydratanteils

5.7.2.1 Nachweis der Kohlenhydrate und Sialinsauren

BSMV-Proteine wurden nach elektrophoretischer Auftrennung auf eine PVDF-Membran

geblottet und einer Perjodatoxidation unterzogen (s. Methoden 4.20.2.1). Nach Markie-

rung der oxidierten Kohlenhydratreste mit Biotinhydrazid, konnten diese uber Streptavi-

din-Peroxidase mittels Chemolumineszenz sichtbar gemacht werden. Abbildung 5.21 (a)

und (b) zeigen, dass es sich bei dem von TGEV erkannten Protein um ein Hauptglyko-

protein der Burstensaummembran handelt (Pfeil, teilweise als Doppelbande). Durch eine

milde Perjodatoxidation auf Eis konnten selektiv die Sialinsauregruppen der Proteine

dargestellt werden (Abb. 5.21 c). Das Hauptglykoprotein ist somit ein Sialoglykoprotein.

Die Absetzferkelproben A3 und A4 schienen auf der gleichen Hohe wie die anderen Proben

ebenfalls ein Hauptglykoprotein mit geringer Sialylierung zu besitzen, obwohl TGEV bei

diesen Proben kein hochmolekulares Protein gebunden hatte. Die vorherige Desialylierung

der Proben (VCNA, +) zeigte jedoch bei A3 und A4 keinen Unterschied im Laufverhalten

der Banden, wohingegen das Hauptsialoglykoprotein der anderen Proben mehr oder we-

niger stark nach oben verschoben wurde. Fur muzinartige sialinsaurereiche Glykoproteine

ist ein verlangsamtes elektrophoretisches Laufverhalten nach Desialylierung typisch. Wie

in Abbildung 5.21 (c) zu erkennen ist, befand sich die hochmolekulare Sialinsaurebande

bereits bei nicht desialylierten A3- und A4-Proben auf der Hohe der Banden der desialy-

lierten anderen Proben. Diese Banden stellen somit moglicherweise Sialinsauretypen dar,

die nicht durch VCNA abgespalten werden konnen und die ebenfalls nicht durch TGEV

gebunden werden.


VCNA+_ _

+

S1 S2

__++

S4S3

__++

220

97

[kDa] A1

__++

A4A3A2

(a)

VCNA+_ _

+

S1 S2

__++

S4S3

__++

220

97

A1

__++

A4A3A2+DTT

(b)

VCNA+_ _

+

S1 S2

__++

S4S3

__++

97

A1

__++

A4A3A2

220(c)

Abbildung 5.21: Nachweis des Kohlenhydratanteils in BSMV-Proteinen. (a) Kohlenhydratreste,

(b) Kohlenhydratreste, Gelelektrophorese unter reduzierenden Bedingungen, und (c) Sialinsaure-

reste wurden mittels Perjodatoxidation nachgewiesen. Der Pfeil auf der linken Seite markiert die

Position des Bindungspartners von TGEV.

5.7.2.2 Charakterisierung der Kohlenhydratreste mit Lektinen

Zur naheren Charakterisierung der Kohlenhydratgruppen wurden in der SDS-PAGE auf-

getrennte und auf Nitrozellulose transferierte BSMV-Proteine mit Digoxigenin-markierten

Lektinen inkubiert (s. Methoden 4.20.3.1). Ein AP-gekoppelter Anti-Digoxigenin-Antikor-

per ermoglichte die Detektion der gebundenen Lektine durch Substratumsetzung auf der

Nitrozellulose. Fur die Untersuchung wurden die Lektine MAA (Maackia amurensis Agglu-

tinin), SNA (Sambucus nigra Agglutinin) und PNA (Peanut Agglutinin) verwendet. MAA

erkennt Sialinsauren, die terminal α(2-3) an Galaktose gebunden vorliegen. SNA hinge-

110 5. Ergebnisse

gen bindet an terminale Sialinsauren, die α(2-6) an Galaktose oder N-Acetylgalaktosamin

gebunden sind. Kommt es zu einer Bindung von PNA liegt das Disaccharid Galaktose-

β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin vor, welches hauptsachlich die Core-Einheit von O-Glykanen

darstellt. Eine terminale Sialinsaure verhindert die PNA-Erkennung, in diesem Fall gelingt

der Nachweis mit PNA nur nach vorheriger Abspaltung der Sialinsauren mit Neuramini-

dase.

Die Lektine SNA und MAA eigneten sich nicht gut fur eine Kohlenhydratuntersuchung

auf dem Blot. Es gab nur sehr schwache Reaktionen, die ein Vorhandensein entsprechender

Sialinsauren erahnen ließen. Nur bei den Proben A1 und A2 gelang eine starkere Reaktion

mit MAA, die zum Nachweis einer Doppelbande auf Hohe des Hauptsialoglykoproteins

fuhrte (> 220 kDa, nicht gezeigt). Somit scheinen die Sialinsauren des Glykoproteins

zumindest zum Teil in α(2-3) an Galaktose gebundener Form vorzuliegen.

Abbildung 5.22 zeigt das Ergebnis der Inkubation mit PNA. Die Proben S2 und A2 wie-

sen beide nach vorheriger VCNA-Behandlung zwei Banden auf, die von PNA gebunden

wurden. Die obere dieser beiden Banden reprasentiert das Glykoprotein, das in nicht

+ +

97

VCNA_

S2 A2

220

[kDa]

_

Abbildung 5.22: Erkennung von BSMV-Proteinen durch PNA. Auf Hohe der oberen Bande von

S2 und A2 befindet sich das von TGEV gebundene Protein. Die Position ist durch einen Pfeil

markiert.

desialylierter Form von TGEV gebunden wird und nach Neuraminidasebehandlung ein

langsameres elektrophoretisches Laufverhalten aufweist. Die Proben S1, S3, S4 und A1

verhielten sich wie S2 und A2. Probe A3 zeigte die Reaktion mit PNA in Form der beiden

Banden bereits ohne Neuraminidasebehandlung. Bei Probe A4 ließ sich keine Bindung von

PNA nachweisen. Das von TGEV gebundene Sialoglykoprotein in sechs der acht Ferkelpro-

ben besitzt somit nachweislich das Disaccharid Galaktose-β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin.

Daher handelt es sich bei dem Sialoglykoprotein um ein O-glykosyliertes Protein.


VCNA++

S1 S2

+ +

220

97

[kDa] A1 A2

(a)

S1 S2 A1 A2

____

VCNA++

S1 S2

+ +

220

97

A1 A2

(b)

S1 S2 A1 A2

____

VCNA

S1 S2

220

97

A1 A2

(c)

S1 S2 A1 A2

++____

++

Abbildung 5.23: Bindung von TGEV-NA an mit Lektinen gefallte BSMV-Proteine. Nach der

Fallung mit WGA- (a), Jacalin- (b) und PNA-Agarose (c) wurde das hochmolekulare Protein von

TGEV erkannt (Pfeil).

Um die Kohlenhydratreste des Sialoglykoproteins mit der TGEV-Bindung gekoppelt dar-

stellen zu konnen, wurden die BSMV-Proteine mit Lektin-Agarosen gefallt und anschlie-

ßend auf Virusbindung untersucht. Fur die Fallung wurden die Lektine WGA, PNA und

Jacalin verwendet. WGA bindet an N-Acetylglukosamin und an Sialinsauregruppen. PNA

erkennt Galaktose-β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin und damit O-glykosylierte Proteine. Die-

ses Disaccharid wird ebenfalls von Jacalin erkannt, welches im Gegensatz zu PNA auch

O-glykosylierte Strukturen ohne vorherige Desialylierung bindet.

Abbildung 5.23 zeigt die gefallten Glykoproteine, die von TGEV gebunden wurden. Ex-

emplarisch sind die Proben der Saugferkel S1 und S2 und der Absetzferkel A1 und A2

dargestellt. In den WGA-gefallten Proben band TGEV an das hochmolekulare Hauptsia-

loglykoprotein (Doppelbande) und an eine Bande bei ca. 150 kDa, bei der es sich um den

112 5. Ergebnisse

zellularen Rezeptor pAPN handelte (Abb. 5.23 a). Das Hauptsialoglykoprotein und pAPN

konnten auch von Jacalin gefallt werden, wie der anschließende Nachweis der Virusbindung

zeigt (Abb. 5.23 b). Die Uberprufung des Erfolgs der PNA-Fallung durch Virusbindung

erwies sich als schwierig, da TGEV an Sialinsauregruppen des Proteins bindet, diese Sia-

linsauren aber fur eine erfolgreiche PNA-Fallung vorher abgespalten werden mussen. Wie

Abbildung 5.23 (c) zeigt, war es jedoch moglich, ohne vorherige VCNA-Behandlung der

S1/S2-Proben einen kleinen Teil des Sialoglykoproteins mit PNA zu fallen. Dieser Teil

konnte von TGEV erkannt werden (Pfeil). Auch von pAPN konnte ohne vorherige De-

sialylierung der S1/S2-Proben ein kleiner Teil mit PNA gefallt und von TGEV gebunden

werden (Abb. 5.23 c). Wurden die Proben mit VCNA behandelt, war die Fallung von

pAPN jedoch wesentlich effektiver. Die Starke der pAPN-Banden in Abbildung 5.23 (c)

bei den BSMV-Proben S1 und S2 zeigt, dass diese Banden gut von TGEV erkannt wur-

den. Die Virusbindung an Aminopeptidase N ist folglich nicht sialinsaureabhangig. Bei

den A1/A2-Proben konnten ohne vorherige VCNA-Behandlung keine fur die Virusbindung

ausreichenden Proteinmengen mit PNA gefallt werden (Abb. 5.23 c). Nach Neuraminida-

sebehandlung dieser Proben konnte bei A1 PNA-gefallte Aminopeptidase N von TGEV

gebunden werden. Bei der BSMV-Probe A2 ist die pAPN-Bande in Abbildung 5.23 (c)

trotz vorheriger Desialylierung der Probe nur schwach zu erkennen. Die Ursache hierfur

ist unbekannt. Die geschilderten Ergebnisse zeigen, dass das Hauptsialoglykoprotein, mit

dem TGEV durch seine Sialinsaurebindungsaktivitat interagiert, ein O-glykosyliertes Sia-

loglykoprotein ist.

5.8 Interaktion von TGEV mit Darmepithel

Nachdem in Burstensaummembranen ein Sialoglykoprotein gefunden worden war, das von

desialyliertem TGEV uber Sialinsauregruppen gebunden wurde, wurde die Bindung von

TGEV in Darmgefrierschnitten untersucht. Die Untersuchung der Bindung in Kryoschnit-

ten bietet den Vorteil, dass die Strukturen des Darmgewebes in ihrer naturlichen Zu-

sammensetzung weitestgehend erhalten bleiben, und so Aussagen uber die tatsachliche

Lokalisation des Bindungspartners gemacht werden konnen.

Gefrierschnitte des Jejunums eines 3 Tage alten Saugferkels wurden mit Paraformaldehyd

fixiert und anschließend mit konzentrierten Virussuspensionen von TGEV-NA, TGEV,

5.8. Interaktion von TGEV mit Darmepithel 113

HAD3-NA und m10-NA inkubiert (s. Methoden 4.19.4). Die Virusbindung wurde uber

den mAk 6A.C3 und einen FITC-gekoppelten Zweitantikorper nachgewiesen und im Fluo-

reszenzmikroskop beurteilt.

Die Fluoreszenz in Abbildung 5.24 (oben, unten) zeigt, dass TGEV-NA in umschriebenen

Bereichen an das Dunndarmepithel des Saugferkels band (weiße Pfeile). Es handelt sich

bei diesen Bereichen vermutlich um Becherzellen des Dunndarmepithels, was vor allem

in dem vergroßerten Bildausschnitt in Abbildung 5.24 (unten) bei der Gegenuberstellung

von Fluoreszenz und Durchlicht zu erkennen ist. Becherzellen sind modifizierte Saulen-

epithelzellen, die Schleim synthetisieren und sezernieren. Der apikale breitere Zellleib der

Becherzellen ist dicht mit Muzingranula gefullt, die durch Exozytose abgegeben werden

und mit Wasser den Darmschleim bilden.

Wurden die Kryoschnitte vor der Virusinkubation mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae

behandelt, verschwand die Bindung von TGEV-NA in den Becherzellbereichen (Abb. 5.24

Mitte). Dies belegt die Sialinsaureabhangigkeit der Bindung von TGEV in diesen Regio-

nen. Die Bindung an den zellularen Rezeptor pAPN bewirkte nur ein schwaches Fluores-

zieren des gesamten Epithels (Nachweis mit mAk G43 nicht gezeigt.).

Zum Vergleich wurde die Interaktion von nicht desialyliertem TGEV und den Mutanten

HAD3 und m10 (in desialylierter Form) mit Gefrierschnitten des Jejunums des Saugferkels

untersucht. Die Ergebnisse dieser Bindungstests sind in Abbildung 5.25 dargestellt. Die

beiden Mutanten zeigten keine Bindung an die von TGEV-NA erkannten Becherzellberei-

che, was die Bedeutung der Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV fur diese Interaktion

unterstreicht. TGEV hingegen konnte auch ohne vorherige Neuraminidasebehandlung mit

Strukturen der Becherzellen interagieren, allerdings in abgeschwachter Form (Abb. 5.19

oben, weiße Pfeile).

TGEV bindet somit vermutlich an Sialinsauregruppen der Muzingranula in den Becher-

zellen und an den daraus entstehenden Darmschleim. Eine vorherige Desialylierung der

TGE-Virionen zur Optimierung der Sialinsaurebindungsaktivitat ist fur die Interaktion

mit Darmepithel im Kryoschnitt nicht unbedingt erforderlich. Entweder sind die Viruspar-

tikel aufgrund der eingesetzten hohen Konzentration auch ohne Desialylierung in der Lage

zu interagieren, oder die Affinitat zu den Strukturen im Becherzellbereich ist hoher als

die zu anderen Sialoglykokonjugaten.

114 5. Ergebnisse

Abbildung 5.24: Bindung von TGEV-NA an Dunndarmepithel. Darstellung der Bindung durch

Fluoreszenz (links) und entsprechender Bildausschnitt im Durchlicht (rechts). Die Bindung von

TGEV-NA ist im Uberblick oben und in einem vergroßerten Bildausschnitt unten gezeigt (wei-

ße Pfeile). Die Bilder in der Mitte zeigen die Bindung von TGEV-NA nach vorheriger VCNA-

Behandlung des Darmschnittes.

5.8. Interaktion von TGEV mit Darmepithel 115

Abbildung 5.25: Bindung von nicht desialyliertem TGEV und den Mutanten HAD3 und m10 an

Dunndarmepithel. Inkubation der Kryoschnitte mit TGEV (oben), HAD3-NA (Mitte) und m10-

NA (unten).

6. Diskussion

6.1 Bedeutung der Desialylierung von TGEV fur die

Interaktion mit Sialoglykokonjugaten

Fur die Untersuchung der Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV wurden die Virionen

im Vorfeld stets mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae desialyliert und anschließend uber

einen Saccharosegradienten gereinigt. Diese Vorbehandlung diente der Optimierung der

Bindung an Sialinsauren durch das S-Protein von TGEV und sollte klarere Ergebnisse

bezuglich potentieller Bindungspartner des Virus liefern. TGEV besitzt im Gegensatz zu

den Coronaviren der Gruppe II keine Rezeptor-inaktivierende Enzymaktivitat. Die Sia-

linsaurebindungsaktivitat von TGEV bewirkt, dass in Zellkultur wachsendes Virus mit

Sialoglykokonjugaten zellularen Ursprungs umgeben wird. Dieser Maskierung der Sia-

linsaurebindungsstellen des S-Proteins kann mangels viraler Enzymaktivitat nur durch

externe Neuraminidasebehandlung entweder der Virionen nach der Virusernte oder der

Zellen vor der Virusinfektion entgegengewirkt werden (Krempl et al., 1997).

Um zu sehen, wie sich die Maskierung der Sialinsaurebindungsstellen des S-Proteins durch

zellulare Sialoglykokonjugate auf die Bindungsaktivitaten von TGEV auswirkt, wurde

bei den Bindungsstudien in Zellkultur, mit intestinalen Muzinen, Burstensaummembra-

nen und Kryoschnitten von Darmepithelien parallel zu neuraminidasebehandeltem TGEV

auch nicht enzymbehandeltes Virus untersucht. Bei den Virusbindungstests auf Nitrozel-

lulose stellte sich heraus, dass TGEV-Partikel, die vor dem Reinigungsschritt uber einen

Saccharosegradienten nicht desialyliert worden waren, nicht nur in ihrer Sialinsaurebin-

dung sondern auch in ihrer Bindung an den zellularen Rezeptor Aminopeptidase N stark

117

118 6. Diskussion

beeintrachtigt waren (5.3.2, 5.6.3). Die Interaktion zellularer Sialoglykokonjugate mit den

S-Proteinen von TGEV-Partikeln konnte zu einer Vernetzung und somit zur Aggregatbil-

dung der Viruspartikel gefuhrt haben (Krempl und Herrler, 2001). Dies wurde auch

die Bindungsstellen fur pAPN zu großen Teilen verdecken und fur die Interaktion mit den

pAPN-Banden auf der Nitrozellulose nicht mehr genugend Kontaktstellen bieten. Selbst

der Einsatz unbehandelter TGE-Virionen in einer 10fach hoheren Proteinkonzentration

als die anderen Viruspartikel zeigte nur eine sehr schwache Bindung an die pAPN-Bande

bei 150 kDa (5.3.2). Fur einen Virusbindungstest auf Nitrozellulose ist somit der Ein-

satz nicht desialylierter TGEV-Partikel zur Untersuchung der Sialinsaurebindungsakti-

vitat und auch zur Untersuchung der Bindung an pAPN ungeeignet.

Bei der Untersuchung der Bindung von TGEV an Zellkulturen, die in Mikrotiterplatten

ausgesat worden waren, wurden ebenfalls VCNA-behandelte und unbehandelte Virionen

verwendet. Auch hier zeigte sich, dass die Sialinsaurebindungseigenschaft unbehandel-

ter Viruspartikel aufgrund bereits gebundener zellularer Sialoglykokonjugate stark einge-

schrankt war. Nicht desialyliertes TGEV kann aber sehr wohl noch Rindererythrozyten

agglutinieren, die zu 90% Neu5Gc auf ihrer Oberflache tragen. Dieser Sialinsauretyp wird

von TGEV bevorzugt erkannt und auf der Oberflache von Rindererythrozyten mogli-

cherweise auch in sterisch gunstiger Form prasentiert (Schultze et al., 1996). Auf ST-

und LLC-PK1-Zellen befindet sich aber uberwiegend Neu5Ac (5.3.1). Da die Affinitat

von TGEV zur Bindung an Neu5Ac wesentlich geringer ist als die Bindungsaffinitat zu

Neu5Gc (Schultze et al., 1996), findet eine effiziente Bindung von TGEV an die beiden

Zellkulturen erst nach Neuraminidasebehandlung der Viruspartikel statt.

Bei intestinalen Muzinen und Muzin aus der Glandula submandibularis des Schweines

(PSM) konnte man aufgrund des teilweise hohen Gehalts an Neu5Gc erwarten, dass die

Bindung von TGEV auch ohne vorherige Desialylierung der Viruspartikel nachweisbar

ist. Es zeigte sich jedoch, dass selbst bei den Muzinen des Saugferkels B und PSM, die

den hochsten Gehalt an Neu5Gc bei den eingesetzten Proben aufwiesen, nicht desialy-

liertes TGEV im Gegensatz zu desialyliertem TGEV nur wenig binden konnte (5.5.1).

Moglicherweise hatten hohere Viruskonzentrationen eine starkere Bindung bewirkt. Es

kann aber auch sein, dass durch die Immobilisierung der Muzine auf der ELISA-Platte

und die Vernetzung der Viruspartikel untereinander ahnlich ungunstige Voraussetzungen

6.1. Bedeutung der Desialylierung von TGEV fur die Interaktion... 119

geschaffen wurden wie bei dem Virusbindungstest auf Nitrozellulose.

Darmgewebe aus frischtoten Tieren, das direkt nach der Entnahme in Isopenthan/flussi-

gem Stickstoff eingefroren wurde, kann in relativ unverandertem Zustand gelagert werden

(−80◦C). Die Untersuchung der Virusbindung an Kryoschnitte, die aus solchen Jejunum-

proben angefertigt wurden, bietet somit die Moglichkeit, an relativ unveranderten Struk-

turen zu arbeiten. Da ein Schnitt nicht mehr das gesamte Gewebe in unveranderter Form

prasentiert, ist auch diese Untersuchungsmethode nur eine Annaherung an naturliche

Verhaltnisse. So sind durch die Anfertigung der Darmschnitte auch Strukturen ange-

schnitten, die im Tier vom Darmlumen aus nicht direkt zuganglich waren. Trotzdem ist

die Untersuchung der Bindung von TGEV an Kryoschnitte des Darmes, die Methode in

dieser Arbeit, die den naturlichen Bedingungen im Tier am nachsten kommt. Die Schnitte

wurden vor der Inkubation mit Virus mit Paraformaldehyd fixiert, da das Arbeiten mit

unfixierten Schnitten die zellularen Strukturen des Darmgewebes nach mehreren Inku-

bationsschritten schadigte bzw. schlechter erkennen ließ. Vorherige Tests mit unfixierten

Schnitten zeigten jedoch, dass sich das Bindungsverhalten von TGEV durch die Fixie-

rung nicht veranderte. Bei der Bindung von TGEV an Sialinsaurereste der Strukturen

des Darmepithels in diesen Kryoschnitten zeigte sich, dass die Vorbehandlung der Virio-

nen mit VCNA in dieser Untersuchungsmethode nicht notwendig war. Nicht desialylier-

te TGE-Virionen konnten uber ihre Sialinsaurebindungsaktivitat an Sialoglykokonjugate

des Darmepithels binden, wenn auch nicht so effizient wie TGEV-NA. Die Bindungspart-

ner, die TGEV uber seine Sialinsaure-bindende Aktivitat im Kryoschnitt des Jejunums

erkennt, sind somit offensichtlich fur eine Interaktion mit TGEV optimal sialyliert, so-

wohl was den Sialinsauretyp betrifft als auch hinsichtlich der raumlichen Prasentation

der Sialinsauren. Die Affinitat zu diesen Bindungspartnern scheint so stark zu sein, dass

die verbleibenden Sialinsaurebindungsstellen auf den nicht desialylierten S-Proteinen von

TGEV fur eine Bindung ausreichen. Denkbar ist auch, dass die Bindung der zellularen

Sialoglykokonjugate an TGEV aufgrund einer hoheren Affinitat zu den jejunalen Sialo-

glykokonjugaten gelost wird.

Die Notwendigkeit der vorherigen Desialylierung der Virionen ergibt sich also aus der Me-

thode, mit der man die TGEV-Bindung nachweisen mochte. Wahrend die enzymatische

Vorbehandlung bei der Bindung an immobilisierte Glykoproteine und Muzine, an Zellkul-

120 6. Diskussion

turen und bei der Agglutination von Huhnererythrozyten unbedingt erforderlich ist, kann

man bei der Agglutination von Rindererythrozyten und bei der Bindung an Kryoschnitte

des Darmes darauf verzichten.

Da fur die Interaktion mit Sialoglykokonjugaten des Darmepithels die Desialylierung von

TGEV nicht erforderlich ist, kann die Sialinsaurebindungsaktivitat fur die Enteropatho-

genitat von TGEV in vivo von großer Bedeutung sein. Ganz gleich, ob das Virus auf

seinem Weg in den Darm mit Sialoglykokonjugaten beladen ist oder nicht, es weist eine

hohe Bindungsaffinitat zu Sialoglykokonjugaten des Darmepithels auf und kann mit den

Enterozyten interagieren.

6.2 Bewertung des Vergleichs von TGEV mit

E. coli F5

E. coli F5 ist ein Bakterium, welches den Dunndarm uber die Bindung an Neu5Gc ko-

lonisiert. Die Fimbrien dieses Mikroorganismus besitzen somit wie die S-Proteine von

TGEV eine Sialinsaurebindungsaktivitat mit Bevorzugung von Neu5Gc. Die Infektion

von Schweinen mit E. coli F5 ist altersabhangig. Bei Saugferkeln kommt es zur Besiede-

lung des Darmes und zur Schadigung des Wirtsorganismus durch Toxinfreisetzung uber

die Bakterien (Stamm und Sorg, 1993). Mit zunehmendem Alter der Tiere haften immer

weniger Bakterien an den Burstensaummembranen. Bei 6 Wochen alten Tieren kommt es

nicht mehr zur Adhasion von F5-positiven E. coli, was als Entwicklung einer naturlichen

Resistenz der Enterozyten interpretiert wurde (Stamm und Sorg, 1993). Teneberg

et al. (1990) berichteten uber ein modifiziertes Rezeptormolekul, das keine Adhasion von

F5-Fimbrien ermoglicht. Auch die Infektion mit TGEV verlauft je nach Alter der Tiere un-

terschiedlich und betrifft Saugferkel besonders stark (Enjuanes und van der Zeijst,

1995). Im Gegensatz zu E. coli F5 war bei TGEV bisher aber weder bekannt, welche

Bedeutung die Sialinsaurebindungsaktivitat fur die Infektion besitzt, noch hatte man

ubereinstimmende Erklarungen fur den altersabhangigen Verlauf der Erkrankung. Der

Vergleich der Sialinsaurebindungsaktivitaten von TGEV und E. coli F5 sollte daher eine

Hilfe sein, aufgrund der Gemeinsamkeiten der beiden Mikroorganismen und des Wissens

uber E. coli F5, Anhaltspunkte fur die Bedeutung der Sialinsaurebindungseigenschaft von

6.2. Bewertung des Vergleichs von TGEV mit E. coli F5 121

TGEV zu bekommen.

Trotz einiger Gemeinsamkeiten bestehen zwischen einer Infektion mit E. coli F5 und einer

Infektion mit TGEV doch große Unterschiede. Bei E. coli F5 handelt es sich um ein nicht-

invasives Bakterium, welches die Mukosa des Dunndarms uber seine Adhasine kolonisieren

kann. Das bedeutet, dass die Bakterien einem Abtransport mit dem Darminhalt aufgrund

der Bindung ihrer Fimbrien (Adhasine) an Rezeptoren auf der Darmschleimhaut entge-

genwirken. Durch die Enterotoxine des Bakteriums werden die Epithelzellen des Darms zu

erhohter Flussigkeitssekretion stimuliert, die die eigentliche Diarrhoe bewirkt (Gaastra

und de Graaf, 1982). Die Epithelzellen selber bleiben intakt. Altere Tiere konnen wegen

einer Veranderung der Rezeptoren nicht infiziert werden. Bei einer TGEV-Infektion muss

das Virus, um sich vermehren zu konnen, in die Wirtszellen eindringen. Die Bindung an

das Epithel ist der erste Schritt, der den Replikationszyklus einleitet. Durch die Infektion

der Epithelzellen mit TGEV kommt es schließlich zu einer Zerstorung des Zottenepithels

und damit zu einer wassrigen Diarrhoe. Infiziert werden konnen Tiere jeden Alters, nur der

Verlauf der Erkrankung ist je nach Alter unterschiedlich. Somit gleichen sich diese beiden

Erreger nur in dem Punkt, dass sie durch die Bindung an Strukturen des Darmepithels

einen Abtransport durch die Darmperistaltik verhindern mussen, um den Fortbestand

ihrer Art sichern zu konnen. Diese erste Bindung erfolgt bei beiden uber Sialinsauren.

Bei den vergleichenden Untersuchungen der beiden Mikroorganismen wurde TGEV stets

in desialylierter Form eingesetzt, um moglichst viele freie Sialinsaurebindungsstellen zu

haben. Da bekannt ist, dass TGEV auch ohne vorherige Desialylierung Rindererythro-

zyten agglutinieren kann (Schultze et al., 1996), ware ein zusatzlicher Vergleich mit

nicht desialylierten Virionen durchaus interessant gewesen. Schultze et al. (1996) ha-

ben die Agglutination von Rinder-, Huhner- und Schweineerythrozyten durch TGEV und

TGEV-NA verglichen. Huhnererythrozyten werden wie bei E. coli F5 von nicht desialylier-

tem TGEV nicht agglutiniert. Interessanterweise werden Schweineerythrozyten, obwohl

sie wie Rindererythrozyten 90% der Sialinsauren in Form von Neu5Gc auf ihrer Oberflache

tragen, von nicht desialylierten TGE-Virionen ebenfalls nicht agglutiniert. Somit scheint

nicht nur der Gehalt an Neu5Gc, sondern auch die Art der raumlichen Prasentation der

Sialinsauren eine Rolle fur die Interaktion zu spielen.

Der Vergleich der Interaktion mit Hamagglutinationsinhibitoren sollte Anhaltspunkte lie-

122 6. Diskussion

fern, ob TGEV ahnliche Bindungspartner bevorzugt wie E. coli F5. Ein Hamagglutina-

tionstest ist nicht sehr sensitiv, bietet aber den Vorteil, dass man einfach und schnell

Anregungen fur die folgenden Untersuchungsrichtungen bekommt. Die Hamagglutination

durch E. coli F5 wurde sowohl von Muzinen als auch von Glykolipiden gehemmmt (5.1.3).

Dieses Ergebnis stimmt mit Berichten uberein, dass E. coli F5 Glykolipide wie Neu5Gc-

GM3 als Rezeptor zur Kolonisation des Darms nutzt (Teneberg et al., 1990; Seignole

et al., 1991), die Fimbrien aber ebenfalls an intestinale Muzine der Darmschleimschicht

binden (Lindahl und Carlstedt, 1990). Die Agglutination von Rindererythrozyten

durch TGEV-NA wurde durch Glykolipide nicht gehemmt. Intestinale Muzine hemmten

die Hamagglutination jedoch zu hoheren Titern als bei E. coli F5. Dieses Ergebnis lasst

somit den Schluss zu, dass TGEV Sialoglykoproteine gegenuber -lipiden als Bindungs-

partner bevorzugt.

6.3 Interaktion von TGEV mit Zellkulturzellen

Die Desialylierung von TGEV bewirkt eine bis zu 6fach hohere Bindung der Virionen

an die Oberflache von ST- und LLC-PK1-Zellen (5.2). Vergleicht man jedoch die Infek-

tiositat von TGEV-NA mit TGEV oder mit sialinsaurebindungsdefizienten Mutanten sind

die Virustiter annahernd gleich hoch (Schultze et al., 1996; Krempl et al., 1997, 2000).

Die Infektiositat in Zellkultur erhoht sich also nicht durch die Eigenschaft, zusatzlich an

Sialinsauren binden zu konnen. Die Bindung an den zellularen Rezeptor porzine Amino-

peptidase N (pAPN) hingegen ist unerlasslich fur die Einleitung einer Infektion. Durch

die Bildung von pAPN-TGEV-Komplexen kommt es zu einer erhohten Endozytoserate,

und auch fur die Fusion der Virus- mit der Endosomenmembran scheint die Interaktion

mit pAPN eine Rolle zu spielen (Hansen et al., 1998).

Die Bindung an mehr als einen Rezeptor ist bereits fur mehrere Viren demonstriert wor-

den und belegt die Komplexitat der Vorgange bei der Einleitung einer Virusinfektion. So

bewirkt z.B. bei einer HIV-Infektion die Bindung des externen Virus-Glykoproteins gp120

an zellulares CD4 eine Konformationsanderung des viralen Proteins, wodurch die Bindung

an den Corezeptor aus der Chemokinfamilie (CCR5) ermoglicht wird (Dalgleish et al.,

1984; Klatzmann et al., 1984; Deng et al., 1996). Diese zweite Interaktion bewirkt

6.3. Interaktion von TGEV mit Zellkulturzellen 123

beim viralen Transmembranprotein gp41 die Umwandlung in eine fusionsaktive Konfor-

mation. Es existieren Virusvarianten, die statt CCR5 CXCR4 oder andere Rezeptoren

nutzen, um die Fusion zu bewirken (Berson et al., 1996; Feng et al., 1996). Auch Vi-

ren der Familie Herpesviridae wie das Herpes-simplex-Virus (HSV-1) benotigen mehrere

Zelloberflachenfaktoren zur Infektion einer Zelle. Mit dem Oberflachenglykoprotein gC

binden die Virionen an Heparansulfat (WuDunn und Spear, 1989). Der Viruseintritt

erfordert jedoch die Interaktion des viralen Glykoproteins gD mit Corezeptoren auf der

Zelloberflache (Campadelli-Fiume et al., 2000). Sowohl bei HIV als auch bei Herpes-

viren existieren Mutanten, die sich in Zellkultur effizient vermehren, obwohl sie nicht an

CD4 bzw. Heparansulfat binden konnen. Die Corezeptoren werden in diesem Fall auch

fur die Adsorption an die Zelle genutzt. Diese Mutanten konnen sich zwar in Zellkultur

vermehren, kommen aber nicht in naturlichen Isolaten vor. In vivo ist die Bindung an

CD4 bzw. Heparansulfat somit unerlasslich.

In ahnlicher Weise kann man die Bindung von TGEV an Sialinsauren betrachten. Unter

den kunstlichen Bedingungen in Zellkultur wird diese Bindungseigenschaft nicht benotigt,

sie ist fakultativ. Im Wirtsorganismus hingegen stellt die Sialinsaurebindungsaktivitat

einen Pathogenitatsfaktor dar, der es TGEV ermoglicht, effizient im Darmtrakt zu repli-

zieren. Im Gegensatz zu HIV und HSV-1 existiert bei TGEV auch in vivo eine naturliche

Variante — das porzine respiratorische Coronavirus (PRCoV), das keine Sialinsaurebin-

dungaktivitat besitzt (Schultze et al., 1996), sondern nur uber die Bindung an pAPN

eine Infektion einleitet (Delmas et al., 1993). PRCoV infiziert jedoch naturlicherweise nur

den Respirationstrakt und kann im Darmtrakt kaum replizieren (Cox et al., 1990). Somit

ist die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV nicht generell fur eine naturliche Infektion

erforderlich, wohl aber fur eine erfolgreiche Replikation im Dunndarm des Schweines.

Die Sialinsaureanalyse der Membranproteine von ST- und LLC-PK1-Zellen ergab, dass

Neu5Ac den großten Anteil der Sialinsauren ausmacht (5.3.1). Dies ist wohl mit ein Grund,

warum TGEV erst nach Neuraminidasebehandlung an Sialoglykokonjugate auf der Zell-

kulturoberflache binden kann (s. auch 6.1). Bei dem Bindungspartner handelt es sich

um ein hochmolekulares Sialoglykoprotein. Einige Befunde weisen auf einen muzinartigen

Charakter dieses Sialoglykoproteins hin:

124 6. Diskussion

• Das Sialoglykoprotein besitzt ein Molekulargewicht von vermutlich mehreren hun-

dert kDa. Muzine sind Glykoproteine mit einem Molekulargewicht von mehreren

hundert bis mehreren tausend kDa (Roussel und Lamblin, 1996).

• Das Sialoglykoprotein ließ sich schlecht mit NHS-Biotin markieren (5.3.3). Da unter

anderem Hydroxyaminosauren mit dem N-Hydroxysuccinimidester des Biotins bei

einer Markierung reagieren, konnte die O-Glykosylierung von Serin- oder Threonin-

resten diese Interaktion verhindert haben. Dies hatte eine geringe Markierbarkeit

des Proteins mit Biotin zur Folge.

• Das Sialoglykoprotein ließ sich gut mit der fur Glykoproteine spezifischen Silberfar-

bung nachweisen (5.3.3). Es farbte sich in dieser Farbung gelb-braunlich, was fur

Proteine mit einem hohen Anteil an O-Glykanen typisch ist (Deh et al., 1985).

• Bei dem Sialoglykoprotein handelt es sich um ein membranassoziiertes Protein ohne

Transmembrananker (5.4.1). Viele Muzine werden von Epithelzellen sezerniert und

befinden sich danach in lockerer Assoziation zur Zellmembran.

• Das Sialoglykoprotein wurde von dem Lektin WGA gut erkannt. WGA bindet be-

vorzugt an N-Acetylglukosamin und hat eine eher schwache Affinitat fur Sialinsau-

ren (Gallagher et al., 1985). Die Kohlenhydratketten von Muzinen bilden haufig

sogenannte Cluster hoch glykosylierter Domanen (Roussel und Lamblin, 1996).

Diese Clusterbildung konnte bei dem hochmolekularen Sialoglykoprotein die gute

Erkennung durch WGA bewirkt haben.

6.4 Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen

und mit Darmepithel

Die Agglutination von Rindererythrozyten durch TGEV wurde von den intestinalen Mu-

zinen aller Tiere zu gleichen Titern gehemmt (5.1.3). Im ELISA band TGEV gut an

intestinale Muzine von Saugferkel A und B und Absetzferkel D, konnte intestinale Muzi-

ne des Absetzferkels C jedoch nicht erkennen (5.5.1). Ein ELISA ist wesentlich sensitiver

als ein Hamagglutinationshemmtest, was erklart, dass die geringeren Bindungsunterschie-

6.4. Interaktion von TGEV mit intestinalen Muzinen und mit Darmepithel 125

de zwischen den Muzinen von Tier A, B und D im Hamagglutinationstest nicht erfassbar

waren. Die Muzine des Absetzferkels C verhielten sich in den beiden Testsystemen jedoch

vollig unterschiedlich. TGEV konnte diese Muzine nicht binden, was durch den spezifi-

schen Nachweis mittels Antikorper im ELISA gezeigt wurde. Trotzdem hemmten diese

Muzine die Hammagglutination durch TGEV zu gleichen Titern wie die Muzine, die auch

spezifisch mit TGEV interagieren. Eine mogliche Erklarung fur diese Hemmung sind un-

spezifische Interaktionen mit den Viruspartikeln, die nicht auf eine direkte Interaktion mit

der Sialinsaurebindungsstelle beruhen, aber die Interaktion von TGEV mit den Erythro-

zyten behindern. Eine spezifische Bindung von TGEV an Sialinsaurereste der Muzine des

Tieres C war vermutlich wegen des geringen Gehalts an Neu5Gc von nur 10% (bezogen

auf den Gesamtgehalt an Neu5Gc und Neu5Ac) nicht moglich. Desialyliertes TGEV kann

jedoch auch an Neu5Ac binden, was die hohen Hamagglutinationstiter beim Einsatz von

Huhnererythrozyten belegen (Schultze et al., 1996). Da die raumliche Prasentation der

Sialinsauren eine bedeutende Rolle fur die erfolgreiche Interaktion mit TGEV spielt, ist

die ungunstige Prasentation der Sialinsauren ein wahrscheinlicherer Grund fur die feh-

lende Bindung an Muzine des Absetzferkels C. In dem Bindungstest auf Nitrozellulose

wurde bei den Muzinen nur bei Tier B und PSM ein positives Signal detektiert. Es ist

wahrscheinlich, dass die aufgetragene Muzinmenge von 5 µg/Spur bei den anderen ELISA-

positiven Muzinen unterhalb der Nachweisgrenze lag. Die Sensitivitat des Bindungstests

auf einer Blotmembran erreicht nicht die eines ELISAs. Um auch die ubrigen Muzine im

Blot detektieren zu konnen, mussten vermutlich Muzinmengen von ≥ 20 µg/Spur gewahlt

werden.

Die Untersuchung der Bindung von TGEV an Burstensaummbranen ergab, dass bei al-

len vier Saugferkelproben (S1–S4) und zwei der vier Absetzferkelproben (A1, A2) neben

pAPN ein hochmolekulares Sialoglykoprotein erkannt wurde. Diese Interaktion erfolgte

uber Sialinsaurereste des Proteins mit der Sialinsaurebindungsstelle der S-Proteine von

TGEV, wie u.a. der Vergleich mit den sialinsaurebindungsdefizienten Mutanten HAD3

und m10 zeigte. Die HPLC-Analyse ergab, dass alle BSMV-Praparationen, auch die der

Absetzferkel A3 und A4, sowohl Neu5Gc als auch Neu5Ac enthielten (5.6.2). Obwohl der

Sialinsauregehalt der Burstensaummembranen von A3 und A4 geringer war als von den

anderen Tieren, erklart sich die fehlende Bindung an Sialinsaurereste des hochmolekularen

Proteins bei diesen beiden Tieren dadurch nicht. Beim Nachweis des Kohlenhydrat- und

126 6. Diskussion

Sialinsaureanteils der einzelnen BSMV-Proteine nach SDS-PAGE und Ubertragung auf

Nitrozellulose zeigte sich jedoch, dass sich die Proteine der Absetzferkel A3 und A4 in ih-

rer Kohlenhydratzusammensetzung von denen der anderen Tiere unterschieden (5.7.2.1).

Die beiden Proben enthielten zwar ebenfalls eine Hauptglykoproteinbande auf der Hohe

des Bindungspartners von TGEV, diese zeigte nach vorheriger Neuraminidasebehandlung

der Proben aber keine Veranderung in ihrem Laufverhalten und ihrer Intensitat. Bei den

ubrigen Proben hingegen kam es nach vorheriger Desialylierung zu einer Verschiebung der

Bande des Hauptglykoproteins nach oben und zu einer Abnahme der Bandenstarke. Die

Hauptglykoproteine der BSMV-Praparationen der Absetzferkel A3 und A4 unterscheiden

sich somit von denen der anderen Ferkel in ihrem Kohlenhydratanteil. Vor allem bei Pro-

be A3 scheinen kaum Sialinsauren an diesem Hauptglykoprotein vorzuliegen. Aus diesem

Grund konnte diese Glykoproteinbande auch ohne VCNA-Behandlung der Probe bereits

mit dem Lektin PNA reagieren. Das Hauptglykoprotein der Probe A4 hingegen schien

etwas starker sialyliert zu sein (5.7.2.1). Hier ließen sich die Sialinsauren jedoch nicht mit

VCNA abspalten, was auch die unterbliebene Bindung von PNA erklart. Diese Unterschie-

de in der Kohlenhydratzusammensetzung im Vergleich zu den anderen Proben erklaren

die fehlende Bindung von TGEV an das Hauptglykoprotein von A3 und A4. Erganzende

Untersuchungen konnten zeigen, ob sich die fehlende Bindung von TGEV an intestina-

le Muzine des Absetzferkels C durch ahnliche Unterschiede in der Kohlenhydratstruktur

erklart.

Die Unterschiede in der Kohlenhydratzusammensetzung der BSMV-Proben A3 und A4

und moglicherweise auch der Muzinprobe C zu den anderen Proben konnten durch die

Isolierungs- und Reinigungsschritte verursacht worden sein. Da aber die Muzinisolierung

und -reinigung sowie die BSMV-Praparation von Saugferkel- und Absetzferkeldarm inner-

halb der Gruppen immer gleich ablief, handelt es sich bei den Unterschieden in der Koh-

lenhydratzusammensetzung wohl eher um individuelle Unterschiede zwischen den Tieren.

Die Absetzferkel A3 und A4 waren 6–8 Wochen alt und kamen beide direkt vor der Totung

aus der gleichen Haltung in Mariensee. Absetzferkel A1 und A2 (12 Wochen alt) kamen

ursprunglich auch aus Mariensee, wurden jedoch bereits ca. 4 Wochen vor der Totung

im Institut fur Physiologie der TiHo Hannover eingestallt und unterlagen dort anderen

Haltungsbedingungen als in Mariensee (Futterumstellung, anderer Stall, Umweltfaktoren,

etc.). Diese Haltungsunterschiede und dabei vor allem eine andere Futterzusammenset-


zung konnten durchaus einen Einfluss auf die Kohlenhydratzusammensetzung der Gly-

koproteine des Darms haben. Die Saugferkelproben fur die BSMV-Praparationen kamen

aus dem Lehr- und Forschungsinstitut der TiHo Hannover in Ruthe. Auch die Tiere fur

die Muzinisolierungen kamen aus unterschiedlichen Haltungen. Der Darm der Absetzfer-

kel C und D und der Darm des Saugferkels A (14 Tage alt) wurden zu verschiedenen

Zeitpunkten vom Institut fur Pathologie zur Verfugung gestellt. Alle Tiere kamen aus

verschiedenen Betrieben mit verschiedenen Vorberichten. Der Darm des 12 Tage alten

Saugferkels wurde vom Institut fur Physiologie zur Verfugung gestellt, das Tier kam aus

Ruthe. Das Tiermaterial war somit sehr heterogen. Die unterschiedlichen Haltungs- und

Ernahrungsbedingungen der Tiere und auch genetisch bedingte individuelle Unterschie-

de konnten die Unterschiede im Bindungsverhalten von TGEV an die jeweiligen Proben

erklaren.

Die Probenauswahl aus jeweils zwei Altersgruppen (Saug- und Absetzferkel) sollte helfen,

die altersabhangigen Unterschiede im Verlauf einer TGEV-Infektion zu erklaren. Die Un-

tersuchungen ergaben, dass es Unterschiede in der Sialinsaurezusammensetzung und in

der Interaktion mit TGEV zwischen den Proben gab. Bei den intestinalen Muzinen wies

die Probe des Absetzferkels C mit einem hohen Neu5Ac- und einem geringen Neu5Gc-

Gehalt eine andere Sialinsaurezusammensetzung als die anderen Proben auf (5.1.3.2).

Diese Muzinprobe wurde von TGEV im ELISA nicht gebunden (5.5.1). Die Muzinprobe

des Absetzferkels D hatte eine fast identische Sialinsaurezusammensetzung (Neu5Gc +

Neu5Ac) wie die Muzinprobe des Saugferkels A (5.1.3.2), wurde im ELISA aber etwas

schlechter von TGEV erkannt als die intestinalen Muzine beider Saugferkel (5.5.1). Der

Sialinsauregehalt der BSMV-Praparationen aus Saugferkeldarm — speziell der Gehalt an

der fur die TGEV-Bindung wichtigen Sialinsaure Neu5Gc — war bezogen auf die Pro-

teinmenge ca. 4-mal hoher als der der Praparationen aus Absetzferkeldarm (5.6.2). Das

hochmolekulare Sialoglykoprotein wurde von TGEV in allen vier BSMV-Proben der Saug-

ferkel gut gebunden. Bei den Absetzferkeln wurden nur zwei von vier Proben von TGEV

erkannt (A1, A2), wobei die Bindung an die hochmolekulare Bande bei A1 schwacher war

als bei A2 (5.6.3). Die bessere Virusbindung an die Saugferkelproben im Vergleich zu den

Absetzferkelproben weist darauf hin, dass die hochgradige Gastroenteritis bei Saugferkeln

durch eine bessere Bindung des Virus an Sialoglykokonjugate im Darm bedingt sein kann.

Durch bessere Anheftungsmoglichkeiten der Virionen im Darm steigt die Wahrscheinlich-

128 6. Diskussion

keit fur eine erfolgreiche Virusreplikation in den Epithelzellen, so dass bei Saugferkeln

eine schwerere Erkrankung verursacht wird. Fur die altersabhangigen Unterschiede ei-

ner virusbedingten Gastroenteritis gibt es viele Erklarungen. Der schwerere Verlauf der

TGE konnte bedingt sein durch die geringe Enterozytenerneuerungsrate bei neugeborenen

Ferkeln (Moon, 1973). Die Malabsorption, die Maldigestion, der daraus folgende Flussig-

keitsverlust und somit der Durchfall dauern aufgrund dieser geringen Erneuerungsrate der

Epithelzellen bei Saugferkeln langer an als bei Absetzferkeln. Das Vorkommen von En-

terozyten fetalen Ursprungs auf dem Villus Neugeborener, die durch ihr tubulo-vakuolares

System die Virusreplikation erleichtern (Wagner et al., 1973), ist als ein weiterer Grund

fur den schweren Verlauf der Gastroenteritis bei Saugferkeln junger als 2 Wochen disku-

tiert worden. Auch haben Umweltfaktoren wie Kalte oder schwankende Temperaturen bei

Neugeborenen einen starkeren Einfluss auf den Schweregrad der Diarrhoe (Saif, 1990).

Das Immunsystem, vor allem die lokale Darmimmunitat, die bei der Bekampfung einer

TGEV-Infektion von großer Bedeutung ist, kann bei Neugeborenen ebenfalls noch nicht

ausreichend entwickelt sein. Diese Erklarungsversuche sind nicht durch experimentelle Da-

ten belegt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sprechen dafur, dass die Bindung an

Sialoglykokonjugate die Infektion von Saugferkeln im Vergleich zu Absetzferkeln beguns-

tigen konnte.

Sowohl bei den Muzinen des Saugferkels B als auch bei den BSMV-Proben der Saugfer-

kel S1–S4 und der Absetzferkel A1 und A2 wurden hochmolekulare Proteinbanden uber

die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV gebunden. Es ist moglich, dass dieses hoch-

molekulare Protein in den BSMV-Praparationen mit dem in den Muzinen identisch ist.

Bei dem Sialoglykoprotein der BSMV-Praparationen sprechen viele Anhaltspunkte dafur,

dass es sich wie bei den Muzinpraparationen ebenfalls um ein Muzin handelt:

• Bei dem von TGEV gebundenen Sialoglykoprotein handelt es sich um ein sehr hoch-

molekulares Protein. Ein Charakteristikum von Muzinen ist ihr Molekulargewicht

von mehreren hundert bis mehreren tausend kDa (Roussel und Lamblin, 1996).

• Bei dem Sialoglykoprotein handelt es sich um ein membranassoziiertes Protein ohne

Transmembrananker (5.7.1). Viele Muzine werden von speziellen Epithelzellen sezer-

niert und bilden zusammen mit Wasser und anderen Substanzen die Schleimschicht

auf der Oberflache von Epithelien wie z.B. im Darm, im Auge, im Respirationstrakt


etc. (Carlstedt et al., 1985).

• Der Nachweis der Kohlenhydratanteile in den BSMV-Proteinen weist durch die In-

tensitat der Kohlenhydratbande auf Hohe des hochmolekularen BSMV-Proteins da-

rauf hin, dass dieses Protein stark glykosyliert ist (5.7.2.1). Die Definition von Muzi-

nen basiert neben dem hohen Molekulargewicht auf einem hohen Kohlenhydratanteil

von 50–70% (Roussel und Lamblin, 1996).

• Die enzymatische Entfernung der Sialinsauren mit VCNA fuhrte zu keiner erhohten

Mobilitat des Proteins in der SDS-PAGE, sondern zu einem verlangsamten Lauf-

verhalten (5.7.2.1). Fur muzinartige sialinsaurereiche Glykoproteine ist solch ein

verlangsamtes elektrophoretisches Laufverhalten typisch.

• Das hochmolekulare Sialoglykoprotein wurde von den Lektinen Jacalin und PNA

erkannt (5.7.2.2), die an das fur O-glykosylierte Proteine charakteristische Disaccha-

rid Galaktose-β(1-3)-N-Acetylgalaktosamin binden (Sastry et al., 1986; Sueyoshi

et al., 1988). Die Kohlenhydratketten von Muzinen sind uber O-gykosidische Bin-

dungen zwischen N-Acetylgalaktosamin und den Hydroxygruppen der Aminosau-

ren Serin oder Threonin mit dem Apomuzin (Peptidanteil des Muzins) verankert

(Roussel und Lamblin, 1996).

• Die sialinsaurespezifischen Lektine MAA und SNA erkannten das sialylierte Glyko-

protein nur schwach bzw. gar nicht. Diese Lektine reagieren gut mit Sialinsauren

in N-Glykanen, konnen Sialinsauren in O-Glykanen jedoch nur ineffizient oder gar

nicht erkennen (Wang und Cummings, 1988; Haselbeck et al., 1990).

• Das Sialoglykoprotein wurde von dem Lektin WGA gut erkannt. WGA bindet bevor-

zugt an N-Acetylglukosamin und hat eine eher schwache Affinitat fur Sialinsauren

(Gallagher et al., 1985). Die Kohlenhydratketten von Muzinen bilden haufig so-

genannte Cluster hoch glykosylierter Domanen, und die Muzine erhalten dadurch

ein”flaschenburstenartiges“ Aussehen (Roussel und Lamblin, 1996). Diese Clus-

terbildung konnte bei dem hochmolekularen Sialoglykoprotein die gute Erkennung

durch WGA bewirkt haben.

TGEV erkannte bei einigen der Proben (Muzine, BSMV-Proben S1, S2, A2) zwei hochmo-

lekulare Banden in etwas unterschiedlicher Hohe, bei anderen (S3, S4, A1) nur jeweils eine

130 6. Diskussion

dieser Banden. Diese von TGEV erkannte Doppelbande konnte ein und dasselbe Prote-

in in unterschiedlicher Glykosylierung darstellen. Es kann aber auch nicht ausgeschlossen

werden, dass sich die beiden Banden in ihrer Aminosaurezusammensetzung unterscheiden.

Es ist bekannt, dass selbst in ein und derselben Zelle produzierte Muzine Unterschiede

aufweisen. Die Polydispersitat der Peptidvorlaufer von Muzinen zeigte sich in Großenun-

terschieden der Peptide von 100 bis uber 400 kDa (Roussel und Lamblin, 1996). Ob

sich die von TGEV erkannten zwei hochmolekularen Banden in ihrer Peptid- oder/und

in ihrer Kohlenhydratzusammensetzung unterscheiden, mussen weitere Untersuchungen

klaren. Die Isolierung und anschließende Sequenzierung der Proteine auf der Hohe dieser

Banden wird zeigen, ob es sich um ein unterschiedlich glykosyliertes Protein oder um zwei

verschiedene Proteine handelt.

Die sialinsaureabhangige Bindung von TGEV an Strukturen der Becherzellen des Darm-

epithels (5.8) spricht dafur, dass es sich hier um eine Bindung an Granula der in den

Becherzellen gebildeten Muzine handelt. Diese Muzine sind wahrscheinlich mit denen in

den BSMV-Praparationen und denen aus der Darmmuzinisolierung identisch. Da diese

Muzine in den Becherzellen gehauft vorkommen und die Becherzellen im Anschnitt fur

das Virus gut zuganglich waren, kam es in dem Bindungstest auf Kryoschnitten vor allem

dort zu einer starken Fluoreszenz. Diese Fluoreszenz uberstrahlte die Bindung von TGEV

an die sezernierten Muzine auf der Epitheloberflache, die nur schwach zu erkennen war. In

vivo sind vor allem die sezernierten Muzine fur eine Interaktion mit TGEV von Bedeutung,

die Muzingranula in den Becherzellen hingegen fur das Virus nicht zuganglich.

Die Bindung von TGEV an die Muzingranula war im Kryoschnitt sowohl im Bereich der

Zotten als auch im Bereich der Krypten vorhanden. Bei einer naturlichen TGEV-Infektion

werden die Epithelzellen im apikalen Bereich der Zotten von Jejunum und Ileum infiziert.

Das Virus breitet sich dann uber den Villus auf die weiter abwarts liegenden Epithelzellen

aus. Es werden somit die Zotten in ihrer gesamten Lange (bis auf die Basis), jedoch nicht

die Krypten infiziert (Pensaert et al., 1970; Saif, 1990). Der zellulare Rezeptor pAPN

wurde in Darmschnitten mit dem monoklonalen Antikorper G43 auf dem gesamten Vil-

lus nachgewiesen, in den Krypten hingegen nicht (Weingartl und Derbyshire, 1994).

Ohne pAPN ist eine erfolgreiche Virusreplikation nicht moglich, was erklart, wieso die

Krypten nicht infiziert werden konnen. In elektronenmikrographischen Scans des Darm-

6.5. Bedeutung der Sialinsaure-bindenden Aktivitat fur die Enteropathogenitat... 131

epithels ist die Dreidimensionalitat der Darmzotten gut zu erkennen. Das Darmepithel

ist von einer dicken Schleimschicht uberzogen, das Darmlumen mit dem im Abbau be-

findlichen Nahrungsbrei gefullt und der gesamte Inhalt ist durch die Darmperistaltik in

standiger Bewegung. Unter all diesen Gesichtspunkten ist es nicht verwunderlich, dass

die im Darmlumen befindlichen TGE-Virionen als erstes die Zottenspitzen infizieren und

sich erst dann auf die weiter abwarts liegenden Epithelzellen ausbreiten. Die Zottenspitze

ist am zuganglichsten und die Wahrscheinlichkeit der erfolgreichen Bindung an pAPN in

diesem Bereich am hochsten.

6.5 Bedeutung der Sialinsaure-bindenden Aktivitat

fur die Enteropathogenitat von TGEV

Die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV stellt einen Pathogenitatsfaktor dar, der fur

die Infektion in Zellkultur nicht erforderlich, fur die Infektion des Gastrointestinaltrakts

hingegen unerlasslich ist. In den letzten Jahren wurden fur viele Viren Corezeptoren be-

schrieben, die fur eine erfolgreiche Infektion erforderlich sind. Das Coronavirus MHV z.B.

scheint einen zweiten Rezeptor zur Penetration der zellularen Membranen zu benotigen

(Yokomori et al., 1993). Corezeptoren, die den Zelltropismus bestimmen, wurden z.B.

fur HIV-1 gefunden. Nach der primaren Bindung an CD4 entscheidet die Bindungsaffinitat

fur CXCR4 bzw. fur CCR5, ob der jeweilige HIV-Stamm T-Zellen bzw. Makrophagen in-

fiziert (Berson et al., 1996; Deng et al., 1996; Dragic et al., 1996; Feng et al., 1996).

Im Gegensatz zu HIV bestimmt bei TGEV die Sialinsaurebindungsaktivitat im ersten

Anheftungsschritt den Enterotropismus. Im zweiten Schritt kommt es zur Bindung an

den zellularen Rezeptor pAPN. Die Bindung an pAPN ist ein gemeinsames Merkmal

der enteropathogenen und der apathogenen Isolate (Delmas et al., 1993). Auch Unter-

suchungen anderer Arbeitsgruppen ergaben, dass der N-terminale Bereich des S-Proteins

von TGEV eine bedeutende Rolle fur den Enterotropismus spielt (Bernard und Laude,

1995; Ballesteros et al., 1997; Sanchez et al., 1999). In diesem Bereich des S-Proteins

ist die Sialinsaurebindungsaktivitat lokalisiert (Schultze et al., 1996; Krempl et al.,

1997). Die Enteropathogenitat von TGEV kann naturlich zusatzlich von weiteren Fak-

toren beeinflusst werden. So sind Feldstamme von enteropathogenen TGEV wesentlich

132 6. Diskussion

virulenter als Zellkultur-adaptierte Virustamme wie TGEV-PUR46 und TGEV-PUR115,

obwohl letztere eine Sialinsaurebindungsaktivitat besitzen und den Darmtrakt infizieren

konnen (Bernard und Laude, 1995; Ballesteros et al., 1997). Die Sialinsaurebin-

dungsaktivitat stellt auch bei dem Bakterium E. coli F5 einen Pathogenitatsfaktor dar.

Durch die Interaktion mit Sialinsauren im Bereich der Glykokalix oder assoziierter Mu-

zinschichten kann das Bakterium den Darmtrakt kolonisieren und seinen Abtransport mit

dem Darminhalt verhindern.

Welche Funktion hat die Sialinsaure-bindende Aktivitat im Rahmen der Enteropathoge-

nitat von TGEV?

Eine mogliche Funktion ware der Schutz der Viruspartikel durch gebundene Sialoglykokon-

jugate bei der Magen-Darm-Passage. Coronaviren sind behullte Viren, die i.d.R. empfind-

licher gegenuber schadigenden Einflussen von außen reagieren als unbehullte Viren. Die

Enteropathogenitat der Viren setzt eine Resistenz gegenuber den niedrigen pH-Werten im

Magen, den Verdauungsenzymen und den detergenzartigen Gallensalzen voraus. Unter-

suchungen haben ergeben, dass sich TGEV in seiner Empfindlichkeit gegenuber Trypsin

und niedrigen pH-Werten nicht von sialinsaurebindungsdefizienten Mutanten unterschei-

det (Krempl et al., 2000). Auch die Stabilitat der Viruspartikel gegenuber dem Deter-

genz Oktylglukosid ist bei TGEV-PUR46 im Vergleich zu den Mutanten nur geringgradig

erhoht. Bei TGEV-PUR115 und den sialinsaurebindungsdefizienten Epitop-D-Mutanten

konnte auch hier kein Unterschied in der Stabilitat der Viruspartikel festgestellt werden

(Krempl et al., 2000). Auch wenn sich die Bedingungen im Magen-Darm-Trakt von den

Testbedingungen in diesen Versuchen unterscheiden, sprechen die Ergebnisse dafur, dass

die Sialinsaurebindungsaktivitat keine große Rolle fur die Stabilitat der Viruspartikel bei

der Magen-Darm-Passage spielt. Vielmehr scheinen andere Faktoren, die auch bei den

sialinsaurebindungsdefizienten Mutanten z.B. eine erstaunlich hohe Resistenz gegenuber

niedrigen pH-Werten bewirken, fur die Stabilitat der Virionen verantwortlich zu sein.

Die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV scheint somit ihre Funktion als Pathoge-

nitatsfaktor in einer ersten Anlagerung der Viruspartikel an die Muzinschicht des Darms

zu haben. Sialinsaurebindungsdefiziente Mutanten wie die Mutante m10 konnen nicht

an diese Muzinschicht binden. Dies erklart die stark reduzierte Enteropathogenitat die-

ser Mutanten. Die Anlagerung an Muzine im Darmschleim erschwert ahnlich wie z.B.

6.5. Bedeutung der Sialinsaure-bindenden Aktivitat fur die Enteropathogenitat... 133

bei E. coli F5 den Abtransport der Virionen durch die Darmperistaltik. Der Mukus im

Darmtrakt hat die Aufgabe, die Epithelzellen vor Selbstverdau zu schutzen. Im Gegensatz

dazu muss das mukoziliare Transportsystem im Respirationstrakt die unteren Atemwege

von mit der Atemluft eingedrungenen Partikeln frei halten (Carlstedt et al., 1985). Die

Schleimhaut der unteren Atemwege ist steril. Im Darm hingegen gibt es eine physiologische

mikrobielle Flora, die u.a. die Mukosa vor pathogenen Mikroorganismen schutzt. Diese

unterschiedliche Funktion des Schleims zeigt schon, dass eine Bindung an Darmschleim fur

pathogene Mikroorganismen durchaus Vorteile fur eine erfolgreiche Infektion hat. Die Bin-

dung an die Schleimschicht des Atemtrakts hingegen ist eher von Nachteil, da es dadurch

zu einem schnelleren Abtransport der Mikroorganismen kommt. Auch der Darmschleim

kann einen Schutz vor potentiellen Krankheitserregern darstellen. Die Bindung an Muzi-

ne und andere kohlenhydratreiche Strukturen des Darmtrakts scheinen jedoch auch einige

Erreger fur sich zu nutzen.

Aus diesen Uberlegungen lasst sich fur eine Infektion des Darmtrakts mit TGEV folgendes

Modell ableiten:

1. Nach oraler Aufnahme und Passage durch den Magen binden die Viruspartikel uber

ihre Sialinsaurebindungsstellen an Muzine in der Schleimschicht, die die Darmmu-

kosa bedeckt.

2. Es kommt zu einem schrittweisen Durchdringen der Schleimschicht, wobei die Bin-

dung an Neu5Gc-tragende Muzine der dem Epithel nahen Schleimschicht eine große

Rolle spielt.

3. Die Viren gelangen zur Glykokalix, wo die Anheftung an Sialinsaure-tragende Mu-

zine ein weiteres Vordringen der Erreger bis zur Zellmembran ermoglicht.

4. Nach Erreichen der Epithelzelloberflache auf den Zottenspitzen kommt es zur Bin-

dung der Viruspartikel an pAPN. Dies bewirkt die Endozytose der Virionen (Hansen

et al., 1998).

5. Nach der Fusion der Endosomenmembran mit den viralen Membranen kommt es zur

Abgabe des Virusgenoms in die Zelle und zur Replikation (Hansen et al., 1998).

Die Virusreifung findet an den intrazellularen Membranen des intermediaren Kom-

134 6. Diskussion

partiments zwischen Endoplasmatischem Retikulum und Golgi-Apparat statt. Die

neuen Viruspartikel verlassen die Zelle.

6. Da TGEV spezifisch an bestimmte losliche Muzine bindet, kommt es trotz fehlen-

der Sialinsaure-spaltender Enzymaktivitat des Virus nicht zu einer Assoziation der

freigesetzten Virionen mit der Wirtszelle, sondern zur Abgabe der Partikel in den

Mukus des Darms.

7. Die Viruspartikel gelangen so zu Zotten, die noch nicht infiziert wurden, und konnen

ihren Replikationszyklus fortsetzen. Eine Infektion bereits erneuerter Epithelzellen

findet nicht statt, da die aus den Krypten nachwachsenden Zellen resistent gegenuber

einer TGEV-Infektion sind (Saif, 1990).

8. Die Virionen wandern, gebunden an losliche Muzine, mit dem Darmschleim Rich-

tung Dickdarm. Die Muzine werden im Rektum von verschiedenen Enzymen (Gly-

kosidasen, Sulfatasen, O-Acetylesterasen) abgebaut. Diese Enzyme werden von der

lokalen Bakterienflora sezerniert (Roussel und Lamblin, 1996). In den Faces ist

somit physiologischerweise kein Muzin mehr vorhanden. Die Viruspartikel werden

mit dem Faces abgegeben, konnen von anderen Tieren oral aufgenommen werden

und eine neue TGEV-Infektion verursachen.

Die Sialinsaurebindungsaktivitat stellt somit einen wichtigen Pathogenitatsfaktor des Vi-

rus der ubertragbaren Gastroenteritis der Schweine dar. Weitere Untersuchungen, wie

die Isolierung und Sequenzierung des hochmolekularen Sialoglykoproteins und genaue-

re Charakterisierung der Kohlenhydratanteile, konnen zur Identifizierung des Muzins im

porzinen Intestinaltrakt fuhren.

7. Zusammenfassung

Das ubertragbare Gastroenteritis-Virus (TGEV) ist ein typischer Vertreter der entero-

pathogenen Coronaviren. Es infiziert Schweine jeden Alters. Bei Saugferkeln kommt es

zu einer besonders schweren Gastroenteritis mit einer Mortalitatsrate von bis zu 100%.

Auf dem Oberflachenglykoprotein S von TGEV sind zwei Bindungsaktivitaten lokali-

siert. Die Bindung an den zellularen Rezeptor porzine Aminopeptidase N (pAPN) ist

fur die Infektion von Zellkulturen und auch im Wirtsorganismus unerlasslich. Uber die

zweite Bindungsaktivitat, deren aktives Zentrum im N-terminalen Bereich des S-Proteins

lokalisiert ist, interagiert TGEV mit den Sialinsaureresten von Glykokonjugaten, wobei

Neu5Gc bevorzugt gebunden wird. Diese Sialinsaurebindungsaktivitat ist zur Replikation

in Zellkultur nicht notwendig. Bei der Verursachung der ubertragbaren Gastroenteritis im

Schwein stellt sie jedoch einen wichtigen Pathogenitatsfaktor von TGEV dar, wie verglei-

chende Untersuchungen mit Mutanten zeigen.

Das Bakterium E. coli F5 bindet uber seine Fimbrien an Neu5Gc-tragende Strukturen im

Intestinaltrakt von Saugferkeln. Mit dieser Bindungsaktivitat kann es den Darm koloni-

sieren und eine schwere Diarrhoe verursachen. Als Rezeptor auf den Enterozyten fungiert

das Glykolipid Neu5Gc-GM3, welches nur bei neugeborenen Schweinen vorkommt. Der

Vergleich der Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV und E. coli F5 ergab, dass die Ag-

glutination von Rindererythrozyten durch diese beiden Krankheitserreger von intestinalen

Muzinen und Glykolipiden unterschiedlich gehemmt wird. Dieser Vergleich fuhrte zu dem

Schluss, dass TGEV und E. coli F5 auch im Darmtrakt des Schweines unterschiedliche

sialinsauretragende Strukturen zur Bindung nutzen. Da Glykolipide die Hamagglutinati-

on durch TGEV nicht messbar hemmen konnten, wurden die weiteren Untersuchungen

der Bindungspartner von TGEV auf Sialoglykoproteine konzentriert.

135

136 7. Zusammenfassung

TGEV wurde hinsichtlich seiner Interaktion mit Zellkulturzellen, intestinalen Muzinen

und Darmepithel untersucht. Die sialinsaurebindungsdefizienten Mutanten HAD3 und

m10 (stark reduzierte Enteropathogenitat) wurden bei diesen Untersuchungen verglei-

chend eingesetzt, um die Bedeutung der Sialinsaure-bindenden Aktivitat von TGEV bes-

ser verstehen zu konnen. TGEV erkannte zusatzlich zu pAPN ein hochmolekulares muzin-

artiges Sialoglykoprotein auf der Oberflache von ST- und LLC-PK1-Zellen. Die Bindung

der Virionen an die Zelloberflache war durch die Interaktion von TGEV mit diesem Pro-

tein um ca. das Sechsfache erhoht. Dies ließ der Vergleich mit den Mutanten HAD3 und

m10 erkennen, die mangels Sialinsaurebindungsaktivitat nur an pAPN binden konnten.

Um mit diesem muzinartigen Protein interagieren zu konnen, mussten die TGEV-Partikel

jedoch von auf der Oberflache haftenden Sialoglykokonjugaten zellularen Ursprungs be-

freit werden. Durch die Behandlung mit Neuraminidase aus Vibrio cholerae konnten die

Sialinsaurebindungsstellen auf den S-Proteinen von TGEV demaskiert und die Interaktion

mit dem hochmolekularen Sialoglykoprotein moglich gemacht werden.

TGEV konnte mit intestinalen Muzinen und Burstensaummembranen der Enterozyten des

Dunndarms interagieren. Die sialinsaurebindungsdefizienten Mutanten HAD3 und m10

banden nicht an die extrazellularen Muzine und konnten nur uber die Bindung an pAPN

mit den Burstensaummembranvesikeln (BSMV) interagieren. TGEV hingegen erkannte

uber seine Sialinsaurebindungsaktivitat zusatzlich ein hochmolekulares O-glykosyliertes

Sialoglykoprotein. Die Untersuchungen zu diesem Protein weisen darauf hin, dass es sich

um ein losliches Muzin handelt, welches in den Becherzellen des Jejunums produziert wird.

Dieses Muzin prasentiert die Sialinsaurereste in optimaler Form fur TGEV, so dass selbst

unbehandeltes, d.h. mit zellularen Sialoglykokonjugaten beladenes Virus an das Muzin

bindet. Die Unterschiede zwischen Saug- und Absetzferkeln in der Zusammensetzung die-

ser Muzine und in der Interaktion mit TGEV konnten eine Rolle fur den altersabhangigen

Verlauf der Gastroenteritis spielen.

Die Sialinsaurebindungsaktivitat von TGEV stellt einen wichtigen Pathogenitatsfaktor

dar, der fur die erfolgreiche Virusreplikation im Intestinaltrakt von Schweinen von ent-

scheidender Bedeutung ist. Die Funktion der Sialinsaure-bindenden Aktivitat scheint da-

rin zu bestehen, dass die Bindung von Virionen an Muzine im Darmschleim ermoglicht

und damit die Wahrscheinlichkeit, zum Rezeptor pAPN auf der Enterozytenoberflache

gelangen zu konnen, deutlich erhoht wird.

8. Summary

Christel Schwegmann-Weßels (2002):

Importance of the sialic acid binding activity for the enteropathogenicity of

transmissible gastroenteritis coronavirus (TGEV)

TGEV is a typical member of the enteropathogenic coronaviruses. It affects pigs of all ages

and causes gastroenteritis. Infection is most severe in suckling piglets with mortality rates

up to 100%. The surface glycoprotein S of TGEV has two binding activities. Binding to the

cellular receptor aminopeptidase N (pAPN) is required for the infection of both cultured

cells and pigs. The second binding activity, the active centre of which is localized in the

N-terminal region of the S protein, enables TGEV to interact with sialoglycoconjugates.

Neu5Gc is the type of sialic acid preferentially recognized by TGEV. The sialic acid

binding activity is dispensable for the replication in cultured cells. However, studies with

mutants indicated that binding to sialoglycoconjugates is an important pathogenicity

factor for the intestinal infection resulting in transmissible gastroenteritis of swine.

Escherichia coli F5 binds via its fimbriae to Neu5Gc-carrying structures in the intestinal

tract of suckling piglets. In this way, the bacterium can colonize the gut and cause severe

diarrhea. The receptor on enterocytes has been shown to be a glycolipid, Neu5Gc-GM3,

which is present only in newborn pigs. The comparison of the sialic acid binding activity of

TGEV and E. coli F5 showed that the agglutination of bovine erythrocytes by these two

pathogens is differentially inhibited by intestinal mucins and glycolipids. From the results

it was concluded that TGEV and E. coli F5 attach to different sialylated compounds in the

intestinal tract of pigs. As glycolipids could not inhibit the hemagglutination by TGEV,

the subsequent search for ligands recognized by TGEV was focussed on sialoglycoproteins.

TGEV was examined with respect to its interaction with cultured cells, intestinal mucins

137

138 8. Summary

and the intestinal epithelium. The mutants HAD3 and m10 that lack a sialic acid binding

activity have been used for comparison to better understand the importance of the viral

sialic acid binding activity. In addition to pAPN, TGEV recognized a high molecular

weight mucin-like sialoglycoprotein on the surface of ST and LLC-PK1 cells. The inter-

action with this protein enhanced the binding of the virions to the cell surface by a factor

of 6. This was evident from the comparison with the mutants HAD3 and m10, which

only bind to pAPN. For the efficient interaction with this mucin-like glycoprotein, TGEV

particles had to be separated from surface-bound sialoglycoconjugates of cellular origin.

The treatment of virions with neuraminidase of Vibrio cholerae unmasked the sialic acid

binding sites on the S proteins of TGEV and enabled strong interaction with the high

molecular weight sialoglycoprotein.

TGEV was found to interact with intestinal mucins and brush border membranes of

enterocytes derived from the small intestine. The mutants HAD3 and m10 did not bind

to extracellular mucins and could only interact with the brush border membrane vesicles

by binding to pAPN. TGEV on the other hand recognized a high molecular weight O-

glycosylated sialoglycoprotein. Analysis of this protein indicated that it is a soluble mucin,

which is produced in the goblet cells of the jejunum. The type, number, and steric presen-

tation of the sialic acid residues on this mucin appear to be optimal for interaction with

TGEV, because even virus not treated with neuraminidase, i.e. virions containing surface

bound cellular sialoglycoproteins, are able to bind to the mucin. The differences between

suckling and weaning piglets in the composition of these mucins and in their interaction

with TGEV may play a role for the age-dependent progression of the gastroenteritis.

The sialic acid binding activity of TGEV presents an important pathogenicity factor,

which is crucial for the successful viral replication in the intestinal tract of swine. Our

results indicate that the sialic acid binding activity allows the binding of virions to mucins

in the intestinal mucus. This interaction may enable TGEV to stay longer in the intestinal

tract, to get into contact with the epithelium, and to find the receptor pAPN on the

enterocyte surface.

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Abbildungsverzeichnis

1.1 Schematische Darstellung eines Coronaviruspartikels . . . . . . . . . . . . . 19

1.2 Schematische Darstellung der Epitope des S-Proteins . . . . . . . . . . . . 30

5.1 Neuraminidase-Sensitivitat der Erythrozytenrezeptoren . . . . . . . . . . . 79

5.2 Qualitative und quantitative Analyse des Sialinsauregehalts intestinaler

Muzine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5.3 Interaktion von TGEV mit Zellkulturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.4 Bindung an Membranproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

5.5 Bindung an Zelloberflachenproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

5.6 Bindung von isoliertem S-Protein an Zelloberflachenproteine . . . . . . . . 90

5.7 Bindung nicht desialylierter Virionen an Zelloberflachenproteine . . . . . . 91

5.8 Oberflachenproteine von ST-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.9 Sialinsaureabhangigkeit der Bindung von TGEV-NA an ST-Zellen . . . . . 93

5.10 Charakterisierung der Assoziation des Sialoglykoproteins mit der Plasma-

membran mittels Triton X-114-Phasenseparierung . . . . . . . . . . . . . 94

5.11 Spezifische Bindung von TGEV an das hochmolekulare Sialoglykoprotein . 95

5.12 Analyse der Sialinsauren der Muzine aus der Glandula submandibularis des

Schweines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

5.13 Interaktion von TGEV mit immobilisierten Muzinen . . . . . . . . . . . . . 98

161

162 Abbildungsverzeichnis

5.14 Sialinsaureabhangigkeit der Bindung von TGEV an intestinale Muzine . . 99

5.15 Bindung an intestinale Muzine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

5.16 Bindung an Muzine des Ferkels B und PSM . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

5.17 Qualitative Analyse des Sialinsauregehalts von BSMV . . . . . . . . . . . . 104

5.18 Bindung von TGEV-NA an Proteine aus BSMV . . . . . . . . . . . . . . . 105

5.19 Bindung von HAD3, m10 und TGEV an Proteine aus BSMV . . . . . . . . 107

5.20 Charakterisierung der Assoziation des Proteins mit der Burstensaummem-

bran mittels Triton X-114-Phasenseparierung . . . . . . . . . . . . . . . . 108

5.21 Nachweis des Kohlenhydratanteils in BSMV-Proteinen . . . . . . . . . . . 109

5.22 Erkennung von BSMV-Proteinen durch PNA . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

5.23 Bindung von TGEV-NA an mit Lektinen gefallte BSMV-Proteine . . . . . 111

5.24 Bindung von TGEV-NA an Dunndarmepithel . . . . . . . . . . . . . . . . 114

5.25 Bindung von TGEV und Mutanten an Dunndarmepithel . . . . . . . . . . 115

Tabellenverzeichnis

1.1 Serologische und phylogenetische Verwandschaft der Coronaviren . . . . . . 19

1.2 Coronaviren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.3 Ubersicht uber Eigenschaften der Epitop-D-Mutanten . . . . . . . . . . . . 32

1.4 Ubersicht uber bekannte Virusrezeptoren (Beispiele) . . . . . . . . . . . . . 36

5.1 Agglutination von Erythrozyten verschiedener Tierarten . . . . . . . . . . 78

5.2 Vergleich der Hemmaktivitaten von intestinalen Muzinen und Glykolipiden 83

5.3 Enzymanreicherungen durch die BSMV-Prapararation . . . . . . . . . . . . 102

163

Veroffentlichungen und Tagungsbeitrage

Teile der vorliegenden Arbeit wurden in folgenden Publikationsorganen veroffentlicht:

Schwegmann, C., G. Zimmer, T. Yoshino, M.-L. Enss und G. Herrler (2001):

Comparison of the sialic acid binding activity of transmissible gastroenteritis coronavirus

and E. coli K99. Virus Res. 75, 69–73.

Schwegmann, C., G. Zimmer und G. Herrler (2001):

Are intestinal mucins involved in the pathogenicity of transmissible gastroenteritis coro-

navirus? Adv. Exp. Med. Biol. 494, 219–223.

Schwegmann-Weßels, C., G. Zimmer, H. Laude, L. Enjuanes und G. Herrler (2002):

Binding of transmissible gastroenteritis coronavirus to cell surface sialoglycoproteins.

J. Virol. 76, 6037–6043.

Teile der vorliegenden Arbeit wurden auf folgenden Tagungen prasentiert:

Jahrestagung der Gesellschaft fur Virologie, Wien, 26.–29.04.2000.

Poster: Untersuchung der Sialinsaurebindungsaktivitat des ubertragbaren Gastroenteri-

tisvirus der Schweine (TGEV) — Vergleich zu E. coli F5 (K99).

Schwegmann, C., Zimmer, G. und Herrler, G.

VIIIth International Symposium on Nidoviruses (Coronaviruses and Arteriviruses),

Pennsylvania, USA, 20.–25.05.2000.

Kurzvortrag: Interaction of transmissible gastroenteritis coronavirus with intestinal sialo-

glycoconjugates.

Schwegmann, C. and Herrler, G.

6th International Symposium on Positive Strand RNA Viruses, Paris, 28.05.–02.06.2001.

Poster: Interaction of transmissible gastroenteritis coronavirus with glycoproteins of cul-

tured cells.

Schwegmann-Weßels, C., Zimmer, G. and Herrler, G.

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Georg Herrler fur die Uberlassung des Themas

und die hervorragende Betreuung und Unterstutzung wahrend der Durchfuhrung dieser

Arbeit.

Herrn Dr. Gert Zimmer danke ich fur die fachlichen Diskussionen und Anregungen und

fur seine Hilfe bei technischen Problemen im Labor.

Herrn Dr. B. Schroder und Herrn Prof. Dr. G. Breves aus dem Institut fur Physiolo-

gie mochte ich ganz herzlich fur die freundliche und hilfreiche Zusammenarbeit bei der

Besorgung von Darmproben sowie der Bereitstellung des Labors und der Technik zur Her-

stellung von BSMV danken. Frau M. Burmester und Frau G. Becker danke ich fur die

Unterstutzung bei der Arbeit im Labor des Instituts fur Physiologie.

Bei Frau Dr. M.-L. Enss aus dem zentralen Tierlabor der MHH bedanke ich mich fur

die gute Zusammenarbeit bei der Isolierung und Reinigung der intestinalen Muzine. Die

Bereitstellung des Labors und der Methodik waren sehr hilfreich. Frau R. Thrien danke ich

fur die tatkraftige Unterstutzung im Labor und die Durchfuhrung vieler Arbeitsschritte.

Durch ihre Hilfe blieb mir ein standiges Hin- und Herfahren zwischen TiHo und MHH

erspart.

Herrn PD Dr. A. Gruber aus dem Institut fur Pathologie mochte ich fur die Zusammen-

arbeit in histologischen Fragestellungen danken. Herrn K.-P. Kuhlmann danke ich fur die

Anfertigung der Kryoschnitte.

Ich mochte mich bei allen Mitarbeitern der AG Herrler und des gesamten Instituts fur

Virologie fur ihre Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima bedanken. Fur die gute

Stimmung im Labor danke ich vor allem meinen”Mit-Doktoranden“ Birthe, Brigitte,

Matthias und Wiebke. Des weiteren bedanke ich mich bei meinen”Ex-Kollegen“ Ina,

Linda, Holger und Oliver fur die schone Zeit im Labor.

Meinem Mann Peter gilt mein besonderer Dank fur seine moralische Unterstutzung

wahrend meiner Promotionszeit und seine technische Hilfe bei der Anfertigung der Dis-

sertation. Vor allem danke ich ihm dafur, dass er mich uberredet hat, diese Arbeit mit

LATEX zu schreiben.

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