Veterinär-Physiologisch-Chemischen Institut der ... · 2.5 Bedeutung von Megalin im...

Aus dem

Veterinär-Physiologisch-Chemischen Institut

der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

und dem

Institut für Ernährungswissenschaft

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Potsdam

Einfluss einer unterschiedlichen Vitamin-A-Versorgung mit dem Futter auf die Verteilung

und Speicherung von Vitamin A und dessen Bindungsproteinen in verschiedenen Geweben

von Ratten und Frettchen

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)

durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von

Claudia Liliana Gómez Hernández

aus Bucaramanga, Kolumbien

Leipzig, 2005

Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Dekan: Prof. Dr. Fehlhaber Karsten

Betreuer: Prof. Dr. Florian J. Schweigert

Betreuer: Prof. Dr. Herbert Fuhrmann

Gutachter: Prof. Dr. Dr. h.c. Hans-Peter Sallmann,

Institut für Physiologische Chemie

Tierärztliche Hochschule, Hannover

Gutachter: Prof. Dr. Johannes Seeger

Veterinär-Anatomisches Institut

Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig

Tag der Verteidigung: 12. Mai 2005

Meiner Familie

Inhalt

1 EINLEITUNG ...................................................................................................................1

2 LITERATURÜBERSICHT..............................................................................................3

2.1 Vitamin A: Bedeutung und chemische Struktur..........................................................3

2.2 Vitamin-A-Stoffwechsel .............................................................................................4

2.2.1 Vitamin-A-Quellen..............................................................................................4

2.2.2 Absorption und Metabolismus von Vitamin A im Gastrointestinaltrakt ............5

2.2.3 Transport und Speicherung von Vitamin A in der Leber....................................7

2.2.4 Vitamin-A-Transport im Blutplasma ..................................................................8

2.2.5 Aufnahme von Vitamin A in die Zielzellen ......................................................11

2.3 Bedeutung der Leber im Vitamin-A-Stoffwechsel ...................................................16

2.3.1 Ito-Zellen ...........................................................................................................17

2.4 Bedeutung der Nieren im Vitamin-A-Stoffwechsel ..................................................24

2.5 Bedeutung von Megalin im Vitamin-A-Stoffwechsel...............................................26

2.6 Vitamin-A-Ausscheidung im Harn ...........................................................................27

2.6.1 Vitamin-A-Ausscheidung im Harn von Fleischfressern ...................................27

2.6.2 Tamm-Horsfall-Protein als Vitamin-A-Trägerprotein im Harn von Hunden ...28

3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ....................................................................30

3.1 Versuchstiere .............................................................................................................30

3.2 Haltung und Fütterung...............................................................................................30

3.2.1 Ratten.................................................................................................................30

3.2.2 Frettchen............................................................................................................31

3.3 Präparation und Konservierung der Proben ..............................................................33

3.4 Retinol- und Retinylester-Bestimmung in Blutserum, Harn und verschiedenen

Geweben....................................................................................................................34

3.4.1 Extraktionsverfahren .........................................................................................34

3.4.2 Umkehrphasen-HPLC-Analyse.........................................................................35

3.4.3 Standards und Chemikalien...............................................................................35

3.5 Bestimmung von Protein, Triglyceriden und Cholesterol im Blutplasma ................35

3.6 Lipoproteintrennung mittels selbstaufbauendem Gradienten ...................................36

3.7 Protein- und Kreatininbestimmungen im Harn .........................................................37

3.8 Untersuchungen zum Retinol-Bindungsprotein und Tamm-Horsfall-Protein ..........37

3.8.1 Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ............................37

3.8.2 Immunologischer Nachweis von Retinol-Bindungsprotein und

Tamm-Horsfall-Protein im Western-Blot .........................................................38

3.9 Immunhistologische Untersuchungen .......................................................................39

3.9.1 Herstellung von Paraffinschnitten .....................................................................39

3.9.2 Seren und Antikörper ........................................................................................39

3.10 Auswertung und statistische Bearbeitung .................................................................43

4 ERGEBNISSE .................................................................................................................44

4.1 Vitamin A im Blutserum von Ratten und Frettchen..................................................44

4.1.1 Vitamin-A-Gehalt im Serum von Ratten...........................................................44

4.1.2 Vitamin-A-Gehalt im Blutserum von Frettchen................................................45

4.2 Vitamin-A-Gehalt in Leber und Nieren von Ratten und Frettchen...........................45

4.2.1 Vitamin-A-Gehalt in der Leber von Ratten und Frettchen ...............................45

4.2.2 Vitamin-A-Gehalt in den Nieren von Ratten und Frettchen .............................45

4.3 Vitamin-A-Verteilung auf die Lipoproteine .............................................................47

4.3.1 Vitamin-A-Verteilung auf die Lipoproteine von Ratten ...................................47

4.3.2 Verteilung des Vitamin A auf die Lipoproteine von Frettchen.........................47

4.4 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentration im Blutserum und in den

Lipoprotein-Fraktionen von Ratten und Frettchen....................................................48

4.4.1 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentration im Blutserum und in den

Lipoprotein-Fraktionen von Ratten...................................................................48

4.4.2 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentrationen im Blutserum und in

den Lipoprotein-Fraktionen von Frettchen .......................................................50

4.5 Retinol-Bindungsprotein im Blutserum und Harn von Ratten und Frettchen...........51

4.5.1 Retinol-Bindungsprotein im Blutserum und Harn von Ratten..........................51

4.5.2 Retinol-Bindungsprotein im Blutserum und Harn von Frettchen .....................52

4.6 Vitamin A und Tamm-Horsfall-Protein im Harn von Frettchen...............................52

4.7 Immunhistologischer Nachweis von Retinol-Bindungsprotein, Megalin und Tamm-

Horsfall-Protein in Leber und Niere von Ratten und Frettchen ................................54

4.7.1 Immunhistologischer Nachweis von Retinol-Bindungsprotein in Leber und

Niere von Ratten und Frettchen ........................................................................54

4.7.2 Immunhistologischer Nachweis von Megalin in Leber und Nieren von Ratten

und Frettchen.....................................................................................................55

4.7.3 Immunhistologischer Nachweis von Tamm-Horsfall-Protein in Leber und

Nieren von Ratten und Frettchen. .....................................................................55

4.8 Immunhistologischer Nachweis der Intermediärfilamente Desmin, Glattmuskulatur-

α-Actin und Vimentin in Leber und Nieren von Ratten und Frettchen ...................56

4.8.1 Immunhistologischer Nachweis von Desmin in Leber und Nieren von Ratten

und Frettchen.....................................................................................................56

4.8.2 Immunhistologischer Nachweis von Glattmuskulatur-α-Actin in Leber und

Nieren von Ratten und Frettchen ......................................................................57

4.8.3 Immunhistologischer Nachweis von Vimentin in Leber und Nieren von Ratten

und Frettchen.....................................................................................................58

5 DISKUSSION ..................................................................................................................60

5.1 Ziel der Arbeit ...........................................................................................................60

5.2 Vitamin-A-Konzentration im Blutserum...................................................................60

5.3 Vitamin-A-Gehalt in der Leber und Niere ................................................................61

5.4 RBP im Blut und Harn ..............................................................................................63

5.5 Vitamin-A-Konzentration in Lipoproteinen..............................................................64

5.6 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentration im Blut und in den

Lipoproteinen ............................................................................................................65

5.7 Vitamin A und Tamm-Horsfall-Protein im Harn ......................................................66

5.8 Immunhistologische Untersuchungen zum Nachweis von RBP, Megalin und

Tamm-Horsfall-Protein .............................................................................................67

5.9 Nachweis der Intermediärfilamente zur Charakterisierung von Ito-Zellen ..............70

6 SCHLUSSFOLGERUNG ...............................................................................................75

7 ZUSAMMENFASSUNG.................................................................................................78

8 SUMMARY......................................................................................................................80

9 LITERATURVERZEICHNIS .......................................................................................82

10 ANHANG .....................................................................................................................98

10.1 Histologische Ergebnisse ..........................................................................................98

Verzeichnis der Abkürzungen und verwendeten Symbole

A. Arteria Abb. Abbildung ADH Alkohol-Dehydrogenase ARAT Acyl CoA: Retinol-Acyltransferase bzw. beziehungsweise BHT Butylhydroxytoluol BSA Bovines Serumalbumin ca. (lat.: circa) ungefähr CRBP (engl.: cellular retinol-binding protein) zelluläres Retinol-Bindungsprotein CRABP (engl.: cellular retinoic acid-binding protein) zelluläres Retinsäure-Bindungsprotein CRALBP (engl.: cellular retinal-binding protein) zelluläres Retinal-Bindungsprotein DAB Diaminobenzidintetrahydrochlorid d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA engl.: enzyme-linked immuno sorbent assay et al. (lat.: et alii) und andere g Gramm GFAP (engl.: glial fibrillary acidic protein) Saures Fibrilläres Glialprotein HDL (engl.: high density lipoprotein) Lipoprotein hoher Dichte IE Internationale Einheit IF Intermediärfilamente IGF-1 (engl.: insulin-like growth factor) Insulinartiger Wachstumsfaktor-1 ILBPs (engl.: intracellular lipid-binding-proteins) intrazelluläre Lipid-Bindungsproteine IUPAC Internationale chemische Nomenklatur kDa Kilodalton LDL (engl.: low density lipoprotein) Lipoprotein niedriger Dichte LRAT Lecithin: Retinol-Acyltransferase α- SMA Glattmuskulatur-α-Actin mM millimolar mRNA Boten-Ribonukleinsäure min Minute n Anzahl n.d. (engl.: not detectable) unter der Nachweisgrenze PAG Polyacrylamid-Gel PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PAP Peroxidase-anti-Peroxidase PDGF (engl.: platelet-derived growth factor) Blutplättchen-Wachstumsfaktor pH pH-Wert RAR (engl.: retinoic acid receptor) Retinsäure-Rezeptor RBP Retinol-Bindungsprotein rp-HPLC Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeits-Chomatographie RXR (engl.: retinoid x receptor) Retinoid-X-Rezeptor s Standardabweichung SCAD (engl.: short-chain alcohol dehydrogenase) kurzkettige Alkohol-Dehydrogenase SDS Natriumdodecylsulfat sog. so genannt

TAL (engl.: thick ascending limb ) dicker aufsteigender Abschnitt der Henle- Schleife TBS (engl.: Tris-buffered saline) Tris-Puffer THP Tamm-Horsfall-Glykoprotein TGF-α (engl.: Transforming growth factor-α) Transformierender Wachstumsfaktor α TNF (engl.: tumor necrosis factor) Tumor-Nekrosefaktor TTR Transthyretin u.a. unter andere µg Mikrogramm µl Mikroliter V. Vena VA Vitamin A VLDL (engl.: very low density lipoprotein) Lipoprotein sehr niedriger Dichte vs. versus

arithmetisches Mittel z.B. zum Beispiel % Prozent

Einleitung 1

1 EINLEITUNG

In der biomedizinischen Forschung werden zunehmend Tiermodelle zur Untersuchung

ernährungsphysiologisch relevanter Fragestellungen des Menschen eingesetzt. Dabei sind

Kenntnisse über die physiologischen Besonderheiten der gewählten Spezies unabdingbar.

Tiermodelle sollten so ausgewählt werden, dass diese auch die gegebenen Verhältnisse des

menschlichen Körpers widerspiegeln.

Zur Erforschung des Carotinoid-Stoffwechsels des Menschen dürfen daher nur solche

Tiermodelle eingesetzt werden, die Carotinoide im Intestinaltrakt intakt resorbieren und in den

Geweben speichern können. Hierzu zählen der Mongolische Gerbil, das präruminante Kalb und

das Frettchen (LEE et al. 1999). Frettchen werden in der Carotinoid-Forschung vor allem für

Studien zur Absorption, Bioverfügbarkeit sowie Interaktion von Carotinoiden mit anderen

Nährstoffen eingesetzt (VAN VLIET et al.1996). Im Gegensatz zum Menschen sind bei

Frettchen, wie bei fast allen Vertretern der Ordnung Carnivora, hohe Vitamin-A (VA)-

Konzentrationen im Blut nachweisbar (SCHWEIGERT et al. 1990a; RIBAYA-MERCADO et

al. 1994). Die erhöhten VA-Konzentrationen sind dabei vorwiegend auf einen erhöhten Anteil

von Lipoprotein-gebundenen-Retinylestern (VA-Estern) zurückzuführen (SCHWEIGERT 1988;

RIBAYA-MERCADO et al. 1993). Dadurch unterliegt der VA-Transport im Blutplasma von

Fleischfressern keiner strengen homöostatischen Regulation, sondern zeigt eine deutliche

Abhängigkeit von der VA-Aufnahme über das Futter (SCHWEIGERT u. BOK 2000).

Bei Menschen und Ratten werden vergleichbar hohe Konzentrationen von

lipoproteingebundenen Retinylestern nur postprandial oder im Zusammenhang mit einer

chronischen VA-Überversorgung gesehen und für die Symptomatik einer VA-Intoxikation

verantwortlich gemacht (BIESALSKI 1989). Als Folge der erhöhten Retinylester-Konzentration

im Blutplasma von Fleischfressern werden erhöhte VA-Konzentrationen in den Geweben sowie

eine Ausscheidung von VA mit dem Harn beobachtet (RAILA et al. 2000).

Da der Carotinoid-Stoffwechsel eng mit dem VA-Metabolismus verbunden ist, müssen diese

Besonderheiten der Fleischfresser beim Einsatz vom Frettchen als Modelltier für den Menschen

beachtet werden. Für Tierexperimente zur Untersuchung des VA-Stoffwechsels des Menschen

werden dagegen vorzugsweise Mäuse und Ratten eingesetzt. Im Gegensatz zum Frettchen

besitzen Ratten keinen unspezifischen VA-Transport durch die Lipoproteine des Blutplasmas

und können Carotinoide nur in einem geringen Umfang intakt resorbieren.

2 Einleitung

Ziel der vorliegenden Studie ist die vergleichende Darstellung ausgewählter Parameter des VA-

Stoffwechsels bei Ratten und Frettchen, also von zwei Modelltieren, die sich hinsichtlich des

VA-Transportes im Blut deutlich unterscheiden. Die Arbeit soll Fragestellungen zum Einfluss

einer unterschiedlichen VA-Versorgung mit dem Futter auf den VA-Transport im Blut, die

Verteilung von VA und dessen Bindungsproteinen in der Leber und in den Nieren sowie die

Ausscheidung von VA mit dem Harn bearbeiten. Einen weiteren Schwerpunkt bildet die

Betrachtung spezieller VA-Speicherzellen, den sog. Ito-Zellen, in der Leber und erstmals auch in

der Niere. Hierbei kommen vorwiegend immunhistologische Verfahren zum Nachweis

bestimmter Markerproteine zur Anwendung. Die Untersuchungen sollen einen weiteren Beitrag

zum VA-Metabolismus von Ratten und Frettchen liefern, welche bei der zukünftigen

Bearbeitung von Fragestellungen mit diesen Tiermodellen hilfreich sein können.

Literaturübersicht 3

2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Vitamin A: Bedeutung und chemische Struktur

VA und dessen Derivate (Retinoide) sind für viele Funktionen des Organismus von essentieller

Bedeutung, die in den letzten Jahren zu einem zunehmenden Interesse dieser Verbindungen in

Medizin und Biologie geführt haben. Neben der zentralen Funktion im Sehprozess (WALD 1968),

besitzt VA eine Bedeutung in der Immunabwehr (ROSS 1992) und trägt zu verschiedenen

Antitumorwirkungen bei (De LUCA et al. 1993). VA ist ein essentieller Wachstumsfaktor und wird

für die normale Funktion der Keimepithelien sowie Strukturerhaltung der Schleimhautepithelien

benötigt (BLOMHOFF 1994a). Neuere Untersuchungen zur Wirkung der Retinsäure als

Morphogen eröffneten andere Aspekte zur Bedeutung von VA in der embryonalen

Gewebedifferenzierung (ZILE 2001). Die morphogene Wirkung beruht auf dem Aufbau eines

Konzentrationsgradienten, der von den embryonalen Zellen erkannt wird und die Ausprägung

morphologischer Strukturen steuert (SCADDING u. MADEN 1994; MORRISS-KAY u.

SOKOLOVA 1996). Die morphogenen Effekte der Retinsäure konnten durch die Regeneration der

Amphibiengliedmaßen und in der Differenzierung des Fingermusters der Flügelanlage beim

Hühnerembryo nachgewiesen werden (MADEN 1979; TICKLE et al. 1982). Die Retinsäure ist

auch für den Aufbau der anterior-posterioren Orientierung des Embryos von Bedeutung

(NIEDERREITHER et al. 2002).

Als „Vitamin A“ bezeichnet man alle Verbindungen, die einem VA-Mangel beseitigen, d.h. zu all-

trans-Retinol umgewandelt werden können. VA sowie dessen natürliche und synthetische Derivate

werden nach Internationaler chemischer Nomenklatur (IUPAC) unabhängig von ihrer biologischen

Aktivität unter dem Begriff „Retinoide“ zusammengefasst (BLOMHOFF et al. 1992). Die

chemischen Strukturen bedeutsamer Retinoide sind in Abb. 2.1 dargestellt. Die Stammkomponente

der Retinoide ist das all-trans-Retinol (VA-Alkohol). Es handelt sich um einen primären Alkohol

mit einer molekularen Masse von 286,5. Unter den Begriff „Vitamin A“ fallen außerdem die

Retinylester, welche Konjugate des Retinols mit Fettsäuren (z.B. Retinylpalmitat, Retinylstearat,

Retinyloleat) darstellen. Die Oxidation von all-trans-Retinol führt zum all-trans-Retinaldehyd (all-

trans-Retinal), das wiederum zu all-trans-Retinsäure oxidiert werden kann. Die all-trans-Retinsäure

und dessen Isomere vermitteln die eigentliche Funktion von VA, indem diese Substanzen die

Expression verschiedener Gene im Zellkern kontrollieren (EVANS 1994; MANGELSDORF.

1994).

4 Literaturübersicht

Abb. 2.1 Struktur physiologisch bedeutsamer Retinoide

2.2 Vitamin-A-Stoffwechsel

2.2.1 Vitamin-A-Quellen

Tiere und Menschen sind zur de novo Synthese von VA unfähig. Daher müssen sie ihren Bedarf an

VA über die Nahrung decken. Präformiertes VA kommt in der Natur nur im tierischen Organismus

in Form von Retinol und Retinylestern vor. Hauptnahrungsquellen für VA sind Leber,

Fischleberöle, Eier sowie Milch und Milchprodukte. Sehr hohe VA-Konzentrationen werden in der

Leber von Eisbären und Robben nachgewiesen (BALL et al. 1986). Karnivoren nehmen VA

überwiegend in Form von Retinol oder Retinylestern auf. Omnivoren beziehen ihr VA teilweise aus

präformiertem VA tierischen Ursprungs, teilweise nehmen sie VA aus Carotinoiden mit

Provitamin-A-Aktivität auf. Dagegen decken Herbivoren ihren gesamten VA-Bedarf aus

Carotinoiden, die vorwiegend in grünem Gemüse, gelben und roten Früchten sowie Futtergräsern

enthalten sind (OLSON 1994). Carotinoide sind fettlösliche Pigmente, die von allen

photosynthetisch aktiven Mikroorganismen und Pflanzen gebildet werden. Es gibt mehr als 600


Carotinoide, jedoch besitzen nur ca. 50 davon Provitamin-A-Aktivität. Unter diesen Provitaminen

ist das all-trans-β-Carotin der wichtigste Vertreter (BAUERNFEIND 1972).

2.2.2 Absorption und Metabolismus von Vitamin A im Gastrointestinaltrakt

Voraussetzung für die Absorption von VA ist die Spaltung der mit der Nahrung aufgenommenen

Retinylester in Retinol und Fettsäuren, welche durch die Aktivität einer unspezifischen

Pankreaslipase (Cholesterylesterase) sowie von spezifischen Retinylester-Hydrolasen gewährleistet

wird (RIGTRUP et al. 1994). Die Absorption von Retinol in die Enterozyten erfolgt zusammen mit

anderen fettlöslichen Nahrungskomponenten über erleichterte Diffusion (BUDDINGTON et al.

2002). Die Absorptionsrate ist dabei von der Art und Menge des zugeführten Fettes sowie einer

adäquaten Gallensekretion abhängig, welche die Bildung mizellärer Lösungen als Voraussetzung

zur Absorption fettlöslicher Nahrungskomponenten fördern (HARRISON u. HUSSAIN 2001).

Innerhalb der Mukosazellen wird Retinol an das zelluläre Retinol-Bindungsprotein Typ II (engl.:

Cellular retinol-binding protein, CRBP II) gebunden, welches Retinol der erneuten Veresterung mit

langkettigen Fettsäuren zuführt. Bei den neu synthetisierten Retinylestern entstehen vorwiegend

Retinylpalmitat und Retinylstearat (im Verhältnis 2:1) sowie geringe Konzentrationen an

Retinyloleat und Retinyllinoleat (GOODMAN et al. 1966). Die Veresterung von Retinol wird durch

zwei verschiedene Enzyme, der Lecithin: Retinol-Acyltransferase (LRAT) und der Acyl

CoA:Retinol-Acyltransferase (ARAT) vermittelt (ONG 1993). Die neu synthetisierten Retinylester

werden zusammen mit Triglyceriden, Cholesterol und anderen fettlöslichen Nahrungskomponenten

in Chylomikronen verpackt und mit der Darmlymphe abgegeben (Abb. 2.2) (BLOMHOFF et al.

1991).

Die Chylomikronen gelangen über den Ductus thoracicus in den Blutkreislauf. Aufgrund der

Aktivität der endothelialen Lipoproteinlipase erfolgt u.a. eine Triglyzerid-Hydrolyse und ein

Austausch der Apolipoproteine, so dass die Chylomikronen zu kleineren Chylomikronen-Resten

(sog. Remnants) abgebaut werden. Während dieser Umwandlung verbleiben die Retinylester

überwiegend in den Chylomikronen-Remnants (BLOMHOFF et al. 1991). Ein geringer Anteil der

Retinylester aus Chylomikronen kann aber von extrahepatischen Zellen mit intensiver

Zellproliferation, wie Knochenmark und Milz, aber auch von Fettgewebe, Skelettmuskel, Niere und

Lunge aufgenommen werden (BLOMHOFF et al. 1991; QUADRO et al. 1999). β-Carotin wird

ebenfalls durch erleichterte Diffusion zusammen mit anderen fettlöslichen Nahrungskomponenten

in die Mukosazellen des Dünndarms aufgenommen (BLOMHOFF et al. 1992). Innerhalb der

Mukosazellen wird β-Carotin entweder unverändert in Chylomikronen eingebaut und mit der


Lymphe abgegeben oder enzymatisch in Retinol umgewandelt. Die Spaltung von β-Carotin erfolgt

vorwiegend an der zentralen Doppelbindung durch die β-Carotin 15, 15΄ Dioxygenase

(LAKSHMAN et al. 1989). Dieses Enzym kommt nicht nur im Dünndarm, sondern auch in Leber,

Niere und Hoden vor (REDMOND et al. 2001).

Retinal wird durch verschiedene NADH-abhängige Reduktasen zu Retinol reduziert. Die Synthese

von Retinol aus Carotinoiden kann aber auch durch exzentrische Spaltung über die Bildung von

Apocarotinoiden und Retinal erfolgen (GANGULY u. SASTRY 1985). Apocarotinoide können in

verschiedenen Zellen des Organismus als Quelle zur Synthese von Retinsäuren herangezogen

werden (WANG et al. 1991; SCHWEIGERT 1998).

Säugetiere können aufgrund ihrer unterschiedlichen Fähigkeit zur Carotinoid-Absorption im

Dünndarm und Carotinoid-Speicherung in den Geweben in zwei Gruppen unterteilt werden

(GOODWIN 1986). Rinder und Pferde können fast ausschließlich β-Carotin absorbieren, weshalb

diese Arten auch als „Gelbfettspezies“ bezeichnet werden. Als „Weißfettspezies“ bezeichnet man

dagegen Tierarten, die Carotinoide nicht oder nur in geringem Umfang resorbieren. Hierzu zählen

das Schaf, die Ziege aber auch Nager sowie Vertreter der Fleischfresser (SCHWEIGERT 1995).

Neuere Untersuchungen zu dieser Thematik zeigen, dass gerade unter Fleischfressern erhebliche

Speziesunterschiede hinsichtlich der Resorption von Carotinoiden und Spaltung von β-Carotin zu

Retinol existieren. So können Frettchen verschiedene Carotine und Xanthophylle recht gut

resorbieren (RIBAYA-MERCADO et al. 1992; TANG et al. 1993; BOILEAU et al. 1999), besitzen

jedoch eine niedrige Kapazität, um β-Carotin zu Retinol zu spalten (LEE et al. 1999). Hunde und

Katzen sind ebenfalls in der Lage, oral verabreichte pharmakologische Dosen von β-Carotin und

Lutein zu absorbieren (CHEW et al. 2000; KIM et al. 2000; SCHWEIGERT et al. 2002b). Die

Katzen sind aber nicht in der Lage, β-Carotin in Retinol umzuwandeln, so dass diese Spezies zur

Deckung des VA-Bedarfes auf eine Zufuhr präformierter VA-Quellen angewiesen ist (GERSHOFF

et al. 1957; SCHWEIGERT et al. 2002b).


RBP= Retinol-Bindungsprotein CM= Chylomikronen ROH= Retinol CMR= Chylomikronenreste RA= Retinsäure RAR= Retinsäurerezeptor RE= Retinylester RXR= Retinoid-X-Rezeptor TTR= Transthyretin

Abb. 2.2 Vitamin-A-Stoffwechsel modifiziert nach BLOMHOFF (1994b).

2.2.3 Transport und Speicherung von Vitamin A in der Leber

Der Hauptanteil der in den Chylomikronen-Remnants enthaltenen Retinylester wird nach Bindung

an den LDL- und Chylomikronen-Remnant-Rezeptor (LRP, lipoprotein receptor-related protein)

durch Endozytose in die Parenchymzellen der Leber (Hepatozyten) aufgenommen. An der

Plasmamembran und in den frühen Endosomen der Parenchymzellen findet eine Hydrolyse der

Retinylester statt. Retinol wird anschließend zum endoplasmatischen Retikulum transportiert


(BLOMHOFF et al. 1985a). Abhängig vom VA-Status des Organismus wird Retinol entweder an

das Retinol-Bindungsprotein (RBP) gebunden und in das Blut sezerniert oder zu besonderen VA-

Speicherzellen der Leber, den Ito-Zellen, transportiert (BLANER et al. 1991). Der Retinol-

Transport von den Parenchymzellen zu den Ito-Zellen wird durch RBP in der interstitiellen

Flüssigkeit vermittelt, ohne dass dieser Komplex in den allgemeinen Blutkreislauf gelangt

(BLOMHOFF et al. 1985a).

Nach Aufnahme des Retinol-RBP-Komplexes wird dieser in den Ito-Zellen gelöst und freies

Retinol durch die hepatischen Enzyme LRAT und ARAT mit Fettsäuren verestert und der

Speicherung in den Lipidtröpfchen zugeführt. Etwa 50-80 % des Gesamt-VA im Organismus wird

in der Leber gespeichert. Die Ito-Zellen bilden dabei den Langzeitspeicher und enthalten 80-90 %

der Retinylester, während die Hepatozyten mit 10-20 % Retinylestern den Kurzzeitspeicher

darstellen, aus dem Retinol in das Blut zur Versorgung peripheren Gewebe mobilisiert werden

kann. Für die Freisetzung von VA aus der Leber ist die erneute Hydrolyse der gespeicherten

Retinylester Voraussetzung. Dabei wird die Hydrolyse endogener Retinylester durch Zugabe von

apo-CRBP I (Retinol-freiem CRBP) stimuliert (BOERMAN u. NAPOLI 1991), da das entstehende

Retinol zunächst an CRBP I gebunden wird. Nach Abgabe an das apo-RBP wird holo-RBP mit

Transthyretin (TTR) komplexiert und schließlich ins Plasma sezerniert (BLANER 1989;

BLOMHOFF et al. 1992).

2.2.4 Vitamin-A-Transport im Blutplasma

Retinoide liegen aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften in wässriger Umgebung an Proteine

gebunden vor (NOY 2000). Als unspezifischer Träger für lipophile Komponenten kann Albumin

diese Funktion übernehmen. Für Retinol existiert im Plasma zudem ein spezifischer extrazellulärer

Carrier, das Retinol-Bindungsprotein (RBP), während Retinylester unspezifisch durch die

Lipoproteine transportiert werden.

2.2.4.1 Spezifischer Vitamin-A-Transport durch das Retinol-Bindungsprotein

Der Transport von VA zu den peripheren Geweben erfolgt nach Hydrolyse der Retinylester zu

Retinol und Verbindung mit dem RBP im endoplasmatischen Retikulum der Hepatozyten. RBP ist

ein monomeres Polypeptid mit einer molaren Masse von 21 kDa (apo-RBP). Unter physiologischen

Bedingungen transportiert RBP spezifisch Retinol im molaren Verhältnis 1:1 (holo-RBP) (KANAI

et al. 1968); in vitro konnte darüber hinaus eine Bindung von Retinaldehyd und all-trans-Retinsäure

nachgewiesen werden (SIVAPRASADARAO u. FINDLAY 1994). Im Blutkreislauf zirkuliert der


holo-RBP-Komplex in Bindung an ein weiteres Protein, das Transthyretin (TTR). Durch die

Bildung dieser ternären Proteinstruktur und Erhöhung der Molmasse auf 76 kDa wird die

glomeruläre Filtration und damit die renale Elimination des holo-RBP-Komplexes verhindert

(MONACO 2000).

Der Hauptanteil von Retinol gelangt als holo-RBP-TTR-Komplex (ca. 96 %) über den Blutkreislauf

zu den Zielzellen im peripheren Gewebe. TTR-ungebundenes-RBP (ca. 4 %) wird bei intakter

Nierenfunktion glomerulär filtriert und im proximalen Nierentubulus über Megalin-vermittelte-

Endozytose vollständig rückresorbiert (GREEN et al. 1985; CHRISTENSEN et al. 1999). Ein

geringer Anteil von Retinol wird über Retinal zu Retinsäure oxidiert, ins Blut abgegeben und als

Retinsäure-Albumin-Komplex transportiert (SPORN et al. 1984).

Studien an Ratten haben gezeigt, dass bei VA-Mangel die Konzentrationen an Retinol und RBP im

Blutplasma fallen (UNDERWOOD et al. 1979). In der Leber hingegen wird RBP aufgrund der

fehlenden Beladung mit Retinol nicht in das Blut abgegeben, so dass man histologisch an einer

verstärkten RBP-Immunreaktion VA-Mangeltiere erkennen kann (KATO et al. 1984). Dies weist

darauf hin, dass im VA-Mangel die Synthese von RBP aufrechterhalten bleibt und apo-RBP im

endoplasmatischen Retikulum der Leberzellen zurückgehalten wird. Dieses apo-RBP steht zur

Verfügung, falls das VA-Angebot in der Diät wieder zunimmt. Bei Erhöhung der VA-Versorgung

über die Nahrung wird Retinol an das apo-RBP gekoppelt, vom endoplasmatischen Retikulum zum

Golgi-Apparat transportiert und als holo-RBP in das Blutplasma sezerniert (SMITH et al. 1998a).

Somit steigen die Retinol- und RBP-Konzentration im Blutplasma schnell an, während die

hepatischen RBP-Konzentrationen fallen (MUTO et al. 1972; LOERCH et al. 1979).

Die Aufrechterhaltung der VA-Homöostase im Blutplasma wird durch die Bindung von Retinol an

das RBP gewährleistet (BLANER 1989). Symptome eines VA-Mangels entstehen, wenn die VA-

Leberreserven bis zu einem kritischen Punkt (< 10 µg/g) aufgebraucht sind (OLSON. 1984). Erst

dann fällt die Plasma-Retinol-Konzentration unter 70 µg/l, welche für einen VA-Mangel

ausrechnen sind (RIBAYA-MERCADO et al. 1999). Somit ist es schwierig, vor allem marginale

VA-Defizite, beispielsweise während der Akut-Phase-Antwort, durch die Analyse der Plasma-

Retinol-Konzentration zu bestimmen (SCHWEIGERT 2001).

Für die Diagnostik von VA-Mangelzuständen wurde deshalb der RDR-Test (engl.: relative dose

reponse) entwickelt (LOERCH et al. 1979). Dieser Test beruht auf der Tatsache, dass im

VA-Mangel RBP in der Leber akkumuliert (KATO et al. 1984). Bei VA-Gabe über die Nahrung


hingegen wird RBP mit Retinol beladen und aus der Leber ausgeschleust, so dass es zum Anstieg

der Plasma-Retinol-Konzentration kommt. Für den RDR-Test sind zwei Blutproben (vor der Gabe

einer physiologischen VA-Dosis und fünf Stunden danach) erforderlich. Ein Anstieg der Retinol-

Konzentration von über 50 % des Ausgangswertes wird als VA-Defizit gewertet (LOERCH et al.

1979).

Während einer chronischen Überversorgung mit VA kommt es zu einer Sättigung der VA-

Speicherkapazität in der Leber und in den Geweben (RUSSELL 2000). Bei Ratten mit einer

chronischen Hypervitaminose A wird VA im Plasma nicht nur im Form von Retinol, sondern

vorwiegend als Retinylester, gebunden an Lipoproteine, transportiert (MALLIA et al. 1975). Ein

Anstieg unspezifisch gebundener Retinylester (vorwiegend Retinylpalmitat) im Plasma von

Menschen und Ratten wird auch postprandial in den Chylomikronen beobachtet (ECKHOFF et al.

1991). Nicht an RBP-gebundenes VA kann dadurch die Doppellipidschicht der Zellmembranen

durchdringen und zur Freisetzung lysosomaler Enzyme, wie Kathepsin, führen. Dadurch kommt es

zu einer initialen Schädigung der Zellen, was längerfristig zur Symptomatik einer VA-Intoxikation

führt (BIESALSKI 1989; RUSSELL 2000). Eine Ausnahme in bezug auf den unspezifischen

Lipoprotein-gebundenen VA-Transport stellen die meisten Tierarten der Ordung Carnivora dar, die

Trotz hoher Konzentrationen von Lipoprotein-gebundenen Retinylestern im Blut keine Symptome

einer Vitamin-A-Intoxikation zeigen (SCHWEIGERT et al. 1990a).

2.2.4.2 Unspezifischer Vitamin-A-Transport durch die Plasma-Lipoproteine

Fleischfresser unterscheiden sich im VA-Transport grundlegend von anderen Tierarten, da bei

Karnivoren VA im Blut physiologischerweise nicht nur in Form von Retinol, sondern vorwiegend

als Lipoprotein-gebundene Retinylester transportiert wird (SCHWEIGERT et al. 1990a). Der

Transport der Retinylester im Blut von den meisten Karnivoren erfolgt durch alle Fraktionen der

Lipoproteine, die very-low density lipoproteins (VLDL), low density lipoproteins (LDL) und high

density lipoproteins (HDL) (WILSON et al. 1987; RIBAYA-MERCADO et al. 1993;

SCHWEIGERT u. THOMANN 1993). Erste Hinweise, die auf eine besondere Situation im VA-

Transport bei Fleischfressern hindeuten, wurden beim Hund in einer Intoxikationsstudie beobachtet

(MADDOCK et al. 1949). Dabei reagierten Hunde einerseits wesentlich unempfindlicher auf eine

hohe VA-Versorgung mit dem Futter, anderseits besitzen sie keinen so streng regulierten VA-

Blutspiegel, wie beispielsweise Menschen oder Ratten (MADDOCK et al. 1949).

Die Gesamtkonzentration an VA im Blutplasma von Fleischfressern liegt über denen, die für


Menschen, Primaten, Nager und Herbivoren beschrieben sind. Besonders hohe VA-

Konzentrationen werden im Blut von Kaniden und Musteliden festgestellt (SCHWEIGERT et al.

1990a; RIBAYA-MERCADO et al. 1994). In Gegensatz zu anderen Tierarten sind aber Symptome

einer VA-Intoxikation bei Fleischfressern, trotz hoher Plasma-Konzentrationen von Lipoprotein-

gebundenen Retinylestern, nicht zu beobachten. Als Folge der erhöhten Retinylester-

Konzentrationen im Plasma von Karnivoren sind die erhöhte VA-Konzentration in den Organen

sowie die Ausscheidung von VA in Form von Retinol und Retinylestern mit den Harn zu sehen

(SCHWEIGERT et al. 1991; RAILA et al. 2000). Die VA-Konzentration im Blutplasma wird bei

Hunden, Füchsen und Nerzen aufgrund des Lipoprotein-gebundenen VA-Transportes durch die

VA-Versorgung über das Futter beeinflusst.

Der Nachweis von Retinylestern im Plasma von Hunden und anderen Fleischfressern ist aber keine

Konsequenz einer erhöhten VA-Versorgung mit der Diät, da bei Hunden selbst bei defizitärer VA-

Versorgung Retinylester im Plasma nachweisbar sind (WILSON et al. 1987; SCHWEIGERT et al.

1990b; SCHWEIGERT u. BOK 2000). In einer Fütterungsstudie bei Hunden wurden die höchsten

Konzentrationen an Retinylestern im Plasma in Korrelation mit dem höchsten Gehalt an VA in der

Diät beobachtet. Die Konzentration an Retinol im Plasma wird aber aufgrund der Bindung an das

RBP nicht von der Fütterung beeinflusst (SCHWEIGERT u. BOK 2000).

2.2.5 Aufnahme von Vitamin A in die Zielzellen

Der molekulare Mechanismus, durch den Retinol von extrahepatischen Zellen aufgenommen wird,

ist bisher nicht vollständig geklärt und wird kontrovers diskutiert. Es wird angenommen, dass ein

Zelloberflächen-Rezeptor (Molmasse 63 kDa) den Retinol-RBP-TTR-Komplex bindet und das

Retinol in die Zelle aufnimmt (SIVAPRASADARAO u. FINDLAY 1988). Untersuchungen zur

Gewebeverteilung des RBP-Rezeptors zeigen, dass in der Nierenrinde, in der Plazenta, im

Epithelgewebe der Retinalpigmente und im Knochenmark hohe Bindungsaffinitäten für holo-RBP

nachweisbar sind (SMELAND et al. 1995). Die Existenz des spezifischen RBP-Rezeptor ist aber

nicht bewiesen. Andere Studien stellen die Existenz eines Oberflächen-Rezeptors in Frage und

vermuten, dass die Aufnahme von Retinol in die Zelle ohne Mitwirkung eines Rezeptors erfolgt

(NOY 2000). Der RBP-Retinol-Komplex wird vor seiner endgültigen Metabolisierung mehrmals

rezykliert. Hierbei scheinen vor allen die Nieren eine wichtige Funktion zu besitzen (GREEN et al.

1985).


2.2.5.1 Zelluläre Vitamin-A-Bindungsproteine

Neben extrazellulären Bindungsproteinen gibt es auch spezifische, intrazelluläre Trägerproteine für

VA. Diese Proteine gehören zur Familie der intrazellulären Lipid-Bindungsproteine (engl.:

intracellular lipid-binding proteins; iLBPs) und besitzen untereinander einen hohen Grad an

Aminosäurensequenz-Homologie (ONG 1994). Tabelle 2.1 zeigt, dass bisher vier Bindungsproteine

beschrieben wurden, die zur intrazellulären Wirkung von VA beitragen (NAPOLI 1999; NOY

2000). Die zellulären Retinol-Bindungsproteine (engl.: cellular retinol-binding protein) CRBP I

und CRBP II können all-trans-Retinol, 13-cis-Retinol und all-trans-Retinaldehyd binden, während

die zellulären Retinsäure-Bindungsproteine (engl.: cellular retinoic acid-binding protein) CRABP I

und CRABP II sehr hohe Bindungsaffinität zu all-trans-Retinsäure aufweisen, wohingegen die

Bindung von 13-cis-Retinsäure oder 9-cis-Retinsäure geringer ausgeprägt ist (NOY 2000). Die

zellulären Bindungsproteine regulieren den Anteil der freien, ungebundenen Retinsäure in den

Zellen und schützen vor unspezifischen Oxidationen (ONG 1994).

Tab. 2.1 Spezifische intrazelluläre Retinoid-Bindungsproteine (NAPOLI 1999).

Bindungsprotein Molmasse

(kDa)

Ligand Zelluläre Expression

CRBP I 15 all-trans-Retinol zahlreich (Embryo und

Adult)

CRBP II 15 all-trans-Retinol

all-trans-Retinal

Dünndarm (Embryo und

Adult) , Leber (Embryo)

CRABP I 15 all-trans-Retinsäure zahlreich (Embryo und

Adult)

CRABP II 15 all-trans-Retinsäure zahlreich (Embryo), Haut,

Hoden, Uterus (Adult)

2.2.5.2 Zelluläre Retinol-Bindungsproteine

CRBP I wurde in verschiedenen Geweben nachgewiesen (Leber, Lunge, Niere, Nebenhoden,

Hoden). Es fördert die zelluläre Aufnahme von Retinol aus dem Blutplasma, die Veresterung von

Retinol mit langkettigen Fettsäuren und die Biosynthese von Retinsäure (GHYSELINCK et al.

1999; NOY 2000). CRBP II wird nur in den Enterozyten des Dünndarms sowie in der embryonalen

Leber nachgewiesen und ist an der Synthese der Retinylester beteiligt (ONG et al. 1987; ONG

1994).


Die Fettspeicherzellen in der Leber (Ito-Zellen) enthalten wesentliche Mengen an CRBP I und

Enzymen (Lecithin: Retinol-Acyltransferase, LRAT, Acyl-CoA: Retinol-Acyltransferase, ARAT),

welche die Veresterung von Retinol vermitteln (BLOMHOFF 1987). Die Mobilisierung von

Retinylestern aus dem Leberspeicher erfordert die Hydrolyse durch eine Retinylester-Hydrolase

und wird durch das Verhältnis von apo- zu holo-CRBP I bestimmt (Abb. 2.3) (ROSS 1993; ZHAI

et al. 1997). Apo-CRBP I (Retinol-ungebundenes CRBP) ist ein potenter Inhibitor der LRAT-

Reaktion, so dass das Verhältnis von apo-CRBP I zu Retinol-gebundenem CRBP I (holo-CRBP I)

entscheidend für die Modulation der LRAT-Aktivität und damit für die VA-Speicherung ist

(BOERMAN u. NAPOLI 1991). Das CRBP I ist auch in den Nieren reichlich nachweisbar; seine

genaue Funktion aber unbekannt (KATO et al. 1984).

In den extrahepatischen Zielgeweben erfolgt eine Metabolisierung von Retinol zu Retinsäure,

welche durch die Bindung an spezifische nukleäre Rezeptoren die Genexpression bestimmter

Proteine kontrollieren (BALMER u. BLOMHOFF 2002). Somit stellt Retinsäure eine Hormon-

ähnliche-Verbindung dar. Die Bildung von all-trans-Retinsäure aus Retinol läuft in einem

zweistufigen Prozess ab: Zunächst wird in einem reversiblen und damit

geschwindigkeitsbestimmenden Schritt Retinol zu Retinal und anschließend in einem irreversiblen

Schritt Retinal zu Retinsäure oxidiert (NAPOLI 1999). Die Oxidation zum Retinal wird durch

zytosolische Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) katalysiert (DUESTER 1996). Eine zweite Enzym-

Familie, die Dehydrogenasen kurzkettiger Alkohole (engl,: short-chain alcohol-dehydrogenase;

SCAD), ist ebenfalls für diesen Schritt relevant (BOERMAN u. NAPOLI 1995).

Vieler dieser SCAD bevorzugen an CRBP-I-gebundenes Retinol als Substrat. Eine gezielte

Interaktion mit der mikrosomalen Retinoldehydrogenase wird nur aufgrund der Sequestrierung von

Retinol durch CRBP I gewährleistet (POSCH 1991). Auch an dem zweiten Reaktionsschritt der

Bioaktivierung von Retinol zur Retinsäure sind zytosolische Dehydrogenasen beteiligt. Die neu

synthetisierte Retinsäure wird an das CRABP I und II gebunden, zu dem Zellkern transportiert und

an die nukleären Retinsäure-Rezeptoren übergegeben (ONG 1994; NOY 2000).


ROL= Retinol REH= Retinylester-Hydrolase RE= Retinylester ROLDH= Retinol-Dehydrogenase RAL= Retinal RALDH= Retinal-Deshydrogenase RA= Retinsäure ARAT= Acyl-CoA: Retinol-Acyltransferase RBP= Retinol-Bindungsprotein LRAT= Lecithin: Retinol-Acyltransferase P 450= Cytochrome P450 CRBP I= Zelluläres Retinol-Bindungsprotein Typ I

Abb. 2.3 Retinol-Stoffwechsel in der Leber (GHYSELINCK et al. 1999)

2.2.5.3 Zelluläre Retinsäure-Bindungsproteine

In vielen biologischen Systemen stellt die all-trans-Retinsäure den aktiven Metaboliten von VA dar.

Bisher sind zwei zelluläre Retinsäure-Bindungsproteine, (engl.: cellular retinoic acid binding

protein) CRABP I und CRABP II, bekannt, die in allen Wirbeltieren zu finden sind (GORRY et al.

1994). Die genaue Funktion der beiden Bindungsproteine ist zur Zeit noch nicht vollständig

aufgeklärt (NOY 2000). Vermutlich wirken CRABP I und CRABP II als Regulatoren für Transport

und Metabolismus der Retinsäure im sich entwickelnden Embryo, wie auch im erwachsenen

Organismus. Weiterhin wird vermutet, dass beide Proteine als Carrier für den Transport der

Retinsäuren in den Zellkern dienen (GAUB et al. 1998).

Das CRABP I ist ubiquitär nachweisbar (ONG et al. 1994) und wird in Hoden und Augen

besonders stark exprimiert, wo es zuerst als Trägerprotein für RA erkannt wurde (TAKASE et al.

1986). CRABP II wird ausschließlich in der Haut, im Uterus sowie im Ovar exprimiert (ONG et al.

1994; WARDLAW et al. 1997).


2.2.5.4 Zelluläres Retinal- und Interphotorezeptor-Retinol-Bindungsprotein

In jedem Säuger-Organismus existieren für die Absorption von Licht verantwortliche Sehpigmente.

Das wichtigste Sehpigment im Säuger ist das Rhodopsin, ein Membranprotein, das 11-cis-Retinal

als prothetische Gruppe bindet (WALD 1968). Zur Generierung von 11-cis-Retinal wird all-trans-

Retinol von der äußeren Kapillarseite her in das Pigmentepithel aufgenommen und an CRBP I

gebunden. Anschließend wird all-trans-Retinol mit langkettigen Fettsäuren durch eine im

Pigmentepithel lokalisierte LRAT in die entsprechenden Retinylester umgewandelt (SAARI u.

BREDBERG 1989).

Die neu synthetisierten Retinylester können durch eine Isomerohydrolase zu 11-cis-Retinal

reagieren, das dann auf ein zelluläres retinalbindendes Protein (engl.: cellular retinal binding

protein) CRALBP übertragen wird (SAARI 1994). Das CRALBP scheint auch für die direkte

Isomerisierungsreaktion von all-trans-Retinol zu 11-cis-Retinal verantwortlich zu sein (STECHER

et al. 1999). Nach Abgabe des 11-cis-Retinal an das Interphotorezeptor-Retinol-bindende-Protein

[engl.: interphotoreceptor retinol binding protein (IRBP)] wird es zu den Photorezeptoren

transportiert und dort in den Scheiben der Segmente an Apoproteine (Opsin) gebunden, wobei

Rhodopsin entsteht. Unter Lichteinfluss findet eine Isomerisierung von 11-cis- zu all-trans-Retinal

statt. Diese Isomerisierung zieht eine Änderung der Konformation der Rhodopsin-Pigmente mit

sich. Diese Reaktion führt zur Dissoziation des Pigment-Chromophor-Komplexes sowie

Stimulation einer Signalkaskade, die letztendlich in der Erzeugung eines Nervenimpulses endet

(WALD 1968). Das entstandene all-trans-Retinal wird in den Photorezeptorzellen der Retina und

dem Epithelgewebe wieder zu 11-cis-Retinal isomerisiert (SAARI 1994).

2.2.5.5 Nukleäre Retinsäure-Rezeptoren

Außer im Auge und im Hoden werden die Wirkungen der Retinoide über nukleäre

Transkriptionsfaktoren vermittelt. Bisher wurden zwei Familien von nukleären Retinsäure-

Rezeptoren identifiziert, die all-trans-Retinsäure-Rezeptoren (RAR) und die Retinoid-X-Rezeptoren

(RXR) (GIGUERE et al. 1987; PETKOVICH et al. 1987; MANGELSDORF et al. 1990). Diese

Rezeptoren gehören zu der Überfamilie der Steroid- und Thyroidhormon-Rezeptoren, zu denen u.a.

der Vitamin-D-Rezeptor, der Östrogen-Rezeptor und der Peroxisomen-Proliferator aktivierter

Rezeptor zählen (MANGELSDORF 1994).

Die nukleären Rezeptoren wirken als Liganden-aktivierte-Transkriptionsfaktoren, die an bestimmte

DNA-Sequenzen in der Promotorregion von Zielgenen (engl.:hormon-responsive elements, HRE)


gebunden werden (MANGELSDORF 1994; PFAHL u. CHYTIL 1996). All-trans-Retinsäure

besitzt eine hohe Affinität für den RAR, nicht aber für RXR, während 9-cis-Retinsäure ein

wirksamer Ligand sowohl für den RAR als auch für RXR darstellt (HEYMAN et al. 1992; LEVIN

et al. 1992). Durch die Bindung der Liganden modulieren die RAR und RXR die Transkription über

die HRE, die in der Regulationsregion von Retinsäure-responsiven Genen lokalisiert sind (PFAHL

u. CHYTIL 1996). Bisher wurden über 500 Gene nachgewiesen, die über diesen Retinoid-

spezifischen Signalweg beeinflusst werden (BALMER u. BLOMHOFF 2002).

2.3 Bedeutung der Leber im Vitamin-A-Stoffwechsel

Die Leber hat im Organismus eine zentrale Funktion in der Aufnahme, Speicherung und

Mobilisierung von VA. Der Stoffwechsel von VA in der Leber ist komplex und durch das

Zusammenspiel von intrazellulären- und extrazellulären Retinoid-Bindungsproteinen reguliert. In

der Leber sind vor allem zwei Zellarten von Bedeutung: die Parenchymzellen als Kurzzeitspeicher

von VA und Ort der RBP-Synthese sowie die Ito-Zellen, die als VA-Langzeitspeicher für den

Organismus fungieren (BLOMHOFF 1987).

Die Parenchymzellen nehmen Retinylester, die in den Chylomikronen-Remnants enthalten sind,

durch rezeptorvermittelte Endozytose auf. Dies erfolgt nach Bindung der Apolipoproteine E und D

an den LDL-Rezeptor sowie das LRP (HUSSAIN et al. 1991). Nach Aufnahme in die

Parenchymzellen werden die Retinylester hydrolytisch in Retinol und Fettsäure gespalten

(BLOMHOFF et al. 1985b). Wenn der Organismus optimal mit VA versorgt ist, wird die Mehrheit

des aufgenommenen VA zur Speicherung in die Ito-Zellen transferiert bzw. nach Bindung an das

RBP zur Versorgung der peripheren Gewebe in das Blut sezerniert (BLOMHOFF et al. 1992). Die

Überleitung von VA zur Speicherung in den Fetttröpfchen der Ito-Zellen erfolgt ebenfalls durch die

Bindung von Retinol an RBP, dessen Aufnahme möglicherweise durch einen Ito-Zell-RBP-

Rezeptor reguliert wird (BLOMHOFF et al. 1984; BLANER et al. 1987; BLOMHOFF et al. 1988).

Die Mobilisierung von VA aus der Leber und die Verteilung zu peripheren Geweben wird durch

verschiedene Faktoren reguliert, welche die RBP-Synthese und Sekretion in der Leber kontrollieren

(MUTO et al. 1972). So wird im VA-Mangel die RBP-Ausschleusung in der Leber gestoppt,

wodurch die RBP-Konzentration im Plasma fällt. Da die hepatische RBP-Synthese nicht gestoppt

wird, steigt deren Konzentrationen in den Parenchymzellen an (siehe auch 2.2.4.1). Bei Menschen

mit Lebererkrankungen sind die VA-Konzentration im Plasma und in der Leber häufig erniedrigt.

Es wird vermutet, dass dies auf eine geringere Synthese und/oder eine gestörte Ausschleusung von

RBP zurückzuführen ist (SMITH u. GOODMAN 1971).


Neuere Untersuchungen an kultivierten Ito-Zellen haben jedoch ergeben, dass die Mobilisierung

von Retinol aus den Ito-Zellen nicht an die Synthese und Sekretion von RBP gekoppelt ist

(SAUVANT et al. 2001). Dieses aktuelle Ergebnis wirft weitere Fragen hinsichtlich der Bedeutung

von Ito-Zellen im VA-Stoffwechsel auf, so dass diese Zellen im Folgenden näher betrachtet

werden.

2.3.1 Ito-Zellen

Im Jahr 1876 beschrieb VON KUPFFER (1876) in der Leber eine Zellart, die er als „Sternzellen“

(engl.: stellate cells) bezeichnete. „Sternzellen“ sind jedoch nicht mit den zur Phagozytose

befähigten „Kupfferschen Sternzellen“ zu verwechseln, die innerhalb der hepatischen Sinusoide zu

finden sind (BLOMHOFF u. WAKE 1991). Im Laufe der Jahre wurde diese Zellenart mit

verschiedenen Namen, meist nach dem Erstbeschreiber, bezeichnet (Tab. 2.2) und bis jetzt haben

sich Forscher nicht auf einen gemeinsamen Terminus einigen können (ANONYMUS 1996).

Gängige Namen sind „perisinusoidale Fettspeicherzellen“; „Interstitialzellen“, „Perizyten“, „VA-

Speicherzellen“ und „Ito-Zellen“.

Im Folgenden soll diese Zellpopulation nur noch als „Ito-Zellen“ bezeichnet werden. Die Ito-Zellen

der Leber befinden sich im Disse’sche Raum, d.h. im interstitiellen Spalt zwischen Endothelzellen

und Parenchymzellen (HENDRIKS et al. 1990). Mit gut entwickelten Ausläufern umkleiden sie die

endothelialen Röhren (Abb. 2.4). Außer im perisinusoidalen Raum wurden Ito-Zellen auch im

perivaskulären Raum der Leber nachgewiesen (SUEMATSU et al. 1993).

Tab. 2.2 Terminologie der „Sternzellen“ nach WAKE (1980)

Name

Autor Jahr

Stellate cells

Pericytes

Fat-storing cells

Perisinusoidal cells

Lipocytes

Ito cells

Vitamin A-storing cells

Kupffer; Wake

Zimmermann

Ito

Wood

Bronfenmajer et al.

Hruban et al.

Yamada und Hirosawa

1876; 1971

1928

1951

1963

1966

1974

1976

Ito–Zellen stellen den Hauptspeicherort für VA im Organismus dar. Ito-Zellen bilden weiterhin die

Hauptquelle für die extrazelluläre Matrix der Leber, wie Kollagen, Fibronektin und Laminin


(BLOMHOFF u. WAKE 1991). Als charakteristisches Merkmal der Ito-Zellen gelten

lichtmikroskopisch sichtbare Lipidtröpfchen, deren Anzahl und Größe von der Speicherung an VA

und damit vom VA-Status abhängig sind (MORIWAKI et al. 1988).

I= Ito cell KC= Kupffer cell PC= Parenchymal cell EC= Endothelial cell

Abb. 2.4 Lokalisation von Ito-Zellen in der Leber (WAKE. 1980)

Anhand von VA-Autofluoreszenz, Intermediärfilament-Expression sowie morphologischer

Merkmale (Elektronenmikroskopie) wurden Zellen mit analoger Funktion zu Ito-Zellen auch in

extrahepatischen Geweben, so z. B in Niere, Dünndarm, Milz, Lunge, Pankreas und Nebenniere

nachgewiesen (NAGY et al. 1997; APTE et al. 1998b).

2.3.1.1 Bedeutung der Ito-Zellen im Vitamin-A-Stoffwechsel

Bei Säugetieren stellen die Ito-Zellen den Hauptspeicherort für VA im Organismus dar. Das aus der

Absorption stammende VA wird durch die Parenchymzellen in Form von Retinol zu den Ito-Zellen

transportiert und dort langfristig als Retinylester gespeichert.

Die VA-Speicherung in den Ito-Zellen der Leber sichert die Verfügbarkeit von VA, wenn die VA-

Zufuhr über die Nahrung verringert ist (BLOMHOFF u. WAKE 1991).


In verschiedenen Studien zur Synthese und Ausschleusung von RBP in der Leber wurde

nachgewiesen, dass die Parenchymzellen den einzigen Ort für die Bildung des Retinol-RBP-

Komplexes darstellen (BLANER et al. 1987; BLOMHOFF et al. 1988; ANDERSEN et al. 1992).

Das bedeutet, dass die Retinylester, welche in den Ito-Zellen der Leber gespeichert sind, zuerst

hydrolysiert und dann in Form von Retinol zu den Parenchymzellen transportiert werden mussen

(BLOMHOFF u. WAKE 1991). Weitere Studien an Ratten haben ergeben, dass die Ito-Zellen RBP-

mRNA enthalten und Retinol an RBP gebunden sezernieren können (ANDERSEN et al. 1992).

Jedoch ist eine Mobilisierung der Retinylester aus den Ito-Zellen auch ohne eine gleichzeitige

Synthese von RBP möglich, so dass die Aufklärung der Mechanismen der Retinolausschleusung

aus den Ito-Zellen der Leber Aufgabe zukünftiger Untersuchungen bleibt (SAUVANT et al. 2001).

Mit dem Nachweis der Existenz von Ito-Zellen in extrahepatischen Geweben, wie Niere, Lunge,

Pankreas oder Dünndarm, wird die Möglichkeit einer direkten Retinol-Sezernierung aus den Ito-

Zellen ins Blutplasma unterstützt (OKABE et al. 1984; YOKOI et al. 1984; NAGY et al. 1997).

2.3.1.2 Bedeutung der Ito-Zellen in der Entwicklung der hepatischen Fibrose

Die hepatischen Ito-Zellen besitzen drei wichtige Funktionen 1) Ito-Zellen dienen zur Speicherung

von VA in den Lipidtröpfchen des Zytoplasmas, 2) Ito-Zellen produzieren nahezu die gesamten

extrazellulären Matrixproteine der Leber und 3) Ito-Zellen sind an der Regulation der sinusoidalen

Mikrozirkulation beteiligt (ENZAN et al. 1994).

Als Antwort auf eine Schädigung der Leberzellen durch unterschiedliche Noxen steigt die Anzahl

der Ito-Zellen an, die sich dann zu myofibroblastähnlichen Zellen transformieren können

(DESMOULIERE et al. 1995; GRESSNER. 1996). Diese Transformation äußert sich in einer

gesteigerten Proliferation und Fibrogenese. Unterdessen verlieren die Ito-Zellen ihre Fähigkeit zur

Speicherung von VA in Form von Retinylestern und erhöhen die Synthese von Glattmuskulatur-α-

Actin (ROCKEY et al. 1992), so dass sich die Form der Ito-Zellen ändert und die Anzahl und

Größe an Lipidtröpfchen verringert (FRIEDMAN et al. 1989; GRESSNER. 1996).

Zum Verständnis der Mechanismen der Ito-Zell-Aktivierung in der Leber wurde ein Drei-Schritt-

Kaskadenmodel vorgeschlagen (Abb. 2.5):

1. Präinflammatorische Phase: Beginn der Ito- und Kupffer-Zell-Aktivierung aufgrund der

Ausscheidung von mitogenen Zytokinen aus geschädigten Hepatozyten, z.B. Transforming


growth factor-alpha (TGF-α), Insulin growth factor-1 (IGF-1).

2. Inflammatorische Phase: In dieser Phase werden die Ito-Zellen durch Zytokine aus aktivierten

Kupfferzellen [(TGF-α, TGF-βı, Tumour necrosis factor-alpha (TNF-α)] und Zytokine aus der

Zersetzung der Hämozyten (Blutkörperchen) [(TGF-βı, Epidermal-like growth factors (EGF),

platelet-derived growth factor (PDGF)] zur Proliferation und Transformation in

myofibroblastähnlichen Zellen stimuliert.

3. Postinflammatorische Phase: Die Transformation der Ito-Zellen in myofibroblastähnliche

Zellen ist vollständig. Die myofibroblastähnlichen Zellen sezernieren verschiedene Zytokine

und Wachstumsfaktoren, die zur autokrinen (myofibroblastähnliche Zellen selbst) und

parakrinen Stimulation nicht transformierter Ito-Zellen führen.

Die autokrine und parakrine Stimulation steuert den progressiven Verlauf der hepatischen

Fibrogenese, die auch nach Wegfall der primären Schädigung der Leberzellen weiterläuft.

(MATHEW et al. 1996). Aufgrund dieser Studien können Ito-Zellen zwei unterschiedliche

Phänotypen ausbilden (GRESSNER. 1996; HAUTEKEETE u. GEERTS 1997). In der Leber

zeigen die Ito-Zellen physiologischerweise einen „ruhenden Phänotyp“, d.h. die Ito-Zellen

enthalten wenige Zellorganellen, viele intrazelluläre Lipidtröpfchen, die reich an VA sind, sowie

eine niedrige Proliferationrate. Pathologischerweise sind dagegen die Ito-Zellen als „aktivierter

Phänotyp“ nachweisbar, d.h. die Zellen wandeln sich zu myofibroblastähnlichen Zellen

(HAUTEKEETE u. GEERTS 1997).

2.3.1.3 Bedeutung der Intermediärfilamente in der Identifikation von Ito-Zellen und

Transformation zu myofibroblastähnlichen Zellen

Die Intermediärfilamente (IF) bilden neben den Mikrotubuli und Mikrofilamenten eine dritte

Gruppe von Zytoskelett-Fasern (FUCHS u. YANG 1999; HERRMANN u. AEBI 2000). IF

besitzen einen Durchmesser von 10 nm und sind damit dünner als Mikrotubuli (24 nm) und dicker

als Mikrofilamente (7 nm). Bei höheren Vertebraten stellen die IF eine große Familie von α-

helikalen Proteinen dar, die sich aufgrund von Aminosäurensequenz-Vergleichen in fünf Gruppen

einteilen lassen (Tab. 2.3).


Phase Präinflammatoria

Schädigung der Parenchymzelle

mitogeneZytokine (TGF- , IGF-1)

Ito-Zell

Kupfferzellen-Aktivierung

mitogeneZytokine

Zytokinen Proteasen

Oxy-Radikalen

Phase InflammatoriaKupfferzellen

Ito-Zell

TGF-TGF-ßTNF-PDGFIL-1Proteasen

Proliferation, Transformation

TGF-ßEGFPDGF PMN

Oxy-Radikalen

Phase Postinflammatoria

Ito-Zell

Stimulans

TGF-ß

TGF-ß

FGF

IL-ß

2M

Abb. 2.5 Drei-Schritt-Kaskadenmodel zur Aktivierung von hepatischen Ito-Zellen in

myofibroblastähnliche Zellen, modifiziert nach GRESSNER (1996).

Jedes IF-Protein wird charakteristischerweise jeweils in bestimmten Gewebe und Zellarten gebildet.

In Gegensatz zu den Isoformen von Actin und Tubulin weisen IF sehr unterschiedliche Sequenzen

auf und haben verschiedene Molmassen. Vimentin, Desmin, das fibrilläre saure Glialprotein

(engl.: glial fibrillary acidic protein, GFAP) und Peripherin zählen zum Typ III der IF-Proteine

(LAZARIDES 1982).


Vimentin kommt physiologischerweise in den Endothelzellen der Blutgefäße sowie in einigen

anderen Epithelien und in mesenchymalen Zellen, wie Fibroblasten vor. In Adipocyten bilden die

Vimentinfilamente einen Käfig um die Lipidtröpfchen und verhindern damit, dass diese

zusammenfließen oder mit der Zellmembran fusionieren. Desmin kommt hauptsächlich in der

quergestreiften und glatten Muskulatur vor, wo es die Myofribrillen zu Bündeln verbindet. Aktin-

Filamente sind Polymere aus zu einer Helix gewundenen, gleich orientierten, globulären G-Actin-

Molekülen. Actin-Filamente besitzen einen Durchmesser von 8 nm. Im Säugergewebe findet man

sechs Actin-Typen, die in drei Klassen eingeteilt werden: α-Actine kommen ausschließlich im

Muskelgewebe vor, während β- und γ-Actine in Nichtmuskelzellen (z.B. Trombozyten)

nachweisbar sind (JUNQUEIRIA et al. 1996).

Desmin- und Vimentin-Filamente können miteinander in den gleichen Filamenten

kopolymerisieren. Die Kopolymerisierung wurde in Muskelzellen, aber auch in Ito-Zellen

nachgewiesen (STEINERT et al. 1981).

Die IF-Proteine werden von zahlreichen Autoren als Marker für die Lokalisierung und Typisierung

der Ito-Zellen sowie für die Identifizierung ihrer Transformation zu myofibroblastähnlichen Zellen

in gesunden als auch in geschädigten Organen, wie Leber, Lunge und Niere verwendet (Tab. 2.5)

(RAMADORI et al. 1990; BUNIATIAN et al. 1996).

Ob ein Unterschied in der IF-Expression von Ito-Zellen zwischen verschiedenen Spezies besteht, ist

noch unklar. In Studien an Geweben vom Menschen wurde in Ito-Zellen ein Unterschied in der

Desmin-Expession zwischen ruhendem und aktiviertem Phänotyp nachgewiesen (Tab. 2.4).

Humane Ito-Zellen mit ruhendem Phänotyp enthalten Vimentin und exprimieren im aktivierten

Phänotyp Desmin (SCHMITT-GRAFF et al. 1991). Untersuchungen an Mäusen zeigen, dass die

Ito-Zellen ein breites Spektrum an IF-Proteinen besitzen. In der ruhenden Phase exprimieren die

Ito-Zellen von Mäusen Desmin, GFAP und geringe Menge an Vimentin, während in der aktivierten

Phase eine Zunahme der Desmin- und Vimentin-Expression sowie eine Verminderung der GFAP-

Expression beobachtet wird (GUMA et al. 2001). Die biologische Bedeutung der gleichzeitigen

Expression von verschiedenen IF-Proteinen in den Ito-Zellen ist jedoch noch nicht vollständig

aufgeklärt (GEERTS et al. 2001).


Tab. 2.3 Intermediärfilamente in Säugetieren (LAZARIDES u. GRANGER 1982)

IF-Protein Molmasse (103) Anzahl an

Polypeptiden

Vorkommen

Typ I

Saure Keratine

40-57

> 15

Epithelien

TypP II

Basische Keratine

53-67

> 15

Epithelien

Typ III

Desmin

Fibrilläres saures

Glialprotein (GFAP)

Vimentin

Peripherin

53

50

57

57

1

1

1

1

Muskel

Glia-Zellen und Astrocyten

Mesenchym

α-Internexin

Typ IV

Neurofilamente

L, M, H

62-110

1

Neurone

Tip V

Lamine A, B, C

67-70

1

Zellkerne

Tab. 2.4 Expression von Intermediärfilamenten in den Ito-Zellen (ruhender Phänotyp) und

myofibroblastähnlichen Zellen (MA) der Leber

Ratte

Mensch

IF Ito-Zellen myofibroblast-

ähnliche Zellen

Ito-Zellen myofibroblast-ähnliche

Zellen

Desmin + + - +

GFAP + + + +

Vimentin * + + + +

Α-SMA + + + +

* Kupffer Zellen und endothelialen Zellen können auch Vimentin exprimieren (HAUTEKEETE u. GEERTS 1997)


Tab. 2.5 Intermediärfilamente in der Identifikation von Ito-Zellen und Transformation zu

myofibroblastähnlichen Zellen

2.4 Bedeutung der Nieren im Vitamin-A-Stoffwechsel

Die Bedeutung der Nieren im VA-Stoffwechsel ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. Die Nieren

sind wichtige Organe in der physiologischen Regulation der Homöostase von Retinol im

Blutplasma (RAILA u. SCHWEIGERT 2001). Wie bereits erwähnt, wird Retinol im Plasma in

einem Komplex von RBP und Transthyretin transportiert (BLANER 1989). Nach Abgabe von

Retinol an die extrahepatischen Zielzellen findet eine physiologische Dissoziation des entstandenen

apo-RBP-TTR-Komplexes statt. Weiterhin liegen etwa 4 % vom holo-RBP nicht an TTR gebunden

vor (MUTO et al. 1972), das aufgrund der geringeren Molmasse (21 kDa) glomerulär filtriert

werden kann (GOODMAN 1984b). Glomerulär filtriertes RBP und Retinol gehen dem Körper aber

nicht verloren, sondern werden in den Epithelzellen des proximalen Tubulus durch

rezeptorvermittelte Endozytose effektiv rückresorbiert (KATO et al. 1984; RAILA et al. 2000).

Dabei kommt Megalin, einem Membranrezeptor aus der LDL-Genfamilie, eine besondere

Autor

Spezies IF Organe Zustand

Yokoi (1984) Ratte Desmin Leber Normal

Okabe (1984) Ratte Fibronektin Lunge Normal

Ballardini (1988) Ratte α-Actin, Desmin Leber Fibrose

Rockey (1992) Ratte α-Actin, Desmin Leber Fibrose

Ramadori (1990) Ratte α-Actin, Desmin,

vimentin

Leber Normal

Enzan (1994) Mensch α-Actin, Desmin

Vimentin

Leber

Niere, Lunge

Darm

Normal

Vitamin-A-

supplementierte Diät

Grupp (1997) Ratte α-Actin, Desmin Niere Normal

Muchaneta-

Kubara (1997)

Ratte α-Actin, Desmin

Vimentin

Niere Subtotal- Nephrectomie

Nakatsuji (1998) Ratte Vimentin Niere Nephropathie

Apte (1998) Ratte GFAP, α-Actin,

Desmin, Vimentin

Pankreas Normal

Zimmerman (1999) Ratte Desmin Leber Normal

Geerts (2001) Maus GFAP, Desmin

Vimentin

Leber IF-defizitäre Mäuse


Bedeutung zu (CHRISTENSEN et al. 1999). Eine neuere Studie zeigt darüber hinaus, dass auch

TTR physiologischerweise glomerulär filtriert und durch Megalin im proximalen Nierentubulus

reabsorbiert wird (SOUSA et al. 2000). So werden etwa 50 % der Konzentration an Retinol-RBP im

Blutplasma durch die Nieren beigesteuert (GREEN et al. 1985; BLOMHOFF et al. 1991).

Untersuchungen an Menschen mit verschiedenen Nierenerkrankungen zeigen, dass im chronischen

Nierenversagen ein Anstieg der Konzentrationen an Retinol, RBP und TTR im Plasma

nachzuweisen ist (SMITH u. GOODMAN 1971; VAHLQUIST et al. 1985). Eine erhöhte VA-

Konzentration liegt möglicherweise in der eingeschränkten glomerulären Filtration von

niedermolekularen Proteinen in der Niere sowie an dem daraus folgendem Anstieg der RBP-

Serumkonzentration begründet. Die erhöhte RBP-Konzentration im Plasma führt zu einer Zunahme

des molaren Verhältnisses zwischen RBP und Retinol (SMITH u. GOODMAN 1971). Der Einsatz

einer therapeutischen VA-Supplemtierung sollte deshalb bei Patienten mit chronischem

Nierenversagen geprüft werden, da diese wesentlich empfindlicher auf eine VA-Applikation

reagieren. Diese kann zu erhöhten VA-Konzentrationen im Blut, zur Hyperplasie der Ito-Zellen

sowie perisinusoidalen Fibrose in der Leber führen (DOYLE et al. 2000).

Untersuchungen, in denen bei Ratten ein akutes Nierenversagen induziert wurde, zeigen, dass die

Erhöhung der Retinol-Konzentration im Plasma auf eine Akkumulation von apo-RBP im Plasma

zurückzuführen ist. Apo-RBP dient als hepatisches Signal für den VA-Bedarf in den peripheren

Geweben und induziert die Ausschleusung des holo-RBP-TTR-Komplexes aus der Leber

(GERLACH u. ZILE 1990). Steigt aufgrund eines akuten Nierenversagens die apo-RBP-

Konzentration im Blut an (verminderte glomeruläre Filtration und Katabolismus im proximalen

Tubulus), so wird vermehrt holo-RBP aus der Leber ausgeschleust, was dann zu einem Anstieg der

Konzentrationen an Retinol, RBP und TTR führt (GERLACH u. ZILE 1991). Deshalb kommt den

Nieren eine besondere Rolle in der Regulation des Plasma-Retinol-Spiegels zu.

Die Nieren sind neben der Leber auch als wichtiges Speicherorgan für VA zu betrachten. Renal

gespeichertes VA kann im VA-Mangel zur Aufrechterhaltung des VA-Plasmaspiegels beitragen

(GERLACH et al. 1988; NAGY et al. 1997). Die Lokalisation von VA in den Nieren zeigt

speziesspezifische Unterschiede und scheint von der VA-Zufuhr über die Nahrung abhängig zu

sein. In neueren Untersuchungen wurde von Ito-Zell-ähnlichen VA-Speicherzellen im Interstitium

der Nierenrinde von Ratten berichtet (NAGY et al. 1997). Auch bei Fleischfressern wird VA

vorwiegend in der Nierenrinde gespeichert (RAILA et al. 2000).


Studien zur Verteilung von VA in den Nieren haben deren Bedeutung im VA-Stoffwechsel

unterstützt (POPPER u. GREENBERG 1941; POPPER. 1944; PLOPPER et al. 1977). VA kann bei

Ratten physiologischerweise im Endothel und intertubulären Kapillaren nachgewiesen werden. Dies

wurde jedoch nicht in den Nieren von Ratten mit einer Hypovitaminose A beobachtet. Dagegen

kann VA in Nieren von Ratten mit einer hochdosierten VA-Diät im proximal gewundenen Tubulus

lokalisiert werden (PLOPPER et al. 1977). Bei Menschen wurde VA im proximalen Tubulus und

benachbarten Histiozyten nur beim Vorliegen einer Nephropathie beobachtet. In den Nieren von

Hunden beschränkt sich der VA-Nachweis auf die Lipidtröpfchen in der Henleschen Schleife

(POPPER 1944). Bei Wildkatzen wurde darüber hinaus die Gegenwart von VA-haltigen

Lipidtröpfchen in den renalen Tubuli bestätigt (HEYWOOD 1967).

2.5 Bedeutung von Megalin im Vitamin-A-Stoffwechsel

Megalin ist ein hochmolekularer 600 kDa-Membranrezeptor, der in der Niere eine wichtige Rolle in

der endozytotischen Aufnahme von glomerulär filtrierten Makromolekülen spielt. Megalin gehört

zur Familie der LDL-Rezeptoren (SAITO et al. 1994) und wurde erstmals als Antigen in den

glomerulären Podozyten und im endozytotischen Apparat des proximalen Tubulus von Ratten mit

Heymann-Nephritis nachgewiesen (KERJASCHKI et al. 1992). Neben den Ephitelzellen des

renalen proximalen Tubulus wird Megalin auch in verschiedenen anderen epithelialen Geweben,

wie Nebenhoden, Endometrium, Eileiter, Nebenschilddrüse, Lunge oder Dottersack exprimiert

(ZHENG et al. 1994). Megalin bindet sowohl Proteine (Insulin, β-2-Glykoprotein, RBP), als auch

eine Reihe unterschiedlicher Substanzen, wie Enzyme, Enzyminhibitoren, Apolipoproteine,

Aminoglykosid-antibiotika, Hormone und Kalzium-Ionen (CHRISTENSEN u. BIRN 2001).

Megalin ist deshalb grundlegend für die tubuläre Reabsorption und metabolische Regulation von

lebenswichtigen Substanzen des Organismus verantwortlich (NYKJAER u. WILLNOW 2002). Die

Analyse von transgenen Megalin-defizitären-Mäusen zeigt, dass eine normale embryonale

Entwicklung von Tieren mit einem Megalin-Mangel nicht möglich ist. Die Überlebensrate dieser

Tiere sind sehr gering (nur ca. 2 %). Megalin wird deshalb als Rezeptor des mütterlich-fetalen

Transportes von Lipoproteinen sowie Vermittlung der endozytotischen Aufnahme von nutritiven

Makromolekülen in der Postgranulationsphase angenommen (WILLNOW et al. 1996).

RBP-Retinol wird über megalinvermittelte Endozytose im proximalen Tubulus reabsorbiert. Das

aufgenommene RBP unterliegt in den Lysosomen einem weiteren Abbau, während Megalin durch

spezifische Vesikel zur erneuten Bindung von RBP zur Verfügung steht. Unter physiologischen

Bedingungen verhindert Megalin durch die Reabsorption im proximalen Tubulus einen Verlust von


Retinol mit dem Harn (CHRISTENSEN et al. 1999). Eine neuere Studie postuliert dagegen, dass

Megalin die Transzytose von RBP-Retinol im proximalen Nierentubulus vermittelt und somit zur

Regulation der Plasma-Retinol-Konzentration beiträgt (MARINO et al. 2001). Hieraus ergibt sich,

dass weitere, bisher unbekannte zelluläre Funktionen des Megalin-Rezeptors zu erforschen sind.

2.6 Vitamin-A-Ausscheidung im Harn

Unter physiologischen Bedingungen wird VA beim Menschen nur in Form von wasserlöslichen

VA-Metaboliten ausgeschieden (LAMBERT u. DE LEENHEER 1985). Schwangere Frauen zeigen

dagegen eine physiologische Ausscheidung von Retinol und RBP im Harn (RAILA. 2003). Diese

Besonderheit ist abhängig vom Stadium der Gravidität. Das Maximum der VA-Ausscheidung liegt

dabei um den Geburtstermin. VA ist schon 6 Tage nach der Geburt nicht mehr im Harn

nachweisbar (RICHTER 1964).

Eine Harnausscheidung von Retinol in Verbindung mit RBP wurde bei Menschen mit Cadmium-

Vergiftung nachgewiesen (PETERSON 1971). Neuere Untersuchungen bei Menschen mit

verschiedenen Infektionskrankheiten bestätigen die Ausscheidung von Retinol über den Harn, was

bei Patienten in Entwicklungsländern ein zunehmendes Risiko für eine Hypovitaminose A darstellt

(STEPHENSEN et al. 1994; MITRA et al. 1998a). Der Verlust von RBP-Retinol im Harn wird in

Folge einer geschädigten tubulären Reabsorption von niedrigmolekularen Proteinen diskutiert

(STEPHENSEN 2001). Eine pathologische VA-Ausscheidung konnte auch bei verschiedenen

Erkrankungen mit einer geschädigten tubulären Funktion gefunden werden (BOSIN u. MONJI

1987; BANKSON et al. 1988; SMITH et al. 1994). Die verstärkte Ausscheidung von Proteinen mit

niedriger Molmasse (sog. low-molecular weight proteins), wie RBP, β2-microglobulin und

Lysozym, weisen auf eine Störung der renalen tubulären Funktion hin (TWYMAN et al. 2000).

Diese werden nach glomerulärer Filtration im proximalen Tubulus physiologischerweise

reabsorbiert. Daher können solche Proteine als Marker für die Diagnostik einer tubulären

Proteinurie verwendet werden (LEHESTE et al. 1999).

2.6.1 Vitamin-A-Ausscheidung im Harn von Fleischfressern

Die relative Unempfindlichkeit von Hunden und anderen Fleischfressern gegenüber hohen VA-

Dosierungen zeigt, dass Hunde physiologische Besonderheiten im VA-Stoffwechsel aufweisen

(MADDOCK et al. 1949). Neben hohen Konzentrationen an Retinylestern im Blut und in den

Geweben, sind besonders Kaniden in der Lage, Retinol und Retinylester im Harn auszuscheiden

(SCHWEIGERT et al. 1991; RAILA et al. 2000). Auch trächtige und laktierende Kegelrobben sind


in der Lage, VA in Form von Retinol über den Harn zu eliminieren (SCHWEIGERT et al. 1991).

Die Ausscheidung von VA im Harn zeigt eine Abhängigkeit von der aktuellen VA-Versorgung über

das Futter. Etwa 15 % bis 65 % der täglichen VA-Zufuhr kann der Hund über den Harn eliminieren

(SCHWEIGERT et al. 1991). Die Retinol- und Retinylester-Konzentration im Harn zeigen aber

kein direktes Verhältnis zur VA-Aufnahme und damit zur VA-Plasmakonzentration

(SCHWEIGERT u. BOK 2000). Es wird aber vermutet, dass die VA-Ausscheidung von Hunden

einen besonderen Schutzmechanismus gegenüber einer VA-Intoxikation darstellt (CLINE 1997;

SCHWEIGERT u. BOK 2000).

2.6.2 Tamm-Horsfall-Protein als Vitamin-A-Trägerprotein im Harn von Hunden

Im Jahr 1950 wurde das Tamm-Horsfall-Protein (THP) aus dem Harn von Menschen als Inhibitor

der viralen Hämagglutinationsreaktion isoliert (TAMM u. HORSFALL 1950). Die Synthese des

THP findet in den Nierenzellen des dicken aufsteigenden Abschnittes (TAL) der Henle-Schleife

und des distalen Tubulus statt und wird physiologischerweise in den Harn abgegeben (HOYER et

al. 1979; BACHMANN et al. 1990). THP scheint identisch mit einem Glykoprotein (Uromodulin)

zu sein, das aus dem Harn von schwangeren Frauen isoliert wurde (MUCHMORE u. DECKER

1985).

Das THP/Uromodulin hat gemeinsame Aminosäurensequenzen mit dem LDL-Rezeptor (PENNICA

et al. 1987). Neue Ergebnisse zeigen, dass THP auch als Träger für Retinol und Retinylester im

Harn von Hunden dient (SCHWEIGERT et al. 2002a). Aufgrund der Aminosäurensequenz-

Ähnlichkeiten zum LDL-Rezeptor und der Lokalisation im TAL wurde eine Theorie der VA-

Ausscheidung im Harn von Fleischfressern postuliert (Abb. 2.7).

So könnte THP an der basolaterale Zellmembran der Epithelien des distalen Tubulus eine LDL-

Rezeptor-Funktion ausüben und Lipoprotein-gebundene Retinylester vom Blut her internalisiert

werden. Innerhalb der Epithelzellen wäre dann ein endosomaler Abbau des Rezeptors mit einer VA-

Speicherung in der Zelle oder ein Transport zur apikalen Membran und Sekretion in den Urin

möglich (RAILA 1999; RAILA u. SCHWEIGERT 2001).


Abb. 2.7 Modell zu den möglichen Mechanismen der renalen Sekretion von Retinol und

Retinylestern bei Hunden und andere Kaniden (RAILA u. SCHWEIGERT 2001).

Material und Methoden 30

3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN

3.1 Versuchstiere

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss einer unterschiedlichen VA-Versorgung mit dem

Futter auf den VA-Transport im Blut, der Verteilung von VA und deren Bindungsproteinen in

der Leber und in den Nieren sowie die Ausscheidung von VA mit dem Harn untersucht. Zur

Bearbeitung dieser Fragestellung wurden 18 männliche Wistar-Ratten (Rattus rattus) im Alter

von 12 Wochen sowie acht adulte (> 15 Monate) weibliche und zwei männliche Frettchen

(Mustela putorios furo) gewählt, die sich aufgrund ihres VA-Transportes im Blut (spezifisch vs.

unspezifisch) unterscheiden. Das Versuchsvorhaben wurde von der zuständigen Behörde (Land

Brandenburg, Ministerium für Landwirtschaft, Umweltschutz und Raumordnung) geprüft und

genehmigt (AZ: 48-3560-0/3)

3.2 Haltung und Fütterung

3.2.1 Ratten

Das Ausgangsgewicht der Ratten betrug 402 ± 59 g (Mittelwert ± Standardabweichung). Die

Haltung der Tiere erfolgte in den Räumen des Max-Rubner-Laboratoriums des Deutschen

Institutes für Ernährungsforschung (Bergholz-Rehbrücke) in artgerechten Käfigen bei

22 ± 1 ºC Raumtemperatur und 55 ± 5 % Luftfeuchtigkeit. Trinkwasser wurde ad libitum

angeboten. Der Fütterungsversuch dauerte insgesamt 65 Tage, wobei in den letzten fünf Tagen

die VA-Supplementierung abgesetzt wurde. Einen Tag vor der Tötung wurde das Futter aus den

Käfigen entzogen. Die Kontrolle des gesundheitlichen Zustandes der Ratten fand täglich statt.

Einmal pro Woche wurden die Tiere gewogen und ihr Futterverzehr bestimmt.

Die Ratten wurden in drei Gruppen zu jeweils sechs Tieren eingeteilt:

1. Kontrollgruppe (K): Die Ratten dieser Gruppe erhielten eine Standarddiät „Altromin

C1000“ (Fa. Altromin, Lage, Deutschland) (Tab. 3.1).

2. Vitamin-A-defizitäre Gruppe (VA-): Die Tiere dieser Gruppe bekamen eine VA-freie

Standarddiät. Es handelte sich um eine selbst hergestellte semisynthetische Ration

(Tab. 3.2) unter Zusatz einer VA-freien Vitamin-Vormischung C1000/Saccharose (Fa.

Altromin).

31 Material und Methoden

3. Vitamin-A-supplementierte Gruppe (VA+): Die Ratten erhielten zusätzlich zur

Standarddiät jeden zweiten Tag oral 10.000 IE VA in Form von Retinylpalmitat

(URSOVIT A®, wässrig; Serum Werk Bernburg AG) durch Applikation in die

Backentasche.

Tab. 3.1 Zusammensetzung der Standarddiät „Altromin C1000“

Inhalt

Mg/kg

Rohprotein 170 Rohfett 0,5

Rohfaser 0,4 Asche 0,6

Wasser 10 N-freie Extraktstoffe 5,8

Kcal/kg 3.500 MJ/kg 146

Calcium 9,5 Phosphor 7,5

Magnesium 0,7 Natrium 2,4

Kalium 7,0

Vitamin A 15.000 IE Vitamin D3 500,00 IE

Vitamin E 150 Vitamin K3 10

Vitamin B1 20 Vitamin B2 20

Vitamin B6 15 Vitamin B12 0,03 µg

Cholin 1.000 Vitamin C 20,00

Tab. 3.2 Zusammensetzung der Vitamin A-freien Standarddiät

Inhalt

g/kg

Weizenstärke

Casein

Planzenöl

Zellulose

640

100

50

20

Rohzucker

Mineral-Mischung

Vitamin A-freie

Mischung

120

50

20

3.2.2 Frettchen

Für den Fütterungsversuch wurden acht weibliche und zwei männliche Frettchen (Mustela

putorios furo), mit einem Gewicht von 1000 ± 281 g verwendet. Die Tiere stammen aus dem


Bundesinstitut für Gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin in Berlin-

Marienfelde (jetzt Bundesinstitut für Risikobewertung) und wurden im Max-Rubner-

Laboratorium des Deutschen Institutes für Ernährungsforschung in Bergholz-Rehbrücke

gehalten. Der Fütterungsversuch dauerte 64 Tage. Während des Versuches erfolgte eine tägliche

Kontrolle des gesundheitlichen Zustandes der Tiere. Einen Tag vor der Tötung wurde den

Frettchen das Futter entzogen.

Da es schwierig ist, eine VA-freie Diät für Fleischfresser herzustellen oder zu beziehen, wurden

die Frettchen in zwei Gruppen zu jeweils vier Tieren eingeteilt:

1. Kontrollgruppe (K): Die Tiere dieser Gruppe enthielten eine kommerziell erhältliche

Standarddiät für Hunde (Effem GmbH Deutschland) (Tab. 3.3).

2. Vitamin-A-supplementierte Gruppe (VA+): Die Frettchen erhalten zusätzlich zur

Standarddiät jeden zweiten Tag oral 35.000 IE VA als Retinylpalmitat

(URSOVIT A®) durch Applikation in die Backentasche.


Tab. 3.3 Zusammensetzung der Standarddiät für Hunde [aus Fleisch und tierischen

Nebenerzeugnisse, 60 % von Rind, 20 % Pansen, 20 % von Geflügel; Getreide

(Weizenkeime)]

Inhalt

g/kg

Rohprotein 114 Asche 25

Rohfaser 6 Wasser 310

MJ/kg 5,4

Calcium 4,5 Phosphor 4

Magnesium 0,4 Natrium 2,6

Kalium 4

Vitamin A 3250 IE Vitamin D3 180 IE

Vitamin E 100

3.3 Präparation und Konservierung der Proben

Die Tötung der Tiere erfolgte in tiefer Narkose durch Blutentzug. Hierzu wurden die Ratten

durch eine intraperitoneale Injektion von 200 mg/kg Körpergewicht (KG) Pentobarbital

(Narcoren® Merial, Halbergmoos), die Frettchen durch eine intramuskuläre Injektion von

Ketamin/Xylazin (10/0,5 mg/kg KG; Ketamin, Albrecht; Rompun, Bayer Leverkusen)

narkotisiert. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurden Blutproben durch Punktion der V. cava

caudalis gewonnen. Anschließend erfolgte eine zweiminütige Perfusion mit EDTA-Puffer durch

Punktion der V. portae und gleichzeitiger Öffnung der V. cava caudalis. Die perfundierten

Organe (Leber, Niere, Lunge, Milz, Dünndarm) wurden zur weiteren Präparation entnommen,

gewogen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C gelagert. Für die

immunohistochemische Untersuchungen wurden die Organproben in neutral gepuffertes 4 %-

iges Formaldehyd eingebracht, 24 h fixiert und anschließend in 70 %igen Alkohol überführt. Zur

Serumgewinnung wurden die Blutproben fünf Minuten zentrifugiert (1500 x g). Die Harnproben

wurden durch Punktion der Harnblase gewonnen sowie fünf Minuten zentrifugiert (300 x g), um

das Sediment abzutrennen. Serum und Harn wurden aliquotiert, mit Stickstoff begast und bei –

20 °C bis zur Analyse aufbewahrt.


3.4 Retinol- und Retinylester-Bestimmung in Blutserum, Harn und verschiedenen

Geweben

3.4.1 Extraktionsverfahren

Die Bestimmung von Retinol und Retinylestern erfolgte mittels Umkehrphasen-Hochdruck-

Flüssigkeits-Chromatographie (reversed phase high pressure liquid chromatography, rp-HPLC).

Zur Extraktion von Blutserum und Harn diente eine nach VUILLEUMIER et al. (1983)

modifizierte Methode. Je 400 µl Blutserum bzw. 800 µl Harn wurden zur Ausfällung der

Proteine mit 400 µl Ethanol versetzt, kurz geschüttelt und 2 ml n-Hexan als Extraktionsmittel,

das jeweils 0,05 % Butylhydroxytoluol (BHT) als Antioxidans erhielt, zugegeben. Die so

vorbereiteten Proben wurden jeweils 10 min geschüttelt und 10 min bei 3800 x g zentrifugiert.

Die obere organische Phase wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Die wässrige Phase

wurde noch einmal mit 2 ml n-Hexan extrahiert. Die beiden Überstände wurden vereinigt, unter

Stickstoff bis zur Trockne eingeengt und der organische Rest in 400 µl Eluent (Methanol,

Dichloromethan, Ammoniumacetat; 10/20/70, v/v/v) aufgenommen.

Die Extraktion der Organproben erfolgte in Anlehnung an die Methode nach RADIN (1981) mit

einem Gemisch aus n-Hexan (0,05 % BHT w/v) und Isopropanol (3/2, v/v). Zuerst wurden die

vorher zerkleinert und gewogenen Proben aufgetaut. Nach Zugabe von 5 ml des n-

Hexan/Isopropanolgemisches wurden die Proben kurz mit einem Ultra-Turrax (IKA

Labortechnik, Janke und Kunkel GmbH, Staufen) zerkleinert und 10 min bei 3800 x g

zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen (Greiner Labortechnik,

Frickenhausen) überführt. Im Geweberückstand wurde die gleiche Prozedur zweimal

durchgeführt und die gewonnenen Extrakte gepoolt. Durch Zugabe einer 0,1 M NaCl-Lösung

wurde die organische Phase von der wässrige Phase getrennt. Nach 30 min wurde die organische

Phase abgenommen und in ein 30 ml Polypropylenröhrchen (Sarstedt) überführt. Zu der

wässrigen Phase wurde noch einmal 7,5 ml n-Hexan mit 0,05 % BHT zugegeben, geschüttelt

und 30 min stehengelassen, bis die obere Schicht klar war. Die obere Schicht wurde

abgenommen und in den Polypropylenröhrchen (Sarstedt) überführt. Dieser Vorgang wurde

nochmals mit 5 ml n-Hexan/BHT wiederholt. Die Polypropylenröhrchen wurden auf 20 ml mit

n-Hexan/BHT aufgefüllt und gut gemischt. 100 µl Leberpool und 3 ml von den anderen Organen

wurden abgezogen und unter Stickstoff zur Trockne eingeengt.

Die Rückstände wurden in 500 µl Eluent (Methanol/Dichloromethan/Acetonitril;10/20/70, v/v/v)

aufgenommen, geschüttelt, fünf Minuten im Ultraschall behandelt, nochmals fünf Minuten bei


3800 x g zentrifugiert und anschließend über die HPLC analysiert.

3.4.2 Umkehrphasen-HPLC-Analyse

Die HPLC-Analysen wurden mit einer isokratischen Methode durchgeführt. Mittels einem

automatischen Probengeber (Autosampler 465, Kontron) wurden 200 µl Probe injiziert. Die

Trennung erfolgte auf einer Ultrasphere-ODS-Säule (4,6 Χ 45 mm 5µm, Beckman, USA). Die

mobile Phase bestand aus dem Eluentgemisch Methanol/Dichloromethan/ Acetonitril;10/20/70,

v /v /v). Die Flussrate betrug 1 ml/min (Pumpe Model 42225). Die Messung erfolgte simultan

mit dem Detektor Spectroflow 783 (ABI Analytical) für Retinol und Retinylester bei 325 nm.

Die Auswertung der Chromatogramme erfolgte mit einem Computerprogramm (Data System

450-MT2, Version 4.02, Kontron). Die Identifizierung und Quantifizierung von Retinol konnten

über den Vergleich der Retentionszeiten und der Peakfläche mit den jeweiligen externen

Standards bestimmt werden. Zur Quantifizierung der Retinylester wurde die von ROSS. (1981)

beschriebene Methode angewandt, in den die UV-Absorption der Retinylester nur vom

Retinolanteil, nicht jedoch von der jeweiligen langkettigen Fettsäure abhängig ist. Damit konnte

der erhaltene Ester in der Retinolkonzentration über den Vergleich der Peakfläche des

Retinylestern mit der Peakfläche einer bekannten Menge Retinol als Retinol-Äquivalent

berechnet werden.

3.4.3 Standards und Chemikalien

Die Standards Retinol, Retinylpalmitat und Retinylstearat stammen von der Fa. Sigma

(Deisenhofen). Methanol, Acetonitril, Dichloromethan, n-Hexan, Isopropanol, und Ethanol

wurden von der Fa. Roth, Karlsruhe bezogen.

3.5 Bestimmung von Protein, Triglyceriden und Cholesterol im Blutplasma

Die Proteinbestimmung erfolgte nach der Methode von SMITH et al. (1985). Dazu wurden 10 µl

Probe mit 200 µl Arbeitsreagenz, (A: 1 % BCA-Na2 ; 2 % Na2CO3; 0,16 % Na-tartrat;

0,4 % NaOH; 0,95 % NaHCO3 und B: 4 % CuSO4 х 5H2O-Lösung. Im Verhältnis 100:2, v/v) in

96-Well Mikrotiterplatten auspipettiert und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Messung erfolgte

photometrisch bei einer Wellenlänge von 570 nm mit einem Plattenlesegerät (Microplate

Reader™, Model 550 BioRad).

Die Konzentrationen wurden anhand einer Standardproteinkurve (Bovines Serumalbumin, RIA-


grade, Gerbu Biotechnik, Gaiberg) bestimmt. Für die Berechnung wurde ein Computer

Programm (Software Microplate Manager™, Version 4.0, BioRad) verwendet.

In Anlehnung an die modifizierte Methode nach McGOWAN et al. (1983) (GPO-PAP-Methode)

erfolgten die Triglyceridbestimmungen. In einer 96-Well Mikrotiterplatten wurden 5 µl Probe

mit 200 µl Reagenz (GPO-Trinder, Sigma) überführt und für 15 min inkubiert. Die Bestimmung

der Konzentration erfolgte anhand eines Glycerol-Standards (Sigma).

Die Cholesterolbestimmungen erfolgten nach der modifizierten Methode von ALLAIN (1974).

Dazu wurden 5 µl Probe mit 200 µl Cholesterol-Reagenz (Sigma) in 96-Well Mikrotiterplatten

auspipettiert und 15 min inkubiert. Die Messung der Extinktionen erfolgte photometrisch bei

einer Wellenlänge von 500 nm mit einem Plattenlesegerät (Microplate Reader™). Die

Konzentrationen wurden anhand einer Standardkurve mit einem Cholesterol-Kalibrator

(Cholesterol Calibrators, Sigma). Die Bestätigung der Richtigkeit der Analysen wurde mittels

Universal-Kontrollserum (Precinorm™ U; Boehringer Mannheim, Mannheim) durchgeführt.

3.6 Lipoproteintrennung mittels selbstaufbauendem Gradienten

Die Trennung der Lipoproteinen erfolgte in Anlehnung an eine von GRAHAM et al. (1996)

beschriebene Methode. Dazu wurde 4,5 ml Blutserum mit 15 % Iodixanol (Iodixanol,

Optiprep™) gemischt und in die Ultrazentrifugenröhrchen (Ultracrimp™) überführt. Die

Ultrazentrifugenröhrchen wurden mit verschiedenen Dichten, die jeweils vorsichtig

unterschichtet wurden, wie folgt befüllt:

2-3 ml NaCl-HEPES-Puffer (0,8 % NaCl, 10mM HEPES, pH 7,4)

6 ml 5 %iges Iodixanol (5,5 ml NaCl-HEPES + 0,5 ml Iodixanol)

5 ml 15 %iges Iodixanol (4,5 ml Serum +1,5 ml Iodixanol)

2,5 ml 25 %iges Iodixanol (1,75 ml NaCl-HEPES + 1,25 ml Iodixanol)

Die Ultrazentrifugenröhrchen (Ultracrimp™) wurden 2.30 h in einer Sorvall Ultra Pro 80

Preparative Ultrazentrifuge (Kendro Laboratory Products, Berlin) bei 350000 x g (100 000 rpm)

und 4 °C zentrifugiert. Für die Bestimmung der Dichte und die Eichung des Refraktometers

wurde ein Kontrollgradient mitgeführt (0,9 %ige NaCl-Lösung statt Serum). Durch die

Ultrazentrifugation stellte sich ein routinuierlicher Gradient ein. Die Fraktionen wurden

gesammelt. Die obere Schicht entspricht den VLDL (Dichte 1.006 g/ml) die folgenden


Fraktionen stimmen mit den LDL (Dichte 1.019-1.063 g/ml) und HDL (Dichte 1.063-1.210

g/ml) überein. Die Bestimmung von Triglyceriden, Cholesterol und Proteinen in den

verschiedenen Lipoprotein-Fraktionen wurde wie in 3.1.6 beschrieben durchgeführt.

3.7 Protein- und Kreatininbestimmungen im Harn

Die Proteinbestimmungen im Harn wurden nach der von BRADFORD (1976) beschriebenen

Methode durchgeführt. 100 µl Harnprobe wurde mit 900 µl Coomassie Brillant Blue G250

(Roth, Karsruhe) versetzt und geschüttelt. Die Probenlösung wurde in 96-Well Mikrotiterplatten

überführt. Die Messung der Extinktionen erfolgte durch ein Mikrotiterplattelesegerät

(Mircroplate Reader™) bei einer Wellenlänge von 570 nm. Als Standardprotein für die

Bestimmung der Konzentrationen wurde Bovines Serumalbumin (BSA, RIA-grade, Gerbu)

angewendet.

Die Kreatinin-Bestimmung (Creatinine Kit 555-A, Sigma) erfolgte nach einer modifizierten

Jaffe-Reaktion. Kreatinin bildet mit Pikrinsäure im alkalischem Milieu einen rot-orangen

Farbkomplex. Die Menge des entstandenen Farbstoffes ist ein Maß für den Kreatiningehalt der

untersuchten Probe und kann photometrisch ermittelt werden. Es wurden 100 µl Kreatinin-

Standardlösung bzw. 100 µl Harnprobe (1:20 verdünnt in Aqua dest.) bzw. 100 µl Aqua dest.

(Leerwert) in Küvetten (1,5 ml Halbmikroküvetten) pipettiert. Anschließend wurde in jeder

Küvette 1000 µl alkalische Pikratlösung zugesetzt, sogleich gemischt und zehn Minuten bei

Raumtemperatur inkubiert. In einem Zweistrahlphotometer (Uvikon, Kontron) wurde die

Absorption von Standard und Proben jeweils gegen den Leerwert bei einer Wellenlänge von 500

nm gemessen. Nachfolgend wurden 33 µl Säure-Reagenz je Küvette zugegeben, sofort gründlich

gemischt und nochmals fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, wobei sich der

Farbkomplex auflöste. Durch eine weitere Messung der Absorption von Standard und Proben

gegen den Leerwert bei 500 nm Wellenlänge wurden störende Chromogene ermittelt. Die

unbekannten Kreatinin-Konzentrationen wurden ausgehend vom Absorptionswert der Kreatinin-

Standardlösung (3 mg/dl) berechnet.

3.8 Untersuchungen zum Retinol-Bindungsprotein und Tamm-Horsfall-Protein

3.8.1 Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Die Natrium-Dodecyl-Sulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde in einer

Vertikalkammer (Mini-Protean™ II; BioRad, München) mit 0,05 mm dicken Gelen


durchgeführt. Die Trennung der Proteine unter denaturierten Bedingungen erfolgte in

12 %igen SDS-Polyacrylamidgelen mit 3 %igen Sammelgelen nach LAEMMLI (1970). Die

Proben wurden in Verhältnis 1:1 mit Probenpuffer verdünnt, fünf Minuten im Wasserbad bei

100 ºC behandelt und 15 µg Protein je Probenaufgabetasche eingesetzt. Die SDS-PAGE wurde

konstant mit einer Stromstärke von 50 mA durchgeführt. Die Trennung dauerte etwa eine

Stunde. Zur Färbung der Proteinbanden wurde die Silberfärbung nach HEUKESHOVEN U.

DERNICK, (1988) angewandt. Die Auswertung erfolgte densitometrisch (Multimager System,

BioRad).

3.8.2 Immunologischer Nachweis von Retinol-Bindungsprotein und Tamm-Horsfall-

Protein im Western-Blot

Zum immunologischen Nachweis von RBP und THP im Serum und Harn wurden die Proteine

nach der SDS-PAGE auf eine Polyvinyldifluoridmembran (PVDF, Immobilon; Millipore Corp.,

Bedford, USA) geblottet. Der Proteintransfer (Transferpuffer: 48 mM Glycin, 39 mM, 0,038 %

SDS, 20 % Methanol) erfolgte mit einer Stromstärke von 0,8 mA/cm2 und 60 min Dauer. Nach

dem Transfer wurde die Blotmembran kurz in TBS-Tween-Puffer (TBST: 50 mM Tris, 150 mM

NaCl, 0,1 % Tween 20 v/v, pH 7,5) gespült und in TBS-Puffer mit 5 % Magermilchpulver

(Nestle AG, Frankfurt/M.) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, um unspezifische

Bindungsstellen abzusättigen.

Im Anschluss erfolgte die Inkubierung mit einem peroxidasekonjugierten Antiserum gegen

humanes Serum-RBP vom Kaninchen (Code Nr A 301, Dako Diagnostika). Das Antiserum

wurde 1:300 in TBST-Puffer (0,05 % Tween 20; 1 % Magermilch, 90 min Raumtemperatur auf

dem Schüttler) verdünnt. Danach wurde die Membran 3 x 10 min mit TBST 0,3 % gewaschen

und anschließend mit Filterpapier getrocknet. Als Positivkontrolle wurde humanes Plasma

verwendet.

Zur Immunfärbung von THP erfolgte die Inkubierung mit einen Primär- und

Sekundärantikörper: Schaf anti-Human THP (AB 733¸ Chemicon) und Kaninchen anti-Schaf

IgG (Dako) 1:1000 mit TBST-Puffer verdünnt, je 60 min Inkubationszeit. Die Membran wurde

wie für den Nachweis von RBP behandelt. Zur Detektion von RBP und THP diente die Luminol-

Reaktion (Chemiluminescense Detektion Kit, Boehringer, Mannheim).

Mit Filterpapier (3MM-Papier; Whatman) wurde die Flüssigkeit entfernt und mit der Proteinseite


nach oben in den Fluor-S™ Multimager (BioRad) gelegt. Mit Hilfe der Software Multi-

Analyst™, Version 1.1 (BioRad) wurde die Chemilumineszenz aufgenommen.

3.9 Immunhistologische Untersuchungen

3.9.1 Herstellung von Paraffinschnitten

Die Formalin-fixierten Gewebeproben (Leber, Niere) wurden in Uni-Kassetten (Tissue-Tek™

III, Sakura, Niederlande) über eine Alkoholreihe mit ansteigender Konzentration und

Essigsäure-Butylester entwässert. Nach der Entwässerung wurden die Proben in Paraffin

eingebettet. Mittels eines Rotationsmikrotoms (SM 2000R, Leica) wurden 3 µm Schnitte erstellt,

auf Superfrost-Plus™-Objektträger (Menzel-Gläser™, Deutschland) aufgezogen und 30 min im

Brutschrank bei 37 ºC getrocknet. Bis zur Durchführungder immunhistologischen

Untersuchungen wurden die Schnitte bei Raumtemperatur gelagert.

3.9.2 Seren und Antikörper

Schweineserum wurde von Dako Diagnostika GmbH, Hamburg (Code Nr. X 0901) bezogen,

Bovines Serumalbumin (BSA) von Gerbu Biotechnik. Die verwendeten Primär- und

Sekundärantikörper und ihre Bezugsquelle sind in Tab. 3.4 und Tab. 3.5 aufgeführt. Als PAP-

Komplex für die monoklonalen Primärantikörper diente eine 1:100 in 1 % BSA in TBS

verdünntes Maus-PAP (Code Nr. 223-005-024, Dianova), für den polyklonalen Primärantikörper

ein 1:100 in 20 % Schweineserum in TBS verdünntes Kaninchen-PAP (Code Nr. Z0113, Dako).


Tab. 3.4 Antikörper für die Immunhistologie von Vitamin-A-Bindungsproteinen

Protein

Primärantikörper Sekundärantikörper

RBP Kaninchen anti-human RBP

(Code Nr.A 0040, Dako)

1:400 in 20 %

Schweineserum/TBS

Schwein anti-Kaninchen IgG

(Code Nr. Z 0196, Dako)

1:100 in 20 % 1:100 in 20 %

Schweineserum/TBS

Megalin

Ziege anti-Megalin

(von Prof. Willnow, MDC-Berlin)

1:1000 in 1 % BSA/TBS

Kaninchen anti-Schaf IgG HRP

(Code Nr. P 163, Dako )

1:100 in 1 % BSA/TBS

THP

Schaf anti-human THP

(Code Nr. AB 733, Chemicol)

1:1000 in 1 % BSA/TBS

Kaninchen anti-Schaf IgG HRP

(Code Nr. P 163, Dako)


Tab. 3.5 Antikörper für Immunhistologie zur Darstellung von Intermediärfilamenten

3.9.3 Lösungen und Puffer

Tris-bufferded saline (TBS, pH 7,6)

Stammlösung:

60,57 g Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Sigma)

610 ml Aqua dest.

1N HCl

Intermediärfilament

Primärantikörper Sekundärantikörper

Actin Maus anti-human Actin 1A4

(Code Nr. N 1584, Dako)


Ratte anti-Maus IgG

(Code Nr 415-005-100, Dianova)


Desmin

Maus anti-human Desmin, D33



Ratte anti-Maus IgG



Vimentin

Maus anti-Schwein Vimentin, V9



Ratte anti-Maus IgG




Gebrauchslösung:

100 ml Stammlösung

900 ml NaCl 0,8 % in Aqua dest.

Imidazol/HCl-Puffer 60 mM (pH 7,1)

4,08 g Imidazol (Merk, Darmstadt)

Aqua dest. ad 1000 ml

HCl auf pH 7,1

Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid-Lösung (DAB) in 60 mM Imidazolpuffer

100 mg DAB (Fluka Feinchemikalien GmbH, Neu Ulm) in 200 ml 60mM Imidazolpuffer (pH

7,1) lösen und mischen (Magnetrührer), filtrieren und unmittelbar vor Gebrauch 70 µl 30 %iges

H2O2 zugeben.

Papanicolaou-Lösung

Papanicolaou-Lösung 1b (Merck) und Aqua dest. im Verhältnis 1:20 mischen und filtrieren.

3.9.4 Durchführung der Peroxidase-anti-Peroxidase-Methode

Diese Peroxidase-anti-Peroxidase (PAP)-Methode wurde für den immunhistochemischen

Nachweis von RBP und Intermediärfilamenten angewendet.

1. Entparaffinierung und Rehydrierung :

1 x 10 min Roti-Histol (Carl Roth KG)

2 x 3 min Isopropanol (Carl Roth KG)

1 x 3 min 96 % Alkohol (Carl Roth KG, Karlsruhe)

1 x 3 min 80 % Alkohol

1 x 3 min 70 % Alkohol

2. Inaktivierung der endogenen Peroxidase

1 Stunde mit Methanol mit frisch zugesetztem 0,5 % H2O2 (Roth)

bei Raumtemperatur

3. 1-2 min waschen in TBS

Wechseln der Schnitte aus der Küvette in Coverplates (Sandon, Frankfurt/M.)


4. Blocken unspezifischer Bindungen

30 min 5 % BSA in TBS

5. Einbringen von je 100 µl des 1 % BSA in TBS verdünnten Primärantikörpers in die

Coverplates bzw. von 100 µl 1 % BSA in TBS / 1 % Schweineserum

in TBS für die Kontrollschnitte. Inkubation über Nacht bei + 4 °C

6. 10 min spülen durch Einbringen von 2 ml TBS je Coverplate

7. Einbringen von je 100 µl des Sekundärantikörper in 1 % BSA

in TBS je Coverplate 30 min Inkubation bei Raumtemperatur

8. Spülen durch Einbringen von 2 ml TBS je Coverplate

9. Einbringen von je 100 µl des PAP-Komplex in 1 % BSA in TBS je Coverplate 30 min

Inkubation bei Raumtemperatur

10. Spülen durch Einbringen von je 2 ml TBS je Coverplate

Wechseln der Schnitte aus den Coverplates in eine Küvette

11. Inkubation der Schnitte unter ständigem Rühren in 3,3' DAB mit 0,01 % H2O2 (30 %) in

0,1 M Imidazolpuffer (pH 7,1). 2 min Inkubation für die Intermediärfilamente und 5

min für RBP bei Raumtemperatur

12. 3 x 5 min Waschen in TBS bei Raumtemperatur

13. 1 x 5 min Waschen in Aqua dest bei Raumtemperatur

14. 10 sec Gegenfärben in Papanicolaou’s Hämatoxylin und 5 min Bläuen in

Leitungswasser

15. Je 3 min Entwässern in der aufsteigenden Alkoholreihe

2 x 5 min Roti-Histol

16. Eindecken der Objektträger mit Kanadabalsam

Für den immunhistologischen Nachweis von RBP im Frettchen wurden die Antikörper in

Schweineserum/TBS verdünnt:

Primärantikörper in 1:1 Schweineserum/TBS

Sekundärantikörper in 20 % Schweineserum/TBS

PAP-Komplex in 20 % Schweineserum/TBS

3.9.5 Durchführung der indirekten Peroxidase-Methode

Diese Methode wurde für den Nachweis von Megalin und Tamm-Horsfall-Protein (THP)


durchgeführt.

1.-6. Wie bei der PAP-Methode durchgeführt.

7. Einbringen von je 100 µl des 1 % BSA in TBS verdünnten Peroxidase gekoppelten

Sekundärantikörpers und 30 min Inkubation bei Raumtemperatur

10 min spülen durch Einbringen von 2 ml TBS je Coverplate

Wechseln der Schnitte aus den Coverplates in eine Küvette

10.-16. Wie bei der PAP-Methode durchgeführt.

3.10 Auswertung und statistische Bearbeitung

Alle Schnitte wurden mit einem Standardmikroskop (Olympus, BX50) unter Verwendung von

10er, 20er, 40er, und 100er Objektiven untersucht. Als positiv wurde in der Schnittebene

liegende, hell- bis dunkelbraune feingranuläre Reaktionsprodukte gewertet, die in der Kontrolle

nicht nachweisbar waren. Als Negativkontrollen dienten die jeweils mit 100 µl 1 % BSA in TBS

oder 1 % Schweineserum in TBS statt des primären Antikörpers parallel inkubierten Schnitte.

Die Beurteilung der Intensität der immunhistologischen Färbung erfolgte semiquantitativ nach

folgendem Muster: kein Reaktionsprodukt (Ø); geringgradig (+); mittelgradig (++); hochgradig

(+++) erhöht.

Die Ergebnisse sind als arithmetisches Mittel mit der dazugehörigen Standardabweichung

(0 ± SD) angegeben. Zur statistischen Auswertung der Daten wurde das Programm SPSS

Version 8.0 angewendet. Der ANOVA Test wurde für die Varianzanalyse und Post-Hoc-Tests

wurden der Duncan Test und der LSD Test für Mehrfachvergleiche angewendet. Als statistisch

signifikant galten Ergebnisse, deren p-Wert kleiner als 0,05 waren.

Ergebnisse 44

4 ERGEBNISSE

4.1 Vitamin A im Blutserum von Ratten und Frettchen

4.1.1 Vitamin-A-Gehalt im Serum von Ratten

Die Gesamt-VA-Konzentration im Serum von Ratten zeigte keinen signifikanten Unterschied in

Bezug auf die drei verschiedenen Diäten. VA wird im Blutserum von Ratten vorwiegend im

Form von Retinol aber auch als Retinylester transportiert. Wie die Ergebnisse in Tab. 4.1 zeigen,

liegt die VA-Konzentration der drei Fütterungsgruppen mit durchschnittlich 0,44 µg/ml auf

vergleichbarem Niveau. Die VA+-Gruppe von Frettchen zeigt im Vergleich zur Kontrollegruppe

einer statistischen Signifikanz in den Retinylestern, die auf die Erhöhung der Konzentrationen

von Retinylpalmitat und Retinylstearat zurückzuführen ist.

Tab. 4.1 Vitamin-A-Konzentration im Blutserum von Ratten und Frettchen

[µg/ml, ± SD (Prozente)].

n VA Retinol Retinyl-

oleat

Retinyl-

palmitat

Retinyl-

stearat

Σ Retinyl-ester

Ratten

K 6 0,41 ± 0,11 0,38 ± 0,09

(93,8 ± 5,1)

nd 0,03 ± 0,03

(6,15 ± 5,2)

nd 0,03 ± 0,03

(6,15 ± 5,2)

VA- 6 0,39 ± 0,01 0,36 ± 0,07

(93,7 ± 2,2)

nd 0,02 ± 0,01

(6,3 ± 2,4)

nd 0,02 ± 0,01

(6,3 ± 2,4)

VA+ 6 0,54 ± 0,33 0,36 ± 0,09

(83,4 ± 27,4)

nd 0,17 ± 0,34

(15,9 ± 26,2)

0,02 ± 0,02

(2 ± 1)

0,19 ± 0,33

(16,7 ± 27,4)

Frettchen

K 4 5,78 ± 0,8* 0,39 ± 0,07

(6,8 ± 1,04)

nd 2,15 ± 0,69**

(36,6 ± 8,4)

3,25 ± 0,41**

(56,6 ± 7,4)

5,39 ± 0,72*

(93,2 ± 1,04)

VA+ 4 33,7 ± 4,4 0,44 ± 0,26

(1,23 ± 0,6)

0,04 ± 0,01

(0,13 ± 0,04)

14,4 ± 3,72

(42,3 ± 6,3)

18,7 ± 1,61

(56,3 ± 6,9)

33,3 ± 4,11

(98,8 ± 0,6)

Signifikante Unterschiede zwischen Gruppen

* P < 0,05 ** P < 0,01

nd: unter der Nachweisgrenze

Eine unterschiedliche VA-Verteilung zwischen den Gruppen wurde festgestellt. Der Retinol-

Anteil dominiert in der Kontrollgruppe und VA--Gruppe mit 93 %, ebenso bei VA+-Gruppe mit

45 Ergebnisse

83 % der Gesamtkonzentration an VA. Jedoch sind in der VA+-Gruppe der Retinylester-Anteil

mit 17 % wesentlich erhöht. Dabei zeigt Retinylpalmitat die höchste Konzentration, gefolgt von

einem geringeren Anteil an Retinylstearat.

4.1.2 Vitamin-A-Gehalt im Blutserum von Frettchen

VA wird bei Frettchen überwiegend in Form von Retinylestern transportiert. Die

Gesamtkonzentration an VA in der VA+-Gruppe liegt sechsfach höher als die der

Kontrollgruppe. Der Retinol-Anteil in beiden Gruppen liegt mit etwa 0,4 µg/ml auf etwa

gleichem Niveau (Tab. 4.1).

4.2 Vitamin-A-Gehalt in Leber und Nieren von Ratten und Frettchen

4.2.1 Vitamin-A-Gehalt in der Leber von Ratten und Frettchen

In der Leber von Ratten ist die höchste VA-Konzentration nachzuweisen (Tab. 4.2). In den drei

Versuchsgruppen bilden die Retinylester, die in Form von Retinylpalmitat zu 98 % in der

Kontrollgruppe zu 90 % in der VA--Gruppe und zu 96 % in VA+-Gruppe dominieren, den

Hauptanteil von VA in der Leber. Die Gesamtkonzentration an VA liegt bei der Kontrollgruppe

20fach höher als der VA--Gruppe und 30fach unter der VA+-Gruppe. Die Varianzanalyse zeigt

bei den Vergleichgruppen relevanten Signifikanzen.

Bei Frettchen ist die höchste VA-Konzentration in der Leber nachzuweisen. Der Retinylester-

Anteil dominiert. 65 % des VA-Gehalts in der Leber der Basalgruppe entspricht Retinylpalmitat,

18 % Retinyloleat und 0,9 % Retinylstearat. In der VA+-Gruppe verschiebt sich das Verhältnis

des Retinylpalmitats zugunsten des Retinyloleats (Tab. 4.2). Nur die Retinyloleat-Werte

(P = 0,03) sind Statistisch gesehen Relevant.

4.2.2 Vitamin-A-Gehalt in den Nieren von Ratten und Frettchen

In den Nieren besitzen die Ratten der Kontrollgruppe eine VA-Konzentration von

24,98 ± 9,99 mg/g, die VA--Gruppe von 2,44 ± 1,03 µg/g und die VA+-Gruppe von

77,48 ± 29,46 µg/g. Diese Werte entsprechen damit 3 %, 6 % bzw. 3 % der gemessenen VA-

Konzentrationen in der Leber der betreffenden Diätgruppe (Tab. 4.2).

Ergebnisse 46

Tab. 4.2 Vitamin-A-Konzentration in der Leber und in den Nieren von Ratten und

Frettchen [µg/g, ± SD (Prozente)].

Organ n VA Retinol Retinyl-

oleat Retinyl-

palmitat Retinyl-

stearat Σ Retinyl-

ester

Ratten

Leber

K 6 856 ± 8,10** 12,1 ± 7,30**

(1,4 ± 0,8)

0,25 ± 0,16**

(0,03 ± 0,02)

843 ± 9,01**

(98,5 ± 1)

1,58 ± 1,50*

(0,1 ± 0,1)

844 ± 8,68**

(98,6 ± 0,8)

VA- 6 40,4 ± 15,8 1,62 ± 1,18

(4,8 ± 5,1)

2,13 ± 0,86

(5, ± 1,4)

36,6 ± 15,4

(89,8 ± 5,4)

nd 38,7 ± 15,9

(95,2 ± 5,1)

VA+ 6 2410 ± 48,7 63,9 ± 13,49

(2,6 ± 0,5)

13,5 ± 12,15

(0,6 ± 0,5)

2320 ± 38,06

(96,4 ± 0,8)

21,6 ± 8,51

(0,4 ± 0,5)

2355 ± 44,5

(97,4 ± 0,5)

Niere

K

6 24,9 ± 9,99** 2,57 ± 1,79

(10,5 ± 5)

0,01 ± 0,01

(0,04 ± 0,04)

22,2 ± 9,04**

(88,9 ± 5,2)

1,04 ± 0,00

(1,1 ± 2,4)

22,4 ± 8,80**

(90 ± 5)

VA 6 2,44 ± 1,03 1,40 ± 0,76

(59,6 ± 18,6)

0,01 ± 0,6

(0,4 ± 13,6)

0,98 ± 0,64

(38,3 ± 18,3)

0,05 ± 0,04

(2 ± 2)

1,03 ± 0,65

(40,4 ± 18,6)

VA+ 6 77,5 ± 29,4 5,05 ± 5,27

(5,2 ± 3,9)

1,29 ± 2,11

(1,2 ± 1,8)

62,9 ± 12,6

(86,7 ± 14,8)

12,3 ± 13,14

(7 ± 10,4)

72,4 ± 24,5

(94,8 ± 3,9)

Frettchen Leber

K 4 159 ± 130 7,2 ± 4,66

(16,1 ± 15,4)

28,5 ± 4,09*

(18,4 ± 12,2)

122 ± 110

(64,5 ± 17,9)

1,21 ± 1,55

(0,9 ± 0,8)

152 ± 131

(83,9 ± 15,3)

VA+ 4 264 ± 80 18,5 ± 13,4

(6,04 ± 3,3)

90,0 ± 27,8

(41,2 ± 23,6)

151 ± 91,58

(50,7 ± 21)

4,97 ± 1,78

(2,02 ± 0,7)

245 ± 67,0

(94 ± 3,3)

Niere

K 4 3,7 ± 1,2 2,27 ± 1,33

(59,4 ± 0,6)

0,25 ± 0,18

(6,2 ± 3,7)

1,12 ± 0,18

(32,3 ± 2,7)

0,06 ± 0,01

(1,7 ± 0,7)

1,43 ± 0,64

(40,9 ± 18,5)

VA+ 4 7,09 ± 3,26 3,79 ± 0,75

(63,2 ± 21,8)

0,84 ± 0,71

(9,9 ± 4,8)

2,31 ± 2,04

(25,8 ± 17,8)

0,05 ± 0,01

(1,1 ± 0,5)

3,21 ± 2,73

(36,8 ± 21,8)

signifikante Unterschiede zwischen Gruppen

* P < 0,05

** P < 0,01

nd: unter der Nachweisgrenze

Die dominierende VA-Fraktion in den Nieren ist Retinylpalmitat. Ihr Anteil an der

Gesamtkonzentration liegt bei 88 % in der Kontrollgruppe und 86 % in der VA+-Gruppe. In der

VA--Gruppe herrscht Retinol mit einem Anteil von 59 % vor. Die statistische Analyse weisen

auf signifikanten Werte bei der Retinylestern hin. Die VA-Konzentration in den Nieren von

Frettchen liegt bei 2 % des VA-Gehalts in der Leber in beiden Diätgruppen. Die vorherrschende

47 Ergebnisse

VA-Fraktion in beiden Gruppen ist Retinol mit 2,27 ± 1,33 µg/g und 3,79 ± 0,75 µg/g. Die

Retinylester-Konzentration entspricht in der Kontrollgruppe 41 % und in der VA+-Gruppe 36 %

der gesamten VA-Konzentration in den Nieren.

4.3 Vitamin-A-Verteilung auf die Lipoproteine

4.3.1 Vitamin-A-Verteilung auf die Lipoproteine von Ratten

Im Rattenserum sind Spuren von Retinylestern in Form von Retinylpalmitat 0,1 ± 0,03 µg/ml,

und Retinylstearat 0,08 ± 0,07 µg/ml nachweisbar. Diese Retinylester sind in der

VA+-Gruppe nur in der LDL-Fraktion detektierbar. Die Retinol-Verteilung auf die

Lipoproteinfraktion zeigte zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede. In allen

Gruppen tritt Retinol nur in Verbindung mit der HDL-Fraktion auf (Tab. 4.3).

Tab. 4.3 Retinol-Konzentrationen in Lipoprotein-Fraktionen im Blutserum von Ratten

[µg/ml, ± SD].

Diät Lipoproteinen Retinol Retinyl-

oleat Retinyl-palmitat Retinyl-

stearat

K HDL 0,03 ± 0,06 nd nd nd VA- HDL 0,01 ± 0,05 nd nd nd VA+ HDL

LDL 0,07 ± 0,07

nd nd

nd nd

0,1 ± 0,03 nd

0,08 ± 0,07

4.3.2 Verteilung des Vitamin A auf die Lipoproteine von Frettchen

Bei Frettchen befindet sich Retinol vorwiegend in der HDL-Fraktion. In dieser Gruppe konnten

keine Retinylester nachgewiesen werden. In der VA+-Gruppe waren sowohl Retinol als auch

Retinylester in den drei Lipoprotein-Fraktionen nachweisbar (Tab. 4.4).

Ergebnisse 48

Tab. 4.4 Vitamin-A-Gehalt in Lipoproteinen von Frettchen [µg/ml, ± SD].

Diät Lipoprotein-

Fraktionen

Retinol Retinyl-

oleat

Retinyl-

palmitat

Retinyl-

stearat

K HDL 0,04 ± 0,02 nd 0,4 ± 0,2 1,2 ± 0,9

VA+ HDL

LDL

VLDL

0,05 ± 0.08

nd

nd

nd

nd

nd

2,3 ± 3,5

3,9 ± 1,5

2,7 ± 0,9

7,4 ± 2,9

6,4 ± 2,8

9,2 ± 3,7

4.4 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentration im Blutserum und in den

Lipoprotein-Fraktionen von Ratten und Frettchen

4.4.1 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentration im Blutserum und in den

Lipoprotein-Fraktionen von Ratten

Die Cholesterol-Konzentrationen im Blutserum der Kontrollgruppe liegen zwischen

83-141 mg/dl, in der VA--Gruppe 69-84 mg/dl und in der VA+-Gruppe 77-120 mg/dl. Die

Triglycerid-Konzentrationen befinden sich zwischen 74-120 mg/dl in der Kontrollgruppe, 74-

120 mg/dl in VA--Gruppe und 120-142 mg/dl in VA+-Gruppe. Der Protein-Gehalt schwankt

zwischen 89-130 mg/ml in der Kontrollgruppe, 64-113 mg/ml in VA--Gruppe und 67-99 mg/ml

in VA+-Gruppe. Die statistische Analyse zeigte einen signifikanten Unterschied (P = 0,001) in

der Triglycerid-Konzentration zwischen den Gruppen, wobei die VA+-Gruppe im Vergleich zur

Kontrollgruppe einem erhöhten Triglycerid-Gehalt und einer Minderung des Cholesterolgehalts

im Serum aufwies (Tab. 4.5).

Tab. 4.5 Cholesterol-, Protein (mg/ml) und Triglycerid-Konzentration im Blutserum von

Ratten [mg/dl, ± SD].

Diät Cholesterol

Protein Triglyceride

Kontrolle 113 ± 20* 101 ± 14 94 ± 15**

VA- 76 ± 6 82 ± 17 88 ± 17

VA+ 99 ± 17 94 ± 5 131 ± 8

signifikante Unterschiede zwischen Gruppen * P < 0,05

** P < 0,01

In der Kontrollgruppe liegt 64 % des Gesamt-Cholesterols, 50 % der Triglyceride und 79 % der

Proteine in der HDL Fraktion vor. In den drei Diätgruppen sind die größten Werte an

49 Ergebnisse

Cholesterol und Protein in der HDL-Fraktion zu finden. Das Cholesterol in der VA--Gruppe

zeigt einer gleichmäßigen Distribution auf die Lipoprotein-Fraktionen. Die HDL-Fraktion

enthält 46 % des Total-Cholesterols, und die LDL-Fraktion 42 %. Andererseits ändert sich die

Cholesterol-Verteilung in der VA+-Gruppe zu ungunsten der LDL-Fraktion. In der VA+-Gruppe

77 % der Cholesterol-Total ist in der HDL-Fraktion und 16 % in der LDL-Fraktion zu weisen

(Tab. 4.6).

Tab. 4.6 Cholesterol-, Protein (mg/ml) und Triglycerid-Konzentration in Lipoprotein-

Fraktionen von Rattenserum [mg/dl, ± SD (Prozente)].

Diät Cholesterol

Protein Triglyceride

K HDL

LDL

VLDL

52,5 ± 22,6

(64,3 ± 27,7)

25,2 ± 13,7

(30,9 ± 16,8)

3,9 ± 1,4

(4,7 ± 1,7)

107 ± 20,7

(78,6 ± 15,2)

18,6 ± 11,5

(13,4 ± 8,5)

10,4 ± 4,8

(7,7 ± 3,5)

46,7 ± 34,7

(50,4 ± 37,4)

13,5 ± 5,0

(14,5 ± 5,4)

32,5 ± 16,7

(35 ± 18)

VA- HDL

LDL

VLDL

12,8 ± 10,9

(45,9 ± 39)

11,8 ± 14,2

(42,3 ± 50,9)

3,29 ± 5,2

(11,8 ± 18,6)

64,5 ± 40,3

(73,8 ± 46,1)

9,8 ± 4,2

(11,2 ± 4,8)

13,1 ± 1,2

(14,9 ± 1,4)

7,2 ± 1,1

(18,2 ± 2,7)

10,2 ± 3,2

(25,7 ± 8,1)

22,1 ± 21,7

(56,0 ± 54,9)

VA+ HDL

LDL

VLDL

22,1 ± 20,6

(76,7 ± 71,5)

4,5 ± 9

(15,6 ± 31,2)

2,16 ± 3,1

(7,5 ± 10,8)

132 ± 20,3

(96,6 ± 14,9)

3,05 ± 18,1

(0,8 ± 13,3)

1,5 ± 1,5

(1.1 ± 1,1)

8,1 ± 4,0

(13,1 ± 6,5)

10,5 ± 1,7

(16,9 ± 2,8)

43,1 ± 20,1

(69,9 ± 32,6)

Die Triglycerid-Verteilung verschiebt sich sowohl in der VA+-Gruppe als auch in der

VA--Gruppe zugunsten der VLDL Fraktion, in der 70 % bzw. 56 % der Triglyceride

nachgewiesen wurden. Die Verteilung der Triglyceride in den Lipoprotein-Fraktionen der

Kontrollgruppe ist uniform (50 % in HDL und 49 % in LDL-VLDL). Der größte Anteil der

Triglyceride in VA--Gruppe und VA+-Gruppe befindet sich in der VLDL-Fraktion (entsprechend

56 %, 70 %) (Tab. 4.6).

Ergebnisse 50

4.4.2 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentrationen im Blutserum und in

den Lipoprotein-Fraktionen von Frettchen

Im Frettchenserum der Kontrollgruppe liegen die Konzentrationen an Cholesterol zwischen 134-

167 mg/dl und in der VA+-Gruppe zwischen 163-255 mg/dl. Die Protein-Konzentrationen der

Kontrollgruppe und VA+-Gruppe liegen zwischen 49-58 mg/ml und 109-122 mg/ml.

Der Triglycerid-Gehalt der Kontrollgruppe schwankt zwischen 46-64 mg/dl und in der VA+-

Gruppe zwischen 37-46 mg/dl (Tab. 4.7). Die Unterschiede zwischen den Gruppen waren

sowohl für Protein (P < 0,008) als auch für Cholesterol (P < 0,05) und Triglyceride (P < 0,03)

statistisch gesichert.

Tab. 4.7 Cholesterol-, Protein- (mg/ml) und Triglycerid-Konzentrationen im Blutserum

von Frettchen [mg/dl, ± SD].

Cholesterol Protein Triglyceride

K 150,7 ± 17,1* 53,70 ± 4,6** 55,27 ± 8,8** VA+ 209,6 ± 45,8 115,90 ± 6,6 40,98 ± 5,3

signifikante Unterschiede zwischen Gruppen

* P < 0,05

** P < 0,01

In den Lipoprotein-Fraktionen von Frettchenserum steht HDL vor den anderen Fraktionen. Die

HDL-Fraktion der Kontrollgruppe sowie der VA+-Gruppe enthält 76 % des gesamten

Cholesterols, das in den Lipoproteinen des Serums vorhanden ist. Der höchste Anteil an

Proteinen und Triglyceriden in beiden Gruppen befindet sich in den HDL- und LDL-Fraktionen

(Tab. 4.8).

51 Ergebnisse

Tab. 4.8 Cholesterol-, Protein (mg/ml) und Triglycerid-Konzentration in Lipoproteinen-

Fraktionen von Frettchenserum [mg/dl, ± SD (Prozente)].

Diät Cholesterol Protein

Triglyceride

K HDL

LDL

VLDL

49,1 ± 22,2

(76,8 ± 34,7) 14,8 ± 12,4

(23.2 ± 19.4)

nd

10,9 ± 3,5

(95,6 ± 30,7)

0,46 ± 0,6

(4.03 ± 5,2)

nd

14,4 ± 3,0

(53,3 ± 11,1)

8,31 ± 0,9

(30,7 ± 3,3)

4,37 ± 2,25

(16,2 ± 8,3)

VA+ HDL

LDL

VLDL

36,4 ± 19,4

(77,4 ± 41,3)

9,07 ± 3,4

(19,3 ± 7,2)

1,57 ± 1,4

(3,34 ± 2,97)

14,2 ± 1,6

(82,1 ± 9,24)

3,14 ± 1,7

(76,8 ± 18,2)

nd

14,9 ± 7,2

(78 ± 37,3)

2,53 ± 0,5

(13,2 ± 2,6)

1,69 ± 1,61

(8,84 ± 8,42)

4.5 Retinol-Bindungsprotein im Blutserum und Harn von Ratten und Frettchen

Der Nachweis von Retinol-Bindungsprotein (RBP) im Blutserum und Harn von Ratten und

Frettchen wurde nach elektrophoretischer Trennung im Western-Blot durchgeführt. Als

Kontrolle diente humanes Serum.

4.5.1 Retinol-Bindungsprotein im Blutserum und Harn von Ratten

Wie Abb. 4.3 zeigt, ist RBP im Blutserum der Ratten aller Diätgruppen mit einem

Molekulargewicht 21 kDa zuweisen. In den Harnproben der Ratten könnte RBP nicht festgestellt

werden.

Ergebnisse 52

Abb. 4.3 Immunologische Detektion von RBP bei 21 kDa im Blutserum von Ratten

supplementiert mit verschiedenen VA-Dosierungen (Western-Blot). VA--Gruppe

R1-R6; Kontrollgruppe R7-R12; VA+-Gruppe R13-R18; Standard Humanserum

(Hu.s).

4.5.2 Retinol-Bindungsprotein im Blutserum und Harn von Frettchen

In allen Serumproben der Frettchen ist RBP (21 kDa) nachweisbar (Abb. 4.6). In Harnproben

von Frettchen ist RBP nicht zu detektieren.

4.6 Vitamin A und Tamm-Horsfall-Protein im Harn von Frettchen

Im Harn der Kontrollgruppe liegt VA ausschließlich als Retinol vor. In der VA+-Gruppe

herrscht erstaunlicherweise der Retinylester-Anteil mit 91 % der Gesamtkonzentration an

VA vor, in denen wiederum das Retinylstearat mit 90 % dominiert (Tab. 4.9). Die Detektion

von THP im Harn von Frettchen erfolgte nach Trennung durch 12 % SDS-PAGE und

Western-Blot. Als Standardprobe wurde THP-Standard (500 ng) verwendet. THP ist im

Harn aller Diätgruppen mit einem Molekulargewicht von 100 kDa feststellbar (Abb.4.5).

Weitere Proteinbanden, die bis jetzt nicht beschrieben wurden, sind im Molekulargewichts-

bereich von 45-31 kDa nachweisbar.

53 Ergebnisse

Abb. 4.4 Immunologische Detektion von RBP im Serum von Frettchen gefüttert mit

unterschiedlichen Vitamin-A-Diäten. Kontrollgruppe: F1-F4; FK

(Kontrollgruppe); VA+-Gruppe: F5-F8; FVA (VA+-Gruppe).

Tab. 4.9 Vitamin-A-Gehalt im Harn von Frettchen [µg/ml , ± SD (Prozente)].

Gruppe N Vitamin A Retinol Retinyl-

oleat Retinyl-

palmitat Retinyl-

stearat Σ Retinyl-

ester K 4 0,26 ± 0,07 0,26 ± 0,07

(100)

nd nd nd nd

VA+ 4 26,1 ± 11,8 2,18 ± 0,62

(9,18 ± 11,8)

0,06 ± 0,06

(0,30 ± 0,31)

0,03 ± 0,02

(0,12 ± 0,02)

23,8 ± 11,8

(90,4 ± 4,15)

24,0 ± 11,8

(90,8 ± 4,08)

Abb. 4.5 Immunlogische Detektion von THP bei 100 kDa im Harn von Frettchen mit

unterschiedlicher Vitamin-A-Supplementation (Western-Bot).

F1-F2=VA+-Gruppe; F3-F4-F5=Kontrollgruppe; Std=Standard.

Ergebnisse 54

4.7 Immunhistologischer Nachweis von Retinol-Bindungsprotein, Megalin und

Tamm-Horsfall-Protein in Leber und Niere von Ratten und Frettchen

4.7.1 Immunhistologischer Nachweis von Retinol-Bindungsprotein in Leber und Niere


4.7.1.1 Retinol-Bindungsprotein in Leber und Nieren von Ratten

Eine positive Immunreaktion für RBP wurde in allen histologischen Proben beobachtet. In der

Leber befindet sich das RBP diffus intrazytoplasmatisch in den Hepatozyten verteilt. Die RBP-

Reaktion ist zentrolobulär intensiver als peripher. Die VA--Gruppe zeigt eine stärkere

Immunreaktion als die zwei anderen Versuchsgruppen (Anhang, Abb. 10.1 A, B, C).

In den Nieren aller Versuchsgruppen ist eine positive Reaktion für RBP in den

Nephronabschnitten der Nierenrinde zu erkennen. Dort zeigten die Epithelzellen der proximalen

gewundenen Tubulusabschnitte bräunliche granuläre Färbungen im Zytoplasma, die als positive

RBP-Reaktion gewertet wurden. Die Reaktion ist deutlich im apikalen Zellbereich lokalisiert.

Die einzelnen Tubulusabschnitte enthalten eine ungleichmäßige RBP-Verteilung. Die Intensität

der Färbung variiert von einem zum anderen Tubulusabschnitt. In den anderen Teilabschnitten

des Nephrons wie glomerulären Strukturen, Epithelien der Henle Schleife, distalen Tubuli und

Sammelrohre wurde keine positive Immunreaktion für RBP nachgewiesen. (Anhang, Abb. 10.2

A, B, C ).

4.7.1.2 Retinol-Bindungsprotein in Leber und Nieren von Frettchen

In der Leber von Frettchen der beiden Gruppen war eine positive RBP-Reaktion sichtbar. Das

RBP befand sich diffus intrazytoplasmatisch in den Hepatozyten. Die RBP-Verteilung war nicht

uniform und reagierte zentrolobulär intensiver als peripher. Die Kontrollgruppe zeigte eine

stärkere Immunreaktion für RBP als die VA+-Gruppe (Anhang, Abb. 10.3 A, B).

Die Nieren von Frettchen zeigten eine positive RBP-Reaktion mit unterschiedlicher Intensität

der Färbung in den Nephronabschnitten, die in der Nierenrinde lokalisiert sind. Die Ephitelzellen

der proximal gewundenen Tubuli sprachen auf die Färbung an. In diesem Abschnitt verteilte sich

das RBP gleichmäßig im Zytoplasma. Die Schnitte in der VA+-Gruppe reagierten intensiver

(Anhang, Abb. 10.4 A, B).

55 Ergebnisse

4.7.2 Immunhistologischer Nachweis von Megalin in Leber und Nieren von Ratten und

Frettchen

4.7.2.1 Megalin in Leber und Nieren von Ratten

Eine positive Reaktion für Megalin in der Leber von Ratten wurde in dem interstitiellen Raum

zwischen den Parenchymzellen beobachtet. Die Megalin-Reaktion ist peripherolobulär intensiver

als zentrolobulär (Anhang, Abb. 10.5 A).

In den Nieren färbten sich die proximal gewundenen Tubuli der Nierenrinde. Die Megalin-

Verteilung beschränkt sich auf die Brush-border-Membran der proximalen Tubuluszellen.

Zwischen den Fütterungsgruppen wurde kein Unterschied in der Verteilung und in der Intensität

der Immunfärbung beobachtet (Anhang, Abb. 10.5 B).

4.7.2.2 Megalin in Leber und Nieren von Frettchen

Eine positive Megalin-Reaktion ist in der Leber von Frettchen nachweisbar. Diese Megalin-

Reaktion war unabhängig von der VA-Versorgung (Anhang, Abb. 10.6 A). Die Nieren der

beiden Versuchsgruppen zeigten eine positive Immunfärbung für Megalin. Die Megalin-

Reaktion ist in den proximal gewundenen Tubuli der Nierenrinde lokalisiert. Die Immunreaktion

ist auf die apikale Zellmembran beschränkt und hat eine uniforme Verteilung (Anhang, Abb.

10.6 B).

4.7.3 Immunhistologischer Nachweis von Tamm-Horsfall-Protein in Leber und Nieren

von Ratten und Frettchen.

4.7.3.1 Tamm-Horsfall-Protein in Leber und Nieren von Ratten

In allen immunhistochemisch untersuchten Leberproben von Ratten konnte kein

immunreaktives THP nachgewiesen werden. In den Nieren von Ratten ist eine positive

Immunreaktion für THP in den distalen Tubuli und in den dicken aufsteigenden

Schleifenschenkel (Henle-Schleife) zu beobachten. Die Reaktion ist an der apikalen

Plasmamembran stärker ausgeprägt als basolateral und intrazytoplasmatisch. Die THP-

Reaktion zeigte keine Unterschiede in der Intensität zwischen den Fütterungsgruppen

(Anhang, Abb. 10.7 A).

Ergebnisse 56

4.7.3.2 Tamm-Horsfall-Protein in Leber und Nieren von Frettchen

Beim Frettchen wird analog zu den Ratten kein immunreaktives THP in der Leber

nachgewiesen.

Eine positive Immunfärbung für THP in den Nieren von Frettchen ist diffus intrazytoplasmatisch

im dicken aufsteigenden Abschnitt der Henle-Schleife sowie in den distalen Tubuli lokalisiert.

Die THP-Reaktion ist an der apikalen Seite der Epithelzellen stärker ausgeprägt. Zwischen den

VA-Diäten war kein Unterschied in der Intensität der Reaktion zu beobachten (Anhang, Abb.

10.7 B).

4.8 Immunhistologischer Nachweis der Intermediärfilamente Desmin,

Glattmuskulatur-α-Actin und Vimentin in Leber und Nieren von Ratten und

Frettchen

4.8.1 Immunhistologischer Nachweis von Desmin in Leber und Nieren von Ratten und

Frettchen

4.8.1.1 Desmin in Leber und Nieren von Ratten

Desmin befindet sich in der Leber von Ratten in den Muskelfasern der A. hepatica, die mit der V.

portae und dem Gallengang eine portale Trias bildet sowie in den Muskelfasern der V. centralis

und V. sublobularis (Anhang, Abb. 10.9 A). Eine positive Reaktion für Desmin ist auch im

perisinusoidalen Raum zwischen den Hepatozyten zu sehen. Diese desmin-positiven Zellen sind

vorwiegend in der perizentralen Zone und um die portale Trias lokalisiert.

Die Anzahl von desmin-positiven Zellen, die in den Leberabschnitten von allen Diätgruppen zu

sehen sind, ist klein. Trotzdem sind in der VA+-Gruppe eine erhöhte Anzahl sowie Größe an

desmin-reaktiven Zellen als in den anderen zwei Gruppen zu beobachten (Anhang,

Abb. 10.8 A, B, C).

Die Immunfärbung für Desmin in den Nieren von Ratten aller Gruppen reagierten in den

Podozyten des Glomerulus, Fasern der Gefäßmuskulatur der renalen Arteriolen (Anhang, Abb.

10.9 B) und in Zellen im Interstitium um die Sammelrohre (Außenzone) im Nierenmark

(Anhang, Abb. 10.9 C).

57 Ergebnisse

Die Zellen im Interstitium der Nierenrinde zeigen keine Desmin-Reaktion.

4.8.1.2 Desmin in der Leber und in den Nieren von Frettchen

In der Leber von Frettchen reagierten die Muskelfasern der V. centralis und des Blutgefäße in

der portalen Trias (V. portae und A. hepatica) auf die Desminfärbung. Im perisinusoidalen Raum

sind desmin-positive Zellen deutlich zu identifizieren (Anhang, Abb. 10.10 A, B, C). Eine große

Anzahl an desmin-positiven Zellen sind im periportalen Raum zu lokalisieren. Die Quantität und

Größe der desmin-positiven Zellen unterscheiden sich nicht zwischen den Diätgruppen (Anhang,

Abb. 10.10 A, B).

Desmin in den Nieren von Frettchen war in der muskulären Schicht der Blutgefäße

immunologisch nachweisbar. Desmin-positive Zellen im Interstitium wurden nur in Nierenmark

um die Sammelrohre (Außenzone) identifiziert (Anhang, Abb. 10.11).

4.8.2 Immunhistologischer Nachweis von Glattmuskulatur-α-Actin in Leber und Nieren


4.8.2.1 Glattmuskulatur-α-Actin in Leber und Nieren von Ratten

Die Lokalisierung des Glattmuskulatur-α-Actins in der Leber von Ratten beschränkt sich auf die

muskuläre Schicht in den V. centralis und in den A. hepatica der portalen Trias

(Anhang, Abb. 10.12 A). Im Interstitium wurde keine positive Glattmuskulatur-α-Actin-

Reaktion beobachtet.

Glattmuskulatur-α-Actin reagierte in der Nierenrinde von Ratten in den Blutgefäßwänden

(Arteria und arteriola renalis), in Zellen zwischen Glomeruli und proximalen Tubuli (Anhang,

Abb. 10.12 B). Im Nierenmark sind Glattmuskulatur-α-Actin–positive Zellen um die

Sammelrohre zu identifizieren (Anhang, Abb. 10.12 C).

In der Leber und Niere von Ratten bestehen zwischen den Diätgruppen keine relevanten

Unterschiede in der Intensität der Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion.

Ergebnisse 58

4.8.2.2 Glattmuskulatur-α-Actin in Leber und Nieren von Frettchen

Eine positive Immunreaktion für Glattmuskulatur-α-Actin in der Leber ist grundsätzlich in den

Muskelfasern der Wand von Blutgefäßen, die um den portale Trias lokalisiert sind und in der

V. centralis nachweisbar (Anhang, Abb. 10.13). Im Interstitium wurde keine Immunfärbung für

Glattmuskulatur-α-Actin beobachtet. Unterschiede in der Farbintensität zwischen den

Diätgruppen waren nicht feststellbar.

Die Nieren der Frettchen zeigen eine positive Immunfärbung für Glattmuskulatur-α-Actin die

Muskelfasern der Blutgefäße, peritubuläre und periglomeruläre Zellen im Interstitium der

Nierenrinde (Anhang, Abb. 10.14 A, B) sowie im Nierenmark (Innenstreifen) (Anhang, Abb.

10.14 C). Die VA+-Gruppe könnte eine größere Anzahl von Zellen im Interstitium der

Nierenrinde als die K-Gruppe beobachten.

4.8.3 Immunhistologischer Nachweis von Vimentin in Leber und Nieren von Ratten und

Frettchen

4.8.3.1 Vimentin in Leber und Nieren von Ratten

Vimentin in der Leber von Ratten ist in den Endothelzellen der Blutgefäße und in Zellen des

Interstitiums lokalisiert. Die Anzahl von Vimentin-positiven Zellen im Interstitium ist begrenzt,

aber es kann ein Unterschied zwischen dem Fütterungsgruppen beobachtet werden. Die

Vimentin-positiven Zellen in der VA+-Gruppe zeigen ein vergrößertes Zytoplasma im Vergleich

zu den Vimentin-reaktiven-Zellen der K-Gruppe und VA--Gruppe (Anhang, Abb. 10.15 A, B,

C).

In den Nieren von Ratten war eine Immunreaktion für Vimentin in den Podozyten des

Glomerulus sowie in der Gefäßmuskulatur erkennbar (Anhang, Abb. 10.16 A). In Nierenmark

befindet sich eine positive Vimentin-Reaktion in den Zellen um die Sammelrohre (Anhang, Abb.

10.16 B). Im interstitiellen Raum der Nierenrinde wurde keine Immunreaktion beobachtet.

4.8.3.2 Vimentin in Leber und Nieren von Frettchen

In der Frettchenleber reagierten Endothelzellen der Blutgefäße und in Zellen des Interstitium

positiv auf Vimentin. Im Interstitium ist eine hohe Quantität an Vimentin-positiven-Zellen zu

sehen, die im periportalen und perizentralen Raum ausgeprägt sind.

59 Ergebnisse

Eine Veränderung der Morphologie und Zahl von diesen Zellen in der VA+-Gruppe ist sichtbar

(Anhang, Abb. 10.17 A, B).

In den Nieren von Frettchen ist eine Vimentin-Reaktion im Glomerulus (Podozyten und

Mesangiumzellen), Endothelzellen der Blutgefäße, Epithelialzellen der gewundenen proximalen

Tubuli (basale Zone) und interstitiellen Zellen in Nierenrinde (Anhang, Abb. 10.18 A) sowie

Nierenmark (Innenstreifen) nachweisbar (Anhang, Abb. 10.18 B). Die verschiedenen

Diätgruppen weisen keinen Unterschied in der Farbintensität oder in der Morphologie der

Vimentin-positiven Zellen auf.

Diskussion 60

5 DISKUSSION

5.1 Ziel der Arbeit

Die meisten der heute bekannten Erkenntnisse auf dem Gebiet der Physiologie wurden mit Hilfe

von Tierversuchen gewonnen. In den Versuchen dient das Tier als Stellvertreter für den

Menschen. Die Übertragbarkeit der Ergebnisse von Tierversuchen hängt aber von der Wahl

eines geeigneten Tiermodelles ab. Vergleichende Studien über physiologische Besonderheiten

von Tiermodellen mit dem Menschen oder anderen Tierarten sind deshalb für die Wahl des

geeigneten Versuchtiers nicht nur wertvoll, sondern unabdingbar.

Die vorliegende Studie wurde zur vergleichenden Darstellung ausgewählter Parameter des VA-

Stoffwechsels zwischen den Spezies Ratte und Frettchen durchgeführt. Beide Spezies wurden

ausgewählt, da sie als Modelltier für den Menschen eingesetzt werden, sich aber in den

grundlegenden Mechanismen des VA-Transportes im Blut unterscheiden. Die Untersuchungen

beinhalteten die Bestimmung folgender Parameter: VA-Transport im Blut, Verteilung von VA

und VA-Bindungsproteinen in der Leber und in den Nieren sowie die Ausscheidung von VA mit

dem Harn. Einen weiteren Schwerpunkt bildete die Betrachtung spezieller VA-Speicherzellen,

den Ito-Zellen, in der Leber und in den Nieren. Hierzu wurde mittels immunhistologischer

Verfahren der Nachweis von Intermediärfilamenten als Markerproteine etabliert. Die

Untersuchungen stellen deshalb einen weiteren Beitrag zur Erforschung des Carotinoid- und

VA-Metabolismus von Ratten und Frettchen dar, die bei der künftigen Auswahl dieser

Tiermodelle hilfreich sein können.

5.2 Vitamin-A-Konzentration im Blutserum

Die Ergebnisse zum VA-Gehalt im Blutserum von Ratten zeigen, dass die Retinolkonzentration

innerhalb der in der Literatur angegebenen homöostatischen Konzentration von 0,3-0,4 µg/ml

lag. Solche Ratten besitzen durchschnittlich 20-60 µg/g VA in der Leber (SMITH u.

GOODMAN 1976; LOERCH et al. 1979).

Im Serum sind Retinylester sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der VA-defizitären Gruppe

nur in Spuren nachweisbar, in der VA-hochdosierten Gruppe jedoch wesentlich erhöht. Die

Ratten der VA+-Gruppe, in der die VA-Konzentration der Leber bei durchschnittlich 2410 µg/g

lag, weisen daher eine Erhöhung der Gesamt-VA-Konzentration im Serum auf. Dieser Anstieg

ist auf eine Erhöhung des Retinylester-Anteils zurückzuführen (ca. 17 % der

61 Diskussion

Gesamtkonzentration an VA, vorwiegend Retinylpalmitat). Eine Zunahme der Retinylester im

Blut um 20 % wird bei Ratten als Anzeichnen einer bestehenden Hypervitaminose A gewertet

(MALLIA et al. 1975) und für Symptome einer VA-Intoxikation verantwortlich gemacht

(SMITH u. GOODMAN 1976). Obwohl zwischen den verschiedenen Fütterungsgruppen große

Unterschiede in der VA-Konzentration der Leber nachweisbar waren, lag die Retinol-

Konzentration im homöostatischen Bereich. Dies kann mit dem Nachweis von RBP im Blut

erklärt werden, da durch die 1:1 molare Bindung von Retinol an RBP die Serum-Retinol-

Homöostase aufrechterhalten wird. Diese Regulation ist unabhängig von der VA-Zufuhr über die

Nahrung und den VA-Speichern in der Leber und garantiert damit die konstante und

kontinuierliche Versorgung der peripheren Gewebe mit Retinol (GOODMAN 1984b; BLANER

1989).

In Frettchen lagen die Retinol-Konzentrationen im Blutserum mit durchschnittlich

0,39 µg/ml in der Kontrollgruppe bzw. mit 0,44 µg/ml in VA-supplementierten-Gruppe auf etwa

gleichem Niveau und sind mit denen von Ratten vergleichbar. Jedoch dominieren bei den

Frettchen die Serum-Retinylester. Diese Besonderheit kommt physiologischerweise bei anderen

Fleischfressern und bei den Frettchen vor (SCHWEIGERT et al. 1990a; RIBAYA-MERCADO

et al. 1994; RAILA et al. 2000). Die Dominanz des Retinylstearats über Retinylpalmitat, wie

mehrmals für andere Fleischfresser beschrieben wurde, konnte bei den Frettchen der

Kontrollgruppe und der VA+-Gruppe bestätigt werden (SCHWEIGERT et al., 1990a; RIBAYA-

MERCADO et al., 1994). Der zunehmende Anteil an Retinylestern in den VA supplementierten-

Gruppen von Ratten und Frettchen steht im engen Zusammenhang mit der VA-Zufuhr über das

Futter (SCHWEIGERT 1998; SCHWEIGERT u. BOK 2000).

5.3 Vitamin-A-Gehalt in der Leber und Niere

Die Leber spielt eine zentrale Rolle in der Aufnahme, Speicherung und Mobilisierung von VA

im Organismus (BLOMHOFF et al. 1992). Beim Menschen liegt etwa 80-95 % des

gespeicherten VA in der Leber in Form von Retinylestern und davon 60 % als Retinylpalmitat

vor (OLSON 1984; SPORN et al. 1984; BLOMHOFF et al. 1992). In den Lebern aller

Fütterungsgruppen sowohl von Ratten als auch von Frettchen werden hohe VA-Konzentrationen

ermittelt. Beim Menschen enthält die Leber durchschnittlich 149 µg/g VA (RAICA et al. 1972).

Die VA-Konzentrationen in der Leber von Frettchen liegen nach Literaturangaben 9 bis 40 mal

höher als beim Menschen (RAICA et al. 1972). In dieser Studie liegt der VA-Gehalt in der Leber

von Frettchen der Kontrollgruppe mit durchschnittlich 158 µg/g auf gleichem Niveau mit dem

Diskussion 62

des Menschen. Dagegen enthält die Leber von Frettchen der VA-supplementierten-Gruppe mit

durchschnittlich 245 µg VA/g erwartungsgemäß mehr VA als die Leber des Menschen

(BERNSTEIN 1984). In Studien mit anderen Fleischfressern wurden unterschiedliche VA-

Konzentrationen in der Leber nachgewiesen. So besitzen Hunde durchschnittlich 1376 µg VA/g

Gewebe, während Marderhunde 67 µg/g und Silberfüchse nur 4,3 µg VA/g Leber aufweisen

(RAILA et al. 2000). Die VA-Konzentration in der Leber der Eisbären ist mit 8050 µg/g, wobei

98 % in Form von Retinylestern vorliegen, wesentlich höher als die anderer Tierarten (BALL et

al. 1986).

Die Leber-VA-Konzentration der Kontrollgruppe ist im Vergleich zur VA+-Gruppe der Ratte

signifikant niedriger. Dabei zeigte sich, dass bei einer erhöhten VA-Konzentration in der Leber

die VA-Konzentration im Serum ansteigt. Dieser Anstieg wird hauptsächlich durch

lipoproteingebundene Retinylester verursacht.

Die Frettchen der K-Gruppe besitzen ebenfalls einen großen Anteil an Retinylestern im

Blutserum. Sowohl bei Hunden, die hohe VA-Konzentrationen in der Leber aufweisen, als auch

bei Silberfüchsen, die niedrigere VA-Konzentrationen in der Leber besitzen, die beim Menschen

für einen VA-Mangel sprechen würden, können hohe Retinylester-Konzentrationen im Blut

nachgewiesen werden (RAILA u. SCHWEIGERT 2002). Diese Ergebnisse zeigen, dass der

erhöhte Retinylester-Anteil im Serum von Fleischfressern kein Symptom einer VA-Intoxikation

darstellt sondern auf bisher unbekannten Regulations-Mechanismen in der Speicherung und

Mobilisierung von VA hindeuten (WILSON et al. 1987; SCHWEIGERT u. BOK 2000; RAILA

u. SCHWEIGERT 2002).

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie bestätigen, dass VA in der Leber von Ratten und

Frettchen als Retinylester, vorwiegend in Form von Retinylpalmitat vorliegen. Die Retinol-

Konzentrationen in der Leber beider Spezies betragen nur 1 % bis 6 % der gesamten

VA-Konzentration und entsprechen den von BATRES et al. 1987 beschriebenen Werten sowohl

bei Hunden als auch bei Marderhunden.

Die Nieren der verschiedenen Diätgruppen von Ratten enthalten im Vergleich zur Leber etwa 20

bis 30fach geringere VA-Konzentrationen. Beim Menschen liegt der Wert ca. 200fach niedriger

(RAICA et al. 1972).Rattennieren enthalten durchschnittlich 2,5 µg/g VA (RAICA et al. 1972;

NAGY et al., 1997). Die ermittelten Werte in den Nieren von Ratten der K-Gruppe und VA+-

Gruppe liegen wesentlich über den beschriebenen Konzentrationen. Nur die Nieren in der VA--

63 Diskussion

Gruppe entsprechen mit 2,4 µg/g den Werten in der Literatur. Diese Ergebnisse zeigen, dass die

VA-Konzentration in den Nieren der Ratten von der VA-Supplementation über das Futter

beeinflusst wird.

In den Nieren der Frettchen ist die VA-Konzentration mit 3,7 µg/g in der K-Gruppe und

7,1 µg/g in der VA+-Gruppe etwa 30 bis 40fach niedriger als in der Leber, das zeigt aber, dass

die VA-Konzentration in den Nieren von der VA-Zufuhr über das Futter abhängig ist. Die VA-

Konzentrationen in den Nieren von anderen Fleischfressern z.B. von Hunden mit 200 µg/g,

Silberfüchsen mit 474 µg/g und Marderhunden mit 291 µg/g liegen über diesen Werten

(SCHWEIGERT u. THOMANN 1993; RAILA et al. 2000). In den Nieren der untersuchten

Ratten und Frettchen dominieren in allen Gruppen die Retinylester in Form von Retinylpalmitat.

5.4 RBP im Blut und Harn

Retinol wird im Serum an das in der Leber synthetisierte Retinol-Bindungsprotein (RBP) in

Form eines Komplexes aus Retinol-RBP-Transthyretin gebunden und transportiert (GOODMAN

1980; BLANER 1989). In diesem Versuch konnte das RBP im Blutserum aller

Fütterungsgruppen sowohl bei Ratten als auch in Frettchen nachgewiesen werden. Dies deutet

darauf hin, dass Frettchen, im Gegenteil zu den Ratten, neben dem spezifischen VA-Transport

durch das RBP auch einen physiologischen unspezifischen Lipoprotein-gebundenen VA-

Transport im Blutserum, besitzen. Diese Besonderheit wurde auch bei anderen Fleischfressern

wie Hunden, Silberfüchsen, Marderhunden und Katzen beobachtet und diskutiert (RAILA et al.

2000; RAILA et al. 2001).

Unter physiologischen Bedingungen werden bei Ratten keine fettlöslichen VA-Verbindungen

über den Harn eliminiert (SCHWEIGERT et al. 1991). Auch wurde bisher kein VA im Harn von

Nagetieren, Herbivoren und Omnivoren beobachtet (SCHWEIGERT u. ZUCKER 1991). Die

eigenen Ergebnisse betätigen, dass im Harn von Ratten kein Retinol an RBP gebunden

nachweisbar ist und dass sich die renale Ausscheidung von VA nicht durch die orale Zugabe von

VA induzieren lässt.

In einer Studie mit transgenen Megalin-defizienten-Mäusen wurden Harnanalysen mit Western

Blot und HPLC durchgeführt. Dabei wurde bei den Tieren Retinol und RBP im Harn

nachgewiesen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Abwesenheit von Megalin die Ausscheidung

von VA im Harn verursacht (CHRISTENSEN u. WILLNOW 1999). Die Ausscheidung von VA

über den Harn von Ratten und Mäusen ist somit als Resultat einer gestörten Interaktion zwischen

Diskussion 64

RBP und Megalin und nicht als Antwort einer VA Überversorgung zu werten.

Bei Menschen wird ein Verlust von RBP und Retinol über den Harn mit einer Störung der

renalen Tubulus-Funktion beschrieben (STEPHENSEN et al. 1994; TWYMAN et al. 2000). Bei

verschiedenen Infektionskrankheiten des Menschen konnte eine pathologische Retinol-

Ausscheidung beobachtet werden, wobei infolge febriler Proteinurie RBP zusammen mit Retinol

und anderen niedrigmolekularen Proteinen ausgeschieden wird (MITRA et al. 1998b;

STEPHENSEN 2000). Bei Patienten mit einer HIV-Infektion wurden auch erhöhte VA-

Konzentrationen im Harn festgestellt (JORDAO JUNIOR et al. 1998).

Bei Fleischfressern wurden lösliche VA-Verbindungen physiologischerweise im Harn von

Hunden, Silberfüchsen und Marderhunden nachgewiesen (SCHWEIGERT et al. 1991; RAILA

et al. 2000). Jedoch zeigen andere Fleischfresser, bei denen ein unspezifischer Transport von

lipoproteinengebundenem VA im Blutserum auch nachgewiesen wurde, wie Wildkatzen und

Nerze, kein VA im Harn (HEYWOOD 1967; SCHWEIGERT u. BOK 2000; RAILA u.

SCHWEIGERT 2002). In neuen Untersuchungen bei Hauskatzen wurde VA in

50 % der analysierten Harnproben nachgewiesen, deren Konzentrationen vergleichsweise

niedriger als bei Hunden und anderen Kaniden waren (RAILA u. SCHWEIGERT 2001).

Anhand der eigenen Untersuchungen konnte kein RBP im Harn von Frettchen nachgewiesen

werden.

Da die Frettchen unter physiologischen Bedingungen kein RBP mit dem Harn ausscheiden, kann

es als Trägerprotein für Retinol und Retinylester im Harn von Frettchen ausgeschlossen werden.

5.5 Vitamin-A-Konzentration in Lipoproteinen

Sowohl bei Ratten als auch beim Menschen werden erhöhte Konzentrationen von

lipoproteingebundenen Retinylestern (vorwiegend Retinylpalmitat) im Serum nur postprandial

oder im Zusammenhang mit der Symptomatik einer VA-Intoxikation beschrieben (MALLIA et

al. 1975; SMITH u. GOODMAN 1976).

In der VA+-Gruppe der Ratten konnten Retinylester in Form von Retinylpalmitat in der LDL-

Fraktion nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass die 65tägige VA-Zufuhr von 10.000 IE bei

Ratten zu einem Anstieg dieses klinisch-chemischen Markers einer Hypervitaminose A führt,

obwohl die Tiere keine klinischen Symptome einer VA-Intoxikation zeigten.

65 Diskussion

Dagegen werden bei Hunden, Füchsen und Marderhunden sowie anderen Fleischfressern die

Retinylester im Serum an alle drei Lipoproteinfraktionen (VLDL, LDL, HDL) gebunden

transportiert (WILSON et al. 1987; SCHWEIGERT et al. 1998). Das Frettchen scheint hierbei

eine Ausnahme darzustellen. So sind beim Frettchen der K-Gruppe die Retinylester nur in der

HDL-Fraktion nachweisbar. Eine mögliche Erklärung hierfür wäre die Hypothese von

RIBAYA-MERCADO et al. (1993), die besagt, dass die HDL-Moleküle nur eine begrenzte

Transportkapazität für Retinylester besitzen und erst, wenn deren Transportkapazität gesättigt

ist, Retinylester an LDL und VLDL gebunden transportiert werden. In den eigenen untersuchten

Frettchen der K-Gruppe scheint diese HDL-Transportkapazität nicht gesättigt zu sein, da in der

VLDL und LDL-Fraktion keine Retinylester nachweisbar waren. Unter hoher VA-Zufuhr

werden in der VA+-Gruppe dagegen die Retinylester an alle Lipoprotein-Fraktionen gebunden

transportiert. Dieses Ergebnis bestätigt damit die Hypothese, dass die Retinylester beim

Frettchen unter basaler VA-Zufuhr physiologischerweise an HDL gebunden werden.

5.6 Cholesterol-, Triglycerid- und Protein-Konzentration im Blut und in den

Lipoproteinen

Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Erhöhung der Triglycerid-Konzentration (P < 0,001) und

eine Abnahme der Cholesterol-Konzentration (P < 0,02) im Blutserum von Ratten der VA-

supplementierten-Gruppe (VA+). In der VA-defizitären-Gruppe (VA-) ist die Konzentration von

Triglyceriden und Cholesterol im Vergleich zur Kontrollgruppe (K) und VA+-Gruppe reduziert.

Die VA-abhängige Änderung des Triglycerides werden bereits in der Literatur beschrieben

(NIERENBERG 1991, SOLOMON 1980). So führt die Zufuhr von 100 µg/g Retinol-Äquivalen

über das Futter bei Ratten zu einer Zunahme der Triglycerid-Konzentration, die vorwiegend in

den VLDL zu finden sind. Das HDL-Cholesterol nimmt dagegen nach oraler VA-Applikation ab

(GERBER 1982; NIERENBERG et al. 1991).

Eine Abnahme der Triglycerid- und Protein-Konzentration im Blutserum von Frettchen konnte

auch in der vorliegenden Studie beobachtet werden, während die Gesamtcholesterol-

Konzentration zunimmt.

In beiden Frettchengruppen sind die höchsten Cholesterol-Konzentrationen in der HDL-Fraktion

zu finden, was den Ergebnissen beim Hund entspricht (CRYER 1978).

Beim Menschen ist dagegen die LDL-Fraktion der Lipoproteine die Haupttransportform von

Diskussion 66

Cholesterol im Serum (LEVY 1976).

5.7 Vitamin A und Tamm-Horsfall-Protein im Harn

Die Ausscheidung von VA im Harn von Menschen und Ratten ist bisher nur in Form von

wasserlöslichen VA-Metaboliten beschrieben (VARMA u. BEATON 1972 LAMBERT u. DE

LEENHEER 1985; SASS et al. 1995). Die Ausscheidung von VA konnte im Harn von Hunden,

Füchsen und Marderhunden sowohl in Form von Retinol als auch in Form von Retinylestern

festgestellt werden (RAILA et al. 2000). Dagegen wurde im Harn von Rindern, Schafen und

Ratten kein VA nachgewiesen (SCHWEIGERT et al. 1991; SCHWEIGERT u. THOMANN

1993).

Die VA-Ausscheidung im Harn zeigt, ähnlich wie die VA-Konzentration im Blut, eine gewisse

Abhängigkeit von der VA-Zufuhr über das Futter (SCHWEIGERT u. BOK 2000). Die eigenen

Untersuchungen bestätigen, dass die Frettchen, abhängig von ihrer VA-Versorgung über das

Futter, VA über den Harn eliminieren. Obwohl die Retinylester im Blut von Frettchen der K-

Gruppe dominieren, wird VA bei diesen Tieren ausschließlich in Form von Retinol

ausgeschieden. Die Werte für Retinylstearat bei Frettchen der beiden Gruppen lagen höher als

Retinylpalmitat im Blut. Dieses Verhältnis Retinylpalmitat/Retinylstearat wurde durch die VA-

Versorgung beeinflusst. In anderen Studien an Fleischfressern wird als mögliche Ursache der

Retinylstearat-Dominanz über Retinylpalmitat diskutiert, dass nicht nur der VA-Gehalt des

Futters, sondern auch die Zusammensetzung eine Rolle für die Retinylstearat-Konzentration im

Blut spielt (SCHWEIGERT et al. 1998). VA ist in Harn von Frettchen der VA+-Gruppe

vorwiegend in Form von Retinylestern (91 % Retinylstearat) nachweisbar. Es deutet darauf hin,

dass die VA-Ausscheidung im Harn von Frettchen auch von der aktuellen VA-Versorgung über

das Futter abhängig ist.

Neue Untersuchungen haben ergeben, dass die renale Ausscheidung von Retinol und

Retinylestern im Harn von Hunden zusammen mit dem THP erfolgt (SCHWEIGERT et al.

2002a).

In dieser Studie gelang die Isolierung und Charakterisierung des VA-Komplexes durch

präparative Ultrazentrifugation, native SDS-PAGE oder Gelpermeations-Chromatographie

(RAILA u. SCHWEIGERT 1999). Dabei wurde jeweils ein Protein mit einer Molmasse von

100 kDa isoliert, das durch massenspektrometrische Analyse (MALDI-TOF-MS) als THP

67 Diskussion

identifiziert wurde (PENNICA et al. 1987).

Zur Ausscheidung von VA wurde daraus eine These abgeleitet, in der aufgrund der THP-

Lokalisation an der basalen und apikalen Membran des TAL und der

Aminosäurensequenzähnlichkeiten zum LDL-Rezeptor eine LDL-Rezeptorfunktion möglich ist

(RAILA 2003). Die Retinol und Retinylester könnten daher vom Blut her in die Epithelzellen

des TAL durch das THP aufgenommen und ausgeschieden werden. Innerhalb der Ephitelzellen

könnte ein endosomaler Abbau mit einer VA-Speicherung oder ein gerichteter Transport zur

apikalen Membran (Transzytose) vorkommen (RAILA u. SCHWEIGERT 1999; RAILA 2003).

Dieser Mechanismus wird für andere Rezeptoren, die zur Familie von LDL-Rezeptoren gehören,

z.B. für Megalin in proximalen Tubuluszellen diskutiert (MARINO et al. 2001). Es wird aber

vermutet, dass eine Synthese und Abgabe von THP in den Epithelzellen des TAL unabhängig

von der VA-Versorgung vorkommt (RAILA et al. 2000). Im Harn von den untersuchten

Frettchen wurde THP nachgewiesen. Die Ausscheidung von VA beim Frettchen erfolgt daher

möglicherweise wie beim Hund in Assoziation an das THP. Um diese Hypothese zu bestätigen,

sind jedoch weitere Untersuchungen zur Isolierung und Charakterisierung des VA-Protein-

Komplexes aus dem Harn von Frettchen notwendig.

5.8 Immunhistologische Untersuchungen zum Nachweis von RBP, Megalin und

Tamm-Horsfall-Protein

RBP wird vorwiegend in den Hepatozyten synthetisiert (BLANER 1989). Die RBP-Sekretion

aus der Leber ist vom VA-Status des Organismus abhängig (SMITH et al. 1998b).

Im VA-Mangel kommt es zu einer Akkumulation von RBP im endoplasmatischen Retikulum der

Hepatozyten (GOODMAN 1980). Dadurch werden im VA-Mangel niedrigere Konzentrationen

an Retinol und RBP im Blutplasma beobachtet (MUTO et al. 1972; RITTER 1996). Die RBP-

Akkumulation in der Leber kann immunhistologisch durch eine verstärkte RBP-Färbung

nachgewiesen werden (KATO et al. 1984). Wenn der VA-Status durch orale oder intravenöse

Administration verbessert wird, wird Retinol als Retinol–RBP Komplex (holo-RBP) in das

Serum ausgeschleust. Die RBP-Immunoreaktivität der Leber nimmt dadurch ab (KATO et al.

1984).

In der vorliegenden Studie wurde die immunhistologische Verteilung von RBP in der Leber von

Ratten und Frettchen bei unterschiedlicher VA-Zufuhr über die Nahrung untersucht. Die RBP-

Diskussion 68

Reaktion befindet sich sowohl in Ratten als auch in Frettchen intrazytoplasmatisch in den

Parenchymzellen der Leber. Diese Ergebnisse bestätigen die vorhergehenden Studien bei Ratten

sowie bei verschiedenen Fleischfressern (KATO et al. 1984; RAILA et al. 2000; RAILA et al.

2001). Ratten und Frettchen, die keine oder eine basale VA-Versorgung erhielten, zeigten eine

intensivere RBP-Reaktion als die Tiere der VA-hochversorgten-Diätgruppen. Diese Ergebnisse

bestätigen damit andere Studien, in denen bei Ratten eine Erhöhung der RBP-Reaktion in den

VA-defizienten Lebern beobachtet wurde (GOODMAN 1984a) und erweitern diese allgemein

gültige Feststellung auch für Frettchen und damit möglicherweise für alle Fleischfresser.

Die Nieren besitzen eine wichtige Rolle im Katabolimus von RBP (GOODMAN 1984b). RBP,

welches nicht an Transthyretin gebunden ist (sog. freies RBP), wird glomerulär filtriert und im

proximalen Tubulus rückresorbiert (CHRISTENSEN et al. 1999). Bei Menschen und Ratten ist

RBP in den proximalen gewundenen Nierentubuli lokalisiert (KATO et al. 1982; KATO et al.

1984). In den Nieren von allen untersuchten Ratten und Frettchen konnte RBP ebenfalls

lokalisiert werden. Dabei zeigte sich in den proximalen gewundenen Tubuli eine positive RBP-

Reaktion. Die Intensität der RBP-Reaktion in den Nieren der VA--Gruppe der Ratten sowie die

Kontrollgruppe der Frettchen war geringer als die der VA+-Gruppen. Dieses Ergebnis kann

damit erklärt werden, dass die niedrige Verfügbarkeit von Retinol während der defizitären VA-

Versorgung die Ausschleusung von RBP aus der Leber beeinflusst und möglicherweise dadurch

die Menge an RBP, die in den Niere filtriert wird und rückresorbiert werden kann, auch

erniedrigt ist.

Megalin ist ein Rezeptor, der für die tubuläre Reabsorption von RBP verantwortlich ist. Durch

die Funktion von Megalin wird ein Verlust von RBP und Retinol über den Harn verhindert

(CHRISTENSEN et al. 1999; RAILA 2003). Nach der endozytotischen Aufnahme (Chlatrin-

vermittelt) unterliegt das aufgenommene RBP in der proximalen Tubuluszelle in den Lysosomen

seinem weiteren Abbau (RAILA u. SCHWEIGERT 2001). Danach kann sich Retinol mit dem

neuen synthetisierten RBP verbinden und wieder ins Blutplasma transportiert werden

(CHRISTENSEN u. WILLNOW 1999). Bei diesem Mechanismus wird angenommen, dass das

RBP in den gleichen Zellen rückresorbiert und synthetisiert wird. RBP wird vorwiegend in den

ersten Segmenten des proximalen Tubulus nachgewiesen (S1- und S2-Segmente). Jedoch konnte

in anderer Untersuchung mittels in situ Hybridisierung RBP-mRNA nur im S3-Segment des

proximalen Tubulus nachgewiesen werden (MAKOVER et al. 1989). In den S1-Segmenten des

proximalen Tubulus von Mäusen war mittels Elektronenmikroskopie zusätzlich zu der

granulären RBP-Färbung von Endosomen und Lysosomen auch RBP-positive Golgi-Granula

69 Diskussion

nachweisbar, die eng an der basalen Membran lokalisiert sind, was wiederum für eine RBP-

Synthese in diesen Segmenten sprechen würde (CHRISTENSEN u. WILLNOW 1999). Die

genaue Erforschung dieser Unterschiede bleibt weiteren Studien vorbehalten.

In neueren Untersuchungen an Zelllinien wurde beobachtet, dass einige Megalin-Liganden

unberührt durch die Zellen durch Transzytose geschleust werden (MARINO et al. 2001).

Dadurch wurde eine neue Theorie zum Retinol-Recycling in der Niere aufgestellt: Retinol,

gebunden an RBP, wird nach glomerulärer Filtration durch Megalin vermittelte Endocytose in

den proximalen Tubulus aufgenommen.

Das aufgenommene RBP wird nicht zu den Lysosomen transportiert und abgebaut, sondern

durchquert die proximalen Tubuluszellen und wird basolateral an das Blutplasma abgegeben.

Gegen diese Theorie spricht aber, dass es sich bei Megalin um einen klassischen Endozytose-

Rezeptor aus der LDL-Rezeptor-Genfamile handelt, deren Liganden dem Abbau in Endosomen

und Lysosomen zugeführt werden (Prof. Thomas E. Willnow, Berlin, 2003).

In den Nieren von Ratten und Frettchen aller Fütterungsgruppen wurde eine positive Megalin-

Reaktion in den proximalen Tubuluszellen nachgewiesen. Daher ist wahrscheinlich, dass Ratten

und Frettchen RBP und damit Retinol aus dem Ultrafiltrat durch Megalin-vermittelte-

Endozytose resorbieren. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei Hunden beschrieben (RAILA u.

SCHWEIGERT 2001; RAILA 2003). In der VA-supplementierten-Gruppe der Frettchen wurde

eine Erhöhung der Intensität der Megalin-Reaktion beobachtet. Diese erhöhte Megalin-Reaktion

könnte das Ergebnis einer gesteigerten Retinol-RBP-Konzentration im Ultrafiltrat sein, ein

Zustand der zu einer Zunahme der Reabsorptionkapazität im proximalen Nierentubulus führt

(LIU et al. 1998).

Neben den Ephitelzellen des renalen proximalen Tubulus wird Megalin auch in verschiedenen

epithelialen Geweben wie Nebenhoden, Endometrium, Eileiter, Nebenschilddrüse, Lunge oder

Dottersack exprimiert (ZHENG et al. 1994). In den eigenen immunhistologischen

Untersuchungen an Ratten ist eine positive Megalin-Reaktion in Zellen des Disse´sches Raumes

zu beobachten. Diese Zellen konnten wegen ihrer Lokalisation innerhalb der hepatischen

Sinusoide und sternförmige Morphologie als Ito-Zellen identifiziert werden. Retinol wird zur

Langzeitspeicherung von den Parenchymzellen zu den Ito-Zellen transportiert (BLOMHOFF et

al. 1992). Für den Transport-Mechanismus werden zwei Hypothesen diskutiert: a) Die

Parenchymzellen sezernieren den Retinol-RBP-Komplex, der von den Ito-Zellen durch einen

Diskussion 70

RBP-Rezeptor aufgenommen wird, b) Der Retinol-CRBP-Komplex wird unmittelbar zu den Ito-

Zellen durch interzelluläre Verbindungen transportiert (Wake, 1980). Neuere Untersuchungen

bei Ratten unterstützen die Hypothese eines Rezeptor-vermittelten Transfers von RBP aus den

Parenchymzellen zu den Ito-Zellen der Leber (SENOO et al. 1993; SENOO et al. 1997). Studien

zeigen auch, dass Ito-Zellen RBP-mRNA enthalten. RBP in den Ito-Zellen könnte somit das

Produkt der Aufnahme und/oder der Synthese von RBP sein (ANDERSEN et al. 1992).

Die positive Megalin-Reaktion in den Ito-Zellen der Leber von Ratten könnte damit bedeuten,

dass Megalin möglicherweise eine Rolle in der Speicherung von VA in Leber spielt. Hierzu sind

jedoch weitere Untersuchungen notwendig.

Die Expression von THP befindet sich bei Menschen, Labortieren und Fleischfressern in den

Epithelzellen des dicken aufsteigenden Astes der Henle-Schleife (TAL) und im distalen Tubulus

(BACHMANN et al. 1990; RAILA 2003). Die vorliegenden Untersuchungen bestätigen diese

Studien. Die THP-Synthese-Aktivität ist nicht nur vom Mechanismus der Harn-Konzentrierung,

sondern auch von der Ion-Transport-Aktivität in den TAL unabhängig (RHODES et al. 1992).

Die VA-Ausscheidung im Harn von Hunden mit definierter VA-Versorgung über das Futter und

vergleichbarer VA-Konzentration im Plasma zeigte große individuelle Variabilitäten

(SCHWEIGERT u. BOK 2000). Ein statistisch gesicherter Zusammenhang zwischen der VA-

Zufuhr über das Futter und der THP-Ausscheidung im Harn besteht deshalb bei Hunden nicht

(RAILA et al. 2002). Bei Ratten zeigt die THP-Ausscheidung im Harn ebenso individuell

unterschiedliche Ausscheidungsraten (GOKHALE et al. 1997; GOKHALE et al. 2001). Die VA

unabhängige THP-Expression konnte in dieser Studie auch für das Frettchen nachgewiesen

werden.

5.9 Nachweis der Intermediärfilamente zur Charakterisierung von Ito-Zellen

Die Ito-Zellen sind durch die üblichen histologischen Präparationen (Hämatoxilin-Eosin-

Färbung) nicht leicht identifizierbar, weshalb für deren Nachweis spezifische Marker notwendig

sind (YOKOI et al. 1984; BUNIATIAN et al. 1996; NAGY et al. 1997). Die Expression von

Intermediärfilamenten wurde vorwiegend für die Lokalisation von Ito-Zellen in der Leber zum

Einsatz gebracht.

Mit Hilfe der IF-Expression können Ito-Zellen auch in anderen Organen zum Nachweis ihrer

Transformation in myofibroblastähnliche Zellen verwendet werden (OKABE et al. 1984; NAGY

et al. 1997; APTE et al. 1998a; GEERTS et al. 2001).

71 Diskussion

Im ruhenden Phänotyp, d.h. der Phänotyp, in denen die Ito-Zellen Lipidtröpfen enthalten, die

reich an VA sind und zudem eine niedrigere Entwicklung von Organellen sowie meist geringe

Proliferationrate aufweisen (HAUTEKEETE u. GEERTS 1997), liegen die Ito-Zellen im

Disse´schen Raum, gelegentlich zwischen zwei anliegenden Hepatozyten, aber auch in dem

Raum zwischen den Hepatozyten. Ihre Ausläufer umkleiden die endothelialen Röhren und

ermöglichen den Kontakt mit den Hepatozyten. Diese Ausläufer enthalten mehrere

Mikrofilamente, Intermediärfilamente und Mikrotubuli.

Die Cytoskelett-Proteine, die in diesen Ausläufern enthalten sind, schließen Desmin, Actin,

Vimentin, Tubulin, Myosin und das Glial-Fibrillare-Säure-Protein ein (YOKOI et al. 1984;

ENZAN et al. 1994; ZIMMERMANN et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurden drei

(Desmin, Actin und Vimentin) der genannten Cytoskelett-Proteine in der Leber und in den

Nieren von Ratten und Frettchen untersucht.

Ursprünglich wurde Desmin als ein spezifisches Muskelprotein betrachtet (LAZARIDES 1982).

Jedoch hat Desmin vielfältige Lokalisationen (GRANGER et al. 1979; YOKOI et al. 1984). In

der Leber ist Desmin in den Muskelfasern der Blutgefäße des portalen Trias lokalisiert

(LAZARIDES u. GRANGER 1982). Die eigenen immunhistologischen Untersuchungen für

Desmin in der Leber von Ratten und Frettchen bestätigen die positive Desmin-Reaktion in den

Muskelfasern dieser Blutgefäße. Desmin-reaktive-Zellen, die morphologische Eigenschaften der

Ito-Zellen aufweisen, sind sowohl in Ratten (ZIMMERMANN et al. 1999) als auch in Frettchen

(eigene Untersuchung) im perisinusoidalen Raum zu erkennen. Im Gegensatz dazu wurden in

der normalen Leber von Menschen keine desmin-positive Zellen in perisinusoidalen Raum

identifiziert (SCHMITT-GRAFF et al. 1991).

In den Ito-Zellen der Rattenleber wurde keine Glattmuskel-α-Actin-Expression nachgewiesen.

Jedoch ist eine Glattmuskel-α-Actin-Expression in geschädigter Leber zu beobachten. Aufgrund

dieser Untersuchungen wurde vorschlagen, dass die Glattmuskel-α-Actin-Expression von Ito-

Zellen mit der Transformation zum aktivierten Phänotyp zusammenhängt (ROCKEY et al.

1992). Dagegen konnte in einer Studie von (HAUTEKEETE et al. 1997) eine Glattmuskel-α-

Actin-Expression in Ito-Zellen der normalen Leber von Menschen beobachtet werden.

Der aktivierte Phänotyp von Ito-Zellen der Leber wurde auch bei einer Vitamin-A-Intoxikation

nachgewiesen (HAUTEKEETE u. GEERTS 1997).

Der Grad der Schädigung der Leber während einer VA-Intoxikation wechselt von Hyperplasie

und Hypertrophe bis hin zur Zirrhose und ist letztendlich graduell abhängig von der

Diskussion 72

Akkumulation an VA (MATHEW et al. 1996). In den vorliegenden Untersuchungen ist keine

Gattmuskel-α-Actin Actin-Expression in Interstitialzellen der Leber von Ratten und Frettchen

der verschiedenen Fütterungsgruppen nachzuweisen. Obwohl bei Ratten der VA+-Gruppe

Symptome einer Hypervitaminose A vorhanden waren, wurde keine Gattmuskel-α-Actin-

Expression in Interstitialzellen beobachtet.

Es kann deshalb angenommen werden, dass die Ito-Zellen in den untersuchten Organen im

ruhenden Phänotyp vorliegen, und dass die vorhandene Hypervitaminose A der VA+-Gruppe der

Ratten sich im frühen Stadium befand (Tab. 5.1).

Vimentin kann in Ito-Zellen der Leber festgestellt werden, aber seine Expression wurde auch in

anderen Nichtparenchymzellen, wie Kupfferzellen und Endothelzellen nachgewiesen

(RAMADORI et al. 1990). Ito-Zellen im ruhenden Phänotyp von Menschen und Mäusen

enthalten eine Vimentin-Expression. Unter pathologischen Zuständen wird eine Interaktion

zwischen Desmin und Vimentin diskutiert, z.B. bei chronischen Lebererkrankungen und

Tumoren (GEERTS et al. 2001). In Frettchen und Ratten wurde eine positive Vimentin-Reaktion

in Zellen bestätigt, die in den Lipidtröpfchen des Zytoplasmas zu sehen sind.

Tab. 5.1 Expression von Intermediärfilamenten (IF) in den Ito-Zellen

(ruhender Phänotyp) der Leber

Ratte Mensch Frettchen IF Ito-Zellen Ito-Zellen Ito-Zellen

Desmin + - +

Vimentin* + + +

α-SMA - + -

*Kupffer-Zellen und endotheliale Zellen können auch Vimentin exprimieren (HAUTEKEETE u.

GEERTS 1997).

In neueren Untersuchungen zur Niere von NAGY et al. (1997) wurden Ito-Zellen im Interstitium

der Nierenrinde von Ratten identifiziert. In dieser Studie konnte durch eine Erhöhung der VA-

Zufuhr eine Zunahme in Anzahl und Größe von VA-haltigen-Lipidtröpfchen innerhalb der Ito-

Zellen festgestellt werden. Die Verteilung von VA in der Niere ist speziesspezifisch. Bei Hunden

wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie VA in den proximalen gewundenen Tubuli sowie in der

Henleschen Schleifen der Niere lokalisiert (POPPER u. GREENBERG 1941; POPPER 1944).

Im Gegensatz dazu wurde bei Menschen keine VA-Fluoreszenz in der Niere beobachtet

(POPPER u. GREENBERG 1941). Der fluoreszenzmikroskopische Nachweis von VA beim

73 Diskussion

Menschen im proximalen Tubulus gelingt nur beim Vorliegen einer Nephropathie. Bei

Fleischfressern wird VA vorwiegend in der Nierenrinde gespeichert (RAILA et al. 2000). VA

konnte in den Nieren von Ratten nur bei einer Hypervitaminose A nachgewiesen werden

(PLOPPER et al. 1977).

Die Anwendung der Intermediärfilamente-Expression als Marker zur Lokalisation und

Charakterisierung von Ito-Zellen in den Nieren ist bisher nicht beschrieben worden. Bisher

wurden Intermediärfilamente nur für die immunhistologische Charakterisierung von

Nephropathien verwendet (MUCHANETA-KUBARA u. EL NAHAS 1997; NAKATSUJI et al.

1998). Desmin wurde in den Nieren von Ratten in Epithelialzellen der Glomeruli beschrieben

(MUCHANETA-KUBARA u. EL NAHAS 1997). In der vorliegenden Arbeit werden weder bei

Ratten noch bei Frettchen in den verschiedenen Fütterungsgruppen desmin-positive Zellen im

Interstitium der Nierenrinde beobachtet, jedoch konnten im Nierenmark sowohl bei Ratten als

auch bei Frettchen desmin-positive Zellen lokalisiert werden. Die interstitialen Zellen, die im

Nierenmark lokalisiert sind, wurden als „lipid-loaden interstitial cells “ mit den physischen

Eigenschaften der Ito-Zellen beschrieben (LEMLEY u. KRIZ 1991). Darüber hinaus wäre es

möglich, dass die genannten Zellen eine Rolle in der Speicherung und/oder Ausscheidung von

VA beim Fleischfresser übernehmen.

Die Expression von Glattmuskel-α-Actin wurde bisher in renalen Arterien und Arteriolen

detektiert (MUCHANETA-KUBARA u. EL NAHAS 1997). Die interstitiellen Zellen in der

Rinde von normalen Nieren erwachsener Menschen zeigten eine positive Actin- aber keine

Desmin-Reaktion (ALPERS et al. 1994). Eine Immunreaktion für Glattmuskel-α-Actin wurde

auch in Ratten und Frettchen in Interstitialzellen der Nierenrinde beobachtet. Bei Frettchen und

Ratten sind auch Glattmuskel-α-Actin positive Zellen im Nierenmark zu beobachten. Diese

Glattmuskel-α-Actin-positiven Zellen zeigen eine Änderung in ihrer Anzahl und Größe in der

VA-supplemtierten-Gruppe der Frettchen. Die positive Glattmuskel-α-Actin-Expression könnte

in interstitialen Zellen der Nierenrinde bei Ratten gemäß der Literatur als Zeichen von einer Ito-

Zellen-Transformation in myofibroblastähnlichen Zellen hindeuten, wobei eine positive

Glattmuskel-α-Actin-Expression in interstitiellen Zellen der Nierenrinde in allen

Fütterungsgruppen der Ratten zu beobachten ist. Bei Frettchen gibt es bisher kein Anhaltspunkt

über die Intermediärfilament-Expression in Ito-Zellen und/oder myofibroblast-ähnlichen Zellen.

Die eigenen histologischen Untersuchungen weisen die Anwesenheit von Ito-Zellen im

Nierenmark nach, in denen eine positive Desmin- und Glattmuskel-α-Actin-Expression

nachgewiesen wurde. Diese Ito-Zellen zeigen Änderungen in Quantität und Größe der in ihrem

Diskussion 74

Zytoplasma enthaltenden Lipidtröpfen, welche von der VA-Versorgung abhängig sind.

Eine Vimentin-Expression wurde in den Nieren in Epithelialzellen und Mesangiumzellen des

Glomerulus sowie in Gefäßen nachgewiesen. Die Vimentin-Expression in Epithelialzellen der

renalen Tubuli ist als Marker für den Nachweis zellulärer Proliferation und Differenzierung

geeignet (NAKATSUJI et al. 1998). In eigenen Untersuchungen wurden bei Ratten Vimentin-

positive Zellen nur im Interstitiellen Raum im Nierenmark beobachtet. Bei Frettchen wurde eine

Vimentin-Reaktion in Interstitialzellen der Nierenrinde und im Nierenmark festgestellt (Tab.5.2).

Darüber hinaus ist ein Zusammenhang zwischen dem vorhandenen VA im Organismus und den

Vimentin-positiven-Zellen im Interstitium der Nieren von Frettchen nicht auszuschließen.

Tab. 5.2 Expression von Intermediärfilamenten in myofibroblastähnlichen Zellen der

Niere

Ratten Human* Frettchen IF

Nierenrinde / Nierenmark Nierenrinde / Nierenmark Nierenrinde / Nierenmark

Desmin - / + - / - - / +

Vimentin - / + - / - + / +

α- SMA + /+ + / ? + / +

*HAUTEKEETE u. GEERTS (1997)

KAISSLING u. LE HIR (1994) beschreiben zwei Typen von Interstitialzellen, die sich in der

Nierenrinde und im Nierenmark von Nagetieren befinden. Typ-1-Zellen wurden wegen ihres

sternförmigen Zytoplasmas mit langen Processus als myofibroblast-ähnliche Zellen benannt.

Diese Zellen haben eine Stützfunktion und sind in der Lage, extrazelluläre Matrix zu

produzieren. Typ-1-Zellen sind im Nierenmark lokalisiert. Die Typ-2-Zellen besitzen eine ovale

Form und dünne zytoplasmatischer Processus. Typ-2-Zellen wurden auch als Mononukleärzellen

oder Histiocyten bezeichnet und in der Nierenrinde lokalisiert (KAISSLING u. LE HIR 1994).

In der vorliegenden Untersuchung wurden mittels immunhistologischem Nachweis von

Intermediärfilamenten myofibroblast-ähnliche Zellen sowohl in der Nierenrinde als auch im

Nierenmark bestimmt. Das Vorkommen von myofibroblastähnlichen Zellen, die als Ito-Zellen

eingestuft werden können, bestätigen die Funktion der Niere in der Vitamin-A-Speicherung

sowie in der Vitamin-A-Ausscheidung (Fleischfresser), obwohl weitere Untersuchungen

erforderlich sind, um die genauen Mechanismen zu entschlüsseln.

75 Schlussfolgerung

6 SCHLUSSFOLGERUNG

Die Untersuchungen der vorliegenden Studie haben gezeigt, dass die Frettchen im Gegensatz zu

Ratten unter basaler und hoher VA-Versorgungen über das Futter VA im Serum nicht nur in

Form von Retinol, sondern vorwiegend als Retinylester transportieren.

Die Konzentration an Retinylestern im Serum von Ratten und Frettchen ist abhängig von der

VA-Zufuhr über das Futter. Jedoch werden bei Ratten erhöhte Retinylester-Konzentrationen im

Blut nur im Zusammenhang mit einer VA-Intoxikation beobachtet. Die VA-Verteilung im

Serum zeigt bei Ratten der VA-supplementierten Gruppe eine erhöhte Retinylester-

Konzentration in Form von Retinylpalmitat (16 %) und Retinylstearat (2 %), was als Symptom

einer Hypervitaminose A zu werten ist. Dagegen konnte für Frettchen beider Gruppen

Retinylstearat als dominierende Retinylester-Fraktion festgestellt werden. Die unterschiedlichen

Anteile von Retinylpalmitat und Retinylstearat an der Gesamtretinylester-Konzentration bei

Ratte und Frettchen deuten daher auf speziesspezifische Besonderheiten im Vitamin-A-

Stoffwechsel hin. Bei Frettchen werden die Retinylester gebunden an Lipoproteine vorwiegend

in der HDL-Fraktion transportiert. Die erhöhten Retinylester-Konzentrationen im Serum von

Fleischfressern sind daher nicht als Symptom einer VA-Intoxikation zu werten.

Gemeinsamkeiten ergeben sich daraus, dass sowohl bei Ratten als auch bei Frettchen das

spezifische Retinol-Bindungsprotein durch immunologische Untersuchungen im Blutserum, in

der Leber und in den Nieren nachgewiesen wurde. Dies bedeutet, dass die Frettchen ebenso wie

die Ratten einen spezifischen VA-Transport durch das RBP besitzen. Die Frettchen zeigen in

dieser Hinsicht ähnliche Charakteristika im VA-Transport wie andere Fleischfresser. Nach den

dargestellten Untersuchungen sind die Frettchen als Modell für die Forschung des

unspezifischen VA-Transportes, auch aufgrund der Ausscheidung von VA mit dem Urin,

geeignet und könnten wegen ihren physiologischen Ähnlichkeiten mit Spezies-Verwandten als

alternatives Tiermodell für die Erforschung des VA-Stoffwechsels bei Fleischfressern dienen.

Außerdem eignen sich gezähmte Frettchen besonders wegen der einfachen Behandlung und

Haltung unter Laborbedingungen.

Die VA-Konzentration in der Leber und in den Nieren von Ratten und Frettchen ist von der VA-

Zufuhr über das Futter abhängig. Trotz der höheren Versorgung an VA zeigten die Frettchen der

VA-supplementierten-Gruppe etwa 100fach geringere VA-Konzentrationen in den Nieren als in

der Leber. Die Verteilungsmuster für RBP in der Leber und in den Nieren von Ratten und

Frettchen bei unterschiedlicher VA-Zufuhr sind vergleichbar. Das RBP befindet sich

intrazytoplasmatisch in den Parenchymzellen der Leber und in den proximalen gewundenen

Schlussfolgerung 76

Tubuli der Nieren. Jedoch ist eine Erhöhung der Intensität der RBP-Reaktion in der Leber der

VA-defizitären-Gruppe der Ratten bzw. Basalgruppe der Frettchen und eine verminderte RBP-

Reaktion in den Nieren der entsprechenden Gruppen zu beobachten. Dies könnte die Folge der

RBP-Akkumulation in den Hepatozyten aufgrund einer VA-Unterversorgung sein. Die geringe

Verfügbarkeit von Retinol beeinflusst die Ausschleusung von RBP aus der Leber ins Blut. Daher

wird eine niedrigere Menge an RBP in den Nieren filtriert und rückresorbiert, was zur

verminderten Immunreaktivität führt.

Die Reabsorption von RBP aus dem Ultrafiltrat der Nieren von Ratten und Frettchen wird

wahrscheinlich nach Bindung an den Megalinrezeptor durch Endozytose vermittelt. In beiden

Spezies wurde eine Megalin-Reaktion im Bereich der Brush-border-Membran der proximalen

Tubuluszellen bestätigt. Die Megalin-Reaktion scheint bei Ratten nicht durch die Verfügbarkeit

von VA beeinflusst zu werden. Bei den Frettchen der VA-supplementierten-Gruppe zeigte eine

intensivere Megalin-Reaktion, möglicherweise aufgrund einer VA-Überversorgung.

In der vorliegenden Studie wurden myofibroblastähnliche Zellen in den Nieren beobachtet.

Diese Zellen, die mit anderen Markern als Ito-Zellen charakterisiert wurden, zeigten eine

positive Megalin-Reaktion in der Leber sowohl im Frettchen als auch in den Ratten unabhängig

von der VA-Versorgung. Daher könnte Megalin eine mögliche Rolle in der Absorption,

Synthese und Sekretion von RBP in den Ito-Zellen der Leber spielen. Hierzu sind jedoch weitere

Untersuchungen notwendig, um die Beteiligung von Megalin in dem VA-Stoffwechsel in der

Leber zu erklären. Die renale Ausscheidung von VA von Fleischfressern stellt einen möglichen

Schutzmechanismus gegenüber einer VA-Intoxikation dar (RAILA u. SCHWEIGERT, 2001).

Die Frettchen sind im Gegensatz zu Ratten in der Lage, VA in Form von Retinol und

Retinylestern über den Harn zu eliminieren. Dies scheint von ihrer VA-Versorgung über das

Futter abhängig zu sein. Die VA-Ausscheidung in Frettchen erfolgt möglicherweise wie bei

anderen Fleischfressern an THP assoziiert, da das THP im Harn und in den Nieren von Frettchen

immunologisch detektiert werden konnte.

Neben der Leber spielen die Nieren eine wichtige Rolle beim VA-Stoffwechsel. Dabei konnte

die Identifikation und Lokalisation von Ito-Zellen in diesen Organen ein entscheidender

Schlüssel für die Aufklärung ihrer dortigen Funktion und der Beteiligung am VA-Stoffwechsel

finden. In vorliegender Studie wurden die Intermediärfilamente Desmin, Glattmuskel-α-Actin,

und Vimentin als Marker für die Identifikation von Ito-Zellen in der Leber und Niere verwendet.

myofibroblastähnliche Zellen wurden im perisinusoidalen Raum der Leber lokalisiert und wegen

77 Schlussfolgerung

ihrer morphologischen Eigenschaften als Ito-Zellen erkannt. Die Ito-Zellen zeigen sowohl bei

Frettchen als auch bei Ratten positive Desmin-Reaktion, negative Glattmuskulatur-α-Actin und

positive Vimentin-Reaktion. Die Anzahl von Ito-Zellen und deren Lipidtröpfchen in ihrem

Zytoplasma scheinen im Zusammenhang mit der VA-Versorgung über das Futter zu stehen.

In den Nieren von Ratten und Frettchen wurden Myofibroblastähnliche Zellen, die für alle drei

Intermediärfilamente eine positive Reaktion zeigen, im Nierenmark der Außenzone beobachtet.

In der Nierenrinde von Frettchen wurde Glattmuskel-α-Actin- und Vimentin-positive-Zellen

nachgewiesen, die ähnliche morphologische Charakteristiken wie die Ito-Zellen der Leber

besitzen. Bei Ratten wurden α-Actin-positive-Zellen im Interstitium der Nierenrinde und im

Nierenmark beobachtet. Im Gegensatz zu Ratten wurde bei Frettchen eine Verbindung zwischen

der VA-Zufuhr und der Anzahl und Größe von Ito-Zellen beobachtet. Die Ito-Zellen in den

Nieren von Fleischfressern könnten daher eine entscheidende Rolle in der physiologischen

Besonderheit des VA-Stoffwechsels bei diesen Spezies spielen. Weil Ito-Zellen auch in dem

Mechanismus der Entstehung verschiedener Leberkrankheiten, vorwiegend der Leberfibrosis,

beteiligt sind, ist eine aktive Rolle dieser Zellen nicht nur beim VA-Stoffwechsel sondern auch

in der Entwicklung von Nierenkrankheiten bzw. Nierenfibrose wahrscheinlich.

78 Zusammenfassung

7 ZUSAMMENFASSUNG

Einfluss einer unterschiedlichen Vitamin-A-Versorgung mit dem Futter auf die Verteilung

und Speicherung von Vitamin A und dessen Bindungsproteinen in verschiedenen Geweben

von Ratten und Frettchen.

Claudia Liliana Gómez Hernández, Veterinär-Physiologisch-Chemisches Institut, Universität

Leipzigy; Institut für Ernährungswissenschaft der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen

Fakultät der Universität Potsdam. 98 S., 10 Abb., 22 Tab., 230 Lit., 1 Anlage. Eingereicht im

Sept. 2004.

Schüsselwörter: Vitamin A-Stoffwechseln • Frettchen • Ratten • Tiermodell

In der Vitamin A-Forschung spielen Tiermodelle eine wichtige Rolle. Das am häufigsten

verwendete Tiermodell in der VA-Forschung sind Ratten, die wie der Mensch einen spezifischen

VA-Transport durch das Retinol-Bindungsprotein (RBP) im Blut besitzen. Im Gegensatz dazu

wurden Frettchen bisher nur in der Carotinoidforschung eingesetzt. Die Frettchen besitzen aber

hinsichtlich des VA-Stoffwechsels physiologische Ähnlichkeiten mit anderen Fleischfressern.

Bei Fleischfressern existiert neben dem spezifischen VA-Transport durch das RBP auch ein

unspezifischer VA-Transport durch Lipoproteine des Blutserums. Dadurch könnten Frettchen

ein geeignetes Tiermodell für Studien zum unspezifischen VA-Transport sein. Ein Vergleich von

Parametern des VA-Stoffwechsels von Ratten und Frettchen könnte die physiologischen

Besonderheiten dieser Tiere näher charakterisieren.

Es wurden deshalb Untersuchungen zum Einfluss unterschiedlicher VA-Dosierungen zur

Verteilung und Speicherung von VA und dessen Bindungsproteinen unter besonderer

Berücksichtigung der Ito-Zellen in Ratten und Frettchen durchgeführt. Dazu wurden zehn

Frettchen (Mustela putorios furo) und achtzehn Ratten (Rattus rattus), die jeweils zwei bzw. drei

Fütterungsgruppen zugeteilt wurden, 65 Tagen unter VA-Diäten gehalten. Am Ende des

Fütterungsversuches wurden von jedem Versuchstier Blut, Harn und Gewebeproben (Leber und

Niere) untersucht. Die VA-Bestimmung (Retinol, Retinylester) erfolgte mittels RP-HPLC. Die

Trennung der Lipoproteine im Blut wurde mittels selbstaufbauendem Gradienten und die

VA-Bestimmung in den verschiedenen Lipoprotein-Fraktionen sowie mittels RP-HPLC

durchgeführt. Der RBP-Nachweis sowie der Nachweis von Tamm-Horsfall-Protein wurden nach

elektrophoretischer Trennung im Western-Blot (Blut, Harn) durchgeführt.

Der immunhistologische Nachweis von RBP, Megalin und THP wurde an Formalin-fixierten

Zusammenfassung 79

und in Paraffin eingebetteten histologischen Schnitten (Leber und Niere) durchgeführt. Die

Identifizierung von Ito-Zellen erfolgte mittels immunhistologischer Untersuchung der

Intermediärfilamente Desmin, Glattmuskel-α-Actin und Vimentin als Marker.

Die Untersuchungen zeigen, dass die Frettchen in ihren VA-Stoffwechsel physiologische

Ähnlichkeiten mit anderen Fleischfressern besitzen. Außer dem bekannten spezifischen VA-

Transport durch RBP besitzen diese Tiere einen unspezifischen VA-Transport durch die

Lipoproteine des Blutserums. Die Frettchen besitzen auch die Fähigkeit, VA möglicherweise

gebunden an THP, über den Harn zu eliminieren. Diese renale VA-Ausscheidung in Frettchen

kommt nicht nur bei VA-Überversorgung, sondern auch bei basaler VA-Versorgung vor. Bei

den Ratten dagegen wird VA durch RBP transportiert. Nur unter einer VA-Überversorgung wird

VA auch über den Harn eliminiert. Trotz der Unterschiede im VA-Stoffwechsel zwischen den

untersuchten Spezies (Ratte, Frettchen) wurden ähnliche zelluläre Verteilungsmuster für RBP,

Megalin und THP in den Organen ermittelt, in denen diese Bindungsproteine enthalten sind. Die

Reabsorption von RBP aus dem Filtrat in den Nieren von Ratten und Frettchen wird

wahrscheinlich durch die Megalin-Endozytose vermittelt.

In der Leber und Nieren von Ratten und Frettchen wurden Zellen mit den morphologischen

Eigenschaften der Ito-Zellen nachgewiesen. Die Ito-Zellen zeigen in der Leber sowohl bei

Frettchen als auch bei Ratten positive Desmin-Reaktion, negative Glattmuskulatur-α-Actin und

positive Vimentin-Reaktion. In den Nieren von beiden Spezies wurden Myofibroblast-ähnlichen-

Zellen im Nierenmark (Außenzone) mit ähnlichen morphologischen Charakteristika gefunden.

Im Gegensatz zu Ratten wurde in der Nierenrinde von Frettchen Glattmuskel-α-Actin- und

Vimentin-positive-Zellen nachgewiesen. Die Ursache der unterschiedlichen IF-Expression und

Lokalisation von Ito-Zellen in den Nieren ist unklar.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Frettchen ein geeignetes Tiermodell für die Forschung des

unspezifischen VA-Transports als auch für möglichen Funktionen der Ito-Zellen in der

Speicherung und Ausscheidung von VA von Fleischfressern sind.

80 Summary

8 SUMMARY

The effect of different vitamin A supplementation on the distribution and storage of

vitamin A and its binding proteins in diverse tissues of rats and ferrets.

Claudia LiLiana Gómez Hernández, Institute of Physiological Chemistry, University of Leipzig;

Institute of Nutritional Science, University of Potsdam

98 pages., 10 figures., 22 tables., 230 references, 1 appendix; Submitted in Sept. 2004

Keywords: vitamin A metabolism • ferret • rat • Animal model

Animal models play an important role in vitamin A research. Rats are the most used

experimental animal models for vitamin A studies due to their specific mechanism of vitamin A

transport in blood via retinol binding protein (RBP) which is similar to humans. The Ferret is

another animal model used almost exclusively for studying carotenoids. The ferrets have a

vitamin A metabolism similar to other carnivores. Carnivores show a specific vitamin A

transport, via RBP as well as an unspecific vitamin A transport via lipoproteins, These findings

have made the ferret an appropiate animal model to study the unspecific metabolism of vitamin

A. In contrast to the species that have an specific vitamin A transport, the carnivores which

present unspecific vitamin A transport have shown to tolerate wall higher vitamin A intake. Such

features allow comparison between both species in order to investigate specific physiological

details metabolism of vitamin A.

In this study, investigations of the effect of different vitamin A doses on the distribution and

storage of vitamin A and its binding proteins in the Ito cells of rats and ferrets were made. Ten

ferrets ((Mustela putorios furo) and eighteen rats (Rattus rattus) were studied. The animals were

divided in two and three feeding groups and were assigned to a diet containing specific amounts

of vitamin A. The diets were given for 65 days. After the feeding period, urine was collected,

then the animals were sacrificed and blood, liver and kidneys were collected. Vitamin A (retinol

and retinyl esters) analyses were performed using a RP-HPLC method. Lipoproteins were

separated in blood using an ultracentrifuge with a gradient system, the vitamin A content in each

fraction was determined using RP-HPLC. RBP and Tamm-Horsfall-Protein (THP) in urine and

blood were analysed using electrophoresis and Western Blot. Immunohistochemical methods

using organ sections fixed in formalin and preserved in paraffin allowed the investigation of

RBP, megalin and THP in liver and kidney. The identification of Ito cells was made throughout

immunohistological observations using markers of the intermediate filaments desmin, α-smooth

muscle actin and vimentin.

Summary 81

The results showed that ferrets physiologically have a similar vitamin A metabolism to the other

carnivores since a confirmation on the specific vitamin A transport via RBP and an unspecific

transport via lipoproteins was found. On the other hand it was also shown that ferrets could

excrete vitamin A in urine possibly bound to THP. The vitamin A excretion was observed after

high doses of vitamin A and also after normal vitamin A doses. Differences in the vitamin A

metabolism between both species (rats and ferrets) were found, however similar cellular pattern

distribution of RBP, megalin and THP were observed in the analysed organs. Re-absorption of

RBP in the kidney filtrate of rats and ferrets could be due to megalin-mediated endocytosis.

Cells with similar morphological features to the Ito cells were found not only in liver but also in

kidney of rats and ferrets. The Ito cells in liver of rats and ferrets reacted positively to desmin

and vimentin and negatively to smooth muscle α-actin. In the kidney of both species, cells with

similar morphological features were found in the medula (outside zone). The Ito cells in the

interstitial renal cortex of ferrets reacted positively to α-smooth muscle actin and reacted

positively to vimentin, contrary to rats. The explanations for the expression and localisation of

intermediate filaments in the Ito cells is still unclear.

In conclusion the ferret proved to be an appropriate animal model to investigate the specific

vitamin A transport and the possible functions that Ito cells may play in the storage and

elimination of vitamin A in carnivores.

82 Literaturverzeichnis

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98 Anhang

10 ANHANG

10.1 Histologische Ergebnisse

Abb. 10.1 Positive RBP-Reaktion in der Leber von Ratten

Die positive RBP-Reaktion befindet sich diffus intrazytoplasmatisch in den Hepatozyten verteilt.

Eine deutliche RBP-Reaktion ist ausschließlich in der defizitären VA--Gruppe (C)

nachzuweisen, welche zentrolobulär intensiver ist als peripher (Pfeile). Zwischen der VA+-

Gruppe (A) und der Kontrollgruppe (B) ist kein Unterschied in der RBP-Reaktion zu

beobachten. V. centralis (Vc).

Anhang 99

100 Anhang

Abb. 10.2 Positive RBP-Reaktion in den Nieren von Ratten

Eine positive RBP-Reaktion ist in den Epitelzellen der proximalen gewundenen

Tubulusabschnitte (pt) zu erkennen. Dort ist die Reaktion im apikalen Zellbereich intensiver

(Pfeile). In den anderen Teilabschnitten des Neprons z.B den distalen Tubuli (dt) ist keine RBP-

Reaktion nachzuweisen. Die RBP-Intensität als auch die RBP-Verteilung variierte innerhalb der

proximalen Tubulusabschnitte. Glomerulum (G).

Anhang 101

102 Anhang

Abb. 10.3 Positive RBP-Reaktion in der Leber von Frettchen

Die positive RBP-Reaktion befindet sich diffus intrazytoplasmatisch in den Hepatozyten verteilt

(Pfeile). Die Kontrollgruppe (B) zeigte eine stärkere Immunreaktion für RBP als die

supplementierte VA+-Gruppe (A). V. centralis (Vc).

Anhang 103

104 Anhang

Abb. 10.4 Positive RBP-Reaktion in der Nierenrinde von Frettchen

Die positive RBP-Reaktion zeigt eine unterschiedliche Intensität der Färbung in den

Nephronabschnitten und verteilt sich im Zytoplasma der Ephitelzellen der proximalen

gewundenen Tubuli (pt). In den anderen Abschnitten des Neprons wie distalen Tubuli (dt) und

glomerulären Strukturen (G) ist keine positive RBP-Reaktion erkennbar. Die VA+-Gruppe (A)

besitzt eine intensivere RBP-Immunreaktion als die Kontrollgruppe (B).

Anhang 105

106 Anhang

Abb. 10.5 Positive Megalin-Reaktion im Interstitium der Leber und in den Nieren von

Ratten

Megalin reagiert im Interstitium (Pfeile) zwischen den Parenchymzellen der Leber (A)

In den Nieren ist Megalin in dem proximalen Tubuli (pt) erhalten und beschränkt sich auf die

Brush-border-membrane und subapikalen Strukturen der proximalen Tubuluszellen (Pfeile) (B).

Anhang 107

108 Anhang

Abb. 10.6 Positive Megalin-Reaktion im Interstitium der Leber und in den Nieren von

Frettchen

Positive Immunfärbung für Megalin im Interstitium der Leber (Pfeile) (A).

In den Nieren ist die Immunreaktion auf die apikalen Zellmembran (Pfeile) der proximalen

Tubuli (pt) beschränkt(B).

Anhang 109

110 Anhang

Abb. 10.7 Positive THP-Reaktion in den Niere von Ratten und Frettchen

Positive THP-Reaktion in den dicken Abschnitten der Henle-Schleife von Ratten. Die Reaktion

ist an der apikalen Plasmamembran stärker ausgeprägt als basolateral und intrazytoplasmatisch

(Pfeile) (A).

Positive THP-Reaktion in den dicken Abschnitten der Henle Schleife (Pfeile) und dem distalen

Tubulus von Frettchen. Die Reaktion ist an der apikalen Seite der Epithelzellen stärker

ausgeprägt (B).

Anhang 111

112 Anhang

Abb. 10.8 Positive Desmin-Reaktion in der Leber von Ratten

Desmin reagiert positiv im perisinusoidalen Raum der Leber. In den Schnitten der VA+-Gruppe

(A) sind eine erhöhte Anzahl sowie Größe von Desmin-positiven-Zellen (Pfeile) als in der

Kontrollgruppe (B) und VA--Gruppe (C) zu beobachten.

Anhang 113

114 Anhang

Abb. 10.9 Positive Desmin-Reaktion in der Leber und in den Nieren von Ratten

In der Leber ist eine positive Desmin-Reaktion in den Muskelfasern der A. hepatica, die mit der

V. portae und dem Gallengang eine portale Trias bildet sowie in den Muskelfasern der

V.centralis (Vc) zu erkennen (A). Eine positive Desmin-Reaktion ist auch in dem

perisinusoidalen Raum zwischen die Hepatozyten zu sehen (Pfeile). Eine relevante Veränderung

der Intensität der Reaktion zwischen den Diätgruppen wurde nicht festgestellt.

Eine positive Desmin-Reaktion ist in Podozyten (Pfeile) des Glomerulus (G) und in der

Gefäßmuskulatur (Pfeile) der Nieren (B). Die Zellen im Interstitium der Nierenrinde zeigen

keine Desmin-Reaktion.

Die Desmin-positiven Zellen (Pfeile) befinden sich im Interstitium des Nierenmarks um die

Sammelrohre (S) (C).

Anhang 115

116 Anhang

Abb. 10.10 Positive Desmin-Reaktion in der Leber von Frettchen

Dort ist eine Desmin-positive Reaktion in den Muskelfasern der V. centralis (Vc), Blutgefäße

z.B. A. hepatica (Ah) und in Zellen des perisinusoidalen Raumes (C) zu beobachten. Die

Quantität und Größe der Desmin-positiven-Zellen unterscheiden sich nicht zwischen der VA+-

Gruppe (A) und der Kontrollgruppe (B).

Anhang 117

118 Anhang

Abb. 10.11 Positive Desmin-Reaktion im Nierenmark von Frettchen

Die desmin-positiven Zellen (Pfeile) befinden sich in Interstitium um die Sammelrohren (S).

Anhang 119

120 Anhang

Abb. 10.12 Positive Immunreaktion für Glattmuskulatur-α-Actin in der Leber und in den

Niere von Ratten

Diese Reaktion beschränkt sich auf die muskuläre Schicht der V. centralis (Vc) und in den

Blutgefäßen der portalen Trias (Pfeile). Im Interstitium wurde keine positive Reaktion

beobachtet (A).

Positive Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion in der Nierenrinde. Eine positive Glattmuskulatur-α-

Actin-Reaktion ist in der Wand der Blutgefäße und in Zellen (Pfeile) zwischen dem Glomerulus

(G) und proximalen Tubulus zu identifizieren (B).

Positive Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion im Nierenmark. Die Reaktion befindet sich um die

Sammelrohre (Pfeile) (C).

Anhang 121

122 Anhang

Abb. 10.13 Positive Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion in der Leber von Frettchen

Eine positive Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion ist in den Muskelfasern der Wand von

Blutgefäßen (Pfeile) der portalen Trias und in der V. centralis (Vc) zu erkennen. Im Interstitium

wurde keine Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion sowie keine unterschiedliche Farbintensität

zwischen den Diätgruppen festgestellt.

Anhang 123

124 Anhang

Abb. 10.14 Positive Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion in den Nieren von Frettchen

Die Nieren zeigen eine positive Immunreaktion für Glattmuskulatur-α-Actin in den

Muskelfasern der Blutgefäße sowie peritubulären und periglomerulären Zellen im Interstitium

(Pfeilen) der Nierenrinde. Glomerulus (G). Die VA+-Gruppe (A) enthält eine größere Anzahl

von Zellen im Interstitium der Nierenrinde als die Kontrollgruppe (B). Im Nierenmark (C) ist in

den Innenstreifen eine positive Glattmuskulatur-α-Actin-Reaktion deutlich nachweisbar.

Sammelrohre (S).

Anhang 125

126 Anhang

Abb. 10.15 Positive Vimentin-Reaktion in Zellen des Interstitiums der Leber von Ratten

Ein Unterschied ist zwischen den Diätgruppen zu beobachten. Die Vimentin-positiven Zellen

(Pfeile) in der VA+-Gruppe (A) zeigen eine vergrößertes Zytoplasma im Vergleich zu denen der

Kontrollgruppe (B) und der VA--Gruppe (C).

Anhang 127

128 Anhang

Abb. 10.16 Positive Vimentin-Reaktion in den Nieren von Ratten

Eine positive Vimentin-Reaktion in der Nierenrinde ist in den Podozyten (Pfeile) des

Glomerulus (G) sowie in der Gefäßmuskulatur (Pfeile) erkennbar (A). Im Interstitiellen Raum

der Nierenrinde ist keine Immunreaktion für Vimentin nachweisbar.

Im Nierenmark reagiert Vimentin in den Zellen (Pfeile) um die Sammelrohre (S) (B).

Anhang 129

130 Anhang

Abb. 10.17 Positive Vimentin-Reaktion in der Leber von Frettchen

Im Interstitium sind eine hohe Anzahl an Vimentin-positive Zellen (Pfeile) zu sehen. Eine

Veränderung der Morphologie und Zahl dieser Zellen ist in der VA+-Gruppe (A) sichtbar.

Kontrollgruppe (B).

Anhang 131

132 Anhang

Abb. 10.18 Positive Vimentin-Reaktion in den Niere von Frettchen

Eine positive Vimentin-Reaktion in der Nierenrinde ist in Podozyten (Pfeile) des Glomerulus

(G) und Epithelialzellen der gewundenen proximalen Tubulus (pt) (Pfeile) zu sehen (A).

Die positive Vimentin-Reaktion im Nierenmark befindet sich in den Innenstreifen um die

Sammelrohre (S). Die verschiedenen Diätgruppen weisen keinen Unterschied in der

Farbintensität oder in der Morphologie der Vimentin-positiven Zellen auf (B).

Anhang 133

Danksagung

Danksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. F. J. Schweigert für die Überlassung des interessanten Themas

und für seine vielseitige Unterstützung bei dessen Umsetzung. Mein besonderer Dank gilt

Herrn Prof. Dr. H. Fuhrmann für die Betreuung und stets schnelle Hilfe bei der Anfertigung

der Arbeit.

Bei Herrn Dr. J. Raila möchte ich mich herzlich für die wertvollen Ratschläge und Mithilfe beim

Lösen methodischer Probleme während der Anfertigung dieser Arbeit bedanken.

Weiterhin danke ich Frau Dr. K. Zeilinger und Frau A. Selke, AG Experimentelle Chirurgie,

Charité, Virchow-Klinikum Berlin, für die Unterstützung bei der Etablierung der

immunhistologischen Verfahren.

Bei den Mitarbeitern des Labors bedanke ich mich für die Beratung und Hilfe bei technischen

Fragen, dabei möchte ich Frau E. Pilz und Frau A. Hurtienne ganz besonders danken.

Mein Dank gilt ferner allen Mitarbeitern des Institutes für Ernährungswissenschaft der

Universität Potsdam, die mit ihrer Hilfsbereitschaft in allen Bereichen für eine angenehme

Arbeitsatmosphäre sorgten.

Die Anfertigung der Promotionsarbeit wurde durch finanzielle Mittel der ICETEX (Instituto de

credito Colombiano para estudios en el exterior) unterstützt, wofür ich ebenfalls meinen Dank

ausspreche.

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