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Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover

Molekulargenetische Untersuchungen zur Vererbungvon Atresia coli beim Rind

INAUGURAL-DISSERTATIONzur Erlangung des Grades eines

DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAEdurch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt vonAnne Kempers

aus Mönchengladbach

Hannover 2000

Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. B. Harlizius

1. Gutachter: PD Dr. B. Harlizius

2. Gutachter: Prof. Dr. H. J. Hedrich

Tag der mündlichen Prüfung: 29. Mai 2000

Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft, die FAZIT-Stiftung, Frankfurt,

und das Niedersächsische Ministerium für Wissenschaft und Kultur.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung.....................................................................................................................1

2 Literaturübersicht ......................................................................................................2

2.1 Atresia coli .................................................................................................................2

2.1.1 Vorkommen beim Kalb......................................................................................2

2.1.2 Vorkommen bei anderen Spezies.......................................................................5

2.1.3 Auftreten im Zusammenhang mit Syndromen...................................................5

2.1.4 Ätiologie.............................................................................................................6

2.1.4.1 Darmentwicklung...........................................................................................6

2.1.4.2 Entstehungstheorien zu Atresia coli...............................................................9

2.1.4.3 Vererbung.....................................................................................................10

2.1.4.4 Kandidatengene............................................................................................13

2.2 Positionelle Klonierung mit genetischen Markern ..................................................15

2.2.1 Genetische Marker und Genomkarten..............................................................15

2.2.2 Parametrische Kopplungsanalyse.....................................................................19

2.2.3 Nichtparametrische Kopplungsanalyse............................................................20

2.2.4 Assoziationsanalyse .........................................................................................22

2.3 Schlußfolgerungen ...................................................................................................23

3 Material......................................................................................................................24

3.1 Tiere .........................................................................................................................24

3.1.1 Familienauswahl...............................................................................................24

3.2 Auswahl der Marker ................................................................................................27

4 Methoden ...................................................................................................................28

4.1 Abstammungsanalyse ..............................................................................................28

4.2 Simulation der Mächtigkeit......................................................................................28

4.3 Typisierung der Mikrosatelliten-Marker..................................................................29

4.3.1 DNA-Isolierung................................................................................................29

4.3.2 Polymerasekettenreaktion ................................................................................31

4.3.3 Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese ............................................32

4.4 Statistische Auswertung...........................................................................................34

4.4.1 Allelfrequenzschätzung und Berechnung des Informationsgehaltes ...............34

4.4.2 Parametrische Kopplungsanalyse.....................................................................34

4.4.2.1 Zweipunkt-Analyse ......................................................................................34

4.4.2.2 Mehrpunkt-Analyse......................................................................................35

4.4.3 Nichtparametrische Kopplungsanalyse............................................................36

4.4.4 Weiterführende Berechnungen zu Familie 2....................................................36

4.4.5 Haplotypenbestimmung ...................................................................................36

4.4.6 Assoziationsanalyse .........................................................................................37

4.5 Entwicklung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus im MYF5-Gen...38

4.5.1 Polymerasekettenreaktion von MYF5-Genfragmenten ...................................38

4.5.2 Restriktionsenzymabbau ..................................................................................39

5 Ergebnisse..................................................................................................................40

5.1 Analyse der Vorberichte und Abstammungsdaten ..................................................40

5.2 Simulation zur Abschätzung der Mächtigkeit..........................................................42

5.3 Kopplungsanalyse von Pedigree Set 1.....................................................................44

5.3.1 Allelfrequenzen und Markerset........................................................................44

5.3.2 Zweipunkt-Analyse ..........................................................................................45

5.3.3 Mehrpunkt-Analyse..........................................................................................46

5.4 Pedigree-Erweiterung und Feinkartierung...............................................................47

5.4.1 Zweipunkt-Analyse ..........................................................................................47

5.4.2 Mehrpunkt-Analyse..........................................................................................50

5.4.3 Betrachtung der Einzelfamilien für BTA 5......................................................52

5.5 Assoziationsanalyse .................................................................................................56

5.6 Genetischer Marker im MYF5-Gen.........................................................................58

5.7 Zusammenfassung der Ergebnisse...........................................................................60

6 Diskussion..................................................................................................................61

6.1 Abstammungsanalyse ..............................................................................................61

6.2 Simulation................................................................................................................62

6.3 Ergebnisse der Kopplungsanalysen .........................................................................63

6.3.1 Computerprogramme für die statistische Auswertung.....................................67

6.4 Ergebnisse der Assoziationsanalyse ........................................................................68

6.5 Chromosom 5 des Rindes und vergleichende Genomkarte .....................................68

7 Zusammenfassung ....................................................................................................71

8 Summary....................................................................................................................73

9 Literaturverzeichnis .................................................................................................75

10 Anhang.......................................................................................................................98

10.1 Einsendebogen .....................................................................................................98

10.2 Primer...................................................................................................................99

10.3 Haplotypenanalyse des proximalen Abschnitts von BTA 5...............................104

10.4 Chemikalien und Lösungen................................................................................106

10.4.1 Puffer und Stammlösungen ............................................................................106

10.4.2 Längenstandards.............................................................................................108

10.4.3 Enzyme...........................................................................................................109

10.4.4 Kits zur DNA-Isolierung................................................................................110

10.5 Geräte und Verbrauchsmaterial..........................................................................110

10.6 Computerprogramme und Rechensystem ..........................................................112

Abkürzungsverzeichnis:

Acc. no. Accession number

APS Ammoniumpersulfat

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

BTA Chromosom vom Rind (Bos taurus)

CGD Cattle Genome Database

cM centiMorgan

CSIRO Commonwealth Scientific and Industrial Research

Organisation. Molecular Animal Genetics Centre, Brisbane,

Australia

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EDN 3 Endothelin 3

EDNRB Endothelin Rezeptor B

GDNF glial derived neurotrophic factors

HF Holstein Friesian

HNF hepatocyte nuclear factor

HSCR Hirschsprung-Erkrankung

kb Kilobasenpaare

Lod logarithm of the odds

LWFS lethal white foal syndrome

MYF 5 myogenic factor 5

NPL non parametric Lod-Score/ nichtparametrischer Lod-Wert

p Irrtumswahrscheinlichkeit

p.a. pro analysis

PAA Polyacrylamid

PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion

RET Tyrosinkinase-Rezeptor

RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus

s Sekunde

srp serpent

TEMED N-N-N`-N`-Tetramethylethylendiamin

USDA United States Department of Agriculture

WS4 Waardenburg-SHA-Syndrom 4

1 Einleitung 1

_________________________________________________________________________

1 Einleitung

Intestinale Atresien sind angeborene Mißbildungen, die einen vollständigen Darm-

verschluß bewirken. Sie treten bei unterschiedlichen Tierarten und beim Menschen auf.

Der Defekt Atresia coli wird nur beim Rind vermehrt beobachtet, bei anderen Spezies wird

sporadisch davon berichtet. Der Darmverschluß führt ohne chirurgischen Eingriff in den

ersten Lebenstagen zum Tod durch Autointoxikation. An der Tierärztlichen Hochschule

Hannover wurde eine Häufung der Atresia coli-Fälle bei Kälbern der Rasse Deutsche

Holstein beobachtet. Tiere beiderlei Geschlechts sind betroffen. Eine Operation ist

aufwendig, und die Überlebensraten sind gering (FUBINI 1990, MARTENS et al. 1995).

Die Ätiologie der Erkrankung ist nicht eindeutig geklärt. Aufgrund der Vielzahl der Fälle

bei einer Rasse und eines übereinstimmenden pathologischen Bildes wird eine genetische

Ursache vermutet. Eine US-amerikanische Arbeitsgruppe (SYED u. SHANKS 1992a)

beobachtete einen Anstieg der Defektfrequenz nach gezielten Paarungen in einer Holstein

Friesian-Herde, der mit einem monogen rezessiven Erbgang übereinstimmte. Andere

Arbeiten widersprechen dieser Hypothese, so wird z.B. das Auftreten eines einzelnen

Defekttieres bei einem eineiigen Zwillingspaar beschrieben (HOFFSIS u. BRUNER 1977).

Eine Untersuchung des Erbganges mit Hilfe von Kreuzungsversuchen ist durch das lange

Populationsintervall beim Rind und die Schwierigkeit, Merkmalsträger aufzuziehen,

problematisch. Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe von molekulargenetischen Methoden

eine etwaige Vererbung zu bestätigen. Es sollen nach Möglichkeit der Erbgang geklärt und

Genomregionen gefunden werden, die mit der Krankheit gekoppelt vererbt werden. Dazu

wurde am Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule

Hannover Material von über 300 betroffenen Tieren gesammelt und ein Genomscan mit

genetischen Markern über das gesamte bovine Genom durchgeführt. Im Rahmen dieser

Arbeit soll das verwendete Markerset ergänzt und vervollständigt werden. Auffällige

Genomregionen sollen mit weiteren Markern untersucht werden, um die Ergebnisse zu

bestätigen und eventuelle Kandidatengene zu identifizieren.

2 Literaturübersicht 2

_________________________________________________________________________

2 Literaturübersicht

2.1 Atresia coli

2.1.1 Vorkommen beim Kalb

Seit dem 19. Jahrhundert wird von Darmmißbildungen bei Kälbern berichtet (MECKEL

1812, GURLT 1832). Es sind Atresien, angeborene Verschlüsse, in allen Darmabschnitten

beobachtet worden (LENGHAUS u. WHITE 1973, KRAMME 1989). Weitere

Mißbildungen wie Urogenital-, Gehirn- und Skelettmißbildungen (LEIPOLD et al. 1976,

PRIEUR u. DRAGATZ 1984) sind mit Atresien aufgetreten. Es werden drei Atresietypen

unterschieden (Abbildung 2.1): bei Typ I verschließt ein Septum den Darm, bei Typ II

verbindet ein bindegewebiger Strang die beiden Blindenden und bei Typ III sind die

Blindenden vollständig getrennt.

Typ I:

Typ II:

Typ III:

Abb. 2.1: Typeneinteilung der Colonatresie

Die Atresia coli tritt beim Kalb häufiger auf als Atresien anderer Darmabschnitte

(GODGLÜCK 1968, SMITH 1984, FUBINI 1986, DUCHARME et al. 1988b,

CONSTABLE et al. 1989). Dabei betrifft die Atresie fast ausschließlich die Ansa spiralis

coli des Colon ascendens (FUNBINI 1990, SMITH 1991).


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Neben Einzelfällen (McGEADY et al. 1967, HOFFSIS u. BRUNER 1977, SMITH 1982)

berichteten BENDA et al. (1978), SCHLEGEL et al. (1981), JOHNSON et al. (1983),

CHIHAYA et al. (1983), DUCHARME et al. (1988b), CONSTABLE et al. (1989),

SMITH et al. (1991) und SYED und SHANKS (1992b) von gehäuftem Auftreten von

Atresia coli beim Kalb. Bei den Beobachtungen der gehäuften Fälle sind in der Regel keine

weiteren Defekte an den Tieren festgestellt worden.

Bei BENDA et al. (1978) und SCHLEGEL et al. (1981) stammten die erkrankten Kälber

von Jersey, Schwarzbuntem Rind, Schwarzbuntem Milchrind, Holstein- bzw. British-

Friesian und ihren Kreuzungen ab. In den Studien der anderen Autoren machten Tiere der

Rasse Holstein Friesian (HF) 80-100 % der Betroffenen aus. CONSTABLE et al. (1997)

stellten in einer Literaturstudie fest, daß in 94 % aller dokumentierten Fälle Holstein

Friesian-Kälber von Atresia coli betroffen waren, und schlossen auf eine

Rassendisposition.

An der Tierärztlichen Hochschule Hannover wurde in den letzten Jahren verstärkt die

Diagnose Atresia coli gestellt. In den Jahren 1994 und 1995 sind am Institut für Pathologie

der Tierärztlichen Hochschule 43 Kälber mit Darmmißbildungen untersucht worden. Dabei

wurde in 36 Fällen die Diagnose Atresia coli Typ III gestellt (Abbildung 2.2), 7 Tiere

hatten andere oder zusätzliche Veränderungen. Soweit die Rasse dokumentiert wurde,

handelte es sich bei allen Kälbern bis auf eine Ausnahme um Deutsche Holsteins (31

Tiere); ein Tier war eine Holstein-Kreuzung (Dr. Hedda Kriesten, pers. Mitteilung,

Hannover 1997).


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Abb. 2.2: Beispiel für eine Atresia coli Typ III

Diagnose und Prognose:

Diagnostisch ist die Atresia coli von anderen Erkrankungen durch das typische klinische

Erscheinungsbild in den ersten Lebenstagen zu unterscheiden, nur eine Verwechslung mit

anderen intestinalen Atresien mit Ausnahme der Atresia ani ist möglich (BERCHTOLD

1985, DREYFUSS 1989, FUBINI 1986). SMITH et al. (1991) berichteten, daß in 66

Fällen immer die richtige symptomatische Diagnose gestellt worden war, die durch

Laparotomie bestätigt wurde. Die Kälber beiderlei Geschlechts zeigten übereinstimmende

Krankheitsverläufe und pathologische Befunde (BENDA et al. 1978, SCHLEGEL et al.

1981, DREYFUSS u. TULLENERS 1989, FUBINI 1990, MODIC u. ZADNIK 1994). Sie

waren nach der Geburt vital und saugten den ersten Tag gut. Sie setzten jedoch kein

Mekonium ab und wiesen im Enddarm nur zähen Schleim auf. Im Laufe der folgenden

Tage entwickelten sie Saugunlust und wurden apathisch. Kolikerscheinungen waren nicht

oder nur geringgradig vorhanden, das Abdomen war in unterschiedlichem Ausmaß


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aufgetrieben. Ohne chirurgischen Eingriff verstarben sie zwischen dem 2. und 20. Tag post

partum an Autointoxikation oder wurden euthanasiert. Unterschiedliche Operations-

methoden wurden von SCHLEGEL et al. (1981), BERCHTOLD et al. (1985),

DUCHARME et al. (1988b), CONSTABLE et al. (1989), FUBINI (1990), SMITH et al.

(1991), JANG et al. (1994) und MARTENS et al. (1995) diskutiert, jedoch konnten in

keiner Studie befriedigende Überlebensraten erzielt werden.

LENGHAUS u. WHITE (1973) und BENDA et al. (1978) hielten es für möglich, daß

Defektkälber von den Betreuern nicht erkannt und für lebensschwache Kümmerer gehalten

werden. Sie vermuteten generell ein weit höheres Auftreten in der Population als

dokumentiert wird.

2.1.2 Vorkommen bei anderen Spezies

Die Kolonatresie ist bei weiteren Spezies beschrieben worden, insbesondere beim Pferd

(ESTES u. LYALL 1979, OVERBAUGH 1983, CHO u. TAYLOR 1986, ANDERSON et

al. 1987, NAPPERT et al. 1992, YOUNG et al. 1992, BENAMOU et al. 1995). Ebenfalls

liegen Berichte von betroffenen Katzen (SCOTT et al. 1974, BAHNEMANN u. SCHALL

1986, BREDAL et al. 1994), Hunden (MULLEN 1982), Schweinen (MULLEY u.

EDWARDS 1984), Schafen (VAN DER GAAG u. TIBBOEL 1980) und einer Python vor

(FRYE 1994). Es handelte sich mit Ausnahme des Pferdes ausschließlich um Einzelfälle.

Beim Menschen wurden Darmatresien einschließlich der Colonatresie ebenfalls in der

Regel sporadisch beobachtet, jedoch berichtete BENAWRA (1981) von zwei an Atresia

coli erkrankten mütterlichen Halbgeschwistern und ihrem betroffenen mütterlichen Onkel.

2.1.3 Auftreten im Zusammenhang mit Syndromen

Die Mißbildung wird auch vergesellschaftet mit bestimmten Syndromen beschrieben. Zu

ihnen zählt die Hirschsprung-Erkrankung (HSCR) beim Menschen, bei der durch fehlende

Darmganglien ein Megacolon entsteht (CURRIE et al. 1983, KIM et al. 1995).

WIEDEKING (1970) berichtete von einem Kalb mit Atresia coli, das er für einen HSCR-

Fall hielt, allerdings wurde kein histologischer Beweis für das Fehlen der Ganglien

erbracht. Die Hirschsprung-Erkrankung tritt nicht nur isoliert, sondern auch im


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Zusammenhang mit Pigmentstörungen auf. Das Waardenburg-SHA-Syndrom (WS4) des

Menschen ist charakterisiert durch fehlende Darmganglien, Pigmentstörungen und

Taubheit. Eine weitere Erkrankung mit diesem Symptomenkomplex ist das lethal white

foal syndrome (LWFS) beim Pferd. Hier verursacht eine Mutation bei homozygotem

Auftreten das Erscheinungsbild meist vollständig unpigmentierter Fohlen mit Megacolon

(METALLINOS et al. 1998, SANTSCHI et al. 1998). Ähnliche Symptome beim Rind

weist die white heifer-Erkrankung auf, bei der unpigmentierte Tiere mit Mißbildungen an

den Geschlechtsorganen beobachtet werden. Es ist ein Fall bekannt, bei dem die white

heifer-Erkrankung zusammen mit Atresia coli aufgetreten ist (LEIPOLD 1976).

2.1.4 Ätiologie

2.1.4.1 Darmentwicklung

In den ersten Stadien der Fruchtentwicklung findet die Induktion der Zellverbände statt,

die die spätere Differenzierung der Zellen bedingt. Während der Gastrulation bilden sich

äußeres Keimblatt (Ektoblast), aus dem u.a. das Nervensystem entsteht, inneres Keimblatt

(Entoblast), welches innere Epithelien wie das des Magen-Darm-Kanals bildet, und

mittleres Keimblatt (Mesoblast), aus dem Muskulatur, Binde- und Stützgewebe

hervorgehen. Aus dem ventralen Mesoblast entsteht nach Spaltung ein viszerales Blatt, das

sich mit dem Entoblast verbindet und die mesenchymale Grundlage einschließlich glatter

Muskulatur für die Darmwand darstellt (MICHEL 1995).

Die Darmanlage entsteht beim Rind etwa am 25. Tag nach der Befruchtung (LATSHAW

1984). Am Ende der Gastrulation liegt ein dreischichtiger, abgeplatteter Embryonalschild

vor. Der primitive Darm wird im Bereich der Grenzfurche (zwischen Embryonalschild und

Keimblase) durch Einbiegung als Darmrinne abgetrennt. Es bilden sich vordere und hintere

Darmbucht und die Mitteldarmhöhle, die mit dem Dottersack über den Dottersackstiel in

Verbindung steht. Aus dem Mitteldarm entsteht der Hauptteil des Darmkanals ab der

Mündung des Gallenganges ins Duodenum einschließlich des Colon ascendens und der

ersten Hälfte des Colon transversum. Die (linke) 2. Hälfte des Colon transversum und das

Colon descendens entstehen aus dem Hinterdarm. Es bildet sich ein einheitliches dorsales

Gekröse aus der dorsalen Gekröseanlage, die medial rückt und ventral der Wirbelanlage


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verschmilzt. Ein ventrales Gekröse entsteht nur im vorderen Darmbereich und reicht bis

zum Duodenum (Höhe Leberanlage) (MICHEL 1995).

Es folgt die Organogenese des Mittel- und Enddarmes. Durch Längenwachstum verlängert

sich das dorsale Gekröse, und es bildet sich die primitive Darmschleife. Aus dem

absteigenden Schenkel entsteht das Jejunum, aus dem Schleifenscheitel das Ileum und aus

dem Anfang des aufsteigenden Schenkels das Caecum. Der aufsteigende Schenkel und ein

kurzer, wieder horizontal verlaufender Teil bilden das Colon. In die Verlängerung des

Gekröses zieht die Arteria mesenterica cranialis in Richtung des Schleifenscheitels. Zu

Beginn der 4. Woche setzt eine Achsendrehung um diese Arterie ein. Nach Abschluß der

360° Drehung liegt das Colon in einer kaudal offenen Schleife um die Gekrösearterie

(Abbildung 2.3 a). Es wird das Colon ascendens (Abbildung 2.3 F, F`), das vor der Arterie

nach links ziehende Colon transversum (Abbildung 2.3 G) und das vorwiegend aus dem

horizontalen Teil der Schleife hervorgegangene Colon descendens (Abbildung 2.3 H)

unterschieden.

Während des Längenwachstums des Darms gelangt ein Teil der Darmschlingen in das

Außenzölom (physiologischer Nabelbruch). Nach der Weitung der Bauchhöhle kommt es

zu einer Rücklagerung.

Bei den Wiederkäuern bildet sich das Colon ascendens über ein kegelförmiges Konvolut

zu einer Kolonscheibe um, die nach rechts zwischen die Blätter des Jejunalgekröses

(Abbildung 2.3 C) geschoben wird (MICHEL 1995).

Durch abgeschluckte Amnionflüssigkeit und Fruchtschmiere bildet sich das Mekonium im

Darmrohr. Die Fruchtschmiere besteht aus abgestoßenen Epithelien und Haut-

drüsensekreten (SCHNOOR 1996).


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Abb. 2.3.: Darstellung des Darmrohrs (NICKEL et al. 1987)

A: Pylorus E: Caecum J: Rectum

B: Duodenum F, F`: Colon ascendens a: Arteria mesenterica cranialis

C: Jejunum G: Colon transversum l: Arteria mesenterica caudalis

D: Ileum H: Colon descendens


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Arteriensystem:

Die Arteria mesenterica cranialis (Abbildung 2.3 a), die aus der Dottersackarterie Arteria

omphalomesenterica dexter entsteht, zieht zur primitiven Darmschleife. Sie versorgt Colon

ascendens und transversum. Aus der unpaaren Aorta descendens gehen die dorsalen,

lateralen und ventralen Segmentalarterien ab. Die ventralen Segmentalarterien werden

ebenfalls zu Darmarterien, einschließlich der Arteria mesenterica caudalis

(Abbildung 2.3 l), die zum Darmrohr kaudal der primitiven Schleife zieht. Sie versorgt das

Colon descendens und anastomisiert mit Ästen der Arteria mesenterica cranialis (NICKEL

et al. 1984).

Nervensystem:

Der Darm weist ein weitgehend autonomes, intramurales Nervensystem (Plexus entericus)

auf. Es wird aus Neuroblasten, die aus den prävertebralen sympathischen Ganglien

stammen, und aus parasympathischen Neuroblasten gebildet (MICHEL 1995). Die

Nervengeflechte enthalten in den Knotenpunkten Ganglienzellen und befinden sich in der

Tela subserosa, zwischen den Muskelschichten und in der Tela submucosa. Der Darm wird

zusätzlich über das vegetative Nervensystem gesteuert (NICKEL et al. 1987).

2.1.4.2 Entstehungstheorien zu Atresia coli

Über das Entstehen der Atresia coli ist kontrovers diskutiert worden. Zu Beginn des

Jahrhunderts wurde die Theorie vertreten, das Darmrohr würde sich während der

Entwicklung durch Epithelproliferation schließen und später rekanalisieren. Eine Atresie

wurde in diesem Zusammenhang durch fehlende Rekanalisation erklärt (McGEADY et al.

1967). TANDLER (1902) stellte einen solchen Verschluß jedoch nur im Duodenum

menschlicher Embryonen fest. Während SCHLEGEL et al. (1986) u. a. eine primäre,

unvollständige Darmrohrbildung in Betracht zogen, konnten NODEN und LAHUNTA

(1985) dies aufgrund der embryonalen Entwicklungsvorgänge weitgehend ausschließen.

MÜLLER et al. (1982) und SCHLEGEL et al. (1986) nannten als Ursache die rektale

Trächtigkeitskontrolle mit Palpation der Amnionblase innerhalb der ersten 42 Tage. Durch

massive manuelle Manipulationen der Fruchtblase konnten NESS et al. (1982) neben dem

Fruchttod auch Atresien auslösen, von 9 ausgetragenen Kälbern hatten 3 Tiere eine Atresia


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coli, 3 Tiere eine Atresia jejuni und 3 Tiere waren ohne Befund. CONSTABLE et al.

(1989) und JUBB (1990) schlossen in ihren Studien einen Zusammenhang mit der

Frühträchtigkeitskontrolle aus, SYED und SHANKS (1992) diskutierten die rektale

Palpation als möglichen Kofaktor.

VAN DER GAAG und TIBBOEL (1980), PRIEUR und DARGATZ (1984), JOHNSON

(1986), KRAMME (1989) und CONSTABLE et al. (1997) hielten einen Gefäßverschluß

der zuführenden Arterienzweige mit folgendem Absterben des Gewebes für

wahrscheinlich. In Gefäßligationsversuchen an Hunde- und Schaf-Embryonen konnten

Darmatresien erzeugt werden (LOUW 1959, CLARK et al. 1978). Von CHRISTL (1970)

wurde eine verspätete Rückbildung des physiologischen Nabelbruchs als Auslöser für eine

Unterbrechung der Blutzufuhr diskutiert. McGEADY et al. (1967) hielten Hernienbildung

und Abknickungen bei der Darmdrehung für mögliche Auslöser. AGKUR et al. (1993)

vermuteten, daß ein Arterienverschluß vor der 8. Entwicklungswoche nicht nur zu einer

Atresie, sondern auch zur Hirschsprung-Erkrankung mit fehlenden Darmganglien führt.

WIEDEKING (1970) hielt ebenfalls einen Zusammenhang zwischen fehlenden

Darmganglien und unterbrochenem Darmrohr für möglich. Dies wird dadurch gestützt, daß

menschliche Hirschsprung-Patienten, bei denen die Darmganglien über einen Teil des

Darmes fehlen, gelegentlich auch Atresien aufweisen (KIM et al. 1995). Es wurden jedoch

bei Atresia coli-Kälbern mit Atresien Typ II im bindegewebigen Strang Darmganglien

gefunden (CHIHAYA et al. 1983).

JOHNSON et al. (1983) zeigten, daß die Atresie in einem frühen Stadium der Entwicklung

entstehen muß, da im Rectum der Kälber weder Bestandteile des Fruchtwassers noch Galle

nachzuweisen waren.

2.1.4.3 Vererbung

Falldaten:

Die Literaturangaben zur Vererbung von Atresia coli sind widersprüchlich. In einigen

Studien überwiegt die Zahl der männlichen, bei anderen Autoren die der weiblichen

Betroffenen. MÜLLER et al. (1982) stellten in ihren Untersuchungen fest, daß 65 % der


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Tiere männlich waren. Bei CHIHAYA et al. (1983) waren sogar 81 % männlichen

Geschlechts. DUCHARME et al. dagegen fanden einen Prozentsatz von 30 % und

CONSTABLE et al. (1989) 31 % männlicher Kälber. In der Studie von SMITH et al.

(1991) waren nur 5 % männliche Tiere in 66 Fällen vertreten. Die Autoren vermuteten

keine Geschlechtsprädisposition, da diese Zahl das Geschlechterverhältnis der Kälber an

ihrer Klinik wiedergab. SYED und SHANKS (1992b) schlossen eine Geschlechts-

abhängigkeit ebenfalls aus.

FREUDENTHAL (1976) stellte bei schwarzbunten Kälbern mit intestinalen Atresien eine

größere genetische Homogenität fest als bei einer Kontrollgruppe, allerdings unterschied er

dabei nicht nach den betroffenen Darmabschnitten. BÖLLING (1985) konnte in einer

entsprechenden Studie die gleiche Aussage treffen. BENDA et al. (1978) vermuteten einen

polygen determinierten Lethalfaktor und gingen von einem Zusammenspiel von Erb- und

Umweltfaktoren aus. Prädisponierende oder auslösende Umwelteinflüsse konnten sie

jedoch nicht ermitteln. SYED und SHANKS (1993) konnten bei der von ihnen

untersuchten Holstein Friesian-Herde beobachtete Frequenzen mit monogen rezessivem

Erbgang in Übereinstimmung bringen und berechneten unter dieser Voraussetzung eine

minimale Genfrequenz von 2,6 %. CONSTABLE et al. (1997) schlossen aus ihren

Untersuchungen, daß einzelne Familienlinien bei den Holstein Friesian genetisch

prädisponiert sind und die frühe Trächtigkeitsuntersuchung einen zusätzlichen,

auslösenden Faktor darstellt.

HOFFSIS und BRUNER (1977) und SMITH et al. (1991) beschrieben je einen Fall von

Atresia coli bei einem von zwei eineiigen Zwillingen.

Für andere Atresien beim Rind wird ein autosomal rezessiver Erbgang angenommen, so

z.B. für die Atresia ilei der Schwedischen Hochlandrinder (NIHLEEN u. ERIKSSON

1958). LABIK et al. (1977) vermuteten eine rezessive Vererbung für das Auftreten von

Atresia ani et recti bei tschechischen Rindern.

Für das Auftreten von Atresia coli bei anderen Spezies wurde auf eine Vererbung

geschlossen. YAMANE (1928) berichtete von rezessiv vererbter Atresia coli beim


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Percheron Pferd. Für ein familiäres Auftreten von humaner Atresia coli beschrieben

BENAWRA et al. (1981) einen autosomal dominanten Erbgang mit reduzierter Penetranz.

Kreuzungsversuche:

Es wurden Kreuzungsversuche zur Schätzung der Heritabilität unternommen. WILLER et

al. (1984) kreuzten zwei operierte Merkmalsträger und erhielten zwei nicht betroffene

Kälber. Die Rasse der Tiere ist nicht bekannt, vermutlich handelte es sich um

Schwarzbunte Milchrinder oder Rassenkreuzungen der ehemaligen DDR. DUCHARME et

al. (1988a) setzten 2 männliche und 3 weibliche Merkmalsträger ein und beobachteten 13

Kälber ohne Atresia coli. Diese Tiere waren US-amerikanische Holstein Friesian und

Simmentaler.

Es wurden auch Merkmalsträger mit Anlageträgern, also Tieren, die schon betroffene

Nachkommen hatten, angepaart. WILLER et al. (1984) kreuzten dabei einen männlichen

Merkmalsträger mit weiblichen Anlageträgern und erhielt 27 nicht betroffene Kälber

(Rasse nicht bekannt, siehe oben). SYED und SHANKS (1993) erhielten aus der

Anpaarung eines Merkmalsträgers mit einem weiblichen Anlageträger (US-amerikanische

Holstein Friesian) ein betroffenes Kalb. Zu dem betroffenen Bullen gab es jedoch auch

einen gesunden eineiigen Bruder, der in Anpaarung an weibliche Anlageträger 2 gesunde

Kälber erzeugte.

SMITH et al. (1991) beobachteten die Nachkommen von 11 operierten Holstein Friesian in

Anpaarung an Tiere mit unbekanntem Genotyp. Von 33 Kälbern war eines betroffen, unter

Annahme eines rezessiven Erbganges entsprach dies den Erwartungen bei einer Gen-

frequenz von 2,6 %.

SYED und SHANKS (1992a) paarten in 67 Fällen männliche Anlageträger an Geschwister

von betroffenen Tieren an und erhielten 8 erkrankte Kälber. Dies entsprach dem

Erwartungswert von 12,5 % betroffener Tiere bei einer autosomal rezessiven Vererbung.


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2.1.4.4 Kandidatengene

Ein Gen, das Atresia coli beim Rind oder einer anderen Spezies auslöst, ist nicht bekannt.

Es sind jedoch einige Gene beschrieben, die die Darmentwicklung in der Embryogenese

steuern oder beeinflussen. Zu diesen gehören die Hox-Gencluster, die Trans-

kriptionsfaktoren hepatocyte nuclear factor (HNF) -3 und -4 und das Drosophila-Gen

serpent (srp).

Hox-Gene gehören zu einer Genfamilie von Transkriptionsfaktoren, die eine zentrale Rolle

in der Embryonalentwicklung spielen (MANN u. AFFOLTER 1998). Sie haben eine

Regulationsfunktion bei der Gastrulation (BONCINELLI u. MALLAMACI 1995) und

steuern die Achsenformation. Von den HoxC-Genen 3 und 4 ist bekannt, daß sie während

der Embryogenese im menschlichen Rückenmark, im Rückgrat, in den Gliedmaßen und

der Haut exprimiert werden (DUBOULE 1994). HoxC-8 hat eine besondere Bedeutung für

die Endoderm- und Mesenchymentwicklung in Ileum und Colon (DULUC et al. 1997).

Der HoxC-Gencluster ist beim Rind auf BTA 5q14-q23 kartiert (GUNAWARDANA u.

FRIES 1992).

Die homologen Gene zu den humanen Transkriptionsfaktoren HNF-3 und –4 werden bei

Drosophila als forkhead und HNF-4 (D) bezeichnet. Sie werden während der

Embryogenese im Vorder- und Enddarm (forkhead) bzw. Mitteldarm (HNF-4 (D))

exprimiert. Bei einer Mutation im HNF-4 (D)-Gen sind Defekte im Mitteldarm beobachtet

worden (ZONG et al. 1993). Für das humane HNF-3 sind die drei Varianten HNF-3 A, B

und G bekannt, die nach vergleichenden Karten (CHOWDHARDY et al. 1996,

SCHIBLER et al. 1998) auf BTA 10, 13 und 18 zu erwarten sind. HNF-4 weist beim

Menschen ebenfalls die Varianten A, B und G auf; die homologen bovinen Gene sind auf

BTA 13 und 14 zu suchen.

Das Gen serpent (srp) beeinflußt die Entwicklung des Mitteldarms, Mutationen haben bei

Drosophila-Embryonen zur Aplasie dieses Darmabschnittes geführt (REHORN u.

REUTER 1994). Das dem srp äquivalente humane Gen GATA-binding protein 2 liegt

beim Menschen auf 3q21. Dieser Abschnitt ist nach vergleichenden Karten zu BTA 1

homolog.


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Im Zusammenhang mit der Hirschsprung-Erkrankung (HSCR), bei der durch fehlende

Darmganglien ein Megacolon entsteht, sind beim Menschen Colonatresien beschrieben

worden (CURRIE et al. 1983, KIM et al. 1995). HSCR kann durch Mutationen an

verschiedenen Genorten verursacht werden. Zu diesen zählen Endothelin 3 (EDN 3),

Endothelin B Rezeptor (EDNRB), Tyrosinkinase Rezeptor (RET) und GDNF (glial

deriverd neurotrophic factors) (EDERY et al. 1994, ROMEO et al. 1994,

PUFFENBERGER et al. 1994). Ebenfalls eine Mutation im EDNRB-Gen verursacht beim

Pferd das lethal white foal syndrome (METALLINOS et al. 1998, SANTSCHI et al. 1998).

Für das Waardenburg-SHA-Syndrom des Menschen sind neben Mutationen in den EDN3-

und EDNRB-Genen Varianten des Sox10-Gen im Maus-Modell von Bedeutung

(SOUTHARD-SMITH et al. 1999). Für EDN 3 und EDNRB ist bekannt, daß sie für die

Entwicklung der Darmganglien und der Melanozyten von Bedeutung sind (BAYNASH et

al. 1994). EDNRB ist essentiell für die Migration der intestinalen Neuroblasten und der

Melanoblasten (SHIN et al. 1999). EDNRB wurde beim Rind auf 12q22 kartiert

(SCHLÄPFER et al. 1997). EDN 3, RET, GDNF und SOX10 sind nur beim Menschen

lokalisiert und liegen dort auf Abschnitten, die dem Rinderchromosom 13 (EDN 3), 28

(RET), 26 (GDNF) und dem distalen Abschnitt von BTA 5 (5q31-qter; Sox10) homolog

sind.

Der roan-Locus, der für die weiße Farbvariante bei der white heifer-Erkrankung des

Rindes verantwortlich gemacht wird, wurde auf BTA 5 zwischen BP 1 und AGLA 293

lokalisiert (CHARLIER et al. 1996; Abbildung 6.1). Das Kandidatengen für den roan-

Locus ist der Steel-Locus oder mast cell growth factor (MgF), der der Ligand des c-kit

Tyrosinase Kinase Rezeptors ist und die Melanogenese beeinflußt (GREEN 1990,

WILLIAMS et al. 1992). Nach RHIM et al. (2000) besteht ein synergistisches

Zusammenspiel zwischen EDNRB und MgF. SEITZ et al. (1999) konnten den

Zusammenhang zwischen einer Mutation im Steel-Locus und der Ausprägung des roan-

Phänotyps belegen. Somit wurde der bovine Steel-Locus auf dem proximalen Abschnitt

von BTA 5 kartiert. Keines von 10 untersuchten gesunden kanadischen Holstein Friesian-

Tieren wies die Mutation für den roan-Phänotyp auf.


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2.2 Positionelle Klonierung mit genetischen Markern

2.2.1 Genetische Marker und Genomkarten

Genetische Marker sind Polymorphismen im Genom, mit deren Hilfe sich die Vererbung

des betreffenden DNA-Abschnitts nachvollziehen läßt. Die Vererbung der Varianten,

Allele, folgt dabei den Mendelschen Regeln. Um sie sichtbar zu machen, werden sie in der

Elektrophorese nach Länge oder Konformation aufgetrennt, häufig nachdem sie durch

sequenzspezifische Primer amplifiziert und in der Polymerasekettenreaktion (PCR)

vervielfältigt worden sind. Zu ihnen gehören die Restriktionsfragmentlängenpoly-

morphismen (RFLP) und die Mikrosatelliten. Sie liegen meist in den untranslatierten

Bereichen des Genoms. RFLP entstehen durch Punktmutationen, die Schnittstellen für

Restriktionsendonukleasen bilden oder aufheben (KNIPPERS et al. 1990). Sie sind in der

Regel diallele Marker und dadurch wenig informativ (WHITE u. LALOUEL 1988).

Mikrosatellitenmarker dagegen sind hochpolymorph. Sie weisen repetitive Oligonukleotide

von 1 bis 10 Basenpaare auf, deren Wiederholungen bis zu einer Zahl von 30 variieren

können (HEARNE et al. 1992). Die meisten Mikrosatellitenmarker haben (CA)n

Dinukleotid-Wiederholungen. Es wird geschätzt, daß sich 50.000 bis 100.000 Mikro-

satelliten im Säugergenom verbergen (TAUTZ 1989).

Mit Hilfe der genetischen Marker ist es möglich, Kopplungsgruppen zu erstellen

(MORTON 1955). Diese werden häufig gemeinsam vererbt und liegen auf einem

bestimmten Bereich eines Chromosoms. Von einer Kopplung zwischen 2 Markern spricht

man, wenn die Wahrscheinlichkeit einer gemeinsamen Vererbung mindestens 1.000 mal

höher ist als eine unabhängige Vererbung. Der dekadische Logarithmus dieser

Wahrscheinlichkeit, der „logarithm of the odds“ oder Lod-Wert, nimmt Werte ≥ 3 an (OTT

1991).

Um die Kopplungsgruppen bestimmten Chromosomen zuzuordnen, werden einzelne

Marker mittels einer Sonde auf den Chromosomenabschnitten sichtbar gemacht (z. B. mit

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, FISH). Diese Marker dienen als Ankermarker für die

Kopplungsgruppen und bilden die physikalische Karte (SOLINAS-TOLDO et al. 1993,

FERRETTI et al. 1997, THIEVEN et al. 1997).


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Die Karten, die über die Berechnung der Markerkopplung erstellt werden, werden als

genetische Karten bezeichnet. Sie geben Auskunft über die relative Anordnung der Marker

untereinander und sind wesentlich detaillierter als physikalische Karten (Abbildung 6.1).

Der Abstand der Marker zueinander wird durch die Rekombinationsfrequenz θ bestimmt.

Zur Rekombination kommt es, wenn während der Meiose ein Crossing-over stattfindet.

Dies ist der Austausch eines DNA-Abschnitts zwischen einem Chromosomenpaar. Die

Rekombinationsfrequenz θ kann Werte zwischen 0 (keine Rekombination) und 0,5 (50 %

bzw. freie Rekombination) annehmen. Wenn θ einen Wert von 0,5 annimmt, werden die

Marker unabhängig voneinander vererbt. Sie liegen auf unterschiedlichen Chromosomen

oder auf einem Chromosom weit voneinander entfernt. Die Einheit für den Abstand

zwischen den Markern ist centiMorgan (cM). Er wird aus der Rekombinationsfrequenz mit

einer Kartierungsfunktion umgewandelt. Die gebräuchlichsten Kartierungsfunktionen

stammen von HALDANE (1919) und KOSAMBI (1944). Dabei entspricht 1 cM etwa

einer Rekombinationsfrequenz von 1 % und annähernd 106 Basenpaaren im Säugergenom.

Die Zahl der Basenpaare, die bei einer Rekombinationsfrequenz von 1 % tatsächlich

vorliegt, schwankt abhängig vom Geschlecht und Alter der Tiere und vom

Chromosomenabschnitt (OTT 1991). Die Länge der genetischen Karte des Rindes wird auf

etwa 4.000 cM geschätzt (FERRETTI et al. 1997).

Bovine genetische Karten sind von FRIES et al. (1993), BARENDSE et al. (1994),

BISHOP et al. (1994), MA et al. (1996), BARENDSE et al. (1997) und KAPPES et al.

(1997) veröffentlicht worden. Bei einer Länge von 3567 cM für männliche und 3765 cM

für weibliche Tiere deckt die Karte von BARENDSE et al. (1997) mit 746 Markern über

95 % des bovinen Genoms ab. Der durchschnittliche Markerabstand beträgt 5,3 cM. Sie ist

in der Cattle Genome Database (CGD) enthalten, die Teil einer internationalen

Zusammenarbeit zur Analyse des bovinen Genoms ist (URL: http://spinal.tag.csiro.au).

Die Karte von KAPPES et al. (1997) enthält 1250 Marker und deckt 2990 cM ab. Sie hat

einen durchschnittlichen Markerabstand von 2,5 cM und ist somit dichter als die Karte von

BARENDSE. Sie ist ebenfalls in aktualisierter Form über das Internet

(URL: http://sol.marc.usda.gov/genome/cattle/cattle.html) frei zugänglich. Auf diesem

Wege können auch weitere Informationen wie Primersequenzen und Annealing-

Temperaturen für die PCR abgefragt werden.


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Die Anordnung der Gene ist für bestimmte Abschnitte der Säugergenome vergleichbar.

Zwischen Rind und Mensch sind die Übereinstimmungen größer als zwischen Mensch und

Maus oder Rind und Maus (BARENDSE et al. 1997). Aktuelle vergleichende Karten von

Wiederkäuern und Mensch (siehe Abbildung 2.4) sind von CHOWDHARDY et al. (1996)

und SCHIBLER et al. (1998) veröffentlicht worden. Wenn ein Gen beim Menschen

lokalisiert ist, kann so seine Position beim Rind auf dem entsprechenden homologen

Abschnitt vermutet werden. Sind jedoch keine Informationen über die Lage eines Gens

vorhanden, so ist es möglich, durch gleichmäßig über das Genom verteilte genetische

Marker eine Lokalisierung vorzunehmen (Genomscan). Dabei soll der Abstand zwischen

einzelnen Markern 40 cM nicht überschreiten (FRIES 1993). Wird eine Kopplung des

gesuchten Gens zu einem Marker festgestellt, kann die Region durch zusätzliche Marker

eingegrenzt werden (Feinkartierung). Als nächste Schritte folgen Identifizierung und

Analyse von Kandidatengenen. Man spricht von positioneller Klonierung (COLLINS

1992).


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Rind (BTA 5) Mensch Maus

cytogenetische u. physikalische Karte genetische Karte (HSA) (MMU)

Abb. 2.4: Vergleichende Genkarten zum proximalen Abschnitt von BTA 5

(United States bovine Ark-database, Texas A&M University, URL:

http://bos.cvm.tamu.edu)

Ein Gen, das beim Rind genetisch kartiert wurde, ist der myogenic factor 5 (MYF5,

Genbank: Acc. no. M95684). MYF5 ist ein Muskel-spezifischer Transkriptionsfaktor, der

ausschließlich in embryonalen Skelettmuskelzellen exprimiert wird und die

Differenzierung der Zellen bewirkt (BARTH et al. 1993). DEAN et al. (1993) wiesen 4

RFLP für die Restriktionsendonukleasen HindIII, BstEII, PvuII und TaqI in der Southern

Blot Analyse nach. Dafür wurde die genomische Rinder-DNA nach Restriktionsabbau und

Gelelektrophorese mit einer radioaktiv markierten MYF5-Sonde hybridisiert. Mit Hilfe der

RFLP wurde MYF5 auf BTA 5 mit einer relativen Position von 18,8 cM genetisch kartiert.

RYAN et al. (1997) konnten MYF5 auf BTA 5q13 physikalisch lokalisieren.


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2.2.2 Parametrische Kopplungsanalyse

Bei der Kopplungsanalyse wird die These überprüft, ob eine gemeinsame Vererbung der

Allele zweier Loci wahrscheinlicher ist als eine unabhängige Vererbung (siehe 2.2.1,

MORTON 1955). Im Lod-Wert-Test wird diese Wahrscheinlichkeit (likelihood, L) der

Kopplung für bestimmte Rekombinationsraten (θ), also Abstände zwischen den Loci,

überprüft. Die Signifikanzschwelle für den Lod-Wert Z liegt für

Z (θ) = log10 ( L (θ) / L (θ = 0,5 ))

bei Z ≥ 3. Ein Lod-Wert ≤ -2 schließt eine Kopplung aus (OTT 1991). Um die Vererbung

zweier Loci beobachten zu können, wird ein umfangreiches Familienmaterial benötigt.

Einzelne Familien werden separat ausgewertet und die Ergebnisse anschließend addiert

(Ott 1991). Je mehr Generationen, Nachkommen und unabhängige Familien analysiert

werden können, desto aussagekräftiger wird die Berechnung. Weiteren Einfluß hat die

Zahl der Allele. Je polymorpher die Loci sind, desto wahrscheinlicher ist ein Gründertier

an beiden Orten heterozygot, so daß die Weitergabe der Allele an die Nachkommen

verfolgt werden kann (FRIES 1993). Die Allele verschiedener gekoppelter Genorte, die

gemeinsam vererbt werden, werden als Haplotyp bezeichnet.

Es sind Programme entwickelt worden, die den Lod-Wert berechnen. Einen Überblick über

vorhandene Programme gibt BRYAN (1997). Wird ein definierter Vererbungsmodus

vorausgesetzt, spricht man von „parametrischer“ Kopplungsanalyse. Bei einem

phänotypischen Merkmal wie z. B. einem Erbdefekt, das auf Kopplung mit einem

genetischen Marker getestet wird, wird neben rezessivem bzw. dominantem Modell mit

oder ohne Einfluß des Geschlechtes zusätzlich die Penetranz des Merkmals vorgegeben.

Im Gegensatz dazu steht die „nichtparametrische“ Analyse ohne derartige Vorgaben.

Ebenfalls unterschieden wird zwischen der Zweipunkt- und der Mehrpunktanalyse. Bei der

Zweipunkt-Analyse werden nur zwei Loci betrachtet und die Rekombinationsrate

zwischen ihnen variiert. Bei der Mehrpunktanalyse werden mehrere Loci gleichzeitig

berücksichtigt. Der Abstand dieser weiteren Loci wird angegeben und bleibt fest, die

Anordnung des ersten Locus wird variiert.


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Ein Programm zur parametrischen Zweipunkt-Analyse ist MLINK aus dem

Programmpaket LINKAGE 5.1 von LATHROP und LALOUEL (1984). MLINK ist in der

Lage, auch komplexe Großfamilien vollständig in die Berechnung einzubeziehen. Eine

Mehrpunktanalyse ist mit MLINK ebenfalls möglich. Die maximale Haplotypenzahl liegt

bei 1408, so daß bei Verwendung von hochpolymorphen Mikrosatellitenmarkern diese

Grenze schon mit 4 Loci überschritten werden kann. Das Programm GENEHUNTER von

KRUGYLAK et al. (1996) ermöglicht eine parametrische Mehrpunktanalyse mit einer

Vielzahl von Loci. Eine Einschränkung liegt jedoch in der Größe der Familie, die

gleichzeitig in die Berechnung einbezogen werden kann. Die Grenze liegt etwa bei einer

Zahl von 12 Nicht-Gründertieren. Zusätzlich ist GENEHUNTER in der Lage, einen

Heterogenitäts-Lod-Wert zu berechnen, so daß eine Aussage über die Homogenität der

Einzelfamilien gemacht werden kann (KRUGYLAK et al. 1996).

Weitere Programme zur Kopplungsanalyse sind z. B. MENDEL von LANGE et al. (1988)

und CRI-MAP von LANDER und GREEN (1987). MENDEL benötigt besonders hohe

Computerkapazitäten (OTT 1999). CRI-MAP ist zur Berechnung von Kopplungskarten bei

bekanntem Genotyp geeignet (BRYANT 1997).

2.2.3 Nichtparametrische Kopplungsanalyse

Bei der nichtparametrischen Kopplungsanalyse wird die Weitergabe der Allele unabhängig

von einem Vererbungsmodell betrachtet. Auch bei komplexen bzw. ungeklärten

Erbgängen mit unterschiedlichen Penetranzen kann sie die vorhandenen

Pedigreeinformationen zu einer Analyse nutzen. Nach OTT (1999) ist GENEHUNTER das

Programm der Wahl für die nichtparametrische Kopplungsanalyse. KRUGYLAK et al.

(1996) stellten in vergleichenden Studien fest, daß die Mächtigkeit ihres Programmes der

einer Lod-Wert-Analyse unter richtigem Modell annähernd entsprach. GENEHUNTER

berechnet neben dem Mehrpunkt-Lod-Wert einen NPL-Score (non parametric Lod-Wert).

Es wird das „identical by decent-sharing“ geschätzt. Damit ist die übereinstimmende

Herkunft von Haplotypen unter Individuen einer Familie gemeint. Es wird beobachtet, ob

betroffene Geschwister einen abstammungsidentischen Genomabschnitt geerbt haben, und

es wird berechnet, ob bestimmte Allele häufiger vererbt wurden als bei zufälliger

Segregation zu erwarten wäre (KRUGYLAK et al. 1996). Zusätzlich wird dazu die


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Irrtumswahrscheinlichkeit (p) bestimmt. Sie ergibt sich nicht durch Permutation des

vorliegenden Pedigrees, sondern beruht auf Schätzwerten (perfect data approximation,

KRUGYLAK et al. 1996). Je höher der Informationsgehalt der Marker und Pedigrees ist,

desto exakter wird der p-Wert geschätzt. Der prozentuale Informationsgehalt, gemessen an

der höchstmöglichen Information des Pedigrees, wird bestimmt und gibt Auskunft über die

Qualität und Dichte der Marker (KRUGYLAK et al. 1996). Die Signifikanzschwelle, die

einem Lod-Wert von 3 entspricht, liegt bei p = 0,0001 für ein monogen bedingtes Merkmal

(CHOTAI 1984). Ab p = 0,001 (Lod-Wert = 2,1) wird von suggestiver Kopplung

gesprochen. Für komplexe Merkmale liegt die Signifikanzschwelle bei p = 0,00002 (Lod-

Wert = 3,6), suggestive Kopplung beginnt bei p = 0,0007 (Lod-Wert = 2,2; LANDER u.

KRUGYLAK 1995). Diese Schwellenwerte finden einen weiten Konsens (Editorial Nature

Genetics 1 (3), 1995). Die Nachteile des Programms liegen in der begrenzten

Familiengröße. In die Berechnung können nur Familien von bis zu 12 Nichtgründern,

Individuen mit Vorfahren im Pedigree, gleichzeitig einbezogen werden. Studien von

KONG und COX (1997) ergaben, daß GENEHUNTER den p-Wert zu konservativ

berechnet, wenn der Informationsgehalt des Materials niedrig ist. Sie entwickelten eine

modifizierte Version, die in dieser Hinsicht verbessert wurde.

Andere Programme zur nichtparametrischen Kopplungsanalyse sind SIBPAL aus dem

S.A.G.E.-Packet von ELSTON (1997) und das ANALYZE-Packet von TERWILLIGER.

Eine größere Zahl von Markern für die Mehrpunkt-Analyse können von diesen

Programmen nicht berücksichtigt werden (OTT 1999). Ein weiteres Programm, SOLAR,

ist von ALMASY und BLANGERO (1998) entwickelt worden und soll die gemeinsame

Berechnung von umfangreichem Familienmaterial ermöglichen.


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2.2.4 Assoziationsanalyse

Mit Hilfe der Assoziationsanalyse können positive Ergebnisse aus der Kopplungsanalyse

bestätigt werden. Sie bietet die Möglichkeit, die betroffene Region für eine physikalische

Kartierung weiter einzuschränken und hilft bei der Genidentifizierung und

Gencharakterisierung (DEVLIN u. RISCH 1995, SCHWAB et al. 1998). In

Assoziationsstudien wird getestet, ob zwischen bestimmten Allelen zweier Loci ein

Kopplungsungleichgewicht herrscht. Im Falle eines Krankheitsmerkmals kann getestet

werden, ob bei betroffenen Individuen eine signifikante Allelfrequenzabweichung eines

genetischen Markers zu der übrigen Population vorliegt (TERWILLIGER u. OTT 1994).

Anders als bei der Kopplungsanalyse, die die Allelweitergabe innerhalb von Familien

beobachtet, erlaubt die Assoziationsanalyse, die Allelvererbung über die Familien hinweg

mit der übrigen Population zu vergleichen (SCHAID 1995). Ein

Kopplungsungleichgewicht ist nur zu erwarten, wenn sich der Marker in unmittelbarer

Nähe des Krankheitslocus befindet und daher keine freie Rekombination gegeben ist. So

werden überwiegend Kandidatengene auf Assoziation getestet (STRACHAN u. READ

1996). Das Auffinden eines Kopplungsungleichgewichts ist in einer Population erleichtert,

wenn diese auf einen Gründer zurückgeführt werden kann (SCHWAB et al. 1998). Da das

Ungleichgewicht jedoch auch über 100 Generationen Bestand haben kann (JORDE 1995),

ist der Gründer im Nachhinein nicht immer auszumachen.

Auf Assoziation kann mit einem Chi-Quadrat-Test für Vierfeldertafeln getestet werden

(KREYSIG 1979). Ursprünglich wurden zur Bestimmung der Referenz-Allelfrequenzen

zufällig ausgewählte Mitglieder der Population herangezogen. Die Auswahl der

Referenzen ist jedoch nicht immer repräsentativ. Um dieses Problem zu umgehen, können

die nicht-weitergegebenen Allele unbetroffener Vorfahren aus den betrachteten Familien

herangezogen werden (FALK u. RUBINSTEIN 1987, FLANDERS u. KHOURY 1996).

Beispiele für dieses Vorgehen sind der TDT- (transmission/disequilibrium test,

SPIELMAN et al. 1993) und der HRR-Test (haplotype relative risk test, KNAPP et al.

1993).


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2.3 Schlußfolgerungen

Die Ursachen für Atresia coli beim Kalb sind nicht geklärt, genetische und

Umweltfaktoren werden als Auslöser diskutiert. Der Defekt tritt beim Rind häufiger auf als

bei anderen Spezies, und es werden vermehrt Fälle bei Holstein Friesian-Kälbern

beschrieben, deren Erscheinungsbild sich sehr ähnelt. Eine Vererbung wird häufig

postuliert, jedoch bleibt der Erbgang unklar. Es sind Kandidatengene bekannt, die die

Darmentwicklung beeinflussen bzw. an Syndromen bei Mensch und Maus beteiligt sind,

die Atresia coli zu ihrem Symptomenkomplex zählen. Diese sind auf verschiedenen

Chromosomen lokalisiert bzw. zu erwarten, die meisten von ihnen sind beim Rind nicht

direkt kartiert. Mit neuen Programmen zur nichtparametrischen Kopplungsanalyse stehen

Methoden zur Verfügung, Kopplung zu einem Genomabschnitt aufdecken zu können, auch

ohne Gewißheit über den Erbgang zu haben. Die Assoziationsanalyse stellt eine weitere

Möglichkeit dar, nach näherer Eingrenzung einer Genomregion einen Zusammenhang

zwischen der Krankheit und einer Genvariante an einem Locus unabhängig vom Erbgang

nachzuweisen.

3 Material 24

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3 Material

3.1 Tiere

Von 1991 bis 1998 wurden am Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der

Tierärztlichen Hochschule Hannover Berichte über 317 Kälber mit Atresia coli gesammelt.

Es wurden dazu Aufrufe im „Deutschen Tierärzteblatt“ veröffentlicht. Zusätzlich wurde

ein Erhebungsbogen verschickt, in dem nach Alter, Geschlecht und Abstammung der

betroffenen Tiere sowie nach der rektalen Trächtigkeitsuntersuchung und Vorkommnissen

während der Trächtigkeit gefragt wurde (siehe 9.1). Die Meldungen und das mitgelieferte

Probenmaterial stammen von niedergelassenen Tierärzten vornehmlich aus Nord- und

Westdeutschland, sowie aus dem Institut für Pathologie und der Klinik für

Rinderkrankheiten der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Von den 317 Tieren waren

114 weiblich, 140 männlich und bei 63 Kälbern war das Geschlecht nicht bekannt.

Probenmaterial stand von 213 Tieren zur Verfügung. Von 124 Kälbern war eine Blutprobe

der Mutter vorhanden, bei 7 zusätzlich noch Material eines Zwillings. Von den 213

Kälbern mit Probenmaterial ist für 42 Tiere die Diagnose Atresia coli durch eine

pathologischen Untersuchung erfolgt. Bei den übrigen Kälbern wurde die Diagnose

aufgrund der klinischen Symptomatik gestellt.

3.1.1 Familienauswahl

Bei allen für den Genomscan ausgewählten Familien handelte es sich um Deutsche

Holsteins. Es sind im Vorfeld fünf Großvaterfamilien und eine Halbgeschwistergruppe aus

insgesamt 42 Kälbern und ihren Vorfahren für die Untersuchung gebildet worden. Bei vier

Tieren ergaben sich bei den Typisierungen Unstimmigkeiten, so daß 38 betroffene Kälber

in die Untersuchungen eingingen, hier als Set 1 bezeichnet (Abbildung 3.1). Im Rahmen

dieser Arbeit wurde das Familienmaterial ergänzt und erweitert, um die Aussagekraft der

Untersuchung zu erhöhen. Jedes Vater- bzw. Großvatertier, das mindestens 3 betroffene

Nachkommen hatte, wurde ausgewählt. Das erweiterte Set 2 umfaßte 79 betroffene Tiere,

die neun Großvaterfamilien zuzuordnen waren (Abbildung 3.2). Zu Beginn enthielt dieses

erweiterte Set zusätzlich 3 Zwillingspaare, die jedoch aufgrund von Blutchimärismus nicht

ausgewertet werden konnten.

3 Material 25

_________________________________________________________________________

Abb. 3.1: Familienstruktur des Set 1

3 Material 26

_________________________________________________________________________

Abb. 3.2: Familienstruktur des erweiterten Sets (Set 2)

3 Material 27

_________________________________________________________________________

3.2 Auswahl der Marker

In Vorarbeiten (THIEVEN et al. 1998) wurden 147 Mikrosatelliten-Marker an Set 1

typisiert, die über die 30 bovinen Chromosomen verteilt lagen. Diese Marker stammten aus

einem 210 Primerpaare umfassenden Set für die Genomkartierung beim Schaf, das von Dr.

N. Cockett (Utah State University, USA) zur Verfügung gestellt wurde. Weiterhin wurde

im Rahmen des EU-Projekts BovMap ein bovines Primer-Set bestehend aus 195

Mikrosatelliten-Markern zusammengestellt. Für diese Arbeit wurden weitere 48 Marker

ergänzt, um Lücken zu füllen und um Chromosomenabschnitte näher zu untersuchen

(Tabelle 10.2). Hierbei wurde ein Markerabstand von höchstens 20 cM angestrebt.

Um die Positionen der Mikrosatelliten-Marker auf der genetischen Karte des Rindes

bestimmen zu können, wurde auf die von KAPPES et al. (1997) veröffentlichte USDA-

Karte zurückgegriffen. Für Marker, die in dieser Karte nicht enthalten waren, wurde die

CSIRO-Karte der Cattle Genome Database (CGD) von BARENDSE et al. (1997) genutzt.

4 Methoden 28

_________________________________________________________________________

4 Methoden

4.1 Abstammungsanalyse

Für die betroffenen Kälber mit eingesandtem Probenmaterial wurden Nachforschungen bei

den Besitzern bezüglich der Abstammung unternommen und die Angaben mit

Unterstützung der Zuchtverbände ergänzt. Mit dem Programm OPTI-MATE 3.2

(SCHMIDT et al. 1996) wurden die Inzucht in der Tiergruppe und die bedeutenden Ahnen

berechnet. Der Inzuchkoeffizient wurde mit Hilfe einer Verwandtschaftmatrix in

Anlehnung an WRIGHT (1922) und HUDSON et al. (1982) bestimmt, wobei die Inzucht

eines Tieres der Hälfte der Verwandtschaft seiner Eltern entsprach. Um die bedeutenden

Ahnen bestimmen zu können, wurde die direkte Verwandtschaft über 6 Generationen

berechnet. Dabei war zu berücksichtigen, daß in der 6. Generation nur noch 41 % der

Ahnen bekannt waren. Es wurden die Genbeiträge der Ahnen an die Nachkommen

gemessen und die Häufigkeit des Auftretens in jeder Generation erfaßt. Ebenfalls mit dem

Programm OPTI-MATE wurde die Anzahl betroffener Kälber je Vater bzw. Großvater

ermittelt. Es waren jedoch bereits in der 2. Generation nur knapp 60 % der Vorfahren

bekannt.

4.2 Simulation der Mächtigkeit

Um die verfügbare Pedigreestruktur auf ihre statistische Aussagekraft zu untersuchen,

wurde das Programm SLINK von WEEKS (1990) mit der Option MSIM angewandt.

Dabei wird die Segregation des genetischen Markers mit Hilfe von Monte Carlo Methoden

zufällig variiert. Die Zahl der Wiederholungen wurde nach einer ersten Testreihe auf 200

festgelegt. In Vorversuchen hatte sich herausgestellt, daß eine weitere Steigerung bis 800

Wiederholungen nur geringe Änderungen von bis zu 5 Prozent der Werte ergaben, jedoch

die in Anspruch genommene Rechenzeit vervielfachte.

Es wurden genetisches Modell, Penetranz, Frequenz des Gens und des Markers verändert.

Dafür wurde das erweiterte Set 2 (Abbildung 3.2) eingesetzt und mit Set 1 (Abbildung 3.1)

verglichen. Das Programm berechnete für die Rekombinationsraten (θ) von 0,1 bis 0,4

zwischen Marker und Krankheitsgen den erreichten durchschnittlichen Lod-Wert, die

4 Methoden 29

_________________________________________________________________________

Standardabweichung und minimalen und maximalen Lod-Wert. Dies wurde für jede

Familie einzeln und über das gesamte Pedigree gemeinsam bestimmt. Daraus wurden die

durchschnittlichen maximalen Lod-Werte und die Zahl der Lod-Werte, die über einer

festgelegten Schwelle lagen, berechnet. Dafür wurden die Lod-Werte bei allen

Rekombinationsraten einbezogen. Als Schwellenwerte wurden dem Programm Lod-Werte

von 1, 2 und 3 vorgegeben.

4.3 Typisierung der Mikrosatelliten-Marker

4.3.1 DNA-Isolierung

Blut:

Die DNA-Isolierung wurde aus Blut mit Hilfe des QIAamp 96 Spin Blood Kit der Firma

QIAGEN durchgeführt. Dieses Kit bietet den Vorteil, daß es im Mikrotiterplatten-Format

erhältlich ist und die Bearbeitung von 2 x 96 Proben gleichzeitig erlaubt. Nach der Zellyse

und Proteinabtrennung wird die DNA bei diesem Verfahren an eine selektive Membran

gebunden und nach mehreren Waschschritten mit einem mitgelieferten Puffer oder Wasser

eluiert. Das zugehörige Protokoll war für humanes Blut ausgelegt und mußte für die

Isolierung aus Rinderblut modifiziert werden. Es wurden 100 µl ungeronnenes Rinderblut

eingesetzt und mit 40 µl QIAGEN Protease-Lösung und 220 µl Puffer AL versetzt. Nach

Inkubation bei 70° C für 20 min wurden 240 µl Ethanol (96-100 %) zugefügt. Das gesamte

Probenvolumen wurde auf die QIAamp 96 Platte überführt und 15 min zentrifugiert.

Waren noch Überstände vorhanden, wurden 500 µl Puffer AW1 zugegeben. Nach weiterer

Zentrifugation für 15 min konnte der zweite Waschschritt mit 500 µl Puffer AW

durchgeführt werden. Die Membran der QIAamp 96 Platte wurde anschließend bei 70° C

für 10 min getrocknet. Die DNA wurde mit 200 µl auf 70° C vorgewärmten Puffer AE

eluiert.

4 Methoden 30

_________________________________________________________________________

Gewebe:

Für Gewebeproben wurde das Dneasy 96 Tissue Kit (QIAGEN) benutzt. Dieses Kit

entspricht in seinen Schritten dem QIAamp 96 Spin Blood Kit und wurde nach dem

MOUSE TAIL Protokoll angewendet. Als Gewebeproben lagen Ohrknorpel, Leber, Milz,

Lunge oder Zunge vor. Insbesondere das Knorpelgewebe war für diese Isolierungsmethode

gut geeignet. Gewebestücke von etwa 0,4 cm Kantenlänge wurden mit 20 µl Proteinase K-

Lösung (QIAGEN) und 180 µl Puffer ATL versetzt und bei 55° C über Nacht inkubiert.

Anschließend wurden 410 µl Puffer AL/E zugefügt und der Überstand nach einem

Zentrifugationsschritt auf die QIAamp 96 Platte überführt. Das weitere Vorgehen

entsprach der DNA-Isolierung aus Blut.

Sperma:

Das Sperma wurde mit dem Nucleon BACC2 Kit von Amersham LIFE SCIENCE

bearbeitet. Die verwendeten Besamungspailletten enthielten 200 µl – 500 µl für die

künstliche Besamung aufbereitetes Sperma. Es wurde nach dem mitgelieferten Protokoll

vorgegangen, bei dem nach Zellyse und Deproteinisation die DNA mit Hilfe von

Chloroform extrahiert wird. Danach wird sie mit Ethanol gefällt und nach Waschschritten

in TE-Puffer aufgenommen.

Zur Konzentrationsbestimmung wurde die DNA auf einem 0,6 %igen Agarosegel mit

Ethidiumbromid angefärbt (3 µl Ethidiumbromid in 50 ml Agaroselösung). Die

Konzentration wurde anhand der Bandenintensität geschätzt. Dafür wurden 4 µl gelöste

DNA mit 3 µl Stopmix versehen und auf das Gel geladen. Als Konzentrationsstandard

dienten 2 µl bzw. 4 µl λ-Phagen-DNA (50 ng/µl) und 5 µl λ-Phagen-DNA / Hind III.

4 Methoden 31

_________________________________________________________________________

4.3.2 Polymerasekettenreaktion

Für die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde die DNA auf 5 ng/µl verdünnt und in 96er

Mikrotiterplatten vorgelegt. Das Mastermix wurde auf Eis gekühlt und mit einem

Seriendosierer verteilt. Zum Schutz vor Verdunstung wurde mit Paraffinöl überschichtet.

Standard-Mastermix (15 µl Ansatz):

9,36 µl H2O (bidest.) (Merck)

1,5 µl 10x Puffer [15 mM MgCl2] (Promega)

0,75 µl Primer A [10µM]

0,75 µl Primer B [10 µM]

0,09 µl dNTP`s [100 µM]

0,06 µl Taq-Polymerase [5 U/µl] (Promega)

+ 2,5 µl DNA [5ng/µl]

Für PCR-Produkte, die mit dem Sequenzierautomaten Li-Cor aufgetrennt wurden, wurde

das Mastermix folgendermaßen variiert:

Mastermix für Li-Cor (10 µl Ansatz):

6,2 µl H2O (bidest) (Merck)

1 µl 10x Puffer [15 mM MgCl2] (Promega)

0,2 µl Primer A mit M13 forward tail [10 µM]

0,2 µl Primer B [10 µM]

0,2 µl Primer M13 forward [10 µM] (IRD 700 oder 800 markiert)

0,1 µl dNTP`s [100 µM]

0,1 µl Taq-Polymerase [5 U/µl] (Promega)

+ 2 µl DNA [5 ng/µl]

Die PCR wurde in 34 bis 38 Zyklen in den Thermocyclern PTC-100TM und PTC-200TM der

Firma BIOzym durchgeführt. Der Einzelzyklus für die PCR bestand aus 30 s

Denaturierung bei 94 °C, 60 s Annealing bei einer primerspezifischen Temperatur

zwischen 52 °C und 62 °C (Tabelle 10.2) und 30 s Extension bei 72 °C.

4 Methoden 32

_________________________________________________________________________

Zur Kontrolle der PCR-Produkte wurden 5 µl der Lösung mit 3 µl Stopmix versetzt und

auf ein 2 %iges Agarosegel aufgetragen. Als Längenstandard diente pBR 322/ Hae III. Zur

Kontaminationskontrolle wurde stets auch Mastermix ohne DNA (Nullproben) in der PCR

eingesetzt und auf dem Agarosegel kontrolliert.

4.3.3 Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese

Die Allele der Mikrosatellitenmarker wurden mit Hilfe der denaturierenden

Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und mittels Silberfärbung oder

Fluoreszenzdetektion sichtbar gemacht.

Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Silberfärbung:

Für diese Art der Polyacrylamidgelelektrophorese wurde 6 %ige Polyacrylamid (PAA)-

Lösung zwischen 2 Glasplatten gegossen, die durch 0,4 mm starke Spacer getrennt waren.

Vorherige Zugabe von 0,05 % (w/v) Ammoniumpersulfat (APS) und 0,05 % (v/v) TEMED

katalysierte die Vernetzung der Gelmatrix. Während der ca. 2 h dauernden Polymerisation

war das Gel waagerecht gelagert und die Gelkanten abgeklebt. Anschließend wurde das

Gel in die Elektrophoreseapparatur (Owl Sequencing Apparatus) eingespannt, ein

Haifischzahnkamm in die obere Gelkante geschoben und die Puffertanks mit je 500 ml

TBE-Puffer gefüllt. Das Gel wurde bei einer Leistung von 110 W auf 50 °C vorgeheizt. Es

konnten bis zu 65 Proben mit einer Mehrkanalpipette in die Taschen des Kammes geladen

werden. Die Proben waren 1 : 2 bis 1 : 4 mit denaturierendem Formamid-Ladepuffer für

PAA-Gele verdünnt und wurden vor dem Laden bei 94 °C 4 min lang denaturiert und

anschließend auf Eis gelagert. Das Ladevolumen betrug 2 bis 5 µl. Als Längenstandard

diente pBR 322 geschnitten mit Hae III und Alu I. Bei gleichbleibender Temperatur wurde

die Elektrophorese je nach Länge der PCR-Produkte 1,5 h bis 3,5 h durchgeführt. Bei

einem Lauf konnten nacheinander 3 bis 4 Ladungen aufgetragen werden.

Die Beschichtung der Glasplatten mit Bindesilanlösung auf der einen und Repelsilan auf

der anderen Seite ermöglichte ein anschließendes Ablösen des Gels von der einen und

vollständiges Haften auf der anderen Platte. Das Gel konnte nun auf dem Glasträger

angefärbt werden.

4 Methoden 33

_________________________________________________________________________

Bei der modifizierten Silberfärbung nach BASSAM et al. (1991) lagern sich Silberionen

durch Komplexbildung an die DNA, die anschließend zu metallischem Silber reduziert und

damit sichtbar werden. Die Färbeschritte und Spülvorgänge werden jeweils mit 2 l der

Lösungen durchgeführt. Zu Beginn wurde das Gel mindestens 20 min in die saure

Fixierlösung gelegt, um ein Herausdiffundieren der DNA-Moleküle aus der Gelmatrix zu

verhindern. Nach dreimaligem Spülen für 2 min mit demineralisiertem Wasser wurde für

30 min die Formamid-haltige Färbelösung hinzugegeben, durch die die Komplexbildung

der Silberionen an die DNA ermöglicht wurde. Nach einem weiteren Spülschritt für 10 sec,

bei dem ungebundene Silberionen entfernt wurden, wurde das Gel mit der auf 4 °C

gekühlten alkalischen Entwicklerlösung bedeckt. Die einsetzende Reduktion des Silbers

wurde nach 4 - 6 min mit 500 ml Fixierlösung gestoppt, nachdem die Banden ausreichend

sichtbar geworden waren (THIEVEN et al. 1997). Anschließend wurde das Gel auf der

Glasplatte mit Cellophanfolie überspannt, die in Konserviererlösung eingeweicht war. Zur

Dokumentation wurden Röntgenfilmaufnahmen angefertigt.

Polyacrylamidgelelektrophorese mit Fluoreszenzmarkierung:

Die computergesteuerte Gelelektrophoreseeinrichtung LI-COR detektiert fluoreszenz-

markierte PCR-Produkte per Laser und wandelt die Signale in ein digitales Bild um.

Dadurch entfällt die Silberfärbung, und die Bilder lassen sich in Größe, Intensität und

Kontrast modifizieren.

Die PAA-Gele wurden analog zur oben beschriebenen Methode vorbereitet, die Platten

wurden durch 0,2 mm starke Spacer getrennt. Die Glasplatten wurden nicht beschichtet. Es

wurde ein Haifischzahnkamm mit 48 Taschen benutzt. Die Proben wurden mit dem

Formamid-Ladepuffer (LI-COR) 1 : 2 verdünnt, und nach 1minütiger Denaturierung bei

94 °C mit der Mehrkanalpipette (HAMILTON) geladen. Die Ladevolumina betrugen 0,3

bis 0,9 µl. Die Elektrophorese wurde bei 45 °C und 31,5 W durchgeführt und dauerte für

die einzelne Ladung zwischen 0,5 h und 2,5 h. Als Längenstandard diente der STR Marker

(Li-Cor 4200-44, IRD 700). Mit den Programmen des Pakets BASE IMAGIR v.4.0 konnte

das entstehende Bild betrachtet, bearbeitet und gespeichert werden.

4 Methoden 34

_________________________________________________________________________

4.4 Statistische Auswertung

4.4.1 Allelfrequenzschätzung und Berechnung des Informationsgehaltes

Um die Allelfrequenzverteilung in der Population zu bestimmen, wurden 10 Referenztiere

zusammen mit dem Set 1 genotypisiert. Bei diesen Tieren handelte es sich um

unverwandte männliche Deutsche Holsteins, die zufällig ausgewählt worden waren. Mit

Ausweitung der Tierzahl auf das erweiterte Set 2 wurde die Zahl der Referenztiere auf 20

erhöht, um die Allelfrequenzen möglichst genau zu schätzen. Zusätzlich wurden die

Mütterallele, die nicht an die betroffenen Kälber weitergegeben worden waren,

berücksichtigt. Dieses Vorgehen ist angelehnt an Assoziationsstudien, bei denen diese

Allele als Kontrolle genutzt wurden, um einen Fehler bei der Wahl der Kontrollgruppen zu

vermeiden (STRACHAN u. READ 1996). So standen bis zu 100 Allele zur Frequenz-

schätzung zur Verfügung.

Der Informationsgehalt der Marker wurde in der GENEHUNTER-Mehrpunktanalyse

berechnet. Der prozentuale Informationsgehalt an einer Markerposition stellt die

tatsächliche Information im Verhältnis zur maximal möglichen Information im Rahmen

des vorhandenen Pedigrees dar.

4.4.2 Parametrische Kopplungsanalyse

4.4.2.1 Zweipunkt-Analyse

Die Zweipunkt–Analyse wurde mit der Option MLINK aus dem Programmpaket

LINKAGE 5.1 von LATHROP und LALOUEL (1984) berechnet. Dabei wurde die

Kopplungswahrscheinlichkeit (Lod-Wert) der einzelnen Marker mit dem Krankheitslocus

für Rekombinationsfrequenzen (θ) von 0 bis 0,5 in Schritten von 0,05 untersucht. Als

Allelfrequenz für das Krankheitsgen wurde 1 % angenommen. In Anlehnung an SYED

und SHANKS (1992a) wurde von einer autosomalen, monogen rezessiven Vererbung

ausgegangen. Dies wurde für die Zweipunkt–Analyse durchgehend beibehalten.

Stichprobenartig wurden positiv herausragende Marker auch unter der Annahme eines

dominanten Erbgangs mit unvollständiger Penetranz berechnet. Für die Geschlechts-

4 Methoden 35

_________________________________________________________________________

Chromosomen wurden die Marker TGLA325 und INRA69, die in der pseudoautosomalen

Region liegen, ebenfalls einbezogen. Die weiteren X-chromosomalen Marker BMS903,

HUJ121, ILSTS017, BMC6021 und XBM16 wurden nur für die Mehrpunkt-Analyse mit

GENEHUNTER, nicht aber für die Zweipunkt-Analyse verwendet.

4.4.2.2 Mehrpunkt-Analyse

Für die Mehrpunkt–Analyse mit vorgegebenem Erbgang wurde ebenfalls von einer

rezessiven Vererbung ausgegangen. Die Markerabstände wurden der USDA- und der

CSIRO-Karte entnommen und mit der Kartierungsfunktion von HALDANE (1919)

umgerechnet. Für alle Rinderchromosomen wurde die Analyse mit dem Programm

GENEHUNTER von KRUGYLAK et al. (1996) durchgeführt. Es konnten alle typisierten

Marker des entsprechenden Chromosoms einbezogen und Mehrpunkt–Lod-Werte an vier

Positionen zwischen und an den Markerpositionen berechnet werden. Zusätzlich wurden 5

Positionen bis zu 30 cM außerhalb der vorgegebenen Karte analysiert. Es wurde für alle

Punkte ein Lod-Wert unter Annahme von Heterogenität der Familien bestimmt. Bei den

Untersuchungen wurde in Einzelfällen neben einer rezessiven auch eine dominante

Vererbung vorausgesetzt und berechnet. Da das Programm die großen Familien nicht

gemeinsam analysieren konnte, mußten Familien getrennt werden. Für das kleine Set 1

wurden Familie 1 und 2 jeweils einmal unterteilt, wobei darauf geachtet wurde, daß

Halbgeschwistergruppen zusammenblieben. Für das erweiterte Set mußte Familie 1 in 3

Gruppen gespalten werden, die Familien 2, 3, 4 und 5 wurden in 2 Gruppen unterteilt. Die

Aufteilung ist den Abbildungen 3.1 und 3.2 zu entnehmen.

Für die Marker auf BTA 5 wurde mit MLINK eine Mehrpunkt–Analyse durchgeführt. Im

Gegensatz zu GENEHUNTER war MLINK in der Lage, die Familien zusammenhängend

zu analysieren. Jedoch war es mit dem Programm nicht möglich, mehr als 2 Marker

gleichzeitig mit dem Krankheitslocus in Betracht zu ziehen, da die zulässige

Haplotypenzahl überschritten wurde. Auf Grund mangelnder Signifikanz bei den

Zweipunkt–Berechnungen war es mit LINKMAP (LINKAGE 5.1) nicht möglich, den

Krankheitslocus einer Position auf der Karte zuzuordnen. Daher wurden alle Marker

paarweise berechnet, während der Krankheitslocus außerhalb des Markerintervalls

angeordnet war.

4 Methoden 36

_________________________________________________________________________

4.4.3 Nichtparametrische Kopplungsanalyse

Das Programm GENEHUNTER berechnet in einer Mehrpunktanalyse neben dem

parametrischen Lod-Wert auch eine Kopplungswahrscheinlichkeit mit dem

Krankheitslocus, ohne einen Erbgang vorauszusetzen. Der NPL-Wert (non parametric

Lod-Wert) wird zusammen mit einer zugehörigen Irrtumswahrscheinlichkeit (p-Wert)

bestimmt. Es wird eine „identical by decent“ (IBD)-Analyse (siehe Kapitel 2.2.3)

durchgeführt. Die Irrtumswahrscheinlichkeit p basiert auf Schätzwerten, die Genauigkeit

dieser Schätzung ist abhängig vom Informationsgehalt des Pedigrees und der verwendeten

Marker. Dieser Informationsgehalt wird prozentual anhand der höchstmöglichen

Information des Materials bestimmt. Die NPL-Werte wurden für alle Chromosomen und

für die gleichen Positionen berechnet wie für die Lod-Wert-Analyse mit GENEHUNTER.

Die Aufteilung der Familien war identisch.

4.4.4 Weiterführende Berechnungen zu Familie 2

Die im proximalen Abschnitt von BTA 5 herausragende Familie 2 wurde mit dem

Programm GENEHUNTER näher untersucht. Da diese Familie 10 Betroffene umfaßt und

das Programm nur bis zu 9 Tiere gleichzeitig verarbeiten konnte, wurde jedes Tier einmal

nicht berücksichtigt und die anderen 9 zusammen gerechnet. Aus diesen 10 Berechnungen

wurden die Minima und Maxima für den Lod-Wert und NPL-Wert bestimmt. Zusätzlich

wurden die Mittelwerte berechnet und mit den Ergebnissen verglichen, die sich für das

zweigeteilte Pedigree ergeben hatten.

4.4.5 Haplotypenbestimmung

Um die Haplotypen der betroffenen Tiere innerhalb der Familien und auch

familienübergreifend zu vergleichen, wurden diese einzeln betrachtet. Das Programm

GENEHUNTER berechnete im Rahmen der Mehrpunkt-Analyse die Haplotypen der

Gründertiere unter Einbeziehung der Nachkommen- und Verwandtschaftsinformationen.

Mit Hilfe dieser Elternhaplotypen wurden die der Kälber hergeleitet und auf

Übereinstimmungen untersucht. In den Abbildungen 5.7 und 5.8 sind, soweit bekannt, der

4 Methoden 37

_________________________________________________________________________

paternale Haplotyp auf der linken und der maternale Haplotyp auf der rechten Seite

dargestellt.

4.4.6 Assoziationsanalyse

Marker aus der proximalen Region von BTA 5 wurden auf eine mögliche Assoziation mit

dem Krankheitslocus überprüft. Zu diesem Zweck wurden alle weiteren betroffenen Tiere

typisiert, die keiner Familie des Set 1 bzw. Set 2 zugeordnet waren. Dadurch konnten für

die Marker BMS1095, BM6026, BMS610, BP1, MYF5i2 und INRA104 weitere 113

Kälber untersucht werden. Von diesen wurden für die Berechnung diejenigen 82 Tiere

ausgewählt, die gesichert der Rasse der Deutschen Holsteins angehörten. Alleine bzw.

ergänzt mit den 79 betroffenen Kälbern aus dem Familienmaterial wurden an diesen Tieren

die Allelfrequenzen bestimmt. Als Kontrollgruppe wurden die 20 Referenztiere und die

Mütterallele, die nicht an betroffene Nachkommen vererbt wurden (siehe auch 4.4.1),

verwendet. Mit einem Chi-Quadrat-Test für Vierfeldertafeln wurde geprüft, ob die

Allelverteilung den Frequenzen der Referenz entsprach oder eine signifikante Abweichung

vorlag (KREYSZIG 1979). Dabei galt:

∑=

−=

K

j j

jj

e

eb

1

22

)(χ mit K – 1 Freiheitsgraden

b = Beobachtungswerte

e = Erwartungswerte

K = Zahl der Allele

j = Laufparameter (Allele)

Für BMS1095, BM6026, BMS610 und BP1 war die Berechnung in dieser Form nicht

durchführbar, da die Marker jeweils 10 bis 11 Allele aufwiesen. Es ergaben sich für einige

seltene Allele Erwartungswerte unter 5, wodurch der Test nicht mehr durchführbar ist

(KREYSZIG 1979). Daher wurden in diesen Fällen die ausreichend häufigen Allele gegen

alle anderen zusammengefaßten Allele getestet.

4 Methoden 38

_________________________________________________________________________

4.5 Entwicklung eines Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus im MYF5-Gen

4.5.1 Polymerasekettenreaktion von MYF5-Genfragmenten

Um Mutationen im MYF5 (myogenic factor 5) -Gen zu entdecken, wurden Primer aus der

bovinen Sequenz (Genbank: Acc. no. M95684) ausgewählt, die Intron 1 (MYF5i1),

Intron 2 (MYF5i2) und den 3`-untranslatierten Bereich des Gens abdeckten. In

Abbildung 4.1 sind die Primerpositionen und die erwarteten Längen der PCR-Produkte

dargestellt. Da der 3`-untranslatierte Bereich etwa 3 kb groß ist, wurden zunächst 2, später

insgesamt 4 Primerpaare (MYF5u1 bis MYF5u4) ausgewählt (Tabelle 10.1). Zur

Primerauswahl wurde das Programm OLIGO 4.0 benutzt. Mit Hilfe des Programms konnte

kontolliert werden, daß die Oligonukleotide insbesondere im 3`-Bereich nicht (selbst-)

komplementär waren, der CG-Gehalt ausreichend war und die Annealing-Temperaturen

übereinstimmten. Mit dem Programm BLASTN wurden anschließend alle verfügbaren

Datenbanken für einen Sequenzvergleich durchsucht. Hierdurch konnte sichergestellt

werden, daß es sich um MYF5-spezifische Sequenzen handelte.

In tro n 1 In tro n 2 u n trans la tie r te r B e re ich

M Y F 5 i1 M Y F5 i2 M Y F 5u 1 M Y F 5 u 2 M Y F 5 u 3 M Y F 5 u4(8 89 b p ) (4 4 5 b p ) (7 96 b p ) (7 5 1 b p ) (79 2 bp ) (7 8 3 b p )

Abb. 4.1: Primerpositionen im MYF5-Gen

Die PCR und der anschließende Restriktionsenzymabbau wurden mit der DNA von 10

Tieren durchgeführt, die die 6 Großväter des Set 1 beinhalteten. Für die erstellten

Primerpaare wurden die gleiche Mastermix-Zusammensetzung und die gleiche Polymerase

wie für die Mikrosatellitenmarker (siehe 4.3.2) gewählt. Die MgCl2-Konzentration wurde

zwischen 1,0 mM und 2,0 mM variiert. Es wurden Annealing-Temperaturen von 56 °C-

62 °C getestet, angelehnt an die Tagushi-Methode (COBB u. CLARKSON 1994). Die

Extension-Zeit des PCR-Prozesses wurde auf 60 sec verlängert, um die Amplifikation der

bis zu 900 bp langen PCR-Produkte zu ermöglichen.

4 Methoden 39

_________________________________________________________________________

4.5.2 Restriktionsenzymabbau

Die PCR-Produkte wurden zunächst mit den Restriktionsenzymen BstEII, HindIII, PvuII

und TaqI auf Schnittstellen getestet. DEAN et al. (1993) beschrieben für diese Enzyme

bereits Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP), die sie mit Hilfe einer MYF5-

Sonde im Southern Blot an genomischer DNA nachgewiesen haben. Zusätzlich wurden die

Enzyme AluI, AvaI, BstUI, EcoRI und HaeIII eingesetzt.

Mit Hilfe des Programms SEQAID wurden die zu erwartenden Schnittstellen der

Restriktionsenzyme in den jeweiligen Sequenzen bestimmt. Alle Enzyme wurden mit den

mitgelieferten Puffern eingesetzt. In einem Volumen von 15 µl wurden etwa 200 ng PCR-

Produkt und 5 U Enzym über Nacht bei der enzymspezifischen Temperatur inkubiert.

Anschließend wurden die 15 µl Lösung mit 5 µl Stopmix versetzt und auf ein 4 %iges

Agarosegel (NuSieve) aufgetragen. Die Fragmente wurden bei 60 mA für 5 h aufgetrennt.

Als Längenstandards dienten pBR 322/ Hae III und die 100 bp DNA-Leiter. Durch das in

der Agarose enthaltene Ethidiumbromid wurden die Spaltprodukte unter UV-Licht sichtbar

gemacht. Zur Dokumentation wurden Polaroidphotos erstellt.

5 Ergebnisse 40

_________________________________________________________________________

5 Ergebnisse

5.1 Analyse der Vorberichte und Abstammungsdaten

Die erkrankten Kälber starben 1 bis 9 Tage nach der Geburt bzw. wurden euthanasiert. Ein

Drittel der Tiere erreichte nur ein Alter von 2 Tagen (67 Tiere bei 191 Angaben). 55 % der

Kälber mit Geschlechtsangabe waren männlich, 45 % weiblich. Von den 213 Kälbern mit

Probenmaterial ist bei 42 die Diagnose Atresia coli in der pathologischen Untersuchung

gestellt worden. Die Atresie Typ I trat in einem Fall auf, Typ II in zwei Fällen und Typ III

in 28 Fällen. Bei 11 Tieren wurde der Atresietyp nicht dokumentiert. Von den sezierten

Kälbern konnten 11 Tiere Familien zugeordnet und in die Untersuchung einbezogen

werden. Es handelte sich bei 10 Tieren um eine Atresia coli Typ III, nur in einem Fall lag

eine Mißbildung Typ II vor.

In 80 Fällen wurden von den Besitzern Angaben zur rektalen Untersuchung der Mütter

während der Trächtigkeit gemacht. Vor dem Tag 42 nach der letzen Besamung wurden

9 % der Rinder auf Trächtigkeit untersucht, 29 % zwischen Tag 42 und 90 und 6 % nach

dem Tag 90. Bei 56 %

Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der ...€¦ · anderen intestinalen...

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