Untersuchung von Endostatin freisetzenden ... · Aus der Klinik für kleine Haustiere der...

Aus der Klinik für kleine Haustiere

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten

zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die

Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Kerstin Kleinschmidt

aus Paderborn

Hannover 2006

Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. phil. nat. Stephan Steinlechner

Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2006

Fördernde Institutionen: International Neuroscience Institute

Hannover (INI) GmbH

Internationale Stiftung Neurobionik Hannover

Bundesministerium für Bildung und

Forschung (BMBF)

Meiner großartigen Familie

gewidmet

Abkürzungsverzeichnis

AGM-1470 Fumagillinanalogon CSF Zerebrospinalflüssigkeit

Ak Antikörper DMEM Dulbecco´s Modified Eagle

AP anterior-posterior Medium

zu Bregma DMSO Dimethylsulfoxid

Aqua dest. destilliertes Wasser DNA Desoxyribonucleinacid

Ba Barium DV dorso-ventral zu Bregma

bFGF basic Fibroblast EBNA Human Fetal Kidney Cells

Growth Factor ECB Endostatin CellBeads®

BHS Blut-Hirn-Schranke EGFR Epidermal Growth Factor

BHSC Baby Hamster Receptor

Kidney Cells EIA enzymatischer

Bm Bregma -1 mm mitte/ Immunoassay

Implantationskoordinate EMSC Endostatin sezernierende

mitte mesenchymale

Bo Bregma -1 oben/ Stammzellen

Implantationskoordinate EN Endostatin und

oben Tiernummer

BSA Bovines Serum Albumin eNOS endotheliale

BT4Ca Gliomzelllinie aus BDIX- Stickstoffoxidsynthasen

Ratten ES Embryonale Stammzellen

Bu Bregma -1 mm unten/ EtOH Ethanol

Implantationskoordinate FDA Federal Drug

unten Administration

Ca Kalzium Fm größte Fläche mitte

CB CellBead® Fo größte Fläche oben

CBs CellBeads Fu größte Fläche unten

CO2 Kohlenstoffdioxid G Guluronsäure

ga gauge KDR/Flk-1 Kinase Insert Domaine

GBM Glioblastoma multiforme Receptor/Fetal Liver

GCB Goldpartikel enthaltende Kinase CellBeads® kg Kilogramm

GFAP Glial Fibrillary Acidic KGW Körpergewicht Protein KH2PO4 Kaliumdihydrogen-

GLP Good Laboratory Practise phosphat

GLUTs Glutaminasen LCB leere CellBeads®

GZ Gliomzellen LM latero-medial zu Bregma

HCl Salzsäure M Mannuronsäure

H.E. Hämatoxylin-Eosin- µ Mikro

Färbung m molar

HIF-1 hypoxia-inducable-factor-1 MCP-1 Monocyte Chemoattractant

hMSC humane mesenchymale Protein-1

Stammzellen MEZ Mitteleuropäische Zeit

H2O2 Wasserstoffperoxid Mg Magnesium

hTERT humane Telomerase MHC Major Histocompatibility

Reverse Transkriptase Complex

i.c.v. intrazerebroventrikulär MHH Medizinische Hochschule

i.c. intrakraniell Hannover

IgE Immunglobulin E Min. Minute

IHC Immunhistochemie MRI Magnet Resonance

IL Interleukin Imaging

i. p. intraperitoneal MSC Mesenchymale

JPEG Joint Photographic Expert Stammzellen

Group MtOH Methanol

kD Kilo Dalton

Na2HPO4 Dinatriumhydrogen- TRS Target Retrieval Solution

phosphat U/Min. Umdrehungen pro Minute

NaCl Kochsalz VEGF Vascular Endothelial

O2 Sauerstoff Growth Factor

OT Objektträger Vol Volumen

p Piko vWF von-Willebrand-Faktor

PBS Phosphate Buffered Saline Ztm zentrales Tierlaboratorium

PDGF Platelet-Derived Growth der MHH

Factor ZZ Zellzahl

PFA Paraformaldehyd

PKB Proteinkinase B

PP Polypropylen

r² Pearssonscher

Korrelationskoeffizient

ROI Region of Interest

RT Raumtemperatur

s.c. subkutan

SCB Stammzell CellBeads®

SD Standardabweichung

Sek. Sekunde

SEM Standardfehler

SPIO superparamagnetische

Eisenoxide

SYBR Cyaninfluoreszenzfarbstoff

SZ Stammzellen

TIFF Target Image File Format

TIMP-1 Matrixmetalloproteinase-1

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung.............................................................................................1

2 Literaturübersicht................................................................................3

2.1 Glioblastoma multiforme................................................................................ 3

2.1.1 Einführung .................................................................................................. 3 2.1.2 Histologie.................................................................................................... 5 2.1.3 Pathophysiologische Grundlagen............................................................... 6 2.1.4 Einteilung der Gliome und Diagnostik......................................................... 7 2.1.5 Klinisch-therapeutische Konsequenzen...................................................... 8 2.1.6 Neue Behandlungsansätze ...................................................................... 10 2.1.7 Glioblastome bei Hund und Katze ............................................................ 11

2.2 Experimentelles Glioblastom-Modell .......................................................... 14

2.3 Angiogenese ................................................................................................. 16

2.3.1 Einführung ................................................................................................ 16 2.3.2 Angiogenese im Glioblastoma multiforme ................................................ 17 2.3.3 Therapieansätze zur Hemmung der Angiogenese ................................... 19

2.4 Endostatin ..................................................................................................... 21

2.4.1 Einführung ................................................................................................ 21 2.4.2 Wirkungen ................................................................................................ 23 2.4.3 Therapeutischer Einsatz........................................................................... 27

2.5 Mikrokapseln zur intrazerebralen Gliomtherapie ....................................... 29

2.5.1 Einführung ................................................................................................ 29 2.5.2 Verkapselungsmaterial: Alginat ................................................................ 33 2.5.3 Biokompatibilität ....................................................................................... 35 2.5.4 Therapeutischer Einsatz........................................................................... 37

2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit......................................................................... 39

3 Untersuchungsgut und Methoden...................................................41

3.1 Tiere ............................................................................................................... 41

3.1.1 Herkunft.................................................................................................... 41 3.1.2 Haltung und Fütterung.............................................................................. 41 3.1.3 Narkose und Analgesie ............................................................................ 42

3.2 Implantate: CellBeads®................................................................................. 43

3.2.1 Herkunft.................................................................................................... 43 3.2.2 Verkapselungstechnologie ....................................................................... 45

3.3 Gliomzelllinie BT4Ca..................................................................................... 46

3.3.1 Herkunft.................................................................................................... 46 3.3.2 Syngenität ................................................................................................ 46

3.4 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen .............................................. 47

3.4.1 Etablierung des Models ............................................................................ 47 3.4.1.1 Tumorzellinokulation .......................................................................... 47 3.4.1.2 CellBead® Implantationen .................................................................. 48 3.4.1.3 Zweizeitige Operation ........................................................................ 49

3.4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des Endostatins ...................................... 50 3.4.2.1 Gruppe I: Kontrollgruppe Gliom (BT4Ca)........................................... 50 3.4.2.2 Gruppe II: Gliom (BT4Ca) und leere CellBeads® (LCB)..................... 51 3.4.2.3 Gruppe III: Gliom (BT4Ca) und Endostatin CellBeads® (ECB)........... 51 3.4.2.4 Gruppe IV: Gliom (BT4Ca) und Stammzell CellBeads® (SCB) .......... 51

3.5 Versuchsdurchführung ................................................................................ 53

3.5.1 Zellkultur................................................................................................... 53 3.5.1.1 Kultivierung der Gliomzellen .............................................................. 54 3.5.1.2 Kryokonservierung der Gliomzellen ................................................... 55 3.5.1.3 Auftauen der Gliomzellen................................................................... 56 3.5.1.4 Vitalzellzählung .................................................................................. 56

3.5.2 Behandlung der Gliomzellen vor der Implantation.................................... 57 3.5.3 Behandlung der CellBeads® vor der Implantation .................................... 59 3.5.4 Stereotaktische Implantationstechnik ....................................................... 60

3.5.4.1 Stereotaktische Implantation der Gliomzellen .................................... 62 3.5.4.2 Stereotaktische Implantation der CellBeads®..................................... 63

3.6 Neuropathologische Untersuchungen ........................................................ 65

3.6.1 Transkardiale Perfusionsfixierung ............................................................ 66 3.6.2 Nachfixierung ........................................................................................... 67 3.6.3 Kryobehandlung ....................................................................................... 67 3.6.4 Gefrierschnitte .......................................................................................... 68 3.6.5 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)........................................................... 70 3.6.6 Immunhistochemische Färbungen (IHC) .................................................. 71

3.6.6.1 Von-Willebrand-Faktor (vWF) ............................................................ 73 3.6.6.2 Endostatin .......................................................................................... 73

3.6.7 Mikroskopische Auswertung..................................................................... 74 3.6.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) zur Etablierung des Modells ....... 75 3.6.7.2 Immunhistologischer Nachweis des Endostatins ............................... 75 3.6.7.3 Immunhistologie zur Untersuchung der Tumorvaskularisierung ........ 76 3.6.7.4 H.E.-Färbung zur Untersuchung der Tumorgrößen ........................... 77

3.7 Statistische Auswertung .............................................................................. 79

4 Ergebnisse .........................................................................................81

4.1 Entwicklung des Versuchsmodells ............................................................. 81

4.1.1 Zellkultur................................................................................................... 81 4.1.1.1 Kultivierung ........................................................................................ 81 4.1.1.2 Vitalzellzahl ........................................................................................ 81

4.1.2 Experimentelles Glioblastom .................................................................... 82 4.1.2.1 Bildtafel 1 ........................................................................................... 85

4.1.3 Koordinaten zur intrazerebroventrikulären Implantation der CellBeads® .. 86 4.1.4 Koordinaten für die BT4Ca-Inokulation und zweizeitige Operation .......... 88

4.1.4.1 Bildtafel 2 ........................................................................................... 90

4.2 Untersuchung der Wirksamkeit ................................................................... 91

4.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate................................................... 91 4.2.2 Nachweis der Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®........................ 91

4.2.2.1 Bildtafel 3 ........................................................................................... 93 4.2.3 Untersuchung der Tumorvaskularisierung................................................ 94

4.2.3.1 Bildtafel 4 ........................................................................................... 99 4.2.4 Untersuchung der Tumorvolumina ......................................................... 104

4.2.4.1 Bildtafel 5 ......................................................................................... 105 4.2.5 Korrelation zwischen Tumorvolumen und Blutgefäßdichte..................... 107

5 Diskussion .......................................................................................109

5.1 Diskussion der Methodik............................................................................ 109

5.1.1 Tierexperimentelles Modell..................................................................... 109 5.1.1.1 Gliomzelllinie BT4Ca........................................................................ 109 5.1.1.2 Histologie des Tumors ..................................................................... 110 5.1.1.3 Intrazerebroventrikuläre Implantation der CellBeads® ..................... 111 5.1.1.4 Biokompatibilität der implantierten CellBeads® ................................ 112

5.1.2 Untersuchungsmethoden ....................................................................... 113 5.1.2.1 Immunhistologische Untersuchung der Endostatinfreisetzung ........ 113 5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung der Endostatin CellBeads®................... 114

5.2 Diskussion der Ergebnisse der Wirksamkeitsuntersuchung.................. 118

5.2.1 Endostatinfreisetzung aus den CellBeads® ............................................ 118 5.2.2 Wirksamkeit der Endostatin sezernierenden CellBeads® ....................... 119

5.2.2.1 Immunhistologisch dargestellte Blutgefäßdichte .............................. 120 5.2.2.2 Tumorvolumina und Korrelation mit der Blutgefäßdichte ................. 123

5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung ............................................................ 127

6 Zusammenfassung..........................................................................130

7 Summary ..........................................................................................132

8 Literaturverzeichnis ........................................................................134

9 Anhang.............................................................................................164

9.1 Bezugsquellen............................................................................................. 164

9.1.1 Versuchstiere ......................................................................................... 164 9.1.2 Allgemeiner Bedarf und OP-Bedarf ........................................................ 164 9.1.3 Verbrauchsmaterialien Zellkultur ............................................................ 166 9.1.4 Verbrauchsmaterialien Histologie und Immunhistologie ......................... 167 9.1.5 Geräte und Software .............................................................................. 169

9.2 Reagenzien .................................................................................................. 172

9.2.1 Färbungen .............................................................................................. 172 9.2.2 Perfusionsfixierung................................................................................. 172 9.2.3 Zellkultur................................................................................................. 173

9.3 Färbeprotokolle ........................................................................................... 174

9.3.1 Färbeprotokoll Hämatoxylin-Eosin-Färbung ........................................... 174 9.3.2 Färbeprotokoll Immunhistologie ............................................................. 175

9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung ..................................................... 176

9.5 Statistik ........................................................................................................ 180

9.5.1 Vaskularisierungsdichte.......................................................................... 180 9.5.2 Tumorgrößen.......................................................................................... 191 9.5.3 Korrelationen zwischen Vaskularisierung und Tumorvolumina .............. 193

9.6 Danksagung ................................................................................................ 195

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Tumorerkrankungen stellen nach den Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste

Todesursache dar. Etwa 27% der Bevölkerung sterben infolge neoplastischer

Entartungen. 1-2% der beim Menschen auftretenden Tumoren sind Neoplasien des

Zentralnervensystems und zirka 15 bis 30% davon sind Glioblastome. Das

Glioblastoma multiforme ist ein auf die proliferative Entartung von Gliazellen

zurückzuführender Gehirntumor. Es nimmt innerhalb weniger Wochen enorme

Ausmaße an und führt über die mit seinem das gesunde Gehirngewebe

verdrängenden Wachstum einhergehenden neurologischen Symptome zum Tod.

Nach Diagnosestellung liegt die mittlere Überlebenszeit bei 12 bis 15 Monaten. Da

das Glioblastom infiltrierend wächst, ist eine chirurgische Resektion des kompletten

Tumorgewebes in der Regel nicht möglich und es kommt fast immer zur Ausbildung

eines Rezidivs. Sowohl Zytostatikagaben und Immuntherapien als auch

strahlentherapeutische Interventionen führen bestenfalls zu einer Verlangsamung

des Glioblastomwachstums, so dass die Prognose trotz der Anwendung aller klinisch

genutzten kurativen Behandlungsoptionen als infaust zu beurteilen ist.

Die Proliferation der Gliomzellen geht mit einer tumorinduzierten kapillaren

Blutgefäßneubildung einher. Das Größenwachstum des Glioblastoma multiforme ist

dabei auf Grund des gesteigerten Sauerstoff- und Nährstoffumsatzes von der

Neoangiogenese abhängig (FOLKMAN 1990). Endostatin ist ein 22kD großes

endogenes Protein, das über noch nicht restlos geklärte Mechanismen selektiv

gegen die neovaskuläre Endothelzellproliferation wirkt (OU-YANG et al. 2006). Seine

antiangiogene Potenz und sein selektiver und somit im Vergleich zu anderen

Tumortherapien nahezu nebenwirkungsfreier Effekt machen Endostatin zu einem

geeigneten Glioblastomtherapeutikum. Da Endostatin eine kurze Halbwertszeit von

unter 12 Stunden hat und zudem die Blut-Hirn-Schranke den Zielort gegen das

Kreislaufsystem abschirmt, ist eine systemische Applikation des Wirkstoffs nicht

geeignet, um ausreichend hohe Dosen innerhalb des Gehirns zu erzielen

(BJERKVIG et al. 2003).

2 1 Einleitung

Humane mesenchymale Stammzellen sind mittels eines einfachen Eingriffs aus dem

Knochenmark zu gewinnen und lassen sich gentechnisch so modifizieren, dass sie

dauerhaft Endostatin sezernieren. Die Verkapselung solcher Wirkstoff

produzierender Zellen mit einer für Nährstoffe, Sauerstoff und Endostatin

durchlässigen, aber gegen die Bestandteile des Empfängerimmunsystems

abschirmenden Alginatmatrix ermöglicht die intrazerebrale Applikation (MARKUSEN

et al. 2006). Diese „Bioreaktoren“ ermöglichen die anhaltende Produktion von

Endostatin direkt am Zielort. Die verkapselten Stammzellen weisen dabei trotz

erhaltener Vitalität und Sekretionsleistung eine stark eingeschränkte

Proliferationsrate mit 1 bis 2 Zellteilungen nach der Verkapselung auf. Von READ et

al. (2001) und in einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit (BARTSCH 2005)

konnte gezeigt werden, dass die zirka 600 µm großen Mikrokapseln nach

tierexperimenteller intrazerebraler Implantation von xenogenen Zellen gut

biokompatibel waren und keine Abstoßungsreaktionen der Empfängertiere

aufwiesen. In dieser Arbeit sollte die Endostatinfreisetzung nach

intrazerebroventrikulärer Implantation solcher vitale, sekretionsaktive Stammzellen

enthaltender Alginatkapseln im Rattenmodell gezeigt werden. Zudem sollte die

Wirksamkeit der als CellBeads® bezeichneten, von der Firma CellMed AG (Alzenau,

Deutschland) hergestellten Mikrokapseln auf ein experimentelles Glioblastom

untersucht werden. Dabei sollten als Voraussetzung für die klinische Anwendung

unter den Bedingungen der Good Laboratory Practice (GLP) die Auswirkungen auf

die intratumorale Vaskularisierungsdichte und das Tumorwachstum quantifiziert

werden.

2 Literaturübersicht 3

2 Literaturübersicht

2.1 Glioblastoma multiforme

2.1.1 Einführung

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der am häufigsten vorkommenden und

gleichzeitig am aggressivsten wachsenden Tumoren des Gehirns. Es nimmt seinen

Ursprung in den Gliazellen. Die derzeitige Klassifizierung durch die World Health

Organisation (WHO) führt das GBM als ein Grad IV Gliom auf (KLEIHUES et al.

2002). Nach der WHO-Klassifikation werden die Hirntumoren unterteilt nach ihren

jeweiligen Ursprungszellen und die Gliome somit in Astrozytome, Oligodendrogliome

und Mischtumoren eingeteilt. Darüber hinaus wird der histologische Malignitätsgrad

zur Klassifizierung herangezogen, wobei „low-grade“- (Malignitätsgrad I und II) von

„high-grade“-Tumoren (Malignitätsgrad III und IV) unterschieden werden (WIESTLER

u. SCHMIDT 1998).

Tabelle 1 Einteilung der high-grade Tumoren nach WHO

Malignitätsgrad Gliatumoren WHO-Klassifikation

III IV

Anaplastisches Astrozytom + Astrozytäre

Tumoren Glioblastoma multiforme +

Oligodendrogliome Anaplastisches Oligodendrogliom +

Mischgliome Anaplastisches Oligoastrozytom + Nach der Einteilung der Tumorarten von KERNOHAN u. SAYRE (1952) werden

Astrozytome, Ependymome und Oligodendrogliome in einer 4-Punkte-Skala

entsprechend ihrer Malignität klassifiziert (NATAF et al. 2005).

4 2 Literaturübersicht Dabei stellen Astrozytome vom Grad 3 und 4, auch als Glioblastoma multiforme

bezeichnet, etwa 50% aller Gliome dar. Etwa 1-2% aller beim Menschen

vorkommenden Neoplasien sind Tumoren des Zentralnervensystems (ZNS).

Die neuroektodermalen Tumoren, insbesondere die Glioblastome, bilden hierbei

noch vor den Angiomen und den Meningiomen die größte Gruppe mit einem Anteil

von 15-30% aller Tumoren im Gehirn.

Glioblastome zeichnen sich durch ihr schnelles Wachstum aus. Sie infiltrieren diffus

in benachbarte Strukturen, so dass eine komplette chirurgische Resektion in der

Regel nicht gelingen kann, sondern Resttumorgewebe im Gehirn verbleibt (DHAYAT

u. GUGGEMOS 1999/2000). Häufig nehmen sie enorme Ausmaße an, bevor

Symptome auftreten. Zu den ersten klinischen Symptomen gehören starke, meist

nicht medikamentös zu beeinflussende Kopfschmerzen, Sehstörungen, epileptische

Anfälle, Lähmungserscheinungen, Sprachstörungen, Bewusstseinseintrübung,

Beeinträchtigungen des Erinnerungsvermögens und der Sensorik sowie

Persönlichkeitsveränderungen (BRUCE et al. 2005).

Hochmaligne Gliome und diffus intrinsische Ponsgliome haben eine infauste

Prognose (JOHANNESEN et al. 2002). Die mittlere Überlebenszeit nach der

Diagnosestellung beträgt trotz intensiver chirurgischer, radio- und

chemotherapeutischer Interventionen derzeit selten mehr als 12 bis 15 Monate und

nur 8-12% der Betroffenen überleben bis zu zwei Jahren oder länger (KIOI et al.

2006).

Die Inzidenz der Glioblastome liegt bei etwa 1 bis 3 Krankheitsfällen pro 100.000

Einwohner, dies entspricht etwa 4000 bis 5000 Neuerkrankungen pro Jahr in

Deutschland. 60% der primären Glioblastome treten bei Erwachsenen älter als 50

Jahre auf (BRUCE et al. 2005). In einer klinischen Studie von 1976 lag der Anteil der

betroffenen Kinder bei 8,8% (DOHRMANN et al.1976).


2.1.2 Histologie

Die Histogenese der Glioblastome nimmt ihren Ursprung in den Gliazellen. Die

Gesamtheit der Gliazelle mit ihren das Stützgewebe bildenden Ausläufern wird als

Glion bezeichnet. Zu den Gliazellen zählen verschiedene Zelltypen mit

verschiedenen physiologischen Aufgaben im Zentralnervensystem. Astrozyten

übernehmen Stütz- und Versorgungsfunktionen, die Mikroglia ist Bestandteil des

Abwehrsystems, Zellen der Oligodendroglia bilden die Markscheiden im zentralen

Nervensystem und Schwannsche Zellen umscheiden die peripheren Nervenfasern.

Astrozyten sind neben den Endothelzellen die Zellen des Zentralnervensystems, die

unter physiologischen Umständen zur Proliferation befähigt sind. Der Zellumsatz liegt

dann bei weniger als 1%. Neuere Arbeiten weisen daraufhin, dass auch andere nicht

neoplastisch entartete Zelltypen des ZNS, insbesondere Neurone zur Neogenese in

der Lage sind (YAMASHITA et al. 2006, WRIGHT et al. 2006). Kommt es zu einer

Störung der regulären Proliferations- und Apoptosemechanismen, kann es zur

tumorösen Entartung von Astrozyten oder Zellen der Oligodendroglia kommen, die

dann Grundlage für ein Astrozytom, Oligodendrogliom oder einen Mischtumor als

Endstadium dieser Veränderung darstellen. Der Anteil der proliferierenden und damit

die Wachstumsrate des Tumors bestimmenden Gliomzellen beträgt etwa 15 bis 30%.

Trotz einer hohen Zellverlustrate von 10 bis 80% verdoppelt sich das Tumorvolumen

alle 40 bis 50 Tage (HOSHINO 1984). Das Glioblastoma multiforme stellt sich

makroskopisch vielfältig mit Nekrosebezirken, stark vaskularisierten Bereichen und

mit teilweise großen durch Einblutungen hervorgerufenen Kavernen dar. Typisch ist

die glasige, weiche, teilweise zerfließende Textur. Am häufigsten zeigen sich

zerebello-medullär gelegene Gliome im frontotemporalen Bereich, die sich bei

Diagnosestellung oft schon über den die Gehirnhälften verbindenden Balken hinaus

bis in die andere Hemisphäre ausgedehnt haben (Schmetterlingsgliom).Histologisch

stellt sich das Glioblastom im entdifferenzierten Zustand mit einem weitgehend

pleomorphen Zellbild dar, welches durch zahlreiche Mitosen, aber auch funktionale

Zellen gekennzeichnet ist.

6 2 Literaturübersicht Zudem zeigen sich perifokal ödematisierte Strukturen und nekrotische Bereiche

werden von solchen mit deutlich erhöhter Zelldichte - so genannten Pseudopalisaden

- umgeben.

Dazu kommen Gefäßneubildungen, die durch ihre vermehrte Anzahl, abnorme

Größe und auftretende glomeruläre Strukturen gekennzeichnet sind (WAGGENER et

al. 1976). Die Blutgefäße innerhalb eines Glioblastoms weisen eine endotheliale

Hyperplasie von bis zu zehn Endothelzellen in einem Gefäßquerschnitt auf, sind

gewunden und zum Teil fenestriert (BREM et al. 1972).

2.1.3 Pathophysiologische Grundlagen

Wie GREENE u. HARVEY 1964 bereits zeigten, kommt es in der Regel nicht zur

Entstehung tumorferner Metastasen, da abgeschwemmte Gliomzellen nicht an den

Gefäßendothelien haften, in andere Gewebe einwandern und auch nicht

proliferationsfähig anwachsen können.

Die Vaskularisierungsdichte und Morphologie der Tumorblutgefäße sind

Malignitätskriterien zur Abgrenzung zwischen Gliomen der Grade III und IV nach

WHO und stellen außerdem ein entscheidendes prognostisches Kriterium dar (LEON

et al. 1996). So dient die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die sich aus Kapillarendothel,

Basalmembran und Oberflächenmembranen der Astrozytenausläufer

zusammensetzt, in physiologischer Weise als Stoffwechselbarriere, die passiv nur

von niedermolekularen lipophilen Substanzen passiert werden kann. Bei

pathologischen Veränderungen wie Fieber, durch Bakterientoxine, aber auch durch

den Einfluss von Neoplasien kann es zu einer erhöhten Permeabilität und in Folge

dessen zur Ödembildung kommen. Die korrelierend mit dem Glioblastoma multiforme

neugebildeten Blutgefäße weisen Strukturveränderungen auf, die mit einer Störung

der BHS einhergehen.

2 Literaturübersicht 7 Sie weisen eine geringere Dichte ihres Zellverbandes mit aufgelockerten Tight

Junctions und einer veränderten Transporterproteinexpression auf, die wiederum auf

die Wirkung des vermehrt freigesetzten "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF)

zurückgeführt wird (ESSER et al. 1998). Aus der vermehrten Durchlässigkeit der

Gefäße, der damit einhergehenden Ödematisierung und dem gleichzeitig innerhalb

des knöchernen Schädels zunehmenden Tumorvolumen resultiert eine Steigerung

des Gehirndrucks. Die damit einhergehende Kopfschmerzsymptomatik wird vom

Patienten meist zuerst wahrgenommenen.

2.1.4 Einteilung der Gliome und Diagnostik

Die Definition hochgradiger Gliome basiert auf histologischen Kriterien. Klinisch

erfolgt diese Klassifizierung anhand von Probebiopsien oder reseziertem

Tumorgewebe. Neben der astrozytären oder oligodendrogliären Differenzierung der

Tumorzellen werden vor allem die Merkmale der Malignität beurteilt: zelluläre

Anaplasie, mitotische und apoptotische Figuren, hohe Zelldichte,

Blutgefäßneubildung und -struktur sowie Anzahl und Ausdehnung von intratumoralen

Nekrosen (KLEIHUES u. SOBIN 2000). Die Zellen des Glioblastoma multiforme

stellen sich als anaplastische, wenig differenzierte, runde oder pleomorphe Zellen mit

teilweise mehreren meist atypischen Zellkernen dar (REARDON u. WEN 2006).

Klinisch werden Gliome in erster Linie radiomorphologisch mittels

Computertomographie (CT) und Magnetresonaztomographie (MRT) klassifiziert, da

gerade bei Hirnstammgliomen die Morbidität in Folge von Resektionen hoch und

außerdem die prognostische Relevanz der Histomorphologie gering ist. Hierbei

werden typische diffuse intrinsische Ponsgliome, typische Mittelhirngliome, dorsal

exophytische zerebello-medulläre Gliome und untypische Hirnstammgliome

unterschieden.

8 2 Literaturübersicht Zur Planung des therapeutischen Vorgehens und der Beurteilung der prognostischen

Aussichten nach einer operativen Tumorentfernung oder -reduktion werden vor allem

die Ausdehnung und Lokalisation der Neoplasien in CT und MRT dargestellt und

bewertet.

Neue molekularbiologische und immunhistologische Möglichkeiten der Diagnostik

erlauben die Darstellung von durch die Tumorzellen exprimierten Proteinen, die nicht

nur als Proliferations-, sondern auch als Identifikationsmerkmale nutzbar sind

(FACOETTI et al. 2006).

2.1.5 Klinisch-therapeutische Konsequenzen

Derzeit beschränkt sich die Therapie auf ein massives palliatives Vorgehen mit einer

chirurgischen Tumorresektion, der eine Strahlen- und/ oder Chemotherapie folgen.

Die komplette Resektion des Tumors ist auf Grund seines diffus-infiltrativen

Wachstums in der Regel ausgeschlossen, so dass der Operationserfolg auf die

Tumorreduktion beschränkt bleibt (BELLO et al. 2002). KIRSCH et al. (2000a)

beschrieben, dass das Glioblastom Metastasen hemmende Proteine sezerniert und

es durch die operative Reduktion des Primärtumors auf Grund des Wegfalls dieser

Proliferation hemmenden Wirkung zu einer Erhöhung der Rezidivrate kommen kann.

MAUFFREY (2006) zeigte aber, dass die radikale Operation direkt im Anschluss an

die Diagnosestellung die einzig wirksame Therapie ist. Sie führt eindeutig zu einer

Lebenszeitverlängerung bei im Gegensatz zur systemischen Chemo-

therapeutikagabe weitgehend erhaltener Lebensqualität. Dennoch birgt der Eingriff

Risiken wie körperliche und geistige Einbußen mit einer bei der Resektion von

Stammhirngliomen hohen Mortalität und auf Grund der sehr hohen Rezidivrate einer

mittleren Überlebenszeit von nur 12 bis 15 Monaten (BARKER et al. 1998, RAINOV

et al. 2006)

2 Literaturübersicht 9 STEWART ermittelte 2002 im Rahmen eines Reviews über die generelle

systemische Verabreichung von Chemotherapeutika bei Glioblastoma multiforme

Patienten eine Verlängerung der mittleren Überlebenszeit von 2 Monaten. BOIARDI

et al. (1999) stellten anhand einer klinischen Studie fest, dass die Überlebenszeit bei

lokal behandelten Glioblastompatienten mit 21 Monaten im Vergleich zu 15 Monaten

bei ausschließlich systemisch mittels Chemotherapeutika (Cisplatinum) behandelten

Patienten verlängert war. ANDERSEN et al. (2006) beschrieben zudem, dass auch

eine radiotherapeutische Behandlung lediglich mit einer Verlangsamung des

Krankheitsprozesses verbunden war, das Tumorvolumen aber stetig weiter zunahm.

Trotz zahlreicher Therapieansätze hat es nach DEORAH et al. (2006) seit den

achtziger Jahren durch die Anwendung der bis heute klinisch eingesetzten

Behandlungsmethoden keine signifikante Steigerung in den Überlebensraten bei

Glioblastompatienten gegeben.

Auf Grund dessen befassen sich aktuelle Untersuchungen mit dem Einsatz neuer

Therapien wie zum Beispiel der Immuntherapie, Radioimmuntherapie oder der

Beeinflussung der Neovaskularisierung (Antiangiogenese), insbesondere unter dem

Gesichtspunkt der Entwicklung lokaler Applikationsmöglichkeiten.

10 2 Literaturübersicht

2.1.6 Neue Behandlungsansätze

Einen neuen therapeutischen Ansatz zeigen Methoden aus dem Bereich der

Nanotechnologie und der Mikroverkapselung auf. Hier sind viele verschiedene

Möglichkeiten der Bekämpfung von Gehirntumoren in der Entwicklung, zu denen

sowohl lokale Immuno- und Radiotherapie, der Einsatz von Neuronen generierenden

Zellen als auch der von „Medikamentenpumpen“ gehört. Vorteil all dieser

Behandlungsansätze ist, dass sie direkt am Zielort in hohen Dosen wirken (DUNN u.

BLACK 2003). Dabei kommen minimal invasiv implantierbare Mikrokapseln und so

genannte „Bioreaktoren“ zum Einsatz. Diese enthalten verkapselte Wirkstoffe oder

Wirkstoff sezernierende Zellen und lassen so eine genaue und sichere Applikation

von therapeutischen Substanzen selbst an schwer zugänglichen Orten wie dem

operativ kaum erreichbaren Hirnstammgliom zu. BRANNON-PEPPAS u.

BLANCHETTE (2004) beschrieben mehrere Studien aus den vergangenen fünf

Jahren, die aufzeigten, dass diese als Medikamententransporter genutzten

Implantate die Applikation eines breiten Wirkstoffspektrums ermöglichten, das von

Chemotherapeutika über Angiogenesehemmer bis hin zu Radio- und

Immuntherapeutika reichte.

Die hohe Vaskularisierungsdichte des Tumors ist ein therapeutisch genutzter

Angriffspunkt. Ziel ist, die Versorgung des Tumors mit Nährstoffen und Sauerstoff zu

unterbinden, indem man antiangiogenetisch auf ihn einwirkt.

Die Folgen sind sowohl eine Tumorreduktion als auch eine langfristige

Wachstumshemmung (SON et al. 2006). Gerade im letzten Jahrzehnt wurden viele

antiangiogenetisch wirkende Proteine und ihre Wirkung auf das Wachstum von

Neoplasien untersucht. Im experimentellen Einsatz und teilweise auch bereits in der

klinischen Erprobungsphase sind Endothelzellen supprimierende Proteine wie zum

Beispiel Angiostatin, Endostatin, Avicine, Interleukin-12, Flavopiridol und Interferon

alpha. Ziel ist die minimal invasive Applikation direkt in den Tumor, um sowohl die

Blut-Hirn-Schranke zu umgehen als auch den Verlust durch Metabolisierung zu

minimieren (BRANNON-PEPPAS u. BLANCHETTE 2004).

2 Literaturübersicht 11 Bei der Anwendung des Gamma-Knifes, das auch als „Strahlenskalpell“ bezeichnet

wird und im Jahre 1968 von LEKSEL erstmalig eingesetzt wurde, werden mittels γ-

Strahlung sowohl die Tumorzellen selbst als auch die Endothelzellen der sie

versorgenden Gefäße dauerhaft geschädigt. Die Nebenwirkungen sind auf Grund der

bei einer Abweichung von nur 0,3 mm sehr hohen Präzision, mit der man auf die

neoplastischen Gewebe einwirken kann, gering. HSIEH et al. (2005) zeigten in einer

Retrospektivstudie über 5 Jahre eine allgemeine verlängerte mittlere Überlebenszeit

von 16,7 Monaten bei mittels Gamma-Knife strahlentherapierten Patienten, die

neben der direkten Tumorzellschädigung ebenfalls auf die Zerstörung

proliferierender Blutgefäße und die Unterversorgung der Gliomzellen zurückgeführt

wird.

2.1.7 Glioblastome bei Hund und Katze

Tumoren des zentralen Nervensystems sind beim Hund nicht so selten, wie lange

Zeit angenommen, bei der Katze treten sie häufig auf. Wie beim Menschen sind die

Folgen für das betroffene Tier unabhängig vom Malignitätsgrad der Neoplasie auf

Grund der Verdrängung funktionellen Gehirngewebes drastisch (NOLTE u. NOLTE

2001). Nach HEIDNER et al. (1991) liegen die mittleren Überlebenszeiten nach der

Diagnosestellung ohne Behandlung oder nur mit symptomatischer Therapie bei einer

Woche, nach der Tumorresektion bei 3 Wochen. Intrakranielle Neoplasien treten

beim Hund häufiger auf als beim Menschen (LIPSITZ et al. 2003). So sind es beim

Hund im Jahr 14,5 Fälle pro 100.000 im Vergleich zu 4-5 Fällen beim Menschen

(STOICA et al. 2004). Das GBM ist weltweit bei Hunden sehr selten und tritt bei

Katzen etwas häufiger auf. Besonders häufig sind brachycephale Rassen betroffen

mit einer Rassedisposition für Boston Terrier, Englische Bulldoggen und

insbesondere Boxer. Die Inzidenz ist bei über 6 Jahre alten Hunden erhöht. Einen

geschlechtsspezifischen Einfluss gibt es nicht (OBERMAIER et al. 1995, STOICA et

al. 2004).

12 2 Literaturübersicht Die caninen glialen Tumoren sind den humanen sowohl morphologisch als auch

immunhistologisch sehr ähnlich und ebenfalls hauptsächlich in den

Gehirnhemispheren, dem Thalamus, dem Hypothalamus und dem Stammhirn

lokalisiert (STOICA et al. 2004). Sie zeigen ebenfalls eine erhöhte Zelldichte und

Vaskularisierung, Pleomorphismus, Zellkernpolygonie, mitotische Aktivität und die

Bildung von Nekrosen umgebenden Pseudopalisaden (LIPSITZ et al. 2003). Die

Vergleichbarkeit von Gliomen im Hund und im Menschen macht die klinischen

Erfahrungen und Retrospektiverkenntnisse aus der Veterinärmedizin zum einen

wichtig für die Humanmedizin, zum anderen ermöglicht diese die Anwendung von für

den Menschen entwickelten Medikamenten auch beim Hund (SNYDER et al. 2006).

Auch die mit schnell wachsenden Gehirntumoren einhergehenden Symptome bei

Hund und Katze ähneln denen des Menschen. So beschrieben LIPSITZ et al. (2003)

bei fünf Hunden mit GBM Ataxien bis hin zur Tetraparese, Kopfschiefhaltung,

Nystagmus und Benommenheit. Vier der fünf Tiere zeigten zudem einen Drang nach

rechts, der sich in im Kreisgehen und einer Kopf-rechts-Haltung äußerte. Ähnliche

Symptome beschrieben STOICA et al. 2004 und HIGGINS et al. 2001 für

Astrozytome und granuläre ZNS Tumoren bei Hunden. DICKINSON et al. (2000)

erhoben diese neurologischen Befunde ergänzt durch eine reduzierte optische

Antwort auf eine Drohreaktion bei zwei Katzen mit Oligodendrogliomen.

Grundsätzlich sind die therapeutischen Probleme bei der Behandlung glialer

Tumoren der Haustiere die gleichen wie in der Humanmedizin. Auch in der

Veterinärmedizin gibt es Ansätze zur chemotherapeutischen Behandlung von

Gliomen, wobei die meisten Berichte über Lomustin vorliegen. Die Resultate waren

jedoch nicht zufrieden stellend und es waren keine Verlängerungen der

Überlebenszeiten zu ermitteln (DOBSEN et al. 2003).

Die Diagnosestellung erfolgt beim Kleintier wie beim Menschen anhand der

Darstellung mittels Computertomographie (CT) oder Magnetic Resonance Imaging

(MRI). Eine Differenzierung der verschiedenen Gehirntumoren ist aber so aufgrund

der allegorischen Ähnlichkeit vieler Gehirntumoren in der Regel nicht möglich

(KRAFT et al. 1997, FUCHS et al. 2003).

2 Literaturübersicht 13 Die prognostische und damit therapieentscheidende Bedeutung des

Malignitätsgrades ist aber gerade bei intrakraniellen Neoplasien wie dem GBM aus

klinischer Sicht immens. Eine diagnostische Option stellt die Färbung und

lichtmikroskopische Darstellung von Zellausstrichen nach stereotaktisch platzierter

Nadelbiopsie dar (FERNANDEZ et al. 1997). So stellten VERNAU et al. (2001) dar,

dass sich das canine Glioblastom anhand seiner glomerulären Blutgefäßformation

sowie anhand einer vermehrten Karyomegalie gut von den besser differenzierten

Astrozytomen unterscheiden lässt. STOICA et al. (2004) entwickelten zudem

immunhistochemische Untersuchungsmethoden zur Spezifizierung von

Tumorbiopsien. So konnten sie in 84% der untersuchten Tiere positive

Immunreaktionen des sauren Gliafaserproteins (GFAP, Glial fibrillary acidic protein)

nachweisen. Außerdem konnten sie zeigen, dass sowohl das Tumorsupressorgen

p53 als auch der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) reduziert waren.

NOLTE et al. konnten 2005 eine verbesserte MRI Darstellung intrakranieller

Tumoren und ihrer Demarkation durch die Anwendung von superparamagnetischen

Eisenoxiden (SPIO) als Kontrastmedien belegen.

Die singuläre Strahlentherapie von Gliomen bei Haustieren führt zu vergleichbaren

Erfolgen wie die Tumorresektion. BREARLY et al. fanden 1999 in einer Studie

mittlere Überlebenszeiten von 40 Wochen nach alleiniger Strahlentherapie und von

44 Wochen nach einer Kombination von Tumorresektion und Bestrahlung heraus.

Eine andere Studie (HEIDNER et al. 1991) ergab nur mittlere Überlebenszeiten von

20 Wochen nach strahlentherapeutischer Intervention. Im Vergleich zu den

Therapieerfolgen beim Menschen sind die Verlängerungen der Überlebenszeit nach

Behandlung beim Hund von einer auf bis zu 44 Wochen gravierend. Da aber in die

zum Hund vorliegenden Retrospektivstudien nicht nur das Glioblastoma multiforme,

sondern auch andere gliale Tumoren eingegangen sind, sind diese Daten nur

bedingt vergleichbar.


2.2 Experimentelles Glioblastom-Modell

Für ein geeignetes Tiermodell zur Induktion eines reproduzierbaren Tumors gibt es

diverse Ansätze. Dabei wurden Gliomzellen, die zuvor in vitro kultiviert worden

waren, als Zellsuspensionen oder auch zusammenhängende in vivo oder in vitro

gezüchtete Tumorgewebe transplantiert. Besonderes Augenmerk liegt auf den

Variablen wie der verwendeten Tierart, der Tumorzelllinie, der Menge der

implantierten Gliomzellen, der Inokulationslokalisation sowie dem

Behandlungsbeginn und der Applikationsmethodik der angewendeten Therapeutika.

IWADATE et al. (2005) injizierten Ratten 105 Gliomzellen der Zelllinie 9L 4 mm

posterior und 3 mm lateral zur Kreuzungsstelle der Sutura interfrontalis und der

Sutura sagittalis (Bregma) nach Bohrlochtrepanation mittels einer Mikroliterspritze mit

einer 25-gauge Nadel direkt in das Parenchym der rechten Hemisphäre und starteten

die folgende Behandlung per Injektion an denselben Koordinaten, nachdem der

Tumor drei Tage gewachsen war.

In einem anderen Modell wurden Mäusen 5 x 104 U87 Gliomzellen nach

Schädeltrepanation intraparenchymal injiziert und acht Tage nach der

Tumorinokulation mit einer intraperitonealen Endostatininjektion begonnen

(SCHMIDT et al. 2004).

Für eine MRI (magnetic resonance imaging) Studie wurden Ratten C6-Gliomzellen

intrakraniell implantiert (BEAUCHESNE et al. 2003). BEUTLER et al. (1999)

verwendeten ebenfalls C6-Gliomzellen, implantierten diese aber subkutan in den

Nacken von Ratten sowie auch von Mäusen, um ein Glioblastommodell zu

entwickeln.

TSENG et al. (2004) implantierten Fischer-Ratten 105 RT-2-Tumorzellen, in 10 µl

Phosphatpuffer (PBS) suspendiert, subkutan in die rechte Flanke und starteten die

Behandlung direkt im Anschluss beziehungsweise nach fünf Tagen, um ein Modell

mit variablen Tumorgrößen zu entwerfen.


YANG et al. (2005) entwickelten ein reproduzierbares Tumormodell, indem sie die

Zelllinie F98 aus CD-Fischerratten gewannen, nachdem sie diese mit N-ethyl-N-

Nitroseharnstoff behandelt hatten, um die Entartung der Zellen auszulösen. Nach der

in vitro Kultivierung der gewonnenen Zellen wurden jeweils 103, 104 und 105 dieser

zu CD-Fischer-Ratten syngenen Zellen stereotaktisch in den rechten Nucleus

caudatus implantiert. DRUCKREY u. LANDSCHUTZ (1971) generierten auf dieselbe

Weise zu BDIX-Ratten syngene BT4C-Gliomzellen. Die Syngenität dieser Zelllinie

zu BDIX-Ratten wurde durch die Typisierung der MHC-Komplexe überprüft

(BEUTLER et al. 1999).

Die Glioblastomzelllinie BT4C wurde häufig verwendet, um ein reproduzierbares

Glioblastom in Ratten hervorzurufen. Sie wurden zur Entwicklung eines

Gehirntumormodells erfolgreich per Injektionem nach Schädeltrepanation

intraparenchymal beziehungsweise in das Corpus Callosum von weiblichen BDIX-

Ratten implantiert (LEHTIMÄKI et al. 2003, GRIFFIN et al. 2003).

READ et al. (2001a) injizierten mittels einer Mikroliterspritze 8 x 103 BT4C

Gliomzellen intraparenchymal in die rechte Gehirnhemisphäre. Gleichzeitig

implantierten sie an derselben Stelle Endostatin produzierende „Bioreaktoren“, um

deren Wirksamkeit zu untersuchen. In einer anderen Arbeit wurden C6-Gliomzellen

verwendet, die als zusammenhängende Zellsphäroide auf Alginat nach der

Gehirnpräparation direkt auf den Gehirnhemisphären platziert wurden (READ et al.

2001b).

16 2 Literaturübersicht 2.3 Angiogenese

2.3.1 Einführung

Unter Angiogenese wird die von bereits bestehenden Gefäßen ausgehende kapillare

Einsprossung in das umgebende Gewebe als Folge der Proliferation, Differenzierung

und Migration von Endothelzellen verstanden. Diese Vorgänge sind im Körper streng

reguliert und bewegen sich in einer feinen Balance (PEROULIS et al. 2002).

Im gesunden adulten Organismus überwiegen die die Gefäßbildung hemmenden

Botenstoffe gegenüber der Konzentration der Aktivatoren. Bei einem proliferierenden

Glioblastom ist dieses Gleichgewicht zu Gunsten der Angiogeneseförderer

verschoben (O`REILLY et al. 1997). So synthetisieren Glioblastomzellen fünfzigmal

mehr Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) als Zellen eines geringergradigen

Astrozytoms (PLATE et al. 1993). Hinzu kommt, dass der Rezeptor für VEGF,

KDR/Flk-1, der von Endothelzellen in gesundem Gehirngewebe regulär nicht

exprimiert wird, von Tumorzellen in hohem Maße synthetisiert wird (PLATE et al.

1992). Ohne einen auslösenden Reiz haben Endothelzellen eine Teilungsrate von

nur 0,01%, was bedeutet, dass sich eine Endothelzelle bei Durchlaufen eines

normalen Zellzyklus nur ca. alle drei Jahre teilt. Erhöhte Teilungsraten findet man

beispielsweise während der Reproduktionszyklen, der Schwangerschaft, bei

Wundheilungsprozessen, im Zusammenhang mit der Retinopathia diabetica und

beim Wachstum von Tumoren (ENGERMANN et al. 1967; HOBSON u. DENEKAMP

1984).

2 Literaturübersicht 17 2.3.2 Angiogenese im Glioblastoma multiforme

Bis zu einer Größe von 2 mm³ werden die sich teilenden Gliomzellen durch Diffusion

aus der Umgebung und den Liquorfluß ausreichend versorgt. Proliferieren sie

darüber hinaus, ist das Wachstum von da an angiogeneseabhängig. Sobald die

morphologische Tumorbildung einmal begonnen hat, ist jede Zunahme der

Zellpopulation auf die Zubildung von Blutgefäßen angewiesen (FOLKMAN 1990),

wobei dann jede weitere Endothelzelle nach DHANABAI et al. (1999) rechnerisch

das Wachstum von 50 bis 100 Gliomzellen ermöglicht. Diese Abhängigkeit des

Tumorwachstums von der Entstehung neuer Blutgefäße wird auch durch die Abläufe

bei der Bildung von Tumormetastasen verdeutlicht. Häufig können Fernmetastasen

erst Monate oder Jahre nach der Operation des Primärtumors auftreten („tumor

dormancy“). Vermutlich hängt dies damit zusammen, dass zwischen der Entstehung

einer Mikrometastase und der Ausbildung von Kapillaren, die Voraussetzung für

einen klinisch relevanten Tumorprogress ist, eine längere zeitliche Verzögerung liegt

(„angiogenic switch“) (HOSSFELD et al. 2001).

Das Ausmaß der Blutgefäßneubildungen und das Auftreten hypoxischer Bereiche

sind direkt mit der Malignität und vor allem der schlechteren Prognose eines Tumors

assoziiert. Die Untersuchung der Tumorvaskularisation ist eine Möglichkeit zur

Abschätzung des Dysplasiegrades von Tumoren.

Werden Tumorzellen hypoxischem Stress ausgesetzt, so wird Hypoxia-Inducable-

Factor-1 (HIF-1) aktiviert, der die Transkription verschiedener Gene promotet. Es

werden Proteine sezerniert, die sich fördernd auf die Neovaskularisierung auswirken,

darunter Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Glutaminasen (GLUTs) und

glykolytische Enzyme (PLATE et al. 1992). Unter normalen Sauerstoffbedingungen

und in gesundem Gewebe wird HIF-1 durch einen Proteasekomplex unterdrückt und

es finden keine angiogenetischen Prozesse statt (LUO et al. 2006).


WESSELING et al. (1997) zeigten auf, dass in Glioblastomen ein Circulus vituosus

entsteht. Die Versorgung mit Blutgefäßen ist nicht nur Bedingung für die

Tumorproliferation. Eine erhöhte Vaskularisierungsdichte und die damit

einhergehende Interaktion zwischen Gliomzellen und Endothelzellen sowie die

erhöhte Nährstoffversorgung treiben die Gliomzellproliferation zudem voran. Diese

Gliomzellen wiederum rekrutieren durch die HIF-1 Ausschüttung neue Blutgefäße.

LUSE zeigte bereits 1960 mittels Elektronenmikroskopie, dass sich auch der

endotheliale Aufbau der Gefäßstrukturen im gesunden Gehirngewebe von denen

diverser Gehirntumoren deutlich unterschied. So war sowohl die allgemeine

Gefäßform anders strukturiert, wobei die Astrozytenendfüße durch Gliomzellen

ersetzt waren, als auch eine vermehrte Extrazellularmatrix mit doppelter

Basalmembran zu finden. Nachfolgende Studien zeigten ein verdünntes Endothel

sowie vermehrte Vesikel und Fenestrierungen (HIRANO u. MATSUI 1975). Der

kapillare Aufbau in einem Glioblastom ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.


E

P

GZ

EZMEZM

AE

BMBA

L L

fE

P

Abbildung 1 Physiologische Struktur von Kapillaren (A) und Kapillaren im Glioblastom (B) modifiziert nach FISCHMANN (2004) Die Astrozytenendfüße (AE) sind im Tumor durch Gliomzellen (GZ) ersetzt. Die

Extrazellulärmatrix (EZM) ist vermehrt und weist eine Trennung der

Basalmembranen (BM) auf. Das Endothel (E) der Tumorgefäße ist schmal und

fenestriert (fE). (L)= Lumen, (P)= Perizyt

2.3.3 Therapieansätze zur Hemmung der Angiogenese

Die Inhibition der Angiogenese bietet einen Ansatz zur Behandlung von Tumoren,

Diabetes bedingter Nephropathie, Arthritis und Psoriasis, wohingegen die Stimulation

der Angiogenese beispielsweise zur Therapie von Erkrankungen der

Herzkranzgefäße, Herzversagen und bei Gewebeverletzungen eingesetzt wird

(PANDYA et al. 2006).

Aus der direkten Beziehung zwischen Prognose des GBM und seiner

Vaskularisierung ergibt sich die Hemmung der Blutgefäßneubildung als

therapeutischer Ansatz zu seiner Behandlung.

20 2 Literaturübersicht Alle Angiogenesehemmer wirken, anders als beispielsweise Chemotherapeutika,

fokussiert auf ihr Ziel, so dass sie aktiv gegen den Tumor, aber nicht toxisch

gegenüber Zellen des gesunden Gewebes sind (FOLKMAN 2006).

Die bislang am besten untersuchten endogenen Angiogenesefaktoren sind

endotheliale Wachstumsfaktoren wie VEGF, "Fibroblast Growth Factor" (FGF),

"Platelet-Derived Growth Factor" (PDGF), Angiogenin, Interleukin-8 (IL-8) und

Proteine aus der Familie der Matrixmetalloproteinasen. Es werden ständig weitere an

der Angiogenese beteiligte Faktoren und ihre Rezeptoren untersucht und damit

einhergehend auch immer mehr antiangiogenetisch wirksame Moleküle. Dazu

gehören vor allem die endogenen Faktoren Angiostatin, Endostatin,

Thrombospondin-1 und -2, und chemische Verbindungen wie das

Fumagillinanalogon AGM-1470 oder Inhibitoren der Matrixmetalloproteinasen wie

TIMP-1 (KUNZ u. HARTMANN 2002).

In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Medikamenten entwickelt, die spezifisch

bestimmte Schritte der Neoangiogenese blockieren sollten. Die

Angiogeneseinhibitoren, die zurzeit klinisch getestet werden, lassen sich in vier

Klassen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen aufteilen (HOSSFELD et al.

2001):

1) Matrixmetalloprotease-Inhibitoren

2) Inhibitoren für Endothelzellen

3) Inhibitoren der pro-angiogenetischen Faktoren

4) Integrinantagonisten

Derzeit sind 28 endogene Angiogeneseinhibitoren bekannt, wobei Endostatin der

erste ist, der als Fragment der Extrazellulärmatrix identifiziert wurde. Die ersten

Angiogeneseinhibitoren sind von der Food and Drug Administration (FDA) in den

USA und 28 Nationen für die Tumortherapie zugelassen worden (FOLKMAN 2006).

Für Endostatin gibt es noch keine Zulassung in den USA und in Europa. Einen

Überblick gibt die Tabelle 2.


Tabelle 2 Von der FDA zugelassene Angiogeneseinhibitoren

Angiogenesis inhibitors approved by the FDA in the U.S. and in 28 other countries including endostatin (China) and Macugen (U.S. and Brazil) Date approved Drug Place Disease December 2003 Thalidomide Australia Multiple myeloma February 2004 Avastin U.S. (FDA) Colorectal cancer November 2004 Tarceva U.S. (FDA) Lung cancer December 2004 Avastin Switzerland Colorectal cancer December 2004 Macugen U.S. (FDA) Macular degeneration January 2005 Avastin European Union (25 countries) Colorectal cancer September 2005 Endostatin (Endostar) China (SFDA) Lung cancer aus: FOLKMAN (2006)

2.4 Endostatin

2.4.1 Einführung

Die Struktur des antiangiogenen Peptids Endostatin entsteht als Spaltprodukt der C-

terminalen, als „Non-Collagenous“ bezeichneten Domäne des Kollagen XVIII.

Ähnlich wie für Kollagen XVIII selbst (REHN et al. 1996) sind für Endostatin

verschiedene Varianten mit unterschiedlichen N-Termini und Längen beschrieben

worden (SASAKI et al. 1998). Zudem bestehen Unterschiede zwischen humanem

Endostatin und dem anderer Spezies. Die humanen Endostatinformen sind zum

Beispiel 12 Aminosäuren kürzer beziehungsweise 4, 9 und 14 Aminosäuren länger

als die murinen Endostatine (STÄNDKER et al. 1997, FELBOR et al. 2000). Aus

dieser Beobachtung lässt sich schließen, dass an unterschiedlichen

Produktionsorten und in verschiedenen Geweben wahrscheinlich unterschiedliche

Endostatinformen hergestellt werden, die eventuell differierende antiangiogenetische

Potenz haben. Die Genkarten für humanes Endostatin (COL18A1) als Spaltprodukt

von Kollagen, Typ XVIII, alpha 1, die Ratte (Rattus norvegicus, Col18a1; collagen,

type XVIII, alpha 1), Mausendostatin (Mus musculus, Col18a1; procollagen, type

XVIII, alpha 1), Hühnerendostatin (Gallus gallus, COL18A1; collagen, type XVIII,

alpha 1), den Zebrafisch (Danio rerio, AJ494837), die Fruchtfliege (Drosophila

melanogaster, CG331711; CG33171-PE, isoform E) und den Hund (Canis lupus f.

familiaris, LOC4747781, similar to Collagen alpha 1(XV) chain precursor) liegen vor.


Für die Katze wurden das entsprechende Gen und Protein noch nicht beschrieben.

Die Sequenzhomologie zwischen humanem und caninem Endostatin beträgt 83.76%

auf Nukleinsäureebene beziehungsweise 82.27% auf Aminosäureebene

(WEIZMANN 2006). KAMSTOCK et al. (2006) infundierten Hunden mit

Weichteilsarkomen canine Endostatin DNA, um seine Tumor supprimierende

Wirkung zu untersuchen. Es wird vor allem in lymphoidem, konnektivem und

epithelialem Gewebe, der Nebenniere, dem Pankreas und der Niere sezerniert.

(MARNEROS, A. G. u. B. R. OLSEN 2005). Die strukturellen Unterschiede

ermöglichen eine Antikörper vermittelte Differenzierung und damit den

immunhistologischen Nachweis speziesverschiedener Endostatine (LI, et al. 2005).

So verwendeten ROSSMEISL et al. (2002) einen polyklonalen Kaninchen Antikörper

gegen rekombinantes canines Endostatin in einem enzymatischen Immunoassay

(EIA) zur Detektion der Endostatinkonzentration im Serum von an malignen

Neoplasien erkrankten Hunden.

Endostatin entsteht, indem es durch Pankreas-Elastase und Cathepsin L

proteolytisch aus der Non-Collagenous 1-Domäne des Kollagen XVIII, welches als

Gerüsteiweiß hauptsächlich in perivaskulären Membranen zu finden ist, abgespaltet

wird (WEN et al. 1999, FELBOR et al. 2000). Das entstehende Peptid ist 22 kD

schwer. In Abbildung 2 ist Kollagen mit seiner Endostatinendung schematisch

dargestellt.

Über die Halbwertszeit von Endostatin sind in der Literatur unterschiedliche Angaben

zu finden. So findet sich bei JOKI et al. (2000) die Angabe, nach 7 Stunden sei die

Hälfte des Proteins abgebaut. BJERKVIG et al. (2003) sprechen von 10,7 Stunden.


Abbildung 2 Schematische Darstellung der Endostatinsynthese aus Kollagen XVIII

Cathepsin L und Pankreas-Elastase spalten Endostatin aus der Non-

Collagenous Domäne-1 des Kollagen XVIII proteolytisch ab.

2.4.2 Wirkungen

Nach wie vor ist der antiangiogene Wirkungsmechanismus des Endostatins nicht

vollständig geklärt. Es wirkt sich auf ein sehr breites Spektrum an Angriffspunkten im

Zusammenhang mit der Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose von

neovaskulären Endothelzellen aus. Außerdem beeinflusst es sowohl die Verbindung

zwischen den Endothelzellen und der umgebenden Matrix als auch den

zytoskelettären Aufbau der Zellen selbst (DIXELIUS et al. 2002; KEEZER et al.

2003). KIM et al. zeigten 2002 auf, dass Endostatin an KDR/Flk-1, den Rezeptor des

VEGFs, bindet. Durch diese Bindung interagiert es mit der Signaltransduktion des

VEGF, indem es die VEGF induzierte Phosphorylierung der Kinase (Erk1/2) reduziert

und somit die nachfolgenden Angiogenese induzierenden intrazellulären Schritte

blockiert (PETERSEN et al. 2005, GETMANOVA et al. 2006).

Zusätzlich interagiert es mit den a5- und aV-Integrinen und die daraus folgende

Angiogenese hemmende Wirkung besteht eventuell in einem sich negativ auf die

Endothelzellproliferation auswirkenden antiadhäsiven Mechanismus (REHN et al.

2001, SUDHAKAR et al. 2003).

Non- Collagenous Domäne-1

Endostatin

--Elastase

Pankreas

Proteolyse

Cathepsin LCathepsin L

Proteolyse Kollagen XVIII

Non-Collagenous-Domäne-1

Pankreas Elastase


Nach DHANABEI et al. (1999) hat Endostatin zudem eine damit einhergehende

Endothelzell-Apoptose fördernde Wirkung, für die die verminderte Expression der

antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-XI verantwortlich gemacht wird.

Außerdem bindet Endostatin an Heparin und auch an Heparansulfate. Für den

endothelzellaktivierenden Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) dienen

Heparansulfate als Korezeptoren. Daraus folgernd wurde eine kompetitive Hemmung

der Wachstumsfaktor-Korezeptoren durch Endostatin diskutiert (SASAKI et al. 1999).

Weiterhin ist Glypikan, ein Proteoglycan der Zellmembranen und

Migrationsvermittler, als Heparinase sensibler Rezeptor für Endostatin beschrieben

worden. Durch die Bindung von Endostatin vermittelt er eine antiapoptotische

Signalkaskade (HAGIHARA et al. 2001, KARUMANCHI et al. 2001).

Endostatin moduliert zudem sowohl die Expression als auch die Präsentation von

Plasminogen-Aktivatoren und auch deren Inhibitoren auf der Oberfläche von

Endothelzellen (WICKSTRÖM et al. 2001).

Da Endostatin die katalytische Aktivität der Matrixmetalloproteinasen 1 und 2

reguliert, könnte es auch über die veränderte proteolytische Potenz der

Endothelzellen selber antiangiogene Wirkung haben (KIM et al. 2000). Hinzu kommt,

dass Endostatin sowie auch Angiostatin den intrazellulären Kalziumgehalt der

Endothelzellen erhöhen und auf diese Weise die Signalkaskaden angiogener

Faktoren beeinträchtigen können (JIANG et al. 2001).

Caspase-8 ist ein zentrales Apoptose auslösendes Protein. Die Proteinkinase-B

(PKB) wirkt regulierend auf diesen Apoptosemechanismus. Endostatin wiederum

blockiert die PKB und hebt somit die zellschützende Wirkung auf (SKURK et al.,

2004, KANG et al. 2006).

VEGF wirkt auf endotheliale Stickstoffoxidsynthasen (eNOS), die wiederum eine

Zellmigration induzieren, indem es Serotonin 1177 phosphoryliert. Endostatin führt zu

einer Dephosphorylierung an Serotonin 1177 und wirkt so der VEGF vermittelten

Endothelzellaktivierung entgegen (URBICH et al. 2002).


Morphologisch zeigt sich die Wirkung von Endostatin auf die Struktur von

Tumorblutgefäßen, wobei sowohl die Gefäßdichte als auch der Durchmesser der

einzelnen Gefäße verringert wird, was dann zu einer Beeinträchtigung der

funktionellen Gefäßversorgung führt (BJERKVIG et al. 2003).

Vorteil der antiproliferativen Wirkung des Endostatins ist, dass es ausschließlich auf

neovaskuläre Endothelzellen abzielt (OU-YANG et al. 2006) und so eine weitgehend

nebenwirkungsfreie Therapie möglich macht, da bereits ausgereifte Gefäße nicht

beeinträchtigt werden. Einen Überblick verschafft Abbildung 3 auf Seite 26.


Erk 1/2

Abbildung 3 Schematisierte Darstellung der Wirkungsweise von Endostatin Endostatin antagonisiert die Neoangiogenese in Tumoren (A) Es blockiert die

Bindung von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) an seinen Rezeptor

KDR/Flk-1 (B), wirkt Apoptose fördernd in dem es den PKB (Proteinkinase B) (E) und

den Bcl-2 und Bcl-XI (C) vermittelten Zellschutz aufhebt. Durch Blockade des

Korezeptors Heparansulfat (D) verhindert es die Endothelzellaktivierung durch bFGF

(basic Fibroblast Growth Factor). Es verhindert die Phosphorylierung an

Serotonin1177 und so die eNOS (endotheliale Stickstoffoxidsynthase vermittelte

Zellmigration (F). Bild A aus: http://www.cancerchoices.com/7facts-angiogenesis.htm (08/2006)

2 Literaturübersicht 27 2.4.3 Therapeutischer Einsatz

ABDOLLAHI et al. (2003) zeigten den antiproliferativen Effekt von Endostatin auf

humane Endothelzellen in vitro. Endostatin wirkte sich vermindernd auf die

Überlebensrate des Endothelzellklons (clonogenic survival) aus, steigerte die

Apoptoserate, reduzierte die Migrations- und Invasionsrate sowie die Bildung von

strukturierten Blutgefäßen. Weiterhin wurde im Tierversuch gezeigt, dass das

Tumorwachstum nach täglicher subkutaner (s.c.) Endostatingabe verzögert war.

Versuche in Mäusen mit humanen Glioblastomimplantaten, denen sowohl Gene für

einen VEGF-Rezeptor als auch ein Angiostatin-Endostatin-Fusionsgen transferiert

wurden, zeigten sowohl eine deutliche Tumorreduktion als auch eine Abnahme in der

Vaskularisierungsdichte und verlängerte Überlebenszeiten (OHLFEST et al. 2005).

Zur Gentransfektion wurde ein so genanntes „sleeping-beauty“-Transposon

verwendet, welches während der G1-Phase des Zellzyklus mitsamt der zu

transferierenden Sequenzen selbständig in die DNA eindringt.

Die starke Vaskularisierung von Tumoren geht mit einer Suppression der

endothelialen Adhäsionsmoleküle einher, aus der eine reduzierte Interaktion

zwischen Leukozyten und Blutgefäßwänden folgt. Die daraus folgende Anergie der

Endothelzellen gegenüber vielen Immunotherapien und Anti-Tumor-Vakzinationen

wurde durch die gleichzeitige Gabe von Endostatin umgangen und es wurden

vermehrte Leukozyteninteraktionen als Reaktion auf die primären Therapeutika

gezeigt (DIRKX et al. 2006).

Synthetisch hergestellte Endostatinfragmente wurden in einem Endometriose-

Mausmodell untersucht und es zeigte sich eine deutliche Abnahme der

endometrialen Läsionen ohne eine Unterdrückung des normalen Zyklus und ohne

einhergehende toxische Wirkungen (BECKER et al. 2006a).


Anhand eines Mausmodells untersuchten SUZAKI et al. (2005) den therapeutischen

Einsatz von Endostatin zur Behandlung von Asthma. Die Behandlung mit Endostatin

verminderte die durch Ovalbumin erhöhte Ansprechbarkeit der Atemwege, die

pulmonale allergische Inflammation und die Produktion spezifischer IgE-Antikörper

sowie Entzündungsmediatoren.

Ein Kolontumormodell in der Ratte zeigte hingegen zwar verlängerte

Überlebenszeiten der oral mit Endostatin behandelten Tiere, aber keine signifikante

Tumorreduktion oder Verringerung der Metastasierungsrate der Primärtumoren (LI u.

LI 2005).

LI et al. (2006) untersuchten die Tumor supprimierende Wirkung von Endostatin auf

das nasopharyngeale Karzinom, indem sie ein Adenovirus als Träger des

Endostatingens verwendeten. Sie konnten sowohl in der Zellkultur als auch in vivo

einen Tumorzellrückgang aufzeigen.

Zur Therapie renaler Strukturveränderungen, die mit dem Diabetes mellitus Typ 1

einhergehen, wurde Endostatin an einem murinen Nephropathiemodell untersucht.

Es zeigten sich deutlich geringere Hyperplasien der glomerulären Strukturen und

eine generelle Verringerung der Läsionen der Nieren im Vergleich zur Kontrollgruppe

(ICHINOSE et al. 2005).

In einem Glioblastommodell konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Infusion

von Endostatin wesentlich effektiver war als eine systemische (intraperitoneale)

Applikation. Während die systemische Therapie mit Endostatin kaum einen Effekt

hatte, konnte bei lokaler Infusion von 10-fach niedrigeren Mengen an Endostatin eine

Hemmung des Tumorwachstums von ca. 75% erreicht werden (SCHMIDT et al.

2004). FOLKMAN (2006) sprach von der Ebnung des Weges für die

Angiogenesehemmer in die klinische Anwendung nach drei Jahrzehnten

Forschungsarbeit durch die Entwicklung lokaler Applikationsmethoden.

2 Literaturübersicht 29 2.5 Mikrokapseln zur intrazerebralen Gliomtherapie

2.5.1 Einführung

Die systemische Behandlung von Neoplasien im Gehirn mittels antitumoröser

Wirkstoffe wie Chemotherapeutika oder antiangiogener Proteine wird auf Grund der

Abschirmung des Gehirns durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) erschwert. Ihre

geringe passive Permeabilität und das hoch selektive Transportsystem wirkten beim

Einsatz therapeutischer Moleküle zur Behandlung zerebraler Erkrankungen stark

limitierend (BOBO et al. 1994, EMERICH u. SALZBERG 2001). Hinzu kommt, dass

Wirkstoffe nach systemischer Applikation und Überwinden der BHS einen großen

interstitiellen, parenchymalen Druck überwinden müssen, um die Tumorzellen zu

erreichen (KIRSCH et al. 2000b). In Konzentrationen, die bei systemischer

Behandlung verabreicht werden müssten, um eine ausreichend hohe Dosis am

Zielort zu erreichen, wäre mit erheblichen Nebenwirkungen zu rechnen (JAIN 1991,

MEYERS et al. 1992).

Um eine auf antiangiogenen Mechanismen beruhende Gliom supprimierende

Wirkung zu erzielen, bedarf es hoher Konzentrationen eines potenten

Angiogeneseinhibitors über einen langen Zeitraum am Zielort (FOLKMAN 1995).

Bedingt durch die nur kurze biologische Halbwertszeit von Endostatin, die

Barrierefunktion der BHS sowie durch den verminderten Blutfluss innerhalb der

zentralen Tumorregionen ist die Applikationsform von wesentlicher Bedeutung. Eine

systemische Glioblastombehandlung ist dem zu Folge nur sehr begrenzt möglich und

es wird vermehrt nach Optionen für die lokale Wirkstoffverabreichung gesucht.

SIPOS u. BREM (2000) beschrieben das GBM für die Anwendung direkt lokaler

Therapien als sehr gut geeignet, da die Metastasierungsrate gering ist und die

Tumoren an nur einer Lokalisationsstelle verbleiben.

30 2 Literaturübersicht Um die BHS wirkungsvoll zu umgehen, war ein Lösungsansatz die direkte zerebrale

Injektion von Wirkstoffen in den Tumor, das umgebende Gewebe oder in das

Liquorsystem mittels Medikamentenpumpen. Hierbei zeigten sich aber sowohl die

Dosierung als auch die Stabilität der Proteine problematisch.

Hinzu kamen entzündliche Gewebsreaktionen sowie Infektionen des Gehirns als

Reaktion auf die sich dauerhaft im Gewebe befindenden Anteile der Apparaturen

(TSENG u. AEBISCHER 2000).

Um diese Probleme zu überwinden, haben verschiedene auf lokalen

Applikationsmethoden basierende Ansätze experimentelle Anwendung gefunden,

dabei kamen gentherapeutische Vektoren (GRISCELLI et al. 1998, MA et al. 2002),

aber auch auf Zellen basierende Transplantate (JOKI et al. 2001, READ et al. 2001)

zum Einsatz. Verschiedene Projekte zur lokalen Tumorbehandlung unter Anwendung

von Angiostatin oder Endostatin haben eine signifikante Inhibition des

Tumorwachstums aufgezeigt (TANAKA et al. 1998, DE BOUARD et al. 2002). Es

wurde mit zwei verschiedenen Implantatmodellen gearbeitet, zum einen mit

Makrokapseln wie zum Beispiel Hohlfaserkapseln und Diffusionskammern und zum

anderen mit Mikrokapseln. Die Implantation von Makrokapseln führte zu sowohl

chirurgischen Problemen auf Grund ihrer Größe als auch zu starken

Abwehrreaktionen bei den Empfängern. Hinzu kamen durch lange Diffusionsstrecken

bedingte Nekrotisierungen des implantierten Gewebes und das Versagen der

Implantate (KUHTREIBER et al. 1999). Unter Mikrokapseln versteht man die

Einbettung von Zellen in eine auf Hydrogelen, zum Beispiel Alginat, basierende

Matrix.

Mikrokapseln haben ein sehr viel vorteilhafteres Oberflächen-Volumen-Verhältnis,

erlauben eine definierte Bestimmung ihrer Permeabilität und garantieren so eine

ausreichende Versorgung der von ihnen beinhalteten Zellen mit Nährstoffen und

Sauerstoff. Ebenso können von den implantierten Zellen sezernierte Proteine durch

die Alginathülle dauerhaft und definiert in das umliegende Gewebe diffundieren.

2 Literaturübersicht 31 Die für die Bestandteile des Immunsystems nicht durchdringbare Hülle schützt

zudem die Implantate vor der Immunabwehr des Wirtes, so dass auch xenogene

Transplantationen ohne Wirtsabstoßung möglich sind. Die geringe Größe der

Mikrokapseln, die unter 1000 µm Durchmesser liegt, ermöglicht außerdem die

minimalinvasive Implantation gleich mehrerer Kapseln selbst in kleinste Räume wie

zum Beispiel die Muskulatur oder das Gehirnparenchym.

Auf Grund ihres Aufbaus aus lebenden, dauerhaft Wirkstoff sezernierenden Zellen in

einer umgebenden permeablen Matrix werden diese Kapseln auch als „Bioreaktoren“

bezeichnet.

Neben verkapselten Gewebeanteilen wie pankreatischen Inselzellen, die zur

Behandlung von Diabetes mellitus Typ 1 transplantiert wurden, kamen bisher 3

Kategorien von Zellen zum Einsatz (EMERICH u. SALZBERG 2001):

Postmitotische Zellen wie adrenerge chromaffine Zellen wurden zur chronischen

Schmerzbehandlung eingesetzt (BUCHSER et al. 1997). Außerdem wurden

immortalisierte Zellen, zum Beispiel Dopamin sezernierende PC12-Zellen, zur

Therapie der Parkinsonerkrankung verwendet (AEBISCHER et al. 1991).

Einen neuen Ansatz stellt die Verwendung gentechnisch so modifizierter Zellen dar,

dass sie ein bestimmtes Protein gezielt sezernieren („cell engineering“). Hier spricht

man auch von somatischer ex vivo Gentherapie, die im Unterschied zur in vivo

Gentherapie, bei der genetisches Material direkt in das Patientengewebe

transplantiert wird, eine genetische Insertion der Zellen in vitro und eine

nachfolgende Verkapselung vor der Implantation in den Patienten beinhaltet.

Hierfür werden in der Regel modifizierte humane mesenchymale Stammzellen

(hMSC) verwendet. Stammzellen sind am Anfang der Entwicklung stehende, nicht

ausdifferenzierte und noch zur Autoreproduktion befähigte Zellgruppen, die je nach

Gewebezugehörigkeit unterschieden werden in embryonale (ES), germinale,

hämatopoetische, somatische, epitheliale und mesenchymale Stammzellen (MSC).

Nach ihren Eigenschaften werden sie in pluripotente Zellen, zu denen die ES

gehören, multipotente Zellen wie die MSC und in unipotente Zellen, zu denen auch

die hämatopoetischen Stammzellen gehören, eingeteilt.

32 2 Literaturübersicht Humane mesenchymale Stammzellen sind undifferenzierte Vorläuferzellen, die zur

Rekonstruktion von Geweben mesenchymalen Ursprungs eingesetzt werden können

und die das Muttergewebe von Binde- und Stützgewebe, glatter Muskulatur sowie

von Skelett- und Herzmuskel darstellen. Sie sind durch ihre fibroblastenartige

Morphologie, adhärentes Wachstum und ihr Potenzial, in Adipozyten, Osteoblasten,

Myozyten und Chondrozyten zu differenzieren, gekennzeichnet.

MSC können durch einen einfachen chirurgischen Eingriff gewonnen werden. Hierbei

wird der Beckenkamm des Spenders punktiert und Knochenmark entnommen. Nach

einem von FRIDENSHTEIN (1982) etablierten Verfahren können hMSC aus

Knochenmarkaspiraten isoliert und expandiert werden. Dazu werden die

mononukleären Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und die

mesenchymalen Stammzellen über Plastikadhärenz selektioniert, indem die mobilen

hämatopoetischen Stammzellen durch mehrmaliges Entfernen des Kulturmediums

herunter gewaschen werden. (AURICH et al. 2006).

Durch Genmodifizierung verändert lassen sich hMSC zur Behandlung von

Gehirngewebsschädigungen wie zum Beispiel bei Hirninfarkten oder Schädel-Hirn-

Traumata und auch zur Bekämpfung hirneigener Neoplasien einsetzen. So zeigten

sie eine deutliche inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Gliomzellen, die

durch die Genmodifikation bedingte Sekretion therapeutischer Zytokine noch

gesteigert wurde (HAMADA et al. 2005).

Werden hMSC durch die humane Telomerase reverse Transkriptase (hTERT),

welche der bestimmende Faktor der enzymatischen Aktivität der humanen

Telomerasen ist, modifiziert, so erreicht man eine „sanfte“ Immortalisierung der

Zellen. Es entsteht eine permanente Zelllinie, ohne dass diese eine onkologische

und damit unkontrollierbare Proliferationsaktivität entwickeln. Auf diese Weise wurde

eine Zelllinie mit weitgehend normalen Zellverhältnissen geschaffen, deren

Proliferation nach der Verkapselung mit Alginat nach ein bis zwei Zellteilungen zum

Erliegen kommt. Diese hTERT-MSC sind unendlich klonierbar und überlebensfähig

ohne in einer Alginatmatrix durch anhaltende Proliferation die Integrität der Kapsel zu

zerstören. (HORIKAWA u. BARRETT 2003).

2 Literaturübersicht 33 Die in dieser Arbeit verwendeten, mit der hTERT versehenen hMSC waren

morphologisch identisch mit den primären hMSC und exprimierten

Oberflächenantigene, einschließlich CD105, CD 73 und CD166. Die hTERT-MSC

zeigten in vitro eine ähnliche Teilungsrate wie unveränderte mesenchymale

Stammzellen und teilten sich bis zu einer Proliferationsdichte von über 80

Verdoppelungen der Population (KOBUNE et al. 2003).

2.5.2 Verkapselungsmaterial: Alginat

Ein ideales Glioblastomtherapeutikum muss prädiktiv im Hinblick auf das

Tumoransprechen und gleichzeitig nicht toxisch für das gesunde Gehirngewebe sein

(HOFER et al. 2002). Dementsprechend musste ein Implantat entwickelt werden,

welches eine kontinuierliche, lokale, hoch konzentrierte Wirkstofffreisetzung

garantierte, ohne zu Abstoßungsreaktionen oder Entzündungen zu führen. Um die

Ausgangsbasis für eine solche Applikationsform zu schaffen, sind in den letzten

Jahren eine große Anzahl von Mikrokapseln aus den verschiedensten Materialien

(Alginat, Agar, Agarose und synthetischen Polymeren) entwickelt und getestet

worden (DULIEU et al. 1999).

Alginat ist ein wasserlösliches Salz der Alginsäure, welches als natürliches

Polysaccharid aus marinen Braunalgen, wie Laminaria, Ecklonia, Macrocystis,

Lessonia, Ascophylum und Durvillea extrahiert wird. Es besteht aus zwei

Uronsäuren, β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G), die über 1,4

Bindungen verknüpft sind. Der strukturelle Polymeraufbau wird durch drei

Sequenzblöcke bestimmt, die entweder homopolymer als M-M- oder G-G-Blöcke

oder heteropolymer als M-G-Blöcke vorliegen. Werden dem Alginat mono- oder

divalente Kationen zugesetzt, so kommt es zu Quervernetzungen der Polymere. Bei

der Verwendung divalenter Kationen außer Magnesium (Mg2+) bildet sich ein

dreidimensionales Netzwerk (GIUNCHEDI et al. 2000). Eine Darstellung des

strukturellen Aufbaus ist in der Abbildung 4 einzusehen.


aus: SMITH (2005)

Abbildung 4 Struktureller Aufbau von Alginat Die Guluronsäuren und Mannuronsäuren sind als MM- und GG- Blöcke über α (1→4)

und β (1→4) Bindungen verknüpft.

Die entstehenden wässrigen Gele können zur Herstellung Poren enthaltender

semipermeabler Mikrokapseln als Einbettung für Wirkstoffe, Zellen oder Gewebe

vertropft werden (PANDEY et al. 2005). Die Verkapselung mit Alginat schirmt die

implantierten Gewebeverbände oder Zellen gegen das Immunsystem des Patienten

ab (LÖHR et al. 2001), so dass auch eine Xenotransplantation möglich ist, und führt

darüber hinaus zu einer Immobilisierung der eingebetteten Zellen.

Die Affinität von Alginat zu den verschiedenen verwendeten divalenten Kationen und

damit die Stabilität seiner Quervernetzung und der entstehenden Gele nimmt in der

Reihenfolge Cd>Ba>Sr>Ca>Ni>Cu>Mn ab (VISTED et al. 2001). Die

morphologische Beständigkeit und die Widerstandsfähigkeit nehmen für Alginatgele

deutlich zu, wenn das in der Vergangenheit üblicherweise eingebundene Kalzium

(Ca)2+-Ion durch Barium (Ba2+) ersetzt wird. Zudem lässt die Verwendung von

Bariumionen eine Verkleinerung der Mikrokapseln zu und verringert die Permeabilität

für Immunglobulin G des Implantatempfängers (MORCH et al. 2006). Ein weiterer

Nachteil von Kalziumionen als Gelbildner ergab sich aus seiner

Chelatbildungsfähigkeit mit anderen körpereigenen Molekülen wie zum Beispiel

Zitraten. So fanden DUVIVIER-KALI et al. (2001) heraus, dass sich bei

Alginatkapseln mit hohem Mannuronsäureanteil, die mit einer

Bariumchloridvernetzung hergestellt wurden, eine geringere fibrotische Reaktion

auftrat als bei Kalziumchlorid vernetzten Kapseln.

2 Literaturübersicht 35 ROKSTAD et al. (2003) zeigten, dass bei der Verwendung von Poly-L-Lysin

Alginaten die Zellen nicht ausreichend gehemmt waren und es durch eine

fortschreitende Proliferation der Zellen zu einer Zerstörung der Kapseln kam.

Durch die Vertropfung der wässrigen, kationenvernetzten Gele lassen sich mit Hilfe

spezieller Beadgeneratoren Alginatperlen beziehungsweise Alginatbeads formen.

Diese Mikrokapseln bestehen aus einer inneren Alginathülle, in der die Zellen als

Zellcore in einer Alginatmatrix eingebettet vorliegen, und aus einer äußeren

Alginathülle, die das Beadinnere durch ihre immunisolierenden Eigenschaften vor

den Immunabwehrsystemen des Empfängers schützt. Einen Überblick über die

Diffusionseigenschaften verschafft Abbildung 6. Diese Art der Doppelverkapselung

gibt den Implantaten trotz erhaltener Flexibilität zudem die nötige Stabilität.

2.5.3 Biokompatibilität

MARKUSEN et al. (2006) belegten, dass Alginat sich sehr gut als

Verkapselungsmaterial für Stammzellen eignet. Es wurde gezeigt, dass hMSC nach

der Verkapselung mit Alginat eine Vitalität von über 80% behielten, ohne jedoch

weiter zu proliferieren und zu einer Desintegration der Mikrokapseln zu führen.

Die Biokompatibilität der Alginatkapseln hängt von der Reinheit der Implantate, ihrer

Stabilität, der Verarbeitung, den verwendeten divalenten Kationen und vor allem der

die Permeabilität bestimmenden Struktur der Alginatmatrix ab. Mögliche

Komplikationen äußern sich in einem fibrotischen Überwachsen der Kapseln,

welches durch Sauerstoff- und Nährstoffentzug zum Tod der eingekapselten Zellen

führt. DE VOS et al. (1999) zeigten diesbezüglich, dass es auch ohne fibrotische

Überwachsungen zum Tod von etwa 10% der von ihnen implantierten verkapselten

ß-Pankreaszellen kam, und nahmen auch hier eine Nährstoffunterversorgung

bedingt durch zu lange Diffusionswege als Ursache an. Sie zeigten aber auch, dass

alle Implantate, die die ersten offensichtlich kritischen 4 Wochen überlebten, auch

nach 8 Wochen noch vital waren.


Alginatkapseln mit einem hohen Mannuronsäureanteil führten zu einer verstärkten

Immunreaktion des Empfängers mit einer vermehrten Bildung proinflammatorischer

Zytokine, wohingegen guluronsäurereichere (high-G Alginate) intraperitoneal

(KULSENG et al. 1999) und auch im Gehirn von Ratten (READ et al. 2001) gut

toleriert wurden.

OMER et al. (2003) verwendeten ein Alginat mit einem Mannuronsäureanteil von

61% (high-M Alginate), um xenogene Pankreaszellen in Mäuse zu transplantieren,

und wiesen auch hier eine Überlebenszeit der verkapselten Zellen von 20 Wochen

nach. Alginate mit einem hohen Guluronsäureanteil weisen zudem die größte

Porenbildung auf und ermöglichen so eine bessere Versorgung der verkapselten

Zellen und eine erhöhte Wirkstofffreisetzung (READ et al. 1999).

2 Literaturübersicht 37 2.5.4 Therapeutischer Einsatz

Die Verwendung von Zellen enthaltenden Mikrokapseln ist innerhalb eines sehr

weiten therapeutischen Spektrums möglich. Die besonderen Vorteile dieser sehr

kleinen, hocheffizienten und gut biokompatiblen Wirkstofflieferanten ermöglichen

insbesondere die Anwendung in schwer zugänglichen und kleinen Zielbereichen wie

der Muskulatur und dem Gehirn.

Einen Überblick über erfolgreich erprobte Anwendungsgebiete von sezernierende

Zellen enthaltenden Alginatbeads gibt die Tabelle 3.

Tabelle 3 Übersicht über die experimentelle Anwendung von Alginatbeads Author Disease Encapsulation Cell line Protein Outcome

Read et al., 2001

Gliomas in rat Microencapsulation 293 Endostatin Prolonged survival

Emerich et al., 1997

Huntington´s disease

Microencapsulation BHK CNTF Reduced neuronal loss

Mitsumoto et al, 1994

Amyotrophic lateral sclerosis

Microencapsulation BHK CNTF Prolonged survival

Winn et al., 1989

Parkinson´s disease Microencapsulation and Macroencapsulation

PC 12 Dopamine Reduced rotation behaviour

Abbreviation: BHK, baby hamster kidney, 293, EBNA human fetal kidney

aus: VISTED et al. (2001)

Es wurde in mehreren Studien gezeigt, dass Alginatkapseln eine für die Diffusion von

Endostatin gut geeignete Permeabilität aufwiesen und eine ausreichend hohe

Freisetzung des Proteins ermöglichten. JOKI et al. (2001) verwendeten hierzu

Endostatin sezernierende BHK 12-Zellen (baby hamster kidney cells) und READ et

al. (2001) verkapselten EBNA 293-Zellen (human fetal kidney cells).

Zur Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Behandlung des Glioblastoms wurden

alginatverkapselte xenogene Zellen bereits erfolgreich in immunkompetenten Ratten

(READ et al. 2001a) als Heterotransplantate in einem Mausmodell (JOKI et al. 2001)

und sowohl subkutan als auch intrakraniell bei Tumoren in Mäusen (READ et al.

2001b) angewendet.


Grundsätzlich gibt es verschiedene Optionen zur intrazerebralen Behandlung mit

alginatverkapselten Zellen. Eine Möglichkeit ist die Applikation in das Liquor führende

System: den Subarachnoidalraum oder die Gehirnventrikel. Von dieser

Implantationslokalisation ausgehend ist die Verteilung therapeutischer Substanzen

durch die Fließrichtung der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) gesteuert. Dieser Fluss ist

von der Produktionsstelle, dem Plexus Choroideus in den Ventrikeln, zu den

Arachnoidalvilli gerichtet, von wo aus der Liquor gefiltert und dem abführenden

venösen System zugeführt wird. Optional können Alginatbeads direkt in das

Parenchym implantiert werden, wo die Implantate fest im Gewebe liegen und

sezernierte Proteine in die direkte Umgebung abgeben. Bei der Implantation in

Liquor führende Räume kommt es zu einer weiter reichenden Verteilung der

Substanzen, aber auch zu einer größeren Verdünnung. Zur Behandlung des

Glioblastoms ist die Applikation in eine Tumorresektionshöhle oder direkt in das

Tumorgewebe hinein möglich. So werden möglichst hohe Konzentrationen

antitumoröser Wirkstoffe direkt am beziehungsweise im Tumor selbst erreicht

(VISTED et al. 2001).

Eine Glioblastomtherapie mittels mikroverkapselter Zellen ist nicht dazu geeignet alle

Tumorzellen zu vernichten und den Patienten zu heilen, sondern sie soll ein lokale

Tumorkontrolle erreichen und so aus einer definitiv tödlich verlaufenden Krankheit

ein chronisches, handhabbares Leiden machen (VISTED u. LUND-JOHANSEN

2003).


2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit

Das Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Entwicklung eines reproduzierbaren

Glioblastommodells in der Ratte und die Untersuchung einer ex vivo Gentherapie zur

Behandlung eines induzierten Glioblastoma multiforme (GBM) mit

alginatverkapselten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die so

gentechnisch modifiziert wurden, dass sie das antiangiogene Protein Endostatin

freisetzten. Zunächst sollte die Kultivierung der verwendeten Gliomzelllinie etabliert

und die zur Implantation geeignete Zellzahl zum Erhalt eines experimentellen GBM,

das qualitative Gruppenvergleiche zulässt, gefunden werden. Außerdem musste eine

stereotaktische Implantationstechnik zur Inokulation der Gliomzellen und zur

Implantation der zu untersuchenden Mikrokapseln entworfen werden. Dabei mussten

geeignete Koordinaten zur Gliomzellinokulation und zur Implantation der

Alginatbeads gefunden werden. Diese sollten einerseits eine Applikation der

Implantate intraparenchymal mit Kontakt zum Ventrikelsystem

(intrazerebroventrikulär) und andererseits eine intraparenchymale Implantation des

Tumors erlauben. Dabei sollten Mikrokapseln und Tumor zudem möglichst nah

beieinander lokalisiert sein, ohne dass aber die rein mechanische Einwirkung der

Implantation der Alginatbeads Auswirkungen auf das Tumorwachstum hatte. Im

Anschluss an die Etablierung des Modells war mittels immunhistologischer

Markierung der Nachweis der Endostatinfreisetzung und damit die Funktionalität der

verwendeten, von der Firma CellMed AG (Alzenau, Deutschland) hergestellten

Alginat-Mikrokapseln (CellBeads®) nach intrazerebraler Implantation aufzuzeigen.

Außerdem sollte die Wirksamkeit sowohl Endostatin sezernierende MSC

enthaltender CellBeads® (Endostatinbeads, ECB) als auch nicht genetisch

modifizierte hTERT-MSC enthaltender CellBeads® (Stammzellbeads, SCB) auf das

Glioblastom im Vergleich zu leeren Alginatkapseln (Leerbeads, LCB)

beziehungsweise unbehandelten Tumoren untersucht werden.

Untersuchungsparameter waren hierbei die Blutgefäßdichte und –morphologie sowie

das Tumorvolumen, die sowohl histologisch als auch immunhistologisch zu prüfen

waren.


Aufbauend auf den Ergebnissen einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit

(BARTSCH 2005) sollte die Wirksamkeit der verwendeten CellBeads® unter GLP-

Bedingungen (Good Laboratory Practice) als Voraussetzung für die Beantragung der

klinischen Anwendung getestet werden. Dazu war das tierexperimentelle

Glioblastommodell zu standardisieren und die Untersuchungsergebnisse unter den

Vorgaben der GLP zu quantifizieren.

Die Etablierung des Glioblastommodells in der BDIX-Ratte wurde nach folgenden

Gesichtspunkten durchgeführt:

1. Entwicklung einer standardisierten Kultivierung der verwendeten syngenen

Gliomzelllinie BT4Ca.

2. Überprüfung der geeigneten zu implantierenden BT4Ca-Zellzahl um einen

reproduzierbaren Tumor nach einer definierten Überlebenszeit zu erhalten.

3. Ermittlung der geeigneten Koordinaten und Applikationsmethodik für die

Implantation sowohl der Gliomzelllinie BT4Ca als auch der zu

untersuchenden CellBeads®.

Die Untersuchung der Wirksamkeit der Endostatin sezernierende humane mesenchymale Stammzellen enthaltenden CellBeads® auf das Glioblastom

erfolgte unter Berücksichtigung folgender Fragestellungen:

1. Kommt es nach einer Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC

enthaltender Mikrokapseln (ECB) über einen Zeitraum von 12 Tagen zu

einer Wirkstofffreisetzung von Endostatin und wo ist das Protein

intrazerebral zu finden?

2. Besteht nach der Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC

enthaltender Mikrokapseln (ECB) eine Wirksamkeit auf die Blutgefäßdichte

innerhalb des Glioblastoms?

3. Besteht nach der Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC

enthaltender Mikrokapseln (ECB) eine Wirksamkeit auf das

Glioblastomwachstum?

3 Untersuchungsgut und Methoden 41

3 Untersuchungsgut und Methoden

3.1 Tiere

3.1.1 Herkunft

Die Versuchstiere wurden im SPF-Bereich des Institutes für Versuchstierkunde und

dem Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet

und wurden zur Versuchsdurchführung in die Tierhaltung des S1-Bereiches des

International Neuroscience Institute Hannover (INI GmbH) überführt.

Zur Durchführung der Versuche zur Etablierung der Methodik wurden 31 weibliche

BDIX/Ztm-Ratten eingestellt. Diese waren zwischen 8 und 12 Wochen alt und wogen

zwischen 200 und 350 Gramm.

Für die Überprüfung der Wirksamkeit von Endostatin freisetzenden CellBeads® wurden 40 weibliche BDIX/Ztm-Ratten eingestellt. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der

Versuchsdurchführung 10 bis 14 Wochen alt und wogen zwischen 250 und 350

Gramm.

3.1.2 Haltung und Fütterung

Die Tiere wurden in Gruppengrößen bis zu drei Tieren in Makrolon®- Käfigen Typ IV

unter kontrollierten, standardisierten Umweltbedingungen gehalten. Gefüttert wurde

ad libitum ein pelletiertes Haltungsfutter (Altromin® Alleinfuttermittel 1324, Altromin

GmbH, Lage). Die Tiere hatten stets freien Zugang zu Trinkwasser über Makrolon®-

Flaschen. Es wurde Standardweichholzgranulat für Labortiere (Altromin) als

Käfigeinstreu verwendet. Die Raumtemperatur betrug während der gesamten

Haltungsdauer 23°C ± 2°C bei einer Luftfeuchtigkeit von 55% ± 5%. Die Beleuchtung

erfolgte ausschließlich durch Kunstlicht bei <250 Lux im Raum und <60 Lux im

Käfigbereich in einem kontinuierlichen Tag-Nachtzyklus mit einer Dunkelphase von

12 Stunden und einer entsprechenden Hellphase von 6:00 bis 18:00 Uhr MEZ.

42 3 Untersuchungsgut und Methoden

Die Versuchstiere wurden wöchentlich in saubere Käfige mit frischer Einstreu

umgesetzt und erhielten zweimal wöchentlich frische Futterpellets und frisches

Trinkwasser.

Alle Tiere wurden frühestens nach einer Eingewöhnungszeit von einer Woche an die

herrschenden Umgebungsbedingungen operiert. Im Anschluss an die Operationen

wurden die Tiere für eine Dauer von mindestens 5 Tagen einzeln in Makrolon®-

Käfigen Typ III gehalten.

Die Haltung und Versuchsabläufe wurden in einem Versuchstierbuch dokumentiert.

Darin wurden Tierstamm, Geschlecht, Geburtsdatum, Einstellungsdatum, Herkunft,

Projektzugehörigkeit, Aktenzeichen des genehmigten Tierversuchsvorhabens,

Narkoseart, Art des Eingriffs, Datum des Eingriffs, Euthanasiemethode und -datum

festgehalten und diese Daten sowohl vom Experimentator als auch vom

Versuchsleiter durch Unterschrift bestätigt.

Alle Untersuchungen wurden durch die verantwortliche Regierungsbehörde

Hannover unter den Aktenzeichen 509.6-42502-04/758 und 33.42502-05/1022

genehmigt und fanden ausschließlich im S1- Bereich des International Neuroscience

Institute Hannover (INI GmbH) statt.

3.1.3 Narkose und Analgesie

Zur Durchführung der Experimente wurden die Tiere mittels intraperitonealer

Injektionsnarkose bestehend aus Ketanest® (Wirkstoff: Ketamin, 75 mg/kg KGW,

Pfizer, Karlsruhe, Deutschland) und Domitor® (Wirkstoff: Medetomidin, 0,2 mg/kg

KGW, Pfizer) für eine Dauer von durchschnittlich 45 Minuten narkotisiert.

Die Narkosetiefe wurde während des gesamten Eingriffs durch Überprüfung der

Reflexe anhand des Zwischenzehenreflexes und des Lidreflexes überwacht.

Bei Wiedereinsetzen eines Tiefenschmerzreflexes erfolgte eine Narkose-

verlängerung durch intraperitoneale Verabreichung von Ketanest® (20 mg/kg KGW).


Bis zum Aufwachen standen die Tiere unter Beobachtung und wurden zur

Vermeidung einer Hypothermie warm gehalten. Zur postoperativen Analgesie wurde

den Tieren Novaminsulfon ratiopharm® (Wirkstoff: Metamizol-Natrium, 110 mg/kg

KGW, Ratiopharm, Ulm, Deutschland) oral nach Einsetzen des Schluckreflexes und

weiterhin über das Trinkwasser während des gesamten Untersuchungszeitraumes

verabreicht.

Die Tiere wurden während der gesamten postoperativen Phase zweimal täglich auf

ihr Allgemeinbefinden hin untersucht und die Befunde dokumentiert. War das

Allgemeinbefinden eines Tieres, insbesondere seine Futteraufnahme, gestört, so

wurde dieses euthanasiert.

3.2 Implantate: CellBeads®

3.2.1 Herkunft

Die alginatverkapselten Implantate (CellBeads®) wurden durch die Firma CellMed AG

(Alzenau, Deutschland) hergestellt und der INI GmbH zur Verfügung gestellt.

Zum Einsatz kamen leere CellBeads® (Leerbeads, LCB), die nur aus der Alginathülle

und Goldpartikeln zur besseren Sichtbarmachung bestanden. Außerdem wurden

CellBeads® verwendet, die vitale mesenchymale Stammzellen humanen Ursprungs

ohne gentechnische Modifikation enthielten (Stammzellbeads, SCB) und solche

CellBeads®, die humane mesenchymale Stammzellen enthielten, welche so

genetisch modifiziert wurden, dass sie humanes Endostatin sezernierten

(Endostatinbeads, ECB). In Abbildung 5 sind die verwendeten CellBeads®

dargestellt. Die verwendeten Zellklone wurden in der gentechnischen S1-Anlage der

Firma CellMed AG generiert und verkapselt.

Durch den Hersteller wurde die Vitalität der verwendeten Chargen in vitro mit Hilfe

eines Alamar Blue Monitoring über 60 Tage kontrolliert.


Alamar Blue ist eine Substanz, die in ihrer oxidierten Form als blauer und in ihrer

reduzierten Form als roter Farbstoff vorliegt, der dann fluorimetrisch nachgewiesen

werden kann. Vitale Zellen sorgen durch ihre metabolische Aktivität für ein den

Farbstoff in seine detektierbare reduzierte Form überführendes Milieu.

Die Biokompatibilität der in dieser Arbeit verwendeten Stammzellkapseln wurde in

einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit am International Neuroscience Institute

überprüft. Dazu wurden die Mikrokapseln sowohl BDIX/Ztm-Ratten als auch

immundefizienten Ztm:RNU-Ratten intraparenchymal implantiert und nach einem

Untersuchungszeitraum von 8 Wochen sowohl histomorphologisch als auch nach

Explantation der Implantate mittels SYBR Green Vitalitätsfärbung durch den

Hersteller überprüft. Dabei dringt ein fluoreszenzmikroskopisch grün darstellbarer

Farbstoff (SYBR) in die lebenden Zellen ein und die abgestorbenen Zellen stellen

sich durch Propidiumjodid angefärbt rot dar (BARTSCH, 2005).

Endostatinsekretion

Nährstoff diffusion

Sauerstoff diffusion

Abschirmung gegen das Immunsystem

CellBeads® mit Zellcore im Inneren und umgebender Alginatkapsel, die für die

Bestandteile der Empfängerabwehr nicht durchdringbar ist, aber die Ernährung und

Sauerstoffversorgung der Stammzellen mittels Diffusion erlaubt.

Abbildung 5

Nativaufnahme der

verwendeten CellBeads®

Abbildung 6

Schematische Darstellung der Diffusionsverhältnisse in Alginatbeads

587 µm

398 µm


3.2.2 Verkapselungstechnologie

Die verwendete humane mesenchymale Stammzelllinie wurde durch einen

Gentransfer bei der Firma CellMed AG gentechnisch modifiziert. Um die

Synthetisierung von Endostatin durch die hMSC zu erreichen, wurde die

entsprechende Stammzelllinie mittels Transfektion verändert, indem ein

Plasmidvektor in ihren Zellkern eingeschleust wurde, in den zuvor die entsprechende

Endostatin cDNA kloniert worden war. Diese Einschleusung erfolgte durch eine

modifizierte Elektroporationsmethode, bei der ein elektrisches Feld angelegt wurde,

welches das Plasmid wiederum direkt in den Zellkern einschleuste. Das Verfahren

führte zudem zu einer „sanften“ Immortalisierung der Zellen, die mit einer stark

limitierten Zellteilung verbunden war. Nach Abschluss der Behandlung waren die

verwendeten Zelllinien maximal zu ein bis zwei Zellteilungen fähig. Die Biosicherheit

und Virusfreiheit wurden vom Hersteller getestet.

Die so veränderten Stammzellen und auch die nicht modifizierten hMSC wurden mit

einer Alginatlösung in einem 20 mM BaCl2-Fällbad vertropft. Die Zellzahl betrug

konstant 40 Millionen Zellen pro ml im Core, wobei der Durchmesser des Cores von

409 bis 457 µm und der Gesamtdurchmesser der CellBeads® von 541 bis 612 µm

variierte. Den Leerbeads wurde zur sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch

besseren Wiederauffindbarkeit ein Goldanteil von 10% zugegeben. Im Anschluss an

die Verkapselung wurden die fertig gestellten CellBeads® für einen Tag bei +37°C

und 5% CO2 in Kultur genommen und anschließend kryokonserviert. Zur

Versuchsdurchführung wurden die Implantate auf Trockeneis verschickt und im

International Neuroscience Institute aufgetaut.


3.3 Gliomzelllinie BT4Ca

3.3.1 Herkunft

Die Gliomzelllinie BT4Ca wurde von dem Institut für Zellbiologie (Tumorforschung)

des Universitätsklinikums Essen, Hufelandstraße 55, 45122 Essen generiert

(DEISSLER et al. 1996) und kryokonserviert. Bei dieser Zelllinie handelt es sich um

Glioblastomzellen, die durch die Applikation von Ethylnitroseharnstoff in BDIX/Ztm-

Ratten induziert worden sind. Auf diese Weise wurde eine zum Rattenstamm

syngene Zelllinie erzeugt (DRUCKREY u. LANDSCHUTZ 1971). Die Zellen wurden

bei ca. -70°C auf Trockeneis im Kryoröhrchen versandt und bei Ankunft im

International Neuroscience Institute sofort aufgetaut und kultiviert. Sie wuchsen

überwiegend homogen und hatten eine Generationszeit von durchschnittlich 10

Stunden. Nach ihrer Ankunft im International Neuroscience Institute wurde die

BT4Ca Zelllinie über 3 Passagen von je 5 Tagen kultiviert und vermehrt, um eine

Akklimatisierung an die veränderten Kulturbedingungen zu ermöglichen. Um eine

Zellbank anzulegen, aus der für jeden Versuch immer gleich behandelte

Zellportionen entnommen werden konnten, wurden die Zellen portioniert und in

flüssigem Stickstoff bei ca. -196°C kryokonserviert.

3.3.2 Syngenität

Vom Institut für Versuchstierkunde und dem Zentralen Tierlabor der Medizinischen

Hochschule Hannover wurde die Syngenität der verwendeten Gliomzelllinie zu dem

dort gezüchteten BDIX/Ztm-Rattenstamm anhand eines komplementabhängigen

Zytotoxizitätstestes zusätzlich überprüft. Dabei wurde eine antikörpervermittelte

Zelllyse dann ausgelöst, wenn oligospezifische Antikörper, welche spezifisch auf die

bei der Ratte bekannten MHC-Klasse I und II Komplexe reagieren, banden. Die

Zellmembran wurde dann durch eine komplementabhängige Reaktion zerstört und

zugegebenes Trypanblau, ein Indikatorfarbstoff für abgestorbene Zellen, färbte die

lysierten Zellen an.


3.4 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen

3.4.1 Etablierung des Models

3.4.1.1 Tumorzellinokulation

Ziel der Versuche war es, die ideale BT4Ca-Zellzahl zur Implantation zu finden, um

ein Tumormodell zu entwickeln, mit dem man einen möglichst immer gleich großen

Tumor nach einer bestimmten Zeit reproduzieren kann. Bei der Verwendung der

BT4Ca Gliomzelllinie, der implantierten Zellzahl, den Implantationskoordinaten und

der Auswahl des Rattenstamms wurde sich an der bestehenden Literatur (READ et

al. 2001, LEHTIMÄKI et al. 2003, GRIFFIN et al. 2003) orientiert (Siehe Kapitel 2.3

Experimentelles Glioblastom-Modell).

Zur Bestimmung der optimalen Tumorzellzahl wurden insgesamt 14 BDIX/Ztm-

Ratten operiert, wobei jeweils 2 Tieren 2 x 103, 4 x 103, 6 x 103 und 8 x 103 BT4Ca-

Zellen injiziert wurden. Nach einem Versuchszeitraum von 12 Tagen wurden die

gewachsenen Tumoren mittels Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbter Gefrierschnitte

beurteilt.

Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die Tumorausdehnung, deren anatomisch-

topographische Lage und die Vergleichbarkeit der jeweils mit derselben Zellzahl

inokulierten Tumoren gelegt. Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Methodik

wurden anschließend weitere 6 BDIX/Ztm-Ratten, von denen jeweils 3 Tiere 6 x 103

und 3 Tiere 8 x 103 Tumorzellen inokuliert bekamen, histologisch untersucht und

insbesondere die Größe und Ausdehnung mit den vorausgegangenen auf die

Reproduzierbarkeit der Methodik hin verglichen.


3.4.1.2 CellBead® Implantationen

Ziel war es, reproduzierbare Koordinaten zur intrazerebroventrikulären (i.c.v.)

Applikation der CellBeads® zu ermitteln, die eine intraparenchymale Implantation mit

Kontaktaufnahme zum Ventrikelsystem ermöglichten. Zur Ermittlung der

Implantationskoordinaten und der Implantationstechnik wurden insgesamt 13

BDIX/Ztm-Ratten operiert.

Anhand der bestehenden Literatur wurde in der anterior-posterior (AP) Ausdehnung

von der Kreuzungsstelle der Suturae interfrontalis und sagittalis (Bregma) ausgehend

-1 mm gewählt (READ et al. 2001). Untersucht wurden verschiedene Koordinaten in

der latero-medialen (LM) und in der dorso-ventralen (DV) Ausdehnung jeweils

bezogen auf Bregma. Dabei wurde zum einen unter dem Gesichtspunkt ermittelt,

genau die LM-Koordinate zu finden, bei der der rechte Seitenventrikel gerade

eröffnet wird, die CellBeads® aber noch im zerebralen Parenchym platziert werden

(intrazerebroventrikulär). Zum anderen musste eine Tiefe in der DV-Ausdehnung

gefunden werden, bei der die bis zu 612 µm großen Implantate sicher und

reproduzierbar appliziert waren, ohne wieder aus dem Stichkanal herauszuquellen.

Dazu wurde ein Vorbohren auf eine tiefer liegende Koordinate (einen Millimeter tiefer

als die Applikationskoordinate) erprobt, um Raum für das zu injizierende Volumen zu

schaffen.


3.4.1.3 Zweizeitige Operation

Es musste eine Methode entwickelt werden, die sowohl die Tumorzellinokulation als

auch die CellBead® Implantation erlaubte, ohne dass es zu einer gegenseitigen

mechanischen Beeinträchtigung durch die Einwirkungen während der Injektionen

kam. Um ein Anwachsen der BT4Ca-Gliomzellen zu ermöglichen und eine nicht

kalkulierbare Verdrängung der Zellsuspension durch die mechanische Einwirkung

der CellBead®-Implantation zu verhindern, wurden die Mikrokapseln einen Tag nach

den Tumorzellen und außerdem weiter medioventral appliziert.

Zur Entwicklung der Methodik wurden 4 BDIX/Ztm-Ratten operiert und die

histologischen Befunde nach einem Versuchszeitraum von 12 Tagen mittels der

Beurteilung Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbter Gefrierschnitte mit den Ergebnissen

aus den Untersuchungen zur alleinigen Implantation von CellBeads®

beziehungsweise BT4Ca-Zellen verglichen. Wichtig war hierbei neben der

unveränderten Tumorausdehnung und der korrekten Lage der Implantate in

Kommunikation mit dem rechten Seitenventrikel, die Lage der CellBeads® und des

Glioms zueinander. Dabei sollte ein möglichst geringer Abstand zwischen Tumor und

Mikrokapseln bestehen, um die Wirkstoffapplikation direkt am Zielort zu

gewährleisten.


3.4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des Endostatins

Die Untersuchung der Wirksamkeit von Endostatin sezernierenden,

alginatverkapselten humanen mesenchymalen Stammzellen (EMSC) wurde an 40

BDIX/Ztm-Ratten durchgeführt. Hierzu wurden 4 Versuchsgruppen mit jeweils 10

Tieren unterschieden. Einen Überblick über die Versuchsgruppen verschafft Tabelle

4 auf Seite 52.

Da 1 Tier unter der Operation verstarb, 3 Tiere vor Ablauf des Versuchszeitraumes

aus Tierschutzgründen euthanasiert werden mussten, bei 2 Tieren die CellBead®

Implantation misslang und bei einem weiteren Tier kein Tumor wuchs, wurden die

Daten von insgesamt 33 Tieren ausgewertet.

Die Durchführung und Auswertung der Versuche erfolgte verblindet. Die nach

Abschluss der Studie bekannt gegebene Kodierung der CellBead® Chargen erfolgte

durch die Firma CellMed AG nach folgendem Schlüssel:

leere CellBeads® = Charge CB039

Endostatin sezernierende MSC CellBeads® = Charge CB038

nicht genmodifizierte MSC CellBeads® = Charge CB037

3.4.2.1 Gruppe I: Kontrollgruppe Gliom (BT4Ca)

In der Kontrollgruppe wurden 10 BDIX/Ztm-Ratten die Glioblastomzellen in einer

einmaligen Injektion an Tag 0 implantiert. Aufgrund des Verlustes von 3 Tieren

wurden die Daten von 7 Tieren ausgewertet. Nach einer Versuchsdauer von 12

Tagen wurden die Tumoren histomorphologisch auf ihre Größe, ihre Lage und

Ausdehnung, ihren strukturellen Aufbau, die Morphologie und Dichte ihrer Blutgefäße

und insbesondere die Parallelen zur Pathologie des humanen Glioblastoms hin

untersucht. Die Versuchsergebnisse dieser Tiere dienten außerdem als

Vergleichswerte zu den anderen 3 Versuchsgruppen im Bezug auf die

Tumorvolumina, die Vaskularisierungsdichte und als negativer Vergleich zur

immunhistologischen Darstellung humanen Endostatins bei der behandelten Gruppe.


3.4.2.2 Gruppe II: Gliom (BT4Ca) und leere CellBeads® (LCB)

Bei den 10 Tieren der Gruppe II wurden neben den Glioblastomzellen leere, nur

Goldpartikel enthaltende CellBeads® (LCB, CB039) intrazerebroventrikulär (i.c.v.)

implantiert. Da bei 1 Ratte die Implantation misslang und 1 Tier vor Abschluss der

Studie euthanasiert wurde, wurden nur 8 Tiere untersucht. Die histologischen und

immunhistologischen Ergebnisse zeigten den Einfluss, den eine Implantation der

Mikrokapseln, das dadurch gesetzte Trauma und die damit einhergehende

Astrozytose auf den im Rattengehirn wachsenden Tumor und seine Angiogenese

hat.

3.4.2.3 Gruppe III: Gliom (BT4Ca) und Endostatin CellBeads® (ECB)

Die Endostatin-Gruppe setzte sich aus 10 Tieren zusammen, denen neben dem

Tumor CellBeads® verabreicht wurden, die Endostatin sezernierende Stammzellen

enthielten (ECB, CB038). Dabei erfolgte die Auswertung im Bezug auf die

Freisetzung von Endostatin in das sie umgebende Gewebe und den Liquor über das

Ventrikelsystem und dessen Wirksamkeit auf die Vaskularisierung und das

Tumorwachstum mittels histologischer und immunhistologischer Untersuchungen.

3.4.2.4 Gruppe IV: Gliom (BT4Ca) und Stammzell CellBeads® (SCB)

Durch die Versuchsergebnisse der Gruppe IV, in der den 10 Versuchstieren

zusätzlich zum Glioblastom CellBeads® mit hMSC verabreicht wurden, die kein

Endostatin-Plasmid enthielten (SCB), sollte die Beeinflussung des Tumors durch die

Anwesenheit von vitalen Stammzellen und ihren Endostatin unabhängigen

Sekretionsproduktion anhand der histologischen und immunhistologischen

Untersuchungen dargestellt werden. 1 Tier verstarb unter der Operation und 1

weiteres wurde auf Grund seines hochgradig gestörten Allgemeinbefindens vor

Ablauf des Untersuchungszeitraumes euthanasiert, so dass auch in dieser Gruppe

nur 8 Ratten zur Untersuchung herangezogen werden konnten.


Tabelle 4 Übersicht der experimentellen Versuchsgruppen zur

Untersuchung der Wirksamkeit Endostatin sezernierender Stammzellen enthaltender CellBeads®

Operationsverfahren, Stamm und Anzahl der Tiere, verwendete Mikroimplantate,

Untersuchungsparameter nach der Injektion von 8 x 10³ BT4Ca Zellen und 12 Tagen

Versuchsdauer

Operation und

Ratten- stamm Tieranzahl

Implantierte CellBeads®

Untersuchungs- Parameter

Gruppe I Kontrolltiere

Glioblastom

(BT4Ca)

10 (7)

BDIX/Ztm-

Ratten

keine

Tumorvolumen

Tumorvaskularisierung

Endostatinfreisetzung (IHC,

Negativkontrolle)

Histomorphologie des Tumors

Gruppe II Glioblastom

(BT4Ca)

und LCB

10 (8)

BDIX/Ztm-

Ratten

Leerbeads

Tumorvolumen


Endostatinfreisetzung (IHC)

Histologie der

Gewebereaktionen

Gruppe III Glioblastom

(BT4Ca)

und ECB

10

BDIX/Ztm-

Ratten

Endostatin

sezernierende

CellBeads®

Tumorvolumen



Histologie der

Gewebereaktionen

Gruppe IV Glioblastom

(BT4Ca)

und SCB

10 (8)

BDIX/Ztm-

Ratten

nicht

sezernierende

Stammzellbeads

Tumorvolumen



Histologie der

Gewebereaktionen


3.5 Versuchsdurchführung

3.5.1 Zellkultur

Alle Arbeiten mit der verwendeten BT4Ca-Gliomzelllinie wurden in einer Sterilbank

(Heraeus Hera Safe, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Deutschland)

durchgeführt. Für die durchzuführenden Pipettierschritte wurden eine elektrische

Pipettierhilfe (Pipetus®-Akku, Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt,

Deutschland) und steril verpackte serologische Pipetten (Sarstedt, Nümbrecht,

Deutschland) verwendet. Alle für die Zellkultur verwendeten Materialien und

Substanzen wurden steril verpackt gekauft oder wie zum Beispiel der Phosphatpuffer

vor der Verwendung bei 3 bar und 121 +/-1°C für 20 Minuten autoklaviert (CertoClav,

Sterilizer GmbH, Traun, Österreich). Mit Gliomzellen verunreinigter Abfall und

Verbrauchsmaterialien wurden ebenfalls vor der Entsorgung oder

Wiederverwendung autoklaviert. Zu entsorgende Flüssigkeiten wurden mit einer aus

Pasteurpipette, Schlauch und Pumpe bestehenden Absaugvorrichtung in eine

Autoklavierflasche abgesaugt und vor der Entsorgung autoklaviert. Vor Arbeitsbeginn

wurden alle benötigten Gerätschaften sowie das Innere der Zellkulturbank mit einem

Schnelldesinfektionsspray (Deso Med Rapid AF, Desomed AG, Freiburg) behandelt.

Für die BT4Ca-Zellen benötigte Flüssigkeiten wie zum Beispiel das Kulturmedium,

Phosphatpuffer oder Trypsin wurden vor der Verwendung im Wasserbad

(Wasserbad GFL 1008, GFL, Burgwedel, Deutschland) auf 37°C erwärmt.


3.5.1.1 Kultivierung der Gliomzellen

Das für die Kultivierung der BT4Ca-Zellen verwendete Kulturmedium wurde aus der

einen pH-Indikator enthaltenden Mediumgrundlage Dulbecco's Modified Eagle

Medium (DMEM high Glucose, PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland),

welcher Penicillin- Streptomycin (PAA Laboratories), Natriumpyruvat (PAA

Laboratories), Fetales Kälberserum (PAA Laboratories) und L-Glutamin (PAA

Laboratories) zugesetzt wurden, hergestellt. Die Rezeptur ist im Anhang einzusehen.

Die Kultivierung erfolgte im Brutschrank (NAPCO Series 5400 Co2-Incubator,

Labotect GmbH, Göttingen, Deutschland) bei 37°C und 5% CO2- Begasung. Um die

idealen Einsaatdichten zu ermitteln, wurden zunächst verschiedene Zellzahlen in

jeweils 15 ml Medium in 75 cm2- Gewebekulturflaschen (Greiner BIO-ONE,

Frickenhausen, Deutschland) eingesät und bei einer Bewuchsdichte zwischen 70

und 90% subkultiviert. Um die Zellen zu subkultivieren, wurde zunächst das in der

Flasche befindliche Kulturmedium mittels Absaugvorrichtung abgesaugt und der

Zellrasen mit ca. 6 ml sterilem PBS (Phosphate Buffered Saline, Code No.S302430,

DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) gespült. Im Anschluss wurden 3 ml

Trypsin (PAA Laboratories) hinzugegeben, um die adhärent auf dem Flaschenboden

wachsenden Zellen abzulösen. Nach 2 Minuten wurde die Trypsinreaktion durch

Zugabe von 7 ml Kulturmedium abgestoppt und die Zellsuspension aus der

Gewebekulturflasche in ein 15 ml Polypropylen (PP) -Röhrchen (Greiner-BioOne)

überführt. Die Zellsuspension wurde anschließend bei 133 G zentrifugiert (Megafuge

1.OR, Kendro Labaratory Products GmbH, Hanau, Deutschland) und nach dem

Absaugen des Überstandes das Gliomzellpellet in 4 ml Kulturmedium resuspendiert.

Anschließend wurde die Lebendzellzahl mittels Vitalzählung (siehe Kapitel 3.5.1.4)

bestimmt. Das Suspensionsvolumen, das rechnerisch 6 x 105 Zellen enthielt wurde

mit 15 ml Medium in eine sterile Gewebekulturflasche pipettiert und in den

Brutschrank verbracht. Am Tag nach der Einsaat und weiter an jedem zweiten Tag

wurde das alte Kulturmedium abgesaugt, der Zellrasen mit etwa 5 ml sterilem PBS

gespült und frisches Kulturmedium aufpipettiert.


Der Grad der Konfluenz, die Zellmorphologie und -homogenität, die Gleichmäßigkeit

des Bewuchses und Farbe sowie Trübung des Mediums wurden täglich mittels

Inversmikroskop (Inversmikroskop Leica DM IRB, Leica, Bensheim, Deutschland)

beurteilt und protokolliert.

3.5.1.2 Kryokonservierung der Gliomzellen

Die BT4Ca-Zellen wurden nach ihrer Ankunft im International Neuroscience Institute

(INI GmbH, Hannover) zunächst vermehrt und an die Kulturbedingungen adaptiert.

Dann wurde eine Zellbank angelegt und kryokonserviert, um immer gleiches

Ausgangsmaterial verwenden zu können. Dazu wurden die Zellen aus einer 75 cm2

Gewebekulturflasche mittels Trypsin herausgelöst, gezählt und abzentrifugiert, in

Einfriermedium resuspendiert und in 2 ml Kryoröhrchen mit Außengewinde

(Nalgene®Kryoröhrchen, Nalge) portioniert. Das verwendete Einfriermedium bestand

aus 10% DMSO (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) und 90%

fetalem Kälberserum (PAA Laboratories). Ab dem Moment, in dem die Zellen in

Einfriermedium suspendiert waren, wurde zügig gearbeitet, da das DMSO bei

Raumtemperatur die Zellmembranen schädigt. Die Aufnahme des zuvor

ausgezählten Zellpellets in Einfriermedium erfolgte so, dass rechnerisch eine

Suspension mit einer Dichte von 106 BT4Ca-Zellen in 1,8 ml entstand. Anschließend

wurden jeweils 1,8 ml der Suspension in ein Kryoröhrchen pipettiert und dieses

verschlossen. Jeweils 18 gefüllte Kryoröhrchen wurden in einem Einfriergerät

(Behälter Qualifreeze PC Mr. Frosty, Omnilab, Bremen, Deutschland), in dem die

Röhrchen reguliert durch eine Isolierung mit 100%igem Isopropanol um genau -1°C/

Minute abgekühlt wurden, in eine -80°C Gefriertruhe (National Lab GmbH, Mölln,

Deutschland) gebracht. Die Zellen verblieben über Nacht bei -80°C und wurden am

nächsten Tag in einen Stickstofftank (Air Liquide Deutschland GmbH, Bremen,

Deutschland) überführt. Hier lagerten sie in der gasförmigen Phase über dem

flüssigen Stickstoff (Air Liquide) bei ca. -196°C bis zur weiteren Verwendung.


3.5.1.3 Auftauen der Gliomzellen

Die kryokonservierten Zellportionen wurden zur weiteren Verwendung aus dem

Stickstofftank entnommen und im Wasserbad (Wasserbad GFL 1008, GFL) bei 37°C

aufgetaut. Anschließend wurden sie zügig in ein 15 ml PP-Röhrchen, mit 10 ml

Kulturmedium überführt, um das bei Raumtemperatur die Zellmembranen

schädigende Einfriermedium zu verdünnen. Während des Auftauvorgangs wurden

die Kryoröhrchen mehrfach vorsichtig kurz aufgedreht, um bei dem extremen

Temperaturwechsel einen Druckausgleich zu gewährleisten und ein Explodieren des

Röhrchens zu verhindern. Anschließend wurde die mit Kulturmedium verdünnte

Suspension sofort bei 133 G für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand

abgesaugt. Das im PP-Röhrchen verbliebene Zellpellet wurde anschließend in 4 ml

Kulturmedium resuspendiert und die Lebendzellzahl mittels Trypanblaufärbung

lichtmikroskopisch bestimmt (siehe Kapitel 3.5.1.4). Die Einsaat erfolgte

entsprechend der ermittelten optimalen Einsaatdichten in 75 cm2

Gewebekulturflaschen mit 15 ml Kulturmedium.

3.5.1.4 Vitalzellzählung

Die Zählung der BT4Ca-Gliomzellen erfolgte als Lebendzellzahlbestimmung mittels

Trypanblau (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland). Das Zellpellet wurde nach

dem Zentrifugieren (133 G, 5 Min.) und dem Absaugen des Überstandes in einer

definierten Menge PBS oder Kulturmedium resuspendiert. Anschließend wurden

10 µl Zellsuspension in ein Eppendorfgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)

überführt und mit 10 µl Trypanblau resuspendiert. Trypanblau dringt durch die

lysierten Zellmembranen abgestorbener Zellen ein und färbt diese blau an. 10 µl

dieser Mischung wiederum wurden unter das Deckgläschen einer Neubauer-

Zählkammer (Omnilab-Laborzentrum, Bremen, Deutschland) pipettiert. Unter dem

Inversmikroskop (Leica DM IRB) wurden anschließend die vitalen nicht blau

angefärbten Zellen in allen vier großen Feldern der Zählkammer ausgezählt.


Die Berechnung der Zellzahlen pro Kulturflasche und des Volumens an Suspension,

dass die gewünschte Zellzahl enthält, erfolgte nach folgenden Formeln:

Zellzahl (ZZ)= ( ) [ ]2

lVdcba µ×+++ Vol. [ ]lµ = [ ]ZZ

lVz µ×

ZZ = Zellzahl insgesamt pro Flasche

V[µl] = Volumen, in dem das Zellpellet resuspendiert wurde, in µl

Vol. [µl] = gesuchtes Volumen, das z enthält, in µl

z = gewünschte Zellzahl

a, b, c, d = Zählergebnisse der 4 ausgezählten Quadrate

Alle Zellzählungen und Berechnungen wurden protokolliert. Das verwendete

Protokoll ist im Anhang einzusehen.

3.5.2 Behandlung der Gliomzellen vor der Implantation

Für die Tumorzellimplantationen wurden jeweils zwei Zellportionen aus der

angelegten Zellbank entnommen, aufgetaut und jeweils über den gleichen Zeitraum

mit der gleichen Einsaatdichte und unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Den

Untersuchungen zu den optimalen Einsaatdichten folgend wurden 6 x 105 BT4Ca-

Zellen in eine 75 cm2 Gewebekulturflasche eingesät (Tag 0). An Tag 3 nach der

Einsaat wurden die Zellen subkultiviert und erneut 6 x 105 Zellen in jeweils 6

Gewebekulturflaschen eingesät. Jeweils an Tag 1 nach der Einsaat wurde ein

Mediumwechsel durchgeführt und an Tag 3 nach dem Subkultivieren wurden die

Zellen bei einer Konfluenz von mindestens 70% zur Operation verwendet.

Nach dem Herauslösen aus den Zellkulturflaschen mittels Trypsin und dem

Abzentrifugieren wurden die Zellen in 4 ml sterilem PBS (DakoCytomation)

resuspendiert. Anschließend wurde mittels Trypanblaufärbung die Vitalzellzahl

bestimmt und protokolliert.


Rechnerisch wurde die Menge PBS ermittelt, in der die Gesamtzellzahl

aufgenommen werden musste, um eine Zelldichte von 8 x 103 Zellen in 3 µl PBS zu

erhalten. Im Anschluss wurden die Zellen erneut abzentrifugiert und in der

errechneten Menge sterilem PBS resuspendiert. Durch das zweimalige

Abzentrifugieren und die Wiederaufnahme in sterilem PBS wurden immunogene

Mediumreste, entfernt. Die so für die Operation vorbereitete Zellsuspension wurde im

verschlossenen PP-Röhrchen in der Sterilbank stehend gelagert.

3.5.2.1 Untersuchung der Zellvitalität bei Lagerung in PBS

Während der Operationsdurchführung waren die Tumorzellen in sterilem PBS

suspendiert und standen bei Raumtemperatur in einem verschlossenen 15 ml PP-

Röhrchen in der Sterilbank. Da hierbei von verschlechterten Bedingungen gegenüber

der Lagerung in Zellkulturmedium bei Brutschrankbedingungen (37°C, 5% CO2)

ausgegangen werden musste, wurde eine Vitalzellzahlbestimmung über einen

Zeitraum von insgesamt 9 Stunden durchgeführt.

Die in einer definierten Dichte von 8 x 10³ Zellen pro 3µl PBS vorliegende

Zellsuspension wurde nach jeweils einer halben Stunde erneut resuspendiert, 10 ml

entnommen und mittels Trypanblaufärbung eine Vitalzellzahlbestimmung

durchgeführt (siehe Kapitel 3.5.1.4). Auf diese Weise wurde der Zeitraum ermittelt,

nach dem die Lebendzellzahl in der PBS Suspension bei Raumtemperatur um mehr

als 10% abgenommen hatte.

Bei der CellMed AG (Alzenau; Deutschland) wurde des Weiteren eine

Vitalzellzahlbestimmung mittels Cell-Counter (CASY®, cell counter and analysis

system, Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) durchgeführt. Das

Verfahren ermöglicht eine Unterscheidung der vitalen, intakten Zellpopulation (8-25

µm) und einer membrangeschädigten, sterbenden Zellpopulation (2-8 µm).


Dazu wurden die BT4Ca-Zellen nach Kultivierung über 2 mal 48 Stunden in sterilen

Phosphatpuffer aufgenommen und nach zweimaligem Abzentrifugieren jeweils 10 ml

PBS-Zellsuspension in zwei 15 ml PP-Röhrchen (Greiner BIO-One) überführt.

Zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7.5h, 9h wurde mittels CASY® Messung die

Zellfraktion der intakten, vitalen Zellen (8-30 µm) bestimmt.

Die Ergebnisse wurden auch hier durch eine Vitalitätsfärbung und Lebendzellzählung

verifiziert. Da die Vitalität von Zellen in PBS durch ein Absenken des

Zellstoffwechsels begünstigt werden kann, wurden die Lagerung und

Vitalitätsuntersuchung nicht nur bei Raumtemperatur, sondern auch bei 4°C im

Kühlschrank durchgeführt.

3.5.3 Behandlung der CellBeads® vor der Implantation

Die CellBeads® wurden von der Firma CellMed AG jeweils am Tag der Operationen

oder einen Tag vorher als Kryokonservate auf Trockeneis bei ca. -70°C verschickt

und kurz vor der OP im International Neuroscience Institute aufgetaut.

Eine Stunde vor Beginn der Arbeiten wurde die Sterilbank (Telstar AH-100, Labotect,

Göttingen, Deutschland) in Betrieb genommen und für die Implantationen vorbereitet.

Nach der Reinigung und Desinfektion (Deso Med Rapid AF, Desomed AG, Freiburg,

Deutschland) der Werkbank wurden die CellBeads® aus dem Kulturmedium in ein

engmaschiges Nylon-Siebchen (100 µm Maschenweite, BD Falcon, Bioscience,

USA) überführt und mehrfach mit ca. 30 ml sterilisiertem Phosphatpuffer (PBS, 0,1

M, pH 7,4) gespült, um mögliche Fremdkörperreaktionen durch Bestandteile des

Kulturmediums wie zum Beispiel hoch immunogenes fetales Kälberserum zu

vermeiden. Dann wurde das Siebchen mit den Implantaten in die Vertiefung einer

Zellkulturplatte (6er well-plate, Greiner BIO-ONE) gehängt, welches so hoch mit

sterilem PBS befüllt war, dass die CellBeads® gerade mit Flüssigkeit bedeckt waren.


Anschließend wurden ca. 20 Mikrokapseln unter Sichtkontrolle (Mikroskop Zeiss NC

32, Carl Zeiss, Jena, Deutschland) mit einer 1 ml Insulinspritze (Dispomed Witt oHG,

Geinhausen, Deutschland), auf die eine stumpfe Hamiltonkanüle (ga 18, Länge 51

mm, pst: AS, tap-, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz) aufgesetzt war, aus

dem Sieb entnommen und in eine sterile Petrischale (Greiner BIO-ONE) gegeben.

Mit der Insulinspritze wurden überflüssige Beads und Flüssigkeit unter

mikroskopischer Sichtkontrolle wieder entfernt. 12 CellBeads® wurden anschließend

mit einer 10 Mikroliterspritze (Hamilton) und einer scharfen, schräg angeschliffenen

Kanüle (ga 19, Länge 15 mm, pst:4, tap:Y, Hamilton) aufgenommen und zur

Implantation bereitgehalten.

Das Siebchen mit den übrigen Implantaten wurde anschließend in eine Vertiefung

der Zellkulturplatte überführt, die mit Kulturmedium befüllt war, um ein Aufquellen der

Implantate in PBS zu vermeiden.

3.5.4 Stereotaktische Implantationstechnik

Die Operationen erfolgten mittels eines stereotaktischen, mikrochirurgischen

Verfahrens unter lichtmikroskopischer Sichtkontrolle (Mikroskop NC Varioskop, Carl

Zeiss) an zwei aufeinander folgenden Tagen.

Die Gliomzelllinie wurde am ersten Tag (Tag 0) inokuliert und die Implantation der

CellBeads® erfolgte am Tag darauf (Tag 1).

Die Tiere wurden vor den Operationen gewogen und gekennzeichnet und alle Daten

einschließlich der Narkose, der Operationsdauer, den Koordinaten und den erfolgten

Implantationen wurden protokolliert. Das Operationsprotokoll ist im Anhang

aufgeführt. Das Operationsfeld auf der Schädeloberseite wurde auf einer Fläche von

etwa 2 x 2 cm rasiert, gereinigt, entfettet und desinfiziert (Cutasept®, BODE Chemie

GmbH & Co., Hamburg, Deutschland).


Auf die Bulbi occuli wurde zum Schutz vor Austrocknung während der Dauer der

Narkose eine Augensalbe (Vidisic, Augengel, Bausch & Lomb GmbH, Berlin,

Deutschland) aufgebracht.

Vor der Fixierung der Tiere in dem Stereotakten (SAS 4120, ASI Instruments,

Warren, USA) wurde Interaural 0 (IA0) bestimmt, um anhand anatomischer

Richttoleranzwerte die Orientierung an Bregma als Überprüfungspunkt möglich zu

machen. Dazu wurde die am beweglichen Seitenarm des Stereotakten angebrachte

Operationsnadel genau zwischen die beiden mittig eingestellten Ohrbalken gebracht

und die Koordinaten abgelesen. Anschließend wurde die Ratte im Stereotakten

fixiert. Anhand der Millimeterskalen wurden die Ohrbalken dabei so eingestellt, dass

das Tier genau in der Mitte fixiert war. Mit der Schnauzenklemme (incisor bar) wurde

die Schädeldecke so horizontal ausgerichtet, dass Lamda und Bregma nach

stereotaktischer Koordinatenermittlung auf derselben Höhe lagen. Vor Beginn des

Eingriffs erfolgte eine erneute Desinfektion des Operationsfeldes (Cutasept®). Die

benötigten, zuvor mit 70%igem Ethanol gereinigten Instrumente wurden für 20

Sekunden in ein Schnellsterilisiergerät (FST Fine Science Tools, Heidelberg,

Deutschland) gebracht. Mit einem Einmalskalpell (Carl Roth GmbH + Co. KG,

Karlsruhe, Deutschland) wurde eine sagittale Hautinzision auf einer Länge von etwa

einem Zentimeter zur Präparation des Operationsgebietes vorgenommen. Das

Periost wurde daraufhin mehrmals geschlitzt und mit einem Rasparatorium

(Dewimed Medizintechnik, Tuttlingen, Deutschland) zur Seite geschoben. Mit einem

Wattestäbchen wurde 3%ige Wasserstoffperoxidlösung aufgebracht, um die

Knochennähte, insbesondere die Suturae interfrontalis und sagittalis, zu bleichen

und besser sichtbar zu machen. Im Anschluss daran wurden die Koordinaten von

Bregma mit der am Seitenarm befestigten Operationsnadel angefahren, abgelesen

und mittels Differenzbestimmung zu IA0 kontrolliert und protokolliert. Von Bregma

aus 1 mm nach posterior und 2,8 mm sowie 3,4 mm nach rechts lateral wurden die

beiden Lokalisationen für die Bohrlochtrepanationen angesteuert und mit einem

dünnen Filzstift markiert. Einen schematischen Überblick über die

Implantationskoordinaten gibt die Abbildung 8 auf Seite 65.


Die Trepanationen erfolgten mittels eines 2,1 mm Bohrkopfes (FST Fine Science

Tools) und eines Handbohrers (Proxxon Minimot 40/E, Proxxon GmbH, Niersbach,

Deutschland) unter Schonung der Dura Mater. Der Bohrkopf wurde jeweils direkt auf

den Markierungen angesetzt, so dass zwei ineinander übergehende Bohrlöcher

entstanden, deren Zentren jeweils der Koordinate für die Implantation der

Gliomzellen (LM -2,8mm) und für die der CellBeads® (LM –3,4mm) entsprachen.

Anschließend wurde die Dura Mater mit einer scharfen Kanüle geschlitzt und Reste

und Knochenkanten mit einer feinen Pinzette (Dewimed Medizintechnik) entfernt, um

ein Verlegen der Implantationskanüle zu vermeiden. Direkt im Anschluss wurden die

Tumorzellen implantiert und am darauf folgenden Tag die CellBeads®.

3.5.4.1 Stereotaktische Implantation der Gliomzellen

Die in einem 15 ml PP-Röhrchen mit einer Zelldichte von 8 x 103 Zellen in 3µl zuvor

unter der Sterilbank (Heraeus Hera Safe, Kendro Laboratory Products GmbH,

Hanau, Deutschland) bereitgestellte BT4Ca Zellsuspension wurde zunächst mittels

einer serologischen 2 ml Pipette (Sarstedt) gründlich resuspendiert. Vor der

Verwendung wurde eine 10 Mikroliterspritze (Hamilton) mit einer scharf

angeschliffenen Implantationskanüle (ga 19, Länge 15 mm, pst: 4, tap: Y, Hamilton)

mehrfach mit 70%igem Ethanol gespült und, nachdem diese getrocknet waren,

mehrfach mit sterilem Phosphatpuffer (PBS, 0,1 M, pH 7,4) nachgespült. Dabei

wurde darauf geachtet, dass der Totraum in der so vorbereiteten Spritze mit einer

Luftblasen freien Flüssigkeitssäule gefüllt war. Anschließend wurden mit der

Mikroliterspritze 3 µl (= 8 x 103 Zellen) Suspension aufgezogen und diese an dem

beweglichen Arm des Stereotakten so fixiert, dass die Schräge des

Kanülenanschliffs zum Operateur zeigte. Die Kanüle wurde in das Bohrloch gefahren

und von der Schädeloberfläche ausgehend 5 mm abgesenkt. Nach einer

Verweildauer von ca. 10 Sekunden wurde die Kanüle wieder um einen Millimeter auf

DV -4 mm angehoben und die Zellsuspension zügig abgesetzt.


Nach weiteren 20 Sekunden wurde die Kanüle aus dem Bohrloch gezogen und die

Spritze mehrfach mit sterilem PBS gespült.

Anschließend wurde die Hautwunde mit etwa 4 Einzelheften mit nicht resorbierbarem

Nahtmaterial (Ethilon 4/0, Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH, Schortens,

Deutschland) über den nicht separat verschlossenen Trepanationsstellen vernäht.

Die restliche Zellsuspension wurde vor jeder weiteren Entnahme gründlich

resuspendiert.

Aufgrund der Ergebnisse aus der Vitalzellzahlbestimmung bei Lagerung in PBS

(siehe Kapitel 3.5.2.1 Bestimmung der Vitalzellzahl in Phosphatpuffer zur Operation)

wurde die Zellsuspension während der Dauer der Operationen alle drei Stunden

durch Zellen aus einer neuen Zellkulturflasche aus dem Brutschrank ersetzt.

3.5.4.2 Stereotaktische Implantation der CellBeads®

Am Tag nach der Injektion der BT4Ca-Gliomzellen wurde die Ratte zur Implantation

der CellBeads® erneut mit Ketamin (Ketanest®, Pfizer) und Medetomidin (Domitor®,

Pfizer) narkotisiert und im Stereotakten fixiert. Die Wunde und ihre Umgebung

wurden erneut gereinigt und desinfiziert (Cutasept®), auf die Augen wurde wieder

Salbe (Vidisic) als Tränenersatz aufgebracht. Im Anschluss wurden ein oder zwei der

die Hautwunde verschließenden Einzelhefte wieder geöffnet, so dass ein Zugang zur

medial gelegenen Bohrlochtrepanation möglich war, die Fäden entfernt und die

Wundflächen mit einer feinen Schere (Dewimed Medizintechnik) aufgefrischt. Die

mediale Trepanation verschließende Fibrosierungen wurden mit einer feinen Pinzette

vorsichtig entfernt und die Gehirnoberfläche an der für die Mikrokapseln

vorgesehenen Implantationskoordinate erneut freigelegt. Dabei wurde darauf

geachtet, Gewebszubildungen, die das für die Gliomzellinokulation verwendete

laterale Bohrloch verschlossen, zu schonen.


Die wie in Kapitel 3.5.3 beschrieben vorbereitete Mikroliterspritze mit den 12

CellBeads® wurde in den steuerbaren Arm des Stereotakten eingespannt und in das

mediale Bohrloch an der Koordinate AP -1 mm, LM -2,8 mm zu Bregma gefahren.

Anschließend wurde die Kanülenspitze von der Schädeldecke ausgehend um 6 mm

abgesenkt, etwa 10 Sekunden gewartet und dann auf DV -5mm wieder

hochgefahren. Die CellBeads® wurden dann im Schuss abgesetzt und die

Mikroliterspritze nach einer Verweildauer von etwa 20 Sekunden wieder entfernt.

Dabei wurden eventuell aus dem Stichkanal wieder hervorquellende CellBeads®

registriert, gezählt und protokolliert.

Im Anschluss an die Implantationen wurde der Stempel aus der verwendeten

Mikroliterspritze herausgezogen und diese mittels einer aufgesetzten Insulinspritze

mit sterilem PBS gespült. Die Spülflüssigkeit wurde in einer sauberen Petrischale

aufgefangen, um eventuell in der Spritze oder der Kanüle verbliebenen Restinhalt

mikroskopisch zu begutachten und zu protokollieren. Somit war eine kontrollierte

Aussage über die tatsächlich implantierte Anzahl CellBeads® möglich und mit der

später histologisch aufgefundenen Anzahl vergleichbar. Nach Abschluss des

Eingriffs wurde die aufgefrischte Hautwunde erneut durch Einzelhefte mit nicht

resorbierbarem Nahtmaterial (Ethilon 4/0) verschlossen.


Bregma

DV – 4 mm

DV – 5 mm

LM –3,4 mm

LM – 2,8 mm

AP – 1 mm

Gliom

CB

modifiziert nach PAXINOS (1998)

Abbildung 7 Operationsfeld mit Abbildung 8 Schematische Implantationskanüle Darstellung der

Implantationskoordinaten

Suturae interfrontalis und sagittalis, Grün: Tumorbereich, und BT4Ca

die sich in Bregma kreuzen, Bohrloch Inokulation

und abgesenkte Implantationskanüle Rosa: Bereich in dem die CB

aufzufinden sind und CB Implantation

3.6 Neuropathologische Untersuchungen

Die histopathologischen Untersuchungen der Gehirne fanden bei den Tieren, die zur

Ermittlung der idealen Implantationskoordinaten untersucht wurden, nach einem

Versuchszeitraum von 2 Tagen, bei allen anderen Tieren nach Tag 12 statt. Hierzu

wurden die Gehirne fixiert, entnommen, geschnitten, gefärbt und histologisch

untersucht.


3.6.1 Transkardiale Perfusionsfixierung

Nach Ablauf der Versuchszeiträume wurden die Rattengehirne mittels transkardialer

Paraformalin-Perfusion fixiert. Hierzu wurden die Tiere erneut mittels

intraperitonealer Ketanest® (Ketamin, Pfizer) und Domitor® (Medetomidin, Pfizer)

Injektion tief narkotisiert und anschließend in Rückenlage auf einer Korkunterlage

fixiert. Dabei wurde auf eine stabile Kreislaufsituation geachtet. Mit einer Schere

wurde zunächst eine Laparotomie und im Anschluss die Eröffnung des Thorax

durchgeführt, wobei rechts und links die Rippen durchtrennt wurden. Das Sternum

mit den Rippen wurde nach kranial vorverlagert und fixiert. Danach erfolgte eine

vorsichtige Präparation und Entfernung des Herzbeutels. Eine Knopfkanüle (1,6 ml,

GE Medical Systems, Garbsen, Deutschland) wurde nach Perforation des linken

Ventrikels in der Herzspitze vorgeschoben, bis sie an der Herzbasis gerade in der

Aorta sichtbar wurde, und mit einer Arterienklemme in ihrer Lage fixiert. Mit einem

Scherenschlag wurde das rechte Herzohr eröffnet, um so das Abfließen des Blutes

und der nachströmenden Flüssigkeiten zu ermöglichen. Der Perfusionsdruck lag

etwas über der Höhe des Blutdruckes der Ratte und wurde an den angeschlossenen

Infusionsflaschen reguliert.

An ein durch einen Wechselschalter verbundenes Infusionsbesteck waren eine

Infusionsflasche mit 0,9%iger Kochsalzlösung und eine mit durch Phosphatpuffer

(0,01 M, pH 7,4) frisch depolymerisiertem 4%igem Paraformaldehyd (PFA, Sigma-

Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland) angeschlossen. Alle Lösungen

wurden bei Raumtemperatur verwendet. Zunächst wurden die Schläuche geöffnet

bis keine Luftblasen mehr im System waren.

Dann wurde zunächst Kochsalzlösung durch die Knopfkanüle in die Ratte infundiert,

bis die abfließende Flüssigkeit klar und die Leber deutlich entblutet war (ca. 150 ml),

um eine Koagulation des Blutes im Gehirn und störende Effekte durch Erythrozyten

bei nachfolgenden Färbungen zu verhindern. Durch Umlegen des Wechselschalters

wurde dann auf die Perfusion mit Paraformaldehyd umgeschaltet.


Die fixierende Infusion der 4%igen Paraformaldehydlösung (PFA) erfolgte in einer

Menge von etwas mehr als 1 ml Lösung pro Gramm Körpergewicht (durchschnittlich

300 ml). Nach abgeschlossener Perfusionsfixierung wurde der Kopf abgesetzt und

der Schädel frei präpariert. Mit einer Hohlmeißelzange (Dewimed Medizintechnik)

wurde die Schädeldecke von Kaudal her abgetragen bis das gesamte Gehirn frei lag.

Mit einer feinen Schere wurden die Gehirnhäute und die Kopfnerven durchtrennt, das

Gehirn in toto entnommen und in ein mit 4%iger PFA-Lösung befülltes

Schraubgläschen überführt.

3.6.2 Nachfixierung

Die entnommenen Gehirne wurden zwei Tage lang in 4%igem PFA im Kühlschrank

bei 4°C nachfixiert. Anschließend wurden die Gehirne zweimal mit Phosphatpuffer

(0,1 M, pH 7,4) gewaschen und zur Kryoprotektion in ein Schraubgläschen mit

30%iger Sucroselösung (30 g Sucrose, Sigma-Aldrich und 70 g PBS 0,01 M, pH 7,4)

überführt. Hier verblieben die Gehirne bis zu ihrem Absinken, um die Bildung von

Eiskristallen bei der folgenden Schockgefrierung zu vermeiden.

3.6.3 Kryobehandlung

Die nach der transkardialen Perfusionsfixierung entnommenen nachfixierten und mit

Sucroselösung vorbehandelten Gehirne wurden in einer Aluminiumform

schockgefroren. Ein Gefäß mit 2-Methylbutan (Carl Roth) als Intermedium wurde

hierzu in flüssigen Stickstoff gehängt und die durch die Aluminiumform geschützten

Gehirne für maximal 5 Minuten darin schockgefroren. Anschließend wurden die

Gehirne bei -20°C (Economic no Frost, Robert Bosch GmbH, Stuttgart, Deutschland)

aufbewahrt.


3.6.4 Gefrierschnitte

Die Gefrierserienschnitte wurden mit einem Kryostaten (Gefriermikrotom, Microm HM

560 Cryo-Star, MICROM International GmbH, Walldorf, Deutschland) angefertigt und

auf beschichtete Objektträger (SuperFrost®Plus, Menzel, Braunschweig,

Deutschland) aufgezogen. Zunächst wurden die eingefrorenen Gehirne mit Hilfe

eines Einbettungsmediums für Gefrierschnitte (Tissue-Tek®, Sakura Fine Tek Europe

B.V., Zoeterwoude, Niederlande) auf dem Objekttisch aufgefroren und eingebettet.

Besonderes Augenmerk wurde hierbei auf die sichere Fixierung der Tumoren gelegt.

Im Anschluss wurden bei einer Objekttemperatur von -21°C Gefrierschnitte mit einer

Dicke von 10 µm angefertigt, diese mit einem feinen Pinsel ausgerichtet und auf die

Objektträger gebracht. Die Gefrierschnitte trockneten anschließend 24 Stunden bei

Raumtemperatur und wurden dann bei -20°C (Economic no Frost, Bosch) gelagert.

Im Rahmen der Etablierung des Versuchsmodells wurde jeweils jeder dritte

Gewebeschnitt alternierend auf einen Objektträger aufgezogen. Auf jeden

Objektträger kamen 6 Schnitte, so dass jeder der insgesamt 20 Objektträger pro Tier

einen Überblick über das ganze Gehirn darstellte. Es wurde der Bereich 0,5 mm bis

3 mm posterior zu Bregma untersucht. Die Orientierung erfolgte hierbei anhand des

anatomischen Atlanten von PAXINOS, G. u. C. WATSON (1998) über die

Neuroanatomie des Rattengehirns.

Um mit den histologischen Befunden für die Wirksamkeitsstudie im Hinblick auf

Tumorvolumen und –vaskularisierung reproduzierbare morphometrische

Berechnungen durchführen zu können, war es erforderlich, regelmäßige und

repräsentative Schnitte durch die Tumoren zu erhalten. Daher wurde folgendes

System für die Aufnahme der Gewebeschnitte entwickelt:

Immer 12 Schnitte à 10 µm machten einen Takt aus (120 µm). Immer zwei

aufeinander folgende Schnitte wurden zusammen aufgenommen, um einen

Referenzschnitt zu haben. So ergaben sich 6 Proben in einem Takt. Jeweils zwei

dieser Proben waren für eine Färbung geplant, um zur Kontrolle eine B-Probe zur

Verfügung zu haben.


Daraus folgten jeweils 3 A- und B- Proben für die drei geplanten Färbungen je Takt.

Die zur selben Färbung und A- oder B-Probe gehörenden Gewebeschnitte zweier

Takte wurden auf einem Objektträger aufgenommen, so dass auf jedem Objektträger

4 Schnitte waren und für 2 aufgenommene Takte à 24 Gewebeschnitte 6

Objektträger benötigt wurden. Einen Überblick über die Systematik gibt die

schematische Darstellung in Abbildung 9. Mit der Aufnahme der Schnitte wurde bei

lichtmikroskopisch (Olympus BX51 Hellfeldmikroskop, Olympus, Hamburg,

Deutschland) kontrolliertem Tumoranfang begonnen und bis zum Tumorende

fortgefahren. Konnten auf Grund der Größe eines Tumors nicht alle Schnitte

aufgenommen werden, so wurde immer ein ganzer oder mehrere ganze Takte

verworfen, um die Systematik einzuhalten und für die Auswertung repräsentative

Querschnitte durch die Gehirne beziehungsweise die Tumoren zu garantieren. Vor

Beginn des Schneidens wurde die makroskopisch erkennbare rostrokaudale

Tumorausdehnung mit einer Schieblehre bestimmt und danach entschieden, der

wievielte Takt jeweils aufgenommen beziehungsweise wie viele zwischen den

aufgenommenen Schnitten verworfen wurden. Das Protokoll der

Gefrierschneidetechnik ist im Anhang aufgeführt.

1 13

2 14

3 15

4 16

5 17

6 18

7 19

8 20

9 21

10 22

11 23

12 24

25 37

26 38

27 39

28 40

29 41

30 42

31 43

32 44

33 45

34 46

35 47

36 48HE A HE B vWF A vWF B En A En B HE A HE B vWF A vWF B En A En B

Objektträger

1

Objektträger

2

Objektträger

3

Objektträger

4

Objektträger

5

Objektträger

6

Objektträger

7

Objektträger

8

Objektträger

9

Objektträger

10

Objektträger

11

Objektträger

12

Takt 1 + Takt2 Takt 3 + Takt4

Die Zahlen 1 bis 48 kennzeichnen die aufgenommenen Gewebeschnitte

HE A = A-Probe für H.E.-Färbung HE B = B-Probe für H.E.-Färbung

vWF A = A-Probe für vWF-Färbung vWF B = B-Probe für vWF-Färbung

En A = A-Probe für Endostatin-Färbung EN B = B-Probe für Endostatin-Färbung

Abbildung 9 Schematische Darstellung der Schneidesystematik für die ersten 4 Takte Bis zum Tumorende wurde entsprechend weiter verfahren.


3.6.5 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)

Die Gewebeschnitte zur Etablierung des Modells sowie die Schnitte auf einem

Objektträger je Takt zur Untersuchung der Wirksamkeit der CellBeads® wurden

mittels Hämatoxylin (Harris Hämatoxylin, Thermo Electron Corporation GmbH,

Dreieich, Deutschland) und Eosin (Shandon Instant Eosin Aqueous, Thermo Electron

Corporation) gefärbt. Bei der H.E.-Färbung stellt sich der Zellkern durch Bindung des

Hämatoxylins an das basophile Chromatin dunkelblau dar. Die zytoplasmatischen

Proteine werden durch Salzbildung der Eosinanionen mit den positiven

Proteingruppen rot angefärbt.

Die aus der -20°C Kühlung entnommenen Objektträger mit den zu untersuchenden

Proben wurden zunächst mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur

aufgetaut, um Kristallbildungen zu vermeiden. Anschließend wurden je 10

Objektträger in einer Glasküvette zum Quellen für 10 Minuten in einen mit

Leitungswasser gefüllten Färbetrog gestellt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation in

zuvor gefiltertem Hämatoxylin für 3 Minuten und danach eine Wässerung für 5

Minuten in fließendem Leitungswasser. Zur Differenzierung wurden die Schnitte

anschließend für 1 Sekunde in 50%igem Ethanol dem 0,15% HCl zugesetzt wurde,

getaucht, erneut 5 Minuten gewässert und anschließend 2 Minuten in Eosin inkubiert.

Nach zweimaliger Spülung in Aqua dest. für jeweils 1 Minute wurden die

Gewebeschnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (2 x 70%, 2 x 96%, 2 x 99% für

je 1 Minute) entwässert. Abschließend erfolgte eine dreimalige Behandlung mit Xylol

(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) und das Eindecken der

Objektträger mit Entellan (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und Deckgläschen

(Menzel GmbH + CoKG, Braunschweig, Deutschland). Das Färbeprotokoll ist dem

Anhang beigefügt.


3.6.6 Immunhistochemische Färbungen (IHC)

Für die immunhistologischen Färbungen (IHC) wurden die Objektträger eine Stunde

vor Arbeitsbeginn bei Raumtemperatur aufgetaut und getrocknet. Anschließend

wurden die Schnitte 3 mal 5 Minuten in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) gewaschen,

um grobe Verunreinigungen zu entfernen. Dann wurde ein Peroxidase Block

durchgeführt, um unspezifische Hintergrundfärbungen durch Reaktionen mit der

endogenen Peroxidase zu vermeiden. Dies geschah mittels einer Präinkubation für

15 Minuten in einer Lösung aus 5333 µl Wasserstoffperoxid und 400 ml PBS unter

Lichtausschluss. Für alle IHC Schritte wurden Färbetröge und Objektträgergestelle

aus lichtundurchlässigem, hitzebeständigem Polyoxymethylen verwendet (Carl Roth

GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland). Im Anschluss wurden die Peroxidreste

durch zweimaliges Spülen für je 5 Minuten in sauberem PBS entfernt und die

Schnitte dann für 5 Minuten in TRS-Puffer (Target Retrieval Solution, Code No

S169984, DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) gestellt. Bei TRS handelt

es sich um einen gebrauchsfertigen Puffer mit einem idealen pH-Wert von 6,1 zur

Antigendemaskierung. In einem Dampfgarer (Multi Gourmet FS 20, Braun AG,

Kornberg, Deutschland) wurde ein Färbetrog mit frischem TRS erhitzt. Bei Erreichen

von mindestens 92°C wurden die Objektträger in das heiße TRS überführt und bei

Erreichen von 94°C die Zeitmessung für 30 Minuten gestartet. Nach dieser

Hitzedemaskierung der zu detektierenden Antigene wurden die Objektträger samt

Färbetrog mit dem heißen TRS in ein Eiswasserbad verbracht und dort weitere 20

Minuten belassen, bevor das Gestell mit den Objektträgern aus dem Färbetrog

entnommen wurde. Bei zu frühem Herausnehmen bestand die Gefahr, dass die

Schnitte aufgrund ihrer hohen Temperatur trockneten. Die abgekühlten Objektträger

wurden anschließend feucht in Coverplates (Shandon Clips, Thermo Electron GmbH,

Dreieich, Deutschland) eingespannt. Dabei entstand zwischen dem Coverplate und

der Oberfläche des Objektträgers ein Kapillarspalt, in dem sich eine

Flüssigkeitssäule aufbaute.


Auf die nach oben gerichtete Öffnung dieses Spaltes wurden die weiteren

Reagenzien aufpipettiert, so dass sie sich den Kapillarkräften folgend gleichmäßig

über die Oberfläche des Objektträgers und somit über die Gewebeschnitte verteilten.

Im nächsten Schritt erfolgte die Blockung unspezifischer Antigenbindungen und die

Absättigung endogener Proteine um unerwünschte Hintergrundfärbungen zu

minimieren. Hierzu wurden 200 µl Antibody Diluent (Code No S080983,

DakoCytomation) aufpipettiert und 30 Minuten inkubiert. Der jeweils verwendete

Primärantikörper (siehe Kapitel 3.6.6.1 und 3.6.6.2) wurde den Verdünnungsreihen

entsprechend in Antibody Diluent verdünnt und anschließend für 30 Minuten in den

Coverplates inkubiert. Nach der Primärantikörperinkubation folgten 2 Spülschritte

über 5 Minuten mit je 500 µl TRS-Puffer und anschließend die Inkubation mit dem

statt eines Sekundärantikörpers zur Bindung an den Primärantikörper verwendeten

Polymer (EnVision + System/ HRP, Rabbit (AEC+), Code No K400811,

DakoCytomation) für weitere 30 Minuten. Nach einer Wiederholung des

Spülvorgangs wurde das Chromogen (Code No K 346911, DakoCytomation),

welches eine Bindung mit dem Polymer einging und so zu der antikörperspezifischen

Rotfärbung führte, auf die Objektträger pipettiert. Nach 26 minütiger Inkubation

wurde aus einer Spritzflasche zügig destilliertes Wasser über die Coverplates

gegeben um den Farbstoff wieder abzuspülen. Nach der Entnahme der Objektträger

aus den Coverplates folgte eine Hintergrund-Gegenfärbung mittels Hämatoxylin-

Inkubation (Thermo Shandon) für 1 Minute. Anschließend wurde durch zweimaliges

Tauchen in Ammoniaklösung (0,0037 M, Carl Roth) für jeweils 5 Minuten gebläut.

Nach zweimaligem Spülen für je 5 Minuten mit Aqua dest. wurden die Objektträger

mit einem Eindeckmedium auf Wasserbasis (Faramount Aqueous Mounting Medium,

DakoCytomation) und Deckgläschen (Menzel) eingedeckt. Bei allen durchgeführten

immunhistologischen Färbungen wurde ein Objektträger statt mit Primärantikörper

mit einer Negativkontrolle (Negative Control Rabbit Immunoglobulin Fraction, Code

No X093602, DakoCytomation) inkubiert, um das Färbeergebnis kontrollieren zu

können. Alle Färbungen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt und dem im

Anhang einzusehenden Färbeprotokoll entsprechend protokolliert.


3.6.6.1 Von-Willebrand-Faktor (vWF)

Der von Willebrand-Faktor ist ein Protein, das von den Endothelzellen der

Blutgefäßwände exprimiert wird. Er spielt eine Hauptrolle bei der Hämostase. Kommt

es zum Riss in einer Gefäßwand, liegen Kollagene frei. Der vWF bindet an dieses

und an Glykoprotein I/IX auf den Thrombozyten und vermittelt somit die

Plättchenaggregation. Eine immunhistochemische Färbung des vWF ist somit dazu

geeignet die Blutgefäßwände auch kleinster Kapillaren darzustellen.

Es wurde aus jedem aufgenommenen Takt ein Objektträger gefärbt.

Verwendet wurde ein polyklonaler Primärantikörper gegen humanen von-Willebrand-

Faktor, der mit Ratten-vWF kreuzreagiert (Polyclonal anti human vWF, Code No

A008202, DakoCytomation). Vor der eigentlichen Versuchsdurchführung wurden

Verdünnungsreihen des Primärantikörpers getestet, um die ideale

Antikörperverdünnung von 1:400 zu ermitteln.

Der verwendete Antikörper (Ak) stammt aus dem Kaninchen, so dass ein Polymer

(EnVision + System/ HRP, Rabbit (AEC+), Code No K400811, DakoCytomation)

verwendet wurde, welches spezifisch an Kaninchen-Ak bindet.

3.6.6.2 Endostatin

Bei Endostatin handelt sich um ein Protein, das auch endogen sezerniert wird. Um

spezifisch das aus den implantierten Mikrokapseln freigewordene humane

Endostatin nachzuweisen, wurde ein polyklonaler Antikörper gegen humanes

Endostatin verwendet, der nicht mit dem der Ratte kreuzreagiert (Polyclonal Antibody

to Human Endostatin, Cat No DP3053, Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen,

Deutschland). Um eine Verwechselung mit dem endogenen Endostatin der Ratte

zusätzlich auszuschließen, wurden auch die Gewebeschnitte der nicht mit humanem

Endostatin behandelten Tiere gefärbt und verglichen. Auch der verwendete

Endostatin-Primärantikörper entstammte dem Kaninchen, so dass dasselbe Polymer

wie bei der von-Willebrand-Faktor-IHC verwendet werden konnte.


Eine zuvor getestete Verdünnungsreihe ergab eine ideale Antikörperverdünnung von

1:75 für den Endostatin-Ak. Um den qualitativen Nachweis des humanen Endostatins

zu führen und die Proteinverteilung innerhalb des Gewebeanschnitts zu beurteilen,

wurden jeweils 2 Objektträger mit Gewebeschnitten aus den Bregma -1 mm am

nächsten liegenden Takten gefärbt. So wurden insgesamt 4 Lokalisationen aus dem

Bereich der Implantationskoordinate auf die Anwesenheit humanen Endostatins

untersucht. Es wurden alle 10 Tiere der mit Endostatinbeads behandelten Gruppe

und jeweils 3 Tiere aus den anderen 3 Gruppen untersucht.

3.6.7 Mikroskopische Auswertung

Die histologische Beurteilung der gefärbten Gewebeschnitte erfolgte

lichtmikroskopisch mit dem Olympus System-Mikroskop BX51 Hellfeld (Olympus,

Hamburg, Deutschland) und die fotografische Dokumentation mittels einer digitalen

Kamera (Color View Soft Imaging System, Olympus). Die Bilddokumente wurden zur

Archivierung im TIFF-Format und in dieser Arbeit als JPEG-Formate verwendet. Die

Bildbearbeitung und Auswertungen wurden mit der Software cell*f (Imaging Software

for Life Sciences Microscopy, Olympus) durchgeführt. Die Bilddateien der gefärbten

Schnitte sind nach folgendem Schema benannt worden: Tiernummer/ Gruppe

(CellBead®-Charge kodiert)/ Färbung/ Schnittnummer (Beispiel: EN79/CB039/HE/4).

Bei den zur Bestimmung der Vaskularisierungsdichte herangezogenen Bildern wurde

zusätzlich die ausgewertete Lokalisation vermerkt (Bu/Bo/Bm, Fo/Fu/Fm).


3.6.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) zur Etablierung des Modells

Bei der histologischen Auswertung der H.E. gefärbten Schnitte zur

Versuchsetablierung wurde die Implantationstechnik zur intrazerebroventrikulären

Applikation der CellBeads® daran beurteilt, wie viele Mikrokapseln im Gewebe zu

finden waren, wo diese lagen und ob sie im Kontakt zum rechten Seitenventrikel

standen. Außerdem wurden die Gewebsreaktionen auf die CellBeads®

beziehungsweise auf den Stichkanal beurteilt.

Zur Etablierung des Glioblastommodells lag das Hauptaugenmerk auf der

histomorphologischen und strukturellen Beurteilung des Tumors, dabei wurden

besonders die Größe und Ausdehnung der experimentellen Gliome verglichen. Bei

den zur Entwicklung der zweizeitigen Applikation von Gliomzellen und Mikrokapseln

operierten Tieren wurden die Lage und die Tiefe der jeweiligen Stichkanäle und die

Lage und Entfernung des Tumors und der CellBeads® zueinander bewertet.

3.6.7.2 Immunhistologischer Nachweis des Endostatins

Mit Hilfe der immunhistochemischen Markierung humanen Endostatins erfolgte der

Nachweis der Proteinfreisetzung durch die Implantate und damit der

Funktionsfähigkeit der CellBeads®. Gleichzeitig wurde untersucht, wo der Wirkstoff

sich anreicherte. Die Auswertung erfolgte anhand einer Klassifikation in eine positive

oder negative Immunreaktion.

Dazu wurden die Gewebeschnitte lichtmikroskopisch mit dem BX51 Hellfeld

Mikroskop untersucht und in verschiedenen Vergrößerungen mit der SoftImage-

Kamera fotografiert. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die CellBeads®, das

sie direkt umgebende Gewebe, die Ventrikelwände, den Plexus Choroideus und den

Virchow Robin Raum als erwartete Gebiete der Endostatinanreicherung gelegt.


3.6.7.3 Immunhistologie zur Untersuchung der Tumorvaskularisierung

Die lichtmikroskopische Auswertung der immunhistochemischen Anfärbung des von-

Willebrand-Faktor erfolgte nach dem Abfotografieren der Gewebeschnitte mit dem

BX51 Hellfeld Mikroskop und der SoftImage-Kamera mit dem 10-er Objektiv. Um

mehrere repräsentative Lokalisationen der Tumorvaskularisierung beurteilen zu

können, wurden 2 Gewebeschnitte pro Tier und 3 Regionen pro Gewebeschnitt

ausgewertet. Es wurden die Gewebeschnitte des in der Volumenauswertung

bestimmten größten Tumoranschnitts (größte Fläche) und der

Implantationslokalisation (Bregma -1 mm) in der rostrokaudalen Ausdehnung des

Tumors untersucht. An diesen beiden Lokalisationen wurde dann jeweils 1

Ausschnitt an der maximal dorsal liegenden, der am weitesten ventral liegenden

Tumorausdehnung und an einer immer auf dieselbe Weise angefahrenen und so

randomisierten Position zwischen den ersten beiden beurteilt.

Die 6 aufgenommenen Regionen (ROI, Region of Interest) wurden getrennt

ausgewertet und ihre Bezeichnung erfolgte als:

ROI- Fu (größte Fläche unten) ROI- Bu (Bregma -1 mm unten)

ROI- Fo (größte Fläche oben) ROI- Bo (Bregma -1 mm oben)

ROI- Fm (größte Fläche Mitte) ROI- Bm (Bregma -1 mm Mitte)

Die Auswertung erfolgte mittels mit der Software cell*f (Olympus) durchgeführter

Partikeldetektion. Dabei war ein fotografiertes Sichtfeld gleich der detektierten

Fläche (ROI). Durch die Verwendung des immer gleichen Objektivs wurde

sichergestellt, dass eine jedes Mal gleich große Fläche von 575321,78 µm2

untersucht wurde. Zunächst wurde eine Farbwertüberarbeitung durchgeführt, um die

positiv rot gefärbten Blutgefäßwände für die digitale Detektion deutlich von der

blauen Hämatoxylin-Gegenfärbung abzusetzen. Für alle Bilder wurden dieselben

einmal definierten Farb-, Gamma- und Sättigungswerte verwendet.


Im Anschluss wurde ein Farbschwellwert bestimmt, bei dem Partikel eines

bestimmten Farbwertes als positiv detektiert wurden. Auch dieser einmal definierte

Wert wurde für alle Auswertungen gleichermaßen angewendet. Die Partikel, deren

Farbe diesen Schwellwert überschritten, wurden im Anschluss detektiert.

Blutgefäßanschnitte, deren nicht rot angefärbte Hohlraumvolumina von der Software

nicht detektiert wurden, wurden mittels Handwerkzeug hinzugefügt. Durch die

Software ermittelt beziehungsweise berechnet wurden die Anzahl der detektierten

Partikel, die Dichte der Partikel, die Gesamtfläche aller detektierten Partikel im ROI

und deren prozentualer Flächenanteil an der Fläche des ROI. Diese Daten wurden in

einer Datenbank archiviert und zur weiteren Berechnung in Excel übertragen.

Ermittelt wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Gruppen

für alle gemessenen Parameter.

3.6.7.4 H.E.-Färbung zur Untersuchung der Tumorgrößen

Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) der Gewebeschnitte aus der

Wirksamkeitsuntersuchung dienten der histomorphologischen Beurteilung, dem

Nachweis der Implantate, und zur Ermittlung der Tumorvolumina. Histologisch stellte

sich der Bereich des Glioblastoms dunkellila und der des gesunden

Gehirnparenchyms rot dar. Der zur Aufnahme der Gefrierschnitte auf Objektträger

entwickelten Systematik (Vergleich Kapitel 3.6.4) folgend wurde aus jedem

aufgenommenen Takt ein Gewebeschnitt ausgewertet. Das Tumorvolumen wurde

mit folgendem histomorphologischen Verfahren näherungsweise bestimmt: Gemäß

der entwickelten Systematik (Vergleich Kapitel 3.6.4) wurden in regelmäßigen

Abständen durch die gesamte Länge der rostrokaudalen Tumorausdehnung die

Gewebeschnitte mit dem 1,25-fach vergrößernden Objektiv in mehreren

Einzelaufnahmen abfotografiert und mittels rechnerischen Ränderabgleichs durch die

verwendete Software, der Bildmontagefunktion (Multiple Image Alignment), zu einem

Gesamtbild des Gewebeanschnitts zusammengefügt.


Anschließend wurden die Flächen des histologisch darstellbaren, soliden

Tumorgewebes bei 50-facher Zoomfunktion mit der Messfunktion ausgemessen.

Die Berechnung des Teilvolumens zwischen zwei Gewebeschnitten erfolgte nach der

Formel für den Kegelstumpf:

Kegelstumpfvolumen = ( ) ( ) ( )

3²221²1 hrrrr ××+×+ π

Dabei entsprach der Takt als Abstand zwischen 2 Schnitten der Höhe h. Die Radien

r2 und r2 wurden als Äquivalentradien aus den gemessenen Flächen der

Tumoranschnitte jeweils vor und nach dem Takt mit folgender Formel ermittelt:

Äquivalentradius = π

lächegemesseneF

Das Gesamtvolumen eines Tumors ergab sich aus der Addition aller berechneten

Kegelstümpfe.


3.7 Statistische Auswertung

Die Daten aus den Volumenberechnungen zum Vergleich der Tumorgrößen wurden

als arithmetische Mittelwerte statistisch ausgewertet. Dazu wurden die

arithmetischen Mittelwerte über alle durch die Addition der aus den gemessenen

Flächen berechneten Kegelstümpfe ermittelten Tumorgesamtvolumina einer

Versuchsgruppe miteinander verglichen.

Die anhand der Partikeldetektion ermittelten Daten zur Blutgefäßdichte wurden als

arithmetische Mittelwerte über alle 4 Gruppen ausgewertet.

Es wurden die arithmetischen Mittelwerte der detektierten Partikelflächen als

prozentualer Anteil der von den Gefäßen eingenommenen Fläche an 6

untersuchten ROI (Region of Interest) getrennt berechnet und miteinander

verglichen. Weiterhin wurden die arithmetischen Mittelwerte der Summen der von

den Gefäßen eingenommenen Flächen von den 3 jeweils in einem Tumoranschnitt

ausgewerteten ROI als Gefäßfläche Summe an beiden untersuchten

Gewebeanschnitten (Implantationslokalisation und größte Fläche) getrennt ermittelt.

Als Gefäßanzahl Summe wurde die Summe der mittels Partikeldetektion gezählten

Partikel über 3 ROI an jeweils der Implantationslokalisation und an dem

Tumoranschnitt mit der größten Tumorfläche berechnet.

Die statistische Auswertung erfolgte mittels der Berechnung des arithmetischen

Mittelwertes und der Standardabweichung (SD). Zunächst wurde eine mehrfaktorielle

Varianzanalyse ANOVA (one way analysis of variance) durchgeführt, um zu

ermitteln, ob mehrere unabhängige Variablen (oder Faktoren) einzeln oder in

beliebiger Kombination einen statistisch gesicherten Einfluss auf ein Merkmal

(abhängige Variable) haben. Mit der Varianz wurde die mittlere quadratische

Abweichung der Daten vom Mittelwert beschrieben. Um einen gesicherten, nicht

zufälligen Unterschied zwischen den einzelnen Versuchsgruppen zu belegen, wurde

dabei mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (P value < 0,05) gerechnet.


Als Post Test zur Untersuchung der tatsächlichen Unterschiede zwischen den

Mittelwerten der Versuchsgruppen wurde der Tukey-Kramer multiple comparison

Test durchgeführt, bei dem alle Gruppen gegeneinander verglichen werden. Auch

hier wurde mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (P value <0,05)

gerechnet, welche aussagt, dass die errechneten Signifikanzen mit einer

Wahrscheinlichkeit von größer 95% „wahr“ sind.

Zur Bestimmung der Korrelation zwischen Blutgefäßdichte und Tumorvolumina

wurde die Summe der 3 pro Gewebeschnitt ermittelten Gefäßflächen den

Tumorvolumina für jede Versuchsgruppe getrennt gegenübergestellt.

Zur Ermittlung der Korrelationen von Tumorvolumen und Vaskularisierungsdichte

wurde die Funktion f(x) = a x X + Y zugrunde gelegt, wobei a die Steigung (slope) ist,

und X die Verschiebung auf der X-Achse (X-Intercept) und Y die Verschiebung auf

der Y-Achse (Y-Intercept) definiert. Liegt ein funktionaler Zusammenhang zwischen

X und Y vor, so lässt sich ein Stichprobenkorrelationskoeffizient r angeben, der

quadriert zu r² den Pearssonschen Korrelationskoeffizienten darstellt. Dieser

Koeffizient beschreibt die Güte des funktionalen Zusammenhangs zwischen zwei

Datenmengen (Goodness of Fit) und es wird von einer bestehenden Korrelation

gesprochen, wenn r² > 0,8 ist.

Alle statistischen Berechnungen und die graphische Darstellung wurden mit dem

Programm Prism® Version 4.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA)

durchgeführt.

4 Ergebnisse 81

4 Ergebnisse

4.1 Entwicklung des Versuchsmodells

4.1.1 Zellkultur

4.1.1.1 Kultivierung

Die Untersuchungen zur Ermittlung der idealen Einsaatdichte und Passagedauer

zeigten, dass bei einer Einsaatdichte von 6 x 105 Zellen in eine 75 cm2 Flasche an

Tag 0 und einer Passagedauer von 2 Passagen mit einer Subkultivierung an Tag 3

nach der Einsaat und einem Mediumwechsel jeweils an Tag 1 nach der Einsaat die

Zellen eine weitgehende Homogenität und eine Bewuchsdichte von 80% +/- 10%

aufwiesen. Das auf den Zellen stehende Medium war jeweils an Tag 1 und 3 klar und

wies nur einen sehr geringen Anteil gelöster, abgestorbener Zellen auf. Es war

hellrötlich gefärbt und somit noch im für die Zellen optimalen pH- Bereich 7 bis 7,5.

4.1.1.2 Vitalzellzahl

Die Messung der Zellvitalität von BT4Ca-Zellen im Lagerungsversuch in sterilem

Phosphatpuffer (PBS) bei Raumtemperatur mittels Trypanblaufärbung und Zählung

in der Neubauer-Kammer zeigte einen zunehmenden Lebendzellverlust nach 4

Stunden. Dabei konnte ein logarithmischer Verlauf bei der Abnahme der vitalen

Zellen beobachtet werden.

Die Untersuchung mittels Cell-Counter (CASY®, cell counter and analysis system,

Schärfe) ergab, dass die Zellen in PBS bei Raumtemperatur bis zu 4 Stunden und

bei 4°C bis zu 5 Stunden problemlos gelagert werden konnten. In diesem Zeitrahmen

lag die Vitalität der Zellen über 90%. Alle Tiere, die in diesem Zeitrahmen mit ein und

derselben Zellsuspension operiert wurden, erhielten somit die gleiche Anzahl vitaler

BT4Ca-Zellen. Der Verlauf des Vitalzellzahlrückgangs wird in der Abbildung 10

dargestellt.

82 4 Ergebnisse

Aufgrund der ermittelten Ergebnisse wurde unter Einbeziehung von einer Stunde

Sicherheitsspanne eine maximale Verwendungszeit für die zur Operation

angesetzten Zellsuspensionen von 3 Stunden festgelegt, um eine gleich bleibende

implantierte Tumorzellzahl sicherzustellen.

Vitale BT4Ca Zellen bei Lagerung in PBS

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 Stunden

Lagerung bei RT Lagerung bei 4°C

Vitale Zellen [%]

Abbildung 10 Ergebnisse der Vitalzellzählung von BT4Ca-Zellen bei

Lagerung in PBS Deutliche Reduktion der vitalen Zellen nach 4 Stunden bei Lagerung bei

Raumtemperatur und nach 5 Stunden bei Lagerung im Kühlschrank

4.1.2 Experimentelles Glioblastom

Die Untersuchungen zur Etablierung eines reproduzierbaren Tumormodells ergaben

eine optimale zu implantierende Gliomzellzahl von 8 x 103 BT4Ca-Zellen von der

Schädeloberfläche ausgehend, nach Absenken der Kanülenspitze auf DV -5 mm, 4

mm tief im Gewebe injiziert. Histologisch zeigten sich nekrotisierte Bereiche, die von

solchen mit einer erhöhten Zelldichte eingegrenzt waren.

4 Ergebnisse 83

Die perifokalen Tumorbereiche wiesen ödematisierte Strukturen mit aufgelockerten

Zellverbänden auf. Vor allem in den zentralen Tumorbereichen war eine starke

Vaskularisierung mit einer großen Anzahl glomerulär gewundener Blutgefäße zu

sehen. Makroskopisch stellten sich die Tumoren vielfältig mit blasigen, zum Teil

blutig infiltrierten, kavernösen Strukturen und zerfließender Textur dar.

Makroskopische Abbildungen des Tumors sind in Abbildung 11 und 12 und

histologische Gewebeschnitte in Bildtafel 1 auf Seite 85 einzusehen.

Auch die Implantation von 6 x 103 BT4Ca-Zellen führte zur Ausbildung eines zur

Auswertung ausreichend voluminösen Tumors, allerdings waren hier die

Variabilitäten innerhalb der Tumorgrößen bei den untersuchten Tieren sehr groß, so

dass keine Reproduzierbarkeit gewährleistet war. Implantierte Zellzahlen von

weniger als 6 x 103 Zellen führten zu sehr unregelmäßigem Tumorwachstum und

schon bei Reduktion der inokulierten Zellzahl auf 4 x 103 BT4Ca-Zellen wuchs bei 1

von 2 Tier gar kein Tumor mehr an. Die beurteilten Gewebeschnitte sind beispielhaft

in Bildtafel 1 auf Seite 85 dargestellt und eine Übersicht über die erhobenen Befunde

ist Tabelle 5 auf Seite 84 zu entnehmen.

Tumor

Tumor

Abbildung 11 Experimentelles Gliom Abbildung 12 Experimentelles Gliom fixiert und kryokonserviert paraformaldehydfixiert verdrängendes Wachstum, Ventrikel blasige, gallertige, teilweise blutig

komprimiert infiltrierte Textur

84 4 Ergebnisse

Tabelle 5 Ermittlung der geeigneten Gliomzellzahl zur Etablierung eines reproduzierbaren Tumormodells

Injizierte Zellzahl, Stamm und Anzahl der Tiere, erhobene Befunde nach 12 Tagen

Versuchsdauer

Rattenstamm BDIX/Ztm Tierzahl n =

implantierte Tumorzellzahl

histologische Befunde

2 Tiere 2 x 103

BT4Ca-Zellen

beide Tiere:

kein morphologisches Tumorwachstum;

vereinzelte Gliomzellen im Stichkanal

2 Tiere 4 x 103

BT4Ca-Zellen

1 Tier: Tumor < 1 mm

1 Tier: Gliomzellen im Stichkanal, kein

morphologisches Tumorwachstum

2 Tiere 6 x 103

BT4Ca-Zellen

1 Tier: ca. 5 mm Tumordurchmesser


Tumoren oberflächlich auf Hirnrinde

2 Tiere 8 x 103

BT4Ca-Zellen

1 Tier: ca. 7,5 mm Tumordurchmesser


Wachstum in der Tiefe, bis an den Seitenventrikel

Wiederholung zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit

3 Tiere 6 x 103

BT4Ca-Zellen

1 Tier: kein morphologisches Tumorwachstum


1 Tier: ca. 2,5 mm Tumordurchmesser

3 Tiere 8 x 103 BT4Ca-Zellen

alle Tumoren zwischen 7,5 und 10 mm

Durchmesser

Wachstum in der Tiefe, bis an den Seitenventrikel

4 Ergebnisse 85

4.1.2.1 Bildtafel 1

Bildtafel 1 H.E. Färbung zur Untersuchung der idealen Zellzahl zur Implantation und Darstellung der Tumorhistomorphologie

Tumoren (a) 12 Tage nach der Implantation von 2000 (A), 4000 (B), 6000 (C) und 8000 BT4Ca Gliomzellen (D/E/F/G/H/I); Gewundene, teils glomeruläre Blutgefäße (b) und Pseudopalisaden (c) (E/F); Übergang (d) von Pseudopalisaden (c) zu nekrotisierendem, aufgelockertem Gliomzellverband (e); Endothelzellproliferation (f), Migration (g) und Differenzierung (h) mit eingewanderten Erythrozyten (i)

B

E D

C A

G F

a a a

c b a

H I

d e

c

b c

f

h

g i

a

86 4 Ergebnisse

4.1.3 Koordinaten zur intrazerebroventrikulären Implantation der CellBeads®

Zur Implantation der CellBeads® intraparenchymal mit Kontakt zum liquorführenden

Ventrikelsystem wurde an den Koordinaten -1 mm AP (anterior-posterior), -2,8 mm

LM (latero-medial) und -5 mm DV (dorso-ventral) nach Vorbohren auf -6 mm DV zu

Bregma eine sichere Applikation der Implantate unter Eröffnung des rechten

Seitenventrikels ermöglicht. Dabei konnten mehrfach reproduziert zwischen 8 und 12

CellBeads® mit Kontakt zum rechten Seitenventrikel intraparenchymal in der rechten

Großhirnhemisphäre platziert werden. Einen Überblick gibt Tabelle 6 und die

mikroskopisch erhobenen Befunde sind beispielhaft in Bildtafel 2 auf Seite 90

einzusehen.

4 Ergebnisse 87

Tabelle 6 Ermittlung der zur Implantation der CellBeads® geeigneten stereotaktischen Koordinaten

Stamm und Anzahl der Tiere, Implantationskoordinaten, Befunde nach der

Implantation von 12 CB und nach 2 Tagen Versuchsdauer

Rattenstamm BDIX/Ztm Tierzahl n =

latero-mediale Koordinate (LM)

dorso-ventrale Koordinate (DV)


2 Tiere LM

-3,2 mm

DV -2,8 mm 2 CB nachweisbar

kein Kontakt zum Ventrikel

zu weit dorsal

2 Tiere LM

-3,2 mm

DV -3,5 mm 6 CB nachweisbar


zu weit lateral

2 Tiere LM

-3 mm

Vorbohren auf DV

-7 mm, Absetzen

bei DV -6 mm

kein CB nachweisbar

Stichkanal nicht im Ventrikel

zu tief, zu weit lateral

2 Tiere LM

-3 mm

Vorbohren auf DV

-6 mm, Absetzen

bei DV -5 mm

10 CB nachweisbar


2 Tiere LM

-2,8 mm

Vorbohren auf DV -6 mm, Absetzen

bei DV -5 mm

12 CB nachweisbar

CB stehen in Kommunikation

zum rechten Seitenventrikel

Wiederholung zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit

3 Tiere LM

-2,8 mm

Vorbohren auf DV -6 mm, Absetzen

bei DV -5 mm

zwischen 8 und 12 CB

reproduzierbar mit Kontakt

zum Ventrikel nachgewiesen

88 4 Ergebnisse

4.1.4 Koordinaten für die BT4Ca-Inokulation und zweizeitige Operation

Zur Inokulation des Tumors einen Tag vor der Implantation der Mikrokapseln

erwiesen sich die Koordinaten -1 mm AP (anterior-posterior), -3,4 mm LM (latero-

medial) und -4 mm DV (dorso-ventral), nach Vorbohren auf -5 mm DV, als geeignet.

So waren die Tumoren auch nach der CellBead®-Implantation in ihrer Größe und

Ausdehnung nach 12 Tagen mit denen der Tiere, die nur Gliomzellen implantiert

bekamen, vergleichbar. Die implantierten CellBeads® waren trotz des stark

verdrängenden Wachstums des experimentellen Glioms auch nach 12 Tagen an der

geplanten Lokalisation zuverlässig nachzuweisen und intakt. In der Bildtafel 2 auf

Seite 90 ist die Kombination der beiden OPs anhand von Gewebeschnitten

dokumentiert und Tabelle 7 verschafft einen Überblick über die durchgeführte

Untersuchung.

4 Ergebnisse 89

Tabelle 7 Entwicklung der Methodik zur zweizeitigen Implantation von Tumorzellen und CellBeads®

Stamm und Anzahl der Tiere, implantierte Tumorzellzahl, implantierte Mikrokapseln,

Implantationskoordinaten, erhobene Befunde nach 12 Tagen Versuchsdauer

Ratten-stamm BDIX/Ztm Tierzahl n =

Tumor-inokulation rechte Hemisphäre Tag 0

CellBead® Implantation rechte Hemisphäre Tag 1


4 Tiere 8 x 10³ BT4Ca-

Zellen

AP -1 mm

LM -3,4 mm

DV -5/ -4 mm

12 leere

CellBeads®

AP -1 mm

LM -2,8 mm

DV -6/ -5 mm

zwischen 8 und 12 intakte CB mit

Kontakt zum rechten Seitenventrikel

nachgewiesen

alle Tumordurchmesser zwischen 8,5

und 10 mm

Tumorausdehnung bis an Ventrikel

reichend

Lage von CellBeads® und Tumor

zueinander so, dass sie in direkter

Kommunikation zueinander stehen

gegebene Reproduzierbarkeit

90 4 Ergebnisse

4.1.4.1 Bildtafel 2

Bildtafel 2 H.E. Färbung zur Ermittlung der idealen Implantationskoordinaten und zur Untersuchung der zweizeitigen OP

Nach Implantation von 12 CellBeads® (CB) an AP -1 mm: 2 Tage post OP: an LM -3,2 DV -2,8 mm (A) nur 2 CB nachweisbar; an LM -3,2 mm DV -3,5 mm (B) 6 CB nachweisbar aber kein Kontakt zum Ventrikel (V); an LM – 3 mm DV – 7/-6 mm (C) kein CB; an LM -3 mm DV -6/-5 mm (D) waren insgesamt 10 CB nachweisbar (nur 7 im Schnitt erkennbar) und LM -2,8 mm DV -6/-5 mm (E) 12 CB mit Kontakt zum Ventrikelsystem 12 Tage post OP: wobei an Tag 0 8 x 10³ BT4Ca an LM -3,4 DV -5/-4 mm und an Tag 1 12 CB an LM -2,8 mm DV -6/-5 mm implantiert wurden (F/G); CB mit Kontakt zum Ventrikelsystem und gleichzeitig tumornah lokalisiert, Tumor (a) im Wachstum unbeeinflusst

A

F

E D

C B

G

a

a

V V

CB CB

CB CB

CB CB

4 Ergebnisse 91

4.2 Untersuchung der Wirksamkeit

4.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate

Bei allen 26 Tieren der 3 Versuchsgruppen, denen CellBeads® implantiert worden

waren, konnten die implantierten Mikrokapseln histologisch nachgewiesen werden.

Zur Auswertung der Ergebnisse aus den Untersuchungen zur Wirksamkeit des

Endostatins sollten nur Daten von Versuchstieren herangezogen werden, bei denen

mindestens 5 intakte Implantate nachgewiesen werden konnten. Dieses Kriterium

erfüllten alle operierten Tiere. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die

strukturelle Darstellung der äußeren Alginathülle und die Unversehrtheit des inneren

Zellcores gelegt. Beispielhaft sind die implantierten CellBeads® in den Abbildungen

der Bildtafel 5 auf Seite 105 einzusehen.

4.2.2 Nachweis der Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®

Ziel war es zum einen das freigesetzte humane Endostatin und damit die

Funktionalität der Implantate nachzuweisen. Zum anderen sollte gezeigt werden, wo

im Gehirnschnitt das Endostatin nach intrazerebroventrikulärer Applikation der

sezernierende Zellen enthaltenden Implantate aufzufinden war, um Hinweise auf die

Verteilung zu erhalten.

In den Gewebeschnitten der Tiere aus der mit Endostatinbeads (ECB) behandelten

Gruppe III konnte eine deutlich positive Immunreaktion gezeigt werden, anhand derer

die Freisetzung des humanen Endostatins belegt werden konnte. Dazu wurden

jeweils 2 Gewebeschnitte pro Tier auf das Vorhandensein von Endostatin-Antikörper-

Präzipitaten hin untersucht. Es konnte bei 9 von 10 Tieren der mit Endostatinbeads

behandelten Gruppe III Endostatin nachgewiesen werden.

92 4 Ergebnisse

Zum Vergleich wurden stichprobenweise jeweils 3 Tiere aus allen 3 übrigen Gruppen

untersucht. In den Gewebeschnitten aus diesen Gruppen war keine positive

Immunreaktion nachweisbar.

Im Rahmen der Auswertung konnte eine deutlich positive Färbung der im Zellcore

der angeschnittenen CellBeads® liegenden Stammzellen gezeigt werden. Zudem war

die Alginathülle der Mikrokapseln an vielen Stellen ebenfalls positiv rot angefärbt.

Weiterhin war eine immunhistologisch positiv zu bewertende Anfärbung des die

CellBeads® direkt umgebenden Gewebes erkennbar. Im Bereich des experimentellen

Glioblastoms sowie des umgebenden Parenchyms konnten zudem multipel verteilte

immunpositive Aggregate dargestellt werden. Diese wurden in einer Entfernung von

bis zu 4 mm entfernt von den CellBeads® angereichert im Gewebe gezeigt. Eine

immunpositive Aktivierung konnte weiterhin in den Bereichen der Ventrikelwände und

des Virchow Robin Raumes ausgemacht werden. Die aufgefundenen

Endostatinpräzipitate sind beispielhaft in der Bildtafel 3 auf Seite 93 dargestellt.

4 Ergebnisse 93

4.2.2.1 Bildtafel 3

Bildtafel 3 Immunhistologische Färbung des humanen Endostatins nach der Implantation von Endostatin sezernierenden humanen mesenchymalen Stammzellen (EMSC) für 12 Tage

Das von den genmodifizierten Stammzellen sezernierte Protein konnte in den Stammzellen (A), im Alginat (al) (A/B), im direkt die CellBeads® umgebenden Parenchym (B/C), im Parenchym in einer Distanz von bis zu 4 mm zu den CellBeads® (D/H), im Tumorgewebe (G/H/J), im Virchow Robin Raum (E/F) und als Anlagerungen an den Gefäßen (I) nachgewiesen werden. Die Pfeile weisen auf die positiven Immunreaktionen hin.

D E F G

H I

A C B

J

EMSC

al CB

CB CB

94 4 Ergebnisse

4.2.3 Untersuchung der Tumorvaskularisierung

Zunächst wurden die Histomorphologie und Struktur der Blutgefäße beurteilt. Dabei

zeigten sich vor allem in den zentralen und ventralen Tumorregionen der

unbehandelten Tiere stark vaskularisierte Bereiche mit bis zu 500 Gefäßanschnitten

pro Quadratzentimeter, die einen Durchmesser von bis zu 600 µm erreichten. In den

subarachnoidal gelegenen Randbereichen der Tumoren waren deutlich weniger und

feinere Kapillaren zu erkennen. Ein großer Anteil der Gefäße wies eine endotheliale

Hyperplasie sowie eine Vielzahl mitotischer Figuren auf und war zum Teil stark

gewunden mit kavernösen Ausbuchtungen. Die histomorphologische Untersuchung

der mit Endostatin CellBeads® behandelten Tumoren zeigte deutlich kleinere

Blutgefäße, deren Endothelien strukturierter und unauffälliger waren. Zudem wiesen

die Tumoren der behandelten Tiere, anders als die der Kontrolltiere avaskuläre

Bereiche ohne Gefäßanschnitte auf. Die histomorphologischen Befunde des Tumors

und seiner Blutgefäße sind in Bildtafel 1 auf Seite 85 dargestellt.

Die Untersuchung der Blutgefäßdichten erfolgte nach zwei verschiedenen

Auswertungsparametern, die über die Partikeldetektion der immunhistologisch rot

angefärbten Endothelien erhoben wurden.

Einmal wurde die Gesamtfläche der detektierten Endothelien einschließlich der

Gefäßlumina als prozentualer Anteil an der detektierten Fläche des ROI (Region of

Interest) gemessen und die arithmetischen Mittelwerte der Gruppen gegeneinander

statistisch ausgewertet. Dabei wurden die 6 pro Tier detektierten ROI getrennt

ausgewertet. Zusätzlich wurde die Summe der Gefäßflächen über die 3 jeweils in

einem der beiden ausgewerteten Gewebeschnitte (größte Fläche und

Implantationslokalisation) aufgenommenen ROI gebildet. Die Daten wurden ebenfalls

statistisch über alle Gruppen ausgewertet.

4 Ergebnisse 95

Der andere Auswerteparameter war die Anzahl der Blutgefäße an denselben

Lokalisationen. Diese Gefäßanzahl wurde als Summe der detektierten

Gefäßanschnitte über die aufgenommenen 3 ROI für die beiden Gewebeschnitte

getrennt bestimmt und verglichen.

An der Implantationslokalisation war die Vaskularisierungsdichte bei den mit

Endostatinbeads (ECB) behandelten Tieren nach allen Auswerteparametern und in

allen 3 ROI signifikant kleiner als bei den Kontrollgruppen. Die Fläche der Gefäße in

allen 3 ROI, die Summe der Flächen über alle 3 ROI und die Summe der

Gefäßanzahl über alle 3 ROI war bei den mit ECB behandelten Tieren der Gruppe I

signifikant kleiner als bei den Gruppen I, II und IV.

Signifikanzen der mit ECB behandelten Tiere an der Implantationslokalisation:

ECB vs BT4Ca P < 0,05

ECB vs LCB P < 0,01

ROI-Bo

ECB vs SCB P < 0,01

ECB vs BT4Ca P < 0,05 ROI-Bm

ECB vs LCB P < 0,001

ROI-Bu ECB vs LCB P < 0,001



Summe Flächen Bo/Bu/Bm

ECB vs SCB P < 0,01

Summe Anzahl Bo/Bu/Bm ECB vs BT4Ca P < 0,01

96 4 Ergebnisse

Bei der nach ROI getrennten Auswertung der Gefäßflächen zeigte sich im ROI-Bm

(Bregma –1 mm Mitte) eine signifikante Reduktion bei der mit Stammzellbeads (SCB)

behandelten Gruppe IV gegenüber der mit Leerbeads (LCB) behandelten Gruppe II.

Diese Signifikanz fand sich auch in der Summe der Gefäßflächen über alle 3 ROI (an

Bregma -1 mm) wieder.

Signifikanzen der SCB Gruppe an der Implantationslokalisation:

ROI-Bm SCB vs LCB P < 0,05

Summe Flächen Bo/Bm/Bu SCB vs LCB P < 0,01

Des Weiteren zeigte sich in der Auswertung der Summen der Gefäßflächen, dass die

Gefäßanschnittsflächen der Kontrollgruppe I (nur BT4Ca) signifikant kleiner war als

die der mit leeren Beads behandelten Gruppe II (LCB).

Signifikanz bei der Kontrollgruppe gegenüber Gruppe II an der Implantations-

Lokalisation:

Summe Flächen Bo/Bm/Bu BT4Ca vs LCB P < 0,01

Bei der statistischen Auswertung der Blutgefäßdichten an der Lokalisation der

größten Tumoranschnittsfläche zeigte sich die mit ECB behandelte Gruppe III bei

der Beurteilung der Gefäßflächen an allen 3 getrennt berechneten ROI, der Summe

der Gefäßflächen über 3 ROI und bei der Auswertung der Gefäßanzahl signifikant

kleiner als alle anderen Gruppen.

Die Auswertung der Gefäßanzahl als Summe über 3 ROI an der größten

Tumorfläche war bei der Endostatinbead-Gruppe III (ECB) signifikant kleiner als bei

allen anderen.

4 Ergebnisse 97

Dabei bestanden keine Unterschiede der Gruppen I, II und IV zueinander.

Signifikanzen der mit Endostatin behandelten Gruppe I an der größten

Tumoranschnittfläche:



ROI-Fo

ECB vs SCB P < 0,001



ROI-Fm

ECB vs SCB P < 0,05



ROI-Fu

ECB vs SCB P < 0,05



Summe Flächen Fo/Fu/Fm

ECB vs SCB P < 0,001


ECB vs LCB P < 0,05

Summe Anzahl Fo/Fu/Fm

ECB vs SCB P < 0,01

Bei allen zur Gefäßfläche erhobenen Daten (in den 3 getrennt gemessenen ROI und

in der Summe über alle drei ROI) war zudem die Gefäßfläche der Kontrollgruppe I

(nur BT4Ca) signifikant kleiner als die der mit Leerbeads behandelten Gruppe II

(LCB). Signifikanzen der Kontrollgruppe gegenüber LCB:

ROI-Fo BT4Ca vs LCB P < 0,05

ROI-Fm BT4Ca vs LCB P < 0,001

ROI-Fu BT4Ca vs LCB P < 0,05

Summe Flächen Fo/Fu/Fm BT4Ca vs LCB P < 0,001

98 4 Ergebnisse

Die Gruppe IV (Stammzellbeads, SCB) zeigte bei der statistischen Auswertung der

Daten aus ROI-Fm (größte Fläche Mitte), ROI-Fu (größte Fläche unten) und bei

denen aus der Summe der Flächen über alle 3 ROI einen signifikanten Unterschied

zur Gruppe II (Leerbeads, LCB). Signifikanzen SCB gegenüber Leerbeads:

ROI-Fm SCB vs LCB P < 0,05

ROI-Fu SCB vs LCB P < 0,01

Summe Flächen Fo/Fu/Fm SCB vs LCB P < 0,001

Einen Überblick verschaffen die Graphen 1 bis 10 und die Abbildungen der Bildtafel

4 auf Seite 99. Die ausführlichen statistischen Daten sind dem Anhang beigefügt.

4 Ergebnisse 99

4.2.3.1 Bildtafel 4

Bildtafel 4 Immunhistologische Färbung des von-Willebrand-Faktors zur Beurteilung der Blutgefäßdichten nach 12 Tagen Übersichtsaufnahme mit dem 1,25er Objektiv (AI/AII/AIII/AIV) und beispielhafte Darstellung der mit dem 10er Objektiv zur Partikeldetektion aufgenommenen ventralen ROI (BI/BII/BIII/BIV); Endothelien (e) der intratumoralen Blutgefäße (b) rot angefärbt; Gliomzellen und Parenchym blau; Für Glioblastome typische, glomeruläre Struktur der Blutgefäße erkennbar (c).

Gruppe I (AI/BI) nur BT4Ca-Zellen

Gruppe II (AII/BII) BT4Ca-Zellen und

Implantation

leerer CellBeads®

Gruppe III (AIII/BIII) BT4Ca-Zellen und

Implantation

Endostatin sezernierender

hMSC CellBeads®

Gruppe IV(AIV/BIV) BT4Ca-Zellen und

Implantation

nicht genmodifizierter

hMSC CellBeads®

A I

A IV

A III

A II

B I

B II

B III

B IV

e

e

e

b

c

b

b

e

b

100 4 Ergebnisse

Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche

an der Fläche des ROI-Fo(größte Anschnittsfläche-oben)

Kontrolle LCB ECB SCB0

102030405060708090

* ** *

Graph 1

[% R

OI]


an der Fläche des ROI-Fm(größte Anschnittsfläche-mitte)


102030405060708090

**

*

**

Graph 2

[% R

OI]


an der Fläche des ROI-Fu(größte Anschnittsfläche-unten)


102030405060708090 **

*

**

Graph 3

[% R

OI]

Vaskularisierung an der größten Anschnittsfläche 1

Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe

ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde

= kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen

*

4 Ergebnisse 101


über alle drei ROI an der größten Anschnittsfläche


2.5×105

5.0×105

7.5×105

1.0×106 ***

*

*

Graph 4

[µm

²]

Anzahl der Gefäßanschnitte überalle drei ROI an der größten Anschnittsfläche


250050007500

100001250015000175002000022500 * *

*

Graph 5

Vaskularisierung an der größten Anschnittsfläche 2Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe


* = kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen

102 4 Ergebnisse


an der Fläche des ROI-Bo(Bregma -1 mm-oben)


102030405060708090

***

Graph 6

[% R

OI]


an der Fläche des ROI-Bm(Bregma -1 mm-mitte)


102030405060708090

***

Graph 7

[% R

OI]


an der Fläche des ROI-Bu(Bregma -1 mm-unten)


102030405060708090 *

*

Graph 8

[% R

OI]

Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 1

Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe



*

4 Ergebnisse 103


über alle drei ROI an Bregma -1 mm


2.5×105

5.0×105

7.5×105

1.0×106

*

*** *

Graph 9

[µm

2 ]

Anzahl der Gefäßanschnitte überalle drei ROI an Bregma -1 mm


5000

10000

15000 *

Graph 10

Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 1Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe



*

Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 2

104 4 Ergebnisse

4.2.4 Untersuchung der Tumorvolumina

Der Vergleich der Tumorvolumina erfolgte nach rechnerischer Auswertung der über

die ganze Länge des Tumors gemessenen Anschnittflächen als arithmetische

Mittelwerte aller Gruppen gegeneinander. Dazu wurden die Gewebeschnitte mittels

Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbt und die Flächen mit einer speziellen Software

(cell*f, Olympus) bei 1,25-facher Objektivvergrößerung gemessen. Da ein Tier aus

der Kontrollgruppe I (nur BT4Ca) am Tag 9 post operationem verstarb und bei 2

witeren Tieren die Implantation der Gliomzellen misslang, konnten in dieser Gruppe

nur 7 Tiere ausgewertet werden

Nach der statistischen Auswertung waren die Tumorvolumina der mit Endostatin

sezernierenden Stammzellen behandelten Tiere (Gruppe III, ECB) nicht signifikant

kleiner als die Tumoren bei den Tieren aus den anderen drei Gruppen. Es konnte

lediglich eine tendenzielle Verkleinerung gegenüber der mit Leerbeads (Gruppe II,

LCB) behandelten Gruppe gezeigt werden.

Einen signifikanten Unterschied gab es lediglich zwischen den Tumorvolumina der

Tiere aus der mit LCB behandelten Gruppe gegenüber der mit Stammzellbeads

(SCB) behandelten Gruppe. Dabei waren die Tumoren der mit SCB kleiner als die

Tumoren der mit LCB behandelten Tiere.

Es bestand kein signifikanter Unterschied der Tumorvolumina zwischen den Tieren

der Gruppe I (nur BT4Ca), der Gruppe II (Leerbeads, LCB) und den Tieren der

Gruppe III (Endostatinbeads, ECB). Signifikanzen der Tumorgrößenunterschiede

innerhalb der Gruppen I bis IV, einzige Signifikanz an SCB vs LCB:

BT4Ca vs ECB P > 0,05 SCB vs ECB P > 0,05

BT4Ca vs LCB P > 0,05 SCB vs LCB P < 0,05

BT4Ca vs SCB P > 0,05 ECB vs LCB P > 0,05

Die detaillierten Ergebnisse der statistischen Untersuchung sind im Anhang

aufgeführt. Zur graphischen Darstellung siehe Graph 11 und einen Überblick über die

Tumoren verschaffen die Abbildungen der Bildtafel 5 auf Seite 105.

4 Ergebnisse 105

4.2.4.1 Bildtafel 5

Bildtafel 5 H.E. Färbung zum Nachweis der Implantate und zur Auswertung der Tumorgrößen nach 12 Tagen

Tumoren (a) bei den Gruppen I bis IV (AI/AII/AIII/AIV) mit in Kommunikation zum Ventrikel (V) implantierten Leerbeads (LCB), Endostatin CellBeads® (ECB), nicht sezernierenden Stammzellbeads (SCB); Darstellung der implantierten CellBeads® und ihres Kontaktes zum Ventrikel (B/C); CellBeads® mit Alginatkapsel (al) und nicht sezernierenden Stammzellen (hMSC) (D), Endostatin sezernierende Stammzellen (EMSC) im CellBead® (E) und Goldpartikel (gp) im Leerbead (LCB) (F)

AI

AIV AIII

AII

a

aa

a

SCBECB

LCB

B

FE D

CECB

ECBSCB

LCB

LCB

VV

al EMSC al gphMSC

106 4 Ergebnisse

Kontrolle SCB ECB LCB0.0

2.5×10 10

5.0×10 10

7.5×10 10

1.0×10 11

1.2×10 11

1.5×10 11

1.7×10 11 *

Arithmetische Mittelwerte über die Tumorvolumina, gemessen als Flächen in µm² in definierten Abständen durch die Länge des Tumors und berechnet als Summe von Kegelstümpfen in µm³

[µm³]

Tumorvolumina

Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppenach 12 Tagen

Graph 11

*

= statistisch signifikanter Unterschied zwischen zwei Gruppen

4 Ergebnisse 107

4.2.5 Korrelation zwischen Tumorvolumen und Blutgefäßdichte

Um zu ermitteln, ob ein direkter Zusammenhang zwischen der Vaskularisierung des

Tumors und seinem Volumen bestand, wurden für jede Versuchsgruppe getrennt die

Korrelation zwischen den Gefäßflächen und dem Tumorvolumen bestimmt. Dazu

wurde die Summe der Gefäßflächen über die 3 an einer Lokalisation ausgewerteten

ROI (Region of Interest) gebildet. So entstand eine Gefäßflächensumme pro

Lokalisation (Bregma –1 mm oder größte Fläche) und pro Tier, deren Korrelation zu

den entsprechenden Tumorvolumina ermittelt wurde. Bei 7 Tieren in Gruppe I (nur

BT4Ca) macht das 14 Paare (Graph 12), für Gruppe II (LCB) 16 Paare (Graph 13),

für Gruppe III (ECB) 20 Paare (Graph 14) und für Gruppe IV (SCB) noch mal 16

Paare (Graph 15), deren Korrelation getrennt voneinander berechnet wurde.

Es zeigte sich, dass bei diesem Versuchsmodell das Tumorvolumen und die

Blutgefäßdichte nicht korrelierten (r² < 0,8). Die graphische Darstellung ist in Graph

12-15 einzusehen und die genauen statistischen Daten sind im Anhang aufgeführt.

108 4 Ergebnisse

Korrelation Kontrollgruppenur BT4Ca

0

2.5×1

010

5.0×101

0

7.5×10

10

1.0×1

011

1.2×101

1

1.5×10

11

1.7×10

11

2.0×10

112.5×1053.0×1053.5×1054.0×1054.5×1055.0×1055.5×1056.0×1056.5×1057.0×1057.5×105

Goodness of Fitr² 0,4276Sy.x 108400

Graph 12

Tumorvolumen

Gefä

ßflä

che

ROI [

µ²]

Korrelation Leerbeads (LCB)

0

2.5×10

10

5.0×1

010

7.5×1

010

1.0×10

11

1.2×1

011

1.5×1

011

1.7×10

11

2.0×1

011

01.0×1052.0×1053.0×1054.0×1055.0×1056.0×1057.0×1058.0×1059.0×1051.0×1061.1×106


Graph 13

Tumorvolumen

Gef

äßflä

che

RO

I [µ²

]

Korrelation Stammzellbeads (SCB)

7.5×1

010

1.0×1

011

1.2×1

011

1.5×1

011

1.7×1

011

2.0×1

011

2.5×1053.0×1053.5×1054.0×1054.5×1055.0×1055.5×1056.0×1056.5×1057.0×1057.5×105


Graph 15

Tumorvolumen

Gef

äßfl

äche

RO

I [µ²

]

Korrelation Endostatinbeads (ECB)

0

2.5×1

010

5.0×1

010

7.5×1

010

1.0×1

011

1.2×1

011

1.5×1

011

1.7×1

011

2.0×1

011

0

5.0×104

1.0×105

1.5×105

2.0×105

2.5×105

Goodness of Fi tr² 0,1285Sy.x 45300

Graph 14

Tumorvolumen

Gef

äßflä

che

ROI [

µ²]

Korrelation zwischen Tumorvoluminaund Vaskularisierung

über beide LokalisationenDie Summe der Gefäßflächen aller sechs ausgemessenen ROIgegenüber dem jeweiligen Tumorvolumen für alle vier Gruppengetrennt

Korrelation zwischen Tumorvolumina

und Vaskularisierung

über beide Lokalisationen Die Summe der Gefäßflächen aller sechs ausgemessenen ROI

gegenüber dem jeweiligen Tumorvolumen für alle vier Gruppen getrennt

5 Diskussion 109

5 Diskussion

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein reproduzierbares Glioblastommodell in

der Ratte entwickelt werden, bei dem ein vergleichbarer experimenteller Gehirntumor

in der rechten Großhirnhemisphäre erzeugt wurde. Daran sollte die Wirksamkeit

Endostatin freisetzender CellBeads® auf die Blutgefäßdichte und das Tumorvolumen

untersucht werden. Die Freisetzung des von den Implantaten sezernierten Wirkstoffs

sollte immunhistologisch bewiesen und damit die Funktionalität der Implantate belegt

werden. Dazu mussten die Verfahren der Zellkultur und die Inokulation der Zellen

etabliert werden. Weiterhin sollte eine Methodik zur sicheren Applikation der

mikroverkapselten Stammzellen in einer festen intraparenchymalen Lage mit

Kontaktaufnahme zum Ventrikelsystem entwickelt werden.

5.1 Diskussion der Methodik

5.1.1 Tierexperimentelles Modell

5.1.1.1 Gliomzelllinie BT4Ca

Die Gliomzelllinie BT4C wurde 1971 von DRUCKREY et al. durch die Verabreichung

von N-ethyl-N-Nitroseharnstoff in BDIX-Ratten generiert. Auf diese Weise konnte

eine zu diesem Rattenstamm syngene Gliomzelllinie mit einem identischen MHC-

Haplotypen entwickelt werden, die zur Inokulation eines experimentellen

Gehirntumors geeignet war. DEISSLER et al. generierten 1996 an der Universität

Essen in BDIX/Ztm-Ratten mittels derselben Methodik eine Gliomzelllinie und

nannten diese BT4Ca. Diese Zellen wurden für die vorliegende Arbeit von dem

Institut für Zellbiologie (Tumorforschung) des Universitätsklinikums Essen bezogen

und im International Neuroscience Institute (Hannover) kultiviert. Die Syngenität mit

den BDIX/Ztm-Ratten wurde am Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule

(Hannover) mittels Zytotoxizitätstest bestätigt.

110 5 Diskussion

BEUTLER et al. (1999) führten zum Beweis der Syngenität mit BDIX-Ratten eine

MHC-Typisierung der verwendeten Gliomzellen durch. Die Kultivierung erfolgte

anhand der vorliegenden Literatur (READ et al. 2001, BEREZIN et al. 1997), wobei

sowohl überprüft wurde, welche die idealen Einsaatdichten und die beste

Passagedauer für die hier verwendeten Zellen waren und ob die Gliomzellen durch

die Kryokonservierung Vitalitätsverluste zeigten. Diese Prüfung erfolgte anhand der

Austestung verschiedener an der Literatur orientierter Ausgangswerte und wurde so

lange wiederholt, bis zufrieden stellende und reproduzierbare Ergebnisse im Hinblick

auf Zellmorphologie, Dichte des Zellrasens und Vitalität der Zellen erzielt wurden.

5.1.1.2 Histologie des Tumors

Die Gewebeschnitte zur histologischen Auswertung wurden orientiert an der

bestehenden Literatur als Kryostatenserienschnitte mit einer Schnittdicke von 10 µm

angefertigt, mittels Hämatoxylin Eosin (H.E.) gefärbt und beurteilt (LANGEN et al.

1998, ABOUNADER et al. 1995). Dabei wurden die Zellkerne angefärbt und der

strukturelle Aufbau des Tumors dargestellt (siehe Bildtafel 1 auf Seite 85) Die

Tumoren stellten sich typisch mit einer erhöhten Zelldichte, mitotischen Figuren,

großen glialen Tumorzellen mit großem Kern-Plasma-Verhältnis, der Bildung von

Pseudopalisaden und Nekrosen sowie einer erhöhten Vaskularisierungsdichte und

endothelialer Hyperplasie dar (TANAKA et al. 2006). Makroskopisch zeigten die

Tumoren die für Glioblastome typische gallertige bis zerfließende, blasige, teilweise

blutig infiltrierte Struktur (siehe Abbildung 8 auf Seite 65). Die histologischen Befunde

waren weitgehend mit den bei humanen Glioblastomen erhobenen vergleichbar

(WAGGENER et al. 1976). Eine veränderte Blutgefäßmorphologie einhergehend mit

der Ausbildung kavernöser und gewundener Gefäßstrukturen war ebenfalls zu

erkennen (LEON et al. 1996). Allerdings stellten sich das Tumorwachstum und seine

Ausdehnung im Vergleich zu den pathologischen Befunden beim Menschen weniger

infiltrativ als vielmehr verdrängend dar (DHAYAT u. GUGGEMOS 1999/2000).

5 Diskussion 111

So konnten nur vereinzelt von Gliomzellen flankierte Blutgefäße ausgemacht werden,

die infiltrierend in das umgebende Parenchym einwuchsen.

Die ermittelte Zellzahl von 8 x 103 Zellen suspendiert in 3 µl zur Inokulation des

Tumormodells findet sich in der Literatur bei READ et al. (2001a). Es wurde versucht

durch die Applikation von weniger Tumorzellen einen kleineren Tumor entstehen zu

lassen und dadurch eine Verlängerung des Untersuchungszeitraumes zu

ermöglichen. Aufgrund der logarithmischen Proliferation der Zellen und der

Notwendigkeit einer Mindestzellzahl (BEREZIN et al. 1997) zur Entwicklung eines

gleichmäßigen Tumors wurden aber bei der Applikation von weniger Zellen keine

zufrieden stellenden Ergebnisse erzielt. Bereits die Reduktion der implantierten

Zellzahl auf 6 x 10³ führte zu einer großen Variabilität innerhalb der Tumorgrößen

(Kapitel 4.1.2 Bildtafel 1, Seite 85). Diese Ergebnisse deckten sich mit den Befunden

aus der in vitro Untersuchung der Zellen zur Ermittlung der geeigneten

Einsaatdichten. Dabei zeigte sich ebenfalls eine starke Erhöhung der Heterogenität,

einhergehend mit dem Absterben von bis zu 50% der Zellen innerhalb der ersten 3

Tage nach der Subkultivierung, wenn diese zu gering konzentriert (< 3 x 104 pro ml)

in die Zellkulturflaschen eingesät worden waren.

5.1.1.3 Intrazerebroventrikuläre Implantation der CellBeads®

Die intraparenchymale räumlich nahe zum Tumor gelegene Applikation der

CellBeads® mit Kontakt zum Ventrikelsystem sollte eine Diffusion des Proteins

Endostatin in den Tumorbereich gewährleisten. Es gelang bis zu 12 CellBeads®

direkt am rechten Seitenventrikel, fest im Parenchym verankert und durch Eröffnung

des Ventrikels während der Implantation, in Kommunikation zu ihm zu platzieren. Die

histologischen Befunde zeigten, dass der Stichkanal nach 12 Tagen weitgehend

verschwunden war, so dass auch teilweise von einem astrozytären Wiederverschluss

der Ventrikeleröffnung ausgegangen werden muss (siehe Bildtafel 2 auf Seite 90).

112 5 Diskussion

Die direkte transparenchymale Diffusion, wurde von READ et al. (2000) über eine

Strecke von 1,7 mm beschrieben. Durch den Kontakt zum rechten Seitenventrikel

wurde außerdem eine Verteilung des Endostatins über den Liquor erreicht. Die

Implantate wurden in dieser Arbeit nicht direkt im Tumor platziert sondern

intraparenchymal ventral des Glioms. Trotzdem konnten immunhistologisch positive

Endostatinaggregate auch in einer Entfernung von bis zu 4 mm von den CellBeads®

sowohl intraparenchymal als auch im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die

Untersuchung der Diffusion über eine längere Distanz ist besonders von klinischer

Relevanz, da nach der chirurgischen Tumorresektion im Tumorbett verbliebene,

Rezidive auslösende Tumorzellen so über Diffusion nach einer Applikation der

CellBeads® in der Resektionshöhle erreicht würden.

Vorteile der Verabreichung eines therapeutischen Wirkstoffs mit Hilfe

alginatverkapselter Stammzellen sind die Möglichkeit der minimal invasiven, direkten

Verabreichung unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke. So werden hohe

Wirkstoffkonzentrationen am Zielort bei minimaler systemischer Belastung erzielt und

zudem die Möglichkeit einer somatischen ex vivo Gentherapie ohne Eingriff in das

Patientengenom geschaffen.

5.1.1.4 Biokompatibilität der implantierten CellBeads®

In diversen Veröffentlichungen wurde Alginat eine gute Biokompatibilität und

Immunisolierung sowohl nach intraperitonealer (KULSENG et al. 1999) als auch

nach intrazerebraler Injektion (READ et al. 1999, VISTED u. LUND-JOHANSEN

2003) zugeschrieben. Anhand klinischer Versuche wurden die Stabilität und

Verträglichkeit bewiesen (LAHAM et al. 1999, SOON-SHIONG et al. 1994). Neuere

Publikationen belegten zudem den erfolgreichen Einsatz alginatverkapselter Gewebe

oder Stoffe zur neuroprotektiven Therapie bei Morbus Huntington (BORLONGAN et

al. 2004a), der Parkinsonerkrankung (YASUHARA et a. 2005) und beim Schlaganfall

(BORLONGAN et al. 2004b).

5 Diskussion 113

Weiterhin wurde in einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit am International

Neuroscience Institute (BARTSCH 2005) eine gute Biokompatibilität, einhergehend

mit erhaltener Vitalität der implantierten Stammzellen nach 8 Wochen bei den in

dieser Arbeit verwendeten CellBeads® gezeigt. So wurde histologisch eine

unveränderte Neuronenstruktur mit geringgradiger Astrozytose und ohne

Fibrosierungen gezeigt.

Nach Explantation der CellBeads®, konnte bei 98% der Implantate mittels SYBR

vermittelter Markierung eine erhaltene Vitalität nachgewiesen werden. Die in dieser

Arbeit erhobenen histologischen Befunde zeigten keine Hinweise auf eine

Entzündungsreaktion oder Aktivierung immunologischer Prozesse sowie intakte und,

aus der positiven immunhistologischen Reaktion des Endostatins folgernd,

sezernierende vitale Implantate. Dies belegt die gute Verträglichkeit und

Anwendbarkeit der verwendeten xenogenen alginatverkapselten Implantate.

5.1.2 Untersuchungsmethoden

Die angewendeten Untersuchungsmethoden ließen die Vergleichbarkeit der

erhobenen Daten mit publizierten Methoden und Ergebnissen zu, hielten der

Überprüfung auf Reproduzierbarkeit stand und erlaubten die Beurteilung der

Wirksamkeit des durch die implantierten Mikrokapseln sezernierten Endostatins.

Die verwendeten CellBead® Chargen waren dabei bis zum Abschluss der

Auswertungen kodiert, so dass durch die verblindete Durchführung eine

unvoreingenommene Datenerhebung garantiert war.

5.1.2.1 Immunhistologische Untersuchung der Endostatinfreisetzung

READ et al. (2001) zeigten die Endostatinverteilung nach der Implantation

sezernierender Mikrokapseln mittels immunhistologischer Anfärbung des Proteins.

Um den Nachweis des sezernierten Proteins Endostatin und damit der Funktionalität

der Gefäße immunhistologisch zu führen, wurde ein Antikörper ausgewählt, der

spezifisch an humanes Endostatin bindet.

114 5 Diskussion

Da das Endostatin als frei diffundierendes Protein erwartungsgemäß zumindest in

weiter von seinem Ausgangspunkt, den CellBeads® entfernten Bereichen, stark

verdünnt vorlag, wurde eine sehr sensible Antikörperverdünnung gewählt. Dennoch

waren störende Hintergrundfärbungen durchweg gering und die immunhistologisch

positiv rot gefärbten Proteinaggregate nach Gegenfärbung mit Hämatoxylin sehr gut

zu erkennen (siehe Bildtafel 3 auf Seite 93).

Die Endostatinfreisetzung wurde als positive oder negative Immunreaktion

ausgewertet, wobei das Auffinden des humanen Endostatins außerhalb der

CellBeads® den Schluss auf die stattgefundene Sekretion erlaubte. Weiter wurde

beurteilt, wo im Gewebeanschnitt Endostatin zu finden war, um so Hinweise auf

seine Verteilung zu bekommen.

5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung der Endostatin CellBeads®

Die antiangiogene Wirksamkeit von Endostatin wurde trotz der bisher nicht genau

geklärten Wirkmechanismen in verschiedenen Arbeiten untersucht. Die meisten der

aktuellen Veröffentlichungen befassen sich dabei mit den tumorsuppressiven Folgen

einer Angiogenesehemmung durch Endostatin. So untersuchten SU et al. (2006) die

Auswirkungen einer Endostatinbehandlung auf das Prostatakarzinom, LI et al. (2006)

auf ein nasopharyngeales Karzinom, ALBA et al. (2006) untersuchten die

Auswirkungen unterschiedlicher Serumendostatinkonzentrationen auf das Wachstum

von Mammakarzinomen und SUBRAMANIAN et al. (2006) zeigten

Tumorsuppression und verlängerte Überlebenszeiten bei ovariellen Tumoren. Aber

auch im Zusammenhang mit anderen mit einer erhöhten Vaskularisierung

einhergehenden Erkrankungen wurde die Wirksamkeit von Endostatin getestet.

BECKER et al. (2006b) zeigten die antiangiogene Wirkung des Endostatins

einhergehend mit einer Besserung der histomorphologischen Befunde bei der

Endometriose und ICHINOSE et al. (2005) zeigten eine Verbesserung der

Nierenbefunde bei Diabetes Mellitus Typ 1 unter Endostatinbehandlung.

5 Diskussion 115

READ et al. (2001) untersuchten die Wirkung von Endostatin auf das Glioblastom

anhand der Implantation alginatverkapselter Endostatin sezernierender Stammzellen.

Sie zeigten verlängerte Überlebenszeiten von 84% gegenüber den Kontrolltieren,

quantifizierten die Tumorvolumina jedoch nicht. Zudem färbten sie die intratumoralen

Blutgefäße immunhistologisch an und zeigten bei 77% der behandelten Tiere nicht

vaskularisierte Bereiche werteten aber auch hier nur qualitativ aus. Die in dieser

Arbeit durchgeführte Detektion der angefärbten Endothelien ermöglicht auch den

quantitativen Vergleich der Vaskularisierungsdichten. JOKI et al. (2001) untersuchten

die Auswirkungen Endostatin freisetzender Mikrokapseln auf Gliomzellen in einem

Mausmodell und verglichen das Gewicht der entnommenen Tumoren. Sie konnten

eine Tumorreduktion nachweisen, inokulierten aber die Tumoren nicht intrazerebral,

sondern subkutan und erhoben keine Daten über die Neovaskularisierung. Eine

komplette Entnahme der Tumoren war bei dem in dieser Arbeit angewendeten

intrazerebralen Modell nicht praktikabel. Das induzierte Gliom wäre durch seine

gallertig weiche Textur nicht in toto zu entnehmen gewesen und so der entstehende

Fehler nicht kalkulierbar. Zudem ermöglichten die histologische und

immunhistologische Untersuchung nach Kryofixation und Anfertigung von

Serienschnitten auch die Beurteilung von Histomorphologie, Nachweis der CB,

Endostatinsekretion und Gewebsreaktionen des Empfängertieres.

5.1.2.2.1 Histologische Untersuchung der Tumorvolumina

Die Hämatoxylin Eosin (H.E.) Färbung ermöglichte eine deutliche Abgrenzung des

Tumorgewebes vom umgebenden Parenchym, so dass eine Ausmessung der

Anschnittflächen gut realisierbar war. Das verwendete Mikroskop BX51 Hellfeld

(Olympus) in Kombination mit der eingesetzten Software cell*f (Software for Life

Imaging, Olympus) ermöglichten durch eine Bildmontagefunktion (Multiple Imaging

Alignment, MIA) die Aufnahme auch sehr großer Tumoranschnitte bei immer

derselben Vergrößerung (1,25er Objektiv) in einem Bild (siehe Bildtafel 5 auf Seite

105).

116 5 Diskussion

Dabei wurden mehrere Aufnahmen von den verschiedenen Bereichen des Tumors

angefertigt und mittels rechnerischen Ränderabgleichs, der MIA Funktion, zu einem

Bild zusammengesetzt. Um ein möglichst genaues Arbeiten zu ermöglichen, wurden

die Tumoren im Anschluss mittels Handwerkzeug Funktion bei 50-fachem Zoom

umfahren und die entstehenden Flächen durch das Programm berechnet und

dokumentiert.

Waren in einem Gewebeanschnitt mehrere nicht miteinander verbundene

Tumoranschnittflächen zu erkennen beziehungsweise kam es durch

Schneideartefakte zur Überlappung einzelner Tumorbereiche, so wurden diese

Flächen zusätzlich umfahren und die Werte addiert. Die Berechnung erfolgte

standardisiert über alle Tumoren mit Excel (Microsoft) auf einem Personal Computer

und wurde mit einem CASIO CFX-9850GB PLUS-WE (Casio Computer Co., LTD.,

Tokyo, Japan) kontrolliert.

5.1.2.2.2 Immunhistologische Untersuchung der Vaskularisierung

In Ahnlehnung an verschiedene Publikationen, die sich mit der immunhistologischen

Darstellung von Blutgefäßen in einem Tumor oder anderen stark vaskularisierten

Gebieten auseinander gesetzt haben, wurde der von-Willebrand-Faktor als Ziel der

antikörperbindungsabhängigen Färbung gewählt (READ et al. 2001, YOSHIMURA et

al. 1998). Dabei bindet der Antikörper an die Endothelien der Blutgefäße und lässt

sich über eine Sekundärantikörper vermittelte Farbstoffbindung sichtbar machen. Der

von-Willebrand-Faktor wird nur von den Endothelzellen exprimiert, so dass der

Nachweis hochspezifisch ist. Aufgrund der konstant hohen Synthese des von-

Willebrand-Faktors und der hohen Sensitivität des Antikörpers ist die Untersuchung

zudem ausreichend sensibel (SELBY et al. 1997). Die immunhistologisch positiven

deutlich rot gefärbten Endothelien hoben sich von dem mittels Hämatoxylin-

Gegenfärbung blau gefärbten Hintergrund deutlich ab und waren sehr gut digital zu

detektieren (siehe Bildtafel 4 auf Seite 99).

5 Diskussion 117

Die Auswertung erfolgte mittels automatisierter und dadurch standardisierter

Partikeldetektion. Dazu wurde anhand von mehreren Beispielen, die manuell im

Schnitt markiert wurden, zunächst ein Farbschwellwert bestimmt, der die

Detektionsgrenze definierte. Dieser einmal festgelegte Wert wurde dann für alle

folgenden Detektionen übernommen. Die Datenerhebung erfolgte einmal als Summe

der Gefäßflächen pro detektierter Fläche (ROI, Region of Interest) und zudem als

Gesamtanzahl der detektierten Blutgefäßanschnitte. So wurde die

Vaskularisierungsdichte in zwei verschiedenen Parametern ausgedrückt. Es wurden

pro Tier insgesamt 6 ROI ausgewertet, davon jeweils 3 an 2 verschiedenen

Lokalisationen. Da die Blutgefäße in einem Glioblastom dem Tumor folgend

dreidimensional auswachsen und dabei eine Baumkronen ähnliche Struktur

annehmen, wurden die Lokalisationen so gewählt, dass bei allen Tieren eine

ähnliche Blutgefäßstruktur zu erwarten war.

Dazu wurden die Implantationslokalisation (Bregma –1 mm) als Ausgangspunkt des

Tumorwachstums und der Anschnitt mit der größten gemessenen Fläche als

morphologisches Zentrum des Tumorwachstums ausgewählt. Dieser breite

Auswerterahmen wurde gewählt, um zufällige Blutgefäßansammlungen,

beziehungsweise zufällig nicht stark durchblutete Bereiche, ausgleichen zu können.

118 5 Diskussion

5.2 Diskussion der Ergebnisse der Wirksamkeitsuntersuchung

5.2.1 Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®

Anhand der durchgeführten immunhistologischen Untersuchungen konnte Endostatin

sowohl in den implantierten Mikrokapseln als auch außerhalb der Implantate gezeigt

werden (siehe Bildtafel 3 auf Seite 93). Damit gelten die Freisetzung des Proteins

und die Funktionalität der Implantate als erwiesen. Die positive Anfärbung von

Endostatin der in den angeschnittenen CellBeads® liegenden Stammzellen belegte

ihre Sekretionsaktivität und somit ihre Vitalität während des

Untersuchungszeitraumes. Positive Immunreaktionen zeigten sich besonders im

Bereich der Alginatkapsel, in der das Endostatin in besonders hoher Konzentration

vorlag. Dies beweist die Diffusion des Endostatins durch die Implantatkapsel. Eine

positive Endostatinmarkierung zeigte sich auch im die CellBeads® direkt

umgebenden Parenchym. Weitere Endostatinanreicherungen waren im Bereich des

rechten Seitenventrikels und im die Gehirngefäße begleitenden Virchow Robin Raum

zu beobachten. Diese Beobachtungen waren im Hinblick auf den physiologischen

intrazerebralen Drainageweg und Proteintransport, vom Plexus Choroideus

ausgehend transparenchymal über die Arachnoidalvilli zu den abführenden

Blutgefäßen, zu erwarten. Sowohl diese Beobachtungen, als auch in einer

Entfernung von bis zu 4 mm von den CellBeads® aufgefundene immunpositive

Präzipitate weisen, anders als von READ et al. (2001) beschrieben, auf eine

transparenchymale Endostatindiffusion über 1,7 mm hinaus, hin. Da die

Mikrokapseln mit Kontakt zum liquorführenden Ventrikelsystem implantiert wurden,

muss auch von einem Endostatintransport über den Liquor ausgegangen werden. So

ist es möglich, dass die fern von den Mikrokapseln gefundenen Präzipitate auch auf

extraparenchymal transportiertes Endostatin zurückzuführen sind.

5 Diskussion 119

Eine genaue Ermittlung der Endostatinverteilung und Beurteilung des intrazerebralen

Endostatinweges waren mit diesem Verfahren nicht möglich. Es muss davon

ausgegangen werden, dass das sezernierte Protein an vielen Stellen so stark

verdünnt im Parenchym vorlag, dass es mittels Immunhistologie nicht angefärbt

beziehungsweise durch die Gegenfärbung überfärbt wurde. Deshalb konnten nur

Anreicherungen des Proteins lokalisiert werden und daraus Schlussfolgerungen auf

seine Verteilung gezogen werden.

5.2.2 Wirksamkeit der Endostatin sezernierenden CellBeads®

Die Untersuchung der Wirksamkeit des von den Implantaten freigesetzten

Endostatins erfolgte anhand von zwei Parametern. Zum einen war dies die

Untersuchung der antiangiogenen Wirkung. Dazu wurde die Vaskularisierungsdichte

in den untersuchten Tumoren als anteilige Gefäßfläche und als Blutgefäßanzahl pro

untersuchter Region ermittelt. Der andere untersuchte Parameter war die Reduktion

des Tumorvolumens, die als Folge der Unterversorgung mit Nährstoffen und

Sauerstoff durch die Hemmung der Neovaskularisierung erwartet wurde (FOLKMAN

et al. 1990).

Dabei wurde das experimentelle Glioblastom ohne nachfolgende Implantation und

nach Implantation von CellBeads® mit Endostatinsekretion, leeren CellBeads® und

CellBeads® mit Stammzellen, deren Sekretionsprofil nicht genetisch modifiziert

worden war, miteinander verglichen. Dies erlaubte zunächst eine Aussage darüber,

ob die alleinige Implantation von Mikrokapseln mit oder ohne Inhalt das

Tumorwachstum und die Einsprossung von Blutgefäßen beeinflusst. Weiterhin

konnte geklärt werden, wie sich die Anwesenheit von humanen, nicht

genmodifizierten, hTERT Stammzellen und ihren Sekretionsproduktion auf das

Wachstum und die Vaskularisierung des Glioblastoms auswirkte.

120 5 Diskussion

Zudem erlaubte dies die Beurteilung der antiangiogenen und tumorsuppressiven

Wirkung von Endostatin bei immunhistologisch belegter Endostatinfreisetzung durch

die Implantate. Im Hinblick auf den gewählten Untersuchungszeitraum muss

berücksichtigt werden, dass lediglich festgestellt werden konnte, welchen Einfluss die

jeweiligen Parameter auf ein schnell wachsendes Glioblastom innerhalb von 12

Tagen hatten.

5.2.2.1 Immunhistologisch dargestellte Blutgefäßdichte

Die immunhistologisch positiv rot gefärbten Endothelien der intratumoralen

Blutgefäße wiesen die auch für das humane Glioblastoma multiforme typischen

Strukturen wie Hyperplasie, Fenestrierung und mitotische Figuren auf. Sie stellten

sich bei den drei nicht mit Endostatin behandelten Gruppen besonders in den

ventralen und mittleren Tumorbereichen mit teilweise enormen Ausmaßen dar. Dabei

waren sie häufig gewunden und weiteten sich zu kavernösen Strukturen mit einem

Durchmesser von bis zu 600 µm aus. Bereits histomorphologisch konnten so

zwischen der behandelten und den unbehandelten Gruppen deutliche Unterschiede

ausgemacht werden, die in Bildtafel 4 auf Seite 99 dargestellt sind. Bei den mit

Endostatin behandelten Tieren waren die Blutgefäßanschnitte mit durchschnittlich ca.

30 µm Durchmesser durchweg kleiner, die Endothelien zeigten sich in der Regel

organisierter und es konnten seltener mitotische Figuren aufgefunden werden.

Bei der Auswertung der Vaskularisierungsdichten innerhalb der Tumoranschnitte der

verschiedenen Untersuchungsgruppen zeigte sich eine durch alle Parameter und

Lokalisationen gleichermaßen signifikante Reduktion der Blutgefäße bei den mit

Endostatin behandelten Tieren. Dabei waren sowohl die absolute Anzahl der

Gefäße, vor allem aber auch die relativen Flächenverhältnisse von Blutgefäßen zu

Tumorgewebe, die auch die Verringerung der Gefäßdurchmesser berücksichtigen,

reduziert. Daraus folgt, dass die antiangiogene Wirksamkeit der Endostatin

freisetzenden CellBeads® als erwiesen angesehen werden kann.

5 Diskussion 121

Die eindeutigen Unterschiede nach einem Untersuchungszeitraum von 12 Tagen

verdeutlichen zudem, wie schnell die Neovaskularisierung eines so schnell

wachsenden Tumors wie des Glioblastoma multiforme voran schreitet und welche

hochpotenten, die Endothelzellproliferation fördernden Mechanismen, dem Tumor

zur Verfügung stehen. Dazu schrieb FOLKMAN 1971, dass durch Tumoren

induzierte Kapillareinsprossungen mit einer Geschwindigkeit von 1 mm pro Tag

wachsen können. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse die hohe Potenz von

Endostatin, diesen proliferationsfördernden Mechanismen entgegenzuwirken. Die

Vorteile der direkten lokalen Applikation des Wirkstoffs als Sekretionsprodukt von

alginatverkapselten als Bioreaktoren fungierenden Implantaten werden anhand der

vorliegenden Ergebnisse belegt. SCHMIDT et al. (2004) zeigten sowohl eine

Reduktion der Blutgefäßdichte um 33,5% als auch eine Tumorreduktion von 74%

nach lokaler Endostatinbehandlung eines experimentellen Glioblastoms in der Maus.

Sie applizierten den Wirkstoff aber mittels Mikroinfusion über 4 Wochen durch fest

implantierte Minipumpen, die, in der Flanke subkutan implantiert, die Infusionslösung

über einen Schlauch in das Gehirn leiteten. Diese Applikationsmethode ermöglicht

zwar sehr hohe Wirkstoffkonzentrationen am Zielort, ist aber klinisch so nicht

anwendbar. Sie birgt im Vergleich zu der hier angewendeten Methode hohe

Komplikationsrisiken, wie Abstoßungsreaktionen und Infektionen des Gehirns durch

die intrazerebralen Anteile der Apparaturen. READ et al. (2001) wendeten Endostatin

freisetzende Alginatkapseln intrazerebral zur Therapie experimenteller Glioblastome

an und konnten sowohl Rückgänge in der Vaskularisierung als auch eine signifikante

Tumorreduktion zeigen, beschrieben die Vaskularisierung aber nur qualitativ als

Anteil der Tiere, bei denen nicht vaskularisierte Bereiche zu finden waren. JOKI et al.

(2001) untersuchten ebenfalls Endostatin freisetzende Alginatkapseln und werteten

die Blutgefäßdichte nach immunhistologischer Färbung des von-Willebrand-Faktors

als Gefäßanzahl aus.

122 5 Diskussion

Sie konnten eine signifikante Reduktion nach Endostatinbehandlung zeigen,

wendeten aber ein Mausmodell an, bei dem sie Tumorzellen subkutan in der Flanke

inokuliert hatten, und erlaubten so nur bedingt Rückschlüsse auf intrazerebrale

Vorgänge zur Behandlung eines Glioblastoma multiforme. Sowohl BJERKVIG et al.

(2001) als auch HUSZTHY et al. (2006) zeigten reduzierte intratumorale

Neovaskularisierung nach Endostatinbehandlung, werteten jedoch nur die absolute

Gefäßanzahl aus, die nicht die teilweise enormen Unterschiede in den

Gefäßdurchmessern beziehungsweise -volumina berücksichtigt.

Anhand der an der Lokalisation des größten Tumoranschnitts erhobenen Daten

wurde eine signifikant höhere Vaskularisierungsdichte der Tumoren nach der

Implantation leerer CellBeads® gezeigt als bei den Tieren der Kontrollgruppe, denen

nur die Gliomzellen ohne weiteren operativen Eingriff am darauf folgenden Tag

inokuliert wurden. Dieses Ergebnis lässt die Vermutung zu, dass die reine

Implantation, das damit einhergehende Trauma und die dadurch ausgelöste

Astrozytose eine Steigerung der Neovaskularisierung zur Folge hatte.

Die traumabedingte Endothelzellproliferation wird von Astrozyten über VEGF und

Angiopoetin-2 vermittelt (NAG et al. 2005, SALHIA et al. 2000). An der

Implantationslokalisation konnte diese Signifikanz jedoch nicht bestätigt werden.

Außerdem hätte dann auch die Vaskularisierungsdichte bei der mit SCB behandelten

Gruppe folgerichtig größer sein müssen als bei der Kontrollgruppe, da ja auch hier

eine CellBead®-Implantation ohne Endostatineinfluss vorlag. Die mit Endostatin

behandelte Gruppe zeigte zudem an allen Lokalisationen eine signifikant kleinere

Blutgefäßdichte als die Kontrollgruppe ohne CellBead®-Implantation.

5 Diskussion 123

5.2.2.2 Tumorvolumina und Korrelation mit der Blutgefäßdichte

Die Erhebung der Tumorgrößen erfolgte anhand der rechnerisch als Summe von

Kegelstümpfen aus den gemessenen Anschnittflächen ermittelten und demzufolge

idealisierten Tumorvolumina (siehe Bildtafel 5 auf Seite 105). Die statistische

Auswertung ergab dabei keinen signifikanten Unterschied in den Tumorgrößen

zwischen der mit Endostatin freisetzenden CellBeads® behandelten Gruppe und den

drei anderen Gruppen. Sowohl die Freisetzung und intratumorale Verteilung sowie

auch die antiangiogene Wirksamkeit des von den ECB sezernierten Endostatins

konnten nachgewiesen werden. Da aber die Tumorgrößen unverändert blieben,

stellte sich die Frage nach der Korrelation zwischen der Reduktion der Blutgefäße

und dem Wachstum der Tumoren. Eine Gegenüberstellung der entsprechenden

Datenpaare belegte, dass kein statistischer Zusammenhang (r²< 0,8) zwischen

beiden Parametern bestand und die Hemmung der Neovaskularisierung in diesem

Modell keinen Einfluss auf das Glioblastomwachstum hatte. Das zeigt auf, dass die

signifikante Reduktion der Tumorvaskularisierung durch die Behandlung mit

Endostatin sezernierende Stammzellen enthaltenden CellBeads® ohne

einhergehende Verkleinerung des Tumorvolumens im Vergleich zu den

Kontrollgruppen nicht im Widerspruch zueinander stehen. Verschiedene

Veröffentlichungen beschreiben einen nachhaltigen Effekt der Antiangiogenese auf

die Proliferation von Gliomzellen und damit die Größenzunahme von Glioblastomen

(ZHANG et al. 2000, SCHMIDT et al. 2004, OHLFEST et al. 2005). Andere Studien

zeigten ebenfalls eine antiangiogene Wirkung des humanen Endostatins mit

signifikanter Reduktion der Vaskularisierungsdichte in einem Tumormodell in der

Ratte, ohne eine Tumorreduktion beziehungsweise Antiangiogenese bedingte

Auswirkungen auf die Tumorzellproliferation oder verlängerte Überlebenszeiten

nachweisen zu können (HUSZTHY et al. 2006, PRADILLA et al. 2005). HUSZTHY et

al. (2006) schlussfolgerten auf eine speziesspezifische Wirkung des Endostatins, da

sie mit murinem Endostatin und demselben Versuchsaufbau eine deutliche

Tumorreduktion und auch Verlängerung der Überlebenszeiten erzielten.

124 5 Diskussion

Da aber in dieser Arbeit deutliche Auswirkungen auf die Vaskularisierung durch

speziesfremdes humanes Endostatin gezeigt werden konnten, ist nicht die Wirkung

des speziesfremden Proteins fraglich, sondern der Zusammenhang dieser Wirkung

mit der Tumorreduktion. So bietet die Theorie der speziesabhängigen Wirkung keine

biologische Erklärung für die unveränderten Tumorgrößen trotz erwiesener

Blutgefäßreduktion in dieser Arbeit.

Da aber die Tumoren in dem hier entwickelten Modell bereits nach 12 Tagen

Volumina von durchschnittlich 95,82 mm³ einnahmen und zu einer das

Allgemeinbefinden der Versuchstiere beeinträchtigenden Gewebsverdrängung

führten, wurden die Befunde aus Tierschutzgründen bereits vor dem Auftreten einer

Symptomatik nach einem im Gegensatz zu anderen Arbeiten relativ kurzen

Untersuchungszeitraum erhoben. Zu diesem Zeitpunkt ist davon auszugehen dass

zumindest über Distanzen von einigen Millimetern (FOLKMAN 1990), die Versorgung

des Tumors über den Liquor noch ausreicht um seine Nekrotisierung und daraus

folgende Volumenreduktion zu verhindern. So konnten auch die Effekte der

Endostatinwirkung vor allem im Parenchym nahen Tumorbereich gezeigt werden, da

der dorsale, dem Liquor führenden Subarachnoidalraum angeschlossene

Tumorbereich in allen Gruppen geringer vaskularisiert war. READ et al. (2001)

führten zur Überprüfung der tumorsuppressiven Wirkung einen Vergleich der

Überlebenszeiten (Kaplan-Meyer) durch und konnten zeigen, dass erst nach einem

Versuchszeitraum von ca. 21 Tagen Unterschiede zwischen den Gruppen ersichtlich

wurden. Auch SCHMIDT et al. (2004), die das Endostatin mittels Mikropumpen in das

Gehirn applizierten, verglichen die Tumorgrößen erst nach 21 Tagen. Das führt zu

der Vermutung, dass der Untersuchungszeitraum im Bezug auf die korrelative

Auswirkung der Unterversorgung des Glioblastoms durch die Reduktion der

Blutgefäße auf den Tumor in dieser Studie zu kurz war. Die Proliferation der

Gliomzellen könnte zunächst enorm schnell voranschreiten, ohne dabei in

ausreichendem Maß auf die Endothelproliferation angewiesen zu sein.

5 Diskussion 125

Vermutlich ist nach 12 Tagen bei antiangiogenetisch behandelten Tieren so zwar die

Neovaskularisierung deutlich minimiert, das Tumorwachstum oder seine

Nekrotisierungsrate aber noch unbeeinflusst. Ein ähnliches Bild zeigen auch Befunde

von mittels Gamma-Knife strahlentherapierten Glioblastompatienten auf (SZEIFERT

et al. 2002). Auch hier zeichnen sich bereits wenige Tage nach der Behandlung

deutliche Rückgänge in der Blutgefäßversorgung beziehungsweise die Verödung

und der Verlust der Funktionalität der Endothelien ab. Mit einer daraus folgenden

Nekrotisierung und Reduktion des Tumorvolumens ist aber erst 4 bis 8 Wochen nach

der Behandlung zu rechnen.

Die mit nicht Endostatin sezernierenden Stammzellbeads (SCB) behandelten Tiere

zeigten signifikant kleinere Tumoren im Vergleich zur mit leeren CellBeads® (LCB)

behandelten Gruppe. Ein möglicher Erklärungsansatz hierfür ist, dass die

verwendeten nicht Endostatin sezernierenden humanen mesenchymalen

Stammzellen (SCB) eine ganze Reihe Zytokine wie Interferon Gamma, IL-12, IL-3,

IL-7 sowie hohe Konzentration an IL-6, IL-8 und MCP-1 sezernieren. Diese könnten

einerseits einen negativen Einfluss auf das Wachstum der Gliomzellen, aber

andererseits eventuell auch positive Auswirkungen auf die Abwehrlage des

Versuchstiers gegenüber dem Tumor haben. Prinzipiell sezernieren aber sowohl die

nicht zur Endostatinsekretion modifizierten als auch die Endostatin produzierenden

Stammzellen dieses Zytokinprofil. Trotzdem könnte es sein, dass die Endostatin

sezernierenden Stammzellen aufgrund der polarisierten Sekretionsleistung

grundsätzlich weniger andere Proteine freisetzen. Nachgewiesen ist von der Firma

CellMed AG eine vermehrte Sekretion von IL-12 bei den nicht genmodifizierten

hMSC gegenüber den Endostatin sezernierenden Stammzellen. Von einem

möglichen antitumorigenen Effekt des IL-12 sprechen YANG et al. bereits 2004. KIM

et al. zeigten 2006 an einem intrakraniellen Mausmodell eine vermehrte Aktivierung

tumorspezifischer zytotoxischer T-Zellen durch die Behandlung mit IL-12

sezernierenden Dendritischen Zellen. So bietet die vermehrte IL-12 Sekretion der

SCB einen möglichen Erklärungsansatz für die signifikante Tumorreduktion nach

ihrer Implantation im Vergleich zu den mit LCB behandelten Tieren.

126 5 Diskussion

Ein zufallsbedingter Unterschied der Tumorvolumina zwischen der mit leeren Beads

und der mit Stammzellbeads behandelten Gruppe kann aber ebenfalls nicht

ausgeschlossen werden, insbesondere da bei keiner der beiden mit Stammzellen

enthaltenden CellBeads® behandelten Gruppen eine signifikante Tumorreduktion

gegenüber der Kontrollgruppe, die nur die Gliomzellen inokuliert bekam, aufgezeigt

werden konnte.

5 Diskussion 127

5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung

Die durchgeführten Untersuchungen zeigten eine signifikante antiangiogene

Wirksamkeit des von alginatverkapselten Stammzellen freigesetzten Endostatins

nach intrazerebraler CellBead®-Implantation. Um die Tumorreduktion als Folge der

Gliomzellunterversorgung durch Unterdrückung der Neoangiogenese zu belegen,

müssten weitere Studien folgen, die ein experimentelles Glioblastommodell zugrunde

legen, welches einen verlängerten Untersuchungszeitraum ermöglicht. Dazu könnte

versucht werden kleinere Tumoren zu entwickeln, beziehungsweise eine

Gliomzelllinie zu verwenden, die langsamer proliferiert. Eine andere Möglichkeit stellt

die Verwendung eines anderen Tiermodells mit einem größeren Versuchstier dar.

Dabei könnte außerdem berücksichtigt werden, dass zur klinischen Anwendung beim

Glioblastoma multiforme im Menschen eine Applikation von weit mehr CellBeads® in

eine große Tumorresektionshöhle zur Hemmung eines Rezidivs möglich wäre.

Genmodifizierte Stammzellen, denen die Wirkstoffproduktion als Motor für einen als

Medikament einsetzbaren Bioreaktor eingearbeitet wurde, bieten bereits ein breites

Spektrum an therapeutischen Möglichkeiten. Die Verwendung von

immunisolierenden Matrizes wie Alginat oder poly-L-Lysinen zur Entwicklung lokal

anwendbarer Therapeutika erweitern den Bereich der möglichen Indikationen und

erlauben auch die Applikation stammzellunabhängiger Stoffe. So wird ebenfalls eine

lokale Verabreichung von Chemotherapeutika wie beispielsweise Doxorubicin in

diffusionsdurchlässigen Kapseln direkt in das Glioblastom denkbar. Auch eine

Kombination aus Stammzellkapseln und Wirkstoff enthaltenden Implantaten als

Zusammenstellung antitumorigener Stoffe wäre möglich und besser kontrollierbar

anzuwenden als nach systemischer Verabreichung. Um genaue Aussagen darüber

treffen zu können, wie viel Wirkstoff durch eine bestimmte Anzahl implantierter

CellBeads® freigesetzt wird und wohin dieses gelangt, sollten Langzeitstudien

angeschlossen werden, die eine Untersuchung der intrazerebralen Endostatinkinetik

erlauben.

128 5 Diskussion

Im Rahmen von Langzeitstudien müsste zudem die maximale Überlebensdauer der

Stammzellen und auch der Haltbarkeit der Alginatkapsel im intrazerebralen Milieu

untersucht werden.

Die Vergleichbarkeit der humanen glialen Tumoren mit denen bei Hund und Katze

(STOICA et al. 2004) sowie die große Ähnlichkeit des humanen Endostatins mit dem

des Hundes machen die Anwendung der verwendeten Implantate in der

Veterinärmedizin denkbar. Die Ähnlichkeit der Gene zwischen Mensch und Hund

beträgt im Unterschied zu nur 67,2 (n) zwischen Ratte und Mensch 83,7 (n)

(WEIZMANN 2006). Trotzdem konnte eine eindeutige Wirkung des humanen

Endostatins in der Ratte gezeigt werden. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass

humanes Endostatin auch die Vaskularisierung und damit die Gliomversorgung im

Hund antagonisiert. Des Weiteren ist eine Entwicklung therapeutische Proteine

sezernierender caniner mesenchymaler Stammzellen und deren Verkapselung mit

Alginat zur Behandlung verschiedener Erkrankungen denkbar. Endostatin

sezernierende CBs könnten wie beim Menschen in Tumorresektionshöhlen

eingebracht werden oder stereotaktisch nach Schädeldeckentrepanation minimal

invasiv in ein diagnostiziertes nicht reseziertes Glioblastom injiziert werden, um eine

Lebensverlängerung zu erreichen. Dabei muss berücksichtigt werden, dass es sich

bei den bisher entwickelten Stammzellpräparaten um Xenoimplantate handelt und

die Zerstörung der Beads zur sicheren Abstoßung führen würde. Außerdem ist das

derzeitige Mittel der Wahl zur Lebensverlängerung bei an Gliomen erkrankten

Hunden und Katzen die Strahlentherapie (BREARLY et al. 1999). Eine Bestrahlung

würde aber die implantierten Stammzellen schädigen, so dass eine Kombination

dieser beiden Therapien von vornherein auszuschließen ist.

Die vorgelegte Arbeit führte zur Etablierung eines reproduzierbaren intrazerebralen

Glioblastommodells in der Ratte und der erfolgreichen Implantation von Alginat

verkapselten Stammzellen in das Gehirnparenchym mit Kontakt zum Liquor

führenden Ventrikelsystem. Es konnten die intrazerebrale Endostatinfreisetzung und

damit die Funktionalität der verwendeten CellBeads® belegt werden.

5 Diskussion 129

Zudem konnte eine Reduktion der Vaskularisierungsdichte des experimentellen

Glioblastoms von über 80% durch die intrazerebroventrikuläre Verabreichung

Endostatin sezernierender CellBeads® nachgewiesen werden. Die Implantation der

CellBeads® unter, statt wie bei READ et al. (2001) und BARTSCH (2005) in den

Tumor hat klinisch eine hohe Relevanz, da sie eine Endostatinwirkung über eine

Diffusionsdistanz belegt. Damit wird eine postoperative Anwendung in einer

Tumorresektionshöhle zur Bekämpfung infiltrierter im Tumorbett verbleibender

Mikrotumoren vorstellbar.

Alle Arbeiten wurden unter GLP-Bedingungen durchgeführt und entsprechend

dokumentiert, so dass die Voraussetzungen für eine spätere klinische Anwendung

gegeben sind. Im Unterschied zu der vorausgegangenen Dissertation von BARTSCH

(2005) und den Arbeiten von READ et al. (2001) und HUSZTHY et al. (2006) wurde

erstmalig unter GLP-Bedingungen die Freisetzung und antiproliferative Wirkung von

Endostatin nach der Implantation alginatverkapselter genmodifizierter

mesenchymaler Stammzellen qualitativ untersucht und bestätigt.

130 6 Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Kerstin Kleinschmidt

Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell

Das Glioblastoma multiforme (GBM) hat eine Inzidenz von 4000 bis 5000

Neuerkrankungen pro Jahr. Trotz der Anwendung aller bekannten Therapien geht die

Diagnose GBM mit einer infausten Prognose einher. Die mittlere Überlebenszeit liegt

bei 12 bis 15 Monaten nach Diagnosestellung. Ein neuer Therapieansatz zur

Bekämpfung des schnell wachsenden Tumors basiert auf antiangiogenen

Mechanismen. Ziel ist es, das GBM durch die Unterdrückung der Neo-

vaskularisierung einer Unterversorgung auszusetzen, um eine Wachstumshemmung

und Nekrotisierung des Tumorgewebes zu erreichen. Endostatin, ein endogenes 22

kD großes Protein, ist ein gut verträglicher Angiogenesehemmer. Problematisch ist

aber seine Verabreichung. Da das Protein eine sehr kurze Halbwertszeit hat und die

Blut-Hirn-Schranke überwinden muss, sind durch systemische Gaben keine

ausreichend hohen Konzentrationen des Proteins im Tumorgebiet erzielbar. Die

Verwendung ex-vivo genmodifizierter Endostatin sezernierender humaner

mesenchymaler Stammzellen (EMSC) ermöglicht eine dauerhafte Produktion des

Proteins. Durch die Verkapselung solcher EMSC mit einer für Nährstoffe und

Sauerstoff diffusionsdurchlässigen, aber gegen die Bestandteile der Empfänger-

abwehr abschirmenden Alginatmatrix, wird die intrazerebrale Implantation direkt am

Zielort möglich. Alginat ist ein Alginsäure-Polymer aus marinen Braunalgen, das eine

gute Biokompatibilität aufweist. Zur Herstellung der in dieser Arbeit implantierten

CellBeads® (CBs) wurde ein Alginat mit einem hohen Guluronsäureanteil (High-G

Alginate), das mit Bariumionen vernetzt war, verwendet.

6 Zusammenfassung 131

Ziel dieser Arbeit war es, ein GBM Modell zu standardisieren und daran die

antiangiogene und tumorreduzierende Wirkung von mit Alginat zu CBs vertropften

EMSC zu untersuchen. Am Tag nach der Gliominokulation wurden den Tieren an

zuvor entwickelten Koordinaten CBs intrazerebroventrikulär und gleichzeitig nahe

dem GBM implantiert. Untersucht wurden eine Kontrollgruppe (nur BT4Ca), eine

Gruppe mit leeren CBs (LCB), eine Gruppe mit Stammzellen ohne

Endostatinsekretion (SCB) und eine Gruppe mit Endostatinbeads (ECB) jeweils nach

12 Tagen Versuchszeitraum. Die Implantate konnten histologisch intakt

nachgewiesen werden und es zeigten sich keine immunologischen Reaktionen der

Empfängertiere. Erstmalig konnte immunhistologisch die Endostatinfreisetzung und

damit die Funktionalität der CBs sowie die intrazerebrale Diffusion des Proteins über

eine Distanz von bis zu 4 mm in das Tumorgewebe gezeigt werden. Anhand einer

immunhistologischen Färbung des von-Willebrand-Faktors (vWF) und

anschließender Partikeldetektion wurde die Vaskularisierungsdichte innerhalb des

experimentellen GBM untersucht. In einem intracraniellen GBM Modell konnte

erstmalig eine signifikante Verringerung der Vaskularisierungsdichte (P<0,05) nach

Implantation Endostatin sezernierender Stammzellen nachgewiesen und unter den

Bedingungen der Good Laboratory Practice (GLP) quantifiziert werden. Es konnte

keine signifikante Tumorreduktion gezeigt werden. Eine Verlängerung des

Untersuchungszeitraumes erscheint sinnvoll, um eine tumorsupprimierende Wirkung

als Folge der Blutgefäßreduktion zu zeigen. Das Fehlen der Korrelation zwischen

Vaskularisierungsdichte und Tumorgröße wurde für diesen Versuch statistisch belegt

(r²< 0,8). Die gute Biokompatibilität und Funktionalität der CBs zeigt, dass die

Verkapselung von Wirkstoff sezernierenden Stammzellen mit Alginat ein breites

Spektrum von denkbaren Anwendungsbereichen bietet. Endostatin diffundierte aus

den CBs transparenchymal bis weit in den Tumorbereich hinein, wies eine große

antiangiogene Potenz auf und war in der Lage, die Neoangiogenese im schnell

wachsenden experimentellen Glioblastom um bis zu 80% zu reduzieren. Diese

Ergebnisse machen eine postoperative Applikation in die Resektionshöhle bei GBM

Patienten im Sinne einer Rezidivprävention denkbar.

132 7 Summary

7 Summary

Kerstin Kleinschmidt

Examination of Endostatin releasing stem cell implants as glioblastoma therapeutics in a rat model

Glioblastoma multiforme (GBM) has an incidence of 4000-5000 cases every year.

Despite the use of all known treatments, GBM still has a poor prognosis. Having

contracted GBM, the medium term life expectancy is 12 to 15 months after diagnosis.

A new treatment opportunity in the abatement against this rapidly growing tumour is

based on antiangiogenic mechanisms. The aim, by suppressing the

neovascularization and thus starving the GBM, is to achieve growth inhibition and

necrotization of the tumour-tissue. Endostatin, an endogenous 22 kD protein, is an

auspicious angiogenesis inhibitor. But due to its short half-time and the barrier

function of the blood-brain-barrier problems arise with its administration. Thus,

effective protein concentrations are not achievable with systematic application. The

use of genetically engineered mesenchymal stem cells expressing endostatin

(EMSCs) allows a constant protein production. By encapsulating these EMSCs with a

nutrient and oxygen permeable alginate matrix the intracerebral implantation at the

target site is possible. This alginate capsule insulates the EMSCs from the

components of the recipient’s immune response. Alginate is an algine-acid polymer

from marine brown-alga with a good biocompatibility. To generate the CellBeads®

(CBs) used in this study, an alginate with high guluronic acid concentration (high G-

alginate) linked with Barium ions was applied. The task of this dissertation was to

standardise a GBM model and to examine the antiangiogenic and the tumour

reducing effects of alginate-CBs containing EMSCs. In order to have a reproducible

experimental GBM, BT4Ca-Glioma cells were injected into the right hemisphere of

BDIX/Ztm-rats. The day after glioma inoculation, CBs were stereotactically implanted

near the GBM approaching the ventricle.

7 Summary 133

A control group (BT4Ca only), a group with empty CBs (LCB), a group with stem cells

without endostatin secretion (SCB) and a group with endostatin beads (ECB) were

examined after 12 days. The implants could be histologically proven to be intact and

no immunological reactions of the host animals were witnessed. The endostatin

release and therefore the functionality of the CBs was immunohistologically shown.

The protein diffusion was proven at a distance of up to 4 mm into the tumour-tissue.

By means of the immunohistological staining of the von-Willebrand-Factor (vWF) and

subsequent histomorphological detection the vascularization density within the GBM

was examined. In this study for the first time significant (P<0,05) reductions of blood

vessel density could be quantificated under conditions of Good-Laboratory-Practise

(GLP) after implantation of Endostatin releasing stem cells. No significant reduction

of tumour size could be shown. A prolongation of the examination period seems

sensible to show the tumour suppressing effects following angiogenesis rejection.

The absence of a correlation between vascularization density and tumour size was

statistically marked down for this experiment (r² <0,8). The good biocompatibility and

functionality of the CBs shows that the encapsulation of the active substance

expressing stem cells with alginate leaves us with a wide spectrum for possible

applications. Transparenchymal Endostatin diffusion far into the tumour-site, its high

antiangiogenic potency and the reduction of neoangiogenesis in a rapidly growing

experimental glioblastoma up to 80% was prevented. Hence a postoperative

application within the resection cavity of GBM patients in order to prevent

recrudescence considers possible.

134 8 Literaturverzeichnis

8 Literaturverzeichnis

ABDOLLAHI, A., K. LIPSON, A. SCKELL, H. ZIEHER, F. KLENKE, D. PERSCHKE,

A. ROTH, X. HAN, M. KRIX, M. BISCHOF, P. HAHNFELDT, H.-J. GRONE, J.

DEBUS, L. HLATKY u. P. E. HUBER (2003):

Combined Therapy with Direct and Indirect Angiogenesis Inhibition Results in

Enhanced Antiangiogenic and Antitumor Effects

Canc Res 63, Nr. 24, 8890-8898

ABOUNADER, R., J. VOGEL u. W. KUSCHINSKY (1995):

Patterns of capillary plasma perfusion in brains in conscious rats during normocapnia

and hypercapnia

Circ Res 76, Nr. 1, 120-126

AEBISCHER, P., P. A. TRESCO, S. R. WINN, L. A. GREENE, C. B u. JAEGER

(1991):

Long-term cross-species brain transplantation of a polymer-encapsulated dopamine-

secreting cell line

Exp Neurol 111, Nr. 3, 269-275

ALBA, E., A. LLOMBART, N. RIBELLES, M. RAMOS, R. FERNANDEZ, J. I.

MAYORDOMO, I. TUSQUETS, M. GIL, A. BARNADAS, F. CARABANTE, M. RUIZ,

R. VERA, I. PALOMERO, V. SORIANO, J. GONZALEZ u. R. COLOMER (2006):

Serum endostatin and bFGF as predictive factors in advanced breast cancer patients

treated with letrozole

Clin Transl Oncol 8, Nr. 3, 193-199

ANDERSEN, P. B., M. BLINKENBERG u. U. LASSEN (2006):

A prospective PET study of patients with glioblastoma multiforme

Acta Neurol Scan 113, Nr.6, 412-418

8 Literaturverzeichnis 135

AURICH, I., L. MUELLER, H. AURICH, K. TISLJAR, S. NAETHER u. B. CHRIST

(2006):

Mesenchymale Stammzellen (hMSC) aus humanem Knochenmark differenzieren in

vitro und in vivo zu Zellen mit hepatozytären Eigenschaften

Z Gastroenterol 44

BARTSCH, I. (2005):

Evaluierung von alginatverkapselten Endostatin sezernierenden Stammzellen zur

Behandlung des Glioblastoms

Diss.-Arbeit, Inst. f. Versuchstierkunde d. MHH und INI Hannover

BEAUCHESNE, P. D., R. M. PEDEUX, A. BONMARTIN, S. BERTRAND, A.

JOUVET, A. L. KIRCHNER, R. REVEL, F. MORNEX u. J. F. DORE (2003):

Intracerebral C6 glioma model in female hairless rats: assessment by using MRI and

follow-up of irradiation

Anticancer Res. 23, Nr.5A, 3755-3760

BECKER, C. M., D. A. SAMPSON, S. M. SHORT, K. JAVAHERIAN, J. FOLKMAN u.

R. J. D'AMATO (2006a):

Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and

endometriosis in a mouse model

Fertil Steril. 85, Nr.1, 71-77

BECKER, C. M., R. D. WRIGHT, R. SATCHI-FAINARO, T. FUNAKOSHI, J.

FOLKMAN, A. L. KUNG u. R. J. D'AMATO (2006b):

A Novel Noninvasive Model of Endometriosis for Monitoring the Efficacy of

Antiangiogenic Therapy

Am J Pathol 168; Nr. 6, 2074-2084


BELLO, L., C. GIUSSANI, G. CARRABBA, M. PLUDERI, V. LUCINI, M. PANNACCI,

D. CARONZOLO, G. TOMEI, R. VILLANI, F. SCAGLIONE, R. S. CARROLL u. A.

BIKFALVI (2002):

Suppression of malignant glioma recurrence in a newly developed animal model by

endogenous inhibitors

Clin Cancer Res 8, Nr. 11, 3539-3548

BEREZIN, V., G. SKLADCHIKOVA u. E. BOCK (1997):

Evaluation of cell morphology by video recording and computer-assisted image

analysis

Cytometry 27, Nr. 2, 106-116

BEUTLER, A. S., M. S. BANCK, D. WEDEKIND u. H. J. HEDRICH (1999):

Tumor gene therapy made easy: allogeneic major histocompatibility complex in the

C6 rat glioma model

Hum Gene Ther 10, Nr.1, 95-101

BJERKVIG, R., T. A. READ, P. VAJKOCZY, P. AEBISCHER, W. PRALONG, S.

PLATT, J. E. MELVIK, A. HAGEN u. M. DORNISCH (2003):

Cell therapy using encapsulated cells producing endostatin

Acta Neurochir Suppl 88, 137-141

BOBO, H. R., D. W. LASKE, A. AKBASAK, P. F. MORRISON, R. L. DEDRICK u. E.

H. OLDFIELD (1994):

Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain

Proc Natl Acad Sci 91, Nr. 6, 2076-2080

BRANNON-PEPPAS, L. u. J.O. BLANCHETTE (2004):

Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy

Advanced drug deliv prev 56, Nr.11, 1649-1659


BOIARDI, A., A. SILVANI, A. POZZI, L. FARISELLI, G. BROGGI u. A. SALMAGGI

(1999):

Interstitial chemotherapy plus systemic chemotherapy for glioblastoma patients:

improved survival in sequential studies

J Neurooncol 41, Nr. 2, 151-157

BORLONGAN, C. V., S. J. SKINNER, M. GEANEY, A. V. VASCONCELLOS, R. B.

ELLIOTT, D. F. EMERICH (2004a):

Intracerebral transplantation of porcine choroid plexus provides structural and

functional neuroprotection in a rodent model of stroke

Stroke 35, Nr. 9, 2206-2210

BORLONGAN, C. V., S. J. SKINNER, M. GEANEY, A. V. VASCONCELLOS, R. B.

ELLIOTT u. D. F. EMERICH (2004b):

Neuroprotection by encapsulated choroid plexus in a rodent model of Huntington's

disease

Neuroreport 15, Nr. 16, 2521-2525

BREARLEY, M. J., N. D. JEFFERY, S. M. PHILLIPS u. R. DENNIS (1999):

Hypofractionated radiation therapy of brain masses in dogs: a retrospective analysis

of survival of 83 cases (1991-1996)

J Vet Int Med 13, Nr. 5, 408-412.

BRUCE, J., R. C. ANDERSON, C. E. MANDIGO, A. T. PARSA u. P. B. SENATUS

(Last update 29.03.2005, download: 10.06.2006):

Glioblastoma Multiforme

http://www.emedicine.com/Med/topic2692.htm


BUCHSER, E., M. GODDARD, B. HEYD, J. M. JOSEPH, J. FAVRE, N. DE

TRIBOLET, M. LYSAGHT u. P. AEBISCHER (1997):

Immunoisolated xenogenic chromaffin cell therapy for chronic pain. Initial clinical

experience

Anesthesiology 86, Nr. 2, 509

DE BOUARD, S., C. CHRISTOV, J. S. GUILLAMO, L. KASSAR-DUCHOSSOY, S.

PALFI, C. LEGUERINEL, M. MASSET, O. COHEN-HAGENAUER, M. PESCHANSKI

u. T. LEFRANCOIS (2002):

Invasion of human glioma biopsy specimens in cultures of rodent brain slices: a

quantitative analysis

J Neurosurg 97, Nr. 1, 169-176

DEISSLER, H., S. BLASS-KAMPMANN, A. KINDLER-ROHRBORN, H. E. MEYER,

u. M. F. RAJEWSKY (1996):

Characterization of rat NCA/CD9 cell surface antigen and its expression by normal

and malignant neural cells

J Neurosci Res 43, Nr. 6, 664-674

DEORAH, S., C. F. LYNCH u. Z. A. SIBENALLER (2006):

Trends in brain cancer incidence and survival in the United States: Surveillance,

Epidemiology, and End Results Program, 1973 to 2001

Neurosurg Focus 20, Nr. 4, E1

DE VOS, P., J. F. VAN STRAATEN, A. G. NIEUWENHUIZEN, M. DE GROOT, R. J.

PLOEG, B. J. DE HAAN, u. R. VAN SCHILFGAARDE (1999):

Why do microencapsulated islet grafts fail in the absence of fibrotic overgrowth

Diabetes 48, Nr. 7, 1381-1388


DHANABAI, M., R. RAMCHANDRAN u. M. J. F. WATERMAN (1999):

Endostatin induces endothelial cell apoptosis

J Biol Chem 247, Nr. 17, 11721-11726

DICKINSON P. J., M. K. KEEL, R. J. HIGGINS, P. D. KOBLIK, R. A. LECOUTEUR,

D. K. NAYDAN, A. W. BOLLEN u. W. VERNAU (2000):

Clinical and pathologic features of oligodendrogliomas in two cats

Vet Pathol 37, Nr. 2, 160-167

DIRKX, A. E., M. G. OUDE EGBRINK, K. CASTERMANS, D. W. VAN DER SCHAFT,

V. L. THIJSSEN, R. P. DINGS, L. KWEE, K. H. MAYO, J. WAGSTAFF, J. C.

BOUMA-TER STEEGE u. A. W. GRIFFIOEN (2006):

Anti-angiogenesis therapy can overcome endothelial cell anergy and promote

leukocyte-endothelium interactions and infiltration in tumors

Faseb J 20, Nr. 6, 621-630

DIXELIUS, J., M. CROSS, T. MATSUMOTO, T. SASAKI, R. TIMPL u. L.

CLAESSON-WELSH (2002):

Endostatin regulates endothelial cell adhesion und cytoskeletal organization

Cancer Res. 62, Nr. 7, 1944-1947

DOBSON, J. M, DUNCAN, B. u. X. LASCELLES (2003):

BSAVA Manual of Canine and Feline Oncology Second Editino

BSAVA, ISBN 0 905214 69 2, 321-323

DOHRMANN, G. J., J. R. FARWELL u. J. T. FLANNERY (1976):

Glioblastoma multiforme in children



DRUCKREY, H u. C. LANDSCHUTZ (1971):

Transplacental and neonatal carcinogenesis by ethylnitrosobiuret (ENBU) in BD IX-

rats

Z Krebsforsch Klin Onkol Cancer Res Clin Oncol 76, Nr. 1, 45-58

DUNN, I. F. u. P. M. BLACK (2003):

The neurosurgeon as local oncologist: cellular and molecular neurosurgery in

malignant glioma therapy

Neurosurg 52, Nr. 6, 1411-1424

DUVIVIER-KALI, V. F., A. OMER, R. J. PARENT, J. J. O'NEIL u. G. C. WEIR (2001):

Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple

barium-alginate membrane

Diabetes 50, Nr. 8, 1698-1705

EMERICH, D. F. u. H. C. SALZBERG (2001):

Update on immunoisolation cell therapy for CNS diseases

Cell Transplant 10, Nr. 1, 3-24

ENGERMAN, R. L., D. PFAFFENBACH u. M. D. DAVIS (1967):

Cell turnover of capillaries

Lab Invest 17, Nr.6, 738-743

ESSER, S., K. WOLBURG, H. WOLBURG, G. BREIER, T. KURZCHALIA u. W.

RISAU (1998):

Vascular endothelial growth factor induces endothelial fenestrations in vitro

J Cell Biol, 140, Nr. 4, 947-959


FACOETTI, A., E. RANZA u. E. BENERICETTI (2006):

Minichromosome maintenance protein 7: a reliable tool for glioblastoma proliferation

index

Anticancer Res 26, Nr. 2A, 1071-1075

FELBOR, U., L. DREIER, R. A. R. BRYANT, H. L. PLOEGH, B. R. OLSEN u. W.

MOTHES (2000):

Secreted cathepsin L generates endostatin from collagen XVIII

EMBO J 19, 1187-1194

FERNANDEZ, F. R., C. B. GRINDEM, T. T. BROWN, N. J. SHAR u. M. SAULNIER

(1997):

Cytologic and histologic features of a poorly differentiated glioma in a dog

Vet Clin Pathol 26, Nr. 4, 182-186

FISCHMANN, A (2004):

Blutgefäße des Glioblastoma multiforme: Elektronenmikroskopische und

immunozytochemische Untersuchungen zu Veränderungen der perivaskulären

extrazellulären Matrix und der Endothelzellen.

Diss.-Arbeit, Medizinische Fakultät der Eberhard-Karls-Universität Tübingen

FOLKMAN, J (1971):

Tumor angiogenesis: therapeutic implications

N Engl J Med 285, Nr. 21, 1182-1186

FOLKMAN, J. (1990):

What is the evidence that tumors are angiogenesis-dependant

J Natl Cancer Inst 82, 4-6


FOLKMAN, J. (1995):

Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease

Nat Med 1, Nr. 1, 27-31

FOLKMAN, J. (2004):

Endogenous angiogenesis inhibitors

APMIS 2004 112, 496-507 FOLKMAN, J. (2006):

Antiangiogenesis in cancer therapy-endostatin and its mechanisms of action

Exp Cell Res 312, Nr. 5, 594-607

FRIDENSHTEIN, A (1982):

Stromal bone marrow cells and the hematopoietic microenvironment

Arkh Patol 44, Nr. 10, 3-11

FUCHS C., A. MEYER-LINDENBERG, P. WOHLSEIN u. I. NOLTE (2003):

Computertomographic characteristics of primary brain tumors in dogs and cats

Berl Munch Tierarztl Wochenschr 116, Nr.11-12, 527

GETMANOVA, E. V., Y. CHEN, L. BLOOM, J. GOKEMEIJER, S. SHAMAH, V.

WARIKOO, J. WANG, V. LING u. L. SUN (2006):

Antagonists to human and mouse vascular endothelial growth factor receptor 2

generated by directed protein evolution in vitro

Chem Biol 13, Nr. 5, 549-556

GIUNCHEDI, P., E. GAVINI, MORETTI, M. D. u. PIRISINO, G. (2000):

Evaluation of alginate compressed matrices as prolonged drug delivery system

AAPS PharmSciTech 1, Nr. 3, E19


GRIFFIN, J. L., K. K. LEHTIMÄKI, P. K. VALONEN, O. H. GROHN, M. I,

KETTUNEN, S. YLA-HERTTUALA, A. PITKANEN, J. K. NICHOLSON u. R. A.

KAUPPINEN (2003):

Assignment of 1H nuclear magnetic resonance visible polyunsaturated fatty acids in

BT4C gliomas undergoing ganciclovir-thymidine kinase gene therapy-induced

programmed cell death

Cancer Res 63, Nr. 12, 3195-3201

GRISCELLI, F., H. LI, A. BENNACEUR-GRISCELLI, J. SORIA, P. OPOLON, C.

SORIA, M. PERRICAUDET, P. YEH u. H. LU (1998):

Angiostatin gene transfer: inhibition of tumor growth in vivo by blockage of

endothelial cell proliferation associated with a mitosis arrest

Proc Natl Acad Sci 95, Nr. 11, 6367-6372

HAGIHARA K., Y. YAMAGUCHI, R. SASISEKHARAN, L. U. CANTLEY u. V. P.

SUKHATME (2001):

Cell surface glypicans are low-affinity endostatin receptors

Molecular cell 7, Nr. 4, 811-822

HAMADA, H., M. KOBUNE, K. NAKAMURA, Y. KAWANO, K. KATO, O. HONMOU,

K. HOUKIN, T. MATSUNAGA u. Y. NIITSU (2005):

Mesenchymal stem cells (MSC) as therapeutic cytoreagents for gene therapy

Cancer Sci 96, Nr. 3, 149

HEIDNER, G. L., J. N. KORNEGAY, R. L. PAGE, R. K. DODGE u. D. E. THRALL

(1991):

Analysis of survival in a retrospective study of 86 dogs with brain tumors

J Vet Intern Med 5, Nr. 4, 219-226


HIGGINS, R. J., R. A. LECOUTEU, K. M. VERNAU, B. K. STURGES, J. E.

OBRADOVICH u. A. W. BOLLEN (2001):

Granular cell tumor of the canine central nervous system: two cases

Vet Pathol 38, Nr. 6, Nr. 620-627

HIRANO, A. u. T. MATSUI (1975):

Vascular structures in brain tumors

Hum Pathol. 6, Nr. 5, 611-621

HOBSON, B. u. J. DENEKAMP, J. (1984):

Endothelial proliferation in tumors and normal tissues, continous labeling studies

Br J Cancer 49, Nr. 4, 405-413

HOFER, S. u. A. MERLO (2002):

Therapeutische Optionen für maligne Gliome WHO-Grad III und IV

Schweiz Med Forum, Nr. 32/33

HORIKAWA, I. u. D. J. C. BARRETT (2003):

Transcriptional regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular and

viral oncogenic mechanisms

Carcinogenesis 24, Nr. 7, 1167-1176

HOSHINO, T. (1984):

A commentary on the biology and growth kinetics of low-grade and highgrade

gliomas



HOSSFELD, D. K., W. FIEDLER, G. WALTER, U. GEHLING u. T. MENDE (2001):

Neoangiogenese und tumorwachstum: pathophysiologie und neue therapeutische

ansätze

Deutsches Ärzteblatt 98, Nr. 21 A-1392 / B-1183 / C-1109

HSIEH, P. C., J. P. CHANDLER u. S. BHANGOO (2005):

Adjuvant gamma knife stereotactic radiosurgery at the time of tumor progression

potentially improves survival for patients with glioblastoma multiforme

Neurosurgery 57, Nr. 4, 684-692

HUSZTHY, P.C., C. BREKKEN, T. B. PEDERSON, F. THORSEN, P. O.

SAKARIASSEN, K. O. SKAFTNESMO, O. HARALDSETH, P. E. LONNING, R.

BJERKVIG u. P. O. ENGER (2006):

Antitumor efficacy improved by local delivery of species-specific endostatin

J Neurosurg 104, Nr. 1, 118-128

ICHINOSE, K., Y. MAESHIMA, Y. YAMAMOTO, H. KITAYAMA, Y. TAKAZAWA, K.

HIROKOSHI, H. SUGIYAMA, Y. YAMASAKI, K. EGUCHI u. H. MAKINO (2005):

Antiangiogenic endostatin peptide ameliorates renal alterations in the early stage of a

type 1 diabetic nephropathy model

Diabetes 54, Nr. 10, 2891-2903

IWADATE, Y., M. INOUE, T. SAEGUSA, Y. TOKUSUMI, H. KINOH, M. HASEGAWA,

M. TAGAWA, A. YAMAURA u. H. SHIMADA (2005):

Recombinant Sendai virus vector induces complete remission of established brain

tumors through efficient interleukin-2 gene transfer in vaccinated rats



JAIN, R. K. (1991):

Haemodynamic and transport barriers to the treatment of solid tumours

Int J Radiat Biol 60, Nr. 1-2, 85-100

JIANG, L., V. JHA, M. DHANABEL, V. P. SUKHATME u. S. L. ALPER (2001):

Intracellular Ca2+ signaling in endothelial cells by the angiogenesis inhibitors

endostatin and angiostatin

Am. J. Physio. Cell Physiol. 280, Nr. 5, 1140-1150

JOHANNESEN, T. B, J. NORUM u. K. LOTE (2002):

A cost-minimising analysis of standard radiotherapy and two experimental

therapies in glioblastoma

Radiother Oncol 62, Nr.2, 227-231

JOKI, T., M. MACHLUF, A. ATALA, J. ZHU, N. T. SEYFRIED, I. F. DUNN, T. ABE, R.

S. CARROLL u. P. M. BLACK (2001):

Continous release of endostatin from microencapsulated egeneered cells for tumor

therapy

Nat. Biotechnol 19, Nr.1, 35-39

KAMSTOCK, D., A. GUTH, R. ELMSLIE, I. KURZMAN, D. LIGGITT, L. CORO, J.

FAIRMAN u. S. DOW (2006):

Liposome-DNA complexes infused intravenously inhibit tumor angiogenesis and elicit

antitumor activity in dogs with soft tissue sarcoma

Cancer Gene Ther 13, Nr. 3, 306-317

KANG, H. Y., D. SHIM, S. S. KANG, S. I. CHANG u. H. Y. KIM (2006):

Protein kinase B inhibits endostatin-induced apoptosis in HUVECs

J Biochem Mol Biol 39, Nr. 1, 97-104


KARUMANCHI, S. A., V. JHA, R. RAMCHANDRAN, A. KARIHALOO, L. TSIOKAS,

B. CHAN, M. DHANABAL, J. I. HANAI, G. VENKATARAMAN, Z. SHRIVER, N.

KEISER, R. KALLURI, H. ZENG, D. MUKHOPADHYAY, R. L. CHEN, A. D. LANDER,

K. HAGIHARA, Y. YAMAGUCHI, R. SASISEKHARAN, L. CANTLEY u. V. P.

SUKHATME (2001):

Cell surface glypicans are low-affinity endostatin receptors

Mol Cell 7, Nr. 4, 811-822

KEEZER, S.M., S. E. IVIE, H. C. KRUTZSCH, A. TANDLE, S. K. LIBUTTI u. D. D.

ROBERTS (2003):

Angiogenesis inhibitors target the endothelial cell cytoskeleton through altered

regulation of heat shock protein 27 and cofilin

Cancer Res 63, Nr.19, 6405-6412

KERNOHAN, J.W. u. G.P. SAYRE (1952):

Tumors of the Central Nervous System

Atlas of Tumor Pathology Section X- Fascicles 35 and 37

KIM, Y. M., J. W. JANG, O. H. LEE, J. YEON, E. Y. CHOI, K. W. KIM, S. T. LEE u. Y.

G. KWON (2000):

Endostatin inhibits endothelial and tumor cellular invasion by blocking the activation

and catalytic activity of matrix metalloproteinase 2

Cancer Res 60, Nr. 19, 5410-5413

KIM, Y. M., S. HWANG, Y. M. KIM, B. J. PYUN, T. Y. KIM, S. T. LEE, Y. S. GHO u.

Y. G. KWON (2002):

Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct

interaction with KDR/Flk-1

J Biol Chem 277, Nr. 31, 27872-27879


KIM, C. H., M. J. HONG, S. D. PARK, C. K. KIM, M. Y. PARK, H. J. SOHN, H. I.

CHO, T. G. KIM u. Y. K. HONG (2006):

Enhancement of anti-tumor immunity specific to murine glioma by vaccination with

tumor cell lysate-pulsed dendritic cells engineered to produce interleukin-12

Cancer Immunol Immunother 4, 1-11

KIOI, M., S. R. HUSAIN, D. CROTEAU u. S. KUNWAR (2006):

Convection-enhanced delivery of Interleukin-13 receptor-directed cytotoxin for

malignant glioma therapy

Technol Cancer Res Treat 5, Nr. 3, 239-250

KIRSCH, M., G. SCHACKERT u. P. M. BLACK (2000a):

Angiogenesis, metastasis and endogenous inhibition

J Neurooncol 50, Nr. 1-2, 173-180

KIRSCH M, G. SCHACKERT u. P. M. BLACK (2000b):

Anti-angiogenic treatment strategies for malignant brain tumors

J Neurooncol 50, Nr. 1-2, 149-163

KLEIHUES, P. u. L. H. SOBIN (2000):

World Health Organization classification of tumors

Cancer, 88, Nr. 12, 2887

KLEIHUES, P., D. N. LOUIS u. B. W. SCHEITHAUER (2002):

The WHO classification of tumors of the nervous system

Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 61, Nr. 3, 215-225


KOBUNE, M., Y. KAWANO, Y. ITO, H. CHIBA, K. NAKAMURA, H. TSUDA, K.

SASAKI, H. DEHARI, H. UCHIDA, O. HONMOU, S. TAKAHASHI, A. BIZEN, R.

TAKIMOTO, T. MATSUNAGA, J. KATO, K. KATO, K. HOUKIN, Y. NIITSU u. H.

HAMADA (2003):

Telomerized human multipotent mesenchymal cells can differentiate into

hematopoietic and cobblestone area-supporting cells

Exp Hematol 31, Nr. 8, 715-722

KRAFT, S. L., P. R. GAVIN, C. DEHAAN, M. MOORE, L. R. WENDLING u. C. W.

LEATHERS (1997):

Retrospective review of 50 canine intracranial tumors evaluated by magnetic

resonance imaging


KULSENG, B., G. SKJAK-BRAEK, L. RYAN, A. ANDERSSON, A. KING, A.

FAXVAAG u. T. ESPEVIK (1999):

Transplantation of alginate microcapsules: generation of antibodies against alginates

and encapsulated porcine islet-like cell clusters

Transplantation 67, Nr. 7, 978-984

KUNZ, M. u. A. HARTMANN (2002):

Angiogenese – Antiangiogenese Bedeutung für Tumorwachstum und Metastasierung

Der Hautarzt 53, Nr. 6, 373-384

LAHAM, R. J., F. W. SELLKE, E. R. EDELMAN, J. D. PEARLMAN, J. A. WARE, D.

L. BROWN, J. P. GOLD u. M. SIMONS (1999):

Local perivascular delivery of basic fibroblast growth factor in patients undergoing

coronary bypass surgery: results of a phase I randomized, double-blind, placebo-

controlled trial

Circulation 100, Nr. 18, 1865-1871


LANGEN, K. J., R. P. CLAUSS, M. HOLSCHBACH, H. MUHLENSIEPEN, J. C.

KIWIT, K. ZILLES, H. H. COENEN u. H. W. MÜLLER-GARTNER (1998):

Comparison of iodotyrosines and methionine uptake in a rat glioma model

J Nucl Med 39, Nr. 9, 1596-1599

LEON, S. P., R. D. FOLKERTH u. P. M. BLACK (1996):

Microvessel density is a prognostic indicator for patients with astroglial

brain tumors

Cancer 77, Nr. 2, 362-372

LEHTIMÄKI, K. K., P. K. VALONEN, J. L. GRIFFIN, T. H. VAISANEN, O. H. GROHN,

M. I. KETTUNEN, J. VEPSALAINEN, S. YLA-HERTTUALA, J. NICHOLSON u. R. A.

KAUPPINEN (2003):

Metabolite changes in BT4C rat gliomas undergoing ganciclovir-thymidine kinase

gene therapy-induced programmed cell death as studied by 1H NMR spectroscopy in

vivo, ex vivo, and in vitro

J Biol Chem 278, Nr. 46, 45915-45923

LÖHR M, A. HOFFMEYER, J. KRÖGER, M. FREUND, J. HAIN, A. HOLLE, P.

KARLE, W. T. KNOFEL, S. LIEBE, P. MÜLLER, H. NIZZE, M. RENNER, R. M.

SALLER, T. WAGNER, K. HAUENSTEIN, W. H. GUNZBURG u. B. SALMONS

(2001):

Microencapsulated cell-mediated treatment of inoperable pancreatic carcinoma

Lancet 357, Nr. 9268, 1591-1592

LI, G. C., J. M. YANG, M. M. NIE, C. G. SU, L. C. SUN, Y. Z. QIAN, G. E. FANG, J.

SHAM, M. C. WU u. Q. J. QIAN (2005):

Potent antitumoral effects of a novel gene-viral therapeutic system CNHK300-

mEndostatin in hepatocellular carcinoma

Chin Med J (Engl) 118, Nr. 3, 179-185


LI, L., R. Y. LIU, J. L. HUANG, Q. C. LIU, Y. LI, P. H. WU, Y. X. ZENG u. W. HUANG

(2006):

Adenovirus-mediated intra-tumoral delivery of the human endostatin gene inhibits

tumor growth in nasopharyngeal carcinoma

Int J Cancer 118, Nr. 8, 2064-2071

LI, W. u. C. B. LI (2005):

Effect of oral lactococcus lactis containing endostatin on 1, 2-dimethylhydrazine-

induced colon tumor in rats

World J Gastroenterol.11, Nr. 46, 7242-7247

LUO, J., D, L. HE u. L. NING (2006):

Hypoxia-inducible factor-1alpha induces the epithelial-mesenchymal transition of

human prostatecancer cells

Chin Med J 119, Nr. 9, 713-718

LUSE, S.A. (1960):

Electron microscopic studies of brain tumors

Neurology 10, Nr. 10, 881-905

MA, H. I., S. Z. LIN, Y. H. CHIANG, J. LI, S. L. CHEN, Y. P. TSAO u. X. XIAO (2002):

Intratumoral gene therapy of malignant brain tumor in a rat model with angiostatin

delivered by adeno-associated viral (AAV) vector

Gene Ther 9, Nr. 1, 2-11

MARKUSEN, J. F., C. MASON, D. A. HULL, M. A. TOWN, A. B. TABOR, M.

CLEMENTS, C. H. BOSHOFF u. P. DUNNILL (2006):

Behavior of adult human mesenchymal stem cells entrapped in alginate-GRGDY

beads

Tissue Eng 12, Nr. 4, 821-830


MARNEROS, A. G. u. B. R. OLSEN (2005):

Physiological role of collagen XVIII and endostatin

FASEB J 19, Nr. 7, 716-728

MAUFFREY, C. (2006):

Paediatric brainstem gliomas: Prognostic factors and management

J Clin Neuroscience 13, Nr. 4, 431-437

MEYERS, C. A., R. S. SCHEIBEL u. A. D. FORMAN (1992):

Persistent neurotoxicity of systemically administered interferon-alpha

Neurology 41, Nr. 5, 672-676

MORCH, Y. A., I. DONATI, B. L. STRAND u. G. SKJAK-BRAEK (2006):

Effect of Ca(2+), Ba(2+), and Sr(2+) on Alginate Microbeads

Biomacromolecules 7, Nr. 5, 1471-1480

MU, Y. G., M. Z. CHEN, Z. P. CHEN, W. N. ZHOU, X. H. ZHANG u. K. SAI

Microsurgical technique of brain glioma-a report of 183 cases

Ai Zheng 23, Nr. 11, 1317-1321

NAG, S., T. PAPNEJA, R. VENUGOPALAN u. D. J. STEWART (2005):

Increased angiopoietin2 expression is associated with endothelial apoptosis and

blood-brain barrier breakdown

Lab Invest 85, Nr. 10, 1189-1198

NATAF, F., M. L. TUCKER, P. VARLET, M. KOZIAK, F. BEUVON, C. DAUMAS-

DUPORT u. F. X. ROUX (2005):

Oligodendrogliomas: historical background of classifications

Neurochirurgie 51, Nr. 3-4 Pt 2, 219-227


NOLTE, I u. M. NOLTE (2001):

Praxis der Onkologie bei Hund und Katze

Enke Verlag, ISBN 3-7773-1471-4, 109-110

OBERMAIER, G, A. REIHLEN, E. DAHME u. S. WEIS (1995)

Rhinencephalic glial cell nests and their possible role in glioma formation:

morphometric studies do not reveal significant differences between brachycephalic

and dolichocephalic dogs

Acta Neuropathol (Berl) 89, Nr. 3, 258-261

OHLFEST, J. R., Z. L. DEMOREST, Y. MOTOOKA, I. VENGCO, S. OH, E. CHEN, F.

A. SCAPPATICCI, R. J. SAPLIS, S. C. EKKER, W. C. LOW, A. B. FREESE u. D. A.

LARGAESPADA (2005):

Combinatorial antiangiogenic gene therapy by nonviral gene transfer using the

sleeping beauty transposon causes tumor regression and improves survival in mice

bearing intracranial human glioblastoma

Mol Ther 12, Nr. 5, 778-788

OMER, A., V. F. DUVIVIER-KALI, N. TRIVEDI, K. WILMOT, S. BONNER-WEIR u. G.

C. WEIR (2003):

Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell

clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice

Diabetes 52, Nr. 1, 69-75

O`REILLY, M. S., T. BOEHM, Y. SHING, N. FUKAI, G. VASIOS, W. S. LANE, E.

FLYNN, J. R. BIRKHEAD, B. R. OLSEN u. J. FOLKMAN (1997):

Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth

Cell 88, Nr. 2, 277-285


OU-YANG, F., K. L. LAN, C, T. CHEN, J. C. LIU, C. L. WENG, C. K. CHOU, X. XIE,

J. Y. HUNG, Y. WEI, G. N. HORTOBAGYI u. M. C. HUNG (2006):

Endostatin-cytosine deaminase fusion protein suppresses tumor growth by targeting

neovascular endothelial cells

Cancer Res 66, Nr. 1, 378-384

PANDEY, R., Z. AHMAD, S. SHARMA u. G. K. KHULLER (2005):

Nano-encapsulation of azole antifungals: potential applications to improve oral drug

delivery

Int J Pharm 301, Nr. 1-2, 268-276

PANDYA, N. M., N. S. DHALLA u. D. D. SANTANI (2006):

Angiogenesis-a new target for future therapy

Vascul Pharmacol 44, Nr. 5, 265-274

PAXINOS, G. u. C. WATSON (1998):

The Rat Brain in Stereotactic Coordinates

Academic Press, Fourth Edition

PEROULIS, I., N. JONAS u. M. SALEH (2002):

Antiangiogenic activity of endostatin inhibits C6 glioma growth

Int J Cancer 97, Nr. 6, 839-845

PETERSEN, W., T. PUFE, C. STARKE, T. FUCHS, S. KOPF, M. RASCHKE, R.

BECKER u. B. TILLMANN (2005):

Locally applied angiogenic factors-a new therapeutic tool for meniscal repair

Ann Anat. 187, Nr. 5-6, 509-519


PLATE, K. H., G. BREIER, H. A. WEICH u. W. RISAU (1992):

Vascular endothelial growth factor is a potential tumour angiogenesis factor in human

gliomas in vivo

Nature 359, Nr. 6398, 845-848

PLATE, K. H., G. BREIER, B. MILLAUER, A. ULLRICH u. W. RISAU (1993):

Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its cognate receptors in a rat

glioma model of tumor angiogenesis

Cancer Res 53, Nr. 23, 5822-5827

PRADILLA, G., F. G. LEGNANI, G. PETRANGOLINI, P. FRANCESCATO, F.

CHILLEMI, B. M. TYLER, S. M. GAINI, H. BREM, A. OLIVI u. F. DIMECO (2005):

Local delivery of a synthetic endostatin fragment for the treatment of experimental

gliomas

Neurosurgery 57, Nr. 5, 1032-1040

RAINOV, N. G., A. SOLING u. V. HEIDECKE (2006):

Novel therapies for malignant gliomas: a local affair

Neurosurg Focus 20, Nr. 4, E9

READ, T. A., V. STENSVAAG, H. VINDENES, E. ULVESTAD, R. BJERKVIG u. F.

THORSEN (1999):

Cells encapsulated in alginate: a potential system for delivery of recombinant

proteins to malignant brain tumours

Int J Dev Neurosci 17, Nr. 5-6, 653-663


READ, T. A., D. R. SORENSEN, R. MAHESPARAN, P. O. ENGER, R. TIMPL, B. R.

OLSEN, M. H. HJELSTUEN, O. HARALDSETH, u. R. BJERKVIG (2001a):

Local endostatin treatment of gliomas administered by microencapsulated producer

cells

Nat Biotechnol 19, Nr.1, 29-34

READ, T. A., M. FARHADI, R. BJERKVIG, B. R. OLSEN, A. M. ROKSTAD, P. C.

HUSZTHY u. P. VAJKOCZY (2001b):

Intravital microscopy reveals novel antivascular and antitumor effects of endostatin

delivered locally by alginate-encapsulated cells

Cancer Res. 61, Nr. 18, 6830-6837

REARDON, D. A. u. P. Y. WEN (2006):

Therapeutic advances in the treatment of glioblastoma: rationale and potential role of

targeted agents

The Oncologist 11, Nr. 2, 152-164

REHN, M., E. HINTIKKA u. T. PIHLAJANIEMI (1996):

Characterization of the mouse gene for the alpha 1 chain of Type XVIII collagen

(col18a1) reveals that the three variant N156 terminal polypeptide forms are

transcribed form two widely separated promotors

Genomics 32, Nr. 3, 436-446

REHN, M., T. VEIKKOLA, E. KUKK-VALDRE, H. NAKUMARA, M. ILMONEN, C. R.

LOMBARDO, T. PIHLAJANIEMI, K. ALITALO u. K. VUORI (2001):

Interaction of endostatin with integrins implicated in angiogenesis

Proc Natl Acad Sci USA 98, Nr. 3, 1024-1029


ROKSTAD, A. M., B. STRAND, K. RIAN, B. STEINKJER, B. KULSENG, G. SKJAK-

BRAEK u. T. ESPEVIK (2003):

Evaluation of different types of alginate microcapsules as bioreactors for producing

endostatin

Cell Transplant 12, Nr. 4, 351-364

ROSSMEISL J. H. JR, P. BRIGHT, L. TAMARKIN, B. W. SIMPSON, G. C. TROY, W.

HUESTON u. D. L. WARD (2002):

Endostatin concentrations in healthy dogs and dogs with selected neoplasms


SALHIA, B., L. ANGELOV, L. RONCARI, X. WU, P. SHANNON P u. A. GUHA

(2000):

Expression of vascular endothelial growth factor by reactive astrocytes and

associated neoangiogenesis

Brain Res 883, Nr. 1, 87-97

SASAKI, T., N. FUKAI, K. MANN, W. GÖHRING, B. R. OLSEN u. R. TIMPL (1998):

Structure, function and tissue forms of the C-terminal domain of collagen XVIII

containing the angiogenesis inhibitor endostatin

EMBO J 17, Nr. 15, 4249-4256

SCHMIDT, N. O., M. ZIU, G. CARRABBA, C. GIUSSANI, L. BELLO, Y. SUN, K.

SCHMIDT, M. ALBERT, P. M. BLACK u. R. S. CARROLL (2004):

Antiangiogenic therapy by local intracerebral microinfusion improves treatment

efficiency and survival in an orthotopic human glioblastoma model



SELBY, D. M., C. A. WOODARD, M. L. HENRY u. J. J. BERNSTEIN (1997):

Are endothelial cell patterns of astrocytomas indicative of grade

In Vivo 11, Nr. 5, 371-375

SIPOS, E. P. u. H. BREM (2000):

Local anti-angiogenic brain tumor therapies

J Neurooncol 50, Nr. 1-2, 181-188

SKURK, C., H. MAATZ, H. S. KIM, J. YANG, M. R. ABID, W. C. AIRD u. K. WALSH

(2004):

The Akt-regulated forkhead transcription factor FOXO3a controls endothelial cell

viability through modulation of the caspase-8 inhibitor FLIP

J Biol Chem 279, Nr. 2, 1513-1525

SMITH, T. J. (2005):

(Page Updated: 12.04.2005, Download: 24.06.2006)

Dr. Smith's Page Physiology & Pharmacology

http://www.pacific.edu/pharmacy/smith_res.html

SNYDER, J. M., F. S. SHOFER, T. J. VAN WINKLE u. C. MASSICOTTE (2006):

Canine intracranial primary neoplasia: 173 cases (1986-2003)


SON, M. J., J. S. KIM, M. H. KIM, H. S. SONG, J. T. KIM, H. KIM, T. SHIN, H. J.

JEON, D. S. LEE, S. Y. PARK, Y J. KIM, J. H. u. D. H. NAM (2006):

Combination treatment with temozolomide and thalidomide inhibits tumor growth and

angiogenesis in an orthotopic glioma model

Int J Oncol 28, Nr. 1, 53-59


SOON-SHIONG, P., R. E. HEINTZ, N. MERIDETH, Q. X. YAO, Z. YAO, T. ZHENG,

M. MURPHY, M. K. MOLONEY, M. SCHMEHL u. M. HARRIS (1994)

Insulin independence in a type 1 diabetic patient after encapsulated islet

transplantation

Lancet 343, Nr. 8903, 950-951

STÄNDKER, L., M. SCHRADER, S. M. KANSE, M. JÜRGENS, W. G. FORSSMAN

u. K. T. PREISSNER (1997):

Isolation and characterization of the circulating form of human endostatin

FEBS Lett 420, Nr. 2-3, 129-133

STEWART, L. A. (2002):

Chemotherapy in adult high-grade glioma: a systematic review and meta-analysis of

individual patient data from 12 randomised trials

Lancet 359, Nr. 9311, 1011-1018

SU, B., Q. ZHENG, M. M. VAUGHAN, Y. BU u. I. H. GELMAN (2006):

SSeCKS metastasis-suppressing activity in MatLyLu prostate cancer cells correlates

with vascular endothelial growth factor inhibition

Cancer Res 66, Nr. 11, 5599-5607

SUBRAMANIAN, I. V., T. M. BUI NGUYEN, A. M. TRUSKINOVSKY, J. TOLAR, B. R.

BLAZAR u. S. RAMAKRISHNAN (2006):

Adeno-associated virus-mediated delivery of a mutant endostatin in combination with

carboplatin treatment inhibits orthotopic growth of ovarian cancer and improves long-

term survival

Cancer Res 66, Nr. 8, 4319-4328


SUDHAKAR, A., H. SUGIMOTO, C. YANG, J. LIVELY, M. ZEISBERG u. R.

KALLURI (2003):

Human tumstatin and human endostatin exhibit distinct antiangiogenic activities by

alpha v beta 3 and alpha 5 beta 1 integrins

Proc Natl Acad Sci USA 100, Nr. 8, 4766-4771

SUZAKI, Y., K. HAMADA, M. SHO, T. ITO, K. MIYAMOTO, S. AKASHI, H.

KASHIZUKA, N. IKEDA, Y. NAKAJIMA, M. IWASE, I. HOMMA, L. KOBZIK u. H.

KIMURA (2005):

A potent antiangiogenic factor, endostatin prevents the development of asthma in a

murine model

J Allergy Clin Immunol 116, Nr. 6, 1220-1227

SZEIFERT, G. T., N. MASSAGER, D. DEVRIENDT, P. DAVID, F. DE SMEDT, S.

RORIVE, I. SALMON, J. BROTCHI u. M. LEVIVIER (2002):

Observations of intracranial neoplasms treated with gamma knife radiosurgery

J Neurosurg 97, Nr. 5 Suppl, 623-626

TANAKA, T., Y.CAO, J. FOLKMAN u. H. A. FINE (1998):

Viral vector-targeted antiangiogenic gene therapy utilizing an angiostatin

complementary DNA

Cancer Res 58, Nr. 15, 3362-3369

TANAKA, K., T. SASAYAMA, A. KAWAMURA, T. KONDOH, N. KANOMATA u. E.

KOHMURA (2006):

Isolated oculomotor nerve paresis in anaplastic astrocytoma with exophytic invasion

Neurol Med Chir (Tokyo) 46, Nr. 4, 198-201


TSENG, J. L. u. P. AEBISCHER (2000):

Encapsulated neural transplants

Prog Brain Res 127, 189-202

TSENG, S. H., S. M. LIN, J. C. CHEN, Y. H. SU, H. Y. HUANG, C. K. CHEN, P. Y.

LIN u. Y. CHEN (2004):

Resveratrol suppresses the angiogenesis and tumor growth of gliomas in rats


URBICH, C., A. REISSNER, E. CHAVAKIS, E. DERNBACH, J. HAENDELER, I.

FLEMING, A. M. ZEIHER, M. KASZKIN u. S. DIMMELER (2002):

Dephosphorylation of endothelial nitric oxide synthase contributes to the anti-

angiogenic effects of endostatin

FASEB J 16, Nr. 7, 706-708

VISTED, T., R. BJERKVIG u. P. O. ENGER (2001):

Cell encapsulation technology as a therapeutic strategy for CNS malignancies

Neuro-oncol 3, Nr. 3, 201-210

VISTED T u. M. LUND-JOHANSEN (2003):

Progress and challenges for cell encapsulation in brain tumour therapy

Expert Opin Biol Ther 3, Nr. 4, 551-561

WAGGENER, J. D. u. J. L. BEGGS (1976):

Vasculature of Neural Neoplasms

Adv Neurol 15, 27-49

WESSELING, P., D. J. RUITER u. P. C. BURGER (1997):

Angiogenesis in brain tumors; pathobiological and clinical aspects

J Neuro-onc 32, Nr. 3, 253-265


WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE

(DOWNLOAD: 20.07.06)

GeneCard for protein-coding COL18A1GC21P045649

http://genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=COL18A1

WICKSTRÖM, S. A., T. VEIKKOLA, M. RAHN, T. PIHLAJENI, K. ALITALO u. J.

KESKI-OJA (2001):

Endostatin-induced modulation of plasminogen activation with concomitant loss

of focal adhesions and actin stress fibers in cultured human endothelial cells

Cancer Res. 61, Nr. 17, 6511-6516

WIESTLER, O. D. u. M. C. SCHMIDT (1998):

Neuropathologie maligner Gliome

Onkologe 4, Nr. 7, 580-588

WINN, S. R., L. WAHLBERG, P. A. TRESCO u. P. AEBISCHER (1989):

An encapsulated dopamine-releasing polymer alleviates experimental parkinsonism

in rats

Exp Neurol 105, Nr. 3, 244-250

YANG, S. Y., H. LIU u. J. N. ZHANG (2004):

Gene therapy of rat malignant gliomas using neural stem cells expressing IL-12

DNA Cell Biol 23, Nr. 6, 381-389

YANG, W., R. F. BARTH, G. WU, M J. CIESIELSKI, R. A. FENSTERMAKER, B. A.

MOFFAT, B. D. ROSS u. C. J. WIKSTRAND (2005):

Development of a syngeneic rat brain tumor model expressing EGFRvIII and its use

for molecular targeting studies with monoclonal antibody L8A4



YASUHARA, T., T. SHINGO, K. MURAOKA, K. KOBAYASHI, A. TAKEUCHI, A.

YANO, Y. WENJI, M. KAMEDA, T. MATSUI, Y. MIYOSHI u. I. DATE (2005):

Early transplantation of an encapsulated glial cell line-derived neurotrophic factor-

producing cell demonstrating strong neuroprotective effects in a rat model of

Parkinson disease


YOSHIMURA, F., T. KAIDOH, T. INOKUCHI u. M. SHIGEMORI (1998):

Changes in VEGF expression and in the vasculature during the growth of early-stage

ethylnitrosourea-induced malignant astrocytomas in rats

Virchows Arch 433, Nr. 5, 457-463

ZHANG, X., J. WU, Z. FEI, D. GAO, X. LI, X. LIU, J. LIANG u. X. WANG (2000):

Angiostatin K(1-3) gene for treatment of human gliomas: an experimental study

Chin Med J (Engl) 113, Nr. 11, 996-1001

164 9 Anhang 9 Anhang

9.1 Bezugsquellen

9.1.1 Versuchstiere

Rattenstamm Anzahl Tiere Bezugsquelle

BDIX/Ztm 65 Zentrales Tierlaboratorium

der Medizinischen

Hochschule Hannover

9.1.2 Allgemeiner Bedarf und OP-Bedarf

Material Bezugsquelle

Mini-Bulldog-Klemmen 35 mm Aesculap AG und Co. KG, Tuttlingen

Flüssigstickstoff Air Liquide Deutschland GmbH, Bremen,

Deutschland

Altromin® Alleinfuttermittel 1324 Altromin GmbH, Lage, Deutschland

Augensalbe, Vidisic Augengel Bausch & Lomb GmbH, Berlin,

Deutschland

Kanülen, 100 Sterican Gr. 17, 0,5 x 25

mm

Braun Omnifix-F Einmalspritzen 1 ml

B. Braun, Melsungen, Deutschland

Nylon-Siebchen (100 µm Maschenweite) BD Falcon, Bioscience, USA

Hautdesinfektionsspray (Cutasept®) Bode Chemie, Hamburg, Deutschland

CellBeads® CellMed AG, Alzenau, Deutschland

Desinfektionsspray (Desomed® Rapid

AF),

Händewaschgel (Desowasch®),

Händedesinfektionsmittel (Aseptoman®)

Desomed AG, Freiburg, D

Pinzetten

Scheren

Dewimed Medizintechnik, Tuttlingen,

Deutschland

9 Anhang 165

Rasparatorium

Arterienklemmen

Hohlmeißelzange

Dewimed Medizintechnik, Tuttlingen,

Deutschland

Insulinspritzen Dispomed Witt oHG, Geinhausen,

Deutschland

Mikroliterspritzen 10 µl, Typ 1710

Hamiltonkanüle (ga 19, Länge 15 mm,

pst:4, tap:Y)

Hamiltonkanüle (ga 18, Länge 51 mm,

pst: AS, tap-)

Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,

Schweiz

Einmalhandschuhe: Kimberly Clark

Powder Free Latex Exam Gloves

Kimberly Clark, Zavantem, Belgien

OT SuperFrost®Plus

Deckgläser 24 x 60 mm # 1

Menzel, Braunschweig, Deutschland

Kohlenstoffdioxid (CO2) Messer, Krefeld, Deutschland

Perfusionsbesteck Omnilab, Bremen, Deutschland

Ketanest®, Ch. B.: 40923A

Domitor®, Ch. B. : 1026548

Pfizer GmbH, Karlsruhe, Deutschland

Einmalrasierer Monomed P.J. Dahlhausen, Köln, Deutschland

Einbettungsmedium (Tissue-Tek®

O.C.T.TM) für Kryoeinbettung

Sakura Fine Tek Europe B.V.,

Zoeterwoude, Niederlande

Pipettenspitzen 10 µl, 100 µl, 200 µl,

1000µl

Eppendorfgefäße 1,5 ml und 2 ml

Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland

Makrolon®-Käfige Typ IV

Makrolon®-Trinkflaschen

TECNIPLAST GmbH, Hohenpeißenberg,

Deutschland

Tierwaage Tefal, Offenbach am Main, Deutschland

Coverplates, Coverplate-Kassetten für

IHC

Thermo Electron GmbH, Dreieich,

Deutschland

Nahtmaterial (4/0 Ethilon, monofil,

(Polyamid 6)

Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH,

Schortens, Deutschland

166 9 Anhang

9.1.3 Verbrauchsmaterialien Zellkultur

Material Verwendung Bezugsquelle

DMSO Einfriermedium Carl Roth GmbH + Co.

KG, Karlsruhe,

Deutschland

PBS (Phosphate Buffered Saline,

Code No.S302430)

OP/Spülen DakoCytomation GmbH,

Hamburg, Deutschland

Gewebekulturflaschen 75 cm² und

25 cm²

Zellkulturplatten, 6er well, 12er

well, 24er well, 48er well und 96er

well

PP-Röhrchen 15 ml und 25 ml

Kultivierung

Kultivierung/Vorberei

tung der Implantate

Suspendieren/

Abzentrifugieren

Greiner BIO-ONE,

Frickenhausen,

Deutschland

elektrische Pipettierhilfe

(Pipetus®-Akku)

Pasteurpipetten

Pipettierschritte/

Resuspendieren

Pipettierschritte/

Resuspendieren

Hirschmann Laborgeräte

GmbH & Co.KG,

Eberstadt, D

Gliomzellen (BT4Ca) experimentelles

Glioblastom

Institut für Zellbiologie

(Tumorforschung) des

Universitätsklinikums

Essen, Essen,

Deutschland

Kryoröhrchen mit Außengewinde,

2 ml

Kryokonservierung Nalgene®Kryoröhrchen,

Nalge Europe Ltd.,

Neerijse, Belgium

Einfrierbox (Behälter Qualifreeze

PC Mr. Frosty)

Neubauer-Zählkammer (Tiefe 0,1

mm, 1/400 u. 1/25 qm²)

Kryokonservierung

Zellzählung

Omnilab Laborzentrum,

Bremen, Deutschland

9 Anhang 167

DMEM high Glucose (4°C)

Penicillin-Streptomycin (-20°C)

Na-Pyruvat (4°C)

Trypsin (-20°C)

L-Glutamin(-20°C)

Fetales Kälberserum (Charge Nr.:

A64905-0311/R1952, -20°C)

Mediumgrundlage

Kulturmediumzusatz

Kulturmediumzusatz

Kulturmediumzusatz

Kulturmediumzusatz

Kulturmediumzusatz

PAA Laboratories GmbH,

Cölbe, Deutschland

Serologische Pipetten (einzeln

steril verpackt) 1 ml, 5 ml, 10 ml

und 25 ml

Pipettierschritte/

Resuspendieren

Sarstedt, Nümbrecht,

Deutschland

Trypanblau Vitalzellzählung Sigma-Aldrich,

Deisenhofen,

Deutschland

9.1.4 Verbrauchsmaterialien Histologie und Immunhistologie


Polyclonal Antibody to Human

Endostatin, Cat No DP3053

Immunhistologie Acris Antibodies GmbH,

Hiddenhausen,

Deutschland

2-Methylbutan (3927.1)

Xylol (8118)

Färbetröge und OT Gestelle aus

Polyoxymethylen

Kryoeinbettung

H.E. Färbung

Immunhistologie

Carl Roth GmbH + Co.

KG, Karlsruhe,

Deutschland

Target Retrieval Solution (Code

No S169984)

Antibody Diluent (Code No

S080983

Immunhistologie

Immunhistologie

DakoCytomation GmbH,


168 9 Anhang

Polymer (EnVision + System/

HRP, Rabbit (AEC+), Code No

K400811)

Chromogen (Code No K 346911)

Faramount Aqueous Mounting

Medium

Negative Control Rabbit

Immunoglobulin Fraction (Code

No X093602)

Polyclonal anti human vWF, Code

No A008202

Immunhistologie

Immunhistologie

Immunhistologie

Immunhistologie

Immunhistologie

DakoCytomation GmbH,


Aqua dest. Histologie/

Immunhistologie

INI GmbH Grundfos,

Hannover, Deutschland

NaCl (0278)

Ethanol Absolut (8006)

Salz für PBS

H.E. Färbung

J.T.Baker, Deventer,

Niederlande

Paraformaldehyd (1.04005.1000)

Wasserstoffperoxid (30%)

Entellan (1.07961.0500)

Salzsäure (1.09057.1000)

Perfusionsfixierung

OP/Immunhistologie

Eindeckmedium

H.E. Färbung

Merck, Darmstadt,

Deutschland

NA2HPO4 (S-0876)

KH2PO4 (P-5379)

Sucrose (S-8501)

Perfusionsfixierung

Salz für PBS

Kryoprotektion

Sigma-Aldrich Chemie

GmbH, München,

Deutschland

Hämatoxylin (Harris Hämatoxylin

6765003)

Eosin (Shandon Instant Eosin

Aqueous 6765540)

Coverplates (Shandon Clips)

Coverplate-Kassetten

H.E. Färbung

H.E. Färbung

Immunhistologie

Immunhistologie

Thermo Electron

Corporation GmbH,

Dreieich, Deutschland

9 Anhang 169

9.1.5 Geräte und Software


Stereotakt (SAS 4120) Stereotaktische

Implantationen

ASI Instruments, Warren,

USA

Photoshop

Version 6.0

Bildbearbeitung Adobe, San Jose, USA

Dampfgarer (Multi Gourmet FS

20)

Immunhistologie Braun AG, Kornberg,

Deutschland

Mikroskop Carl Zeiss NC 32

Varioskop

Mikroskop NC Varioskop

Superlux 301

Vorbereitung der

Implantate

OP-Mikroskop

Lichtquelle

Carl Zeiss, Jena,

Deutschland

CASIO CFX-9850GB PLUS-WE Statistik Casio Computer Co.,

LTD., Tokyo, Japan

Tischautoklav, CertoClav Sterilisierung,

Zellkultur

CertoClav Sterilizer

GmbH, Traun, Österreich

Sterilizer Schnell-

sterilisierung

FST Fine Science Tools,

Heidelberg, Deutschland

Wasserbad (Wasserbad GFL

1008)

Zellkultur GFL, Burgwedel,

Deutschland

Kern 440-33 Chemikalienwaage Gottl. Kern, Albstadt,

Deutschland

Prism® Version 4.03 Statistik GraphPad Software Inc.,

San Diego, USA

Sterilbank (Heraeus Hera Safe)

Zentrifuge (Megafuge 1 OR)

Zellkultur

Zellkultur

Kendro Laboratory

Products GmbH, Hanau,

Deutschland

Abzug Histologie/

Immunhistologie

Köttermann, Uetze-

Hennigsen, Deutschland

170 9 Anhang

Brutschrank (NAPCO Series 5400

Co2-Incubator)

Sterilbank Telstar AH-100

Kultivierung der

Gliomzellen

Vorbereitung der

Implantate

Labotect GmbH,

Göttingen, Deutschland

Inversmikroskop Leica DM IRB Beurteilung der

Gliomzellen

Leica, Bensheim,

Deutschland

Kühlschrank 4°C Zellkulturreagenzien Liebherr, Biberach an der

Riss, Deutschland

Kryostat Gefriermikrotom (Microm

HM 560 Cryo-Star)

Gefrierschnitte MICROM International

GmbH, Walldorf,

Deutschland

Gefriertruhe -80°C Einfrieren der

Gliomzellen

National Lab GmbH,

Mölln, Deutschland

Mikroskop Olympus BX51 Hellfeld

Digitalkamera (Color View Soft

Imaging System)

cell*f Imaging Software for Life

Sciences Microscopy

Auswertung

Bildaufnahme

Bildbearbeitung/

Messungen/

Partikeldetektion

Olympus, Hamburg,

Deutschland

Omnilab MR 3001 K Magnetrührer Omnilab, Bremen,

Deutschland

Kühlschrank 4 °C Chemikalien Robert Bosch GmbH,

Stuttgart, Deutschland

Messer Sec 35, Low Profile

Blades

Gefrierschnitte Richard-Allan Scientific,

Kalamazoo, USA

9 Anhang 171

Cell-Counter (CASY®, cell counter

and analysis system

Vitalzellzählung Schärfe System GmbH,

Reutlingen, Deutschland

Bohr- und Fräsgerät Minimot 40/E Kraniotomie Proxxon, Niersbach,

Deutschland

Gefrierschrank –20°C (Economic

no Frost)

Lagerung der

Gehirne/

Zellkulturalliquots

Robert Bosch GmbH,

Stuttgart, Deutschland

172 9 Anhang

9.2 Reagenzien

9.2.1 Färbungen

Alkoholreihe und Xylol

2 x 1 Min. 70% Ethanol



3 x 1 Min. 100% Xylol

HCl-EtOH für H.E. Färbung

100 ml Aqua dest.

100 ml Ethanol absol.

0,5 ml Salzsäure (30%ig)

Peroxidase Block für Immunhistologie

5333 µl Wasserstoffperoxid

400 ml PBS (0,1 M, DakoCytomation)

9.2.2 Perfusionsfixierung

PBS (Phosphatpuffer)

nach DAKO Handbuch, 0,1 M auf 1 Liter Aqua dest. (pH 7,2)

1,48 g NA2HPO4

0,43 g KH2PO4

7,20 g NaCl

9 Anhang 173

PFA (Paraformaldehydlösung)

1 L PBS (0,1 M)

40 g PFA

unter Rühren auf 60°C unter Abzug erhitzen, Klären mit NaOH, filtrieren, Lagerung

bei 4°C, Verwendung bis nächsten Tag

Sucroselösung

70 g PBS (0,1 M)

30 g Sucrose

9.2.3 Zellkultur

Kulturmedium

174 ml DMEM High Glucose

20 ml fetales Kälberserum

2 ml Natriumpyruvat

2 ml Penicillin Streptomycin

2 ml L-Glutamat

nach dem Auftauen im Wasserbad steril unter der Werkbank in autoklavierte

Glasflasche pipettieren, Lagerung bei 4°C, Verwendbar 1 Woche

Einfriermedium

180 ml DMEM High Glucose

20 ml fetales Kälberserum

nach dem Auftauen im Wasserbad steril unter der Werkbank in autoklavierte

Glasflasche pipettieren, sofort verwenden

174 9 Anhang

9.3 Färbeprotokolle

9.3.1 Färbeprotokoll Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Zeit Färbeschritt 30 Min. OT bei Raumtemperatur auftauen lassen

10 Min. Spülen in Leitungswasser

3 Min. Inkubation in Hämatoxylin

5 Min. Wässern in fließendem Leitungswasser zum Bläuen

1 Sek. Differenzieren in 0,15%HCl-EtOH

5 Min. Wässern in fließendem Leitungswasser zum Spülen

3 Min. Spülen in Aqua dest.

2 Min. Inkubation in Eosin

2 x 1 Min. Spülen in Aqua dest.

Alkoholreihe zum Entwässern

Xylol

Eindecken mit Entellan

9 Anhang 175

9.3.2 Färbeprotokoll Immunhistologie

Immunhistologie Endostatin/ vWF Host: Rabbit Dako K400811 PBS (Phosphate Buffered Saline) TRS (Target Retrieval Solution) 1L (900ml Aqua dest.+ 100ml TRS) PrimärAk Verdünnung in Antibody Diluent (anti human endostatin, bzw. anti-vWF)

SC (Shandon Clips) Zeit Vorgang

60 Min bei RT auftauen in schwarzen Schiffchen 3x5 Min Phosphatpuffer waschen (0,1 mol/L) 2x15 Min Peroxidase Block [5333,33µl H2O2 auf 400ml

Phosphatpuffer (0,1 mol/L)]

2x5 Min PBS Dako waschen 1x5 Min waschen TRS (Target Retrieval Solution) 30 Min Kochen mit TRS erhitzen auf >92°C, OT rein,

Zeit erst messen, wenn >94°C erreicht

20 Min In Puffer stehend abkühlen lassen, dann in kalten Puffer überführen

SC In Shandon Clips einklemmen mit TRS SC 30 Min Blocking Antibody Diluent SC 30 Min Primär AK verdünnt in Antibody Diluent,

bzw. negative Kontrolle 1:400

SC 2x5 Min waschen TRS 500µl SC 30 Min Polymer SC 2x5 Min waschen TRS 500µl SC 26 Min Chromogen

mit Aqua dest. Waschen (schnell Spritzflasche) 1 Min Hämatoxylin 2x in 5 Ammoniak (0,037 mol/L), tauchen 2x5 Min Aqua Dest. waschen Eindecken mit Faramount

OT Bemerkungen OT Bemerkungen OT Bemerkungen 1 14 27 2 15 28 3 16 29 4 17 30 5 18 31 6 19 32 7 20 33 8 21 34 9 22 35 10 23 36 11 24 37 12 25 38 13 26 39 40 Negativ Kontrolle

176 9 Anhang 9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung

OP-Protokoll BT4Ca Inokulation und CB Implantation

Projekt Tier Tag der Einstellung

KGW (g)

m / w OP-DatumTag 0

OP-Beginn OP-Dauer

Endostatin EN g w Min

Injektionen Uhrzeit

Vol./Med. ml Ket. ml Dom.

Nadel Nadel IA0 AP Bregma AP

LM LM DV DV

Bohrlochkoordinaten AP-1; LM-2,8 bis AP-1; LM3,4

Bregma Koordinaten Ergebnis

AP -1 LM –3,4

DV BT4Ca-Impl. -5/-4 Anzahl BT4Ca Flasche Inj. Volumen

verwendete Hamiltonkanüle: ga 19, spitz

OP-Datum Tag 1

OP-Beginn OP-Dauer

Min

Injektionen Uhrzeit

Vol./Med. ml Ket. ml Dom.

Bregma Koordinaten Ergebnis

AP -1 LM -2,8

DV CB-Impl. -6/-5 aufgezogen Restinhalt Implantiert 1.Impl. 2.Impl.

verwendete Hamiltonkanüle: ga 19, spitz Perfusionsdatum:__________________________

9 Anhang 177 Schneideprotokoll für 6000-10000 µm langen Tumor Datum:_________ Seite 1 Taktlänge 360µm Takt µm S OT Bez. Bemerkng

Takt µm S

OT Bez. Bemerkng

1 0-120 1 1 HE A 1+2 7 2880-3000 289 13 HE A 7+8 0-120 2 2880-3000 290 0-120 3 2 HE B 1+2 2880-3000 291 14 HE B 7+8 0-120 4 2880-3000 292 0-120 5 3 vWF A 1+2 2880-3000 293 15 vWF A 7+8 0-120 6 2880-3000 294 0-120 7 4 vWF B 1+2 2880-3000 295 16 vWF B 7+8 0-120 8 2880-3000 296 2 480-600 49 1 HE A 1+2 8 3360-3480 337 13 HE A 7+8 480-600 50 3360-3480 338 480-600 51 2 HE B 1+2 3360-3480 339 14 HE B 7+8 480-600 52 3360-3480 340 480-600 53 3 vWF A 1+2 3360-3480 341 15 vWF A 7+8 480-600 54 3360-3480 342 480-600 55 4 vWF B 1+2 3360-3480 343 16 vWF B 7+8 480-600 56 3360-3480 344 3 960-1080 97 5 HE A 3+4 9 3840-3960 385 17 HE A 9+10 960-1080 98 3840-3960 386 960-1080 99 6 HE B 3+4 3840-3960 387 18 HE B 9+10 960-1080 100 3840-3960 388 960-1080 101 7 vWF A 3+4 3840-3960 389 19 vWF A 9+10 960-1080 102 3840-3960 390 960-1080 103 8 vWF B 3+4 3840-3960 391 20 vWF B 9+10 960-1080 104 3840-3960 392 4 1440-1560 145 5 HE A 3+4 10 4320-4440 433 17 HE A 9+10 1440-1560 146 4320-4440 434 1440-1560 147 6 HE B 3+4 4320-4440 435 18 HE B 9+10 1440-1560 148 4320-4440 436 1440-1560 149 7 vWF A 3+4 4320-4440 437 19 vWF A 9+10 1440-1560 150 4320-4440 438 1440-1560 151 8 vWF B 3+4 4320-4440 439 20 vWF B 9+10 1440-1560 152 4320-4440 440 5 1920-2040 193 9 HE A 5+6 11 4800-4920 481 21 HE A 11+12 1920-2040 194 4800-4920 482 1920-2040 195 10 HE B 5+6 4800-4920 483 22 HE B 11+12 1920-2040 196 4800-4920 484 1920-2040 197 11 vWF A 5+6 4800-4920 485 23 vWF A 11+12 1920-2040 198 4800-4920 486 1920-2040 199 12 vWF B 5+6 4800-4920 487 24 vWF B 11+12 1920-2040 200 4800-4920 488 6 2400-2520 241 9 HE A 5+6 12 5280-5400 529 21 HE A 11+12 2400-2520 242 5280-5400 530 2400-2520 243 10 HE B 5+6 5280-5400 531 22 HE B 11+12 2400-2520 244 5280-5400 532 2400-2520 245 11 vWF A 5+6 5280-5400 533 23 vWF A 11+12 2400-2520 246 5280-5400 534 2400-2520 247 12 vWF B 5+6 5280-5400 535 24 vWF B 11+12 2400-2520 248 5280-5400 536

Endostatin: OT: Endo 2,2 + 1,6 bis Endo - 2,56 + - 3,14; jeweils 4 Schnitte/OT; 2 Lokalisationen/ OT, alles in doppelter

Ausführung

178 9 Anhang Seite 2 Ta kt µm S OT Bez. Bemerkng

Takt µm S OT Bez. Bemerkng

13 5760-5880 577 25 HE A 13+14 19 8640-8760 865 37 HE A 19+20 5760-5880 578 8640-8760 866 5760-5880 579 26 HE B 13+14 8640-8760 867 38 HE B 19+20 5760-5880 580 8640-8760 868 5760-5880 581 27 vWF A 13+14 8640-8760 869 39 vWF A 19+20 5760-5880 582 8640-8760 870 5760-5880 583 28 vWF B 13+14 8640-8760 871 40 vWF B 19+20 5760-5880 584 8640-8760 872






Zusätzliche OT:

Nr. Bez. was Nr. Bez. Was Nr. Bez. wasNr. Bez. was

9 Anhang 179

Zellzahlbestimmung

• Neubauerzählkammer und Deckglas mit 70%igem EtOH reinigen • Zellen je nach Pellet Größe mit bis zu 8ml Medium resuspendieren • 10µl Zellsuspension mit 10µl Trypanblau mischen: 10µl in Kammer geben • 4 Quadrate auszählen • Zellen auf dem linken und oberen Rand nicht mitzählen • Berechnung der Zellzahl

o Summe der Quadrate :2 (wenn mit Trypanblau) o Summe der Quadrate :4 (wenn ohne Trypanblau) o x 104 = Zellzahl pro ml o x Anzahl der ml in denen Zellen gelöst sind = Zellzahl gesamt

Datum: Flasche Trypan-

blau A B C D :2 (m.Tr.)

:4 (o.Tr.) = Zellzahl Kammer[x104]

x ml

Zellzahl/Flasche

pro 75cm2 Flaschen 6x105 Zellen einsetzen Volumen berechnen nach Formel: X ml= 5

5

10106×××

zyml

X= in Zellkulturflasche einzusetzen Y = Menge Medium, in dem das Pellet aufgenommen wurde Z = Anzahl der Zellen pro Flasche Flasche Menge in ml, die 6x105 Zellen

enthalten

180 9 Anhang 9.5 Statistik

9.5.1 Vaskularisierungsdichte

Statistik Vaskularisierung an der größten Tumoranschnittsfläche Parameter Value Fläche Gefäße Fo Table Analyzed Fläche Gefäße oben (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 19,29 R squared 0,6662 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 39,07 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 4065 3 1355 Residual (within columns) 2037 29 70,23 Total 6102 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -12,28 4,003 P < 0.05 -24.10 to -0.4558 Kontrolle vs ECB 17,07 5,846 P < 0.01 5.815 to 28.33 Kontrolle vs SCB -2,166 0,7064 P > 0.05 -13.99 to 9.654 LCB vs ECB 29,35 10,44 P < 0.001 18.51 to 40.18 LCB vs SCB 10,11 3,412 P > 0.05 -1.310 to 21.53 ECB vs SCB -19,24 6,844 P < 0.001 -30.07 to -8.403 Fläche Gefäße Fm Table Analyzed Fläche Gefäße mitte (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 31,12 R squared 0,763 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,13 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 9726 3 3242 Residual (within columns) 3021 29 104,2 Total 12750 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -26,6 7,123 P < 0.001 -41.00 to -12.21 Kontrolle vs ECB 18,97 5,334 P < 0.01 5.263 to 32.68 Kontrolle vs SCB -9,882 2,646 P > 0.05 -24.28 to 4.515 LCB vs ECB 45,58 13,31 P < 0.001 32.38 to 58.77 LCB vs SCB 16,72 4,634 P < 0.05 2.814 to 30.63 ECB vs SCB -28,85 8,428 P < 0.001 -42.05 to -15.66

9 Anhang 181

Statistik Vaskularisierung an der größten Tumoranschnittsfläche Fläche Gefäße Fu Table Analyzed Fläche Gefäße unten (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 14,8 R squared 0,6049 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 6,815 P value 0,078 P value summary ns Do the variances differ signif. (P < 0.05) No ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8441 3 2814 Residual (within columns) 5514 29 190,1 Total 13950 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -23,16 4,589 P < 0.05 -42.61 to -3.706 Kontrolle vs ECB 20,4 4,245 P < 0.05 1.878 to 38.92 Kontrolle vs SCB 1,603 0,3176 P > 0.05 -17.85 to 21.05 LCB vs ECB 43,55 9,417 P < 0.001 25.73 to 61.38 LCB vs SCB 24,76 5,079 P < 0.01 5.968 to 43.55 ECB vs SCB -18,8 4,064 P < 0.05 -36.62 to -0.9686 Summe Fläche Gefäße Fu/Fo/Fm Table Analyzed Summe Fläche Gefäße (größte Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 54,46 R squared 0,8493 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 9,144 P value 0,0274 P value summary * Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 2,102E+12 3 7,007E+11 Residual (within columns) 3,731E+11 29 12870000000 Total 2,475E+12 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -356900 8,598 P < 0.001 -516900 to -196900 Kontrolle vs ECB 324700 8,215 P < 0.001 172400 to 477100 Kontrolle vs SCB -60130 1,448 P > 0.05 -220100 to 99870 LCB vs ECB 681600 17,92 P < 0.001 535000 to 828300 LCB vs SCB 296800 7,401 P < 0.001 142200 to 451400 ECB vs SCB -384800 10,11 P < 0.001 -531500 to -238200

182 9 Anhang

Statistik Vaskularisierung an der Implantationslokalisation Parameter Value Fläche Gefäße Bo Table Analyzed Fläche Gefäße oben (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0004 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 8,169 R squared 0,458 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,82 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 3147 3 1049 Residual (within columns) 3724 29 128,4 Total 6871 32

Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff

Kontrolle vs LCB -5,549 1,338 P > 0.05 -21.53 to 10.43 Kontrolle vs ECB 16,48 4,174 P < 0.05 1.261 to 31.70 Kontrolle vs SCB -6,416 1,547 P > 0.05 -22.40 to 9.568 LCB vs ECB 22,03 5,796 P < 0.01 7.380 to 36.68 LCB vs SCB -0,8663 0,2162 P > 0.05 -16.31 to 14.58 ECB vs SCB -22,9 6,024 P < 0.01 -37.55 to -8.247 Fläche Gefäße Bm Table Analyzed Fläche Gefäße mitte (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 10,23 R squared 0,5143 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,48 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8279 3 2760 Residual (within columns) 7820 29 269,7 Total 16100 32

Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff

Kontrolle vs LCB -19,65 3,27 P > 0.05 -42.81 to 3.512 Kontrolle vs ECB 23,07 4,032 P < 0.05 1.016 to 45.13 Kontrolle vs SCB 6,639 1,105 P > 0.05 -16.52 to 29.80 LCB vs ECB 42,72 7,757 P < 0.001 21.49 to 63.95 LCB vs SCB 26,29 4,528 P < 0.05 3.913 to 48.67 ECB vs SCB -16,43 2,983 P > 0.05 -37.66 to 4.796

9 Anhang 183

Statistik Vaskularisierung an der Implantationslokalisation Fläche Gefäße Bu Table Analyzed Fläche Gefäße unten (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0002 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 8,964 R squared 0,4811 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 20,55 P value 0,0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8093 3 2698 Residual (within columns) 8728 29 301 Total 16820 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -24,14 3,803 P > 0.05 -48.61 to 0.3268 Kontrolle vs ECB 18,06 2,987 P > 0.05 -5.244 to 41.36 Kontrolle vs SCB 4,885 0,7694 P > 0.05 -19.59 to 29.36 LCB vs ECB 42,2 7,252 P < 0.001 19.77 to 64.63 LCB vs SCB 29,03 4,733 P < 0.05 5.388 to 52.67 ECB vs SCB -13,17 2,264 P > 0.05 -35.60 to 9.256 Summe Fläche Gefäße Bu/Bo/Bm Table Analyzed Summe Fläche Gefäße (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 24,55 R squared 0,7175 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 18,07 P value 0,0004 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 1,701E+12 3 5,669E+11 Residual (within columns) 6,697E+11 29 23090000000 Total 2,37E+12 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -283900 5,105 P < 0.01 -498200 to -69540 Kontrolle vs ECB 331400 6,259 P < 0.001 127300 to 535500 Kontrolle vs SCB 29390 0,5284 P > 0.05 -185000 to 243700 LCB vs ECB 615300 12,07 P < 0.001 418900 to 811800 LCB vs SCB 313300 5,831 P < 0.01 106200 to 520400 ECB vs SCB -302000 5,926 P < 0.01 -498500 to -105600

184 9 Anhang

Statistik Gefäßanzahl an der größten Tumoranschnittsfläche und an der Implantationslokalisation Summe Anzahl Gefäße Fu/Fo/Fm Table Analyzed Summe Anzahl Gefäße (größte Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value 0,0059 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 5,089 R squared 0,3449 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 18,42 P value 0,0004 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 445000000 3 148300000 Residual (within columns) 845300000 29 29150000 Total 1290000000 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB 663,6 0,3359 P > 0.05 -6952 to 8279 Kontrolle vs ECB 7705 4,096 P < 0.05 454.0 to 14960 Kontrolle vs SCB -1139 0,5764 P > 0.05 -8754 to 6477 LCB vs ECB 7042 3,889 P < 0.05 62.11 to 14020 LCB vs SCB -1803 0,9443 P > 0.05 -9160 to 5555 ECB vs SCB -8844 4,884 P < 0.01 -15820 to -1865 Summe Anzahl Gefäße Bu/Bo/Bm Table Analyzed Summe Anzahl Gefäße (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0043 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 5,442 R squared 0,3602 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 20,2 P value 0,0002 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 317800000 3 105900000 Residual (within columns) 564500000 29 19460000 Total 882200000 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB 2583 1,6 P > 0.05 -3640 to 8806 Kontrolle vs ECB 8214 5,343 P < 0.01 2288 to 14140 Kontrolle vs SCB 2677 1,658 P > 0.05 -3546 to 8900 LCB vs ECB 5631 3,805 P > 0.05 -72.83 to 11330 LCB vs SCB 94,25 0,0604 P > 0.05 -5918 to 6106 ECB vs SCB -5536 3,741 P > 0.05 -11240 to 167.1

9 Anhang 185 Erhobene Daten zu Blutgefäßflächen an der größten Tumoranschnittsfläche größte Anschnittsfläche Flächen

Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965,338 BT4Ca Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 12081757,4 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier Flächenanteil/Gruppe µm² µm² µm² µm² % %

102 77421,48 114298,69 112625,27 304345,44 17,63334587 106 147848,82 148065,10 196922,87 492836,79 28,55426906 122 77121,38 123141,51 107271,48 307534,38 17,81810865 123 108146,11 73448,77 135063,92 316658,80 18,3467649 80 168818,31 120441,67 124782,34 414042,32 23,9890289 83 131843,07 228027,13 340204,21 700074,41 40,56132496 93 97784,54 117856,17 159911,68 375552,38 21,75897572

7 808983,71 925279,05 1176781,76 2911044,52 168,66 24,09 MW 115569,10 132182,72 168111,68 415863,50 24,09454544 STBW 35230,57302 47666,83218 81917,6638 142794,7709 8,273327844 CB039 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 13807722,7 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %

100 265204,55 313339,35 205388,02 783931,92 45,41991103 101 175531,32 321763,01 425314,13 922608,46 53,45463406 111 233132,14 293922,94 390344,44 917399,52 53,15283565 115 144554,22 244348,11 288222,36 677124,69 39,23165042 116 127161,27 456872,59 238819,20 822853,05 47,67494665 79 82683,36 271633,18 465337,86 819654,40 47,48962124 88 115513,07 232235,31 202124,64 549873,02 31,85886793 94 345838,90 147870,43 195186,90 688896,24 39,91367736


108 15722,18 12716,69 28826,48 57265,35 3,3178737 112 14262,61 26107,45 32203,50 72573,56 4,204810075 118 22104,34 20879,33 37654,04 80637,70 4,672035008 119 23928,16 14540,86 66021,82 104490,84 6,054052056 121 13089,39 30169,87 45144,00 88403,25 5,12195978 124 8854,50 19776,73 42888,87 71520,10 4,143773924 82 12022,17 38354,58 156865,85 207242,59 12,0073439 85 25862,49 32283,84 31837,05 89983,39 5,213510656 98 13635,14 10328,05 6046,00 30009,18 1,738689726

103 24133,93 25146,47 60208,18 109488,57 6,343613769 10 173614,90 230303,87 507695,78 911614,55 52,82 5,28

MW 17361,49 23030,39 50769,58 91161,45 5,281766259 STBW 6046,605816 9069,990392 40863,927 46818,7644 2,712613247 CB037 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 13807722,7 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %

110 96244,75 167045,81 187617,18 450907,74 26,12495928 114 147800,50 160226,46 78950,87 386977,82 22,42094971 117 164554,75 116413,71 83672,20 364640,66 21,12676629 120 124284,33 235451,54 119804,83 479540,70 27,78391261 84 113954,55 307269,77 223039,33 644263,65 37,32772843 96 96326,59 162186,57 156269,35 414782,51 24,03191428 97 154673,38 240481,87 307640,62 702795,86 40,71900224

105 126521,08 123183,48 114323,20 364027,75 21,09125511

8 1024359,92 1512259,20 1271317,59 3807936,71 220,63 27,58 MW 128044,99 189032,40 158914,70 475992,09 27,57831099 STBW 25814,25807 65927,78131 78043,7864 129285,0641 7,490594465

186 9 Anhang Erhobene Daten zu Gefäßflächen an der Implantationslokalisation Bregma -1 Flächen

Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965,34 BT4Ca Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 12081757,37 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier Flächenanteil/Gruppe µm² µm² µm² µm² % %

102 166031,54 91979,91 232107,81 490119,26 28,3968195 106 213995,14 226572,99 227852,92 668421,05 38,72737383 93 144984,71 140568,44 106444,36 391997,52 22,71178399

122 64811,37 136361,99 78827,99 280001,35 16,22288369 123 76984,28 96654,43 188939,30 362578,01 21,00725924 80 88064,77 57424,18 246192,40 391681,35 22,69346578 83 87710,11 433754,32 89955,99 611420,42 35,42483786


100 177767,484 248111,12 216757,51 642636,12 37,23343128 101 67508,32 477084,78 436567,45 981160,55 56,84705987 111 97762,92 406723,80 479952,94 984439,66 57,03704686 115 103025,61 211225,59 327890,27 642141,47 37,20477203 116 89907,44 404866,00 549667,02 1044440,45 60,51340826 79 187568,86 80430,32 59807,74 327806,92 18,99267111 88 90838,83 295894,73 240018,20 626751,76 36,31311378 94 404077,37 132458,99 138003,63 674539,99 39,08189654


108 27219,75 27746,43 33793,69 88759,88 5,142622188 112 22345,36 51811,46 58234,89 132391,71 7,670589108 118 18583,62 51733,77 65070,08 135387,48 7,844160033 119 28497,02 20417,27 88419,43 137333,72 7,95692253 121 55331,82 57414,94 64586,30 177333,06 10,27442759 124 14439,60 10599,71 49048,73 74088,04 4,292556657 82 25757,99 47590,44 33542,03 106890,46 6,193082936 85 16968,58 16007,83 44911,18 77887,58 4,512696698 98 23795,45 25929,89 62032,23 111757,57 6,475076247

103 22726,04 53801,40 133310,27 209837,70 12,15770059 10 255665,24 363053,13 632948,84 1251667,21 72,52 7,25

MW 25566,52 36305,31 63294,88 125166,72 7,251983457 STBW 11379,3467 17837,72813 29555,74684 43306,1908 2,509099684 CB037 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 13807722,71 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %

110 131982,25 219295,17 220478,56 571755,98 33,12673604 114 230503,63 100279,53 81732,90 412516,06 23,90059915 117 145620,16 146249,37 85762,25 377631,79 21,87945397 120 130616,32 69844,94 126370,57 326831,83 18,936176 84 136184,78 70547,79 73423,80 280156,37 16,2318653 96 124165,73 116297,30 164310,03 404773,05 23,45198043 97 245226,56 146249,03 278877,49 670353,07 38,83931251

105 114112,92 177981,81 81618,11 373712,84 21,65239521

8 1258412,35 1046744,94 1112573,70 3417730,99 198,02 24,75 MW 157301,54 130843,12 139071,71 427216,37 24,75231483 STBW 50692,5353 52129,6914 76261,97684 129698,504 7,514548609

9 Anhang 187

Erhobene Daten zur Partikelanzahl an Bregma -1 mm, Seite 1

Dichte Bregma -1 Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965BT4Ca Summe Flächen ROIs [µm²] 12081757,37 oben mitte unten oben mitte unten

Tier

Dichte Partikel alle Klassen



Anzahl Partikel Gesamt



Summe Partikel Dichte/Tier

Dichte/ Gruppe

1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 102 0,00983276 0,00229089 0,00094382 5657 1318 543 7518 0,00435582 106 0,01506461 0,01271289 0,01000000 8667 7314 5754 21735 0,01259295

93 0,00678055 0,00271674 0,00189807 3901 1563 1092 6556 0,00379845 122 0,00391259 0,00143919 0,00127407 2251 828 733 3812 0,00220862 123 0,01765447 0,00124974 0,01907280 10157 719 10973 21849 0,012659

80 0,00333900 0,01186640 0,00725159 1921 6827 4172 12920 0,00748567 83 0,00169992 0,00735415 0,00346241 978 4231 1992 7201 0,00417216

7 0,00832627 0,00566143 0,00627182 33532 22800 25259 81591 0,00675324 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,006128366 0,004973464 0,006571556 MW 11656 0,00675324 STBW 7434 0,00430718 CB039 Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71 oben mitte unten oben mitte unten

Tier








Dichte/ Gruppe

1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 100 0,00328686 0,00453485 0,00498330 1891 2609 2867 7367 0,00426834 101 0,00405686 0,00753144 0,00879508 2334 4333 5060 11727 0,00679446 111 0,00313737 0,00708821 0,00549084 1805 4078 3159 9042 0,00523881 115 0,00731243 0,00617741 0,00639294 4207 3554 3678 11439 0,0066276 116 0,00931131 0,00694220 0,00562120 5357 3994 3234 12585 0,00729157

79 0,00605574 0,00155913 0,00173121 3484 897 996 5377 0,00311536 88 0,00285927 0,00514147 0,00394214 1645 2958 2268 6871 0,00398096 94 0,00839530 0,00369011 0,00212229 4830 2123 1221 8174 0,0047359

8 0,00555189 0,00533310 0,00488488 25553 24546 22483 72582 0,00525662 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,002563959 0,002029475 0,002297492 MW 9072,8 0,00525662 STBW 2596,8 0,00150457

188 9 Anhang

Erhobene Daten zur Partikelanzahl an Bregma -1 mm, Seite 2

CB038 Summe Flächen ROIs [µm²] 17259653,38 oben mitte unten oben mitte unten

Tier








Dichte/

Gruppe 1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm²

108 0,00187026 0,00174685 0,00180942 1076 1005 1041 3122 0,00180884 112 0,00209274 0,00299658 0,00282277 1204 1724 1624 4552 0,00263736 118 0,00059966 0,00134533 0,00173990 345 774 1001 2120 0,0012283 119 0,00118716 0,00111416 0,00159563 683 641 918 2242 0,00129898 121 0,00002002 0,00025391 0,00205624 72 913 1183 2168 0,00125611 124 0,00091775 0,00204234 0,00231175 528 1175 1330 3033 0,00175728

82 0,00175380 0,00247340 0,00153827 1009 1423 885 3317 0,00192182 85 0,00111764 0,00197629 0,00206841 643 1137 1190 2970 0,00172078 98 0,00147396 0,00165125 0,00755403 848 950 4346 6144 0,00355975

103 0,00207710 0,00180421 0,00438016 1195 1038 2520 4753 0,00275382 10 0,00131101 0,00174043 0,00278766 7603 10780 16038 34421 0,0019943

MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,000676052 0,000747742 0,001872938 MW 3442,1 0,0019943 STBW 1315,3 0,00076207 CB037

Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71 oben mitte unten oben mitte unten

Tier








Dichte/


110 0,00421677 0,00513452 0,00779042 2426 2954 4482 9862 0,0057139 114 0,00577416 0,00293922 0,00333726 3322 1691 1920 6933 0,00401688 117 0,00302787 0,00210839 0,00155391 1742 1213 894 3849 0,00223006 120 0,00573592 0,00160258 0,00229263 3300 922 1319 5541 0,00321038

84 0,00471736 0,00320864 0,00648333 2714 1846 3730 8290 0,00480311 96 0,00370401 0,00342591 0,00590452 2131 1971 3397 7499 0,00434481 97 0,00597752 0,00316866 0,00780433 3439 1823 4490 9752 0,00565017

105 0,01217579 0,01290234 0,00986231 7005 7423 5674 20102 0,01164682

8 0,00566618 0,00431128 0,00562859 26079 19843 25906 71828 0,00520202 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,002836002 0,003622582 0,002954905 MW 8978,5 0,00520202 STBW 4929,3 0,00285597

9 Anhang 189

Erhobene Daten zur Partikelanzahl an der größten Tumoranschnittsfläche, Seite 1

Dichte größte Fläche Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965BT4Ca Summe Flächen ROIs [µm²] 12081757,37 oben mitte unten oben mitte unten

Tier








Dichte/


102 0,00358582 0,00565597 0,00242125 2063 3254 1393 6710 0,00388768 106 0,00782345 0,00916009 0,01349506 4501 5270 7764 17535 0,01015953

93 0,00254466 0,00196759 0,00189285 1464 1132 1089 3685 0,00213504 122 0,00120454 0,00088820 0,00219529 693 511 1263 2467 0,00142935 123 0,01169259 0,00934781 0,00194500 6727 5378 1119 13224 0,0076618

80 0,01873213 0,00623999 0,02344601 10777 3590 13489 27856 0,01613937 83 0,00166863 0,00139748 0,00717512 960 804 4128 5892 0,00341374

7 0,00675026 0,00495102 0,00751008 27185 19939 30245 77369 0,00640379 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,006499001 0,003587976 0,00823157 MW 11053 0,00640379 STBW 9152,2 0,00530265 CB039 Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71

oben mitte unten oben mitte unten

Tier








Dichte/


100 0,00710733 0,00595840 0,00671277 4089 3428 3862 11379 0,00659283 101 0,00668669 0,00994748 0,01266074 3847 5723 7284 16854 0,00976497 111 0,00568204 0,00400124 0,00618784 3269 2302 3560 9131 0,00529037 115 0,00376137 0,00820584 0,00922093 2164 4721 5305 12190 0,00706271 116 0,00390912 0,00776957 0,00694568 2249 4470 3996 10715 0,00620812

79 0,00446880 0,00832925 0,00061531 2571 4792 354 7717 0,00447112 88 0,00033957 0,00568899 0,00045915 1221 3273 1651 6145 0,00356033 94 0,00647290 0,00170339 0,00743584 3724 980 4278 8982 0,00520404

8 0,00480348 0,00645052 0,00627978 23134 29689 30290 83113 0,00601931 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,002214802 0,002670892 0,004093702 MW 10389 0,00601931 STBW 3269,8 0,00189446

190 9 Anhang

Erhobene Daten zur Partikelanzahl an der größten Tumoranschnittsfläche, Seite 2

CB038 Summe Flächen ROIs [µm²] 17259653,38 oben mitte unten oben mitte unten

Tier








Dichte/ Gruppe

1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 108 0,00146874 0,00077000 0,00139574 845 443 803 2091 0,0012115 112 0,00164604 0,00265591 0,00359277 947 1528 2067 4542 0,00263157 118 0,00161301 0,00074046 0,00191197 928 426 1100 2454 0,00142181 119 0,00192762 0,00121671 0,00179726 1109 700 1034 2843 0,00164719 121 0,00071960 0,00123409 0,00184592 414 710 1062 2186 0,00126654 124 0,00084474 0,00089341 0,00329033 486 514 1893 2893 0,00167616

82 0,00096120 0,00267502 0,00584195 553 1539 3361 5453 0,00315939 85 0,00464088 0,00496939 0,00274455 2670 2859 1579 7108 0,00411828 98 0,00087429 0,00127233 0,00031461 503 732 181 1416 0,00082041

103 0,00146005 0,00144093 0,00142181 840 829 818 2487 0,00144093 10 0,00161562 0,00178683 0,00241569 9295 10280 13898 33473 0,00193938

MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,001138771 0,001317187 0,001542054 MW 3347,3 0,00193938 STBW 1784,5 0,00103391 CB037 Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71

oben mitte unten oben mitte unten

Tier








Dichte/ Gruppe

1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 110 0,00575852 0,00764268 0,00650940 3313 4397 3745 11455 0,00663687 114 0,00658240 0,00175373 0,00520404 3787 6306 2994 13087 0,00758242 117 0,00310261 0,00138010 0,00177292 1785 794 1020 3599 0,00208521 120 0,00265417 0,00058486 0,00284536 1527 2103 1637 5267 0,00305163

84 0,00682401 0,00983450 0,00977192 3926 5658 5622 15206 0,00881014 96 0,00714904 0,00785647 0,00841268 4113 4520 4840 13473 0,00780607 97 0,00755056 0,00620696 0,00887677 4344 3571 5107 13022 0,00754476

105 0,00685008 0,01235830 0,01976807 3941 7110 11373 22424 0,01299215

8 0,00580892 0,00595220 0,00789515 26736 34459 36338 97533 0,00706366 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,001883046 0,00430944 0,005578841 MW 12192 0,00706366 STBW 5846,2 0,00338721

9 Anhang 191

9.5.2 Tumorgrößen

Statistik der Tumorvolumina Parameter Value Table Analyzed Data 1 One-way analysis of variance P value 0,0209 P value summary * Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 3,784 R squared 0,2813 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 0,2622 P value 0,967 P value summary ns Do the variances differ signif. (P < 0.05) No ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 2,029E+22 3 6,762E+21 Residual (within columns) 5,183E+22 29 1,787E+21 Total 7,211E+22 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value Kontrolle vs SCB 22490000000 1,454 P > 0.05 Kontrolle vs ECB -10960000000 0,7439 P > 0.05 Kontrolle vs LCB -47320000000 3,059 P > 0.05 SCB vs ECB -33450000000 2,359 P > 0.05 SCB vs LCB -69820000000 4,671 P < 0.05 ECB vs LCB -36360000000 2,565 P > 0.05 95% CI of diff Kontrolle vs SCB -37140000000 to 82120000000 Kontrolle vs ECB -67740000000 to 45820000000 Kontrolle vs LCB -107000000000 to 12310000000 SCB vs ECB -88100000000 to 21200000000 SCB vs LCB -127400000000 to -12210000000 ECB vs LCB -91020000000 to 18290000000

192 9 Anhang Summen der gemessene Anschnittsflächen

Tumorflächen Endostatinbeads und Stammzellbeads gegenüber Leerbeads und Kontrolle Kontrollgruppe CB037/ SCB Tier Vol Takt Tier Vol Takt EN80 8,1335E+10 480 EN84 2,2939E+10 360 EN83 1,6803E+11 600 EN96 5,4875E+10 480 EN93 6,4975E+10 480 EN97 1,0536E+11 480 EN102 3,0934E+10 480 EN105 5,4586E+10 360 EN106 4,7249E+10 480 EN110 1,3476E+11 600 EN122 9,407E+10 480 EN114 3442419538 120 EN123 1,206E+11 480 EN117 8,8809E+10 480 EN120 4,9209E+10 480 Mittelwert µm³ 8,6742E+10 6,4249E+10 Mittelwert mm³ 86,742235 64,2485135 STBW µm³ 4,6521E+10 4,3223E+10 STBW mm³ 46,5213758 43,2227401 CB038/ ECB CB039/ LCB Tier Vol Takt Tier Vol Takt EN82 1,0143E+11 720 EN79 9,762E+10 540 EN85 1,2343E+11 600 EN88 9,669E+10 600 EN98 1,2912E+11 600 EN94 1,471E+11 480 EN103 9,884E+10 480 EN100 8,0734E+10 480 EN108 5,0943E+10 480 EN101 1,5007E+11 600 EN112 1,0706E+10 360 EN111 1,7994E+11 600 EN118 1,4567E+11 600 EN115 1,4243E+11 600 EN119 1,0633E+11 480 EN116 1,7793E+11 600 EN121 7,5597E+10 480 EN124 1,3495E+11 600 Mittelwert µm³ 9,7702E+10 1,3406E+11 Mittelwert mm³ 97,7015568 134,064787 STBW µm³ 4,1727E+10 3,7974E+10 STBW mm³ 41,7269779 37,9737898 Verwendete Formeln Äquivalentradius r = √ A⁄π Kegelstumpf V = 1⁄3* (r1² + r1*r2 + r2²) Kegel 1⁄3* G* h r1= Radius 1= Radius der ersten Fläche r2= Radius 2= Radius der zweiten Fläche G= Grundfläche bei nur einer Fläche h= Höhe= Takt zwischen den Schnitten Tumorvolumina wurden berechnet als Summe der Kegelstümpfe zwischen zwei ausgemessenen Tumorflächen addiert mit als Kegel berechneten Ausgleichswerten bei Tumorüberständen vor oder nach dem letzten auswertbaren Schnitt.

9 Anhang 193

9.5.3 Korrelationen zwischen Vaskularisierung und Tumorvolumina

Statistik zur Bestimmung der Korrelationen Seite 1 Gefäßfläche Y Intercept Gruppe I BT4Ca Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.000002015 ± 0.0000006729 Y-intercept when X=0.0 261500 ± 65170 X-intercept when Y=0.0 -1,298E+11 1/slope 49640095% Confidence Intervals Slope 0.0000005484 to 0.000003481 Y-intercept when X=0.0 119500 to 403500 X-intercept when Y=0.0 -711800000000 to -35480000000 Goodness of Fit r² 0,4276 Sy.x 108400Is slope significantly non-zero? F 8,964 DFn, DFd 1.000, 12.00 P value 0,0112 Deviation from zero? Significant Data Number of X values 14 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 14 Number of missing values 0Gruppe II LCB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.000002254 ± 0.000001048 Y-intercept when X=0.0 611800 ± 79540 X-intercept when Y=0.0 -2,714E+11 1/slope 44360095% Confidence Intervals Slope 0.000000007024 to 0.000004502 Y-intercept when X=0.0 441200 to 782400

X-intercept when Y=0.0 -107700000000000 to -101400000000

Goodness of Fit r² 0,2485 Sy.x 169400Is slope significantly non-zero? F 4,63 DFn, DFd 1.000, 14.00 P value 0,0494 Deviation from zero? Significant Data Number of X values 16 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 16 Number of missing values 0

194 9 Anhang

Statistik zur Bestimmung der Korrelationen Seite 2 Gefäßfläche Y Intercept Gruppe III ECB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.0000004169 ± 0.0000002559 Y-intercept when X=0.0 67430 ± 26980 X-intercept when Y=0.0 -1,618E+11 1/slope 239900095% Confidence Intervals Slope -0.0000001208 to 0.0000009545 Y-intercept when X=0.0 10760 to 124100 X-intercept when Y=0.0 Goodness of Fit r² 0,1285 Sy.x 45300Is slope significantly non-zero? F 2,654 DFn, DFd 1.000, 18.00 P value 0,1207 Deviation from zero? Not Significant Data Number of X values 20 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 20 Number of missing values 0Gruppe IV SCB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope -0.0000002097 ± 0.0000009280 Y-intercept when X=0.0 479700 ± 128700 X-intercept when Y=0.0 2,287E+12 1/slope -476800095% Confidence Intervals Slope -0.000002200 to 0.000001781 Y-intercept when X=0.0 203700 to 755800 X-intercept when Y=0.0 Goodness of Fit r² 0,003635 Sy.x 131900Is slope significantly non-zero? F 0,05108 DFn, DFd 1.000, 14.00 P value 0,8245 Deviation from zero? Not Significant Data Number of X values 16 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 16 Number of missing values 0

9 Anhang 195

9.6 Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. T. Brinker herzlichen Dank für die wissenschaftliche Betreuung,

vielmehr aber noch für das immer wieder Mutmachen und für viele gute Tipps. Herrn

Univ. Prof. Dr. vet. med. I. Nolte danke ich für die Übernahme der Betreuung und für

die Gelegenheit anderthalb Jahre lang in der Onkologiesprechstunde lernen zu

dürfen. Herrn Prof. Dr. med. Dr. hc mult Dr. M. Samii danke ich für die Bereitstellung

der Forschungseinrichtungen des INI Hannover und für tolle Feste. Frau PD Dr. med.

P. Klinge vielen Dank für die nette und hilfreiche Beratung in immunhistologischen

Dingen. Der Internationalen Stiftung Neurobionik Hannover und dem

Bundesministerium für Bildung und Forschung danke ich für die finanzielle

Projektunterstützung. Bei der Firma CellMed AG bedanke ich mich für die

Bereitstellung der Implantate und vor allem bei Frau Dr. Christine Wallrapp für die

geduldige und immer freundliche Unterstützung und Hilfe.

Ganz herzlichen Dank an all die, die diese Arbeit möglich gemacht haben und

geholfen haben, wo sie konnten. Allen voran das ganze Laborteam: Steffen Baltes

für Rat und Tat; Christiane Bartling und Jana Unger für viele bunte Schnitte und noch

vieles mehr; Ina Freund, Caro Mallig, Pia Rittmann und allen anderen für eine

wirklich gute Zeit, für Trost, für Kaffee, fürs Zuhören und für Hilfe überall.

Vielen Dank auch an all meine fleißigen Korrekturleser und Übersetzungshelfer.

Ein besonderer Dank geht an meine ganze WG, die mir ohne ein Wort darüber zu

verlieren immer wieder wochenlang den Rücken frei gehalten und ein schönes

Zuhause gegeben hat. Ihr seid die Größten.

Den Engeln und Allen die dazu gehören, danke ich dafür, dass sie mir die Familie

sind, die sie sind und für ihr Verständnis.

Ich danke meinen Freunden, denn ganz sicher ist: Ohne Eure Unterstützung wäre

ich da so nicht durchmarschiert: Nicole Hartmann, Juliane Körte, Enrico Schulz, Anna

Heile, Doro Kollmann, Peter Krause, Mario Kollmann und allen anderen. Es ist

schön, sich auf Menschen verlassen zu können.

Liebe Mama, lieber Papa, liebe Vera, liebe Oma: Euch Danke für einfach alles. ILE.

Christian, ich danke dir von ganzem Herzen.

Untersuchung von Endostatin freisetzenden ... · Aus der Klinik für kleine Haustiere der...

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