Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple kartilaginäre Exostosen)

DNA-Sequenzanalyse (direkte Diagnostik) (Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom)

MLPA (direkte Diagnostik, Retinoblastom)

(D. Lohmann) H.-J. Lüdecke

Retinoblastom

Familienanamnese bei Retinoblastom

Familie L.S.

I

II

1 2

1 2 3

I

II

1 2

1 2 3

Familie J.W.

Familie L.B.

I

II

1 2

1 2

III 1 2 3

3 4

Erbliches Retinoblastom

rbrb rbrbRBRB rbrbrbrb X RBRB

TumorkonstitutionellKeimbahn

rbrb RBRB

Gameten

ersteMutation

zweiteMutation

Retinoblastomgen

1 2 3 6 7 17 18 275´ 3´

Genomische DNA

ExonIntron Intron

Beispiele für Mutationen in kodierenden Bereichen

Segregation

Indirekte Diagnostik: Segregation gekoppelter Marker

locus A

locus B

A1 A2B1 B2

A1B1

A1B1

A2B2

A2B2

A1B1

A2B2

A1B1

A2B2

crossingover

DNA-replication

or

A1B1

A1B1

A1B1

A1B2

A2B1

A2B2

A2B2

A2B2

gametes

VNTR-Polymorphismus

14801 ggtgtacgtc tatacagggc tatgtataac cgactcctgt ttctcctccc 14851 tgcaaccaca gaaccatcac acacacacac acacacacac acacacacac

14901 acacacacac acacggatac acgcacagat acgctccttt ccacaaatgc

14951 acgcaaaccg ggacgcaaac ccacaactcg agggcttaga ccttcactgc

5´ 3´

... CTTT ...

... GAAA ...

Intragene VNTR-Loci

5´ 3´

D13S153(RBi2) RB1.20

... CA ...

... GT ...n n

VNTR-Loci

Genotypisierung

RB1, väterliches Allel RB1, mütterliches Allel

CAGT

20

CTTTGAAA

14

CAGT

18

CTTTGAAA

19

Kopplungsphase

RB1, mutiert

CTTTGAAA

14

CTTTGAAA

19

4bpDeletionExon 4

Kopplungsphase

I

II

1 2

1 2

III 1 2 3

3 4

14-2014-20

14-1814-18

15-1815-18

18-2018-20

14-1614-16

Rb1.20-Rb1.20-GenotypGenotyp

Kopplungsphase

I

II

1 2

1 2

III 1 2 3

3 4

1414-20-20

1414-18-18

15-1815-18

18-2018-20

1414-16-16

Rb1.20-Rb1.20-GenotypGenotyp

CTTTGAAA

1414

4bpDeletionExon 4

Analyse von VNTR-Loci

5´ 3´

PCR

Fragmentlängenanalysedurch elektrophoretischeAuftrennung

oder

Gelektrophorese

›

+

– 1 2 3Ladepositionen

elek

tris

ches

Fel

d

Längen-standard

Polyacrylamidgel

St.

90 bp

180 bp190 bp

300 bp

400 bp500 bp

Agarosegel in Elektrophresekammer

Kathode (+)

Anode (–)

Auftragen der Proben

Elektrophoretische Auftrennung

Dokumentation per Videobild

Dokumentation

Genotypisierung

I

II

1 2

1 2

III 1 2 3

3 4

11-5-5

11-4-4

2-42-4

4-54-5

11-3-3

Rb1.20-Rb1.20-GenotypGenotyp

I-1 I-2 II-2 II-3 III-1

Familie I

I

II

III

1 2

1 2 3 4

1 2

I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2

Familie 1

11 11

1

1

Familie I

I

II

III

1 2

1 2 3 4

1 2

I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2

Familie 1

2222 22 22 22 22

1-2

12 2

2

Familie I

I

II

III

1 2

1 2 3 4

1 2

I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2

Familie 1

33

1-2

12-3 2-3

2-3

33

33 33 33 33

3

3

3

Familie I

I

II

III

1 2

1 2 3 4

1 2

I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2

Familie 1

44

1-2

1-42-3 2-3

2-3

3-4

3

3

44

Familie I

I

II

III

1 2

1 2 3 4

1 2

I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2

Familie 1

1-2

1-42-3 2-3

2-3

3-4

3-5

3-5

55 55

Familie I

I

II

III

1 2

1 2 3 4

1 2

I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1 III-2 RB-Probenvon III-2

Familie 1

11-22

11-422-3 22-33

22-3

3-4

33-5

3-5

Familie 2

II-1 II-3II-2 III-1

Familie 2 I

II 1

1 2

2 3

1III22-331-31-3 11-33

22-3

Familie 3Familie 4

II

III

IV

1 2

1 2

1

I 1 2

3 4 5

II-1 II-3II-2 II-4III-1 III-2 IV-1 II-5

44-5 2-4

2-44

1-5 3-44 1-5

44-4

1-4

3

Familie 4

I

II

1 2 3

III

1 2 3 4

1

Familie 6

I-1 I-2 II-1 II-3II-2 II-4 III-1

2-4

2-4

2-33

22-33

22-4 33-4 1-33

4

Prädiktive Diagnostik bei Prädiktive Diagnostik bei LocusheterogenitätLocusheterogenität

SegregationsanalyseSegregationsanalyse bei bei hereditären multiplen cartilaginären hereditären multiplen cartilaginären

Exostosen (HME)Exostosen (HME)

Hermann-Josef LüdeckeHermann-Josef Lüdecke

Lokalisierung der ExostosenLokalisierung der Exostosen

Multiple cartilaginäre ExostosenMultiple cartilaginäre Exostosen

Häufigkeit 1 : 50.000

Penetranz 100 %

autosomal dominant

genetisch heterogen• 8q24.1 EXT1• 11p11-12 EXT2 (19p EXT3)

Spektrum der Mutationen in Spektrum der Mutationen in EXT1EXT1 und und EXT2EXT2

Wuyts & van Hul, 2000

KopplungsanalyseKopplungsanalyse

und Segregationsanalyseund Segregationsanalyse

mitmit

EXT1EXT1- bzw. - bzw. EXT2EXT2- intragenen- intragenen

Mikrosatelliten-MarkernMikrosatelliten-Markern

genomische Organisation des genomische Organisation des EXT1EXT1-Gens-Gens

(A)nUGAAUG

6.5

5.09.0 1.0 4.0

4.0 2.2

6.02.2

6.0

65G5 46F10

25B8

90D8

250 kb

6.0

21 3 4 5 6 7 8 9 10 11

“EXT1“

Kopplungsphase:Risiko:

12345

1234

P

P

PGP

P P

EXT2, Allel 2

MP

kein Risiko

ÜbungsaufgabenÜbungsaufgaben

1234

123P

P

EXT1, Allel 2

P

kein Risiko für III2

123

123

P P

P P

keine Aussage möglich

12345

1234

P

P

EXT2, Allel 2

P

Individuum III2 wird erkranken

I

II

EXT1

EXT2

Familie D

P PPM M

M

M

MP

? P ?

Fehlen paternaler EXT1-Allele

y935A12

y960B10

y960B10

der(8)

der(5)

8

der(5)

5

5

Sonde: "paint 5" Sonde: y960B10

Molekulargenetische Molekulargenetische Diagnostik durch DNA-Diagnostik durch DNA-

SequenzanalyseSequenzanalyse

PunktmutationenPunktmutationen

THE CAT DID EAT THE RED HATTHE CAT DID EAT THE RED HAT

THE RAT DID EAT THE RED HATTHE RAT DID EAT THE RED HAT

THE ATD IDE ATT HER EDH ATTHE ATD IDE ATT HER EDH AT

THE CHA TDI DEA TTH ERE DHA TTHE CHA TDI DEA TTH ERE DHA T

1. Enzymatische Vermehrung des zu untersuchenden Genabschnittes mittels PCR

Cave: Es werden immer das maternale und paternale gemeinsam amplifiziert!

2. Enzymatische Sequenzierung nach Sanger

Template (Matrize)

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'

Primer (Startmolekül)5'-AAGTCATTGC-3'

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC-3'

Primer-Annealing (Anlagerung)

DNA-PolymerasedNTPsddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

Primer-Verlängerung und Kettenabbruch

Enzymatische Sequenzierung nach Sanger

Template (Matrize, einzelsträngig)

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'

Primer (Startmolekül)5'-AAGTCATTGC-3'

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC-3'

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC

Primer-Annealing (Anlagerung)

DNA-PolymerasedNTPsddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

Primer-Verlängerung und Kettenabbruch

TACGTAACT

TACGTAACTG

TACGTAACTGA

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGAC

Enzymatische Sequenzierung nach Sanger

3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'5'-AAGTCATTGC-3'

5'-AAGTCATTGCTACGT

DNA-PolymerasedNTPsddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

Primer-Verlängerung und Kettenabbruch

5'-AAGTCATTGCTACGTAA5'-AAGTCATTGCTACGTAAC

hier sind einmal alle Produkte der Primer-Verlängerung gezeigt:

5'-AAGTCATTGCT5'-AAGTCATTGCTA5'-AAGTCATTGCTAC5'-AAGTCATTGCTACG

5'-AAGTCATTGCTACGTA

5'-AAGTCATTGCTACGTAACT5'-AAGTCATTGCTACGTAACTG5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGAusw.

Gelelektrophorese Kapillarelektrophorese

manuelle Beladung der Gele automatische Beladung der Kapillaren

laser

detectorcomputer

Automateddetection

–

+

T ACT GAGCT ACAGAAAAACAT AGAA

AGCTATAATTGTCAGTTCTGTGACTTCNGATATTCCAAAAGC

AGCTATAATTGTCAGTTCTGTGACTTCCGATATTCCAAAAGC

PatientPatient

NormalpersonNormalperson

CGATGA

Klinische Zeichen:Klinische Zeichen:

• dünnes, spärliches Kopfhaar dünnes, spärliches Kopfhaar • große, "birnenförmige" Nase große, "birnenförmige" Nase • langes, flaches Philtrumlanges, flaches Philtrum• schmales Oberlippenrotschmales Oberlippenrot• ZapfenepiphysenZapfenepiphysen• BrachydaktylieBrachydaktylie• HüftveränderungenHüftveränderungen• KleinwuchsKleinwuchs• multiple cartilaginäre Exostosen multiple cartilaginäre Exostosen (nur TRPS II) (nur TRPS II)

Tricho-Rhino-Phalangeale SyndromeTricho-Rhino-Phalangeale Syndrome8

TRPS1TRPS1EXT1EXT1

Tricho-Rhino-Phalangeales SyndromTricho-Rhino-Phalangeales Syndrom

An dieser Stelle wurde im Praktikum das Foto einer

Patientin gezeigt. Dieses darf jedoch nicht im Internet

veröffentlicht werden. Ich hoffe, Sie haben sich die

Charakteristika des TRPS einprägen können.

33 44 55 6 77N C

Struktur des TRPS1 TranskriptionsfaktorsStruktur des TRPS1 Transkriptionsfaktors

Exon 6Exon 6

Sequenzierung von Exon 6 des Sequenzierung von Exon 6 des TRPS1TRPS1-Gens-Gens

CGA CGA CAA; Arg CAA; Arg Gln; R Gln; R Q Q

ÜbungsaufgabenÜbungsaufgaben

Patient 1Patient 1

NormalpersonNormalperson

CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGNCCACAAAGACCTCTC

CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGACCACAAAGACCTCTC

ACCCCC

Patient 1Patient 1

NormalpersonNormalperson

CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGNCCACAAAGACCTCTC

CCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTGACCACAAAGACCTCTC

ACCCCC

= Thr= Pro

R R R G S G V F C

ANCLTTKTSLW

RKNANGGYVC

NA

CG L Y Q K L H S

Zn

PP

NH2 COOH

Struktur des Zinkfingers vom "GATA"-TypStruktur des Zinkfingers vom "GATA"-Typ

aus: Vilain et al. (1999) Am J Med Genet 85:495-497

Patient 2Patient 2

NormalpersonNormalperson

CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTNGGNCCATTGNCNN

CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTG

Patient 2Patient 2

NormalpersonNormalperson

CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTGTGCCAATTGCCTG

TGTGCCAATTGCCTGTGCCAATTGCCTG

CAGAGGCGTAGAGGCTCCGGTGTTTTTTNGGNCCATTGNCNNWildtyp:mutant:

T-Insertion

Patient 3Patient 3

NormalpersonNormalperson

CTCTGGCGAAAGAATGCAAATGGCGGATANGTATGCAACGCGT

CTCTGGCGAAAGAATGCAAATGGCGGATATGTATGCAACGCGT

TATTAA = Stop

Patient 4Patient 4

NormalpersonNormalperson

AAGCTTCACTCGNTAAGAACTTGTTCCACTCTTTCAGGAAAA

AAGCTTCACTCGGTAAGAACTTGTTCCACTCTTTCAGGAAAA

gtaagattaaga

RNA - Spleissen

WildtypWildtyp

Mutation eines Spleiss-SignalsMutation eines Spleiss-Signals

33 44 55 6 77N C

IVS6+1G>T exon6-TRPS1

33 44 55 77N C

1281 aa1281 aa

1240 aa1240 aa

Wildtyp-TRPS1

MMultiplex ultiplex LLigation-dependent igation-dependent PProbe robe AAmplication mplication (MLPA)(MLPA)

SALSA MLPA probes

Hybridisierung1. Der MLPA Sondenmix wird zu denaturierter

genomischer DNA gegeben2. Die zwei Teile jeder Sonde hybridisieren mit

benachbarten Zielsequenzen

Beachte den Unterschied

Ligation3. Die Sonden werden mit Hilfe einer thermostabilen

Ligase verbunden (ligiert)

Amplification4. Mit einem universellen Primerpaar kann man alle

ligierten Sonden amplifizierenDas Amplifikationsprodukt jeder einzelnen Sonde hat eine genau definierte Länge (92 - 481 bp).

Fluoreszenzfarbstoff

bp

NP1

NP2

Patient 1

Patient 2

Patient 3

1 10 20 30 40