บทปฏิบติัการท่ี 4การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อและการนับจำานวนแบคทีเรยี

ท่ีมชีวีติ

ณัฐภัทร ภลูสนอง รหสั 5010101325

พรอ้มพนัธ ์ ศรอีมรรตัน์ ร ห สั 5010101350

พสิทิธิ์ แซจู่ ร ห สั 5010101353

อิศราพร เสนยอง รหสั 5010101384

เอกชยั หล้ามา ร ห สั 5010101385

สาขา การประมง 4 ปี

เสนอ

อาจารยช์นกันต์ จติมนัส

รายงานนี้เป็นสว่นหนึ่งของวชิา โรคสตัวน์้ำ้า

ภาคเรยีนท่ี 1 ปีการศึกษา 2553

มหาวทิยาลัยแมโ่จ้

คำานำา

ปัจจุบนันี้โรคสตัวน์้ำ้า เป็นปัจจยัหลายๆด้านท่ีท้ำาใหเ้กษตรกรประสบปัญหาเรื่องการขาดทนุ และท้ำาใหผ้ลผลิตท่ีได้ลดต้ำ่าลง ดังนัน้คณะผู้จดัท้ำาจงึท้ำาการศึกษาความแตกต่างระหวา่งปลาท่ีเป็นโรคกับปลาท่ีไมเ่ป็นโรค เพื่อง่ายต่อการสงัเกตและเพื่อใหส้ามารถเผยแพรแ่ก่เกษตรกรท่ีประสบปัญหาได้

รายงานน้ีจดัท้ำาขึ้นเพื่อประกอบการเรยีนในวชิา โรคสตัวน์้ำ้า เรื่อง การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อและการนับจ้ำานวนแบคทีเรยี และเพื่อเพิม่เติมความรูค้วามเขา้ใจในเรื่องโรคสตัวน์้ำ้าใหม้ากขึ้น

รายงานน้ีคณะผู้จดัท้ำามคีวามตัง้ใจในการน้ำาเสนอ หากมสีิง่ใดขาดตกบกพรอ่งคณะผู้จดัท้ำาต้องขออภัยมา ณ ท่ีน้ีด้วย

คณะผู้จดัทำา

27 มถินุายน 2553

บทนำา

ในการเพราะเล้ียงสตัวน์้ำ้าแต่ละชนิดจะต้องมกีารตรวจสอบคณุภาพของน้ำ้าและตัวของสตัวน์้ำ้าเอง เพื่อเป็นการตรวจหาเชื้อโรคท่ีอาจท้ำาใหเ้กิดความเสยีหายต่อสตัวน์้ำ้าได้ ซึ่งจะท้ำาใหส้ตัวน์้ำ้าติดโรคได้ ซึ่งในบทปฏิบติัการท่ี 4 น้ีจะเป็นการเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อและการนับจ้ำานวนแบคทีเรยีท่ีมชีวีติ โดยวธิ ีdilution plate count ซึ่งจะสามารถน้ำาไปปรบัใชใ้นการตรวจสอบปรมิาณเชื้อแบคทีเรยีในตัวอยา่งสตัวน์้ำ้าหรอืตัวอยา่งน้ำ้าได้ การสุม่นับจ้ำานวนแบคทีเรยีสามารถน้ำาไปเป็นขอ้มูลในการวางแผนป้องกันการสญูเสยีท่ีอาจเกิดขึ้นจากการระบาดของแบคทีเรยีได้ เน่ืองจากในแหล่งน้ำ้าอาจมแีบคทีเรยีอาศัยอยูเ่ป็นจ้ำานวนมาก และรวมไปถึงการควบคมุความสะอาดของเครื่องมอืท่ีใชใ้นการผลิต

การนับจ้ำานวนแบคทีเรยีใหไ้ด้ผลดีเพยีงใด ขึ้นอยูก่ับปัจจยัหลายอยา่ง เชน่การสุม่เก็บตัวอยา่ง ชนิดของแบคทีเรยีและความสามารถท่ีเจรญิบนอาหารเล้ียงเชื้อ อุณหภมูแิละระยะเวลาในการบม่เชื้อ จ้ำานวนซ้ำ้าของการทดลอง ความระเอียดรอบคอบในการตรวจนับ

วธิ ีdilution plate count เป็นเทคนิคท่ีท้ำาใหเ้ชื้อแบคทีเรยีในตัวอยา่งเจอืจางลงด้วยน้ำ้ากลัน่หรอืน้ำ้าเกลือ 0.85% ท่ีฆา่เชื้อแล้ว โดยปกตอจะท้ำาใหเ้ชื้อแบคทีเรยีเจอืจางลงครัง้ละ 10 เท่า ( ten-fold serial dilution) การท้ำาใหเ้จอืจางเพื่อใหม้กีารเจรญิของเชื้อในอาหารเล้ียงเชื้อระหวา่ง 30-300 โคโลนี (Colony forming unit : CFU)

บทปฏิบติัการท่ี 4การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อและการนับจำานวนแบคทีเรยี

ท่ีมชีวีติ

จุดประสงค์การทดลอง

1.เพื่อศึกษาการเตรยีมอาหารท่ีใชใ้นการเล้ียงเชื้อแบคทีเรยีในสตัวน์้ำ้า

2.เพื่อเป็นการฝึกสงัเกตและนับจ้ำานวนโคโลนีของเชื้อแบคทีเรยีในสตัวน์้ำ้า

วนัท่ีทำาการทดลอง

วนัพฤหสับดี ท่ี 23 มถินุายน 2553

สถานท่ีทำาการทดลอง

หอ้งปฏิบติัการโรคสตัวน์้ำ้าและหอ้งปฏิบติัการวเิคราะห์คณุภาพน้ำ้า คณะเทคโนโลยกีารประมงและทรพัยากรทางน้ำ้า

อุปกรณ์ท่ีใชใ้นการทดลอง

- การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อ

1.เครื่องแก้ว2.Agar , Slant Broth

- การ Dilution เชื้อแบคทีเรยีและการเขีย่เชื้อบนอาหารเล้ียงเชื้อ1.เชื้อแบคทีเรยี2.อาหารเล้ียงเชื้อ3.น้ำ้าเกลือ4.หลอดใชส้้ำาหรบั Dilution เชื้อ5.Auto pipette6.แท่งแก้วเขีย่เชื้อ7.ตะเกียงแอลกอฮอล์8.แอลกอฮอล์

การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อ

อาหารเล้ียงเชื้อ

ชัง่อาหารเล้ียงเชื้อ จ้ำานวน 10 กรมั

ละลายด้วยน้ำ้ากลัน่

การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อ (ต่อ)

ละลายอาหารเล้ียงเชื้อ

อาหารเล้ียงเชื้อ

น้ำาอาหารเล้ียงเชื้อ ไปฆา่เชื้อในเครื่อง Autoclave

การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อ (ต่อ)

น้ำาอาหารท่ีฆา่เชื้อแล้ว ไปเทใสล่งในจานเล้ียงเชื้อ

วธิกีารทดลอง

1.ใหน้ักศึกษาเล้ียงเชื้อแบคทีเรยีบรสิทุธิใ์นอาหารเหลวเป็นเวลา 16-24 ชม.

2.เก็บเซลล์แบคทีเรยีโดยการปั่ นท่ี 2500 rpm เป็นเวลา 15 นาที

3.ล้างเซลล์ด้วยน้ำ้าเกลือ 0.85 % ท่ีฆา่เชื้อแล้ว 2 ครัง้4.เติมน้ำ้าเกลือ 0.85 % ท่ีฆา่เชื้อ แล้วผสมใหเ้ขา้กันเป็น

เน้ือเดียวกับแบคทีเรยี ก่อนน้ำาไปวดัความขุน่ (Optical density; OD) ท่ีความยาวคล่ืน 540 nm ด้วยเครื่อง spectrophotometer ใหไ้ด้ค่า OD = 0.1

5.เจอืจางแบคทีเรยีลงครัง้ละ 10 เท่าจนถึง 10-5 , 15-6 และ 10-7 ดดูสารละลายแบคทีเรยี 0.1 ml หยดลงตรงกลางอาหารวุน้ แล้วเกล่ียด้วยแท่งแก้วงอท่ีฆา่เชื้อแล้ว ท้ิงใหแ้หง้ โดยแต่ละความเขม้ขน้ควรมอียา่งน้อย 3 ซ้ำ้า

6.น้ำาไปอบท่ี 28-30 0C เป็นเวลา 18-24 ชม.7.ใหน้ับจ้ำานวนโคโลนี แล้วรายงานผลเป็น colony

forming unit (CFU/ml) โดยท่ีจ้ำานวนโคโลนีท่ีนับได้บนอาหารเล้ียงเชื้อต้องอยูร่ะหวา่ง 30-300 โคโลนีต่อหนึ่งจานเล้ียงเชื้อ

8.ค้ำานวณจ้ำานวนโคโลนีต่อตัวอยา่ง

สมมุติวา่ จ้ำานวนโคโลนีเฉลี่ยเท่ากับ 123 โคโลนี นับได้จากจานเล้ียงเชื้อท่ีเติมน้ำ้าตัวอยา่งท่ีเจอืจาง 10-4

จ้ำานวนแบคทีเรยี 123 โคโลนี ได้จากน้ำ้าตัวอยา่งเจอืจาง 10-4 ml จ้ำานวน 0.1 ml

ดังนัน้ ในน้ำ้าตัวอยา่ง 1 ml จะมแีบคทีเรยีจ้ำานวน 123 x 104 x 10 = 1.23x107 CFU/ml

การเจอืจางเชื้อแบคทีเรยี ( Dilution )

การเจอืจางเชื้อ

น้ำ้าเกลือท่ีใชใ้นการเจอืจาง

หลอดท่ีใชใ้นการเจอืจางเชื้อ โดยเจอืจางลง 10-6/ml

การเขีย่เชื้อ

อุปกรณ์ในการเขีย่เชื้อ

ดดูเชื้อท่ีผ่านการเจอืจางแล้ว

หยดเชื้อลงในจานอาหารเล้ียงเชื้อ

การเขีย่เชื้อ (ต่อ)

ใชแ้ท่งแก้วเขีย่เชื้อใหทั้ว่จานเล้ียงเชื้อ

ก่อนน้ำาไปเก็บในตู้ปลอดเชื้อ เป็นเวลา 24 ชม.ก่อนน้ำามานับจ้ำานวนโคโลนี

ผลการศึกษา

จากการศึกษาพบวา่ อาหารท่ีใชเ้ล้ียงเชื้อแบคทีเรยี สามารถท้ำาใหแ้บคทีเรยีสามารถเจรญิเติบโตได้ และจ้ำานวนแบคทีเรยีท่ีได้จากการ Dilution ท่ีการเจอืจาง 10-6 ซึ่งมจี้ำานวนโคโลนีของเชื้อแบคทีเรยี อยูร่ะหวา่ง 30-300 โคโลนี ซึ่งท้ำาการทดลอง 2 ซ้ำ้า โดยมจี้ำานวนโคโลนี ดังนี้

1.จานเล้ียงเชื้อ ท่ี 1 มจี้ำานวนแบคทีเรยีอยู ่281 โคโลนี

2.จานเล้ียงเชื้อ ท่ี 2 มจี้ำานวนแบคทีเรยีอยู ่206 โคโลนี

3.

ภาพ แบคทีเรยีในอาหารเลี้ยงเชื้อ

จ้ำานวนแบคทีเรยี = (281 + 206)/2 x 106 x 10 = 2.435 x 109 CFU/ml

ดังนัน้ จะมจี้ำานวนแบคทีเรยีทัง้หมด เท่ากับ 2.435 x 109 CFU/ml

สรุปผลการศึกษา

จากการศึกษาพบวา่ อาหารท่ีใชเ้ล้ียงเชื้อแบคทีเรยี สามารถท้ำาใหแ้บคทีเรยีสามารถเจรญิเติบโตได้ และจ้ำานวนแบคทีเรยีท่ีได้จากการ Dilution ท่ีการเจอืจาง 10-6 ซึ่งมจี้ำานวนโคโลนีของเชื้อแบคทีเรยี อยูร่ะหวา่ง 30-300 โคโลนี ซึ่งท้ำาการทดลอง 2 ซ้ำ้า

ขอ้เสนอแนะ

อุปกรณ์ท่ีใชใ้นการท้ำาการทดลองมจี้ำานวนไมเ่พยีงพอต่อการเรยีน และขัน้ตอนการท้ำาการทดลองบางการทดลองไมม่กีารควบคมุใหป้ลอดเชื้ออยา่งเต็มที อาจท้ำาใหผ้ลการทดลองผิดไปจากความเป็นจรงิท่ีต้องเกิด

เอกสารอ้างอิง

คู่มอืปฏิบติัการวชิาโรคปลา.ชนกันต์ จติมนัส.คณะเทคโนโลยกีารประมงและทรพัยากรทางน้ำ้า มหาวทิยาลัยแมโ่จ้.เชยีงใหม,่2551.