4. Auf Physiologie und Pathologie beziigliche. 67

gestellten. R i p e r t ist der Ansicht, daß man aus den Ergebnissen der Refraktion und dem Gehalt der verschiedenen Fraktionen an Ketonen ein Bild über die Reinheit der Essenzen erhalten kann. A. B. L u q u e 1) hat die von A. E l l m e r ~) erhaltenen Werte für die Haftbarkeit reiner t~ieehstoffe und gtheriseher Öle nachgeprüft und dabei eine Überein- stimmung mit seinen Werten gefunden, die er beim Verdunstet an der Luft bei einer konstanten Temperatur von 40 o erhielt. W. D eh io.

4. Auf P h y s i o l o g i e u n d P ~ t h o l o g i e b e z ü g l i c h e M e t h o d e n . Von

K. Hinsberg. Über die Bestimmung von Chlor, Brom, Jod, Schwefelsäure und Phos-

phorsäure in biologischen Substraten. Die B e s t i m m u n g de r C h l o r i d e in b i o l o g i s c h e n M a t e r i a l i e n hat in den letzten Jahren eine wesent- liche Verbesserung erfahren. Statt der früher allgemein üblichen Titration nach V o l h a r d kann man mit gutem Erfolg folgendes Prinzip benutzen. Mercu r in i t r a t gibt in saurer Lösung mit Nitroprussidnatrium einen Niederschlag. Mercur ich lor id gibt unter den gleichen Bedingungen keinen Niederschlag. Läßt man daher in eine chloridhaltige Lösung Mercurinitrat fließen, so t r i t t die Trübung erst dann auf, wenn keine Chlor-Ionen mehr zur Bildang von QuecksilberII-chlorid vorhanden sind. Die Methode ist dem Prinzip nach schon 1918 von E. V o t o S e k a) be- schrieben worden. Auch H e l m u t Müller4), E. G e y e r und A. R o t s c h ») sowie J. W. C a v e t t und C. E. H o l d r i d g e G) haben Arbeitsvorsehriften angegeben. Die Vorschrift von G e y e r und R o t s e h wird hier wieder- gegeben.

L ö s u n g e n . t. 3,99 g Mercurinitrat Hg(N08)2.2 H20 werden unter Zusatz von so viel konz. Salpetersäure, daß eine klare Lösung entsteht, in Wasser zu J000 c c m ~ufgelöst. Der Titer der Lösung wird gegen eine 0,0i n-Natriumchloridlösung bestimmt. 2. Zur Eiweißfgllung 10% ige X~a$riumwolframatlösung und 3°/oige Sehwefelsgure. 3. 0,5°/oige Nitro- prussidn~triumlösung, frisch hergestellt.

A u s f ü h r u n g . 2,00 c c m Blut oder Serum werden mit l0 ccm Wasser hgmolysiert, dann mit je 2,0 c c m Wolframatlösung und Schwefelsäure versetzt und auf 20,0 c c m aufgefüllt. Vom Filtrat werden 5,00 c c m mit genau 3 Tropfen Nitroprussidnatrium]ösung versetzt und sofort aus einer Mikrobürette mit der Mercurinitratlösung titriert, bis sich vor einem schwarzen Hintergrund eine bleibende Trübung bemerkbar macht. Man bestimmt ebenfalls einen Leerwert, indem man 5,00 c c m der entsprechend verdünnten Fällungsmittel ebenso behandelt, d .h . bis zur sichtbaren Trübung titriert, wozu im allgemeinen 0,03--0,95 ccm erforderlich sind. Dieser Wert ist vom Hauptversach in Abzug zu bringen. Da 0,5 c c m

1) Congr. inS. Quim. apl. IX. Congr. 4, 594 (i934); durch Chem. Zenfrbl. 108, I, 2890 (1937). - - 3) t~ieehstoff-Ind. 5, 156 (1930); 6, 57 (~93~1). a) Vgl. diese Z~sehrf~. 60, 417 (~1921). - - a) Biochem. Ztsehrft. 213, 116, 121 (1929). - - ~) Vgl. diese Ztschrft. 98, 382 (1934). - - 3) Journ. Lab. clin. ~Vied. 18, 944 (1933); C. E. / t o l d r i d g e und J. W. Cav e t t , Journ. Labor. clin. iVied. 20, 303 (1934).

5*

68 Bericht: Spezielle analybische 1V[ethoden.

Blut bzw. Serum zur Analyse gelangten, lärmt sich die Chloridmenge unter Berücksichtigung des Titers leicht berechnen. Es gelingt auch noch, in O,t ccm Blut die Chloride auf diese Weise zu bestimmen.

Ha rn verdünnt man etwa 20fach und nimmt von dieser Verdünnung ~0 ccm, die mit 5 ccm Snlfosalicyls~ure-Lösung gefällt werden. Vom Fil trat verwendet man 10 ccm, die wie oben besehrieben titriert werden.

An Stelle des I~Titroprussidnatriums kann man nach K. L a n g 1) sowie J . V. Dubskh~ und J. T r t i l e k ~) Diphenylcarbazid oder Diphenyl- carbazon als Indikator benutzen (0fl°//o in Alkohol). Man setzt dem wie oben beschrieben bereiteten Fi]trat 5 Tropfen Indikator zu und ti tr iert mit Mercurinitrat bis zum Auftreten einer Blaufärbung. Die zu unter- suchende Lösung soll schwach sauer sein, jedoch darf der Säuregehalt 0,05 n nicht übersteigen, weil sonst der Umschlagpunkt nicht mehr scharf ist. Es ist auch nicht empfehlenswert, mit schwächeren als 0,095 n- Lhsungen zv titrieren.

Die beiden Methoden sind gleichwertig und geben ausgezeichnete Resultate. Ihr Vorteil gegenüber früheren Methoden besteht besonders darin, daß nicht verascht werden muß, was einen großen Zeitgewinn be- deutet, ohne die Genauigkeit zu beeinflussen. Die Methode von N. Be renda ) , nach der die überschüssigen Silber-Ionen mit Joda t gefällt werden, gibt bei sehr kleinen Mengen wegen der Löslichkeit des Silber- jodats keine zuverlässigen Werte. Dagegen ist ein ähnliches Prinzip, die Silber-Ionen mit Jodat-Jodid zu titrieren, von F. C. M c L e a n und D. D. r a n S l y k e 4) angegeben worden, welches von t~. K. C h r i s t y und W. R o b s o n 5) für Blut und Harn modifiziert worden ist.

Lösungen. 5,808 g Silbernitrat auf ~000 ccm Wasser und 5,6763 g Kaliumjodid auf 1000 ccm Wasser; je i,00 ccm der LOsungen entsprechen genau 2,0 mg Natriumchlorid; k0nz. Salpetersäure; etwa 0,0i n-Kalium- bijodatlösnng (0,325 g in ~000 ccm); l°/oige Stärkelösung.

A u s f ü h r u n g . Die Eiweißfgllung erfolgt mit Natr iumwolframat und Schweßelsäure wie oben angegeben. Zu 20 ccm Fil trat von Blut oder Harn kommen l ccm Salpetersäure und 4,00 ccm Silbernitratlösung oder mehr, jedenfalls müssen die Silber-Ionen im Überschuß sein. Nach einigem Stehen füllt man auf ein bekanntes Volumen, z. B. 50 ccm, auf und fügt zu 20 ccm Fil trat I ccm Kaliumbijodatlösung und etwas Stärke. Man titriert alsdann mit der Kaliumjodidlösung bis zum Auftreten einer bleibenden Blaufärbung. Der Verbrauch an Kaliumjodid gibt im Ver- gleich mit einem Leerwer t an, wieviel Silber im Überschuß vorhanden war, woraus sich wiederum der Verbrauch durch F~llung als AgC1 be- rechnen läßt. Bei der Titrat ion spielt sich folgender Vorgang ab. Das Xali~mjodid setzt sich einerseits mit den Silber-Ionen um unter Bildung von unlöslichem Silberjodid. Andererseits setzt es sich auch mit dem Jodat unter Abseheidung von freiem Jod um, welches aber auch

1) Biochem. Ztschrft. 290, 289 (1937). - - 2) Vgl. diese Ztsehrft. 96, 358 (1934); Mikroehem. 15, 95 (~[934). - - 3) Vgl. diese Ztschrft. 99, t57 (~934). - - a) Vgl. diese Ztschrft. 55, 347 (1916). ~ 5) Biochem. Journ. 22, 571 (~928).

4. Auf Physiologie und Pathologie bezügliche. 69

sofort Silberjodid bildet. Die zuerst auftretende B]aufgrbung verschwindet darauf wieder und bleibt erst bestehen, wenn keine Silber-Ionen mehr vorhanden sind. Es kommt also nicht darauf an, den Titer der Jodat . lösung zu kennen, sondern den der Jodidlösung. Da die Fgllung der Silber-Ionen als sehr schwerlösliches Silberjodid erfolgt und der Umschlag von Farblos zu Blau scharf ist, sind die erhaltenen Werte sehr zuverlässig.

Weitere Methoden, die für Spezialf~lle wichtig sein können, siehe bei K. H i n s b e r g und K. Lang1).

Zu r B e s t i m m u n g des C h l o r g e h ~ l t e s von B l u t k ö r p e r c h e n u n d P l a s m a gibt M. P a g e t 2) folgende Anweisung: Man setzt dem Blut am besten 20/0o Natrium- oder Kaliumoxalat zu und zentrifugiert darau* in geeichten Zentrifugengl£sern, um das Volumen von Plasma und Erythrocyten bestimmen zu können. Dies muß spgtestens iß Stde. nach Blutentnahme geschehen sein. Das P l a s m a wird abgehoben und nacheinander mit 4 ccm Wasser, t cc~n t5~oiger Kaliumferrocyanidlösung und 2 ccm 1t,2% iger Zinkacetatlösung versetzt. Anschließend füllt man auf ein bekanntes Volumen auf, schüttelt durch, filtriert und erhglt ein wasserklares, eiweißfreies Filtrat.

Die B l u t k ö r p e r c h e n werden zweimal auf der Zentrifuge mit iso- tonischer Zuckerlösung gewaschen; von dem Blutkörperchenbrei werden 3 ccm mit ungefähr 75 ccm Wasser h~molysiert; das Eiweiß daraus wird mit etwa 0,6 ccm Kalinmferrocyauidlösung und 1,2 ccm Zinkacetatlösung ge- f~Lllt. Man füllt auf 250 ccm auf, schüttelt heftig, filtriert und erh~Llt immer ein farbloses, eiweißfreies Filtrat. Die Chlorbestimmung erfolgt nach bekannten Methoden.

B e s t i m m u n g de r B r o m i d e . Zur Bestimmung der Bromide ist prinzipiell zu sagen, daß hierfür die Abtrermung von Chlor und Jod sehr wichtig ist, weil z. B. im Blut auf etwa 0,4 m g Brom 350 m g Chlor und 0,17 mg Jod kommen. Ffir das Chlor fallen demnach die beiden anderen Halogene nicht ins Gewicht, wohl aber ist das Chlor bei der Brom- bestimmnng zu berücksichtigen und auf eine genaue Trennung oder eine spezifische Reaktion für Brom zu achten. Nach T. L e i p e r t 3) sind im Blut 0,16--0,40 ~ng-~o, im Blutplasma 0,18--0,45 m g - % vorhanden. Es besteht also eine gewisse l%etentiou in den Erythrocyten, es liegt aber keine Brom-Eiweißverbindung vor und die Ausscheidung im Harn geht parallel der des Chlors, so daß kein Anhalt für eine physiologische Be- deutung des Broms vorhanden ist.

Nach Fr . L. H a h n ¢) kann man mit Hilfe von Fluorescein Brom gut bestimmen.

Ein ~hnliches Verfahren stammt von 1%. I n d o v i n a ~ ) , verbessert von H. K i r c hho f6 ) . Diese Verfahren sind aber durch Verwendung von fnchsinschwefliger S~Lure umstSndlicher.

1) Medizinische Chemie (1938). - - 2) ffourn. Pharm. Chim. [8] 25, t03 (i937). - - 3) Biochem. Ztschrft. 280, 416 (~935). - - 4) Vgl. diese Ztschrft: 108, 39 (~937); 109, 351 (1937). - - õ) Biochem. Ztschrf~. 275, 286 (t934).

_ _ 6) Klin. Wochenschrift 14, ~755 (~935).

70 Bericht: Spezielle analytische )/[ethoden.

Ü b e r d ie B e s t i m m u n g des J o d s ist bereits eingehend berichtet ùworden1). Inzwischen ist eine Arbeit von W. R u f t 2) ü b e r die Be- ù s t i m m u n g k l e i n e r J o d m e n g e n in O r g a n e n , b e s o n d e r s in Sch i ld - d r ü s e n v o n I ~ i n d e r n , erschienen. ~, Es wird auf die alte Methode von Th. v. F e l l e n b e r g zurückgegriffen, aber unter Zusatz von viel Pottasche bei tiefer Temperatur veraseht, Dabei sollen keine Jodverluste entstehen. Das Extraktionsverfahren ist außerordentlich zeitraubend. Es wird folgende Vorschrift gegeben:

Auf den Boden einer kleinen Porze]lanschale von 6 c m Durchmesser und 2 c m Tiefe bringt man 0,5 g fein gepulvertes Carbonat, darauf gleich- m£Big verteil t 0,1 g Schflddrüsenpslver; das Ganze wird mit 3 - - 5 g feinem Kaliumcarbonat überdeckt. Es wird auf dem Sandbad erhitzt, bis aller Geruch nach organischer Substanz verschwunden ist, zuletzt mit kleiner direkter Flamme, bis keine Stechenden Gerüche mehr wahr- nehmbar sind. Zur Extrakt ion des Kaliumjodids rühr t man mit heißem Wasser zu einer dünnen PaSte an, die aber noch schwerflüssig sein soll, und extrahiert darauf mit 5 c c m Alkohol, indem man mit einem ver- dickten Glasstab t5- -20 Min. rührt. Diese Extrakt ion muß f ü n f m a l wiederholt werden. Der Alkohol wird abfiltriert, das Filter nachgewaschen, der Alkohol auf dem Wasserbad vollkommen verdampft, der Rückstand mit Br0mwasser oxydiert und in 6--7 c c m Wasser aufgenommen; dann wird noch einige Minuten gekocht, um Alkoholreste zu' entfernen, mit 0,05 n-Schwefels£ure und Lackmus neutralisiert, 0,t c c m Sehwefels£ure im Überschuß zugesetzt und nach dem Erkalten nach Zusatz von etwas Kaliumjodid mit Thiosulfat titriert. Der Jodgehalt der Schilddrüsen schwankt bett&ehrlich, und zwar werden die höchsten Werte im Winter, die niedrigsten im Sommer gefunden. Die Drüsen von den Tieren aus dem Xüstengebiet sind jodreicher. Es ist immer nur ein ganz best immter Teil des Jods an Thyroxin gebunden. Die Hypophyse weiblicher Tiere enthglt mehr Jod als die der mgnnlichen Tiere, der Hypophysenvorder- lappen ist reicher als der Hinterlappen. Den Jodgehalt anderer Organe gibt fo]gende Tabelle an.

Milz . . . . . . . . . . . . . 10,37 mg-% Jod Nebenniere . . . . . . . . . 5,5 . . . . Hoden . . . . . . . . . . . 3,8t . . . .

Ovarien . . . . . . . . . . t,21 . . . . Bauchspeicheldrüsen . . . . . 1,06 . . . . P]acenta . . . . . . . . . . 0,74 . . . . Galle . . . . . . . . . . . . 0,48 . . . . Mamma . . . . . . . . . . 0,22 . . . . Leber . . - . . . . . . . . . 0,22 . . . .

B e s t i m m u n g der S u l f a t e , d e r S e h w e f e l s ä u r e e s t e r u n d des s o g e n a n n t e n n e u t r a l e n S c h w e f e l s . Der Schwefel kommt in der belebten Natur, abgesehen von seinem Vorkommen im Eiweiß, in ver- schiedenen Formen vor:

i) Vgl. diese ZtsehrfL 97, 367 (1934). - - 3) Bioehem. Ztsehrft. 287, 40 (1936).

4. Auf Physiologie und Pat~hologie bezügliche. 7 J.

1. Als anorganisehes Sulfat; 2. als Schwefelsaureester, meist des Phenols, die durch Kochen mit Säuren gespa]ten werden können; 3. als Sulfosäuren z. B. im Taurin; 4. als Schwefel in Form von Sulfhydryl- und Disulfidverbindungen; 5. als flüchtige Schwefelverbindtmgen wie Mer- eaptane und Schwefelwasserstoff. Die Gruppen 2 bis 5 werden häufig unter dem Namen ,Neutralschwefel" zusammengefaßt. Er wird meistens als Sulfat nach vollständiger Oxydation der organischen Substanz bestimmt. I m allgemeinen werden 3 Fraktionen bes t immt:

A. Präformiertes anorganisches Sulfat; B. Gesamtsulfat, nach Spalt- ung der Ester mit Säure; C. Gesamtschwefel, nach vollstandiger Ver- aschung.

Zur Veraschung bedient man sich am besten einer Mischung von Salpetersäure und Perhydrol oder eines Brom-Salpetersaure-Gemisehes. Von den verschiedenen Vorschlägen, die zur Bestimmung der Sulfat-Ionen bei Mikromengen gemacht worden sind, hat sich vor allem die Benzidin- methode durchzusetzen vermocht, obschon sie keine ideale Methode ist, weil die Eigenlöslichkeit des Benzidinsu]fates noch sehr merklich ist. Sie betragt 9,3 mg-% in Wasser, 8 ,76mg-% in Aceton und 5 ,24mg-% in Alkohol. Außerdem werden sehr leicht Phosphate mitgefällt, wenn nicht genügend freie Salzsäure vorhanden ist, was aber wieder den Nachteil hat, daß dann der Niederschlag sehr leicht durch Benzidinhydrochlorid verunreinigt ist.

Weiter hat sich die Bariumchromatmethode eingebürgert, die darauf beruht, daß aus einer säuren Bariumchromatlösung ein Teil des Bariums als Sulfat ausgefällt wird. Nach Neutralisation bleibt also ein der Schwefel- säure aquivalenter Teil von Chromat in Lösung und kann leicht best immt werden. Fehler entstehen hier ebenfalls durch Phosphate und durch reduzierende Stoffe, die einen Teil des Chromats reduzieren können. Eine derartige Vorschrift findet man bei S. M o r g u l i s und M a r t h a H e m p h i l l l ) .

E i n e c o l o r i m e t r i s e h e B e s t i m m u n g d e r S u l f a t e in B l u t u n d S e r u m haben T. V. L e t o n o f f und J . G. l ~ e i n h o l d u) veröffentlicht. Sie fällen die Sulfate mit Benzidin aus, waschen den Niederschlag ans und best immen das im Niederschlag befindliche Benzidin durch eine Farb- reaktion mit naphthochinonsulfosaurem Natrium.

Lösungen. t. 0,4%ige Uranylacetatlösung. 2. l%ige Lösung von Benzidin in Aceton; oft frisch ansetzen. 3. Benzidinstandardlösung: 0,1606 g gereinigtes Benzidinhydrochlorid werden in Wasser auf 200 ccm

1) Vgl. diese Ztschrft. 102, 457 (t935); siehe auch K. Lang , vgl. diese Z~sehrft. 97, 154 (]934). __ 2) Journ. of Biol. Chem. 114, 147 (t936). Weitere eolorimetrische Benzidinmethoden siehe A l f r ed F r i e d r i e h und E. B a u e r , vgl. diese Ztschrft. 104, 46t (1936); E. G. W a k e f i e ] d , Journ. of Biol. Chem. 81, 713 (1929); A. F r i e d r i e h und F. Mundl , Ztsehrft. f. physiol. Chern. 23~, 174 (1935); 1%.S. t t u b b a r d , Journ. of Biol. Chem. 88, 663 (1930); ]~. S. K a h n und S. L. L e i b o f f , Journ. of Biol. Chem. 80, 623 (1928); D. P. C u t h b e r t s o n und S. L. T o m p s e t ~ , t~ioehern. Journ. -05, t237 (t931).

72 Bericht: Spezielle analytische Methoden.

gelöst und zum Gebrauch i0fach verdünnt, i,00 ccrn dieser Verdünnung entspricht 0,01 m g S. Die Lösung muß in der Kälte aufbewahrt werden. 4. Boratpuffer: 1 g Borsäure in i00 c c m 0,1 n-Natronlauge. 5. 0,i5~öige Lösung von fl-naphthoehinonsulfosaurem Natrium in Wasser.

Reinigung des ki~uflichen Benzidinhydroehlorids: Man löst 5 g in 200 c c m 5°/oiger Salzsi~ure bei 50 ° C, f i l t r ier tund Setzt 20 c c m konz. Salz- si~ure zu. Es wird in Eiswasser gekühlt und lnaeh 30 Min. kann man die ausgefallenen Krystalle absaugen, mit kalter verdünnter Salzsäure waschen und im Vakuum trocknen. Die trockenen Krystalle werden noch zweimal mit je 25 c c m Alkohol und viermal mit Äther gewaschen und wieder getrocknet.

A u s f ü h r u n g . 6 c c m Uranylacetatlösung werden in einem Zentrifugen- glas langsam mit 2,00 c c m Blut oder Serum versetzt. Es fallen die Ei- weißkörper und die Phosphate aus. Iqach einiger Zeit schleudert man ab und versetzt 4,00 c c m des klaren Zentrifugats in einem zweiten Zentri- fugenglas mit i c c m Eisessig und 9 c c m Benzidinlösung in Aceton. Die F~llung muß mindestens 30Min. in Eiswasser stehenbleiben; sie wird dann zentrifugiert, der Niederschlag mit i4 c c m Aceton ausgewaschen, getroeknet, in I c c m Boratpuffer bei 60 ° gelöst und schließlich mit i0 c~m

Wasser und ~ c c m 1Naphthochinonreagens versetzt. Nach 5 Min. gibt man noch 2 c c m Aceton zu und kann nun nach 5 Min. die rote Farbe colorimetrieren (Zeiss Stufo Filter S 47). Entsprechende Ansätze mit der Standardbenzidinlösung werden unter gleichen Bedingungen an- gesetzt, indem je nach der Menge Benzidinlösung entsprechend weniger Wasser genommen wird, d. h. das Flüssigkeitsvolumen muß immer 14 c c m

betragen. Mit dieser Methode wird etwa I m g - % anorganischer Sulfat- schwefel im Serum gefunden.

Die Methode ist auch für Harn brauchbar, der indessen stark ver- dünnt werden muß. Im allgemeinen nimmt man auf i,00 c c m Harn 4 ccm Uranylacetatlösung und 5--10 c c m Wasser und verwendet zur Fällung t,00 c c m dieses Filtrates.

St. L o r a n t 1) fällt die Sulfate ebenfalls als Benzidinsalz. Der Niederschlag wird ausgewaschen, in heißem Wasser gelöst und in einem säuren Acetatpuffer mit p-Dimethylaminobenzaldehyd zu einem Farbstoff kondensiert, dessen Konstitution nicht näher angegeben ist. Die maximale Farbe ist nach I Stde. entwickelt, bleibt dann 12--24 Stdn. konstant und kann während dieser Zeit eolorimetriseh bestimmt werden. Die Methode ist umständlich und scheint gegenüber anderen eolorimetrisehen Methoden keine Vorteile zu besitzen.

Dagegen ist es wichtig, wie St. L o r a n t und H. H e r z o g 2) betonen~ besonders bei der Bestimmung der Gesamtsulfate die Chlor-Ionen-Kon- zentration möglichst niedrig zu halten, weil sonst Benzidinhydrochlorid mit dem Su]fat zusammen ausfällt. Er verwendet deshalb z. B. zur Hydro- lyse des Trichloressigsäurefiltrates von Serum nur 0,75 ccm 0,1 n-Salzsäure.

1) Biochem. Ztsehrft. 289, 425 (1937). -- 2) Biochem. Ztschrft. 292, 98 (1937).

4. Auf Physiologie und Pathologie bezüglichc. 73

E i n e t i t r i m e t r i s c h e B e n z i d i n m e t h o d e gibt E. 0 1 1 g a a r d 1) ùan. Er t i tr iert direkt unter Verwendung von Rhodizonsäure als Indikator .

L ö s u n g e n . t. 20% ige Trichloressigsäure. 2. t°/oige Benzidinlösung in Aceton. Täglich frisch. 3. Alkoholmischung: 6 g Ammoniumchlorid und 6 g krystallisiertes Magnesiumchlorid werden in 60 c c m Wasser gelöst; nun wird mit Alkohol zu einem Liter aufgefüllt. 4. 0,02 n-Lösung von Bariumchlorid in kohtendioxydfreiem Wasser. 5. Indikator : ~[ m g Natr ium- rhodizonat, in einigen Kubikzentimetern Wasser gelöst. Die Lösung ist nur etwa I Stde. haltbar.

A u s f ü h r u n g . 2,00 c c m Serum werden mit 2 c c m Wasser und 2 c c m

Triehloressigsäure enteiweißt und nach 10 Min. filtriert; dann werden 2 c c m Filtrat in einem passenden Zentrifugenglas mit 5 c c m Benzidinlösung t Stde. sich selbst überlassen. Darauf wird zentrifugiert, die Flüssigkeit abgegossen, das Glas mit der Mündung nach unten auf ein Fil tr ierpapier gestellt und nach l0 Min. nochmals mit l0 c c m Aceton ausgewaschen, ohne dabei den Niederschlag aufzuwirbeln. Es wird erneut abgesohleudert. Man läßt das Aceton ablaufen bzw. verdampfen und kann nach etwa t0 Min. den Niederschlag in t Tropfen 0,1 n-Natronlauge lösen. Dann setzt man 2 c c m Alkoholmischung zu und bringt das Glas in ein Wasser- bad von 65--70 °. Gerührt wird mit einem kohlendioxydfreien Luftstrom. Wenn nach ~ - - t Min. die Lösung die Temperatur des Bades ange- nommen hat, wird mit Bariumchlorid aus einer R e h b e r g - B ü r e t t e mit lang ausgezogener Spitze, die in die Flüssigkeit eintaucht, t i triert, bis eine deutliche l~otfärbung bestehen bleibt. Eine vorübergehende Gelb- färbung ist nicht maßgebend. Bleibt die rote Farbe bestehen, n immt man die Bürettenspitze aus der warmen Lösung, wartet , bis sich die Spitze abgekühlt hat, füllt sie wieder mit Flüssigkeit bis zam Ende, um nun erst den Verbrauch an Bariumchlorid abzulesen. Die Titrat ion darf wegen der Unbest/~ndigkeit des Indikators nicht zu lange dauern. 1 c m m

0,02 n-Bariumchloridlösung entspricht 0,3206 y Schwefel. Ein Blindwert muß immer abgezogen werden. Die Methode soll für Vollblut nicht brauchbar sein.

Eine gleichartige makroanalytische Methode haben I~. S t r e b i n g e r und L. v. Z o m b o r y 2) angegeben.

Eine weitere Methode, die gleichsam ein Mittelding zwischen Ben- zidin- und Chromatmethode darstellt, s t ammt von K. Yosh ino~) . Die Methode ist besonders zur Untersuchung von Milch geeignet, l£Bt sich aber auch auf andere Substrate übertragen. Sie stellt eine Modifikation der Methode von A. S a t o und H o s h i 4) zur Bestimmung des Schwefels im Urin dar. Die Sulfate werden durch eine bekannte Menge Barium-

1) Biochem. Ztschrft. 274, 181 (1934) . - Weitere titrimetrisehe Benzidin- methoden unter Verwendung von Permanganat zur Oxydation sind vor- geschlagen worden von: C. L. Cope, Bioehemical Journ. 25, 1183 (1931); Power , Journ. of Biol. Chem. 105, 67 (t934); W. S. I - Iof fman und 1%. Cardon , Journ. of Biol. Chem. lÕ9, 717 (1935). - - e) Diese Ztschrft. 105, 346 (1936). - - ~) Tohoku Journ. exp. Med. 80, 501 (1937). __ 4) Tohoku Igaku Zasshi 5, I (t920).

74 Bericht: Spezielle analytische l~ethoden.

chlorid gefällt; der Überschuß an Barium wird als Chromat niederge- schlagen, dieses in Salzsäure gelöst und mit Benzidin ifl I~eaktion gebracht. Die entstehende Farbe (gelb-braun) wird sofort colorimetriert.

R e a g e n z i e n . Ka]iumchromat: 2,427 g auf 100 ccm. Davon werden 2 c c m auf 1000 verdünnt; dann entsprechen 5 , 0 0 c c m 0,00010 g S03. Bariumchloridlösung: 1,525 g Bariumchlorid (BaC12 . 2 I-I20) auf t000 c c m

Wasser. Benzidin-Salzsäure: 4,0 g Benzidin werden mit Wasser ver- rieben, in einen Meßkolben übergeführt, mit 4 c c m Salzsäure (D t,19) versetzt und mit Wasser auf 500 cc~n aufgefüllt. Nach einiger Zeit entsteht ein Niederschlag, die Lösung kann aber trotzdem lange be- nutzt werden. Acetatmisehung: 10 g Natriumacetat Und 3 c c m Eis. essig werden mit Wasser auf 100 c c m aufgefüllt. Gesättigte Kalium- chromatlösung. 0,2n-Salzsäure. 0,33°/oige Uranylacetatlösung. 95~oiger Alkohol. Aufschwemmung von 0,7 g Aluminiumoxydhydrat (Merck) in t 0 0 c c m destflliertem Wasser.

A u s f ü h r u n g . Zu 2,00 c c m menschlicher Milch setzt man 0,5 c c m

Uranylaeetatlösung, 0,5 c c m Acetatmischung und 5,0 c c m Alkohol, hängt unter Schütteln in ein kochendes Wasserbad, bis Koagulation eingetreten ist, kühlt ab, gibt dann 2 c c m Aluminiumoxyd-Anfschwemmung hinzu, schüttelt kraftig durch Und füllt auf 10 c c m auf. Zu genau 5,00 ccm des klaren Filtrates gibt man in einem konischen Zentrifugenglas 1,00 ccm Bariumehloridlösung, rührt mit einem Glasstab 5 Min. um und zentri- fugiert nach dieser Zeit ebenfalls 5 Min. Vom Zentrifugat entnimmt man 3 c c m in ein anderes Zentrifugenglas, setzt 3 Tropfen gesättigte Kalium-

Tabelle I. chromatlÖsung zu, zentrifugiert nach einiger Zeit, dekantiert die

A ccm der ccm Salzsäure, überstehende Flüssigkeit, wäscht ]3ariumehromat- die zugesetzb den 1Wiederschlag zweimal mit

Lösung werden müssen 2 c c m destilliertem Wasser aus und fügt danach i c c m Salzsäure zu. Die Lösung wird auf 10,0 c c m

3,00 0,7 aufgefüllt und ein aliquoter Teil, 4,00 0,6 der sich nach der Menge Barium- 5,00 0,5 chromat richtet, abpipettiert und 6,00 0,4 so viel Salzsäure zugegeben, daß

im ganzen t c c m Salzsäure vorhanden ist. Vgl. Tab. I. Zuletzt wird nach Zusatz von I c c m Benzidinlösung auf t0,0 c c m

aufgefüllt und die Farbe nach t Stde. gemessen. Eine oder mehrere StandardlÖsungen werden ebenso behandelt und direkt verglichen, oder es wird in einem Absoluteolorimeter die Extinktion gemessen.

Bei Verwendung eines gewöhnlichen Colorimeters ist bei den an- gegebenen Mengen der Gehalt an

SO3 in t00 c c m Milch = (0,5 Ablesung des Standards 2 Ablesung der Probe X Ä) x 100 mg.

Der Fehler betr~gt bei einer absoluten Menge von 0,1 m g SOa ~ 3,6%. Gelegentlich sind Abweichungen bis 90/0 anzutreffen. Die Dauer einer Analyse beträgt 3 Stdn.

4. Auf Physiologie und Pathologie bezügliche. 75

B e s t i m m u n g de r P h o s p h o r s / ~ u r e u n d i h r e r E s t e r usw. Die Phosphors/~ure kommt im Organismus teils in den verschiedensten Verbindungen, teils auch frei als anorganisches Phosphat vor. Ihr Vorkommen ist dem der Sulfate zu vergleichen, aber bei weitem mannigfaltiger. Im allgemeinen unterscheidet man 3 tIauptgruppen:

i. Kolloidale phosphorhMtige Verbindungen: Phosphorproteide, Nucleoproteide. 2. Ätherlöslicher Phosphor oder Lipoidphosphor. 3. S/~urelöslieher Phosphor, der alle Verbindungen umfaßt, die bei einer sattren Eiweißf~llung in Lösung bleiben. Hierzu gehören: Anorganisehe Phosphors~ure, Nueleotide z .B. Adenyls/ture, Kohlenhydratphosphor- s/~ureester, Triosephosphors/~ureester, Phosphobrenztraubens/~ure, Phos- phoglycerinsgure, Glycerinphosphors~ure und schließlich noch die Phos- phagene, die amidartig gebunden sind. Die einzelnen Verbindungen unterscheiden sich durch relative Bestgndigkeit gegenüber Sturen, und man kann die Ester durch fraktionierte Hydrolyse bestimmen. Am leichtesten werden die Phosphagene gespMten; man bestimmt sie schon als anorganisches Phosphat mit, wenn man unter normalen Umstgnden enteiweißt. Daher sind zur Bestimmung des wahren anorganischen Phos- phates besondere Vorsichtsmaßregeln erforderlich, die sich sowohl auf die Vorbereitung des Substrates als auch auf die Art der Phosphatf/tllung beziehen.

In einem früheren Referat 1) sind die wesentlichen Methoden bereits besprochen. Als Standardmethode kann das Verfahren von K. L o h m a n n und L. J e n d r a s s i k 2) gelten, das auf der methode von C. I-I. ~ ' iske und Y. S u b b a r o w ~) beruht. Wesentlich ist, das Eikonogen «) umzukrystalli- sieren und stets nur rein weiße Präparate zu verwenden. An Stelle des Eikonogens, welches im Handel nicht immer zu haben ist, wird von Mül l e r s) Amidol, 2,4-Diamidophenolchlorhydrat empfohlen, doch ist die Farbtiefe bei gleichen Phosphatmengen gegenüber dem Eikonogen verschieden, und man muß besondere Eiehkurven aufnehmen.

Bei der Entwicklung der blauen Farbe, die auf Zusatz von Eikonogen oder Amidol entsteht, ist es vorteilhaft, nach L o h m a n n und J e n d r a s - sik 6) 7 Min. in ein Wasserbad von 370 zu stellen und nachher in ein solches von Zimmertemperatur. Dadurch ist die Farbentwicklung gleichmäßiger. Im Stufenphotometer von Zeiss wird mit dem Filter S 61 gemessen. Es ist ferner wesentlich, dag alle Proben, auch diejenigen zur Aufnahme der Eichkurve, gleiche Säurekonzentration, und zwar sowohl an Triehlor- essigs~ure als auch an Sehwefelsgure haben.

Nach D. ]%. D a v i e s und W. C. D a v i e s 7) stört eine l~eihe von Sub- stanzen, aber nur in relativ großer Konzentration. Es dürfen in 25 ccm der Colorimeterlösung vorhanden sein: Citronens/~ure 30 mg, Oxals/~ure und Brenztraubens~ure 59 mg, Weinsäure 90 mg, J~pfel- und Milchsäure

1) Vgl. diese Ztschrf$. 10~, 371 (1936). - - ~) Vgl. diese Ztschrft. 96, 297 (i933). - - a) Vgl. diese Ztschrft. 85, t10 (193t). - - 4) 1,2,4-Amino- naphtholsulfosäure, vgl. diese Ztsehrft. 104, 378 (1936). - - 5) Ztschrft. f. physiol. Chem. 237, 35 (1935). - - 6) a. a. O. - - ~) Biochemieal Journ. 26, 2046 (1932); vgl. auch diese Ztschrft. 102, 427 (1935).

76 Bericht : Spezielle analytische Methoden.

i20 mg und Glyko]säure 250 mg. Werden diese Mengen überschritten, so muß die Molybdatkonzentration erhSht werden. Einen wesentlichen Einfluß übt noch die Arsens~ure aus, die mit Molybdat denselben reduzier. baren Komplex bildet wie die Phosphors~ure. Man schaltet sie am besten aus durch Reduktion zum dreiwertigen Arsen, das nicht mehr stört. Als Reduktionsmittel verwendet L. B. P e t t 1) schweflige Säure. Eine/~hniiche Methode geben A. S e h ä f f n e r und F. K r u m e y 2) an. Weiteres siehe bei R. A m m o n und K. H i n s b e r g 3 ) . Es muß noch betont werden, daß auch Kiese]siiure ähnlich stört wie Arsensäure.

I m normalen menschlichen Blut finden sich folgende Phosphat- fraktionen:

Anorganisches Orthophosphat . . . . . etwa 3- -4 m g - % Pyrophosphat . . . . . . . . . . . . . . 5 - -6 , t texoseester . . . . . . . . . . . . . . , 6 , Diphosph oglycerins~ure . . . . . . . . . . I t , Gesamter s~urelöslicher Phosphor . . . . . 25 ,

Die B e s t i m m u n g de r P h o s p h o r s ~ u r e m i t H i l f e v o n 8 - O x y - c h i n o l i n führt man nach C. J. K i n g und G. E. D e l o r y «) in folgender Weise aus.

P r i n z i p . Die Phosphorsäure wird als 8-Oxychinolinsalz [(C9H70N)~ , II~(P[Mo20~]6) . 2 H20)]

der Phosphormolybdänsäure gefällt, worauf das im l~iedersch]ag befind- liche Cbinolin co]orimetrisch mit dem Pheno]reagens von 0. Folin und V. Ciocalteu 5) bestimmt wird.

Lösungen. I. Phosphorhaltige Stammlösung --~ 2,i94 g Monokalium- phosphat auf 500 ce~ (i mg P im Kubikzentimeter). II. Phosphorhaltiger Vergleichsstandard: LösungI, 500fach verdünnt (2 y P im Kubikzentimeter). III. 0,8 g 8-0xychinolin und 4,2 g Ammoniammolyhdat werden getrennt in 5 n-Salzsäure gelöst, die Lösungen nachher gemischt und auf i00 ccm mit Salzsäure aufgeßüllt. IV. 0,1 n-Natronlauge. V. Phenolreagens. i00 g krystallisiertes Natriumwolframat (Na2WO 4 . 2 H~O) und 25 g ~atrium- molybdat (Na2MoO 4 . 2 H20 ) werden in 700 ccm Wasser gelöst. Dann setzt man 50 ccm 85% ige Phosphorsäure zu, nebst t00 ccm konz. Salz- säure and kocht die Mischung i0 Stdn. am Rückflußkühler. Gegen Ende der Kochperiode wird mit 150 g Lithiumsulfat, 50 cem Wasser und einigen Tropfen Brom versetzt. Um den Bromüberschuß zu vertreiben, wird noch etwa 15 Min. ohne l~ückfluß weiter gekocht und nach dem Ab- kühlen auf i l aufgefüllt. Das Reagens soll keinen grünlichen Schimmer haben und vor Licht und Staub geschützt aufbewahrt werden. VI. l0 °/oige Sodalösung. VII . 20°/oige Trichloressigsaure.

A u s f ü h r u n g . Zur Bestimmt~ng des anorganischen Phosphors wird 0,t ccm Blut mit 5,4 ccm Wasser hamolysiert und das Eiweiß mit 2 ccm

1) Vgl. diese Ztschrft. 104, 446 (1936). - - 8)Ztschrft. L physiol. Chem. 243, :t49 (t936). - - ~) Vgl. diese Ztsehrft. 111, 3t (t937/38). - - 4) Bio- chemical Journ. 31, 2046 (t937) und Mikrochem. 22, 125 (1937); durch Ber. ges. Physiol. 105, 8 (1938). - - 5) Vgl. diese Ztschrft. 94; 370 (1933).

4. Auf Physiologie und Pathologie bezügliche. 77

Triehloressigs~ture gefällt. 5 ccm Filtrat werden mit i ccm Lösung I I I in einem Zentrifugenglas versetzt und 30 Min. in ein Wasserbad von 600 eingestellt. Danach zentrifugiert man, dekantiert, stellt das Glas 5 Min. umgekehrt auf ein FlicBpapier und wischt die Ränder gut ab. Der Niederschlag wird einmal mit eiskaltem Wasser gewaschen, indem gleich- zeitig die Wände des Glases abgespült werden, und erneut zentrifugiert, das Wasser wird abgegossen und der Niederschlag in 5 ccm Lösung IV gelöst, die Lösung dann mit je 0,5 ccm Lösung V und VI versetzt und noch 5 Min. in ein Wasserbad von 40 o eingestellt, damit sich die blaue Farbe entwickelt. Dann kann colorimetriert werden.

Zur Bestimmung des organischen säurelöslichen Phosphors wird ccm Filtrat mit 0,2 ccm 60% iger Überchlorsäure bis zur ]~~arblosigkeit

erhitzt, nach dem Abkühlen mit Wasser verdünnt, mit 2 ccm n-Natron- lauge neutralisiert und die Bestimmung wie oben beschrieben durch- geführt.

Es sei daran erinnert, daß das Phenolreagens nach den Angaben von H. F u j i w a r a und E. K a t a o k a 1) mit einer großen Zahl von organ- ischen Substanzen reagiert. Es ist daher notwendig, den Niedersclllag gut auszuwaschen, um die in diesem Fall charakteristische FLeduktion mit 8-Oxychinolin zu bekommen. Eine Zusammenstellung störender Substanzen findet sich bei K. H i n s b e r g und K. Lang~).

Nach K. L a n g und M. M i e t h k e 8) verfährt man zur E n t e i w e i ß - ung de r Mi lch vorteilhaft wie folgt:

In einen 100 c c m - M e ß k o l b e n gibt man 10 ccm 20% ige Trichloressig- säure und setzt tropfenweise unter Schütteln 5 ccm Milch zu. Nach einiger Zeit füllt man mit Wasser auf und bestimmt die einzelnen Frak- tionen in aliquoten Teilen.

Es soll in der Milch eine außerordentlich labile Phosphatfraktion vorhanden sein, deren Nachweis nur bei neutraler Eiweißfällung gelingt. Es iinden sieh in der Milch etwa 30--35 mg-°/o wahrer anorganischer Phosphor, etwa 20 mg-°/o säurelabiler Phosphor und i - - 8 m g - % schwer hydrolysierbare Ester neben sehr geringen Mengen leicht hydrolysier- baren Estern.

Ein besonderes Kapitel nimmt die B e s t i m m u n g de r P h o s p h a t - f r a k t i o n e n im L i q u o r ein, weit einerseits die Menge des zur Ver- fügung stehenden Materials in der Regel sehr beschränkt ist und weil andererseits auch die vorkommenden absoluten Mengen sehr klein sind. In dem nachstehenden Referat ist ein Arbeitsgang für eine derartige Analyse angegeben. Es werden gefunden:

Anorganischer Phosphor . . . . . . t ,02 - - i ,84 m g - % Gesamter säurelöslicher Phosphor . i,36 --2,~4 , Lipoidphosphor . . . . . . . . . . 0,0i6--0,030 , Gesamtphosphor . . . . . . . . . . 1 ,37- -2 ,15 ,

1) Ztschrft. f. physiol. Chem. 216, 133 (1933); vgl. diese Ztschrft. 100, 53 (t935). - - 2) Medizinische Chemie (1938). - - a) t3iochem. Zfschrft. 254, 484 (1932).

78 Bericht : Spezielle analytische Methoden.

Die M i k r o b e s t i m m u n g des P h o s p h o r s im L i q u o r haben C. T r o p p , O. S e u b e r l i n g und B. E c k a r d t 1) wie folgt beschrieben:

L ö s u n g e n . 1. 14% ige Trichloressigsäure, reinst, mit redestilliertem Wasser hergestellt. 2 .7%ige Trichloressigsäure, reinst, mit redestilliertem Wasser hergestellt. 3. Molybdänschwefelsäurereagens. a) 93 c c m Schwe- felsäure werden mit redestilliertem Wasser auf t000 cc~n verdiinnt. b) 7,5 g Natriummolybdat pro anal. werden in redestilliertem Wasser zu 100 c c m gelöst. Kurz vor Gebrauch werden 3 Teile a und i Teil b gemischt. 4. Zinnchlorür-Stammlösung. 10 g Zinnehlorür p. a. werden in tauchender Salzsäure zu 25 c c m gelöst. Die Lösung ist 4 Wochen haltbar. Vor Gebrauch ist sie 200fach mit Salzsäure zu verdünnen. 5. n-Schwefelsäure. 6. Konz. Schwefelsäure p .a . 7. 30~oiges Wasser- stoffsuperoxyd p .a . 8.0,1% ige Lösung von Phenolphthalein in Alkohol. 9. Natronlaugen, 40°/oig und normal. 10.96%iger redesti]lierter Alkohol. t l . Redestillierter Äthyläther. 12. Phosphatstandard: l c c m = 0,0025 bis 0,t0 m g P .

A r b e i t s g a n g . t. Anorganischer Phosphor. t,50 c c m Liquor werden mit 1,5 c c m t4% iger Trichloressigs~ure enteiweißt, indem 3 Min. in einem siedenden Wasserbad erhitzt wird. Es wird 20 Min. zentrifugiert, und 2 c c m Zentrifugat werden in ein Glasstöpse]-Meßkölbchen eingebracht; in ein zweites Meßkölbchen kommen 2 c c m 7~/oige Trichloressigsäure als Kontrolle. In beide Meßkölbchen kommen sodann 2 c c m Molybdänsäure- reagens, wobei gründlich geschüttelt werden muß, damit ein gleichmäßiger

, pR-Wer t sich einstellt, was sehr wichtig ist. Unter leichtem Schwenken setzt man jetzt t c c m Zinnchlorürlösung hinzu, die Farbintensit~tt ist nach einer halben Minute erreicht und bleibt für 2 Stdn. konstant. Man füllt die Meßkölbchen auf und mißt die Farbintensität im Stufenphotometer mit Filter S 75.

2. Säurelöslicher Phosphor. 2 c c m Zentrifugat, die wie oben ge- wonnen wurden, werden mit 3 Tropfen konz. Schwefelsäure in einem kleinen Kj e ldah lkolben mit Marke bei 8 und 10 c c m über freier Flamme verascht (2 Min.). Nach dem Abkühlen werden 2 Tropfen Wasserstoff- peroxyd zugegeben; nun wird bis zur Farblosigkeit erhitzt und dann abgekühlt. Der Kolbenhals wird mit Wasser abgespült; hierauf wird nochmals erhitzt, bis Schwefelsänredämpfe aufsteigen, um alles Per- hydrol zu zerstören. Der Kolbeninhalt wird mit 2--3 c c m Wasser ver- dünnt, zuerst mit 40%iger, dann mit n-Natronlauge gegen Phenolphthalein genau neutralisiert, hierauf bis auf 8 cc~n aufgefüllt.

Nach Zugabe von 1 c c m Molybd£nschwefels£ure gießt man den Kolbeninhalt in ein kleines Becherglas, läßt jetzt unter leichtem Schwenken Zinnchlorürlösung zufließen, womit die Probe zur colorimetrischen Be- stimmung fertig ist. Die Zinnchlorürlösung muß im Beeherglas zugesetzt werden, weil sonst die Durchmisehung nicht rasch genug erfolgt und abweichende Colorimeterwerte erhalten werden.

3. Lipoidphosphor. 5 c c m Liquor werden mit 4 c c m Alkohol kräftig geschüttelt; dieses Verfahren wird mit 5 ccm Äther wiederholt. Nach

~) Biochern. Ztschrft. 290, 320 (t937).

4. Auf Physiologie und 1)albhologie bezügliche. 79

3 Min. wird der Äther abgetrennt und in ein Becherglas filtriert. Die wgBrige Lösung wird ein zweites Mal mit 5 ccm Äther ausgeschüttelt. Zur klaren Trennung sind jetzt mitunter i - -2 Km Alkohol nötig. Die ver- einigten Ätherauszüge engt man auf 2 ccm ein, führt in einen Veraschungs- kolben über, vertreibt den Äther vollkommen und verascht, wie oben beschrieben, mit 3 ccm Schwefelsgure.

4. Gesamtphosphor. i ccm Liquor wird mit 2 ccm Wasser und 0,5 ccm Trichloressigsäure (Verhinderung des Schgumens) sowie mit 3 Tropfen Schwefelsäure in einem kleinen Ki e ldahlkolben verascht.

Die Methode ist auch für anderes Material brauchbar. Der L i p o i d p h o s p h o r kann nach dem Veraschen prinzipiell nach

jeder Methode bestimmt werden. Meistens wird er dadurch gewonnen, daß mit Alkohol oder Äther das Eiweiß gef~llt und der im Filtrat vor- handene, in Äther oder Petrolgther lösliche Phosphor bestimmt wird. Einen anderen Weg schlagen B. RTorberg und T. Te o r e l l 1) ein. Sie haben festgestellt, daß die Phosphatide mit dem Eiweiß durch Trichlor- essigsgure gef~llt werden. Aus dem Niederschlag kann man sie nach dem Trocknen im Vakuum mit Alkohol-Äther in einem Extraktions- apparat oder besser nach B. N o r b e r g 2) mit Chloroform-Alkohol (t:3) extrahieren. Die Extraktion ist in 7 Stdn. beendet. Man braucht etwa 0,i g fein verriebenes Organ oder 0,5 ccm Blut oder Plasma.. (Ein kleiner praktischer Extraktionsapparat ist im Original angegeben.)

Auch oxydimetrisch sind die Phosphatide bestimmbar. Dies setzt aber voraus, daß sie von anderen organischen Stoffen quantitativ ab- getrennt werden. Eine solche Vorschrift s tammt von W. t~. Bloora). Nach ihm werden die Phosphatide in Aceton gelöst und dann mit Magnesiumchlorid in Alkohol gefMlt. Der Niederschlag wird abgetrennt und mit Silberchromat-Schwefels~ure in der Hitze oxydiert. Die Oxy- dation soll nach B loo r nach folgender Gleichung verlaufen:

2 C42Hs~OgN P + 239 0 = 84 CO 2 ~ 8i H20 d- 2 HaPO ~ d- N2. Demnach würden verbrauchen

I m g Leeithin 3 , i l ccm 0,1 n-Bichromatlösung, i m g Cephalin 3,t2 ccm 0,i n-Bichromat]ösung.

Tatsgch]ich findet man nur 94--97% der Theorie, und zwar weil, wie M. J o w e l l und E. W. L a w s o n 4) gezeigt haben, die Lecithine nicht quantitativ gef~llt werden und weil, wie S. K a t s u r a , T. H a t a k e y a m a und K. T a j i m a 5) zeigen, die Oxydation nur bis zum Trimethylamin verl~tuft.

Die Oxydationsgleichung lautet also: 2 C42ttstOgN P d- t09 02 = 78 CO~ d- 72 HeO -~- 2 N(CH3) a ~ 2 HsPO «

Auf Grund dieser Gleichung verbraucht: m g Stearyloleyllecithin 2,85 ccm 0,t n-Bichromatlösung,

1 m g Palmityloleyllecithin 2,82 ccm 0,t n-Biehromatlösung.

1) Biochem. Z~schrft. 264, 310 (1933); vgl. diese Ztschrft. 104, 380 (1936). - - ~) Biochem. Ztschrfb. 269, t (1934); vgl. diese Ztschrft. 104, 38~ (~936). __ a) Journ. of Biol. Chem. 82, 273 (~929). -- ~) Bioehemieal Journ. ~5, 198i (1934). - - 5) Vgl. diese Ztschrft. 104, 381 ('1936).

80 Berieht: Spez. analyt, h~ethoden. 4. Auf Physiol. u] Pa~hol. bez.

Die Autoren belegen dies durch eine Reihe yon An~lysen und zeigen auch, dag naeh ihrer 5Iethode noch 0,1 mg Lecithin, selbst ~us Eiern dargestellt, richtig bestimmt werden k~nn. Wesent]ich ist, daI~ die Oxydationsbedingungen gengu eingehMten werden. Sie miissen im Origin~,l n~chge]esen werden. Fiir die quantitative Fi~llung der Phos- ph~tide wird folgende Vorsehrift gegeben:

Eine L6sung, die Lecithine im Gemiseh mit Neutralfetten nnd Cholesterin. enthi~lt, wird einged~mpft und der Riiekstand d~nn in I ccm

Petrol£ther gelSst. Hierzu kommen 5 ccm reines Aeeton. Man dampft welter ab, wobei der Petrot~ther schne]ler verschwindet. Ist n~r noeh t c cm LSsung vorh~nden, so setzt ma.n 7 ccm einer ges~ttigten LSsung yon Cglciumchlorid (C~C12 . 6 H20 ) in w~sserfreiem Aceton zu. Je n~ch tier Menge Lecithin t r i t t sofort eine Triibung oder F~llung auf, die n~ch t Side. durch ein entfettetes Filter abgetrennt wird. D~s Filter wird zweimM mit CMeiumchlorid-Aceton gew~scben, das Fil trat mit 0,5 ccm

Wasser und 8 ccm Petrot~ther behandett, wobei die Sa, lze in den wg~rigen Teil gehen, w~hrend die Phosphatide im Petrol£ther sind. Dcr Petrol- ~ther wird in den Oxyd~tionskolben gegossen, noch zweimal mit Petrol- gther n~ehgespiilt and alles L6sungsmittel verdgmpft. Der t~iickstand wird wie iiblich oxydiert.

Eine gleiche Mange des Extrgktes wird, ohue die Phosphutide a~b- zutrennen, eingedumpft und oxydiert. Aus der Differenz des Verbr~uchs ~n 0xydutionsmittel li~Bt sich ngch obiger Gleichung d~s Lecithin be- rechnen.

Eine weitere M 6 g l i c h k e i t d e r P h o s p h a . t i d b e s t i m m u n g i s t dt~rch B e s t i m m u n g des Cho l in s gegeben. Eine der~rtige Vorschrift st~mmt yon W. L i n t z e l und G. M o n a s t e r i o ~) Die Diaminophos- phutide kSnnen na, eh S. J. T h ~ n n h g u s e r und P. S e t z u) dureh Fgllung Ms Reineck~t bestimmt werden. Es miissen ~ber mindestens 20 m g

Substa.nz vorhgnden sein. Im norm~len mensch]ichen ~Blut werden 86--220 m g Diaminophosph~tide gefunden. Als Konstitution des Nieder- seM~ges wird C~a~H~N~P~O~S~Cr ~ngegeben. K. H i n s b e r g .

2) Biochem. Ztschrft. 241, 2Y3 (193t); W. L i n t z e l und S. Fo rn in , vgl. diese Ztschrft. 94, 452 (1933). - - 2) Journ. of Biol. Chem. 116, 533 (1936). - - a) Eine vollst~ndige Anleitung zur Bestimmung Mler Lipoid- fmktionen finde~ sieh bei W. 1%. Wilson und A. E. I{ansen, vgl. diese Ztschrf%. 111, 3t 3 (t 937/38) ; S. K a t s u r a , T. I - Ia t~keyama und K. T~j ima, Biochem. Ztschrft. 269, 23~ (t934).