Weiterentwicklung desFluoreszenz-Clamp-Prinzips

durch Einsatz vondigitalen Reglern mit endlicher Einstellzeit

Diplomarbeit derMathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Christian-Albrechts-Universitätzu Kiel

vorgelegt vonTorben Behrend

Kiel, Dezember 2000

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Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis häufig verwendeter Abkürzungen und Begriffe . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 Einleitung

2 Das photosynthetische System

2.1 Ort der Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2.2 Licht- und Dunkelreaktion der Photosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2.3 Die Photosysteme I und II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2.4 Die Elektronentransportkette . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3 Die Fluoreszenz aus dem Photosystem II als Grundlage des Fluorescence Clamp Meßverfahrens

3.1. Fluoreszenzentstehung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3.1.1 Dominate Rolle des Photosystems II (PS II) im Fluoreszenzsignal . . . . .

3.2 Die Quenchingmechanismen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3.2.1 Das Topfmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3.2.2 Erhöhung der Empfindlichkeit durch Yieldmessung . . . . . . . . . . . . . .

3.3 Das Zeitverhalten der Chlorophyll-Fluoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3.4 Messungen mit sättigenden Blitzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3.5 Messungen mit dem PAM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4 Motivation für die (Weiter-)Entwicklung derFluoreszenz-Clamp-Maschine4.1 Direkte Flußmessungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4.2 Das Fluoreszenz-Clamp Verfahren (FC) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4.3 Die FC-Maschine von Schinner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4.4 Messungen mit der FC-Maschine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4.5 Motivation für die Weiterentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5 Die Fluoreszenz-Clamp-Maschine5.1 Prinzip des Meßaufbaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.2 Die Verkopplung zweier Regelkreise . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.3 Der Photodetektor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.4 Der Leuchtdiodenkopf (Kuppel) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.5 Wahl der LEDs und Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5.6 Die LED-Ansteuerung von aktinischem Licht und Blitzlicht . . . . . . . . . . . . . .5.7 Der Digitalbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6 Entwurf des Reglers auf endliche Einstellzeit6.1 Einführende Grundlagen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.1.1 Abtasten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.1.2 Die Laplacetransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.1.3 Verschiebungsatz der Laplacetransformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.1.4 Die Z-Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.2 Vergleich Regler endlicher Einstellzeit mit herkömmlichen Reglern . . . . . . . .

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6.3 Prinziperläuterung der endlichen Einstellzeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.4 Vorgang der Regelung bei Abtastreglern . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.5 Herleitung der Stellfunktion u(t) des Reglers endlicher Einstellzeit am . . . . . .

Beispiel 2. Ordnung und einer Totzeit6.5.1 Herleitung des Steuerungssignals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.5.2 Reglerentwurf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.6 Stabilität bei Reglern endlicher Einstellzeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.7 Bestimmung der Sprungantwortsparameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.7.1 Die Zeitkonstanten τ1, τ2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.7.1.1 Relevanz der Zeitkonstanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.7.1.2 Ermittlung der Zeitkonstanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.7.1.2.1 Frequenzganganalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.7.1.2.2 Probierverfahren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.7.1.3 Photodetektorstufe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.7.1.4 Vergleich der Ergebnisse der beiden Verfahren . . . . . . . . . . . . . . .

6.7.2 Die Gleichspannungsverstärkung r0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6.7.2.1 Linearisierung des Zusammenhangs von Stellgröße x und . . . . . .

Stellfunktion u6.7.3 Die Koeffizienten r1 und r2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6.8 Wahl der Abtastzeit T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7 Software7.1 Wahl der Softwareumgebung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7.1.1 Betriebssystem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7.1.2 Programmiersprache . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7.2 Regelungsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7.3 Programmteile . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7.3.1 Der Hellregler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7.3.1.1 Einschwingprozesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7.3.1.2 Schwankungen der Gleichspannungsverstärkung . . . . . . . . . . . . . .

7.3.2 Der Dunkelregler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7.3.2.1 Ungenauigkeiten des Dunkelreglers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7.3.2.1.1 Genauigkeit der Dunkelregleransteuerung (DA) . . . . . . . . . .7.3.2.1.2 Kapazitive Störungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7.3.3 Relaxation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7.3.4 Der Ausgleich von starken Hintergrundlichtänderungen (Blitz, aktin.

Licht): der spezielle Dunkelregler7.3.4.1 Ablauf der Kompensation starker Hintergrundlichtänderungen

(2-stufige-Dunkelregelung)7.3.4.2 Test der Hintergrundlichtkompensation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7.4 Programmablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

8 Erprobung der digitalen FC-Maschine8.1 Messungen mit der Sättigungsblitzmethode der neuen FC-Maschine . . . . . . . .

9 Fazit und Ausblick

10 Zusammenfassung

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Literaturverzeichnis 77

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Verzeichnis häufig verwendeter Abkürzungen und Begriffe

ADP : AdenosindiphosphatADW, AD-Wandler : Analog-Digital-WandlerATP : AdenosintriphosphatChl : ChlorophyllDAW, DA-Wandler : Digital-Analog-WandlerETC : lineare ElektronentransportketteF0 : GrundfloureszenzFC-Machine : Fluoreszenz-Clamp-MaschineFd : FerredoxinFET : Feld-Effekt-TransistorFM : MaximalfluoreszenzΦ0 : maximaler ExzitonenflußΦM : minimaler ExzitonenflußI : Lichtintensitätkf : Ratenkonstante der Fluoreszenzkp : Ratenkonstante der photochemischen Deaktivierungkt : Ratenkonstante der thermischen DeaktivierungLED : LeuchtdiodeLHC : light harvesting complexML : MeßlichtNADP : NicotinadenindinucleotidphosphatOP : OperationsverstärkerP680, P700 : Reaktionszentrumsmulekül von PS II bzw. PS IPC : PlastocyaninPQ : PlastoquinonPS I, PS II : Photosystem I bzw. IIQA, QB : Akzeptoren von PS IIqE : Energy-QuenchingqI : Photoinhibitions-QuenchingqN : nichtphotochemisches QuenchingqP : photochemisches QuenchingRZ : Reaktionszentrumu : Stellfunktionx : Regelgrößexd : Regelabweichung

Vereinbarung

Die Intensitätsangaben in W/m2 beziehen sich auf die Mittelung über Hell- und Dunkelphasender Lichtprogramme.

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Kapitel 1

Einleitung

Die Pflanzen wandeln durch die Photosynthese die Energieeinstrahlung der Sonne inchemische Energie um und verringern dabei z.B. auch die CO2-Konzentration der Luft. DieBedeutung der Pflanzen als Sauerstoff- und Nahrungsmittelproduzent und die Veränderungen,die Störungen in der Umwelt der Pflanzen hervorrufen, haben nicht nur Generationen vonBauern dazu veranlaßt, lange darüber nachzudenken, wie man diese Reaktionen bzw. dasWachstum der Pflanze beeinflussen kann. Auch die Wissenschaftler untersuchen denkomplizierten Prozeß der Photosynthese in intensiver Forschung und tragen Stück für Stückzusammen. Bei der Photosynthese spielen die zwei Photosysteme PS II und PS I, die dieLichtenergie nutzen, um Elektronen zu transportieren, eine zentrale Rolle. Die Chlorophyll-Fluoreszenz von PS II enthält eine Menge Informationen und ist eine relativ einfach zumessende Größe (Schreiber et al., 1986).In der Kieler Arbeitsgruppe für Biophysik wird zum einen die bekannte Meßtechnik benutzt,um aktuelle Fragen wie z. B. die unterschiedliche Resistenz von ammonium- undnitraternährten Pflanzen gegen Lichtstreß zu bearbeiten (Zhu et al., 2000; Bendixen et al.,2001), zum anderen wird aber auch an der Verbesserung der Meßtechnik gearbeitet. EinProblem der Chlorophyll-Fluoreszenz ist ihr außerordentlich reicher Gehalt an Information, sodaß es schwierig ist, diese einzeln zu erkennen. Daher werden Verfahren gesucht, dieProzesse besonders deutlich hervortreten lassen.Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Problem, daß die Fluoreszenz dieKonzentration von Exzitonen in den Antennen des PS II wiedergibt. Sie ist daher einePotentialgröße wie die Spannung in einem elektrischen Netzwerk. Häufig ist man jedoch anden Flüssen interessiert. Sie müssen indirekt aus den Veränderungen der Fluoreszenzerschlossen werden. Es hat jedoch Vorteile, die Flüsse direkt zu messen (Kapitel 4).Dafür wurde die FC-Maschine (Fluorescence-Clamp-Maschine) entwickelt. Diese entstandnach dem Vorbild des Voltage-Clamp, bei dem ein Regelkreis die Spannung an den Zellenkonstant hält, indem der dafür nötige Strom verändert wird und damit die Messung derStröme ermöglicht wurde (Marmont, 1949). Die FC-Maschine hält die Fluoreszenz konstant,indem es das Einstrahlungslicht so regelt, daß die Exzitonenflüsse aus den Antennenkompensiert werden. Mit der FC-Maschine können daher die Flüsse am PS II direkt gemessenwerden.In der Arbeitsgruppe Biophysik der Universität zu Kiel wurde eine FC-Maschine vonGiannikos (1995) entwickelt und von Schinner (1997), Schinner et al. (2000) verbessert.Diese FC-Maschine in Analogtechnik hat aber einen sehr komplexen elektronischen Aufbau,dessen Nachbau und Justierung im Betrieb recht hohe Anforderungen auf dem Gebiet derRegelungstechnik stellen (Frequenzgangabgleich, Ermitteln von „Wunder-Cs“). Dies machtdie Verbreitung des Prinzips in andere Labore schwierig.Die Aufgabe zu dieser Diplomarbeit war daher die Entwicklung einer FC-Maschine, zu dernur noch möglichst wenig elektronische Bauteile benötigt werden und viele Funktionen voneinem Computerprogramm übernommen werden, das sich an die verwendete Hardware

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anpaßt. Dadurch sind Nachbauten leicht zu erstellen. Diese müssen nicht genau aus dengleichen Bauteilen bestehen und kleine Ungenauigkeiten beim Aufbau stören auch nicht dieFunktionstüchtigkeit. Computerprogramme können einfach kopiert werden und zeigen keineBauteiltoleranzen o.ä.. Die vorliegende Arbeit wird zeigen, daß es gelingt, eine solche digitaleFC-Maschine zu entwickeln, die mindestens genauso gute Meßergebnisse liefert.

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Kapitel 2

Das photosynthetische System

Die hier zu entwickelnde Fluoreszenz-Clamp-Maschine dient zur Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz von Blättern. Da die Grundlagen des photosynthetischen Systems bereits häufigin vorangegangenen Diplomarbeiten beschrieben wurden, folgt nur ein kurzer Überblick.

2.1 Ort der Photosynthese

Die Photosynthese findet bei Pflanzen in den zahlreichen Chloroplasten statt, die sich in denZellen der Blätter befinden. Die Chloroplasten sind von elliptischer Form und haben einVolumen von ca. 40 µm3. In einem Chloroplasten (Abbildung 2.1) befindet sich eine 7 nmdicke Doppellipidschicht, die man als Thylakoidmembran bezeichnet und in gestapelter undungestapelter Form vorkommt. Die gestapelten Schichten nennt man Granathylakoide und dieungestapelten Stromathylakoide.

Abbildung 2.1: Schematische Darstellung eines aufgeschnittenen Chloroplasten(Libbert, 1987)

Die in sich geschlossene Thylakoidmembran teilt den Innenraum des Chloroplasten in zweiBereiche: den inneren Bereich, den man als Lumen bezeichnet, und den äußeren Bereich, dasStroma. Im Lumen befinden sich die für die Energieumwandlung verantwortlichenKomponenten (Junge, 1975; Renger et al., 1987):

• die lichtsammelnden Proteine,• die Photosysteme I und II,• die Elektronentransportkette (ETC),• das Elektroenzym ATPase.

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Hier reichern sich durch die Wasserspaltung an einem Mangankomplex und einer weiterenH+-Transportreaktion Protonen in der wässrigen Lösung an. Die rückfließenden Protonentreiben das Enzym ATPase.

2.2 Licht- und Dunkelreaktion der Photosynthese

Der Prozeß der Photosynthese läßt sich in die Bereiche Lichtreaktion und Dunkelreaktionunterteilen. Bei der Lichtreaktion laufen hauptsächlich biophysikalische Vorgänge an derThylakoidmembran ab: Die elektromagnetische Energie des Lichts wird in einenelektrochemischen Protonen-Gradienten und in Redoxenergie umgewandelt. Hingegenspielen während der Dunkelreaktion im Stroma im wesentlichen biochemische Vorgänge eineRolle, die für eine gewisse Zeit ohne direkten Einfluß von Licht ablaufen, doch sind Licht-und Dunkelreaktion eng miteinander verknüpft.Wie die Abbildung 2.2 zeigt, wird durch Photolyse des Wassers Sauerstoff freigesetzt und dieEnergie des absorbierten Lichtes genutzt, um die chemischen Substanzen ATP undNADPH/H+ herzustellen. Mit ATP als Energieträger und NADPH/H+ als Reduktionsmittelwerden in der folgenden Dunkelreaktion – dem sogenannten Calvin-Zyklus – mit CO2

Kohlenhydrate aufgebaut.

Abbildung 2.2: Licht- und Dunkelreaktion und ihre Verknüpfung in der Photosynthese(Buschmann und Grumbach, 1985)

2.3 Die Photosysteme I und II

Die Photo- bzw. Antennensysteme absorbieren das zur Photosynthese notwendige Licht undwandeln die absorbierte Lichtenergie in elektroosmotische Energie um. Die Chlorophyll-Moleküle, aus denen die Antennenpigmente gebildet werden, sind in der Lage, Photonen

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unterschiedlicher Frequenz zu absorbieren. Ein Photosystem besteht aus ca. 300 Chlorophyll-Molekülen a (Chl a), weiteren Photorezeptormolekülen (Chl b und Carotinoide) und demReaktionszentrum (RZ). Dort wird lichtgetriebene Ladungstrennung mit Hilfe der von denAntennensystemen absorbierten Energie durchgeführt.Die beiden Photosysteme Photosystem I (PS I) und Photosystem II (PS II) unterscheidensich durch die Absorptionsmaxima ihrer Reaktionszentren. So liegt das Maximum desReaktionszentrummoleküls, ein spezielles Chl a, im PS I bei 700 nm (P 700) und im PS II bei680 nm (P 680). Die Modelle für den Energietransfer des PS II beziehen sich einerseits aufdie Übertragung der Anregungsenergien innerhalb eines PS II und andererseits zwischen denPS II-Einheiten. So beschreibt das „Connected-Unit“-Modell (Geacintov und Breton, 1987)die mögliche Übertragung der Anregungsenergie auf das RZ eines anderen Antennenkom-plexes.Das „Reversible-Radikal-Paar“-Modell (Schatz et al., 1988) bildet die Grundlage für vieleUntersuchungen der Übertragung des Anregungszustandes (Exziton = S1-Zustand desChlorophyllmoleküls) aus der Antenne in das RZ des PS II mit Hilfe der Picosekunden-Fluoreszensmeßtechnik (Dau und Sauer, 1996). Nach dem „Shallow-Trap“-Modell bewegtsich das Exziton frei im Antennenkomplex: Untersuchungen (Leibl et al., 1989) ergaben, daßsich die Ladungstrennung erst nach ca. 60 „Kontakten“ mit dem RZ einstellt; jedoch isthierfür ein „offenes“ RZ mit einem nicht oxidierten P 680 Voraussetzung. Im anderen Fall(P 680+) verschwindet des Exziton durch thermische Deaktivierung oder durch Fluores-zenzabstrahlung, doch kann das Exziton auch bei offenen Reaktionszentren über dieseProzesse deaktiviert werden.Da die Fluoreszenzabstrahlung auf Veränderungen der Lichtintensität reagiert, werdenProzesse wie der Elektonentransport von PS II nach PS I meßbar. Die Lichtreaktion bewirkteine Anhebung von Elektronen der Chlorophyllmoleküle in den Antennensystemen. Derbewegliche Anteil dieses „light-harvesting-complexes“ (LHC) ermöglicht eine Veränderungder Antennengröße von PS I und PS II und damit eine Anpassung an die Lichtverhältnisse.

2.4 Die Elektronentransportkette

Der photochemische Energietransfer beginnt mit der Aufnahme des Lichtes durch dieAntennenkomplexe. In den nacheinander ablaufenden Reaktionen werden die Elektronen voneinem Reaktionspartner an den nächsten weitergereicht. Die Abbildung 2.3. stellt dassogenannte Z-Schema der Elektronentransportkette dar, wobei des Redoxpotential an derOrdinate ablesbar ist.Nach der Abspaltung der Elektronen aus dem Wasser im wasserspaltenden Enzym (WSE)wird das Reaktionszentrum P 680 von PS II angeregt. Bei der dort stattfindendenLadungstrennung bildet sich das Radikalpaar (P 680+, Pheo-).Das Reaktionszentrum P 680 liefert die Energie für die nächsten Schritte. Auf der Donorseitespaltet das WSE zwei Moleküle H2O aus dem Lumen in ein Molekül Sauerstoff, vierProtonen und vier Elektronen. Auf der Akzeptorseite wandert das Elektron des reduziertenPheophytin vom primären Chinonakzeptor QA zum sekundären Chinonakzeptor QB. NachAufnahme von zwei Protonen aus dem Stroma kann QB PS II verlassen und tritt alsPlastohydrochinon (PQH2) in den Plastoquinonpool (PQ-Pool) ein. Dieser Pool bildet einenRedoxspeicher zwischen PS II und den weiteren Komponenten der ETC.

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Das Plastohydrochinon diffundiert durch die Thylakoidmembran und transportiert dabei diebeiden Protonen vom Stroma ins Lumen. Dort erhöht sich die Protonenkonzentration, undzusätzlich, angereichert mit den vier Protonen aus der Wasserspaltung, baut sich ein pH-Gradient über der Thylakoidmembran auf. Die daraus resultierende freie Reaktionsenthalpieermöglicht über eine inverse Protonenpumpe (ATPase) die Synthese des ATP aus ADP undPhosphat (Mitchel, 1977; Witt, 1979). Der Elektronentransport führt vom PQ-Pool über denCytochrom b6/f-Komplex und das Rieske Fe-S-Zentrum zum Cytochrom f und in denPlastocyanin-Pool (PC-Pool).Das ebenfalls durch Lichtabsorption angeregte Reaktionszentrum P 700 des PS I übernimmtdie Elektronen vom Plastocyanin und über Zwischenschritte (Ax) wird Ferredoxin (Fd)reduziert, wobei es durch das Enzym Ferredoxin-NADP-Reduktase (FNR) unter Aufnahmevon H+ im NADPH/H+ chemisch gebunden wird. Es gibt für die Elektronen jedoch nochweitere Möglichkeiten, das PS I zu verlassen. So treten neben dem linearenElektronentransport noch zyklische Transporte und die pseudozyklische Mehler-Reaktion auf,deren Existenz noch nicht endgültig geklärt ist.

Abbildung 2.3: Schema der linearen Elektronen-Transport-Kette. Darstellung nachReihenfolge in der ETC und in der Höhe nach dem Redoxpotential (Buschmann undGrumbach, 1985).

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Kapitel 3

Die Fluoreszenz aus dem Photosystem II als Grundlage desFluorescence-Clamp-Meßverfahrens

Die Prozesse im photosynthetischen Apparat haben den großen Vorteil, daß sie durchLichtsignale beobachtet werden können. Hier gibt es zahlreiche Absorptionsmessungen, diemit A und der Wellenlänge in nm abgekürzt werden. A505 mißt z. B. den Zeaxanthin-Gehalt(Schutz-Carotenoid in der Antenne, Bendixen et al. 2001), A515 die elektrische Spannungüber der Thylakoidmembran mit Hilfe des Stark-Effektes (Windecker et al. 1990), A535 denpH-Gradienten über der Thylakoid Membran (Horton 1996) oder A830 den Redox-Zustandvon PS I (Klughammer et al. 1994). Doch das aussagekräftigste Signal ist F685 (Fluoreszenzmit Maximum bei 685 nm), die Chlorophyll-Fluoreszenz vom Photosystem II.

3.1 Fluoreszenzentstehung

Die Antennen der Photosysteme bestehen hauptsächlich aus den Pigmentmolekülen Chl a undChl b (siehe Abschnitt 2.3). Das Absorptions- und Emissionsverhalten des Chl a ist inAbbildung 3.1 dargestellt. Die zwei ausgeprägten Maxima der Absorption im blauen(450 nm) und roten (680 nm) Spektralbereich entstehen durch den Übergang vomGrundzustand S0 zu höheren Singulettzuständen Sx, wie das Termschema von Jablonski inAbbildung 3.1 zeigt. Höhere Anregungszustände können strahlungslos in den S1-Zustandübergehen oder über Energietransfer auf Nachbarmoleküle deaktivieren.Die Emission von Fluoreszenz entsteht ausschließlich beim Übergang vom S1-Zustand in denGrundzustand S0. Sie ist nach einer 1 ns abgeklungen. Aber es gibt noch spätereFluoreszenzsignale nach einem kurzen Blitz. Entweder kommen Sie aus dem Triplettzustand(T1 in Abbilung 3.1) oder die S1-Zustände werden wieder durch Rückfluß aus derElektronentransportkette aufgefüllt. Die dann (später als 2 ns nach dem Abschalten desLichtes) beobachtbare Fluoreszenz heißt Lumineszenz (delayed fluorescence). DasIntensitätsverhältnis von Fluoreszenz zu Lumineszenz liegt bei 100 bis 1000.Wie die Abbildung 3.1 zeigt, gibt es folgende Möglichkeiten, von dem S1- den S0-Zustand zuerreichen:

• durch Fluoreszenz über Abstrahlung eines Lichtquants,• über sogenannte thermische Deaktivierung durch Abgabe der Energie als Wärme,• durch die Übertragung der Anregungsenergie auf ein benachbartes Pigmentmolekül oder

an das Reaktionszentrum des Photosystems,• indirekt als Phosphoreszenz über einen Triplettzustand.

Phosphoreszenz ist jedoch eine Seltenheit und unter normalen physiologischen Bedingungenkaum nachweisbar. Bei intakten, photosynthetisch aktiven Blättern werden 3 bis 7 % und bei

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isolierten Chlorophyllextrakten 30% des Lichtes über Fluoreszenz abgegeben. DieserProzentsatz ist konstant für eine Pflanze, und deshalb kann die Fluoreszenz als ein Maß fürden physiologischen Zustand und die Photosyntheseaktivität der jeweiligen Probe benutztwerden.

Abbildung 3.1: Links das Absorptions- und Emissionsspektrum von Chl a, rechts imJablonski-Diagramm die entsprechenden atomaren Zustände: dünne Pfeile stellenstrahlungslose Übergänge dar, dick gezeichnete Pfeile Fluoreszenz und Phosphoreszenz(Haken und Wolf, 1987).

3.1.1 Dominate Rolle des Photosystems II (PS II) im Fluoreszenzsignal

Die durch Änderungen des Zustandes des photosynthetischen Systems verursachtenÄnderungen in der Chlorophyll-Fluoreszenz stammen fast ausschließlich vom PS II. BeideSysteme tragen zur Fluoreszenz bei. Dabei unterscheiden PS I und PS II sich nur gering inihren Absorptions- und Fluoreszenzmaxima. Maximal absorbiert PS I bei 700 nm und PS IIbei 680 nm. Für PS I liegt das Fluoreszenzmaximum bei 735 nm, für PS II sind es 683 nm.Für die Auswertung der Fluoreszenz ist der Befund von Baker und Webber (1987) von großerBedeutung, daß bei normaler Zimmertemperatur der variable Anteil der Fluoreszenzausschließlich von PS II stammt.

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Allerdings ist die Funktion des PS I durchaus nachweisbar. Bei der Beleuchtung mitfernrotem Licht (λ > 700 nm) wird hauptsächlich PS I angeregt. Die verstärkte Saugwirkungvon PS I reduziert über PQ die Quencher von PS II und beeinflußt so die PS II-Fluoreszenz(Hansen et al., 1987).

3.2 Die Quenchingmechanismen

Die Fluoreszenz des PS II hängt von den Flüssen aus der Antenne des PS II ab. Alle Prozesse,die zum Abbau der S1-Zustände und der dazu proportionalen Fluoreszenzverminderungführen, werden Quenchingmechanismen genannt.

3.2.1 Das Topfmodell

Nach den Vorstellungen des Topfmodells bildet sich in den PS II-Antennen ein sogenannter„Exzitonensee“ (Abbildung 3.2), dessen Höhe durch eingestrahlte Lichtenergie undExzitonenabflüsse aus den Antennen bestimmt wird. Diese Höhe ist nur als statistischesMittel zu betrachten, denn bei einer Absorptionsrate von 10 bis 100 Photonen pro Sekundeund einer maximalen Lebensdauer der Exzitonen von 9 µs (Rogers und Bates, 1980) sind diePhotosysteme meistens leer.

Abbildung 3.2: Das Topfmodell. Alle Antennensysteme werden im Sinne des Matrix-Modells als ein Topf betrachtet, in dem die Exzitonen (S1-Zustände) frei wandern können.Durch eingestrahltes Licht der Intensität I bildet sich in den PS II-Antennen ein Exzitonensee,dessen Energie photochemisch (kp), thermisch (kt) und über die Abstrahlung von Fluoreszenz(kf) deaktiviert werden kann.

Die Exzitonenenergie kann über thermische und photochemische Deaktivierung und überFluoreszenzabstrahlung abgebaut werden. In der Abbildung 3.2 stehen die Ratenkonstantenkf, kp und kt für die entsprechenden Vorgänge. Die Ratenkonstante kf kann als konstant

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angenommen werden, so daß die Intensität der Fluoreszenz als Meßgröße den Pegelstand imExzitonensee abbildet.Das Topfmodell geht von den Annahmen des Matrix-Modells aus, daß die einzelnen PS IIPhotosysteme stark gekoppelt sind. Die Alternative ist das Separate Unit Modell (Dau, 1994),doch diese Unterschiede sind für die vorliegende Arbeit nicht relevant.Nach dem Matrix-Modell, ergibt sich folgender Zusammenhang zwischen der Höhe desExzitonensees und seinen Abflüssen (Dau, 1989, 1994):

]Q[kkkaIE

Aptf ++= (3.1.)

mit E : Höhe des Exzitonensees a : mittlerer Absorptionsquerschnitt der Photosysteme II I : Intensität des Anregungslichtes kf : Ratenkonstante der Fluoreszenz

kt : Ratenkonstante der thermischen Deaktivierungkp : Ratenkonstante der photochemischen Deaktivierung[QA]: Konzentration an nichtreduziertem Quencher QA

Aufgrund der Konstanz der Ratenkonstante der Fluoreszenz kf ergibt sich daraus dieFluoreszenz F zu:

aI]Q[kkk

kEkFAptf

ff ++

== (3.2)

In dieser Formel tauchen folgende Quenchingmechanismen auf:

• Verminderung des Absorptionsquerschnittes a der PS II,• Anwachsen der thermischen Deaktivierung kt,• Erhöhung der photochemischen Aktivität kp .

Die Wirkung von a und kt bezeichnet man als nichtphotochemisches Quenching qN und dieErhöhung von kp als photochemisches Quenching qP.Nichtphotochemisches Quenching schützt die Pflanze vor zu hoher Lichtintensität.

• Das zu a gehörende State-transition-Quenching qT hängt damit zusammen, daß diebeweglichen LHCs zwischen den Photosystemen II und I umverteilt werden, um einebessere Anpassung an das Lichtspektrum und den Lichtbedarf von PS I und PS II zuerreichen. Die Veränderung des Absorptionsquerschnittes a dauert 3 bis 10 min (Dau undHansen, 1988; Dau, 1989; Dau und Canaani, 1990).

17

kt in Gleichung 3.2 wird noch weiter unterteilt:

• Das Energy-Quenching qE, auch pH–abhängiges Quenching genannt, ist eine Folge desAufbaus des pH-Gradienten über der Thylakoidmembran. Die Zeitkonstante ist 5 bis 20Sekunden.Die genannten Prozesse der thermischen Deaktivierung sind noch nicht vollständig geklärt(Dau und Hansen, 1990; Schreiber und Neubauer, 1990; Schreiber et al., 1991; Ramm undHansen, 1993), hängen aber wohl mit der Aggregation spezieller LHC-Proteinezusammen (Horton, 1999).

• Das Photoinhibitions-Quenching qI tritt bei sehr hohen Lichtintensitäten auf. Dabeiwerden Einheiten von PS II geschädigt und die Fluoreszenzausbeute vermindert. DerProzeß läuft mit einer Zeitkonstanten von 30 Minuten relativ langsam ab und macht sichebenfalls in einer Verringerung des Absorptionsquerschnittes a bemerkbar (Powles undBjörkmann, 1982; Krause und Laasch, 1987).

3.2.2 Erhöhung der Empfindlichkeit durch Yieldmessung

Eine wesentliche Erhöhung der Aussagekraft der Fluoreszenzmessungen wurde durch dasVerfahren der Yieldmessung erreicht. Charakteristisch für die Yieldmessung ist der Einsatzzweier Lichtarten:

• Das aktinische Licht (AL) stellt den Zustand des Blattes, d. h. die Größen kp, kt, und kf

über die Redoxzustände der ETC und die Quenchingmechanismen ein.

• Das modulierte Meßlicht (ML) detektiert den vom aktinischen Licht eingestellten Zustand.

Wie bei einem nicht-linearen elektronischen Bauelement unterscheidet man zwischeneinfachen Quotienten und differentiellen Quotienten. Im Falle der Fluoreszenz sind das derintegrale Fluoreszenzyield

IFY = (3.3)

und der differentiellen Fluoreszenzyield

dIdF y = (3.4)

Für hohe Meßlichtfrequenzen, während deren Periode sich das photosynthetische Systemnicht ändert, sind beide gleich, wie man an Gleichung 3.2. erkennt:Der differentielle und der integrale Fluoreszenzyield sind danach:

f

f t p

dF ky adI k k k

= =+ +

(3.5)

18

Das bedeutet, daß man mit sehr großen Meßlichtintensitäten arbeiten kann. Allerdingsgeschieht das doch nicht, weil das Meßlicht auch eine aktinische Wirkung hat.

Durch das niederfrequente, aktinische Licht werden die photosynthetischen Parameter, wieoben dargestellt, verändert, doch besitzt das Meßlicht ebenfalls eine aktinische Wirkung. Dadie Yieldmessung aber nur Prozesse detektiert, die langsamer als eine Meßlichtperiodeablaufen, wirkt das Meßlicht wie ein Gleichlichtanteil des aktinischen Lichtes.Die Trennung von Meßlicht und aktinischem Licht ist vorteilhaft, weil das aktinische Lichtzwei Signalteile in der Chlorophyll-Fluoreszenz erzeugt. Ein großer Teil ist direktproportional zum eingestrahlten Licht und enthält keine Informationen.Von Interesse ist nur die Abweichung von dem proportionalen Anteil, die dadurch entsteht,daß sich der Zustand des photosynthetischen Apparates geändert hat und damit auch dieQuenching-Faktoren kt und QA aus Gleichung 3.5. Diese Änderungen wirken auch auf dieAntwort auf das Yieldlicht und modulieren dessen Amplitude. Ein Korrelator trennt diesesgewünschte Signal von dem unerwünschten niederfrequenten Proportionalanteil der Antwortauf das aktinische Licht ab. Dadurch wird das informationsreiche Signal nicht mehr vominformationslosen Anteil verdeckt.

3.3 Das Zeitverhalten der Chlorophyll-Fluoreszenz

Abbildung 3.3: Phasen der Fluoreszenzantwort auf einen Sprung der Lichtintensität von IA

auf IB (Hansen et al., 1993)

19

Bei der Bestrahlung eines dunkeladaptierten Blattes mit Licht mittlerer Intensität zeigt dasFluoreszenzsignal die in Abbildung 3.3 dargestellte charakteristische Kurve. Diesesogenannte „Kautsky-Kurve“ (Kautsky und Hirsch, 1931) wird auch Induktionskurvegenannt.Nimmt man die Fluoreszenzantwort unter linearisierten Meßbedingungen auf (Hansen et al.,1991), so lassen sich diese durch eine Summe von Exponentialfunktionen beschreiben:

∑=

τ−

=

n

1i

t

iie-1af(t)

Die Zeitkonstanten τi können bestimmten dominierenden Prozeßen der Photosynthesezugeordnet werden. Die zugehörigen Amplitudenfaktoren ai stellen die Ausprägungen derProzesse dar. Die Zeitkonstanten in Abbildung 3.3 haben folgende Bedeutung:

τ1 < 1 s Lichtinduzierte Reduktion der Akzeptoren QA und QB

1 < τ2 < 10s Absaugen von Elektronen durch PS I, das über PQ verzögert auf QA

durchgreift, und zur Fluoreszenzerniedrigung führt (Hansen et al.1981).

2 < τ3 < 20s Reduktion der Akzeptoren von PS I und damit wieder verminderteSaugwirkung von PS I bewirkt eine Abnahme der Reoxidation von PQund damit einen Anstieg der Fluoreszenz (Vanselow, 1993).

3 < τ4 < 30s Verstärktes Energy-Quenching durch den Aufbau des pH-Gradientenüber den Thylakoidmembran (Hansen et al., 1987, 1993; Dau undHansen, 1989, 1990) und verstärktes photochemisches Quenchingdurch das Anlaufen des Calvin-Zyklus.

10< τ5a <100s unbekannte Zeitkonstante, mit Zunahme der Fluoreszenz auf dasNebenmaximum. Sie hängt mit der lichtinduzierten Ca2+-Aufnahme indie Chloroplasten zusammen(Vanselow und Hansen, 1989; Plieth undHansen, 1992 und 1998 sowie Scholz 1995).

50 < τ5b < 250s unbekannte Zeitkonstante.200 < τ6 < 1000s Lichtverteilungsregler (Dau und Canaani, 1990, 1992).

3.4 Messungen mit sättigenden Blitzen

Eine gewisse Standardisierung der Chlorophyll-Fluoreszenzmessungen wurde durch dieMethode der sättigenden Blitze errreicht. Hierbei werden zwei Extremzustände desphotosynthetischen Apparates bestimmt: die Werte der Fluoreszenz bei völlig oxidiertem(offenen) und bei völlig reduziertem (geschlossenen) Quencher QA.Wenn nach ausreichend langer Dunkeladaption gemessen wird, ist der Yield minimal ( F0 )(Abschnitt 3.5), denn die Quencher sind voll oxidiert und saugen kräftig Elektronen aus demReaktionszentrum ab. Wenn dann als aktinisches Licht ein sättigender Blitz gegeben wird,schließen sich die Reaktionszentren und das Yieldlicht kann den Fluß in die Reaktionszentrennicht mehr erhöhen. Der Yield wird maximal ( FM ).

20

Im helladaptierten Zustand kommt eine erhöhte thermische Deaktivierung hinzu. DieExtremwerte werden jetzt F0‘ bzw. FM‘ genannt. Aus diesen Werten kann man, wie inAbschnitt 3.5 beschrieben, das photochemische und nichtphotochemische Quenchingberechnen.Diese sogenannte Sättigungsblitzmethode (Schreiber et al., 1986) gilt als standardisierteMeßmethode dieser Größen, die mit dem von Schreiber entwickelten und durch die FirmaWalz kommerziell vertriebene Puls-Amplituden-Modulierten Fluorometer (PAM) durch-geführt werden kann.

3.5 Messungen mit dem PAM

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der durch die Sättigungsblitzmethode ermitteltenFluoreszenzniveaus: F0 und FM = Fluoreszenz nach Dunkeladaption bei geöffneten bzw.geschlossenen Reaktionszentren; FM‘ und F0‘ = im helladaptierten Zustand bei geschlossenenbzw. geöffneten Reaktionszentren; ML = Meßlicht, SB = sättigender Blitz (Halogenlampe,0.5 - 2.0 s), AL = aktinisches Licht

21

Das PAM ermittelt die variable Fluoreszenz durch ein festgelegtes Lichtprotokoll (Abbildung3.4). Hierbei verändert das aktinische Licht (AL) den Zustand des photosynthetischenApparates, während das Meßlicht (ML) den vom aktinischen Licht eingestellten Zustandmißt.

1. Das Blatt wird zur Messung der Grundfluoreszenz F0 dunkeladaptiert und mitMeßlicht (ML) von geringer Intensität bestrahlt. Wenn die Reoxidation von −

AQ durchdie Saugwirkung von PS I durch fernrotes Licht verstärkt wird, sind alleReaktionszentren von PS II geöffnet und QA vollständig oxidiert (QA = 1 inGleichung 3.2). Somit kann eine maximale Anzahl an Elektronen in die ETC fließen,die Fluoreszenz ist minimal und photochemisches Quenching tritt maximal auf (qP =1, qN= 0 oder kP = maximal, k t = minimal). qN ist die thermische Deaktivierung,die durch die Ratenkonstante kt beschrieben wird.

2. Ein sättigender Lichtblitz von 0,5 s – 2 s Dauer mit einer Intensität von ca. 1000 Wm-2

reduziert den Akzeptor QA vollständig (QA = 0) und verursacht eine maximaleFluoreszenzantwort FM. Völlig reduziert kann der Akzeptor QA bei zusätzlichemMeßlicht keine Elektronen mehr aufnehmen und es tritt kein Quenching auf (qP = 0;qN = 0 bzw. kP = 0 und kt = noch minimal)

3. Durch das Zuschalten von aktinischem Licht (AL) mittlerer Intensität erhält man dieKautsky-Induktionskurve, die nach einem schnellen Anstieg langsam auf ein bzw.mehrere Nebenmaxima abfällt bis sie den Gleichgewichtszustand („Steady-State“)erreicht (1 > qP , qN > 0 bzw. kp = maximal, kt > minimal).

4. Gibt man während der Induktionskurve in bestimmten zeitlichen Abständen erneutsättigende Lichtblitze auf das Blatt, so wird die maximale Fluoreszenz FM‘ beihelladaptiertem Zustand erzeugt, die im Vergleich zu FM durch anwachsendesnichtphotochemisches Quenching verringert ist (qP = 0; 0 < qN < 1 bzw. kP = 0,kt > minimal).

5. Die Grundfluoreszenz F0‘ des helladaptierten Zustandes wird erreicht, wenn man dasaktinische Licht ausschaltet. Wegen des nichtphotochemischen Quenchings kann F0‘tiefer als F0 liegen ( qP = 1; 0 < qN < 1 bzw. kp = max, kt > minimal).

Aus den gemessenen Größen F, F0, F0‘, FM und FM‘ lassen sich das photochemische undnichtphotochemische Quenching berechnen (Schreiber et al., 1986; van Kooten und Snel,1990):

'F 'FF 'F

q0M

MP −

−= und

0M

0MN F F

'F 'F1q

−−

−= (3.6 a,b)

Das FM -F 0 –Verhältnis gibt Auskunft über den physiologischen Zustand des Blattes. Eingesundes Blatt erreicht FM/F0-Werte von 4-5, während niedrigere Werte (2-4) auf einenschlechteren physiologischen Zustand schließen lassen.

22

Kapitel 4

Motivation für die (Weiter-)Entwicklung derFluoreszenz-Clamp-Maschine

Geräte zur Messung von Fluoreszenz, mit dem die Vorgänge der Photosynthese untersuchtwerden, sind schon seit langem im Einsatz. Das im letzten Kapitel behandelte, von Schreiberet al. (1986) entwickelte Puls-Amplituden-Modulierte Fluorometer (PAM) ist dasStandardgerät und in quasi jeder Arbeitsgruppe vorhanden, die sich mit Photosynthesebeschäftigt. Dabei ist die Fluoreszenz die Meßgröße und die Lichtintensität des Meßlichteskonstant. Es wird beim PAM also die Höhe des Exzitonensees (ein Potential) gemessen.Die FC-Maschine hält dagegen die Fluoreszenz durch einen Regelkreis konstant und liefertals neue Meßgröße die Meßlichtintensität. Dabei wird die Höhe des Exzitonensees konstantgehalten und die Flüsse aus ihm werden direkt gemessen. Da die FC-Maschine Vorteilebesitzt, wenn unter Bedingungen, bei denen hohe Flüsse auftreten, gemessen werden soll(Schinner et al. 2000), wird in der Arbeitsgruppe Biophysik in Kiel an der ständigenWeiterentwicklung der Maschine gearbeitet.

4.1 Direkte Flußmessungen

In Kapitel 3 wurde die Gleichung für den Zusammenhang zwischen Fluoreszenz F und demZustand des photosynthetischen Apparates und den Ratenkonstanten kf, kp und kt fürFluoreszenz, photochemische Nutzung und thermische Deaktivierung dargestellt:

aIkkk

kEkFfpt

ff ++

== (4.1)

Im Rahmen der aus elektrischen Netzwerken bekannten Begriffsbildung ist F einePotentialgröße.Gleichung 4.1 kann aus dem Zusammenhang zwischen den Flüssen von eingestrahlten undabfließenden Exzitonen (Dau, 1994; Schinner et al. 2000) hergeleitet werden.

a I = Φt + Φf + Φp = kt E + kf E + kp E (4.2)

dabei ist Φt der Exzitonenfluß in die thermische Deaktivierung,Φf der Exzitonenfluß in die Fluoreszenz,Φp der Exzitonenfluß in den photosynthetischen Apparat.

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Die verschiedenen Aspekte der Potential- oder Flußmessung sind im Appendix von Schinneret al. (2000) ausgeführt. In den folgenden beiden Abschnitten werden Meßverfahrenvorgestellt, die die Potentialmessung oder die Flußmessung in den Vordergrund stellen; dasPAM für Potentialmessungen und die FC-Maschine für Flußmessungen.

4.2 Das Fluoreszenz-Clamp Verfahren (FC)

Das Topfmodell in Abbildung 3.2 oder Gleichung 4.2 macht die Funktionsweise des FC-Prinzips deutlich. Der Lichtfluß (I) ist gleich der Summe der Exzitonenflüsse aus derAntenne. Wenn nun ein Regelkreis die Fluoreszenz (speziell den Yield) und damit die Höhedes Exzitonensees E konstant hält, sind die dazu notwendigen Änderungen des Lichtflusses(Intensität) gleich der Summe der Änderungen der Flüsse aus dem Antennen-Pool. DieLichtintensität ist damit ein direktes Maß der Flüsse. Hierbei wird allerdings angenommen,daß die Ratenkonstante der Fluoreszenz kf und der Absorptionsquerschnitt a konstant bleiben.Für kf ist dies erfüllt. a kann sich im Bereich von 10 min ändern (Dau und Canaani, 1990).Dies wäre bei solchen Messungen stets zu diskutieren.

Bei den traditionellen Verfahren (Light-Clamp, PAM) ist also die Meßgröße die FluoreszenzF. Bei der FC-Maschine hingegen ist dies die Einstrahlungsintensität I. Der Vorteil der FC-Maschine wird bei einer Ableitung beider nach Φp deutlich:

Aus Gleichung 4.1 folgt:

( ) pfpt

fp

fpt

fp2

fpt

f dkkk

kEdkkkk

kdkkkk

aIkdF Φ++

−=++

−=++

−= (4.3a)

Aus Gleichung 4.2 folgt:

pda1dI Φ= (4.3b)

Der Zusammenhang von Meßgröße und Φp ist daher bei Light-Clamp arbeitspunktabhängigund ändert sich mit kt und kp.Dagegen ist der Zusammenhang von Meßgröße und Φp bei der FC-Maschine proportional undarbeitspunktunabhängig, wenn sich der Absorptionsquerschnitt a der PS II-Antennen sichnicht ändert. Dies geschieht, wenn der LHC-Regler (Dau und Canaani, 1990) die beweglichenLHC-Antennen verschiebt.

4.3 Die FC-Maschine von Schinner

Die Vorgängerversion der hier entwickelten digitalen FC-Maschine wurde von Schinner et al.(2000) entwickelt (Abbildung 4.1):Sie besteht aus zwei Regelkreisen: Einen für die Hellphase, in der das Meßlicht so geregeltwird, daß die Fluoreszensantwort des Blattes konstant ist und damit der Yield als Regel-LED-

24

Intensität gemessen wird. Und einen Regelkreis für die Dunkelphase, in der dieAusgangsspannung des Photodetektors auf Null geregelt wird, damit die Veränderungen desHintergrundlichtes in der Hellphase nicht mit gemessen werden. Diese beiden Regelkreisewerden abwechselnd mit einer festen Zeitdauer (Hellregelkreis 1.5 ms, Dunkelregelkreis3.5 ms) benutzt.Der Hellregelkreis besteht aus OP1 (Photodetektor (FD)), OP2, OP3 (Vergleichsstufe (VS))und der LED-Ansteuerung (HA). Bei OP3 wird Soll- und Istwert der Hellregelungmiteinander verglichen. Der Istwert wird vom Photodetektor erzeugt und ist eine zurFluoreszenz des Blattes proportionale Spannung und der Sollwert eine vom Computererzeugte Spannung. Der Regler OP3 ist als Addierer geschaltet und verstärkt die Differenzvon Soll- und Istwert. Das Ausgangssignal von OP3 verändert die Intensität der LED, bis derIstwert den Sollwert kompensiert. Der Istwert wird in S&H1 gespeichert, so daß OP3während der Dunkelphase nicht übersteuert, obwohl während der Dunkelphase der Sollwertimmer noch anliegt und der Photodetektorausgang auf Null geregelt wird. Die Lichtintensitätspeichert als dazu proportionale Spannung S&H3, wo sie mittels AD-Wandler gespeichertwerden kann. In der Dunkelphase wird die Regel-LED durch FET1 ausgeschaltet.

Abbildung 4.1: Zusammenfassende Darstellung der FC-Maschine nach Schinner et al. (2000)

25

Der Dunkelregelkreis besteht aus OP1 (Photodetektor (FD)), OP4 und dem Transistor T1

(Dunkelregelung (DR)). Dieser kompensiert den durch das Hintergrundlicht verursachtenPhotodiodenstrom, das bis zu 1000 mal heller als das Meßlicht ist, indem es durch T1 einenStrom einspeist, der den Photodiodenstrom kompensiert und so den Ausgang desPhotodetektors auf null regelt. In S&H6 wird am Ende der Dunkelphase die dafür nötigeSpannung festgehalten und wird so in der Hellphase gehalten. In S&H2 wird das Signal desPhotodetektors am Ende der Dunkelphase gespeichert und in der Hellphase vomPhotodetektorsignal abgezogen, um zu gewährleisten, daß das die Hellphase nicht dadurchgestört wird, daß der Dunkelregler es nicht ganz geschafft hat, das Hintergrundlicht zukompensieren.Sämtliche Vorgänge werden über die Eingänge V1 bis V3 mit fest vorgegebener Taktung anund aus geschaltet.Ungenauigkeiten entstehen bei der FC-Maschine nach Schinner durch Fehler der S&H-Bausteine.

4.4 Messungen mit der FC-Maschine

Mit der FC-Maschine können die zu FM und F0 (Abschnitt 3.4) äquivalenten ExzitonenflüsseΦM und Φ0 gemessen werden. Der Zusammenhang zwischen ihnen ist invers (Schinner et al.,2000):

• maximale Fluoreszenz FM bei minimalem Exzitonenfluß ΦM

• minimale Fluoreszenz F0 bei maximaler Exzitonenfluß Φ0

Für den Exzitonenfluß Φ werden wieder die gleichen Indizes wie für die Fluoreszenz Fverwendet und bezeichnen wieder den Zustand von QA. Es ist QA bei ΦM maximal und bei Φ0

minimal reduziert.Bei den Messungen mit der FC-Maschine werden die Änderungen der Ratenkonstanten kp

und kt betrachtet. Das nichtphotochemische Quenching qN wirkt über die Ratenkonstante kt,das photochemische Quenching qP über die Ratenkonstante kp. Für die FC-Maschine spielendie Quenching-Parameter eine geringe Rolle. Diese können zwar auch berechnet werden(Schinner et al., 2000), aber die FC-Maschine liefert die Flüsse in Thermik und Photochemiedirekt. Die Quenching-Parameter (Gleichungen 3.6, 4.3a) enthalten daher noch Anteile desanderen Prozesses (Havaux et al., 1991). Sie sind nicht „rein“, sondern gekoppelt.Es wird wie beim PAM die Sättigungsblitzmethode nach (Schreiber et al., 1986) mit demgleichen Lichtprotokoll verwendet.Durch die Sättigungsblitzmethode kann man bei der FC-Maschine die Flüsse direkt ablesen.Die Thermik ergibt sich aus den Spitzen der Peaks, die während des sättigenden Blitzesgemessen werden. Die Höhe der Blitzpeaks ergibt den Elektronenfluß in die ETC.In Abbildung 4.2 ist eine Messung nach der Sättigungsblitzmethode mit der FC-Maschine vonSchinner dargestellt.

26

-15.00000

-10.00000

-5.00000

0.00000

5.00000

10.00000

15.00000

20.00000

25.00000

30.00000

35.00000

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

t in s

Φ ΦΦΦ in

will

kürli

chen

Ein

heite

nΦΦΦΦ0

ΦΦΦΦM

ThermikLICHT (ΦΦΦΦM')

ThermikLICHT + El.-Fluß

ThermikDUNKEL

ThermikDUNKEL + El.-FlußΦΦΦΦ0'

aktinischesLicht an

kp < maxkt > min

kp = maxkt > min

aktinisches Licht aus

kp = maxkt = min

kp = 0kt = min

kp = 0kt > min

kp = 0kt > min

Abbildung 4.2: Darstellung einer Messung mit der FC-Maschine von Schinner nach derSättigungsblitzmethode. Die Flüsse können direkt abgelesen werden.

Da die Werte für Flüsse und zugehörige Fluoreszenz invers sind, sieht eine FC-Messung fastso aus, als wenn man eine PAM-Messung auf den Kopf stellt.

1. Zur Messung von Φ0 ist die Situation wie bei 1. In Abschnitt 3.5 (PAM). Das Blattwurde vorher dunkeladaptiert, und das Meßlicht hat nur eine kleine Intensität(3 W/m2). QA ist vollständig oxidiert und es können maximale Anzahl von Elektronenin die ETC fließen (kp = max, kt = min).

2. Durch einen sättigenden Blitz von 1s Dauer und einer Intensität von ca. 1000 W/m2

wird QA vollständig reduziert (ΦM). Da der Akzeptor QA völlständig reduziert ist, kanner durch zusätzliches Meßlicht keine Elektronen mehr aufnehmen (kp = 0, kt = min).

3. Das aktinische Licht wird eingeschaltet, so daß eine Kurve entsteht, die an einespiegelbildliche Kautsky-Induktionskurve erinnert (Elektronen-Fluß + ThermikLICHT inAbbildung 4.2). Durch das aktinische wird QA reduziert, und der Fluß in dieReaktionszentren nimmt ab (kp wird kleiner). Der darauffolgende Anstieg desGesamtflusses entsteht durch die Reoxidation von QA durch die Saugwirkung von PS I(kp wird wieder größer) und durch das Anwachsen der thermischen Aktivierung(kt > minimal).

4. Wenn man während des aktinischen Lichtes Blitze auf das Blatt gibt, wird QA

vollständig reduziert und man mißt allein die Thermik (ΦM‘) (kp = 0, kt > min) .

27

5. Nach Ausschalten des aktinischen Lichtes kann man den zur Grundfluoreszenz F0‘ imhelladaptierten Zustand zugehörigen Fluß (Φ0‘) messen. Bei großen Flüssen kommtder Vorteil der direkten Messung der Flüsse bei der FC-Maschine voll zum tragen.Da direkt nach dem Ausschalten des aktinischen Lichtes kt und kp noch sehr groß sind,wird das Fluoreszenzsignal trotzdem nicht sehr viel kleiner (Gleichung 4.3a), so daßder Eindruck entsteht, als würden die Flüsse nicht sehr groß werden (F0‘ inAbbildung 3.4). Bei der FC-Maschine tritt keine solche Verzerrung auf und es tritt eingroßer Peak nach dem Ausschalten des aktinischen Lichtes auf (Φ0‘ in Abbildung 4.2).

6. Das aktinische Licht ist aus. Die Thermik geht wieder zurück und der Elektronenflußnimmt wieder zu.

4.5 Motivation für die Weiterentwicklung

Ein großes Problem bei der in Analogtechnik aufgebauten Maschine von Schinner et al.(2000) war der Abgleich der Regelkreise. Auch im Betrieb war häufig eine Anpassung an dasjeweilige Blatt erforderlich und dies erforderte sehr fundierte Kenntnisse derReglungstechnik, um die Frequenzgänge und Verstärkungen so abzustimmen, daß einbrauchbarer Kompromiß zwischen wilden Schwingungen und geringer Regelabweichunggefunden wurde. Deshalb soll untersucht werden, ob eine softwaremäßige Verwirklichunghöheren Komfort in der Bedienung und vielleicht auch bessere Regeleigenschaften erbringt.

28

Kapitel 5

Die Fluoreszenz-Clamp-Maschine

In der vorliegenden Diplomarbeit sollen die Regelkreise in Analogtechnik, die von Giannikos(1995), Schinner (1997), Schinner et al. 2000) entwickelt wurden, durch digitale Regler mitendlicher Einstellzeit auf Software-Basis ersetzt werden. Angestrebt ist ein Ersatz der rechtmühseligen Abgleichsarbeiten an den Frequenzgängen der schnellen Regelverstärker undSample-and-Hold Bausteine durch Software, auch im Hinblick auf eine möglicheBeschleunigung der Einstellprozesse.

5.1 Prinzip des Meßaufbaus

In Abbildung 5.1 ist das Meßprinzip der in dieser Arbeit entwickelten FC-Maschinedargestellt, der im Prinzip dem bestehenden analogen Aufbau ähnlich ist, nur daß dieSignalverarbeitung im Computer geschieht.

Abbildung 5.1: Prinzip der FC-Maschine: Der Regler stellt über die Stellgröße u dieIntensität der Regel-LED so ein, daß die vom Photodetektor erzeugte Regelgröße x gleichdem Sollwert W0 ist. Die Stellgröße u ist das zu messende Signal. Die Hintergrundlicht-LEDs(HL-LEDs) erzeugen sättigendes Blitzlicht und aktinisches Licht auf dem Blatt.

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Die Fluoreszenz des Blattes wird wie beim analogen Aufbau mit einer Photodiode (HamatsuS 3590-01) gemessen. Der Rotfilter (RG 645, Schott Jena) vor der Photodiode trennt dasLicht der LEDs ab und läßt nur das Fluoreszenzlicht durch. Da bei einer Photodiode derStrom, aber nicht die Spannung proportional zur Lichtintensität ist, speist die Photodiodeihren Strom in einen analogen Strom-Spannungswandler ein. Meßaufnehmer, die einephysikalische Größe (hier Licht) in ein elektrisches Signal umwandeln, sind im allgemeinenaus analogen Bauelementen aufgebaut. Es folgt, wie in Abbildung 5.3 gezeigt sogar noch eineweitere analoge Stufe, um die Signalspannung auf Werte zu verstärken, die den Bereich desAnalog-Digital-Wandlers (ADW) gut ausnutzen.

Der digitale Teil umfaßt die Berechnung des Steuersignals (Stellgröße u) für die Meßlicht-LED aus der Differenz zwischen Sollwert W0 und dem vom ADW-gelieferten Istwert(Regelgröße x), also dem Chlorophyll-Fluoreszenzsignal. Diese Größe wird dieRegelabweichung xd genannt.

xd = W0 - x

Der Regelkreis wird wieder über ein analoges Glied geschlossen. Die Stellgröße u steuert miteinem DA-Wandler die Meßlicht LED über einen Transitorverstärker so an, daß das Meßlichtgerade die Chlorophyll-Fluoreszenz erzeugt, die an der Vergleichstufe im Computer denrichtigen Wert (nämlich Istwert = W0) liefert und somit die Regelabweichung xd = 0 wird.Die Intensität der Meßlicht-LED IML ist proportional zur Stellgröße u und wird somit alsMeßgröße für die Flüsse vom Computer aufgezeichnet.Die Hintergrundlicht-LEDs (HL-LEDs) erzeugen das helle Hintergrundlicht, das alssättigender Blitz oder aktinisches Licht auf das Blatt gebracht wird.Die Meßkammer schützt vor störenden Lichteinflüssen.

5.2 Die Verkopplung zweier Regelkreise

Abbildung 5.1 gab einen vereinfachten Aufbau der FC-Maschine. Die reale Maschine bestehtjedoch aus zwei Regelkreisen:1. Ein Regler für das Yieldsignal (Antwort auf das Meßlicht)2. Ein Regler für das Hintergrundlicht.

Der Hintergrundregler ist notwendig, weil Signale mit sehr großem Unterschied verarbeitetwerden müssen. Das Meßlicht hat z. B. eine Intensität von 1 bis 10 Wm-2, das sättigendeHintergrundlicht 1000 Wm-2. Wenn der Photodetektor so dimensioniert wird, daß die vomsättigenden Licht erregte Fluoreszenz den Photodetektor nicht übersteuert, kommt das vomMeßlicht induzierte Signal nicht aus dem Verstärker- oder Bitrauschen heraus. Der bereitsvon Schinner et al. (2000) benutzte Trick ist, in den Dunkelpausen des Meßlichtes einenKompensationsstrom aus einem Transistor so einzustellen, daß der Ausgang desPhotodetektors auf Null geht, wird auch für die neue FC-Maschine verwendet.Deshalb gibt es auch bei neuen Version der FC-Maschine eine Hell- und Dunkelphase:

30

Der elektronische Aufbau mit den DA- und AD-Wandlern als Verbindung zumComputerprogramm ist in Abbildung 5.2 dargestellt. Der in Abbildung 5.3 genauerdargestellte Photodetektor (FD), enthält zusätzlich den Stromkompensationstransistor derDunkelregelung (DA), der über DAWD angesteuert wird.

Abbildung 5.2: Die neuen Regelungskreise mit Photodetektor (FD), Hellregleransteuerung(HA) und Dunkelregleransteuerung (DA), den Wandlern und dem Computer (Regler),T1 = 2N3904

Der Dunkelregelkreis (Hintergrundlichtkompensation) besteht aus dem DA-Wandler DAWD,der Dunkelregleransteuerung (DA), dem Photodetektor (FD), dem AD-Wandler ADW1 undADW2 für den Fall der Übersteuerung der zweiten Stufe des Photodetektors und demComputer (Regler). Der Dunkelregelkreis bringt während der Dunkelphase durchVeränderung der Spannung an der Dunkelregleransteuerung (DA) mittels DAWD die zweiteStufe des Photodetektors auf ungefähr 0 V (von ADW1 gemessen). Dies geschieht, indemdurch die Dunkelansteuerung, die eine spannungsgesteuerte Stromquelle darstellt, ein Stromeingespeist wird, der den Strom der Photodiode kompensiert. Die Fluoreszenz des Blatteswird während der Dunkelphase nur durch das Hintergrundlicht erzeugt.Der Hellregelkreis besteht aus dem DA-Wandler DAWH der Leistungsansteuerung derMeßlicht-LED (HA), dem Blatt, dem Photodetektor (FD), dem AD-Wandler ADW1 und demComputer (Regler). Der Hellregler regelt während der Hellphase durch Veränderung derSpannung an der Hellregleransteuerung (HA) durch DAWH die Meßlicht-LED (Regel-LED)so, daß das Fluoreszenzlicht des Blattes einen so großen Strom in der Photodiode erzeugt, daßam Ausgang der zweiten Stufe des Photodetektors durch ADW1 der Sollwert gemessen wird.Am Ende der Hellphase wird die Meßlicht-LED ausgeschaltet, indem 0 V an dieHellregleransteuerung (HA) durch DAWH angelegt wird.

Beide Regelkreise verwenden also den Photodetektor (FD) und den Computer (Regler)gemeinsam, nur steuern sie diese verschieden über die Hellregleransteuerung (HA) beim

31

Hellregelkreis und die Dunkelregleransteuerung (DA) beim Dunkelregelkreis an. Zusätzlichkommt beim Hellregelkreis das Blatt hinzu.

5.3 Der Photodetektor

Der in Abbildung 5.3 dargestellte und im Rahmen dieser Arbeit verwendete Photodetektor istim wesentlichen von Schinner (1997) übernommen und durch eine zweiteNachverstärkungsstufe erweitert worden.Die erste Stufe des Photodetektors ist ein Strom-Spannungs-Wandler, der den Strom derPhotodiode (Hamatsu S 3590-01) über den Rückkopplungswiderstand (RL = 1MΩ) einesOperationsverstärkers in eine Spannung umwandelt. Als OP1 wurde der `Difet`-Operationsverstärker OPA 602 von Burr Brown verwendet, da sich dieser durch einenbesonders niedrigen Biasstrom (maximal ±1pA) auszeichnet. Das Rauschen bei einem Strom-Spannungswandler erzeugt hauptsächlich der Biasstrom, daher sorgt ein niedriger Biasstromfür ein gutes Signal-Rauschverhältnis. Außerdem ist der Strom der Photodiode sehr klein. Derbei Messungen mit dem Hellregelkreis entstehende Sollwert W0 hinter der ersten Stufe ist50 mV und das Rauschen beträgt ca. 1 mV, daß das Auflösungsvermögen begrenzt.Die Bandbreite des OPA 602 ist mit 6.5 MHz zwar verhältnismäßig niedrig, aber beim Testmit einem anderen Breitbandverstärker (OPA 655) der ausdrücklich für das Betreiben alsStrom-Spannungswandler einer Photodiode empfohlen wird und einen Biasstrom von 5pAhat, erzeugte dieser ein ca. 20 mal so großes Rauschen.

Abbildung 5.3: Photodetektor mit erster Stufe als Strom-Spannungswandler (OP1) undzweite Stufe als Breitband-Nachverstärkung (OP2)

32

Der Kondensator CL parallel zum Rückkopplungswiderstand RL des Strom-Spannungswandlers dient zur Schwingungsunterdrückung und ist gegenüber der Version vonSchinner (1997) von 5.6 pF auf 10.4 pF erhöht worden, da nur bei über 9 pF die Polstellenreell sind. Die in dieser Arbeit zur Anwendung kommende Reglertheorie auf endlicheEinstellzeit ist nur für reelle Polstellen anwendbar.Die zweite Stufe des Photodetektors ist ein nicht-invertierender Verstärker mit einerVerstärkung von

10R

RRV1R

2R1R =+= .

Dieser verstärkt das Signal auf eine für den AD-Wandler (ADW1) gut meßbare Größe miteinem Sollwert von W0 = -0.5V. Da bei dieser Verstärkung das Auflösungsvermögen des AD-Wandlers (2.5 mV) ca. 4 mal so groß wie das Rauschen von ca. 10 mV ist, würde eine höhereVerstärkung keine höhere Auflösung bringen, da das Rauschen im wesentlichen von derersten Detektorstufe stammt. Es wurde ein Breitbandverstärker (OPA 687) mit einerBandbreite von 3.8 GHz als OP2 verwendet, damit dieser als unendlich schnell betrachtetwerden kann (siehe Abschnitt 6.7.1.3).Für den Fall der Übersteuerung der zweiten Stufe, kann das Signal auch von der erstenDetektorstufe abgenommen werden (ADW2).Die Widerstände RD =100 Ω dienen der Schwingungs- und Rauschunterdrückung und sindnicht geschwindigkeitshemmend.Beide Operationsverstärker erhalten als Spannungsversorgung ±5 V. Aus dieser macht derOPA 602 eine mögliche Ausgangsspannung von ±2 V und der OPA 687 von ±3 V.

5.4 Der Leuchtdiodenkopf (Kuppel)

Es werden drei Lichter benötigt:1. das Meßlicht von möglichst kleiner Intensität, das den Zustand des Blattes mißt,2. helle sättigende Blitze von hoher Intensität (> 700 Wm-2) (Schinner, 1997) und3. das aktinische Licht (einige 10 Wm-2) zum Einstellen des physiologischen Zustandes des

Blattes.

In bisher in der Arbeitsgruppe Biophysik in Kiel verwendeten FC-Maschinen wird dasaktinische Licht und das Meßlicht durch LEDs erzeugt und das Blitzlicht von einerHalogenlampe über einen Lichtleiter auf das Blatt gebracht. Das Blitzlicht wird dabei durcheinen Shutter, der von einem Schrittmotor bewegt wird, an und aus geschaltet. DieserVorgang, den Shutter zu öffnen und zu schließen, dauert ca. 10 –20 ms.In der neuen während dieser Arbeit entwickelten Version der Lichtsteuerung werdensämtliche drei Lichter durch LEDs vom Typ “NSBP500“ der japanischen Firma Nichiaerzeugt, da LEDs sehr viel schneller sind und es so möglich wird, auch das Blitzlicht schnellzu schalten.Um dies zu ermöglichen, wurde ein großer Leuchtdiodenkopf in Form eines Halbrundes(Kuppel) gebaut, in dem 69 LEDs auf einen Punkt bei gleichem Abstand von ca. 2.5 cmausgerichtet werden können, so daß 65 von diesen LEDs an diesem Punkt genügend Intensität(ca. 800 Wm-2) für das Blitzlicht erzeugen.

33

Das aktinische Licht wird auch von diesen 65 LEDs erzeugt, allerdings bei verminderterIntensität. Über einen 12-bit-DA-Wandler ist der Diodenstrom fein einstellbar.Das Meßlicht wird von einer einzigen LED dieses Typs (Regel-LED) erzeugt.

Abbildung 5.4: Anordnung von LEDs, Blatt und Photodetektor in der Kuppel. Die LEDs undder Photodetektor sind auf einen Punkt gerichtet, wo sich das Blatt befindet.

5.5 Wahl der LEDs und Filter

Für das aktinische und Meßlicht wurden in den Vorgängerversionen der FC-Maschine roteLEDs verwendet. Im folgenden wird erklärt, warum sich blaue besser eignen und für die neueFC-Maschine verwendet wurden.Das Absorptionsspektrum von Chlorophyll (in Abbildung 5.5 B, durchgezogene Linie) hatzwei Maxima bei 445 nm und bei 690 nm. Darüber in Abbildung 5.5 A sind zwei Spektrenvon Leuchtdioden eingezeichnet, die von Andreas Ruser mit einem Shimadzu-Spektrometergemessen wurden. Links eine in dieser Arbeit verwendete blaue LED mit einerPeakwellenlänge von 465 nm, rechts eine in Vorgängerversionen verwendete rote LED miteiner Peakwellenlänge von 660 nm (Oshino, OL-SUR 14180-T). Bei beiden LED-Typen fälltder Wellenlängenbereich in ein Absorptionsmaximum des Chlorophylls.Um nur die Fluoreszenz des Blattes und nicht auch das Anregungslicht der LEDs (besondersdas Meßlicht) zu detektieren, muß der überlappende Wellenlängenbereich der LEDs durchFilter vor den LEDs und vor dem Fluoreszenzdetektor ausgeblendet werden. In der Abbildung5.5 C sind die Transmissionsspektren zweier Rotfilter und eines Blaufilters der Firma Schotteingezeichnet. Bei roten LEDs als Meßlicht muß das Filter RG 9 verwendet werden, da es dasLicht der roten LEDs recht gut abhält. Da aber ein großer Teil des Fluoreszenzlichtes vondem RG 9 nicht durchgelassen wird, geht ein großer Teil des Nutzsignales verloren.

34

Bei der Verwendung von blauen LEDs tritt dieses Problem nicht auf, da zwischen LED-Lichtund Fluoreszenz, ein Zwischenraum von ca. 100 nm ist. Es ergibt sich dadurch dieMöglichkeit, das Filter so zu wählen, daß das LED-Licht fast vollständig abgehalten und dasFluoreszenzlicht kaum abgeschwächt wird.Da das Spektrum der blauen LEDs erst bei ca. 600 nm auf ein Niveau von unter 0.1 % vomHauptmaximum fällt, wurde als Rotfilter ein RG 645 gewählt (Abbildung 5.4, 5.5 C). Dieblauen LEDs haben allerdings noch ein kleines Maximum von ca. 2% der Intensität desblauen Maximums bei ca. 900nm, so daß das Meßlicht noch durch einen zusätzliche BlaufilterBG 39 (Abbildung 5.5 C links und Abbildung 5.4) gefiltert wird.Bisher wurden keine blauen LEDs verwendet, da sie eine erheblich geringereLichtintensitäten hatten als rote LEDs. In den letzten Jahren hat sich das allerdings geändert,so daß blaue LEDs mittlerweile auch nicht mehr viel teurer sind als rote. Die blauen LEDsvom Typ „NSBP500“ der Firma Nichia erwiesen sich als die hellsten der vielen von AndreasRuser getesteten und werden deshalb in dieser Arbeit verwendet. Sie erzeugen eineLichtintensität von ca. 12 Wm-2 pro LED in ca. 25 mm Abstand mit 65 auf einen Punktgerichteten LEDs mit dem Photometer LI-250 der Firma Licor (Lincoln, USA) gemessen. Dadas Licht der LEDs in der Mitte nicht am hellsten ist, sondern auf einem Kreis von ca. 0.5 cmDurchmesser (bei 2.5 cm Abstand) am hellsten ist, kommt man bei Messungen mit einzelnenLEDs auf niedrigere Intensitäten (ca. 5Wm-2).

35

Abbildung 5.5: Spektren von (A) LEDs, (B) Chlorophyll und (C) Filter der neuen FC-Maschine (RG 645, BG 39) und der Version von Schinner (RG 9)

36

5.6 Die LED-Ansteuerung von aktinischem Licht und Blitzlicht

Die 65 LEDs für aktinisches Licht und Blitzlicht sollen gemeinsam über einen DA-Wandlergesteuert werden. Je fünf Leuchtdioden werden in Serie geschaltet und von einem Transistor2N 3904 versorgt. Die Betriebsspannung von 30 V reicht für 5 Dioden (5 mal 4 V) gut. Aufeiner Platine befinden sich 13 Transistoren für 5er-LED-Gruppen mit der in Abbildung 5.5gezeigten Schaltung. Im folgenden wird diese Schaltung dimensioniert:Die verwendeten blauen LEDs dürfen maximal mit einem Strom von 20 mA betriebenwerden.Daraus folgte für den Emitterwiderstand als Strombegrenzer der verwendeten Schaltung beieiner maximalen Ansteuerspannung des DA-Wandlers von 5V an der Basis des Transistors.

Ω=−= 220mA20

V6.0V5R E

Abbidung 5.6: Durch jede LED-Ansteuerung werden 5 LEDs in Serie betrieben, so daß mit13 Einheiten 65 LEDs gleichzeitig angesteuert werden können. T = 2N3904, RE = 220 Ω,RB = 48 Ω

37

5.7 Der Digitalbereich

Daß Aktoren (LEDs) und Sensoren (Photodetektor) im allgemeinen analog aufgebaut werden,läßt sich kaum umgehen. Aber der Regler dazwischen kann heutzutage durch Digitalreglerersetzt werden. Seine Verbindung mit der Außenwelt geschieht über AD-Wandler und DA-Wandler. Die Verwirklichung der Regler durch Algorithmen wird im nächsten Kapitelbesprochen.

38

Kapitel 6

Entwurf des Reglers auf endliche Einstellzeit

Wie in Abschnitt 5.1 bereits erklärt, ändert ein Regler die Stellfunktion u, um dieRegelgröße x auf den Sollwert W0 zu regeln.In diesem Kapitel wird die Stellfunktion u des in der neuen Version der FC-Maschineverwendeten Reglers auf endliche Einstellzeit für den verwendeten Fall (2. Ordnung und eineTotzeit) hergeleitet. Aufgrund der großen Gemeinsamkeiten von Hell- und Dunkelregelkreis,wird die gleiche Stellfunktion u(t) in beiden Regelkreisen eingesetzt (Erläuterung in Abschnitt6.7.1.3).

6.1 Einführende Grundlagen

6.1.1 Abtasten

Abtasten erfolgt in der Regel durch ein Abtast-Halte-Glied. In der neuen FC-Maschine tastendie AD-Wandler (ADW1 und ADW2) den Ausgang des Photodetektors ab.Bei der Abtastung mit der Abtastzeit T einer Zeitfunktion f(t) entsteht die zeitdiskreteFunktion

f(kT) = fk , k = 0, 1, 2, 3, ....

oder als Pulsfolge geschrieben

∑∞

=

δ=0k

k* kT)-(t f)t(f

6.1.2 Die Laplacetransformation

Auch in dieser Arbeit wird von der Möglichkeit Gebrauch gemacht, daß durch Wechsel vonZeit- in den Frequenzbereich einige Probleme leichter zu bearbeiten sind. Die dazunotwendige Laplacetransformation vom Zeitbereich in den Frequenzbereich ist

F(s) = Lf(t) = ∫∞

−0

dt)stexp()t(f

und zurück

f(t) = L -1F(s) =

>π

<

∫ 0tds)stexp()s(Fj2

10t0

39

Nach der üblichen Konvention werden im folgenden Funktionen aus dem Zeitbereich kleingeschrieben (f(t)) und die Funktionen im Frequenzbereich groß geschrieben (F(s)).

6.1.3 Verschiebungsatz der Laplacetransformation

Bei der Verarbeitung von Signalen im Computer spielt der Verschiebungssatz eine zentraleRolle, denn er beschreibt das Aufbewahren eines Signals in den Speicherzelleen desComputers von einem Zeittakt zum nächsten.

const a , )kTsexp( F(s)akT)-f(t akT)-f(ta =−== LL (6.1)

)kTsexp(− ist der sogenannte Verschiebungsoperator und bedeutet eine Verschiebung derFunktion um kT im Zeitbereich.

6.1.4 Die Z-Transformation

Die Z-Transformation ist nichts weiter als die Laplacetransformation der abgetastetenFunktion mit der Abkürzung : z = exp(Ts)

∑∑∑∞

=

−∞

=

∞

=

=−=

−δ===

0k

k k

0k k

0k k

*k zf)kTsexp(f)kTt(f)t(ffZ)z(F LL

6.2 Vergleich Regler endlicher Einstellzeit mit herkömmlichen Reglern

Abbildung 6.1: Vergleich von endlicher Einstellzeit (1) mit konventionellen Reglern (2, 3)

Beim Entwurf eines Regelkreises besteht das wichtigste Ziel darin, die Ausgangsgröße x(t)der Führungsgröße w(t) möglichst gut nachzuführen. Bei Führungsgrößenänderungen sollte

40

die Ausgangsgröße den neuen Führungswert möglichst schnell annehmen und festhalten.Abbildung 6.1 zeigt einen solchen Wunschverlauf in Kurve 1, wenn als Führungsgröße eineSprungfunktion w = W0 σ(t) aufgeschaltet wird. Nach der endlichen Zeit te ist hier derFührungswert erreicht. Durch konventionelle Regler ist diese Forderung nicht zu erfüllen.Diese liefern Übergangsvorgänge nach Art der Kurven 2 und 3 in Abbildung 6.1, die erst fürt → ∝ gegen den gewünschten Wert streben. Endliche Einstellzeit läßt sich also durchkonventionelle Regler nicht erreichen.

6.3 Prinziperläuterung der endlichen Einstellzeit

Abbildung 6.2: Bestimmung einer Stellfunktion u auf endliche Enstellzeit bei einem Tiefpaß1. Ordnung

Als Beispiel wird im folgenden ein Tiefpaß 1. Ordnung genommen, auf den dieEingangsgröße (Stellfunktion) u(t) wirkt.Die Besonderheit des Reglers endlicher Einstellzeit ist in Abbildung 6.2 dargestellt: ZumZeitpunkt t = 0 wird ein Sprung der Höhe U0 aufgeschaltet (Abbildung 6.2 A), so daß eineansteigende e-Funktion entsteht, die in Abbildung 6.2 B mit x0(t) bezeichnet ist. Sie strebteinem Grenzwert zu, der wesentlich höher als W0 liegt. Zum Zeitpunkt t = T erreicht sie den

41

Wert W0 und würde dann über den Wert W0 hinausschießen (gestrichelt gezeichneter Teil vonx0(t)). Dieser Teil von x0(t) muß kompensiert werden, um x auf dem Wert W0 zu halten. Dazuwird zum Zeitpunkt t = T eine zweite Sprungfunktion mit der negativen Sprunghöhe U1

aufgeschaltet (gestrichelt in Abbildung 6.2 A). Diese allein würde die gestrichelt gezeichnetee-Funktion x1(t) in Abbildung 6.2 B erzeugen. Wenn U1 gerade so gewählt wird, daß x1(t)gleich dem gestrichelten Teil von x0(t) (mit umgekehrten Vorzeichen) ist, so kompensierensich beide Funktionen. Durch die Überlagerung der beiden Sprungfunktionen entsteht dieTreppenfunktion u(t) (Abbildung 6.2 A). Die Funktion x(t) in Abbildung 6.2 B nimmt ab demZeitpunkt t = T den Wert des Führungswertes W0 wie gewünscht ein.

6.4 Vorgang der Regelung bei Abtastreglern:

In Abbildung 6.3 ist schematisch das Abtastregelungsproblem dargestellt. DasAbtasthalteglied (AH) wird bei dem in dieser Arbeit verwendeten Aufbau durch den AD-Wandler repräsentiert, der Regler durch den Algorithmus des Computers und das Systemdurch die Ansteuerung, den Photodetektor und das Blatt (nur beim Hellregler) (sieheAbbildung 5.2).

Abbildung 6.3: Auf endliche Einstellzeit zu entwerfende Abtastregelung. DasAbtasthalteglied (AH) wird bei dem in dieser Arbeit verwendeten Aufbau durch den AD-Wandler repräsentiert, der Regler durch den Algorithmus des Computers und das Systemdurch die Ansteuerungen (HA,DA), den Photodetektor und das Blatt (nur beim Hellregler).

Das System gibt die Regelgröße x (rechts in Abbildung 6.3) aus. Durch Abtastung mit derAbtastzeit T entsteht aus der Regelgröße x die Pulsfolge x*. In einer Vergleichstufe wird x*mit dem im Computer bereitgestellten (und damit auch als abgetastetes Signal zubetrachtenden) Sollwert w (Führungsgröße) verglichen. Die Pulsfolge der Regelabweichungxd* ergibt sich zu

xd* = w – x*

Aus der Regelabweichung xd* muß der Regler die Stellfunktion u* erzeugen. DieseStellfunktion wird auf das System gegeben, so daß sich der gewünschte Verlauf derRegelgröße x ergibt.

42

Durch die Wandelzeit der Wandler und durch die Zeitverzögerung im Regler (Rechenzeit)kommt es zu einer Totzeit Tt, die so gewählt werden sollte, daß sie ein Vielfaches derAbtastzeit ist.

Tt = n T, n ∈ N

Da sämtliche folgende Vorgänge aus der Sicht des Reglers gesehen werden, wird zurVereinfachung auf die Sterne(*) verzichtet:

*x :x *x :x *u :u

dd ===

6.5 Herleitung der Stellfunktion u(t) des Reglers endlicher Einstellzeit amBeispiel 2. Ordnung und einer Totzeit

Die Messungen am Analogteil des Regelkreises (Abschnitt 6.7.1) werden zeigen, daß dasanaloge System durch einen Tiefpass 2. Ordnung zu beschreiben ist. Deshalb wird hier derFall für 2. Ordnung und einer Totzeit beschrieben (Föllinger 1986).

In Abbildung 6.4 ist der typische Verlauf von Stellgröße x(t), Regelabweichung xd(t) undStellfunktion u(t) bei Regelung auf endliche Einstellzeit im Falle 2. Ordnung und einerTotzeit Tt = T dargestellt.

Für die FC-Maschine wird die Sprungfunktion als Sollwertverlauf benötigt.

w = W0 σ(t)

Die Stellgröße x(t) wird aber nur bei den Zeitpunkten (eingekreist in Abbildung 6.4)

t = k T (T = Abtastzeit; k = 0, 1, 2, 3, 4, 5, ...)

vom Regler durch die AD-Wandler gemessen und daher liegen auch nur dort Informationenüber die Regelabweichung xd(t) (gestrichelt eingekreist) vor und die Stellfunktion u(t) wirdauch nur an diesen Zeitpunkten um die Sprunghöhen Uk vom Regler geändert.

Durch die Totzeit Tt = T hängen x(t) und xd(t) um eine Abtastzeit T zurück.

Der Regler endlicher Einstellzeit besteht aus zwei Teilen:1. der Steuerung, die aufgrund von Vorwissen über das System die Stellgröße x(t) theoretischauf x(3T) = W0, wie in Abbildung 6.4 dargestellt, bringt und2. der Regelung, die dafür sorgt, daß der Sollwert W0 erreicht wird, obwohl Fehler imVorwissen gewesen sind und den Wert der Stellgröße nach der Steuerung bei x(t > 3T) = W0

hält.

43

Die Besonderheit des Reglers endlicher Einstellzeit ist die Steuerung, da diese ein schnellesErreichen des Sollwertes W0 ermöglicht. Die Regelung ist das Sicherheitsnetz, daß immerfunktioniert, aber länger dauert und nach der Steuerung nachregelt.Im folgenden wird die dafür nötige Stellfunktion u(t) hergeleitet.

Abbildung 6.4: Typischer Verlauf von Regelgröße x(t), Regelabweichung xd(t) undStellfunktion u(t). Die Werte von Regelgröße x(t) und Regelabweichung xd(t) liegen nur anden eingekreisten Zeitpunkten vor.

6.5.1 Herleitung des Steuerungssignals

Man geht aus von der Sprungantwort des Systems. Sie ist für alle t > Tt:

∑=ν ν

ν

τ−−+=

n

1

t0

Ttexprr)t(h n = Ordnung, r0 = Gleichspannungsverstärkung

In dem betrachteten Fall Tt = T und Ordnung zwei (n = 2) ergibt sich:

44

τ−−+

τ−−+=

22

110

TtexprTtexprr)t(h (6.2)

Es wird die Stellfunktion u(t) gesucht. Sie ist eine Treppenfunktion mit n+1 Sprungstellen:

u(t) = U0 σ(t) + U1 σ(t – T) + U2 σ(t – 2T) (6.3)

Abbildung 6.5: Typische Stellfunktion u(t) für endliche Einstellzeit bei einem System2. Ordnung

Für t > 2T ist u(t) im System 2. Ordnung konstant. Die Sprunghöhen Uλ sind freie Parameter,die so gewählt werden, daß nach endlicher Zeit x(t) = W0 ist. Um diese zu bestimmen, mußzunächst die Ausgangsgröße des Systems (Regelgröße) x(t) berechnet werden, die sich ausden Sprungantworten der Sprünge der Stellfunktion U0, U1, U2 zusammensetzt:

∑=λ

λ λ−=2

0

)Tt(hU)t(x

τ

−λ−−+

τ

−λ−−+= ∑=λ

λ2

21

10

2

0

TTtexprTTtexprrU)t(x

Endliche Einstellzeit ist dann erreicht, wenn dieser Ausdruck gleich dem Sollwert W0

gemacht werden kann:

45

τλ−−

τ−−+

τλ−−

τ−−+=

τ

−λ−−+

τ

−λ−−+=

∑

∑

=λλ

=λλ

222

1110

2

0

22

110

2

00

TexpTtexprTexpTtexprrU

TTtexprTTtexprrUW

τλ−−

τ−−+

τλ−−

τ−−+= ∑∑∑

=λλ

=λλ

=λλ

2

2

022

1

2

011

2

00

TexpUTtexprTexpUTtexprUr

Diese Forderung ist für t > 2T genau dann erfüllt, wenn der konstante Term gleich W0 ist unddie Koeffizienten der e-Funktionen Null sind:

0

2

00 WUr =∑

=λλ

0TexpU1

2

0

=

τλ−−∑

=λλ

0TexpU2

2

0

=

τλ−−∑

=λλ

Mit

τ

−=γν

νTexp: (6.4)

ergibt dies das einfache Gleichungssystem:

U0 + U1 + U2 = W0/ r0

U0 + γ1 U1 + γ12 U2 = 0

U0 + γ2 U1 + γ22

U2 = 0

Dessen Lösungen sind unter Verwendung der Abkürzung

( )( )210

0

11rWC

γ−γ−= : (6.5)

U2 = C (6.6)U1 = - C ( γ1 + γ2 ) (6.7)U0 = C γ1 γ2 (6.8)

Bisher wurde nur die Steuerung aufgrund von Vorinformationen über das System berechnet,was noch fehlt ist der Regler. Es soll etwaige Fehler, die aufgrund mangelnder Genauigkeitdes Vorwissens in der Steuerung entstehen, ausregeln. Allerdings liefert die Rückführung jaauch bei exakter Funktion der Steuerung ein Signal an die Vergleichsstufe. Diesesrückgeführte Signal muß bei der Berechnung des Differenzsignals, aus dem der Regler dieStellfunktion u(t) erzeugen soll, berücksichtigt werden.

46

6.5.2 Reglerentwurf

Der Regler hat die Aufgabe, die Funktion xd(t) in die Funktion u(t) zu verwandeln. Also istdie Übertragungsfunktion (im Frequenzbereich):

)s(X

)s(U(t)x

u(t) )s(Gdd

d ==LL (6.9)

Mit Gleichung (6.3) ergibt sich für U(s) durch den Verschiebungssatz derLaplacetransformation (Gleichung 6.1):

U (s) = (U0 + U1 exp(-Ts) + U2 exp(-2Ts))

Analog zu Gleichung 6.3 gilt für die Regelabweichung xd (xd(kT) = xdk):

xd(t) = xd0 σ(t) + (xd1 - xd0) σ(t – T) + (xd2 - xd1) σ(t – 2T) + (xd3 - xd2) σ(t – 3T)

und daraus

Xd(s) = xd0 + ( xd1 - xd0 ) exp(-Ts) + ( xd2 - xd1 ) exp(-2Ts) + ( xd3 - xd2 ) exp(-3Ts)

Bestimmung der xk und xdk:

Abbildung 6.6: Verlauf von Regelgröße x(t) und Regelabweichung xd(t) bei einem Regler aufendliche Einstellzeit 2. Ordnung mit einer Totzeit. Abgetastete Werte sind wieder eingekreist.

Für t ≤ T und t ≥ 3T sind die Werte für x(t), xd(t) dadurch festgelegt, daß es sich um einenRegler mit einer Totzeit (Tt = T) und 2. Ordnung handelt. Dies bedeutet, daß bis T = Tt dieRegelgröße x = 0 bleibt und für t ≥ 3T die Regelgröße x = W0 ist (Abbildung 6.6):

47

x0 = x1 = 0 xd0 = xd1 = W0

x3 = x4 = x5 = x6 = .... = W0 xd3 = xd4 = xd5 = xd6 = .... = 0

Es bleibt noch der Wert am Zeitpunkt t = 2T zu bestimmen. Es ist zu diesem Zeitpunkt alleinder erste aufgeschaltete Sprung von der Höhe U0 wirksam, der folgende Ausgangsgrößeerzeugt:

x(2T) = x2 = U0 h(2T)

Daraus folgt:

x2 = U0 h(2T) xd2 = W0 – x2 = W0 – U0 h(2T) (6.10)

Dies alles in die Übertragungsfunktion Gd in Gleichung 6.9 eingesetzt, ergibt:

( ) ( )( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )Ts3expxxTs2expxxTsexpxxx

Ts2expUTsexpUU)s(X)s(U)s(G

2d3d1d2d0d1dd

210

dd

0−−+−−+−−+

−+−+==

( ) ( )( ) ( ) ( )

( ) ( )( ) ( )Ts3exp1

WxTs2exp

Wx1

Ts2expUTsexpUUTs3expWxTs2expxW

Ts2expUTsexpUU

0

2

0

2

210

0220

210

−

−+−−

−+−+=−−+−−

−+−+=

( ) ( )[ ] ( ) ( ) )s(UTs3exp1WxTs2exp

Wx1)s(XTs2expUTsexpUU

0

2

0

2d210

−

−+−−=−+−+

Im Zeitbereich ergibt sich daraus für u(t) mit dem Verschiebungssatz in Gleichung 6.1:

)T3t(u1Wx)T2t(u

Wx)T2t(x

WU)Tt(x

WU)t(x

WU)t(u

0

2

0

2d

0

2d

0

1d

0

0 −

−+−+−+−+=

Durch Einsetzen von x2 (Gleichung 6.10) und h(2T) (Gleichung 6.2) ergibt sich dieRekursionsformel für den Regler:

)T3t(u1TexprTexprrWU

)T2t(uTexprTexprrWU)T2t(x

WU)Tt(x

WU)t(x

WU)t(u

22

110

0

0

22

110

0

0d

0

2d

0

1d

0

0

−

−

τ

−+

τ

−++

−

τ

−+

τ

−++−+−+=

(6.11)

48

Der Regler berücksichtigt zur Berechnung der Stellfunktion u(t) die aktuelleRegelabweichung xd(t) und die beiden davor xd(t - T), xd(t – 2T) und die Stellfunktionen diezwei und drei Abtastzeiten zurückliegen u(t – 2T) und u(t – 3T). Wenn man sich in Gleichung6.5, 6.6, 6.7, 6.8 die Formeln für U0, U1, U2 ansieht, so erkennt man, daß sich der Sollwert W0

herauskürzt. Dies ist eine Eigenschaft linearer Systeme, bei denen die Variablen nicht in denKoeffizienten vorkommen dürfen. Der Sollwert W0 ist damit natürlich nicht wirkungslos,denn er kommt über die Regelabweichungen xdx vor, da diese auf ihn bezogen sind.Um mit dieser Formel für die Stellfunktion u(t) regeln zu können, müssen die Parameter derSprungantwort des Systems τ1, τ2, r0, r1 und r2 ermittelt werden, was in Abschnitt 6.7beschrieben wird.

6.6 Stabilität bei Reglern endlicher Einstellzeit

Bei der Entwicklung von konventionellen Reglern garantiert man Stabilität, indem diePhasendrehung unter 180° bleibt, solange die Ringverstärkung größer eins ist. Alstheoretischeres Kriterium kann man auch sagen: Für alle Polstellen sx (Nullstellen desNenners der Übertragungsfunktion) muß gelten:

Re(sx) < 0

Sie müssen also in der linken Halbebene der komplexen s-Ebene liegen.

Da man die s-Ebene mittels bilinearer Transformation auf die z-Ebene abbilden kann unddabei die linke Halbebene der s-Ebene innerhalb eines Einheitskreises um z = 0 in der z-Ebene abgebildet wird, folgt für das Stabilitätskriterium im z-Bereich:Liegen alle Polstellen (Nullstellen des Nenners der Übertragungsfunktion) innerhalb desEinheitskreises der z-Ebene so ist das Abtastsystem stabil.

Auf endliche Einstellzeit entworfene Abtastregelungen sind immer stabil, da alle Pole desgeschlossenen Kreises in z = 0 liegen, was im folgende gezeigt wird (Föllinger, 1986):

Die z-Übertragungsfunktion der geschlossenen Abtastregelung ist

)z(W)z(X)z(G = (6.12)

Für W(z) gilt:

10

00k

k00 z1

W1z

zWzW))t((ΖW)z(W −

∞

=

−

−=

−==σ= ∑

Ist x(t) ≡ W0 für t ≥ Tt + nT = mT (n = Ordnung), so ist

xm = xm+1 = ... = W0.

49

Daraus folgt:

( )...zzWzx...zxx)z(X )1m(m0

)1m(1m

110 ++++++= +−−−−

−−

oder auch

1

m

0)1m(

1m1

10 z1zWzx...zxx)z(X −

−−−

−−

−++++=

In (6.12) eingesetzt ergibt dies:

( )m

0

1m01m

01m

0

zWxW...zxxzx)z(G −

− −++−+=

In der Übertragungsfunktion tauchen noch Signalwerte auf, weil die xk nicht durch einenallgemeinen Algorithmus ersetzt werden können, sondern aus den Zeitverläufen abgelesenund eingesetzt werden müssen. Die Amplitude W0 kürzt sich aufgrund der Linearität heraus.

Der geschlossene Regelkreis endlicher Einstellzeit hat also nur einen m-fachen Pol in z = 0und ist daher stabil.

6.7 Bestimmung der Sprungantwortsparameter

Damit der Regler in Gleichung 6.11 im Computer implementiert werden kann, benötigt mandie Kenntnis über die Sprungantwortparameter des Systems τ1, τ2, r0, r1 und r2. Sie werdenwie folgt bestimmt:Die Zeitkonstanten τ1 und τ2 sind für Hell- und Dunkelregler die selben (Abschnitt 6.7.1), r0,r1 und r2 sind verschieden (Abschnitt 6.7.2 und 6.7.3).

Es gibt daher für den Hellregler: r0(HELL), r1(HELL) und r2(HELL)

Und für den Dunkelregler: r0(DUNKEL), r1(DUNKEL) und r2(DUNKEL)

6.7.1 Die Zeitkonstanten ττττ1, ττττ2

Aufgrund der Partialbruchzerlegung, aus der Gleichung 6.2 entstanden ist (siehe Abschnitt6.7.3, Gleichung 6.13 und 6.14), treten beim Regler endlicher Einstellzeit nur die Polstellenexplizit auf. Die Nullstellen stecken in den Koeffizienten ri.Beim Reglerentwurf wurde davon ausgegangen, daß genau zwei Zeitkonstanten (Polstellen)im System existieren. Im folgenden wird gezeigt, daß tatsächlich in dem verwendeten Aufbaunur zwei relevante Zeitkonstanten existieren.

50

6.7.1.1 Relevanz der Zeitkonstanten

In der Abtastregelungstechnik können alle Zeitkonstanten, die erheblich kleiner und größerals die Abtastzeit T sind, ignoriert werden.Das Blatt selber hat auch Zeitkonstanten (Abschnitt 3.3), die allerdings parametrischnachgestellt werden (Abschnitt 7.3.1.2). Die Beiträge der in Abschnitt 3.3 nicht aufgeführtenKomponenten im Mikro- und Millisekundenbereich sind allerdings gering, so daß diese beimReglerentwurf nicht beachtet werden.

6.7.1.2 Ermittlung der Zeitkonstanten

Bei der Suche nach den Zeitkonstanten wurden zwei Verfahren benutzt:

1. Frequenzgangsanalyse (Asymptotenverfahren) (Abschnitt 6.7.1.2.1)2. Ausprobieren sämtlicher wahrscheinlich möglicher Zeitkonstanten und dann Suche nach

der geringsten mittleren Regelabweichung xd (Abschnitt 6.7.1.2.2)

6.7.1.2.1 Frequenzganganalyse

0.01

0.1

1

10

1 10 100 1000

f in Hz

Vers

tärk

ung

f2=16kHz

f1=58kHz

f0

f1

f2

Abbildung 6.7: Frequenzgang des Hellsystems mit zwei Polstellen (Schnittpunkte derAsymptoten)

Der Frequenzgang des Hellsystems ist in Abbildung 6.7 dargestellt. Dazu wurde ein Sinus-Signal an den Eingang der Hellansteuerung (HA) angelegt. Der Frequenzgang des

51

Dunkelsystems sieht genauso aus, was vermuten läßt, daß die Zeitkonstanten vomPhotodetektor stammen. Dieses in Abschnitt 6.7.1.3 noch einmal überprüft.Die Frequenzgangsanalyse mittels Asymptotenverfahren bringt zwei Zeitkonstanten(Polstellen) mit

τ1≈ s75.2f2

1

1

µ=π

und τ2 ≈ 0.10f2

1

2

=π

µs.

Durch das Asymptotenverfahren, bei dem man Geraden mit nf − an den Frequenzgang legt,werden die Polstellen als Schnittpunkte der Geraden ermittelt.

6.7.1.2.2 Probierverfahren

Hier wurde der Regler selbst zur Polstellenbestimmung benutzt. Die beiden Zeitkonstantenwurden so lange geändert, bis sich ein optimales Reglerverhalten ergab. Diese Suche führteder Computer automatisch aus. Dazu wurden zwei Zeitkonstanten im Bereich von τ1 ≈ 0.1 bis100 µs und τ2 ≈ 0.1 bis 300 µs mit einer Schrittweite von jeweils 0.1µs bei Abtastzeiten vonT = 20 µs und T = 40 µs am Hellregler ausprobiert. Die Summe der quadratischenRegelabweichungen von xd3, xd4, xd5, xd6, xd7 und xd8 diente als Gütemaß. Eine Messung miteinem τ1,τ2-Pärchen wurde, um keine Verfälschung durch das Rauschen zu bekommen 100mal durchgeführt. Ein Sortierprogramm speicherte die besten 50 Ergebnisse mit dergeringsten Regelabweichung. Die Ergebnisse lieferten einen Durchschnittswert der besten 12Ergebnisse bei

τ1 ≈ 14.2 µs und τ2 ≈ 2.4 µs.

Da diese Zeitkonstanten, die nach dem Probierverfahren ermittelt wurden, bei Hell- undDunkelregler den besten Regelungsverlauf zeigten, wurden sie bei Hell- und Dunkelreglerverwendet.

Übersicht über die besten 12 Ergebnisse:

τ1 = 2.4 µs, τ2 = 14.4 µsτ1 = 2.4 µs, τ2 = 14.1 µsτ1 = 2.6 µs, τ2 = 14.0 µsτ1 = 2.5 µs, τ2 = 14.6 µsτ1 = 2.5 µs, τ2 = 14.1 µsτ1 = 2.2 µs, τ2 = 14.4 µsτ1 = 2.7 µs, τ2 = 14.2 µsτ1 = 2.4 µs, τ2 = 14.0 µsτ1 = 2.4 µs, τ2 = 14.3 µsτ1 = 2.3 µs, τ2 = 14.3 µsτ1 = 2.3 µs, τ2 = 14.1 µsτ1 = 2.4 µs, τ2 = 14.2 µs

52

6.7.1.3 Relevante Zeitkonstanten von erster Photodetektorstufe

Die Tatsache, daß es zwei Zeitkonstanten gibt, die bei Hell- und Dunkelregler auftreten, läßterwarten, daß beide Zeitkonstanten aus dem Photodetektor (FD) stammen (Abbildung 5.2).Weiter ist zu erwarten, daß sie aus der ersten Stufe des Photodetektors stammen, da die zweiteStufe aus einem Breitbandverstärker (OPA 687) mit nur kleiner Verstärkung besteht(Abschnitt 5.3).Um zu verifizieren, daß die beiden Zeitkonstanten tatsächlich wie erwartet von der erstenDetektorstufe stammen, wurde direkt am negativen Eingang von OP1 über einenVorwiderstand ein Frequenzgenerator angeschlossen und ein Frequenzgang über den direktenAusgang der ersten Stufe aufgenommen, an dem sonst ADW2 angeschlossen ist. DieserFrequenzgang sieht genauso wie der Frequenzgang des Hellkreises in Abbildung 6.7 aus unddas Asymptotenverfahren liefert die gleichen Zeitkonstanten wie in Abschnitt 6.7.1.2.1.Daraus folgt, daß nur relevante Zeitkonstanten aus der ersten Detektorstufe kommen und nurdiese bei der Reglerentwicklung berücksichtigt werden müssen.Da die Zeitkonstanten aus dem Photodetektor stammen, besitzen Hell- und Dunkelregler diegleichen Zeitkonstanten. Die Tatsache, daß die Zeitkonstanten aus der erstenPhotodetektorstufe stammen, bedeutet, daß bei einer Regelung über die erstePhotodetektorstufe (über ADW2) (Abschnitt 7.3.4.2), auch die selben Zeitkonstanten benutztwerden können.

6.7.1.4 Vergleich der Ergebnisse der beiden Verfahren

Das Probierverfahren und die Frequenzganganalyse lieferten Ergebnisse, die in der Nähe voneinander lagen. Allerdings ergaben die Zeitkonstanten aus der Frequenzganganalyse beimEinbau in den Regler schlechtere Ergebnisse. Es dauerte bei jeder möglichen Abtastzeitrelativ lange bis der Regler sich auf einen Wert eingeregelt hat. Es werden für dieDimensionierung die Wert des Probierverfahrens verwendet:

τ1 = 2.4 µs und τ2 = 14.2 µs

Wie man in Abbildung 6.7 sehen kann, bestätigt sich die Annahme, daß es im interessantenFrequenzbereich nur zwei Zeitkonstanten gibt.

6.7.2 Die Gleichspannungsverstärkung r0

Die Gleichspannungsverstärkung r0 ist das Verhältnis von Regelgröße x und Stellfunktion uim eingeschwungenen Zustand.

)t(u)t(x

)t(u)t(xr0 =

∆∆=

Die Deltas sind fortgelassen, weil die Signale auf Null (Dunkelheit) bezogen sind (offset-frei).

53

Es gibt eine Gleichspannungsverstärkung des Hellsystems r0(HELL) und des Dunkelsystemsr0(DUNKEL). Sie besitzen eine gemeinsame Regelgröße x (Ausgang des Photodetektors), abereine unterschiedliche Stellfunktion uHELL(t) und uDUNKEL(t), da die Stellfunktion uHELL(t) vomHellregler an der Hellregleransteuerung (HA) angelegt wird und die Stellfunktion uDUNKEL(t)vom Dunkelregler an der Dunkelregleransteuerung (DA).

)t(u)t(x

)t(u)t(xr

HELLHELL)HELL(0 =

∆∆=

)t(u)t(x

)t(u)t(xr

DUNKELDUNKEL)DUNKEL(0 =

∆∆=

Am besten bestimmt man die Gleichspannungsverstärkung, indem man die maximal möglicheStellgröße (zur Optimierung des Signal/Rauschverhältnisses) auf den Regler gibt und diedaraus resultierende Regelgröße mißt.

max

max0 u

xr =

6.7.2.1 Linearisierung des Zusammenhangs von Stellgröße x und Stellfunktion u

Der Regler endlicher Einstellzeit geht davon aus, daß ein proportionaler Zusammenhangzwischen der Stellfunktion u (DA-Wandler-Signal) und der Regelgröße x (Eingang der AD-Wandler) besteht (zumindest im eingeschwungenen Zustand).

)t(u)t(x

)t(u)t(xr0 =

∆∆=

Da die Hellregleransteuerung (HA) und die Dunkelregleransteuerung (DA) mit demTransistor ein nicht-lineares Bauteil enthalten, muß eine softwaremäßige Korrekturvorgenommen werden:Die Kennlinie des Hellreglersystems ist die Abhängigkeit des Photodetektorsignals von derSpannung an der Hellregleransteuerung (HA) durch DAWH (siehe Abbildung 5.2) für denFall eines streng linearen Systems als fluoreszierendes Material (Computerpapier).Abbildung 6.8 zeigt die gemessene Kurve. Die Gerade in Abbildung 6.8 stellt den Verlaufdar, wie er für den Regler sein muß und wie er nach der Korrektur auch ist.Für das Dunkelreglersystem sieht die Kurve genauso aus, nur daß sie in die positive Richtunggeht, weil das Signal aus dem Transistor ja das Signal aus der Photodiode kompensieren soll.

54

-2.2

-2

-1.8

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5

Spannung an der Hellregleransteuerung (HA)

Reg

elgr

öße

x (P

hoto

dete

ktor

ausg

ang)

in V

gemessene Kennlinie des Hellreglersytems

Verlauf, wie er sein sollte

Abbildung 6.8: Ausgangsspannung des Photodetektors über Spannung an der BasisHellregleransteuerung und Gerade, wie sie verlaufen sollte und vom Regler später auch sogesehen wird.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

5.5

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Speicherstelle des Arrays, auf das die Stellgröße u zugreift

Span

nung

an

Hel

lregl

eran

steu

reru

ng (H

A) i

n V

Abbildung 6.9: Inhalt des Arrays zu Linearisierung der Antwort der Regelgröße x(Photodetektorausgang) auf die Stellfunktion u

Es muß also eine Umrechnung gefunden werden, die zu jeder Regelgröße x eine Umrechnungzwischen der Stellgröße u und der Spannung an der Hellregleransteuerung (HA) vornimmt,damit immer ein proportionaler Zusammenhang zwischen Regelgröße x und Stellfunktion u

55

vorliegt. Eine solche Umrechnung ist in Abbildung 6.9 dargestellt. Sie zeigt die Spannung ander Hellregleransteuerung (HA) über der Stellfunktion u. Da es schwierig ist, eine analytischeFunktion zu finden, die genau diesen Verlauf hat und diese immer wieder vor Einsatz desReglers neu bestimmt werden sollte, damit auch kleine Veränderungen des Systems in derUmrechnung enthalten sind, wurden die Spannungen in einem Array von 4100Speicherstellen gespeichert, auf das die Stellfunktion als Index zugreift. Dadurch besteht einproportionaler Zusammenhang von Regelgröße x und Stellfunktion u, der in Abbildung 6.10dargestellt ist.

-2.2

-2

-1.8

-1.6

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Stellgröße u

Reg

elgr

öße

x

Abbildung 6.10: Zusammenhang von Regelgröße x und Stellgröße u nach der Korrektur

6.7.3 Die Koeffizienten r1 und r2

Wie für r0 gibt es auch bei r1, r2 verschiedene für den Hell- und Dunkelkreis:

r1(HELL), r2(HELL)

r1(DUNKEL), r2(DUNKEL)

Oben wurde bereits erwähnt, daß r1 und r2 aus den Zeitkonstanten berechnet werden können.Zunächst werden r1, r2 für den allgemeinen Fall berechnet und dann nach Hell- undDunkelkreis getrennt.Die Sprungantwort des Systems 2. Ordnung (nach Gleichung 6.2)

56

τ−−−−

τ−−−−=

τ−−+

τ−−+=

22

11

22

110

Ttexp1rTtexp1r

TtexprTtexprr)t(h

(6.13)

entsteht in diesem Fall aus einem System mit zwei in Serie geschalteten Tiefpässen. ImFrequenzbereich multiplizieren sich die Einzelübertragungsfunktionen. DurchPartialbruchzerleging ergeben sich daraus r1 und r2:

( )( )21

221121

2

1

1

2

210

τs1τs1τsrτsrrr-

τs1r

τs1r

τs11

τs11r)s(H

++−−−=

+−+

+−=

+

+

=

(6.14)

Daraus folgt durch Koeffizientenvergleich:

r0 = -r1 - r2

τ1 r2 = - τ2 r1

Daraus folgt durch kurze Rechnung:

21

101 ττ

τrr−

−= und 21

202 τττrr−

= (6.15)

Die Zeitkonstanten τ1 und τ2 (Abschnitt 6.7.1) und die Gleichspannungsverstärkung r0

(Abschnitt 6.7.2) werden gemessen und sind bekannt.

Für Hell- und Dunkelkreis gilt wie bei r0(HELL) und r0(DUNKEL):

21

1)HELL(0)HELL(1 τττrr−

−= und 21

2)HELL(0)HELL(2 τττrr−

=

21

1)DUNKEL(0)DUNKEL(1 τττrr−

−= und 21

2)DUNKEL(0)DUNKEL(2 τττrr−

=

Somit sind sämtliche Parameter des Reglers bekannt.

57

6.8 Wahl der Abtastzeit T

Nach der Zeit te = Tt + nT hat der Regler endlicher Einstellzeit die Regelgröße x auf denSollwert W0 geregelt. Die Geschwindigkeit des Reglers wird also von der Ordnung n, derAbtastzeit T und der Totzeit Tt (die als ein Vielfaches von der Abtastzeit gewählt wird)bestimmt, wobei nur T nicht fest vorgegeben ist.Die minimale Abtastzeit ergibt sich aus der Geschwindigkeit der Wandler und der Rechenzeit.Da die AD-Wandlung ca. 11 µs, die DA-Wandlung ca. 3 µs und die Berechnung des Reglersca. 1 µs dauert, wurde aus Sicherheitsgründen eine Abtastzeit von

T = 20 µs

gewählt.Die Abtastzeit ist aber auch durch Gegebenheiten von Regler und Aufbau begrenzt:Bei kleiner Abtastzeit T wir der Regler schneller. Aber die Beträge der Impulse, aus denensich die Stellfunktion u(t) zusammensetzt werden exponentiell mit T größer. Dies läßt sich amBeispiel des ersten Pulses leicht zeigen:Aus (6.8) folgt durch Einsetzen von (6.4) und (6.5):

−−

−−

−

−

=

21

21

0

00

τTexp1

τTexp1

τTexp

τTexp

rWU (6.16)

Für T → 0 wird daher U0 einen unendlich großen Betrag annehmen.

Ein weiteres Problem verbietet zu kleine Abtastzeiten bei der vorliegenden FC-Maschine: Beizu kleiner Abtastzeit ist U1 betragsmäßig größer als U0. Dadurch wird u(T) < 0 nach demzweiten Sprung. Dies bedeutet für den Hellregler, daß die LED negatives Licht ausstrahlenmüßte.Aus (6.7) folgt durch Einsetzen von (6.4) und (6.5):

−−

−−

−+

−

−=

21

21

0

01

τTexp1

τTexp1

τTexp

τTexp

rWU (6.17)

Die Abtastzeit T muß also so groß sein, daß das Produkt der exp-Funktionen in Gleichung6.16 größer als die Summe dieser in Gleichung 6.17 ist.

58

Kapitel 7

Software

7.1 Wahl der Softwareumgebung

7.1.1 Betriebssystem

Das Programm regelt in Echtzeit. Unterbrechungen durch das Betriebssystem dürfen dahernicht vorkommen. Damit scheiden Systeme wie z.B. Windows aus, die sich nicht vollständigkontrollieren lassen und im Hintergrund noch Prozesse laufen haben, die zwischendurcheinfach einen Interrupt auslösen. Seit einiger Zeit gibt es auch für den privaten NutzerEchtzeitbetriebssysteme wie LinuxRT und QXL. Nur leider erlauben diese Systeme keinedirekten Addressenzugriffe ohne einen Treiber, der für die verwendeten DA- und AD-Wandler-Karten nicht verfügbar war. Daher wurde als System MS-DOS verwendet, das demBenutzer alle Freiheiten läßt und keine Prozesse im Hintergrund laufen hat, so daß immervolle Prozessorleistung zur Verfügung steht.

7.1.2 Programmiersprache

Als Programmiersprache wurde C verwendet, da es die schnellste ist, um die Abtastzeit Tmöglichst kurz wählen zu können. Als Compiler wurde der für alle Systeme frei verfügbareCompiler GNU-C (gcc) gewählt, um eine möglichst hohe Portabilität der Software zuermöglichen.

7.2 Regelungsablauf

Der Regler mißt die Regelgröße x, berechnet aus ihr die Regelabweichung xd, bestimmtdaraus die Stellfunktion u und gibt diese aus.Die softwaremäßige Umsetzung des Reglers ist in Abbildung 7.1 dargestellt. Am Anfang wirdxd0 := W0 und der Index auf k := 0 gesetzt. Der Wert von W0 ist beim Hellregler immer gleichW0 = -0.5 V. Beim Dunkelregler ist W0 = (Abweichung des Photodetektorausgangs von 0Vvor Regelungsbeginn).uk wird berechnet und auf das Taktsignal der Abtastzeit von T = 20 µs gewartet, die voneinem quarzgesteuerten Timer kommt. Dann werden möglichst gleichzeitig uk auf das Systemgegeben und die Messung von xk+1 gestartet, da aufgrund der Totzeit Tt = T ist die Regelgrößeum eine Abtastzeit zurückhängt. Durch die Ladezeit des Eingangskondensators des AD-Wandlers von 1.5 µs ist die Gleichzeitigkeit nur ungefähr möglich. Nach 12 µs Wartezeit aufden AD-Wandler wird der Meßwert von xk+1 aufgenommen, woraus durch

59

xdk+1 = W0 – xk+1

die Regelabweichung berechnet wird.Dann wird der Index hochgezählt

k := k + 1

und die Reglerabbruchbedingung (Abschnitt 7.3.1.1) überprüft. Ist die Bedingung erfüllt, wirdder Regler beendet, sonst wird wieder uk berechnet (oben in Abbildung 7.1) usw.

Abbildung 7.1: Softwaremäßige Umsetzung des Reglers: Es werden gleichzeitig Stellgrößeuk ausgegeben und Regelgröße xk+1 gemessen, da die Totzeit eine Abtastzeit ist (Tt = T). DieWartezeit von 12 µs entsteht aus der Wandelzeit des AD-Wandlers. Die Abbruchbedingungwird in Abschnitt 7.3.1.1 erläutert.

60

7.3 Programmteile

Das Programm besteht aus drei Teilen:

• Hellregler mißt über das zum Abgleich notwendige Meßlicht den Zustand des Blattes• Dunkelregler hält bei normalen Hintergrundlichtschwankungen den Ausgang des

Photodetektors in der Mitte des Aussteuerbereiches des Photodetektors• Spezieller Dunkelregler bringt bei starker Hintergrundlichtschwankung den Photodetektor

wieder in die Mitte des Ausgangsbereiches

Der Hell und der Dunkelregler sind die in Abb. 5.2 gezeigten Reglerkreise. Bei starkemHintergrundlicht reicht der Austeuerbereich des normalen Dunkelreglers nicht aus und derSpezielle Dunkelregler unterstützt ihn durch Einspeisen sehr hoher Kompensationsströme.Sämtliche Regler sind als Regler auf endliche Einstellzeit realisiert.

7.3.1 Der Hellregler

Der Hellregelkreis besteht aus dem DA-Wandler DAWH der Leistungsansteuerung der Regel-LED (HA), dem Photodetektor (FD), dem AD-Wandler ADW1 und dem Computer (Regler)(Abbildung 5.2).Der Hellregler hat die Aufgabe, die Amplitude der Antwort auf das Yieldlicht konstant zuhalten. Die dafür notwendige Intensität dient als Meßgröße. Dafür regelt er denPhotodetektorausgang (Regelgröße x) auf den Sollwert W0, indem er die Stellgröße uverändert. Während bei der Version von Schinner et al. (2000) der Strom durch die Regel-LED als Meßwert für die Lichtintensität noch in einem Sample-and-Hold Baustein(Abbildung 4.1) gespeichert werden mußte, kann bei der neuen Version ausgenutzt werden,daß die Stellgröße u (proportional Regel-LED-Intensität) bereits im Rechner als Zahlenwertvorliegt.Für den Hellregler der neuen FC-Maschine muß der Photodetektorausgang in derMeßlichtdunkelphase vorher nicht genau auf Null eingestellt sein, weil im Rechner dieMöglichkeit besteht, diese Abweichung zu berücksichtigen. Bei der analogen FC-Maschinegibt es auch so eine Differenzenbildung zwischen den Werten während Hell- undDunkelphase des Meßlichtes. Aber da dies eine Analog-Schaltung mit Sample-and-HoldStufen war, wurde zur Fehlerminimierung doch großer Wert darauf gelegt, daß in derDunkelphase der Ausgang des Photodetektors auf Null geregelt wurde.Der Sollwert am Vergleicher (W0V), mit dem die Regelgröße x verglichen wird, ist bei derHellregelung der neuen FC-Maschine kein konstanter Wert, sondern um den Sollwert desYields (W0(HELL) = -0.5 V) von dem Wert des Photodetektorausgangs vor Beginn derHellphase (= x0) entfernt:

W0V(HELL) = W0(HELL) + x0

61

7.3.1.1 Einschwingprozesse

Die Frage ist nun, wann der Einschwingvorgang der Regelung beendet wird und dieStellgröße als Meßwert für den Fluß übernommen wird. Bei der Version von Schinner ist diesdie Zeit 1.5 ms nach Sprungbeginn. Bei der neuen digitalen Version wird keine feste Zeitabgewartet, sondern durch einen Algorithmus aus der Abweichung eine Abbruchszeitbestimmt.Man könnte auf die Idee kommen, einfach den Wert von u als Ergebnis zu verwenden, beidem zufällig gerade einmal xd = 0 ist. Dies funktioniert leider nicht sehr gut, da der Wertxd = 0 z. B. nach einer Störung aus dem Rauschen, bei nicht abgeklungenemEinschwingvorgang vorkommen kann.Daher wurde, um möglichst zuverlässige Werte für die Stellgröße u zu erhalten, ein Schlauchvon ungefährer Größe des Rauschens um xd = 0 von 12.5 mV gelegt und gefordert, daß sichxd fünf mal hintereinander innerhalb dieses Schlauches befinden muß (| xd | ≤ 12.5 mV), dasich die Stellgröße u nur bei mehrmaligen und kleinen Abweichungen so weit `beruhigt` undkaum noch schwankt, daß das Ergebnis einigermaßen genau wird.Eine Forderung von öfter als fünfmal hintereinander erhöht die Genauigkeit des Ergebnissesnicht, aber erhöht die durchschnittliche Regelungsdauer, da die Wahrscheinlichkeit für dieErfüllung der Forderung sinkt. Dieses bedeutet, daß von der Wahl der Dicke des Schlauchesdie Genauigkeit des Ergebnisses und die Regelungsdauer abhängt. Es wurde ein Schlauch von| xd | ≤ 12.5 mV gewählt, was eine durchschnittliche Regelzeit von ca. 340 µs zur Folge hat,da bei einer Schlauchdicke von | xd | ≤ 10 mV (nächst kleinere Möglichkeit durchQuantisierung des Eingangs des AD-Wandlers) die durchschnittliche Regelungszeit auf1040 µs ansteigt und auch selbst Regelungszeiten von über 2 ms keine Seltenheit sind.

Zur höheren Genauigkeit wird das Ergebnis über die letzten beiden Stellgrößen gemittelt:

21)T)-((kuT)u(kErgebnis EndeEnde += (7.1)

Das Verhältnis von Sollwert W0 und Rauschen bestimmt die Genauigkeit des Ergebnisses, sodaß der Sollwert W0 möglichst groß sein sollte. Der Sollwert W0 ist allerdings dadurchbegrenzt, daß für ein größeres W0 die Intensität der Regel-LED erhöht werden muß, diemöglichst gering gehalten werden sollte, damit sie möglichst wenig aktinische Wirkung hat.Die Einstellprozesse sind vom Rauschen überlagert. Das Rauschen des Photodetektoraus-gangs (Regelgröße x) sorgt dafür, daß der Sollwert von W0 nicht genau erreicht und danngehalten werden kann, sondern x nur ungefähr den Wert W0 annimmt. Die Regelabweichungxd wird damit auch nicht null, sondern „rauscht“ um null „herum“. Auf die rauschinduzierteRegelabweichung xd reagiert der Regler natürlich auch mit Veränderung der Stellgröße u, sodaß auch diese zum Rauschen etwa proportional schwankt und so sich der Wert der Stellgrößeu auch ständig ändert.

Die Standardabweichung des Rauschens des Photodetektorausgangs ist σ = 6.1 mV und derSollwert W0 wurde auf W0 = -0.5 V festgelegt, so daß noch genügend Abstand zu denBereichsgrenzen bei ca. ±3 V der zweiten Nachverstärkungsstufe besteht und das lineare

62

Signal-Rauschverhältnis von x bei ca. -82 liegt. Dafür ist eine Meßlichintensität von ca.IML = 2 Wm-2 nötig.Das Signal-Rauschverhältnis der Stellfunktion uHELL beträgt allerdings etwa 60. Dieses wurdeaus den Ergebnissen einer Messung durch die Sättigungsblitzmethode mit einem Blattfluoreszierendem Computerpapier ermittelt, von der ein Ausschnitt in Abbildung 7.7dargestellt ist.In Abbildung 7.2 ist ein typischer Hellregelungsverlauf abgebildet. Die Regelgröße x ist zwarschon ab t = 60 µs = 3T in der Nähe des Sollwertes, wie es die Theorie besagt, aber es dauertbis t = 340 µs, bis die Forderung für den Abbruch der Regelung erfüllt ist und dieRegelabweichung fünfmal hintereinander innerhalb des Schlauches befindet.

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 50 100 150 200 250 300 350

t in µµµµs

x, x

d in

V

-800

0

800

1600

2400

3200

4000

4800

u in

rela

tiven

Ein

heite

n

xd

x

u

Schlauch von |xd| < 12.5 mV

Abbildung 7.2: Typischer Hellregelungsverlauf bei einer Schlauchdicke von| xd | ≤ 12.5 mV. Die Regelabweichung muß sich fünfmal innerhalb des Schlauches befinden.Zur besseren Darstellung wurde bei Regelgröße x und Regelabweichung xd das Vorzeichenumgedreht, was aufgrund der Linearität keine Verfälschung darstellt.

7.3.1.2 Schwankungen der Gleichspannungsverstärkung

Durch Veränderungen des Zustandes des Blattes, ausgelöst vor allem durch Veränderungendes Hintergrundlichtes, kann sich die Gleichspannungsverstärkung des Hellregelkreisesr0(HELL) von einem Hellreglerdurchlauf zum anderen um den Faktor fünf ändern. Dieser Faktor5 entspricht dem FM/F0 Verhältnis (Abschnitt 3.5). Dadurch beginnt der Regler am Anfangdes Regelvorganges mit völlig falschem r0(HELL)-Wert, bis er dies über die Rückkopplung nachzwei Abtastzeiteten merkt und korrigiert.

63

In Abbildung 7.3 ist ein Test abgebildet, bei dem der Wert von r0(HELL) künstlich auf dasFünffache erhöht wurde. Der Regler benötigt ca. t = 440 µs, um die Regelgröße x in denBereich des Sollwertes W0 zu regeln und 600 µs, um zu einem Meßwert mit fünfReglabweichungen innerhalb des Schlauches von | xd | ≤ 12.5 mV zu kommen. Dies istangesichts der Tatsache, daß so starke Schwankungen der Gleichspannungverstärkung r0(HELL)

nur beim Anschalten von Blitzen vorkommen, kein Problem.

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600

t in µµµµs

x, x

d in

V

-220

0

220

440

660

880

1100

1320

1540

1760

1980

2200

2420

u in

rela

tiven

Ein

heite

n

Stellfunktion u

Stellgröße x

Regelabweichung xd

Abbildung 7.3: Verlauf der Regelung bei einem fünfmal zu großen r0. Der Regler isttrotzdem nach 600 µs fertig. Zur besseren Darstellung wurde bei Regelgröße x undRegelabweichung xd das Vorzeichen umgedreht, was aufgrund der Linearität keineVerfälschung darstellt.

Um jedoch die Stärke des Reglers endlicher Einstellzeit, seine Schnelligkeit voll auszunutzen(Abbildung 7.2), wird ein adaptives Element eingebaut. Die Gleichspannungsverstärkung derHellregelung r0(HELL) wird aufgrund der Abweichung bei den ersten Regelschritten korrigiertDazu wird die Stellfunktion uHELL mit einem Korrekturfaktor (korrekturHELL) multipliziert.Die Berechnung geht von folgender Überlegung aus: Der Sprung wird auf das System unterder Annahme einer falschen Gleichspannungsverstärkung r0f gegeben. Trotzdem regelt derRegler die Regelgröße x auf W0 ein (braucht aber länger). Am Ende des Reglerprozesses trittdie Stellgröße

uende = r0

0

rW

auf. Aus dieser Stellgröße und dem bekannten Sollwert W0 kann die tatsächlich vorliegendeGleichspannungsverstärkung ror bestimmt werden. Damit kann aus dem Vergleich von r0f undr0r der Korrekturfaktor bestimmt werden. Mit W0 = -0.5 ergibt sich

64

korrekturHELLREGLER =

f0

0

ende

rWu

uende ist das Ergebnis für die Stellfunktion der letzten Hellregelung (Gleichung 7.1) und f0

0

rW

ist der Wert der Stellfunktion, der vom Regler als Ergebnis für die Stellfunktion erwartetwurde.

7.3.2 Der Dunkelregler

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

0 20 40 60 80 100 120 140 160

t in µµµµs

x,xd

in V

0

1

2

3

4

5

6

u in

rela

tiven

Ein

heite

n

xdx

u

Schlauch von 800 mV

Abbildung 7.4: Verlauf einer Dunkelregelung. Es wird eine Abweichung vonxd(DUNKEL) = 900 mV in den Schlauch von xd(DUNKEL) = ±400 mV gebracht.

Der Dunkelregelkreis besteht aus dem DA-Wandler DAWD, der Dunkelregleransteuerung(DA), dem Photodetektor (FD), dem AD-Wandler ADW1 (Abbildung 5.2). Wie inAbschnitt 7.3.1 besprochen, muß der Dunkelregler dafür sorgen, daß die zweite Stufe desPhotodetektors immer ungefähr in der Mitte des Ausgangsspannungsbereiches ist. Auch beimDunkelregler muß die Regelabweichung xd (DUNKEL) fünfmal hintereinander innerhalb desSchlauches sein. Allerdings muß man sich mit einer Schlauchdicke vonxd (DUNKEL) = ±400 mV zufrieden geben (Abschnitt 7.3.2.1).In Abbildung 7.4 ist der Verlauf einer Dunkelregelung abgebildet. Die Abweichung vonxd(DUNKEL) = 900 mV erreicht unter starken Schwankungen den Schlauch von|xd(DUNKEL) | ≤ 400 mV.

65

7.3.2.1 Ungenauigkeiten des Dunkelreglers

7.3.2.1.1 Genauigkeit der Dunkelregleransteuerung (DA)

Eine genaue Kompensation ist mit dem neuen Dunkelregler gar nicht zu erreichen, da er übereinen 11-bit-DA-Wandler (211 = 2048 Werte) angesprochen wird und über einenAusgangsspannungsbereich des Photodetektors von ca. 150 V arbeiten muß, um das Blitzlichtzu kompensieren, so daß die Genauigkeit bei ca.

mV 722048

V150V ==∆

liegt.Da bei der Umrechnung zur Linearisierung des Zusammenhangs von Regelgröße x undStellfunktion u (Abschnitt 6.7.2.1) die Umrechnung über quantisierte Werte vorgenommenwird, steigt die Ungenauigkeit des Dunkelreglers auf ca. 130 mV.

7.3.2.1.2 Kapazitive Störungen

Die Dunkelregleransteuerung erzeugt durch große Spannungen (im Volt-Bereich) an derBasis des Transistors der Dunkelregleransteuerung (Abbildung 5.2) kleine Ströme (imBereich einiger 100 µA). Dadurch ändert sich über der Basis-Kollektor-Kapazität CBC desTransistors plötzlich die Spannung und ein großer Strompuls entsteht

dtdUCi = ,

der am Photodetektorausgang einen Peak erzeugt, der ungefähr so groß wie dieSpannungsänderung an der Basis ist und ca. 2 µs dauert. Diese Störungen sind allerdings nuram Anfang des Regelvorgangs wirklich von bedeutender Größe, da dort die Stellgröße uwesentlich geändert wird. Aufgrund der kurzen Zeitdauer übersteuert der Detektor nicht. Dax(k+1) im selben Moment gemessen wird, wie uk ausgegeben wird, würde der Peak genau indie Kondensator-Aufladezeit des AD-Wandlers fallen, die 1.5 µs dauert.Nun ist aber x(k+1) das Signal aus dem System, das noch auf den vorangegangenen Stellwert uk

zurückgeht. Deshalb kann die Messung von xk+1 ohne großen Fehler um 2 µs vorgezogenwerden.

Die ideale Lösung wäre gewesen, den Peak abzuschwächen, indem ein Transistor mit einergeringeren Basis-Kollektor-Kapazität. Nur leider hatte der verwendete 2N 3904 mitCBC = 5pF schon eine relativ geringe CBC, und Transistoren mit geringer Kapazität warenleider nicht zu bekommen. Die andere Möglichkeit wäre, einen Tiefpaß vor die Basis zuschalten, was den Peak zwar nicht mehr so groß, aber leider auch breiter macht, so daß ernoch mehr als nur einen Abtastpunkt stört.

66

7.3.3 Relaxation

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

0.65

0.7

0.75

0 100 200 300 400 500 600

t in µµµµs

x in

V

Abbildung 7.5: Typischer Verlauf der Relaxation des Photodetektorausgangs nach demAusschalten der Hellregler-LED. Nach 300 µs verschwindet das Signal im Rauschen. Zurbesseren Darstellung wurde bei Regelgröße x das Vorzeichen umgedreht, was aufgrund derLinearität keine Verfälschung darstellt.

Am Ende der Hellphase wird die Hellregler-LED (Meßlicht-LED) ausgeschaltet. Dadurchergibt sich ein Verlauf der Regelgröße x wie in Abbildung 7.5. In den ersten 100 µs starkerVeränderung der Regelgröße darf der Dunkelregler nicht eingeschaltet sein, weil er ja denWert wegregeln soll, der bei Abwesenheit des Meßlichtes vorliegt (Ende der Abklingkurve).Nach der Hellphase vor dem Einsatz des Dunkelreglers ist daher zunächst eine kurzeRelaxationsphase des Detektors auf noch 8% des Sollwertes (100 µs) abzuwarten. Wenn diesnicht geschieht, dauert die Dunkelregelung ca. 200 µs länger. Der Dunkelregler braucht 140µs (Abbildung 7.4). Aufgrund der Ungenauigkeit und starken Schwankungen desDunkelreglers ist auch nach dem Ende der Dunkelreglung eine Relaxationszeit von 400 µsnötig.Aufgrund dieses großen Zeitbedarfs wird im Fall einer geringeren Abweichung als 0.8 V derPhotodetektorausgangsspannung von der Mitte des Bereiches (| xd (Dunkel)| < 0.8 V), derDunkelregler nicht eingeschaltet. Die Relaxation der Hellregler-LED verschwindet ohneDunkelregler nach ca. 300 µs im Rauschen (Abbildung 7.5), und der Hellregler wird nacheiner Relaxationszeit von 500 µs wieder eingeschaltet.

67

7.3.4 Ausgleich von starken Hintergrundlichtänderungen (Blitz, aktin. Licht):spezieller Dunkelregler

Das Blitzlicht ist mit ca. 800 Wm-2 rund 400-mal heller als das Meßlicht mit rundIML = 2 Wm-2 und ruft eine entsprechend stärkere Fluoreszenz hervor. Mit dieser Aufgabekönnte der normale Dunkelregler aus Abschnitt 7.3.2 überfordert sein. Insbesondere kann esauftreten, daß während des Regelprozessen die zweite Detektorstufe (Abbildung 5.2 und 5.3)stark übersteuert wird. Dann ist der Regleralgorithmus sehr stark gestört und der normaleDunkelregler aus Abschnitt 7.3.2 braucht sehr lange, um den Photodetektor wieder in dieMitte des Ausgangsbereiches zu bringen.Daher wird im Fall von starken Hintergrundlichtänderungen (Blitze oder aktinisches Lichtan/aus) ein zweistufiger Dunkelregler mit Vorkompensation verwendet. Zweistufig bedeutet,daß ein Regelkreis die Grobabstimmung und ein zweiter die Feinabstimmung übernimmt.Eine solche Aufgabenteilung läßt sich besonders gut bei einem digitalen System durchführen.

Das Blitzlicht in der Version von Schinner et al. (2000) ist eine Halogenlampe, deren Lichtvon einem Shutter an und aus geschaltet wird. In der neuen Version dagegen wird dasBlitzlicht von 65 LEDs erzeugt. Dies ermöglicht ein schnelleres Schalten des Blitzlichtes.Bei der FC-Maschine nach Schinner dauert es ungefähr 10 - 20 ms bis sich der Shuttergeöffnet hat und die Dunkelregelung muß ca. 30 ms durchgehend aktiv bleiben, um den Blitzzu kompensieren.Bei der neuen Version wäre es denkbar, daß die Kompensation des Blitzes nur durch einengenauen Gegensprung aus dem Dunkelkreis erfolgt, was 3 µs dauern würde (Zeit für DA-Wandler), da beide Signale über eine Transistoransteuerung erfolgen. Dann wäre dieKompensation nach einer Abtastzeit fertig. Aber die erforderliche Höhe dieses Sprungs istveränderlich, da sie vom Zustand des Blattes abhängt.Daher wird ein lernfähiges System verwendet, das sich merkt, wieviel zur Kompensationbeim letzten Blitz nötig war, und diesen Wert als Gegenpuls beim nächsten Blitz verwendet.Wenn sich der Zustand des Blattes zwischen zwei Blitzen nicht ändert, liefert diese Methodegute Ergebnisse.Zu den Zeiten, an denen sich das aktinische Licht ändert, wird aufgrund vonErfahrungswerten die Gegenpulshöhe eingestellt. Bei diesem Verfahren liegt der Gegenpulsdurchschnittlich 5% daneben und die Ausregelungszeit liegt durchschnittlich bei 400 µs. Daßaber auch ein viel zu schwacher Gegenpuls nur eine Blitzkompensationszeit von ca. 1 ms zurfolge hat, wird im folgenden gezeigt:

7.3.4.1 Ablauf der Kompensation starker Hintergrundlichtänderungen(2-stufige-Dunkelregelung)

Wenn der aufgrund schlechter Information über den Blattzustand ungünstig gerateneGegenpuls des Dunkelreglers erheblich von dem abweicht, was nötig ist, sind die zweitePhotodetektorstufe (2. FD-Stufe) und evtl. auch die erste FD-Stufe übersteuert.Der Ablauf der zweistufigen Dunkelregelung nach diesem Gegenpuls, der mehr oder wenigergut das Blitzlicht kompensiert, läuft folgendermaßen ab:Wenn trotz des Gegenpulses auf die Dunkelansteuerung (DA) die zweite Photodetektorstufe(2. FD-Stufe) übersteuert ist, erfolgt die Signalabnahme von der ersten FD-Stufe (ADW2)

68

(Abbildung 5.2). Dadurch wird zunächst über die erste FD-Stufe geregelt. Wenn sich jetzt amSignal der ersten Stufe zeigt, daß das Signal so dicht an Null liegt, daß die zweite Stufe nichtmehr übersteuert wird, tritt der Regler über die zweite FD-Stufe (ADW1) in Aktion.Daß mit dem gleichen Algorithmus über die erste FD-Stufe geregelt werden kann und nur dieVerstärkung von 10 der zweiten Stufe berücksichtigt werden muß, ergibt sich daraus, daß dieZeitkonstanten von der ersten FD-Stufe stammen (Abschnitt 6.7.1.3).Ist die zweite FD-Stufe nicht übersteuert, wird nur über die zweite FD-Stufe geregelt.

-1000

-800

-600

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100

t in µµµµs

x, x

d in

V

0

50

100

150

200

250

300

350

400

u in

rela

tiven

Ein

heite

n

u

xd

x

ab hier Regelungüber 2. FD-Stufe

Abbildung 7.6: Verlauf der 2-stufigen Dunkelregelung, wenn der Gegenpuls nur halb so großwie nötig ist

Abbildung 7.6 zeigt den Regelverlauf aus Dunkelregelung über 1. Stufe und 2. Stufe beieinem Blitz auf ein dunkeladaptiertes Blatt und einem Gegenpuls, der nur die halbe Größe wienötig hat. Dies kann als schlimmster Fall angesehen werden, bei dem auch die erste FD-Stufestark übersteuert ist. Der Regelprozeß dauert nur ungefähr 1 ms, was also selbst in diesemschlimmsten Fall sehr schnell geht. Bis t = 860 µs wird über die erste FD-Stufe geregelt,danach über die zweite FD-Stufe nachgeregelt. Es ist auch zu sehen, daß es ungefähr 100 µsdauert, bis der Operationsverstärker der 1. Stufe (OP1 in Abbildung 5.2) aus derÜbersteuerung kommt, da bei t = 340 µs die Stellfunktion u bereits so groß wie am Ende istund erst bei t = 440 µs umschlägt und damit kurz in die andere Richtung übersteuert, da dieStellfunktion uDUNKEL zu groß geworden ist. Wenn nur über die zweite FD-Stufe geregeltwird, dauert es ca. 3800 µs, bis die 2. FD-Stufe aus der Übersteuerung heraus ist. DerUnterschied ist so groß, da die zweite Stufe um den Faktor 10 verstärkt und daher der Reglerbei einer Regelung über die erste Stufe 10-mal so große Werte für die Regelabweichungannimmt und daher auch 10-mal so große Sprünge erzeugt, so daß es auch ca. 10-mal so langedauert, bis die Übersteuerung beseitigt ist.

69

7.3.4.2 Test der Hintergrundlichtkompensation

Abbildung 7.7: Test der Kompensation starker Hintergrundlichtänderungen. Das starkeBlitzlicht von 800 Wm-2 wird bei t = 30 s angeschaltet und bei t = 31 s ausgeschaltet. Es zeigtsich kein Einfluß auf das Ergebnis des Hellreglers, der mit einer Meßlichtintensität vonIML = 2 Wm-2 regelt.

Daß die Kompensation starker Hintergrundlichtänderungen funktioniert und dieMeßergebnisse der Hellregelung von starken Hintergrundlichtänderungen nicht beeinflußtwird, zeigt Abbildung 7.7. Es wurde ein Test an fluoreszierendem Computerpapier gemacht,das ein streng lineares System darstellt:

• Die Fluoreszenz des Computerpapiers zeigt keine Kinetik.• Die Fluoreszenzantworten auf Meßlicht und Hintergrundlicht sind additiv und

beeinflussen sich nicht.

In Abbildung 7.7 sind die Ergebnisse der Stellgröße uHELL des Hellreglers gezeigt. Bei t = 30 swurde Blitzlicht von 800 Wm-2 angeschaltet und bei t = 31 s wieder ausgeschaltet.

0100200300400500600700800900

10001100120013001400150016001700180019002000210022002300240025002600270028002900300031003200330034003500

28 29 30 31 32 33

t in s

Erge

bnis

Hel

lregl

er in

rela

tiven

Ein

heite

n

Blitz an Blitz aus

70

7.4 Programmablauf

Abbildung 7.8: Schematische Darstellung des Programmablaufs

Das Programm, das die Messungen nach der Sättigungsblitzmethode durchführt, istschematisch in Abbildung 7.8 dargestellt. Nach 400 µs Relaxation (ganz oben inAbbildung 7.8), um jedes mögliche Signal ausklingen zu lassen, beginnt die Flußmessungdurch den Hellregler. Nach 100 µs Relaxation ist das Signal des Hellreglers auf 8%abgeklungen und bei zu großer Abweichung der zweiten Stufe des Photodetektorausgangs (2.Stufe des FD-Ausgangs) von der Mitte des Bereiches (| xd (DUNKEL) | < 0.8 V) regelt derDunkelregler (über die 2. FD-Stufe) ihn wieder in eine Spanne von 0.4 V um den FD-Ausgangsbereich (| xd (DUNKEL) | < 0.4 V). Wenn nach dem Zeitplan der Sättigungsblitz-methode (siehe Abschnitt 4.4, Abbildung 4.2) eine Veränderung des Hintergrundlichtes fälligist, wird dieses geändert und nach dem Gegenpuls evtl. die Dunkelregelung über die erstePhotodetektorstufe (1. FD-Stufe) aber auf jeden Fall die Dunkelregelung über die 2. FD-Stufe

71

eingesetzt, um dieses zu kompensieren. Danach erfolgt in allen Fällen 400 µs Relaxation(ganz oben in Abbildung 7.8), um die Signale des vorherigen Programmteils (Hellregler,Dunkelregler) ausklingen zu lassen und dann kommt wieder die Hellregelung usw.

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 2750 3000 3250

t in µµµµs

2.St

ufe

Phot

odet

ekto

raus

gang

in V

HR1 R2R1 DR1 R3 HR2 R4 HR3 R5

Abbildung 7.9: Ausschnitt aus Programmablauf. Es ist der Verlauf desPhotodetektorausgangs (2. Stufe) dargestellt (Regelgröße x). HRi := Hellreglerverlauf,Ri = Relaxationsverlauf, DR1 = Dunkelreglerverlauf

In Abbildung 7.9 ist ein Ausschnitt aus dem Verlauf der zweiten Stufe desPhotodetektorausgangs (Regelgröße x) während des Programmablaufes gezeigt. Als erstes istder Rest einer Relaxation dargestellt (R1), dann eine Hellregelung (HR1). Da nach kurzerRelaxation von 100 µs (R2), die Regelgröße außerhalb des Bereiches von ± 0.8 V ist, regeltder Dunkelregler die Regelgröße wieder in den Bereich um ± 0.4 V (DR1). Nach 400 µsRelaxation (R3) des Signals der Dunkelregelung wird der Hellregler angeschaltet (HR2).Danach erfolgen 500 µs Relaxation der Hellregelung (R4), da sich die Stellgröße nochinnerhalb von ± 0.8 V befindet, eine Hellregelung (HR3) und eine Relaxation derHellregelung (R5).Die Dunkelregelung kommt nur relativ selten zum Einsatz. Selbst in Phasen, in denen sichdie Eigenschaft des Blattes über einen langen Zeitraum ändert, z.B. in der Minute nachEinschalten des aktinischen Lichtes wird der Dunkelregler nur ca. alle 40 ms benutzt.Daher kann der Regler ungefähr alle 1ms ein neues Ergebnis liefern. Das ist ungefähr soschnell wie die schnellste Einstellung der FC-Maschine von Schinner et al. (2000), dieallerdings aus Sicherheitsgründen normalerweise nur mit 5 ms betrieben wird.

72

Kapitel 8

Erprobung der digitalen FC-Maschine

Die höchsten Ansprüche an die Regler stellt die Sättigungsblitzmethode (Abschnitt 3.4), dadie gegenüber dem Meßlicht 100- bis 1000-fach höhere Intensität vom Dunkelreglerkompensiert werden muß. Deshalb wird als Nachweis der Funktion der neuen FC-Maschineeine Induktionskurve mit sättigenden Blitzen (Abbildung 8.1 und Abbildung 8.2)aufgenommen.

8.1 Messungen mit der Sättigungsblitzmethode der neuen FC-Maschine

Abbildung 8.1: Messung mit der neuen FC-Maschine: größeres Rauschen als die Messungenmit der FC-Maschine von Schinner

In Abbildung 8.1 ist eine Messung mit der neuen FC-Maschine abgebildet. Man erkennt, daßdie typischen Eigenschaften der FC-Induktionskurve (Abbildung 4.2) richtig wiedergegebenwerden. Allerdings ist das Rauschen höher als bei der FC-Maschine von Schinner

73

(Abbildung 4.2). Der Grund ist, daß bei der digitalen Maschine gesampelt wird. Das heißt eswerden während sehr kurzer Zeit Meßwerte übernommen und andere Zeitbereiche werden garnicht in den Meßprozess einbezogen. Im analogen System hingegen ergibt sich aus denZeitkonstanten des Systems und den langen Aufladezeiten der Sample-and-Hold-Bausteineeine Mittelung.

Daher wurde mit Mittelung gemessen: Es wurde für die Messung in Abbildung 8.1 alle 64 msein Ergebnis für die Stellfunktion u des Hellreglers gespeichert. Der Hellregler liefert aber ca.alle 1 ms ein Ergebnis für die Stellfunktion uHELL. Daher wurde, um das Rauschen zubeseitigen, über alle Ergebnisse innerhalb der 64 ms gemittelt. Da außer bei Änderungen desHintergrundlichtes die Stellfunktion uHELL des Hellreglers keine Sprünge aufweist, geht dabeikeine Information verloren, wenn man darauf achtet, daß nicht über die Sprungstellen desHintergrundlichtes gemittelt wird.Eine solche Messung ist in Abbildung 8.2 abgebildet. Das Rauschen ist erheblich kleiner,sogar kleiner als bei der FC-Maschine von Schinner (Abbildung 4.2).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

t in µµµµs

Flüs

se Φ ΦΦΦ

(Ste

llunk

tion

u) in

will

kürli

chen

Ein

heite

n

Abbildung 8.2: FC-Messung mit der neuen FC-Maschine mit Mittelung über 64 ms

74

Kapitel 9

Fazit und Ausblick

Abb. 8.1 und 8.2 zeigen, daß die digitale FC-Maschine funktioniert und gleich guteErgebnisse wie die von Schinner et al. (2000) entwickelte Maschine in Analogtechnik liefert.Das Ziel, die Analogtechnik weitgehend zu reduzieren, ist geglückt. Insbesondere konnten dieproblematischen Teile, nämlich die Sample-and-Hold Bausteine (die doch immer wiederetwas vergessen) und die schwingungempfindlichen Breitbandverstärker, durch Softwareersetzt werden.Kritisch ist sicher die Ermittlung der Zeitkonstanten der verbliebenen Analogteile,insbesondere des Photodetektors. Aber die Software zur automatischen Suche der geeignetenParameter nimmt einem die ganze Abgleichsarbeit ab. Man baut irgendeinenPhotodiodenverstärker, natürlich unter dem Gesichtspunkt geringen Rauschens und hoherGeschwindigkeit. Dann braucht man aber keinen Breitbandverstärker durch RC-Netzwerke soabgleichen, daß das Gesamtsystem einen schönen 1/f- Frequenzgang erhält, wie derunerbittliche Satz von Bode (1964) es fordert. Stattdessen läßt man den Computer über Nachtdie beste Kombination von Zeitkonstanten selbst suchen, und am nächsten Morgen ist derideale Regelkreis bereits fertig.Weiterhin ist erfreulich, daß der Regler tolerant gegenüber falschen Parametern ist. DerRegelungsprozeß dauert dann zwar länger, aber der Endwert kann mindestens genau soschnell erreicht werden wie beim Analogregler. Die Flexibilität von Softwarelösungen zahltsich besonders bei der Aufspaltung des Dunkelreglers in eine Grob- und Feinabstimmung aus,die bei sättigendem Hintergrundlicht, einer häufigen Meßbedingung, sehr zur Schnelligkeitdes Einstellens beiträgt.Verbesserungswünsche sind hingegen vom unersättlichen Wunsch nach Geschwindigkeitgeprägt. Hier allerdings ist wieder die Analogtechnik gefragt, denn die Einstellzeit hängt anden Zeitkonstanten des OPs im Stromspannungswandler des Photodetektors. Das hier nochReserven sind, sieht man an den Patch-Clamp Verstärkern (Neher und Sakmann 1995), dieBandbreiten von 200 kHz bei Strommessungen im pA-Bereich erreichen.

75

Kapitel 10

Zusammenfassung

Bei der FC(Fluorescence-Clamp)-Maschine stellt ein Regler die Lichtintensität der Meßlicht-LED so ein, daß die gemessene Chlorophyll-Fluoreszenz einem vorgegebenen Sollwertentspricht. Dann ist die Meßlichtintensität ein Maß für die Exzitonenfüsse Φ amPhotosystem II. Die Aufgabe dieser Arbeit war die Entwicklung einer portablen undmöglichst auch besseren Version der FC-Maschine als die Vorversion von Schinner et al.(2000).Wie bei der Vorversion in Analogtechnik von Schinner et al. (2000) gibt es einenHellregelkreis zur Messung des Zustandes des Blattes über die Intensität der Meßlicht-LEDund einen Dunkelregelkreis für die Kompensation des Hintergrundlichtes, bei dem der dazunötige Strom über einen Transistor eingespeist wird. Dadurch kann die Größe desYieldsignals des Photodetektors optimal an den Aussteuerbereich der AD-Wandler angepaßtwerden.Die Regelung wird bei der neuen digitalen FC-Maschine von einem Computerprogrammübernommen. Ein Regler endlicher Einstellzeit wurde gewählt, damit eine möglichst schnelleRegelung gelingt. Der Regler endlicher Einstellzeit besteht aus einer Steuerung und einerRegelung. Die Steuerung nutzt das Vorwissen über das System aus, die eine schnelleEinregelung in endlicher Einstellzeit ermöglicht. Die Regelung ist das Sicherheitsnetz, dasimmer funktioniert. Es wurde nur das Nötigste als analoger elektronischer Aufbau nochbeibehalten und möglichst viel durch Computerprogramme ersetzt. Es blieben noch dieAnsteuerung der Regelungs-LED und die Ansteuerung der Stromeinspeisung zurKompensation des Hintergrundlichtes und der Photodetektor übrig.Das Wissen über das analoge System, das in der Kenntnis der Gleichspannungsverstärkungund der Zeitkonstanten des analogen Systems besteht, wurde zuerst ausFrequenzgangmessungen gewonnen. Als effektiver und für den späteren Einsatz anunbekannten Systemen erwies sich aber ein neuentwickelter Computeralgorithmus, der dieoptimalen Parameter selber sucht.Die zwei gefundenen Zeitkonstanten stammen aus dem Photodetektor und kommen daher inDunkel- und Hellregelkreis gleichermaßen vor, so daß diese die gleiche Stellfunktion u haben.Man muß nur berücksichtigen, daß die Gleichspannungsverstärkung r0 der beidenunterschiedlich ist und kann ansonsten den gleichen Regler für beide Regelkreise verwenden.Bei dem Hellregelkreis ist die Gleichspannungsverstärkung r0(HELL) vom Zustand des Blattesabhängig. Da der Regler endlicher Einstellzeit seine Stärke der schnellen Einregelung nurausspielen kann, wenn das Vorwissen stimmt, wird die Gleichspannungsverstärkung desHellkreises r0(HELL) laufend korrigiert.Neben der Veränderung des Grundprinzips gab es auch technische Verbesserungen: AlsBlitzlicht wurden blaue LEDs anstatt der bisherigen Halogenlampe, die durch einen Shuttergeschaltet wurde, verwendet, so daß die Zeit der Unterbrechung durch die Ausregelung beimAn- oder Ausschalten des Blitzlichtes von 30 ms auf höchstens 2 ms verkürzt werden konnte.

76

Auch als Meßlicht und aktinisches Licht wurden blaue LEDs anstatt der bisherigen rotenLEDs verwendet, so daß die Spektren von Anregungslicht und Fluoreszenzlicht sich nichtüberlappen. Deshalb konnte durch die blauen LEDs das Rotfilter auf ein RG 645 umgestelltwerden, so daß das Fluoreszenzsignal voll genutzt wird.Die neue digitale FC-Maschine liefert in bezug auf Schnelligkeit ähnliche Ergebnisse wie dievon Schinner et al. (2000) entwickelte Maschine in Analogtechnik. Das Rauschen wargeringer.

77

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Plant biol. 2: 558-570

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Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei Prof. Dr. Hansen für die interessante Aufgabenstellung,den freundschaftlichen Umgang und die außerordentlich gute Betreuung dieser Arbeitbedanken.

Der gesamten Arbeitsgruppe danke ich für ihre Unterstützung und das nette Arbeitsklima.

Katrin Schinner möchte ich für die vielen Hilfen zur Funktion einer FC-Maschine danken.

Ein Dank an Andreas Ruser und Christoph Plieth für die Messung der LED- undFilterspektren.

Meiner Familie und Enno einen besonderen Dank für das finden der vielen Fehler.

Ich danke allen, die immer an mich geglaubt haben.

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Die eidesstattliche Erklärung:

Hiermit erkläre ich an Eides Statt, daß ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig unterAnleitung meines akademischen Lehrers angefertigt und dabei nur die genannten Quellen alsHilfsmittel verwendet habe.

Kiel, den ......................................................................................................................................