Post on 02-Jul-2019
Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie
der Universität Würzburg
Lehrstuhl für Anatomie II
Vorstand: Professor Dr. med. D. Drenckhahn
Reaktive Veränderungen von Rückenmark und Nervenwurzeln nach dorsaler
Rhizotomie sowie Ausriss und Replantation der Vorderwurzel im Segment C7 mit
Applikation neurotropher Faktoren CNTF und BDNF
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg
vorgelegt von
Nicolas Schlegel
aus
Donaueschingen
Würzburg, Oktober 2006
Referent: Prof. Dr. med. Esther Asan
Koreferent: Prof. Dr. med. Cordula Matthies
Dekan: Prof. Dr. med. Georg Ertl
Tag der mündlichen Prüfung: 11.12.2007
Der Promovend ist Arzt
V
Inhaltsverzeichnis
Einleitung ..................................................................................................... 1
Einführung zum Thema; allgemeine Problematik........................................................ 1
Klinik und Diagnostik von Verletzungen des Plexus brachialis .................................. 2
Definitionen.............................................................................................................. 2
Unfallmechanismus und Folgen ............................................................................... 2
Diagnostik von Nervenwurzelverletzungen des Plexus brachialis........................... 4
Überblick über die Anatomie des Nervensystems........................................................ 6
Bedeutung der Myelinscheide .................................................................................. 7
Anatomie des peripheren Nerven ............................................................................. 8
Anatomie des Rückenmarks ..................................................................................... 9
Schichtenbau und Zytoarchitektonik des Rückenmarks und des Vorderhorns ...... 11
Pathophysiologie von Nervenläsionen ................................................................... 12
Degeneration und Regeneration von Nerven nach Verletzung .................................. 13
Peripheres Nervensystem und Waller-Degeneration.............................................. 13
Reaktion im distalen Stumpf nach Axotomie..................................................... 13
Reaktion im proximalen Anteil der Nervenzelle................................................ 15
Prozesse der Myelinisierung............................................................................... 16
Regeneration im zentralen Nervensystem .............................................................. 18
Therapieansätze zur Behandlung von Nervenwurzelausrissen .................................. 21
Allgemeine Therapieansätze für Nervenverletzungen ........................................... 21
Therapieansätze für Nervenwurzelausrisse ............................................................ 21
VI
Historische Entwicklung .................................................................................... 21
Technik des Nerventransfers .............................................................................. 22
Replantationstechnik von Nervenwurzeln.......................................................... 22
Operationtechnik nach Thomas Carlstedt........................................................... 23
Voraussetzungen für eine Verbesserung der Therapieansätze der Vorderwurzel .. 24
Voruntersuchungen zur vorliegenden Arbeit ............................................................. 25
Neurotrophe Faktoren................................................................................................. 25
Neurotrophine der NGF- Familie ........................................................................... 26
BDNF (brain derived neurotrophic factor)......................................................... 28
Familie der Neurokine ............................................................................................ 29
CNTF (ciliary neurotrophic factor) .................................................................... 29
Familie der Transforming Growth Factors............................................................. 31
Fragestellung der Untersuchungen ............................................................................. 31
Material und Methoden............................................................................32
Untersuchungsmaterial ............................................................................................... 32
Operatives Vorgehen .............................................................................................. 32
Bildung verschiedener Versuchsgruppen ............................................................... 34
Postoperative Beobachtung der Tiere..................................................................... 34
Perfusion und Überlebenszeiträume....................................................................... 34
Behandlung der proximalen Gewebeanteile............................................................... 35
Behandlung der distalen Gewebeanteile..................................................................... 37
Markscheidenfärbung ................................................................................................. 39
VII
Modifizierte Färbung nach Klüver-Barrera (Luxol-Fast Blue Färbung).................... 39
Morphologische und quantitative Auswertung der Gewebeschnitte.......................... 40
Zählung der Vorderhornneurone ............................................................................ 41
Bestimmung der Axondurchmesser ....................................................................... 42
Auswertung der Semidünnschnitte......................................................................... 42
Bestimmung der Myelinisierung ............................................................................ 44
Analyse von Anzahl und Flächen myelinisierter Axone innerhalb des Spinalganglions ...................................................................................................... 45
Messung von Flächen sensorischer Neurone in den Semidünnschnitten ............... 46
Messung der Dichte sensorischer Neurone ............................................................ 46
Ergebnisse ..................................................................................................47
Morphologie des Rückenmarks und der Axonverläufe.............................................. 47
Morphologie des Rückenmarks der unverletzten Seiten ........................................ 47
Morphologie der replantierten Seiten ..................................................................... 49
Replantationstelle und Verletzungsausmaß am Rückenmark ............................ 49
Allgemeine morphologische Beobachtungen an der grauen Substanz............... 52
Intraspinale Narbenausdehnung um die Replantationsstelle im Segment C7 .... 53
Anzahl überlebender Motoneurone nach 6 Monaten ............................................. 53
Allgemeine morphologische Beobachtungen an den Regenerationswegen auswachsender Axone ........................................................................................ 54
Morphologische Unterschiede zwischen ventral und lateral austretenden Axonen............................................................................................................................ 59
Morphologie der Vorderwurzel C7 ............................................................................ 60
VIII
Gesunde, nicht replantierte Seiten .......................................................................... 60
Vergleich zwischen den Gruppen; Besonderheiten............................................ 60
Replantierte Seiten.................................................................................................. 62
Quantitative Analysen ................................................................................................ 62
Gesamtflächen der Vorderwurzeln......................................................................... 62
Axonzahlen der Vorderwurzeln.............................................................................. 63
Analyse von Axonflächen der Vorderwurzel ......................................................... 64
Axon-Myelinverhältnis........................................................................................... 65
Veränderungen in der rhizotomierten Hinterwurzel und im Spinalganglion ............. 69
Veränderungen im zentralen Rest der C7 Hinterwurzel......................................... 69
Morphologie des C7 Spinalganglions ........................................................................ 72
Axone in den Spinalganglien.............................................................................. 74
Verlauf der zentralen sensorischen Fortsätze ..................................................... 77
Morphologie des Nervus radialis................................................................................ 80
Gesunde, nicht replantierte Seiten .......................................................................... 80
Replantierte Seiten.................................................................................................. 81
Diskussion ..................................................................................................83
Das verwendete Tiermodell ist der klinischen Situation eher vergleichbar als frühere Modelle....................................................................................................................... 84
Interindividuelle Abweichungen des Verletzungsausmaßes: mögliche Ursachen ..... 84
Kein deutlicher Einfluß auf Motoneuronüberleben nach einmaliger Applikation neurotropher Faktoren ................................................................................................ 86
Regenerierende Axone wachsen lateral und ventral aus ............................................ 87
IX
Ventrale Replantation könnte günstige Effekte haben ............................................... 88
Deutliche Regeneration von myelinisierten Axonen in der Vorderwurzel auf Höhe des Spinalganglions .................................................................................................... 90
Regenerierte Vorderwurzelaxone sind kleinflächig ................................................... 92
Neurotrophe Faktoren wirken positiv auf die Remyelinisierung ............................... 93
Morphologie des Nervus radialis zeigt regenerative Prozesse ................................... 95
Verletzungsauswirkungen auch auf den unverletzten Seiten? ................................... 96
Beobachtungen zur durchtrennten Hinterwurzel vervollständigen das Bild der komplexen Veränderungen im Segment C7............................................................... 96
Reaktion der Spinalganglienneurone auf Axotomie des zentralen Fortsatzes ist minimal....................................................................................................................... 99
Wege der regenerierten Hinterwurzelaxone zeigen möglicherweise Einfluss auf die regenerierende Vorderwurzel ................................................................................... 102
Zusammenfassung...................................................................................104
Literatur ...................................................................................................106
Danksagung..............................................................................................120
Lebenslauf ................................................................................................121
1
Einleitung
Einführung zum Thema; allgemeine Problematik
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zu
Regenerationsphänomenen in Rückenmark und Nervenwurzeln sowie zum Einfluss
neurotropher Faktoren CNTF (ciliary neurotrophic factor) und BDNF (brain derived
neurotrophic factor) auf diese Phänomene in einem Plexus brachialis-Läsions- und
Therapiemodell (dorsale Rhizotomie, Ausriss und Replantation der Vorderwurzel im
Segment C7) nach einer Regenerationszeit von sechs Monaten.
Durch extreme Zugbelastung an Nervenfasern des Plexus brachialis kann es zu
vielfältigen Verletzungsmustern kommen. Für die meisten dieser Verletzungen
existieren chirurgische Therapieverfahren, die seit einiger Zeit zu wachsenden Erfolgen
in der Wiederherstellung der Funktion der verletzten peripheren Nervenstränge führen.
Eine der gravierendsten Verletzungen des Plexus brachialis ist der Ausriss von
Nervenwurzeln aus dem Rückenmark, da an diesen Verletzungen nicht nur das
periphere Nervensystem, sondern durch die Beschädigung des Rückenmarks auch das
zentrale Nervensystem mitbeteiligt ist. Nervenwurzelausrisse sind Folge extremer
Zugbelastungen und daher immer traumatisch bedingt. Bis vor wenigen Jahren wurden
solche Verletzungen als nicht therapierbar angesehen und die chirurgische Intervention
war auf Maßnahmen begrenzt, die mit einem Nerventransfer zumindest eine partielle
Wiederherstellung der verlorengegangenen Funktionen erlaubte.
Die bisher unbefriedigenden Therapieergebnisse und die relativ geringen Kenntnisse
über die komplexen Schädigungsfolgen auf zellulärer Ebene lassen einen weiten Raum
für die experimentelle Erforschung neuer Therapieansätze. Um diese Herausforderung
erfolgreich angehen zu können, ist es sinnvoll, dass verschiedene Disziplinen der
Medizin eng zusammenarbeiten. Grundlage der vorliegenden Arbeit ist daher eine enge
Verknüpfung zwischen chirurgisch-experimenteller Arbeit und histologisch-
morphologischer Analyse der Ergebnisse. Die Zusammenarbeit erfolgte zwischen Frau
Dr. Eva Lang, Oberärztin für Plastische- und Handchirurgie des Universitätsklinikums
in Freiburg im Breisgau und dem Institut für Anatomie und Zellbiologie der Universität
Würzburg.
2
Klinik und Diagnostik von Verletzungen des Plexus brachialis
Definitionen
Verletzungen des Plexus brachialis können in Penetrationsverletzungen,
Kompressionsverletzungen und Zug- bzw. Traktionsverletzungen eingeteilt werden. Die
bei weitestem häufigste Verletzung des Plexus brachialis ist dabei die
Traktionsverletzung. Für die Behandlungsweise und Prognose ist die weitere
Unterscheidung zwischen zwischen prä- und postganglionärer Verletzung wichtig.
Postganglionäre Verletzungen sind definiert als Verletzungen, die distal des
Spinalganglions liegen. Entsprechend befindet sich eine präganglionäre Läsion
proximal des Spinalganglion. Bei den bereits intradural liegenden präganglionären
Läsionen ist entscheidend, ob sie sich zentral oder peripher der Transitionszone
zwischen zentralem und peripherem Nervensystem befinden. Im Falle, dass sich die
Läsion peripher dieser Übergangszone befindet, kann man bei der operativen
Exploration Nervenstümpfe unterschiedlicher Länge erkennen. Daher hat man diese
diese Art der Verletzung als periphere intradurale Ruptur bezeichnet. Im anderen Fall
der zentralen intraduralen Ruptur findet sich der Ausriss der Nervenwurzel
einhergehend mit einer oberflächlichen Verletzung des Rückenmarks. Wird in der
vorliegenden Arbeit von Nervenwurzelausrissen gesprochen, ist damit die zentrale
intradurale Ruptur gemeint (Tavakkolizadeh et al., 2001; Birch, 1998; Schenker and
Birch, 2000).
Unfallmechanismus und Folgen
Nervenwurzelausrisse kommen am häufigsten bei Motorradunfällen, Verkehrsunfällen
und komplizierten Geburten vor. Es handelt sich dabei um Schädigungen, die durch
extreme Zugbelastung auf die Nervenwurzeln ausgelöst werden (Bae et al., 2003;
Dunham, 2003; El Gammal and Fathi, 2002; Kim et al., 2003; Terzis et al., 1999). In
Abbildung 1 sind typische Positionen dargestellt, die zu Ausrissen von Nervenwurzeln
führen.
3
Oft betreffen diese Verletzungen nicht nur ein Segment, sondern mehrere
Nervenwurzeln, die an der Bildung des Plexus brachialis beteiligt sind. Dies führt meist
zum kompletten Ausfall der motorischen und sensorischen Qualitäten, was funktionell
einer Amputation des betroffenen Armes gleichkommt. Da es sich überwiegend um
Folgen von Motorradunfällen handelt, sind vorwiegend jüngere Menschen von solchen
Verletzungen betroffen. Der obere Teil des Plexus brachialis ist häufiger betroffen als
der untere. Häufigste Lokalisation von Nervenwurzelausrissen aus dem Rückenmark ist
das Segment C7. Eine Erklärung für diese Lokalisation ist wohl die stärkere Fixierung
an den äußeren Rand der Foramina intervertebralia der Spinalnerven C5-C7 und die
vergleichsweise ungeschützte Lage im Halsbereich (Drenckhahn D., 2004b).
Fast immer werden beide Nervenwurzeln, also sowohl Vorder- als auch Hinterwurzel,
ausgerissen bzw. verletzt. Ein isolierter Vorderwurzel- bzw. Hinterwurzelausriss kommt
sehr selten vor. Häufig sind Patienten mit einer solchen Verletzung polytraumatisiert, so
dass sich der Nervenwurzelausriss erst später diagnostiziert wird oder aufgrund vitaler
Bedrohung durch andere Verletzungen als nachrangig eingestuft wird. Dies hat
ungünstige Auswirkungen auf die Prognose. Die Gründe werden unten näher erläutert.
Abbildung 1: Typische Positionen nach Unfall mit Motorrädern, die durch starke mechanische Zugbelastung zum Ausriss von Nerven-wurzeln aus dem Rückenmark führen (zur Verfügung gestellt von Frau Dr. Eva Lang).
4
Diagnostik von Nervenwurzelverletzungen des Plexus brachialis
Das Ergebnis der klinischen Untersuchung des Patienten wird üblicherweise nach der
Narakas-Klassifikation dokumentiert (Verfahren am Royal National Orthopaedic
Hospital, Stanmore, England):
- Grad I: Ausfall von C5, C6 und C7
- Grad II: Ausfall von C5, C6, C7 und C8
- Grad III: Ausfall von C5-Th1; also gesamter Plexus brachialis
- Grad IV: Ausfall von C5-Th1 mit Hornersyndrom (Ptosis, Miosis, Enophtalmus)
Im klinisch unrealistischen Falle eines isolierten Nervenwurzelausrisses (wie im
Tiermodell der vorliegenden Arbeit; siehe unten) würde sich dem Untersucher beim
Menschen folgendes Bild bieten: Da die Nervenwurzel C7 einen starken Anteil des
Nervus radialis bildet, sind Streckdefizite in Ober- und Unterarm und somit eine
„Fallhand“ zu erwarten. Kennmuskel für dieses Segment ist der M. triceps brachii. In
der Regel ist spätestens nach acht Wochen eine deutliche Atrophie der betroffenen
Muskelpartien zu sehen. Im entsprechenden Dermatom findet sich entsprechend einer
gleichzeitigen Verletzung der Hinterwurzel auch ein Sensibilitätsverlust.
Durch die klinische Untersuchung ist es normalerweise nicht möglich zwischen präg-
und postganglionären Läsionen zu unterscheiden. Auch elekrophysiologische Verfahren
bringen üblicherweise nicht die nötige Sicherheit für eine Diagnose, so dass der
behandelte Arzt zur optimalen Diagnostik auf bildgebende Verfahren angewiesen ist.
Hierfür stehen verschiedene Möglichkeiten zur Verfügung.
Ein Verfahren stellt die Bildgebung mit dem MRT dar (Abbildung 2). Den
limitierenden Faktor bei der Bildgebung durch das MRT stellt die Schichtdicke von 4-5
mm für axiale Sequenzen dar. Menschliche Nervenwurzeln haben einen Durchmesser
von 1-3 mm. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass das MRT nur in
Ausnahmefällen eine klare Diagnostik der Nervenwurzelausrisse erlaubt. Einen
einigermassen sicheren Hinweis auf den zentralen Ausriss der Nervenwurzel gibt das
durch die Verletzung entstehende Ödem (Tavakkolizadeh et al., 2001).
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Abbildung 2: MRT- Bild in T1-Wichtung eines Patienten mit Nervenwurzelausriss rechts (A) und ein Bild eines unverletzten Rückenmarkssegments im Vergleich (B). Man sieht, wie die Kontinuität zwischen Rückenmark und Vorderwurzel bzw. Rückenmark und Hinterwurzel aufgehoben ist (A). Abbildung 2 und 3 modifiziert nach „Preoperative Assessment of Stretch/ Contusive Injuries to the Brachial Plexus der Homepage Aruna Ganju, MD und David G. Kline, MD“.
Das hochauflösende CTM (Computerised Tomographic Myelography) ist derzeit am
ehesten in der Lage zwischen zentraler und peripherer Ruptur zu unterscheiden. Die
Myelographie bzw. die CTM stellt daher das Verfahren der Wahl zur Darstellung von
Nervenwurzelausrissen dar. Bei dieser Untersuchung wird der Dura mater-Sack mit
einem Kontrastmittel gefüllt. Im Röntgenbild zeigt sich ein Nervenwurzelausriss dann
als Aussackung des Dura mater-Sackes. Auch im CT-Bild ist die Aussackung der Dura
Mater gut zu erkennen und gilt als eindeutiges diagnostisches Merkmal
(Tavakkolizadeh et al., 2001);(Abbildung 3).
Abbildung 3: (folgende Seite) Myelographische Darstellung von Nervenwurzelausrissen: links ein Röntgenbild nach Kontrastmittelapplikation in den Dura mater Sack a.p; die Pfeile zeigen die Aussackung des Dura Mater Sackes welche als diagnostisches Merkmal eines Nervenwurzelausriss gilt; A-D CTM Bilder eines Patienten nach Kontrastmittelapplikation in den Dura Matersack (Quelle siehe oben).
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Überblick über die Anatomie des Nervensystems
Im Folgenden soll ein Überblick gegeben werden, welcher auch Laien bzw. Betroffenen
das Verständnis der vorliegenden Arbeit ermöglichen soll. Es handelt sich dabei um die
Darstellung von zusammengefasstem Lehrbuchwissen:
Das Nervengewebe ist strukturelle Grundlage des Nervensystems. Es stellt eine
funktionelle Einheit dar, die zur Reizaufnahme, Erregungsbildung,
Erregungsweiterleitung, Verarbeitung und Beantwortung von Reizen aus der Umwelt
und dem Körperinneren dient. Das Nervensystem setzt sich aus dem zentralen
Nervensystem (ZNS) und dem peripheren Nervensystem (PNS) zusammen.
Das Neuron ist die spezifische Zelle des Nervengewebes, die hochspezialisiert und nicht
mehr teilungsfähig ist. Die Nervenzelle besteht aus dem Zellkörper (Soma) und seinen
Fortsätzen, den Dendriten und Axonen. Es existieren mehrere Typen von Neuronen, die
nach Anzahl ihrer Fortsätze unterschieden werden: Man unterscheidet multipolare,
unipolare, pseudounipolare und bipolare Neuronen, deren Lokalisation für verschiedene
Regionen des Nervensystems typisch ist. So sind die Motoneurone in den
Vorderhörnern des Rückenmarks, Körnerzellen, Sternzellen, Korbzellen des Kleinhirns
und Pyramidenzellen des Neocortex multipolare Nervenzellen, die Zellen in den Spinal-
und Hirnnervenganglien sowie im mesenzephalen Trigeminuskern sind pseudounipolar;
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bipolare Nervenzellen findet man typischerweise in der Retina, im Ganglion spirale, im
Ganglion vestibulare und im olfaktorischen System.
Der Zellkörper (Soma) enthält den Zellkern und dessen zytoplasmatische Umgebung,
das Perikaryon. Die Größe des Zellkörpers variiert zwischen 6 und 100 µm im
Durchmesser und ist mit seiner Vielzahl von Mitochondrien, dem endoplasmatischem
Retikulum (ER) und Golgi-Apparat Ort der Proteinsynthese. Der Proteingehalt einer
Nervenzelle wird in 14 Tagen durchschnittlich einmal umgesetzt. Für den Umsatz
und Nachschub von Proteinen in die Fortsätze der Zellen existieren verschiedene
Transportmechanismen, die z.B. durch ATP-abhängige Transportmoleküle entlang der
Mikrotubuli vermittelt werden.
Das endoplasmatische Retikulum wird in der Nervenzelle auch als Nissl-Substanz
bezeichnet. Ihre biochemischen Eigenschaften macht man sich in der Nissl-Färbung zur
Anfärbung von Neuronen in histologischen Schnitten zu Nutze. Feine Verästelungen,
die vom Zellkörper ausgehen, werden Dendriten genannt. Sie unterscheiden sich,
abhängig vom Typ der Nervenzelle, in Länge und Grad der Verzweigung. Sie sind
anhand ihrer Morphologie und über Oberflächenantigene immunhistochemisch von
Axonen zu unterscheiden. Das Axon einer Nervenzelle entspringt aus dem Soma.
Gelegentlich können Axone ihren Ursprung auch aus großen Dendriten haben
(Drenckhahn D, 2004a; Drenckhahn D., 2004b).
Bedeutung der Myelinscheide
Neuronale Fortsätze werden von Zellen umhüllt, welche die sogenannte Markscheide
bzw. Myelinscheide bilden. Die Myelinscheide von markhaltigen Axonen erhöht den
Membranwiderstand erheblich und wird im ZNS von Oligodendrozyten, im PNS von
Schwann-Zellen gebildet. Die durch die Umhüllung entstandene Isolierschicht um die
Nervenfortsätze ist in ihrem Verlauf nicht kontinuierlich, sondern durch reguläre
Intervalle unterbrochen, die kein Myelin enthalten und als Ranvier`sche Schnürringe
bezeichnet werden. Sie ermöglichen eine sprunghafte (saltatorische) Weiterleitung von
Aktionspotentialen von einem Schnürring zum nächsten. Auf diese Weise kann die
Geschwindigkeit der Reizleitung gegenüber unmyelinisierten Axonen um einen
erheblichen Faktor gesteigert, metabolische Energie für die Entstehung von
Aktionspotentialen gemindert und durch Reduktion des Axondurchmessers Platz im
Nervensystem eingespart werden. Die Leitungsgeschwindigkeit myelinisierter
8
Nervenfasern beträgt 5-120 m/s. Es werden nach Durchmesser und
Leitungsgeschwindigkeit verschiedene Gruppen von Nervenfasern unterschieden, die in
Tabelle 1 kurz charakterisiert sind.
Es besteht eine proportionale Beziehung zwischen der Dicke der Myelinscheide und der
Dicke des Axons, die als g-ratio bezeichnet wird (Adhami et al., 1976; Orgel, 1982;
Fraher and O`Sullivan 2000; Nave and Salzer, 2006). Diese Beziehung beeinflusst
wesentlich die Funktion des Axons und damit der gesamten Nervenzelle. Die
Geschwindigkeit der Erregungsleitung ist von diesen beiden kritischen Größen der
Nervenfaser abhängig. Bei Vergrößerung des Durchmessers eines Axons und
entsprechend dickerer Myelinscheide wird die Reizleitung als Folge größeren
Stromflusses erhöht.
Anatomie des peripheren Nerven
Periphere Nerven enthalten somato und viszeromotorische, und -sensorische Fasern.
Die Zellkörper der motorischen Fasern sind Vorderhornzellen im Rückenmark, die
Zellkörper der sensorischen Fasern sind die pseudounipolaren Zellen im
Spinalganglion. Das Nervenfaserbündel wird von drei Schutzschichten umgeben:
Tabelle 1: Schematische Übersicht über Fasertypen, Durchmesser, Leitgeschwindigkeit und Funktion der verschiedenen Nervenfasern; modifiziert nach Silbernagl/Despopoulos (Taschenatlas der Physiologie).
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- Epineurium: Umhüllt den peripheren Nerven als Ganzes und besteht aus dichtem
Bindegewebe. Netzwerke von Lymph- und Blutgefäßen sind im Epineurium enthalten.
- Perineurium: Epithelartig, mehrschichtig angeordnete Zellen, die untereinander mit
Tight Junctions verbunden sind und damit für die meisten Makromoleküle eine
Diffusionsbarriere bilden und den intrafunikulären Druck erzeugen.
- Endoneurium: Lockeres Bindegewebe, das sich an die Basallamina der Schwann-
Zellen anschließt und jede Nervenfaser als schmalen Saum aus kollagenen Fibrillen
umhüllt. Im Endoneurium kommen freie Zellen und Kapillaren vor. Innerhalb des
Endoneuriums bedindet sich eine liquorähnliche Flüssigkeit.
Anatomie des Rückenmarks
Das Rückenmark ist ein Teil des zentralen Nervensystems. Es befindet sich im
Wirbelkanal, der durch die Wirbelkörper und deren Wirbelbögen gebildet wird. Das
Rückenmark ist ein weißlicher, zylindrischer Strang, der einen kreisrunden bis ovalen
Querschnitt zeigt. Sein Gewicht beträgt beim erwachsenen Menschen etwa 36g und ist -
abhängig von der individuellen Rumpflänge des erwachsenen mitteleuropäischen
Menschen - durchschnittlich 40-45 cm lang. Der kraniale Beginn des Rückenmark ist
auf Höhe der Kreuzung der Pyramidenbahn im unteren Bereich der Medulla oblongata
etwa auf Höhe des Foramen magnum des Os occipitale und es erstreckt etwa bis auf die
Höhe des zweiten Lendenwirbels. Nach kaudal verjüngt sich das Rückenmark zum
Conus medullaris. Das Rückenmark gibt insgesamt 31-33 Spinalnerven ab, deren
genaue Zusammensetzung unten genauer beschrieben wird. Entsprechend seiner
Projektion auf die Körperabschnitte wird das Rückenmark in folgende Abschnitte
unterteilt:
- Pars cervicalis mit den Nervenwurzeln für 8 Zervikalnerven
- Pars thoracalis mit den Nervenwurzeln für 12 Thorakalnerven
- Pars lumbalis mit den Nervenwurzeln für 5 Lumbalnerven
- Pars sacralis mit den Nervenwurzeln für 5 Sakralnerven
- Pars coccygea mit den Nervenwurzeln für 1-3 Kokzygealnerven.
Die Dicke des Rückenmarks ist in verschiedenen Abschnitten unterschiedlich.
Diejenigen Abschnitte, welche für die neuronale Versorgung der Extremitäten zuständig
sind, sind wesentlich dicker und werden daher als Intumescentia cervicalis im Bereich
zwischen viertem Halswirbel und zweitem Thorakalsegment und als Intumescentia
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lumbosacralis im Bereich zwischen erstem Lumbalsegment und drittem Sakralsegment
bezeichnet.
Die Oberfläche des Rückenmarks ist durch mehrere Längsfurchen in einzelne
Abschnitte unterteilt. In der Mitte ventral schneidet die tiefe Fissura mediana anterior
ein, dorsal der seichte Sulcus medianus posterior. Beiderseits des Sulcus medianus
posterior befindet sich je ein Sulcus posterolateralis, in dem die Hinterwurzeln in das
Rückenmark eintreten. Zwischen diesen beiden Sulci liegt der Hinterstrang, der im
Halsbereich durch den Sulcus intermedius posterior in den medialen Fasciculus gracilis
und den lateralen Fasciculus cuneatus unterteilt wird. Die Vorderwurzeln verlassen das
Rückenmark in einem beidseits der Fissura mediana gelegenen Längsstreifen, dem
Sulcus anterolateralis.
Im mikroskopischen Querschnitt kann man erkennen, dass das Rückenmark
grundsätzlich aus zwei verschiedenen Substanzen besteht. In der Mitte kann man eine
graue, nervenzellreiche schmetterlingsförmige Struktur erkennen, die als Substantia
grisea bezeichnet wird. Umgeben wird diese von einer fetthaltigen, weißlichen
Substanz, die als Substantia alba bezeichnet wird.
Die graue Substanz kann grob in ein Vorderhorn und ein Hinterhorn untergliedert
werden. Während das Hinterhorn Neurone beinhaltet, welche die Verarbeitung der
sensorischen Impulse aus der Peripherie ermöglichen, sind im Vorderhorn
unterschiedlich große Neuronenpopulationen zu sehen, die in ihrer Gesamtheit auch als
Wurzelzellen bezeichnet werden. Die größten Zellen des Rückenmarks sind die α-
Motoneurone. Sie haben beim Menschen einen Durchmesser von 30-80µm. Die Axone
der Motoneurone geben noch in der grauen Substanz 1-5 Kollateralen ab, die sich zum
Teil mit Interneuronen verbinden. Extramedullär haben die menschlichen
Motoneuronaxone einen Durchmesser zwischen 12 und 20 µm und ziehen zu
bestimmten Muskelgruppen des Bewegungsapparates, um dann dort in den motorischen
Endplatten zu enden. Die γ-Motoneurone sind mit einem Durchmesser von 15-20 µm
kleiner als die α-Motoneurone, versorgen die intrafusalen Muskelfasern und regulieren
deren Spannung. γ-Motoneuronaxone haben extramedullär einen Durchmesser von 2-15
µm. Im thorakalen und lumbalen Bereich (C8-L2) liegen im Seitenhorn multipolare
sympathische Neurone, die Axone zu vegetativen Ganglien senden und
viszeromotorische Funktionen erfüllen. Im Sakralbereich befinden sich im Bereich des
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Seitenhorns multipolare Nervenzellen mittlerer Größe, die dem Parasympathikus
angehören. Auch diese Zellen entsenden Axone zu vegetativen Ganglien. In der grauen
Substanz finden sich diffus verteilte Interneurone, die auch als Binnenzellen bezeichnet
werden. Innerhalb der grauen Substanz sind außerdem Strangneurone zu sehen, die sich
hauptsächlich in den dorsalen Anteilen der Zona intermedia oder im Hinterhorn
befinden. Ihre Neuriten verlaufen in der Regel in der weißen Substanz und über weite
Strecken (Drenckhahn D, 2004a; Drenckhahn D., 2004b; Schiebler T et al., 1996).
Schichtenbau und Zytoarchitektonik des Rückenmarks und des Vorderhorns
Die graue Substanz gliedert sich in 9 Laminae die von dorsal nach ventral
durchnummeriert werden (Lamina I-IX). Hinzu kommt noch die Lamina X, das Gebiet
um den Zentralkanal. Die Laminae VIII – IX bilden das Vorderhorn. Dabei überwiegen
in der Lamina VIII die Interneurone für die motorischen Systeme. Die Lamina IX
enthält dagegen die Motoneurone, die somatotopisch gegliederte Zellgruppen bilden.
Das Vorderhorn enthält zwei Arten von Nervenzellen, nämlich die Wurzelzellen, deren
Axone über die Vorderwurzel das Rückenmark verlassen und die Strangzellen, deren
Axone komplett im Zentralorgan liegen. Alle im Vorderhorn entsprungenen
markhaltigen bzw. myelinisierten Axone der Vorderwurzeln enden auf typische Weise
im quergestreiften Muskelgewebe. Um die Funktion der Innervation des quergestreiften
Muskelgewebes präziser zu beschreiben, wurden diese Zellen von Massaza 1924 auch
myorhabdotische Zellen genannt. Die myorhabdotischen Zellen liegen nicht
gleichmäßig verteilt im Vorderhorn, sondern sind in mehr oder weniger abgrenzbaren
Untergruppen angeordnet, deren Anzahl und Form in den verschiedenen Segmenten und
sogar oft in den verschiedenen Niveaus der Segmente variieren. Erkenntnisse aus vielen
Untersuchungen machen es wahrscheinlich, dass ein Zusammenhang zwischen dieser
variierten Gruppierung der myorhabdotischen Zellen und dem Formenreichtum des von
ihnen innervierten quergestreiften Muskelgewebes besteht. Diese Untersuchungen
zeigen, dass jeder bestimmte quergestreifte Muskel seine Innervation aus Zellen
empfängt, die nebeneinander und niemals diffus verstreut zwischen anderen
myorhabdotischen Zellen der übrigen Muskeln liegen. Die Peripherie ist also streng im
Vorderhorn repräsentiert und erstaunlicherweise ist die Lokalisation recht konstant, so
dass einzelne Neuronengruppen in verwandten Tieren an ähnlichen Stellen im
Vorderhorn wieder gefunden werden können. Jede myorhabdotische Zelle liegt im
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selben Segment und in derselben Körperhälfte, in welchem ihr Axon durch eine
Vorderwurzel austritt. Alle Zellen liegen also in denjenigen Segmenten, deren
Vorderwurzeln motorische Fasern für jenen Muskel enthalten. Da die meisten Muskeln
polysegmental innerviert werden, haben ihre Zellfelder die Form einer longitudinal
gelegenen Zellsäule.
Aus dem Rückenmark entspringen insgesamt 31-33 Spinalnervenpaare, die sich jeweils
aus der Vorder- und Hinterwurzel zusammensetzen. Die Zusammensetzung der
Vorderwurzeln aus Axonen, welche dem Vorderhorn und ggf. dem Seitenhorn
entstammen ergibt sich aus den oben erwähnten Erklärungen über den zellulären Inhalt
der grauen Substanz. Das Gesetz von Magendie besagt, dass in Vorderwurzeln
ausschließlich motorische Fasern verlaufen bzw. in Hinterwurzeln nur sensible Fasern
zu finden sind.
Dieses neuroanatomische Dogma hat bis heute Gültigkeit, obwohl es seit seiner
Postulierung im Jahre 1822 in Frage gestellt wird. Zahlreiche Studien zeigten nämlich,
dass Vorderwurzeln außer den Motoneuronaxonen noch Populationen dünner
myelinisierter und unmyelinisierter Axone enthalten, deren Somata in sensorischen oder
sympathischen Ganglien liegen (z.B. Hildebrand et al., 1997; Schenker and Birch,
2000; Coggeshall et al., 1973; Coggeshall et al., 1974; Coggeshall et al., 1977). Die
Anzahl solcher Axone in der Vorderwurzel wurde auf 3,9% angegeben (Loeb, 1976).
Ursprung und Ziel dieser Fasern sind noch umstritten (Hildebrand et al., 1997). Es gibt
Hinweise dafür, dass diese Fasern nicht über die Vorderwurzel in das ZNS einwachsen,
sondern dort blind enden, die Pia mater erreichen, dort drehen und anschließend zurück
in die Peripherie laufen bzw. das ZNS über die Hinterwurzel erreichen (Hildebrand et
al., 1997). Andere Arbeiten zeigten, dass wenige primäre senorische Neurone Axone
haben, die direkt über die Vorderwurzeln zum ZNS gelangen (Maynard et al., 1977;
Yamamoto et al., 1977). Die Hinterwurzel besteht im Wesentlichen aus den axonalen
Fortsätzen der pseudounipolaren Nervenzellen des Spinalganglion und leitet, wie bereits
erwähnt, dem Rückenmark somatosensorische und viszerosensorische Informationen zu
(Scharf JH, 1958)
Pathophysiologie von Nervenläsionen
Die Prognose einer funktionellen Nervenregeneration hängt vom Grad der
Nervenverletzung ab. Sunderland (Sunderland S, 1951) definierte anhand von
13
histologischen Veränderungen 5 Stadien der Nervenschädigung. Drei Schweregrade der
Nervenunterbrechung wurden von Seddon vorgeschlagen und sind heute im
allgemeinen klinischen Gebrauch (Seddon HJ, 1943):
1. Neurapraxia: Es handelt sich dabei um die leichteste Form der, mit Funktionsverlust
einhergehenden, traumatischen Nervenschädigung, bei welcher die Myelinscheide
beschädigt ist. Die Wiederherstellung des vollständig reversiblen Funktionsausfalls ist
spätestens nach zwei Monaten abgeschlossen.
2. Axonotmesis: Die Kontinuitätsunterbrechung endoneuraler Strukturen und Axone
bei erhaltener Hülle. Distal tritt eine Wallersche Degeneration (s.u.) auf. Dabei sind die
erhaltenen Hüllstrukturen für eine Regeneration sehr günstig.
3. Neurotmesis: Nervenschädigung mit kompletter Durchtrennung der Fasern und der
Hülle. Eine spontane Reinnervation ist in diesem Stadium nicht möglich. Die
Ausrissverletzung, welche in der vorliegenden Arbeit untersucht wird entspricht diesem
Ausmaß der Verletzung.
Degeneration und Regeneration von Nerven nach Verletzung
Eine Nervenzelle geht üblicherweise zugrunde, wenn die Verletzung ihren Zellkörper
oder den proximalen Teil des Axons betrifft. Wenn die Verletzung im distalen Teil des
Axons stattfindet, kann die Nervenzelle überleben und es treten zunächst verschiedene
degenerative Veränderungen auf, die im peripheren Nervensystem letztendlich zu einer
Regeneration der durchtrennten Nerven führen können.
Peripheres Nervensystem und Waller-Degeneration
Reaktion im distalen Stumpf nach Axotomie
Unmittelbar nach Unterbrechung des Nervs folgt die anterograde Degeneration der
Nervenfasern distal der Läsion, die nach ihrem Entdecker August Waller (Waller A.,
1850), Wallersche Degeneration genannt wird. Die Wallersche Degeneration umfasst
den Untergang des Axons und die Entfernung der Myelinscheide vom distalen Stumpf
durchtrennter Nervenfasern. Die Fragmentierung der Axone beginnt am Ort der
Faserdurchtrennung und setzt sich nach distal mit einer Geschwindigkeit fort, die der
Dicke und der Internodallänge der betroffenen Fasern proportional ist. Die Latenzzeit
bis zum Beginn der Wallerschen Degeneration ist abhängig vom Fasertyp, sie beträgt
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bei dünnen Markfasern 25 Stunden, bei dicken Markfasern 45 Stunden. Beim Menschen
wurde als Geschwindigkeit des distalen Fortschreitens für dünne Axone 2,5 mm pro
Tag und für dicke Fasern 4,6 mm pro Tag ermittelt. Bereits 10 bis 21 Tage nach der
Durchtrennung erstreckt sich die Wallersche Degeneration bis zum Endorgan, z.B. der
motorischen Endplatte, und die Muskelfasern im Zielgebiet atrophieren infolge der
Denervierung (Mumenthaler M, 1998). Ein entscheidender Prozess in der Wallerschen
Degeneration ist die granuläre Desintegration des Zytoskeletts. Hierbei werden die
Elemente des axonalen Zytoskeletts, Neurofilamente und Mikrotubuli zu Granula und
Trümmern abgebaut. Die granuläre Desintegration ist die Folge der Aktivierung
ionensensitiver Proteasen im distalen Nervenstumpf. Der Anstieg von intraaxonalem
Kalzium auf ein kritisches Niveau initiiert die Proteolyse des Axoplasmas. Assoziiert ist
die granuläre Desintegration des Zytoskeletts mit dem Verlust des Axolemms und des
Axoplasmas, so dass die Myelinscheide einen leeren Zylinder umhüllt, der zuvor vom
Axon ausgefüllt war. Anschließend kommt es zum Zerfall der Myelinscheide in kurze
Fragmente, die so genannten Ovoide. Das Myelin fällt in sich zusammen und verliert
seine Periodizität (Griffin JW, 1992). Innerhalb von zwei Tagen hat sich die
Ovoidbildung vollzogen. Die Schwann-Zellen phagozytieren die Myelintrümmer und
bilden Lipidtröpfchen noch bevor Makrophagen einwandern. Bereits zwei bis vier Tage
nach Faserdurchtrennung findet man Schwann-Zell-Mitosen. Die Schwann-Zellen teilen
sich am stärksten am dritten Tag nach der Durchtrennung und bilden mit ihrer
Basallamina Röhren, die Büngner-Bänder, welche später als Führung für regenerierende
Nervenfasern dienen. Neben den vorhandenen ortständigen Makrophagen treten ab dem
zweiten Tag, mit einem Maximum zwischen dem vierten und dem siebten Tag,
hämatogene Makrophagen in den distalen Stumpf ein und migrieren zu den Ovoiden
(Stoll and Müller, 1999). Die Myelindegeneration stellt für die Makrophageninvasion
einen stärkeren Stimulus dar, als die Axoplasmadegeneration. Die rekrutierten
Makrophagen wandern zu den degenerierenden Fasern, in die sie nach Passage der
Basalmembran eintreten. In den degenerierenden Nervenfasern werden die
hämatogenen Makrophagen zu intratubalen Phagozyten. Mit steigender
Phagozytoseaktivität werden die Phagozyten zu Schaumzellen, die Fetttropfen
enthalten. Der größte Teil der Myelintrümmer wird von Makrophagen beseitigt.
Innerhalb von zwei Wochen verschwinden die Myelintrümmer und zurück bleiben die
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Schaumzellen, die nicht nur von Makrophagen, sondern auch von Schwann-Zellen,
Endothelzellen, Fibroblasten und perineuralen Zellen abstammen.
Eine T-Zell Antwort fehlt während der Wallerschen Degeneration, d.h. es kommt nicht
zu einer Entzündung (Griffin JW, 1992; Mumenthaler M, 1998; Stoll and Müller,
1999). Auf die nach distal fortschreitende Wallersche Degeneration folgt mit der Zeit
die Verödung der intramuskulären Nervenscheiden im denervierten Zielgebiet, was
dazu führt, dass regenerierende Axone nur schwer Anschluss an die Muskulatur finden.
Außerdem nimmt die Anzahl reinnervations-bereiter Muskelfasern durch degenerative
Prozesse ab (Fu and Gordon, 1995).
Die Axotomie eines peripheren Nervs führt auch zu molekularen Veränderungen. Es
entsteht ein Milieu, das die axonale Regeneration im peripheren Nervensystem
erheblich fördert. Zuvor myelinisierende Schwann-Zellen dedifferenzieren und werden
phänotypisch zu Zellen vor der Myelinisierung. Als Antwort auf den Axonverlust
kommt es zur Schwann-Zellteilung und Hypertrophie. Die Läsion eines peripheren
Nervs führt zu einer vermehrten Produktion neurotropher Faktoren in den
degenerierenden Nervensegmenten. Nerve Growth Factor (NGF) und Brain Derived
Neurotrophic Factor (BDNF) sind bereits in den ersten Tagen nach der Verletzung
vermehrt vorhanden. Ferner kommt es zu einer Hochregulation von pro- und
antiinflammatorischen Zytokinen, die eine T-Zell-Entzündungsreaktion verhindern
(Stoll and Müller, 1999).
Reaktion im proximalen Anteil der Nervenzelle
Innerhalb weniger Tage nach der Läsion stirbt das äußerste Ende des proximalen Teils
des Axons ab. Durch Anstau von Zellmaterial, dass mit dem axoplasmatischen Fluß
antransportiert wird, schwillt das Axon an und es bildet sich aus dieser Anschwellung
ein Wachstumskolben. Zunächst findet durch Phagozytose von Makrophagen eine
Abräumreaktion von Zelltrümmern und Schwannzellen statt. Es können zystische
Defekte, Bindewebsnarben oder Glianarben entstehen.
Aus dem Wachstumskolben wachsen in der Folgezeit viele feine Sprossen aus
(Abbildung 4), die eine Verbindung mit den Resten des ehemaligen distalen Axonende
bekommen sollen. Im distalen Stumpf wird eine Reihe von Molekülen vermehrt
gebildet, die das Auswachsen von Neuriten nach distal fördern sollen. So unterstützt
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eine Chemotaxis durch im distalen Stumpf freigesetzte Zytokine, wie Tumor Necrosis
Factor Alpha (TNF-α), verschiedene Interferone und Neurotrophe Faktoren, wie Ciliary
Neurotrophic Factor (CNTF) und NGF, das Auswachsen der Axone nach distal.
Zusätzlich verhindern die genannten Stoffe das Absterben der axotomierten Perikarya
im proximalen Nerven. Die Geschwindigkeit des Auswachsens neuer Axone liegt, je
nach Literaturangabe, zwischen 1-3mm pro Tag. Bei Ausbleiben von
Wachstumsfaktoren, findet keine Axonaussprossung statt. Man nimmt daher an, dass
durch eine zusätzliche externe Applikation von neurotrophen Faktoren das
Axonwachstum und die Regeneration gefördert und beschleunigt werden können (siehe
unten).
Bei vollständiger Axotomie und fehlender Reanastomosierung, können die von
proximal auswachsenden Axone den distalen Stumpf nicht erreichen. Durch die Bildung
von Narbengewebe durch Schwann-Zell- und Fibroblastenwucherung kann es ebenfalls
zum Fehlen einer Anschlussmöglichkeit des proximalen und des distalen Stumpfes
kommen. Fehlt der Kontakt zu den leitenden Büngner-Bändern verlieren die
nachwachsenden Axone bald ihre proximodistale Ausrichtung und wachsen aberrierend
und knäuelartig durcheinander. Zusammen mit einem Narbenbindegewebe bildet sich in
diesem Fall in Narbenneurom. Histologisch liegen in Neuromen zahlreiche, in
verschiedenen Richtungen wachsende, kleine Nervenfaserbündel. Diese Bündel
besitzen nur wenige Nervenfasern und sind von einer mehrschichtigen perineuralen
Hülle umgeben. Die Nervenfaserbündel liegen in einem zunehmend derber werdenden,
kollagenen Bindegewebe, welches eine unterschiedlich starke Vaskularisierung aufweist
(Schiebler T et al., 1996).
Prozesse der Myelinisierung
Untersuchungen zur Entwicklung von Myelinscheiden deuten daraufhin, dass es einen
initialen Anstoß zur Myelinisierung geben könnte. Dieses Signal bestimmt auch die
Dicke der Myelinscheide, die dann gleichmäßig aufrechterhalten wird, ohne dass dafür
zusätzliche Informationen notwendig sind (Fraher and Dockery, 1998). Vor kurzem
wurde entdeckt, ein einzelner Wachstumsfaktor, das Neuregulin-1 ein solch ein Signal
für Schwann-Zell Proliferation und Myelinisierung ist (Review: Nave and Salzer,
2006). Die Neuregulin-1 Familie beinhaltet mehr als 15 membranassoziierte und freie
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Proteine, deren Expression nicht spezifisch für das Nervensystem ist (Esper et al.,
2006). Innerhalb des Nervensystems werden häufig NRG-1 Typ I und III insbesondere
durch Motoneuronen und Spinalganglienneuronen exprimiert. NRG-1 Proteine
vermitteln ihre Effekte durch die Interaktion mit ErbB-Rezeptoren, welche zur EGF-
Rezeptor Superfamilie gehören (Citri et al., 2003). Während der Entwicklung des
Nervensystems initiiert das Signal durch NRG-1 Typ III der Neurone auf den Erb-
Rezeptorkomplex der Schwann-Zellen die Myelinisierung. Es ist jedoch nicht nur der
Beginn der Myelinisierung, sondern auch deren Ausmaß für die entsprechende Funktion
des myelinisierten Axons von maßgeblicher Bedeutung. Michailov et al. zeigten, dass
dieses zumindest teilweise durch die Menge von Membran-assoziiertem NRG-1 Typ III
auf der Axonoberfläche abhängig ist. Eine Veränderung dieser Menge bedeutet eine
Veränderung der g-ratio. Das Ausmaß der Expression des ErbB2/ErbB3-Rezeptors auf
der Schwann Zelle spielt nicht die gleiche entscheidende Rolle, weil dieser
Rezeptorkomplex normalerweise in großen Mengen vorhanden ist . Zusammenfassend
ist die frühere Meinung, dass Myelinisierung von der Axongröße abhängig ist nicht
falsch, sondern stimmt mit der Beobachtung überein, dass größere Axone auf ihrer
Oberfläche den Schwann-Zellen quantitativ mehr NRG-1 Typ III zur Interaktion zur
Verfügung stellen, was zur besseren Myelinisierung führt.
Dieser Mechanismus spielt auch in der Regeneration peripherer Nerven eine Rolle. Es
wurde gezeigt, dass NRG-1 während der Waller-Degeneration die Proliferation von
Schwann-Zellen stimuliert. Dazu kommt, dass ErbB2 innerhalb Minuten nach einer
Nervenverletzung durch Phosphorylierung aktiviert wird, gefolgt von einer
Hochregulation der ErbB2-Rezeptoren.
Interessanterweise wurde in weiteren Arbeiten gezeigt, dass neurotrophe Faktoren
(NGF, GDNF) zu einer raschen Freisetzung von NRG-1 durch kultivierte Motoneurone
und Spinalganglienneurone führte. Diese Freisetzung ist dosisabhängig und geschieht
innerhalb von Minuten. Gemeinsam mit der Tatsache betrachtet, dass NRG-1 die
GDNF-Expression von Schwann-Zellen fördert, scheint es eine Regulationsschleife
zwischen glia-axo-glialen Signalen durch Wachstumsfaktoren zu geben, welche das
Überleben von Nervenzellen und die Proliferation bzw. die Differenzierung von
Schwann-Zellen bedingen (Nave and Salzer, 2006).
18
Regeneration im zentralen Nervensystem
Es ist bekannt, dass das zentrale Nervensystem eine viel schlechtere
Regenerationskapazität als das periphere Nervensystem hat. Es existieren vier
anerkannte Theorien, die versuchen diese geringe Regenerationskapazität des zentralen
Abbildung 4: Schematische Darstellung der wichtigsten Veränderungen nach Axotomie.A: Normal myelinisierte Nervenfaser mit Neuron und intakter Verbindung zum Skelettmuskel;B: Nach Axotomie verlagert sich der Nucleus in die Peripherie des vergrößerten Neurons. Im distalem Abschnitt kommt es zur Wallerschen Degeneration. Die endogene Produktion der Wachstumsfaktoren gesteigert, Abäumraktionen von Zelltrümmern und Schwann-Zellen findet statt; C: Proliferierende Schwann-Zellen bilden im distalen Abschnitt das Büngnersche Band, das dem auswachsenden Axon als Leitschiene dient. Der Muskel ist atrophisch; D: Nach erfolgreicher Regeneration wird der Skelettmuskel reinnerviert. Die Remyelinisierung findet anschließend statt (Abbildung nach Schiebler, Histologie)
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Nervensystems zu erklären. Diese vier Modelle wurden jeweils entwickelt, um daraus
entsprechend therapeutische Ansätze zur Behandlung von zentralen Nervenläsionen zu
entwickeln:
Periphere Nerven scheinen eine günstigere Mikroumgebung als zentrale Axone zu
haben. Das liegt daran, dass Schwann-Zellen in der Lage sind, wachstumsfödernde
Faktoren an der Läsionsstelle zu produzieren, die normalerweise im ZNS nicht
vorkommen. Zahlreiche Studien des letzten Jahrhunderts haben gezeigt, dass einige
Bestandteile des peripheren Nerven und der Schwann-Zellen potente Förderer für
axonales Wachstum sind. Dazu gehören Komponenten der Schwann-Zell Basallamina,
wie Laminin, Zelladhäsionsmoleküle der Immunglobulinsuperfamilie wie NgCAM/L1.
Dazu kommt, dass denervierte distale Axonstümpfe die Produktion von Neurotrophinen
oder anderen trophischen Molekülen erhöhen. Zentrale Gliazellen sind dagegen kaum
Quelle für derartige Moleküle. Sie enthalten beispielsweise wenig Laminin und
produzieren typischerweise nur kleine Mengen trophischer Moleküle. In der
Embyonalentwicklung findet sich dagegen sowohl im peripheren als auch im zentralen
Nervensystem eine wachstumspermissive Umgebung. Wahrscheinlich ist es so, dass
lediglich das periphere Nervensystem in der Lage ist nach einer Verletzung diese
Umgebung wieder zu entwickeln.
Die Umsetzung dieser Theorie ist der Versuch mit der Applikation neurotropher
Faktoren oder anderer Moleküle wie Laminin eine erhöhte Regenerationskapazität im
ZNS zu erreichen. In anderen Fällen wurden Schwann-Zellen selbst in das ZNS
eingebracht, um eine Umgebung zu erreichen, die der wachstumspermissiven des PNS
gleicht.
In den 1980er Jahren wurde eine vollkommen andere Theorie entwickelt: Nach dieser
haben beide Teile des Nervensystems eine ausreichende Regenerationskapazität. Der
zentrale Teil des Nervensystems enthält jedoch auch Elemente, die hemmend auf die
Regeneration wirken. Tatsächlich ist die zentrale Myelinscheide, bestehend aus
Oligodendrozyten ein potenter Inhibitor des axonalen Wachstums. Dies erklärt
vielleicht warum die Myelinisierung in der Entwicklung sehr spät stattfindet - nämlich
nachdem die Nervenbahnen bereits gebildet sind. Es wurden zwei Elemente entdeckt,
die für diese inhibitorische Funktion der Oligodendrozyten verantwortlich sind: Eines
ist das Myelin-Associated-Glykoprotein (MAG), ein struktureller Bestandteil des
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Myelin, der in der Lage ist das Auswachsen von Axonen bei bestimmten Neuronen zu
fördern oder aber im Gegenteil das Auswachsen anderer Neurone zu hemmen. Das
zweite Element ist ein Protein, das Neurite inhibitor of 35 kDa (NI-35) genannt wird.
In Zellkulturen konnte gezeigt werden, dass mit einer Ausschaltung dieser Proteine
durch Antikörper ein Auswachsen von Axonen zentraler Neurone auf einem Rasen von
Oligodendrozyten stattfindet, ohne deren Hemmung jedoch nicht. Eine andere
Möglichkeit ist, die inhibitorische Signalkaskade, die durch Proteine ausgelöst wird,
durch die Blockade von second-messenger Systemen zu unterbrechen.
Ein drittes Modell betont nicht die Unterschiede der Umgebung des Nervs, sondern die
Unterschiede zwischen peripheren und zentralen Neuronen. Einige Experimente haben
gezeigt, dass die Regenerationsfähigkeit eines zentralen Neurons mit fortschreitendem
Alter sinkt, wohingegen die Regenerationsfähigkeit eines peripheren Neurons bei
geeigneter Umgebung erhalten bleibt. Eine Erklärung für diesen Unterschied liegt in der
Expression eines Proteins, von dem man annimmt, dass es für das Auswachsen von
Axonen von entscheidender Bedeutung sei. Es handelt sich dabei um das Growth-
associated-Protein-43 (GAP 43), das während der embryonalen Phase der Entwicklung
in beiden Teilen des Nervensystems in hohen Konzentrationen exprimiert wird. Im
peripheren Nervensystem bleibt die Konzentration des GAP 43 auch im
Erwachsenenalter hoch und wird nach Axotomie erhöht, während es im zentralen
Nervensystem nach Abschluß der Entwicklung kaum zu finden ist und auch nach
Axotomie nicht nennenswert vermehrt exprimiert wird. Zur Umsetzung dieses Ansatzes
wurden fetale Neurone in das ZNS eingebracht.
Das vierte Modell schließlich konzentriert sich auf die sekundären Veränderungen, die
nach Axotomie stattfinden: Durch die Verletzung von Gewebe des zentralen
Nervensystems kommt es zur Astrozytenproliferation, Aktivierung von Mikroglia,
Narbenbildung und Invasion von Zellen des Immunsystems. Diese Vorgänge wirken
sich inhibierend auf ein mögliches Axonwachstum aus. Es konnte gezeigt werden, dass
durch Vermeidung eines großen Verletzungsausmaßes und der darauf folgenden
Narbenbildung weit mehr Regeneration im ZNS stattfindet, als bei riesigem
Verletzungsausmaß.
21
Um die Narbenbildung und Immunreaktion zu verhindern wurden Immunsupressiva,
antiinflammatorische Substanzen und Enzyme appliziert. Tatsächlich wird
Methylprednisolon heute routinemäßig bei Rückenmarkverletzungen appliziert. Ein
positiver Effekt dieser therapeutischen Intervention ist mehrfach nachgewiesen worden
(Kandel E et al., 2000).
Therapieansätze zur Behandlung von Nervenwurzelausrissen
Allgemeine Therapieansätze für Nervenverletzungen
Seit Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts gibt es in der Humanmedizin zahlreiche
Ansätze, um Nerven- und Muskelfunktion nach unterschiedlichsten Verletzungen des
peripheren Nervensystems wiederherzustellen. Hierzu zählen der Einsatz von
Nerveninterponaten, die autolog (z.B. N. suralis) oder auch artifiziell (z.B.
schwammähnliche Materialien oder Röhren) sein können. Hinzu kommt der Versuch,
artifizielle Nerveninterponate mit helfenden Zellen (z.B. Schwann-Zellen) zu versehen
oder aber auch exogene, lösliche neurotrophe Faktoren in die Regenerationszone
einzubringen. Nach einer Nervendurchtrennung weist die primäre, mikrochirurgische
Nervennaht unter Berücksichtigung der intraneuralen Topographie die besten
Regenerationsergebnisse auf (Schmidt and Leach, 2003; Frostick et al., 1998).
Therapieansätze für Nervenwurzelausrisse
Historische Entwicklung
Die erste Beschreibung einer Nervenwurzelverletzung mit Beteiligung des Plexus
brachialis stammt aus einem „Case report“, der zu Beginn des 19. Jahrhunderts
veröffentlicht wurde (Flaubert G., 1827). 1911 wurde die erste intradurale Exploration
einer solchen Plexus brachialis Verletzung vorgenommen. Bereits in dieser Arbeit
wurde eine frühestmögliche chirurgische Behandlung der Verletzung empfohlen
(Frazier CH and Skillern PG, 1911). Die erste chirurgische Behandlung einer
intraspinalen Plexusverletzung erfolgte erst 1979 (Bonney G and Jamieson A, 1979;
Carlstedt et al., 2000).
22
Technik des Nerventransfers
Ein chirurgischer Therapieansatz zur Wiederherstellung der ausgefallenen Funktionen
bei Nervenwurzelausrissen ist der Transfer der geschädigten Nervenfasern des Plexus
auf intakte Nerven (Terzis J.K., 1999; Fantis and Slezk, 1967). Ein häufig angewandtes
Verfahren ist der Nerventransfer des N. accessorius auf den N. suprascapularis bei
Schädigung C5 und C6. Das funktionelle Ergebnis solcher Nerventransfers erlaubt eine
Wiederherstellung der Funktion - zumindest der wirbelsäulennahen und der
Oberarmmuskulatur. Die Reinnervation von Unterarm oder Handmuskulatur kann nicht
stattfinden.
Replantationstechnik von Nervenwurzeln
In den letzten Jahren ist durch Thomas Carlstedt und seine Mitarbeiter ein neuer
chirurgischer Therapieansatz entwickelt worden (Carlstedt et al., 1993a; Carlstedt et al.,
2000; Carlstedt et al., 1995; Carlstedt, 2000; Carlstedt et al., 1988; Carlstedt, 1991;
Carlstedt, 1983; Carlstedt et al., 1993b; Cullheim et al., 1989). Grundlage ist die
Wiederherstellung der Kontinuität zwischen ausgerissenen Nervenwurzeln und
Rückenmark durch Replantation direkt im Bereich des verletzten
Rückenmarkssegments. Mit dieser Technik konnte gezeigt werden, dass ein
Auswachsen von Vorderwurzelaxonen in die replantierte Vorderwurzel möglich ist
(Carlstedt et al., 1995; Cullheim et al., 1989; Hallin et al., 1999).
Im Gegensatz dazu zeigte sich, dass die Axone der Hinterwurzel nicht in der Lage sind,
nach einer chirurgischen Replantation spontan in das Rückenmark einzuwachsen. Die
beiden vermuteten Hauptursachen dafür sind erstens die Narbenbildung durch
Astrozyten an der Übergangszone zwischen dem peripheren und zentralen
Nervensystem (Fernaud-Espinosa et al., 1993; Tang et al., 2004) und zweitens das
wachstumsrestriktive Milieu des zentralen Nervensystems (Bandtlow et al., 1990;
Pesheva et al., 1989; Schnell and Schwab, 1990). Zahlreiche Studien der vergangenen
Jahre versuchten diese Bedingungen zu verändern. Vielversprechende erste Ergebnisse
zeigte die Applikation neurotropher Faktoren oder die „Neurotrophin Gentherapie“
(Oudega and Hagg, 1996; Ramer et al., 2000; Ramer et al., 2001; Romero et al., 2001;
Deng et al., 2000). Ein weiterer experimenteller Ansatz zur Verbesserung der
Regeneration der Hinterwurzel ist das Einbringen von olfaktorischen Hüllzellen
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(OECs=olfactory ensheathing cells) (Ramn-Cueto and Nieto-Sampedro, 1994) oder
neuronalen Stammzellen (Ohta et al., 2004) direkt an die Übergangszone zwischen
peripherem und zentralen Nervensystem.
Unter klinischen Bedingungen ist es derzeit jedoch nicht möglich, eine funktionelle
Verbindung zwischen Hinterwurzelaxonen und Rückenmark herzustellen. Aus diesem
Grund werden die verletzten Hinterwurzeln nicht behandelt, wohingegen die
Vorderwurzeln chirurgisch replantiert werden. Erstaunlicherweise wurde bei Patienten,
bei denen eine Replantation der Vorderwurzel durchgeführt worden war, festgestellt,
dass sie neben der Wiederherstellung einiger motorischer Funktionen auch sensorische
Qualitäten wie z.B. Propriozeption, Temperatur- und Schmerzempfindung
wiedererlangten (Carlstedt, 2000). Eine Erklärung für dieses Phänomen gibt es derzeit
nicht. Es wurde spekuliert, dass dies durch intraspinale Sprossung zuvor „stummer”
Fasern über angrenzende Nervenwurzeln (Darian-Smith, 2004), oder durch Sprossung
aus Hinterhornneuronen entlang der replantierten Vorderwurzel zustande gekommen
sein könnte (Carlstedt, 2000). Vorderwurzeln enthalten eine Population dünner
myelinisierter und unmyelinisierter Axone aus dem Spinalganglion, die ebenfalls für
derartige Phänomene verantwortlich sein könnten (s.o.) (Hildebrand et al., 1997;
Schenker and Birch, 2000) .
Operationtechnik nach Thomas Carlstedt
Die ausgerissene Vorderwurzel wird in diesem neuen chirurgischen Verfahren in einem
Areal zwischen den physiologischen Austrittsstellen von Vorder- und Hinterwurzel
ventrolateral replantiert (Abbildung 5). Durch eine kleine Inzision in die Pia mater wird
erreicht, dass die ausgerissene Vorderwurzel in direkten Kontakt mit dem Rückenmark
kommt. Durch die Narbe, die dabei entsteht, werden neurotrophe Faktoren gebildet, die
das Überleben von Neuronen begünstigen sollen (Carlstedt et al., 1993a; Hallin et al.,
1999). Somit soll durch eine ausreichende Anzahl an überlebenden Motoneuronen die
Grundlage für eine Regeneration geschaffen werden.
Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass einige Zeit nach Replantation Axone von
überlebenden Motoneuronen ausgewachsen sind und Anschluss an die replantierte
Vorderwurzel gefunden haben. Funktionell konnte eine Wiederherstellung der
paravertebralen und der proximalen Schultermuskulatur und gelegentlich auch der
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Oberarmmuskulatur erreicht werden (Carlstedt et al., 1993a; Carlstedt et al., 2000;
Carlstedt et al., 1995). Mit diesem Ergebnis hat sich dieses neue Verfahren im
Vergleich zu früheren Therapieansätzen wie dem Nerventransfer als nicht überlegen
erwiesen. Eine adäquate Therapie mit einem befriedigenden funktionellen Ergebnis für
Nervenwurzelausrisse existiert daher bis heute nicht (Holtzer et al., 2002; Lang et al.,
2005a).
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Technik der Vorderwurzelreplantation nach Thomas Carlstedt. Links: Rückenmarkssegment mit ausgerissener Vorderwurzel; Rechts: Ventrolaterale Replantation der Vorderwurzel; Modifizierte Abbildung nach Carlstedt et al., 1993b; Carlstedt et al., 1993a.
Voraussetzungen für eine Verbesserung der Therapieansätze der Vorderwurzel
Die Suche nach einer Verbesserung der bisherigen Therapieansätze zur funktionellen
Wiederherstellung der zunächst der motorischen Innervation wirft die Frage auf, welche
grundsätzlichen Vorraussetzungen zu erfüllen sind. Zunächst erscheint es sinnvoll eine
Replantation der Voderwurzel dem Nerventransfer vorzuziehen, da der Nerventransfer
immer den Ausfall anderer Innervationsgebiete zur Folge hat. Zur Verbesserung der
Replantationstechnik der Vorderwurzel sind vor allen anderen Gesichtspunkten
insgesamt drei wesentliche Punkte zu erfüllen (Lang et al., 2005b):
1. Eine ausreichende Anzahl an Motoneuronen muss das Trauma überleben und die
Fähigkeit haben, neue Axone in die Peripherie auswachsen zu lassen.
2. Die Verbindung zwischen Rückenmark und ausgerissener Vorderwurzel muss
wiederhergestellt werden.
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3. Die regenerierenden Axone müssen qualitativ hochwertig sein.
Voruntersuchungen zur vorliegenden Arbeit
In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass es bereits in der ersten Woche bzw.
innerhalb von drei Wochen nach einem Vorderwurzelausriss zu einem Verlust von bis
zu 80% der Motoneuronen im betroffenen Segment kommt (Carlstedt, 1997; Carlstedt
T., 1997b; Cullheim et al., 1989; Koliatsos et al., 1994). Voruntersuchungen zur
vorliegenden Arbeit zeigten, dass allein durch Replantation der Vorderwurzel mehr
Motoneurone die Verletzung überleben (Verlust von 33,5 ± 7,1%). Es wurde weiter
gezeigt, dass mit Applikation neurotropher Faktoren (ohne Replantation) ein erheblicher
Anteil von Motoneuronen vor dem Zelluntergang bewahrt werden kann. In einem
Plexus brachialis Läsionsmodell, wurden nach Ausriss der Vorderwurzeln, neurotrophe
Faktoren auf die Ausrisstelle appliziert. Es wurden in verschiedenen Versuchsgruppen
CNTF (ciliary neurotrophic factor), BDNF (brain derived neurotrophic factor) und eine
Kombination aus beiden Faktoren verwendet. Nach einer Überlebenszeit von einer
Woche konnte gezeigt werden, dass diejenigen Tiere, die neurotrophe Faktoren erhalten
hatten, einen deutlich niedrigeren Verlust von 16,9 ±14.3 % (CNTF-Gruppe ) bzw. 28,0
± 11.4 % (BDNF-Gruppe) Motoneuronen zeigten als die Kontrollen mit 54,4 ± 12.1 %,
die keine Faktoren erhalten hatten. Dieser positive Effekt neurotropher Faktoren konnte
auch nach drei Wochen nach gleicher Behandlung gezeigt werden (Lang et al., 2005a).
Auch andere Arbeiten zeigten in verschiedenen Modellen vergleichbare Effekte
neurotropher Faktoren auf das Überleben von Motoneuronen z.B (Ma J., 2001; Novikov
et al., 2000; Novikov et al., 1995; Novikov et al., 1997).
Neurotrophe Faktoren
Neurotrophe (trophisch, griechisch: fördernd, ernährend) Faktoren sind eine Guppe von
Polypeptiden, die das Überleben von neuronalen Populationen fördern und eine Rolle
bei der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen spielen. Die Entdeckung des
ersten neurotrophen Faktors Nerve Growth Factor (NGF) durch Cohen und Levi-
Montalcini (1951) gilt als Meilenstein in der Untersuchung von Wachstumsfaktoren und
löste die Suche nach weiteren Faktoren aus. Heutzutage weiß man, dass NGF nur einer
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unter vielen neurotrophen Faktoren ist, der für die oben genannten Effekte
verantwortlich sein kann.
Ursprünglich hatte man angenommen, dass neurotrophe Faktoren das Überleben von
Neuronen fördert, indem die Faktoren den Metabolismus der Zellen in einer positiven
Weise beeinflussen. Heute nimmt man an, dass die Faktoren u.a. das
Apoptoseprogramm der Zellen unterdrücken.
Neurotrophe Faktoren werden nach ihren Eigenschaften und Rezeptoren in drei
verschiedene Hauptfamilien eingeteilt (Drenckhahn D, 2004a):
Die Neurotrophine der NGF Familie; dazu gehören:
NGF (Nerve growth factor)
BDNF (Brain derived neurotrophic factor)
NT-3 (Neurotrophin-3)
NT-4/5 (Neurotrhophin 3/4)
Die Familie der Neurokine (Interleukin-6-Familie); dazu gehören
CNTF (Ciliary neurotrophic Factor)
LIF (Leukaemia inhibitory factor)
Cardiotrophin
Die Familie der Transforming growth factors
TGF-β1 (Transforming growth factors)
TGF-β2 (Transforming growth factors)
TGF-β3 (Transforming growth factors)
GDNF (Glial derived neurotrophic factor)
FGF (Fibroblast growth factor)
Persephin
Neurturin
Artemin
Andere Quellen (Kandel E et al., 2000) ordnen den FGF in eine eigene Familie ein.
Neurotrophine der NGF- Familie
Die Familie der Neurotrophine gilt als die am besten untersuchte Gruppe der
neurotrophen Faktoren. Die Mitglieder dieser Familie BDNF (Brain derived
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neurotrophic factor), NT-3 (Neurotrophin-3), NT-4/5 (Neurotrophin 4/5) zeigen eine
hohe strukturelle Ähnlichkeit zu NGF (Nerve growth factor).
Neurotrophine interagieren mit zwei Rezeptorhauptklassen: Die transmembranösen, als
Dimer vorliegenden Tyrosinkinaserezeptoren mit dem Namen trk-A, trk-B, trk-C.
Dabei interagiert NGF hauptsächlich mit trk-A, BDNF und Neurotrophin 4/5 mit trk-B
und Neurotrophin-3 mit trk-C, aber ferner auch mit trk-B. Die Aktivierung der trk-
Rezeptoren durch Bindung des Liganden führt zunächst zur Dimerisierung. Die
anschließende Phosphorylierung der zytoplasmatischen Domäne führt zur Aktivierung
spezifischer intraneuronaler Signalmoleküle, von denen viele auch durch andere
Tyrosinkinaserezeptoren aktiviert werden können.
Neurotrophine binden auch an den p75NTR (NTR=Neurotrophinrezeptor). Im Gegensatz
zu den trk-Rezeptoren bindet jedes Neurotrophin mit gleicher Affinität an den p75NTR.
Dem p75NTR werden verschiedene Funktionen zugeschrieben: Eine Rolle ist, dem trk-A-
Abbildung 6: Schematische Darstellung derNeurotrophinrezeptoren, ihrer Liganden und der intrazellulären Wirkung (modifizierte Abbildung nach Principles of Neural Science)
28
Rezeptor NGF zu präsentieren. Die zweite Rolle ist die Übertragung intrazellulärer
Signale direkt durch Aktivierung von Transduktionswegen, die durch Signale ausgelöst
wurden, die von Membranlipiden getriggert werden. An Zellen, denen trk-Rezeptoren
fehlen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von p75NTR den Tod dieser Zellen
fördert, statt das Absterben zu verhindern.
BDNF (brain derived neurotrophic factor)
BDNF gehört zur Familie der Neurotrophine. Nach Verletzung der Nervenzelle
unterliegt BDNF unter anderem einem retrograden Transport. Es konnte in vitro und in
vivo gezeigt werden, dass das Überleben und die Differenzierung von Motoneuronen
durch BDNF gefördert wird (Novikov et al., 1997). Auch wird die Regulation der
entwickelnden neuromuskulären Synapse u.a. durch BDNF beeinflußt. Dieser
Sachverhalt erhöht die Wahrscheinlichkeit, daß BDNF zur Verbesserung der
Nervenregeneration erfolgreich genutzt werden könnte. In einer Studie von Utley et al.
wurde gezeigt, daß Tiere, die nach einer peripheren Nervenverletzung mit BDNF
gemeinsam mit „Collagen Tubulisation“ behandelt wurden, die größte
Wiederherstellung der Funktion und durchschnittlich den größten Axondurchmesser
aufweisen (Utley et al., 1996). Jüngere Studien fanden dagegen keinen Hinweis darauf,
daß BDNF einen fördernden Effekt auf die axonale Regeneration hat. Die
unterschiedlichen Ergebnisse könnten durch eine unterschiedliche Dosierung und
andere Art der Bewertung zustande gekommen sein.
Vor kurzem wurde gezeigt, dass die Bindung von BNDF an den p75NTR in frühen
Abschnitten der postnatalen Entwicklung unter anderem für die Myelinisierung von
Axonen durch Schwann-Zellen verantwortlich ist (Cosgaya et al., 2002) (Abbildung 6).
Es konnte weiter gezeigt werden, dass die Applikation von exogenem BDNF die
Myelinisierung von Axonen fördert. Die BDNF Applikation hatte neben der erhöhten
Produktion von Myelin durch Schwann Zellen direkten Einfluss auf die Dicke der
Myelinscheide. Cosgaya et al. konnten durch Versuche beweisen, dass die Bindung von
BDNF an den p75NTR Rezeptor der Schlüsselprozess für die Produktion von Myelin
durch Schwann Zellen war.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Modell für die Aktivität von
Neurotrophinen und deren Wechselwirkungen mit ihren Rezeptoren im peripheren
29
Nervensystem in Bezug auf die Myelinisierung vorgeschlagen. Danach spielt sich die
Myelinisierung in verschiedenen Stadien ab, die sich aus Proliferation und
Einwanderung von Schwann-Zellen gefolgt von Verlängerung und Einhüllung der
Axone und schließlich aus der Formation des Internodiums zusammensetzen. Während
dieser Stadien spielt die Verfügbarkeit von Neurotrophinen und deren Rezeptoren eine
entscheidende Rolle. Wichtig sind NT-3 und sein Rezeptor trk-C sowie BDNF und sein
Rezeptor p75NTR, die alle im prämyelinisierten Nerven exprimiert werden. Trk-C und
NT-3 verhindern zunächst die Myelinisierung und halten die Schwann-Zellen im
Proliferationsstadium. Wenn die Schwann- Zellen Verbindung mit dem Axon
aufgenommen haben, erfolgt eine Herunterregulation von trk-C und NT-3, während
p75NTR und BDNF vermehrt exprimiert werden. Ist die Myelinscheide gebildet, werden
beide Neurotrophine und deren Rezeptoren herunterreguliert (Notterpek, 2003;
Hempstead and Salzer, 2002).
Familie der Neurokine
Zur Familie der Neurokine gehören CNTF (ciliary neurotrophic factor) und LIF
(leukemia inhibitory factor). Ferner werden auch Cardiotrophin-1 und andere IL-6
ähnliche Faktoren zu dieser Familie gerechnet.
Neurokine entfalten ihre Wirkung über einen heterodimeren Rezeptor, bestehend aus
den Untereinheiten gp130 und LIFR-β. Die Wirkung von CNTF wird ermöglicht durch
eine weitere hochaffine Untereinheit, genannt CNTFR-α, die nur im ZNS exprimiert
wird und mit einem Lipidanker in der Zellmembran verankert ist.
CNTF (ciliary neurotrophic factor)
Der ciliary neurotrophic factor (CNTF) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von
22-24 kDa. Es wurde erstmals in embryonalem Hühneraugengewebe entdeckt. In
anschließenden Untersuchungen wurde CNTF im Nervus ischiadicus von erwachsenen
Kaninchen und Ratten nachgewiesen. CNTF besitzt eine ähnliche Struktur wie andere
hämatopoetische Zytokine, insbesondere bestehen große Ähnlichkeiten mit Leukemia
inhibitory Factor (LIF). Sie teilen die Eigenschaft in vitro noradrenerge Neurone im
Phänotyp in cholinerge Neurone umzuwandeln (Terenghi, 1999).
CNTF war der erste neurotrophe Faktor, bei dem nachgewiesen wurde, dass er das
Überleben von α-Motoneuronen sowohl in vivo als auch in vitro fördert (Masu et al.,
30
1993). Der Faktor wird im PNS von Schwann- Zellen exprimiert und im ZNS von
Astrozyten.
Nach Axotomie fällt der Anteil an CNTF m-RNA dramatisch im distalen Stumpf und
erhöht sich erst nach der axonalen Regeneration wieder. Man nimmt an, dass exogenes
CNTF die periphere Nervenregeneration verbessern könnte.
Funktionell fördert CNTF das Auswachsen von Axonen sensibler und sympathischer
Neurone, fördert das Überleben von Motoneuronen, verhindert über bereits erläuterte
Mechanismen die Apoptose, rettet entwickelnde Rattenmotoneurone vor dem Zelltod
nach Axotomie und verhindert die Degeneration von Axonen und Somata der
Motoneuronen (Sendtner, 1995; Sendtner et al., 1994). Auch für Prozesse der
Myelinisierung ist der Einfluß von CNTF von Bedeutung. Einige Arbeiten konnten in
der Vergangenheit zeigen, dass CNTF einen Einfluß auf Oligodendrozyten und damit
auf die Myelinisierung im ZNS nimmt, was von großem Interesse für Therapieansätze
zentral demyelinisierender Erkrankungen ist (Stankoff B., 2002; Barres et al., 1996;
Mayer M., 1994). Ein erster Hinweis, dass CNTF auch Einfluß auf Schwann-Zellen und
Myelinisierung im PNS nimmt existiert seit kurzem. Allerdings fehlt ein quantitativer
Nachweis dieser Beobachtung (Zhang et al 2004).
Abbildung 7: Schematische Darstellung des CNTF-Rezeptors und seines intrazellulären Wirkmechanismus. Nach Bindung von CNTF an seinen heterodimeren Rezeptor und der Untereinheit CNTF-α erfolgt intrazellulär eine Autophosphorylierung über Januskinasen mit anschließender Aktivierung von Statinen. Dieser Mechanismus führt letztendlich zur Verhinderung von Zelltod und begünstigt Auswachsen neuer Axone (modifizierte Abbildung nach Principles of Neural Science
31
Familie der Transforming Growth Factors
Die Familie der Transforming growth factors ist sehr groß. Zahlreiche sehr bekannte
und wichtige Faktoren gehören ihr an. Dazu gehören TGF-β1, TGF-β2, TGF-β, GDNF
(Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor), das in der Entwicklung sehr wichtige
Bone morphogenetic protein, sowie Neuturin, Persephin, Artemin.
Die Signaltransduktion dieser Faktoren findet über die Rezeptoruntereinheit c-ret statt.
Jeder Ligand bindet an eine spezifische Rezeptoruntereinheit, die als Lipidanker in der
Membran befestigt ist (Kandel E et al., 2000; Drenckhahn D, 2004a; Drenckhahn D.,
2004b).
Fragestellung der Untersuchungen
Aus den bisherigen Erkenntnissen aus den Voruntersuchungen gehen folgende
Fragestellungen hervor:
1. Kann in einem Tiermodell für Plexus brachialisläsion und –therapie durch
Kombination aus Replantation ausgerissener Vorderwurzeln und Applikation
neurotropher Faktoren auf die Replantationsstelle das Überleben der Motoneuronen
nach einem Vorderwurzelausriss langfristig erhöht werden, so dass eine ausreichende
Anzahl Motoneuronen für eine hochwertige Regeneration zur Verfügung stehen?
2. In welchem Ausmass und über welche Wege findet ein Auswachsen regenerierender
Axone in die ventrolateral replantierte Vorderwurzel statt?
3. Hat die Applikation neurotropher Faktoren Einfluss auf Quantität (Anzahl) und
Qualität (Dicke und Myelinisierung ) der regenerierten Axone?
4. Welche Veränderungen ergeben sich im Spinalganglion und den Hinterwurzelresten
durch die Durchtrennung der Hinterwurzel und reicht der Einfluß neurotropher Faktoren
bis dorthin?
5. Welche morphologischen Veränderungen sind im peripheren Nerven sichtbar?
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine detaillierte morphologische und
morphometrische Analyse von Rückenmark, Nervenwurzeln, Spinalganglien und
peripherem Nerven nach einer Überlebenszeit der Versuchstiere von 3 Wochen bzw. 6
Monaten durchgeführt.
32
Material und Methoden
Untersuchungsmaterial
Die Untersuchungen wurden an C7 Segmenten des Rückenmarks adulter New Zealand
Kaninchen durchgeführt. Die operative Behandlung, die postoperative Versorgung und
Beobachtung der Tiere, die anschließende Perfusion und Präparation des Rückenmarks
(s.u.) wurden von Frau Dr. med. Eva Lang (Plastische- und Handchirurgie)
durchgeführt. Herstellung und Analyse der Schnittpräparate waren Gegenstand der
vorliegenden Dissertation.
Operatives Vorgehen
Nach Einleitung der Narkose erfolgte zunächst eine Tracheotomie zum Einlegen eines
Beatmungstubus. Die anschließende Operation der Versuchstiere wurde über einen
dorsalen operativen Zugangsweg durchgeführt. Dieser Zugangsweg hat sich in der
Vergangenheit für die Durchführung von ventrolateraler Replantation ausgerissener
Vorderwurzeln bewährt, da die Komplikationsraten während der Operation im
Vergleich zum ventralen Zugang deutlich niedriger sind.
Nach Hautschnitt und Präparation der paravertebralen Muskulatur erfolgte zunächst
eine Hemilaminektomie des Wirbels C6 und anschließend die Darstellung des
Rückenmarksegments C7. Nach Inzision und Auftrennung der Dura mater wurde die
Hinterwurzel dargestellt und durchtrennt. Damit wurde die Sicht auf die Vorderwurzel
möglich. Diese wurde nun mit einem Haken aus dem Rückenmark herausgerissen und
anschließend ventrolateral replantiert. Dabei wurde darauf geachtet, dass die zur
Vorderwurzel gehörigen gebündelten Fila radicularia vollständig ausgerissen und
replantiert wurden (Carlstedt et al., 1993a; Carlstedt et al., 2000). Nach Inzision der Pia
mater an der geplanten Replantationsstelle erfolgte die Replantation der Vorderwurzel
an dieser Stelle. Die primäre Fixation der Vorderwurzel wurde mit 0,2 ml Fibrinkleber
bei allen Tieren erreicht (Abbildung 8).
33
Abbildung 8: Dokumentation des operativen Vorgehens. Zunächst erfolgte die Hemilaminektomie über dem Wirbelkörper C6 (siehe Text). Nach Eröffnung der Dura mater konnte die Hinterwurzel dargestellt werden (a).Zur Darstellung der Vorderwurzel wurde die Hinterwurzel durchtrennt (b). Die Vorderwurzel wurde mit einem Haken entsprechend eines hiermit simulierten Ausrisstraumas herausgerissen (c); (d) zeigt die herausgerissene Vorderwurzel. Anschließend erfolgte die ventrolaterale Replantation der Vorderwurzel nach dem Prinzip von Thomas Carlstedt im Bereich zwischen Ausrissstelle der Vorderwurzel und Eintrittsstelle der Hinterwurzel (e). Die primäre Fixation erfolgte mit Fibrinklebe (siehe Text) (f). Die Bilder wurden zur Illustration von Frau Dr. Eva Lang zur Verfügung gestellt.
34
Bildung verschiedener Versuchsgruppen
Bei insgesamt 10 Tieren, nachfolgend als Kontrollgruppe bezeichnet, wurde die
Vorderwurzel wie oben beschrieben mit 0,2 ml Fibrinkleber (Tissuecol Duo S ®,
Baxter, Stadt, Österreich) fixiert. Bei den anderen Gruppen, jeweils bestehend aus 7
Tieren wurden 10 µl rekombinantes Ratten-CNTF (0.78 bzw. 1 mg/ml in PBS) oder 10
µl rekombinantes Menschen-BDNF (1mg/ml) in den Fibrinkleber gemischt und die
Vorderwurzel auf gleiche Weise ventrolateral replantiert und fixiert. Bei der vierten
Versuchsgruppe, ebenfalls bestehend aus 7 Tieren wurden je 10 µl beider neurotropher
Faktoren CNTF und BDNF in den Fibrinkleber gemischt.
Diese Gruppen sind nachfolgend entsprechend der Beigabe neurotropher Faktoren in
den Fibrinkleber als CNTF-Gruppe, BDNF-Gruppe oder CNTF+BDNF-Gruppe
bezeichnet.
Postoperative Beobachtung der Tiere
Zwei Tiere mussten getötet werden, weil sie anhaltend an Gleichgewichtsproblemen
litten, die wahrscheinlich auf einer Verletzung der Tractus spinocerebellares anterior
und posterior beruhte. Alle weiteren Tiere, außer einem Tier der BDNF-Gruppe, das
eine Woche nach der Operation starb, überstanden die Operation komplikationslos. Sie
zeigten einen partiellen Verlust der Funktionen der Extensoren des Vorderlaufs, was
durch Hinken deutlich wurde. Diese Symptomatik war für einige Wochen
offensichtlich, wurde im Laufe der Zeit geringer, war aber nach sechs Monaten immer
noch vorhanden. Offensichtliche Unterschiede in der Wiederherstellung der
Muskelfunktionen in den einzelnen Gruppen wurden nicht beobachtet.
Perfusion und Überlebenszeiträume
Nach einer Überlebenszeit von 3 Wochen (n=3 Tiere der Kontrollgruppe) bzw. einer
Überlebenszeit von 6 Monaten (n=25 Tiere aller Versuchsgruppen) erhielten die Tiere
erneut eine Narkose mit Beatmung über Tracheotomie und wurden transcardial
perfundiert. Die verwendete Fixationslösung bestand aus 4% Paraformaldehyd und
0,2% Glutaraldehyd in 0,1M Phosphat Puffer bei PH 7,4.
Die Segmente C6-C8 wurden nach der Perfusion aus dem Wirbelkanal zusammen mit
Hinterwurzel, Spinalganglien, Vorderwurzeln und dem proximalen Spinalnervenanteil
35
herauspräpariert. Das Spinalganglion und die Vorderwurzeln wurden auf beiden Seiten
durch einen Transversalschnitt in einen proximalen und distalen Abschnitt geteilt
(Abbildung 9). Auf die proximale Schnittfläche von Spinalganglion und Vorderwurzel
wurde der Fluroeszenfarbstoff DiI (1,1´dioctadecyl-3,3,3´3´-tetramethylindo-
carbocyaninperchlorat) in einer 2%igen Agar Lösung in Form von Kristallen appliziert
und bei 37°C für die Dauer mindestens eines Jahres in Fixans inkubiert. Bei DiI handelt
es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der durch seine lipophilen Eigenschaften in
der Lage ist, retrograd entlang von neuronalen Membranen zu wandern. Bei einer
Inkubationszeit von 12-15 Wochen und einer Inkubationstemperatur von 37°C wandert
DiI nach Literaturangaben 28,9 ±2,2 mm (Lukas et al., 1998).
Behandlung der proximalen Gewebeanteile
Nach der Inkubationszeit wurde das Segment C7 in PBS gewaschen in 10% und 20%
Saccharoselösung in PBS gebracht, über Isopentan in Stickstoff eingefroren und mit
Tissue Tek auf Korken geklebt. Die so behandelten Gewebe wurden bei -80°C gelagert.
Durch das gesamte Segment C7 wurden im Cryostat Transversalserienschnitte
angefertigt, die eine Dicke von 30µm haben. Diese Schnitte wurden auf Objekträger
SuperfrostTM (Menzel, Braunschweig) aufgezogen, um eine anschließende
mikroskopische Beobachtung der Schnitte durchführen zu können. Es wurden jeweils
Abbildung 9: Methodenschema; durch Transversalschnitte auf der Höhe, an der die Vorderwurzel dem Spinalganglion anliegt erfolgte die Aufteilung des Gewebeblocks bestehend aus Segment C7 in zwei distale und einen proximalen Gewebeanteil (siehe Text). Diese beiden Gewebeanteile wurden zur Beurteilung verschiedener Aspekte unterschiedlich histologisch aufbereitet.
36
Serien aus vier Objektträgern gebildet, auf die jeweils sechs Rückenmarkschnitte
aufgezogen wurden. Die Reihenfolge der Schnitte ist aus folgendem Schema ersichtlich
(Abbildung 10).
Abbildung 10: Die Transversalserienschnitte wurden in Serien à je vier Objektträgern aufgezogen. Die Nummerierung der Schnitte im Schema zeigt die Reihenfolge, in der die Schnitte aufgezogen wurden. Bei einer Schnittdicke von 30 µm ist der Abstand dieser Schnitte auf einem der Objekträger 120 µm bis zum nächsten Schnitt auf dem gleichen Objektträger. Der jeweils erste Schnitt einer solchen Serie wurde mit einer Klüver-Barrera Färbung (KBF; siehe unten im Text) die drei anderen mit einer Markscheidenfärbung MSF (siehe unten im Text) gefärbt.
Die anschließende fluoreszenzmikroskopische Beobachtung der
Transversalserienschnitte erfolgte mit einem Olympus Mikroskop (Olympus GmbH,
Deutschland). Fotografien von wichtigen Schnitten wurden mit einer Olympus Kamera
und Kodak TMAX- 400 Schwarzweißfilmen (Kodak GmbH, Stuttgart) angefertigt.
Zwei Fragestellungen sollte die anschließende lichtmikroskopische Analyse der
Transversalserienschnitte beantworten:
1. Ist eine ausreichende Anzahl von Motoneuronen vorhanden und gibt es Unterschiede
in der Anzahl der überlebenden Motoneurone in den verschiedenen Gruppen?
2. Welche Wege nehmen regenierende Axone beim Wiederauswachsen aus den
Neuronen durch das Rückenmark in die replantierte Vorderwurzel?
37
Diese Fragestellungen machten die Auswahl geeigneter Gewebefärbungstechniken
notwendig. Zur Darstellung neuronaler Strukturen insbesondere des Perikaryons eignet
sich die Kresylviolettfärbung nach Nissl, die die basophilen Strukturen der Zellen (Nissl
Schollen) selektiv darstellt. Mit einer modifizierten Färbung nach Klüver Barrera, die
eine Kresylviolettfärbung einschließt und gleichzeitig Markscheiden schwach darstellt
wurde jeder erste Objekträger einer Viererserie gefärbt. Dies sollte später bei der
Zählung der Neurone ermöglichen, dass jedes Neuron im definierten Zählbereich erfasst
wird.
Die intensive Darstellung der Markscheiden zur Erfassung regenerierter myelinisierter
Axone erfolgte mit einer spezifischen Markscheidenfärbung, welche Markscheiden
schwarz und Zellkörper rot anfärbt.
Behandlung der distalen Gewebeanteile
Für die Beurteilung der Morphologie und zur späteren quantitativen Analyse der
Vorderwurzeln und der anliegenden Spinalganglien wurde der distale Gewebeanteil
zunächst in Kunstharz eingebettet.
Das zur Fixierung des Gewebes verwendete Formaldehyd wurde zunächst 3x 10
Minuten mit 0,15 M Phosphatpuffer ausgewaschen. 0,15M Phosphatpuffer besteht aus
405ml Di-Natriumhydrogenphosphat und 95 ml Natriumdihydrogenphosphat (Firma
Merck, Darmstadt) gelöst in 900 ml Aqua dest. Die Lösung wurde mit
Natriumdihydrogenphosphat auf pH 7,4 eingestellt und auf 1l mit Aqua dest. aufgefüllt.
Mit einer 1:1 Verdünnung aus 4% Osmiumtetroxyd und Daltonpuffer wurde das
Gewebe für 90 Minuten nachfixiert und anschließend wieder 3x15 Minuten mit 0,15 M
Phosphatpuffer ausgewaschen und über Nacht im Puffer belassen.
Der Daltonpuffer besteht aus zu gleichen Teilen gemischter 4% Kaliumdichromatlösung
und 3,4% NaCl-Lösung (Firma Merck, Darmstadt), die mit Kalilauge auf pH 7,4
eingestellt wurde.
Für die Herstellung des 4%igen Osmiumtetroxyd (Firma Chempur, Karlsruhe) werden 2
Ampullen Osmiumtetroxyd à 1g aufgebrochen, in 50 ml Aqua dest gegeben und über
Nacht auf dem Rührer zur Lösung belassen.
Mit einer aufsteigenden Acetonreihe erfolgte am nächsten Tag für jeweils 15 Minuten
am nächsten Tag die Dehydrierung des Gewebes (30% Aceton, dann 40% Aceton, 50%
Aceton und 60% Aceton). Nach einer Vorkontrastierung in 70% Aceton mit
38
Phosphorwolframsäure und Uranylacetat für 2x30 Minuten wurde das Gewebe für je 15
Minuten in 80% und 90 % Aceton, anschließend für 3x 10 Minuten in 100% Aceton
weiter dehydriert.
Die Mischung zur Vorkontrastierung besteht aus 1% Phosphorwolframsäure (Firma
Chroma, Münster) und 0,5g Uranylacetat (Firma Merck, Darmstadt) auf 100 ml 70%
Aceton. Die Mischung wurde gelöst und anschließend filtriert.
Danach folgte der Übergang in das Einbettgemisch: Das Gewebe wurde zunächst für
2x30 Minuten in einer 1:1 Mischung aus dem Einbettgemisch und 100% Aceton
belassen, anschließend für die gleiche Zeit in einer Mischung dieser beiden Stoffe im
Verhältnis 3:1 und dann in reinem Einbettgemisch belassen.
Für das Einbettgemisch wurde „Spurr Mixture“ verwendet. Es handelt sich dabei um
eine Kunstharzeinbettung mit ERL 4221-D, welches folgendermaßen hergestellt wurde:
- ERL 4221-D 15ml (Vinylcyclohexendioxid)
- D.E.R. 736 7,5ml (Weichmacher; Dioxid)
- NASA 37,5 ml (Nonensuccinic anhydride, Härter)
- DMAE (S-1) 1,5 ml (Dimethylaminoethanol; Beschleuniger) (alle hier genannten
Firma Serva, Heidelberg).
Das Gemisch wurde für 20-30 Minuten unter Vermeidung von Luftblasenbildung gut
gerührt bis sich das Gemisch von gelb nach orange-braun verfärbte.
Über Nacht wurde das Gewebe bei 4°C im Kühlschrank gelagert, bevor am nächsten
Morgen das Einbettgemisch erneut einmal gewechselt wurde.
Danach folgte das Ausgießen in geeignete Formen, das Gewebe wurde eingelegt und
ausgerichtet und dann luftblasenfrei mit ERL- Medium aufgefüllt.
Nach der Einbettung wurden aus dem Gewebe Semidünnschnitte von 1µm Dicke mit
einem Ultracut (Firma Reichert und Jung, Wien) angefertigt.
Für die Anfärbung der Semidünnschnitte wurde der Farbstoff Touluidinblau verwendet.
Die meisten anderen Färbungen dringen nicht genügend in Epoxidharz ein.
Touluidinblau führt zu einer differenzierten Anfärbung biologischer Bestandteile in
unterschiedlichen Blautönen.
Die angefertigten Schnitte wurden mit folgender Lösung gefärbt: Je ein Gramm
Toluidinblau, Azur II und Borax in 100 ml Aqua bidest. wurden auf dem Rührer
durchmischt und gelöst. Anschließend wurde die Färbelösung für 1 min auf
39
Semidünnschnitte aufgetropft, abgegossen, die Schnitte wurden kurz in Aqua bidest
gewaschen, getrocknet und mit Entellan eingedeckt.
Markscheidenfärbung
Für die Markscheidenfärbung wurden zunächst folgende Lösungen hergestellt:
Sudanschwarz B:
1. 0,1g Sudanschwarz werden in 100 ml 70% Alkohol im Wasserbad gelöst und bis zum
Kochen erhitzt (76°C).
2. Kernechtrot: 0,1g Kernechtrot in 100 ml 5% Aluminiumsulfat (wässrig) heiß lösen
und nach Erkalten filtrieren.
3. Alkohol: Ausgangspunkt ist 96%iger Alkohol
500 ml 96% Alkohol und 960 ml Aqua Dest. => für 50% Alkohol
750 ml 96% Alkohol und 960 ml Aqua Dest. => für 70% Alkohol
Färbevorgang:
Alle Objektträger wurden zunächst 1 Minute in 50% Alkohol belassen, bevor sie für
eine Stunde in frisch filtriertes Sudanschwarz B überführt wurden. Danach wurde die
überschüssige Färbelösung durch Waschung der Objektträger mit 50% Alkohol entfernt
und es wurde in Aqua dest. gespült. Anschließend wurden die Schnitte für 10 Minuten
in Kernechtrot gestellt und danach wieder mit Aqua dest. gespült. Die Eindeckung der
Schnitte erfolgte mit Glyceringelatine. Die Ränder der Deckgläschen wurden mit
Entellan zur Abdichtung umrahmt. Der gesamte Färbevorgang wurde bei
Raumtemperatur durchgeführt.
Modifizierte Färbung nach Klüver-Barrera (Luxol-Fast Blue Färbung)
Zunächst wurden folgende Lösungen hergestellt:
1. Luxol Fast Blue Färbelösung (0,1%): 0,1g Luxol Fast Blue (LFBMS, Lösung 38
Sigma) wurden in 100 ml 96%igem Ethanol aufgelöst und anschließend 0,5 ml 10%ige
Essigsäure zugefügt.
2. Lithiumcarbonatlösung (0,05%): 0,5g Lithiumcarbonat (Brüssel, r.c.b. 85.078)
wurden in einem Liter Aqua dest. aufgelöst.
3. Acetatpuffer (20mM): 1,2g Essigsäure wurden in 1000 ml Aqua bidest gelöst und der
pH-Wert wurde auf 4,0 mit etwa 3,5 ml 1 M NaOH Lösung eingestellt.
40
4. Cresyl violett (0,2%, pH 4,0): 1g Cresylviolettacetat (Sigma; C-5042) wurde in 500
ml 20 mM Acetatpuffer mit pH 4,0 gelöst. Anschließend wurde der pH neu auf 4,0
eingestellt. Diese Lösung wurde unmittelbar vor jedem Gebrauch filtriert.
Folgende Vorgehensweise zur Färbung der Schnitte:
Die Schnitte auf den Objektträgern wurden zunächst für 10 min in PBS gestellt.
Anschließend erfolgte eine Überführung der Gewebeschnitte in 70% Ethanol, dieses
wurde gewechselt und anschließend wurden die Objektträger für 24h bei 20°C
Raumtemperatur in 70% Ethanol belassen. Am nächsten Tag wurden die Objektträger
in die vorgewärmte Luxol Fast Blue Lösung überführt und über Nacht bei 56°C im
Wärmeschrank inkubiert. Danach wurden die Schnitte 3 min in PBS gewaschen und für
weitere drei Minuten in die Lithiumcarbonatlösung gestellt. Anschließend wurden die
Objektträger für drei Minuten in 70% Ethanol eingestellt und zweimal für je 5 Minuten
in PBS gewaschen. Nach einer Waschung der Schnitte in Aqua dest. für zwei Minuten
wurden sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten in der Cresylviolettlösung belassen und
dann wieder für zwei Minuten in Aqua dest. gewaschen. Danach folgte die Dehydration
der Gewebe mit einer aufsteigenden Alkoholreihe: 1 Minute in 70% Ethanol, 2 Minuten
in 80% Ethanol, 5 Minuten in 96% Ethanol und zum Schluss zweimal für je 5 Minuten
in 100% Ethanol. Vor der Eindeckung in Entellan wurde das Gewebe noch zweimal für
je 5 Minuten in Xylol gestellt (Geisler et al., 2002).
Morphologische und quantitative Auswertung der Gewebeschnitte
Die morphologische Auswertung der Transversalschnitte durch das Rückenmark wurde
mittels eines Lichtmikroskops der Firma Zeiss (Jena) vorgenommen. Die
lichtmikrospischen Bilder wurden mit einer Spot Camera (Visitron, Puchheim)
aufgenommen. Morphometrische Analysen dieser Schnitte wurden mit der
Morphometriesoftware Spot advanced der gleichen Firma vorgenommen. Die aus den
digitalen Aufnahmen gewonnenen morphometrischen Daten wurden auf
Normalverteilung und statisch signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen
Gruppen überprüft. Dafür wurden Sigma Stat 2.0 und Sigma Plot 8.0 verwendet. Die
Auswertungen wurden von einem Statistiker überprüft.
41
Zählung der Vorderhornneurone
Die Zählung der Motoneurone im Segment C7 wurde am Lichtmikroskop
vorgenommen.
Um diese Bestimmung durchführen zu können wurden bei verschiedenen Tieren (n=6)
zunächst die Durchmesser der Zellkerne der Neurone (n=30) ermittelt. Die Durchmesser
der Zellkerne lagen in einem Bereich zwischen 9-17µm der Mittelwert liegt bei 12,8 µm
±1,9 (Mittelwert ± Standardabweichung).
Bei jedem Tier wurde ein Bereich von 4 mm innerhalb des Segment C7 ausgezählt. Um
einen vergleichbaren Bereich zwischen den einzelnen Tieren zu erhalten, wurde der
Beginn der Zählung 2 mm oberhalb der Mitte der durch die Replantation entstandenen
Narbe gewählt. Entsprechend war der Endpunkt der Zählung 2 mm unterhalb der Mitte
der Narbe. Da die größte Narbenausdehnung 3,5 mm beträgt, kann damit davon
ausgegangen werden, dass bei allen Tieren Neurone in dem Bereich gezählt wurden, in
dem eine Wirkung der neurotrophen Faktoren am ehesten erwartet werden kann.
Gezählt wurde jeder vierte Schnitt, bei einer Schnittdicke von 30 µm also in einem
Abstand von 120 µm. Gezählt wurden lediglich Neurone, bei denen der Zellkern zu
sehen war und die im Bereich des Vorderhorn vor einer gedachten Linie durch
Zentralkanal und Taille der Schmetterlingsfigur der grauen Substanz lokalisiert waren.
Da sich im Vorderhorn des Rückenmarks nicht nur Motoneurone befinden, soll hier
noch erwähnt werden, dass diejenigen Zellen als Motoneurone gezählt wurden, welche
nach allgemeinem Kenntnisstand der Morphologie Motoneuronen entsprechen (siehe
oben).
Mit der Formel nach Abercrombie wurden anschließend die Absolutzahlen der Neurone
in diesem Abschnitt berechnet.
Formel nach Abercrombie: Absolutzahl Neurone = gezählte Zahl*Zahl der Schnitte, die
zur Serie gehören*(Schnittdicke/Schnittdicke+Kerndurchmesser)
Beispiel für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführte Berechnung: Absolutzahl
Neurone= 260*4*(30µm/30µm+12µm). (Clarke and Oppenheim, 1995; Abercrombie M
and Johnson M L, 1946; Abercrombie M, 2004) Eine Auswertung war möglich bei
insgesamt 18 Tieren aller experimentellen Gruppen (Kontrolle n=5, CNTF n=3, BDNF
n=5, CNTF+BDNF n=5).
42
Bestimmung der Axondurchmesser
In Markscheidenfärbungen wurde der Axondurchmesser von Axonen mit Hilfe der Spot
Advanced Software (Visotron Systems, Puchheim) ausgeführt. Um vergleichbare und
möglichst genaue Daten gewinnen zu können musste folgendes beachtet werden: Die
Messungen erfolgten immer im gleichen Schnitt auf gesunden und verletzten Seiten.
Ausgemessen wurden jeweils alle Axone, deren Durchmesser klar von anderen Axonen
abgrenzbar waren. Dies ergab eine besondere Schwierigkeit, da auf den unverletzten
Seiten die Axone in den relativ dicken Schnitten (30 µm) häufig übereinander lagen und
damit nicht voneinander abgrenzbar waren. Aus diesem Grunde sind diese Messungen
nicht bei allen Tieren möglich gewesen. Bestimmung der Axondurchmesser für die
Vorderwurzelaxone war möglich bei 9 Tieren (Kontrolle n=3, CNTF n=2, BDNF n=2,
CNTF+BDNF n=2). Es wurde dabei darauf geachtet, dass lediglich Schnitte von Tieren
ausgemessen wurden, bei denen die Herkunft der Axone durch direkten Nachweis der
Kontinuität in der Markscheidenfärbung zu sehen war. Die Messungen wurden an der
Stelle vorgenommen, an der die Axone aus dem Rückenmark austreten, distal von der
Transitionszone.
Für die Hinterwurzelaxone war diese Auswertung bei insgesamt 8 Tieren (Kontrolle
n=2, CNTF n=2, BDNF n=3, CNTF+BDNF n=2) möglich und wurde nach den gleichen
Kriterien vorgenommen. Die statistische Auswertung erfolgte bei diesen Messungen mit
dem „Tukey-Test“.
Auswertung der Semidünnschnitte
Zur morphologischen und morphometrischen Analyse fand eine Digitalisierung der
histologischen Gewebeschnitte statt. Die lichtmikroskopische Beobachtung der
Semidünnschnitte wurde mit einem Zeiss-Axioplan 2 Mikroskop (Carl Zeiss Jena, Jena)
durchgeführt. Die zur quantitativen Analyse benötigten digitalen Fotografien wurden
mit einer Axiocam Digitalkamera in höchstmöglicher Auflösung (3090x3600 Pixel)
angefertigt.
Die Vorderwurzeln aller Tiere sowohl von unverletzter Seite, als auch von replantierter
Seite jeden Tieres wurden zunächst lichtmikroskopisch beobachtet und anhand der
Morphologie beurteilt. Sodann wurden digitale Fotographien in verschiedenen
Vergrößerungen angefertigt (5x für Übersichten, 10x für Auswertungen). Alle Schnitte,
43
die eine klare Abgrenzung der Vorderwurzel vom anliegenden Spinalganglion
erlaubten, wurden in die weiteren Auswertungen einbezogen (Kontrolle
unverletzte/replantierte Seiten n= 6/9; CNTF n=5/4, BDNF 6/6 und CNTF+BDNF
n=6/6). Vorderwurzeln bei denen ein Einwachsen von Hinterwurzelaxonen nicht
ausgeschlossen werden konnte (siehe Ergebnisse) wurden ebenfalls von den weiteren
Analysen ausgeschlossen. Mit Hilfe eines digitalen Morphometrieprogramms Scion
Image (Scion Corporation, Maryland USA) wurden alle in den Vorderwurzeln
befindlichen Axone ausgezählt. Anschließend wurden alle Vorderwurzelflächen
ausgemessen.
Für alle in dieser Arbeit analysierten Daten wurde SigmaStat®Software (Systat
Software GmbH Erkrath, Deutschland) verwendet. Die statistische Analyse der
Axonzahlen zwischen verletzten und unverletzten Seiten erfolgte mit einem einer „one
way repeated measures analysis of variance” gefolgt von einem „Tukey Test“.
Statistische Unterschiede der Axonzahlen zwischen verschiedenen experimentellen
Gruppen wurden mit einer „Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks“
ermittelt. Die Analyse der Vorderwurzelflächen erfolgte auf die gleiche Weise.
Zur Beurteilung der Axone innerhalb der Vorderwurzeln wurden in Anlehnung an
frühere Studien (Geuna et al., 2001; Vögelin et al., 2006; Novikov et al., 1997) in jeder
Vorderwurzel drei zufällig gewählte Regionen (Region of interest, ROI) mit einer
Fläche von jeweils 900 µm² bestimmt. Für alle darin befindlichen Axone wurden deren
Axonflächen und die Flächen deren Myelinscheiden mit Hilfe des digitalen
Morphometrieprogramms Scion Image ausgemessen (Abbildung 11). Die so gewonnen
Daten für die weitere statistische Analyse der Vorderwurzelaxone verwendet.
Zur Analyse der Flächenverteilung wurden für jedes Einzeltier Histogramme mit einer
Skalierung im Abstand von 5 µm² angefertigt. Diese Flächenverteilung wurde für jedes
Tier in Prozent der Gesamtaxonzahl pro Vorderwurzel umgerechnet, damit die
Größenverteilung der Axonflächen bei einzelnen Tieren mit unterschiedlichen
Axonzahlen in den ROIs in einer gemeinsamen Darstellung vergleichbar wurde. Der
Gruppenvergleich erfolgte durch Mittelwertbildung dieser Prozentwerte der Einzeltiere.
Die Ergebnisse dieser Berechnungen wurden in Histogrammen aufgetragen, jeweils
unverletzte Seiten aller Gruppen gegen die replantierten Seiten der einzelnen
experimentellen Gruppen
44
Bestimmung der Myelinisierung
Um den Grad der Myelinisierung der regenerierten Axone zu bestimmen wurden die
Flächen der Myelinscheiden im Verhälntis zur Axonfläche bei unverletzten und
regenerierten Axonen in den verschiedenen Versuchsgruppen miteinander verglichen.
Zunächst wurde ein Vergleich individueller Axone vorgenommen. Hierfür wurden die
Ergebnisse von Messungen aus den ROIs sowie die Messungen 30 zusätzlich
ausgewählter Axone in den unverletzten Seiten in einem Streuungsdiagramm
aufgetragen. Die Axonflächen wurden dabei auf der Abszisse und die jeweils
zughörigen Flächen der Myelinscheiden auf der Ordinate aufgetragen, so dass ein Punkt
im Diagramm das Axon-Myelinverhältnis eines Axons darstellt. Mit Hilfe statistischer
Software (Sigma Plot 8.0) wurden Regressionsgeraden für jede Versuchsgruppe
bestimmt.
Abbildung 11: Bildung von Regions of interest (ROIs): Zufällig ausgewählte Regionen einer Größe von 900 µm² wurden aus jedem der drei Abschnitte der Vorderwurzel genommen. Die Abbildung zeigt dies exemplarisch an der Histologie einer unverletzten Vorderwurzel.
45
Für die statistische Analyse wurden ausschließlich Axone aus den ROIs verwendet. Da
sich die Fläche der Myelinscheide in Abhängigkeit von der Axongröße ebenfalls
verändert (Orgel, 1982; Friede and Samorajski, 1968; Schroder, 1972), wurden nur
Myelinflächen von Axonen gleicher Fläche verglichen. Hierfür wurden die Axone
zunächst in Größenklassen eingeteilt, in denen sich die Axonflächen weder zwischen
individuellen Tieren, noch zwischen den experimentellen Gruppen, noch zwischen
verletzten und unverletzten Seiten statistisch signifikant voneinander unterschieden.
Anschließend wurden für jedes Tier in diesen Bereichen die zugehörigen Mittelwerte
der Myelinscheiden berechnet. Diese Mittelwerte wurden dann zu Mittelwerten der
einzelnen experimentellen Gruppen zusammengefaßt und statistisch miteinander
verglichen. Die statistische Analyse erfolgte mit einer „One way Anova“ gefolgt von
einem „Tukey Test“.
Analyse von Anzahl und Flächen myelinisierter Axone innerhalb des
Spinalganglions
Innerhalb des Spinalganglions wurden für jedes Tier je zwei „Regions of interest“
(Größe 2500 µm2) zufällig aus denjenigen Regionen des Spinalganglions, die
ausschließlich Axone beinhalten, ausgewählt um damit zunächst die Axondichte
vergleichen zu können. Die Flächen der in den ROIs befindlichen Axone wurden
ausgemessen. Daraus wurden für jedes Einzeltier Histogramme der Flächenverteilung
mit einer Skalierung im Abstand von 5 µm² angefertigt (analog zum Vorgehen für die
Vorderwurzelaxone; siehe oben). Abschließend erfolgte die Überprüfung auf
Abbildung 12: Quergetroffene myelinisierte Axone (mit Tolouidinblau gefärbt). Die roten Markierungen sollen die Art der Messungen von Axonfläche (innerer Kreis) und Myelinfläche (Fläche zwischen äußerem und innerem Kreis) verdeutlichen.
46
Normalverteilung (p= 0,121) danach ein „Equal Variance Test“ (p = 0,423), um
signikante Unterschiede zu überprüfen.
Messung von Flächen sensorischer Neurone in den Semidünnschnitten
Neuronflächen wurden in Querschnitten von Spinalganglien gemessen. Zunächst wurde
der Gesamtquerschnitt bei 1,25x-facher Vergrößerung mikroskopisch beobachtet. Bei
dieser Vergrößerung sind morphologische Details innerhalb des Spinalganglions nicht
sichtbar. Es wurden jeweils zwei nicht überlappende zufällig lokalisierte Areale (20x
Vergrößerung) aus dem Gesamtquerschnitt eines Spinalganglions fotografiert und alle
darin befindlichen Neurone gemessen, bei denen Zellkerne sichtbar waren. Analog zur
Analyse der Axonflächen wurden nach dem gleichen Prinzip Histogramme der
Flächenverteilung der Neurone angefertigt. Für die Histogramme der
Neuronflächenverteilung wurden die Berechnungen mit einer Skalierung im Abstand
von 500 µm² angefertigt.
Die Ergebnisse der Berechnungen wurden in Histogrammen aufgetragen, jeweils
unverletzte Seiten aller Gruppen gegen alle verletzten Seiten bzw. gegen die einzelnen
experimentellen Gruppen. Anschließend erfolgte die Überprüfung auf Normalverteilung
(p= 0,121) danach ein „Tukey-Test“ zur Überprüfung auf statistisch signifikante
Unterschiede.
Messung der Dichte sensorischer Neurone
Es wurden dafür in den Klüver-Barrera gefärbten Längsschnitten des proximalen
Abschnitts der Spinalganglien vier „Regions of interest“ innerhalb der
Neuronengruppen ohne dazwischenliegende Axone oder Bindegewebsanteile gebildet
(Größe je 30000 µm²) und die darin befindlichen kernhaltigen Neurone bestimmt.
Anschließend erfolgte die Überprüfung auf Normalverteilung (p>0,200) danach ein
„Equal Variance Test“ (p=0,220).
47
Ergebnisse
Morphologie des Rückenmarks und der Axonverläufe
Morphologie des Rückenmarks der unverletzten Seiten
Die graue Substanz der unverletzten Seiten erschien bei allen Tieren ohne
Beeinträchtigung. Die Laminierung von Hinter- und Vorderhörnern war morphologisch
unverändert gegenüber dem Normalzustand (Abbildung 13a-c). Innerhalb der
unverletzten Vorderhörner zeigten sich verschiedene Populationen von großen und
mittelgroßen Neuronen.
Alle Regionen der weißen Substanz waren bei allen Tieren ebenfalls unverletzt und
zeigten zahlreiche quergetroffene myelinisierte Axone, die in der Markscheidenfärbung
gut identifizierbar waren (Abbildung 13a-c). Im ventrolateralen Bereich konnte man
beobachten, wie dichte Bündel myelinisierter Axone ausgehend von den Vorderhörnern
die weiße Substanz durchliefen, die Außenfläche des Rückenmarks erreichten, wo sie in
der sogenannten ventralen Austrittszone das Rückenmark verließen um die Fila
radicularia der Vorderwurzeln zu bilden. Diese Bündel von Axonen entsprechen den
„intramedullary bundles“ IMBs, den intramedullären Bündeln, die von Fraher
beschrieben wurden (Fraher J.P., 1997). Die Fila radicularia vereinigten sich und
verliefen gebündelt als kompakte Vorderwurzel in Richtung Spinalganglion. Auf Höhe
des Spinalganglions bestand die Vorderwurzel aus einem kompakten Bündel von
Axonen, das in Bindegewebe eingehüllt war und damit deutlich vom Spinalganglion
abgegrenzt war. Nervenfasern, die Vorderwurzel und Spinalganglion verbinden wurden
in keinem Fall beobachtet. Die Hinterwurzel trat aus dem Spinalganglion aus und zog
nach dorsal, um im Bereich der dorsalen Eintrittszone in das Rückenmark einzutreten.
Fluoreszenzuntersuchungen auf der unverletzten Seite zeigten, dass der fluoreszierende
Tracer zwar in hoher Konzentration in peripheren Abschnitten der Motoneurone und
deren Axonen zu sehen war, aber am Übergang zwischen peripherem und zentralen
Nervensystem, an der sogenannten Transitionszone trotz ausreichend langer Inkubation
nicht in großen Mengen in intramedulläre Axone übergegangen war. Aus diesem Grund
war die Fluoreszenzmarkierung von Motoneuronen nur in wenigen Fällen zu sehen
(Abbildung 14, Abbildung 17c).
48
Abbildung 13: Unterschiedliche morphologische Erhaltungszustände des RM in Markscheidenfärbung; Die Tiere entsprechen nach unserer Klassifikation einem Grad 1 (a), Grad 3 (b) und Grad 4 (c); Maßstab: 500 µm
49
Morphologie der replantierten Seiten
Replantationstelle und Verletzungsausmaß am Rückenmark
Der erste Schwerpunkt der lichtmikroskopischen Beobachtung der Morphologie der
verletzten Seiten galt der Beurteilung des Verletzungsausmaßes, der Narbenbildung und
der Identifikation der Replantationsstelle.
Als Stelle der Replantation wurde etwa in der Bereich des Rückenmarks identifiziert, an
der das Auswachsen von lateral austretenden Axonen besonders deutlich zu sehen war
und die Art der Rückenmarksbeschädigung (Kerbe) auf einen Replantationsvorgang
rückschließen lies (Abbildung 13a-c). Während der Replantation waren drei
verschiedene kleinere Wurzelanteile getrennt replantiert worden. Diese
unterschiedlichen Anteile waren nach sechs Monaten nicht mehr zu identifizieren.
Stattdessen bekam man bei einigen Tieren den Eindruck schräger, uneinheitlicher
Replantationsstellen. Abbildung 15 gibt diese Eindrücke schematisch für alle
Versuchstiere wieder. Replantationsstellen waren in jedem Tier in ventrolateraler
Position zu finden. Diese Position zeigte jedoch von Tier zu Tier leichte Abweichungen
nach ventral oder dorsal.
Das Ausmaß der Narbe, die innerhalb und außerhalb des Rückenmarks durch die
Replantation entstanden war, lag zwischen 1,4 und 3,5 mm. Morphologische
Abbildung 14: DiI-Fluoreszenz gesunder Seiten in der Übersicht (a) und in höherer Vergrößerung (b). Der fluoreszierende Tracer ist in hoher Konzentration in peripheren Abschnitten der beiden Nervenwurzeln bzw. des Spinalganglion zu sehen. Am Übergang zwischen peripherem und zentralem Nervensystem, an der sogenannten Transitionszone (b) ist der Tracer trotz ausreichend langer Inkubation nicht in großen Mengen in intramedulläre Axone übergegangen. Maßstab (a) 500 µm; (b) 50 µm.
50
Veränderungen innerhalb des Rückenmarks waren in der Mitte des Segments am
deutlichsten zu sehen (Abbildung 13, Abbildung 15). Das Ausmaß der Veränderungen
war interindividuell sehr unterschiedlich, deutliche Unterschiede zwischen den
verschiedenen Gruppen waren nicht vorhanden. Um die Unterschiede der
Narbenbildung und vor allem deren Ausmass innerhalb des Rückenmarks deutlicher
machen zu können, wurde die Morphologie der verletzten Seiten nach folgender
Klassifizierung eingeteilt:
Grad 1: Leichte Veränderungen mit wenig Narbenbildung (Abbildung 13a)
Grad 2: Degeneration der weißen Substanz in Umgebung der Replantationsstelle ohne
bemerkenswerte Narbenbildung innerhalb der grauen Substanz (Abbildung 14b)
Grad 3: Deutliche Degeneration der weißen Substanz mit bemerkenswerter Narbe der
grauen Substanz (Abbildung 13b)
Grad 4: Großer Schaden der grauen und weißen Substanz (Abbildung 13c)
Interessanterweise war bei allen Tieren, der ventrale Teil der weißen Substanz, der
durch den Vorderwurzelausriss ebenfalls zerstört sein sollte, relativ gut erhalten und
zeigte fast keine Narbenbildung. Im Gegenteil waren die intramedullären Strassen,
welche für das Auswachsen regenerierender Axone wegweisend sein könnten in allen
Fällen erhalten (Abbildung 17a-c)
Abbildung 15: Schematische Darstellung der Replantantationsstellen, der lateral ausgemessenen Narbenbildung, sowie der morphologischen Veränderungen innerhalb des Rückenmarks (Querschnitte auf Höhe der Mitte des Segments); römische Zahlen geben den Grad der Veränderung an.(siehe folgende Seite)
51
52
Allgemeine morphologische Beobachtungen an der grauen Substanz
Die morphologische Analyse der Vorderhörner der replantierten Seiten ergab große
interindividuelle Unterschiede bezüglich des Grads der Veränderung. In den meisten
Fällen korrelierte der Grad der Veränderung der grauen Substanz mit dem Ausmass der
intraspinalen Narbenbildung. Die Laminierung der grauen Substanz war bei einigen
Tieren fast schadlos erhalten, bei anderen war ein mittleres Ausmaß der Beschädigung
und bei anderen eine komplette Disorganisation und Degeneration der grauen Substanz
zu beobachten. Die interindividuellen Unterschiede bezüglich der Anzahl überlebender
Motoneurone waren nach rein morphologischer Beurteilung groß. Vor allem auf Höhe
der geschätzten Replantationsstelle fanden sich im Allgemeinen sehr wenig Neurone,
wohingegen oberhalb und unterhalb dieser Stelle mehr Neurone vorhanden waren. Die
graue Substanz schien in fast allen Versuchstieren deutlich atrophiert. Gelegentlich war
von der grauen Substanz nur noch ein kleiner Rand zu sehen. Dieser lag ventral am
Übergang zur weißen Substanz und enthielt wenige Neurone. Der Rest der grauen
Substanz war bei diesem hohen Schädigungsgrad ausgefüllt mit Narbengewebe,
welches sich in einigen Fällen beim Anfertigen der Schnitte herausgelöst hatte und
daher im mikroskopischen Bild als Loch erschien (Abbildung 13c). Die Morphologie
der überlebenden Motoneurone erschien in den Klüver-Barrera Färbung normal im
Vergleich zu Motoneuronen der Gegenseite.
Verletzungsbedingte morphologische Veränderungen im Hinterhorn sind in Abbildung
28 beispielhaft dargestellt. Wie für die Veränderung im Vorderhorn zeigten sich im
Hinterhorn der verletzten Seiten extrem unterschiedliche morphologische
Veränderungen. Diese reichten von nahezu normaler Anordnung der Laminae und
moderaten Veränderungen des posterioren, posterolateralen und lateralen Trakts
(Abbildung 28a, b, 29) bis hin zu völliger Zerstörung mit Bildung von Zysten innerhalb
des Hinterhorns und der Hinterhornaustrittszone (Abbildung 28c). Diese
unterschiedlichen Grade der Veränderungen waren wieder in allen experimentellen
Gruppen zu beobachten. Vergleichweise gut erhaltene Hinterhornstrukturen waren in 3
von 7 Tieren der Kontrollgruppe, in 3 von 5 der CNTF-Gruppe, in 4 von 6 der BDNF-
Gruppe und in 5 von 7 der CNTF+BDNF-Gruppe zu finden.
53
Außerhalb des Rückenmarks befand sich an der Replantationsstelle lockeres
Bindegewebe, das sich nach dorsal bis hin zur ursprünglichen Hinterwurzeleintrittszone
erstreckte. Beobachtungen zu dieser extraspinalen Narbenbildung werden bei den
Analysen der Reaktion der durchtrennten Hinterwurzeln beschrieben (siehe unten).
Intraspinale Narbenausdehnung um die Replantationsstelle im Segment C7
Die Ausdehnung der Narbe, die durch die ventrolaterale Replantation entstanden war,
konnte in den Querschnitten gut abgegrenzt werden und damit errechnet werden. Das
Ausmaß der Narbe lag im Bereich zwischen 1,4 mm (Tier 81; Kombinationsgruppe)
und 3,5 mm (Tier 65; CNTF-Gruppe). Die mittlere Ausdehnung der Narbe betrug
2,4±0,5 mm. Es waren wieder deutliche interindividuelle Unterschiede vorhanden.
Gruppenspezifische Unterschiede bezüglich der Narbenbildung waren nicht zu
beobachten.
Anzahl überlebender Motoneurone nach 6 Monaten
Der Mittelwert der Anzahl von Neuronen im gezählten Bereich lag auf den gesunden
Seiten zwischen 690 (BDNF-Gruppe) und 789 (CNTF-Gruppe) und zeigte im
interindividuellen Vergleich und im Vergleich zwischen den einzelnen
Versuchsgruppen keine großen Schwankungen. Ein Tier der BDNF-Gruppe mit sehr
starkem Verletzungsausmaß kontralateral hatte mit 481 Neuronen eine reduzierte
Anzahl Nervenzellen. Die Auswertung anderer Tiere mit ähnlichem kontralateralem
Verletzungsausmaß zeigte jedoch, dass eine Reduktion von Neuronen nicht mit dem
Ausmaß der kontralateralen Verletzung korreliert.
Abbildung 16: Regressionsanalyse des Zu-sammenhangs zwischen Verletzungsausmaß und Überlebensrate (Grad 1-4) der Motoneurone des verletzten Segments C7 in den einzelnen experimentellen Gruppen. Es zeigt sich tendenziell, dass bei höherem Verletzungsausmass weniger Neurone überleben.
54
Die mittlere Anzahl der Neuronen auf den verletzten Seiten zeigte ebenfalls wenig
interindividuelle Unterschiede und fast keine Unterschiede zwischen den einzelnen
Versuchsgruppen. Die Mittelwerte der Anzahl der Nervenzellen lagen im Bereich
zwischen 191± 90 (Kombinationsgruppe) und 235 ± 106 (Kontrollgruppe). Die
Überlebensrate der Neuronen im Vorderhorn lag nach sechs Monaten im Bereich von
30%±11 (Kontrollgruppe), 29%±10 (CNTF-Gruppe), 33%±11 (BDNF-Gruppe),
27%±12 (CNTF+BDNF-Gruppe). Es existierten keine statistisch signifikanten
Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen (Tabelle 4). Ein Vorteil für das Überleben
von Motoneuronen, der durch die Applikation neurotropher Faktoren entstanden sein
könnte war daher nicht erkennbar.
Allgemeine morphologische Beobachtungen an den Regenerationswegen auswachsender Axone
Die Kontinuität von Axonen zwischen Rückenmark und Vorderwurzelquerschnitt in
Höhe des Spinalganglions konnte in der fluoreszenzmikroskopischen Analyse
nachgewiesen werden. DiI diffundierte in den meisten Fällen auf verschiedenen Wegen
durch die replantierte und die durchtrennte Hinterwurzel (Abbidung 17, gesunde Seite
Abbildung 14). Bei sechs Tieren konnte keine Diffusion von DiI beobachtet werden.
Tabelle 4: Mittelwerte ± SEM von Anzahl der Neurone im gezählten Bereich mit dem prozentualen Anteil überlebender Neurone in den verschiedenen Versuchgruppen. Die Anzahl der Neurone ist auf den replantierten Seiten reduziert. Zwischen den experimentellen Gruppen existieren keine signifikanten Untschiede
55
Dies war wahrscheinlich durch fehlerhafte Lage der DiI Kristalle während der
Inkubationszeit bedingt.
Die genaue Analyse der Regenerationswege erfolgte durch lichtmikroskopische Analyse
der Markscheidenfärbung. Die myelinisierten Axone benutzen im Allgemeinen zwei
Wege, um vom Vorderhorn zur replantierten Vorderwurzel zu gelangen. Auf der Höhe
des Segments, auf der zahlreiche Motoneurone zu sehen waren, konnte man feststellen,
dass Axone ventral ausgewachsen waren und damit die replantierte Vorderwurzel über
die physiologische Austrittszone erreichen (Abbildung 17a-c). Bei diesem
Regenerationsweg benutzen Axone zum Teil die erhaltenen intramedullären Straßen. Es
konnten regelmäßig Motoneurone in der Nähe des Beginns der intramedullären Straßen
beobachtet werden. Diese Motoneurone waren in einigen Fällen mit DiI gefärbt, was die
direkte Kontinuität zwischen regeneriertem Axon und Motoneuron beweist. In den
meisten Fällen konnte- analog zur unverletzten Seite- nur sehr schwache Fluoreszenz
intramedullär gefunden werden. In Fällen, in denen die Vorderwurzel ventral nahe der
physiologischen Austrittsstelle zu liegen kam zeigte sich in den Markscheidenfärbungen
die direkte Kontinuität ventral austretender, oft großkalibriger Axone in die replantierte
Abbildung 17: Austritte regenerierter Axone über die ventrale physiologische Austrittszone. (a) Die Markscheidenfärbung zeigt, wie zahlreiche Axone großen Kalibers das Rückenmark verlassen. In der Vergrößerung ist die Transitionszone zwischen zentralem und peripherem Nervensystem zu sehen. (b) DiI-Fluoreszenz zeigt, wie die intramedullären Straßen einen Weg für ventral austretetende Axone bilden und in (c) kann man ebenfalls in DiI- Fluoreszenz die Kontinuität eines Axons vom Neuron in die Peripherie verfolgen; Maßstab: (a) 50 µm; (b) 10 µm, (c) 100 µm.
56
Vorderwurzel. Eine Gruppe ventral austretender Axone schien nach ihrem Austritt nach
rostral oder kaudal entlang der Pia mater zu verlaufen. Diese Axone fanden schließlich
nahe der lateralen Replantationsstelle Anschluß an die replantierte Vorderwurzel und
zogen dann in dieser in Richtung des Spinalnerven (Abbildung 19). Es konnten
großkalibrige und kleinkalibrige Axone beobachtet werden, die innerhalb der
replantierten Vorderwurzeln 180°-Wendungen zeigten (Pfeilspitzen in Abbildung 19).
Analyse der Serienschnitte vermittelte den Eindruck, dass diese Axone direkt aus der
ventralen Austrittszone in die daran anliegende replantierte Vorderwurzel in Richtung
der lateralen Replantationsstelle gewachsen waren und dann einen scharfen
Richtungswechsel nach ventral in die Peripherie vollzogen. Bei diesem Verhalten der
Axone handelt es sich interessanterweise um eine initial falsche Richtung der
Regeneration. Die Anzahl solcher Axone war relativ hoch, selbst in Tieren, die ein
relativ geringes Motoneuronüberleben auf Höhe der Replantationsstelle zeigten.
Der zweite Weg, den regenerierende Axone nahmen, ging vom Vorderhorn nach lateral
durch die weiße Substanz zur lateralen Replantationsstelle (Abbildung 17). Die
Kontinuität der lateral austretenden Axone in die Vorderwurzel auf Höhe des
Spinalganglions hinein konnte bei Analyse der markscheidengefärbten Serienschnitte
beobachtet werden. In nur 2 Fällen waren Axone zu erkennen, die direkt durch die
weiße Substanz vom Vorderhorn zur lateralen Replantationsstelle gewachsen waren
(Abbildung 17a). In 13 Fällen konnten DiI-markierte Bündel von Axonen an der
Abbildung 18: Darstellung des lateralen Austritts regenerierter Axone in Richtung der ventrolateral replantierten Vorderwurzel in Markscheidenfärbung (a) und DiI-Fluoreszenz (b) etwa auf Höhe der Replantationsstelle. Oberhalb und unterhalb der Replantionsstelle kann man quergetroffene Axone in DiI-Fluoreszenz beobachten (c). Diese Axone wandern rostral oder kaudal entlang der Pia mater, um sich dann der replantierten Vorderwurzel anzuschließen. Maßstab: 50 µm
57
lateralen Replantationsstelle beorbachtet werden (Abbildung 17b), deren intraspinaler
Verlauf allerdings in den transversalen Cryostatschnitten nicht beurteilbar war. In 8
dieser Fälle konnten DiI-markierte quergeschnitttene Axone mehr kranial bzw. kaudal
der Replantationsstelle nachgewiesen werden (Abbildung 17c). Dies legt nahe, dass
diese Axone, nachdem sie beispielsweise aus der ventralen Austrittszone ausgetreten
waren, in der weißen Substanz bzw. an deren Oberfläche nach oben oder unten
gewachsen waren und dann Anschluß an die lateral replantierte Vorderwurzel gefunden
hatten.
Da regenerierende Axone oft in dichten Bündeln verliefen, in denen einzelne Fasern
nicht identifiziert werden konnten, war eine Zählung der austretenden Axone nicht
möglich. Deshalb wurde eine quantitative Analyse über Unterschiede zwischen den
verschiedenen experimentellen Gruppen über das jeweilige Ausmaß ventral oder lateral
austretender Axone nicht durchgeführt. Folgende Feststellungen waren im vorliegenden
Material möglich:
1. Der Austritt lateraler Axone fand am häufigsten auf mittlerer Höhe des Segments,
also etwa auf Höhe der Replantationsstelle statt. Die Zahl lateral austretender
myelinisierter Axone schien größer bei Tieren mit starker Narbenbildung, obwohl die
Zahl der Motoneurone bei großer Narbe stark reduziert war. Daraus kann man
schließen, dass der größte Teil dieser Axone von Neuronen stammte, die oberhalb oder
unterhalb dieser Stelle lagen. Lediglich bei einem Tier der Kombinationsgruppe
(CNTF+BDNF) konnten keine lateralen Austritte beobachtet werden. Dieses Tier zeigte
einen riesigen zentralnervösen Defekt an der Replantationsstelle.
2. Ventral austretende Axone waren häufiger oberhalb oder unterhalb der
Replantationsstelle zu beobachten. Diese Axone erschienen besonders zahlreich bei
denjenigen Tieren, bei denen die Replantation nahe der physiologischen
Vorderwurzelaustrittsstelle stattgefunden hatte und bei denjenigen Tieren, bei denen die
Vorderwurzel in ihrem Verlauf an der physiologischen Austrittsstelle zu liegen kam.
Die mikroskopische Beobachtung der Schnitte vermittelte den Eindruck, dass
Unterschiede dieser Parameter nicht durch Applikation neurotropher Faktoren
beeinflusst werden, sondern eher auf die morphologischen Variationen bzw.
unterschiedlichen Erhaltungs- und Regenerationszustände des Rückenmarks
zurückzuführen sind.
58
Abbildung 19: Darstellung verschiedener Axonverläufe innerhalb eines Tieres in Markscheidenfärbung. (a) und (b) zeigen den Austritt zahlreicher Axone ventral an der physiologischen Austrittsstelle der Axone und lateral an der Replantationsstelle. (c) zeigt den Austritt großkalibriger Axone ventral (weißer Pfeil); Kontinuität der Axone außerhalb des Rückenmarks (Doppelpfeilspitzen) und ein Axon das zunächst nach dorsal wandert, direktes Einwachen in die Vorderwurzel (2 Pfeile in d) und im U-turn in die Vorderwurzel einwandernde Axone (schwarzer Pfeil) in (c) und (d). Maßstab: 50 µm
59
Morphologische Unterschiede zwischen ventral und lateral austretenden Axonen
Der morphologische Vergleich zwischen ventral und lateral austretenden Axonen
vermittelte den Eindruck, dass ventral austretende Axone größere Durchmessser haben
als lateral austretende. Aus diesem Grund wurden bei einigen Tieren, bei denen eine
solche Messung möglich war, ein morphometrischer Vergleich zwischen ventral und
lateral austretetenden Axonen vorgenommen.
Die Messung wurde insgesamt an neun Tieren durchgeführt. Der Durchmesser ventral
austretender Axone lag im Bereich zwischen 3,0 ±1,2 µm und 5,1 ±1,8µm. Der
Durchmesser lateral austretetender Axone lag im Bereich zwischen 1,9±0,8µm und 3,6
±1,7 µm. Der intraindividuelle Vergleich bei den einzelnen Tieren zeigte, dass der
Mittelwert des Durchmessers ventral austretender Axone in allen Fällen größer war, als
der Mittelwert des Durchmessers lateral austretetender Axone. Um den Durchmesser
der regenerierten Axone mit dem normaler, unverletzter Axone vergleichen zu können,
wurden bei mehreren Tieren Messungen von Vorderwurzelaxonen auf der unverletzten
Seite durchgeführt. Das Ergebnis dieser Messungen zeigte, dass unverletzte
Vorderwurzelaxone einen mittleren Durchmesser von 4,9±1,0 haben.Ventral
Tabelle 5: Mittelwerte±SEM von Durchmessern [µm] ventral und lateral austretender Axone der replantierten Seiten (Spalten 3 und 4) und unverletzter Vorderwurzelaxone (Spalte 2) im Vergleich. Signitfikante Unterschiede mit p<0,05*; p<0,01**; p<0,001***; alle verglichen mit ventral austretenden Axonen der replantierten Seiten.
60
austretetende regenerierte Axone sind also den unverletzten Vorderwurzelaxonen
ähnlicher als lateral austretende. Dies legt nahe, dass es sich bei den ventral
austretenden Axonen möglicherweise um primäre Axonsprouts der überlebenden
Motoneurone handelt, während lateral austretende Axone in der Mehrzahl Kollateralen
dieser Neurone sein könnten. Der Unterschied des Axondurchmessers zwischen ventral
und lateral austretetenden Axonen ist bei allen, außer einem Tier (siehe Tabelle)
statistisch signifikant unterschiedlich.
Morphologie der Vorderwurzel C7
Gesunde, nicht replantierte Seiten
Im transversalen touluidinblaugefärbten Semidünnschnitt lag die Vorderwurzel dem
Spinalganglion halbmondförmig an. Die Vorderwurzel war vom Spinalganglion
deutlich durch Bindegewebe, Epineurium, abgegrenzt und wies in den meisten Fällen
eine Dreiteilung in einen medianen und zwei laterale ebenfalls durch bindegewebige
Septen voneinander abgegrenzte Teile auf. Diesen bindegewebigen Abgrenzungen lag
ein größeres Blutgefäß an.
Quergetroffene runde bis polygonale, gleichmäßig dick myelinisierte Axone
unterschiedlichen Durchmessers füllten die gesamte Vorderwurzel aus. Endoneurales
Bindegewebe war gering ausgeprägt, nicht myelinisierte Axone waren selten.
Vergleich zwischen den Gruppen; Besonderheiten
Die Morphologie von Vorderwurzeln der unverletzten Seiten war bei allen
Versuchstieren sehr ähnlich. In diesen Präparaten war nicht zu beurteilen, ob und in
welcher Weise die gesunden Seiten auf den kontralateralen Vorderwurzelausriß reagiert
haben.
Abbildung 20: (nächste Seite) Semidünnschnitte der unverletzten Seite (a,b,c) sowie der verletzten Seite drei Wochen (e,f) und sechs Monate nach Replantation ohne Applikation von neurotrophen Faktoren (d,g,h) und sechs Monate nach Replantation. Semidünnschnitte durch Vorderwurzeln und Spinalganglien der unverletzten Replantation und Behandlung mit neurotrophen Faktoren (i-n). Maßstab: 500 µm für (a,e,g,i,k,m); 50 µm für( b,c,d, f, h, j, l, n).
61
62
Replantierte Seiten
Überraschenderweise waren die Form und die bindegewebige Hülle der Vorderwurzel
auf der replantierten Seite relativ unverändert. Drei Wochen nach Vorderwurzelausriss
und anschließender Replantation waren die Nervenfasern der Vorderwurzel fast
komplett degeneriert (Abbildung 20e,f). Die Vorderwurzel bestand aus dichtem, gut
kapillarisiertem Gewebe mit vielen Zellen, wahrscheinlich verschiedenen Typen von
Gliazellen und endoneuralen Makrophagen. Vielfach waren
Myelindegradationsprodukte (Myelinovoide) sichtbar. Wenige kleine myelinisierte
Axone schienen erhalten.
Nach 6 Monaten war in allen Präparaten ausgeprägte Regeneration zu beobachten:
Viele Axone von geringem Durchmesser standen mehr oder weniger dicht in
verschiedenen Abschnitten der Voderwurzel. Große Axone waren vorhanden, aber weit
seltener als auf der unverletzten Seite. Nach sechs Monaten fand sich wie nach drei
Wochen zwischen den Axonen vermehrt Bindegewebe sowie eine höhere
Kapillardichte. Die Remyelinisierung der eingesprossten Axone schien in
bemerkenswertem Umfang stattgefunden zu haben, nicht myelinisierte Axone waren
außerordentlich selten Zahl und Dichte regenerierter Axone waren interindividuell
verschieden. Deutliche Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen waren qualitativ
nicht fassbar. Die Flächen der Vorderwurzeln erschienen im Vergleich zu den gesunden
Seiten kleiner.
Quantitative Analysen
Gesamtflächen der Vorderwurzeln
Die Flächen der replantierten Vorderwurzeln waren im Vergleich zu den gesunden
Vorderwurzeln um etwa ein Drittel reduziert. Die Vorderwurzelflächen auf den
unverletzten Seiten lagen zwischen 0,38±0,04 mm² (CNTF) und 0,50±0,03 mm²
(Kontrolle), auf den verletzten Seiten zwischen 0,24±0,02 (CNTF) und 0,33±0,05
(BDNF). Signifikante Unterschiede zwischen den verschiedenen exerimentellen
Gruppen existierten weder auf den gesunden noch auf den replantierten Seiten. Die
Vorderwurzelflächen der CNTF-Gruppe waren im Vergleich zu den unverletzten Seiten
signifikant reduziert (p<0,02). Die anderen Gruppen zeigten keinen Unterschied im
Vergleich zu den unverletzten Seiten (Tabelle 6).
63
Axonzahlen der Vorderwurzeln
Auf den unverletzten Seiten lag die Zahl der Axone zwischen 1414-3255 und zeigte
damit eine große interindivuelle Schwankungsbreite. Zwischen den experimentellen
Gruppen existierten keine signifikanten Unterschiede. Aus diesem Grund wurden die
unverletzten Seiten für die weiteren Vergleiche zusammen dargestellt. Drei Wochen
nach Ausriss und Replantation der Vorderwurzel war die Anzahl der Axone (zwischen
31 und 64) auf 0,02% im Vergleich zu den unverletzten Seiten signifikant reduziert
(p<0,001). Sechs Monate nach Ausriss und Replantation der Vorderwurzel zeigten sich
ebenfalls große interindividuelle Unterschiede (zwischen 407 und 1847).
Im Vergleich zur Situation nach drei Wochen war die Anzahl der Axone signifikant
erhöht (p<0,007). Im Vergleich zu den unverletzten Seiten war sie jedoch immer noch
signifikant reduziert (Kontrolle 52,40%, CNTF 38,88%, BDNF 44,45% und
Tabelle 6: Mittelwerte der Vorderwurzelflächen [mm²]±SEM und die prozentuale Reduktion der Flächen im Vergleich mit den unverletzten Seiten. (* p<0,02)
Abbildung 21: Axonzahlen der Vorderwurzeln der verschiedenen Versuchsgruppen. (*** signifikanter Unterschied p<0,001 im Vergleich mit den unverletzten Seiten; ** signifikanter Unterschied p<0,001 im Vergleich mit den unverletzten Seiten; + signifikanter Unterschied p<0,007 im Vergleich zwischen der Situation nach 3 Wochen und 6 Monaten
64
CNTF+BDNF 46,05%; p≤0,001). Signifikante Unterschiede zwischen den
experimentellen Gruppen nach sechs Monaten waren nicht vorhanden (Abbildung 21)
Analyse von Axonflächen der Vorderwurzel
Die Analyse der im Schnitt quergetroffenen myelinisierten Axone der Vorderwurzel
fand den „Regions of interest“ (ROIs) statt (genaue Beschreibung siehe Material und
Methoden). Dabei erschien die Bestimmung der Flächen der Axone statt der
Durchmesser besser geeignet, da einige Axone in den Querschnitten eine eher
quadratische oder vieleckige als runde Form hatten (siehe auch Abbildung 20). Die
Histogramme der Axonflächen der unverletzten Seiten zeigten in allen Gruppen eine
ähnliche Größenverteilung und keine signifikanten Unterschiede zwischen den
Gruppen. Daher wurden die unverletzten Seiten in den Histogrammen zusammen
aufgetragen. Es zeigte sich eine Kurve, aus der ersichtlich war, dass eine große
Axonpopulation eine Querschnittsfläche zwischen 15 und 20 µm² aufwies, sowie
weitere kleinere Populationen bei einer Querschnittsfläche über 35 µm² zu sehen waren
(Abbildung 22).
Abbildung 22: Histogramme der Axonflächen der Vorderwurzeln der unverletzten und der replantierten Seiten im Vergleich. Auf der Abszisse sind die Axonflächen [µm²] auf der Ordinate der Mittelwert des relativen Anteils Axone (%)±%SEM aufgetragen.
65
Die Histogramme der replantierten Seiten zeigten ein verändertes Bild. In allen Gruppen war der Großteil der Axone im Bereich zwischen 5-10 µm² zu finden. Im Bereich größerer Axone war die Kurve im Histogramm flach, was darauf hinwies, das sich in den replantierten Vorderwurzel nur wenig große Axone befanden. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung zeigte sich, dass große Axone (≥35 µm2) einen Anteil von etwa 45% (alle unverletzten 44,9±4,1%) ausmachten, während der Anteil der großen Axone auf den replantierten Seiten weniger als 14% aller analysierten Axone betrug (Kontrolle 13,5±3,02%; CNTF 9,8±7,4%; BDNF 12,8±7,41%; CNTF+BDNF 6,5 ±4,85%; Angabe jeweils als Mittelwert±SEM). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht feststellbar.
Axon-Myelinverhältnis
Die Betrachtung der Darstellung des Axon-Myelinverhältnisses aller Axone auf der
unverletzten Seite der Kontrolltiere (nicht dargestellt) zeigte, dass die Fläche der
Myelinscheide mit steigender Axonfläche ebenfalls stieg, allerdings in einer nicht
linearen Beziehung. Getrennte Berechnung und Auftragung von Regressionsgeraden für
kleine (<35 µm²) und große (≥35 µm²) Axone ergab unterschiedliche Steigungen beider
Geraden. (Abbildung 23). Darstellung der Regressionsgeraden aus Analysen
unverletzter Vorderwurzelaxone aller Versuchsgruppen bestätigten die Beobachtung,
dass die Zunahme der Fläche der Myelinscheide bei großflächigen Axonen weniger
stark war als bei kleinflächigen Axonen (Abbildung 24).
Abbildung 23: Regressionsgeraden des Axon Myelinverhältnisses von Axonen <35µm² und > 35 µm² von Kontrolltieren in einem Diagramm aufgetragen. Die Darstellung zeigt für die kleineren Axone einen steileren Anstieg der Regressionsgeraden als für die größeren Axone. Insgesamt ist dieser Anstieg nicht linear.
66
67
Die Regressionsgeraden für beide Axonpopulationen in den verschiedenen
Versuchgruppen sahen für die unverletzten Seiten bei kleinen Axonen sehr ähnlich aus.
Bei großen Axonen ergaben sich geringfügig stärkere Steigungen der Geraden bei
Tieren der BDNF- und Kombinationsgruppen als bei CNTF-behandelten und
Kontrolltieren. Auftragungen von Messungen an Axonen der replantierten Seiten der
Kontrollgruppe zeigten durchschnittlich schlechtere Myelinisierung der Axone der
verletzten Seite mit einem deutlichen Abstand zwischen den berechneten
Regressionsgeraden (Abbildung 23). Regressionsgeraden berechnet für Axon-
Myelinverhältnisse bei den faktorbehandelten Tieren wiesen keine eindeutige Tendenz
zur Verbesserung der Myelinisierung bei BDNF- und CNTF-behandelten Tieren auf
(Abbildung 24). Die Kombinationsgruppe dagegen zeigte nahezu eine Angleichung der
Myelinisierung der regenerierten im Vergleich zu den unverletzten Axonen (Abbildung
24).
Um die statistische Signifikanz von Veränderungen der Myelinisierung zu analysieren,
wurden Vergleiche der mittleren Dicke der Myelinscheide von Axonen definierter
Größe ausschließlich aus den ROIs angestellt (siehe Material und Methoden). Die
Mittelwerte der Flächen der Myelinscheiden der unverletzten Seiten in den
Größenklassen zeigten keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen
Gruppen. Daher wurden sie für die weiteren Analysen zusammengefasst (Tabelle 7,
Abbildung 25„alle unverletzten“).
Abbildung 24: (vorherige Seite) Regressionsgeraden aller Versuchsgruppen und Axonpopulationen zur Darstellung der Myelinisierung inidividueller Axone. Auf der Abszisse sind die Axonflächen aufgetragen; auf der Ordinate die Flächen der zughörigen Myelinscheiden. Es sind jeweils die Regressionsgeraden kleiner(<35µm²) und großer Axone (>35 µm²) getrennt dargestellt. Kontrolle: dunkelblau unverletzte/hellblau regenerierte Axone; CNTF: gelb unverletzte/rosa regenerierte Axone; BDNF dunkelgrün unverletzte/hellgrün regenerierierte Axone; CNTF+BDNF rot unverletzte/orange regenerierte Axone.
Tabelle 7: P-Werte ermittelt aus dem statistischen Vergleich der Flächen der Myelinscheide in den einzelnen Axonpopulationen. Details siehe Text.
68
Die Flächen der Myelinscheiden der replantierten Seiten waren in allen Größenklassen
signifikant kleiner als die der unverletzten Seiten. Die Myelinflächen regenerierter
Axone der CNTF-Gruppe und der BDNF-Gruppe waren zwar immer noch deutlich
reduziert, jedoch erreichte dieser Unterschied nur in einer Grössenklasse der CNTF-
Gruppe Signifikanz. Nur in dieser Grössenklasse bestanden darüberhinaus auch
signifikante Unterschiede in der Myelinisierung regenerierter Axone zwischen der
Kontrollgruppe und der CNTF- und BDNF-Gruppe. Regenerierte Axone der
CNTF+BDNF-Gruppe zeigten in allen Grössenklassen die geringste Reduktion der
Myelinflächen im Vergleich zu den unverletzten Seiten, und in der Mehrzahl der Axon-
Grössenklassen waren die Flächen der Myelinscheiden der regenerierten Axone in der
Kombinationsgruppe signifikant größer als in der Kontrollgruppe (Tabelle 7;
Abbbildung 25).
Abbildung 25: Graphische Darstellung der stastischen Analyse zeigt die Axonflächen [µm²] (Abszisse) gegen die Mittelwerte±SEM der Flächen der Myelinscheiden. Details werden im Text beschrieben.
69
Veränderungen in der rhizotomierten Hinterwurzel und im Spinalganglion
Veränderungen im zentralen Rest der C7 Hinterwurzel
Außerhalb des Rückenmarks umgab lockeres Bindegewebe die Replantationsstelle der
Vorderwurzel (siehe oben) und reichte bis an die Hinterwurzeleintrittszone (Abbildung
26a,c). In allen Tieren konnte man zahlreiche Sudanschwarz-gefärbte Nervenfasern
sehen, die ausgehend vom Spinalganglion nach dorsal verliefen (Abbildung 26a,c;
Details siehe unten). Die regenerierten Hinterwurzelaxone waren immer von peripherem
lockerem Bindegewebe eingehüllt. Eine Verbindung zur ursprünglichen
Hinterwurzeleintrittszone bestand in keinem Fall, was die erfolgreiche komplette
Durchtrennung der Hinterwurzeln des Segments C7 während der Operation beweist
(Fig. 26a, c) (Carlstedt, 1997).
Eine allgemeine Beschreibung der Morphologie des Hinterhorns findet sich oben.
Analog zu den Veränderungen im Vorderhorn zeigten sich die größten Veränderungen
im Hinterhorn etwa in der Mitte des Segments C7 und waren nach rostral und caudal
ausgedehnt. In 14 Tieren (Kontrolle: 3, CTNF: 3, BDNF: 2, CNTF+BDNF: 6) konnten
an der ursprünglichen Hinterwurzeleintrittszone kleine konische Gewebsprotrusionen
beobachtet werden. Dies war der Fall bei Tieren, deren Hinterhorn gut erhalten war, nur
bei zwei von diesen Tieren zeigte sich eine ausgeprägtere Zerstörung des Hinterhorns
(Abbildung 27a-c). In diesen Gewebsprotrusionen konnten zahlreiche dünne Axone
beobachtet werden.
Die Analyse von Serienschnitten zeigte, dass viele dieser dünnen Axone in Kontinuität
mit tieferen Schichten des Hinterhorns oder mit dem medialen Anteil des lateralen
Trakts standen. In einigen Fällen reichten diese Axone relativ weit nach peripher, ohne
zurück Richtung Hinterwurzeleintrittszone zu drehen. Eine spontane Wiederherstellung
der Kontinuität mit der durchtrennten Hinterwurzel wurde in keinem Fall beobachtet.
In den rostralen und caudalen Anteilen des Segments waren extraspinal zahlreiche dick
myelinisierte Axone in Verbindung mit der Hinterwurzeleintrittszone zu beobachten.
Diese Axone bildeten Bündel im Subarachnoidalraum und zeigten in der Untersuchung
der Serienschnitte kompliziert gewundene Verläufe (Abbildung 27d). Diese
Axonbündel hatten eine deutlich andere Morphologie, als die Axonbündel der
Hinterwurzel der unverletzten Seiten (Abbildung 26a,b, 27a). Die tiefschwarze Färbung
70
ihrer Myelinscheide war jedoch vergleichbar mit der peripheren Myelinscheide der
unverletzten Hinterwurzelaxone (Fig. 27a, d).
Abbildung 26: (a) Markscheidenfärbung eines Rückenmarks mit minimalen Veränderungen, regenerierter Vorderwurzel und Hinterwurzelstumpf. Das lockere Bindegewebe um die Replantationsstelle erstreckt sich bis zur ehemaligen Hinterwurzeleintrittszone. (b) Morphologie der unverletzten Nervenwurzeln und der Rückenmarkshüllen. Vorder- und Hinterwurzeln werden von dünnen Hüllen eingescheidet. Diese Hüllen stehen in Kontinuität mit der Pia mater des Rückenmarks, was besonders gut an der Hinterwurzel (Pfeile) nachzuvollziehen ist. Eine dickere Hülle, die der Dura mater ähnelt ist zwischen distaler Vorderwurze, Spinalganglion und der Hinterwurzel zu sehen, welche die beiden Nervenwurzeln komplett trennt (größere Pfeile in a und b). (c) zeigt ein Schnitt durch eine verletzte Seite mit schwerem Rückenmarkschaden und Zystenbildung. Maßstab: 500 µm.
71
Abbildung 27: (a) Markscheidenfärbung eines Schnitts, der die Hinterwurzeleintrittszone mit eintretenden Hinterwurzelaxonen auf der unverletzten Seite, und auf der verletzten Seite die kleine konischen Gewebsprotrusion der Hinterwurzeleintrittszone zeigt. Die Vergrößerung im Inset zeigt die PNS-ZNS-Übergangszone in höherer Vergrößerung. Es zeigt sich eine dunklere Färbung der PNS-Markscheiden. (b-d) zeigen die verletzten Hinterhörner und Hinterwurzeleintrittszonen bei verschiedenen Tieren. (b) Dünne myelinisierte Axone nehmen den Weg vom Hinterhorn in die Gewebsprotrusionen. Der Pfeil in b zeigt auf myelinisierte Axone, die vom medialen Anteil des lateralen Trakts in die Protrusionen verfolgt werden können. Zahlreiche myelinisierte Axone ohne offensichtliche Kontiniutät zum Rückenmark sind im Umfeld der Protrusionen im Subarachnoidalraum lokalisiert (Pfeilköpfe in 2) (c) bei einigen Tieren erichen dünne myelinisierte Axoneweit nach peripher in die Protrusionen hinein d) rostral und kaudal im Segment sieht man, wie zahlreiche myelinisierte Axone über die Hinterwurzeleintrittszone in den Subarachnoidalraum gelangen. Dort bilden sie Bündel, deren Anfärbung den peripheren Myelinscheiden der unverletzten Seiten ähnelt. Maßstab: 500 µm in (a), 50 µm in (b-d).
72
Morphologie des C7 Spinalganglions
Auf den unverletzten Seiten waren in der Peripherie des Spinalganglions in einer
kompakten Schicht mehrere Zellkörper der pseudounipolaren Neurone angeordnet. Das
Zentrum des Spinalganglions wurde durch Faserbündel eingenommen, die durch
Gruppen von dichtstehenden Neuronen unterbrochen waren. (Abbildung 28 a,c). Die
Anordnung der Neurone in Gruppen und die Faserzüge der Axone erschien in den
verletzten Spinalganglien gelegentlich zwar weniger dicht, aber im Wesentlichen nicht
verändert (Abbildung 28 b,d).
73
Abbildung 28: (siehe vorherige Seite) Klüver-Barrera-gefärbte Kryostat (a-b) und Semidünnschnitte (c-f) von Spinalganglien auf der unverletzten (a,c,e) und verletzten Seiten in Tieren der Kontrollgruppe (b,d,f). Die Struktur innerhalb des Spinalganglions scheint auf den verletzten Seiten nur wenig verändert (b). (c-f). Die Semidünnschnitte zeigen vergleichweise unveränderte Anordnung und Morphologie der Neurone in den verletzten Spinalganglien (d,f). Der Pfeil in (f) zeigt auf einen Axonursprungshügel. Die Dichte und Größe der quergeschnittenen Axone scheint an einigen Stellen innerhalb der verletzten Spinalganglien reduziert (d,f). Maßstab: 500 µm (a-d); 50
( f)
Neurone in den Spinalganglien
Alle Neurone der verletzten Seiten besaßen eine vollkommen normale Morphologie mit
runden Zellkörpern, zentral gelegenen Zellkernen und klar abgrenzbaren Nucleoli,
deutlich erkennbarer Nisslsubstanz und Axonursprungshügeln (Abbildung 28f). Die
Bestimmung der Axonzahlen in definierten Regionen zeigte keine signifikanten
Unterschiede zwischen unverletzten und verletzten Seiten (Tabelle 8). Histogramme der
relativen Neuronflächenverteilungen wiesen einen großen Gipfel bei einer Neuronfläche
von etwa 1500 µm2 und einen kleineren Gipfel bei ungefähr 3000 µm2 auf (Abbildung
29a). Die Histogramme der verletzten Seiten zeigten gleiche Größenverteilungen der
Neuronflächen (Abbildung 29a-e). Große Neurone mit Flächen über 2500 µm2 hatten
einen Anteil von etwa 20% aller Spinalganglien-Neurone auf den unverletzten Seiten
(61 von 301 analysierten Neuronen) und auf den verletzten Seiten von etwa 15,5% aller
Neurone (34 von 219 Neuronen). Die Histogramme aller Neuronflächen der verletzten
Seiten in den verschiedenen experimentellen Gruppen zeigten einen verminderten
relativen Anteil von großen Neuronen in allen experimentellen Gruppen mit Ausnahme
der CNTF+BDNF-Gruppe (Abbildung 29). Dieser Unterschied war jedoch nicht
statistisch signifikant.
Tabelle 8: Übersichtstabelle zu den verschiedenen gemessenen Parametern, die im Text erläutert werden. Signifikant unterschiedlich sind in der letzten Zeile folgende gegeneinander getesteten Gruppen: Alle gesunden gegen alle verletzten p≤0,003, alle gesunden gegen Kontrolle verletzt p≤0,001, alle gesunden gegen CNTF verletzt p≤0,017, Kontrolle verletzt gegen BDNF verletzt, p≤0,015,Kontrolle verletzt gegen CNTF+BDNF-Gruppe 0,014. (* p≤0,003, **p≤0,001, + p≤0,017, ++ p≤0,015, # p≤ 0,014)
74
Axone in den Spinalganglien
Nicht-myelinisierte kleine Axone und myelinisierte Axone verschiedener Größen waren
in den Axonbündeln innerhalb des Spinaganglion auf beiden Seiten zu sehen. Die
Abbildung 29: Histogramme der relativen Anteile der Flächen aller Neurone, die auf verletzten und unverletzten Seiten gemessen wurden (a; Mittelwerte± SEM) sowie der Neurone der verletzten Seiten der Kontrollgruppe (b), der CNTF-Gruppe (c), der BDNF-Gruppe (d) und der CNTF+BDNF-Gruppe (e) jeweils gegenüber allen Neuronen der unverletzten Seiten (nur Mittelwerte)
75
Axondichte in einigen Regionen innerhalb der verletzten Seiten der Spinalganglien war
reduziert zugunsten einer Zunahme von Bindegewebe. Die Größenverteilung der Axone
schien eine größere Varianz als auf den unverletzten Seiten aufzuweisen (Abbildung
30d,f). Die quantitative Analyse der Axone war auf die myelinisierten Axone
beschränkt, da die unmyelinisierten Axone in den Semidünnschnitten nicht immer klar
identifiziert werden konnten. Der visuelle Eindruck verminderter Axondichte auf den
verletzten Seiten, konnte durch die Quantifizierung nicht bestägt werden (Tabelle 8).
Histogramme der relativen Verteilung der Flächen myelinisierter Axone zeigten, dass
die Größenverteilung der Axone zwischen verletzten und unverletzten Seiten
unverändert war (Abbildung 30). Der erste Gipfel der Axonpopulationen lag zwischen 5
und 10 µm², der zweite, breitere Gipfel bei einer Axonfläche von 20 bis 30 µm².
Zusätzlich konnten mehrere kleine Gipfel bei Axonflächen über 30 µm² festgestellt
werden. Der prozentuale Anteil der kleinsten Axone (bis 5 µm²) war auf den verletzten
Seiten signifikant höher als in den unverletzten Spinalganglien (Tabelle 8). Beim
Vergleich der verschiedenen experimtentellen Gruppen zeigte sich, dass in der
Kontrolle und CNTF-Gruppe signifikant mehr der sehr kleinen Axone vorhanden waren
(Abbildung 30, Tabelle 8), während ihre Anzahl bei den BDNF und CNTF+BDNF-
Tieren keine signifikanten Unterschiede zur gesunden Seite aufwiesen.
76
Abbildung 30: Histogramme der relativen Anteile von Axonflächen die auf verletzten und unverletzten Seiten gemessen wurden (a; Mittelwerte± SEM) sowie der Axone der verletzten Seiten der Kontrollgruppe (b), der CNTF-Gruppe (c), der BDNF-Gruppe (d) und der CNTF+BDNF-Gruppe (e) der unverletzten Seiten jeweils gegenüber den Flächen aller Axone der unverletzten Seite (nur Mittelwerte).
77
Verlauf der zentralen sensorischen Fortsätze
Der Weg der myelinisierten Hinterwurzelaxone auf den unverletzten Seiten verlief in
allen Fällen ausgehend vom Spinalganglion direkt in das Rückenmark über die
Hinterwurzeleintrittszone (Abbildung 26a,b). Vorder- und Hinterwurzeln waren auf
ihrem Weg zum Rückenmark deutlich voneinander getrennt. Beide Wurzeln waren
durch eine dünne, aber gut erkennbare Wurzelscheide eingehüllt, die, wie bereits für die
Vorderwurzel beschrieben, in direkter Kontinuität zur Pia mater stand (Kaar and Fraher,
1986). Der proximale Anteil des Spinalganglions und der Ursprung der Hinterwurzel
waren zusätzlich von der Vorderwurzel durch eine Scheide getrennt, die der Dura mater
ähnelt. Ähnliche Verhälntisse sind bereits für menschliche thorakale
Spinalnervenwurzeln beschrieben (Abbildung 26a,b; (ScharfJH, 1958). Ein
gemeinsamer Nervus radicularis wurde nicht beobachtet. Nervenfasern, die
Spinalganglion bzw. Hinterwurzel mit der Vorderwurzel verbinden, wurden auf den
unverletzten Seiten nie festgestellt (Abbildung 26a, b).
Auf den verletzten Seiten war in allen Fällen ein Hinterwurzelstumpf mit zahlreichen
myelinisierten Axonen zu beobachten (Abbildung 13, 32). In allen untersuchten Fällen,
waren die Durchmesser der Axone in diesem Hinterwurzelstumpf signifikant reduziert
im Vergleich zu den unverletzten Seiten (p≤0.001; Tabelle 9).
Die regenerierten myelinisierten Axone traten aus dem Spinalganglion in verschiedenen
Bündeln über die rostrokaudale Ausdehnung des Ganglions verteilt aus. Diese Axone
erreichten in den meisten Fällen eine beachtliche Länge und erstreckten sich nach dorsal
entlang der dorsalen Zirkumferenz des Rückenmarks (Abbildung 26a). Die Axone
Tabelle 9: Mittelwerte der Durchmesser der Hinterwurzelaxone der unverletzten und verletzten Seiten im Vergleich. In allen Fällen sind die Axone der verletzten Seiten signifikant (*p<0,001) kleiner.
78
endeten immer blind, ohne eine Verbindung mit dem Rückenmark zu erreichen
(Abbildung 26a, c, 31a-d). Der Hinterwurzelstumpf, der durch die Axonbündel gebildet
wurde, lag der replantierten Vorderwurzel an und war von einer bindegewebigen Hülle
umgeben (Abbildung 31b-d). Dadurch waren diese Axone von den regnerierten
Vorderwurzelaxonen in der replantierten Vorderwurzel getrennt. Die replantierte
Vorderwurzel hatte keine klar abgrenzbare Einscheidung bis zum Kontaktpunkt mit
dem Spinalganglion. Dort ähnelte die Einscheidung der Dura Mater, wie sie auf der
unverletzten Seite als Abgrenzung zwischen Spinalganglion und Vorderwurzel zu sehen
war (Abbildung 31b, e-g). Die peripheren Hinterwurzelaxone konnten auch in der DiI-
Fluoreszenz mit gleichem Verlauf und Einscheidung beobachtet werden. Auch hier
zeigte sich keinerlei Anschluss an das Hinterhorn.
Bei 13 Tieren (3 aus der Kontrollgruppe, 4 aus der CNTF-Gruppe, 2 aus der BDNF-
Gruppe and 3 aus der CNTF+BDNF-Gruppe) zeigte ein Teil der Axone, die aus den
verletzten Seiten der Spinalganglien austraten, eine scharfen Umschlag nach medial
direkt in Richtung der replantierten Vorderwurzel und des sie umgebenenden
Bindegewebes (Abbildung 31e-k). Eine variable Anzahl der Axone zeigte einen
kompletten Umschlag mit anschließendem Verlauf in Richtung des Spinalnervs. In zwei
dieser Fälle zeigte die Analyse der Makscheidenfärbungen (Abbildung 33e-g) und der
DiI-Fluoreszenz (Abbildung 31h-k), dass Axone aus dem Hinterwurzelstumpf in das
lockere Bindegewebe der Replantationsnarbe eintraten. An dieser Stelle war die
Einscheidung der Hinterwurzel nicht sichtbar. Einige dieser Axone verliefen im
lockeren Bindegewebe nach dorsal und konnten in Serienschnitten außerhalb der Pia
Mater des Rückenmarks weiterverfolgt werden (Abbildung 31f). Eine Kontiuität dieser
Axone in das Rückenmark hinein auf Höhe der Replantationsstelle der Vorderwurzel
oder der ursprünglichen Hinterwurzeleintrittszone wurde in keinem Fall beobachtet.
Einige der in das lockere Bindegwebe der Replantationsstelle eintretenden
Hinterwurzelaxone wendeten sich nach ventral und verliefen mit den regenerierten
Axonen der replantierten Vorderwurzel in Richtung auf den Spinalnerven (Abbildung
31e, g-k).
79
Nach medial/ventral umschlagende Hinterwurzelaxone wurden in allen experimentellen
Gruppen beobachtet. Korrelative Analysen deuteten auf einen Zusammenhang zwischen
dem Vorkommen von Umschlägen und dem Ausmaß der Beschädigung des
Rückenmarks hin (Abbildung 32): Umschläge wurden bei 100% der Tiere mit sehr
schweren Rückenmarksveränderungen (Grad 4), bei 83,3% der Tiere mit schweren
Veränderungen (Grad 3), und in 22.2% bei Tieren mit moderaten Veränderungen des
Abbildung 31: (a) Markscheidenfärbung zeigt Auswachsen von regenerierten Hinterwurzelaxonen aus dem Spinalganglion. (b) Der Stumpf der regenerierten Hinterwurzel steht in engem Kontakt zum Rückenmark und zur Replantationsstelle.(c,d) zeigen diese Stelle in höherer Vergrößerung. Hier zeigt sich deutlich die Trennung der Hinterwurzelaxone von den regenerierten Vorderwurzelaxonen und der Replantationsstelle durch bindegewebige Hüllen. Einige der Hinterwurzelaxone zeigen einen Umschlag nach ventral (kleine Pfeile e,g) und verlaufen weiter nach ventral mit der replantierten Vorderwurzel. Andere Axone drehen nach hinten ohne Verbindung mit dem Rückenmark zu zeigen.(kleine Pfeile in in f). (h-k) Serienschnitte zeigen DiI-Fluoreszenz tracing im Tier, das in (e-g) gezeigt ist. Kleine Pfeile zeigen in diesen Bildern auf Axone, die nach ventral vom Spinalganglion in die regenerierte Vorderwurzel umschlagen. Maßstab: 500 µm in (a,b,g) , 50 µm in (c,d), 250 µm in (e), 150 µm in (f), 100 µm in (h-k).
80
Rückenmarks beobachtet (Grad 2). Bei Grad 1 Veränderungen wurden Axonumschläge
nach ventral nie beobachtet.
Morphologie des Nervus radialis
Gesunde, nicht replantierte Seiten
Der Touluidinblau-gefärbte transversale Schnitt zeigte den Nervus radialis kurz vor
seiner Teilung in den Ramus profundus und in den Ramus superficialis. Er zeigte die
typische Morphologie eines peripheren Nerven. Zahlreiche quergetroffene Axone
waren regelmäßig angeordnet und hatten eine rundliche bis ovale Form. In einigen
Querschnitten sah man bereits abgehende Nervenfasern, welche auf die Nähe zur
Teilungsstelle des Nervs hinweisen. Man sah Axone unterschiedlicher Größe und
unterschiedlich starker Myelinisierung. Zwischen den Axonen lag lockeres
Bindegewebe, das Endoneurium. In den meisten Schnitten sah man innerhalb des Nervs
einige Nervenfaserbündel, die von laminärem Bindegewebe, dem Perineurium
umschlossen waren. Der gesamte rundlich bis ovale Nerv war ebenfalls von
Bindegewebe, dem Epineurium eingehüllt.
Abbildung 32: Darstellung der verschiedenen Grade des Verletzungsausmaß (a-d) Grad I-IV und in Zusammenhang mit e) Darstellung der Korrelation zwischen Verletzungsausmaß und Richtung des Axonwachstums der regenerierten Hinterwurzelaxone.
81
Der Vergleich aller Nervi radiales der gesunden Seiten zeigte keine Unterschiede
zwischen den einzelnen Gruppen.
Replantierte Seiten
Die Nervi radiales der replantierten Seiten zeigten Areale mit Zeichen der Degeneration
innerhalb des Nervenquerschnitts. Man sah in diesen Arealen eine aufgelockerte
Anordnung der Axone. Die Form der Axone zeigte in diesen Stellen nicht mehr die
ovale bis runde Form, sondern es fanden sich unregelmäßige Strukturen, die auf axonale
Degeneration hinweisen. Zwischen den aufgelockert angeordneten Axonen sah man die
Einlagerung von Bindegewebe, vermutlich Narbengewebe. Die Ausprägung dieser
Degeneration wies Unterschiede zwischen den einzelnen Tieren auf. Es gab Tiere, bei
denen die Degeneration sehr ausgeprägt erschien, aber auch Tiere, bei denen man fast
keinen Unterschied zur gesunden Seite feststellen konnte. Allerdings waren tendenziöse
Unterschiede des Ausprägungsgrads der Degeneration zwischen den einzelnen Gruppen
nicht feststellbar (Abbildung 32).
82
Abbildung 33: (vorherige Seite) Vergleich der Morphologie des Nervus radialis auf der unverletzten Seite (a) und der replantierten Seite (c) in der Übersichtsvergrößerung. In höherer Vergrößerung zeigen sich auf der replantierten Seite die Folgen des Wurzelausriss C7 in einem Areal des Nerven (Quadrat im Nervenquerschnitt auf der linken Seite) (d). Der unverletzte Nerv zeigt solche Areale nicht (b).Pfeile: veränderte myelinisierte Axone auf der verletzten Seite. Maßstab: a,c 500µm, b,d 50µm.
83
Diskussion Nervenwurzelausrisse sind extrem komplexe Verletzungen, die noch bis vor wenigen
Jahren als nicht therapierbar angesehen wurden. Ein relativ neuer chirurgischer
Therapieansatz ist die Replantation ausgerissener Vorderwurzeln. Diese Technik hat zu
deutlichen Verbesserungen in der Wiederherstellung der ausgefallenen motorischen
Funktionen geführt (z.B. Carlstedt et al., 2000; Hallin et al., 1999; Carlstedt et al.,
1993a; Hoffmann et al., 1993b; Hoffmann et al., 1996; Hoffmann et al., 1993a; Fournier
et al., 2001a; Fournier et al., 2001b; Carlstedt, 1997).
Zahlreiche Studien beschäftigten sich mit dem Ausmaß des Überlebens von
Motoneuronen und der Regeneration ihrer Axone nach Ausriss und Replantation der
Vorderwurzel (Hoffmann et al., 1996; Carlstedt T., 2000; Hallin et al., 1999; Risling
M., 1993; Lang et al., 2005a). Es konnte gezeigt werden, dass allein durch eine
möglichst zeitnah zur Verletzung durchgeführte Replantation der Vorderwurzel das
Überleben der Motoneurone begünstigt wird. Weiter wurde gezeigt, dass die
überlebenden Motoneurone in der Lage sind, neue Axone in die Peripherie auswachsen
zu lassen und damit die periphere Muskulatur zu erreichen. Allerdings blieb die
Funktionalität dieser regenerierten Axone weit hinter den Erwartungen zurück (z.B.
Lang et al., 2005a; Lang et al., 2005b; Carlstedt T., 1997a; Carlstedt T., 2000; Carlstedt
T., 1997b; Cullheim S., 1989).
Darüber hinaus wurde in der Vergangenheit der Effekt neurotropher Faktoren auf das
Überleben von Motoneuronen nach Vorderwurzelausrissen eingehend untersucht
(Carlstedt T., 1997b; Cullheim S., 1989; Hoffmann and Thomeer, 1992; Hoffmann et
al., 1993a; Koliatsos et al., 1994; Carlstedt, 1997a). Ein positiver Effekt auf das
Überleben der Motoneuronen konnte für die meisten Faktoren nachgewiesen werden,
was angesichts ihrer bisher bekannten molekularen Wirkungen gut nachvollziehbar ist.
Die vorliegende Arbeit ist nun eine der ersten, welche eine Kombinationstherapie
bestehend aus der Applikation neurotropher Faktoren und Replantation der
ausgerissenen Vorderwurzel im Detail untersucht.
84
Das verwendete Tiermodell ist der klinischen Situation eher vergleichbar als frühere Modelle
Die meisten Tiermodelle, die für Untersuchungen zur Verbesserung der Therapieansätze
von Vorderwurzelverletzungen entwickelt wurden, waren beschränkt auf den Ausriss
von Vorderwurzeln, während die Hinterwurzeln intakt blieben (z.B. Hallin et al., 1999;
Carlstedt et al., 1993b; Hoffmann et al., 1993a; Hoffmann et al., 1996; Bergerot et al.,
2004; Carlstedt et al., 1993a), oder nach Durchtrennung an die Rückenmarkhüllen
genäht wurden, ohne im Fortgang der Experimente untersucht zu werden (Chai et al.,
2000; Gu et al., 2005; Gu et al., 2004). In praktisch allen klinischen Fällen sind die
Hinterwurzeln jedoch ebenfalls verletzt (El Gammal and Fathi, 2002; Terzis et al.,
1999).
Im Modell der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich zum Ausriss mit sofortiger
Replantation der Vorderwurzel die C7 Hinterwurzel durchtrennt und nicht
weiterbehandelt. Damit kommt es der klinischen Situation bei Plexusverletzungen näher
als die meisten bisherigen Modelle. Da alle abgelaufenen biologischen Prozesse
innerhalb des verletzten und operierten Segments C7 miteinander in direktem oder
indirektem Zusammenhang stehen, wurden sowohl der Aspekt der
Rückenmarksveränderungen und der Vorderwurzelregeneration, als auch der Aspekt der
reaktiven Veränderungen der verletzten Hinterwurzel detailliert untersucht, um für
weitere Untersuchungen auf diesem Gebiet ein umfassendes Bild dieser Verletzung und
ihrer Folgen darzustellen. Die detaillierten morphologischen Dokumentationen über
Zustand des Rückenmarks und Regenerationswege der Axone sowie der Vergleich mit
vorangegangenen Studien auf diesem Gebiet haben nun einige Ergebnisse
hervorgebracht, welche neue Rückschlüsse auf die Konsequenzen dieser Verletzung und
ihrer chirurgischen Therapie ermöglichen. Diese könnte für die Erarbeitung künftiger
experimenteller Modelle für Therapieansätze von Bedeutung sein.
Interindividuelle Abweichungen des Verletzungsausmaßes: mögliche Ursachen
Das Verletzungsausmaß der Rückenmarksquerschnitte zeigte große Abweichungen
zwischen den einzelnen Tieren der verschiedenen Versuchsgruppen. Tendenzen, welche
ein geringeres Ausmaß an Verletzung in einer bestimmten Gruppe zeigten waren nicht
85
erkennbar. Interindividuell unterschiedliche Verletzungsausmaße wurden auch in einer
Voruntersuchung beobachtet, in der die Hinterwurzel durchtrennt und die Vorderwurzel
ausgerissen wurde, allerdings ohne sie anschließend zu replantieren (Lang E.M., 2005a;
Lang et al., 2005b). Ähnlich große Verletzungsausmaße und interindividuelle
Unterschiede wurden in vergleichbaren Studien über Vorderwurzelausrisse ohne bzw.
mit anschließender Replantation nicht beobachtet (Hoffmann et al., 1993a; Carlstedt T.,
1997a; Cullheim S., 1989; Ma J., 2001). Die Hinterwurzel wurde jedoch bei diesen
Studien über Vorderwurzelausrisse nicht verletzt. Bei menschlichen Verletzungen
werden in der großen Mehrheit der Fälle Ausrisse beider Nervenwurzel diagnostiziert
(Terzis J.K., 1999; El-Gammal T.A., 2002). Es ist anzunehmen, dass die Verletzung der
Hinterwurzel in unserem Modell wie auch bei Patienten die Reaktion der Motoneurone
beeinflusst und damit sehr wahrscheinlich zu einem größeren Verletzungsausmaß führt,
als ein Vorderwurzelausriß allein. Dies könnte auch erklären, warum der Untergang der
Motoneurone im vorliegenden Modell relativ früh stattfindet und der Verlust von
Motoneuronen nach einer Woche ohne Applikation neurotropher Faktoren bei nahezu
60% lag (Lang et al., 2005a).
Ein weiterer Aspekt, welcher zu diesen interindividuellen Unterschieden beiträgt,
könnte sich möglicherweise aus einem interindividuell unterschiedlichen Ausmaß der
Unterbrechung der Blutversorgung erklären. Mit der Unterbrechung der Kontinuituität
zwischen Rückenmark und Nervenwurzeln werden gleichzeitig auch die Arteriae
radiculariae des entsprechenden Segments durchtrennt. Eine Blutversorgung des
verletzten Segments kann dann nur noch durch Anastomosen zu den benachbarten
Rückenmarksegmenten erfolgen. Beim Menschen ist bekannt, dass erhebliche
Variationen der Blutversorgung der Segmente bzw. der Nervenwurzeln existieren
(Lasjaunias and Berenstein, 1990). Unzureichende Anastomosenverbindungen zu den
benachbarten Segmenten könnten daher zu einem größeren Schädigungsausmaß führen.
Carlstedt (Carlstedt, 2000) vermutete bereits, dass derartige Variationen der
Blutversorgung das Verletzungsausmaß bei menschlichen Wurzelverletzungen und bei
experimentellen Untersuchungen an Tieren beeinflusst. Da es für das Kaninchen keine
genauen Daten über die Blutversorgung des Rückenmarks gibt, kann man über diesen
Sachverhalt leider nur spekulieren.
86
Kein deutlicher Einfluß auf Motoneuronüberleben nach einmaliger Applikation neurotropher Faktoren
Die Replantation der Vorderwurzel, obwohl mit großer Vorsicht durchgeführt, hatte
eine Narbenbildung innerhalb der weißen Substanz zur Folge. Bei der intraspinalen
Narbenbildung nach Replantation handelt es sich im Prinzip um eine erwünschte
Veränderung (Carlstedt T., 1993), da dem Narbengewebe des ZNS
regenerationsinduzierende Eigenschaften zugeschrieben werden, die das Überleben von
Motoneuronen und Regeneration von Axonen begünstigen (Hallin et al., 1999). Man
nimmt an, dass die Vorteile einer solchen Narbenbildung und damit einer Verletzung
der weißen Substanz die möglichen Nachteile überwiegen. Im Modell der vorliegenden
Arbeit scheint ein solch positiver Einfluss auf begünstigtes Überleben von
Motoneuronen nicht gegeben. Es ist im Gegenteil so, dass eine große Narbe meist mit
einem höheren Verlust von Neuronen einhergeht.
Die Überlebensrate von Motoneuronen beträgt in den vorliegenden Untersuchungen in
allen Gruppen etwa 30% und ist damit dramatisch hinter den Erwartungen
zurückgeblieben, wenn man diese an den Ergebnissen orientiert, die drei Wochen nach
Ausriss, Replantation und Applikation von neurotrophen Faktoren im vergleichbaren
Modell der Voruntersuchungen gefunden wurden (Lang et al., 2005a). Diese und andere
Studien zeigten, dass durch die Behandlung mit neurotrophen Faktoren das Überleben
von Motoneuronen zumindest für eine kurze Zeit von 3 Wochen nach dem Trauma
gesteigert werden kann. Weitere Arbeiten bestätigten die Wirksamkeit von CNTF und
BDNF auf das Überleben von Motoneuronen über diesen Zeitraum hinaus (Arakawa et
al., 1990; Chai et al., 1999; Novikov et al., 1997; Sendtner et al., 1990; Yan et al., ).
Kürzlich wurde sogar eine dauerhafte Erhöhung der Anzahl von Motoneuronen nach
vier Monaten gezeigt. Dies wurde durch das Einbringen eines GDNF bzw. BDNF-
exprimierenden Adenovirus in das verletzte Segment erreicht (Blits et al., 2004).
In den meisten dieser Studien- wie auch in den Voruntersuchungen- wurden die
Faktoren direkt auf die Ausrißstelle oder sehr nahe an die verletzten Motoneurone
appliziert. Fraher et al. (Fraher J.P., 1999) postulieren, dass neurotrophe Faktoren bei
einer Applikation an die Ausrißstelle die “intramedullary bundles” (IMBs) als
„Führungskanal“ benutzen könnten, um zu den verletzten Motoneuronen zu
diffundieren (Cullheim S., 2002), und so sehr rasch die proximalen Axonstümpfe und
87
damit die verletzen Motoneurone erreichen könnten. Gleichzeitig wäre ein
Konzentrationsgradient in Richtung ventral replantierter Vorderwurzel gegeben, an dem
entlang neue Axone auswachsen und damit erfolgreich regenerieren könnten (Fraher
J.P., 1999; Fraher J.P., 1997). Die vorliegenden Untersuchungen unterstützen die
Möglichkeit, dass IMBs postläsional als mögliche „Führungskanäle“ offen bleiben und
nicht durch gliale Narbenbildung verlegt werden, da in allen Fällen ein
Widerauswachsen der Axone ventral beobachtet wurde.
In der vorliegenden Arbeit wurden Faktoren in den Fibrinkleber gemischt, der zur
primären Befestigung der Vorderwurzel nach der Replantation diente. Die durch
Replantation induzierte Narbe entwickelt sich erst nach einer gewissen Zeit. Während
dieser Zeit fehlen diese zusätzlichen Faktoren im Vorderhorn – dies könnte ein Grund
dafür sein, dass in unserem Modell schnell untergehende Motoneurone nicht gerettet
werden konnten.
Doch selbst wenn die einmalige Applikation neurotropher Faktoren in den untersuchten
Tieren zunächst ein Überleben der Motoneurone in den verletzten Segmenten bewirkt
haben sollte, besteht die Möglichkeit, dass ein Teil der Motoneurone in einem Zeitraum
untergegangen ist, der nach den ersten drei Wochen nach dem Trauma liegt, während
derer nach der Voruntersuchung weit mehr Motoneurone überlebt hatten (Lang et al.,
2005a). Dies könnte dadurch bedingt sein, dass nicht alle überlebenden Motoneurone
über regenerierende Axone rechtzeitig die replantierten Wurzeln erreicht hatten, und
damit keinen Zugang zu weiterer trophische Unterstützung durch die periphere Glia
bestand. Eine solche Konstellation könnte damit einen sekundär stattfindenden Zelltod
bewirkt haben.
Prinzipiell besteht natürlich die Möglichkeit, dass beide Erklärungsmodelle sowohl
isoliert, als auch kombiniert zu den Ergebnissen geführt haben. Zur Klärung dieser
Problematik sind weitere Experimente erforderlich.
Regenerierende Axone wachsen lateral und ventral aus
Obwohl die Replantation so weit wie möglich ventral stattfand, ergaben sich leichte
Unterschiede bezüglich der Lokalisation der Vorderwurzel. Diese Unterschiede waren
aus chirurgisch-technischen Gründen unvermeidbar und wurden bei der
morphologischen Analyse der C7-Rückenmarksquerschnitte deutlich. Dazu zeigte sich,
dass bei einigen Tieren die Vorderwurzel in ihrem Verlauf nahe der physiologischen
88
ventralen Austrittszone zu liegen kam bzw. sich sogar ihr anzulegen schien. Es wird
allgemein vermutet, dass es verschiedene Vor- und Nachteile bezüglich des Ortes der
Replantation gibt. Jedoch wurden bis heute keine Studien veröffentlicht, die eine
ventrale mit einer lateralen Replantation der Vorderwurzel vergleicht (Carlstedt, 1997a;
Carlstedt T., 1997b; Hoffmann et al., 1996; Fournier H.-D., 2001a; Fournier H.-D.,
2001b).
Die fluoreszenzmikroskopischen und lichtmikroskopischen Analysen zeigten, dass aus
den überlebenden Motoneuronen myelinisierte Axone auswachsen. Weiter konnte in der
vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass der Regenerationsweg dieser Axone sowohl
nach lateral über die Replantationsstelle als auch nach ventral über die IMBs mit
Austritt aus der physiologischen Austrittstelle von Vorderwurzelaxonen stattfindet.
Diese ventral austretenden Axone finden anschließend Wege in die replantierte
Vorderwurzel. Übereinstimmend mit diesen Beobachtungen beschrieben Thomas
Carlstedt et al. (Carlstedt T., 1997a), dass nach lateraler Replantation der Vorderwurzel
zahlreiche myelinisierte Axone ventral austreten und entlang der Pia mater in die
replantierte Vorderwurzel einwachsen. Aus diesem Grund war es ihre Empfehlung, so
weit ventral wie möglich zu replantieren. Hoffmann et al. (Hoffmann et al., 1996)
zeigten, dass nach einem Ausriss intramedulläre Regeneration von
Motoneuronenaxonen in den ursprünglichen Wegen stattfindet und dass diese durch
ventrale Replantation gefördert wurden (Hoffmann et al., 1993b; Hoffmann et al.,
1996). In den vorliegenden Untersuchungen schien es so, dass ventral austretende
Axone regelmäßig von Neuronen stammten, die in den gleichen oder direkt
angrenzenden Querschnitten zu finden waren. Dies war bei den lateral austretenden
Axonen nicht häufig zu beobachten. Direkte Verbindungen nach lateral waren selten,
meist schienen die Axone innerhalb des Rückenmarks nach rostral oder caudal zur
Ausstrittstelle zu verlaufen.
Ventrale Replantation könnte günstige Effekte haben
Auch die fluoreszenzmikroskopische Analyse zeigte, dass die Mehrzahl der lateral
austretenden myelinisierten Axone aus Neuronen stammen, die oberhalb oder unterhalb
dieses Austritts liegen und innerhalb des Rückenmarkssegments zu ihrer Austrittsstelle
gewachsen sind. Dies legt nahe, dass es sich bei diesen Axonen höchstwahrscheinlich
um Kollateralen von Neuronen handelt. Kollateralisierung von Axonen nach
89
Wurzelausriss aus dem Rückenmark in periphere Nerven wurde bereits häufig
beschrieben und findet sowohl ohne (Novikov L., 1997; Novikov et al., 1995) als auch
mit Replantation statt (Hallin et al., 1999). Weiterhin könnten diese Axone auch
Dendraxone aus funktionell anderen Neuronen des Rückenmarks sein, die sich an der
Reinnervation der Muskelgruppen beteiligen (Linda et al., 1985)
In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass zusätzlich zu den lateral austretenden
Axonen zahlreiche Axone über die IMBs ventral auswachsen und Anschluß an die
ventrolateral replantierte Vorderwurzel finden (s.o.). Der Durchmesser dieser ventral
austretenden Axone war mehrheitlich signifikant größer als der Durchmesser lateral
austretender Axone. Diese Beobachtungen legen nahe, dass es sich bei den ventral
austretenden Axonen um primäre Axonsprossen handelt (Hoffmann et al., 1993a),
während die Mehrheit der lateral austretenden Axone Sprossen sind, die aus anderen
Teilen des Neuron oder aus Dendriten (Cullheim S., 2002) auswachsen. Da
Kollateralen im Vergleich zu primären Axonen funktionell minderwertig sind (Linda
H., 1992; Streppel M., 2002) und gezeigt wurde, dass die Kollateralisierung sogar
schädlich für eine erfolgreiche funktionelle Wiederherstellung ist (Hallin et al., 1999;
Streppel M., 2002) erscheint es vorteilhaft, Möglichkeiten zu entwickeln, die ein
ventrales Auswachsen begünstigen.
Der Vergleich zwischen dem Ausmaß der axonalen Regeneration entlang der beiden
Wege bestätigt diese Aspekte. Ventral austretende Axone wurden in allen Fällen
gefunden. In den Fällen, in denen die Replantationsstelle mehr lateral zu finden war und
die Vorderwurzel in ihrem Verlauf nicht an der physiologischen Austrittsstelle zu liegen
kam, erschien die Anzahl lateral austretender Axone höher zu sein als die der ventral
austretenden. Auf der anderen Seite war ein massives ventrales Auswachsen zu
beobachten, wenn weit ventral replantiert wurde oder wenn die Vorderwurzel in ihrem
Verlauf an der physiologischen Austrittsstelle zu liegen kam. In diesem Fall zeigte sich,
dass diese ventral austretenden Axone teilweise in der Lage waren, in die replantierte
Vorderwurzel einzuwachsen ohne zuerst entlang der Pia zur Replantationsstelle
wandern zu müssen. Dies bedeutet, dass die Hülle der replantierten Wurzel unter
Umständen den Eintritt der Axone zulässt.
Auch die Zahl der lateral austretenden myelinisierten Axone schien in diesen Fällen
eher klein zu sein- auch wenn Narbengewebe vorhanden ist. Ein mögliche Erklärung für
90
unsere Ergebnisse könnte folgendermaßen aussehen: Motoneurone bilden sowohl
Primäraxone, die das Rückenmark über die IMBs verlassen als auch Kollateralen, die in
das durch die durch die Replantation geschaffene trophisch günstige Narbengewebe
einwachsen. Derjenige Fortsatz, der dann zuerst das periphere Gewebe erreicht wird
entsprechend eines „pruning“ verstärkt (Angelov et al., 1996; Streppel et al., 2002),
während der andere Fortsatz degeneriert. Ausgehend von dieser Argumentation würde
eine Anlagerung der Vorderwurzel an die ursprüngliche Austrittsstelle von Vorteil sein,
da sie eine direkte Verbindung zwischen Primäraxon und Peripherie bilden würde.
Dadurch wäre die Möglichkeit erhöht, dass regenerierende Motoneuronaxone mit
großem Durchmesser, die funktionell hochwertiger sein dürften als kleine
Axonkollateralen, aus dem Rückenmark in die Peripherie einwachsen.
Deutliche Regeneration von myelinisierten Axonen in der Vorderwurzel auf Höhe des Spinalganglions
Drei Wochen nach Ausriss und Replantation waren in der Vorderwurzel nur sehr
wenige sehr kleinflächige Axone (40-60) vorhanden, und es waren deutliche Zeichen
von Degenerationsvorgängen festzustellen. Obwohl es möglich ist, dass die wenigen
kleinen Axone, die nach drei Wochen beobachtet wurden, besonders schnell
regenerierende efferente Axone sind, erscheint wahrscheinlicher, dass es sich dabei um
sensorische Fortsätze aus den Spinalganglienzellen handelt, deren Einwachsen in die
Vorderwurzel ohne Erreichen des Rückenmarks auch physiologischerweise bekannt ist
(Hildebrand C., 1997).
Nach sechs Monaten betrug die Anzahl regenerierter Axone, die in den
Semidünnschnitten der replantierten Vorderwurzeln gezählt wurden, etwa 45%
verglichen mit den gesunden Seiten. Dies belegt zunächst, dass es tatsächlich im
Zeitraum zwischen drei Wochen und sechs Monaten nach der Operation zu vaskulären
Reorganisationsvorgängen, signifikanter Regeneration von efferenten Axonen und
begleitender Ausbildung von Myelinscheiden gekommen ist, was Beobachtungen
vorheriger Studien bestätigt (Risling M., 1983; Cullheim et al., 1989; Carlstedt et al.,
2000; Carlstedt, 2000; Carlstedt et al., 1993b; Carlstedt, 1991; Holtzer et al., 2002; Gu
et al., 2005; Gu et al., 2004; Hoffmann et al., 1996).
Die Anzahl der Axone auf den unverletzen Seiten zeigte relativ große interindividuelle
Abweichungen zwischen den Tieren. Dieser Befund ist überraschend, wenn man dem
91
die homogene Anzahl von gezählten Neuronen in den Segmenten der unverletzten
Seiten gegenüberstellt. Fraher (Fraher and VR, 1989) dokumentierte allerdings, dass im
Verlauf der Vorderwurzel eine Kollateralisierung der Motoneuronaxone stattfindet, was
die hohe Anzahl von Axonen in der C7 Vorderwurzel verglichen mit den gezählten
Neuronen im Segment C7 erklären könnte. Diese unterschiedliche Anzahl von Axonen
führte zu großen Standardabweichungen der Mittelwerte der Axonzahlen in den
unverletzten Vorderwurzeln der einzelnen Gruppen. Da die Mittelwerte der Gruppen
nicht statistisch signifikant unterschiedlich waren, ist davon auszugehen, dass Tiere
aller Gruppen gleichmässig inhomogene Axonzahlen in der Vorderwurzel besitzen, was
den Vergleich auch der replantierten Seiten untereinander ohne Bias zulassen sollte.
Der morphologische Eindruck, dass die myelinisierten Axone innerhalb der
unverletzten Vorderwurzeln grob in zwei verschiedene Populationen aufgeteilt werden
können, wurde durch die Histogramme der Axonflächen nur teilweise bestätigt. Die
Messungen der Axonflächen in den unverletzten Vorderwurzeln zeigten, dass in allen
Gruppen etwa 45% der Axone großflächig (≥35µm²) waren. In früheren Studien wurde
gezeigt, dass großflächige Axone (von α−Motoneuronen) in der Vorderwurzel etwa 60-
70% der Gesamtpopulation ausmachen (Kaar and Fraher, 1985). Der Unterschied der
Daten aus der vorliegenden Arbeit im Vergleich zu Literaturangaben ist am ehesten auf
die Methodik der Auswertung zurückzuführen. Die Analysen in den ROIs haben den
Nachteil, dass Axone die im Randbereich der analysierten Areale liegen, nicht in die
Messungen miteinbezogen werden. Damit steigt die Wahrscheinlichkeit für
großflächige Axone nicht gemessen zu werden. Dieses Phänomen ist in der Literatur
auch als sog. „edge effect“ bekannt (Geuna et al., 2001). Für die Daten der vorliegenden
Arbeit ist also davon auszugehen, dass die größeren Axone, die häufiger in den
unverletzten Seiten sind, in den Histogrammen aus den ROIs unterrepräsentiert sind. Es
erscheint wahrscheinlich, dass die Gruppe der von uns als „groß“ klassifizierten Axone
den α−Motoneuron-Axonen entspricht.
Es wurden insgesamt sehr wenig nicht-myelinisierte Axone in den unverletzten
Vorderwurzeln beobachtet. Dies stimmt mit Ergebnissen früherer Studien überein, nach
denen außerhalb der Austrittssegmente von vegetativen Nervenfasern in Vorderwurzeln
von Kaninchen sehr wenig C-Fasern zu finden sind (Hildebrand et al., 1997;
Applebaum et al., 1976).
92
Regenerierte Vorderwurzelaxone sind kleinflächig
In den Vorderwurzeln der replantierten Seiten lag der Anteil großflächiger Axone in
allen Gruppen unter 14% und war damit im Vergleich zu den unverletzten Seiten
deutlich reduziert. Die Mehrheit der gemessenen Axone lag in einem Größenbereich,
der sogar noch kleiner war, als die Mehrheit der kleinflächigen Axone in den
unverletzten Vorderwurzeln. Die größeren regenerierten Axone sind wahrscheinlich
funktionell die vielversprechendsten Axone, da sie eher primären Motoneuronsprossen
als Kollateralen entsprechen. Da primäre regenerierte Motoneuronsprossen kleiner sind
als die Fortsätze unverletzer Axone (Morris et al., 1972a; Morris et al., 1972b), sind
möglicherweise auch eine Reihe mittelgroßer Axone zu den funktionell hochwertigen
regenerierten Axonen zu rechnen. Dagegen sind die vielen sehr kleinflächigen Axone,
die in den regenerierten Vorderwurzeln zu finden waren, am ehesten Kollateralen aus
Motoneuronen oder sogar aus anderen Neuronen. Aus diesem Grund, und da in diesem
Größenbereich auch sensorische Axone zu finden sein dürften, deren Vorkommen in der
Vorderwurzel seit längerem bekannt ist (Hildebrand et al., 1997), sind definitive
Aussagen über die funktionelle Qualität kleiner regenerierter Axone in Bezug auf
motorische periphere Innervation nicht möglich. Die Regeneration von
Axonkollateralen in die replantierte Vorderwurzel aus dem Rückenmark des verletzten
Segments und sogar aus den benachbarten Segmenten wurde in der Vergangenheit
mehrfach dokumentiert. (Hallin et al., 1999; Novikov L., 1997; Linda et al., 1985;
Havton and Kellerth). Es wurde angenommen, dass diese Art der axonalen
Regeneration am ehesten zu einer unspezifischen Reinnervation führt, die dann ein
Ausbleiben der adäquaten motorischen Funktionen zur Folge hat (Hallin et al., 1999;
Angelov et al., 1996; Ito and Kudo, 1994; Brown et al., 1981). Die Ergebnisse der
vorliegenden Untersuchungen legen nahe, dass die Regeneration von großen
Motoneuronaxonsprouts durch eine nahe ventrale Replantation begünstigt wird (siehe
oben). Die Bildung von Kollateralen scheint sogar ausgeprägter istzu sein, je weiter die
Replantationsstelle von der originalen Austrittszone der Vorderwurzel entfernt ist.
Dagegen wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in den
Größenverhältnissen der regenerierten Vorderwurzelaxone zwischen den
experimentellen Gruppen gefunden. Von BDNF wurde in verschiedenen Arbeiten
gezeigt, dass es die Kollateralisierung steigert (Novikov L., 1997; Streppel M., 2002).
93
Eine höhere Anzahl kleinflächiger Axone nach BDNF Aplikation konnte im
vorliegenden Material jedoch nicht gefunden werden. Somit scheint die Applikation von
BDNF, CNTF, oder der Kombination beider Faktoren auf die Replantationstelle auf die
Größe der Axone zumindest im vorliegenden Modell weder positiven noch negativen
Einfluss zu haben.
Neurotrophe Faktoren wirken positiv auf die Remyelinisierung
Die Nervenleitgeschwindigkeit und damit die funktionelle Qualität einer Regeneration
sind abhängig von verschiedenen Parametern. Zum einen ist der Abstand von einem
Ranvier´schen Schnürring zum nächsten wichtig. Wird der Abstand größer, also das
Internodium länger, steigt die Geschwindigkeit der Erregungsübertragung und
umgekehrt. Weiter ist der Faserdurchmesser und die Dicke der Myelinscheide
entscheidend (Hursh J.B., 1939; Rushton W.A.H., 1951). Abnahme der Dicke der
Myelinscheide führt zu schwerwiegenden Dysfunktionen (Schröder J.M., 1972). Um
einen möglichen Effekt neurotropher Faktoren auf die Remyelinisierung der
regnerierten Axone, und damit auf diesen funktionell wichtigen Parameter der
Regeneration, untersuchen zu können, wurde das Axon-Myelinverhältnis der
unverletzten Vorderwurzelaxone bestimmt und dieses mit dem der regenerierten Axone
der replantierten Seiten verglichen.
Es existiert eine lineare Beziehung zwischen Axondurchmesser und Dicke der
Myelinscheide in vielen verschiedenen Spezies von der Ratte bis hin zum Mensch.
(Dyck P.J., 1971; Friede R.L., 1968). Dies ist auch der Fall bei verschiedenen Größen
von Nervenfaser-Populationen motorischer Axone (Kaar and Fraher, 1985; Fraher,
1992). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen dies, indem festgestellt
werden konnte, dass größere Axone eine dickere Myelinscheide haben als kleinere.
Dieser Anstieg erschien in kleineren Axonen etwas stärker ausgeprägt als in größeren,
was ebenfalls Literaturdaten, erhoben an verschiedenen Spezies, für das Kaninchen
bestätigt (Fraher and O'Sullivan, 2000).
Die Bestimmung der Myelinisierung zeigte zunächst, dass regenerierte Axone bei
Kontrolltieren eine signifikant geringere Myelinscheidenfläche aufweisen als
unverletzte Axone. Weiterhin waren Unterschiede zwischen der Myelinisierung der
regenerierten Axone in den einzelnen experimentellen Gruppen vorhanden. Diese
94
Unterschiede waren für sehr kleine Axone etwas geringer ausgeprägt als in der
Population großflächiger Axone. Der positive Effekt auf die Myelinisierung war
zumeist in der BDNF-Gruppe am geringsten, minimal deutlicher in der CNTF-Gruppe
und statistisch signifikant in der Mehrzahl der Axongrößenklassen bei der
Kombinationsgruppe. Zahlreiche Studien jüngeren Datums unterstreichen die Rolle von
neurotrophen Faktoren für die Myelinisierung. Neurotrophine, genauer BDNF
stimulieren die Myelinisierung durch Schwann Zellen über eine Stimulation über den
p75-Neurotrophinrezeptor während der Entwickung (Notterpek L., 2003; Cosgaya et al.,
2002). BDNF wird auch für die Remyelinisierung nach peripherer Nervenverletzung
benötigt (Zhang J.-Y., 2000). In ihrem Review spekuliert Notterpek (Notterpek L.,
2003), dass die Signalübertragung über p75-NTR nicht nur eine Rolle in der
Entwicklung, sondern auch für die Remyelinisierung von Axonen nach peripheren
Nervernläsionen spielen könnte. Lewin et al. zeigten schon 1997, dass eine
Vergrößerung des Axondurchmessers und eine Verbesserung der funktionellen
Wiederherstellung durch exogene BDNF Applikation nach Durchtrennung des Nervus
ischiadicus erzielt werden konnte. Dieser Effekt wurde –zumindest in den ersten
Wochen- durch die kombinierte Applikation mit CNTF verstärkt (Lewin et al., 1997).
Eine kürzlich veröffentlichte Arbeit deutete zum ersten Mal in qualitativen Analysen
darauf hin, dass die Myelinisierung im PNS auch durch CNTF-Applikation nach
Verletzung des N. ischiadicus verbessert werden kann, was durch die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit unterstützt wird (Zhang et al., 2004). Ein quantitativer Nachweis
des Effekts von CNTF auf periphere Myelinisierung fehlt jedoch bisher. Für das ZNS
wurde dagegen gezeigt, dass CNTF die Myelinisierung steigern kann und als
protektiver Faktor bei demyelinisierenden Erkrankungen des ZNS wirkt (Linker et al.,
2002). Dabei nimmt CNTF höchstwahrscheinlich Einfluß auf die Differenzierung von
Oligodendrozyten (Stankoff B., 2002; Barres et al., 1996; Mayer M., 1994).
Die vorliegende Arbeit erbringt erstmalig durch quantitative Analysen einen Beleg
dafür, dass die einmalige Applikation von CNTF und BDNF einen stimulierenden
Effekt auf das Ausmaß der Remyelinisierung regenerierter peripherer Axone hat. Die
Dicke der Myelinscheide wird reguliert durch Axon-Schwannzell-Kommunikation (z.B.
über den Neuregulin-ErbB2- Pathway, Nave and Salzer, 2006) sowie durch die
Beeinflussung der Expression von Myelinscheiden-Bestandteilen (Zu Hörste and Nave,
95
2006; Suter and Scherer, 2003). Untersuchungen zur Entwicklung von Myelinscheiden
deuten daraufhin, dass es einen initialen Anstoß der Myelinisierung geben könnte, der
auch die Dicke der Myelinscheide bestimmt, die dann im weiteren gleichmäßig
aufrechterhalten wird, ohne dass dafür zusätzliche Informationen notwendig sind
(Fraher and Dockery, 1998). Angesichts dieser Befunde ist es denkbar, dass das
Einwirken neurotropher Faktoren zu Beginn der Remyelinisierung in unserem Modell
zur Ausbildung einer im Vergleich zu Kontrollen dickeren Myelinscheide geführt hat,
die auch nach 6 Monaten feststellbar war. Interessanterweise zeigte die alleinige
Applikation von BDNF oder CNTF nicht so deutliche Effekte wie die Kombination aus
beiden Faktoren, die letztendlich zu einer statistisch signifikant höheren Myelinisierung
als in den verletzten Kontrollen führte. Die Beobachtung, dass neurotrophe Faktoren
einzeln wenig Effekte zeigen, wohl aber in Kombination mit anderen zahlreiche
Prozesse beeinflussen, wurde bereits mehrmals gemacht (Logan et al., 2006; Esquenazi
et al., 2005; Marzella et al., 1999; Lewin et al., 1997; Arce et al., 1998). Auch für die
periphere Remyelinisierung gibt es Hinweise dafür, denn ein solcher additiver Effekt
wurde durch die kombinierte Applikation von BDNF und CNTF bereits für eine frühe
Phase der Regeneration gezeigt (Lewin et al., 1997). Die Interaktion von CNTF-
Signaltransduktion mit Signalwegen der Neurotrophine ist Gegenstand aktueller
Forschungsprojekte (Stankoff et al., 2002; English). Darüber hinaus existieren Hinweise
auf den modulierenden Effekt von neurotrophen Faktoren in der Schwann-Zell-
Neuroninteraktion, welche die Myelinisierung in der Regeneration peripherer Nerven
fördert (Nave and Salzer, 2006; Hoke et al., 2003). Die vorliegenden Ergebnisse deuten
nun einen weiteren Aspekt von Interaktionen zwischen verschiedenen Faktoren an. Die
Analyse der genauen Mechanismen, die diesen Interaktionen zugrunde liegen, könnte
zahlreiche wichtige und interessante Ergebnisse im Hinblick auf therapeutische
Interventionen bei peripheren Nervenverletzungen erbringen, die letztendlich auch von
höchster klinischer Relevanz sind.
Morphologie des Nervus radialis zeigt regenerative Prozesse
Die unregelmäßige Anordnung von Axonen in Teilen der verletzten Seiten des Nervus
radialis weist darauf hin, dass regenerierte Axone von der Vorderwurzel in die
Peripherie gewachsen sind. Da die degenerativen Prozesse und die Abbräumreaktion
96
von Myelindebris nach sechs Monaten jedoch längst abgeschlossen sein sollte (Stoll et
al., 2002), könnte das Vorhandensein von morphologisch veränderten Axonen Hinweis
auf eine sekundäre Degeneration sein. Diese könnte möglicherweise durch einen
sekundär eingetretenen Zelltod von Motoneuronen zustandegekommen sein (siehe
oben). Andererseits können mit ebenso großer Wahrscheinlichkeit die komplexen
Vorgänge im Hinterwurzelbereich Ursache für derartige Veränderungen sein. Über
diesen Sachverhalt lässt sich mit dem vorhandenen Material jedoch nur spekulieren.
Verletzungsauswirkungen auch auf den unverletzten Seiten?
Es ist bekannt, dass Nervenverletzungen auch die kontralateralen, unverletzten
Strukturen beeinflussen. Diese Effekte sind qualitativ gleich wie auf der ipsilateralen
Seite, jedoch gewöhnlicherweise von weit geringerem Ausmass (Koltzenburg M.,
1999). Ein Einfluß der Läsion auf die unverletzten Seiten konnte in unserer Arbeit nicht
festgestellt werden, da keine Vergleiche zur völlig unverletzten Situation angestellt
wurden. Die Tatsache, dass keine deutlichen Unterschiede zwischen den Befunden der
unverletzten Seiten bei sehr starkem Verletzungsausmaß des kontralateralen
Rückenmarks und denen der unverletzten Seiten bei geringem kontralateralem
Verletzungsausmaß festzustellen war, deutet allerdings darauf hin, dass die durch die
Läsion bedingten Veränderungen relativ gering sein dürften. Es gab darüber hinaus
keine signifikanten Unterschiede zwischen den unverletzten Seiten der verschiedenen
experimentellen Gruppen. .
Beobachtungen zur durchtrennten Hinterwurzel vervollständigen das Bild der komplexen Veränderungen im Segment C7
Verletzungen der durchtrennten Hinterwurzel werden zur Zeit noch nicht behandelt,
weil Interventionen zur Verbesserung der sensorischen Funktionen noch nicht ausgereift
sind (z.B. Ramer et al., 2000; Ramer et al., 2002; Romero et al., 2001; Fraher, 2002;
Donnerer, 2003). Bis heute ist nichts über das Schicksal der unbehandelten
rhizotomierten Hinterwurzelaxone in dem Modell der chirurgischen ventrolateralen
Replantation der Vorderwurzel bekannt. Veränderungen von Rückenmark und
Spinalganglien, die durch Rhizotomie stattfinden, wurden -mit wenigen Ausnahmen-
ohne die begleitende Verletzung der Vorderwurzeln beschrieben (z.B. Hinsey et al.,
97
1937; Carlstedt, 1985; Carlstedt et al., 1991; Jenkins et al., 1993; Ni et al., 2001; Ma et
al., 2003; McGraw et al., 2005; Review Lieberman, 1971).
Die Untersuchungen des Spinalganglions, der darin befindlichen Neurone und ihrer
zentralen Fortsätze wurden sechs Monate nach Durchtrennung der Hinterwurzel
vorgenommen. Die Untersuchung der Transversalserienschnitte des Segements C7
zeigte bei allen Tieren eindeutig, dass die operative Durchtrennung der Hinterwurzeln
vollständig war und dass die Hinterwurzeln nach sechs Monaten in keinem Fall spontan
Anschluss an die Hinterwurzeleintrittszone gefunden hatten. Der Fibrinkleber, der zur
primären Fixation der ausgerissenen Vorderwurzel verwendet worden war, wurde im
Laufe der sechs Monate offensichtlich durch lockeres Bindegewebe ersetzt, wie es in
einem ähnlichen Modell nach der Fixation von Hinterwurzeln mit Fibrinkleber bereits
beschrieben ist (Iwaya et al., 1999). Die regenerierten Hinterwurzelstümpfe lagen
diesem Bindegewebe an, in einigen Fällen waren sie davon komplett eingehüllt. Dies
legt nahe, dass die durchtrennten Hinterwurzeln postoperativ möglicherweise in
direktem Kontakt mit dem Fibrinkleber standen und damit auch Zugang zu den
neurotrophen Faktoren hatten, die diesem Fibrinkleber beigemischt waren.
Rhizotomie führt zur Degeneration der zentralen und peripheren Anteile des zentralen
sensorischen Axonfortsatzes (Murray et al., 1990; Fraher J.P., 1999). Bei adulten Tieren
kommen sowohl bei motorischen als auch bei sensorischen Nervenwurzeln sogenannte
„central tissue projections“ vor (Fraher J.P., 1999; Carlstedt, 1997), die wahrscheinlich
das Korrelat der konischen Gewebsprotrusionen der vorliegenden Arbeit an der
Hinterwurzeleintrittszone sind. In diesen Protrusionen wurde das Vorhandensein
sudanschwarzgefärbter myelinisierter Axone beobachtet, die in Kontinuität mit dem
Rückenmark standen. Wie von Fraher (Fraher, 2002) angedeutet könnte es sich bei
diesen Fasern um Axone spinaler Neurone handeln, die eine Schleife in diesen
Protrusionen bilden. Allerdings legt die Beobachtung, dass diese Fasern relativ weit in
der Peripherie der Gewebevorsprünge hereinreichen, ohne sich wieder in Richtung
Rückenmark zu weden, nahe, dass es sich dabei um neu ausgewachsene Fortsätze
spinaler Neurone handeln könnte. Carlstedt et al. konnten in adulten Ratten das
Auswachsen von Fortsätzen aus Hinterhornneuronen durch Replantation der
Hinterwurzel induzieren (Carlstedt, 1985; Carlstedt et al., 1991). Sie zeigten außerdem,
dass die verletzungsinduziert aus den Rückenmarksneuronen in die Peripherie
98
regenerierten Axone Anschluß an Pacini-Körperchen gewannen (Carlstedt, 1997).
Dagegen konnten die Autoren nach Quetschungsverletzung oder Ganglionektomie kein
Einwachsen von Fortsätzen spinaler Neurone in den zentralen Teil der
Hinterwurzelaxone beobachten (Carlstedt, 1985; Carlstedt et al., 1989; Carlstedt, 1997).
Sie schlugen als Grund für diese unterschiedlichen Beobachtungen vor, dass die
Replantation der Hinterwurzel eine Verletzung der zentralen Neurone und der weißen
Substanz verursachte, welche eine Sprossungsreaktion in Richtung des PNS-Gewebe
der replantierten Wurzel verursachte, wohingegen nach einer Verletzung durch eine
Quetschung oder eine Durchtrennung der Hinterwurzel die Rückenmarksneurone
unverletzt blieben und kein Einwachsen in die verletzte Wurzel induziert werden
konnte. Smith et al. (Smith et al., 1992) zeigten, dass in adulten Ratten ein relativ
kleines Trauma sowohl notwendig als auch ausreichend war, ein Einwachsen von
Fortsätzen von Rückenmarksneuronen in chronisch denervierte Hinterwurzeln zu
induzieren, sogar ohne zusätzlichen Schaden zentralen weißen Substanz an der
Hinterwurzeleintrittszone.
Die Rückenmarksläsion, die durch Verletzung und Replantation der Vorderwurzel im
vorliegenden Modell entstanden ist, kann durchaus eine Sprossungsreaktion der
intrinsischen Hinterhornneurone verursacht haben. Erstaunlich ist, dass diese Sprossung
offensichtlich in Richtung der ursprünglichen Hinterwurzeleintrittszone bzw. in
Richtung des zentralen Restes der durchtrennten Hinterwurzel stattgefunden hat, ohne
dass wachstumförderndes peripheres Nervengewebe die Sprossung befördert hätte. Ein
Vorhandensein von solchem Gewebe war, wie oben erwähnt, in anderen
Läsionsexperimenten als wichtige Voraussetzung für solch regenerative Prozesse
gefordert worden (Smith et al., 1992; Carlstedt, 1985; Carlstedt et al., 1988).
Fraher (Fraher J.P., 1999) wies darauf hin, dass eine Schwierigkeit in der Interpretation
axonaler Regeneration über die ZNS-PNS- Übergangszone der Hinterwurzel darin liegt,
dass zwischen den durchtrennten Hinterwurzeln und Nervenwurzeln benachbarter
Spinalnerven Anastomosen existieren. In den Serienschnitten des Rückenmarkssegment
C7 und benachbarter Segmente zeigte sich, dass auch im vorliegenden Modell solche
Axone offensichtlich vorhanden waren. Diese Axone zeigten in der
Markscheidenfärbung die gleiche Morphologie wie Hinterwurzelaxone distal der
Transitionszone auf den unverletzten Seiten. Damit unterschieden sich diese distal der
99
Transitionszone befindlichen Axone deutlich von den direkt aus dem Rückenmark
ausgewachsenen Axone. Es ist daher davon auszugehen, dass es sich bei der in der
vorliegenden Arbeit beschriebenen Sprossungsreaktion von Axonen direkt aus dem
Rückenmark nicht um solche präsexistenten anastomosierenden Axone handelt.
Reaktion der Spinalganglienneurone auf Axotomie des zentralen Fortsatzes ist minimal
Zahlreiche Studien in der Vergangenheit haben gezeigt, dass Spinalganglienneurone
nach Durchtrennung ihres peripheren Fortsatzes mit Chromatolyse reagieren, ihre
elektrophysiologischen Eigenschaften verändern und regenerative Reaktionen wie die
gesteigerte Expression von cJun and GAP43 zeigen (Lieberman, 1971; Himes and
Tessler, 1989; Chong et al., 1994; Chong et al., 1996b; Vestergaard et al., 1997; Broude
et al., 1997; McKay et al., 2002; Ma et al., 2003). Diese kurzfristig anlaufende Reaktion
auf Genebene mündet schließlich in eine Regeneration des peripheren Fortsatzes
(Belyantseva and Lewin, 1999). Wird die Reinnervation des Zielgebiets nicht erreicht,
sterben die meisten Neurone (z.B. Karchewski et al., 2002). Im Gegensatz dazu zeigen
die meisten Studien, dass Spinalganglienneurone nach Durchtrennung ihres zentralen
Fortsatzes keine wesentlichen Reaktionen zeigen. Es finden weder Chromatolyse noch
gesteigerte cJun oder GAP-43-Expression statt. Letztere konnte nur in einer kleinen
Population verletzter Neurone gefunden werden (Broude et al., 1997; Zhang et al.,
2000; Wallquist et al., 2004). Eine signifikante neuronale Degeneration konnte selbst
nach längeren Beobachtungszeiträumen nicht beobachtet werden (Cragg, 1970;
Aldskogius and Kozlova, 2002). Eine Regeneration von zentralen Fortsätzen in die
Schwann-Zellumgebung des distalen Hinterwurzelanteils wurde zwar beobachtet, ist
aber offenbar sehr gering (Jenkins et al., 1993;Broude et al., 1997; Aldskogius and
Kozlova, 2002; Wallquist et al., 2004). Sowohl die Expression Regenerations-
assoziierter Proteine als auch die Regeneration des zentralen Fortsatzes kann durch das
Einbringen von wachstumsfördendem Material wie peripherem oder fetalen Nervengebe
gesteigert werden (Chong et al., 1996; Broude et al., 1997). Dies ist auch möglich durch
eine zusätzliche Verletzung des peripheren Nerven, wodurch die Reaktionsfreudigkeit
des Neurons gesteigert wird (Chong et al., 1999). Die Empfindlichkeit und die
Regenerationsfähigkeit sind außerdem bei verschiedenen Neurongrößen
unterschiedlich. Elektrophysiologische Veränderungen nach Rhizotomie waren nur in
100
großen Neuronen zu beobachten (Ma et al., 2003), und die gesteigerte Expression von
cJun und des Adhäsionsmoleküls CHL1 (close homologue of L1) wurden nach
Hintwurzelverletzung und Einbringen von fetalem Gewebe nur in kleinen und
mittelgroßen Neuronen gezeigt (Broude et al., 1997; Zhang et al., 2000).
Mittlere und große sensorische Neurone, welche den spezifischen hochaffinen BDNF-
Rezeptor exprimieren, synthetisieren unter physiologischen Bedingungen keine großen
Mengen BDNF. Sie zeigen jedoch nach Verletzung eine deutliche Steigerung der
BDNF Synthese (Michael et al., 1999; Zhou, 1999). Dieser Eigenschaft wurde eine
autokrine Überlebensfunktion der offensichtlich vulnerablen großen sensorischen
Neurone zugeschrieben (Karchewski et al., 2002).
Im Material der vorliegenden Arbeit waren die Veränderungen sechs Monate nach
Durchtrennung der Hinterwurzel auf eine leichte strukturelle Störung der Faserstränge
und Neurongruppen innerhalb des Spinalganglions beschränkt. Die Morphologie der
Neurone erschien im Vergleich zur unverletzten Seite unverändert und die Neurondichte
innerhalb des Ganglions war nicht wesentlich verringert, was gegen eine drastische
Reduktion der Neuronanzahl spricht. Daher bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit
frühere Studien, indem gezeigt wird, dass die Rhizotomie auch in Kombination mit
Vorderwurzelausriss und -replantation in diesem Modell kein massives Absterben von
Neuronen im Spinalganglion verursacht. Die Histogramme zur Analyse der
Größenverteilungen der Neurone zeigen Populationen kleiner und mittelgroßer Neurone
(Zellkörperfläche bis 2500 µm2) und großer Neurone (Zellkörperfläche >2500 µm2) von
etwa 80% bzw. 20% auf den unverletzten Seiten. Interessanterweise zeigte sich eine
Tendenz zur Abnahme des relativen Anteils großer Neurone auf den verletzten Seiten,
was darauf hindeutet, dass diese Neuronpopulation empfindlicher gegenüber der
Verletzung seines zentralen Fortsatzes sein könnte, wie dies schon in früheren Studien
vermutet wurde (s.o.). Diese Beobachtung könnte auch Folge von Schrumpfung bzw.
degenerativen Prozessen als Langzeitfolgen der Verletzung sein. Hinzu kommt, dass in
unserem Modell die begleitende motorische Denervation Auswirkung auf
beispielsweise große propriozeptive Neurone des Spinalganglions haben könnte. Unsere
Beobachtungen werden durch jüngste Befunde unterstützt, die 30 und 60 Tage nach
dorsaler Rhizotomie einen spezifischen Verlust großer sensorischer Neurone zeigte
(Guseva and Chelyshev, 2006).
101
Regenerierte Axone der Hinterwurzeln hatten in allen Fällen signifikant kleinere
Durchmesser als auf den unverletzten Seiten. Dies bestätigt frühere Beobachtungen,
dass regenerierte Axone im Vergleich kleinere Durchmesser haben (Morris et al.,
1972a; Morris et al., 1972b; Schroder, 1972). Die Messungen zur Dokumentation der
Größenverteilung der myelinisierten Axone innerhalb des Spinalganglion zeigten
deutlich mehr kleinere Axone auf den verletzten Seiten als auf den unverletzten Seiten.
Dies war besonders deutlich in der Kontroll- und der CNTF-Gruppe. Die Axone, die
innerhalb des Spinalganglions analysiert wurden, repräsentieren natürlich eine
gemischte Population von peripheren und zentralen Fortsätzen der sensorischen
Neurone. Lekan et al. (Lekan et al., 1997) zeigten, dass Spinalnervenverletzungen eine
Sprossung der zentralen Fortsätze der überlebenden sensorischen Neurone induziert,
was sich dann im Einwachsen zahlreicher Axone mit kleinem Durchmesser in die
Hinterwurzel spiegelt. Intra-ganglionäre Sprossung von regenerierten zentralen und
peripheren Fortsätzen als Ursache der Erhöhung des Verhältnis sehr kleiner Axone im
vorliegenden Experiment erscheint unwahrscheinlich, da sich Neurondichte und
Axondichte zwischen verletzten und unverletzten Seiten in den verschiedenen Gruppen
nicht unterschieden. Es erscheint daher wahrscheinlicher, dass es sich bei den kleinen
myelinisierten Axone um regenerierte zentrale Fortsätze handelt, die kleinere
Durchmesser als die unverletzten haben. Eine notwendige Voraussetzung für diese
Argumentation wäre, dass die Rhizotomie zu einer retrograden Degeneration bis auf
Höhe des Zellkörpers führen würde.
Die Analyse der Veränderungen innerhalb des Spinalganglions bei den verschiedenen
Versuchsgruppen ergab einige unerwartete und interessante Beobachtungen, die zum
jetzigen Zeitpunkt schwierig zu interpretieren sind: Zum einen war die Abnahme des
relativen Verhältnisses großer Neurone in der CNTF+BDNF-Gruppe nicht zu
beobachten. Auch die Veränderung des relativen Anteils der kleinsten Axone war in der
BDNF und in der CNTF+BDNF-Gruppe nicht zu finden. In Anbetracht des engen
Kontakts der durchtrennten Hinterwurzeln mit der Replantationsstelle und damit auch
mit dem faktorenhaltigen Fibrinkleber erscheint es möglich anzunehmen, dass die
verletzten Neurone Kontakt zu den neurotrophen Faktoren hatten. Dies könnte die
Reduktion der Schrumpfung bzw. des Zelltods großer Neurone und des Ausmaßes der
Degeneration der zentralen Fortsätze zur Folge gehabt haben. Diese Hypothesen sind
102
natürlich hochspekultativ und müssten in weiteren Experimenten, die für diese
Fragestellung konzipiert wurden, bewiesen werden.
Wege der regenerierten Hinterwurzelaxone zeigen möglicherweise Einfluss auf die regenerierende Vorderwurzel
In der vorliegenden Arbeit konnte das Vorhandensein zahlreicher zentraler Fortsätze der
verletzten Spinalganglienneurone in allen Versuchstieren gezeigt werden. Diese Axone
waren gut myelinisiert und sie bildeten einzelne Bündel. Eine Hülle, die der Hülle der
unverletzten Seite glich, schied die regenerierten Hinterwurzeln ein und grenzte deren
Ausläufer nach dorsal ab. Innerhalb der Hülle erreichten die zentralen Axone
beträchtliche Längen. Alle Fortsätze endeten blind, ohne Anschluß an das Rückenmark
zu erlangen. Frühere Studien haben gezeigt, dass auch wenn die Regenerationskapazität
zentraler Fortsätze im Vergleich mit den peripheren Fortsätzen eingeschränkt ist
(Aldskogius and Kozlova, 2002), eine beträchtliche Regeneration stattfinden kann,
wenn die zentralen Fortsätze mit peripheren Nerveninterponaten verbunden oder mit
Neurotrophen Faktoren versorgt werden. Dies kann auch mit einer sog.
präkonditionierenden Verletzung des peripheren Fortsatzes erreicht werden (Chong et
al., 1999). Im vorliegenden Modell hat die motorische Denervation sicherlich zu
veränderter afferenter Aktivität geführt- z.B. in propriozeptiven Neuronen- was dann
eine regenerative Aktivität zur Folge gehabt haben könnte. Überraschendes Ergebnis
dieser Untersuchungen war, dass einige der regenerierten Hinterwurzelaxone in
Richtung der nahen replantierten Vorderwurzel gewachsen sind. Da dieses Verhalten
der Hinterwurzelaxone in allen Gruppen beobachtet wurde, erscheint es nicht
wahrscheinlich, dass die Anwesenheit der zusätzlich in den Fibrinkleber gemischten
Faktoren Ursache dafür ist. Dieses Phänomen war allerdings ausgeprägter in denjenigen
Tieren zu sehen, die ein großes Zerstörungsausmaß des Rückenmarks zeigten.
Umgekehrt war in wenig zerstörtem Rückenmark kaum ein Wachstum der
Hinterwurzelaxone in Richtung Vorderwurzel zu beobachten. Eine mögliche Erklärung
könnte folgendermaßen aussehen: Die Durchblutung der Wurzelscheiden und des
Rückenmarks kommen möglicherweise aus der dem gleichen Gefäß. Unterschiede der
Durchblutung und der daraus resultierenden allgemeinen Verletzungsantwort könnten
dann sowohl die Rückenmarksschädigung den Einschluss des Hinterwurzelstumpfes in
die extraspinale Narbe, als auch die Auflösung der Wurzelscheiden verursachen.
103
Keines der Axone, die vom Hinterwurzelstumpf nach medial gewachsen waren, zeigte
eine Verbindung zum Rückenmark. Es hatte jedoch den Anschein, dass einige
regenerierte zentrale Fortsätze in die Peripherie Richtung Spinalnerven zeigten.
Somit ergibt die voliegende Arbeit keine Hinweise darauf, dass regenerierende
Hinterwurzelaxone in der Lage sind, entlang der replantierten Vorderwurzeln in das
Rückenmark einzuwachsen, wie früher vorgeschlagen wurde (Carlstedt, 2000). Sie
scheinen jedoch möglicherweise in der Lage zu sein, in die replantierten Vorderwurzeln
über Lücken der einhüllenden Scheiden einzuwachsen. Damit könnten sie die
„conduits“ aus Schwann-Zellen, die als Leitschiene für die Vorderwurzelaxone dienen
sollen, besetzen, und statt der Vorderwurzelaxone nach distal wachsen. Letztendlich
besteht dann die Gefahr, dass damit eine qualitativ und quantitativ hochwertige
Regeneration der Vorderwurzelaxone zusätzlich erschwert wird.
104
Zusammenfassung Als Therapieversuch bei Plexusläsionen wird die Replantation ausgerissener
Vorderwurzelfasern durchgeführt. Voraussetzung für die erfolgreiche Regeneration von
Motoneuronaxonen sind 1. Überleben einer ausreichenden Anzahl von Motoneuronen 2.
erfolgreiche Wiederherstellung der Kontuität ausgerissener Axone mit dem
Rückenmark und 3. funktionelle Hochwertigkeit regenerierter Axone. Neurotrophe
Faktoren können Überleben und Regenerationsfähigkeit von Motoneuronen fördern.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Analyse des Einflusses von CNTF und
BDNF auf die Regeneration von Motoneuronaxonen nach Ausriss und Replantation im
Segment C7 nach einer Überlebenszeit von 3 Wochen bzw. 6 Monaten. Vervollständigt
wurden diese Untersuchungen durch detaillierte morphologische Analysen von
Spinalganglien, durchtrennter Hinterwurzel und verletztem Hinterhorn.
In verschiedenen Gruppen von adulten Kaninchen wurden CNTF, BDNF, oder beide
Faktoren auf die ventrolaterale Replantationsstelle appliziert, Kontrollen wurden ohne
Faktor belassen (n≥5). Die Überlebenszeit der Versuchstiere lag bei 3 Wochen (n=3
Kontrollen) und 6 Monaten (n=27). Aus dem perfundiertem Gewebe wurden
Semidünnschnitte durch Vorderwurzel/Spinalganglien und Kryostatserienschnitte durch
das Segment C7 angefertigt. DiI-Fluoreszenztracing, Markscheidenfärbung, eine
modifizierte Klüver-Barrera-Färbung der Kryostatschnitte sowie eine
Touloidinblaufärbung der Semidünnschnitte ermöglichte die morphologische und
morphometrische Analyse des Gewebes.
Die Anzahl der überlebenden Motoneurone lag nach sechs Monaten bei allen
Versuchsgruppen bei etwa 30%. Fluoreszenz-Tracing und Markscheidenfärbungen von
Serienschnitten zeigten, dass Axone sowohl über die ursprünglichen ventralen
Austrittstellen als auch über die ventrolaterale Replantationsstelle das Rückenmark
verließen und im Bereich des Spinalganglions eine kompakte Vorderwurzel bildeten.
Ventral austretende Axone zeigten signifikant größere Durchmesser als lateral
austretende. Ausmaß und Art der Regeneration waren interindividuell unterschiedlich,
die besten Ergebnisse zeigte die Replantation nah am ursprünglichen Austrittsort der
Vorderwurzel. Unterschiede zwischen den Gruppen waren nicht deutlich. In
Semidünnschnitten durch die regenerierte Vorderwurzel fanden sich nach drei Wochen
105
kaum intakte, myelinisierte Axone, nach sechs Monaten war die Zahl der Axone auf
etwa 45% der Zahl der gesunden Seite angestiegen. Regenerierte Axone waren dünn,
typische Motoneuronaxone stellten nur einen kleinen Teil der regenerierten Axone.
Gruppenunterschiede fanden sich im Axon-Myelinverhältnis, das bei Kontrollen der
replantierten Seiten signifikant erniedrigt war. Diese Erniedrigung war noch vorhanden,
jedoch nicht mehr signifikant bei Tieren, die mit CNTF- und BDNF-behandelt wurden.
Die replantierten Vorderwurzeln der CNTF+BDNF-Gruppe zeigte überwiegend eine
signifikant bessere Myelinisierung als die replantierten Kontrollen.
An der früheren Hinterwurzeleintrittszone am Rückenmark wurden in Tieren mit
geringem Verletzungsausmaß kleine ZNS-Gewebsprotrusionen beobachtet, in denen
sich myelinisierte Axone befanden. Diese Axone zeigten eine Wachstumsrichtung in die
Peripherie, was auf eine Sprossung der sensorischen Rückenmarksneurone schließen
lässt. Innerhalb des Spinalganglions waren Neuron- und Axondichte auf den verletzten
Seiten nicht wesentlich verändert. Eine leichte Abnahme des relativen Anteils großer
Neurone und Axone wurde in den verletzten Seiten der Kontrollgruppe beobachtet. Für
Axone war diese Abnahme statistisch signifikant. Im Gegensatz dazu war dies in
Tieren, die mit neurotrophen Faktoren behandelt wurden, nicht zu beobachten. Bei allen
Tieren zeigte sich ein beträchtliches Auswachsen von Hinterwurzelaxonen aus dem
Spinalganglion. Diese Axone fanden keine spontane Verbindung mit dem proximalen
Rest der Wurzel, sondern waren durch Bindegewebe eingehüllt. Bei etwa der Hälfte der
Tiere zeigte sich, dass einer Untergruppe dieser Axone in Richtung des Narbengewebes
der replantierten Vorderwurzel gewachsen war und über Defekte in der
Bindegewebshülle teilweise sogar in die Vorderwurzel einwuchsen.
Ein möglicher Einfluss der applizierten neurotrophen Faktoren auf das quantitative
Regenerationsergebnis scheint also in diesem Modell gering zu sein. Auf eine
qualitative Verbesserung deutet die Normalisierung des Axon-Myelinverhältnisses
großer regenerierter Axone bei Kombinationsbehandlung hin. Die im vorliegenden
Modell beträchtliche Regenerationskapazität der Hinterwurzel scheint bisher
unterschätzt worden zu sein. Das unerwartete Einwachsen von Hinterwurzelaxonen in
die Vorderwurzel könnte mit einer funktionellen Beeinträchtigung der regenerierten
Vorderwurzel verbunden sein.
106
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Danksagung Diese Seite meiner Dissertation ist denen gewidmet, denen ich zu großem Dank für das Gelingen meiner Arbeit in den letzten vier Jahren verpflichtet bin: Allen voran danke ich Frau Professorin Dr. Esther Asan für ihren unermüdlichen Einsatz für mich und meine Arbeit, ihre engagierte Betreuung und für die vielen Stunden, die sie meiner Arbeit gewidmet hat. Weiter danke ich ihr, dass sie mir ermöglicht hat, die Daten dieser Arbeit zu veröffentlichen und in Form von Postern bzw. Vorträgen auf Kongressen zu präsentieren. Einen herzlichen Dank dafür, dass sie auch für Anliegen außerhalb meiner Dissertation offene Ohren hatte und für mich damit auch mehr geworden ist, als meine wissenschaftliche Lehrerin. Nicht zuletzt gilt mein Dank an Sie auch dafür, dass ich als ihr „Assistent“ in den Kursen der Anatomie viel von ihr lernen konnte. Herrn Professor Dr. Detlev Drenckhahn danke ich für die Überlassung des Themas meiner Dissertation an seinem Institut und für die freundliche und interessierte Unterstützung meiner Arbeit. Frau Dr. Eva Lang bin ich zu großem Dank verpflichtet, da ihre experimentellen Arbeiten zu ihrer Habilitation im Fach für Plastische- und Handchirurgie die Voraussetzung für die Entstehung dieser Dissertation auf diesem interessanten Gebiet war. Sie ermöglichte mir eine Famulatur in ihrer Abteilung und durch ihre Kontakte zu Prof. Carlstedt eine Famulatur an der Einheit für periphere Nervenchirurgie in London. Dadurch konnte ich sehen wie die wissenschaftliche Theorie dieser Arbeit in der klinischen Umsetzung lebendig wurde, was für mich die wichtigste Motivationsquelle in den letzten vier Jahren war. In vielen interessanten und freundschaftlichen Gesprächen war Eva Lang ein entscheidender Motor, der das Gelingen der Arbeit ermöglichte. Rita Herrmann, Karin Reinfurt-Gehm und Sieglinde Schenk gilt mein besonderer Dank. Sie haben mich in sehr netter Atmosphäre mit den notwendigen Techniken im Labor vertraut gemacht. Durch ihre große Hilfe beim Anfertigen und Färben der immensen Anzahl an Gewebeschnitten für diese Arbeit gaben sie mir die Möglichkeit den Anforderungen in meinem Medizinstudium auch während der Dissertation gerecht zu werden. Allen Mitarbeitern des Anatomischen Instituts danke ich für die freundliche und immer hilfsbereite Arbeitsatmosphäre. Meinen Eltern Elisabeth und Volker danke ich dafür, dass sie mir dieses Studium ermöglicht haben und mir durch ihre Unterstützung die Möglichkeit gaben, viele Herausforderungen der vergangenen Jahre zu bewältigen.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Schlegel
Vorname Nicolas
Familienstand ledig
Geburtsdatum/ort 23.01.1979; Lörrach
Anschrift: Wagnerstraße 12; 97080 Würzburg
Schulbildung
1985-1989 Erich-Kästner Grundschule Donaueschingen
1989-1998 Fürstenberg Gymnasium Donaueschingen; Abitur
Zivildienst
1998-1999 Ambulante Alten- und Krankenpflege in der Caritas Sozialstation St. Elisabeth in Donaueschingen
Hochschulbildung
2000 -2006 Studium der Humanmedizin an der Bayerischen Julius-Maximilian Universität Würzburg
2002 Juli/August Famulatur im Fach Allgemein- und Viszeralchirurgie im Krankenhaus Villingen
2002 September/Oktober Famulatur im Fach Plastische- und Handchirurgie am Universitätsklinkum Freiburg
2003 März Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung
2004 Januar Dritter Preis in der Kategorie „Vorträge” am Promomed-Kongress in Würzburg
2004 Juli/August Famulatur im Fach Anästhesie und Intensivmedizin im Juliusspital Würzburg
2004 September/Oktober Praxisfamulatur im Fach Allgemeinmedizin/Innere Medizin in Donaueschingen
2005 März Teilnahme am 1. Münchner Operationskurs für Mikrochirurgie unter der Leitung von Prof. Dr. Stock
2005 April Famulatur am Royal National Orthopedic Hospital London-Stanmore in der Abteilung für periphere Nervenchirurgie
2005 September Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung
2005/2006 Praktisches Jahr 1. Tertial: Innere Medizin (Missionsärztliche Klinik
Würzburg) 2. Tertial: Chirurgie (Zentrum operative Medizin des
Universitätsklinikums Würzburg) 3. Tertial: Anästhesie (Anästhesiologische Klinik und
Poliklinik der Universität Würzburg) Oktober 2006 Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung;
Approbation zum Arzt Oktober 2006 Einreichung der Dissertation zum Thema „Reaktive
Veränderungen von Rückenmark und Nervenwurzeln nach dorsaler Rhizotomie sowie Ausriss und Replantation der Vorderwurzel im Segment C7 mit Applikation neurotropher Faktoren CNTF und BDNF“
Berufliche Tätigkeit seit Oktober 2006 Wissenschaftlicher Assistent am Institut für Anatomie und
Zellbiologie der Universität Würzburg
Sonstige Tätigkeiten
1999-2000 Ausbildung zum Rettungssanitäter an der Landesschule für Rettungsdienst in Bad Dürrheim
2000-2002 Anstellung als Pflegekraft im Juliusspital Würzburg
2002 Studentischer Tutor am Institut für Physiologie Würzburg
2002- 2004 Leiter und Kassenwart der Seg-Med e.G. Hochschulgruppe Würzburg
2003-2006 Studentischer Tutor in Histologie und Makroskopischer Anatomie am Institut für Anatomie und Zellbiologie Würzburg
Würzburg, im Oktober 2006 Nicolas Schlegel